KR910002691B1

KR910002691B1 - 사이클로스포린류를 함유하는 면역원성 복합체의 제조방법 및 그것을 이용한 모노클론항체의 제조 방법

Info

Publication number: KR910002691B1
Application number: KR1019860700333A
Authority: KR
Inventors: 로젠탈러 요아킴; 벤거 로란드; 에. 발 필립; 하. 쉬라이어 막스; 께스 니오 발레리
Original assignee: 산도즈 파마슈티칼스 코오포레이숀; 제랄드 디. 샤르킨
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1986-06-03
Publication date: 1991-05-03
Also published as: AU3914289A; FI862370A0; WO1986002080A1; AU4967185A; JPH074269B2; DE3587342T2; FI93965B; CY1927A; AU3914189A; EP0290762A1; DE3587342D1; HK78696A; ATE92501T1; NZ213680A; DK261386A; KR870700637A; NO862177D0; NO173557C; FI862370A; EP0198026B1

Abstract

내용 없음.

Description

사이클로스포린류를 함유하는 면역원성 복합체의 제조방법 및 그것을 이용한모노클론항체의 제조 방법

본 발명은 사이클로스포린류(cyclosporins)에 대한 모노클론 항체, 특히 진단/분석 키트(kit)에 사용할 수 있으며 사이클로스포린류와 그들의 대사물 사이를 식별할수 모노클론 항체뿐 아니라, 이 모노클론 항체를 함유하는 진단/분석용 키트와 이 모노클론 항체의 제조에 사용되는 신규의 하이브리도마 셀 라인에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단/분석 키트 용도에 적합한 폴리클론항 혈청 생성에 유용하며, 전술한 바와같은 모노클론 항체생성에 사용되는 신규의 사이클로스포린류와 그들을 함유하는 면역원성 복합체, 항혈청 및 항체생성물과 이들을 함유하는 진단/분석 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 진단/분석 키트 용도에 적합한 신규의 사이클로스포린류의 라벨된 유도체와, 이들을 함유하는 진단/분석 키트에 관한 것이다. 사이클로스포린류는 약학적으로, 특히 면역억제작용, 항염증작용 및 항기생충활성을 지닌 구조적으로 특징이 있는 시클릭 폴리-N-메틸화된 운데카펩타이드류를 포함한다. 분리된 사이클로스포린류중 첫번째 화합물은 천연적으로 얻어지는 진균의 대사산물인 사이클로스포린(Cyclosporine)으로서 이것은 하기식(A) 표시되며 사이클로스포린류 A(Cyclosporin A)로 공지되어 있다.

상기식에서 -MeBmt (A)는 하기식(B)의 N-메틸-(4R)-4-부트-2E-엔-1-일-4-메틸-(L)트레오닐 잔기를 의미한다.

상기식에서 -x-y는 -CH=CH- (트랜스)이다.

사이클로스포린이 최초로 발견된 이래로, 여러가지의 천연적으로 얻어진 사이클로스포린류가 분리확인되었으며, 비천연적인 수 많은 사이클로스포린류가 전체 합성 또는 부분 합성 방법 또는 개선된 배양기술을 이용해 제조되어왔다. 그러므로, 사이클로스포린류로 구성된 이러한 부류는 현재 매우 중요하며, 이것은 또한 천연유래 사이클로스포린류 A-Z[c.f.Kobel et al.European Journal of applied Microbiology and Biotechnology 14. 237-240 (1982) and poster presented by Traber et al., 24th. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherpy, Washington, October 8-10, (1984)] 뿐 아니라 여러가지 비천연 사이클로스포린류 또는 합성사이클로스포린류를 포함한다. 비천연 사이클로스포린류 또는 합성 사이클로스포린류는 디하이드로사이클로스포린류(이것은 -MeBmt- 잔기 (상기식 B 참조)의 -x-y기가 포화되어 있는 것으로, 미합중국 특허 제 4,108,985호, 4,220,641호에 기술되어 있다), -MeBmt- 잔기가 이성질체형태 또는 N-데스메틸형태로 존재하는 사이클로스포린류[비교 ; 유럽특허 제 0,034,567호와 "사이클로스포린 A", Proc. Intetnat.Conference on Cyclosporin A, Cambridge(U.K.) September 1981, Ed.

D.J.G.White, Elsevier Press (1982)- 상기 두 문헌은 R. Wenger에 의해 개발된 사이클로스포린의 전체 합성방법에 관해 설명하고 있다.]과 그 펩티드 서열내의 특정위치에 변형 아미노산이 결합되어 있는 사이클로스포린류등을 포함한다.

참고로 상기 종래의 기술 문헌에 개시된 사이클로스포린류의 예로는 [Thr]²-, [Val]²-, [Nva]²-, 및 [Nva]²-, [Nva]⁵- 사이클로스포린(사이클로스포린류 C.D.G 및 M으로 각각 공지되어 있음)과 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린(디하이드로사이클로스포린 D라 공지되어 있음) 등이 있다.

[사이클로스포린류의 통상적인 명명법에 따라, 사이클로스포린류들은 사이클로스포린의 구조(즉, 사이클로스포린류 A)를 참고로 본 명세서와 청구범위를 통하여 정의된다. 이것은 사이클로스포린중에 존재하는 잔기와는 다른 분자중의 잔기를 먼저 표시하고, 사이클로 스포린 중에 존재하는 잔기와 동일한 남아있는 잔기를 특정짓기 위해 "사이클로스포린"이란 용어를 적용함으로써 행해진다.

동시에 "디하이드로"라는 접두어는 식 B의 -x-y-가 -CH₂-CH₂-인 즉, -MeBmt- 잔기가 수소화된 (-디하이드로-MeBmt-) 사이클로스포린류를 명명하는데 사용된다. 그러므로, [Thr]²-사이클로스포린은 식(A)로 표시한 서열을 지닌 사이클로스포린류 이지만, 2-위치의 -αAbu-가 -Thr-로 치환된 사이클로스포린이며, 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린은 식(A)로 표시한 서열을 지닌것이지만 1-위치의 -MeBmt-가 수소화되었으며 2-위치의 -αAbu-가 -Val-로 치환된 사이클로스포린류를 뜻한다. 덧붙여, 통상적인 관습에 따라 약어(略語)로 언급된 아미노산 잔기, 예를들면 -Ala-, -MeVal-…등은 특별한 언급이 없는한 (L)-배열을 갖는 것을 의미한다. -MeLeu-의 경우처럼 "Me"가 선행된 잔기들은 N-메틸화된 잔기를 나타낸다. 사이클로스포린분자의 각각의 잔기는 종래기술에서 처럼 1-위치에 있는 잔기 -MeBmt- (또는 디하이드로 -MeBmt)에서 시작하여 시계도는 방향으로 번호가 붙여진다. 똑같은 번호 순서가 본 명세서와 청구범위 전반에 사용된다.]

사이클로스포린류의 독특한 면역억제 작용때문에, 사이클로스포린류는 의학 및 학술모임에서 뿐 아니라 언론에서도 상당한 관심을 모아왔다. 사이클로스포린 그 자체는 현재 상업적으로 시판되고 있으며, 주로 심장이식, 심장-폐이식, 신장이식 및 골수이식등의 동종조직의 이식에 따른 거부반응을 예방하는데 사용할뿐 아니라, 최근에는 다양한 자가면역질환 및 관련 질환과 상태의 치료에 사용되고 있다. 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린과 [Nva]²-사이클로스포린은 사이클로스포린과 비견될 수 있는 화합물로서 광범위한 임상적 연구중에 있다.

하지만, 사이클로스포린 같은 사이클로스포린류의 투여량을 정하는 것은 매우 어렵다. 대사전환율이 환자마다 다르고 치료범위가 좁기 때문에, 효과적인 투여량은 환자마다 매우 높은 특이성이 있으므로, 개인별로 적합한 혈청 레벨을 확립할 필요가 있다.

그러므로, 사이클로스포린류의 혈장 농도를 규칙적으로 측정하는 것은 효과적인 치료를 위해 필수적인 것이다. 이러한 목적을 위해서 고압 액체크로마토그래피(High pressure liquid chromatography, HPLC), 방사면역분석(Radioimmunoassay, RIA) , 형광면역분석(Fluoroimmunoassay, FIA) 시스템등이 개발되었다.

하지만, HPLC 방법은 특이성은 높은 반면 사용하기 어렵고 불편하며, 양(sheep)의 폴리클론 항혈청을 주로 사용한 현재 시판되는 RIA 시스템은 특이성 결여때문에 인기가 었다. 따라서 인체에 치료학적 용도로 투여된 사이클로스포린류와 그들의 대사산물 사이를 식별할 수 있는 사이클로스포린 특이적 모노클론 항체의 개발이 오랫동안 임상분야와 과학분야에서 요구되어 왔는데, 그 이유는 이들이 통상적인 면역분석 시스템에 의해 제공되는 사용이 용이한 장점을 제공하면서 HPLC 방법과 똑같은 우수한 특이성을 제공하는 장점을 가졌기 때문이다. 또한, 이러한 사이클로스포린류 특이성 모노클론 항체의 출현은 사이클로스포린류의 구조에 대한 비교연구 및 사이클로스포린 수용체 요구조건의 의미를 밝히는 중대한 새로운 연구 기구를 제공하게 되었다.

사이클로스포린이 최초로 발견된 이래로 사이클로스포린류에 반응하는 모노클론 항체를 제조하려는 수많은 시도가 있어왔다. 사이클로스포린 같은 사이클로스포린류 그 자체는 면역원성 활성이 거의 없기 때문에, 커플링 반응제로서 EDCI [N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 2HCl] 또는 MCDI [N-시클로헥실-N'-[β-(N-메틸-모르폴리노)메틸]-카르보디이미드.p.톨루엔설포네이트]을 사용하여 통상적이 커플링 기법으로 [Thr]²-사이클로스포린중의 -Thr²-에 존재하는 히드록시기를 경유해 면역 글로블린을 커플링 시킴으로서 유도된 합텐-단백질 같은 즉 면역원성 복합체를 사용하려는 시도가 진행되었다. 하지만 이러한 방식의 시도는 실패하였고, 이렇게 얻어진 모노클론 항체는 사이클로스포린에 대해 비교적 낮은 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 또는 사이클로스포린보다는 담체 단백질 또는 커플링 반응제에 대해 특이성을 갖는 것으로 나타났고, 또는 커플링 반응제와 상당한 교차반응성이 있는 것으로 나타났다. 이제까지 사이클로스포린과 이것의 대사산물(이후 상세히 설명되는 대사산물인 사이클로스포린 17과 사이클로스포린 18)사이를 식별하는 것으로 알려진 모노클론 항체를 제조하는 것은 불가능한 것으로 알려져왔다. 또한, 이러한 시도는 사이클로스포린에 대한 IgM 타잎의 모노클론 항체를 주로 제조하므로 어떤 경우에 있어서건 이것은 임상적인 통상의 분석키트 형태로 사용하기 부적합한 것이었다. 그러므로 사이클로스포린류에 대해 특이한 반응성을 지니고, 인체내에서 각각의 사이클로스포린류와 그들의 대사산물 사이를 식별할 수 있으며, 분석시스템에 사용하기 적합한 모노클론 항체를 제조하는 것이 중요한 과제로 남아있었다.

본 발명에 의해 사이클로스포린류에 대한 반응성이 있으며, 상술된 여러가지 목적에 부합하는, 특히 사이클로스포린류와 그들의 대사물간의 차이를 식별할수 있는 모노클론 항체는 초기 면역단계에서 합텐으로서 사이클로스포린류를 함유하는 면역원성 복합체를 사용하여 통상적인 면역/융합/클로닝 기술에 의해 생산될 수 있다. 상기의 복합체는 출발물질로서 활성화된 커플링기를 함유하는 사이클로스포린류에 담체를 커플링 시켜 합성되는데, 이때 이 결합은 상기 활성화된 커플링기를 경유해 발생한다. 특히, 이러한 면역원성 복합체를 사용함으로써, 사이클로스포린류와 그들의 대사산물(각각의 잔기상에 유일한 변형그룹을 지니고 있는 사이클로스포린의 대사산물) 사이의 상이점을 정확히 식별할수 있는 모노클론 항체를 얻을수 있다.

예를들면, 사이클로스포린의 경우, 상기 모노클론 항체는 사이클로스포린에는 반응하지만, 이것의 대사산물인 사이클로스포린 17 및/또는 사이클로스포린 18에 대해서는 낮은 교차 반응성을 나타낸다.

