KR20230066000A - 면역자극성 박테리아-기초 백신, 치료제, 및 rna 전달 플랫폼 - Google Patents

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immunostimulatory
sting
bacterium
bacteria
protein
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KR1020237008539A
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로라 힉스 글릭맨
브렛 니콜라스 피터슨
하이싱 케호
알렉산드르 찰스 미셸 이안넬로
크리스토퍼 디. 타노스
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액팀 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드
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Abstract

예컨대 종양 미세환경, 특히 종양-체류 골수성 세포에서의 축적을 증가시키며, 보체 비활성화에 대한 내성을 향상시키고, 면역 세포 사멸을 감소시키며, 적응 면역력을 촉진하고, T-세포 기능을 증강시킴으로써 예를 들어, 독성을 감소시키고 항종양 활성을 향상시키도록 변형된 게놈을 갖는 약독화된 면역자극성 박테리아가 제공된다. 또한, 백신으로서 사용하기 위한, 그리고 mRNA의 전달을 위한 면역자극성 박테리아가 제공된다. 포식 세포의 콜로니화의 증가는 종양 미세환경 및 종양으로의 인코딩된 치료 생성물의 전달을 향상시키고, 다른 경로 중에서도 면역자극성 박테리아의 전신 투여를 허용한다. 포식 세포의 콜로니화의 증가는 또한, 백신으로서 사용하기 위한 직접 조직 투여용 면역자극성 박테리아의 용도를 제공한다.

Description

면역자극성 박테리아-기초 백신, 치료제, 및 RNA 전달 플랫폼
우선권의 이익은 2020년 8월 12일에 출원되고 출원인이 Actym Therapeutics, Inc.이며 발명자가 Laura Hix Glickman, Christopher D. Thanos, Alexandre Charles Michel Iannello, Chris Rae, 및 Haixing Kehoe이고 발명의 명칭이 "IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM"인 미국 임시 출원 일련 번호 63/064,869호에 대해 주장된다.
우선권의 이익은 또한 2021년 5월 13일에 출원되고 출원인이 Actym Therapeutics, Inc.이며 발명자가 Laura Hix Glickman, Christopher D. Thanos, Alexandre Charles Michel Iannello, Chris Rae, 및 Haixing Kehoe이고 발명의 명칭이 "IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM"인 미국 임시 출원 일련 번호 63/188,443호에 대해 주장된다.
우선권의 이익은 또한 2021년 5월 13일에 출원되고 출원인이 Actym Therapeutics, Inc.이며 발명자가 Laura Hix Glickman, Christopher D. Thanos, Alexandre Charles Michel Iannello, Chris Rae, Haixing Kehoe, Bret Nicholas Peterson, 및 Chingnam Cheung이고 발명의 명칭이 "IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC PROTEINS"인 미국 출원 번호 17/320,200호에 대해 주장된다.
이 출원은 2020년 11월 12일에 출원되고 2021년 5월 20일에 WO 2021/097144로서 공개된 출원인이 Actym Therapeutics, Inc.이며 발명자가 Christopher D. Thanos, Laura Hix Glickman, Alexandre Charles Michel Iannello, Chris Rae, Haixing Kehoe, Bret Nicholas Peterson, 및 Chingnam Cheung이고 발명의 명칭이 "IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC PRODUCTS"인 동시계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2020/060307호에 관한 것이다.
이 출원은 또한 출원인이 Actym Therapeutics, Inc.이며 발명자가 Christopher D. Thanos, Laura Hix Glickman, Justin Skoble, Alexandre Charles Michel Iannello, 및 Haixing Kehoe이고 발명의 명칭이 "IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS, TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS, AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT"인 2020년 2월 27일에 출원되고 2020년 9월 3일에 WO 2020/176809호로서 공개된 동시계류중인 국제 특허 출원 번호 PCT/US2020/020240호 및 2020년 3월 19일에 출원되고 2020년 8월 27일에 미국 공보 US 2020-0270613 A1호로서 공개된 동시계류중인 미국 특허 출원 일련 번호 16/824,500호에 관한 것이다.
이 출원은 또한 2018년 7월 11일에 출원되고 2019년 1월 17일에 WO 2019/014398호로서 공개된 국제 특허 출원 PCT/US2018/041713호, 및 2018년 7월 11일에 출원되고 2019년 1월 17일에 미국 공보 2019/0017050 A1호로서 공개되고 현재 허용된 동시계류중인 미국 특허 출원 일련 번호 16/033,187호에 관한 것이며, 이는 각각 발명의 명칭이 "ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF"이다.
이 출원은 또한 2019년 7월 11일에 출원되고 2020년 1월 16일에 WO 2020/014543호로서 공개된, 발명의 명칭이 "ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF"인 국제 특허 출원 PCT/US2019/041489호에 관한 것이다.
각각의 이러한 출원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이 출원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있고, 이러한 박테리아는 본원에 참조로서 포함된다. 허용된다면, 이러한 출원 각각의 주제는 그 전문이 참조로서 포함된다.
전자적으로 제공된 서열 목록의 참조에 의한 포함
서열 목록의 전자 버전은 본원에 출원되고, 이의 내용은 그 전문이 참조로서 포함된다. 전자 파일은 2021년 8월 12일에 생성되었으며, 크기가 868 킬로바이트이고, 명칭이 1708SEQPC0.txt이다.
기술분야
보체 비활성화에 대한 내성을 증가시키며, 면역 세포 사멸을 감소시키고, 적응 면역력을 촉진하고, T-세포 기능을 증강시킴으로써 예를 들어, 바람직하지 못한 염증 반응 및 독성을 감소시키고, 항종양 활성을 향상시키도록 변형된 게놈을 갖는 약독화된 면역자극성 박테리아가 제공된다. 항암 용도를 위한 포식 세포의 콜로니화의 증가는 종양 미세환경 및 종양으로의 인코딩된 치료 생성물의 전달을 향상시키고, 다른 경로 중에서도 면역자극성 박테리아의 전신 투여를 허용한다. 적절한 투여에 의한 백신으로서 사용하기 위해, 박테리아는 병원체에 의해 콜론화된 조직을 포함하여 포식 세포를 콜론화할 수 있다.
암 면역요법 분야는 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 면역 체크포인트 항체의 임상 성공에 의해 입증되는 바와 같이 큰 진전을 이루었다(예를 들어, 문헌[Buchbinder 등 (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383]; 문헌[Hodi 등 (2010) N. Engl. J. Med. 363(8):711-723]; 및 문헌[Chen 등 (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391] 참조). 종양은 주로 면역억제성 환경을 발달시켰다. 종양은 면역 감시를 피하고, 항종양 면역력 세포가 면역력을 억제시키도록 재프로그래밍하고, 최근 암 요법에 대한 내성을 계속 돌연변이화시키는 다수의 기전을 개시한다(예를 들어, 문헌[Mahoney 등 (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584] 참조). 현재의 면역요법의 자가면역-연관 독성을 제한하는 한편, 면역 관용(immune tolerance) 및 회피를 극복하는 면역요법 및 암 요법을 설계하는 것은 면역-종양학 분야에 도전한다. 그러므로, 추가 및 혁신적인 면역요법 및 다른 요법이 필요하다.
종양, 특히 종양 체류 면역 세포를 효과적으로 콜로니화하는 면역자극성 박테리아의 능력으로 인해, 그리고 항종양 면역 반응을 초래하는 인코딩된 페이로드로 인해 암 치료제인 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 종양 및 종양 미세환경을 콜로니화하는 능력 때문에, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경 및 종양에서 희박한 또는 부재하는 T-세포 침윤을 갖는 면역 결핍(immune desert)(면역-배제(immune-excluded)) 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이는 간질 장벽(stromal barrier)을 갖는 종양을 포함한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 면역요법에 내성이거나 비반응성인 소위"콜드(cold)" 종양을 "핫(hot)" 종양으로 변환시킬 수 있다.
이들 면역자극성 박테리아는 본원에 기재된 게놈 변형을 포함하며, 따라서 이는 예컨대 편모의 제거, msbB - /pagP - 표현형, 뿐만 아니라 추가 돌연변이, 예컨대 컬리 핌브리애의 제거, 및 또한 다른 돌연변이, 예컨대 ansB - 표현형으로 인해 TLR2/4/5 약독화된다. 이러한 박테리아는 생체내에서 증식할 수 있다. 박테리아에서 플라스미드(들)에 인코딩된 페이로드는 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 것이다. 특히, 이러한 생성물은 유형 I IFN의 발현을 항시적으로 만드는 기능-획득 돌연변이를 포함한다. 이러한 면역자극성 박테리아는 또한 IL-15와 같은 사이토카인 또는 사이토카인들을 특히 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체로서 인코딩할 수 있고, 종양-연관 항원 및/또는 이중특이적 T-세포 연계자 항체를 인코딩할 수 있다. 암 요법을 위해, 박테리아는 전신 투여될 수 있다.
또한, 예컨대 근육내 주사, 흡입, 및 다른 이러한 직접 경로에 의해 조직 내로의 투여를 위한 백신으로서 사용되고/되거나 제형화될 수 있는 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 이러한 박테리아는 생체내에서 비복제성인 것으로 설계되고, 그러므로 영양학적 영양 요구체, 예컨대 thyA - 를 포함하며, 따라서 이는 활성 티미딜레이트 신타제를 발현하지 않고 이는 박테리아에서 인식되는 프로모터의 제어 하에 페이로드를 인코딩한다. 이는 단백질 페이로드를 백신화된 숙주로 전달하는 것으로 의도된다면, 인코딩된 페이로드는 서열을 포함하거나 이들이 박테리아 숙주에서 번역되도록 설계된다. 이들이 RNA를 전달하는 것으로 의도된다면, 인코딩 핵산은 박테리아 리보솜이 이러한 RNA를 번역하지 않을 수 있으나 진핵 리보솜이 이를 번역할 수 있도록 설계된다. 이는 예를 들어, 인코딩 핵산에서 IRES를 포함함으로써 수행될 수 있다. 백신의 페이로드는 면역화 항원 또는 단백질, 예컨대 바이러스 또는 박테리아 병원체로부터의 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 페이로드는 또한 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 면역자극성 단백질, 예컨대 생성물, 예컨대 STING, 특히 변형된 STING, 및 또한 선택적으로, 사이토카인, 예컨대 IL-15, 예컨대 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체를 포함할 수 있다. 백신은 적합한 투여 경로를 위해 제형화되고, 에어로졸 및 에멀젼, 정제 및 분말을 포함한다.
게놈 변형, 및 하나 이상의 치료 생성물, 예컨대 항암 치료제 또는 관련 치료를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 게놈 변형은 종양 미세환경 및 종양-체류 면역 세포에서 축적되는 면역자극성 박테리아를 초래하고, 이러한 장소에서 면역자극성 박테리아는 인코딩된 치료 생성물을 발현한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 대상체에서 강력한 항암 반응을 자극하거나 유도하거나 초래하는 하나 또는 복수의 보완 생성물을 인코딩하였다.
항종양 반응과 항바이러스 반응 사이의 면역 반응의 유사성 때문에, 본원에제공된 면역자극성 박테리아는 또한 감염성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 항바이러스 또는 항박테리아 치료제, 예컨대 바이러스 또는 박테리아 생성물의 저해제, 또는 바이러스 또는 박테리아 생성물의 발현의 저해제, 또는 바이러스 또는 박테리아 항원을 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아 및 치료적 항병원체 생성물로부터의 면역 반응과 또한 면역자극성 단백질 및 다른 이러한 치료제의 조합은 감염성 질환, 특히 바이러스 감염, 예컨대 만성 바이러스 감염 및 잠재 바이러스 감염과 연관된 질환에 대해 백신화하고/하거나 이를 치료하기 위한 치료적 면역자극성 박테리아를 제공한다. 관심 있는 것은 만성 바이러스 감염, 예컨대 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상 포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 호흡기 융합 바이러스(RSV), 홍역 바이러스, 및 대상체를 만성적으로 감염시키는 다른 이러한 바이러스에 의한 감염이다. 면역자극성 박테리아는 또한 마찬가지로 급성 감염, 예컨대 만성 인플루엔자, 피. 긴기발리스, 및 코로나바이러스, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2로서, COVID-19를 야기함)에 의한 초기 감염의 치료에 사용될 수 있다. 표적화된 병원체성 박테리아는 또한 예를 들어 에스케리키아, 스타필로콕커스, 슈도모나스, 및 포르피로모나스의 종을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 병원체로부터의 항원 또는 항원들, 예컨대 바이러스 항원을 인코딩할 수 있고, 감염을 예방하거나 기존의 감염을 치료하기 위한 백신으로서 사용된다. 항원은 면역보호 반응을 이끌어내기 위해 또는 병원체로부터 비롯되는 질환을 개선하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 면역자극성 박테리아는 면역 세포, 예컨대 항원-제시 세포에서 축적되는 능력으로 인해 병원체, 예컨대 바이러스에 대한 T-세포 반응을 프라이밍할 수 있다. 예를 들어, 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 중에는 T-세포의 기능을 억제시키는 효소인 아스파라기나제 II가 결핍된 것이 있다. 본원에 기재되고 제공된 임의의 면역자극성 박테리아가 사용될 수 있다. 예를 들어, 예컨대 활성 효소의 발현을 무효화시키기 위해 박테리아 게놈을 변형시킴으로써 아스파라기나제 II 활성을 무효화시키는 것은 항원 또는 항원 조합을 인코딩하는 데 사용될 수 있는 것으로 본원에 기재되고 제시된다. 생성된 박테리아는 항병원체, 예컨대 항바이러스, T-세포 반응을 촉진한다. 예컨대 병원체, 박테리아 또는 바이러스 또는 다른 것으로부터의 항원의 발현과 면역 세포, 예컨대 항원-제시 세포에서 축적하는 능력을 갖는 다른 것의 조합은 병원체에 의한 감염으로부터의 보호를 제공한다. 예를 들어, 면역자극성 박테리아는 바이러스 항원, 예컨대 바이러스 계열 중에서 또는 바이러스 계열들에 걸쳐 공유되는 필수 바이러스 코어 단백질로부터의 항원을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 코로나바이러스, 예컨대 SARS-COV2의 경우, 뉴클레오캡시드 및/또는 비구조적 M 단백질로부터의 항원은 고도로 보존되고 덜 돌연변이화된 코어 단백질에 대한 CD8+ T-세포 반응을 증강시켜, 이로써 넓은 pan-코로나바이러스 보호를 제공하여 효과적인 백신 및 치료를 제공할 수 있다. 면역화 및/또는 치료에 사용되는 이러한 코로나 바이러스 및 코로나 바이러스 계열로부터의 단백질 및 항원은 알려져 있고, 예시적인 것은 본원에 기재되어 있으며 당업자에게 알려져 있다. 스파이크(spike) 단백질, 이의 일부, 및 변형된 스파이크 단백질에 더하여, 다른 단백질은 이러한 목적을 위해 식별화되었다. 예를 들어, 문헌[Cohen et al., (2021) Cell Reports Medicine 2:1000354]를 참조한다.
면역자극성 박테리아는 항바이러스 치료제 또는 항박테리아 치료제를 인코딩할 수 있다. 이러한 치료제는 바이러스 유전자 및 단백질, 예컨대 복제 및/또는 패키징에 필요한 단백질의 저해제를 포함하거나, 면역자극성 박테리아는 표적 세포 내로의 바이러스 진입을 용이하게 하거나 이를 제공하는 수용체 또는 수용체들과 바이러스의 결합 또는 상호작용을 방지하는 치료제를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 인코딩된 치료적 단백질, 예컨대 항원 또는 항원 단백질의 발현은 원핵 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질은 진핵 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 프로모터의 선택은 이것이 예컨대 숙주에서 번역되는 mRNA의 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같이 투여 전에 박테리아에서 발현되어야 하는지, 또는 단백질이 전달 후에 숙주 세포, 예컨대 면역 세포에서 발현되어야 하는지의 여부에 의존한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 게놈 변형, 예컨대 비활성 인코딩된 생성물을 초래하는 결실, 방해, 및 다른 변경, 예컨대 유전자의 모두 또는 일부의 배향을 변화시키는 것을 포함하여, 기능적 유전자 생성물은 발현되지 않는다. 면역자극성 박테리아 중에는 변형되어, 생성된 박테리아가 msbB -/purI -인 것이 제공된다. 일부 구현예에서, 박테리아는 msbB - 및 purI -이며, 이로써 msbB 및/또는 purI 유전자의 적어도 코딩 부분의 전장이 결실된다. 박테리아의 게놈은 또한 변형될 수 있어서, 박테리아는 편모가 결여된다. 이는 편모를 정상적으로 발현하는 박테리아에서 수행된다. 이러한 박테리아에서, 예를 들어 살모넬라 내 fliC 및 fljB 유전자, 또는 fliC 및 fljB와 동등한 다른 종 내의 유전자는 결실되거나 다르게는 변형될 수 있어서, 기능적 유전자 생성물이 발현되지 않는다. 박테리아는 또한, 이것이 아데노신 영양요구체이고/이거나 msbB -/pagP -가 되도록 변형될 수 있다. 또한, 면역자극성 박테리아 및 이를 함유하는 약학적 조성물이 제공되며, 박테리아는 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않아 박테리아는 ansB -이다. 인코딩된 아스파라기나제 활성의 무효화는 T-세포 생존력/활성을 향상시키거나 보유시킨다. 백신으로서 사용되는 치료적 박테리아, 예컨대 비활성화된 또는 약독화된 박테리아는 아스파라기나제 활성을 무효화시키는 박테리아 게놈을 변형시킴으로써 향상될 수 있다. 이러한 백신의 예는 BCG(바실러스 칼메트-게렝(Bacillus Calmette-Guerin)) 백신 및 관련 백신이고, 이는 결핵에 대해 면역화하는 데 사용된다. BCG 백신은 다양한 효능을 갖는 것으로 알려져 있다; 아스파라기나제의 무효화는 이러한 백신의 효능을 향상시킬 수 있는데, 왜냐하면 내인성 박테리아 아스파라기나제가 T-세포 활성을 저해하거나 감소시키기 때문이다.
진핵생물 프로모터의 제어 하에 치료 생성물 또는 치료 생성물의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 박테리아의 게놈은 하기 중에서 선택되는 변형, 예컨대, 1, 2, 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다:
a) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 펜타-아실화된 지질다당류(LPS)를 생산하도록 변형되었으며,
면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되어 박테리아는 펜타-아실화된 지질다당류를 생산하도록 변형되었고;
헥사-아실화된 지질다당류는 야생형 박테리아와 비교하여 적어도 10배만큼 실질적으로 감소되거나, 부재함;
b) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 톨-유사 수용체(TLR) 2, TLR4, 및/또는 TLR5에 의해 약독화된 인식을 가짐;
c) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 컬리 핌브리애 및/또는 셀룰로스의 합성을 활성화시키지 않음;
d) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 분비되는 아스파라기나제의 합성을 활성화시키지 않음;
e) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 퓨린, 아데노신, 및/또는 ATP에 대해 영양요구성임;
f) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 편모가 결여됨;
g) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 종양-체류 골수성 세포를 특이적으로 감염시키도록 변형되었음;
h) 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해로서, 박테리아는 종양-체류 골수성 세포를 특이적으로 감염시키도록 변형되었고 종양-체류 골수성 세포에서 복제할 수 없음; 및
i) 막에서 지질단백질 발현을 저하시키거나 무효화하기 위한 lppA 및 lppB 중 어느 하나 또는 둘 다의 결실 또는 방해로서, 인코딩된 치료 단백질의 발현이 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 면역 세포에서 증가됨.
예를 들어, 면역자극성 박테리아는 a), d), 및 f)의 결실, 삽입, 및 대체를 포함한 변형, 또는 변형 c) 및 d), 또는 변형 a), c), d), e), 및 f), 또는 변형 a), c), d), e), f), 및 i), 또는 변형 a), d) f), 및 i), 또는 변형 c), d), 및 i), 또는 변형 f) 및 i), 또는 변형 a) 내지 i), 또는 변형 a), b), d), 및 f), 또는 변형 a), b), c), 및 d), 및 변형 a) 내지 i)의 다른 조합을 함유한다. 결실 또는 방해는 활성 유전자 생성물이 발현되지 않는 유전자의 임의의 변형을 포함한다.
특히, 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 충분한 부분의 삽입에 의한 것을 포함한 결실 또는 방해에 의해 게놈이 변형되어 박테리아가 TLR2, TLR4, 및 TLR5에 의한 약독화된 인식을 갖는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 이러한 박테리아는 낮은 독성을 갖고, 종양 미세환경 및 종양-체류 골수성 세포, 예컨대 대식세포에 축적되며/이를 콜로니화한다. 이러한 박테리아는 치료 생성물, 특히 보완 생성물, 예컨대 사이토카인과 기능-획득/항시적 활성 STING 단백질, STING 키메라, 및 기능-획득(GOF) 돌연변이를 갖는 키메라 STING 단백질을 포함한 변형된 STING 폴리펩타이드의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 사이토카인은 예를 들어, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(본원에서 IL-15Rα/IL-15sc, 또는 IL-15/IL-15Rα, 또는 IL-15 복합체로 지칭됨), 또는 IL-15, 또는 IL-12, 또는 다른 항종양 면역력 자극 사이토카인 또는 케모카인을 포함한다. 박테리아는 추가로 다른 생성물, 예컨대 항종양 항체를 인코딩할 수 있다. 생성물의 조합은 본원에 기재되고 제공된다. 항종양 반응을 자극시키거나 촉진하고/하거나 치료 생성물을 전달하는 생성물의 조합은 본원의 개시내용 전반에 걸쳐 기재되며, 이러한 조합은 박테리아가 낮은 독성을 갖고 종양, 종양 미세환경, 및/또는 종양-체류 면역 세포, 예컨대 대식세포를 효과적으로 콜로니화하도록 게놈이 변형된 면역자극성 박테리아에 의해 전달된다. 이러한 박테리아의 예는, 이것이 편모를 갖지 않도록 변형되고 예컨대 이것이 박테리아를 msbB - /pagP - 로 되게 함으로써 펜타-아실화된 지질 A와 함께 지질다당류(LPS)를 함유하도록 변형된 살모넬라, 리스테리아 및 이. 콜라이와 같은 종의 것이다. 박테리아는 추가로 컬리 핌브리애의 무효화에 의해 변형될 수 있고/있거나 예컨대 박테리아가 csgD -이도록 이를 변형시킴으로써 감소된 또는 무효화된 셀룰로스 생성 및 생물막 형성을 가질 수 있다. 이러한 변형을 갖는 박테리아는 어떠한 최대 내약 용량(MTD: maximum tolerated dose)도 갖지 않고, 높은 종양 콜로니화를 나타내는 것으로 본원에 제시된다.
모든 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 또한 편모를 인코딩하는 유전자의 결실 또는 방해를 포함하거나 추가로 포함할 수 있어서, 박테리아는 플라젤린-(예컨대 fliC - /fljB - )이고 편모를 생성하지 않으며, 야생형 박테리아는 편모를 갖는다. 면역자극성 박테리아는 퓨린에 대해 영양요구성, 예컨대 아데노신에 대해 영양요구성, 또는 아데노신, 아데닌, 및/또는 ATP에 대해 영양요구성일 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한 purI - 일 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한 pagP -일 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-(asd - )일 수 있으며, 예컨대 박테리아는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(asd)를 인코딩하는 내인성 유전자의 모두 또는 일부의 방해 또는 결실로 인해 asd -이며, 이로써, 내인성 asd는 발현되지 않는다. 박테리아는 박테리아 프로모터의 제어 하에 플라스미드 상에서 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(asd)를 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한 msbB - 일 수 있거나, pagP - /msbB - 일 수 있다. 예를 들어, 면역자극성 박테리아는 asd - , purI - , msbB - , 플라젤린-(예컨대 fliC - /fljB - ), 및 pagP - 일 수 있거나, asd - , csgD - , purI - , msbB - , 플라젤린-(fliC - /fljB - ), 및 pagP - 일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 ansB - , asd - , csgD - , purI - , msbB - , 플라젤린-(예컨대 fliC - /fljB - ), 및 pagP - 이다.
진핵생물 프로모터의 제어 하에 치료 생성물을 인코딩하거나 복수의 진핵생물 프로모터의 제어 하에 또는 단일 프로모터의 제어 하에 복수의 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 충분한 부분의 결실에 의해 또는 유전자 또는 유전자들의 방해에 의해 변형되어, 박테리아는 ansB - , asd - , csgD - , purI - , msbB - , 플라젤린-(예컨대 fliC - /fljB - ), 및 pagP - 중 하나 이상이다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 또한, 유전자 lppA(lpp1) 및/또는 lppB(lpp2)를 갖는 것을 포함하며, 이는 인코딩된 지질단백질(들)의 발현을 무효화하거나 실질적으로 감소시키기 위해 결실되거나 방해된 주요 외막지질단백질 Lpp1(LppA) 및 Lpp2(LppB)를 각각 인코딩한다. 특히, 면역자극성 박테리아는 lppA - 및 lppB - 이다. 진핵생물 조절 서열의 제어 하에 항암 치료제 또는 항병원체 치료제를 인코딩하는 플라스미드를 함유하고 lppA - 및 lppB - 인 면역자극성 박테리아가 제공된다. 예를 들어, 면역자극성 박테리아는 ansB -, asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린-(예컨대 fliC -/fljB -), pagP -, lppA -, 및/또는 lppB -일 수 있다.
본원의 구현예에서, 치료 생성물은 항암 치료제 또는 암 요법에 사용되는 치료제이다. 인코딩된 생성물(들)은 분비 신호를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 발현될 때 치료 생성물은 분비되고, 예컨대 종양-체류 면역 세포로부터 분비된다.
임의의 면역자극성 박테리아는 또한, 결실되거나 비활성화된 살모넬라 병원성 섬 1(SPI-1: 살모넬랑 병원성 섬 1) 침범에 관여하는 하나 이상의 유전자 또는 오페론을 가질 수 있어서, 면역자극성 박테리아는 상피 세포를 침범하거나 감염시키지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자/오페론은 avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, invJ, iacP, iagB, spaO, spaQ, spaR, spaS, orgA, orgB, orgC, prgH, prgI, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB, 및 sptP 중에서 선택된다.
면역자극성 박테리아에서 플라스미드는 저(low) 복제수 또는 중(배지) 복제수로 존재할 수 있다. 플라스미드는 중-내지-저 복제수 복제 원점, 예컨대 저 복제수 복제 원점을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 더 고-복제수로 존재한다. 일반적으로, 중 복제수는 150 미만 또는 약 150 미만이고 20 초과 또는 약 20 초과이거나, 20 또는 25 내지 150이고; 저 복제수는 25 미만, 또는 20 미만, 또는 약 25 미만, 또는 약 20 미만의 복제수이다. 특히, 저 내지 중 복제수는 약 150 미만의 복제수, 또는 150 미만의 복제수이고; 저 복제수는 약 25 미만의 복제수, 또는 25 미만의 복제수이다.
인코딩된 치료 생성물은 핵산 및 단백질을 포함한다. 플라스미드는 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩할 수 있다. 예시적인 생성물은 사이토카인, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 및 공동자극성 수용체 또는 리간드를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 추가의 예시적 조합은 아래에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 공동자극성 분자는 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 중 모두 또는 일부가 결여되어, 절두된 분자는 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포로의 항시적 면역-자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실된 또는 절두된 세포질 도메인 또는 이의 결실된 부분으로 인해 항원-제시 세포(APC)로의 역조절 신호를 할 수 없다.
인코딩된 치료 생성물은 진핵생물 숙주에 의해 인식되는 조절 서열, 예를 들어, 박테리아 또는 플라스미드를 포함하는 세포로부터의 분비를 발휘하기 위한 분비 신호를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 면역자극성 박테리아가 2개 이상의 생성물을 인코딩하는 구현예에서, 각각의 생성물의 발현은 별개의 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 생성물은 단일 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있고, 각각의 생성물은 예를 들어, 내보 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 2A 펩타이를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되어, 각각의 인코딩된 치료 생성물의 별개의 발현을 발휘한다. 예시적인 2A 펩타이드는 T2A, F2A, E2A, 또는 P2A이며, 이는 치료 생성물을 인코딩하는 핵산을 플랭킹(측면)하여, 단일 프로모터의 제어 하에 발현되는 치료 생성물의 별도의 발현을 발휘할 수 있다. 치료 생성물은 진핵생물 프로모터, 예컨대 RNA 폴리머라제 II(RNAP) 프로모터, 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 제어 하에 발현된다. 이는 바이러스 프로모터인 RNA 폴리머라제 II 프로모터, 또는 포유류 RNA 폴리머라제 II 프로모터, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 헤르페스 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 신장 인자-1(EF-1) 알파 프로모터, UBC 프로모터, PGK 프로모터, CAGG 프로모터, 아데노바이러스 2 또는 5 후기 프로모터, EIF4A1 프로모터, CAG 프로모터, 또는 CD68 프로모터를 포함한다. 플라스미드는 다른 진핵생물 조절 서열, 예컨대 종결인자 및/또는 SV40 중에서 선택되는 프로모터, 인간 성장 호르몬(hGH), 소 성장 호르몬(bGH), MND(골수증식성 육종(myeloproliferative sarcoma) 바이러스 인핸서와 함께 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터), 닭 베타-글로불린, 및 rbGlob(토끼 글로불린) 유전자를 추가로 포함하여, 치료 생성물(들)의 발현을 제어할 수 있다. 다른 서열은 polyA 테일, 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE), 및 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함한다.
인코딩된 치료 생성물은 본원 및 원래의 청구범위에 기재된 임의의 것, 예컨대 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 부분인 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 유형 I IFN은 인터페론-α 및 인터페론-β를 포함한다. 변이체는 대상체에서 발현될 때, 유형 I IFN의 항시적 발현을 유발하는 것을 포함한다. 이는 유형 I IFN의 발현을 초래하기 위해 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드(CDN)를 필요로 하지 않는 기능-획득(GOF) 변이체를 포함한다. 이러한 단백질의 예는 STING, RIG-I, MDA-5, IRF-3, IRF-5, IRF-7, IRF-8, TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 및 SNRNP200 중에서 선택되는 단백질, 및 증가된 활성을 갖거나 유형 I 인터페론(IFN)의 항시적 발현을 초래하는 이의 변이체이다. 변이체는 STING, RIG-I, IRF-3, 또는 MDA5의 변이체를 포함하며, 여기서 하나 이상의 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기(들)는 바이러스 감염의 결과 인산화되고, 아스파르트산(D) 잔기로 대체되어, 생성된 변이체는 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 인산모방체, 및 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재된 임의의 것을 포함한다. 변이체는 예를 들어, 돌연변이가 하기와 같인 선택되는 것을 포함한다: a) STING에서, SEQ ID NO: 305-309를 기준으로 하기 중에서 선택되는 하나 이상: S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, N154S/R284G, 및 S324A/S326A; b) MDA5에서, SEQ ID NO: 310을 기준으로 하기 중에서 선택되는 하나 이상: T331I, T331R, A489T, R822Q, G821S, A946T, R337G, D393V, G495R, R720Q, R779H, R779C, L372F, 및 A452T; c) RIG-I에서, SEQ ID NO: 311을 기준으로, E373A 및 C268F 중 하나 또는 둘 다; 및 d) IRF-3에서, SEQ ID NO: 312를 기준으로, S396D, 예컨대 SEQ ID NO: 305-309를 기준으로 하기 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노 대체(들)를 함유하는 변이체 STING: S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, N154S/R284G, 및 S324A/S326A, 및 이의 보존적 대체 및 이의 조합.
면역자극성 박테리아는 또한 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질을 인코딩할 수 있다. 이는 사이토카인, 케모카인, 또는 공동자극성 분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이의 예는 하기 중 하나 이상에서 선택되는 단백질이다: IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-36 감마, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, IL-18, IL-21, IL-23, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, CCL3, CCL4, CCL5, T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질, CD40, CD40 리간드(CD40L), CD28, OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), B7-CD28 계열의 구성원, CD47 길항제, 항-IL-6 항체 또는 IL-6 결합 유인 수용체, TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 및 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원. CD40, CD40 리간드, CD28, OX40, OX40 리간드, 4-1BB, 및 4-1BB 리간드 중에서 선택되는 공동자극성 분자는 절두될 수 있어서, 분자는 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 또는 이의 일부가 결여되고; 절두된 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실되거나 부분적으로 결실된, 또는 절두된 세포질 도메인으로 인해 항원-제시 세포(APC)로의 역조절 신호를 할 수 없어서, 면역억제성 리버스 신호전달을 무효화한다. 다른 이러한 단백질은 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 예컨대 항-TGF-베타 항체 또는 이의 단편, 항-TGF-베타 수용체 항체 또는 이의 단편, 가용성 TGF-베타 길항제 폴리펩타이드, 또는 TGF-베타 결합 유인 수용체이다.
플라스미드는 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 Fv(scFv), Fv, dsFv, 나노체, 이중체(diabody) 단편, 또는 단일-사슬 항체를 인코딩할 수 있다. 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, VEGF, VEGFR2, 또는 IL-6의 길항제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
플라스미드는 발현이 증강된 항종양 또는 다른 활성을 초래하는 보완 생성물을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된, 예컨대 항시적 활성 및/또는 키메라 STING 단백질과 사이토카인, 예컨대 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc)의 조합은 상승작용 활성을 갖는다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 면역 반응, 면역화 또는 면역보호가 요망되는 항원을 인코딩함으로써 백신으로서 사용될 수 있다. 본원에서 면역자극성 박테리아는 백신으로서 사용하기 위해 또는 치료제의 전달을 위해 RNA, 예컨대 mRNA 또는 다른 형태를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 박테리아는 박테리아 또는 박테리아에 의해 인식되는 다른 원핵 프로모터의 제어 하에 관심 생성물, 예컨대 치료 생성물, 예컨대 병원체로부터의 항원을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 인코딩 핵산 카세트는 박테리아 리보솜에 의한 번역을 차단하거나 저해하거나 방지하지만 진핵 리보솜, 예컨대 인간 세포에 존재하는 리보솜에 의한 번역을 허용하거나 제공하거나 증강시키는 조절 서열 또는 다른 서열을 포함한다. 박테리아는, 이것이 예컨대 박테리아를 시험관내에서의 성장을 위해 DAP를 필요로 하는 asd - 또는 성장을 위해 티미딘 모노포스페이트 전구체를 필요로 하는 ThyA - 로 되게 함으로써 진핵생물에서 성장하거나 복제할 수 없도록 변형되지만, 이것이 시험관내에서 배양될 수 있어서 인코딩된 RNA를 생성한다. 당업자는 내인성 유전자를 예컨대 결실, 삽입, 대체, 전위(transposition), 또는 임의의 이러한 변형에 의해 변형시킴으로써 유전자 또는 생성물을 비활성화시킬 수 있으며, 따라서 활성 효소가 생성되지 않는다. 살모넬라로부터의 예시적인 ThyA 유전자에 대해서는 SEQ ID NO: 464, 및 인코딩된 단백질에 대해서는 SEQ ID NO: 465를 참조한다. 면역화를 위해 단백질 및/또는 항원을 인코딩하는 RNA는 플라스미드에서 인코딩되지만, 인코딩 핵산은 번역 신호/서열을 포함하며, 따라서 박테리아는 이러한 RNA를 번역할 수 없다. 생성된 박테리아는 인코딩된 RNA를 숙주 식세포 내로 전달하며, 여기서 이러한 RNA는 숙주 세포 리보솜에 의해 번역된다. ThyA - 인 면역자극성 박테리아는 티미딜레이트 신타제의 생성의 비활성화 또는 무효화를 초래하는 게놈 변형, 예컨대 삽입, 결실, 대체 또는 다른 변화를 가지며, 이는 DNA 생합성 전구체(dTTP로의 전구체)인 dTMP로의 dUMP의 환원적 메틸화를 촉매화한다.
다른 영양소 및 필수 생성물에 대한 △ThyA 영양 요구체는 asd 비활성화/결실 대신에 또는 이에 더하여 도입될 수 있다. 성장에 필요한 유전자 또는 유전자 생성물, 예컨대 영양소를 생성하는 유전자의 다른 결실 또는 비활성화는 asd 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있고, 예를 들어 thyA를 포함한다(예를 들어, 문헌[Loessner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88] 참조). 이러한 생성물의 생성을 위한 박테리아 게놈의 생성 또는 발현의 무효화 또는 다른 약독화 돌연변이는 투여 후 생체내에서 박테리아 세포 사망 시 인코딩된 거대분자의 방출을 초래한다. Asd는 박테리아 세포벽 합성을 위한 필수 효소이다; ThyA는 DNA 합성에 필요한 효소이다. 각각의 유전자의 돌연변이는 균주를 디아미노피멜산(DAP) 또는 티미딘 모노포스페이트 전구체에 대한 영양 요구성으로 만든다. 보완 기질의 부족 시, 이러한 박테리아는 DAP-부재(less) 또는 티민부재 사망에 의해 사멸되어, 박테리아 단백질 및 플라스미드의 방출을 초래한다. Asd의 비활성화 또는 무효화는 거대분자의 방출을 초래한다; ThyA(△ThyA 박테리아를 생성하기 위해) 발현/활성의 무효화 또는 비활성화는 티미딘 고갈 시 단백질 및 플라스미드를 포함한 거대분자의 방출을 초래하지 않는다(문헌[Leossner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88]). 그러므로, △ThyA는 생체내에서 숙주 세포로의 플라스미드의 전달에 유리한데, 왜냐하면 박테리아는 이의 내용물을 너무 일찍 방출하지 않을 것이기 때문이다. 본원에 제공된 박테리아가 이러한 박테리아를 소모하는 골수성 세포, 예컨대 식세포, 예컨대 마크로페이트(macrophate), 수지상 세포, 단핵구 및 중성구를 감염시키거나 이에 축적되기 때문에, 무손상(intact) △ThyA 박테리아는 표적화된 세포 내부에서 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 방출한다.
박테리아는 이것이 약독화되도록, 예컨대 본원의 박테리아는 톨-유사 수용체(TLR: toll-like receptor) 2, 4 및 5에 의한 반응이 이러한 게놈 변형이 없는 박테리아와 비교하여 감소되도록 게놈-변형되고, 선택적으로 보체에 의한 비활성화를 감소시키기 위해 rck(보체 사멸화(complement killing)에 대한 내성)를 인코딩하고, 필요하다면 이러한 박테리아가 식세포, 예컨대 조직-체류 대식세포를 주로 또는 단독으로 감염시키게 하는 변형을 포함한다. 게놈 변형, 예컨대 TLR 2,4,5에 의한 반응을 감소시키는 변형의 조합은 인간 항원-제시 세포에 의한 유형 I IFN의 생성에 필요한 것으로 본원에 제시된다.
톨-유사 수용체(TLR) 2, 4 및 5에 의한 반응이 게놈 변형이 없는 박테리아와 비교하여 감소되도록 게놈 변형을 함유하는 박테리아가 본원에 제공된다. 이러한 변형은 펜타-아실화된 LPS 및 편모의 무효화를 초래하는 것, 예컨대 편모가 결여된 pagP - /msbB - 박테리아, 및 또한 아스파라기나제 II가 결핍되거나 이를 생성하거나 발현하지 않는 것, 예컨대 ansB - 인 것을 포함한다. 박테리아는 또한 추가의 게놈 변형, 예컨대 박테리아가 필요한 영양소 또는 인자에 대해 영양 요구성이 되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 따라서 이러한 박테리아는 진핵 숙주에서 복제할 수 없으나, 예컨대 티미딜레이트 신타제(△ThyA), 또는 Asd를 생성하거나 발현할 수 없게 하는 게놈 변형에 의해 영양소 또는 인자, 티미딘에 대한 이러한 영양 요구성(△ThyA)과 함께 공급될 때 시험관내에서 복제할 수 있다.
이들 속성 중 일부 또는 모두를 조합하는 본원에 제공된 박테리아는 항암 생성물을 포함한 치료 생성물 및 항원을 이의 의도된 용도에 따라 발현시키는 데 사용된다. 암을 갖는 대상체에게의 투여를 위해, 종양-체류 골수성 세포에 축적되는 박테리아는 항암 치료제, 예컨대 면역 반응의 자극을 초래하고/하거나 면역억제의 저해를 초래하거나, 종양을 치료하는 생성물을 인코딩하는 생성물, 및 상승작용적으로 작용하여 암을 치료할 수 있는 생성물의 조합을 인코딩한다. 식세포에 축적되거나 이를 감염시키는 본원에 제공된 박테리아는 또한 암을 갖지 않는 대상체를 위해 예컨대 항원을 전달하거나 인코딩함으로써 또는 RNA를 전달함으로써 백신으로서 사용될 수 있다. 특성과 생성물, 및 용도의 다양한 구현예 및 조합은 본원 개시내용 전반에 걸쳐 기재된다.
일부 구현예에서, 박테리아는 생성물을 인코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드를 포함하거나, 생성물을 인코딩하는 RNA를 포함하며, 여기서 핵산 또는 RNA에 의해 인코딩되는 생성물은 항원 서열 또는 병원성 바이러스, 박테리아, 기생충으로부터의 서열이거나, 종양 항원이고, 이로써 숙주에서 인코딩된 항원의 발현 시, 숙주는 병원성 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 종양 항원에 대한 면역-보호 반응 또는 면역화 반응을 발달시키거나, 인코딩된 생성물은 치료 생성물이며; 항원 서열(들)의 발현은 원핵 프로모터의 제어 하에 있어서, 항원(들)을 인코딩하는 RNA는 박테리아에서 생성되고; 항원을 인코딩하는 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지만, 진핵 숙주 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지 않는 조절 서열을 포함하며, 이로써 번역은 박테리아에서 전사로부터 디커플링되며; 생성된 박테리아는 진핵 대상체에게 투여될 때 식세포를 감염시키는 데 있어서 선택적이고, 핵산을 RNA가 번역되는 식세포 내로 전달한다.
RNA를 생성하기 위해 시험관내에서 배양되는 박테리아는 투여 시, 식세포를 감염시키고 이의 내용물을 전달하지만, 이는 생존 가능하지 않고/않거나 복제되지 않아서, RNA, 예컨대 mRNA를 숙주 세포에 제공하며, 이는 RNA를 번역하여 인코딩된 생성물, 예컨대 면역원성 단백질 또는 항원을 생성한다. RNA는 일반적으로 mRNA이며, 또한 다른 형태의 RNA, 예컨대 RNAi, 또는 eRNA(원형 RNA) 및 다른 치료적 형태일 수 있다. 이러한 목적에 사용되는 면역자극성 박테리아는 RNA를 인코딩하는 플라스미드를 높은 또는 더 높은(일반적으로 150 이상) 복제수로 포함하여, 전달되는 RNA의 양을 증가시킬 수 있다. 다양한 구현예가 본원에 기재되며, 청구되고, 예시된다. mRNA는 종양 또는 감염의 치료를 위한 병원체 단백질, 병원체 항원, 종양-항원, 치료 생성물 및 이의 조합을 인코딩할 수 있다. mRNA는 합성, 예컨대 면역화를 위해 설계된 것일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공보 제20190351040호, 및 면역화 또는 치료를 위한 mRNA를 기재하는 다른 것 참조). 생성된 박테리아는 요법 또는 면역화를 위한 백신이다. 페이로드는 면역화 항원/단백질과 협력하여 T-세포를 활성화시키기 위해 유형 I 인터페론(IFN)을 유도하는 면역자극성 단백질인 아쥬반트인 생성물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 하기 중에서 선택되는 2개 이상의 치료 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다: a) 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질; b) 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 단백질, 또는 유형 I IFN의 발현을 증가시키도록 증가된 활성을 갖는 이의 변이체, 또는 유형 I IFN의 항시적 발현을 초래하는 이의 변이체 중 하나 이상; 및 c) 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분. 예를 들어, 면역자극성 단백질은 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 또는 이의 충분한 부분이 결여된 공동자극성 분자일 수 있어서, 절두된 공동자극성 분자는 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고, 항원 제시 세포(APC)에 역조절 신호를 할 수 없다. 일부 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 단일 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 사이토카인, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 공동자극성 분자, 및 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중에서 선택되는 적어도 2개의 치료 생성물을 인코딩한다. 예를 들어, 생성물 중 적어도 2개 또는 모두를 인코딩하는 핵산의 발현은 단일 프로모터의 제어 하에 있고, 각각의 생성물을 인코딩하는 핵산은 2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되어, 번역 시, 각각의 생성물은 별개로 발현된다. 각각의 생성물을 인코딩하는 핵산은 세포로부터의 발현된 생성물의 분비를 지시하는 서열을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 적어도 하나의 생성물은 a)로부터 선택되고, 적어도 하나는 b)로부터 선택되며, a)는 IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-23, IL-36 감마, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15/IL-15Rα, IL-15 복합체, 또는 다른 변이체로도 지칭됨), IL-18, 변형되어 IL-2Ra에 결합하지 않는 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 인터페론-α, 인터페론-β, CCL3, CCL4, CCL5, T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질, CD40, CD40 리간드(CD40L), OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), B7-CD28 계열의 구성원, TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원이고; b)는 STING, RIG-I, MDA-5, IRF-3, IRF-5, IRF-7, TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 및 SNRNP200이다. 이는 또한 TGF-베타 저해성 항체, TGF-베타 결합 유인 수용체, 항-IL6 항체, 또는 IL-6 결합 유인 수용체 중 하나 이상을 인코딩할 수 있다.
인코딩된 치료 생성물의 조합의 예는 치료 생성물의 하기 조합 중 임의의 것이다: IL-2 및 IL-12p70; IL-2 및 IL-21; IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(Δcyt가 결실된 세포질 도메인인 4-1BBLΔcyt 포함); IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); IL-15/IL-15Rα 및 IL-12p70; IL-15/IL-15Rα 및 IL-21; IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); IL-12p70 및 IL-21; IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); IL-12p70 및 STING GOF 변이체; IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); IL-12p70 및 IL-18; IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-18; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); TGF-β 유인 수용체 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 및 절두된 세포질 도메인을 갖는 4-1BBL 포함); 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-18; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 항-CTLA-4 항체 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-2, 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-2 및 IL-21; CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-21; CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-18; CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함)); 및 CD40 작용제 및 STING GOF 변이체.
생성물의 다른 조합은 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 기능-획득 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는 STING 키메라를 포함하는 IL-15 및 STING 기능-획득 변이체, 또는 기능-획득 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는 STING 키메라를 포함하는 IL-15Rα-IL-15sc 및 STING 기능-획득 변이체를 포함한다. 다른 생성물 또는 이의 조합은 이중특이적 T-세포 연계자(BiTE®); BiTe® 및 STING 단백질, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 변형된 GOF STING 단백질 또는 STING 키메라; BiTe® 및 IL-15; BiTe® 및 IL-15Rα-IL-15sc; BiTe®, IL-15 및 STING 단백질, 예컨대 변형된 GOF STING 단백질 또는 키메라 STING 단백질; 및 BiTe® IL-15Rα-IL-15sc, 및 STING 단백질, 예컨대 변형된 GOF STING 단백질 또는 키메라 STING 단백질을 포함하며, 여기서, BiTe® 표적은 예를 들어, DLL3, EGFR, Her2, CEA, 메소텔린, PSMA, EpCAM, CD74, 폴레이트 수용체, Nectin4, EphA2, CA-IX, B7H3, Siglec-15, Muc1, 루이스 Y 항원, 및 다른 이러한 종양 항원/ 종양 표적을 포함한다.
또한, 종양 항원(들) 및 STING 기능-획득 변이체 또는 STING 키메라를 함유하는 치료 조성물; 종양 항원(들)과 IL-15의 치료 조성물; 종양 항원(들)과 IL-15Rα-IL-15sc의 치료 조성물; 종양 항원(들), IL-15, 및 STING 기능-획득 변이체 또는 STING 키메라의 치료 조성물; 및 종양 항원(들), IL-15Rα-IL-15sc, 및 STING 기능-획득 변이체 또는 STING 키메라의 치료 조성물이 제공된다. 이러한 생성물은 면역자극성 박테리아에서 인코딩될 수 있다. 종양 항원은 본원에서(예를 들어 실시예 35에서) 임의로 나열되거나 기재되거나 당업계에 알려져 있을 수 있다.
생성물의 조합은 또한, 항원과 면역 자극성 단백질의 조합을 포함한다. 항원은 종양 항원일 수 있거나, 항원은 면역화 항원, 예컨대 병원성 항원일 수 있으며, 여기서 병원체는 예를 들어, 질환 및 장애를 야기하는 박테리아, 원생동물, 바이러스, 및 프리온, 및 다른 프리온-유사 입자를 포함한다. 항원은 본원에서 임의로 나열되거나 기재되거나 당업계에 알려져 있을 수 있다. 조합은 예를 들어, 하나 이상의 항원과 IFNα2; 하나 이상의 항원과 IFN-β; 하나 이상의 항원, IFNα2 및 IFN-β; 하나 이상의 항원과 돌연변이 S396D를 갖는 IRF3 GOF 변이체; 및 하나 이상의 항원, IFNα2, 및 돌연변이 S396D를 갖는 IRF3 GOF 변이체의 조합을 포함한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 인코딩되는 다른 생성물 및 생성물의 조합은 IFNα2와 돌연변이 S396D를 갖는 IRF3 GOF 변이체; IFNα2와 IFN-β; FLT-3L(FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드; 예를 들어, SEQ ID NO: 436 참조); 시알리다제(예를 들어, SEQ ID NO: 435); IL-12p70 단독의 IL-12 p35 하위단위; 아주린; 막 앵커링(anchored)/테터링된(tethered) 사이토카인 또는 분자, 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-12p35, IL-21, IL-15, IL-15Rα-IL-15sc, 또는 FLT-3L; 또는 TLR8 작용제의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 여기서 TL38 작용제는 polyU 또는 polyU/G, microRNA이거나, miR-21이다.
또한, 본원에 기재된 임의의 것을 포함하여 변형된 비-인간 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질, 및 STING 단백질 키메라, 뿐만 아니라 전달 비히클, 약학적 조성물, 이러한 STING 단백질을 인코딩하거나 함유하는 세포, 및 이의 용도, 및 암의 치료 방법이 제공된다. 특히, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 비-인간 STING 단백질, 비-인간 STING 단백질, 및 STING 키메라를 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩되는 이러한 STING 단백질은 본원에 제공되고 전반에 걸쳐 기재된다. 본원에서 하기의 성분이 제공된다:
변형된 비-인간 STING 단백질로서, 비-인간 STING 단백질은 인간 STING 단백질보다 더 낮은 NF-κB 활성화, 및 선택적으로 야생형(WT) 인간 STING 단백질과 비교하여 더 높은 유형 I 인터페론 활성화 활성을 갖는 것이다. 이러한 비-인간 STING 단백질은, 이것이 증가된 활성을 갖거나 세포기질 핵산 신호전달의 부재 하에 항시적으로 작용하도록 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하도록 변형된다. 돌연변이는 전형적으로, 인간에서 인터페론병증에서 발생하는 아미노산 돌연변이, 예컨대 인간 STING에 대해 상기 기재된 것이다. 상응하는 돌연변이는 비-인간 종 STING 단백질 내로 도입되며, 여기서 상응하는 아미노산 잔기는 정렬에 의해 식별된다. 또한 일부 구현예에서, STING 단백질의 C-말단 테일(CTT) 내 TRAF6 결합 부위는 결실되어, NF-κB 신호전달 활성을 감소시킨다.
변형된 STING 단백질, 특히 키메라인 인간 STING 단백질이 제공되며, 여기서 하나의 종, 예컨대 인간으로부터의 STING 단백질 내 CTT(C-말단 테일) 영역은 인간 STING보다 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성 및/또는 더 높은 유형 I IFN 신호전달 활성을 갖는 또 다른 종의 STING 단백질로부터의 CTT로 대체된다. 또한, TRAF6 결합 부위는 이러한 키메라에서 선택적으로 결실된다.
본원의 개시내용 전반에 걸쳐 제시된 바와 같은 돌연변이를 또한 포함하는 2의 변형된 STING 단백질이다.
전달 비히클, 예컨대 면역자극성 박테리아, 및 예를 들어, 임의의 1 내지 3의 변형된 STING 단백질을 인코딩하는 엑소좀, 나노입자, 미니셀, 세포, 리포솜, 리소좀, 종양용해 바이러스, 및 다른 바이러스 벡터를 포함하는 본원에 제공되거나 당업자에게 알려진 임의의 것이 또한 제공된다.
전달 비히클, 예컨대 면역자극성 박테리아, 예를 들어, STING 단백질이 인간 STING과 비교하여 감소된 NF-κB 신호전달 활성, 및 선택적으로 인간 STING과 비교하여 증가된 유형 I 인터페론 자극/신호전달 활성을 갖는 비-인간 종으로부터의 비변형된 STING을 인코딩하는 엑소좀, 나노입자, 미니셀, 세포, 리포솜, 리소좀, 종양용해 바이러스, 및 다른 바이러스 벡터를 포함하는 본원에 제공되거나 당업자에게 알려진 임의의 것이 또한 제공된다.
세포(인간이라면 비-접합체), 예컨대 세포 요법에 사용되는 세포, 예컨대 T-세포 및 줄기세포, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 1 내지 3의 STING 단백질을 생성하는 데 사용되는 세포가 또한 제공된다. 또한, STING 단백질, 또는 전달 비히클, 또는 세포, 또는 이의 조합을 함유하는 약학적 조성물이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 면역자극성 박테리아를 투여함으로써 암의 치료 및 병원체 또는 암에 대한 백신화를 위한 용도 및 방법이 본원에 제공된다.
NF-κB 활성(신호전달 활성), 및 활성을 자극시키는 유형 I 인터페론 또는 STING의 활성을 자극시키는 인터페론-β를 평가하기 위한 검정 및 방법은 본원에 기재되고 또한 당업자에게 알려져 있다. 방법은 예를 들어, 문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175]에 기재된 것을 포함하며, 이는 특히, 인간을 포함한 다양한 종으로부터의 STING 단백질의 인터페론-β 및 NF-κB 신호전달 활성을 기재하여, 인간 STING보다 더 낮은 NF-κB 활성을 갖는 다양한 종으로부터의 STING 단백질, 및 또한 인간 STING과 필적할 만하거나 더 높은 인터페론-β 활성을 갖는 것을 식별한다. de Oliveira Mann 등(2019)은 CTT 도메인을 포함하여 각각의 종에서 종 정렬을 제공하고 STING의 도메인을 식별한다(또한 de Oliveira Mann 등 (2019)에 대한 보조 정보 참조).
비-인간 STING 단백질은 하기 종으로부터의 STING 단백질일 수 있으나 이로 제한되지 않는다: 태즈메이니아 데빌(사르코필루스 하리시이(Sarcophilus harrisii); SEQ ID NO: 349), 마모셋(칼리트릭스 야쿠스(Callithrix jacchus); SEQ ID NO: 359), 소(보스 타우루스(Bos taurus); SEQ ID NO: 360), 고양이(펠리스 카투스(Felis catus); SEQ ID NO: 356), 타조(스트루티오 카멜루스 오스트랄리스(Struthio camelus australis); SEQ ID NO: 361), 따오기(니포니아 니폰(Nipponia nippon); SEQ ID NO: 362), 실러캔스(라티메리아 칼룸내(Latimeria chalumnae); SEQ ID NO: 363-364), 야생돼지(수스 스크로파(Sus scrofa); SEQ ID NO: 365), 박쥐(로우세투스 애깁티아쿠스(Rousettus aegyptiacus); SEQ ID NO: 366), 바다소(트리케쿠스 마나투스 라티로스트리스(Trichechus manatus latirostris); SEQ ID NO: 367), 은상어(칼로린쿠스 밀리이(Callorhinchus milii); SEQ ID NO: 368), 및 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus); SEQ ID NO: 369). 이러한 척추동물 STING 단백질은 인간 세포에서 면역 신호전달을 쉽게 활성화시키며, 이는 STING 신호전달의 분자 기전은 척추동물에서 공유됨을 나타낸다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조).
골수성 세포, 예컨대 종양-체류 및 조직-체류 대식세포를 감염시키는 능력, 및 생존력을 적어도 제한된 시간 동안 보유하는 능력, 및/또는 유형 I IFN의 발현을 초래하기 위해 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드(CDN)를 필요로 하지 않는 기능-획득(GOF) 변이체와 같이 유형 I IFN 및/또는 다른 면역-자극 생성물을 초래하는 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 전달하는 능력 덕택에, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 M2 표현형을 갖는 대식세포를, 면역억제성 특성이 감소되거나 무효화되고 면역-자극성, 항종양 또는 항-바이러스 특성이 증강되거나 첨가된 M1 또는 M1-유사 대식세포로 전환시킬 수 있는 것으로 본원에 제시된다. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 여기서 박테리아에 의한 인간 대식세포를 포함한 대식세포의 감염은 M2 대식세포를 M1 표현형 또는 M1-유사 표현형 대식세포로 전환시킨다. 대식세포에서의 발현이 M2 대식세포, 예컨대 인간 M2 대식세포로부터 M1 또는 M1-유사 표현형의 전환을 초래하거나 전환시키는 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 이러한 특성을 갖는 면역자극성 박테리아는, 종양-체류(암을 갖는 대상체에서), 및 조직-체류 골수성 세포의 감염을 초래하는 게놈 변형을 함유하는 본원에 제공된 임의의 박테리아를 포함한다. 이러한 게놈 변형은 편모의 결여를 초래하는 것, 및 다른 것, 예컨대 pagP - /msbB - 인 박테리아를 초래하는 것을 포함하며, 야생형 박테리아는 편모를 갖는다. 다른 변형은 아스파라기나제 활성의 무효화를 초래하는 것, 예컨대 골수성 세포를 감염시켜 T-세포 활성을 증강시키는 박테리아에서 ansB - 인 박테리아를 초래하는 변형, 및 지질다당류(LPS)를 변경시키는 다른 변형을 포함한다. 본원에 제공된 이러한 면역자극성 박테리아는 면역억제성 포식성 대식세포를, 현장에서 항원을 CD8+ T-세포에 교차-제시할 수 있고 림프절로 이동하여 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 프라이밍할 수 있는 면역자극성 포식성 대식세포로 전환시킨다.
M2 대식세포로부터 M1 대식세포의 일부 또는 모든 특징의 프로파일을 갖는 M1 또는 M1-유사 표현형으로의 전환을 용이하게 하거나 초래하거나 전환시키는 대식세포 내 치료 생성물을 인코딩하는 면역자극성 박테리아가 포함된다. 치료 생성물의 예는 유형 I 인터페론(IFN)의 발현, 특히 항시적 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 것이다. 이는, 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부이고, 유형 I IFN의 발현을 초래하기 위해 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드(CDN)를 필요로 하지 않는 치료 생성물의 기능-획득(GOF) 변이체, 예컨대 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 변이체 및 비-인간 STING 단백질, STING 키메라, 및 기능-획득 돌연변이를 갖는 STING 키메라를 포함한다. 박테리아는 본원에 나열된 종, 예컨대 살모넬라 종 및 균주를 포함하여 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
또한, 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 여기서: 핵산은 원핵 세포에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 포함하고, 이로써 RNA는 박테리아에서 생성되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 예를 들어, RNA는 샤인-달가노 서열이 결여되어 있으며, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 번역 판독물 2A 펩타이드를 포함한다. IRES 서열은 원핵 리보솜에 의한 번역을 방지하지만, 진핵 리보솜에 의한 번역을 제공한다. 박테리아는 다시스트론성 작제물로부터 별개의 생성물을 생성하기 위해 2A 펩타이드가 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 중 하나 이상인 면역자극성 박테리아를 포함한다.
또한, RNA를 진핵 세포, 예컨대 골수성 세포에 전달하기 위한 전달 비히클일 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 면역자극성 박테리아가 제공된다. 이러한 박테리아는 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하며, 여기서: 핵산 및 원핵 프로모터는 일반적으로 플라스미드 상에서 인코딩되지만, 일부 구현예에서 박테리아 게놈에서 인코딩되며; 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 포함하고, 이로써 RNA는 박테리아에서 생성되며, 여기서: RNA는 샤인-달가노 서열이 결여되고, 내부 리보솜 진입 서열(IRES), 또는 번역 판독물 2A 펩타이드를 포함한다. 치료적 단백질(또는 비(非)박테리아 단백질)을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 때 원핵 프로모터는 박테리아 프로모터 또는 파지 프로모터, 예컨대 박테리오파지 프로모터일 수 있다. 파지 프로모터를 인식하는 RNA 폴리머라제는 박테리아 게놈에서 인코딩될 수 있거나, 박테리아에서의 발현을 위해 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있다. 예시적인 원핵 프로모터는 서열이 임의의 SEQ ID NO: 393-396으로 각각 표시된 프로모터 중 전부 또는 충분한 부분(작동 가능하게 연결된 핵산의 전사를 개시하기에 충분함)을 포함하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 알려진 임의의 것을 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
이러한 면역자극성 박테리아는 본원에 기재된 바와 같은 게놈 변형을 포함하며, 이로써 박테리아는 조직-체류 골수성 세포 및/또는 종양-체류 골수성 세포를 감염시키거나 종양을 갖지 않는 대상체에서는 식세포, 예컨대 대식세포를 감염시킨다. 박테리아는 세포를 감염시키고 RNA를 전달하며, 이러한 RNA는 진핵 숙주 세포에서 번역된다. 이러한 박테리아의 예는 예컨대 편모를 생성하는 데 관여하는 유전자의 결실 또는 방해에 의해 편모가 결여되도록 변형된 것을 포함한다. 박테리아는 게놈 변형이 없을 때 편모를 갖는 종 및 균주이다.
또한, 인코딩된 치료 생성물, 예컨대 단백질이 향상된 약리학적 특성, 예컨대 약동학적 또는 약력학적 특성, 예컨대 증가된 혈청 반감기를 부여하는 모이어티에 연결되는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 그러므로, 인코딩된 치료 생성물이 Fc 도메인, 또는 반감기 연장 모이어티, 예컨대 인간 혈청 알부민, 또는 이의 일부를 포함하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 반감기 연장 방식 또는 방법은 예를 들어, PEG화, 글리코실화의 변형, 시알릴화, PAS화(약 100 내지 200개 잔기 길이인 PAS 아미노산의 중합체에 의한 변형), ELP화(예를 들어, 문헌[Floss 등 (2010) Trends Biotechnol. 28(1):37-45] 참조), HAP화(글리신 동종중합체에 의한 변형), 인간 혈청 알부민에의 융합, GLK에의 융합, CTP에의 융합, GLP 융합, 인간 면역글로불린(IgG)의 불변 단편(Fc) 도메인에의 융합, 트랜스페린에의 융합, 비-구조화된 폴리펩타이드, 예컨대 XTEN(rPEG로도 지칭되며, A, E, G, P, S, 및 T를 함유하는 부정확한 반복 펩타이드 서열의 유전적 융합임; 예를 들어, 문헌[Schellenberger 등 (2009) Nat. Biotechnol. 27(12):1186-1190] 참조), 인간 면역글로불린(IgG), 및 크기를 증가시키거나, 유체역학적 반경을 증가시키거나, 변화를 변경하거나, 청소보다는 재순환을 위해 수용체를 표적화하는 다른 이러한 변형과 융합, 및 이러한 변형과 융합의 조합을 포함한다.
또한, 인코딩된 치료 생성물이 B7 단백질 막횡단 도메인을 포함하거나 치료 생성물이 내인성 또는 첨가된 GPI 앵커로 인해 GPI-앵커링되는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 인코딩된 치료 생성물은 콜라겐에의 융합을 포함할 수 있다.
임의의 그리고 모든 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 임의의 적합한 종일 수 있다. 특정 유전자 및 유전자 변형을 참조하는 경우, 유전자 및 변형은 예시적인 종으로서 살모넬라를 참조한 유전자 및 변형에 상응하는 것이다. 종 및 균주는 예를 들어, 리케치아(Rickettsia), 클레브시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 네이쎄리아(Neisseria), 애로모나스(Aeromonas), 프란치셀라(Francisella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 시트로박터(Citrobacter), 클라미디아(Chlamydia), 해모필루스(Haemophilus), 브루셀라(Brucella), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라즈마(Mycoplasma), 레지오넬라(Legionella), 로도콕커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 바실러스(Bacillus), 및 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)의 균주를 포함한다. 예를 들어, 리케치아 리케치애(Rickettsia rickettsiae), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamuchi), 리케치아 무세리(Rickettsia mooseri), 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이쎄리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 유크레노필라(Aeromonas eucrenophila), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 프란치셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 시트로박터 프룬디이(Citrobacter freundii), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 해모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 로도콕커스 에퀴(Rhodococcus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 헬리코박터 무스텔래(Helicobacter mustelae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 로칼리마애 퀸타나(Rochalimaea quintana), 및 애그로박테리움 투메르파시움(Agrobacterium tumerfacium)을 포함한다.
TLR2, TLR4 및 TLR5 신호전달이, 게놈 변형이 없는 박테리아와 비교하여 감소되는 게놈 변형을 포함하는 게놈 변형된 박테리아가 본원에 제공되며, 여기서:
박테리아는, 필요한 영양소 또는 인자에 대한 영양 요구성이어서 이것이 진핵 숙주에서 복제될 수 없으나 영양소 또는 인자가 공급될 때 시험관내에서 복제될 수 있게 하는 게놈 변형을 추가로 포함하며;
박테리아는 핵산을 함유하는 플라스미드를 포함하거나, 항원 서열 또는 병원성 바이러스, 박테리아 또는 기생충으로부터의 서열을 인코딩하거나, 종양 항원을 인코딩하는 RNA를 포함하며, 이로써 숙주에서 인코딩된 항원의 발현 시, 숙주는 병원성 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대해 면역보호 반응을 발달시키고;
항원 서열(들)의 발현은 원핵 프로모터의 제어 하에 있어서, 항원(들)을 인코딩하는 RNA는 박테리아에서 생성되며;
항원을 인코딩하는 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지만 진핵 숙주 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지 않는 조절 서열을 포함하며, 이로써 번역은 박테리아에서 전사로부터 디커플링되고;
생성된 박테리아는 진핵 대상체에게 투여될 때 식세포를 감염시키고, 핵산을 RNA가 번역되는 식세포 내로 전달한다.
항원을 인코딩하는 핵산 서열(들)은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 포함할 수 있으며, 이로써 숙주 세포 번역은 용이하게 되거나 증강되고 박테리아 번역은 저해되거나 방지된다. IRES는 혈관 내피 성장 인자 및 유형 1 콜라겐 유도적 단백질(VCIP; 예를 들어, SEQ ID NO: 434 참조)일 수 있고, 항원을 인코딩하는 핵산(들)은 VCIP IRES 또는 박테리아 번역을 저해하는 다른 IERS를 포함할 수 있다. IRES 또는 VCIP IRES는 프로모터의 3' 및 항원(들) 코딩 서열의 5'인 위치에서 플라스미드에 포함될 수 있다.
병원체는 박테리아 또는 바이러스일 수 있거나, 인코딩된 항원은 종양 항원일 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 만성 바이러스 감염 및 급성 감염을 포함한 바이러스 감염 또는 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기 위한 백신일 수 있다. 감염은 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상 포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 호흡기 융합 바이러스(RSV), 홍역 바이러스, 및 대상체를 만성적으로 감염시키는 다른 바이러스에 의한 감염으로부터의 것일 수 있다. 감염성 병원체는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 또는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2로서, COVID-19를 야기함)일 수 있다.
병원체는 에스케리키아, 스타필로콕커스, 슈도모나스, 또는 포르피로모나스의 종일 수 있거나, 병원체는 피. 긴기발리스, SARS-CoV, 또는 이. 콜라이일 수 있다.
이러한 면역자극성 박테리아에서 플라스미드는 면역자극성 단백질 또는 다른 아쥬반트를 추가로 인코딩할 수 있거나, 면역자극성 단백질 또는 다른 치료 단백질의 조합을 인코딩할 수 있다. 면역자극성 단백질은 STING 단백질, 예컨대 기능-획득 돌연변이를 포함하는 것, 또는 키메라 STING 단백질인 것일 수 있다. 박테리아는 치료 생성물의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 면역자극성 단백질(들) 및/또는 다른 치료 단백질은 플라스미드 상에서 박테리아에 의해 인식되는 원핵 프로모터의 제어 하에 항원과 함께 다시스트론성 서열의 일부로서 인코딩될 수 있거나; 면역자극성 단백질(들) 및/또는 다른 치료 단백질은 플라스미드 상에서 진핵 숙주에 의해 인식되는 진핵 프로모터의 제어 하에 인코딩될 수 있다. 원핵 프로모터는 박테리아 프로모터 또는 박테리아 파지 프로모터일 수 있고, 진핵 숙주는 인간일 수 있다.
면역자극성 박테리아는 원핵 프로모터의 제어 하에 발현되는 항원(들) 및 임의의 다른 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있으며, 이는 시험관내에서 박테리아를 배양함으로써 생성된다. 면역자극성 박테리아는 박테리아가 편모가 결여되고 펜트-아실화된 LPS를 생성하게 하는 게놈 변형을 포함할 수 있고/있거나, 박테리아는 asd - , 및/또는 아데노신 영양 요구체, 및/또는 csgD - 및/또는 ansB - 일 수 있다.
박테리아는 TLR8 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
박테리아는 msbB - /pagP - 일 수 있고/있거나, 편모가 결여될 수 있고/있거나, asd - 일 수 있다.
박테리아는 에스케리키아, 리스테리아, 또는 살모넬라의 종 또는 균주일 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 살모넬라 티피무리움 균주일 수 있고, 비변형된 살모넬라 균주는 야생형 균주이거나, 약독화된 균주이다. 면역자극성 박테리아는 균주 AST-100(VNP20009 또는 YS1646)로부터, 또는 균주 ATCC 14028로부터, 또는 균주 ATCC 14028의 모든 식별 특징을 갖는 균주로부터 유래될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 면역자극성 박테리아는 결실, 삽입, 방해, 및 다른 변형 중 하나 이상인 하나 이상의 게놈 변형을 유전자에 함유할 수 있으며, 이로써 유전자에 의해 인코딩되는 생성물은 생성되지 않거나, 생성된 대로 이거나, 비활성이다.
또한, 본원에 기재되거나 제공된 임의의 면역자극성 박테리아를 약학적으로 허용 가능한 비히클에 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 약학적 조성물은 백신으로서, 예를 들어 액체, 분말 또는 정제로서 제형화될 수 있다. 또한, 질환, 병태, 감염 또는 암을 치료하거나 예방하기 위한(이를 발증시킬 위험을 감소시키기 위한) 박테리아 또는 약학적 조성물의 방법 및 용도, 뿐만 아니라 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기 위한 박테리아의 용도, 및 본원의 박테리아를 투여하는 단계를 포함하는 RNA를 대상체에게 전달하는 방법이 제공된다.
또한, 생성물 또는 생성물들을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아가 제공되며, 여기서 생성물(들)은 치료 생성물(들)이고, 박테리아 내 플라스미드는 생성물(들)을 인코딩하여, 박테리아에 의해 번역되지 않는 mRNA를 생성한다.
박테리아는 본원에 기재된 변형으로 인해 약독화되거나, 저독성 또는 무독성으로 되게 할 수 있다. 박테리아의 예는 살모넬라의 종, 예컨대 살모넬라 티피무리움 균주이다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 보체 사멸화에 대한 내성을 인코딩하는 유전자(rck), 예컨대 살모넬라 rck 유전자를 내인성적으로 인코딩하고 발현하거나, 인코딩하고 발현하도록 변형되는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료적 이. 콜라이는 이것이 전신 투여될 수 있도록 rck를 인코딩하도록 변형된다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이 그리고 청구범위에 제시된 바와 같이, 특히 인간에서 전달 비히클, 세포, 약학적 조성물, 방법, 용도 및 암의 치료가 제공된다. 또한, 치료를 위한 대상체의 선택을 위한 동반 진단 및 방법, 및 치료의 모니터링 방법이 제공된다. 이는 아래 및 또한 청구범위에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본 섹션에 포함된다.
도 1a 내지 도 1c는 플라스미드 pATI-1.75 및 pATI-1.76에서의 삽입물을 도시한다(각각 도 1a 및 도 1b). 도 1c는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이 진핵 세포, 예컨대 골수성 세포에서 번역을 위해 코작(Kozak) 서열로 대체됨을 도시한다.
도 2는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 태즈메이니아 데빌 STING(SEQ ID NO: 349) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 3은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 마모셋 STING(SEQ ID NO: 359) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 4는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 소 STING(SEQ ID NO: 360) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 5는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 고양이 STING(SEQ ID NO: 356) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 6은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 타조 STING(SEQ ID NO: 361) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 7은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 따오기 STING(SEQ ID NO: 362) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 8은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 실러캔스 STING(SEQ ID NO: 363) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 9는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 306) 및 제브라피쉬 STING(SEQ ID NO: 348) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 10은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 305) 및 야생돼지 STING(SEQ ID NO: 365) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 11은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 305) 및 박쥐 STING(SEQ ID NO: 366) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 12는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 305) 및 바다소 STING(SEQ ID NO: 367) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 13은 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 305) 및 은상어 STING(SEQ ID NO: 368) 단백질의 정렬을 도시한다.
도 14는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 305) 및 마우스 STING(SEQ ID NO: 369) 단백질의 정렬을 도시한다.
개요
A. 정의
B. 암 요법을 위한 면역자극성 박테리아의 개요
1. 박테리아 암 면역요법
2. 종양 미세환경을 표적화하는 선행 요법
a. 자가 T-세포 요법의 한계
b. 바이러스 백신 플랫폼
c. 박테리아 암 요법
i. 리스테리아
ii. 살모넬라 종
iii. VNP20009
iv. 야생형 균주
3. 기존의 박테리아 암 면역요법의 한계
C. 종양-체류 골수성 세포에서 치료 지수를 증가시키고 축적을 증가시키기 위한 면역자극성 박테리아의 변형 및 증강
1. LPS 생합성 경로에서 유전자의 결실
a. msbB 결실
b. pagP 결실 또는 비활성화
2. 영양소 영양요구성
a. purI 결실/방해
b. 아데노신 영양요구성
c. 티미딘 영양요구성
3. 플라스미드 유지 및 전달
a. asd 결실
b. endA 결실/방해
4. 플라젤린 넉아웃 균주
5. 적응 면역력을 촉진하고 T-세포 기능을 증강시키기 위한 박테리아의 조작
L-아스파라기나제 II ( ansB ) 결실/방해
6. 컬리 핌브리애 csgD 결실을 생성하는 데 필요한 살모넬라 유전자에서의 결실/방해
7. 보체에 대한 내성의 향상
Rck 발현
8. 살모넬라 및 다른 그람-음성 박테리아에서 지질단백질 발현에 필요한 유전자의 결실
9. 강력한 면역자극성 박테리아로서, 이의 게놈은 항종양 요법에 대해 최적화되고 복수의 치료 생성물을 포함한 치료 생성물을 인코딩한다
10. 진핵 숙주에서의 발현을 위해 mRNA 및 다른 형태의 RNA를 포함한 RNA를 전달하는 백신 및 박테리아
11. 항병원체 치료 및 백신으로서 사용하기 위한, 그리고 항암 치료 및/또는 예방을 위한, 병원체로부터의 항원 및 또한 종양으로부터의 항원을 포함한 특정 항원에 대한 박테리아 백신
12. M2 표현형 대식세포로부터 M1 및 M1-유사 표현형 대식세포로의 전환
D. 종양 미세환경에서 면역 반응을 자극시키는 유전자 페이로드를 인코딩하는 증강된 치료 지수를 갖는 면역자극성 박테리아
1. 면역자극성 단백질
a. 사이토카인 및 케모카인
b. 공동자극성 분자
2. 면역 반응 및/또는 유형 I IFN을 자극시키는 항시적 활성 단백질, 비-인간 STING 단백질, STING 키메라, 및 변형된 형태
a. 항시적 STING 발현 및 기능-획득 돌연변이
b. 항시적 IRF3 발현 및 기능-획득 돌연변이
c. 증가된 또는 항시적 활성을 갖는 비-인간 STING 단백질과 이의 변이체, 및 증가된 또는 항시적 활성을 갖는 STING 키메라와 이의 변이체
d. 세포기질성 DNA/RNA 센서 및 이의 항시적 변이체로서 작용하는 다른 유전자 생성물
i. RIG-I
ii. MDA5/IFIH1
iii. IRF7
e. 다른 유형 I IFN 조절 단백질
3. 항체 및 항체 단편
a. TGF-β
b. 이중특이적 scFvs 및 T-세포 연계자
c. 항-PD-1, 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체
i. 항-PD-1/항-PD-L1 항체
ii. 항-CTLA-4 항체
d. 추가 예시적인 체크포인트 표적
4. 면역조절성 단백질의 조합은 상승작용 효과 및/또는 보체 효과를 가질 수 있다
5. 전구약물을 활성화시키는 분자
6. 병용 요법을 전달하는 면역자극성 박테리아
E. 항바이러스 치료제로서의 그리고 다른 감염성 병원체에 대한 치료제로서의 면역자극성 박테리아
F. 박테리아 전달을 위한 치료 생성물을 인코딩하는 예시적인 플라스미드의 작제
1. 단백질의 이종성 발현을 위한 항시적 프로모터
2. 다수의 치료 생성물 발현 카세트
a. 단일 프로모터 작제물
b. 이중/다중 프로모터 작제물
3. 조절 요소
a. 전사-후 조절 요소
b. 폴리아데닐화 신호 서열 및 종결인자
c. 인핸서
d. 분비 신호
e. 박테리아 적합도의 향상
4. 복제 원점 및 플라스미드 복제수
5. CpG 모티프 및 CpG 섬
6. 플라스미드 유지/선택 구성요소
7. DNA 핵 표적화 서열
G. 백신 및 치료제로서 사용하기 위한 예시적인 박테리아 균주 및 작용 기전
1. 예시적인 면역자극성 박테리아 - 현장에서의 암 백신화 작용 기전(MOA)
2. 말초 암 백신화를 위한 예시적인 면역자극성 박테리아 및 작용 기전
3. 병원체 백신화를 위한 예시적인 면역자극성 박테리아 및 MOA
H. 약학적 생성, 조성물, 및 제형
1. 제조
a. 세포 은행 제조
b. 약물 성분 제조
c. 약품 제조
2. 조성물
3. 제형
a. 액체, 주사제, 에멀젼
b. 건조된 열안정성 제형
4. 다른 투여 경로를 위한 조성물
5. 투여량 및 투여
6. 포장 및 제조 물품
I. 치료 방법 및 용도
1. 치료를 위한 환자 선택 및 치료 모니터링을 위한 진단
a. 환자 선택
b. 면역자극성 박테리아의 활성을 평가하거나 검출하기 위한 진단은 치료의 효과성을 나타낸다
2. 종양
3. 투여
4. 모니터링
J. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명(들)이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 전체에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 애플리케이션 및 간행물, GenBank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 공개된 자료는 달리 명시되지 않는 한 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에서 복수의 용어 정의가 있는 경우에는 이 섹션의 정의가 우선한다. URL 또는 다른 식별자 또는 주소에 대한 참조가 있는 경우 이러한 식별자는 변경될 수 있으며 인터넷에서 특정 정보가 왔다 갔다 할 수 있지만 인터넷 검색을 통해 동등한 정보를 찾을 수 있다. 이에 대한 참조는 해당 정보의 적용성 및 공개 배포를 증명한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 박테리아"는 인간과 같은 대상체에게 투여될 때 항암 또는 항종양 요법과 같은 요법에 영향을 미치는 박테리아이다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역자극성 박테리아"는 대상체에게 도입될 때 면역특혜 조직 및 세포, 예컨대 종양, 종양 미세환경 및 종양-체류 면역 세포에 축적되고, 면역자극성이거나 면역 자극을 초래하는 생성물을 복제 및/또는 발현하는 치료 박테리아이다. 예를 들어, 면역자극성 박테리아는 감소된 독성 또는 병원성 및/또는 독성 또는 병원성을 감소시키는 인코딩된 생성물 덕분에 숙주에서 약독화되는데, 이는 주로 면역 특권이 있는 환경, 예컨대 종양 미세환경(TME)을 제외하고는 면역자극성 박테리아가 생성물을 복제 및/또는 발현할 수 없기 때문이다(또는 감소된 복제/생성물 발현을 가짐). 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 생성물 또는 생성물들을 인코딩하도록, 그리고/또는 이를 면역자극성으로 만드는 속성 또는 특성을 나타내도록 변형된다. 면역자극성 박테리아는 또한, 내인성 생성물 또는 생성물들이 발현되지 않게 하는 게놈 변형을 추가로 포함한다. 박테리아는 이러한 생성물(들)에서 결실되는 것이라고 할 수 있다. 당업자는 유전자가 트랜스포존의 전위 또는 삽입을 포함한 결실, 방해, 삽입, 및 유전자 생성물을 무효화시키는 임의의 다른 변화에 의해 비활성화될 수 있음을 인식한다. 이는 트랜스포존의 전위 또는 포함을 포함한 삽입, 결실, 및/또는 방해에 의해 달성될 수 있다. 비활성화되는 유전자의 예는 예를 들어, msbB, pagP, ansB, 컬리 핌브리애를 인코딩하는 유전자(들), 박테리아에서 편모가 결여되는 편모를 인코딩하는 유전자, 및 본원에 기재되고/되거나 당업자에게 알려진 다른 변형을 포함한다. 당업자는 또한, 다양한 박테리아 종의 상응하는 유전자가 상이한 명칭을 가질 수 있음을 이해한다. 면역자극성 박테리아에서의 인코딩된 생성물, 특성 및 속성은 예를 들어 하기 중 적어도 하나를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 사이토카인, 케모카인 또는 공동자극성 분자와 같은 면역자극성 단백질; 세포기질성 DNA/RNA 센서 또는 이의 기능-획득 또는 항시적으로 활성인 변이체(예를 들어, STING, IRF3, IRF7, MDA5, RIG-I); 예를 들어 TREX1, PD-1, CTLA-4 및/또는 PD-L1과 같은 면역 체크포인트를 표적화하거나, 방해하거나, 저해하는 siRNA(shRNA 및 microRNA) 또는 CRISPR와 같은 RNAi; 항-면역 체크포인트 항체, 항-IL-6 항체, 항-VEGF 항체 또는 TGF-β 저해 항체와 같은 항체 및 이의 단편; 이중특이적 T-세포 연계자(BiTE® 항체)와 같은 다른 항체 작제물; TGF-β, 또는 TGF-β 길항 폴리펩타이드에 결합하기 위한 유인물로 작용하는 가용성 TGF-β 수용체; 및 IL-6 결합 유인 수용체. 면역자극성 박테리아는 또한 면역억제성인 대사산물 또는 아데노신과 같은 면역억제성 경로에 있는 대사산물에 대해 박테리아를 영양요구성으로 만드는 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 균주 명칭 VNP20009(예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 99/13053 참조, 또한 미국 특허 번호 6,863,894 참조), YS1646 및 41.2.9는 상호 교환적으로 사용되며 각각 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되어 있으며 수탁 번호 202165로 표기된 균주를 지칭한다. VNP20009는 msbB 및 purI에 결실을 포함하고 야생형 에스. 티피무리움 균주 ATCC #14028에서 생산된 살모넬라 티피무리움의 변형된 약독화 균주이다.
본원에 사용된 바와 같이, 균주 명칭 YS1456 및 8.7은 상호 교환적으로 사용되며, 각각은 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되고 수탁 번호 202164로 표기된 균주를 지칭한다(미국 특허 번호 6,863,894 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 박테리아가 특정 균주로부터 "유래"된다는 언급은 이러한 균주가 출발 물질로서 역할을 할 수 있고 특정 박테리아를 초래하도록 변형될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 카세트"는 치료 생성물 또는 다른 단백질과 같은 페이로드를 인코딩하는 개방 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된, 유전자 발현을 위한 조절 서열을 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2A 펩타이드는 진핵생물 세포에서 번역 동안 폴리펩타이드의 절두를 매개하는 18-22개의 아미노산(aa) 길이의 바이러스 올리고펩타이드이다."2A"라는 명칭은 바이러스 게놈의 특정 영역을 지칭하며, 상이한 바이러스 2A는 일반적으로 이것이 유래된 바이러스의 이름을 따서 명명되었다. 이의 예는 F2A(수족구병 바이러스 2A), E2A(말 비염 A 바이러스), P2A(돼지 테스코바이러스-1 2A) 및 T2A(토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A)이다. 예를 들어, 인코딩 서열에 대해서는 Liu 등(2017) Scientific Reports 7:2193, 도 1을 참조한다. SEQ ID NO: 327-330을 또한 참조한다. 이러한 펩타이드는 일반적으로 DxExNPGP의 핵심 서열 모티프를 공유하며, 많은 수의 바이러스 계열에서 발생한다. 이는 리보솜이 펩타이드 결합을 만드는 데 실패하도록 하여 다단백질(polyprotein)을 분해하는 데 도움을 준다. 2A 펩타이드는 다수의 단백질이 단일 개방 리딩 프레임(ORF)으로부터 발현되는 다시스트론성/다중시스트론성 벡터를 제공한다. 본원의 목적을 위해, 2A 펩타이드는 천연 발생하는 것, 및 이의 임의의 변형된 형태, 예를 들어 본원에 개시된 것을 포함하여 임의의 천연 발생 2A 펩타이드와 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 것을 포함하며, 이는 복수(2개 이상)의 개방 리딩 프레임을 포함하는 전사체로부터 단일 폴리펩타이드가 전사 및 번역되게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "인터페론병증"은 인터페론의 발현을 조절하거나 유도하는 경로에 관여하는 유전자 생성물의 돌연변이에 의한 인터페론의 상향조절과 관련된 장애를 지칭한다. 생성물의 활성은 일반적으로 세포기질 DNA 또는 RNA 또는 뉴클레오타이드와 같은 매개체에 의해 조절되며; 단백질 생성물이 돌연변이되면 활성은 항시적이다. 유형 I 인터페론병증은 중증 형태의 아이카르디-구티에르 증후군(AGS: Aicardi-Goutieres Syndrome)과 경증의 가족성 아동 루푸스(FCL: Familial Chilblain Lupus)를 포함한 다양한 스펙트럼을 포함한다. 이러한 특성을 갖는 돌연변이된 생성물을 인코딩하는 핵산 분자는 정상 활성을 갖는 대립유전자의 생성물과 비교하여 생성물에서 기능-획득을 초래하는 돌연변이를 선택하는 것과 같이 시험관내에서 생성될 수 있거나, 본원에 기재된 질환-연관 기능-획득 돌연변이와 비교하여 추가의 기능-획득을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "기능-획득 돌연변이"는 돌연변이가 없는 동일한 단백질과 비교하여 단백질의 활성을 증가시키는 것이다. 예를 들어, 단백질이 수용체인 경우 리간드에 대한 친화도가 증가할 것이며; 이것이 효소라면 항시적 활성을 포함하여 활성이 증가할 것이다. 특히, STING, IRF3, IRF7, MDA5, RIG-I와 같은 생성물에 관하여, 항시적으로 활성인 생성물은 이의 활성화 리간드, 예컨대 STING의 경우 cGAS의 부재 하에, 그리고/또는 세포기질 핵산, 예컨대 DNA, RNA, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드, 환식 뉴클레오타이드 및/또는 환식 디뉴클레오타이드 또는 다른 핵산 분자의 부재 하에 유형 I 인터페론의 생성을 유발하는 활성 생성물이다. 세포기질에서 이러한 핵산 분자는 바이러스 또는 박테리아 감염 및/또는 방사선 또는 다른 이러한 노출로부터 발생하여, 이러한 병원체에 대한 숙주 내 면역 반응의 활성화를 유발한다.
본원에 사용된 바와 같이, "복제 원점"은 염색체, 플라스미드, 또는 바이러스에서 복제가 개시되는 DNA 서열이다. 박테리아 플라스미드와 작은 바이러스를 포함한 작은 DNA의 경우 단일 기원으로 충분하다.
복제 원점은 선택한 복제 원점에 따라 벡터 복제수를 결정한다. 예를 들어, 발현 벡터가 저-복제수 플라스미드 pBR322에서 유래된 경우 복제수는 약 15-20 복제/세포이고, 고-복제수 플라스미드 pUC에서 유래된 경우 복제수는 500-700 복제/세포일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포 내 플라스미드의 중-복제수는 약 150 또는 150 미만이고, 저-복제수는 5-30, 예를 들어 20 또는 20 미만이다. 중 내지 저 복제수는 150 복제수/세포 미만이다. 셀. 고-복제수는 150 복제수/세포 초과이다.
본원에 사용된 바와 같이, "CpG 모티프"는 중앙 CpG를 플랭킹하는 적어도 하나의 염기(3' 및 5' 쪽)에 의해 둘러싸인 비메틸화된 중앙 CpG를 포함하는 염기 패턴이다("p"는 연속적인 C 및 G 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 연결부를 지칭함). CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드는 길이가 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드이고 비메틸화된 CpG를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 적어도 5' CG 3'의 C는 비메틸화된다.
본원에 사용된 바와 같이, "RIG-I 결합 서열"은 5' 트리포스페이트(5'ppp) 구조를 직접 지칭하거나, 또는 폴리(dA-dT) 서열로부터 RNA pol III에 의해 합성되는 것으로, 이는 RIG-I와의 상호 작용으로 인해 RIG-I 경로를 통해 유형 I IFN을 활성화시킬 수 있다. RNA는 적어도 4개의 A 리보뉴클레오타이드(A-A-A-A)를 포함하고; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상을 포함할 수 있다. RIG-I 결합 서열은 polyA로의 전사를 위해 박테리아의 플라스미드에 도입된다.
본원에 사용된 바와 같이, "사이토카인"은 세포 신호전달에 중요한 작은 단백질(약 5-20 kDa)의 광범위하고 느슨한 범주이다. 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함한다. 사이토카인은 면역 반응에서 세포간 소통을 돕고 염증, 감염 및 외상 부위로의 세포의 이동을 자극하는 세포 신호전달 분자이다.
본원에 사용된 바와 같이, "케모카인"은 케모카인 수용체에 결합하고 천연 공급원으로부터 단리된 단백질, 뿐만 아니라 재조합 수단 또는 화학적 합성에 의해 합성적으로 제조된 단백질을 포함하는 화학유인체(주화성) 사이토카인을 지칭한다. 예시적인 케모카인은 IL-8, IL-10, GCP-2, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG (CXCL9), CXCL10(IP-10), CXCL11, PF4, SDF-1α, SDF-1β, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1α (CCL3), MIP-1β(CCL4), MIP-1γ (CCL9), MIP-2, MIP-2α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, ALP, 렁카인(lungkine), Tim-1, 에오탁신(eotaxin)-1, 에오탁신-2, I-309, SCYA17, TRAC, RANTES(CCL5), DC-CK-1, 림포탁틴(lymphotactin), 및 프랙탈카인(fractalkine), 및 당업자에게 알려진 다른 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 케모카인은 염증 부위로의 면역 세포의 이동, 뿐만 아니라 면역 세포의 성숙화 및 적응 면역 반응의 생산에 관여한다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역자극성 단백질"은 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 나타내거나 촉진하는 단백질이다. 이러한 단백질의 예는 사이토카인, 케모카인, 및 공동자극성 분자, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, IFN-α, IFN-β, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(본원에 제시된 IL-15/IL-15Rα, IL-15Rα-IL-15sc, IL-15 복합체, 및 다른 변이체로도 본원에서 지칭됨), IL-36 감마, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10(IP-10), CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, 잠재적인 T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하는 분자, CD40, CD40 리간드(CD40L), OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), 결실된 세포질 도메인 또는 부분적으로 결실된(절두된) 세포질 도메인을 갖는 4-1BBL(1BBLΔcyt), B7-CD28 계열의 구성원, 및 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원이다.
면역자극성 단백질 중에는 항원 제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 각각 완전 또는 부분 세포질 도메인 결실을 갖는 예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1 및 OX40L과 같은 절두된 공동자극성 분자가 존재한다. 이러한 절두된 유전자 생성물, 예컨대 세포질 도메인의 결실 또는 부분 결실을 갖는 것은, 이것이 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있도록 절두되지만, 결실된 또는 절두된 세포질 도메인으로 인해 APC에 역조절 신호를 할 수 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포질 도메인 결실"은, 단백질의 세포질, 또는 세포내, 도메인을 포함하는 아미노산 잔기 중 모두 또는 일부의 결실이며, 여기서 결실은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포로의 항시적 면역자극성 신호전달을 발휘하기에 충분하고, APC로의 역조절 신호전달을 저해하기에 충분하다. 예를 들어, 인간 4-1BBL(TNFSF9라고도 함)의 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 342의 아미노산 잔기 1-28을 포함한다. 인간 CD80의 세포질 도메인은 단백질의 아미노산 잔기 264-288을 포함하며; 인간 CD86의 세포질 도메인은 단백질의 아미노산 잔기 269-329를 포함하고; 인간 CD27L(CD70으로도 알려져 있음)의 세포질 도메인은 단백질의 아미노산 잔기 1-17을 포함하며; 인간 B7RP1(ICOSLG 또는 ICOS 리간드로도 알려져 있음)의 세포질 도메인은 단백질의 아미노산 잔기 278-302를 포함하고; 인간 OX40L(TNFSF4 또는 CD252로도 알려져 있음)의 세포질 도메인은 단백질의 아미노산 잔기 1-23을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유인 수용체"는 특정 성장 인자 또는 사이토카인에 특이적이고 효율적으로 결합할 수 있지만 의도된 수용체 복합체를 구조적으로 신호화하거나 활성화시킬 수 없는 수용체이다. 유인 수용체는 리간드에 결합하고 이것이 이의 동족(cognate) 수용체에 결합하는 것을 방지함으로써 저해제로서 작용한다.
예를 들어, TGF-β 계열 수용체는 이량체화된 리간드의 존재 하에 헤테로머 복합체를 형성하는 세포-표면 세린/트레오닌 키나제 수용체 유형 I(TβRI 또는 TGFβR1) 및 유형 II(TβRII 또는 TGFβR2), 뿐만 아니라 유형 III 수용체 베타글리칸(TβRIII 또는 TGFβR3)을 포함한다. TGF-β가 이의 수용체에 결합하는 것을 방지하는 TGF-β에 대한 가용성 유인 수용체는 TβRI, TβRII, 또는 TβRIII(β글리칸)의 가용성 세포외 도메인(TGF-β 결합 영역)을 포함하며, 이는 다른 분자, 예컨대 Fc 도메인과 융합될 수 있다. 추가로, BAMBI(골형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 및 액티빈(activin) 막-결합된 저해제)는 유형 I 수용체와 구조적으로 관련이 있고, 수용체 활성화를 저해하는 유인으로서 작용한다. TGFβR2 및 막횡단 영역을 포함하지만 신호전달에 필요한 세포질 도메인이 결여된 우성 음성(dominant negative) TGFβR2(DN-TGFβR2)가 또한 TGF-β 유인 수용체로서 사용될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공보 WO 2018/138003호 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 공동자극성 분자 작용제는 공동자극성 분자에 결합 시 이를 활성화시키거나 이의 활성을 증가시키는 분자이다. 예를 들어, 작용제는 작용제 항체일 수 있다. CD40 작용제 항체는 예를 들어, CP-870,893, 다세투주맙(dacetuzumab), ADC-1013(미타잘리맙(mitazalimab)), 및 Chi Lob 7/4를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로는 DNA, RNA, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드, 환식 뉴클레오타이드 및/또는 환식 디뉴클레오타이드 또는 다른 핵산 분자의 존재에 의해 개시되어 유형 I 인터페론의 생성을 유발하는 것이다. 세포기질 내 핵산 분자는 바이러스나 박테리아 또는 방사선이나 다른 이러한 노출로부터 발생하여, 숙주에서 면역 반응의 활성화를 유발한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유형 I 인터페론 경로 단백질"은 내재성 면역 반응, 예컨대 유형 I 인터페론의 유도를 유도하는 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포기질성 DNA/RNA 센서"는 면역 반응 매개자, 예컨대 유형 I 인터페론의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 부분인 단백질이다."세포기질성 DNA/RNA 센서"는 유형 I 인터페론 경로 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 그리고 당업자에게 알려진 바와 같이, 세포기질 DNA는 cGAS에 의해 감지되어, cGAMP의 생성 및 후속적인 STING/TBK1/IRF3 신호전달, 및 유형 I IFN 생성을 유발한다. 박테리아 환식 디뉴클레오타이드(CDN, 예컨대 박테리아 환식 디-AMP)가 또한 STING을 활성화시킨다. 그러므로, STING은 유형 I 인터페론을 유도하는 면역조절성 단백질이다. 5'-트리포스페이트 RNA 및 이중 가닥 RNA는 RIG-I 및 MDA-5 단독, 또는 MDA-5/LGP2에 의해 감지된다. 이는 미토콘드리아 MAVS(미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질)의 중합을 유발하고, 또한 TANK-결합 키나제 1(TBK1) 및 인터페론 조절 인자 3(IRF3)을 활성화시킨다. 이러한 경로에서 단백질은 면역자극성 단백질이고, 내재성 면역 반응 매개자, 예컨대 유형 I 인터페론의 발현을 유발한다. DNA/RNA 센서 경로에서 면역조절성 단백질은, 이것이 증가된 활성을 갖거나 세포기질 핵산 및/또는 활성화/자극성 리간드의 부재 하에 항시적으로 작용하여 면역 반응, 예컨대 유형 I 인터페론의 발현을 유발하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 내재성 면역 단백질 STING의"카르복시-말단 테일" 또는 "C-말단 테일"(CTT)은, 야생형 STING 단백질에서 가요성 링커 영역에 의해 cGAMP-결합 도메인에 의해 부착되는 STING 단백질의 C-말단 부분을 지칭한다. CTT는 IRF3 결합 부위, TBK1 결합 부위 및 TRAF6 결합 부위를 포함한다. STING은 TANK-결합 키나제 1(TBK1)에 의한 STING 단백질 C-말단 테일(CTT)의 인산화를 통해 인터페론 베타(IFN-β) 생성의 유도를 촉진한다. STING과 TBK1 사이의 상호작용은 STING의 카르복시-말단 테일(CTT)에 있는 8개 아미노산 잔기의 진화적으로 보존된 스트레치에 의해 매개된다. TRAF6은 STING에서 K63-연결 유비퀴틴 사슬의 형성을 촉매하여, 전사 인자 NF-κB의 활성화와 대체 STING-의존 유전자 발현 프로그램의 유도를 유발한다. CTT에서 TRAF6 결합 부위의 결실 또는 방해는 NF-κB 신호전달의 활성화를 감소시킬 수 있다. 인간 STING CTT(또는 이의 일부)를 낮은 NF-κB 활성화를 갖는 종의 STING 단백질로부터의 CTT(또는 이의 상응하는 부분)로 치환하면, 생성된 변형된 인간 STING 단백질에 의한 NF-κB 활성화를 저하시킬 수 있다. STING CTT는 STING 인산화 및 IRF3 모집에 필요한 서열 모티프를 함유하는 약 40개 아미노산의 비구조화된 스트레치이다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조). 인간 STING 잔기 S366은 인터페론 신호전달을 활성화하는 내재성 면역 어댑터 단백질 중에서 공유되는 LxIS 모티프의 일부인 1차 TBK1 인산화 부위로 식별되었다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조). 인간 STING CTT는 TBK1 결합에 필요한 잔기 L374를 포함하는 제2 PxPLR 모티프를 함유하며; LxIS 및 PxPLR 서열은 척추동물 STING 대립유전자 중에서 보존된다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조). 예시적인 STING CTT 서열, 및 IRF3, TBK1 및 TRAF6 결합 부위는 하기 표에 제시되어 있다:
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본원에 사용된 바와 같이, "종양-체류 면역 세포에서 더 적은 세포 사멸을 유도"하거나"면역 세포에서 더 적은 세포 사멸을 유도"하도록 변형된 박테리아는 변형이 없는 박테리아보다 독성이 적거나 독성이 없는 박테리아와 비교하여 독성이 감소한 박테리아이다. 이러한 변형의 예는 식세포에서 파이롭토시스(pyroptosis)를 무효화하고 박테리아의 지질다당류(LPS) 프로파일을 변경하는 변형이다. 이러한 변형에은는 플라젤린 유전자, pagP, 또는 hilA, 간상체 단백질(예를 들어, prgJ), 침 단백질(예를 들어, prgI) 및 QseC와 같은 SPI-1 경로의 하나 이상의 구성요소의 방해 또는 결실을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양-체류 면역 세포를 우선적으로 감염시키도록 변형된" 또는 "면역 세포를 우선적으로 감염시키도록 변형된"박테리아는 면역 세포 이외의 세포를 감염시키는 이의 능력을 감소시키는 게놈에 변형을 갖는다. 이러한 변형의 예는 유형 3 분비 시스템 또는 유형 4 분비 시스템을 방해하는 변형 또는 박테리아가 비면역 세포를 침범하는 능력에 영향을 미치는 다른 유전자 또는 시스템을 방해하는 변형이다. 예를 들어, 변형은 SPI-1 구성요소의 방해/결실을 포함하는데, 이는 상피 세포와 같은 세포의 감염에 필요하지만 살모넬라에 의한 식세포와 같은 면역 세포의 감염에는 영향을 미치지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형"은 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드 서열의 변형과 관련되며, 각각 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 대체를 포함한다. 폴리펩타이드를 변형시키는 방법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자에게 일상적이다.
본원에 사용된 바와 같이, 박테리아 게놈, 또는 플라스미드, 또는 유전자에 대한 변형은 핵산의 결실, 대체 및 삽입을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, RNA 간섭(RNAi)은 표적화된 mRNA 분자를 중화시켜 표적화된 유전자의 번역 및 이의 발현을 저해함으로써 RNA 분자가 유전자 발현 또는 번역을 저해하는 생물학적 과정이다.
본원에 사용된 바와 같이, RNAi를 통해 작용하는 RNA 분자는 표적화된 유전자의 발현의 침묵화로 인해 저해제로 지칭된다. 침묵화 발현은, 표적화된 유전자의 발현이 감소되거나, 억제되거나, 저해되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, RNAi를 통한 유전자 침묵화는 표적화된 유전자의 발현을 저해하거나, 억제시키거나, 방해하거나, 침묵화시킨다고 한다. 표적화된 유전자는 저해 RNA 내 서열에 상응하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하여, 저해 RNA는 표적 mRNA의 발현을 침묵화시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적 유전자를 저해, 억제, 방해 또는 침묵시키는 것은 표적 유전자의 번역과 같은 발현을 변경하여 표적 유전자에 의해 인코딩되는 생성물의 활성 또는 발현이 감소되는 과정을 지칭한다. 감소는 완전 넉아웃 또는 부분 넉아웃을 포함하며, 이에 의해 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 및 본원의 투여를 참조하여 치료가 발휘된다.