임상적 용도로 편리한 모노클론 분석 시스템을 발전시키기 위한 수단을 제공하는 것 이외에, 본 발명은 추가로 사이클로스포린류의 대사산물을 정제할 수 있는 수단을 제공한다. 그리고, 모노클론 항체는 본 발명의 일반적 방법을 사용해 제조될 수 있기 때문에 상기 수단은 수용체부위와 유사하고, 내인성 사이클로스포린 유사형 분자로 특정지워진다. 임상적인 관점과 순수과학적인 관점에서 볼때 본 발명은 매우 중요하다.

상술된 것처럼, 본 발명의 실시에 필수적인 면역원성 복합체는 단백질 분자 같은 담체를 활성화된 커플링기의 작용에 의해 사이클로스포린류와 직접 커플링시킴으로서 제조된다. 이것은 [Thr]²-사이클로스포린 또는 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린 경우처럼 히드록시 또는 아미노기와 같은 적합한 공동 반응성 치환체를 갖는 사이클로스포린류와 활성화된 커플링기를 함유한 담체를 반응시키거나 또는 활성화된 커플링기를 지닌 사이클로스포린류(이것은 그 분자내에 존재하는 아미노산 잔기중 하나가 활성화된 커플링기를 갖는 α-탄소원자에 측쇄를 지니고 있다)과 담체를 반응시켜 수행될 수 있다. 즉, 이 복합체는 개재된 커플링 반응제 잔기를 경유해서 결합되기 보다는 담체 부위에 직접 결합된 합텐부인 사이클로스포린류를 함유하고 있으며, 따라서 이것은 종래 기술에서 폴리클론 항 혈청을 생성시키기 위해 합텐성분으로 사이클로스포린류를 함유한 면역원성 복합체의 경우와 같다.

본 명세서의 청구범위 전반에 사용된 "활성화된 커플링 기"란 용어는 반응을 용이하게 하거나 촉진시킬 수 있는 커플링 반응제를 사용하지 않고도 공유 결합다리를 제공할수 있도록 하는 아미노기, 히드록시기, 티오기등과 같은 적절한 공동반응기와 직접 반응할수 있는기를 의미한다.

"활성화된 커플링 기"를 지닌 사이클로스포린류의 경우에 있어서, 활성화된 커플링기는 담체 분자와의 커플링 또는 분자와의 반응을 용이하게 하거나 촉진시키기 위해 커플링 반응제를 사용하지 않고도 단백질 분자와 같은 담체분자와 공유 결합된 복합체를 제공하는 담체분자와 직접 반응할수 있는 기를 의미한다.

활성화된 커플링기로서 적합한 기는 종래기술에 공지되어 있으며, 이것은 i) Z가 O- 또는 p-니트로페닐, 1-벤즈트리아졸, 펜타플루오로페닐 또는 N-숙신이미드 같은 카르복시활성기인 식 -CO-OZ로 표시되는 활성화된 에스테르 또는 활성화된 카르복시기와 ; ii) X가 2-피리딜 같은 디티오활성기인 식 -S-S-X로 표시되는 활성화된 디티오기와 ; iii) 에폭시기를 포함한다.

상술된 것처럼, 에폭시기같은 활성화된 커플링기를 지닌 바람직한 면역원성 복합체 담체분자는, Laumen 등에 의해 Tetrahedron Letters, 26(4), 407-410(1985)에 교시된 공지기술에 따라 제조할 수 있다. 하지만, 본 발명에 의한 일반적인 방법에 따라 활성화된 커플링기를 담체와 커플링된 사이클로스포린류 상에 제공하는 것이 바람직하다.

원칙적으로 활성화된 커플링기는 사이클로스포린류 분자주위의 어떠한 위치에도 존재할 수 있다. 1-위치에서의 변형이 사이클로스포린류 대사에 중요한 의미를 갖는한, 또는 사이클로스포린 경우에서 처럼 주요한 사이클로스포린 대사산물인 사이클로스포린 17과 사이클로스포린 18이 후술하는 바와 같이 1-위치에서 구조적 변형을 나타내는한, 활성화된 커플링기는 2 내지 11위치중의 어느 하나에 존재하는 것이 바람직하며, 이렇게 함으로써 후에 얻어진 면역원성 복합체내에서 1-위치에 있는 잔기는 담체에 의해 마스크되지 않은 원래 상태로 남아 있게됨으로써 특이 항체 반응을 유발하지 않게되어 바람직하다. 일반적으로 활성화된 커플링기는 2-위치 또는 3, 5 내지 8, 또는 10, 특히 5 내지 8위치중 어느하나에 존재할 수 있는데, 특히 2- 및 8-위치가 바람직하다.

인체에서 일어나는 사이클로스포린의 주요 대사전환 과정은 다음과 같다 :

Ⅰ. -MeLeu⁹-의 말단 히드록실화에 의해 하기식(E)의 잔기생성 ;

Ⅱ. -MeBmt¹-의 말단 히드록실화에 의한 하기식(F)의 잔기생성 ;

Ⅲ. -MeLeu⁴-의 데스-N-메틸화에 의해 -Leu- 생성 ;

Ⅳ. -MeLeu⁴-의 말단 히드록실화에 의한 상기식(E)의 잔기생성 ;

Ⅴ. -MeLeu⁶-의 말단 히드록실화에 의한 상기식(E)의 잔기생성 ;

Ⅵ. -MeBmt¹-의 말단 히드록실화와 고리 닫힘(ring-closure)에 의한 하기식(G)의 잔기생성 ;

사이클로스포린의 공지된 대사산물(사이클로스포린 1, 사이클로스포린 8등올 명명됨.)은 다음과 같은 대사변형을 나타내고 있다 ;

사이클로스포린 1 : I. 사이클로스포린 8 : I+Ⅲ.

사이클로스포린 9 : I+Ⅲ+Ⅴ. 사이클로스포린 10 : I+Ⅳ.

사이클로스포린 16 : I+Ⅴ. 사이클로스포린 17 : Ⅱ.

사이클로스포린 18 : Ⅳ. 사이클로스포린 21 : Ⅲ.

[G.Maurer et al에 의한 "Dryg Metab.Disposit" 12, 120-126(1984) 참조]

따라서, 인체내에서 사이클로스포린과 이것의 대사산물 사이의 상이점을 식별할수 있는 모노클론 항체를 제조하기 위해서는, 면역원성 복합체를 제조하기 위해 사용된 사이클로스포린 내의 활성화된 커플링기를 1-, 4-, 6- 또는 9- 위치이외의 위치에 위치시키는 것이 적합하며, 사이클로스포린 17 및 18이 주된 대사산물인한, 적어도 1-위치이외의 위치에 위치시켜야 한다. 그러므로, 특정한 사이클로스포린의 경우에 있어서 2- 및 8- 위치가 특히 바람직하다.

상술한 바와 같이 활성화된 커플링기를 갖는 사이클로스포린류는 다음 방법중 하나에 의해 제조될수 있다 : i) 이미 존재하고 있는 적절한 전구체 그룹(즉, 비활성화된 형태의 커플링기)을 활성화시키는 방법으로, 이를테면 2- 또는 8- 위치에서 카르복시기 치환된 α-아미노산 잔기 (즉 α-아미노산 잔기는 α-탄소원자에 카르복시기를 함유하거나 갖고 있는 측쇄를 지니고 있다)를 지닌 사이클로스포린류의 카르복시기를 카르복시 활성체와 반응시켜 활성화된 카르복시기로 전환시키는 방법 ; 또는 ii) 아미노- 또는 히드록시- 치환된 α-아미노산 잔기(즉 α-아미노산잔기는 α-탄소원자에 히드록시 도는 아미노기를 함유하거나 갖고 있는 측쇄를 지니고 있다)를 갖는 사이클로스포린류를 아실화시키거나, 에테르화 시키는 방법으로, 이를테면 2위치에 있는 히드록시- 치환된 α-아미노산 잔기 또는 8위치에 있는 아미노- 또는 히드록시- 치환된 α- 아미노산 잔기를 활성화된 커플링기를 지닌 아실화제 또는 알킬화제로 아실화시키거나 또는 에테르화 시킨다.

단계 i)의 방법은 0- 또는 p-니트로페놀, 1-히드록시-벤즈트리아졸, 펜타플루오로페놀 또는 N-히드록시-숙신이미드 같은 통상의 카르복시 활성화제와의 반응에 의해 카르복시기를 활성화시키는 본 기술분야에 알려진 표준 기술에 따라 수행될 수 있다. 이 반응은 EDCI 같은 응축제 존재하에 바람직하게 수행된다.

단계 ii)의 방법은 또한 통상적인 기술에 따라 수행될 수 있다. 즉 N-[(2-피리딜)디티오-프로피온-1-일]-숙신이미드[활성화된 커플링기(이 경우에 아미노기와 히드록시기 둘모두와 비반응성임]을 제공하는 (2-피리딜)-디티오부와 아실화반응을 수행하는 활성화된 카르복시기를 제공하는 -COO- 숙신이미도부]경우에서처럼 아미노 또는 히드록시에 비반응성인 활성화된 커플링기를 부가적으로 함유하며, 카르복시기가 활성화된 카르복실산의 유도체와의 반응에 의해 아미노기 또는 히드록시기는 아실화될수 있다. 반응은 주위 온도하에서 디클로로메탄 같은 불활성 용매 또는 희석제중에서 바람직하게 수행된다. 대안으로서, Laumen et al. Loc.cit에 의해 교시된 일반적인 방법에 따라 본 기술분야에 공지된 반응제인 에피클로로히드린 또는 에피브로모히드린을 사용하여

구조식을 지닌 에폭시 함유부[활성화된 커플링기를 제공하는 에폭시부]를 도입함으로써 히드록시기를 에테르화시킬수 있다.

상기 단계 i)의 사이클로스포린 출발물질은 2- 또는 8-위치에서 카르복시치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린을 제조하기 위한 단계 ii)의 방법과 유사한 방법으로 제조될 수 있다 : iii) 2-위치의 히드록시치환된 α-아미노산 잔기 또는 8-위치의 히드록시치환된 α-아미노산 잔기 등의 아미노- 또는 히드록시 치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린류와 a) 카르복시기중의 하나가 보호된 형태인 디카르복실산을 반응시키거나, 또는 b) 숙신 안하이드라이드 같은 디카르복실산 안하이드라이드와 반응시켜 출발물질이 제조될 수 있으며, 상기 a) 반응의 경우 그 이후로 사이클로스포린 생성물내의 카르복시기를 탈보호 시킨다.

반응단계 iii)은 주위온도 또는 이보다 약간 높은 온도하에서 불황성유기용매 또는 희석제중에 4-디메틸 아미노피리딘 같은 산결합체 존재하에 통상적으로 수행될 수 있다. 카르복시보호기가 변형방법 a)에서와 같이 사용될때, 이들은 통상적인 기술에 의해 제거될수 있다.

히드록시치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 단계 ii)와 iii)의 사이클로스포린 출발물질은 다음과 같은 공지된 사이클로스포린류를 포함한다:

[Thr]²-사이클로스포린 및 [(D)Ser]⁸-사이클로스포린.(후자는 유럽특허 제 0,056,782호에 발효기술과 관련된 사이클로스포린 제조를 위한 총합성 방법에 관한 일반기술과 그 제조방법이 함께 교시되어 있다.) 8-위치에서 히드록시 치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 또다른 사이클로스포린은 상기와 유사하게 제조될 수 있으며, [(D)Thr]⁶-사이클로스포린, [Nva]²-[(D)Ser]⁸-사이클로스포린, 그리고 [Thr]²-[(D)Ser]⁸-사이클로스포린 등은 미합중국 특허 제 713,259호(1985년 3월 19일 출원)=서독연방공화국 제 3, 509,809.0호(1985년 3월 19일 출원)=프랑스공화국 특허 제 8,404,172호(1985년 3월 19일 출원)=오스트레일리아 연방공화국 특허 제 40 272/85(1985년 3월 22일)=영국 특허 출원 제 8507270호(1985년 3월 30일 출원)=뉴질랜드 출원 제 211,526호(1985년 3월 21일 출원)=남아연방공화국 특허출원 제 85/2195호(1985년 3월 22일 출원) 등에 교시 청구되어 있다.