본원에 사용된 바와 같이, 소형 간섭 RNA(siRNA)는, 특정 서열에서 메신저 RNA(mRNA)에 결합하고 이의 분해를 촉진하여 단백질의 번역을"간섭"하는 데 사용될 수 있는 각각의 단부에 3' 돌출부(overhang)(2개 뉴클레오타이드)가 있는 일반적으로 약 21개 뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥(ds) RNA의 작은 조각이다. 그렇게 함으로써, siRNA는 상응하는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열에 기초한 특정 단백질의 생성을 방지한다. 이 과정을 RNA 간섭(RNAi)이라고 하며 siRNA 침묵 또는 siRNA 녹다운이라고도 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 짧은 헤어핀 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)는 RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키는 데 사용될 수 있는 밀착 헤어핀 회전을 갖는 인공 RNA 분자이다. 세포에서 shRNA의 발현은 전형적으로 플라스미드의 전달에 의해, 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 종양 미세환경(TME)은 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 골수-유래 염증 세포, 림프구, 신호전달 분자 및 세포외 기질(ECM)을 포함하여 종양이 존재하는 세포 환경이다. 존재하는 상태는 혈관 생성 증가, 저산소증, 낮은 pH, 젖산 농도 증가, 피루브산 농도 증가, 간질액 압력 증가, 대사 생성물 또는 대사 변경, 예를 들어, 아데노신 수치 증가를 포함되지만 이로 제한되지 않으며, 이는 종양을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 면역 결핍 종양 또는 면역-배제 종양은 종양 침윤성 T-세포가 없는 종양이다. 면역 결핍 종양은 고형 종양이며, 여기서 최소 이펙터 면역 세포는 종양에 침윤하고, 종양에 존재한 면역 반응의 결여가 존재한다. 결핍 종양은 종양-침윤성 림프구가 없고, CD8+ T-세포는 실질(parenchyma), 기질(stroma), 및 종양 주변부를 포함한 종양으로부터 부재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "박토펙션"은 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포 내로의 유전자 또는 플라스미드 DNA의 박테리아-매개 전달을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간 유형 I 인터페론(IFN)은 면역계의 활성을 조절하는 인터페론 단백질의 하위군이다. 모든 유형 I IFN은 IFN-α 수용체와 같은 특정 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다. 유형 I 인터페론은 무엇보다도 IFN-α 및 IFN-β를 포함한다. 골수성 세포는 주로 내재성 면역 반응에 관여하는 항바이러스 활성을 갖는 IFN-α 및 IFN-β의 주요 생성자이다. IFN-β의 2개 유형은 IFN-β1(IFNB1) 및 IFN-β3(IFNB3)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "M1 대식세포 표현형" 및 "M2 대식세포 표현형"은 대식세포 표현형이 나뉘는 2개의 광범위한 군을 지칭한다: M1(고전적으로 활성화된 대식세포)과 M2(대안적으로 활성화된 대식세포). M1 대식세포의 역할은 전염증성 사이토카인과 케모카인을 분비하고 항원을 제시하여, 이것이 긍정적인 면역 반응에 참여하고 면역 모니터로서의 기능을 하도록 하는 것이다. 이것이 생성하는 주요 전염증성 사이토카인은 IL-6, IL-12 및 TNF-알파이다. M2 대식세포는 아르기나제-I, IL-10, TGF-β 및 다른 항염증성 사이토카인을 주로 분비하며, 이는 염증을 감소시키는 기능을 하고 종양 성장 및 면역억제 기능에 기여한다. M1-유사 표현형을 갖는 대식세포는 전염증성 사이토카인을 분비하고 M2 대식세포의 면역억제 활성을 갖지 않는다. M2 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형을 갖는 대식세포로 전환하면 M2 대식세포를 면역억제적이지 않지만 항종양 반응에 참여하는 것으로 전환한다. M1 또는 M1-유사 표현형을 갖는 대식세포로 전환된 M2 대식세포는 더 많은 전염증성 사이토카인/케모카인 및 수용체, 예를 들어, CD80 및 CCR7, 및 케모카인, 예를 들어, IFNγ 및 CXCL10의 분비/발현을 나타낸다. M1 표현형 마커는 CD80, CD86, CD64, CD16 및 CD32 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. M1 대식세포에서 산화질소 합성효소(iNOS)의 발현도 표현형 마커로 작용할 수 있다. CD163 및 CD206은 M2 대식세포의 식별을 위한 주요 마커이다. M2-유형 세포에 대한 다른 표면 마커에는 CD68도 포함된다. M2 마커의 감소 또는 무효화, 및 M1 대식세포를 나타내는 사이토카인/케모카인의 증가는, M2 표현형에서 M1 또는 M1-유사 표현형으로의 전환을 반영한다. 아래 섹션과 M2에서 M1-유사 또는 M1 표현형 전환에 관한 작업예는 유도되는 예시적인 사이토카인 프로파일 및 마커를 설명한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 인코딩된 RNA가 유전자를 표적으로 한다는 언급은 이것이 임의의 기전에 의해 유전자의 발현을 저해하거나 억제시키거나 침묵시킨다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 핵산은 표적화된 유전자에 대해 상보적인 부분을 적어도 포함하고, 이 부분은 상보적인 부분과 하이브리드를 형성하기에 충분하다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 폴리펩타이드 서열을 언급할 때 "결실"은 표적 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리펩타이드, 또는 네이티브 또는 야생형 서열과 같은 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 결실을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "삽입"은 핵산 또는 아미노산 서열을 언급할 때 표적, 네이티브, 야생형 또는 다른 관련 서열 내에 하나 이상의 추가 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 포함을 설명한다. 따라서, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 삽입을 함유하는 핵산 분자는 서열의 선형 길이 내에 하나 이상의 추가 뉴클레오타이드를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 및 아미노산 서열에 대한 "첨가"는 다른 서열과 비교하여 어느 한쪽 말단에 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 첨가하는 것을 설명한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치환" 또는 "대체"는 네이티브, 표적, 야생형 또는 다른 핵산 또는 폴리펩타이드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 분자 길이(뉴클레오타이드 또는 잔기의 수로 설명됨)의 변화 없이 대체 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 따라서, 분자에서 하나 이상의 치환은 분자의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 수를 변화시키지 않는다. 특정 폴리펩타이드와 비교한 아미노산 치환은 폴리펩타이드 서열의 길이에 따른 아미노산 잔기의 수로 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "~에 상응하는 위치에서" 또는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 기재된 바와 같은 개시된 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에"상응한다"는 언급은, GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대화하기 위해 공개된 서열과 정렬 시 식별되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 당업자는 예를 들어 가이드로서 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 사용하여 상응하는 잔기를 식별할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 식별하기 위해, 아미노산의 서열은 가장 높은 차수의 일치가 수득되도록 정렬된다(예를 들어, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carrillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math 48:1073 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 서열의 정렬은 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 2개 이상의 서열을 정렬하기 위한 상동성의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성에 의해 관련된 2개 이상의 서열이 정렬된다. 정렬된 서열 세트는 상응하는 위치에 정렬된 2개 이상의 서열을 지칭하며, 게놈 DNA 서열과 정렬된 EST 및 다른 cDNA와 같은 RNA로부터 유래된 정렬 서열을 포함할 수 있다. 관련 또는 변이체 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 정렬될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 일치를 최대화하고, 수동 정렬을 사용하는 것과 같은 방법을 포함하고, 이용 가능한 수많은 정렬 프로그램(예를 들어, BLASTP) 및 당업자에게 알려진 다른 것을 사용한다. 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열을 정렬함으로써, 당업자는 가이드로서 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 사용하여 유사한 부분 또는 위치를 식별할 수 있다. 추가로, 당업자는 또한 인간 서열과 비인간 서열 사이에서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 찾기 위한 가이드로서 보존된 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 사용할 수 있다. 상응하는 위치는 또한 예를 들어 단백질 구조의 컴퓨터 시뮬레이션된 정렬을 사용하여 구조적 정렬을 기초로 할 수 있다. 다른 경우에 상응하는 영역이 식별될 수 있다. 당업자는 또한, 보존된 아미노산 잔기를 가이드로서 이용하여 인간 서열과 비인간 서열 사이에서 상응하는 아미노산 잔기를 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체와 같은 폴리펩타이드의 "특성"은 결합 특이성, 구조적 구성 또는 형태, 단백질 안정성, 단백질분해에 대한 내성, 형태적 안정성, 내열성 및 pH 조건에 대한 내성을 포함하지만 이로 제한되지 않는 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 특성을 지칭한다. 특성의 변화는 폴리펩타이드의 "활성"을 변경할 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩타이드의 결합 특이성의 변화는 항원에 결합하는 능력 및/또는 다양한 결합 활성, 예컨대 친화도 또는 결합력, 또는 폴리펩타이드의 생체내 활성을 변경할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드, 예컨대 항체의 "활성" 또는 "기능적 활성"은 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 활성을 지칭한다. 이러한 활성은 경험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 활성은 예를 들어 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합, 또는 이량체화를 통해 생체분자와 상호작용하는 능력, 또는 효소 활성, 예를 들어 키나제 활성 또는 단백질분해 활성을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 항체(항체 단편 포함)의 경우, 활성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 항원 결합 친화도(예를 들어, 높거나 낮은 친화도), 항원 결합 결합력(예를 들어, 높거나 낮은 결합력), 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 항원 중화 또는 청소를 촉진하는 능력과 같은 이펙터 기능, 바이러스 중화, 및 병원체의 감염 또는 침입을 방지하는 능력과 같은 생체내 활성, 또는 청소를 촉진하거나 신체의 특정 조직이나 체액 또는 세포에 침투하는 능력을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 활성은 ELISA, 유세포분석, 표면 플라즈몬 공명, 또는 온-레이트 또는 오프-레이트를 측정하기 위한 동등한 검정, 면역조직화학 및 면역형광 조직학 및 현미경, 세포-기초 검정, 및 결합 검정(예를 들어, 패닝 검정)과 같은 인식된 검정을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "결합하다", "결합된" 또는 이의 문법적 변형은 다른 분자와의 임의의 매력적인 상호작용에 분자가 참여하여 두 분자가 서로 매우 근접한 안정한 회합을 이끄는 것을 의미한다. 결합은 비공유 결합, 공유 결합(예를 들어, 가역 및 비가역 공유 결합)을 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 약물을 포함한 화학적 화합물과 같은 저분자와 같으나 이로 제한되지 않는 분자 사이의 상호작용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 의미하며, 천연이든 부분적으로든 완전히 합성이든, 예를 들어 재조합적으로 생성된 면역글로불린 분자의 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 적어도 일부를 함유하고, 항원 결합 부위를 형성하기에 충분하고 조립될 때 항원에 특이적으로 결합하는 이의 임의의 단편을 포함한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원 결합 도메인(항체 결합 부위)과 상동성 또는 실질적으로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체는 2개의 중쇄(H 및 H'로 표시될 수 있음) 및 2개의 경쇄(L 및 L'로 표시될 수 있음)를 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 각각의 중쇄는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 전장 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부(예를 들어, 중쇄는 VH 사슬, VH-CH1 사슬 및 VH-CH1-CH2-CH3 사슬을 포함하지만 이로 제한되지 않음)일 수 있고, 각각의 경쇄는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 전장 경쇄 또는 이의 일부일 수 있다(예를 들어, 경쇄는 VL 사슬 및 VL-CL 사슬을 포함하지만 이로 제한되지 않음). 각각의 중쇄(H 및 H')는 하나의 경쇄(각각 L 및 L')와 쌍을 이룬다. 전형적으로, 항체는 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)의 전부 또는 적어도 일부를 최소한으로 포함한다. 항체는 또한 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원의 목적을 위해, 용어 항체는 전장 항체 및 항-CTLA-4 항체 단편과 같은 항체 단편을 포함하는 이의 부분을 포함한다. 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화 결합 Fv(dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 Fv(scFvs), 단일 사슬 Fab(scFab), 이중체, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중-특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간 항체, 비-인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 인트라바디를 포함한다. 본원에 제공된 항체는 임의의 면역글로불린 부류(예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 하위 하위부류(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 구성원을 포함한다. 인간 치료용 항체는 일반적으로 인간 항체이거나 인간화되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체 단편(들)"은 (i) 가변 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 항체의 기능적 단편을 함유하고 Fc 부분이 없는 1가 및 단일특이적 항체 유도체; 및 (ii) BiTE® 항체(예컨대 탠덤 scFvs), 이중-친화도 재표적화 항체(DART),다른 이량체성 및 다량체성 항체, 이중체 및 단일 사슬 이중체(scDB)를 지칭한다. 따라서, 항체 단편은 예를 들어 Fab, Fab', scFab, scFv, Fv 단편, 나노체(예를 들어, 카멜루스 박트리아무스(Camelus bactriamus), 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius) 또는 라마 파코스(Lama paccos)에서 유래된 항체 참조)(예를 들어, 미국 특허 번호 5,759,808 및 Stijlemans 등 (2004) J. Biol. Chem. 279:1256-1261참조), VHH, 단일-도메인 항체(dAb 또는 sdAb), 최소 인식 단위, 단일 사슬 이중체(scDb), BiTE® 항체, DART 항체, 및 항원에 결합하는 다른 항체 작제물을 포함한다. 전형적으로, 인용된 항체 단편의 분자량은 60 kDa 미만이다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 일반적으로 포스포디에스테르 연결부에 의해 함께 연결된 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 2개 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 지칭한다. "핵산"이라는 용어에는 또한 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 및 다른 이러한 유사체 및 유도체, 또는 이의 조합과 같은 핵산의 유사체가 포함된다. 핵산은 또한 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 이외의 "백본" 결합, 예를 들어, 포스포트리에스테르 결합, 포스포라미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산) 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 DNA 또는 RNA 유도체를 포함한다. 이 용어는 또한 뉴클레오타이드 유사체, 단일 가닥(센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 핵산으로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 등가물, 유도체, 변이체 및 유사체를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오타이드에는 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신 및 데옥시티미딘이 포함된다. RNA의 경우 우라실 염기는 우리딘이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 단리된 핵산 분자는 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 영역, 요소 또는 도메인과 관련하여 "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 핵산 영역이 서로 기능적으로 관련되어 있음을 의미한다. 설명된 구성요소가 의도한 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 이의 전사 또는 발현에 영향을 미치거나 영향을 미치는 경우 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 리더 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 이로써 핵산은 전사되고 번역되어 기능적 융합 단백질을 발현할 수 있으며, 여기서 리더 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 분비에 영향을 미친다. 일부 예에서, 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 리더 펩타이드)를 인코딩하는 핵산은 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 핵산은 단일 mRNA 전사체로 전사되지만 mRNA 전사체의 번역은 발현되는 2개의 폴리펩타이드 중 하나를 초래할 수 있다. 예를 들어, 앰버 정지 코돈은 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있으므로, 부분적인 앰버 억제 세포에 도입될 때 생성된 단일 mRNA 전사체는 제1 및 제2 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질을 생성하도록 변역될 수 있거나, 제1 폴리펩타이드만을 생성하도록 번역될 수 있다. 또 다른 예에서, 프로모터는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 이로써 프로모터는 핵산의 전사를 조절하거나 매개한다.
예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, "합성"은 재조합 방법 및/또는 또는 화학적 합성 방법에 의해 생성되는 핵산 분자, 또는 유전자, 또는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는 인간에서 동족 mRNA 코돈과 함께 하전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질에 통합되는 자연에서 발견되는 20개의 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 공유 결합된 2개 이상의 아미노산을 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 길이가 2 내지 약 40개 아미노산인 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기 및 카르복실산기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위해, 본원에 제공된 항체 및 면역자극성 단백질에 함유된 아미노산은 20개의 천연 발생 아미노산(하기 표 참조), 비-천연 아미노산, 및 아미노산 유사체(예를 들어, α-탄소는 측쇄를 가짐)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 나타나는 폴리펩타이드의 다양한 아미노산 서열에서 발생하는 아미노산은 잘 알려진 3자 또는 1자 약어에 따라 식별된다(하기 표 참조). 다양한 핵산 분자 및 단편에서 발생하는 뉴클레오타이드는 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 단일 문자 지정으로 표기된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 이의 펩타이드 결합에서 폴리펩타이드의 화학적 소화(가수분해) 시 형성된 아미노산을 지칭한다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 일반적으로 "L" 이성질체 형태이다. 원하는 기능적 특성이 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한 "D" 이성질체 형태의 잔기는 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 지칭한다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복실 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 지칭한다. J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968) 및 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822에 기재된 표준 폴리펩타이드 명명법에 따라, 아미노산 잔기에 대한 약어는 하기 표에 나와 있다:
Figure pct00006
본원에서 화학식으로 표시되는 아미노산 잔기의 모든 서열은 아미노 말단에서 카르복실 말단의 통상적인 방향으로 좌측에서 우측으로 배향된다. 어구 "아미노산 잔기"는 상기 대응표에 열거된 아미노산뿐만 아니라 변형된, 비천연 및 특이한 아미노산을 포함하는 것으로 정의된다. 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝에 대시(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열, 또는 NH2와 같은 아미노 말단기, 또는 COOH와 같은 카르복실 말단기에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다.
펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적절한 보존적 치환은 당업자에게 알려져 있고 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않고 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 참조).
이러한 치환은 하기 표에 제시된 예시적인 치환에 따라 이루어질 수 있다:
Figure pct00007
다른 치환도 허용되며 경험적으로 또는 알려진 다른 보존적 또는 비보존적 치환에 따라 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생 아미노산"은 폴리펩타이드에서 발생하는 20개의 L-아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 의미한다. 따라서 비-천연 아미노산은 예를 들어 20개의 천연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함하고 아미노산의 D-입체이성질체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 예시적인 비천연 아미노산은 당업자에게 알려져 있으며, 2-아미노아디프산(Aad), 3-아미노아디프산(bAad), β-알라닌/β-아미노-프로피온산(Bala), 2-아미노부티르산(Abu), 4-아미노부티르산/피페리딘산(4Abu), 6-아미노카프로산(Acp), 2-아미노헵탄산(Ahe), 2-아미노이소부티르산(Aib), 3-아미노이소부티르산(Baib), 2-아미노피멜산(Apm), 2,4-디아미노부티르산(Dbu), 데스모신(Des), 2,2'-디아미노피멜산(Dpm), 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), N-에틸글리신(EtGly), N-에틸아스파라긴(EtAsn), 하이드록시라이신(Hyl), 알로-하이드록시라이신(Ahyl), 3-하이드록시프롤린(3Hyp), 4-하이드록시프롤린(4Hyp), 이소데스모신(Ide), 알로-이소류신(Aile), N-메틸글리신, 사르코신(MeGly), N-메틸이소류신(MeIle), 6-N-메틸라이신(MeLys), N-메틸발린(MeVal), 노르발린(Nva), 노르류신(Nle) 및 오르니틴(Orn)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 작제물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 단편을 함유하는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 작제물은 인간 조작의 결과로 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 복사체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절은 특정 속성을 갖는 더 큰 DNA 분자의 일부이다. 예를 들어, 특정 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분절은 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 특정 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 인코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편과 같은 더 긴 DNA 분자의 일부이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA와 DNA를 포함하며 천연 공급원에서 단리되거나 시험관 내에서 합성되거나 천연 분자와 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 분자의 길이는 본원에서 뉴클레오타이드(약어 "nt") 또는 염기쌍(약어 "bp")으로 제공된다. 뉴클레오타이드라는 용어는 문맥이 허용하는 경우 단일 가닥 및 이중 가닥 분자에 사용된다. 용어가 이중 가닥 분자에 적용될 때 전체 길이를 나타내는 데 사용되며 용어 염기쌍과 동일한 것으로 이해될 것이다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 2개의 가닥은 길이가 약간 다를 수 있고 이의 말단이 엇갈릴 수 있음을 당업자는 인식할 것이며; 따라서 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자 내의 모든 뉴클레오타이드는 쌍을 이룰 수 없다. 이러한 쌍을 이루지 않은 단부는 일반적으로 길이가 20개 뉴클레오타이드를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 방법에 의한 생성은 클로닝된 DNA에 의해 인코딩된 단백질을 발현하기 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종성 핵산"은 이것이 발현되는 세포에 의해 생체내에서 정상적으로 생성되지 않는 생성물(즉, RNA 및/또는 단백질)을 인코딩하는 핵산, 또는 이것이 일반적으로 발생하지 않거나 전사, 번역 또는 다른 조절 가능한 생화학적 과정에 영향을 주어 DNA와 같은 내인성 핵산의 발현을 변경하는 매개체를 매개하거나 인코딩하는 좌위 내의 핵산이다. DNA와 같은 이종성 핵산은 외래 핵산이라고도 한다. 당업자가 이것이 발현되는 세포에 대해 이종성 또는 외래인 것으로 인식하거나 고려할 수 있는 DNA와 같은 임의의 핵산은 본원에서 이종성 핵산에 포함되며; 이종성 핵산은 내인성으로도 발현되는 외인성으로 첨가된 핵산을 포함한다. 이종성 핵산은 일반적으로 이것이 도입된 세포에 내인성이지 않지만, 다른 세포로부터 얻거나 합성적으로 제조되거나 자연적으로 발생하지 않는 게놈 좌위에 도입되거나, 이의 발현은 천연 조절 서열 또는 서열들과 상이한 조절 서열들 또는 서열의 제어 하에 있다.
본원에서 이종성 핵산의 예는, DNA/RNA 센서 경로의 단백질 또는 이의 기능-획득 또는 항시적으로 활성인 변이체, 또는 면역자극성 단백질, 예컨대 사이토카인, 케모카인 또는 공동자극성 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 이는 종양 미세환경에서 항종양 면역력을 부여하거나 이에 기여한다. 항체 및 이의 단편, BiTEs®, 유인 수용체, 길항 폴리펩타이드 및 RNAi와 같이 종양 미세환경에서 항종양 면역력을 부여하거나 이에 기여하는 다른 생성물도 포함된다. 면역자극성 박테리아에서, 이종성 핵산은 일반적으로 도입된 플라스미드에 인코딩되지만, 박테리아 생성물의 발현을 변경하는 프로모터와 같은 박테리아의 게놈 내로 도입될 수 있다. DNA와 같은 이종성 핵산은 어떤 방식으로 치료 생성물을 인코딩하는 DNA의 발현을 매개할 수 있는 핵산을 포함하거나, 이는 어떤 방식으로 직접적으로 또는 간접적으로 치료제의 발현을 매개하는 펩타이드 또는 RNA와 같은 생성물을 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 요법은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 세포를 전달하는 것을 수반한다. 대상체에게 동종이계 또는 자가일 수 있는 세포는 생체외에서, 예컨대 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 의한 세포의 감염에 의해 변형되어, 대상체에게 도입될 때 생성물을 전달하거나 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, 유전자 요법은 이러한 요법이 추구되는 장애 또는 병태를 가진 포유동물, 특히 인간의 표적 세포와 같은 특정 세포로 DNA와 같은 이종성 핵산의 전달을 포함한다. DNA와 같은 핵산은 DNA와 같은 이종성 핵산이 발현되고 이에 의해 인코딩된 치료제(들)가 생성되는 방식으로 선택된 표적 세포에 도입된다. 유전자 요법은 또한 결함이 있는 유전자를 대체하거나 포유동물 또는 이것이 도입된 세포에 의해 생성된 유전자 생성물을 보충하는 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 포유동물 숙주에서 정상적으로 생성되지 않거나 치료적 유효량 또는 치료적으로 유용한 시간에 생성되지 않는 치료 화합물, 예컨대 성장 인자 또는 이의 저해제, 또는 종양 괴사 인자 또는 이의 저해제, 예컨대 이의 수용체를 인코딩할 수 있다. 치료 생성물을 인코딩하는 DNA와 같은 이종성 핵산은 생성물 또는 이의 발현을 증강시키거나 달리 변경하기 위해 감염된 숙주의 세포 내로 도입하기 전에 변형될 수 있다. 유전자 요법은 또한 저해제 또는 억제인자 또는 다른 유전자 발현 조절자의 전달을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역에 의해 폴리펩타이드가 생성되는 과정을 의미한다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 예를 들어 숙주 세포로부터 생성된 폴리펩타이드의 양을 결정하는 방법을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법에는 ELISA, 겔 전기영동 후 쿠마시 블루 염색, 로우리 단백질 검정 및 브래드포드 단백질 검정에 의한 세포 용해물 내 폴리펩타이드의 정량화가 포함될 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 재생산 및/또는 증폭하는 데 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다. 벡터에 함유된 핵산은 숙주 세포가 분열할 때 복제되어 핵산을 증폭시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때 하나 이상의 이종성 단백질이 발현될 수 있는 복제 가능한 핵산이다. 벡터에 대한 언급은 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산이 일반적으로 제한 분해 및 리게이션에 의해 도입될 수 있는 벡터를 포함한다. 벡터에 대한 언급은 또한 변형된 항-CTLA-4 항체와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 포함한다. 벡터는 핵산의 증폭, 또는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 발현/디스플레이를 위해 숙주 세포 내로 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입하는 데 사용된다. 벡터는 전형적으로 에피솜으로 남아있지만, 유전자 또는 이의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합되도록 설계될 수 있다. 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체와 같은 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포로 전달하기 위해(비히클 또는 셔틀로서) 외인성 유전자에 작동 가능하게 연결된 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 이러한 DNA 단편의 발현에 영향을 미칠 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 추가 분절은 프로모터 및 종결인자 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 원점, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA에서 유래되거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내로 도입시 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 작제물을 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제 가능한 것과 에피솜으로 남아 있거나 숙주 세포 게놈에 통합되는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "1차 서열"은 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 서열, 또는 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 서열을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 시험과 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 비교에서 동일하거나 유사한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 염기의 수를 지칭한다. 서열 동일성은 유사성 또는 동일성의 영역을 식별하기 위해 핵산 또는 단백질 서열의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 일반적으로 동일한 잔기를 식별하기 위한 정렬에 의해 결정된다. 정렬은 로컬 또는 글로벌일 수 있다. 비교된 서열 사이에서 일치, 불일치 및 갭이 식별될 수 있다. 갭은 동일하거나 유사한 문자가 정렬되도록 정렬된 서열의 잔기 사이에 삽입된 무효(null) 아미노산 또는 뉴클레오타이드이다. 일반적으로 내부 및 말단 갭이 존재할 수 있다. 갭 페널티를 사용할 때, 단부 갭에 대한 페널티 없이 서열 동일성이 결정될 수 있다(예를 들어, 말단 갭은 페널티를 받지 않음). 대안적으로, 서열 동일성은 갭을 고려하지 않고 동일한 위치의 수/총 정렬된 서열의 길이 x 100으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "글로벌 정렬"은 2개의 서열을 처음부터 끝까지 정렬하고, 각각의 서열의 각각의 문자를 한 번만 정렬하는 정렬이다. 서열 사이에 유사성 또는 동일성이 있는지의 여부에 관계없이 정렬이 생성된다. 예를 들어, "글로벌 정렬"을 기초로 하는 50% 서열 동일성은, 각각 길이가 100개 뉴클레오타이드인 2개의 비교 서열의 전체 서열 정렬에서 잔기의 50%가 동일함을 의미한다. 전체 정렬은 정렬된 서열의 길이가 동일하지 않은 경우에도 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있음이 이해된다."단부 갭에 대한 페널티 없음"이 선택되지 않는 한, 서열의 말단 단부의 차이는 서열 동일성을 결정할 때 고려될 것이다. 일반적으로 글로벌 정렬은 대부분의 길이에 걸쳐 상당한 유사성을 공유하는 서열에 사용된다. 글로벌 정렬을 수행하기 위한 예시적인 알고리즘은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘을 포함한다(Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). 글로벌 정렬을 수행하기 위한 예시적인 프로그램은 공개적으로 사용 가능하며 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/)에서 사용할 수 있는 글로벌 서열 정렬 툴 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html에서 사용할 수 있는 프로그램을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "로컬 정렬"은 2개의 서열을 정렬하지만, 유사성 또는 동일성을 공유하는 서열의 부분만을 정렬하는 정렬이다. 따라서 로컬 정렬은 하나의 서열의 하위분절이 다른 서열에 존재하는지 여부를 결정한다. 유사성이 없으면 정렬이 반환되지 않을 것이다. 로컬 정렬 알고리즘은 BLAST 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 포함한다(Adv. Appl. Math. 2:482(1981)). 예를 들어, "로컬 정렬"을 기초로 하는 50% 서열 동일성은, 임의의 길이의 비교된 2개 서열의 전체 서열의 정렬에서 100개 뉴클레오타이드 길이의 유사성 또는 동일성 영역이 유사성 또는 동일성의 영역에서 동일한 50%의 잔기를 갖는다는 것을 의미한다.
본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 각각의 공급자에 의해 설정된 디폴트 갭 페널티와 함께 사용되는 표준 정렬 알고리즘 프로그램에 의해 결정될 수 있다. GAP 프로그램의 디폴트 매개변수는 하기를 포함할 수 있다: (1) Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기재된 바와 같이 Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745-6763의 단항 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값 및 동일하지 않음에 대해 0의 값을 함유함) 및 가중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해 3.0의 페널티 및 각각의 갭의 각각의 기호에 대해 추가의 0.10의 페널티; (3) 단부 갭에 대한 페널티 없음. 임의의 2개의 핵산 분자가 뉴클레오타이드 서열을 갖고 있는지, 또는 임의의 2개의 폴리펩타이드가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%"동일한"아미노산 서열, 또는 퍼센트 동일성을 인용하는 다른 유사한 변형을 갖는지 여부는 로컬 정렬 또는 글로벌 정렬을 기초로 하는 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software 참조, 수십 개의 알려지고 공개적으로 사용 가능한 정렬 데이터베이스 및 프로그램에 대한 링크 제공). 일반적으로, 본원의 목적을 위해 서열 동일성은 NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome)로부터 입수 가능한 니들만-분쉬 글로벌 서열 정렬 툴; LAlign (William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)); 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html에서 입수 가능한 Xiaoqui Huang의 프로그램과 같은 글로벌 정렬을 기초로 한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정된다. 전형적으로, 비교되는 각각의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드의 전장 서열은 글로벌 정렬에서 각각의 서열의 전장에 걸쳐 정렬된다. 로컬 정렬은 또한 비교되는 서열이 실질적으로 동일한 길이일 때 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 사용된 용어 "동일성"은 시험과 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 비교 또는 정렬을 나타낸다. 하나의 비제한적 예에서, "~과 적어도 90% 동일한"은 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 90% 내지 100%의 동일성 백분율을 의미한다. 90% 이상의 수준에서의 동일성은 예시 목적으로 100개 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 시험 및 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 길이가 비교된다고 가정할 때, 시험 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 중 10%(즉, 100개 중 10개) 이하가 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 또는 뉴클레오타이드와 상이하다는 사실을 나타낸다. 시험 및 기준 폴리뉴클레오타이드 사이에 유사한 비교가 이루어질 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포된 점 돌연변이로 나타낼 수 있거나, 최대의 허용 가능한, 예를 들어 10/100개의 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 다양한 길이의 하나 이상의 위치에서 클러스터링될 수 있다. 차이는 또한 아미노산 잔기의 결실 또는 절두로 인한 것일 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 정의된다. 비교된 서열의 길이에 따라, 약 85-90% 초과의 상동성 또는 동일성 수준에서 결과는 프로그램 및 갭 매개변수 세트와 무관할 수 있으며; 이러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의존하지 않고 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천적 상태 및 유전적 상태를 포함하지만 이로 제한되지 않는 원인 또는 병태로부터 초래되는 유기체의 병리학적 상태를 나타내며, 이는 식별 가능한 증상을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 병태를 가진 대상체를 "치료하는" 것은 대상체의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나 치료 후 정적 상태를 유지하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 질환 또는 장애의 증상을 개선하는 임의의 효과를 지칭한다. 치료에는 예방, 요법 및/또는 치료가 포함된다. 치료는 또한 본원에 제공된 임의의 면역자극성 박테리아 또는 조성물의 임의의 약학적 사용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방"은 잠재적인 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "방지" 또는 예방, 및 이의 문법적으로 동등한 형태는 질환 또는 상태가 발병할 위험 또는 확률이 감소되는 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 유효 제제"는 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 및 저분자 약물 및 치료 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 치료제 또는 생물활성제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과"는 질환 또는 병태의 증상을 변경, 일반적으로 향상 또는 개선하거나 질환 또는 병태를 치유하는 대상체의 치료로 인한 효과를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 대상체에게 투여한 후 치료 효과를 발휘하기에 적어도 충분한 제제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 질환이나 장애의 증상을 방지, 치유, 개선, 저지 또는 부분적으로 저지하는 데 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효능"은 제제, 화합물, 물질, 또는 화합물을 함유하는 조성물이 투여된 대상체에서 치료 효과를 발휘하는 제제, 화합물, 물질, 또는 화합물을 함유하는 조성물의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방적 유효량" 또는 "예방적 유효 용량"은 대상체에게 투여될 때, 예를 들어, 의도된 예방 효과, 예컨대 질환 또는 증상의 발병 또는 재발을 방지 또는 지연시키거나, 질환 또는 증상의 발병 또는 재발 가능성을 감소시키거나, 바이러스 감염의 발생을 감소시키는 것을 가질 제제, 화합물, 무질, 또는 화합물을 함유한느 조성물의 양을 지칭한다. 완전한 예방 효과는 1회 투여로 반드시 나타나는 것은 아니며, 일련의 투여 후에만 나타날 수 있다. 따라서, 예방적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여와 같은 치료에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은, 영구적이든 일시적이든, 지속되거나 일시적이든 간에, 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련될 수 있는 증상의 임의의 약화를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항암제" 또는 "항암 치료제"는 악성 세포 및 조직에 직접적으로 또는 간접적으로 방해적이거나 독성인 임의의 제제 또는 치료제를 지칭한다. 예를 들어, 항암제는 암세포를 죽이거나 그렇지 않으면 종양 또는 암세포의 성장을 저해하거나 손상시키는 제제를 포함한다. 예시적인 항암제는 화학요법제 및 면역요법제이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 활성"은 폴리펩타이드, 핵산 분자, 및 다른 치료 분자와 같은 치료제의 생체내 활성을 지칭한다. 일반적으로, 치료 활성은 질환 또는 병태의 치료와 관련된 활성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간과 같은 포유동물을 포함하는 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동물"은 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 래트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴 및 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물과 같은 임의의 동물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려되는 동물로서 인간을 배제한다. 본원에 제공된 폴리펩타이드는 동물, 식물, 원핵생물 및 진균류와 같은 임의의 공급원으로부터 유래된다. 대부분의 폴리펩타이드는 포유류 기원을 포함하여 동물 기원이다.
본원에 사용된 바와 같이, "조성물"은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조합"은 2개 이상의 항목 사이 또는 그 사이의 임의의 연관을 지칭한다. 조합은 2개의 조성물 또는 2개의 컬렉션과 같은 2개 이상의 개별 항목, 2개 이상의 항목의 단일 혼합물과 같은 이의 혼합물, 또는 이의 임의의 변형일 수 있다. 조합의 요소는 일반적으로 기능적으로 연관되거나 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "병용 요법"은 2개 이상의 상이한 치료제의 투여를 지칭한다. 상이한 치료제는 개별적으로, 순차적으로, 간헐적으로 제공 및 투여될 수 있거나, 단일 조성물로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트"는 활성화, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 특성의 평가를 포함하지만 이로 제한되지 않는 목적을 위해 다른 요소, 예컨대 병용을 위한 추가 제제 및 설명서 또는 이의 요소를 선택적으로 포함하는 포장된 조합이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단위 투여 형태"는 당업계에 알려진 바와 같이 인간 및 동물 대상체에 적합하고 개별적으로 포장된 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단일 용량 제형"은 직접 투여를 위한 제형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "다중 용량 제형"은 다수 용량의 치료제를 함유하고 치료제의 여러 단일 용량을 제공하기 위해 직접 투여될 수 있는 제형을 지칭한다. 용량은 몇 분, 몇 시간, 몇 주, 며칠 또는 몇 달에 걸쳐 투여될 수 있다. 다중 용량 제형은 용량 조정, 용량 풀링 및/또는 용량 분할을 허용할 수 있다. 다중 용량 제형은 시간이 지남에 따라 사용되기 때문에 일반적으로 미생물 성장을 방지하기 위해 하나 이상의 방부제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제조 물품"은 제조 및 판매되는 생성물이다. 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 이 용어는 포장 물품에 포함된 본원에 제공된 임의의 조성물을 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "유체"는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 따라서 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 젤, 로션, 크림 및 다른 이러한 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리되거나 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 또는 이의 생물학적 활성 부분(예를 들어, 단리된 항원-결합 단편)은 세포 물질 또는 폴리펩타이드 또는 단백질이 유래되는 세포나 조직으로부터의 다른 오염성 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 조제물은 이것이 순도를 평가하기 위해 당업자에게 사용되는 표준 분석 방법, 예컨대 박층 크로마토그래피(TLC), 젤 전기영동 및 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정될 때 쉽게 검출 가능한 불순물이 없는 것으로 보인다면 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있으거나, 추가 정제가 성분의 효소적 및 생물학적 활성과 같은 물리적 및 화학적 특성을 검출 가능하게 변경시키지 않도록 충분히 순수하다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 생성하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다. 그러나 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체 이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우, 추가 정제는 화합물의 비활성(specific 활성)을 증가시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포 추출물" 또는 "용해물"은 용해되거나 방해된 세포로부터 제조된 조제물 또는 분획을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "지속적 바이러스 감염"은, 바이러스가 청소되지 않지만 감염된 개체의 특정 세포에 남게 되는 감염이다. 지속적 감염은 숙주 세포를 급속하게 사멸화시키거나 심지어 과도한 손상을 입히지 않으면서 침묵 및 생산적인 감염 병기를 수반한다. 잠재, 만성, 및 느린 감염으로서 정의될 수 있는 중복형 지속적 바이러스-숙주 상호작용의 3개 유형이 존재한다. 지속적 바이러스 감염에 의해 야기되는 질환은 후천적 면역결핍 증후군(AIDS), AIDS-관련 합병증, 만성 간염, 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis)(만성 홍역 뇌염(chronic measles encephalitis)), 만성 파포바바이러스 뇌염(chronic papovavirus encephalitis)(진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy)), 해면상 뇌병증(spongiform encephalopathy)(프리온에 의해 야기됨), 몇몇 헤르페스바이러스-유도 질환, 및 일부 신형성(neoplasia)을 포함한다. 이러한 감염 및 다른 감염을 야기하는 바이러스는 예를 들어, 헤르페스바이러스, 대상 포진(varicella-zoster) 바이러스(VZV), 홍역 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 파포바바이러스, 인간 파보바이러스, 인간 유두종바이러스, 간염 바이러스, 아데노바이러스, 및 파보바이러스를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대조군"은, 시험 매개변수로 처리되지 않는 점을 제외하고는 또는 혈장 시료인 경우 이것이 관심 조건으로 영향을 받지 않는 정상 지원자로부터 유래될 수 있다는 점을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료을 지칭한다. 대조군은 내부 대조군일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "면역글로불린 도메인"을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 언급은 하나 또는 복수의 면역글로불린 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 대안만을 지칭하도록 명시적으로 나타내지 않는 한, 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다."약"에는 정확한 양도 포함된다. 따라서, "약 5개의 아미노산"은 "약 5개의 아미노산" 과 "5개의 아미노산"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적인" 또는 "선택적으로"는 이후에 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않음을 의미하고, 이러한 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 선택적으로 변이체 부분은 해당 부분이 변이체 또는 비변이체임을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 보호 기, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 지시되지 않는 한, 이의 보편적인 용법에 따라 인식된 약어, 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732 참조)이다.
제한이 아닌 개시의 명료성을 위해, 상세한 설명은 다음의 하위섹션으로 나뉜다.
B. 요법을 위한 면역자극성 박테리아의 개요
박테리아가 항암 활성을 가진다는 인식은 1800년대로 거슬러 올라가며, 당시 여러 의사들이 스트렙토콕커스 피오게네스에 감염된 환자의 종양 퇴행을 관찰하였다. William Coley는 말기 암 치료를 위해 박테리아를 사용한 제1 연구를 시작하였으며 에스. 피오게네스와 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)로 이루어진 백신을 개발하였고, 이는 육종, 암종, 림프종 및 흑색종을 포함한 다양한 암을 치료하는 데 성공적으로 사용되었다. 그 이후로, 클로스트리디움, 미코박테리움, 비피도박테리움, 리스테리아 모노사이토게네스 및 에스케리키아를 비롯한 다수의 박테리아 종이 항암 백신의 공급원으로서 연구되어 왔다(예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 1999/013053 및 WO 2001/025399; Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199; Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21; 및 Pawlek et al. (2003) Lancet Oncol. 4:548-556 참조).
치료 플랫폼으로서, 박테리아는 종양용해 바이러스와 같은 다른 요법와 비교하여 몇 가지 장점이 있다. 일부 박테리아 종은 경구 및 전신(정맥내; IV) 투여되도록 조작될 수 있으며, 이는 시험관내 및 생체내에서 쉽게 증식하며, 동결건조된 상태로 저장 및 수송될 수 있다. 박테리아 염색체는 엑손이 없기 때문에 쉽게 조작될 수 있으며, 수많은 균주에 대한 완전한 게놈이 완전히 특징화되었다(Felgner 등 (2016) mBio 7(5):e01220-16). 많은 유형의 박테리아가 바이러스보다 저렴하고 생성하기가 더 쉬우며, 조작된 박테리아의 적절한 전달은 숙주 세포 게놈에 영구적으로 통합되지 않고 상피 세포보다 골수성 세포를 우선적으로 감염시키고 필요하다면 항생제에 의해 신속하게 무효화되어 이를 안전하게 만들기 때문에 경구 전달보다 선호할 수 있다.
이러한 유리한 특성을 이용하도록 변형된 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 박테리아는 종양 미세환경, 특히 종양-체류 면역 세포(골수성 세포), 예컨대 종양-연관 대식세포(TAM), 수지상 세포(DC) 및 골수-유래 억제 세포(MDSC)에서 감염 및 축적되도록 변형되고, 또한 높은 수준의 치료 단백질 및 조합, 특히 상보적 조합을 발현 및 전달하도록 설계된다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 암을 예방하고/치료하기 위한 백신으로서 그리고 또한 박테리아, 바이러스, 기생충 및 다른 병원체를 포함한 병원체에 대한 백신으로서 사용될 수 있다. 이러한 용도는 종양-체류 대식세포에 축적되고 또한 직접적으로, 에컨대 근육내 또는 흡입에 의해 투여될 때 식세포에 축적되며, 지속 가능한 면역 반응 및 면역력을 촉진하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 능력에 의존한다. 암의 치료에 사용되는 박테리아의 특성은 또한, 백신으로서의 이의 용도에 유리하다. 이러한 특성은 TLR2, TLR4 및 TLR5 반응을 감소시키는 게놈 변형, 및 다른 변형, 예컨대 시험관내에서의 성장을 허용하지만 생체내에서의 성장을 감소시키거나 무효화시키는 영양 요구체, 및 종양 미세환경에서 축적된 영양소, 예컨대 아데노신의 면역억제성 효과를 감소시키는 영양 요구체, 및 T-세포를 비활성화시킬 수 있는 박테리아 효소, 예컨대 아스파라기나제의 면역억제성 효과를 무효화시키는 게놈 변형으로부터 유래된다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 기존의 박테리아 요법, 또한 세포 요법, 종양용해성 바이러스 요법 및 선행 박테리아 요법보다 우수한 유리한 특성을 갖는다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있지만, 정맥내와 같은 전신 투여에 적합하다. 본원에 제시되고 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 주요 면역 경로를 표적으로 할 수 있다.
항암 치료제뿐만 아니라 항암 백신 및 병원체 백신, 및 또한 RNA 전달 비히클로서 사용되거나 적응될 수 있는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 특정 용도는 특정 게놈 변형 및 페이로드에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어 항원 제시 세포(APC)에서의 발현을 위해 완전한 또는 부분적 세포질 도메인 결실이 있는 절두된 공동자극성 분자(수용체 또는 리간드; 예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1, OX40L)를 포함한 하나 이상의 치료 생성물을 인코딩하는 유전적 페이로드를 전달하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 절두된 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 대한 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실되거나 절두된 세포질 도메인으로 인해 APC에 역조절 신호를 할 수 없다. 면역자극성 박테리아는 유형 I 인터페론(IFN)을 항시적으로 유도하는 것 및 면역 반응의 항바이러스 유형을 자극시키는 것, 예컨대 IL-15, 특히 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15 복합체)로서 제공되는 IL-15, 및 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 조작된 STING 단백질을 포함한 복수의 생성물을 인코딩할 수 있고, 또한 원하지 않는 염증 반응을 무효화시키거나 감소시키기 위해 감소된 NF-κB 신호전달을 갖도록 변형될 수 있다.
면역자극성 박테리아는 IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-12, IL-15, IL-15/IL-15Rα 사슬 복합체, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, 인터페론-α, 인터페론-β, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, 세포기질성 DNA/RNA 센서 또는 유형 I IFN 경로 단백질, 예컨대 기능-획득 또는 항시적 활성 STING, IRF3, IRF7, MDA5, 또는 RIG-I 변이체(유형 I IFN을 유도함), TGF-베타의 저해제, 예컨대 TGF-β 저해성 항체, TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 및 TGF-베타 결합 유인 수용체, 항체 및 이의 단편, 예컨대 면역 체크포인트 및 다른 항암 표적, 예컨대 VEGF 및 IL-6, 공동자극성 수용체/분자, 예컨대 결실되거나 절두된 또는 다르게는 무효화된 4-1BBL을 포함한 4-1BBL을 표적화하는 것, 및 다른 것 중 하나 이상을 인코딩하거나 발현할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한, 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 완전 또는 부분 세포질 도메인 결실을 갖는 절두된 공동자극성 분자(예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1, OX40L)를 인코딩하거나 발현할 수 있으며, 절두된 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포로의 항시적 면역-자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실된 또는 절두된 세포질 도메인으로 인해 APC로의 역조절 신호를 할 수 없다. 다른 인코딩된 치료 생성물은 이중특이적 T-세포 연계자(engager)(상표명 BiTEs® 하에 상업적으로 입수 가능함), 예컨대 DLL3 X CD3 연계자로 지칭되는 것을 포함한다.
이러한 치료 생성물 및 제제의 조합은 단일 치료 조성물에서 발현될 수 있다. 박테리아 게놈의 변형으로 인해, 면역자극성 박테리아는 종양-특이적 위치화 및 농화를 나타내고, 항종양 면역력 경로의 활성화를 위해 정맥내(IV) 투여를 제공하며, 이는 전신으로 활성화되면 독성이다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 예컨대 직접 투여에 의해 백신으로서 투여될 때 유전적으로 안전하고 종양, 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 면역 세포, 및 또한 식세포를 표적화하도록 설계된다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양-체류 면역 세포에 축적되고, 독성 부작용이 없거나 제한된 독성 부작용으로 종양 및 종양 미세환경에서 항암 면역 자극을 유도하거나 촉진하는 치료 생성물, 특히 조합을 전달하기에 충분히 오래 지속되는 면역자극성 박테리아를 제공하기 위해 협력하여 기능하는 게놈 변형 및 다른 변형, 뿐만 아니라 인코딩된 치료 생성물의 조합을 포함한다. 정맥내(IV)와 같이 전신적으로 전달되는 경우, 면역자극성 박테리아는 전이성 병변을 비롯한 종양에서 농화되며; 이는 특히 종양-연관 대식세포(TAM), 골수-유래 억제 세포(MDSC) 및 수지상 세포(DC)를 포함한 종양-체류 골수성 세포에 면역 페이로드의 효율적인 유전자 전달을 제공하고; 이는 강력한 국소 면역 반응을 유도하여 종양을 방해하고 미래의 재발에 대비한 백신을 접종하며; 치료가 끝나면 식균 작용 및 감염된 세포에 의한 방해와 같이 자연적으로 제거되거나 항생제의 과정에 의해 빠르게 방해될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 설계된 퓨린/아데노신 영양요구성으로 인해 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 면역 세포에서 우선적인 축적을 나타내고, 식세포 내부에서 복제 불능을 나타낸다. 혈청 보체에 의한 비활성화를 피하는 면역자극성 박테리아는 정상 조직에 대한 독성을 최소화하면서 종양 미세환경 내에서 직접 고농도로 다양한 면역치료제 및 치료 생성물의 전달을 가능하게 하고 본원에 제공된다.
예를 들어, 섹션 C.9에서와 같이 더 자세히 설명된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 msbB - /pagP - 가 되도록 하는 게놈의 하나 이상의 변형을 포함하며, 이는 LPS에서 지질 A를 변경하여, 펜타-아실화(야생형 지질 A는 6-7개의 지방산 사슬을 가짐)를 초래하며, TLR4 친화도를 감소시키고; purI - 와 같은 아데노신/아데닌 영양요구체이며; T-세포 품질을 향상시키는 아스파라기나제 II-(ansB - )이고; 편모가 결여되어 있으며(편모 결핍); 컬리 핌프래를 생성하는 유전자/생성물이 결핍되고, 예컨대 다른 특성 중에서 컬리 핌브래를 제거하는 csgD -이고; 삽입, 결실, 방해 및 임의의 다른 변형과 같은 다른 선택적 게놈 변형을 포함하여, 인코딩된 생성물(들)이 본원에 상세히 논의된 바와 같이 활성 형태로 생성되지 않게 된다. 면역자극성 박테리아는 진핵생물 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 치료 생성물, 특히 항암 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 이러한 동일한 변형 및 특성은 특히 직접적인 투여에 의해, 예컨대 흡입, 및 근육내(IM) 주사, 및 페이로드를 식세포에게 전달하기 위한 다른 직접적인 경로에 의해 전달될 때 이를 암 치료제 및 암 백신, 및 병원체 백신으로서 사용하기 위한 RNA에 대한 전달 비히클로서 그리고 백신으로서 유용하게 만든다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 비활성 인코딩된 생성물(들)을 초래하는 예컨대 유전자 모두 또는 일부의 배향을 변화시키는 게놈 변형, 예컨대 결실, 방해, 및 다른 변경을 포함하며, 따라서 기능적 유전자 생성물(들)이 발현되지 않는다. 제공된 면역자극성 박테리아 중에는 생성된 박테리아가 msbB -/purI -가 되도록 변형되는 것이 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 msbB - 및 purI -이며, 이로써 msbB 및/또는 purI 유전자의 저거도 코딩 부분의 전장이 결실된다. 박테리아의 게놈은 또한, 박테리아에서 편모가 결여되도록 변형될 수 있다. 이는 편모를 정상적으로 발현하는 박테리아에서 수행된다. 이러한 박테리아에서, 예를 들어 살모넬라내의 fliC 및 fljB 유전자, 또는 다른 종에서 fliC 및 fljB에 등가인 유전자가, 기능적 유전자 생성물이 발현되지 않도록 결실되거나 다르게는 변형될 수 있다. 박테리아는 또한, 이것이 아데노신 영양 요구체이고/이거나 msbB -/pagP -이도록 변형될 수 있다. 또한, 면역자극성 박테리아 및 이를 함유하는 약학적 조성물이 제공되며, 여기서 박테리아는 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않고, 따라서 박테리아는 ansB -이다. 인코딩된 아스파라기나제 활성의 무효화는 T-세포 생존력/활성을 향상시키거나 보유시킨다. 백신으로서 사용되는 치료적 박테리아, 예컨대 비활성화된 또는 약독화된 박테리아는 아스파라기나제 활성을 무효화시키도록 게놈을 변형시킴으로써 향상될 수 있다. 이러한 백신의 예는 결핵에 대해 면역화하는 데 사용되는 바실러스 칼메트-게렝(BCG) 백신 및 관련 백신이다. BCG 백신은 다양한 효과성을 갖는 것으로 알려져 있다; 아스파라기나제의 무효화는 이러한 백신의 효과성을 향상시킬 수 있는데, 왜냐하면 내인성 박테리아 아스파라기나제가 T-세포 활성을 저해하거나 감소시키기 때문이다.