아미노 치환된 α-아미노산잔기를 갖는 바람직한 사이클로스포린류는 아미노산잔기가 8-위치에 있는 것으로서, 특히 8-위치에 있는 잔기가 -(D)Lys-인 사이클로스포린류가 바람직하다. 이러한 사이클로스포린류는 R.wenger에 의해 개발된 사이클로스포린 제조를 위한 총합성방법기술에 따라 제조될 수 있다.

iv) 8-위치에서 아미노 치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 보호형태의 사이클로스포린류를 탈보호 시키는 방법으로, 예를들면 8-위치에서 잔기가 N-ε-보호 형태의 -(D)Lys-인 사이클로스포린을 탈보호 시키거나 ; 또는 v) 사이클로스포린 생성물의 서열을 지닌 직쇄의 운데카펩타이드 (유리형태 또는 보호형태이며, 사이클로스포린 생성물의 8-위치에 상응하는 위치에서 유리 또는 N-ε-보호된 형태의 -(D)Lys-잔기를 함유하고 있다)를 고리화시킨후, 필요하다면 단계 iv)를 수행하여 제조할수 있다.

단계 iv) 및 v)는 후술되는 실시예 (1)의 일반적인 절차에 따라 수행될 수 있다.

단계 i) ii) 및 iii)에서 알수 있는 것처럼, 단계 i) 또는 ii)의 생성물은 아실아미노- 아실옥시- 또는 알콕시치환된 α-아미노산잔기 (즉, α-아미노산잔기는 α-탄소원자에서 아실아미노-, 아실옥시-, 또는 알콕시-기를 함유화는 측쇄를 지니고 있다)를 갖는 사이클로스포린류, 예를들면, 2-위치에서의 아실옥시- 또는 알콕시가 치환된 α-아미노산 잔기, 8-위치에서 아실아미노-, 아실옥시- 또는 알콕시치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린류를 포함하는데 여기서 활성화된 커플링기는 아실/아킬부상에 존재하고 있다.

이것은 단계 i)-v)의 일반적 방법에 따라 특정군의 사이클로스포린류를 제조하는 방법을 예시한 하기의 반응개요도를 참고로 더욱 용이하게 이해할수 있다.

하기식 Ia 내지 Id, Ⅱa 내지 Ⅱd 및 Ⅲ에 있어서, c는 서열

를 나타내며, E는 서열

을 나타낸다.

반응단계 i)

상기식에서 A¹=-MeBmt-이며, Ba¹=-(0-아실)-Thr-이며 (여기서 아실부는 비활성형태인 커플링기로서 예를들면 유리카르복실기, 즉 - (0-히드록시숙시닐)-Thr-이다),

상기식에서 A¹과 D¹은 상기 정의한 것과 같으며, Bb¹=-(0-아실)-Thr-이며 (여기서, 이실부는 활성화된 커플링기로서 예를들면, 활성화된 카르복시기를 함유하며, 즉 아실부가 ZO-CO-(CH₂)₂-CO- (Z는 카르복시활성화기)인 -(0-아실)-Thr-이다.),

상기식에서 A²=-MeBmt-이며 B²=-αAbu- 또는 -Nva-이거나, 또는 A²=-디하이드로 -MeBmt-이며, B²=-Val-이고, 그리고 Da²=아실아미노치환된 (D)α-아미노산잔기, 예를들면 -(N-ε-아실)-(D)Lys- (여기서 아실부는 비활성화형태는 커플링기, 예를들면 유리 카르복시기, 즉 -(N-ε-히드록시 숙시닐)-(D)Lys-를 갖고 있다 ;

상기식에서 A²및 B³는 상기 정의한 것과 같으며,

는 아실아미노치환 (D)α-아미노산 잔기, 예를들면 -(N-ε-아실)-(D)Lys-이다(여기서 아실부는 활성화된 커플링기, 즉 활성화된 카르복실기를 갖으며, 아실부는 Z가 상기 정의한 것과 같은 ZO-CO(CH₂)₂-CO- 식으로 표시된다.

반응단계 ii)

상기식에서 A¹과 D¹은 상기 정의한 것과 같고,

상기식에서 A¹과 D¹은 상기 정의한 것과 같고 Bb³는 알킬부가 활성화된 커플링기, (예를들면 에폭시기)를 갖는 -(0-알킬)-Thr-이며, 그 예로는 즉 -(0-에폭시메틸)-Thr-이 있다.

상기식에서 A¹과 B²는 상기 정의한 것과 같으며,

Da³는 아실아미노가 치환된 (D)α-아미노산잔기, 예를들면 -(N-ε-아실)-(D)Lys-이다 (여기서 아실부는 활성화된 커플링 잔기, 즉 [N-ε-(3-(2-피리딜)디티오-프로피온-1-일)]-(D)Lys-같은 것을 지니고 있다.

반응단계 iii)

a) 상기 정의한 식(Ic)의 사이클로스포린 :

↓ 숙신 안하이드라이드와 반응시킴으로써 아실화반응시킴 :

상기 정의한 식(Ia)의 사이클로스포린.

b) 상기 정의한 식(Id)의 사이클로스포린 :

상기 정의한 식(Ib)의 사이클로스포린.

반응단계 iv)

상기식에서 A²과 B²는 상기 정의한 것과 같으며,

상기 정의한 식(Id)의 사이클로스포린.

반응단계 v)

상기식에서 A²와 B²는 상기 정의한 것과 같고,

상기 정의한 식(Id) 또는 (Ie)의 사이클로스포린.

-MeBmt- 및 -디하이드로 -MeBmt 내의 3위치에 있는 히드록시기는 비교적 반응력이 약하다. 그러므로 상술된 방법들은 2 내지 11 위치중 어느 한 곳에 히드록시 치환된 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린류들의 반응, 즉 2-위치에 -Thr-을 갖는 사이클로스포린류의 반응을 포함하며, 상기 잔기의 히드록시기와의 반응은 -MeBmt- 또는 -디하이드로-MeBmt- 중의 히드록시기와의 반응보다 우선적으로 일어난다. 그러므로 후자외의 바람직하지 못한 부반응은 쉽게 피할 수 있다.

식(Ib),(Ⅱb),(Id),(Ⅱd),(Ie) 및 (Ⅲ)에 있어서, A²및 B²는 각각 -MeBmt- 및 -αAbu-를 나타낸다.

전술된 설명을 통해서 사이클로스포린류들은 8-위치에 특정 잔기를 갖는 것으로 설명되었지만, 이러한 잔기의 배열에 대한 언급은 없다. (D)-배열이 바람직하다.

상기의 활성화된 커플링기를 갖는 사이클로스포린류 뿐만 아니라 8-위치에 아미노산 치환된 α-아미노산잔기를(여기에서 아미노치환체는 유리형태 또는 보호형태이거나, 또는 그렇지 않으면 유도체화된, 즉 아실화된 형태이다) 갖는 사이클로스포린류는 신규의 것이며, 본 발명의 일부이다. 따라서 본 발명은 다음과 같은 사이클로스포린류를 제공한다 :

1.1 활성화된 커플링기를 갖는 α-아미노산 잔기를 지닌 사이클로스포린.

1.2 1.1에 있어서, 2 내지 11 위치중 어느 한곳에 상기의 α-아미노산 잔기가 존재하는 사이클로스포린.

1.3 1.2에 있어서, 상기의 α-아미노산 잔기가 아실아미노-, 아실옥시- 또는 알콕시가 치환된 α-아미노산잔기(여기서 활성화된 커플링기는 아실아미노-, 아실옥시- 또는 알콕시 치환체상에 존재한다)로 구성된 사이클로스포린.

1.4 1.1 내지 1.3중 어느 하나에 있어서, 활성화된 커플링기는 활성화된 에스테르, 활성화된 디티오 또는 에폭시기인 사이클로스포린.

1.5 1.3에 있어서, 상기의 α-아미노산잔기는 아실아미노치환된 α-아미노산잔기(여기서 아실아미노 치환체는 활성화된 카르복시기 또는 활성화된 디티오기에 의해 이것의 아실부내가 치환된 것이다) : 아실옥시 치환된 α-아미노산 잔기(여기서 아실옥시 치환체는 활성화된 카르복시기에 의해 이것의 아실부내에서 치환된 것이다) ; 또는 알콕시 치환된 α-아미노산 잔기(여기서 알콕시치환체는 에폭시기에 의해 치환된 것이다) 등으로 구성되는 사이클로스포린.

1.6 1.3 내지 1.5중 어느 하나에 있어서, 상기의 α-아미노산 잔기는 2-위치에 있는 (0-아실)-트레오닐 잔기인 사이클로스포린.

1.7 1.6에 이어서, 상기 아실부가 ZO-CO-CH₂-CH₂-CO-로 표시되는(여기서 Z는 카르복시활성기이다) 사이클로스포린.

1.8 1.2에 있어서, 상기의 α-아미노산 잔기가 5-, 5-, 7- 또는 8-위치에 존재하는 사이클로스포린.

1.9 1.8에 있어서, 상기의 α-아미노산 잔기는 8-위치에 존재하는 (D)α-아미노산 잔기인 사이클로스포린.

1.10 1.9에 있어서 상기의 α-아미노산 잔류기는 아실아미노가 치환된 (D)α-아미노산 잔기(여기서 활성화된 커플링기는 아실아미노 치환체상에 존재한다)인 사이클로스포린.

1.11 1.10에 있어서, 활성화된 커플링기는 활성화된 카르복시 또는 활성화된 디티오기인 사이클로스포린.

1.12 8-위치에 유리 또는 보호형태로 존재하는 아미노치환체가 치환된 (D)α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린.

1.13 8-위치에 아실아미노가 치환된 (D)α-아미노산 잔기(여기서 아실아미노 치환체는 유리카르복시기에 의해 이것의 아실부내가 치환된 것이다)를 갖는 사이클로스포린.

1.14 1.10 내지 1.13중 어느 하나에 있어서 하기식으로 존재하는 사이클로스포린.

상기식에서 X는 수소, 아미노보호기, 또는 유리 카르복시기 또는 활성화된 커플링기(예를들면 활성화된 카르복시기 또는 디티오기이다)에 의해 치환된 아실기이며, 이 아실기는 하기식으로 표시된다.

Y-CH₂-CH₂-CO-

상기식에서 Y는 카르복시, 활성화된 카르복시기 또는 활성화된 디티오기이다.

1.15 상술된 식(Ⅱa), (Ib), (Ⅱb), (Ⅱc), (Id), (Ⅱd) 또는 (Ie)의 사이클로스포린.

1.1 내지 1.11, 1.14 또는 1.15에서 정의한 바와 같이, 상술한 활성화된 커플링기를 지닌 사이클로스포린류를 사용하여 제조된, 즉 활성화된 커플링기를 경유해 커플화된 사이클로스포린류와 담체로 구성된 면역원성 복합체는 먼저, 사이클로스포린류와 그의 대사산물 사이를 식별할수 있는 모노클론 항체 형성을 가능케한다. 즉. 상술된 것처럼 합텐 성분으로서 상기의 사이클로스포린류의 반응 생성물을 함유하는 면역원성복합체는 접종된 동물체내에서 항체 반응을 끌어낼수 있다. 동물체내에서 회수된 항체 생산세포(cell), 즉 비장세포 또는 임파절세포를 치료목적으로 투여된 사이클로스포린과 이것의 대사산물, 특히 인체내의 대사산물인 사이클로스포린 17과 사이클로스포린 18 사이를 식별할 수 있는 모노클론항체를 제공하는 하이브리도마 라인의 제조에 사용할수 있다. 이러한 항원성 복합체는 지금까지 비공지된 것으로서 본 발명은 다음과 같은 복합체를 제공한다 :

2.1 1.1 내지 1.11, 1.14 또는 1.15(식 (Ⅱa), (Ⅱb), (Ⅱc) 또는 (Ⅱd))에서 정의한 바와 같은 사이클로스포린에 활성화된 커플링기를 경유해 담체를 커플링시켜 제조된 면역원성 복합체, 예를들면 전술한 활성화된 커플링기를 함유하는 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린류에 담체를 커플링시킨 면역원성 복합체.

2.2 활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산 잔기를 갖는 사이클로스포린을 커플링시켜 얻어진 또는 제조될 수 있는 면역원성 복합체로, 상기 사이클로스포린은 1.1-1.11, 1.14 또는 1.15 식 (Ⅱa), (Ⅱb), (Ⅱc) 또는 (Ⅱd) 중 어느 하나에 정의된 것인 면역원성 복합체.

2.3 사이클로스포린과 이것의 대사산물 사이의 상이점을 식별할 수 있는 모노클론항체의 제조에 사용할 수 있는 상기 2.1 또는 2.2에서 정의된 바와 같은 면역원성 복합체로서, 상기 모노클론 항체는 후술되는 3.1-3.10중 어느 하나에 정의되는 것과 같은 것을 특징으로 하는 면역원성 복합체.