종양-체류 골수성 세포에 치료 생성물(예를 들어, 항시적 활성 STING 변이체 및 다른 면역조절 단백질 및 생성물)을 전달하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 적응 면역력을 촉진하고 T-세포 기능을 증강시킨다. 면역자극성 박테리아는 면역억제성 종양 미세환경을 적응성 항종양 표현형으로 완전히 개조하고, 내재성 면역력의 촉진 및 적응 면역력의 억제를 특징으로 하는 박테리아 표현형에서 멀어지게 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 특성 및 페이로드는 또한, 백신 및 RNA 전달 플랫폼으로서 박테리아의 사용에 대해 조사될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 비변형 박테리아와 비교하여 또는 균주 VNP20009와 비교하여 유의하게 더 큰, 예컨대 적어도 약 100,000배 더 큰 종양 침윤 및 농화를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 박테리아는 이것이 종양에서 대식세포(및 백신으로서 투여될 때 다른 식세포)를 감염시켜 이의 페이로드, 예컨대 조작된 STING의 조합을 전달하는 게놈 변형을 함유한다(다양한 조작된 STING 단백질, 예컨대 기능-획득 돌연변이, 예컨대 유형 I IFN의 유도를 항시적으로 만들기 위해 N154S/R284G를 갖는 인간 STING, 및 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성을 갖는 비인간 STING으로부터의 CTT, 예컨대 인간 STING과 비교하여 태즈메이니아 데빌로부터의 CTT, 및 다양한 형태의 IL-15, 특히 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15 복합체)에 관하여 논의를 전반적으로 참조). 이러한 조합은 상승작용 효과를 가지며, 높은 정도의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함한 T-세포, 종양의 침윤을 초래하는 것으로 본원에 제시된다. 이러한 조합은 수많은 치료적 개입 지점에서 작동하므로 포괄적인 면역요법이다. 면역자극성 박테리아는 플라스미드를 숙주 세포 내로 전달하는 종양-활성화된 대식세포(TAM)에 의해 소모되며, 이는 인코딩된 생성물, 예컨대 IL-15 및 조작된 STING을 발현한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양-체류 면역세포에 의해 소모되며, 면역세포 및 종양 미세환경에서 발현 및 생성되는 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함한 이의 내용물을 전달하여 항종양 면역력을 생산한다. asd - 이고 숙주 세포 제어 하에 발현을 위해 플라스미드 상에서 인코딩되는 보체 유전자를 포함하지 않는 박테리아는 숙주에서 복제되지 않는다. 박테리아는, thyA - 이며, 티민 성장용 보조제를 필요로 하는 비활성 또는 결측(missing) 유전자 생성물을 초래하는 게놈 변형, 예컨대 결실, 삽입, 전위 또는 변형으로 인해 페이로드를 식세포 내로 유사하게 전달하지만 이러한 세포에서 복제될 수 없는 박테리아가 제공된다.
1. 박테리아 암 면역요법
많은 고형 종양 유형이 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 요법과 같은 승인된 체크포인트 요법에 대해 매우 성불응으로 만드는 심각하게 면역억제성인 미세환경을 진화시켰다. 종양이 체크포인트 요법에 대한 내성을 진화시킨 하나의 기전은 종양내 T-세포 및 종양 항원 교차-제시 수지상 세포(DC)가 없기 때문이며, 이는 T-세포 배제, 비염증 또는 "콜드 종양(cold tumor)"(Sharma et al. (2017) Cell 168(4):707-723). 종양이 T-세포에 염증을 일으키고 체크포인트 면역요법에 반응하는 소수의 환자의 경우, 이러한 환자는 종종 심각한 자가면역 독성을 경험하고 많은 환자가 결국 재발하여 체크포인트 불응성이 될 것이다(예를 들어, Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3377-3383; Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363(8):711-723; 및 Chen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391 참조). 종양은 면역 감시를 피하기 위해 여러 기전을 개시하고, 면역력을 억제시키기 위해 항종양 면역력 세포를 재프로그래밍하고, 항종양 T-세포를 배제 및 비활성화하고, 표적 암 요법에 대한 내성을 발생시킨다(예를 들어, Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584 참조). 이 문제를 해결하려면 이러한 종양에 적절하게 염증을 일으키고 장기간 지속되는 종양 퇴행을 제공할 수 있는 항종양 면역력을 생성할 수 있는 면역 요법이 필요할 것이다. 이에 더하여, 종양내 요법은 다루기 힘들고 전이성 질환 환경에서 상당히 제한적일 것이다. 각각의 개별적인 전이성 병변에 적절히 염증을 일으키고 다양한 면역억제 경로를 극복하는 전신 투여 요법이 필요하다. 종양-체류 면역 세포를 특이적으로 표적화하고 다수의 상보적 유전자 페이로드/치료 생성물을 발현하는 능력으로 인해, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이러한 문제를 해결하도록 설계된다.
2. 종양 미세환경을 표적화하는 선행 요법
종양 미세환경(TME)을 표적화하고 항종양 면역력을 촉진하기 위한 많은 요법이 개발되었다. 각각은 고유한 문제와 단점을 가지고 있으며, 이는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 의해 해결된다.
a. 자가 T-세포 요법의 한계
고도로 면역억제적인 종양 미세환경에 접근하고 종양에 염증을 일으키고 항종양 면역력을 촉진하기 위한 적절한 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 여러 전신 투여 치료 플랫폼이 임상적으로 조사되었다. 이러한 플랫폼에는 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T-세포)가 포함되며, 이는 환자로부터 T-세포를 수합하고 T-세포 수용체를 특정 종양 항원에 특이적인 항체 Ig 가변 세포외 도메인에 융합하도록 재설계함으로써 생성된다. 이는 활성화된 T-세포의 세포용해 특성과 함께 항체의 항원 인식 특성을 세포에 부여한다(예를 들어, Sadelain et al. (2015) J. Clin. Invest. 125(9):3392-3400 참조). CD19 CAR-Ts 티사겐레클류셀(tisagenlecleucel)(예를 들어, 상표 Kymriah®) 및 악시카브타겐 실로류셀(axicabtagene ciloleucel)(상표 Yescarta®)의 FDA 승인과 같은 이 기술의 가능성과 약효에도 불구하고 성공은 CD19+ 조혈 악성물로 제한되었고, 치명적인 면역 관련 이상반응(adverse event)이라는 비용이 들었다(예를 들어, Jackson et al. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13(6):370-383 참조). 종양은 항원 CD19를 포함하는 고형 종양에 대한 표적화된 종양 항원을 하향조절하기 위해 빠르게 돌연변이할 수 있으며, 이에 의해 면역 탈출을 촉진한다(예를 들어, Mardiana et al. (2019) Sci. Transl. Med. 11(495):eaaw2293 참조). 종양-특이적 표적 항원이 과다하지 않다. 건강한 조직에서 발현되지 않는 고형 종양 표적은 CAR-T 요법의 주요 장애물이다. 그 외에도 CAR-T 요법은 종양으로의 적절한 T-세포 침윤에 필요한 T-세포 케모카인 구배가 충분하지 않기 때문에 고형 종양 미세환경에 접근하는 데 있어서 다른 장애물을 겪는다. 또한, 일단 종양이 침윤되면 빠르게 비활성화된다(예를 들어, Brown et al. (2019) Nat. Rev. Immunol. 19(2):73-74 참조). CAR-T-세포의 안전성이 크게 향상되고 효능이 고형 종양으로 확대되더라도, 이러한 노동 집약적인 요법과 관련된 실현 가능성과 비용은 여전히 이의 더 광범위한 채택을 제한한다.
b. 바이러스 백신 플랫폼
종양용해성 바이러스(OV)는 종양 세포 용해를 유도하고, T-세포를 종양으로 모집하고, 종양 세포가 읽을 수 있는 유전 물질을 전달하여 면역 조절 단백질을 생성하는 자연적이고 조작된 특성을 갖고 있다. 예를 들어, 탈리모겐 래허파렙벡(T-VEC: Talimogene laherparepvec)으로 명명된 종양용해 바이러스는 종양내 투여되는 항흑색종 항원 및 사이토카인 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자)를 인코딩하는 변형된 단순 포진 바이러스이다. 이는 전이성 흑색종에 대해 FDA 승인을 받았다(예를 들어, Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21 참조). T-VEC은 일부 흑색종 환자에 대한 임상적 이점을 실증하였으며, 면역 체크포인트 항체 또는 IL-2 및 인터페론-알파와 같은 FDA-승인 전신 사이토카인보다 면역 독성이 적다(예를 들어, Kim et al. (2006) Cytokine Growth Factor Rev. 17(5):349-366; 및 Paul et al. (2015) Gene 567(2):132-137 참조).
종양용해성 바이러스(OV)는 항암 요법으로서 많은 한계를 갖고 있다. 첫째, 종양용해성 바이러스는 혈액에서 인간 보체 시스템에 의해 빠르게 비활성화된다. 원하는 치료 효과를 갖기 위해 전신 투여를 통해 충분한 바이러스를 전달하는 것이 어렵다는 것이 입증되었다. 종양내 전달은 전이 환경(병변이 신체 전체에 퍼짐)에서 제한적이고, 대부분의 고형 종양 유형(예를 들어, 폐 및 내장 병변)에 대해 다루기 어려우며, 반복 투여를 제한하는 주사를 위한 중재적 유도 방사선 요법이 필요하다. 바이러스는 상업적 규모로 제조하고 저장하기 어려울 수 있다. 무엇보다도 파라믹소바이러스, 레오바이러스 및 피코르나바이러스를 기초로 하는 것과 같은 대부분의 OV-기초 백신은 유사한 한계를 갖고 있다(예를 들어, Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300 참조). 종양용해성 바이러스는 본질적으로 면역원성이고 인간 혈액에서 빠르게 제거되며, 종양으로 트래픽(traffic)하는 T-세포는 더 약한 종양 신생항원보다 바이러스 항원에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다(예를 들어, Aleksic et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42(12):3174-3179 참조). 따라서, 플랫폼의 인식된 기술적 한계 외에도 OV는 지속되는 항종양 면역력을 자극하는 제한된 능력을 가질 수 있다(예를 들어, 문헌[Kedl et al.(2003) Curr Opinion Immunol. 15:120-127]; 및 문헌[Aleksic et al., (2012) Eur. J. .Immunol. 42:3174-3179]를 참조하며, 이는 바이러스 항원에 결합하는 TCR이 암 관련 항원에 결합하는 TCR보다 더 높은 HLA-A2 친화도를 가짐을 보여줌).
c. 박테리아 암 요법
다수의 박테리아 종은 전임상 동물 연구에서 원위 부위에서 주사될 때 고형 종양 내에서 우선적으로 복제되는 것으로 실증되었다. 여기에는 살모넬라, 비포도박테리움, 클로스트리디움, 에스케리키아 등이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 박테리아 감염에 대한 숙주의 내재성 면역 반응과 조합된 박테리아의 종양-귀소 특성은 항종양 반응을 매개할 수 있다. 이러한 종양 조직 향성(tropism)은 종양의 크기를 다양한 정도로 감소시킨다. 이러한 박테리아 종의 종양 향성에 기여하는 인자 중 하나는 무산소 및 저산소 환경에서 복제하는 능력이다. 이러한 자연적인 종양-향성 박테리아의 수는 항종양 반응의 약효를 증가시키기 위해 추가로 조작되었다(Zu et al. (2014) Crit. Rev. Microbiol. 40(3):225-235; 및 Felgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078에서 검토됨). 동물 연구에서 개념 증명에도 불구하고, 동물 모델에는 없는 인간 혈청 내 보체 인자는 박테리아를 비활성화시켜 암 치료를 위한 요법으로서의 사용을 제한할 수 있다.
경구 또는 전신 투여를 위해 박테리아 균주는 약독화되어 전신 질환 및/또는 패혈성 쇼크를 일으키지 않지만, 효과적인 종양 콜로니화 및 보체에 의한 비활성화에 대한 내성을 위해 어느 정도의 감염성을 유지한다. 클로스트리디움(예를 들어, Dang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(26):15155-15160; 미국 특허 공보 2017/0020931 및 2015/0147315; 및 미국 특허 7,344,710 및 3,936,354 참조), 미코박테리움(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2015/0224151 및 2015/0071873 참조), 비피도박테리움(Dang et al. (2001); 및 Kimura et al. (1980) Cancer Res. 40:2061-2068 참조), 락토바실러스(예를 들어, Dang 등 (2001) 참조), 리스테리아 모노사이토게네스(예를 들어, Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868; Starks et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427; 및 미국 특허 공개 번호 2006/0051380 참조) 및 에스케리키아 콜라이(예를 들어, 미국 특허 번호 9,320,78 참조)을 포함하는 다수의 상이한 박테리아 종은 항암 요법의 가능한 제제로서 연구되었다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양 치료를 위해 개발된 이전 박테리아의 문제를 해결하는 게놈 변형을 포함한다. 변형은 일반적으로, 유전자 또는 유전자 생성물을 비활성으로 되는 게놈 내 변화를 포함한다. 이는 유전자 또는 이의 일부를 결실시키거나 유전자를 방해함으로써, 또는 비활성 생성물을 초래하는 임의의 다른 이러한 변화에 의해 실시될 수 있다. 게놈 변형은 종양 미세환경에서 박테리아의 표적화 또는 축적을 향상시키며, 특히 박테리아가 종양-체류 면역 세포를 우선적으로 또는 이것만 감염시키고 건강한 조직은 감염시키지 않도록 설계되어 독성을 저하시키고 인코딩된 생성물의 전달을 향상시킨다. 면역자극성 박테리아는 또한 종양의 면역억제 효과를 무효화하고, 숙주의 항종양 반응을 증강시키고, 항종양 생성물을 제공하도록 설계된, 이의 조합을 포함한 치료 생성물을 전달하도록 설계된다.
i. 리스테리아
암의 마우스 모델에서 발현된 종양 항원에 대한 강력한 CD8+ T-세포 프라이밍을 유도할 수 있는 약독화된 살아있는 세포내 박테리아인 리스테리아 모노사이토게네스도 박테리아 암 벡터로서 조사되었다(예를 들어, Le 등 (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868). 프라임-부스트 접근법에서 동종이계 췌장암-기초 GVAX 백신과 더불어 종양 항원 메조텔린을 혼입하는 엘. 모노사이토게네스-기초 백신의 임상 시험에서, 진행된 췌장암 환자의 중앙 생존 기간은 6.1개월로 나타났고, GVAX 백신 단독으로 치료된 환자에 대한 중앙 생존 기간은 3.9개월이었다(예를 들어, Le 등 (2015) J. Clin. Oncol. 33(12):1325-1333 참조). 그러나, 이러한 결과는 더 큰 2b상 연구에서 복제되지 않았으며, 이는 인간에서 친화도가 낮은 종양 신생항원에 대한 말초 면역 감시를 전복시키는 어려움을 지적한다. 엘. 모노사이토게네스는 또한 인간 대식세포에서 엘. 모노사이토게네스에 의해 발생하는 것으로 실증되지 않은 효율적인 플라스미드 전달의 전제 조건인 식균 작용 후 박테리아가 용해되어야 하는 요건으로 인해, 인코딩된 종양 항원에 대한 제한된 면역 반응을 보여주었다.
ii. 살모넬라 종
살모넬라 엔테리카 혈청변형 티피무리움(에스. 티피무리움)은 항암 치료제로 사용하기 위한 박테리아 종의 예시이다. 에스. 티피무리움은 그람-음성 통성 혐기성 박테리아(facultative anaerobe)으로서, 조직 괴사, 누출된 종양 혈관 구조 및 면역억제된 종양 미세환경에서의 생존 가능성 증가로 인해 저산소 및 괴사 영역에 우선적으로 축적된다(예를 들어, Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-394 참조). 통성 혐기성 미생물인 에스. 티피무리움은 호기성 및 혐기성 조건에서 성장할 수 있으므로, 덜 저산소성인 작은 종양과 더 저산소성인 큰 종양 둘 다에 콜로니화할 수 있다.
분변-경구 경로를 통한 에스. 티피무리움 전파는 국소 위장 감염을 일으킨다. 박테리아는 또한 혈류와 림프계로 들어가 간, 비장 및 폐와 같은 전신 조직을 감염시킬 수 있다. 야생형 에스. 티피무리움의 전신 투여는 TNF-α 및 IL-6을 과도하게 자극하여 사이토카인 캐스케이드 및 패혈성 쇼크를 유발하며, 치료하지 않으면 치명적일 수 있다. 결과적으로, 에스. 티피무리움과 같은 병원체성 박테리아 균주는 종양 조직을 효과적으로 콜로니화하는 능력을 완전히 억제하지 않으면서 전신 감염을 예방하기 위해 약독화되어야 한다. 약독화는 종종 박테리아 외막과 같은 병원체 패턴 인식을 통해 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 세포 구조를 돌연변이시키거나 보충 영양소가 없을 때 박테리아의 복제 능력을 제한함으로써 달성된다.
에스. 티피무리움은 대식세포와 같은 포식 골수성 세포에 의해 빠르게 흡수되거나, 살모넬라 병원성 섬 1(SPI-1)-인코딩된 유형 III 분비 시스템(T3SS1)을 통해 상피세포와 같은 비-포식성 세포를 직접 침범할 수 있는 세포내 병원체이다. 일단 세포 내부에 들어가면, 이는 SPI-2 조절을 통해 살모넬라-함유 액포(SCV) 내에서 복제할 수 있으며, 일부 상피 세포의 세포기질로 빠져나갈 수도 있다(예를 들어, Agbor et al. (2011) Cell Microbiol. 13(12):1858-1869; 및 Galan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573 참조). 에스. 티피무리움의 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 직접적인 종양사멸화 효과를 이끌어내고/내거나 종양사멸화 분자를 전달하는 항종양제로 기재되었다(예를 들어, Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199; Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760; 및 Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652 참조).
박테리아 병원체의 약독화를 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 영양요구성 돌연변이는 박테리아가 필수 영양소를 합성할 수 없도록 하고, aro, pur, gua, thy, nad 및 asd와 같은 유전자의 결실/돌연변이(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2012/0009153 참조)가 사용된다. 이러한 유전자를 포함하는 생합성 경로에 의해 생성된 영양소는 종종 숙주 세포에서 사용할 수 없으므로 박테리아 생존이 어렵다. 예를 들어, 살모넬라 및 다른 종의 약독화는 해당과정을 방향족 아미노산 생합성에 연결하는 시키메이트 경로(shikimate pathway)의 일부인 aroA 유전자의 결실 또는 방해에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Felgner 등 (2016) mBio 7 참조). (5):e01220-16). aroA의 결실 또는 방해는 방향족 아미노산에 대한 박테리아 영양요구성 및 후속 약독화를 초래한다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0170276, 2003/0175297, 2012/0009153 및 2016/0369202; 및 국제 출원 공개 번호 56928 /032165 및 WO 2016/025582 참조). 유사하게는, aroC 및 aroD를 포함하는 방향족 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 다른 효소는 약독화를 달성하기 위해 결실되었다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2016/0369282 및 국제 출원 공개 번호 WO 2016/025582 참조). 예를 들어, 에스. 티피무리움 균주 SL7207은 방향족 아미노산 영양요구체(aroA-돌연변이체)이고, 균주 A1 및 A1-R은 류신-아르기닌 영양요구체이다.
박테리아를 약독화시키는 돌연변이에는 지질다당류(LPS)의 생합성을 변경시키는 유전자 내 돌연변이, 예컨대 rfaL, rfaG, rfaH, rfaD, rfaP, rFb, rfa, msbB, htrB, firA, pagL, pagP, lpxR, arnT, eptA, 및 lpxT; 자살 유전자를 도입하는 돌연변이, 예컨대 sacB, nuk, hok, gef, kil, 또는 phlA; 박테리아 용해 유전자를 도입하는 돌연변이, 예컨대 hly 및 cly; 독성 인자를 인코딩하는 유전자 내 돌연변이, 예컨대 IsyA, pag, prg, iscA, virG, plc 및 ac; 스트레스 반응을 변형시키는 유전자 내 돌연변이, 예컨대 recA, htrA, htpR, hsp 및 groEL; 세포 주기를 방해하는 유전자 내 돌연변이, 예컨대 min; 및 조절 기능을 방해하거나 비활성화하는 유전자 내 돌연변이, 예컨대 cya, crp, phoP/phoQ 및 ompR(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2012/0009153, 2003/0170276, 및 2007/0298012; 미국 특허 번호 6,190,657; 국제 출원 공개 번호 WO 2015/032165; Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177; Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178; Frahm et al. (2015) mBio 6(2):e00254-15; Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038; 및 Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419 참조). 일반적으로, 약독화 돌연변이는 독성 표현형으로의 복귀를 초래할 수 있는 자발적인 보상 돌연변이를 방지하기 위한 유전자 결실이다.
안전을 위해 에스. 티피무리움을 약독화시키는 또 다른 방법은 PhoP/PhoQ 오페론 시스템을 사용하는 것이며, 이는 막-연관 센서 키나제(PhoP: membrane-associated sensor kinase) 및 세포질 전사 조절자(PhoP)로 이루어진 전형적인 박테리아 2-구성요소 조절 시스템이다(예를 들어, Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058; 및 Groisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081 참조). PhoP/PhoQ는 독성에 필요하고; 이의 결실은 대식세포에서 이 박테리아의 불량한 생존 및 마우스 및 인간에서 현저한 약독화를 초래한다(예를 들어, Miller, S. I. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5054-5058; Groisman, E. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7077-7081; Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443; 및 Fields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193 참조). PhoP/PhoQ 결실 균주는 백신 전달 비히클로 사용되었다(예를 들어, Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6:433-443; Fields, P. I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5189-5193; 및 Angelakopoulos, H. and Hohmann, E. L. (2000) Infect. Immun. 68:2135-2141 참조). 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 박테리아가 플라스미드 전달을 시도하지 않는 경우 균주가 대식세포에서 제한된 생존율을 갖는 것은 불리하다.
이들 약독화된 박테리아 균주는 정맥내(IV) 투여될 때 마우스, 돼지 및 원숭이에서 안전한 것으로 밝혀졌고(Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760; Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652; Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315; 및 Zheng, L. et al. (2000) Oncol. Res. 12:127-135 참조) 및 소정의 생 약독화 살모넬라 균주는 인간 임상 시험에서 경구 투여 후 내약성이 우수한 것으로 나타났다(예를 들어, Chatfield, S. N. et al. (1992) Biotechnology 10:888-892; DiPetrillo, M. D. et al. (1999) Vaccine 18:449-459; Hohmann, E. L. et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1408-1414; 및 Sirard, J. C. et al. (1999) Immunol. Rev. 171:5-26 참조).
요법을 위해 약독화된 에스. 티피무리움의 다른 균주는 예를 들어 류신-아르기닌 영양요구성 A-1(예를 들어, Zhao et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(3):755-760; Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436; 미국 특허 번호 8,822,194; 및 미국 특허 공개 번호 2014/0178341 참조) 및 이의 유도체 AR-1(예를 들어, Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436; Kawaguchi et al. (2017) Oncotarget 8(12):19065-19073; Zhao et al. (2006) Cancer Res. 66(15):7647-7652; Zhao et al. (2012) Cell Cycle 11(1):187-193; Tome et al. (2013) Anticancer Research 33:97-102; Murakami et al. (2017) Oncotarget 8(5):8035-8042; Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882; 및 Binder et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1(2):123-133); aroA - 돌연변이체 에스. 티피무리움 균주 SL7207(예를 들어, Guo et al. (2011) Gene Therapy 18:95-105; 및 미국 특허 공개 번호 2012/0009153, 2016/0369282 및 2016/0184456 참조), 및 이의 절대 혐기성 미생물 유도체 YB1(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 2015/032165; Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436; 및 Leschner et al. (2009) PLoS ONE 4(8):e6692 참조); aroA - /aroD - 돌연변이체 에스. 티피무리움 균주 BRD509, SL1344(야생형) 균주의 유도체(예를 들어, Yoon et al. (2017) Eur. J. Cancer 70:48-61 참조); asd - /cya - /crp - 돌연변이체 에스. 티피무리움 균주 χ4550(예를 들어, Sorenson et al. (2010) Biologics: Targets & Therapy 4:61-73 참조) 및 phoP - /phoQ - 에스. 티피무리움 균주 LH430(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 2008/091375 참조)이다.
그러나, 약독화는 종양-체류 면역 세포, 종양 미세환경 및 종양 세포에 축적되는 박테리아의 능력에 영향을 미친다. 이 문제는 본원에서 해결된다. 본원에 예시된 살모넬라 균주와 같은 면역자극성 박테리아는 변형에 의해 약독화되며, 이는 상기 기재된 것 중 일부를 포함할 수 있을 뿐만 아니라 암 치료제로서의 효과성을 증강시키는 본원에 기재된 다른 변형 및 특성을 가질 수 있다.
약독화된 에스. 티피무리움 균주는 식균작용 및 분해 후 DNA를 전달하는 타고난 능력을 보유한다(예를 들어, Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293(1):95-106 참조). 이는 유전자 요법을 위한 벡터로 사용되었다. 예를 들어, 에스. 티피무리움 균주는 사이토카인, 혈관신생 저해제, 독소 및 전구약물-전환 효소를 인코딩하는 유전자를 비롯한 다양한 유전자를 전달 및 발현하는 데 사용되었다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2007/0298012; Loeffler et al. (2008) Cancer Gene Ther. 15(12):787-794; Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883; Loeffler et al. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100:1113-1116; Clairmont, C. et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199; Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:755-760; Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652; 및 Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control. Release 74:313-315 참조).
에스. 티피무리움은 종양-연관 항원(TAA) 서바이빈(SVN)을 항원 제시 세포(APC)에 전달하여 적응 면역력을 프라임하도록 변형되었다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2014/0186401; 및 Xu 등 (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270). SVN은 세포 생존을 연장하고 세포 주기 제어를 제공하는 세포자멸사 단백질의 저해제(IAP)이며 모든 고형 종양에서 과발현되고 정상 조직에서는 저조하게 발현된다. 이 기술은 SPI-2 및 이의 유형 III 분비 시스템을 사용하여 TAA를 APC의 세포기질로 전달한 다음 활성화되어 TAA 특이적 CD8+ T-세포 및 항종양 면역력을 유도한다(예를 들어, Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270 참조). 리스테리아-기초 TAA 백신과 유사하게, 이 접근법은 마우스 모델에서 가능성을 보여주었지만 인간에서 효과적인 종양 항원-특이적 T-세포 프라이밍을 실증하지 못하였다.
에스. 티피무리움은 단백질을 인코딩하는 DNA의 전달 외에도 암 치료를 위한 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 전달에 사용되었다. 예를 들어, 약독화된 에스. 티피무리움은 면역억제 유전자인 인돌라민 디옥시게나제(IDO)를 표적화하는 것과 같은 특정 shRNA를 발현하도록 변형되었다. 쥐 흑색종 모델에서 침묵된 IDO 발현은 종양 세포 사멸 및 호중구에 의한 상당한 종양 침윤을 초래하였다(예를 들어, Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456; 국제 출원 공개 번호 WO 2008/091375; 및 미국 특허 번호 9,453,227). 히알루로니다제와 이 벡터의 공동 투여는 뮤린 췌관 선암종의 치료에서 긍정적인 결과를 보여주었다(예를 들어, Manuel 등 (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107; 및 미국 특허 공보 2016/0184456). 다른 연구에서 phoP/phoQ 결실에 의해 약독화된 에스. 티피무리움 균주는 신호 변환기 및 전사 3(STAT3) 특이적 shRNA의 활성제를 발현하여 종양 성장을 저해하고 전이 기관의 수를 감소시켜 C57BL/6 마우스의 수명을 연장하였다(예를 들어, Zhang 등 (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864 참조). 또 다른 예에서, 에스. 티피무리움 균주 SL7207은 β-카테닌을 인코딩하는 유전자인 CTNNB1을 표적화하는 shRNA의 전달에 사용되었다(예를 들어, Guo 등 (2011) Gene Therapy 18:95-105; 및 미국 특허 공개 번호 2009/0123426 및 2016/0369282). 에스. 티피무리움 균주 VNP20009는 STAT3을 표적화하는 shRNA의 전달에 사용되었다(예를 들어, Manuel 등 (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191; 미국 특허 공개 번호 2009/0208534, 2014/0186401 및 2016/0184456; 및 국제 출원 공개 번호 WO 2008/091375 및 WO 2012/149364). 자가포식 유전자 Atg5 및 Beclin1을 표적화하는 siRNA는 에스. 티피무리움 균주 A1-R 및 VNP20009를 사용하여 종양 세포에 전달되었다(예를 들어, Liu 등 (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882 참조).
그러나, 이러한 균주는 항종양 면역 반응을 효과적으로 자극하지 않으며, 인코딩된 생성물의 치료 용량의 전달을 위해 종양을 효과적으로 콜로니화하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 균주의 향상은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아와 같은 항종양 면역 반응을 더 효과적으로 자극하기 위해 필요하다. 다양한 박테리아의 추가 및 대안적 변형이 공개된 국제 PCT 출원 번호 WO 2019/014398 및 미국 공개 번호 2019/0017050 A1에 기재되어 있다. 또한 본원에 기재된 이러한 간행물 각각에 기재된 박테리아는 면역자극 및 종양 표적화 특성을 추가로 개선하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
iii. VNP20009(YS1646)
본원에 기재된 변형을 위한 출발 균주로 사용될 수 있는 치료적 박테리아의 예는 VNP20009(ATCC # 202165, YS1646)로 명명된 균주이다. 이 바이러스는 임상 후보였다. VNP20009(ATCC # 202165, YS1646)는 msbB 및 purI 유전자의 결실에 의해 안전성을 위해 적어도 50,000배 약독화되었다(예를 들어, Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59; 및 Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25). msbB 유전자의 발현을 방지하기 위한 결실 또는 방해는 그람-음성 박테리아 외막의 주요 성분인 지질다당류의 지질 A 도메인의 조성을 변경한다(예를 들어, Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41). 이는 잠재적으로 해로운 TNFα의 생성을 감소시키면서 지질다당류-유도 패혈성 쇼크를 방지하고, 박테리아 균주를 약독화시키고, 전신 독성을 낮춘다(예를 들어,Dinarello, C.A. (1997) Chest 112(6 Suppl):321S-329S; 및 Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41). purI 유전자의 발현을 방지하기 위한 결실 또는 방해는 박테리아를 퓨린에 대한 영양요구성으로 만들고, 이는 박테리아를 추가로 약독화시키고 종양 미세환경에서 박테리아를 농화시킨다(예를 들어, Pawelek et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544; 및 Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178). 본원에 나타낸 바와 같이, VNP20009는 또한 면역억제성 뉴클레오사이드 아데노신에 대해 영양요구성이다. 아데노신은 종양에서 병리학적으로 높은 수준으로 축적될 수 있고 면역억제성 종양 미세환경에 기여할 수 있다(예를 들어, Peter Vaupel and Arnulf Mayer, Oxygen Transport to 조직 XXXVII, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 chapter 22, pp. 177-183).
VNP20009를 동계 또는 인간 이종이식 종양이 있는 마우스에게 투여하였을 때, 박테리아는 300-1000:1을 초과하는 비율로 종양의 세포외 구성요소 내에 우선적으로 축적되었으며, 대조군 마우스와 비교하여 종양 성장 저해 및 연장된 생존을 실증하였다(예를 들어, Clairmont 등 (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002). VNP20009는 동물 모델에서 종양 표적화 및 종양 성장 저해에서 성공을 실증하면서 독성을 거의 이끌어내지 않았다(예를 들어, Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178; Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883; Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508; 및 Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002).
인간 전이성 흑색종에 대한 1상 임상 시험의 결과에 따르면 VNP20009가 비교적 안전하고 내약성이 우수하지만 매우 제한된 항종양 활성이 관찰되었다(예를 들어, Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152). VNP20009의 사용은 전이성 질환 부담에 유의한 변화를 가져오지 않았지만 최대 허용 용량(MTD)에서 종양 콜로니화의 증거를 실증하였다. 항종양 활성에 영향을 미치는 데 필요한 더 높은 용량은 높은 수준의 전염증성 사이토카인과 관련된 독성으로 인해 불가능하였다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 균주 VNP20009에 없는 수많은 개선 및 이점을 제공한다. 예시된 균주의 경우, VNP20009 균주(YS1646)는 편모를 무효화시키는 것을 포함하여 추가의 게놈 변형의 도입에 의해 추가로 변형되는 부모 균주로서 사용된다. 균주는 또한, purI 및/또는 msbB를 완전히 결실시킴으로써 향상된다. 다른 게놈 변형은 컬리 핌브리애의 무효화 또는 비활성화를 포함하며, 박테리아가 생체내에서 복제되지 않게 하는 균주 thyA - 및/또는 T-세포의 활성을 비활성화시키거나 감소시키는 아스파라기나제 활성을 무효화시키는 ansB - 가 되게 한다. 이러한 게놈 변형은 개별적으로 그리고 함께, 식세포에서 축적되거나 이를 감염시키고 또한 숙주의 항바이러스 유형 면역 반응을 증가시키는 박테리아의 능력을 향상시킨다. 면역자극성 박테리아는 면역계를 자극시키고/시키거나 면역억제를 감소시키고 치료 생성물 및 면역화 항원과 생성물을 제공하는 다양한 페이로드를 포함하도록 변형된다.
면역자극성 박테리아는 인코딩된 유전자 페이로드를 종양-특이적 방식으로 종양-체류 골수성 세포에 전달한다. 유전자의 결실 또는 방해와 같은 게놈 변형 및 게놈의 다른 변형으로 인해 면역자극성 박테리아는 예를 들어 편모 제거에 의해 감소된 TLR2-매개, TLR4-매개 및 TLR5-매개 염증, LPS의 변형, 및 컬리 핌브래의 제거 및 생물막 형성 감소를 나타낸다. 본원에 제시되고 기재된 바와 같이, TLR2의 무효화, 및 또한 TLR2/4/5-매개 활성과 반응의 무효화는 유형 I 인터페론 생산을 촉진하거나 증강시키고/시키거나 이러한 수용체가 TLR 반응으로 인해 활성화될 때 발생하는 유형 I IFN의 임의의 감소 또는 저해를 감소시킨다. 면역자극성 박테리아는 L-아스파라기나제 II의 발현을 무효화함으로써 T-세포 기능과 활성 및 효과를 증강시키고 플라스미드 유지를 촉진, 제공, 허용 및 지원한다. 박테리아는 골수성 세포, 특히 종양-체류 골수성 세포에만 또는 실질적으로 여기에만 축적(또는 표적화)하여 식균 작용 후 매우 효율적인 플라스미드 전달을 제공한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경을 콜로니화하고 전신적으로 투여될 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 VNP20009와 비교하여 15배 이상 개선된 LD50을 나타낸다. 따라서 필요한 경우 VNP20009와 비교하여 훨씬 더 높은 용량의 본원에 제공된 면역자극성 박테리아가 독성 효과 없이 투여될 수 있다(예를 들어 예시적인 용량 및 투여를 설명하는 섹션 F.5의 아래 표 참조).
편모의 제거, LPS 변형 및 다른 변형을 포함하여 본원에 기재된 바와 같이 변형된 면역자극성 박테리아가 골수성 세포, 특히 종양-체류 골수성 세포에 우선적으로 축적되거나 표적화된다는 것이 본원에 제시되고 설명된다. 실시예는 면역자극성 박테리아가 정맥내와 같은 전신 투여 후에 이러한 세포에 축적된다는 것을 실증한다. 실시예는 또한 면역자극성 박테리아에서 종양-체류 골수성 세포로의 플라스미드 전달 및 박테리아 세포 사멸 후 오래 지속되는 단백질 발현을 설명하고 보여줌으로써 항암 반응 및 표현형을 초래하는 생성물을 포함하는 치료 생성물을를 전달한다.
iv. 야생형 균주
종양에 VNP20009가 축적되는 것은 하기를 포함하는 인자의 조합에서 기인한다: ATCC 14028 모 균주의 고유한 침습성, 저산소 환경에서 복제할 수 있는 능력, 종양의 간질액에 존재하는 고농도 퓨린에 대한 요건. 본원에 기재된 바와 같이, VNP20009와 같은 약독화된 균주를 출발 박테리아 균주로 사용할 필요는 없다. 본원에 기재된 변형으로 인해, 박테리아는 무독성 또는 약독화된다. 모 균주, ATCC 14028, 또는 다른 야생형 균주는 출발 균주로 사용될 수 있고 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 게놈 변형으로 인해, 종양 및 종양-체류 면역 세포, 및 또한 종양-체류 대식세포를 침윤시키고 콜로니화한다. 종양을 갖지 않는 대상체에서 백신으로서 사용될 때, 박테리아는 식세포, 예컨대 대식세포에 축적된다.
3. 선행 박테리아 암 면역요법의 한계
본원에 제시된 바와 같이, 그리고 또한 당업계의 지식의 관점에서 실증된 바와 같이, TLR은 유형 I IFN의 유도를 저해하거나 방지한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 TLR2/4/5 반응/활성을 감소시키거나 저해하거나 무효화시키는 변형을 포함하여, 유형 I IFN의 저해를 극복한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 또한, 유형 I IFN 발현을 증강시키거나 유형 I IFN 유도를 항시적으로 만드는 특성 및/또는 페이로드를 포함한다.
많은 종류의 면역 요법은 안전성과 효능을 제한하는 중대한 한계와 널리 사용되지 않을 복잡한 플랫폼을 갖고 있다. 박테리아, 특히 본원에 제공된 것은 예를 들어 종양용해 바이러스와 비교하여 항암 치료제로 사용하기에 많은 유리한 특성을 갖고 있다. 여기에는 증식, 제조, 저장 및 치료가 완료되면 숙주에서 제거할 수 있는 용이성이 포함된다. 그러나 바이러스는 숙주 반응을 포함하여 유리한 특성도 갖고 있다. 박테리아 감염에 대한 반응은 내재성인 염증 반응으로 항암 치료에 유리하지 않다. 바이러스 감염에 대한 반응은 항암 반응과 유사한다. 이는 하기 표에 요약되어 있다.
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따라서 미생물 항암 플랫폼으로서의 선행 박테리아의 한계는 항암 요법에 더 가까운 바이러스-감지 경로와 비교하여 면역계가 박테리아, 심지어 세포내 박테리아를 감지할 때 시작되는 특정 면역 프로그램에서 유래된다. 바이러스를 인식하는 감지 프로그램은 매우 효과적인 백신과 지속적인 있는 적응 면역력의 생성을 허용한다. 그러나 박테리아에 대한 백신화는 제한된 성공을 거두었다. 예를 들어, 살모넬라 티피에 대한 장티푸스열(typhoid fever)에 대해 FDA 승인을 받은 백신은 고 면역원성 Vi 캡슐 및 O:9 항원을 함유하는 에스. 티피에도 불구하고 55%만 효과적이고(예를 들어, Hart et al. (2016) PLoS ONE 11(1):e0145945 참조), 이는 백신이 없는 엘. 모노사이토게네스 및 에스. 티피무리움과 같은 덜 면역원성인 박테리아 균주에서는 발생하지 않는다.
박테리아 및 바이러스에는 숙주 세포 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 감지되는 병원체-연관 분자 패턴(PAMP)으로 알려진 보존된 구조가 포함되어 있다. PRR에 의한 PAMP의 인식은 사이토카인 및 케모카인의 유도 및 특정 면역 반응의 개시를 초래하는 다운스트림 신호전달 캐스케이드를 유발한다(예를 들어, Iwasaki 및 Medzhitov(2010) Science 327(5963):291-295 참조). 내재성 면역계가 PAMP에 의해 연계되는 방식과 어떤 유형의 감염원이 침입하는 병원체와 싸우기 위해 적절한 내재성 또는 적응 반응이 생성되는지의 여부를 결정한다.
톨-유사 수용체(TLR: Toll Like Receptor)로 알려진 PRR 부류는 박테리아 및 바이러스 기원에서 유래된 PAMP를 인식하고 세포 내의 다양한 구획에 위치한다. TLR은 지질다당류(TLR4), 지질단백질(TLR2), 플라젤린(TLR5), DNA의 비메틸화된 CpG 모티프(TLR9), 이중 가닥 RNA(TLR3) 및 단일 가닥 RNA(TLR7 및 TLR8)를 포함한 다양한 리간드를 인식한다(예를 들어, Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680; 및 Kawai and Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17(4):338-344 참조). DNA 및 RNA-기초 바이러스는 식균 작용 후 숙주 세포기질 구획에서 감지되거나 세포기질에서 직접 감지될 수 있다. 유형 I 인터페론(IFN-α, IFN-β)은 바이러스 기원 또는 손상된 숙주 세포 DNA의 흡수로부터 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA의 숙주 인식에 의해 유도된 시그니처 사이토카인이다. 예를 들어, 합성 dsRNA 유사체 폴리이노신:폴리시티딜산(폴리(I:C))은 엔도솜 TLR3에 대한 작용제이며; dsRNA의 더 안정적인 버전인 폴리 ICLC(예를 들어, 상표 Hiltonol®)는 임상 개발 중이었다(예를 들어, Caskey 등 (2011) J. Exp. Med. 208(12):2357-2366 참조). 유사하게는, 엔도솜의 단일 가닥 RNA(ssRNA)는 TLR7 및 TLR8(인간에서만)에 의해 감지되며, 이의 알려진 합성 리간드인 레시퀴모드 및 이미퀴모드는 FDA-승인 국소 암 면역요법이다.
세포기질에서 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I) 및 흑색종 분화 관련 유전자 5(MDA-5)와 같은 RNA 헬리카제에 의해 감지되어 유형 I IFN을 유도한다(예를 들어, Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919 참조). dsDNA에 대한 세포기질 센서는 감염성 병원체 또는 비정상적인 숙주 세포 손상으로부터 세포기질 dsDNA를 감지하기 위한 중앙 매개체인 ER-체류 어댑터 단백질인 인터페론 유전자의 자극인자(STING: Stimulator of 인터페론 유전자)를 통해 매개된다(예를 들어, Barber (2011) Immunol. Rev. 243(1):99-108). STING 신호전달은 TANK-결합 키나제 1(TBK1)/인터페론 조절 인자 3(IRF3) 축 및 NF-κB 신호전달 축을 활성화하여 IFN-β 및 내재성 및 적응 면역력을 강하게 활성화하는 다른 전염증성 사이토카인과 케모카인을 유도한다(예를 들어, Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518 참조). STING을 통한 세포기질 dsDNA 감지에는 dsDNA에 직접 결합하는 숙주 세포 뉴클레오티딜 전이효소인 환식 GMP-AMP 합성효소(cGAS)가 필요하며, 이에 반응하여 환식 디뉴클레오타이드(CDN) 2차 메신저인 환식 GMP-AMP(cGAMP)를 합성하고, 이는 STING에 결합하여 이를 활성화한다(예를 들어, Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791; 및 Wu et al. (2013) Science 339(6121):826-830 참조).
STING은 또한 세포내 엘. 모노사이토게네스에서 생산된 c-디-AMP 또는 에스. 티피무리움에서 c-디-GMP와 같은 박테리아 유래 CDN에 결합할 수 있다. 환식 GMP-AMP 신타제(cGAS)는 박테리아에서 유래한 정규(canonical) CDN에 반응하지 않는 인간 STING 대립유전자를 활성화할 수 있는 비정규 CDN을 생성한다. 2개의 퓨린 뉴클레오사이드가 3'-3' 연결을 가진 포스페이트 다리로 연결된 박테리아에 의해 생성된 CDN과 달리, cGAS에 의해 합성된 cGAMP의 뉴클레오타이드간 포스페이트 다리는 비정규 2'-3' 연결부로 연결된다. 이러한 2'-3' 분자는 박테리아 3'-3' c-디-GMP보다 300배 더 나은 친화도로 STING에 결합하므로 STING의 더 강력한 생리학적 리간드이다(예를 들어, Civril et al. (2013) Nature 498(7454):332-337; Diner et al. (2013) Cell Rep. 3(5):1355-1361; Gao et al. (2013) Sci. Signal 6(269):pl1; 및 Ablasser et al. (2013) Nature 503(7477):530-534). 인간의 cGAS/STING 신호전달 경로는 박테리아성 병원체보다 바이러스성 병원체에 우선적으로 반응하도록 진화한 것으로 보이다.
따라서, STING 및 RIG-I와 같은 바이러스 감지 PRR 및 TLR은 유형 I IFN 및 효과적인 T-세포-매개 적응 면역력을 유도하는 사이토카인 및 케모카인을 유도한다. 종양 환경에서, 유형 I IFN 신호전달은 CXCL10과 같은 T-세포 트래피킹 케모카인을 유도하고 또한 CD8+ T-세포를 프라임하기 위한 종양 항원의 DC 교차-제시를 활성화하는 데 필요하다(예를 들어, Diamond et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):1989-2003; 및 Fuertes et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):2005-2016).
대조적으로, 에스. 티피무리움과 같은 박테리아의 숙주 감시는 주로 TLR2, TLR4 및 TLR5를 통해 매개된다(예를 들어, Arpaia 등 (2011) Cell 144(5):675-688 참조). 이러한 TLR은 MyD88(골수성 분화 1차 반응 단백질 88) 및 TRIF(Toll/인터루킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β) 어댑터 분자를 통해 신호를 보내 NF-κB 의존성 전염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 유도를 매개한다(예를 들어, Pandey et al. (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7(1):a016246 참조). 에스. 티피무리움은 NLRP3 인플라마솜 경로를 활성화하여 카스파제-1의 절단 및 파이롭토틱(pyroptotic) 세포 사멸을 유발하는 전염증성 사이토카인 IL-1β 및 IL-18의 유도를 초래하는 것으로 나타났다. TLR2, TLR4 및 TLR5의 연계와 인플라마솜 활성화는 케모카인과 사이토카인을 유도하여 호중구와 대식세포에 의한 박테리아 제거를 유도한다. 에스. 티피무리움이 T-세포에 의해 제거된다는 증거는 제한적이며, 이에 대해 생산된 항체는 중화되지 않는다(예를 들어, McSorley (2014) Immunol. Rev. 260(1):168-182 참조). 또한, 에스. 티피무리움은 T-세포 기능을 직접적으로 억제하여 잠재적인 항종양 T-세포 반응이 생산되는 것을 손상시키는 기전을 갖고 있다(예를 들어, Kullas 등 (2012) Cell Host Microbe. 12(6)791-798 참조). 결과적으로 에스. 티피무리움과 같은 박테리아성 암 요법은 적응성 항종양 면역력을 생산하는 데 필요한 T-세포가 아닌 호중구 및 대식세포에 의한 모집 및 제거로 이어진다. 이러한 차이가 숙주 종양 항원을 포함하는 이전의 박테리아성 항암 백신이 인간에서 불량한 T-세포 프라이밍 벡터인 이유를 설명할 수 있다는 것이 본원에 기재되고 제시되어 있다. 많은 TLR은 유형 I 인터페론(IFN)을 유도하는 것으로 보고되어 왔으나, 이러한 도그마(dogma)가 1차 인간 단핵구-유래 대식세포에서 TLR2/3/4/5/7에 관하여 필수적으로 올바르지 않다는 것이 본원에서 확인되고 기재된다. 실험은 유형 I IFN에 미치는 효과를 평가하기 위해 TLR 작용제를 사용하여 수행되었다. 결과는, TLR3 및 TLR4 작용제가 IFNα으로 전처리되지 않는 한 1차 인간 단핵구에서 유형 I IFN을 유도하지 않음을 보여주었다. 작용성(agonizing) TLR2는 심지어 IFNα로 전처리되었을 때에도 유형 I IFN을 유도하지 않는다. 실제로, TLR2는 유형 I IFN의 유도를 저해할 수 있다. 이는 박테리아-기초 치료제가 갖는 지금까지 식별되지 않은 문제점이다.
이러한 문제는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 의해 해결되는 문제 중 하나이다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이전에 바이러스 치료제에 의해서만 제공되었던 유리한 특성을 갖고 또한 박테리아 치료제의 유리한 특성을 보유하도록 조작된다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 전신 투여될 수 있고, 종양, 종양-체류 면역 세포 및/또는 종양 미세환경에 국한될 수 있고, 면역억제를 극복하고, 항종양 면역력을 적절하게 활성화할 수 있으며, 또한 기존 전신 면역요법의 자가면역-연관 독성을 제한할 수 있다. 본원에 제공된 박테리아는 종양-체류 면역 세포에 효과적으로 위치하고, 치료적 항암 생성물을 인코딩하고, 복수의 이러한 생성물을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 박테리아는 상보적인 치료 생성물을 인코딩할 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 TLR2, 4 및 5의 활성화를 감소시키거나 무효화시키도록 변형된다. 그 결과, 이는 유형 I IFN의 유도를 저해하지 않는다. 본원에 제공된 이러한 면역자극성 박테리아는 유형 I IFN을 유도하는 페이로드를 인코딩한다. 이러한 발견은, TLR2 반응이 무효화되거나 감소되도록 본원에 제공되는 백신 및 전달 비히클이 설계되어 이것이 유형 I IFN을 방지하거나 저해하지 않는 것으로 일반화된다. 일부 구현예에서, TLR4 및 5 반응은 감소되거나 무효화되어, 유형 I IFN을 저해하지 않는 백신 및 다른 면역-자극 치료제를 제공한다.
효과적인 적응 면역력을 유도하는 바이러스-유사 면역 반응을 이끌어내면서 박테리아의 유익한 특성을 보유하도록 설계된 우수한 미생물 항암, 백신, RNA 전달 플랫폼이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 살모넬라 및 다른 종의 균주와 같은 박테리아는 염증 효과가 감소되어 독성이 덜하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 그 결과, 예를 들어 더 높은 용량이 투여될 수 있다. 당업자에게 알려져 있고/있거나 상기 및 본원에 열거된 살모넬라의 임의의 이러한 균주 및 다른 종의 박테리아는 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경, 종양-체류 면역 세포 및 종양의 콜로니화를 증가시키도록 변형된다. 이는 독성을 줄이고 아데노신 영양요구성을 포함하여 종양 미세환경을 표적화하는 다른 특성을 갖도록 조작된다. 본원에 제공된 균주는 또한 보체에 의해 비활성화되지 않도록 조작된다. 이러한 특징, 특히 식세포의 콜로니화/감염을 초래하는 특징은 또한 박테리아를 백신 플랫폼으로서 그리고 RNA 전달 비히클로서 유용하게 만든다. 이는 선택되는 페이로드, 이용되는 조절 서열, 박테리아 또는 숙주 세포 전사/번역 머시너리가 인코딩된 생성물의 발현에 사용되어야 하는지의 여부, 및 생성물이 생산되는 숙주 세포 또는 조직의 좌위(locus)로 인해 각각의 용도에 대해 적응될 수 있다.