본 발명은 면역원성 복합체에 적합한 담체는 공지된 것으로 고분자량의 폴리펩타이드, 특히 닭 또는 기니아피그 IgG같은 IgG류의 혈청알부민인 소의 혈청알부민 및 닭의 오브 알브민, 면역글로블린등과 같은 단백질 및 폴리글루타민산 같은 합성 중합체를 포함한다.

본 발명은 또한 상술된 것과 같은 면역원성 복합체의 제조 방법을 제공하는데 이 방법은 다음과 같다.

활성화된 커플링기를 함유하는 상술된 담체와 히드록시기 또는 아미노기 같은 공동반응성기를 함유하는 α-아미노산 잔기를 갖는 [Thr]²-사이클로스포린 또는 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린 같은 사이클로스포린류를 커플링시키거나, 또는 상술된 활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산 잔기를 갖는 상기 1.1-1.11, 1.14 또는 1.15중 어느 하나에서 정의한 사이클로스포린류를 담체와 커플링시켜 복합체를 제조한다.

상기의 방법 단계는 커플링 반응제 사용없이 사이클로스포린 성분을 직접 반응시켜 수행된다.

이 반응은 디메틸포름아미드 같은 적합한 불활성 희석제 또는 담체에 용해시킨 사이클로스포린 성분을 실온하에서 담체 단백질의 완충 용해인 중탄산염완충 용액 또는 이것의 현탁액의 가함으로서 수행된다. 얻어진 면역원성 복합체는 인산염이 완충된 식염수에 대해 투석 정제한다.

2.1-2.3에서 정의된 바와같은 상기의 면역원성 복합체는 표준 기술에 의해 모노클론 항체를 제조하는데 사용될수 있다. 이 방법은 다음 단계들을 포함한다. a) 2.1-2.3중 어느 하나에 정의된 면역원성 복합체를 적합한 동물부류에 투여하는 단계 ; b) 면역원성 복합체로 감작시킨 항체 생산성-비장 세포 또는 임파절 세포를 회수하는 단계 ; c) 회수된 세포들을 영구증식화시키는 단계로, 예를들면 하이브리도마 셀라인을 제조하기 위해서 적합한 골수종 셀라인과 융합시켜 연구증식화시키는 단계 ; 그리고 d) 필요한 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 라인인 영구증식화된 세포를 선별하는 단계로 구성된다.

단계 a)는 수용체로서 쥐 또는 생쥐, 예를들면

Bal b/c생쥐를 사용하여 면역원성 복합체 50-200㎍의 양을 피하주사 또는 복강내 주사로 투여한후, 14-21일후에 약 100㎍을 다시 추가 항원자극 주사로 피하내, 복강내 또는 근육내로 투여함으로서 수행된다. RIA 및/또는 ELISA기술에 의해 측정된 바와같이 적절한 이소타잎 분포의 고역가 항혈청을 갖는 생쥐를 실시예(9)에 설명된 방법에 따라 추가 항원자극 주사를 투여한후 비장세포 같은 항체 생산성 세포를 수거한다[(단계 b)]. 단계 c)는 S. Fazekas 등에 의한 "J. Immunol. Methods" 35, 1-32(1980)에 설명된 방법을 사용하여 수행될수 있다. 여기에서 바람직한 미엘로마 라인은 생쥐(Bal b/c)라인이다. 단계 d)에서는 실시예 (9)에 설명된 것처럼 ELISA시스템 또는 사이클로스포린류의 방사능 라벨된 유도체를 사용하는 RIA시스템을 이용하여 생장중인 미엘로마 라인인 쥐(Bal b/c)라인을 사이클로스포린류에 대한 항체가 생산되는지 여부에 대해 선별한다.

본 발명의 면역원성 복합체를 사용하여 상기 과정을 적용하면, 모노클론 항체를 얻을 수 있다. 이 항체는 각각의 사이클로스포린들간의 차이점을 식별할 수 있는 특이성을 갖고 있는데, 즉 수소원자 대신에 한개의 히드록시기가 존재하는 것과 같이 단지 사소한 구조적 차이까지도 식별할 수 있는 특이성을 나타낸다. 특히 본 발명에 의해 처음으로 인체의 사이클로스포린 대사산물과 사이클로스포린류 사이를 식별할 수 있는 모노클론 항체를 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 모노클론 항체는 사이클로스포린의 대사산물과 비교적 낮게 교차 반응하는 반면, 사이클로스포린 자체와는 반응하는 것으로 알려졌다. 상기 2.1-2.3에서 정의한 것처럼 사이클로스포린 합텐 성분이 선택된 "목표" 사이클로스포린과 상응하는 본 발명에 의한 면역원성 복합체를 사용함으로서, "목표" 사이클로스포린 및 이와 구조적으로 비슷한 대사산물(인체 대사산물 같은 것)사이의 차이를 식별할수 있는 모노클론 항체를 생산할 수 있다. 그러므로 상기 1.6에서 정의한 것과 같은 2-위치에 활성화된 커플링기를 지닌 사이클로스포린류(여기서 1,3-11위치의 α-아미노산 잔기는 사이클로스포린의 것과 똑같다)와 담체와의 커플링에 의해 제조된 면역원성 복합체로부터 출발하여, 인체내 사이클로스포린 대사산물인 사이클로스포린 1, 8, 9, 10, 16, 17, 18 및/또는 21, 바람직하게는 17 및/또는 18, 더욱 바람직하게는 17 보다는 "목표" 사이클로스포린과 우선적으로 반응하는 모노클론 항체를 제조할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 1.8에서 정의된 바와같이 5-, 6-, 7- 또는 8-위치, 특히 상기 1.9, 1.11, 1.14 또는 1.15에서 정의한 바와같이 8-위치(일반식(Ⅱb) 또는 (Ⅱd))에 활성화된 커플링기를 지닌 사이클로스포린류(남은부위 1-7과 9-11위치에 있는 잔기는 사이클로스포린, 디하이드로 -[Val]²-사이클로스포린 또는 [Nva]²-사이클로스포린내의 잔기에 상응한다)과 담체를 커플링시켜 제조된 면역원성 복합체에서 출발하여 인체내의 사이클로스포린 대사산물(상술됨)보다는 "목표" 사이클로스포린류인 사이클로스포린, 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린 또는 [Nva]²-사이클로스포린과 더 우선적으로 반응하는 모노클론 항체를 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 제조될 수 있는 모노클론 항체는 "목표" 사이클로스포린류와 1-위치의 α-아미노산 잔기가 구조적으로 변형된 이것의 대사산물 사이의 상이점을 식별할 수 있다. 여기서 대사산물이란 1-위치에 있는 -MeBmt- 또는 -디하이드로-MeBmt- 잔기를 화학적으로 변형 또는 치환에 의해 변형시킴으로써 유도된 대사되지 않은 사이클로스포린과는 다른 물질로서, 특히 1-위치의 잔기 말단 부위에 구조적 변형을 나타낸다. 즉, 대사산물인 사이클로스포린 17에 대해서는 비교적 낮은 교차 반응력을 보이며 사이클로스포린에 대해서는 높은 반응력을 보이는 후술되는 실시예(9)의 모노클론 항체의 경우에는 말단기인 (C⁹)-MeBmt-메틸기에 히드록실화반응을 포함한다. 이와같이 사이클로스포린의 대사성변형이 사이클로스포린 17 및 18의 경우에서처럼 인체내에의 대부분의 대사물들의 특징으로서 중요한 의미를 갖는한, 이러한 변형을 나타내는 사이클로스포린류와 그의 대사산물 사이를 식별하는 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 모노클론 항체의 능력은 특히 주목되고 있다.

약 pH 6-8, 바람직하게는 7-8의 완충용액(Tween으로 시판되는 비이온성 계면활성제 또는 텐사이드를 0.01-0.1%, 바람직하게는 0.01-0.05% 함유하고 있다), 예를들면 Tween 20같은 0.03% 계면활성제를 함유한 pH 7.5의 인산염 완충식 염수를 사용하여 RIA 또는 ELISA, 바람직하게는 경쟁적 ELISA방법으로 측정하면, 대사되지 않은 사이클로스포린과의 반응성에 대한 대사산물과의 교차반응성은 약 5% 또는 그 이하, 바람직하게는 약 3% 또는 그이하, 더욱 바람직하게는 약 2% 또는 그이하이다. 그러므로 본 발명에 따라 제조될 수 있으며 사이클로스포린과 반응하는 모노클론 항체는 상기 조건하에서 경쟁적 ELISA기법을 사용하여 측정된 사이클로스포린과의 반응성을 비교해보면 사이클로스포린 17에 대한 IC₅₀비에서 35배 또는 그 이상의 차이를 가짐을 알 수 있었다.

본 발명에 의해 제조될 수 있는 모노클론 항체는 사이클로스포린 같은 "목표" 사이클로스포린류에 대해 친화력이 높은 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명에 의한 바람직한 모노클론 항체는 M

oler 등에 의해 Methods in Enzymology, 92, 589-601(1983)에 설명된 방법에 따라 목표 사이클로스포린류에 대한 친화도를 측정해보면 일반적인 RIA온도(약 4-37℃)하에서 10^-9몰/L 또는 그 이하, 바람직하게는 10^-9몰/L 또는 그 이하임을 나타낸다.

본 발명은 IgG부류, 예를들면 IgG₁준부류의 모노클론 항체 생산을 가능하게 한다. 이러한 항체는 후술되는 것처럼 진단/분석 키트 용도에 적합하므로 바람직하다.

상술된 단일클론성 항체뿐아니라 이들을 생산하는 하이브리도마 라인은 신규의 것이며, 이것은 전술된 설명에서 알수 있듯이 사이클로스포린류 약제의 치료를 받는 환자의 사이클로스포린류 약제 혈장-혈액 레벨을 측정하기 위한 진단/분석 키트 시스템에 적합하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 다음과 같은 항체를 제공한다 :

3.1 소정의 사이클로스포린류 그리고 그들의 대사산물, 특히 인체내의 최소한 하나의 주요한 대사산물 사이를 식별할 수 있느 모노클론 항체.

3.2 3.1에 있어서, 소정의 사이클로스포린 같은 사이클로스포린류와 반응하며, 그들의 대사산물, 특히 인체내의 최소한 하나의 주요한 대사산물에 대해서는 비교적 낮은 교차반응성을 나타내는 모노클론 항체.

3.3 3.1 또는 3.2에 있어서, 상기 사이클로스포린류(cyclosporin)는 사이클로스포린(Cyclosporine), 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린 또는 [Nva]²-사이클로스포린이며, 특히 사이클로스포린인 모노클론 항체.

3.4 3.1-3.3중 어느 하나에 있어서, 상기 대사산물은 1-위치의 α-아미노산 잔기, 특히 이 1위치의 잔기상의 말단 위치에서 구조적 변형을 나타내는 대사산물, 즉 1-위치의 α-아미노산 잔기인 -MeBmt-의 말단 히드록실화 반응을 나타내는 대사산물인 모노클론 항체.

3.5 3.4에 있어서, 상기 사이클로스포린류는 사이클로스포린이며, 대사산물은 사이클로스포린 1, 8, 9, 10, 16, 17, 18 또는 21, 바람직하게는 사이클로스포린 17 또는 18, 가장 바람직하게는 사이클로스포린 17인 모노클론 항체.

3.6 3.2-3.5중 어느 하나에 있어서, 상기 대사산물과의 교차반응성은 상술된 조건하에서 RIA 또는 ELISA기법으로 측정했을때 약 5% 또는 그 이하, 바람직하게는 3% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 2% 또는 그 이하인 모노클론 항체.

3.7 3.1-3.6중 어느 하나에 있어서, 상술된 조건하에서 측정했을때 소정의 사이클로스포린류에 대한 친화상수는 10^-9-몰/l 또는 그 이하, 바람직하게는 10^-10몰/l 또는 그 이하인 모노클론 항체.

3.8 3.1-3.7중 어느 하나에 있어서, IgG부류인 모노클론 항체.