본원에 제공된 박테리아 균주는 치료 생성물을 전달하도록 조작된다. 본원의 박테리아 균주는 사이토카인, 케모카인 및 공동자극성 분자를 비롯한 면역자극성 단백질뿐만 아니라 유형 I IFN 발현을 항시적으로 유발하거나 유도할 수 있는 변형된 기능-획득 세포기질성 DNA/RNA 센서, 및 다른 치료 생성물, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는 항체 및 이의 단편, TGF-β 및 IL-6 결합 유인 수용체, TGF-β 폴리펩타이드 길항제, 이중특이적 T-세포 연계자(BiTEs®), RNAi, 및 이의 상보적 조합을 전달하고, 이는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 촉진한다. 박테리아 균주는 또한 식세포의 파이롭토시스를 감소시켜 더 강력한 면역 반응을 제공하고/하거나 상피 세포를 감염/침투하는 능력을 감소 또는 무효화하지만, 식세포를 감염/침투하는 능력은 보유하는 게놈 변형을 포함하므로, 이는 종양, 종양 미세환경 및 종양-체류 면역 세포에 더 효과적으로 축적된다. 박테리아 균주는 또한 인간 혈청의 보체 인자에 의한 비활성화에 저항하도록 변형될 수 있다. 박테리아 균주는 또한 단독으로 또는 조합하여, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 공동자극성 분자, 유형 I IFN의 항시적으로 활성인 유도제, 및 면역 체크포인트 및 또한 다른 이러한 표적에 대한 단일클론 항체(및 이의 단편)를 포함하는 치료 생성물을 인코딩하도록 변형될 수 있다.
항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 전체 또는 부분 세포질 도메인 결실을 갖는 절두된 공동자극성 분자(수용체 또는 리간드; 예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1, OX40L)를 인코딩하는 유전적 페이로드를 전달하는 항암 치료 생성물이 제공되며, 여기서 절두된 유전자 생성물은 공동-자극성 수용체 연계(engagement)를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실된 또는 절두된 세포질 도메인으로 인해 APC에 반대-조절 신호를 할 수 없다.
박테리아는 또한 면역자극성 단백질(들), 예컨대 STING 및 사이토카인에 더하여(또는 그 대신에) 항원, 예컨대 종양 항원, 및 병원체 항원 또는 단백질을 인코딩할 수 있다.
C. 종양-체류 골수성 세포에서 치료 지수를 증가시키고 축적을 증가시키기 위한 면역자극성 박테리아의 변형 및 증강
본원에서는 예를 들어 종양-체류 골수성 세포의 축적을 증가시키고 보체 비활성화에 대한 내성을 개선하고, 면역 세포 사멸을 감소시키고, 적응 면역력을 촉진하고, T-세포 기능을 증강시킴으로써 독성을 감소시키고 항종양 활성을 개선하는 박테리아 게놈 또는 면역자극성 박테리아에 대한 변형을 포함하는 향상을 제공한다. 변형은 살모넬라, 특히 에스. 티피무리움과 관련하여 설명되고 예시되어 있으며; 당업자는 유사한 특성 및/또는 효과를 달성하기 위해 그리고 동일한 인코딩된 페이로드를 발현하기 위해 다른 박테리아 종, 예컨대 리스테리아 및 이. 콜라이에서 그리고 다른 살모넬라 균주에서 유사한 향상/변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 개선/변형의 예는 하기와 같다.
1. LPS 생합성 경로에서 유전자의 결실
그람음성균의 지질다당류(LPS)는 박테리아막의 바깥쪽 소엽의 주성분이다. 이는 세 가지 주요 부분, 지질 A, 비반복 코어 올리고당 및 O 항원(또는 O 다당류)으로 이루어진다. O 항원은 LPS의 가장 바깥쪽 부분으로 박테리아 투과성에 대한 보호층 역할을 하지만 O 항원의 당 조성은 균주마다 크게 다르다. 지질 A와 코어 올리고당은 덜 다양하고 더 일반적으로 동일한 종의 균주 내에서 보존된다. 지질 A는 내독소 활성을 포함하는 LPS의 부분이다. 일반적으로 여러 지방산으로 장식된 이당류이다. 이 소수성 지방산 사슬은 LPS를 박테리아 막에 고정시키고 나머지 LPS는 세포 표면에서 돌출한다. 지질 A 도메인은 그람 음성 박테리아의 독성의 대부분을 담당한다. 일반적으로 혈액의 LPS는 중요한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)으로 인식되며 두드러진 전염증 반응을 유도한다. LPS는 CD14, MD2 및 TLR4를 포함하는 막 결합 수용체 복합체의 리간드이다. TLR4는 MyD88 및 TRIF 경로를 통해 신호를 보내 NF-κB 경로를 자극하고 TNF-α 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인을 생성할 수 있는 막횡단 단백질이며, 그 결과 내독성 쇼크가 발생할 수 있으며, 이는 치명적일 수 있다. 포유동물 세포의 세포기질에 있는 LPS는 카스파제 4, 5 및 11의 카스파제 모집 도메인(CARD)에 직접 결합하여 자가활성화 및 파이롭토틱(pyroptotic) 세포 사멸을 유발할 수 있다(예를 들어, Hagar 등 (2015) Cell Research 25:149-150 참조). 지질 A의 조성과 지질 A 변이체의 독성은 잘 문서화되어 있다. 예를 들어, 단일인산화 지질 A는 다중 인산기가 있는 지질 A보다 염증이 훨씬 적다. 지질 A의 아실 사슬의 수와 길이도 독성 정도에 중대한 영향을 미칠 수 있다. 이. 콜라이의 규정 지질 A는 6개의 아실 사슬을 가지고 있으며 이 헥사-아실화는 잠재적으로 독성이 있다. 에스. 티피무리움 지질 A는 이. 콜라이의 지질과 유사하며; 이는 4개의 1차 및 2개의 2차 하이드록시아실 사슬을 운반하는 글루코사민 이당류이다(예를 들어, Raetz 등 (2002) Annu. Rev. Biochem. 71:635-700 참조).
a. msbB 결실
에스. 티피무리움에서 msbB 유전자에 의해 인코딩된 효소 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제는 지질다당류(LPS)의 지질 A 도메인에 말단 미리스토일 기의 첨가를 촉매화한다(예를 들어, Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41). 따라서, msbB의 결실은 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 구성요소인 LPS의 지질 A 도메인의 아실 조성을 변경한다. 예를 들어, 에스. 티피무리움 균주 VNP20009에서 msbB의 결실은 천연 헥사-아실화된 지질 A보다 독성이 덜하고 독성 쇼크의 유도 없이 전신 전달을 허용하는 우세하게 펜타-아실화된 지질 A의 생성을 초래한다(예를 들어, Lee 등 (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25 참조). 이러한 변형은 패혈성 쇼크를 유도하는 LPS의 능력을 상당히 감소시키고, 박테리아 균주를 약독화시키고, 따라서 살모넬라-기초 면역치료제의 치료 지수를 증가시킨다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0170276, 2003/0109026, 2004/0229338, 2005/0255088, 및 2007/0298012). 중요하게는, msbB 생성물을 발현하지 않는 msbB 돌연변이체는 본원에 예시된 바와 같이 세포내 복제할 수 없으며(예를 들어, 실시예 2 참조), 이는 살모넬라 독성에 대한 요건이다(예를 들어, Leung 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11470-11474).
대체, 결실 또는 삽입을 포함하여 LPS 발현을 변경하는 다른 LPS 돌연변이는 독성을 극적으로 감소시켜 더 낮은 독성을 제공하고 더 높은 용량의 투여를 허용하는 살모넬라 균주를 포함하여 본원에 제공된 박테리아 균주에 도입될 수 있다. 본원에 예시된 바와 같이, msbB - 좌위는 부분적으로 결실되거나, 간섭되거나, 전좌될 수 있다. 이는 또한, 완전히 결실될 수 있으며, 이는 균주의 성장을 향상시킬 수 있다.
다른 박테리아 종에서 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제의 상동체 또는 이종상동체를 인코딩하는 상응하는 유전자도 결실되거나 방해되어 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 미리스토일-아실 운반체 단백질-의존성 아실트랜스퍼라제를 인코딩하는 lpxM; 및 에스. 티피에서 지질 A 아실트랜스퍼라제를 인코딩하는 msbB를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
b. pagP 결실 또는 비활성화
상기 기재된 바와 같이, 에스. 티피무리움의 msbB 돌연변이는 지질 A의 말단 미리스토일화를 겪을 수 없으며, 헥사-아실화된 지질 A보다 훨씬 덜 독성인 주로 펜타-아실화된 지질 A를 생성한다. 팔미테이트를 사용한 지질 A의 변형은 효소 지질 A 팔미토일트랜스퍼라제(PagP)에 의해 촉매화된다. pagP 유전자의 전사는 예를 들어 SCV 내부에서 낮은 농도의 마그네슘에 의해 활성화되는 PhoP/PhoQ 시스템의 제어 하에 있다. 따라서 에스. 티피무리움 지질 A의 아실 함량은 가변적이며 야생형 박테리아의 경우 헥사 아실화 또는 펜타 아실화될 수 있다. 지질 A를 팔미트화하는 에스. 티피무리움의 능력은 포식용해소체로 분비되는 항균 펩타이드에 대한 내성을 증가시킨다.
야생형 에스. 티피무리움에서 pagP의 발현은 헵타-아실화된 지질 A를 생성한다. msbB 돌연변이체(지질 A의 말단 아실 사슬이 추가될 수 없음)에서 pagP의 유도는 헥사-아실화된 지질 A를 생성한다(예를 들어, Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038 참조). 헥사-아실화 지질 A는 가장 전염증성인 것으로 나타났다. 군은 예를 들어 헥사-아실화된 지질 A만 생성되도록 하기 위해 pagP의 결실 또는 방해에 의해 이러한 전염증성 신호를 이용하려고 노력하였으나(예를 들어, Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177; 및 Felgner et al. (2018) Oncoimmunology 7(2):e1382791 참조), 이는 LPS의 TNF-α-매개 전염증 특성과 역설적으로 덜 적응 면역력으로 인해 불량한 내약성을 유발할 수 있다(예를 들어, Kocijancic 등 (2017) Oncotarget 8(30):49988-50001 참조).
LPS는 TNF-α 및 IL-6을 유도하는 강력한 TLR4 작용제이다. 1E9 CFUs/m2에서 I.V. VNP20009 임상 시험에서 용량 제한 독성(예를 들어, Toso 등 (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152 참조)은 2시간째에 혈청에서 TNF-α 수준 > 100,000 pg/mL, 및 IL-6 수준 > 10,000 pg/mL과 함께 사이토카인 매개였다(열, 저혈압). VNP20009의 msbB 결실 및 감소된 발열성에도 불구하고 LPS는 헥사 아실화 지질 A의 존재로 인해 고용량에서 여전히 독성이 있을 수 있다. 따라서 헥사 아실화 지질 A를 생성할 수 없고 단지 펩타-아실화 지질 A만 생성하여 전염증성 사이토카인의 더 낮은 유도를 초래하는 pagP - /msbB - 균주는 고용량에서 더 잘 견디며 1E9 CFU/m2 이상에서 인간에게 투여될 수 있다. 더 높은 용량은 종양, 종양-체류 면역 세포 및 종양 미세환경의 콜로니를 증가시켜 면역자극성 박테리아의 치료 효능을 향상시킨다. 박테리아막 및 구조의 결과적인 변화로 인해 보체 활성과 같은 숙주 면역 반응이 변경되어 전신 투여 시 박테리아가 제거되지 않는다. 예를 들어, pagP -/msbB - 돌연변이체 균주가 보체 비활성화에 대한 증가된 내성 및 인간 혈청에서 향상된 안정성을 갖는다는 것이 본원에서 제시된다.
본원에서는 펜타-아실화된 지질 A를 갖는 LPS만을 생산할 수 있고 msbB 유전자의 결실 또는 방해를 함유하고 pagP의 결실 또는 중단에 의해 추가로 변형되는 에스. 티피무리움의 예시적인 균주와 같은 생 약독화된 살모넬라 균주에 의해 예시되는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 위에서 논의한 바와 같이, msbB 발현의 결실은 지질 A의 말단 미리스토일화를 방지하는 반면, pagP 발현의 결실은 팔미토일화를 방지한다. 펜타-아실화 지질 A로 LPS를 생산하도록 변형된 균주는 종양 미세환경에서 면역 반응을 자극하는 이종성 유전자 페이로드를 발현하도록 추가로 변형되었을 때, 전염증성 사이토카인의 수준을 낮추고, 혈액 내 안정성을 개선하고, 보체 고정에 대한 내성을 증가시키고, 항균성 펩타이드에 대한 감수성을 증가시키고, 내약성을 증강시키고, 항종양 면역력성을 증가시킨다.
다른 박테리아 종에서 지질 A 팔미토일트랜스퍼라제(PagP)의 상동체 및 이종상동체를 인코딩하는 해당 유전자도 결실되거나 방해되어 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 지질 IVA 팔미토일트랜스퍼라제를 인코딩하는 pagP; 및 에스. 티피에서 항균성 펩타이드 내성 및 지질 A 아실화 단백질을 인코딩하는 pagP를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
2. 영양소 영양요구성
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 하나 이상의 필수 영양소, 예컨대 퓨린(예를 들어, 아데닌), 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신), 아미노산(예를 들어, 방향족 아미노산, 아르기닌 및 류신), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 또는 당업계에 알려지고 기재된 바와 같은 다른 영양소에 대해 이러한 면역자극성 박테리아를 영양요구성으로 되게 함으로써 약독화될 수 있다.
a. purI 결실/방해
purI 유전자(purM 유전자와 동의어)에 의해 인코딩되는 효소인 포스포리보실아미노이미다졸 합성효소는 퓨린의 생합성 경로에 관여한다. 따라서 purI 유전자의 방해 또는 결실 또는 비활성화는 박테리아를 퓨린에 대한 영양요구성으로 만든다. 약독화되는 것 외에도, purI - 돌연변이체는 종양 환경에서 풍부하고 상당한 항종양 활성을 갖는다(예를 들어, Pawelek 등 (1997) Cancer Research 57:4537-4544 참조). 이러한 콜로니화는 종양의 빠른 세포 회전율의 결과로 종양의 간질액에 존재하는 고농도의 퓨린으로 인해 발생한다고 이전에 설명되었다. purI - 박테리아는 퓨린을 합성할 수 없기 때문에 외부 아데닌 공급원이 필요하며 이것이 퓨린이 풍부한 종양 미세환경에서 제한된 성장으로 이어질 것으로 생각되었다(예를 들어, Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225). VNP20009 균주는 처음에 purI 유전자의 결실을 함유하는 것으로 보고되었지만(예를 들어, Low 등 (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, pp. 47-59 참조), VNP20009의 전체 게놈에 대한 후속 분석은 purI 유전자가 결실되지 않지만 염색체 역전(inversion)에 의해 방해됨을 보여주었다(예를 들어, Broadway 등 (2014) Journal of Biotechnology 192:177-178 참조). 전체 purI 유전자는 삽입 서열에 의해 플랭킹되는 VNP20009 염색체의 두 부분 내에 포함되어 있으며, 그 중 하나는 활성 트랜스포사제를 갖고 있다. purI 유전자의 방해는 종양 조직/미세환경으로의 복제를 제한하지만, 여전히 세포내 복제 및 독성을 허용한다. 본원에 예시된 바와 같이(실시예 2 참조) msbB 및 purI 유전자 각각의 결실 또는 방해는 종양 조직의 세포외 공간으로의 박테리아 성장을 제한하고 세포내 복제를 방지하기 위해 필요하다. 재조합에 의한 야생형으로의 가능한 복귀를 제거하기 위해 이러한 유전자의 인코딩 부분이 완전히 결실된 균주가 본원에 제공된다. 이러한 박테리아는 더 효과적으로 성장하는 것으로 본원에 제시된다.
purI 유전자 결실 또는 방해 외에도, 영양 영양요구성은 예를 들어 aro, gua, thy, nad 및 asd와 같은 유전자의 결실/돌연변이에 의해 면역자극성 박테리아에 도입될 수 있다. 이러한 유전자를 포함하는 생합성 경로에 의해 생성된 영양소는 종종 숙주 세포에서 사용할 수 없으므로 박테리아 생존이 어렵다. 예를 들어, 살모넬라 및 다른 박테리아 종의 약독화는 해당과정을 방향족 아미노산 생합성에 연결하는 시키메이트 경로의 일부인 aroA 유전자의 결실에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Felgner 등 (2016) mBio 7(5):e01220-16). aroA의 결실은 방향족 아미노산에 대한 박테리아 영양요구성 및 후속 약독화를 초래한다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0170276, 2003/0175297, 2012/0009153, 및 2016/0369282, 및 국제 출원 공개 번호 WO 2015/032165 및 WO 2016/0369282 참조). 유사하게는, aroC 및 aroD를 포함하는 방향족 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 다른 효소는 약독화를 달성하기 위해 결실되었다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2016/0369282 및 국제 출원 공개 번호 WO 2016/025582 참조). 예를 들어, 에스. 티피무리움 균주 SL7207은 방향족 아미노산 영양요구성(aroA - 돌연변이체)이고; 균주 A1 및 A1-R은 류신-아르기닌 영양요구균이고; VNP20009/YS1646은 퓨린 영양요구성(purI-돌연변이), 뿐만 아니라 msbB - 이다. 본원에 나타낸 바와 같이, VNP20009/YS1646은 또한 면역억제성 뉴클레오사이드 아데노신 및 ATP에 대해 영양요구성이다(예를 들어, 실시예 1 참조). 본원에 제공된 균주는 YS1646로 명명된 균주로부터 유래된 균주, 예컨대 편모가 결여되거나 pagP - 이거나 펜타-아실화된 LPS를 생산하도록 변형된 것을 포함하고, purI 및/msbB의 완전 결실, 뿐만 아니라 예컨대 박테리아를 csgD-로 만드는 게놈 변형에 의한 컬리 핌브리애의 결실을 포함한 추가의 변형, 및 thyA - 균주와 같이 성장을 위해 다양한 영양소를 필요로 하는 추가의 변형을 포함한다. 균주는 또한, 이를 ansB - 로 만들어 이것이 아스파라긴 신타제를 생산하지 않는 게놈 변형을 가질 수 있으며, 이는 T 세포를 저해할 수 있어서 면역자극성 박테리아의 이러한 면역억제성 양태를 무효화시킨다. 예시적인 균주는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI, 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI/△thyA로 명명된 것을 포함한다. 이러한 명명은 살모넬라 유전자를 참조하는 것으로 이해된다; 유사한 변형은 다른 박테리아 종, 예컨대 리스테리아 및 이. 콜라이, 예컨대 니쓸(Nissle)에서 수행될 수 있다.
포스포리보실아미노이미다졸 합성효소(PurI)의 상동체 또는 이종상동체를 인코딩하는 상응하는 유전자, 및 다른 박테리아 종에서 퓨린 합성에 필요한 다른 유전자도 유사한 결과를 달성하기 위해 결실되거나 방해될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 포스포리보실포르밀글리신아미드 사이클로-리가제를 인코딩하는 purM; 에스. 티피에서 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩하는 purM; 엘. 모노사이토게네스에서 아데닐로숙시네이트 합성효소를 인코딩하는 purA, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 II를 인코딩하는 purQ, 및 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 하위단위 PurS를 인코딩하는 purS; 비피도박테리움 롱검에서 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩하는 purM(BL1122); 및 AIR 합성효소를 인코딩하는 NT01CX_RS09765, 및 클로스트리디움 노비에서 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩하는 NT01CX_RS07625(purM)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
b. 아데노신 영양요구성
트립토판 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)/아데노신 경로에서 유래된 대사 생성물은 종양/종양 미세환경(TME) 내에서 면역억제 환경을 형성하는 주요 구동인자이다. 세포 내부와 외부에 자유 형태로 존재하는 아데노신은 면역 기능의 이펙터이다. 아데노신은 NF-κB의 T-세포 수용체 유도 활성화를 감소시키고 IL-2, IL-4 및 IFN-γ를 억제한다. 아데노신은 T-세포 세포독성을 감소시키고, T-세포 아네르기(anergy)를 증가시키며, Foxp3+ 또는 Lag3+ 조절 T-세포(T-reg 세포, T-reg 또는 Treg)로의 T-세포 분화를 증가시킨다. 자연 살해(NK) 세포에서 아데노신은 IFN-γ 생성을 감소시키고 NK 세포 세포독성을 억제한다. 아데노신은 호중구 부착 및 혈관외유출을 차단하고, 식균작용을 감소시키며, 초과산화물 및 산화질소 수준을 약독화시킨다. 아데노신은 또한 대식세포에서 TNF-α, IL-12 및 MIP-1α(CCL3)의 발현을 감소시키고, 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 II 발현을 약화시키며, IL-10 및 IL-6의 수준을 증가시킨다. 아데노신 면역조절 활성은 종양의 세포외 공간으로 방출되고 표적 면역 세포, 암세포 또는 내피 세포 표면의 아데노신 수용체(ADR)가 활성화된 후에 발생한다. 종양 미세환경의 높은 아데노신 수치는 국소 면역억제를 일으켜 면역계가 암세포를 제거하는 능력을 제한한다.
세포외 아데노신은 종양 기질 세포에서 발현되는 막 관련 엑토엔자임 CD39(엑토-뉴클레오사이드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라젤, 또는 NTPDase1)와 CD73(엑토-5'-뉴클로오티다제)의 순차적인 활성에 의해 생성되며, 더불어 사멸되거나 사멸중인 세포로부터 생성된 ATP 또는 ADP의 인산가수분해에 의해 아데노신을 생성한다. CD39는 세포외 ATP(또는 ADP)를 5'-AMP로 전환하고, 이는 CD73에 의해 아데노신으로 전환된다. 종양 미세환경의 저산소 상태에서 내피 세포에서 CD39 및 CD73의 발현이 증가하여 아데노신 수준이 증가한다. 종양 저산소증은 부적절한 혈액 공급 및 와해된 종양 혈관계로 인해 산소 전달이 손상될 수 있다(예를 들어, Carroll and Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7(6), DOI: 10.1017/S1462399405009117 참조). 종양 미세환경에서 발생하는 저산소증은 또한 아데노신을 AMP로 전환시키는 아데닐산 키나제(AK)를 억제하여 매우 높은 세포외 아데노신 농도를 유발한다. 저산소 종양 미세환경에서 아데노신의 세포외 농도는 10-100 μM에서 측정되었으며, 이는 약 0.1 μM의 일반적인 세포외 아데노신 농도보다 최대 약 100-1000배 더 높다(예를 들어, Vaupel et al. (2016) Adv. Exp. Med. Biol. 876:177-183; 및 Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857). 종양의 저산소 영역은 미세혈관에서 멀리 떨어져 있기 때문에 종양의 일부 영역에서 아데노신의 국소 농도는 다른 영역보다 높을 수 있다.
면역계를 저해하는 직접적인 효과를 나타내기 위해, 아데노신은 또한 암세포 증식, 세포자멸사 및 혈관신생에 대한 효과에 의해 암세포 성장 및 전파를 제어할 수 있다. 예를 들어, 아데노신은 주로 A2A 및 A2B 수용체의 자극을 통해 혈관신생을 촉진할 수 있다. 내피 세포의 수용체 자극은 내피 세포의 세포간 접착 분자 1(ICAM-1) 및 E-셀렉틴의 발현을 조절하고, 혈관 무결성을 유지하며, 혈관 성장을 촉진할 수 있다(예를 들어, Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857). 다양한 세포에서 A2A, A2B, 또는 A3 중 하나 이상이 아데노신에 의해 활성화되면 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨-8(IL-8) 또는 안지오포이에틴 2와 같은 전혈관신생 인자의 생성을 자극할 수 있다(예를 들어, Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857 참조).
아데노신은 또한 암세포의 수용체와의 상호작용을 통해 종양 세포 증식, 세포 사멸 및 전이를 직접 조절할 수 있다. 예를 들어, 연구에 따르면 A1 및 A2A 수용체의 활성화는 일부 유방암 세포주에서 종양 세포 증식을 촉진하고 A2B 수용체의 활성화는 결장암 세포에서 암 성장 촉진 특성을 갖는 것으로 나타났다(예를 들어, Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857). 아데노신은 또한 암세포의 세포자멸사를 유발할 수 있으며, 다양한 연구에서 이 활성을 A3을 통한 외인성 세포자멸사 경로의 활성화 또는 A2A 및 A2B를 통한 내부 세포자멸사 경로의 활성화와 연관시켰다(예를 들어, Antonioli 등 (2013) 참조). 아데노신은 세포 운동성, 세포외 기질에 대한 부착, 세포 부착 단백질 및 수용체의 발현을 증가시켜 세포 이동 및 운동성을 촉진함으로써 종양 세포 이동 및 전이를 촉진할 수 있다.
아데노신 트리포스페이트(ATP)의 세포외 방출은 자극된 면역 세포, 손상되거나 죽어가는 세포 또는 스트레스를 받은 세포에서 발생한다. NLR 계열의 피린 도메인 함유 3(NLRP3) 인플라마솜은 이러한 ATP의 세포외 방출에 의해 자극을 받으면 카스파제-1을 활성화하고 사이토카인 IL-1β 및 IL-18을 분비하여 내재성 및 적응 면역력을 활성화한다(예를 들어, Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358 참조). ATP는 종양 조직에서 100 mM을 초과하는 농도로 축적될 수 있는 반면 건강한 조직에서 발견되는 ATP 수준은 매우 낮다(약 1 내지 5 μM)(예를 들어, Song et al. (2016) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310(2):C99-C114). ATP는 CD39와 CD73이라는 효소에 의해 아데노신으로 분해된다. 활성화된 아데노신은 음성 피드백 기전을 통해 고도의 면역억제성 대사 생성물로 작용하고 저산소 종양 미세환경에서 여러 면역 세포 유형에 대해 다면(pleiotropic) 효과를 나타낸다(예를 들어, Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358). 아데노신 수용체 A2A 및 A2B는 다양한 면역 세포에서 발현되고 아데노신에 의해 자극되어 cAMP-매개 신호 변화를 촉진하여 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, 대식세포, 호중구 및 자연 살해 T(NKT) 세포의 면역억제 표현형을 초래한다. 결과적으로, 아데노신 수준은 CD73과 같은 엑토-뉴클레오티다아제를 과발현하는 것으로 나타난 고형 종양과 같은 병리학적 조직에서 정상 농도의 100배 이상까지 축적될 수 있다. 아데노신은 또한 종양 신생 및 발달을 촉진하는 것으로 나타났다. 따라서 아데노신에 대한 영양요구성인 조작된 박테리아는 향상된 종양 표적화 및 콜로니화를 나타낼 것이다.
살모넬라 티피와 같은 면역자극성 박테리아는 예를 들어 tsx 유전자의 결실에 의해(예를 들어, Bucarey et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6210-6219 참조) 또는 purD의 결실에 의해(예를 들어, Husseiny (2005) Infection and Immunity 73(3):1598-1605 참조) 아데노신에 대한 영양요구성이 될 수 있다. 그람-음성 박테리아 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)에서, purD 유전자 넉아웃은 아데노신에 대해 영양요구성인 것으로 나타났다(예를 들어, Park 등 (2007) FEMS Microbiol. Lett. 276:55-59 참조). 본원에 예시된 바와 같이, 에스. 티피무리움 균주 VNP20009는 purI 변형으로 인해 아데노신에 대해 영양요구성이고; 따라서, 아데노신에 대한 영양요구성을 만들기 위한 추가 변형은 필요하지 않다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 면역자극성 박테리아 균주의 구현예는 아데노신에 대해 영양요구성이다. 이러한 영양요구성 박테리아는 종양 미세환경에서 선택적으로 복제하여 종양 내 투여된 박테리아의 축적 및 복제를 더욱 증가시키고 종양 내 및 종양 주변의 아데노신 수준을 감소시켜 아데노신의 축적으로 인한 면역억제를 감소 또는 제거한다. 본원에 제공된 이러한 박테리아의 예는 아데노신 영양요구성을 제공하는 purI - /msbB - 돌연변이를 함유하는 에스. 티피무리움의 변형된 균주이다. 다른 균주 및 박테리아의 경우 purI 유전자가 VNP20009에서와 같이 방해될 수 있거나 purI 유전자의 전체 또는 일부가 결실되어 야생형 유전자로 복귀할 수 없도록 할 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 균주 VNP20009에서, purI-유전자는 역전에 의해 비활성화되었다. 유사하게는, VNP20009의 msbB 유전자는 완전히 결실되지 않았다. 본원에 예시된 바와 같이, purI 및 msbB 유전자가 완전히 결실되어 임의의 복귀 위험을 제거한 균주는 시험관내 배양물의 성장에 의해 평가된 바와 같이 우수한 적합성을 실증한다.
퓨린(예를 들어, 아데닌), 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신), 아미노산(예를 들어, 방향족 아미노산, 아르기닌, 류신) 또는 아데노신 트리포스페이트(ATP)와 같은 하나 이상의 필수 영양소에 대해 영양요구성을 만들어 변형된 면역자극성 박테리아가 사용된다. 특히, 에스. 티피무리움의 균주와 같은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 구현예에서, 박테리아는 아데노신에 대해 영양요구성이 되고, 선택적으로 ATP에 대해 영양요구성이 되며, 우선적으로 종양 미세환경(TME)에 축적된다. 따라서, 본원에 기재된 면역자극성 박테리아 균주는 성장을 위해 퓨린, 아데노신 및/또는 ATP를 필요로 하기 때문에 약독화되고, 아래에서 논의되는 바와 같이 이러한 대사산물이 풍부한 TME를 우선적으로 콜로니화한다. 일부 종양의 종양 미세환경에서 발생하는 아데노신 축적은 면역억제적이기 때문에, 아데노신 영양요구성은 종양 미세환경에 축적되는 아데노신으로부터의 면역억제를 제거한다.
c. 티미딘 영양 요구체
게놈 변형은 아래 논의된 비활성화/결실(섹션 3 참조) 대신에 또는 이에 더하여 도입될 수 있다. 성장에 필요한 유전자 또는 유전자 생성물, 예컨대 영양소를생산하는 유전자의 다른 결실 또는 비활성화는 예를 들어, asd 비활성화/결실 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 박테리아를 thyA-로 만드는 변형을 포함한다(예를 들어, 문헌[Loessner et al. (2006) FEBS Lett 265:81-88] 참조). ThyA - 인 면역자극성 박테리아는 티미딜레이트 신타제의 생산의 비활성화를 초래하거나 무효화시키는 게놈 변형, 예컨대 삽입, 결실, 대체, 전위, 및/또는 다른 변화를 갖는다. 티미딜레이트 신타제는 DNA 생합성 전구체(dTTP로의 전구체)인 dTMP로의 dUMP의 환원적 메틸화를 촉매화한다.
이러한 생성물의 생산을 위한 박테리아 게놈의 발현이나 생산의 무효화 또는 다른 약독화 돌연변이는 투여 후 생체내에서 박테리아 세포 사망 시 인코딩된 거대분자의 방출을 초래한다. 아래 논의된 바와 같이 Asd는 박테리아 세포벽 합성을 위한 필수 효소이다; ThyA는 DNA 합성에 필요한 효소이다. 각각의 유전자의 돌연변이는 균주를 디아미노피멜산(DAP) 또는 티미딘 모노포스페이트 전구체에 대한 영양 요구성으로 만든다. 보완 기질의 부족 시, 이러한 박테리아는 DAP-부재 또는 티민부재 사망에 의해 사멸되어, 박테리아 단백질 및 플라스미드의 방출을 초래한다. Asd의 비활성화 또는 무효화는 거대분자의 방출을 초래한다. ThyA(삽입, 결실 및 다른 변형을 가져서 활성 효소가 생산되지 않는 것을 포함하는 △ThyA 박테리아를 생산하기 위해) 발현/활성의 무효화 또는 비활성화는 티미딘 고갈 시 단백질 및 플라스미드를 포함한 거대분자의 방출을 초래하지 않는다(문헌[Loessner et al., (2006) FEBS Lett 265:81-88]).
그러므로, 게놈이 변형되어 활성 효소가 생산되지 않는 △ThyA 박테리아는 예를 들어 생체내에서 숙주 세포로의 플라스미드의 전달에 유리한데, 왜냐하면 박테리아는 이의 내용물을 너무 일찍 방출하지 않을 것이기 때문이다. 본원에 제공된 박테리아가 이러한 박테리아를 소모하는 골수성 세포, 예컨대 식세포, 예컨대 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 및 중성구를 감염시키거나 이에 축적되기 때문에, 무손상 △ThyA 박테리아는 예를 들어, RNA라면 발현 또는 단백질이라면 분비나 제시를 위해, 표적화된 세포 내부에서 페이로드, 예컨대 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 방출한다. 그러므로, 박테리아를 thyA - 로 만드는 게놈 변형은 특정 적용, 예컨대 면역화, 세포 상에서의 제시, RNA의 전달, 및 다른 이러한 적용에 유리하다.
3. 플라스미드 유지 및 전달
a. asd 결실
상기 논의된 바와 같이, 박테리아는 thyA - 로 될 수 있다; 이는 또한 그 대신에 또는 이에 더하여 asd - 로 될 수 있다. 특정 게놈 변형의 선택은 박테리아의 의도된 적용에 의존한다. thyA 비활성화는 일부 적용에 유리하다; 다른 경우 박테리아를 asd - 로 만드는 것이 유리하다; 특정 변형(들)을 선택하는 것은 당업자에게 있다. 박테리아의 asd 유전자는 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩한다. 에스. 티피무리움의 asd - 돌연변이체는 세포벽 합성에 필요한 디아미노피멜산(DAP)에 대한 필수 요구 사항을 가지며 DAP가 없는 환경에서 용해를 겪을 것이다. 이 DAP 영양요구성은 asd 유전자가 박테리아의 플라스미드에서 트랜스로 보완될 때 항생제를 사용하지 않고 생체내에서 플라스미드 선택 및 플라스미드 안정성 유지에 사용할 수 있다. 비항생제-기초 플라스미드 선택 시스템은 유리하며 1) 부작용 발생 시 신속한 제거 기전으로 투여된 항생제를 사용하고, 2) 일반적으로 이러한 사용을 피하는 항생제 없는 생산 규모 확대를 허용한다. asd 유전자 보체 시스템은 이러한 비항생제-기초 플라스미드 선택을 제공한다(예를 들어, Galan 등 (1990) Gene 94(1):29-35 참조). 종양 미세환경에서 플라스미드를 유지하기 위해 asd 유전자 보체 시스템을 사용하면 면역자극성 단백질(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 공동자극성 분자); STING 및 IRF3과 같은 유형 I IFN, 및 이의 기능-획득/항시적으로 활성인 돌연변이를 유도하는 세포기질성 DNA/RNA 센서; 항체 및 이의 단편(예를 들어, 체크포인트 저해제, 또는 항-IL-6 또는 항-VEGF 항체); 이중 특이적 T-세포 연계자(상표 BiTEs®로 판매됨); 간섭 RNA; 및 본원의 다른 곳에서 논의되고 당업계에 알려진 다른 치료 생성물; 및 모든 선행 치료 생성물의 보완적 조합을 인코딩하는 플라스미드를 전달하도록 조작된 에스. 티피무리움 균주의 약효를 증가시키는 것으로 예상된다.
에스. 티피무리움의 asd 돌연변이체에 대한 대안적인 용도는 숙주 종양을 지속적으로 콜로니화하는 능력 없이 감염된 세포에 치료 생성물/거대분자를 전달하기 위해 자가분해(또는 자살) 균주를 생성하기 위해 DAP 영양요구성을 이용하는 것이다. asd 유전자의 결실은 시험관내 또는 생체내에서 성장할 때 박테리아를 DAP에 대한 영양요구성으로 만든다. 본원에 기재된 예는 DAP에 대해 영양요구성이고 면역조절 단백질의 전달에 적합한 플라스미드를 함유하지만 asd 보체 유전자를 함유하지 않아 생체내 복제에 결함이 있는 균주를 생성하는 asd 결실 균주를 제공한다. 이 균주는 DAP의 존재 하에 시험관 내에서 증식되고, 정상적으로 성장한 다음, DAP가 존재하지 않는 포유동물 숙주에 면역치료제로서 투여된다. 자살 균주는 숙주 세포를 침범할 수 있지만 포유동물 조직에 DAP가 없기 때문에 복제할 수 없으며 자동으로 용해되고 세포질 내용물(예를 들어, 플라스미드 또는 단백질)을 전달한다.
다른 박테리아 종에서 아스파테이트-세미알데하이드 탈수소효소(asd)의 상동체 또는 이종상동체를 인코딩하는 해당 유전자도 결실되거나 방해되어 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 asd; 에스. 티피에서 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 asd(STY4271); 엘. 모노사이토게네스에서 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 asd(lmo1437); 비피도박테리움 롱검에서 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 asd(BL0492); 및 클로스트리디움 노비에서 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 NT01CX_RS04325(asd)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유사하게는, 본원 위에서 논의된 바와 같이, thyA는 asd 변형 대신에 게놈 변형에 의해 비활성화되거나 무효화될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 티미딜레이트 신타제 발현/활성의 비활성화 또는 무효화는 티미딘 고갈 시 단백질 및 플라스미드를 포함한 거대분자의 방출을 초래하지 않는다.
b. endA 결실/방해
endA 유전자(예를 들어, SEQ ID NO: 250 참조)는 그람 음성 박테리아의 주변 세포질에서 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 분해를 매개하는 엔도뉴클레아제(DNA-특이적 엔도뉴클레아제 I; 예를 들어, SEQ ID NO: 251 참조)를 인코딩한다. endA 유전자의 돌연변이가 플라스미드 DNA의 더 높은 수율을 허용하기 때문에 실험실 이. 콜라이의 가장 일반적인 균주는 endA - 이다. 이 유전자는 종 사이에서 보존된다. 무손상 플라스미드 DNA 전달을 용이하게 하기 위해, 조작된 면역자극성 박테리아의 endA 유전자는 엔도뉴클레아제 활성을 방지하기 위해 결실되거나 돌연변이된다. 이러한 돌연변이의 예는 E208K 아미노산 치환(예를 들어, Durfee 등 (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606), 또는 관심 종의 상응하는 돌연변이이다. E208 잔기를 포함하는 endA는 살모넬라를 포함한 박테리아 종 사이에서 보존된다. 따라서, E208K 돌연변이는 살모넬라 종을 비롯한 다른 종에서 엔도뉴클레아제 활성을 제거하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 endA 활성을 제거하기 위해 다른 돌연변이 또는 결실을 도입할 수 있다. 이 돌연변이에 영향을 미치거나 살모넬라와 같은 본 발명의 면역자극성 박테리아에서 endA의 활성을 제거하기 위해 유전자를 결실 또는 방해하면 무손상 플라스미드 DNA 전달의 효율성이 증가하여 플라스미드 상에서 인코딩되는 하나 또는 둘 이상의 면역조절 단백질/치료 생성물의 발현이 증가하고, 항종양 면역 반응 및 항종양 효능을 향상시킨다.
4. 플라젤린 넉아웃 균주
편모는 이동 수단을 제공하기 위해 시계 방향 또는 반시계 방향으로 회전할 수 있는 회전 모터에 후크를 통해 부착된 긴 필라멘트로 구성된 박테리아 표면의 소기관이다. 예를 들어 에스. 티피무리움의 편모는 위장관의 점막층을 가로지르는 운동성을 매개하는 능력으로 인해 화학주성 및 구강 경로를 통한 감염 확립에 중요하다. 편모는 시험관 내에서 종양 실린더로이드에 대한 화학주성 및 콜로니화에 필요하고(예를 들어, Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209 참조), 운동성이 종양 침투에 중요한 것으로 나타난 것이 실증되긴 하였지만(예를 들어, Toley and Forbes (2012) Integr. Biol. (Comb) 4(2):165-176 참조), 박테리아가 정맥내 투여되는 경우 편모는 동물의 종양 콜로니화에 필요하지 않다(예를 들어, Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456). 각각의 편모 필라멘트는 수만 개의 편모 하위단위로 이루어진다. 에스. 티피무리움 염색체는 fliC 및 fljB라는 두 개의 유전자를 포함하며, 이는 항원적으로 구별되는 플라젤린 단량체를 인코딩한다. fliC 및 fljB 둘 다에 결함이 있는 돌연변이체는 경구 감염 경로를 통해 투여될 때 운동성이 없고 독성이 없지만 비경구적으로 투여될 때 독성을 유지한다.
플라젤린은 살모넬라의 주요 전염증성 결정인자이며(예를 들어, Zeng 등 (2003) J. Immunol. 171:3668-3674 참조), 세포 표면의 TLR5 및 세포기질의 NLCR4에 의해 직접 인식된다(예를 들어, Lightfield 등 (2008) Nat. Immunol. 9(10):1171-1178 참조). 두 경로 모두 전염증 반응을 일으켜 IL-1β, IL-18, TNF-α 및 IL-6을 포함한 사이토카인의 분비를 유발한다. fliC 및 fljB에 의해 인코딩된 플라젤린보다 더 큰 염증을 유도하는 비브리오 불니피쿠스 플라젤린 B(Vibrio vulnificus 플라젤린 B)를 분비하도록 박테리아를 조작함으로써 플라젤린에 대한 전염증 반응을 증가시킴으로써 살모넬라-기초 암 면역요법을 더욱 강력하게 만들려는 시도가 있었다(예를 들어, Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9(376):eaak9537 참조).
본원에서, 에스. 티피무리움과 같은 살모넬라 박테리아는 플라젤린 하위단위 fliC 및 fljB가 모두 결여되도록 조작되어 TLR5-매개 전염증 신호를 감소시킨다. 편모를 포함하는 다른 박테리아도 편모를 제거하도록, 그리고 살로넬라의 예시된 변형과 동일한 효과를 실질적으로 갖는 다른 변형을 포함하도록 유사하게 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 나타낸 바와 같이, 감소된 TNF-알파 유도를 초래하는 msbB 및/또는 pagP가 결여된 살모넬라 균주는 살모넬라에서 fliC 및 fljB 넉아웃에 의해 달성될 수 있는 편모의 제거와 조합된다. 그 결과 다른 효과 중에서도 TNF-알파 유도 감소와 TLR5 인식 감소가 조합된 살모넬라 균주가 생성된다. 이러한 박테리아 변형, msbB-, pagP-, fliC- 및 fljB-는 면역조절 단백질 및 생성물의 조합과 같은 치료제를 인코딩하는 CpG를 임의로 함유하는 면역자극 플라스미드와 조합될 수 있다. 생성된 박테리아는 전염증 신호를 감소시켰지만 강력한 항종양 활성을 나타냈다. 이러한 게놈 변형은 또한 본원에 기재된 게놈 변형의 다른 것과 조합될 수 있다. 백신의 경우, 인코딩된 생성물은 항원 및 단백질에 대해 면역보호성 또는 치료 반응이 의도되는 이러한 항원 및 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 예시되고 제공되는 바와 같이, fliC 및 fljB 이중 돌연변이체가 에스. 티피무리움의 asd-결실된 균주, VNP20009에서 작제되었다. purI/purM의 방해로 독성이 약화된 VNP20009는 야생형 지질 A보다 독성이 덜한 지질 A 하위단위를 생성하는 msbB 유전자 변형(부분 결실)을 포함한다. 이는 야생형 지질 A를 갖는 균주와 비교하여 정맥내 투여 후 마우스 모델에서 TNF-α 생성을 감소시킨다. 생성된 균주는 TLR2/4 신호전달을 감소시키기 위한 지질 A의 변형 및 TLR5 인식 및 인플라마솜 유도를 감소시키는 플라젤린 하위단위의 발현의 결실에 의해 박테리아 염증에 대해 약독화된 예시적인 균주이다.
에스. 티피무리움과 같은 살모넬라 종을 포함한 특정 박테리아 종의 발병은 살모넬라 병원성 섬(SPI)이라고 하는 유전자 클러스터를 포함한다. 살모넬라는 이펙터 단백질을 숙주 세포의 세포질에 직접 주입하는 바늘 같은 구조를 형성하는 살모넬라 병원성 섬 1(SPI-1)에 의해 인코딩된 유형 3 분비 시스템(T3SS)을 사용하여 비 포식성 장 상피 세포를 침범한다. 이러한 이펙터 단백질은 진핵 세포의 세포골격을 재배열하여 장 상피의 침입을 용이하게 하고, 또한 전염증성 사이토카인을 유도한다. SPI로 표기된 SPI-1은 상피 세포의 침입을 매개한다. SPI-1 유전자는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, invJ, iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spaS, orgA, orgB, orgC, prgH, prgI, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB 및 sptP. 이러한 유전자 중 하나 이상을 제거하면 박테리아이 상피 세포를 감염시키는 능력이 감소하거나 제거되지만, 식세포 면역 세포를 비롯한 식세포를 감염시키거나 침입하는 능력에는 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, fliC 및 fljB 유전자 모두의 결실이 hilA, hilD, invA, invF 및 sopB와 같은 SPI-1 유전자의 발현을 유의하게 감소시켜 비-식세포를 침범하는 능력을 감소시키는 것으로 입증되었다(예를 들어, Elhadad et al. (2015) Infect. Immun. 83(9):3355-3368).
살모넬라과 같은 박테리아에서 플라젤린은 SPI-1 3형 분비 시스템(T3SS)과 함께 대식세포에서 파이롭토시스를 유발하는 데 필요하며 대식세포 NLRC4 인플라마솜에 의해 검출될 수 있다. 편모 하위단위의 제거는 대식세포의 파이롭토시스를 감소시킨다. 예를 들어, fliC 및 fljB가 결실된 에스. 티피무리움은 야생형 균주와 비교하여 IL-1β 분비를 상당히 감소시키는 반면, 박테리아의 세포 흡수 및 세포내 복제는 영향을 받지 않은 채로 남아 있다. 이는 플라젤린이 인플라마솜 활성화에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, fliC를 항시적으로 발현하도록 조작된 에스. 티피무리움 균주는 대식세포 파이롭토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447; Fink and Cookson (2007) Cellular Micro-biology 9(11):2562-2570; 및 Winter et al. (2015) Infect. Immun. 83(4):1546-1555).
본원의 면역자극성 박테리아의 게놈은 에스. 티피무리움에서 플라젤린 유전자 fliC 및 fljB를 결실 또는 돌연변이시켜 대식세포와 같은 종양-체류 면역 세포의 세포 사멸을 감소시키고 면역자극성 박테리아의 항종양 면역 반응을 강화하도록 변형될 수 있다.
LPS의 변형과 결합된 플라젤린 하위단위의 결실은 숙주에서 더 큰 내약성을 허용하고, 식세포로만의 흡수를 제한하고, 그들의 파이로톱틱 세포 사멸을 감소시키고, TME, 특히 종양-체류 골수성 세포로의 면역조절 단백질과 같은 치료 생성물의 전달에 대한 면역자극 반응을 지시한다. 생성된 면역자극성 박테리아는 항종양 반응을 이끌어내고 종양에 대한 적응 면역 반응을 촉진한다.
다른 박테리아 종에서 플라젤린을 인코딩하는 해당 유전자도 유사한 결과를 얻기 위해 결실될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 편모 필라멘트 구조 단백질을 인코딩하는 fliC, 및 이. 콜라이에서 편모 기저체 단백질 FliE를 인코딩하는 fliE; 플라젤린을 인코딩하는 fliC 및 에스. 티피에서 편모 기저체 간상체 단백질 FlgB를 인코딩하는 flgB; 엘. 모노사이토게네스에서 플라젤린을 인코딩하는 flaA,편모 후크 기저체 단백질 FliE를 인코딩하는 fliE, 및 편모 기저체 간상체 단백질 FlgB를 인코딩하는 flgB; 및 플라젤린을 인코딩하는 NT01CX_RS04995, NT01CX_RS04990, NT01CX_RS05070 및 NT01CX_RS05075, 편모 기저체 간상체 단백질 FlaB를 인코딩하는 NT01CX_RS05080(flgB), 편모 기저체 간상체 단백질 FlaC를 인코딩하는 NT01CX_RS05085(flgC), 및 편모 기저체 간상체 단백질 FlaG를 인코딩하는 NT01CX_RS05215(flgG)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
5. 적응 면역력을 촉진하고 T-세포 기능을 증강시키기 위한 박테리아의 조작
L-아스파라기나제 II ( ansB ) 결실/방해
L-아스파라기나제 II는 L-아스파라긴을 암모니아 및 아스파라긴산으로 전환하는 것을 촉매하는 효소이다. 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움과 같은 여러 박테리아 균주는 L-아스파라기나제를 사용하여 과당-아스파라긴을 탄소 및 질소 공급원으로 소거한다(예를 들어, Sabag-Daigle et al. (2018) Appl. Environ. Microbiol. 84(5):e01957-17). 급성 림프구성 백혈병(ALL)과 같은 악성 T-세포는 아스파라긴을 합성하는 효소가 부족하기 때문에 아스파라긴이 필요하다. L-아스파라기나제의 투여는 1970년대 초부터 ALL에 대한 최전선 요법이었다(예를 들어, Batool et al. (2016) Appl. Biochem. Biotechnol. 178(5):900-923 참조). 에스. 티피무리움에 의한 L-아스파라기나아제 II의 생산은 T-세포 수용체(TCR) 하향조절을 직접 유도하고, T-세포 사이토카인 생성을 감소시키며, 종양 세포용해 기능을 억제하기 때문에 T-세포 억제에 필요하고 충분하다(예를 들어, Kullas et al. (2012) Cell Host Microbe. 12(6)791-798; 및 van der Velden et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(49):17769-17774). 종양 미세환경에서 T-세포 활성화 동안 발생하는 것과 같은 빠른 클론 확장 조건에서 아스파라긴이 필요하며 L-아스파라기나제 II에 의한 고갈은 T-세포 억제로 이어진다. 따라서 L-아스파라기나제 II는 T-세포 억제가 치료 양식인 암에 대한 항암 치료제로 사용되어 왔다.
항암 치료제로서 L-아스파라기나제의 이전 사용과 대조적으로, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 그리고 면역자극성 박테리아 및 박테리아 백신, 예컨대 결핵(TB) 및 다른 질환에 대해 백신화하는 데 사용되는 BCG 백신에서 L-아스파라기나제 활성의 제거가 종양 미세환경에서 T-세포의 기능을 향상시키는 것으로 본원에서 제시된다. L-아스파라기나제 활성의 제거는 활성 효소의 발현을 제거하기 위해 박테리아 게놈을 변형함으로써 수행될 수 있다. 변형에는 핵산의 삽입, 결실, 교체 및 다른 변화가 포함되어 생성된 인코딩된 효소가 활성화되지 않거나 발현되지 않거나 제거된다. 면역자극성 박테리아에서 인코딩된 효소의 발현을 제거하기 위해 L-아스파라기나제 II, ansB를 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 결실 또는 이의 방해가 박테리아-콜로니화된 종양 미세환경에서 T-세포의 기능을 향상시킨다는 것이 본원에서 제시된다. L-아스파라기나제 II 활성의 억제는 면역자극성 박테리아에서 유전자 ansB의 전부 또는 일부의 결실 또는 중단/방해에 의해 달성되며, 이에 의해 L-아스파라기나제 II는 생성되지 않는다. 따라서, L-아스파라기나아제 II가 생성되지 않도록 게놈이 변형된 면역자극성 박테리아를 제공한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 항종양 면역 반응을 향상시키기 위해 종양-체류 면역 세포를 콜로니화하기 위해 사용되며; 박테리아 게놈 변형에는 L-아스파라기나제 II의 발현을 제거하는 결실, 삽입, 방해 및/또는 다른 변형이 포함된다.
본원에 나타낸 바와 같이, 본원의 면역자극성 박테리아의 게놈은 ansB를 결실시키거나, 이를 방해하거나 달리 변형하여 불활성 인코딩된 L-아스파라기나제 II를 생성하거나, 아스파기나제를 제거하여 T-세포 억제를 방지하고 생체 내 항종양 T-세포 기능을 향상시킬 수 있다. ansB가 온전한 균주는 균주로 공동-국재화된 T-세포에서 심각한 T-세포 면역억제를 유도한다는 것이 본원에서 제시된다. ansB가 결실된 균주는 면역억제를 유도하지 않으며, 따라서 박테리아를 사용하여 인코딩된 치료제를 종양에 전달하는 당업계의 또 다른 문제를 해결한다. 기능적으로 인코딩된 효소가 발현되지 않는 ansB 유전자의 결실 또는 방해와 같은 변형을 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 면역 세포에서 축적을 증가시키는 본원에 기재된 다른 변형과 조합하는 면역자극성 박테리아는 면역자극성 박테리아의 우수한 치료제를 제공한다.
다른 박테리아 종에서 L-아스파라기나제 II(AnsB)의 상동체 또는 이종상동체를 인코딩하는 해당 유전자도 결실되거나 방해되어 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 L-아스파라기나제 2를 인코딩하는 ansB; 에스. 티피에서 L-아스파라기나제를 인코딩하는 ansB(STY3259); 엘. 모노사이토게네스에서 아스파라긴 합성효소를 인코딩하는 ansB(lmo1663); 및 비피도박테리움 롱검에서 L-아스파라기나제 전구체를 인코딩하는 BL1142를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
6. 컬리 핌브리애를 생성하는 데 필요한 살모넬라 유전자에서의 결실/방해
박테리아와 곰팡이는 생물막이라고 하는 다세포 구조를 형성할 수 있다. 박테리아 생물막은 세포외 중합체 물질로 통칭되는 세포외 DNA뿐만 아니라 분비되고 세포벽과 관련된 다당류, 당단백질, 당지질의 혼합물로 둘러싸여 있다. 이러한 세포외 중합체 물질은 세척제, 항생제 및 항균 펩타이드와 같은 여러 손상으로부터 박테리아를 보호한다. 박테리아 생물막은 표면의 콜로니화를 허용하고 주사 포트 및 카테터와 같은 보철물의 심각한 감염의 원인이다. 생물막은 또한 감염 과정에서 조직에 형성될 수 있으며, 이는 박테리아의 잔류 및 배출 기간을 증가시키고 항생제 치료의 효과를 제한한다. 생물막에서 박테리아의 만성 지속은 예를 들어 담낭의 에스. 티피 감염에서 증가된 종양 형성과 관련이 있다(예를 들어, Di Domenico 등 (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887 참조).
csgD 결실
에스. 티피무리움과 같은 살모넬라에서 생물막 형성은 csgD 유전자에 의해 조절되며, 이는 csgBAC 오페론을 활성화하고 컬리 핌브리애 하위단위 CsgA 및 CsgB의 생성을 증가시킨다(예를 들어, Zakikhany 등 (2010) Molecular Microbiology 77( 3):771-786 참조). CsgA는 TLR2에 의해 PAMP로 인식되고 인간 대식세포로부터 IL-8의 생산을 유도한다(예를 들어, Tukel 등 (2005) Molecular Microbiology 58(1):289-304 참조). 또한 csgD는 디-구아닐레이트 고리화효소를 인코딩하는 adrA 유전자를 활성화하여 셀룰로스 생산을 간접적으로 증가시킨다. adrA에 의해 생성된 저분자 환식 디구아노신 모노포스페이트(c-디-GMP)는 거의 모든 박테리아 종에서 발생하는 유비쿼터스 2차 메신저이다. c-디-GMP의 증가는 셀룰로스 합성 효소 유전자 bcsA의 발현을 향상시키고, 이는 차례로 bcsABZC 및 bcsEFG 오페론의 자극을 통해 셀룰로스 생산을 증가시켜 셀룰로스 생물막 형성을 유도한다. 결과적으로 에스. 티피무리움과 같은 박테리아는 숙주 면역 세포에 의한 식균 작용에 대한 보호로서 고형 종양에 생물막을 형성할 수 있다. 생물막을 형성할 수 없는 살모넬라 돌연변이와 같은 박테리아 돌연변이는 숙주 식세포에 의해 더 빠르게 흡수되고 감염된 종양에서 더 쉽게 제거된다(예를 들어, Crull 등 (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233 참조). 식세포 내 세포내 국소화의 이러한 증가는 세포외 박테리아의 지속성을 감소시킬 수 있고, 본원에 나타낸 바와 같이 면역조절 단백질 및 다른 항암 치료제와 같은 치료제의 플라스미드 전달의 효율성을 향상시킬 수 있다. 생물막을 형성하는 에스. 티피무리움과 같은 면역자극성 박테리아의 능력 감소는 생물막 형성에 관여하는 유전자, 예를 들어 csgD, csgA, csgB, adrA, bcsA, bcsB, bcsZ, bcsE, bcsF, bcsG, dsbA 또는 dsbB의 결실 또는 방해를 통해 달성될 수 있다(예를 들어, Anwar 등 (2014) PLoS ONE 9(8):e106095 참조).
생물막 형성을 감소시키기 위해 면역자극성 박테리아를 조작하는 것은 종양/조직으로부터 제거율을 증가시키고, 요법의 내약성을 증가시키며, 환자에서 보철물의 콜로니화를 방지함으로써 이러한 균주의 치료 이점을 증가시키는 것으로 본원에서 제시된다. 아데노신 모방체는 에스. 티피무리움 생물막 형성을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 이는 종양 미세환경에서 높은 아데노신 농도가 종양-연관 생물막 형성에 기여할 수 있음을 나타낸다(예를 들어, Koopman 등 (2015) Antimicrob. Agents Chemother. 59: 76-84 참조). csgD-결실된 면역자극성 박테리아 균주는 종양-체류 골수성 세포로의 더 큰 박테리아 흡수로 인해 개선된 항종양 효능을 입증하는 것으로 본원에서 제시된다. 유사한 게놈 변형은 생물막 형성 및/또는 컬리 핌프리애 생성을 변경시켜, 박테라아가 종양 및 종양 미세환경에 존재하는 것과 같은 혈관구조를 더 잘 침윤시킬 수 있도록, 다른 박테리아 균주, 예컨대 이. 콜라이 및 리스테리아에서 실시될 수 있다.
csgD의 상동체 및 이종상동체를 인코딩하는 해당 유전자, 그리고 다른 박테리아 종에서 컬리 핌브리애 및 생물막 형성에 필요한 다른 유전자도 결실되거나 중단되거나 다른 방식으로 변형되어 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 이. 콜라이에서 DNA-결합 전사 이중 조절인자 CsgD를 인코딩하는 csgD; 에스. 티피에서 조절 단백질 CsgD를 인코딩하는 csgD(STY1179); 및 엘. 모노사이토게네스에서 생물막 형성에 관여하는 리스테리아 셀룰로스 결합 단백질을 인코딩하는 lcp를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
박테리아 csgD -를 만들기 위한 유전자의 결실 또는 방해와 같은 박테리아 게놈의 변형은 컬리 핌브리애 및 염증성 순환 디뉴클레오타이드(CDN)의 제거 중 하나 이상과 같은 변화를 초래하고, 셀룰로스 분비를 제거한다. 이는 염증 및 면역억제 요소를 제거하고 변경된 지질 A 아실화를 통해 TLR4 인식을 방지하며 셀룰로스 분비를 제거하여 가능한 생물막 형성을 방지함으로써 안전성과 효능을 증가시킨다.
본원에 기재된 바와 같이, 아데노신에 대해 영양요구성이 되도록 조작된 박테리아 균주, 예를 들어 에스. 티피무리움 균주; LPS의 변형 및/또는 플라젤린의 결실에 의해 전염증성 사이토카인을 유도하는 능력이 감소되고; 및/또는 T-세포 기능을 개선하기 위해 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않거나; 및/또는 생물막 형성에 필요한 유전자의 결실 또는 방해를 포함하며; 및/또는 항생제 선택의 부재 하에 세포당 상당한 플라스미드 복제수를 적어도 저 내지 중-복제수 이상으로 유지하도록 추가로 변형되고; 치료제를 인코딩하는 유전자 발현 카세트를 전달하고 강력한 항종양 면역 반응을 촉진한다. 플라스미드는 인코딩된 치료제의 종양 미세환경으로의 분비를 촉진하기 위한 조절 서열을 포함한다.
7. 보체에 대한 내성의 향상
보체 시스템은 인간 숙주에서 렉틴 경로 또는 대체 경로(AP) 캐스케이드를 직접 활성화하는 침입하는 병원체에 대한 면역 방어의 제1 라인이다. 보체 시스템은 박테리아, 바이러스에 감염된 세포 및 기생충과 같은 병원체를 인식하고 죽이기 위해 내재성 면역 반응에서 기능하고 항체-매개 면역 반응에도 역할을 하는 30개 이상의 가용성 및 세포막 결합 단백질을 포함한다. 보체 캐스케이드의 활성화는 외래 미생물의 옵소닌화, 화학주성 펩타이드의 방출, 그리고 마지막으로 박테리아 세포막의 방해로 이어진다. 보체 시스템의 3개의 상동 당단백질인 C3, C4 및 C5는 보체 기능에서 중심 역할을 하고 다른 보체 구성요소와 상호작용한다. C3 및 C4에서 각각 생성된 C3b 및 C4b는 보체 캐스케이드의 활성화를 촉진하는 전환효소의 중요한 구성요소이다. C5의 절두 단편은 식세포의 감염 부위로의 이동을 유도하는 C5a 및 막 공격 복합체(MAC)의 형성 및 박테리아 용해를 개시하는 C5b이다(예를 들어, Ramu et al. (2007) FEBS Letters 581:1716-1720 참조).
생존을 위해 병원체는 보체 활성화의 유해한 결과를 방지하는 전략을 개발하였다. 예를 들어, Ail/Lom 외막 단백질 계열의 구성원은 많은 병원체성 박테리아에 대한 보체 의존적 사멸로부터 보호한다. 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) 및 와이. 슈도투베르쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)와 같은 예르시니아(Yersinia) 종의 Ail(부착 침입 좌위), 살모넬라 종의 Rck(보체 살해에 대한 내성) 및 PagC, 에스케리키아 콜라이의 OmpX를 포함하는 Ail/Lom 계열의 구성원은 중요한 아미노산 서열 유사성과 동일성을 공유하고 유사한 막 토폴로지를 갖는 외막 단백질이다. 이 단백질 계열의 구성원은 다양한 기능을 나타내지만, 와이. 엔테로콜리티카 및 와이. 슈도투베르쿨로시스의 Ail 및 에스. 엔테리카(S. enterica)의 Rck를 포함한 이러한 중 일부는 적어도 부분적으로 보체-매개 용해로부터 박테리아를 보호하는 기능을 한다(예를 들어, Bartra 등 (2008) Infection and Immunity 76:612-622 참조).
보체를 피하거나 완화하는 데 도움이 되는 또 다른 박테리아 생성물은 살모넬라에서 PgtE(외막 세린 프로테아제)로 표기된 표면 프로테아제 및 다른 옴틴 계열 구성원이다. 에스. 엔테리카의 표면 프로테아제 PgtE는 장내박테리아 외막 아스파르테이트 프로테아제의 옴틴 계열에 속한다. PgtE 및 다른 옴틴은 활성을 위해 거친 LPS를 필요로 하지만 O-항원에 의해 입체적으로 억제된다. 대식세포 내부에서 살모넬라가 증식하는 동안 pgtE의 발현이 상향조절되고, 대식세포에서 방출된 박테리아는 강력한 PgtE-매개 단백질 분해 활성을 나타낸다. PgtE는 포유동물 혈장 전구효소 플라스미노겐을 플라스민으로 단백질 분해적으로 활성화하고, 플라스민의 주요 생리학적 저해제인 알파 2-항플라스민을 비활성화하고, 인간 세포의 세포외 기질에 대한 박테리아 부착을 매개한다. 이러한 방식으로, PgtE는 세포외 기질 성분의 분해를 매개하고 세포외 기질을 가로질러 살모넬라의 이동을 촉진할 수 있는 강력하고 국부적인 단백질 분해 활성을 생성한다. PgtE는 또한 살모넬라의 세포내 성장 동안 중요할 수 있는 알파-나선형 항균 펩타이드를 분해한다. 예르시니아 페스티스의 옴틴 Pla는 PgtE의 가까운 이종상동체이며 PgtE와 기능을 공유한다. Pla는 C3를 절단하고 PgtE는 보체 성분 C3b, C4b 및 C5를 절단하여 살모넬라의 혈청 내성을 증가시킨다. 다른 박테리아 종으로부터의 유전자 pgtE, 및 이의 이종상동체는 보체에 대한 내성을 증가시키기 위해 본원의 면역자극성 박테리아에 포함될 수 있다.
인간 혈청에서 보체의 효과는 설치류 모델에서 종양을 효과적으로 콜로니화하는 것으로 나타난 살모넬라 균주 VNP20009와 같은 치료 면역자극성 박테리아의 실패를 설명한다는 것이 여기서 보여진다. VNP20009의 전신 투여는 마우스 종양의 콜로니화를 초래하였으며(예를 들어, Clairmont 등 (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; 및 Bermudes 등 (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:219-33); 반면에 인간 환자에서 VNP20009의 전신 투여는 콜로니화를 거의 초래하지 않았다. 진행성 흑색종 환자에 대한 1상 연구에서, 30분 정맥내 주입 후 인간 종양에서 매우 적은 VNP20009가 검출되었다(참조: Toso 등 (2002) J. Clin. Oncol. 20:142-52). VNP20009의 더 긴 4시간 주입을 평가하는 후속 연구에 참여한 환자들도 종양 생검 후 검출 가능한 VNP20009의 부족을 보여주었다(Heimann 등 (2003) J. Immunother. 26:179-180 참조). 종양내 투여 후, VNP20009의 유도체의 콜로니화가 검출되었다(참조: Nemunaitis 등 (2003) Cancer Gene Ther. 10:737-744). VNP20009를 인간 종양에 직접 종양 내 투여하면 훨씬 더 높은 종양 콜로니화를 초래하여 인간 종양이 높은 수준에서 콜로니화될 수 있고 마우스와 인간 간의 종양 콜로니화의 차이는 전신 투여 후에만 발생함을 나타낸다.
야생형 에스. 티피무리움에서 이전에 발생하는 것으로 알려지지 않았지만 VNP20009는 인간 보체에 의해 비활성화되며, 이는 VNP20009의 전신 투여 시 인간에서 관찰되는 낮은 종양 콜로니화를 설명한다. 본원에 제공된 균주는 보체에 대한 내성을 나타낸다. 이는 예르시니아 엔테로콜리티카의 Ail 또는 살모넬라 티피무리움의 PgtE와 같이 보체 내성 또는 회피 매개에 관여하는 Rck 및 다른 단백질을 발현하도록 변형될 수 있으며, 또는 이러한 단백질을 천연적으로 발현하는 경우 Rck 및/또는 다른 이러한 단백질을 과발현하도록 변형될 수 있다. Rck는 상동체가 없는 이. 콜라이와 같은 박테리아에 도입될 수 있다.
Rck 발현
Rck(보체 사멸에 대한 내성)는 에스. 엔테리티디스 및 에스. 티피무리움과 같은 살모넬라 종의 큰 독성 플라스미드에 의해 인코딩된 17 kDa 외막 단백질로, 상피 세포에 대한 부착 및 침입을 유도한다. Rck 단백질은 C9 중합 및 기능성 막 공격 복합체의 후속 조립을 저해함으로써 보체로부터 에스. 엔테리카를 보호하는 것으로 나타났다. rck 돌연변이는 야생형 균주와 비교하여 상피 세포 침윤에서 2-3배 감소를 나타내는 반면, 야생형 균주에서 rck 과발현은 침습을 증가시킨다. Rck 단백질은 수용체-매개 과정에 의해 세포 진입을 유도하여 국소 액틴 리모델링 및 약하고 밀접하게 부착된 막 확장을 촉진한다. 따라서 살모넬라는 T3SS-1 복합체에 의해 매개되는 트리거(Trigger) 기전과 rck에 의해 유도되는 지퍼(Zipper) 기전이라는 두 가지 별개의 기전에 의해 세포에 들어갈 수 있다(예를 들어, Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364). 살모넬라 독성 플라스미드에 대한 rck의 발현은 막 공격 복합체의 형성을 방지함으로써 인간 보체에 의한 중화에 대한 높은 수준의 내성을 부여한다. rck를 함유하는 에스. 티피무리움 독성 플라스미드가 혈청 민감도가 높은 이. 콜라이 균주에서 발현되었을 때, Rck는 보체 내성을 회복할 수 있었다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 인간 보체에 대한 내성을 부여하기 위해 Rck를 보유하거나 제공된다. 이. 콜라이와 같은 면역자극성 박테리아는 박테리아의 플라스미드 상의 rck를 인코딩함으로써 변형되어 보체에 대한 내성을 부여할 수 있다는 것이 본원에서 제시된다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 내인성으로 rck를 인코딩하거나, 보체에 대한 내성을 증가시키기 위해 이를 인코딩하도록 변형될 수 있다. 보체에 내성을 부여하는 방법도 제공된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2018/0325963 및 2018/0273956, 및 미국 특허 번호 9,889,164 및 9,688,967에 기재된 치료용 이. 콜라이 종은 플라스미드 상의 살모넬라 rck 유전자를 인코딩하는 핵산을 도입하여 이에 의해 보체에 대한 내성을 개선하거나 제공하는 것과 같이 내부에 있는 박테리아를 변형함으로써 개선될 수 있다. 보체에 내성이 있는 균은 전신 투여가 가능하며, 충분한 균이 생존하여 치료 효과가 있을 수 있다.
살모넬라 rck 유전자를 인코딩하는 핵산은 치료용 이. 콜라이와 같은 박테리아에 도입되어 보체 내성을 부여하거나 증가시킨다.
다른 박테리아 종으로부터의 rck의 다른 이종상동체 및 상동체는 유사하게 면역자극성 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Ail은 예르시니아 엔테로콜리티카의 Rck 상동체로, 이종성 발현 하에서 보체 내성을 향상시킨다. PgtE는 에스. 티피무리움 표면 프로테아제로 이종성 발현 하에서 보체 내성을 향상시키는 것으로 나타났다.
8. 살모넬라 및 다른 그람-음성 박테리아에서 지질단백질 발현에 필요한 유전자의 결실
LPS 및 브라운(무레인) 지질단백질(Lpp)은 염증 및 면역 반응의 강력한 자극제로서 기능하는 그람 음성 장내 박테리아의 외막의 주요 구성요소이다. 브라운(무레인) 지질단백질(Lpp)은 에스. 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 성분 중 하나이며, TNFα, IL-6 및 IL-8(인간에서)과 같은 전염증성 사이토카인의 TLR2 유도를 초래한다. 살모넬라의 박테리아 염색체에 위치한 지질단백질 유전자(lppA(SEQ ID NO: 387) 및 lppB(SEQ ID NO: 388))의 두 기능적 사본은 박테리아 독성에 기여한다. lppA 및 lppB 유전자의 결실 및 지질단백질 발현의 제거는 독성을 감소시키고 전염증성 사이토카인 생성을 감소시킨다(예를 들어, Sha 등 (2004) Infect. Immun. 72(7):3987-4003; 및 Fadl 등 al.(2005) Infect.Immun. 73(2):1081-1096 참조). Lpp 유전자의 결실은 세포 감염을 감소시켜 플라스미드 전달 및 인코딩된 치료 생성물 또는 단백질의 발현을 감소시킬 것으로 예상된다. 그러나, 하기 실시예 18에 나타낸 바와 같이, 이러한 유전자의 결실은 종양 콜로니화를 감소시키는 반면, 표적 세포, 즉, 종양-체류 면역 세포, 특히 대식세포에 전달되는 플라스미드의 양은 유의하게 증가하였다. 본원에 나타난 바와 같이, 이러한 유전자(lppA 및 lppB)의 결실 또는 방해는 감염된 대식세포에서 생존할 수 없기 때문에 독성을 감소시켰지만 면역자극성 박테리아의 플라스미드 전달을 증가시켜, 표적 세포, 즉 종양-체류 면역 세포, 특히 대식세포에서 인코딩된 치료 유전자의 발현을 증가시켰다.
본원에 제공된 균주는 △FLG(편모 결여) 및/또는 △pagP 및/또는 △ansB 및/또는 △csgD이다. 또한 균주는 △purI(△purM), △msbB 및 △asd(박테리아 게놈에서) 중 하나 이상이다. 예시적인 균주는 △asd 대신에 △purI(△purM), △msbB, △pagP, △ansB, △asd, 또는 △ThyA이다. 균주는 또한 lppA - 및/또는 lppB - , 특히 lppA - /lppB - 일 수 있다. 플라스미드는 숙주 인식 프로모터(예를 들어, 진핵생물 프로모터, 예를 들어 진핵생물 및 동물 바이러스의 것을 포함하는 RNA 중합효소 II 프로모터)의 제어 하에 치료 생성물을 인코딩하도록 변형된다. 플라스미드는 생체내 박테리아 복제를 허용하도록 asd를 인코딩할 수 있고, 다른 유익한 기능(예를 들어, CpG)을 갖는 핵산을 인코딩할 수 있고, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 유전자 생성물을 인코딩할 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 예를 들어 편모를 제거함으로써 상피 세포를 감염시키는 능력을 제거하도록 변형될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 상피 세포를 감염시키는 능력의 제거는 또한 SPI-1 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자의 비활성화 또는 넉아웃을 통해 SPI-1 의존성 침입을 비활성화함으로써 달성될 수 있다. 이러한 유전자는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, invJ, iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spaS, orgA, orgB, orgC, prgH, prgI, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB, and sptP. 추가로 또는 대안적으로, 면역자극성 박테리아는 유전자 fljB, fliC, rck, pagN, hlyE, pefI, srgD, srgA, srgB, 및 srgC 및/또는 면역자극성 박테리아는 fljB, fliC, prgI(바늘 단백질) 및 prgJ(간상체 단백질)를 포함하여 인플라마솜에 의해 직접 인식되는 단백질을 인코딩하는 유전자와 같은 종양-체류 면역 세포의 세포 사멸을 유도하는 유전자의 생성물을 비활성화하기 위해 넉아웃 또는 결실을 포함할 수 있다. rck 유전자는 보체에 의한 비활성화로부터 박테리아를 보호하기 때문에 바람직하다. 내인성으로 rck를 인코딩하지 않는 박테리아는 이종성 rck 유전자를 인코딩하도록 변형될 수 있다.
면역자극성 박테리아는 적절한 박테리아 균주에서 유래한다. 박테리아 균주는 약독화된 균주 또는 표준 방법에 의해 약독화된 균주일 수 있거나, 또는 본원에 제공된 변형으로 인해 이의 콜로니화 능력이 주로 면역특권이 있는 조직 및 기관, 특히 종양-체류 면역 세포, TME 및 고형 종양을 포함한 종양 세포로 제한된다는 점에서 약독화된 균주일 수 있다. 박테리아는 예를 들어, 살모넬라, 시겔라, 리스테리아, 이. 콜라이, 및 비피도박테리아의 균주를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 종은 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 리스테리아 모노사이토게네스, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 및 살모넬라 엔테리티디스를 포함한다. 다른 적합한 박테리아 종은 리케치아, 클레브시엘라, 보르데텔라, 네이쎄리아, 애로모나스, 프란치셀라, 코리네박테리움, 시트로박터, 클라미디아, 해모필루스, 브루셀라, 미코박테리움, 미코플라즈마, 레지오넬라, 로도콕커스, 슈도모나스, 헬리코박터, 비브리오, 바실러스, 및 에리시펠로트릭스를 포함한다. 예를 들어, 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 프로와제키이, 리케치아 쯔쯔가무시, 리케치아 무세리, 리케치아 시비리카, 보르데텔라 브론키셉티카, 네이쎄리아 메닌지티디스, 네이쎄리아 고노로애, 애로모나스 유크레노필라, 애로모나스 살모니시다, 프란치셀라 툴라렌시스, 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스, 시트로박터 프룬디이, 클라미디아 뉴모니애, 해모필루스 솜누스, 브루셀라 아보르투스, 미코박테리움 인트라셀룰라레, 레지오넬라 뉴모필라, 로도콕커스 에퀴, 슈도모나스 애루기노사, 헬리코박터 무스텔래, 비브리오 콜레라, 바실러스 서브틸리스), 에리시펠로트릭스 루시오파시애, 예르시니아 엔테로콜리티카, 로칼리마애 퀸타나, 및 애그로박테리움 투메르파시움을 포함한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 예는 살모넬라 종이다. 본원에 기재된 변형을 위한 박테리아의 예는 수탁번호 #14028로서 American Type Culture Collection(ATCC에 기탁된 균주의 식별 특성을 모두 갖는 균주와 같은 살모넬라의 야생형 균주이다. 균주 YS1646(ATCC 카탈로그 번호 202165, VNP20009로도 지칭됨; 또한 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 99/13053 참조)과 같은 살모넬라 티피무리움의 조작된 균주는 플라스미드로 조작되어 asd 유전자 넉아웃을 보완하고 무항생제 플라스미드 유지를 가능하게 한다. 그 후에, 균주는 플라젤린 유전자를 결실시키고/시키거나 pagP를 결실시키도록 변형된다. 편모 넉아웃과 pagP 결실의 조합은 균주가 인간 혈청 보체에 대해 높은 내성을 갖도록 한다. 균주는 또한 퓨린, 특히 아데노신에 대해 영양요구성이 되며 asd - 및 msbB -이다. 예시된 바와 같이, purI 및 msbB 유전자가 완전히 결실된 균주는 이러한 유전자가 결실되지 않았지만 발현을 제거하도록 변형된 균주 VNP20009보다 더 적합(더 빠르게 성장)하다. asd 유전자는 진핵 숙주에서 생체내 복제를 위해 플라스미드 상에 제공될 수 있다. 균주는 또한 ansB 유전자에 결실, 방해 또는 다른 변형과 같은 변형이 있어 면역억제성 L-아스파라기나제 II 생성을 방지하고 종양 T-세포 기능을 개선한다. 균주는 또한 csgD 결실와 같은 생물막 생성을 제거하도록 변형되어 컬리 핌브리애, 셀룰로스 및 c-디-GMP를 생성할 수 없게 하여 원치 않는 염증 반응을 줄이고 생물막 형성을 방지한다.
이들 게놈 결실 및 플라스미드는 본원의 다른 곳에서 기재되고 예시된다. 본원의 다른 곳에서 기재되고/되거나 당업자에게 알려진 면역자극성 단백질 및 다른 생성물과 같은 치료 생성물을 인코딩하는 핵산은 플라스미드에 포함될 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 저-복제수 내지 중-복제수로 존재한다. 치료 생성물에는 유형 I IFN 발현을 항시적으로 유발/유도할 수 있는 세포질 DNA/RNA 센서의 기능-획득 돌연변이와 종양 미세환경에서의 면역 반응에서 항종양을 촉진하는 사이토카인, 케모카인 및 공동자극성 분자와 같은 다른 면역자극성 단백질 및 본원에 기재된 다른 이러한 생성물이 포함된다. 플라스미드는 또한 면역 체크포인트 및 다른 암 표적(예를 들어, VEGF, IL-6 및 TGF-β) 및 다른 분자, 예를 들어 이중특이적 T-세포 연계자 또는 BiTEs®를 표적화하는 항체 및 이의 단편(예를 들어, 단일 사슬 항체)을 인코딩할 수 있다. 플라스미드는 또한 IL-6 결합 유인 수용체, TGF-베타 결합 유인 수용체, 및 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제를 인코딩할 수 있다.
9. 게놈이 항종양 요법을 위해 최적화되고 복수의 생성물을 포함하여 치료 생성물을 인코딩하는 강력한 면역자극성 박테리아
본원에 기재된 바와 같이, 아데노신에 대해 영양요구성이 되도록 조작되며; LPS의 변형 및/또는 플라젤린의 결실에 의해 전염증성 사이토카인을 유도하는 능력이 감소되며; 그리고/또는 T-세포 기능을 향상시키기 위해 L-아스파라기나제 II 발현의 결실 또는 제거에 의해 변형되며; 그리고/또는 생물막 형성에 필요한 유전자의 결실 또는 방해에 의해 변형되며; 그리고/또는 증가된 rck 발현으로 인해 증강된 인간 혈청 생존을 실증하도록 조작된 박테리아 균주, 예를 들어 에스. 티피무리움 균주는 치료 생성물, 예컨대 면역조절 단백질을 전달하고 강력한 항종양 반응을 촉진하도록 추가로 변형된다.
아래 표는 대응 유전자가 다른 박테리아 종에서 변형될 수 있는 살모넬라 유전자를 참조로 하여 박테리아 유전자형/변형, 이의 기능적 효과, 및 본원에서 달성되는 일부 효과/이점을 요약한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
10. 진핵 숙주에서의 발현을 위해 mRNA 및 다른 형태의 RNA를 포함한 RNA를 전달하는 백신 및 박테리아
RNA에 대한 전달 비히클로서의 면역자극성 박테리아
인코딩된 이종성 RNA를 함유하거나 발현하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 여기서 박테리아는 진핵 숙주 세포를 감염시키고 인코딩된 RNA를 숙주 세포의 세포질 내로 방출시킨다(예를 들어, 미국 특허 제7,390,646호 참조). RNA는 치료 생성물일 수 있거나, RNA는 숙주 세포 머시너리에 의해 치료 생성물로 번역된다. 이러한 생성물은, T-세포 반응, 기억 T-세포 및 항체를 포함한 면역 반응을 유도하기 위한 제시를 위해 세포, 예컨대 식세포에서 발현될 수 있는 병원체로부터의 면역자극성 단백질 및 항원 및/또는 종양 항원을 포함한다. 면역화를 위해, 박테리아는 부위로 또는 병원체의 천연-발생 경로와 동일한 경로에 의해, 예컨대 호흡기 바이러스의 경우 흡입 또는 비내 투여, 위 및 장 병원체의 경우 경구 투여, 예컨대 바이러스의 경우 근육내 투여, 및 또한 전신 경로에 의해 투여될 수 있다. 이는 일생의 면역을 제공할 수 있는 현장에서 면역 반응을 초래할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 면역자극성 박테리아는 이러한 박테리아가 예컨대 시험관내에서의 세포 배양 동안, 또는 숙주 진핵 세포 내로의 박테리아 세포의 진입 후, 또는 시험관내에서의 세포 배양 동안과 숙주 진핵 세포 내로의 박테리아 세포의 진입 후 둘 다에서, 시험관내에서 박테리아 세포 내에서 외인성 또는 이종성 RNA를 생산하도록 변형될 수 있다. 진핵 숙주 세포의 감염 후, 박테리아는 외인성 RNA를 숙주 세포의 세포질 내로 방출시킨다. RNA는 박테리아에서 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있고, 복수의 치료 생성물을 인코딩할 수 있다. 특히, 전달되는 RNA 형태는 진핵 세포 머시너리에 의해 번역될 수 있는 임의의 형태이다. 이는 mRNA, 긴 비코딩(long non-coding) RNA, RNAi, dsRNA, 원형 RNA(eRNA; 예를 들어, 미국 특허 제10,953,033호 참조)를 포함한다.
인코딩된 이종성 RNA를 함유하거나 발현하는 면역자극성 박테리아 및 게놈적으로-변형된 박테리아가 제공되며, 여기서 박테리아가 진핵 숙주 세포를 감염시킬 때, 인코딩된 RNA, 예컨대 mRNA가 숙주 세포의 세포질 내로 방출된다. 박테리아는 본원에 제공된 임의의 면역자극성 박테리아, 특히 이러한 박테리아가 감소된 TLR2, TLR4, 및 TLR5 신호전달을 갖게 되는 게놈 변형을 포함하는 것을 포함한다. 박테리아는 또한 치료 생성물 또는 이의 복수를 인코딩할 수 있고, 특히 사이토카인 및 본원에 제공된 변형된 STING 단백질을 포함한 STING 단백질을 포함한 면역자극성 단백질을 인코딩하며, 이는 RNA가 백신화를 위한, 또는 면역 자극이 유리한 치료를 위한 항원 또는 단백질을 인코딩하고 있다면 아쥬반트로서 작용할 수 있다.
RNA를 인코딩하는 핵산은 이것이 박테리아에서 전사되지만 번역되지는 않도록 변형된다. 이는, 전사된 RNA 생성물이 원핵 리보솜에 의해 인식되지 않거나 번역될 수 없도록 핵산을 설계함으로써 수행될 수 있다. 인코딩 핵산은 추가로, 전사체가 진핵 리보솜, 예컨대 인간과 같은 숙주에 존재하는 것에 의해 인식되고 번역되도록 설계된다. 이는 예를 들어, 원핵 리보솜에 의해 인식되지 않지만 진핵 리보솜에 의해 인식되는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 인코딩하는 핵산을 포함함으로써 수행될 수 있다. 인코딩된 RNA는 전형적으로 mRNA이지만, 치료 생성물이나 면역화 항원 또는 단백질로 변역될 수 있는 다른 형태의 RNA일 수 있다. 다른 형태의 RNA는 원형 RNA인 eRNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. eRNA는: (a) 폴리펩타이드, 예컨대 항원을 인코딩하는 발현 서열을 함유하며; (b) 원핵 리보솜에 의해 인식되지 않는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 종결 요소를 함유하고; (c) 폴리-A 서열, 자유(free) 3' 단부, 및 RNA 폴리머라제 인식 모티프가 결여된 원형 폴리리보뉴클레오타이드이다(예를 들어, 이러한 원형 RNA를 기재하는 미국 특허 제10,953,033호 참조). 박테리아는 전사된 RNA가 생체내에서 고리화되도록 변형된다.
RNA는 치료 생성물일 수 있거나, RNA는 숙주 세포 머시너리에 의해 치료 생성물로 번역된다. RNA는 항원을 인코딩할 수 있으며, 이로써 이는 숙주 세포 내로 전달될 때 단백질로 인코딩되어, 항원, 및 항원이 유래되는 병원체 또는 종양에 대해 숙주를 면역화시킨다. 핵산은, 인코딩된 항원이 예컨대 항원의 회전배열을 안정화시킴으로써 변형되어 면역화를 위해 이의 특성을 향상시키도록 변형될 수 있으며, 이러한 항원에 대해 항체 및 다른 적응 면역 반응이 유도된다. 이는 예를 들어, 코로나 바이러스 상의 스파이크 단백질에 대해 수행되어 왔으며, 따라서 숙주 세포 수용체에 결합하는 회전배열이 안정화되어 더 강력한 항체 반응을 초래한다.
본원에 제공된 임의의 면역자극성 박테리아는 이러한 박테리아가 예컨대 시험관내에서의 세포 배양 동안, 또는 숙주 진핵 세포 내로의 박테리아 세포의 진입 후, 또는 시험관내에서의 세포 배양 동안과 숙주 진핵 세포 내로의 박테리아 세포의 진입 후 둘 다에서, 시험관내에서 박테리아 세포 내에서 외인성 또는 이종성 RNA를 생산하도록 변형될 수 있다. 진핵 숙주 세포의 감염 후, 박테리아는 외인성 RNA를 숙주 세포의 세포질 내로 방출시킨다. RNA는 박테리아에서 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있고, 복수의 치료 생성물을 인코딩할 수 있다.
RNA를 인코딩하는 핵산은 박테리아에 의해 인식되는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 박테리아는 프로모터, 예컨대 박테리아 프로모터, 또는 파지 T7 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 박테리오파지 프로모터를 인식하는 RNA 폴리머라제를 인코딩하도록 변형된다. RNA는 mRNA, 또는 진핵 숙주 세포에서 발현을 위해 조절 서열을 함유하는 다른 RNA 분자일 수 있다. 프로모터는 유도적 프로모터일 수 있다. 박테리아는 인코딩된 RNA의 복수의 복사체를 함유할 수 있으며, 이는 진핵 숙주, 예컨대 인간 내로 도입될 때 숙주 세포 세포질 내로 방출되고, 여기서 이러한 RNA가 mRNA라면, 이는 번역될 수 있다. 박테리아 전사는 박테리아 번역으로부터 디커플링되며, 따라서 유전자 생성물은 전사되지만 번역되지는 않는다. 일부 구현예에서, IRES 서열을 포함하기 보다는, RNA를 인코딩하는 핵산은 출발 코돈의 업스트림에 샤인-달가노(SD) 서열이 결여되며, 이로써 RNA는 박테리아 또는 고세균 리보솜에 의해 번역될 수 없으나 진핵 리보솜에 의해서는 번역될 수 있다. RNA는 서열, 예컨대 코작 서열을 진핵 리보솜에 의해 인식되는 출발 코돈과 함께 함유할 수 있다. 샤인-달가노 서열은 예를 들어 SEQ ID NO: 389-392를 포함한다:
Figure pct00011
(예를 들어, parts.igem.org/File:RBSAlignedSpacing.png 참조). RNA는 또한, 원핵 리보솜에 의한 번역을 차단하거나 저해하는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 그러므로, RNA는 골수성 세포를 감염시키거나 감염시켰던 박테리아에서 생산되어, RNA를 골수성 세포로 전달하고, 여기서 이러한 RNA가 mRNA라면, 이는 샤인-달가노 서열, 또는 IRES, 또는 다른 이러한 조절 서열때문에 번역을 위해 RNA를 인식하는 골수성 세포에서 번역된다. 예를 들어, IRES를 프로모터와 유전자 서열 사이에 삽입하는 것은 전사를 번역으로부터 디커플링시킨다. 그러므로, 면역자극성 박테리아는 RNA 전달 시스템으로서 역할을 한다.
구현예에서, 박테리아 시스템, 예컨대 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 유전적 페이로드를 조직-체류 및/또는 종양-체류 골수성 세포로 전달하는 데 사용된다. 이러한 맥락에서, 박테리아는 생체내에서 투입되며; 박테리아는 예를 들어, asd - 이고, 보완 asd 유전자 카세트를 함유하는 플라스미드를 포함하지 않으며, 따라서 이는 생체내에서 복제될 수 없다. 박테리아를 성장시키기 위해, 이는 시험관내에서 배양된다; 디아미노피멜산(DAP)은 배양 배지에 첨가되어, 기능적 asd 유전자의 부재 하에 박테리아 복제를 용이하게 한다. 이러한 맥락에서, 이러한 면역자극성 박테리아가 투여될 때, 핵산의 하나의 볼루스(bolus)가 조직-체류 또는 종양 체류 골수성 세포로 전달된다. 박테리아의 포식작용 및 세포내 파괴 후, 치료 생성물(들)을 인코딩하는 RNA가 번역을 위해 골수성 세포의 세포질 내로 방출되어, 감염된 세포가 종양-체류 골수성 세포일 때 골수성 세포로부터 주변 환경, 예컨대 종양 미세환경 내로 분비되는 치료 생성물(들)을 생산한다.
시험관내에서 배양된 박테리아는 RNA를 인코딩하지만, RNA를 번역하는 데 필요한 신호/조절 서열, 예컨대 샤인-달가노 서열이 결여되거나, 인코딩 핵산은 원핵 리보솜에 의한 번역을 차단하거나 이를 제공하지 않으나, 진핵 리보솜에 의해 인식되는 서열, 예컨대 IRES를 함유하며, 따라서 박테리아는 mRNA를 생산하지만 번역하지는 않는다. 본원에 기재된 바와 같이 변형되며 따라서 조직-체류 또는 종양-체류 면역 세포, 특히 조직-체류 또는 종양-체류 골수성 세포를 감염시키거나 이에 축적되는 박테리아는 RNA를 골수성 세포에 전달하며, 여기서 이는 번역된다. 예컨대 원핵 프로모터의 제어 하에 발현되는 병원체 또는 종양으로부터의 항원을 인코딩하고/하거나 항바이러스 치료제를 인코딩하는 RNA를 포함한 임의의 RNA가 전달될 수 있다. 이러한 적용을 위해, 플라스미드는 더 높은 복제수(예를 들어, 150 이상의 복제수, 예컨대 200, 300, 400, 500 이상의 복제수, 예컨대 500 내지 700의 복제수)로 존재할 수 있으며, 따라서 다량의 RNA가 생산되고 골수성 세포에 전달된다.
또한, 본원에 기재되고 예시되며 상기 논의된 바와 같이, 인코딩 및 조절 서열은 RNA가 박테리아에서 생산되도록 제조될 수 있으나, 인코딩 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 번역을 저해하거나 방지하지만 진핵 숙주 리보솜에 의해 인식되고/되거나 이에 의한 번역을 증강시키거나, 촉진하거나 허용하는 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, mRNA는 원핵 프로모터의 제어 하에 전사된다. IRES 서열은 전사체에 포함되며, 이는 원핵 박테리아에서 번역을 차단하지만, 진핵 숙주 세포 내로 전달될 때 진핵 리보솜에 의한 번역을 허용한다. 그러므로, 박테리아는 안정한(non-labile) mRNA 전달 시스템을 제공한다. 박테리아는 다량으로 성장될 수 있고, 그 후에 동결건조 또는 냉동되고/되거나 실온에서 보관될 수 있다. 이러한 박테리아는 정제 또는 분말로 제형화될 수 있거나 흡입을 위해 미분화될 수 있다.
박테리아는 톨-유사 수용체(TLR) 2, 4 및 5에 의한 반응이 게놈 변형이 없는 박테리아와 비교하여 감소되도록 게놈-변형을 함유하는 것을 포함한다. 이러한 박테리아는 선택적으로, 박테리아가 필요한 영양소 또는 인자에 대해 영양 요구성이 되는 게놈 변형을 추가로 함유할 수 있으며, 따라서 이러한 박테리아는 진핵 숙주에서 복제할 수 없으나, 영양소 또는 인자와 함께 공급될 때 시험관내에서 복제할 수 있다. 이는 아데노신 생합성 결핍을 포함하며 이는 아데노신이 축적되는 종양 및 종양 미세환경을 갖는 암을 가진 대상체의 치료에 사용될 때 면역억제를 감소시키는 부가 이점을 갖는다. 다른 결핍은 티민 합성 결핍, 예컨대 상기 섹션에서 기재되고 논의되며 아래에 예시된 thyA - 를 포함한다.
박테리아는 생성물을 인코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드를 함유하거나, 생성물을 인코딩하는 RNA를 포함한다. 플라스미드는, 저, 중 또는 고 복제수로 존재할 수 있다. RNA를 전달하는 데 사용될 때, 플라스미드는 고 복제수, 예컨대 150 이상의 복제수로 존재할 수 있다. 핵산 또는 RNA에 의해 인코딩된 생성물은 항원 서열 또는 병원성 바이러스, 박테리아, 기생충으로부터의 서열이거나, 종양 항원이며, 이로써 숙주에서 인코딩된 항원의 발현 시, 숙주는 병원성 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대해 또는 종양 항원에 대해 면역보호 반응 또는 면역화 반응을 발달시키거나, 생성물은 숙주에 전달될 치료 생성물이다. 항원 서열(들)의 발현은 원핵 프로모터의 제어 하에 있어서, 항원(들)을 인코딩하는 RNA는 박테리아에서 생성되고, RNA 전달을 위해, 항원을 인코딩하는 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지만 진핵 숙주 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지 않는 조절 서열을 포함하며, 이로써 번역은 박테리아에서 전사로부터 디커플링된다. 게놈 변형으로 인해, 생성된 박테리아는 진핵 대상체에게 투여될 때 식세포를 감염시키고, 핵산을 RNA가 번역되는 식세포 내로 전달한다.
식세포, 예컨대 대식세포를 감염시키도록 변형된 본원에 제공된 면역자극성 박테리아가 특히 흥미롭다. 특히, 임의의 적합한 종/속, 예컨대 살모넬라, 리스테리아 및 이. 콜라이일 수 있는 박테리아는 이것이 펜타-아실화된 지질 A와 함께 LPS를 생산하도록 변형되고, 편모가 결여되도록 변형되고, 컬리 핌브리애가 결여되도록 변형되는 것 중 하나 이상 또는 모두가 되도록 변형된다; 예를 들어, 박테리아는 msbB - /pagP - , 플라젤린-, 및 csgD -이다(특정 종에서 각각의 인코딩 유전자 또는 등가 유전자에 의해 생성물이 생산되지 않거나 생산되더라도 비활성이 되도록 변형됨). 박테리아는 또한, 예컨대 이를 asd - 로 만듦으로서 변형되어, 이는 DAP와 같은 적절한 영양소를 제공함으로써 시험관내에서 성장될 수 있으나, 이는 진핵 숙주에서 복제되지 않고 궁극적으로는 mRNA가 진핵 세포에 전달될 때 사멸된다. 박테리아는 또한, 본원에 기재된 바와 같이 추가의 페이로드, 예컨대 변형된 STING 단백질 및/또는 사이토카인(모두 본원 어디에서나 기재되고 나열된 바와 같음)을 인코딩할 수 있으며, 이는 숙주 면역계을 자극시키는 역할을 하여 아쥬반트로서 작용한다. 이러한 생성물은 본원 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같이 박테리아에서 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있고, 항원을 인코딩하는 mRNA와 함께 다시스트론성 작제물 상에서 인코딩될 수 있고/있거나, 단백질로의 전사/번역을 위해 진핵 프로모터의 제어 하에 인코딩될 수 있다. 이러한 단백질은 전사를 위해 설계될 수 있거나, 적절하다면 이것이 제시를 위해 막에 앵커링되도록 변형될 수 있다. 면역자극성 박테리아, 예컨대 이. 콜라이는 이것이 인코딩되고 rck를 발현하여 보체에 대한 내성을 증가시키도록 변형될 수 있다.
11. 항병원체 치료 및 백신으로 사용하기 위한, 그리고 항암 치료 및/또는 예방을 위한, 병원체 및 종양으로부터의 항원을 포함하는 특정 항원에 대한 박테리아 백신
백신은 질환에 걸리거나 장애 또는 암이 발생하는 것을 예방(위험 감소)하기 위해 또는 질환, 장애 또는 암 및 이의 조합에 대한 치료로서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 및 다른 백신이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
항종양 반응과 항바이러스 반응 사이의 면역 반응의 유사성 때문에, 본원에서 제공되는 면역자극성 박테리아는 또한 감염성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 바이러스 또는 박테리아 생성물의 저해제, 또는 바이러스 또는 박테리아 생성물의 발현 저해제, 또는 바이러스 또는 박테리아 항원과 같은 항바이러스 또는 항박테리아 치료제를 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아로부터의 면역 반응 및 치료적 항병원체 생성물, 및 또한 면역자극성 단백질 및 인코딩된 면역자극성 단백질에 대한 조합은 감염성 질환, 특히 바이러스 감염, 만성 바이러스 감염 및 잠복 바이러스 감염과 관련된 질환에 대한 백신화 및/또는 치료를 위한 치료적 면역자극성 박테리아를 제공한다. 관심 대상은 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 홍역 바이러스 및 대상체를 만성적으로 감염시키는 다른 이러한 바이러스에 의한 감염과 같은 만성 바이러스 감염이다. 면역자극성 박테리아는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(COVID-19를 유발하는 SARS-CoV-2)와 같이 코로나바이러스 및 만성 인플루엔자에 의한 초기 감염과 같은 급성 감염의 치료에 사용될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 바이러스 항원과 같은 병원체의 항원을 인코딩할 수 있으며 감염을 예방하거나 기존 감염을 치료하기 위한 백신으로 사용될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 T-세포와 같은 항원 제시 세포와 같은 면역 세포에 축적되는 능력으로 인해 바이러스에 대한 T-세포 반응을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 면역자극성 박테리아는 T-세포의 기능을 향상시켜 항바이러스 반응을 촉진하는 아스파라기나아제 II가 결핍되어 있다. 예를 들어 코로나바이러스의 경우 뉴클레오캡시드, M 및/또는 S 단백질의 항원과 같은 필수 바이러스 단백질의 항원과 같은 바이러스 항원의 발현 조합은 중화 항체, 및 장기 수명의 순환형 및 조직-체류 CD8+ T 세포의 증강을 초래할 수 있고, 효과적인 백신 및 치료를 제공한다.
결핵(TB)에 대한 바실러스 칼메트-게렝(BCG) 백신과 같은 불활성화 또는 약독화 백신과 같은 기존 백신의 효능은 아스파라기나제가 발현되지 않도록 게놈을 변형하여 면역 억제를 무효화함으로써 향상될 수 있다. BCG 백신 효과는 종종 감소한다. 이는 백신 박테리아가 분비하는 아스파라기나제때문에 T 세포의 활동을 감소시켜 면역억제 효과가 나타난다. 이는 아스파라기나제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 박테리아를 변형함으로써 완화될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 박테리아에 대한 TLR2 또는 TLR2/4/5 반응을 감소시키거나 제거하는 다른 변형은 TLR2, TLR4, TLR5 또는 다른 박테리아에 대한 톨-유사 수용체의 활성 또는 반응에 의한 I형 IFN의 임의의 차단 또는 저해를 무효화한다. 본원에 기재된 바와 같이, 박테리아에 대한 TLR의 반응은 I형 IFN을 차단하거나 저해할 수 있으며; 이러한 TLR의 반응을 제거함으로써 본원에서 박테리아의 변형은 이러한 바람직하지 않은 효과를 제거한다.
상기 섹션에서 논의된 바와 같이, 면역자극성 박테리아는 항바이러스 치료제 또는 항박테리아 치료제, 또는 면역화를 위한 항원을 인코딩할 수 있다. 이러한 치료제는 복제 및/또는 패키징에 필요한 단백질과 같은 바이러스 유전자 및 단백질의 저해제를 포함하거나, 면역자극성 박테리아는 바이러스가 표적 세포 내로 유입되는 것을 용이하게 하거나 제공하는 수용체 또는 수용체와 바이러스의 결합 또는 상호작용을 방지하는 치료제를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 원핵 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 위 섹션에서 논의한 바와 같이 박테리아는 RNA를 전달하는 박테리아일 수 있다.
위에서 논의한 바와 같이, 박테리아는 SARS-CoV, SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 다른 병원체와 같은 병원체에 대한 백신화를 위한 mRNA를 포함하는 RNA를 전달하고 또한 항종양 요법을 위해 사용될 수 있다. 박테리아는 또한 면역자극제 또는 다른 면역계 증강제 또는 면역 체크포인트 단백질과 같은 면역저해제 저해제를 인코딩할 수 있다. 이의 예는 본원에서 제공되는 변형된 STING 단백질, 사이토카인 및 다른 이러한 면역 자극 단백질을 포함하는 STING 단백질이다. 종양을 치료하기 위한 결합된 페이로드를 포함하는 본원에 기재된 임의의 페이로드는 또한 박테리아에 의해 인코딩/전달될 수 있다. 항종양 반응과 항바이러스 반응은 비슷하다. 백신의 경우 면역자극 페이로드는 면역 반응을 향상시키는 아쥬반트 역할을 한다. 병원체 항원을 인코딩하는 핵산은 원핵생물 프로모터의 제어 하에 있다. 다른 페이로드는 또한 병원체 항원-인코딩 핵산을 갖는 폴리시스트론 작제물로서 제공될 수 있거나, 항-종양 치료제에 대해 본원에 기재된 바와 같이 진핵생물 프로모터의 제어 하에 인코딩될 수 있다.