3.9 3.1-3.8중 어느 하나에 있어서, a) 상기 1.1-1.11, 1.14 또는 1.15(식(Ⅱa), (Ⅱb), (Ⅱc) 또는 (Ⅱd))중 어느 하나에서 정의한 바와같은 활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산 잔기를 지닌 사이클로스포린류를 담체에 커플링시켜, 면역원성 복합체를 제조하고 ; b) 상기 면역원성 복합체를 적합한 동물중에 투여시켜 면역원공격을 실시한후, 상기 복합체에 의해 감작된 항체생산성 세포를 회수하고 ; c) 상기 항체 생산성 세포를 적합한 골수종 셀라인과 융합시켜 영구증식화시키고 ; d) 하이브리도마 셀라인 같은 선택된 영구증식화된 셀라인으로 부터 모노클론 항체를 회수함으로써 제조된 모노클론 항체.

3.10 3.1-3.8중 어느 하나에 있어서 a) 2.1-2.3중 어느 하나에 의한 면역원성 복합체에 의해 감작된 항체 생산성 세포를 회수하고 ; b) 이 항체 생산성 세포를 적합한 골수중 셀라인과의 융합시켜 영구증식화 시키고 ; c) 하이브리도마 셀라인같은 선택된 영구증식화된 셀라인으로부터 필요한 모노클론 항체를 회수함으로써 제조된 모노클론 항체.

4.1 3.1-3.8중 어느 하나에 의한 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 셀라인.

4.2 3.9의 단계 a)-c) 또는 3.10의 단계 a) 및 b)에 의해 제조된 또는 제조될 수 있는 하이브리도마 셀라인.

상술된 것처럼, 본 발명에 의한 모노클론 항체는 소정의 사이클로스포린류와 이것의 대다수의 대사산물 사이를 식별할 수 있는데, 이를테면 그 대부분의 대사산물에 대해 낮은 교차 반응성을 나타낸다.

본 발명은 또한 다음과 같은 방법을 제공한다 :

vii) 상기 3.1-3.8중 어느 하나에서 정의된 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 셀라인을 배양하고, 이렇게 생산된 항체를 회수하는 것으로 구성된 모노클론 항체의 제조방법 ; viii) 3.1-3.8중 어느 하나에 정의된 모노클론 항체를 생산하는 항체 생산성 세포(이를테면, 비장 또는 임파절 세포)를 적합한 골수종 셀라인과 융합시킴으로서 항체생산성 세포를 영구증식화시키는 것을 포함하는 상기 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 셀라인의 제조방법.

상기 방법단계들은 상술된 바와같은 표준방법 또는 첨부된 실시예에 설명된 바와같이 실시될 수 있으며 방법 viii)에 사용되는 바람직한 골수종 셀라인은 쥐(Bal b/c) 골수종 셀라인이다.

본 발명에 있어서 1.14 또는 1.15(식 Id)에 정의한 것처럼 8-위치에서 -(D)Lys-잔기를 갖는 사이클로스포린류뿐 아니라 그들의 N-ε-원자가 유도체화된 유도체는 상응하는 "모체" 사이클로스포린류(8-위치에서 -(D)Ala-를 갖는 상응하는 사이클로스포린류)의 세포결합특성과 거의 유사한 정도의 세포결합 특성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이러한 사실은 -(D)Lys-의 N-ε-질소원자가 라벨링이 실시되는 이상적인 위치, 즉 라벨기 또는 추적기(tracer groups)가 도입되는 위치를 제공하기 때문에 매우 중요하다. 상술된 라벨시킨 사이클로스포린류는 실험관내의 조직 배양물제제내에서 "모체" 사이클로스포린류의 결합부위를 동정하거나 및/또는 "모체" 사이클로스포린류(예, 사이클로스포린의 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린류의 경우)의 작용 메카니즘을 연구하는데 중요한 수단을 제공해준다. 즉 방사능라벨된¹²⁵I라벨-유도체들은 신장 마이크로-자동방사그라피에서처럼 조직에 대한 급속한 자동방사그래피법에 유용하다.

그 외에도, 8-위치에 -(D)Lys-잔기를 지닌 사이클로스포린류로부터 제조할 수 있는 방사능 라벨 또는 형광 라벨된 유도체들은 RIA 및 FIA진단용 키트에 사용하기 위한 이상적 성분을 제공한다. 따라서, [(D)Lys]⁸-사이클로스포린류는 상기 정의한 것과같은 또는 본 발명에 의해 얻어진 것과같은 모체 사이클로스포린의 모노클론 항체에 대한 결합특성과 똑같은 결합특성을 갖는 라벨된 "모체" 사이클로스포린의 유사물을 용이하게 제조할 수 있는 수단을 제공하며, 이 유사물들은 진단/분석키트 성분 또는 보조성분으로 유용하다.

따라서 본 발명은 다음과 같은 유도체를 제공한다 :

5.1 8-위치에서의 잔기가 -(D)Lys-인 사이클로스포린류의 라벨된 유도체; 특히

5.2 상기 정의한 식(Id) 사이클로스포린류의 라벨된 유도체.

본 명세서에서 사용되는 "라벨된 유도체"란 해당유도체의 정량분석 또는 위치 분석을 용이하게하는 추적원소(tracer atom), 마커원소(marker atom) 또는 표지 그룹을 함유한 유도체를 뜻한다. 이러한 유도체로는 다음과 같은 것이 있다 ; -(D)Lys-잔기의 하나이상의 원자들이 방사능 원자와 같이 추적 또는 마커원자로 작용하는 유도체, 그리고 추적 또는 마커그룹이 -(D)Lys-잔기의 N-ε-원자에 연결된 유도체. 상기에서 추적 또는 마커그룹을 상기 잔기의 N-ε-원자에 연결시키는 방법은 상기 추적 또는 마커그룹을 상기 N-ε-원자에 직접결합시키거나, 추적 또는 마커그룹을 개재성 연결부를 경유해 N-ε-원자에 결합시킴으로써 얻어진다. 라벨된 유도체의 예로는 방사능 라벨된 유도체, 형광 및 화학발광성 유도체 및 광친화성 라벨링에 적합한 유도체등을 포함한다. 즉 광친화성 라벨링법이란 광을 조사하면 사이클로스포린이 결합되는 단백질과 반응하는 치환체를 제공하는 방법이다.

전술된 방사는 라벨된 유도체는 8-위치에 있는 -(D)Lys-잔기의 N-ε-원자가¹²⁵I/로 라벨된 p-OH-페닐-프로피오닐 잔기에 부착된 유도체를 포함한다. 전술된 형광 및 화학발광성 유도체는 8-위치에있는 -(D)Lys-잔기의 N-ε-원자가 단실기(dansyl group) 또는 로다민기 같은 형광성기, 또는 아크리디늄 에스테르기 같은 화학발광성기에 부착된 유도체를 포함한다. 이것은 Clin. Chem. 29 8, pp.1474-1479(1983)에 기술되어 있다. 5.1과 5.2에서 정의된 사이클로스포린류의 특성부류는 다음과 같다 :

5.3 8-위치에 있는 잔기가 하기식으로 표시되는 잔기인 류.

상기식에서 Q는 추적그룹 또는 마커그룹이거나, 이런 그룹을 포함하는 것으로서, 바람직한 추적그룹은 상술된 방사능 라벨기, 형광성기 또는 화학 발광성기이다.

상술한 라벨된 유도체는 상기 단계 iv)와 v) 방법과 유사한 방법으로 제조될 수 있으며, 즉 8-위치의 -(D)Lys-잔기를 사전 라벨시킨 출발물질을 사용하여 제조될 수 있다. 대안으로서 그들은 8-위치에 있는 -(D)Lys-잔기의 N-ε-원자에 적합한 라벨링 치환체를 도입시켜 제조할 수 있다. 따라서 형광성 라벨된 유도체는 N-ε-단실화(dansylation) 방법에서와 같이 N-ε-원자에 형광부를 연결시킴으로써 제조된다. 이와 유사하게, 방사능 라벨된 유도체는 방사능 라벨된 치환체를 N-ε-원자에 연결시켜 제조될 수 있다. 후자의 경우에 있어서, 치환체는 도입하기전에 라벨된 형태이거나 또는 도입후에 라벨시킬 수 있다. 예를들면 8-위치에 있는 리신 잔기의 N-ε-원자는¹²⁵I 라벨된 p-OH-페닐-프로피온산과 집접 반응하거나 또는 라벨되지 않은 p-OH-페닐-프로피온산과 직접 반응시켜, 산출된 N-ε-아미드를¹²⁵I를 사용해 p-OH-페닐부를 라벨시킨다. 커플링은 종래기술에 공지된 방법에 따라 실시되는데, 이를테면 N-히드록시-숙신이미드 에스테르 형태의 p-OH-페닐-프로피온산(라벨된 것 또는 라벨되지 않은 것)과 반응시킴으로써 커플링 반응이 실시될 수 있다.¹²⁵I 라벨된 p-OH-페닐-프로피온산을 클로라민 T-방법 [Hunter and Greenwood, Nature, 194, 495(1962)]에 의해 제조될 수 있다. 라벨링이 커플링 반응이후에 실시될때, 이것은 클로라민 T-방법 또는 아이오도겐-방법[Good, J.Clin. -Chem.Clin.Biochem., 19,1051(1981)]을 사용하여 실시될 수 있다. 상술한 바와같이 라벨링이 용이한 본 발명의 사이클로스포린류 유도체들은 본 발명의 라벨된 유도체의 전구체들이며, 이들은 본 발명의 범위내에 포함된다. 여기에서 라벨링이 용이한 유도체로는 8-위치에 있는 -(D)Lys-의 N-ε-원자가 p-OH-페닐 프로오닐과 같이¹²⁵I에 의한 요오드화 반응이 용이한기로 치환된 유도체를 포함한다.

본 발명은 또한 다음과 같은 것을 제공한다 :

ix) 소정의 라벨되지 않은 유리 또는 보호된 사이클로스포린류를 라벨시키고, 필요하다면 상기 방법단계 iv)를 실시하는 것으로 구성된 유리 또는 보호된 형태의 상기 5.1 내지 5.3에서 정의된 라벨된 유도체를 제조하는 방법. 이때 상기 라벨시키는 단계는 상술된 라벨링 치환체를 8-위치에 있는 -(D)Lys-잔기의 N-ε-원자에 도입시킴으로써 실시된다.

1.12에서 정의된 유리 아미노기를 지닌 사이클로스포린류(예를들면, 화합물 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린)는 면역억제작용, 항염증작용 및 기생충작용(예, 항말라리아병, 항 콕시디오이데스병) 같은 약학적 활성을 갖고 있다. 상기 활성들은 유럽특허 제0,056,782호에 기술된 여러 테스트 방법에 따라 생체내 및 실험관내에서 입증이 될 수 있다.

본 발명에 있어서 담체분자가 5-, 6-, 7-, 또는 8-위치 특히 8-위치에 있는 잔기를 경유해 합텐인 사이클로스포린류에 커플링된 면역원성 복합체(2.1-2.3에서 정의된 복합체)뿐 아니라, 상기위치중 어느 한위치에서 활성화된 커플링기 이외의 반응성 기를 지닌 아미노산을 함유한 사이클로스포린류를 커플링 반응제에 의해 담체에 결합시켜 얻어진 복합체는 (Thr)²-사이클로스포린내의 -(Thr)²-에 담체를 커플링시켜 얻는 복합체를 사용하여 지금까지 얻어진 것보다 더 높은 특이성을 갖는 폴리클론 항혈청을 생성시킬 수 있다.

(상술된 "반응성기"란 담체(즉 폴리펩타이드 또는 기타적합한 거대분자)와 커플링을 가능하게하는 기이다. 일반적으로 이 용어는 지금까지 정의된 활성화 커플링기를 포함할뿐 아니라 반응할 수 있는 유리아미노기, 카르복시기 떠는 히드록시기 등을 포괄)한다.

5-, 6-, 7- 또는 8-위치의 α-아미노산 잔기를 경유하여 담체에 결합된 합텐인 사이클로스포린류를 함유하는 면역원성 복합체는 신규의 것이다. 이러한 복합체의 합텐부를 제공하는 바람직한 사이클로스포린류는 특히 1.8-1.11, 1.14 및 1.15(식 (Ⅱb) 및 (Ⅱd))에서 정의한 활성화된 커플링기를 지닌 것들이다.

본 발명은 다음과 같은 복합체를 제공한다 :

2.4 상기 사이클로스포린류의 5-, 6-, 7- 또는 8-위치의 α-아미노산 잔기를 경유해 사이클로스포린에 커플링된 담체를 포함하는 면역원성 복합체.