식세포에 페이로드를 전달하고 전달 특성을 향상시키는 다양한 게놈 변형을 함유하는 본원에 제공된 박테리아와 같은 박테리아는 RNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 RNA가 박테리아 세포질에 전달되고 유형 I IFN을 자극하는 아쥰반트를 포함하기 때문에 나노입자 및 다른 전달 비히클보다 우수한 비히클이다. RNA 전달을 위해 본원에서 제공되는 박테리아의 이점 중에는 하기와 같은 것이 있다: 1) "RNA 없이" RNA 전달을 가능하게 하는 박테리아 전달 비히클은 복잡한 RNA 안정성/제조에 대한 필요성을 제거한다; 2) 식세포 항원 제시 세포(APC)를 직접 표적화한다; 3) 유형 I IFN 아쥬반트 활성을 제공하는 페이로드의 포함을 허용한다; 4) 박테리아가 내인성 asd 활성을 불활성화하고 플라스미드에서 인코딩하지 않음으로써 박테리아를 asd - 로 만드는 것과 같이 박테리아가 진핵생물(예를 들어 인간) 숙주에서 복제되지 않도록 게놈 변형을 포함한다; 그리고 5) 편모 제거, LPS 변형, 생물막 형성 감소 또는 제거, 아스파라기나제 II 활성 제거와 같은 게놈 변형에 의한 불량 아쥬반트인 세균 생성물의 제거가 가능하다. 이러한 박테리아의 예는 msbB - /pagP - 및 플라젤린-, 및 임의로 ansB -, 및 csgD -이며, purI 유전자의 완전한(깨끗한) 결실을 갖는다. 비히클로서의 박테리아는 또한 신속한 조작 및 배치를 허용한다; 박테리아는 쉽게 확장 가능하고 제조하기 용이하다; 복수의 상이한 RNA가 단일 세균에서 코딩될 수 있다; 그리고 박테리아는 안정적이며 실온에서 보관할 수 있고 동결건조할 수 있으며 비강내 전달 또는 흡입 전달 및 정맥 전달용으로 제형화할 수 있으며 다른 적합한 전달 경로를 위해 제형화할 수 있다. 일부 TLR2 활성을 유지하면 박테리아 csgD -를 만드는 게놈 변형을 포함하여 내피 혈관 세포가 누출된다.
항암 치료 생성물을 종양/종양 미세 환경으로 전달하기 위해 인코딩된 생성물은 분비 신호와 같은 트래피킹 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 생성물은 또한 종양 상주 골수 세포 및 다른 식세포의 세포 표면과 같은 세포 표면에서의 발현을 위해 설계될 수 있다. 유전자 생성물은 막 고정되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, IL-12는 C-말단에 막횡단 도메인을 추가하여 막 고정되도록 여기에서 변형되었다. 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-12p35, IL-21, IL-15 및 FLT-3L을 포함하는 다른 단백질은 막관통 도메인 또는 GPI 앵커와 같은 다른 앵커 도메인을 추가함으로써 유사하게 변형될 수 있다. 박테리아에 감염된 세포의 막에 이러한 단백질을 고정하면 독성이 감소하여 전신적으로 분비되지 않고 종양 미세 환경에서 작용한다. 특히, 이러한 생성물 및 이의 조합을 인코딩하는 면역자극성 박테리아는 게놈 변형, 예를 들어 박테리아가 msbB -/pagP -가 되고 편모를 갖지 않게 하는 변형과 같은 게놈 변형을 갖는 것이고, 이로써 톨-유사 수용체(TLRs) 2, 4 및 5에 의한 반응은 게놈 변형이 없는 박테리아에 비교하여 감소된다.
12. M2 표현형 대식세포로부터 M1 및 M1-유사 표현형 대식세포로의 전환
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 대식세포에 축적되고/거나 대식세포를 표적으로 한다. 대식세포는 식세포 면역 세포이다. 이는 노화 세포 및 세포 사멸 세포를 제거하고 면역 관련 복합체 및 병원균의 식균 작용, 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 대식세포의 표현형과 기능은 미세환경에 의해 양극화될 수 있다. M1형(고전적으로 활성화된 대식세포)과 M2형(대체로 활성화된 대식세포)의 두 가지 유형이 있다.
M1 대식세포의 역할은 전염증성 사이토카인과 케모카인을 분비하고 항원을 제시하여 긍정적인 면역 반응에 참여하고 면역 모니터로서의 기능을 하는 것이다. M1 대식세포는 IL-6, IL-12 및 TNF-알파를 포함한 염증유발 사이토카인을 생성한다. M2 대식세포는 아르기나제 1, IL-10, TGF-β 및 다른 항염증성 사이토카인을 분비하여 염증을 감소시키는 기능을 하고 종양 성장 및 면역억제 기능에 기여한다. 따라서, 암 및 다른 이러한 질환 및 장애의 치료를 위해 M1 또는 M1-유사 표현형이 유리하다.
M2 대식세포는 M1 대식세포 또는 M1-유사 표현형을 갖는 대식세포로 전환될 수 있다. 대식세포를 감염시키는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 M2 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형을 갖는 대식세포로 전환할 수 있다. M1 대식세포 표현형 마커에는 CD80(B7, B7.1 또는 BB1로도 알려짐), CD86(B7.2로도 알려짐), CD64(고친화도 면역글로불린 감마 Fc 수용체 I로도 알려짐), CD16 및 CD32(또한 저친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 IIb로 알려짐)가 있다. M1 대식세포에서 산화질소 합성효소(iNOS)의 발현도 표현형 마커로 작용할 수 있다. CD163 및 CD206은 M2 대식세포의 식별을 위한 마커이다. 아르기나제 1(Arg1) 및 DECTIN-1은 또한 M2 대식세포의 식별을 위한 이상적인 표현형 지표이다. 표현형 전환은 이러한 마커, 및/또는 대식세포 표현형의 특징인 다른 마커의 발현에 의해 모니터링되거나 평가될 수 있다.
종양-연관 대식세포(TAM)는 면역억제성 M2 표현형과 관련이 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이러한 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형을 갖는 대식세포로 전환할 수 있다. 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유도하는 치료제를 인코딩하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이러한 전환에 영향을 미칠 수 있다. 이는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 고유한 특성이며, 대식세포의 감염을 초래하는 게놈 변형을 포함하는 박테리아의 능력을 이용한다. 인코딩된 치료 생성물에는 STING 변이체(본원에 자세히 설명됨)와 같은 세포질 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 생성물이 포함된다. 인코딩 면역자극성 박테리아는 종양-체류 대식세포의 감염 및 치료제(들)의 발현 시 M1 표현형(또는 M1-유사 표현형)으로의 감염된 대식세포의 전환에 영향을 미칠 수 있다. 대식세포 표현형을 전환하는 이러한 능력은 하기 실시예 12에서 입증되고 예시된다. 대식세포를 감염시키고 STING 단백질을 발현하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 의한 변형된 STING 단백질의 발현은 M2 대식세포의 표현형을 M1-유사 표현형으로 전환시킨다.
편모 및 LPS 변형의 제거와 같은 본원에 기재된 게놈 변형을 포함하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 감염된 M2 대식세포를 M1 대식세포의 사이토카인 프로파일 특징 중 일부 또는 모두를 유도하는 것으로 전환시킨다. 인간 1차 M2 대식세포에서 항시적 유형 I IFN 발현을 초래하는 변이체 STING 단백질을 발현하는 면역자극성 박테리아는 이러한 세포를 M1-유사(M1 대식세포의 전형적인 표현형 마커 및/또는 발현 프로파일을 가짐) 유형 I IFN 생산 세포로 전환시킨다.
D. 종양 미세환경에서 면역 반응을 자극시키는 유전자 페이로드를 인코딩하는 증강된 치료 지수를 갖는 면역자극성 박테리아
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 진핵 프로모터의 제어 하에 인코딩된 치료 생성물이 발현되는 종양 미세환경 및 종양-체류 골수성 세포에 축적되도록 변형된다. 박테리아는 면역계를 자극하고/하거나 종양의 면역억제 효과를 역전 또는 완화시키는 생성물을 포함하여 치료 생성물, 특히 항암 생성물을 인코딩한다. 본원에 기재된 바와 같이, 박테리아는 복수의 생성물을 인코딩할 수 있고, 여기서 각각의 생성물의 발현은 별개의 프로모터의 제어 하에 있거나, 생성물의 발현은 하나의 프로모터의 제어 하에 있고, 발현 카세트는 별개의 생성물의 발현을 초래하는 서열을 포함할 수 있으며, 적절한 경우 인코딩된 생성물이 종양 미세환경으로 분비되도록 하는 조절 서열을 포함한다. 면역자극성 박테리아는 플라스미드에 인코딩된 치료 생성물을 발현한다. 본원에 논의된 바와 같이, 플라스미드는 하나의 생성물 또는 이의 다수를 인코딩할 수 있다. 각각의 생성물은 다른 진핵생물 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있거나, T2A(서열 327), P2A(SEQ ID NO: 328), E2A(SEQ ID NO: 329), 및 F2A(SEQ ID NO: 330)와 같은 코딩 부분 사이에 2A 자가 절단 펩타이드를 포함하는 것과 같이 단일 프로모터의 제어 하에 다중 인코딩된 생성물이 발현될 수 있다. 인코딩된 생성물은 본원에 기재된 것을 포함하며, 활성이 상보적인 항암 면역 자극 생성물일 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 전신 투여되는 경우 너무 독성이 있는 다중 면역조절 생성물 또는 페이로드(다중화된 페이로드)의 조합 투여를 허용한다. 다중화된 페이로드의 예는 하나 이상의 사이토카인(들), 유형 I IFN의 발현을 자극하거나 유도하기 위한 면역자극성 단백질, 예컨대 증가된 활성을 갖거나 항시적으로 활성인 STING 또는 이의 변이체, 및 조작된 4-1BBL 공동자극성 분자와 같은 공동자극성 분자를 포함한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 다중화된 페이로드 또는 단일 작용제 페이로드로 IV 투여한 후와 같은 치료의 제공을 포함하는 강력한 항종양 효과를 갖는다. 면역자극성 박테리아는 전신 투여될 때 고형 종양, TME 및 종양-체류 골수성 세포에 침투하여 농축되며, 여기서 인코딩된 치료제가 발현된 다음 종양 미세환경에 국소적으로 전달된다. 종양-체류 골수성 세포에 의한 소비(식균작용) 시, 박테리아는 종양-특이적 방식으로 이소성, 단일 또는 다중 페이로드 발현을 허용하는 유전자 페이로드-인코딩 플라스미드를 전달한다.
1. 면역자극성 단백질
본원에서 면역자극성 박테리아는 항종양 반응을 촉진하거나, 유도하거나, 증강시키는 하나 이상의 면역자극성 단백질을 인코딩하도록 변형될 수 있다. 보누언에 예시되고 기재된 바와 같이, 인코딩 핵산이 플라스미드 상에 배열되는 순서는 전반적인 발현을 향상시킬 수 있고, 플라스미드에 대한 변형, 예컨대 유전자의 완전 결실 또는 비활성화는 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 박테리아의 적합도를 향상시킬 수 있다.
면역자극성 단백질(들)은 진핵생물 대상체, 특히 면역자극성 박테리아가 투여될 대상체, 예컨대 인간에서의 발현을 위해 진핵생물 프로모터, 예컨대 RNA 폴리머라제 II에 의해 인식되는 프로모터의 제어 하에 박테리아 내 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있다. 면역자극성 단백질(들)을 인코딩하는 핵산은 진핵생물 프로모터에 더하여, 세포에서의 발현 또는 트래피킹을 위해, 예컨대 세포 표면 상에서의 분비 또는 발현을 위해 다른 조절 신호를 포함할 수 있다.
면역자극성 단백질은 적절한 환경, 예컨대 종양 미세환경 (TME)에서 면역자극성 박테리아가 투여되는 대상체에 의한 항종양 반응을 촉진하거나 이에 참여하거나 이를 증강시킬 수 있는 것이다. 면역자극성 단백질은 사이토카인, 케모카인, 및 공동자극성 분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이는 사이토카인, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, IL-36γ, GM-CSF, IFNα, IFNβ, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, 및 IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2; 케모카인, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10, 및 CXCL11; 및/또는 공동자극성 분자, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, CD40, CD40L, OX40, OX40L, 4-1BB, 4-1BBL, 절두된 또는 결실된 세포질 도메인을 갖는 4-1BBL(4-1BBLΔCyt), TNF/TNFR 슈퍼계열의 구성원(예를 들어, CD27 및 CD27L), 및 B7-CD28 계열의 구성원(예를 들어, CD80, CD86, ICOS, 및 ICOS 리간드 (B7RP1))을 포함한다.
종양 치료에 사용되거나, 당업자에게 알려진, 항종양 반응을 촉진, 향상 또는 달리 증가 또는 유발시킬 수 있는 이러한 다른 면역자극성 단백질은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 인코딩하기 위해 고려된다. 예를 들어, 면역자극성 박테리아는 APC 상에서의 발현을 위해 전체 또는 부분 세포질 도메인 결실과 함께 절두된 공동자극성 분자(예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1 및 OX40L)를 인코딩하는 유전자 페이로드를 전달할 수 있으며, 여기서 절두된 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 결합을 통해 T-세포에 대한 항시적 면역-자극 신호전달이 가능하고 결실되거나 절두된 세포질 도메인으로 인해 APC에 대한 역조절 신호를 할 수 없다. 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 예를 들어 4-1BBL의 변형된 절두된 세포질 도메인은 단백질의 발현을 증가시키는 단백질 도메인의 적절한 배향을 보장하기 위해 특정 잔기를 함유한다. 공동자극성 분자의 세포질 도메인의 결실(전체 또는 부분) 및 변형은 면역억제성 역 신호전달 없이 공동자극성 분자의 활성화를 강화시킨다.
a. 사이토카인 및 케모카인
일부 구현예에서, 본원의 면역자극성 박테리아는 면역계를 자극하여 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-12, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-15:IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc), IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IL-2Ra에의 약화된 결합을 갖는 IL-2, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형되는 IL-2, IFN-α 및 IFN-β를 포함하지만 이로 제한되지 않는 사이토카인을 발현하하도록 조작된다. 사이토카인은 종양 부위에서 면역 이펙터 세포와 기질 세포를 자극하고 세포독성 세포에 의한 종양 세포 인식을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 예를 들어 CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 및 CXCL11과 같은 케모카인을 발현하도록 조작될 수 있다.
IL-2
암 치료용으로 승인된 최초의 사이토카인인 인터루킨-2(IL-2)는 세포독성 T 림프구(CTL) 성장의 활성화 및 촉진, 림포카인 활성화 킬러(LAK) 세포의 생산, 조절 T-세포(Treg 세포) 성장 및 증식의 촉진, 종양 침윤 림프구(TIL)의 자극, 및 T-세포, B 세포 및 NK 세포 증식 및 분화의 촉진에 관여한다. 재조합 IL-2(rIL-2)는 전이성 신세포 암종(RCC) 및 전이성 흑색종의 치료에 대해 FDA 승인을 받았다(예를 들어, Sheikhi 등 (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148 -166).
IL-7
IL-2 슈퍼계열의 구성원인 IL-7은 T-세포의 생존, 증식 및 항상성에 연루되어 있다. IL-7 수용체의 돌연변이는 T-세포의 손실과 중증 복합 면역결핍 질환(SCID)의 발병을 초래하는 것으로 나타났으며, 이는 IL-7이 T-세포 발달에서 하는 중요한 역할을 강조한다. IL-7은 휴식 중인 미접촉 T-세포와 기억 T-세포에 지속적인 신호를 제공하고 림프구감소증 상태 동안 축적되어 T-세포 증식과 T-세포 레퍼토리 다양성을 증가시키는 항상성 사이토카인이다. IL-2와 비교하여 IL-7은 CD4+FOXP3+ 조절 T-세포보다 CD8+ T-세포를 확장하는 데 선택적이다. 재조합 IL-7은 백신화 및 생쥐의 입양 세포 치료 후 항원 특이적 T-세포 반응을 증가시키는 것으로 나타났다. IL-7은 또한 조혈모세포 이식의 화학요법 후 T-세포 회복을 촉진하는 역할을 할 수 있다. 진행성 악성종양 환자에 대한 초기 단계 임상 시험은 재조합 IL-7이 내약성이 우수하고 생물학적 활성 용량(즉, 순환하는 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 수가 3-4배 증가하는 용량)에서 독성이 제한됨을 보여주었다(예를 들어, Lee, S. 및 Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893 참조). IL-7은 신경교종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 전립선암 및 교모세포종과 같은 종양에서 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났으며 뮤린 모델에서 IL-7의 생체내 투여는 암세포 성장을 감소시켰다. IL-7은 또한 래트 신경교종 종양에서 IFN-γ의 항종양 효과를 향상시키고 단핵구에 의한 IL-1α, IL-1β 및 TNF-α의 생성을 유도하여 흑색종 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 추가로, 소아 육종의 치료 후 재조합 IL-7의 투여는 면역 회복의 촉진을 초래하였다(예를 들어, Lin 등 (2017) Anticancer Research 37:963-968 참조).
IL-12(IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35))
세포-매개 면역을 촉진하는 생리활성 IL-12(IL-12p70)는 p35 및 p40 하위단위로 구성된 이종이량체인 반면, IL-12p40 단량체 및 동종이량체는 IL-12 길항제로서 작용한다. 항원 제시 세포에 의해 분비되는 IL-12는 NK 및 T-세포로부터 IFN-γ의 분비를 촉진하고, 종양 혈관신생을 억제하며, NK 세포, CD8+ T-세포 및 CD4+ T-세포의 활성화 및 증식을 초래하고, 미접촉 CD4+ T-세포의 Th1 세포로의 분화를 강화하고, 종양 세포에 대한 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 촉진한다. IL-12는 흑색종, 결장 암종, 유선 암종 및 육종의 쥐 모델에서 항종양 효과를 나타내는 것으로 나타났다(예를 들어, Kalinski et al. (2001) Blood 97:3466-3469; Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166; 및 Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893).
IL-15 및 IL-15:IL-15Rα(IL-15/IL-15Rα)
IL-15는 구조적으로 IL-2와 유사하며 IL-2와 IL-15는 모두 T-세포의 증식 및 활성화를 위한 조기 자극을 제공하지만 IL-15는 IL-2 유도 세포자멸사를 차단하며, 이는 자극된 T-세포를 제거하고 T-세포 내성을 유도하여 기억 T-세포 반응을 제한하고 IL-2 단독의 치료 효능을 잠재적으로 제한하는 과정이다. IL-15는 또한 장기 항종양 면역력을 유지하기 위한 기억 CD8+ T-세포의 지속성을 지원하며 항원-독립적인 방식에서 CD8+ 이펙터 T-세포의 직접 활성화를 통해 전임상 쥐 모델에서 상당한 항종양 활성을 입증하였다. CD8+ T-세포에 더하여, IL-15는 이펙터 자연 살해(NK) 세포의 발달, 증식 및 활성화를 담당한다(예를 들어, Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856- 3893 및 Han 등 (2011) Cytokine 56(3):804-810).
Il-IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체는 IL-15 대신에 사용될 수 있는데, 왜냐하면 이것이 단량체성 IL-15보다 더 긴 생체내 안정성을 갖고, 면역 세포 상에서 IL-15보다 10배 내지 100배 이상 활성이기 때문이다. IL-15/IL-15Rα는 NK 세포, γδ(감마 델타) T-세포 및 T-세포의 성숙, 증식 및 항-세포자멸사 유지를 자극시키고; 이는 활성화된 T-세포(CTL)의 생존 및 장기-수명의 CD8+ CD44hi T-세포 기억 세포의 생성을 촉진시킨다. 임상적으로, IL-15는 IL-2보다 우수한데, 이것이 면역억제성 Tregs 상에 위치한 IL-2R알파에 결합하지 않고 활성화-유도 세포 사멸(AICD) 또는 광범위한 모세관 누출 증후군(capillary leak syndrome)을 유도하지 않기 때문이다. 본원에서 CD8+ 세포 기능을 증강시키기 위해, 조작된 STING에 의해 유도되는 유형 I 인터페론 사이에 상승작용이 존재하는 것으로 제시된다. 골수성-매개 T-세포 모집 및 CD8+ T-세포 기능을 증강시키기 위한 상승작용이 존재한다. 이는 인간 수지상 세포(DC)를 활성화시켜 항바이러스 CD8+ T-세포 반응을 유도함으로써 항암 면역을 유도하기 위해 상승작용적으로 작용한다. 본원에서 이러한 조합은 동물 모델에서 높은 치유율을 유도하는 것으로 제시된다. 뮤린 동소 T-모델에서 강한 T-세포 침윤은 종양, 및 간질 종양 연관 대식세포(TAM) 장벽의 분해를 배제하였다. 유의한 T-세포 및 NK 모집이 관찰되었다.
IL-15 및 IL-15 수용체 알파(IL-15Rα)는 단핵구 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에 의해 공동으로 발현되고, IL-15는 CD8+ T-세포와 NK 세포의 표면 t사에서 발현되는 IL-15Rβγc 수용체 복합체에 IL-15Rα에 의해 트랜스로 제시된다. 가용성 1L-15:IL15-Rα(IL-15/IL-15Rα) 복합체는 IL-15Rβγc 복합체를 통해 면역 반응을 조절하는 것으로 나타났으며, IL-15의 생물학적 활성은 미리 형성된 IL-15와 가용성 IL-15Rα의 복합체에 투여함으로써 50배 증가된 것으로 나타났으며, 이는 IL-15 단독과 비교하여 반감기가 증가하였다. IL-15Rα와의 사전-연관에 의한 IL-15의 치료 효능의 이러한 상당한 증가는 뮤린 종양 모델에서 입증되었다(예를 들어, Han 등 (2011) Cytokine 56(3):804-810 참조).
IL-18
IL-18은 NK 및 CD8+ T-세포에 의한 IFN-γ의 분비를 유도하여 독성을 향상시킨다. IL-18은 또한 대식세포를 활성화하고 Th1 헬퍼 CD4+ T-세포의 발달을 자극한다. IL-18은 여러 전임상 마우스 모델에서 유망한 항종양 활성을 보였다. 예를 들어, 재조합 IL-18(rIL-18)의 투여는 CD4+ T-세포 및/또는 NK 세포-매개 반응의 활성화를 통해 동계 마우스에서 흑색종 또는 육종의 퇴행을 초래하였다. 다른 연구에서는 IL-18 항종양 효과가 IFN-γ에 의해 매개되고 항혈관신생 기전과 관련이 있음을 보여주었다. IL-18과 IL-12와 같은 다른 사이토카인 또는 CD80과 같은 공동자극성 분자와의 조합은 IL-18-매개 항종양 효과를 향상시킨다. 진행성 고형 종양 및 림프종 환자를 대상으로 한 1상 임상 시험에서 IL-18 투여가 안전하고 면역 조절 활성을 가져오고 환자에서 그리고 중등도의 임상 반응에서 혈청 IFN-γ 및 GM-CSF 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 임상 시험은 IL-18이 단일클론 항체, 세포독성 약물 또는 백신과 같은 다른 항암 치료제와 조합될 수 있음을 보여주었다(예를 들어, Fabbi 등 (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665- 675, 및 Lee, S. 및 Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893).
IL-18을 발현하도록 조작된 살모넬라 티피무리움의 약독화 균주는 전신 투여 후 독성 효과 없이 동계 마우스에서 피하(S.C.) 종양 또는 폐 전이의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이 조작된 박테리아를 사용한 치료는 종양에서 T-세포, NK 세포 및 과립구의 축적을 유도하였고, 결과적으로 사이토카인의 종양내 생성을 초래하였다(예를 들어, Fabbi 등 (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665- 675).
케모카인
케모카인은 손상 또는 염증 부위로의 백혈구 이동을 매개하고 면역 및 염증 반응 매개에 관여하는 작은 사이토카인 계열이다. 케모카인은 서열에서 시스테인 잔기의 위치, 즉 XC-, CC-, CXC- 및 CX3C-케모카인 리간드 또는 XCL, CCL, CXCL 및 CX3CL에 따라 4개의 서브계열로 분류된다. 케모카인 리간드는 동족 수용체에 결합하고 면역 세포의 순환, 귀환 및 보유를 조절하며, 각각의 케모카인 리간드-수용체 쌍은 특정 유형의 면역 세포를 선택적으로 조절한다. 상이한 케모카인은 상이한 백혈구 집단을 유인하고, 유인된 면역 세포가 더 높은 농도의 케모카인을 향해 구배를 통해 이동하면서 생체내 농도 구배를 형성한다(예를 들어, Argyle D. and Kitamura, T. (2018) Front. Immunol. 9:2629; 및 Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335). 케모카인은 면역 세포가 종양으로 침투하는 것을 증가시키고 항원 제시 세포(APC)를, 미접촉 T-세포 및 B 세포를 프라이밍하는 종양 배출 림프절로 이동시키는 것을 촉진하여 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340)). 본원의 면역자극성 박테리아는 CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 및 CXCL11을 포함하지만 이로 제한되지 않는 케모카인을 인코딩하도록 조작될 수 있다.
CCL3, CCL4, CCL5
CCL3, CCL4 및 CCL5는 고도의 상동성을 공유하고 인간과 마우스 모두에서 미성숙 DC 및 T-세포를 포함한 여러 세포 유형에서 CCR5(CCL3, CCL4 및 CCL5) 및 CCR1(CCL3 및 CCL5)에 결합한다. 치료 T-세포는 CCL3, CCL4 및 CCL5의 종양-특이적 분비를 통해 내재성 면역 세포의 종양 부위에 대한 화학주성을 유도하는 것으로 나타났다(예를 들어, Dubinett 등 (2010) Cancer J. 16(4) :325-335).
T 헬퍼 세포 유형 1(Th1) 반응의 유도는 CCL3을 방출한다. 생쥐에 대한 생체 외 및 시험관 연구에서 CCL3이 호중구와 단핵구 모두에 대해 화학주성인 것으로 나타났으며; 구체적으로, CCL3는 골수로부터 골수 전구체 세포(MPC) 동원을 매개할 수 있고 MPC 조절 및 자극 효과를 갖는다. CCL3으로 형질주입된 인간 난소 암종 세포는 종양 내에서 향상된 T-세포 침윤 및 대식세포를 보여 개선된 항종양 반응을 일으켰고, 호중구의 CCL3-매개 화학주성이 종양 성장을 저해함을 나타내었다. CCL3에 의해 모집된 종양 항원 인간 흑색종 관련 유전자(MAGE)-1로 형질주입된 DC는 흑색종 마우스 모델에서 림프구 증식, 세포용해 능력 및 생존 증가, 종양 성장 감소를 비롯한 우수한 항종양 효과를 나타냈다. MAGE-1에 대한 항원 특이적 플랫폼과 CCL3의 조합 사용도 위암 치료에 사용되었다. 고도로 면역원성인 뮤린 결장 종양인 CT26에 의한 CCL3 생산은 생체 내 종양 성장을 늦추었으며; 이 과정은 자연 살해(NK) 세포의 CCL3 의존적 축적, 따라서 IFNγ에 의해 유도되어 CXCL9 및 CXLC10을 생성한다(예를 들어, Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598; 및 Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-10600).
CCL3는 암 치료를 위한 보조제로 사용되었다. 마우스 간세포 암종에서 고주파 절제 후 CCL3 활성 변이체인 ECI301의 투여는 종양-특이적 반응을 증가시켰고, 이 기전은 CCR1의 발현에 의존하는 것으로 추가로 나타났다. CCL3은 또한 백혈병/림프종 모델에서 CCL3 및 IL-2 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로 백신을 접종한 마우스가 증가된 생존율을 나타내는 전신암에서 보조제로서의 성공을 보여주었다(예를 들어, Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060).
CCL3 및 CCL4는 흑색종 및 결장암의 원발성 종양 부위로 CD8+ T-세포 침윤을 지시하는 역할을 한다. CCL4의 종양 생산은 CD103+ DC의 축적으로 이어진다. WNT/β-카테닌 의존성 경로를 통한 CCL4의 억제는 흑색종 종양의 CD103+ DC 침윤을 방지하였다(예를 들어, Spranger 등 (2015) Nature 523(7559):231-235 참조). CCL3은 또한 결장암의 마우스 모델에서 원발성 종양 부위에 대한 CD4+ 및 CD8+ T-세포 침윤을 향상시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Allen 등 (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598 참조).
CCL3 또는 CCL5가 수용체(CCR1 및 CCR5)에 결합하면 미성숙 DC, 단핵구, 기억 및 T 이펙터 세포가 순환계에서 염증 또는 감염 부위로 이동한다. 예를 들어, 결장직장 종양에서 CCL5 발현은 T 림프구 화학유인 및 생존에 기여한다. CCL3 및 CCL5는 여러 전임상 모델에서 종양 퇴행 및 면역을 유도하기 위해 단독으로 또는 병용 요법으로 사용되었다. 예를 들어, 연구에 따르면 CCL3을 발현하도록 유전적으로 변형된 차이니즈 햄스터 난소 세포의 피하 주사는 종양 억제 및 호중구 침윤을 초래하였다. 또 다른 연구에서 CCL5(Ad-RANTES-E1A)를 발현하는 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 원발성 종양 퇴행을 초래하고 유선 암종 쥐 모델에서 전이를 차단하였다(예를 들어, Lechner 등 (2011) Immunotherapy 3(11): 1317-1340).
결장직장암에 대한 번역 연구에서 CCL5는 대식세포에서 "항바이러스 반응 패턴"을 유도하였다. 결장직장암에서 간 전이의 침습적 변연에서 림프구의 CXCR3-매개 이동의 결과로 CCL5가 생성된다. CCL5 수용체인 CCR5의 차단은 IFN 및 활성 산소 종을 생성하는 대식세포에 의해 구동되는 종양 사멸을 초래한다. 대식세포가 종양 미세환경에 존재하는 동안, CCR5 억제는 M2 표현형에서 M1 표현형으로의 표현형 이동을 유도한다. CCR5 차단은 또한 결장직장암 환자에서 임상 반응을 유도한다(예를 들어, Halama 등 (2016) Cancer Cell 29(4):587-601 참조).
CCL3, CCL4, 및 CCL5는 림프 종양, 방광암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 난소암, 자궁경부암 또는 간암을 포함하는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호. US 2015/0232880 및 국제 출원 공개 번호 WO 2015/059303, WO 2017/043815, WO 2017/156349 및 WO 2018/191654).
CXCL9, CXCL10, CXCL11
CXCL9(MIG), CXCL10(IP10) 및 CXCL11(ITAC)은 IFN-γ의 생산에 의해 유도된다. 이러한 케모카인은 활성화된 T-세포에서 우선적으로 발현되는 CXCR3에 결합하고, 혈관정지 및 백혈구 동원 및 활성화 모두에서 기능한다. 결장직장암의 예후는 종양 침윤 T-세포, 특히 Th1 및 CD8+ 이펙터 T-세포와 강한 상관관계가 있으며; CXCL9, CXCL10 및 CXCL11의 높은 종양내 발현은 좋은 예후를 나타낸다. 예를 들어, 결장암 환자 163명의 시료에서 CXCL9 또는 CXCL11 수치가 높은 사람은 수술 후 생존율이 증가하였으며 CXC 발현이 높은 환자는 상당히 더 높은 수의 CD3+ T-세포, CD4+ T 헬퍼 세포, 및 CD8+ 세포독성 T-세포를 가졌다. 결장직장암 환자의 간 전이에서, CXCL9 및 CXCL10 수준은 침습성 변연에서 증가하였으며, 이펙터 T-세포 밀도와 상관관계가 있었다. CXCR3에 대한 CXCL9 및 CXCL10의 작용을 통한 림프구 이동의 자극은 침습성 변연에서 CCL5의 생성을 유도한다(예를 들어, Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601; 및 Kistner et al. (2017) Oncotarget 8(52):89998-90012).
생체 내에서, CXCL9는 종양 침윤 림프구(TIL), 활성화된 말초 혈액 림프구, 자연 살해(NK) 세포 및 Th1 림프구에 대한 화학 유인 물질로 기능한다. CXCL9는 또한 피부 종양의 T-세포-매개 억제에 중요하다. 예를 들어, 전신 IL-2와 결합할 때 CXCL9는 CXCR3+ 단핵 세포의 종양 내 침윤 증가를 통해 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 결장암의 쥐 모델에서 huKS1/4-IL-2 융합 단백질과 CXCL9 유전자 요법의 조합은 CD8+ 및 CD4+ T 림프구의 화학유인 및 활성화를 통해 우수한 항종양 효과와 연장된 수명을 달성하였다(예를 들어, Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; 및 Ruehlmann et al. (2001) Cancer Res. 61(23):8498-8503).
활성화된 단핵구, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포에 의해 생성되는 CXCL10은 활성화된 T-세포에 대한 화학주성이며 생체내에서 혈관신생의 저해제로 작용할 수 있다. 결장직장 종양에서 CXCL10의 발현은 세포독성 T 림프구 화학유인 및 더 긴 생존에 기여하는 것으로 나타났다. IL-12와 같은 면역자극성 사이토카인의 투여는 CXCL10에 의해 생성된 항종양 효과를 향상시키는 것으로 나타났다. 종양 세포 용해물로 프라이밍되고 CXCL10으로 형질주입된 수지상 세포(DC) 백신은 마우스에서 면역학적 보호 및 효과가 증가하였으며; 동물은 종양 공격에 대한 내성, 종양 성장의 둔화 및 더 긴 생존 시간을 보여주었다. CXCL10-뮤신-GPI 융합 단백질을 사용한 마우스의 생체내 및 시험관내 연구는 융합 단백질로 치료하지 않은 종양과 비교하여 모집된 NK 세포 수준이 더 높은 종양을 초래하였다. 인터페론(형질세포양 수지상 세포에 의해 생성될 수 있으며; 이러한 세포는 원발성 흑색종 병변과 연관되고 CCL20에 의해 종양 부위로 모집될 수 있음)은 마우스 흑색종 모델에서 CXCL9/10을 생성하는 것으로 나타난 CD103+ DC와 같은 종양 DC 하위집합에 작용할 수 있고, 인간 질환에서 CXCL9/10과 관련이 있다. CXCL10은 또한 원발성 흑색종 시료와 비교하여 인간 전이성 흑색종 시료에서 더 높은 발현을 나타냈다. 치료적으로, 보조 IFN-α 흑색종 요법은 CXCL10 생성을 상향 조절하는 반면, 화학요법제 시스플라틴은 CXCL9 및 CXCL10을 유도한다(예를 들어, Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271; Li et al. (2007) Scand. J. Immunol. 65(1):8-13; 및 Muenchmeier et al. (2013) PLoS One 8(8):e72749).
CXCL10/11 및 CXCR3 발현은 기저 세포 암종(BCC)에서 유래된 인간 각질세포에서 확립되었다. CXCL11은 또한 인간 기저 세포 암종에서 면역억제성 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 발현을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 침윤성 CXCR3+ 이펙터 T-세포의 항종양 활성을 감소시킬 수 있는 각질세포 증식을 향상시킬 수 있다(예를 들어, Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271).
CXCL9, CXCL10 및 CXCL11은 암 치료를 위한 종양용해성 바이러스에서 인코딩될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2015/0232880; 및 국제 출원 공개 번호 WO 2015/059303 참조). 의사형(peudotyped) 종양용해성 바이러스 또는 CXCL10에 대한 유전자를 인코딩하는 유전자 조작된 박테리아는 또한 암을 치료하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 2018/006005 및 WO 2018/129404 참조).
b. 공동자극성 분자
공동자극성 분자는 종양 세포에 대한 면역 반응을 증강시키고, 공동자극성 경로는 종양 세포에 의해 저해되어 종양발생을 촉진한다. 본원에서 면역자극성 박테리아는 공동자극성 분자, 예를 들어, CD40, CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, 세포질 도메인의 결실을 갖는 4-1BBL(4-1BBLΔcyt), 절두된 세포질 도메인을 갖는 4-1BBL, OX40(CD134), OX40L(CD252), TNFR 슈퍼계열의 다른 구성원(예를 들어, CD27, CD27 리간드, GITR, CD30, Fas 수용체, TRAIL-R, TNF-R, HVEM, 및 RANK), B7, CD80, CD86, ICOS, ICOS 리간드(B7RP1), 및 CD28을 발현하도록 조작될 수 있다. 추가로, 면역자극성 박테리아는 항원 제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 완전 또는 부분(세포에서 발현될 때 적절한 배향을 보장하기 위해 완전, 또는 절두된, 또는 변형됨) 세포질 도메인 결실을 갖는 절두된 공동자극성 분자(예를 들어, 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1, OX40L)를 인코딩하고 발현할 수 있다. 완전 결실을 포함하여 절두된 세포질 도메인을 갖는 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포로의 항시적 면역자극성 신호전달을 나타내고, 절두된 또는 결실된(또는 다르게는 본원에 기재된 바와 같이 변형된) 세포질 도메인으로 인해 APC로의 역조절 신호를 할 수 없는 것으로 제시된다. 절두는 신호전달을 제공하고, 변형된 공동자극성 분자의 경우 APC로의 역조절 신호를 할 수 없기에 충분하다. 본원에 기재된 바와 같이 공동자극성 분자의 세포질 도메인의 완전 또는 부분 결실은 면역억제성 리버스 신호전달 없이 공동자극성 분자의 활성화를 강화시킨다. 세포질 도메인의 부분 결실(또는 절두)은 공동자극성 분자의 발현, 또는 발현된 공동자극성 분자의 배향에 영향을 미치지 않으면서 이러한 효과를 달성하기에 충분한 결실이다.
공동자극성 분자는 또한, 삽입, 결실, 및/또는 대체를 포함하여 세포질 도메인 내 아미노산에 대한 변형에 의해 면역억제성 세포내/리버스 신호전달을 무효화하거나 감소시키도록 변형될 수 있다. 특히, 공동자극성 분자는 세포질 도메인 인산화 부위의 변형, 예컨대 대체에 의해 변형된다. 예를 들어, 인간 4-1BBL에 대해서와 같이 적절한 좌위 또는 좌위들에서 하나 이상의 Ser 잔기, Ser5 및 Ser8을, 리버스 신호전달을 감소시키거나 무효화하는 잔기로 대체한다.
본원에서 면역자극성 박테리아는 또한 항종양 면역 반응을 증강시키기 위해 공동자극성 분자(예를 들어, 4-1BBL)에 대한 작용제 항체를 발현하도록 조작될 수 있다.
TNF 수용체 슈퍼계열
리간드의 TNF 수퍼계열(TNFSF) 및 이의 수용체(TNFRSF)는 종양 및 면역 이펙터 세포의 증식, 분화, 활성화 및 생존에 관여한다. 이 계열의 구성원에는 세포자멸사를 유도하는 CD30, Fas-L, TRAIL-R 및 TNF-R과 B 및 T-세포 면역 반응을 조절하는 CD27, OX40L, CD40L, GITR-L 및 4-1BBL이 있다. 다른 구성원으로는 헤르페스바이러스 진입 매개체(HVEM)가 있다. 본원에서 면역자극성 박테리아에 의한 TNFSF 및 TNFRSF의 발현은 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 뮤린 종양에서 4-1BBL의 발현은 면역원성을 향상시키고 OX40L의 발현이 증가된 수지상 세포(DC)의 종양내 주사는 뮤린 모델에서 종양 거부를 초래할 수 있는 것으로 나타났다. 연구에 따르면, 재조합 GITR을 발현하는 아데노바이러스를 B16 흑색종 세포에 주사하면 T-세포 침윤이 촉진되고 종양 부피가 감소한다. 4-1BB, OX40 및 GITR과 같은 분자에 대한 자극 항체는 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩되어 면역계를 자극할 수도 있다. 예를 들어, 작용성 항-4-1BB 단일클론 항체는 항종양 CTL 반응을 향상시키는 것으로 나타났으며, 작용성 항-OX40 항체는 이식 가능한 종양 모델에서 항종양 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 작용성 항-GITR 항체는 항종양 반응 및 면역을 향상시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; 및 Peggs et al. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157:9-19).
CD40 및 CD40L
TNF 수용체 슈퍼계열의 구성원인 CD40은 APC와 B 세포에 의해 발현되는 반면, 이의 리간드인 CD40L(CD154)은 활성화된 T-세포에 의해 발현된다. CD40과 CD40L 사이의 상호작용은 B 세포를 자극하여 사이토카인을 생성하여 T-세포 활성화와 종양 세포 사멸을 초래한다. 연구에 따르면 항종양 면역 반응은 T-세포의 CD40L 또는 수지상 세포의 CD40 발현 감소로 인해 손상된다. CD40은 여포성 림프종, 버킷 림프종, 림프구성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병과 같은 여러 B 세포 종양의 표면에서 발현되며, CD40L과의 상호작용은 B7-1/CD80, B7-2/CD86 및 CD40+ 종양 세포에서 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 II 분자의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 항원 제시 능력을 증강시키는 것으로 나타났다. 다발성 골수종의 뮤린 모델에서 CD40L의 이식유전자 발현은 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 유도, 국소 및 전신 항종양 면역 반응 및 종양 성장 감소를 초래하였다. 항-CD40 작용제 항체는 또한 항-종양 T-세포 반응을 유도하였다(예를 들어, Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207; 및 Murugaiyan et al. (2007) J. Immunol. 178:2047-2055).
4-1BB 및 4-1BBL
4-1BB(CD137)는 T-세포와 NK 세포에 의해 주로 발현되는 유도성 공동자극 수용체이며; DC, B 세포 및 단핵구를 포함한 APC에서 발현되는 리간드 4-1BBL에 결합하여 면역 세포 증식 및 활성화를 유발한다. 4-1BB는 활성화된 T-세포의 더 길고 광범위한 반응을 초래한다. 항-4-1BB 작용제 및 4-1BBL 융합 단백질은 CD4+ Th1 및 종양-특이적 CTL 활성에 의해 매개되는 육종 및 비만세포종 종양에 대한 면역-매개 항종양 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; 및 Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39). 4-1BBL은 세포질 신호전달 도메인에 의해 부정적으로 조절된다. T-세포에 대한 대식세포 상의 4-1BBL 리게이션의 후기 단계에서, 4-1BBL 세포질 도메인의 역 신호전달은 4-1BBL의 표면 전위를 유도하여 TLR4와 신호전달 복합체를 형성하도록 결합한다. 이는 TLR4의 LPS 활성화에 필적하는 높은 수준의 TNF-α를 유도하여 적응 면역 반응의 면역억제를 유도한다(예를 들어, Ma 등 (2013) Sci. Signaling 295(6):1-11 참조). 본원에 기재된 바와 같이 4-1BBL의 세포질 도메인의 결실은 면역억제 역방향 신호전달 없이 4-1BBL의 활성화를 강화한다.
OX40 및 OX40L
OX40(CD134)은 활성화된 이펙터 T-세포에서 발현되는 TNF 수용체 슈퍼계열의 구성원이며, 그 리간드인 OX40L은 TLR 작용제 및 CD40-CD40L 신호전달에 의한 활성화 후 DC, B 세포 및 대식세포를 포함한 APC에서 발현된다. OX40-OX40L 신호전달은 T-세포의 활성화, 강화, 증식 및 생존, 뿐만 아니라 NK 세포 기능의 조절 및 Treg의 억제 활성의 억제를 초래한다. OX40을 통한 신호전달은 또한 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-5 및 IFN-γ)의 분비를 일으켜 Th1 및 Th2 세포 반응을 촉진한다. 종양 침윤 림프구(TIL)에 의한 종양 항원의 인식은 개선된 예후와 상관관계가 있는 TIL에 의한 OX40의 발현을 증가시킨다. 연구에 따르면 항-OX40 작용제 항체 또는 Fc-OX40L 융합 단백질로 치료하면 흑색종, 육종, 결장암 및 유방암의 쥐 모델에서 종양-특이적 CD4+ T-세포 반응이 향상되고 생존이 증가하는 반면, Fc-OX40L은 종양 세포 백신에 통합되어 유방암 세포에 대한 후속 공격으로부터 마우스를 보호하였다(예를 들어, Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; 및 Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39).
B7-CD28 계열
CD28은 항원 제시 세포에서 발현되는 공동자극성 분자인 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)에 대한 수용체로 작용하는 T-세포 표면에서 발현되는 공동자극성 분자이다. CD28-B7 신호전달은 T-세포 활성화 및 생존, 그리고 T-세포 무산소증의 예방에 필요하며 결과적으로 IL-6과 같은 인터루킨의 생성을 초래한다.
최적의 T-세포 프라이밍에는 (1) MHC 제시 항원의 T-세포 수용체(TCR) 인식 및 (2) T-세포 CD28과 APC에서 발현되는 B7-1(CD80) 또는 B7-2(CD86)의 연결로 인한 공동자극 신호의 두 가지 신호가 필요하다. T-세포 활성화 후, CTLA-4 수용체가 유도되어 B7-1 및 B7-2 리간드에 대한 결합에 대해 CD28을 능가한다. 종양 세포에 의한 항원 제시는 B7-1/CD80 및 B7-2/CD86과 같은 공동자극성 분자의 발현 부족으로 인해 불량하여 T-세포 수용체 복합체를 활성화하지 못하게 한다. 결과적으로 종양 세포 표면에서 이러한 분자의 상향 조절은 면역원성을 향상시킬 수 있다. 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 면역요법은 예를 들어 B7의 종양 세포 발현 또는 가용성 B7-면역글로불린 융합 단백질을 통해 B7에 의해 성공적으로 유도되었다. ICAM-3 및 LFA-3과 같은 다른 공동자극 리간드와 조합된 B7의 바이러스-매개 종양 발현은 만성 림프구성 백혈병 및 전이성 흑색종의 치료를 위한 전임상 및 임상 시험에서 성공적이었다. 또한, 가용성 B7 융합 단백질은 단일 작용제 면역요법으로서 고형 종양의 면역요법에서 유망한 결과를 입증하였다(예를 들어, Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; 및 Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207).
2. 면역 반응 및/또는 유형 I IFN을 자극시키는 항시적 활성 단백질, 비-인간 STING 단백질, STING 키메라, 및 변형된 형태
유형 I 인터페론(IFN, 인터페론 유형 1이라고도 함)은 IFN-α 및 IFN-β를 포함하며 항바이러스, 항종양 및 면역조절 활성을 갖는 다면성 사이토카인이다. IFN-β는 대부분의 세포 유형에서 생성되며; IFN-α는 주로 조혈 세포, 특히 형질세포양 수지상 세포에 의해 생성된다. 유형 I IFN은 패턴 인식 수용체(PRR)에 의한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)의 감지 후에 생성된다. 이는 병원체, 주로 바이러스에 대한 내재성 면역 반응에 관여하며, 항원 제시를 촉진하고, 수지상 세포(DC) 성숙을 매개하고, 세포독성 T 림프구(CTL), 자연 살해(NK) 세포 및 대식세포를 활성화하고, 고친화도 항원 특이적 T-세포 및 B 세포 반응 및 면역학적 기억의 발달을 촉진함으로써 적응 면역력계를 활성화시킨다.
유형 I IFN은 종양에 대한 항증식 및 세포자멸사 효과를 나타내고 종양 신생혈관에 대한 항혈관신생 효과를 갖는다. 이는 종양 세포 표면에서 MHC 부류 I 분자의 발현을 유도하고, 종양 세포의 면역원성을 증가시키고, 종양 세포에 대한 세포독성을 활성화한다. 유형 I IFN은 암 및 바이러스 감염의 치료를 위한 치료제로 사용되었다. 예를 들어, IFN-α(상표 Intron®/Roferon®-A로 판매됨)는 모세포 백혈병, 악성 흑색종, AIDS 관련 카포시 육종 및 여포성 비호지킨 림프종의 치료용으로 승인되고; 이는 또한 만성 골수성 백혈병(CML), 신세포 암종, 신경내분비 종양, 다발성 골수종, 비여포성 비호지킨 림프종, 데스모이드 종양 및 피부 T-세포 림프종의 치료에도 사용되지만 전신 면역독성으로 인해 사용이 제한된다(예를 들어, Ivashkiv and Donlin (2014) Nat. Rev. Immunol. 14(1):36-49; Kalliolias and Ivashkiv (2010) Arthritis Research & Therapy 12(Suppl 1):S1; 및 Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893).
종양 및 종양 미세환경에서 유형 I 인터페론의 발현은 본원의 면역자극성 박테리아가 유발하도록 설계된 면역 반응 중 하나이다. 유형 I 인터페론을 유도하거나 유발하는 것은 암 치료를 위한 항종양 면역력을 제공한다.
a. 항시적 STING 발현 및 기능-획득 돌연변이
유형 I IFN, 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 유도는 바이러스 병원체에 의한 감염을 예방하거나 억제하는 면역 반응을 시작하는 데 필요하다. 이 반응은 또한 항종양제로도 효과적일 수 있다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질 중에는 면역 반응 조절제의 과잉 생산과 관련된 다양한 질환 또는 장애를 가진 개체에서 발생하는 단백질이 있다. 예를 들어, 유형 I IFN 및 전염증성 사이토카인의 과잉 생산 또는 과도한 생산, 또는 음성 조절 결함은 염증 및 자가면역 질환과 같은 바람직하지 않은 영향을 초래할 수 있다. 일반적으로 만성 유형 I IFN의 과잉 생산을 포함하는 장애는 인터페론병증이라고 한다(예를 들어, Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118; 및 Konno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123 참조). 유형 I 인터페론병증과 관련된 장애 및 임상 표현형에는 아이카르디-구티에르 증후군(AGS), STING-연관된 유아기 발병 혈관병증(SAVI), 싱글레톤-마르텐 증후군(SMS: Singleton-Merten syndrome), 비정형 SMS, 가족성 소인 루푸스(FCL), 전신성 루푸스 홍반(SLE), 양측 선조체 괴사(BSN), 뇌혈관 질환(CVD), 유전성 염색체이상증(DSH), 경직 마비(SP), X-연관 망상 색소 장애(XLPDR), 프로테아좀-연관 자가염증 증후군(PRAAS), 두개내 석회화(ICC), 마이코박테리아 질환에 대한 멘델식 감수성(MSMD), 및 척추연골이형성증(SPENCD)이 포함된다(예를 들어, Rodero 등 (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527.-2538 참조) 이러한 표현형은 유형 I IFN의 유도에 관여하는 생성물의 항시적 활성을 유도하는 유전자의 돌연변이를 포함하는 특정 유전자형과 관련이 있다.
인터페론 신호전달의 지속적인 활성화는 1) 세포질 DNA 증가로 이어지는 기능 상실 돌연변이(예를 들어, TREX1 및 SAMHD1의 돌연변이) 또는 세포질 RNA/DNA 하이브리드 증가(예를 들어, RNASEH2A, RNASEH2B의 돌연변이, RNASEH2C 및 POLA1); 2) RNA 편집의 결함 및 세포질 내 자가 핵산 RNA 종의 비정상적인 감지를 초래하는 기능 상실 돌연변이(예를 들어, ADAR1의 돌연변이); 3) 세포질 IFN 신호전달 경로의 항시적 활성화를 유도하는 기능-획득 돌연변이/세포질 핵산 리간드에 대한 민감도 증가(예를 들어, RIG-I, MDA5 및 STING의 돌연변이); 4) 펼친 단백질 반응의 장애로 인한 MAVS를 통한 비정상적인 RNA 신호전달로 이어지는 기능 상실 돌연변이(예를 들어, SKIV2L의 돌연변이); 5) IFN 수용체(IFNAR1/2) 신호전달 제한을 담당하는 분자의 기능 상실 돌연변이로 인해 조절되지 않는 IFN-자극 유전자(ISG) 생산(예를 들어, USP18 및 ISG15의 돌연변이); 6) 미지의 기전을 통해 증가된 IFN 신호전달을 유발하는 프로테아좀 기능장애(예를 들어, PSMA3, PSMB4 및 PSMB8의 돌연변이); 및 7) TRAP/ACP5 및 C1q의 기능 상실 돌연변이로 인한 것일 수 있으며, 여기서 유형 I IFN 신호전달을 유도하는 기전은 여전히 불분명한다(예를 들어, Rodero 등 (2016) J. Exp. Med. 213(12) 참조: 2527-2538).