2.5 1.8-1.11, 1.14 또는 1.15(식 (Ⅱb) 및 (Ⅱd)) 중 어느 하나에서 정의된 활성화된 커플링기를 지닌 사이클로스포린류와 함께 커플링된 담체를 함유하는 면역원성 복합체.

2.6 1.12-1.14 및 1.15(식 (Ib) 및 (Id)) 중 어느 하나에서 결합된 유리아미노기 또는 카르복시기를 지닌 사이클로스포린류, 특히 상기 정의한 식(Id) 또는 1.14에서 정의한 사이클로스포린류와 함께 커플링된 담체를 함유하는 면역원성 복합체.

3.11 전술된 3.9에 있어서 단계 a)에서 사용된 사이클로스포린류는 상기 2.5에서 정의된 사이클로스포린류인 것을 특징으로하는 모노클론 항체.

6.1 상기 2.4-2.6중 어느 하나에서 정의한 면역원성 복합체에 대한 반응으로 생성된 사이클로스포린류와 반응하는 항체(사이클로스포린류와 반응하는 항체를 함유한 폴리클론 항혈청포함).

6.2 6.1에 있어서 사이클로스포린, 디하이드로-[Val]²-사이클로스포린 또는 -[Nva]²-사이클로스포린, 바람직하게는 사이클로스포린과 반응하는 항체.

2.5에서 정의된 면역원성 복합체는 단계 vi)의 방법에 따라 제조할 수 있다. 2.6에서 정의된 면역원성 복합체는 상술된 방법에 의해 제조될 수 있거나 또는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다 :

x) 반응 성기를 함유한 α-아미노산 잔기(즉, 반응성기를 포함하는 α-탄소원자에 측쇄를 갖는 α-아미노산 잔기)를 갖는 사이클로스포린류, 예를들면 상기 1.12-1.14 및 1.15(식 (Ib) 및 (Id))중 하나에 의해 정의된 유리아미노기 또는 카르복시기를 함유한 사이클로스포린류에 담체를 커플링시키는 방법.

상기 방법단계는 커플링 반응제의 중앙부를 경유해 사이클로스포린을 담체에 결합시킴으로서 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 그러므로 8-위치에 -(D)Lys-잔기를 갖는 사이클로스포린류의 경우에 있어서, 폴리펩타이드(예를들면, 면역글로블린)같은 담체를 -(D)Lys-N-ε-원자에 결합시켜 복합체를 얻을 수 있는데, 이때 결합시키는 방법은 카보디이미드 방법[Kellie et al., "Steroid Immunology", ed Cameron et al., Alpha, Omega, Cardiff, 1975] 또는 커플링 반응제로서 포름알데히드를 사용하는 Mannich 반응에 의해 제조될 수 있다.

적합한 담체로는 모노클론 항체를 제조하기 위한 복합체의 제조방법과 관련하여 이미 언급된 유형의 담체를 포함하며, 특히 고분자량의 폴리펩타이드, 특히 혈청 알부민, 면역글로블린 같은 단백질과 폴리글루탐산 같은 합성 중합체를 포함한다.

모노클론 항체의 특이성이 결여된 상기 정의한 6.1의 폴리클론 항혈청은 본 기술분야에 공지된 폴리클론 항혈청과 비교하여 볼때 사이클로스포린에 대한 개선된 특이성을 갖는다는 관점에서 진단/분석키트의 성분으로서 유용하다. 이 폴리클론 항혈청은 통상의 방법, 즉, 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다 :

xi) 2.4-2.6중 어느 하나에 의해 정의된 면역원성 복합체를 적당한 동물조에 투여하여 면역반응을 일으킨후, 생성된 항혈청을 회수하는 방법.

상기 단계 xi) 방법은 쥐, 양 또는 닭에 면역원성 복합체를 투여(이를테면, 주사법으로)하여 수행할 수 있다. 적절한 시간동안 배양한후 항혈청을 회수하고, 나중에 키트에 사용하기 위해 적당히 동결건조한다. 배양시간은 RIA에 의해 1 : 2,000이상, 예를들면 1 : 7,000 내지 1 : 10, 000범위의 항혈청 역가를 제공하는 시간으로 선택한다.

이미 언급한 바와같이 본 발명의 사이클로스포린류뿐 아니라 모노클론 항체와 폴리클론 항체들이 모두 진단/분석 키트 시스템(이를테면, 면역분석 키트)의 성분으로 유용하다.

따라서, 본 발명은 다음과 같은 면역분석키트를 제공한다 :

7. 치료제 사이클로스포린과 같은 사이클로스포린류를 투여한 환자체내의 사이클로스포린 존재를 분석하기 위한 면역분석키트 또는 시스템(즉 RIA 또는 FIA키트)에 있어서, 이 키트 또는 시스템은 그 구성성분으로 다음을 포함하고 있다.

A) 3.1-3.11 또는 6.1-6.2중 어느 하나에서 정의된 항체 또는 항혈청, 특히, 3.1-3.11중 어느 하나에 의해 정의된 모노클론 항체, 및/또는 B) 상기 5.1-5.3중 어느 하나에서 정의된 사이클로스포린류의 라벨화된 유도체.

상기 7에서 정의한 키트는 혈액, 혈장 또는 요중에 존재하는 사이클로스포린류의 양을 정량하기 위한 진단목적에 유용하며, 이것은 사이클로스포린 치료를 받는 환자들에 대한 적절한 투여량을 결정하는 수단이된다. 이러한 키트는 종래 알려진바 없는 우수한 감도로 사이클로스포린 같은 사이클로스포린류를 분석하는 수단을 제공한다.

본 발명에 의한 키트(즉 RIA 및 FIA키트)는 통상의 RIA 및 FIA분석기술에 따라 사용되는 통상의 타잎일 수 있다. 그러므로 RIA키트는 상기 (A)에서 기술된 항혈청 또는 항체(A)이외에도 상기 (B)에서 언급된 적당히 라벨된 사이클로스포린 유도체(B)와, 표준 사이클로스포린류 화합물(C)을 포함하고 있다. 여기에서 라벨된 사이클로스포린 유도체는 분석하려는 사이클로스포린류에 대해 상보성이 있다. 사이클로스포린을 분석하는 경우 상기(B)에서 정의된 라벨된 유도체는 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 라벨된 유도체가 적절하다. 그러나, 이것은 또한다른 라벨된 상보성 사이클로스포린일 수 있다. 예를들면 사이클로스포린을 분석하는 경우, 라벨된 상보성 사이클로스포린은 심중수소화된 사이클로스포린이다. 표준 사이클로스포린(C)은 분석될 사이클로스포린을 공지된 양으로 함유하고 있는 용액이거나 또는 그와 비슷한 것일수 있다.

동결건조상태의 항혈청/항체를 용해시키고, 성분 B), 그리고 분석용 샘플 또는 성분 C)중 하나와 함께 배양시킨다. 배양은 냉각하면서(즉, 4℃에서)실시한다. 배양혼합물의 pH는 약 5-8, 바람직하게는 약 pH 7 또는 8의 범위를 유지하면서 구연산염 또는 트리스 완충용액같은 완충제와 함께 방치한다.

약 6-12시간, 최소한 2시간동안 배양을 지속시킨다. 배양후 챠콜(예를들면, 덱스트란으로 코팅된 챠콜을 사용하여 항체에 결합한 성분 B)의 분획을 비결합 분획부분으로부터 분리해낸다. 비결합 분획부분은 챠콜상에 흡착되며, 여과 또는 원심 분리에 의해 분리된다.

한 분획부내의 방사능량은 이차 용질을 첨가한후 액체 계수 카운팅법과 같은 표준 방법에 의해 측정한다. 항체와 결합한 성분 B)의 비율은 미지의 혈장샘플내의 사이클로스포린의 양에 반비례한다. 정량분석을 위해서는 공지된 농도의 사이클로스포린 용액들을 분석하여 표준 측정곡선을 만드는 것이 유용하다.

본 발명의 FIA키트는 항체가 광 스카벤저에 결합되어 있는 것으로서 형광사이클로스포린(본 발명에 의한 형광 라벨된 유도체)과 항체사이의 경쟁에 의존하는 방법이다. 대안으로서 상기 7에서 정의된 분석키트/시스템은 본 기술분야에 공지된 통상의 ELISA시스템중 어느 하나에 기초한 것이다.

하기의 실시예는 본 발명을 예시한 것이다 :

[(D)Lys⁸]-사이클로스포린의 제조

a) CH₂Cl₂(200㎖) 및 H₂O(100㎖)에 용해된 6.4g의 H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl 말레이네이트 용액을 고체 K₂CO₃를 사용하여 pH8로 조절한다. 2회(매번 CH₂Cl₂(200㎖)를 사용함) 추출한 후, 유기상을 과량의 Na₂SO₄를 사용해 탈수시키고, 여과 및 건조상태가 될때까지 증발시켜 유리 H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl (결정질의 잔사 상태로)를 얻는다.

b) (N-ε-BOC)-FMOC-(D)Lys(6.26g)을 CHCl₃(100㎖)에 용해시킨 후 N-메틸모르폴린(2.95g)을 교반하면서 첨가한다. -20℃로 그 용액을 냉각시킨 후 피발로일 클로라이드(1.75g)을 적가하고, 반응 혼합물을 -20℃에서 6시간 동안 교반시킨다. CHCl₃(200㎖)에 용해된 H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl(6.34g) 용액을 상기 무수산용액에 적가한 후 -20℃에서 17시간 동안 교반시켜 반응을 완결한다. CHCl₃용액을 추가의 CHCl₃(200㎖)를 가해 희석한 후, 혼합물을 포화 NaHCO₃용액(100㎖)으로 진탕시킨다. 유기상을 과량의 Na₂SO₄로 탈수시키고, 여과한 후 용매를 건조상태가 될때까지 증발시킨다. 얻어진 오일 잔류물을 용출액으로서 3%의 메탄올이 첨가된 염화메틸렌을 사용해 25배량의 실리카겔(입자크기 0.063-0.2㎜) 상에서 크로마토그래피시켜 정제한다 :

[α]_D ²⁰=-114.2°(c=CHCl₃중에서 1.0).

c) 무수에탄올(400㎖)중에서 용해시킨(N-ε-BOC)-FMOC-(D) Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl(8.8g)을 Gaster 수소하기(Hydrogenator)에서 10%의 팔라듐/C 촉매(0.6g)을 사용해 이론량의 H2가 흡수될 때까지(214㎖) 수소화시킨다. 용매를 증발제거시킨 후, 잔사는 용출액으로 7%의 메탄올이 첨가된 염화메틸렌 및 50배량의 실리카겔(0.063-0.20㎜)을 사용하여 크로마토그래피로 정제시킨다 : [α]_D ²⁰=-129.1°(c=CHCl₃중에서 1.0).

d) H-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl(7.4g) 및 (N-ε-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OH(7.1g)을 염화 메틸렌(100㎖)중에 용해시키고, N-메틸모르폴린(1.72g) 및 카스트로 시약(Bt-OP(NMe₂)₃ ⁺PF₆ ^-)(5.6g)을 실온(25°)에서 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 3일동안 교반시킨 후, 용액을 염화메틸렌(200㎖)으로 희석시키고, 포화 NaHCO₃용액 (100㎖)으로 진탕시킨다. 유기상을 과량의 Na₂SO₄로 탈수시킨 후 여과하고 증발시켜 건조시킨다. 얻어진 오일 잔류물을 용출액으로서 3%의 메탄올이 첨가된 염화 메틸렌을 사용하여 실리카겔(500g)(0.06-0.20㎜)상에서 크로마토그래피하여 정제시킨다.

[α]_D ²⁰=-143.8°(c=CHCl₃중에서 1.0).

e) (N-ε-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl(5.54g)을 실온하의 염화 메틸렌(50㎖) 및 피페리딘(10㎖)의 용액중에서 총 4시간 동안 교반시킨다. 용매를 증발시키고, 산출된 오일을 용출액으로서 3%의 메탄올이 첨가된 염화 메틸렌을 사용하여 Sephadex LH20(300g) 상에서 크로마토그래피시킨다 : [α]_D ²⁰=-165.2°(c=CHCl₃중에서 1.0).

f) 0.2N의 NaOH(24㎖)를 에탄올(75㎖)에 용해된 (N-ε-BOC)- H-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl(6.48g)에 첨가한다. 7시간 경과 후, 이 용액의 pH를 2N의 HCl을 냉각하면서 적가하여 pH 4로 조절한다. 용매를 증발시킨 후, 산출된 잔류물을 CH₂Cl₂(200㎖) 및 포화 NaHCO₃(200㎖) 용액중에서 진탕시킨다. 수성 상을 2회 추출한 후(매번 염화메틸렌 200㎖를 사용), 유기상을 과량의 Na₂SO₄로 탈수시키고 여과한 뒤 증발시킨다. 생성물을 용출액으로써 20%의 메탄올이 첨가된 염화 메틸렌을 사용하여 실라카겔(300g, 0.06-0.20㎜)상에서 크로마토그래피하여 정제시킨다.

[α]_D ²⁰=-169.9°(c=CHCl₃중에서 1.0).

g) [단계 v)의 방법]

디메틸 아미노피리딘(147㎎)을 염화 메틸렌(2000㎖)에 용해된 (N-ε-BOC)-H-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MaVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OH(413㎎)에 교반하면서 첨가한다. 프로판 포스폰산 무수물[(0.19g), CH₂Cl₂중의 50% 용액]을 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 25°에서 교반시킨다. 산출된 용액을 포함 NaHCO₃용액(200㎖)으로 세척하고, 유기상을 과량의 NaSO₄로 탈수시킨 후, 여과하고 증발시킨 후, 용출액으로서 5%의 메탄올이 부가된 염화 메틸렌을 사용하여 실리카겔상(300g) (0.062-0.20㎜)에서 크로마토그래피하여 정제시킨다 : [α]_D ²⁰=-198.3°(c=CHCl₃중에서 1.0).

h) [단계 iv)의 방법]

[(N-ε-BOC)-(D)Lys]⁸-사이클로스포린(842㎎)을 트리플루오로아세트산(25㎖)를 사용해 -20℃로 냉각한 후, -20℃에서 4시간 동안 교반시킨다. 반응 용액을 냉각된 포화 K₂CO₃(10㎖)와 혼합한 후, 염화 메틸렌(200㎖)으로 3회 추출한다. 유기상을 과량의 NaSO₄로 탈수시킨 후, 여과하고 용매를 증발시킨다. 산출된 조 생성물을, 용출액으로서 1%의 메탄올이 첨가된 염화메틸렌을 사용하여 Sephadex LH20(200g) 상에서 크로마토그래피하여 본 표제의 화합물[(D)Lys]⁸-사이클로스포린을 얻는다 :

[α]_D ²⁰=-204.3°(c=CHCl₃중에서 1.0).

생성된 화합물은 표준 방법에 의해 염형태로 전환될 수 있다. 대표적인 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린 하이드로클로라이드([α]_D ²⁰=-203°c=CHCl₃중에서 1.0) 및 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린 트리플루오로아세테이트([α]_D ²⁰=-203°, c=CHCl₃중에서 1.0) 을 포함한다.

[실시예 2]

(N-ε-히드록시숙시닐)-(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 제조

[단계 iii)의 방법]

상기 실시예 1의 방법에 의해 산출된 255㎎의 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린을 200㎖의 피리딘에 용해시킨 후, 36㎎의 숙신상 무수물을 첨가한다. 산출된 용액을 실온에서 약 14시간 동안 교반시킨 후, 피리딘을 최대 40℃의 진공하에서 완전히 증발시킨다. 산출된 오일 잔류물을 2%의 메탄올이 첨가된 염화 메틸렌을 사용하여 55g의 Sephadex LH20상에서 크로마토그래피하고, 10㎖씩의 부분액을 수취한다. 순수한 표제 화합물은 15 내지 23번까지의 부분액에서 산출된다.

NMR스펙트럼 분석 결과 2.50 및 2.70ppm에서 숙시닐 프로톤(넓은 시그날)이 나타났으며, 3.25ppm에서 -CH₂-NH-COCH₂CH₂COOH의 시그날이 나타남을 알 수 있다.

실시예 3

[(O-히드록시숙시닐)-Thr]²-사이클로스포린의 제조

[단계 iii)의 방법]

6.05g의 [Thr]²-사이클로스포린을 20㎖의 피리딘에 용해시킨 후, 3.66g의 4-디메틸아미노-피리딘 및 1.5g의 숙신상 무수물 75℃에서 첨가한다. 반응혼합물을 75℃에서 4시간 동안 교반시킨 후 500㎖의 CH₂Cl₂로 희석시키고, 각각 50㎖의 2N HCl을 사용해 5회 세척한 뒤 150㎖의 H₂O로 1회 세척한다. 유기상을 추출하고 과량의 Na₂SO₄로 탈수시킨 후 증발시키고, 용출액으로서 아세트산을 사용하여 250g의 실리카겔(0.040-0.062㎜)상에서 크로마토그래피시켜 정제한다.

실시예 4

[(N-ε-숙신이미도옥시숙시닐)-(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 제조

[단계 i)의 방법]

상기 실시예 2에 따라 제조된 [(N-ε-히드록시숙시닐)-(D)Lys⁸]-사이클로스포린 50㎎, 14㎎의 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 HCl, 23.8㎎의 N-히드록시숙신이미드 및 24.6㎎의 트리에틸아민을 2시간 동안 실온하에 2㎖의 염화메틸렌중에서 교반시켜, 무색의 맑은 용액을 얻는다. 산출된 용액을 50㎖의 염화메틸렌 및 10㎖의 H₂O로 희석시킨 후, 1N의 HCl를 pH6이 될때까지 적가한다. 2상의 혼합물이 얻어지면, 각각에 HCl를 첨가하여 철저히 흔든다. 유기상은 10㎖의 묽은 NaHCO₃용액으로 진탕시킨 후, 과량의 Na₂SO₄상에서 건조시키고 여과시킨 다음 용매를 증발제거시켜, 본 표제의 화합물을 얻는다.

NMR 스펙트럼은 2.50 및 2.75ppm(J=5cps)에서 숙시닐 프로톤이 존재함을 나타내며, 2.18 및 2.19ppm(2S)에서 N-숙신이미도프로톤이 존재함을 나타내고 있다. 8-위치의 잔기는 하기 구조를 갖는다 :

실시예 5

[(O-숙신이미도옥시숙시닐)-Thr]²-사이클로스포린의 제조

[단계 i)의 방법]

54㎎의 트리에틸아민, 98㎎의 N-히드록시숙신이미드 및 102㎎의 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보이미드를 10㎖의 염화메틸렌에 용해된 200㎎의 [(O-히드록시숙시닐)-Thr]²-사이클로스포린(상기 실시예 3의 방법에 따라 제조됨)에 첨가하는데, 이러한 첨가는 20℃에서 습기를 배출시키면서 실시한다.

반응 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 200㎖의 염화메틸렌으로 희석하고 50㎖의 H₂O과 함께 진탕한다. 1N의 HCl을 적가하여 수성상의 pH를 5 내지 6으로 조절한다. 수성 상은 100㎖의 염화메틸렌으로 추출하며, 유기상은 0.1N의 NaHCO₃로 세척하고 과량의 Na₂SO₄로 탈수한 뒤 여과하고, 증발시킨다. 잔류물은 용출액으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 110g의 실리카겔에서 크로마토그래피로 정제함으로써 본 표제의 화합물을 얻는다.

[α]_D ²⁰=-178°c=CHCl₃중에서 1.0). CDCl₃중에서의¹H-NMR은 2.80ppm에서 숙신이미도 프로톤(단일상태)이 존재하며, 2.60ppm에서 숙시닐 프로톤(다중상태)에 존재함을 나타내준다. 2-위치의 잔기는 하기 구조를 갖는다 :

실시예 6

[(N-(3-(2-피리딜)디티오)프로피온-1-일)-(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 제조

[단계 ii)의 방법]

35㎎의 숙시닐-3-[(2-피리딜)디티오]프로피오네이트를 20℃에서 10㎖의 염화메틸렌을 용해된 126㎎의 [(D)Lys⁸]-사이클로스포린 용액에 첨가하고, 습기를 제거한다. 반응 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반한 후, 200㎖의 염화메틸렌으로 희석하고, 50㎖의 포화 NaHCO₃로 진탕시킨다. 수성상은 150㎖의 염화메틸렌으로 추출하고, 유기상은 H₂O로 세척한 후 과량의 Na₂SO₄로 탈수시키고, 여과한 후 증발시킨다. 비결정질 잔류물은 용출액으로서 염화메틸렌/메탄올(95 : 5)을 사용하여 100g의 실리카겔상에서 크로마토그래피시켜 정제하여, 순수한 표제 화합물을 얻는다 :

[α]_D ²⁰=-165°(c=CHCl₃중에서 1.0).

8-위치의 잔기는 하기 식으로 표시된다.

실시예 7

상기의 2.1에서 정의한 타잎의 면역원성 사이클로스포린-담체-복합체의 제조

[방법 단계 vi)]

7.1 닭의 γ-글로불린을 사용한 복합체

실시예(4)의 방법에 따라 제조된 10㎎의 [N-ε-숙신이미도옥시숙시닐)-(D)Lys]⁸-사이클로스포린을 4㎖ NaHCO₃(1.5% w/v, pH 8.1) 중에 닭의 γ-글로불린 100㎎에 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 교반한다. 얻어진 복합체는 인산염환충 식염수로 투성정제한다.

7.2 닭의 오브 알부민을 사용한 복합체

100㎕의 디메틸포름 아미드중에 용해된 2회 삼중 수소화한 물질 10% 1-2μCi/㎎-실시예 5와 유사하게 제조되지만 출발물질로 삼중 수소화한 [Thr]²-사이클로스포린을 사용함]을 추가로 함유한 실시예(5)의 방법에 의해 제조된 [(O-숙신이미도옥시숙시닐)-Thr]²-사이클로스포린 10.7㎎을 1.5%의 NaHCO3 완충용액(과몰량의 사이클로스포린/오브 알부민=10.68) 2㎖중의 닭 오브 알부민 30.45㎎에 교반과 함께 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 얻어진 복합체는 4℃에서 18시간 동안 인삼염 완충식염수에 대해 3회 투석정제시킨다. 생성된 복합체에 대해, 투입 방사능의 55.7%는 오브 알부민과 결합하였음을 알 수 있으며, 이로써 사이클로스포린/오브 알부민 결합비 5.95임을 알 수 있다.

사이클로스포린과 오브 알부민과의 공유 결합은 복합체 부분 표본의 3개를 아세톤 침전시켜 평가한다. 비공유 결합된 사이클로스포린에 해당하는 방사능 39.5%는 아세톤성 상청액중에서 측정되었는데, 따라서 최종 사이클로스포린/오브 알부민의 공유 결합비는 3.6임을 알 수 있다. 산출된 복합체를 부분 표본으로 취하여, 이것을 -20℃에서 유지시킨다.

비슷한 복합체들이 실시예 7.1과 7.2와 비슷하게 제조되지만, 사이클로스포린류 출발물질로서 실시예 (6)의 생성물을 사용하였다.

실시예 8

2.4/2.6에서 정의한 타잎의 면역원성 사이클로스포린-담체 복합체의 제조

8.1 기니아 피그 IgG을 사용한 복합체

기니아 피그 IgG(30㎎)을 0.1M의 중탄산염 완충용액(pH 9, 0.5㎖)에 용해시키고 같은 완충 용액(0.5㎖)중에 용해시킨 실시예 (1)의 방법에 따라 제조된 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린(1㎎) 용액에 가한 후, 1%의 아세톤 몇방울을 가한다. N-에틸-N°-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드를 계속해서 2회(매회=100㎎)로 나누어 첨가하여 커플링을 실시한다. 반응 생성물은 24시간 후에 주사용으로 사용하기 위해 물로 여러회 투석한 뒤 동결 건조시켜 둔다.

8.2 토끼 IgG를 사용한 복합체

실시예(1)의 방법에 따라 제조한 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린(10㎎)을 6.9㎍(=0.1mci)의 삼중수소화된 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 에탄올성 용액 0.1㎖에 용해한다. 0.1㎖에 용해한다. 0.1㎖의 피리딘과 35%의 포름알데하이드 0.1㎖를 가하고 실온에서 30분간 유지시킨다. 0.02M의 인산염 완충 식염수(1㎖)중의 토끼 IgG 20㎎과 0.3㎖의 피리딘을 가하고, 반응물을 실온에서 14시간 동안 방치한다. 산출된 복합체를 30%의 피리딘, 10%의 피리딘에 대해 투석시키고, 최종적으로 0.005M의 인산염 완충 식염수로 투석한다. 복합체의 커플링비는 1 : 11.4이다.

실시예 9

사이클로스포린과 반응하는 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 셀라인의 제조방법

[방법 단계 viii)]

9.1 실시예 7.1의 복합체를 사용하는 방법

면역법

0.2㎖의 완전 Freund 보강제중에 유화시킨 실시예 7.1에서 제조된 면역원성 복합체 100μG을 암컷 Bal b/c 쥐(20-25g)에 복강내로 주사 투여하였다. 2주일 후 0.2㎖의 완전 Freund 보강제중에 유화된 실시예 7.1의 생성물 50㎍을 함유한 주사액으로 이차 추가항원 접종(복강내 주사)을 실시했다. 추적용 표지로서 트리튬이 라벨된 사이클로스포린을 사용하여 RIA 분석을 실시해 처리된 쥐의 혈청내에 사이클로스포린에 반응하는 항체가 존재함을 확인했다.

b) 하이브리도마 제조

최대의 사이클로스포린 반응성 항체 역가를 나타낸 단계 a)에서 얻어진 쥐에 실시예 3.2의 생성물 20㎍을 식염수(0.85% w/v)에 유탁시킨 추가 항원 자극용 주사액을 정맥내로 투여한다. 이 쥐를 4일째에 죽여서 비장 세포를 분리해낸 후 S. Fazekas et al., J Immunol. Methods, 35, 1-21(1980)에 기술된 방법에 따라 쥐(Bal b/c) 골수종 세포와 융합시킨다.

추적용 표지로 트리튬이 라벨된 사이클로스포린을 이용하여 RIA기법으로 사이클로스포린에 대해 반응하는 항체 생산 여부에 대해 증식한 하이브리도마들을 선별하고, 또한 추적용 표지로 트리튬 라벨된 사이클로스포린을 사용하고, 경쟁적 리간드로 사이클로스포린 17을 사용하는 RIA 분석법을 이용해 사이클로스포린 17과 낮은 교차반응성을 나타내는 하이브리도마를 선별한다.

선택된 하나의 하이브리도마 셀라인은 사이클로스포린에 대해 반응하며 사이클로스포린 17에 대해서는 낮은 교차 반응성을 보이는 모노클론 항체를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 IgG 부류, IgG₁준부류에 속하는 것으로 특징 짓는다. RIA에서 사이클로스포린과의 반응을 위한 IC₅₀값은 6.7ng/㎖인데 비해 사이클로스포린 17은 280ng/㎖이다. 사이클로스포린 17과의 교차 반응성은 2%에 불과하다. 사이클로스포린에 대한 친화 상수는 10^-9몰/ℓ였다.

면역원성 복합체를 제조하기 위해 1·1-1·11, 1·14 또는 1.15 (식 Ⅱa, Ⅱb, Ⅱc 또는 Ⅱd)중의 어느 하나에서 정의한 것처럼 활성화된 커플링기를 갖는 사이클로스포린을 사용하여 본 실시예의 방법과 비슷한 본 발명의 기술을 적용하면, 본 실시예의 특이한 하이브리도마라인/모노클론 항체와는 동일하지는 않지만, 상술한 것과 같은 동일한 특성을 나타내거나 또는 상술된 특성 보다 더 개선된 특성을 갖는 하이브리도마 라인/모노클론 항체가 용이하게 제조될 수 있다. 이것은 하기에 나타나는 실시예의 결과에서 명백해진다.

9.2 실시예 7.2의 복합체를 사용하는 방법

a) 면역법

각각의 쥐(Bal b/c)에 200㎕의 인산염 완충 식염수/Freund 보강제(1 : 1)중에 유탁시킨 실시예 7.2생성물인 면역원성 복합체 100㎍을 투여한다. 일차 투여(완전 Freund 보강제)는 뒷다리 발, 꼬리와 목부분에서 피하내 주사로 실시한다. 3주일 후, 2차 및 3차 투여(불완전 Freund 보강제)를 등에 피하주사로, 뒷다리에 근육주사로 실시한다. 2차 및 3차 투여 후 각각 1주일내에 혈액 샘플들을 수취한다.

하기의 항혈청 기준에 따라 쥐를 선택한다 :

1. 액상 RIA와 ELISA중에서의 역가 ; 2. 실질상의 이소타잎의 분포치(ELISA에서 IgG₁단독 또는 IgG_1+a+b) ; 3. ELISA에서의 상대적 화합력(avidity) ; 4. 경쟁적 ELISA법으로 사이클로스포린과 사이클로스포린 17 및 사이클로스포린 18 사이를 식별할 수 있는 능력.

선택된 쥐는 9%의 NaCl 200㎕중에 유탁시킨 실시예 7.2의 면역원성 복합체 생성물 100㎍을 사용하여 융합을 실시하기 3일전째에는 복강내 주사(50%) 및 정맥내 주사(50%)로 추가 항원 자극 주사를 투여하고, 2일 및 1일전에는 복강내 주사(100%)를 통해 선택된 쥐에 추가 항원 자극을 실시한다.

b. 하이브리도마 제조

각각의 쥐에서 얻어진 2.5×10^-7또는 5×10^-7비장 세포를 PEG 4000을 사용하여 쥐(Balb/c)의 5×10^-7골수종 세포와 융합한 뒤, 24×24웰내에 분포시킨다. 음성 대조용으로서 사용된 유리된 소혈청 알부민보다 우선적으로 소혈청 알부민에 커플된 [Thr]²-사이클로스포린(실시예 7.2에서와 유사하게 제조됨) 및/또는 소혈청 알부민에 커플된 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린(실시예 7.1에서와 유사하게 제조됨)을 인지하는 항체가 존재하는지에 대해 배양 상등액을 ELISA법으로 선별했다. 선택된 IgG를 생산하는 하이브리도마 라인을 클론화시켜 모노클론성을 확인했다. (a) 사이클로스포린과 (b) 사이클로스포린 17 및 사이클로스포린 18 사이를 식별/구별할 수 있는 상기 하이브리도마 라인에 의해 생산된 모노클론 항체의 능력이 Quesniaux et al에 의한 mmunology Letters, 9, 99-104, (1985)에 서술된 방법에 따라 간접 ELISA의 경쟁 방식으로 여러 완충 용액 시스템내에서 시험되었다. 여러 완충 용액으로는 pH 7.5의 인산염 완충 식염수로서 0.03%의 Tween 20을 함유하고 있거나 함유하고 있지 않은 것 ; 0.03%의 Tween을 함유하고 NaCl을 함유하지 않는 pH 7.5의 트리스를 포함한다. 최적 식별 조건은 140mM의 NaCl과 0.03%의 Tween 20을 함유한 pH 7.5의 인산염 완충 식염수 내에서 이다. 조사된 9개의 클론 라인중에서 7개가 (a) 사이클로스포린과 (b) 사이클로스포린 17 및 사이클로스포린 18 사이를 식별할 수 있는 모노클론 항체를 생산하였다. 6개에 대해서 사이클로스포린의 IC₅₀값에 대한 사이클로스포린 17의 IC₅₀비는35배 또는 그 이상이었다.

실시예 10

사이클로스포린과 반응하는 폴리클론 항체의 제조

[방법 단계 xi)]

약 14일의 간격을 두고 양의 뒷발에 근육내로 10회의 주사를 투여해 양을 면역시킨다. 주사액은 실시예 8.1의 동결 건조된 면역원성 단백질 복합체 생성물, Alugel S(0.2㎖), Freund 보강제(0.6㎖)를 포함하고 있다. 삼중 수소화된 사이클로스포린에 대해 얻어진 최종 역가는 FIA로 측정했을 때 1/100,000이었다.

회수된 폴리클론 항 혈청은 현재 사용되고 있는 사이클로스포린 RIA 분석 키트에 이용되는 [Thr]²-사이클로스포린-IgG 복합체를 사용하여 제조된 폴리클론 항 혈청과 비교해 볼때, 사이클로스포린과 이것의 대사산물인 사이클로스포린 17 사이를 식별하는 능력이 개선된 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 실시예에 따라 얻어진 항 혈청의 사이클로스포린 17에 대한 교차 반응성은 약 18%인데 비해, 공지된 폴리클론 항혈청의 교차 반응성은 약 42.0%이다.

실시예 11

5.1에서 정의된 사이클로스포린의 라벨된 유도체의 제조 방법

[방법 단계 ix)]

11.1[N-TRITC-(D)Lys]⁸-사이클로스포린의 제조

실시예 (1)에 의해 제조된 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린(15㎎)을 염화 메틸렌(2㎖)중에 용해시킨다. 로다민 이소티오시아네이트(TRITC)(5.3㎎)을 가하고, 반응 혼합물을 -7℃에서 17시간 동안 방치시킨다. 얻어진 적색 용액을 염화 메틸렌과 0.5%의 메탄올을 사용해 Sephadex LH20 (20g)상에서 직접 크로마토그래피시킨다. 부분액은 10㎖씩 나누어 수취한다. 5-7번째의 부분액 및 10-14번째의 부분액으로부터 오일상태의 표제 화합물이 회수되었다. UV 흡수도 ; 300nm/형광 방출 : 540nm, 8-위치의 잔기는 하기식으로 표시된다.

11.2[N-ε-단실-(D)Lys]^--사이클로스포린의 제조방법

실시예 (1)에서 제조된 [(D)Lys]^--사이클로스포린(232㎎)을 클로로포름(15㎖)중에 용해시킨다. 에틸 디이소프로필아민(7.3㎎)과 염화단실(99.5㎎)을 가한뒤, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반시킨다. 생성물을 염화 메틸렌과 0.5%의 메탄올을 사용해 Sephadex LH20 (100g)상에서 직접 크로마토그래피시킨다. 부분액들은 10㎖씩의 양으로 수취한다.

수취된 부분액들을 증발시킨 뒤, 얻어진 생성물을 염화 메틸렌과 5%의 메탄올을 사용해 실리카겔(0.06-0.20㎜) (100g) 상에서 재크로마토그래피시킨다. 부분액들은 15㎖씩의 양으로 수취한다. 28-44번째의 부분액들로부터 순수한 생성물이 산출된다.

[α]_D ²⁰=-183.8°, C=CHCl₃중에서 1.08.

11.3 [(D)Lys]^--사이클로스포린의¹²⁵I 요오드화된 유도체의 제법

실시예 (1)에 의해 제조된 [(D)Lys]⁸-사이클로스포린 8-위치에 있는 잔기의 N-ε-원자에 p-OH-페닐프로피오닐잔기를 연결시켜 표제 화합물을 제조한다. [Bolton 및 Hunter에 의해 Biochem. J. 133, 529(1973)에 기술된 방법을 사용함]¹²⁵I 라벨은 p-OH-페닐프로피오닐 잔기의 페닐고리내에 위치된다.

액상으로서 5% 아세트산/0.2%의 트리플루오로아세트산중의 10-30% n-프로판올/0.2% 트리플루오로 아세트산을 사용하고 선형구배를 이용하여 RP 18의 4×250 컬럼상에서 HPLC법으로 정제를 실시한다.

Claims

활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산 잔기를 갖고 있는 사이클로스포린류 화합물을 담체에 커플링시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 활성화된 커플링기는 반응을 실시하거나, 촉진시키기 위해 커플링제를 사용하지 않고도 적합한 공동 반응성기와 직접 반응하여 공유 결합을 제공할 수 있는기를 의미하는, 면역원성 복합체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산 잔기는 2-위치에 있는 (0-아실)-트레오닐 잔기인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 (0-아실)부는 Z가 카르복시 활성화기인 일반식 ZO-CO-CH₂--CH₂-CO-를 갖는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 활성화된 커플링기를 함유한 α-아미노산잔기는 8-위치에 있는 (D)α-아미노산 잔기인 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 8위치에 있는 (D)α-아미노산 잔기는 Y가 활성화된 카르복시기 또는 활성화된 디티오기인 하기 일반식을 갖는 것인 방법 :
a) 제 1 항의 방법에 따라 면역원성 복합체를 제조하고 ; b) 상기 면역원성 복합체를 적절한 동물에 투여하여 면역원 공격을 실시한 후, 상기 복합체에 감작된 항체-생산성 세포를 회수하고 ; c) 상기 항체-생산성 세포를 영구 증식화(immortalisation) 시키고 ; 및 d) 확립된 영구증식성 셀라인을 선택하여, 이것으로부터 모노클론 항체를 회수하는 단계들을 포함하는 사이클로스포린류 화합물과 그 대사산물 사이를 식별할 수 있는 모노클론 항체의 제조 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 사이클로스포린(Cyclosporine)과 그 대산 산물 사이클로포린 17(Cyclosporine 17) 사이를 식별할 수 있는 것인 방법.