여기서 흥미로운 것은 기능-획득(GOF)을 유도하는 돌연변이이다. STING, MDA5 및 RIG-I에는 인코딩된 단백질의 항시적 활성화 및/또는 향상된 감도 또는 증가된 친화도 또는 내인성 리간드에 대한 결합과 관련된 알려진 돌연변이가 있다. 예를 들어, STING의 GOF 돌연변이는 SAVI 및 FCL에 연결되며; MDA5의 GOF 돌연변이는 AGS 및 SMS와 연결되고; RIG-I의 GOF 돌연변이는 비정형 SMS와 연결된다.
TMEM173 STING 대립유전자
인터페론 유전자 자극제(STING)는 약 7 kb 길이의 유전자인 막횡단 단백질 173(TMEM173) 유전자에 의해 인코딩된다. 인간 TMEM173 유전자는 대립유전자의 상당한 이질성과 집단 계층화를 특징으로 한다. 가장 일반적인 인간 TMEM173 대립유전자는 R232로 지칭된다(잔기 232에 존재하는 아미노산 참조; 예를 들어, 다양한 인간 TMEM173 대립유전자의 서열을 제시하는 SEQ ID NO: 305-309 참조). 미국 인구의 절반 이상이 R232/R232가 아니다. 제2의 가장 흔한 대립 유전자는 R71H-G230A-R293Q (HAQ)이다. 다른 일반적인 대립 유전자에는 AQ (G230A-R293Q), Q (Q293) 및 R232H(Glen Barber가 데이터베이스에서 처음으로 식별하고 분류한 참조 STING 대립 유전자의 이름을 따서 REF로 명명됨)가 포함된다.
R232/R232는 유럽인에서 가장 흔한 유전자형이고 HAQ/R232는 동아시아인에서 가장 흔한 유전자형이다. 아프리카인은 HAQ/HAQ 유전자형이 없지만 Q 대립유전자가 있으며 아프리카인의 약 4%는 AQ/AQ이며 다른 민족 집단에는 없다(예를 들어, Patel and Jin (2018) Genes & Immunity, doi:10.1038/s41435-018-0029-9). REF, AQ 및 Q 대립유전자는 3'3' c-디-GMP와 같은 박테리아 유래 CDN에 대해 매우 성불응이다(예를 들어, Corrales 등 (2015) Cell Reports 11:1018-1030 참조).
STING 기능-획득 돌연변이
STING의 유전자인 TMEM173의 여러 활성화 또는 기능-획득(GOF) 돌연변이는 유전되고 새로운 것으로, 희귀 자가염증성 질환인 SAVI(STING 관련 혈관병 및 유아기 발병)와 관련이 있다. SAVI는 상염색체 우성 질환이며 전신 염증, 간질성 폐 질환, 피부 혈관염 및 재발성 박테리아 감염이 특징이다. 새로운 TMEM173 돌연변이가 있는 SAVI는 일반적으로 조기 발병(< 8주) 및 심각한 표현형을 특징으로 하는 반면, 가족 돌연변이는 늦게 발병(10대에서 성인) 및 경미한 임상 증상을 초래한다. 유전된 TMEM173 활성화 돌연변이에는 G166E 및 V155M이 포함되는 반면, 새로운 돌연변이에는 N154S, V155M, V147M, V147L, C206Y, R284G, R281Q 및 S102P/F279L이 포함된다(예를 들어, Patel and Jin (2019) Genes & Immunity 20:82-89). 식별된 다른 활성화 TMEM173 돌연변이는 R284M, R284K, R284T, E316Q, 및 R375A를 포함한다(예를 들어, 미국 출원 공개 번호 2018/0311343 참조). TMEM173의 또 다른 기능-획득 돌연변이는 R284S로, 이는 매우 항시적으로 활성인 STING을 유발하고, 활성화 CDN이 없을 때 내재성 면역 신호를 유발하여 전염증성 사이토카인의 만성 생성을 유발하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, Konno 등 (2018) Cell Reports 23:1112 1123 참조).
N154S, V155M 및 V147L과 같은 TMEM173 돌연변이, 및/또는 아래 표에 나열된 돌연변이 중 하나는 단독으로 또는 이러한 및 N154S/R284G와 같은 다른 이러한 돌연변이와 조합하여 발생하여, 항시적으로 활성이고 리간드 자극을 필요로 하지 않거나 과민하여 STING-인터페론 경로의 만성 활성화를 유도하는 기능 획득 STING을 초래한다. 이는 입증되었다(예를 들어, Liu 등 (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518 참조). 돌연변이된 TMEM173(교체 V147L, N154S, V155M 및 기능 상실 돌연변이 V155R 각각 포함) 및 돌연변이되지 않은 TMEM173의 작제물을 STING 음성 HEK293T-세포에 형질주입시키고 STING 리간드 cGAMP로 자극하였다. N154S, V155M 및 V147L 돌연변이로 형질주입된 세포는 고도로 상승된 IFNB1(IFN-β를 인코딩하는 유전자) 리포터 활성을 나타내었으며, 이는 STING 리간드 cGAMP로의 자극에 의해 유의하게 부스트되지 않았다. 기능 상실 돌연변이(V155R), 돌연변이되지 않은 TMEM173 또는 대조군 플라스미드로 형질주입된 세포는 유의한 기준선 활성화가 없었다. cGAMP를 사용한 자극은 돌연변이되지 않은 TMEM173이 있는 세포에서 용량 의존적 방식으로 반응을 일으켰고, 기능 상실 돌연변이를 발현하는 세포에서 가장 높은 cGAMP 농도에서만 최소 반응을 나타내었다(예를 들어, Liu 등 (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518). 이러한 결과는 활성화된 TMEM173 돌연변이가 cGAMP에 의한 자극이 없는 경우에도 STING의 항시적 활성화를 초래한다는 것을 보여준다.
G207E는 탈모증, 광과민성, 갑상선 기능 장애 및 SAVI 기능을 유발하는 또 다른 기능-획득 STING 돌연변이이다. G207E 돌연변이는 HEK 세포에서 염증 관련 경로의 항시적 활성화뿐만 아니라 환자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 비정상적인 인터페론 신호 및 인플라마솜 활성화를 유발한다. R232 또는 H232 대립유전자 및 GOF 돌연변이 G207E가 있는 STING 변이체를 사용하여 CDN으로 자극한 후 R232 + G207E 변이체가 IFN-β 및 STAT1/2 경로에서 활성이 약간 증가하는 반면 H232에서는 + G207E 변이체, IFN-β 수준은 일정하게 유지되었고 STAT1/2는 감소된 활성을 나타내었다. 두 변이체 모두 자극 후 유사한 STAT3 및 NF-κB 경로 활성화를 보여주었다. 이러한 결과는 위치 232의 잔기 R이 cGAMP 결합 및 IFN 유도에 중요함을 보여주고, G207E 돌연변이가 STING 신호전달 경로의 항시적 활성화 및 NF-κB 경로의 리간드-의존적 과활성화를 초래한다는 것을 보여준다. R232 대립유전자와 G207E 돌연변이를 가진 환자는 더 심각한 질환을 가지고 있었다. 이 다형성은 돌연변이 STING의 항시적 활성화를 강화하여 IFN, IL1-β 및 IL-18과 같은 다운스트림 표적의 과발현을 유도한다(예를 들어, doi.org/10.1101/394353에서 제공되는 Keskitalo 등 (2018) 참조).
뮤린 STING(SEQ ID NO: 369)의 67개 아미노산이 환식 디-GMP(c-디-GMP) 결합 및/또는 IFN 유도에 관련된 아미노산을 식별하기 위해 개별적으로 또는 군으로 돌연변이되었다(Burdette 등 (2011) Nature 478(7370):515-518 참조). 식별된 돌연변이 중에는 낮은 수준의 형질주입에서 자발적으로 IFN을 유도하고 c-디-GMP에 반응하지 않는 과활성 돌연변이체 R196A/D204A, S271A/Q272A, R309A/E315A, E315A, E315N, E315Q 및 S271A(R197A/D205A, EA16, EA16, EA16, S232A/Q27에 상응하고, 각각 SEQ ID NO: 305-309에 기재된 인간 STING의 서열과 관련됨), 및 과발현되었을 때 IFN을 유도하였으나 c-디-GMP에 반응하지 않은 돌연변이체 R374A, R292A/T293A/E295A/E299A, D230A, R231A, K235A, Q272A, S357A/E359A/S365A, D230A/R231A/K235A/R237A, 및 R237A(R375A, R293A/T294A/E296A(인간 STING의 E299에 대한 등가물이 존재하지 않음), D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, 및R238A, 각각 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 인간 STING를 참조로 함)였다. 이 대립유전자는 여전히 내인성 CDN 2'3' c-디-GAMP에 반응할 수 있는데, 나중에 일부 인간 STING 돌연변이가 c-디-GMP와 같이 박테리아에 의해 생성된 3'3' CDN에 대해 낮은 친화도를 갖는다는 것이 발견되었기 때문이다(예를 들어, Corrales 등 (2015) Cell Reports 11:1018-1030 참조).
기능-획득 돌연변이를 갖는 이러한 단백질을 인코딩하는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 유형 I IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 증가시키기 위해 이러한 단백질의 항시적 활성화를 이용한다. 기능-획득 돌연변이와 함께 STING, IRF3, IRF5, IRF7, MDA5, 및/또는 RIG-1을 인코딩하는 종양-표적화 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경에서 유형 I IFN-매개 사이토카인 및 케모카인 생성을 증가시켜 항종양 면역 반응을 강화하고 면역자극성 박테리아의 치료 효능을 향상시킨다. STING을 인코딩하는 유전자는 TMEM173으로 지칭되고, MDA5를 인코딩하는 유전자는 IFIH1이고, RIG-I를 인코딩하는 유전자는 DDX58이다. 각각의 유전자에 대해 수많은 대립 유전자가 있으며, 대립 유전자가 있는 유전자에서 발생할 수 있는 알려진 돌연변이로 인해 기능-획득 또는 항시적 활성화가 발생한다. 아래 나열된 돌연변이는 단독으로 발생할 수도 있고 조합하여 사용할 수도 있다. 기능-획득을 초래하는 다른 돌연변이는 일상적인 스크리닝/돌연변이 프로토콜에 의해 식별될 수 있다. 하기 표는 STING/TMEM173(SEQ ID NO: 305-309), MDA5/IFIH1(SEQ ID NO: 310), RIG-I/DDX58(SEQ ID NO: 311), IRF3(SEQ ID NO: 312), 및 IRF7(SEQ ID NO: 313) 각각에서 예시적인 기능-획득 돌연변이를 나열한다. STING의 S324/L325/S326 → S324A/L325/S326A와 같은 인산화 부위의 결실 또는 교체와 같은 다른 돌연변이, 및 STING에서 핵인자-κB(NF -κB), 또는 이러한 신호전달을 이용하는 다른 단백질의 신호전달을 감소시키기 위해 인산화 부위를 제거하기 위한 다른 대체가 또한 도입될 수 있다.
생성된 단백질은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 인코딩될 수 있다. 단백질은 면역자극성 박테리아의 플라스미드에 인코딩된다.
야생형 STING을 인코딩하는 핵산을 투여하면 면역 반응을 유도할 수 있으며; 종양-표적화된 면역자극성 박테리아에 본원에 제공된 바와 같은 항시적 활성을 갖는 기능-획득 STING 돌연변이체의 투여는 보다 강력한 면역 반응 및 보다 효과적인 항암 치료제를 유도한다. 항시적으로 활성인 STING의 종양 표적 투여, 또는 본원에 제공된 바와 같은 MDA5, RIG-I, IRF3 또는 IRF7의 기능-획득 돌연변이체와 같은 다른 변형된 DNA/RNA 센서에 의한 강화된 면역 반응은 치료적으로 더 효과적인 항암 치료를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 면역자극성 박테리아가 상피 세포를 감염시키지 않지만 종양-체류 면역 세포를 포함하는 식세포를 감염시키는 능력을 유지하도록 면역자극성 박테리아를 변형하는 것은 면역자극성 박테리아를 종양 미세환경에 효과적으로 표적화하여 치료 효율을 개선하고, 바람직하지 않은 전신 면역 반응을 방지한다. 이러한 종양 표적 박테리아는 기능-획득 STING, MDA5, RIG-I, IRF3 또는 IRF7 돌연변이를 인코딩하도록 조작되었으며, 이는 예를 들어 리간드 자극이 없는 경우에도 항시적으로 활성이며, 이로써, 종양 미세환경에서 항암 면역 반응을 개선하기 위한 강력한 유형 I IFN 반응을 제공한다. .
따라서, 예를 들어, 항시적으로 활성화된 STING의 투여는 암의 면역요법적 치료를 위한 STING 신호전달을 증가시키는 대안적인 수단을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 종양-표적화 면역자극성 박테리아는 S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, R197A, D205A, R197A/D205A, C206Y, G207E, D231A, R232A, K236A, R238A, D231A/R232A/K236A/R238A, S272A, Q273A, S272A/Q273A, F279L, S102P/F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R293A, T294A, E296A, R293A/T294A/E296A, R310A, E316A, E316N, E316Q, R310A/E316A, S324A/S326A, S358A, E360A, S366A, S358A/E360A/S366A, 및 R375A로부터 선택되는 기능 획득 돌연변이, 뿐만 아니라 이의 보존적 돌연변이를 갖는 STING/TMEM173(SEQ ID NO: 305-309)을 인코딩하도록 변형될 수 있다. 이에 더하여, STING 기능-획득 돌연변이, 예컨대 N154S/R284G의 조합은 단일 돌연변이 대응물과 비교하여 STING 신호전달을 유의하게 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 STING의 항시적 활성을 초래한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQ ID NO: 305-309로 표시된 바와 같이 인간 STING에 기재된 임의의 서열을 참조로, 아미노산 잔기 R197, D205, R310, R293, T294, E296, S272, Q273, E316, D231, R232, K236, S358, E360, S366 및 R238은 SEQ ID NO: 369로 표시된 바와 같이 뮤린 STING을 참조로 아미노산 잔기 R196, D204, R309, R292, T293, E295, S271, Q272, E315, D230, R231, K235, S357, E359, S365, 및 R237에 상응한다. 또한 각각의 대체물의 보존적 치환이 포함된다(각 아미노산에 대한 예시적인 보존적 돌연변이를 나열하는 정의 섹션의 표 참조).
b. 항시적 IRF3 발현 및 기능-획득 돌연변이
IRF3(인터페론 조절 인자 3, 또는 IRF-3) 및 IRF7(또는 IRF-7)은 유형 I IFN 유전자의 주요 활성제이다. 바이러스 유도 C-말단 인산화(TBK1에 의한) 후, 활성화된 IRF3 및 IRF7은 동종이량체를 형성하고, 세포질에서 핵으로 전위되고, IFN 자극 반응 요소(ISRE)에 결합하여 유형 I IFN 반응을 유도한다. IRF3는 자극되지 않은 세포에서 항시적으로 발현되어 불활성 세포질 형태로 존재하는 반면, IRF7은 세포에서 항시적으로 발현되지 않고 IFN, 지질다당류 및 바이러스 감염에 의해 유도된다. IRF3의 과발현은 유형 I IFN 유전자의 바이러스-매개 발현을 상당히 증가시켜 항바이러스 상태를 유도한다. IRF3 활성화는 또한 바이러스 감염 후 CC-케모카인 RANTES(CCL5)의 전사를 상향 조절하는 것으로 나타났다(예를 들어, Lin 등 (1999) Mol. Cell Biol. 19(4):2465-2474 참조).
IRF3의 C-말단 도메인에 있는 잔기 S385, S386, S396, S398, S402, T404 및 S405는 바이러스 감염 후 인산화되어 IRF3의 활성화를 초래하는 구조적 변화를 유도한다. IRF3 활성화는 바이러스 감염뿐만 아니라 지질다당류(LPS) 및 폴리(I:C)에 의해 유도된다. IRF3의 C-말단 클러스터에서 인산화될 수 있는 7개 잔기 중 단일 점 돌연변이인 S396D는 항시적으로 활성인 형태의 IRF3 생성에 충분하다. IRF3(S396D)는 야생형 IRF3와 비교하여 IFNα1, IFN-β 및 RANTES 프로모터의 트랜스활성화(transactivation)를 각각 13배, 14배 및 11배 향상시킨다. 또 다른 돌연변이체 IRF3(S396D/S398D)는 야생형 IRF3와 비교하여 IFNα1, IFN-β 및 RANTES 프로모터의 트랜스활성화를 각각 13배, 12배, 12배 향상시킨다. IRF3의 또 다른 구성 활성 돌연변이체는 IRF3(5D)이며, 여기서 396, 398, 402, 404 및 405 위치의 세린 또는 트레오닌 잔기가 포스포모방 아스파르트산 잔기로 대체된다(IRF3(S396D/S398D/S402D/T404D/S405D). 유형 I 인터페론 유도와 같은 면역 반응 매개체의 항시적 활성으로 이어지는 유사한 기능-획득 돌연변이는 면역 반응 신호전달 경로에 있는 RIG-I, MDA5 및 STING과 같은 다른 단백질에서 세린 잔기를 포스포모방체 아스파르트산으로 돌연변이시켜 달성할 수 있다.
IRF3(5D)는 항시적 DNA 결합 및 트랜스활성화 활성, 이량체 형성, 전사 보조 활성화제 p300(EP300 또는 E1A 결합 단백질 p300이라고도 함)/CBP(CREB 결합 단백질 또는 CREBBP라고도 함) 및 핵 위치와의 연관성을 표시한다. 이의 트랜스활성화 활성은 바이러스 감염에 의해 더 이상 유도되지 않는다. IRF3(5D)는 IFN-β 및 ISG-15 유전자 발현의 매우 강력한 활성제이며; IRF3(5D) 단독은 바이러스 감염만큼 강력하게 IFN-β 발현을 자극하고, 야생형 IRF3와 비교하여 IFNα1, IFN-β 및 RANTES 프로모터의 트랜스활성화를 각각 9배, 5.5배 및 8배 향상시킨다(예를 들어, Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327; Lin et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18(5):2986-2996; 및 Servant et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9441-9447). 위치 S385, S386, S396, S398, S402, T404 및 S405 중 임의의 것은 단독으로 또는 조합하여 돌연변이되어 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 항시적으로 활성인 IRF3 돌연변이체를 생성할 수 있다.
c. 증가된 또는 항시적 활성을 갖는 비-인간 STING 단백질과 이의 변이체, 및 증가된 또는 항시적 활성을 갖는 STING 키메라와 이의 변이체
위에서 논의한 바와 같이, 세포질 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 전사 인자 인터페론 조절 인자 3을 활성화하는 소포체(ER)-상주 어댑터 단백질 STING(IFN 유전자 자극제)을 통해 유형 I 인터페론(IFN) 생성을 자극한다(IRF3). TANK 결합 키나제 1(TBK1)/IRF3 축은 유형 I IFN의 유도, 수지상 세포(DC)의 활성화 및 CD8+ T-세포-매개 항종양 면역력을 활성화하기 위한 종양 항원의 교차 제시를 초래한다. STING 신호전달은 또한 활성화된 B 세포(NF-κB) 신호전달 축의 핵인자 카파-경쇄 증강 인자를 활성화시켜 염증유발 반응을 일으키지만 항종양 면역력에 필요한 DC 및 CD8+ T-세포의 활성화에는 영향을 미치지 않는다.
2'3' cGAMP를 인식하면 STING은 골지체를 통해 소포체에서 전위되어 TANK 결합 키나제 1(TBK1)의 모집과 전사 인자 IRF3 및 NF-κB의 활성화를 허용한다. STING의 카르복실 말단 테일(C 말단 테일 또는 CTT) 영역은 TBK1을 활성화하고 IRF3의 인산화를 자극하는 데 필요하고 충분하며; 또한 NF-κB 신호전달에도 관여한다. CTT는 STING 인산화 및 IRF3 모집에 필요한 서열 모티프를 포함하는 약 40개 아미노산의 구조화되지 않은 스트레치이다. IRF3 및 NF-κB 다운스트림 신호전달은 척추동물 종 사이에서 보존되는 STING의 C-말단 테일(CTT) 내의 특정 서열 모티프에 기인한다. IRF3-, TBK1- 및 TRAF6-결합 모듈을 포함하는 CTT의 모듈 모티프는 세포 신호 및 면역 반응의 강도와 특이성을 제어한다.
STING CTT 개별 요소의 종 및 해당 특성에 따라 IRF3 및 NF-κB 다운스트림 응답이 영향을 받을 수 있으며 때로는 반대이다. STING CTT 요소는 두 신호 경로 사이의 균형을 지시하고 미세하게 조정하여 다른 생물학적 반응을 유발한다. 예를 들어, 인간 및 마우스 면역 세포에서 STING 의존성 IRF3 활성화는 주로 유형 I 인터페론 반응을 초래한다. 인간 세포에서 STING 신호전달은 또한 TRAF6 모집을 통해 정규 및 비정규 NF-κB 경로를 통해 전염증 반응을 유도한다. 인간 STING 잔기 S366(예를 들어, SEQ ID NO: 305-309 참조)은 IRF3 결합에 필요한 CTT의 LxIS 모티프의 일부인 1차 TBK1 인산화 부위인 반면, 잔기 L374를 포함하는 제2 PxPLR 모티프는 TBK1 결합에 필요하다. LxIS 및 PxPLR 모티프는 모든 척추동물 STING 대립유전자에서 고도로 보존된다. 다른 종에서 STING 신호전달은 주로 NF-κB 신호전달 축의 활성화를 초래한다. 예를 들어, NF-κB 신호전달의 과활성화를 담당하는 제브라피쉬 CTT는 인간 및 다른 포유동물 STING 대립유전자에 존재하지 않는 극단적인 C-말단에 고도로 보존된 PxExxD 모티프가 있는 확장을 포함하며; 이 모티프는 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6(TRAF6) 결합 부위와 유사성을 공유한다. 인간 STING 신호전달에서 TRAF6의 역할은 필수적이지 않지만 TRAF6 모집은 제브라피쉬 STING 유도 NF-κB 활성화에 필수적이다. 인간 STING이 제브라피쉬 STING CTT 모듈 DPVETTDY를 포함하도록 설계된 인간-제브라피쉬 STING 키메라는 NF-κB 활성화의 100배 이상 활성화를 유도하였으며, 이는 이 영역이 향상된 NF-κB 신호 활성화를 지시하는 데 필요하고 충분함을 나타낸다. 제브라피쉬 CTT를 첨가하면 STING 인터페론 반응이 증가하였다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조).
IRF3와 NF-κB 신호전달 사이의 균형에서 종 간의 차이는 NF-κB 신호전달이 감소되고/거나 선택적으로 IRF3 신호전달이 증가된 변형된 STING 단백질을 생성하기 위해 여기서 이용되어 STING 단백질이 전달되고 발현될 때 TME에서 결과적인 반응은 변형되지 않은 STING 단백질과 비교하여 증가된 항종양/항바이러스 반응이다.
일부 구현예에서, NF-κB 신호전달 활성이 낮거나 없는 종으로부터의 STING 단백질은 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 임의의 면역자극성 박테리아를 비롯한 전달 비히클 뿐만 아니라 종양용해 벡터, 미니세포, 엑소좀, 리포솜을 포함하는 바이러스 벡터 및 세포 치료에 사용되고 박테리아 및 종양용해 벡터와 같은 비히클을 전달하는 데 사용되는 다른 전달 비히클에 제공된다.
비-인간 STING 단백질은 하기 종으로부터의 STING 단백질일 수 있으나 이로 제한되지 않는다: 태즈메이니아 데빌(사르코필루스 하리시이(Sarcophilus harrisii); SEQ ID NO: 349), 마모셋(칼리트릭스 야쿠스(Callithrix jacchus); SEQ ID NO: 359), 소(보스 타우루스(Bos taurus); SEQ ID NO: 360), 고양이(펠리스 카투스(Felis catus); SEQ ID NO: 356), 타조(스트루티오 카멜루스 오스트랄리스(Struthio camelus australis); SEQ ID NO: 361), 따오기 니포니아 니폰(Nipponia nippon); SEQ ID NO: 362), 실러캔스 라티메리아 칼룸내(Latimeria chalumnae); SEQ ID NO: 363-364), 야생돼지 수스 스크로파(Sus scrofa); SEQ ID NO: 365), 박쥐(로우세투스 애깁티아쿠스(Rousettus aegyptiacus); SEQ ID NO: 366), 바다소(트리케쿠스 마나투스 라티로스트리스(Trichechus manatus latirostris); SEQ ID NO: 367), 은상어(칼로린쿠스 밀리이(Callorhinchus milii); SEQ ID NO: 368), 및 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus); SEQ ID NO: 369). 이러한 척추동물 STING 단백질은 인간 세포에서 면역 신호전달을 쉽게 활성화시키며, 이는 STING 신호전달의 분자 기전이 척추동물에서 공유됨을 나타낸다(문헌[de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175] 참조).
다른 구현예에서, 비-인간 STING 단백질은 상기 기재된 인간 STING의 것에 상응하는 비-인간 STING의 상응하는 좌위에서 항시적 STING 활성화 및 기능-획득 돌연변이 중 임의의 것을 함유한다 (하기 실시예 17 참조, 이는 다양한 종에서 예시적인 정렬 및 상응하는 돌연변이를 제공하며, 또한 도 1-13 참조).
다른 구현예에서, STING 단백질의 키메라가 제공된다. 키메라에서, 제1 종의 STING 단백질의 NF-κB 신호전달/활성을 부여하거나 이에 참여하는 CTT 영역 또는 이의 부분(들)은 제2 종의 상응하는 CTT 또는 이의 부분(들)으로 대체되고, STING 단백질은 인간보다 낮거나 매우 적은 NF-κB 신호 활성을 갖는다. 일반적으로 제1 종은 인간이고 대체 CTT 또는 이의 일부는 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스 및 은상어와 같은 종의 STING에서 유래하며, 이는 NF-κB 활성이 훨씬 낮다. 이에 의해 항종양 활성에 중요하고 NF-κB 활성이 제한되거나 전혀 없는 유형 I 인터페론을 유도하는 STING 단백질이 생성되는데, 이는 항종양 요법에서 바람직하지 않다. 키메라는 유형 I 인터페론 활성을 항시적으로 증가시키거나 유지되게 하기 위해 상응하는 좌위에서 인간 항시적 STING 활성화 및 기능-획득 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 모든 구현예에서, TRAF6 결합 모티프는 항종양 치료제에서 바람직하지 않은 활성을 추가로 감소 또는 제거하기 위해 결실될 수 있다. 이들 비-인간 STING 단백질, 키메라 및 돌연변이체는 종양용해성 바이러스 벡터, 세포 요법에 사용되는 세포, 예를 들어 줄기 세포 및 T-세포, 엑소좀, 미니세포, 리포좀, 및 본원에 기재된 면역자극성 박테리아를 포함하여 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 것과 같은 전달 비히클에 제공되며, 이는 종양-체류 면역 세포에 축적되고 인코딩된 단백질을 종양 미세환경 및 종양에 전달한다. 비-인간 STING 단백질, 변형된 STING 단백질, 및 STING 키메라는 본원에 기재된 바와 같은 종양의 치료를 위한 치료제로서 사용하기 위한 것, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법에서의 사용을 위한 것이다. STING 단백질, 전달 비히클 및 인코딩 핵산을 함유하는 약학적 조성물도 제공된다.
d. 세포기질성 DNA/RNA 센서 및 이의 항시적 변이체로서 작용하는 다른 유전자 생성물
세포질 핵산을 감지하거나 상호작용하는 다른 유전자 생성물은 RIG-I 및 MDA5(흑색종 분화 관련 단백질 5)를 포함하는 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I) 유사 수용체(RLR)이다. RLR은 바이러스 dsRNA 및 박테리아에 의해 분비되는 핵산의 세포질 센서이며 RIG-I, MDA5 및 LGP2(유전학 및 생리학 연구소 2)를 포함한다. 바이러스 dsRNA와 같은 리간드가 결합하면 RIG-I 및 MDA5가 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자(TRAF)를 모집하는 미토콘드리아 항바이러스 신호 어댑터 단백질 또는 MAVS를 활성화하여 미토콘드리아 외막의 복합체에서 신호전달 복합체를 조립한다. 다운스트림 신호 구성요소는 TRAF에 의해 추가로 모집되어 IRF3(인터페론 조절 인자 3), IRF7, NF-κB(활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서) 및 AP-1(활성제 단백질 1)의 인산화 및 활성화를 유발한다. 그 결과, IFN, 전염증성 사이토카인, 및 병원체 제거에 관여하는 다른 유전자의 발현이 유도된다(예를 들어, Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118 참조). STING과 마찬가지로 기능-획득 돌연변이로 인한 MDA5 및 RIG-I의 항시적 활성화는 유형 I IFN의 유도를 유도하며, 이는 면역자극성 박테리아에서 항종양 면역 반응을 향상시키는 데 활용할 수 있다.
i. RIG-I
DDX58(DEXD/H-박스 헬리카제 58)로도 알려진 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I)은 항시적 활성화가 비정형 스미스-마제니스 증후군과 같은 인터페론병증의 발병과 관련이 있는 또 다른 단백질이다. MDA5/IFIH1과 같은 RIG-I는 RIG-I 유사 수용체(RLR) 계열의 구성원이며 바이러스 dsRNA의 검출에서 기능하는 925-잔기 세포질 패턴 인식 수용체이다. RIG-I는 유형 I 및 유형 III IFN 및 전염증성 사이토카인의 발현을 촉진하는 독립적인 경로를 통해 바이러스 RNA에 대한 내재성 면역 반응을 개시한다(예를 들어, 문헌[Jang 등 (2015) Am. J. Hum. Genet. 96: 266-274, Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118).
특징적인 치아 기형은 없지만 녹내장, 대동맥 석회화 및 골격 이상을 포함한 다양한 표현형을 가진 비정형 스미스-마제니스 증후군은 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I)를 인코딩하는 DEXD/H-박스 헬리카제 58 유전자(DDX58)의 돌연변이에 의해 유발되는 것으로 밝혀졌다. 특히, DDX58의 돌연변이 E373A 및 C268F는 RIG-I에서 기능-획득을 유발하는 것으로 확인되었다. 돌연변이된 DDX58의 증가된 양은 NF-κB 리포터 유전자 활성의 기본 수준의 상당한 증가와 연관되었으며, 이 활성은 dsRNA 유사체 폴리(I:C)로의 자극에 의해 추가로 증가되었다. RIG-I 돌연변이는 또한 기초 수준에서 IRF3 인산화 및 이량체화를 기저 수준에서 유도하고, 기저 세포와 폴리(I:C) 형질주입된 HEK293FT-세포 둘 다에서 IFNB1, 인터페론 자극 유전자 15(ISG15) 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5(CCL5)의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 돌연변이된 DDX58/RIG-I가 항시적 활성화를 초래하여 IFN 활성 및 IFN-자극된 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다(예를 들어, Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274; 및 Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118). 본원에 제공된 종양-표적화 면역자극성 박테리아는 E373A 및 C268F와 같은, 그러나 이로 제한되지 않는 기능-획득 돌연변이를 단독으로 또는 조합으로 갖는 RIG-I/DDX58(예를 들어, SEQ ID NO: 311 참조)을 인코딩하도록 변형될 수 있다.
ii. MDA5/IFIH1
또 다른 인터페론병증 유전자는 세포질 DExD/H 박스 RNA 수용체의 RIG-I 유사 계열의 구성원인 흑색종 분화 관련 단백질 5(MDA5)라고도 하는 헬리카제 C 도메인 함유 단백질 1(IFIH1)로 IFN 유도된다. IFIH1에 의해 인코딩된 MDA5는 1,025개 아미노산의 세포질 패턴 인식 수용체로서, 세포질에서 바이러스 이중 가닥 RNA(dsRNA)와 분비된 박테리아 핵산을 감지하고 어댑터 분자인 MAVS(미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질)를 통해 유형 I IFN 신호전달을 활성화한다. MAVS는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자(TRAF)를 모집하고, 이는 차례로 다운스트림 신호전달 구성요소를 모집하여 IRF3(인터페론 조절 인자 3), IRF7, NF-κB(활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-증강제), 및 AP-1(활성화제 단백질 1)의 인산화 및 활성화를 초래한다. 이는 IFN, 전염증성 사이토카인 및 병원체 제거에 관여하는 다른 유전자의 발현을 초래한다(예를 들어, Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282; Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509; 및 Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118).
기능-획득(GOF) IFIH1 변이체는 눈에 띄는 혈관 염증을 특징으로 하는 아이카르디-구티에르 증후군(AGS) 및 싱글레톤-마르텐 증후군(SMS)을 포함한 자가면역 장애가 있는 대상체에서 발생한다. AGS는 특히 뇌와 피부에 영향을 미치는 염증성 질환으로 인터페론-유도 전사체의 상향조절이 특징이다. AGS는 일반적으로 DNA 엑소뉴클레아제 TREX1, RNase H2 엔도뉴클레아제 복합체의 3개 비대립유전자 구성요소, 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 트리포스포하이드롤라제 SAMHD1, 및 이중 가닥 RNA 편집 효소 ADAR1을 인코딩하는 임의의 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. AGS가 있는 일부 환자는 이러한 유전자에 돌연변이가 없지만 IFIH1에 GOF 돌연변이가 있으며, 이는 이 유전자가 AGS에도 관련되어 있음을 나타낸다. 싱글톤-메르텐 증후군은 혈관(예를 들어, 석회화), 치아(예를 들어, 조기 발병 치주염, 치근 흡수) 및 뼈(예를 들어, 골감소증, 말단 골용해, 골다공증)의 이상을 특징으로 하는 상염색체 우성 장애이다. 인터페론 시그니처 유전자는 IFIH1의 GOF 돌연변이와 연결된 싱글톤-메르텐 증후군 환자에서 상향조절된다(예를 들어, Rice 등 (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509; 및 Rutsch 등 (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282).
야생형 IFIH1, 및 AGS 환자에서 확인된 6개의 IFIH1 GOF 돌연변이체(R720Q, R779H, R337G, R779C, G495R, D393V)의 IFN-β 리포터 자극 활성을, 낮은 수준의 내인성 바이러스 RNA 수용체를 발현하는 HEK293T-세포에서 비교하였다. 야생형 IFIH1은 긴(> 1kb) dsRNA 유사체 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(I:C))의 결합 시 유도되었지만, 짧은 162 bp dsRNA에 의해 유도되지 않았으며, 외인성 RNA의 부재 하에 최소 활성을 가졌다. IFIH1 돌연변이체는 폴리(I:C)에 대한 강력한 신호전달 외에 짧은 162 bp dsRNA에 대한 반응으로 IFN 신호전달의 상당한 유도를 나타내었다. 돌연변이체는 또한 외인성 리간드의 부재 하에 4-10배 더 높은 수준의 기준선 신호전달 활성을 나타내었다(예를 들어, Rice 등 (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509 참조).
또 다른 기능-획득 IFIH1 돌연변이인 R822Q는 유형 I IFN 생성을 유발하고 조기 동맥 석회화와 치아 염증 및 흡수를 유발하여 싱글톤-메르텐 증후군을 유발하는 것으로 확인되었다. HEK293T-세포(가장 낮은 내인성 IFIH1 발현 수준을 가짐)를 사용하여 야생형 및 R822Q MDA5를 과발현시켰다. 야생형 IFIH1 발현은 용량 의존적 방식으로 IFNB1(인터페론, 베타 1, 섬유아세포)의 발현을 증가시킨 반면, 돌연변이된 IFIH1은 약 20배 더 많은 IFNB1 발현을 유도하였다. dsRNA 유사체 폴리(I:C)로 자극한 후, R822Q IFIH1은 야생형 IFIH1보다 더 높은 수준의 IFNB1 발현을 초래하였으며, 이는 R822Q IFIH1이 비자기 dsRNA에 대해 과활성임을 나타낸다. 싱글톤-메르텐 증후군 환자의 전혈 시료에서 IFI27, IFI44L, IFIT1, ISG15, RSG15, RSAD2 및 SIGLEC1과 같은 인터페론 시그니처 유전자의 발현도 더 높았으며, 이는 R822Q IFIH1에 의해 IFNB1의 더 높은 발현 수준과 일치하였다(예를 들어, Rutsch 등 (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282 참조).
또 다른 IFIH1 GOF 돌연변이인 A489T가 있는 환자에서 관찰된 인터페론 신호는 유형 I 인터페론병증을 나타내며; IFIH1 A489T는 증가된 인터페론 생산 및 아동형 루푸스, AGS 및 SMS와 유사한 표현형과 관련이 있다(예를 들어, Bursztejn 등 (2015) Br. J. Dermatol. 173(6):1505-1513 참조). A489T 변이체는 긴 dsRNA 유사체 폴리(I:C)뿐만 아니라 짧은 dsRNA로 자극한 후 IFN 유도를 초래하였다. IFIH1에서 2개의 추가 기능-획득 돌연변이, T331I 및 T331R가 IFN-유도 전사체의 상당한 상향 조절을 나타내는 SMS 표현형 환자에서 식별되었다. T331I 및 T331R 변이체는 MDA5의 관찰된 항시적 활성화와 일치하여 외인성 dsRNA 리간드가 없는 경우에도 IFN-β의 발현을 증가시켰다(예를 들어, Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118 참조).
A946T는 유형 I IFN의 생성을 증가시켜 염증을 촉진하고 자가면역의 위험을 증가시키는 또 다른 IFIH1 GOF 돌연변이이다. IFIH1의 A946T 돌연변이는 STING의 TMEM173 R232 대립유전자 및 G207E GOF 돌연변이와 결합될 때 부가 효과를 일으켜 SAVI와 유사한 특징을 갖는 심각한 조기 발병 표현형을 초래한다(예를 들어, Keskitalo 등 (2018) preprint, doi.org/10.1101/394353에서 사용 가능). G821S는 마우스 모델에서 자발적으로 발달된 루푸스-유사 자가면역 증상을 유도하는 것으로 나타난 IFIH1의 GOF 돌연변이이며(예를 들어, Rutsch 등 (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282 참조), 한편 AGS를 가진 개체에서 확인된 IFIH1 미스센스 돌연변이 A452T, R779H 및 L372F는 유형 I 인터페론 과잉생산을 유발하는 것으로 나타났다(예를 들어, Oda et al. (2014) Am. J. Hum. Genet. 95:121-125).
본원에 제공된 종양-표적화 면역자극성 박테리아는 단독으로 또는 조합으로 T331I, T331R, R337G, L372F, D393V, A452T, A489T, G495R, R720Q, R779H, R779C, G821S, R822Q, 및 A946T로부터 선택되는 기능 획득 돌연변이로 MDA5/IFIH1(예를 들어 SEQ ID NO: 310)을 인코딩하도록 변형될 수 있다.
iii. IRF7
IRF7(또는 IRF-7)의 항시적 활성 형태에는 IRF7(S477D/S479D), IRF7(S475D/S477D/S479D), 및 IRF7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)을 포함하여 상이한 C-말단 세린이 인산모방체 Asp로 치환된 돌연변이가 포함된다. IRF7(S477D/S479D)은 IFNA 및 RANTES 유전자 발현을 위한 강력한 트랜스활성인자(transactivator)이며, 바이러스 감염이 없는 경우에도 유전자 발현을 자극한다. IRF7(S475D/S477D/S479D) 및 IRF7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)은 IRF7(S477D/S479D)의 트랜스활성화 활성을 추가로 증가시키지 않지만, 모든 3개 돌연변이체의 모든 추가 트랜스활성화 활성은 바이러스 감염에 의해 추가로 자극된다. 비감염 세포의 핵에 국한되는 돌연변이체 IRF7(Δ247-467)은 IRF7의 매우 강력한 항시적 형태이며; 이는 비자극 세포 및 바이러스-감염 세포에서 야생형 IRF7보다 1500배 이상 더 높은 전사를 활성화한다(예를 들어, Lin 등 (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327 참조). 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 잔기 475-477, 479, 483 및 487에 대체를 갖는 것 및 아미노산 결실을 갖는 것을 포함하여 항시적 활성 IRF7 돌연변이체를 인코딩하고 발현할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 프로모터 및 인간을 포함한 포유동물 숙주에 의해 인식되는 임의의 다른 원하는 조절 신호의 제어 하에 플라스미드에서 이러한 단백질을 인코딩한다.
e. 다른 유형 I IFN 조절 단백질
유형 I IFN 반응을 활성화하는 DNA/RNA의 인식에 관여하는 다른 단백질은 항시적 유형 I IFN 발현을 생성하도록 돌연변이될 수 있다. 비변형 및/또는 변형된 단백질은 유형 I IFN의 발현을 증가시키기 위해 종양 미세환경, 예를 들어 종양-체류 면역 세포에 단백질을 전달하는 데 사용하기 위해 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 인코딩될 수 있다.
이러한 단백질에는 TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF2, TRAF3, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9(DDX9), DDX1, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60 및 SNRNP200로 표기된 단백질이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
기능-획득 변이체는 예를 들어 스크리닝 및/또는 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발은 시험관 내에서 수행되어 더 높은 수준 및/또는 항시적 유형 I IFN 발현을 유도하는 활성이 강화된 돌연변이를 식별할 수 있다. 온전한 게놈 DNA는 자가면역 및 자가염증 증상을 경험하는 관련이 없는 환자와 건강한 개인으로부터 얻을 수 있으며, 그 발현이 증가되거나 항시적인 유형 I IFN 발현을 유도하는 다른 생성물을 선별하고 식별할 수 있다. 전체 엑솜 시퀀싱을 수행할 수 있고 인트론 및 엑손을 분석하여 유형 I 인터페론의 증가 또는 항시적 발현과 관련된 경로에 돌연변이가 있는 단백질을 식별할 수 있다. 돌연변이 식별 후, 식별된 돌연변이(들)가 있거나 없는 전장 유전자를 인코딩하는 cDNA 분자는 유형 I 인터페론의 발현을 측정하는 리포터 세포주로 형질주입된다. 예를 들어, 루시페라제의 발현이 IFN-β에 대한 프로모터의 제어 하에 놓이는 리포터 세포주가 생성될 수 있다. 항시적으로 활성인 기능-획득 돌연변이는 IFN-β의 발현을 촉진하는 반면, 자극되지 않은 야생형 단백질은 그렇지 않다. 자극은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 박테리아 핵산, LPS, dsRNA, 폴리(I:C)에 의해, 또는 단백질 리간드(예를 들어, CDN)의 외인성 수준 증가에 의한 것일 수 있다. 식별된 단백질은 또한 대상체에서 관심 항원(들)에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 포함한다. 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 포함한다: (i) 유형 I 인터페론 경로 신호전달 자극; (ii) NF-κB 경로 신호전달 자극; (iii) 염증 반응 자극; (iv) 사이토카인 생성 자극; (v) 수지상 세포 발달, 활성 또는 동원의 자극; (vi) 그 발현이 면역 반응을 향상시키는 생성물을 나타내는 다른 반응; 및 (vii) (i) 내지 (vi) 중 어느 하나의 조합.
3. 항체 및 항체 단편
항체 공학의 발전으로 특히 제조, 조직 침투 및 사용 용이성 측면에서 기존의 단일클론 항체와 비교하여 많은 개선이 있는 재조합 항체 단편이 생성되었다. 이의 예는 일반적으로 (G4S)3 서열인 가요성 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 항체 결합 부위의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로 구성된 단일 사슬 단편 가변(scFv)이다(Weisser et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27(4):502-520). 다른 예는 scFv의 VH 도메인이 Fc 영역에 연결된 scFv-Fc 항체 단편, 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 항체의 이량체와 다량체 및 다른 조합과 형태를 포함한다. 항체 단편 및 다른 작제물은 플라스미드 상에 인코딩될 수 있고 본원에 예시된 바와 같이 면역자극성 박테리아에 의해 전달될 수 있는 방식으로 항원의 표적화를 허용한다. 표적화하는 항원의 예는 아래 실시예에서 논의된 것을 포함한 종양 항원, 및 아래와 본원 어디에서나 논의된 다른 예시적인 표적을 포함한다. 당업자에게 알려진 임의의 표적이 포함되며, 이는 회전배열(회전배열) 또는 구조의 변화 시 형성되는 네오항원이다.
a. TGF-β
형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)는 배아 발생, 상처 치유, 혈관 신생 및 면역 조절에서 수많은 역할을 하는 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다. 이는 포유류 세포, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 세 가지 이소형으로 존재하며; TGF-β1은 면역 세포에서 가장 우세하다(예를 들어, Esebanmen 등 (2017) Immunol. Res. 65:987-994 참조). 면역저해제로서의 TGF-β의 역할은 틀림없이 가장 지배적인 기능이다. 특히, 종양 미세환경에서 크립틱 형태로부터의 활성화는 DC 및 항원 특이적 T-세포를 관용하는 능력에 대해 뚜렷한 면역억제 효과를 갖는다. TGF-β는 또한 Th1 CD4+ T-세포를 면역억제성 Treg로 직접 전환시켜 종양 내성을 추가로 촉진할 수 있다(예를 들어, Travis 등 (2014) Annu. Rev. Immunol. 32:51-82 참조). 종양-특이적 면역억제 기능을 기초로 하고 알려진 암세포 성장 및 전이 촉진 특성과 상관없이, TGF-β의 저해는 암 치료 표적이다. 높은 수준의 TGF-β 신호전달은 결장직장암(CRC), 간세포암종(HCC), 췌관 선암종(PDAC) 및 비소세포폐암(NSCLC)을 포함한 여러 인간 종양 유형에서 입증되었다(Colak et al. (2017) Trends Cancer 3(1):56-71). TGF-β의 전신적 억제는 수용할 수 없는 자가면역 독성을 유발할 수 있으며, 그 억제는 종양 미세환경에 국한되어야 한다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 TGF-β 결합을 위한 유인로서 작용하는 가용성 TGF-β 수용체를 생성하는 것이다(예를 들어, Zhang 등 (2008) J. Immunol. 181:3690-3697 참조). 이와 같이, 본원에 제공된 TGF-β 수용체 유인을 함유하는 종양 표적 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경으로부터 TGF-β에 결합 및 제거함으로써 종양 면역 관용을 방해하고 항종양 면역력을 자극할 수 있다.
TGF-베타 결합 유인 수용체에 더하여, 종양 미세환경에서 TGF-β에 결합하고 이를 제거하거나 감소시켜 종양 면역 관용을 방해하고 항종양 면역력을 자극할 수 있는 다른 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제가 포함된다. 이의 예는 항-TGF-베타 항체 또는 항체 단편, 항-TGF-베타 수용체 항체 또는 항체 단편, 및 가용성 TGF-베타 길항제 폴리펩타이드이다.
종양 미세환경, 종양, 특히 종양-체류 면역 세포에 축적되고, 예를 들어 TGF-베타 결합 유인 수용체(TGF-β 수용체 유인), 항-TGF-베타 항체 또는 항체 단편, 항-TGF-베타 수용체 항체 또는 항체 단편, 및 가용성 TGF-베타 길항제 폴리펩타이드를 포함하여 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 항체 단편은 scFv 및 scFv-Fcs를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다.
b. 이중특이적 scFvs 및 T-세포 연계자
scFv의 사용은 종종 긴 링커에 의해 함께 연결된 하나 이상의 scFv 단편(이중특이적, 삼중특이적 등)의 사용을 통해 표적에 대한 결합 원자가를 증가시킴으로써 개선되었다. 이중특이적 T-세포 연계자(상표명 BiTE® 하에 입수 가능함) 작제물은 암 면역요법에 사용되는 인공 이중특이적 단일클론 항체의 한 부류이며, 2개의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 연결함으로써 형성되어, 하나의 scFv가 세포독성 T-세포 표면의 CD3에 결합하고, 다른 하나는 특정 종양-연관 항원(TAA)에 결합한다. 따라서 BiTEs®는 MHC 부류 I 또는 공동자극성 분자와 무관하게 T-세포를 종양 세포로 표적화하여 T-세포 활성화, 사이토카인 생산 및 종양 세포 세포독성을 자극한다. 이중특이적 T-세포 연계자(BiTEs®)의 2개 예는 FDA의 승인을 받았으며, 여기에는 종양 항원 EpCAM 및 CD3에 대한 것이고 악성 복수의 치료에 사용되는 카투막소맙(catumaxomab), CD19 및 CD3에 대한 것이고 재발성, 불응성 급성 림프구성 백혈병(ALL)의 치료에 사용되는 블리나투모맙(blinatumomab)이 있다(예를 들어, Ahamadi-Fesharaki et al. (2019) Mol. Ther. Oncolytics 14:38-56 참조). 다른 이중특이적 T-세포 연계자(BiTEs®)은 예를 들어 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), EGFR, EphA2, HER2/neu, ADAM17/TACE, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 델타-유사 리간드 3(DDL3), 및 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)을 포함한 여러 가지 항원을 표적화한다. 본원에 예시된 바와 같이, BiTE® 항체는 또한 면역자극성 박테리아에 의한 전달 후 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
c. 항-PD-1, 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체
i. 항-PD-1/항-PD-L1 항체
프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)은 면역 반응의 음성 조절에 관여하는 면역억제 수용체이다. 이의 동족 리간드인 PD-L1(프로그램된 사멸-리간드1)은 항원 제시 세포(APC)에서 발현되며, T-세포의 PD-1에 결합하면 CD8+ T-세포 이펙터 기능의 상실을 유발하여 T-세포 관용을 유도한다. PD-L1의 발현은 종종 특정 인간 암에서 종양 공격성 및 감소된 생존과 관련이 있다(예를 들어, Gao 등 (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979 참조).
항-PD-1(예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙) 및 항-PD-L1(예를 들어, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙) 항체와 같은 면역 체크포인트를 차단하도록 설계된 항체는 T-세포 아네르기를 방지하고 면역 관용을 파괴할 수 있다. 그러나, 치료된 환자의 일부만이 임상적 이점을 나타내고, 종종 자가면역 관련 독성을 나타낸다(예를 들어, Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373(16):1490-1492; 및 Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366(26):2443-2454). 독성 획득 외에도, 항PD-1/항PD-L1 요법은 종종 내성을 유발하며, 항CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙)의 병용은 임상 시험에서 유의한 부가 독성으로 제한된 성공을 보였다. 독성을 제한하고 PD-1/PD-L1 차단의 효능을 향상시키기 위해, scFv 및 scFv-Fc와 같은 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아, 및 PD-1 또는 PD-L1에 대한 당업계에 알려져있고/있거나 본원에 기재된 다른 것은 면역 세포의 활성화와 상승작용을 일으켜 항종양 면역력을 강화할 것이다.
ii. 항-CTLA-4 항체
CD152(분화 클러스터 152)로도 알려진 CTLA-4(세포독성 T-림프구 관련 단백질 4)는 면역 체크포인트로 기능하고 면역 반응을 하향조절하는 또 다른 면역억제 수용체이다. CTLA-4는 조절 T-세포(Treg 또는 Treg)에서 항시적으로 발현되고 억제 기능에 기여하지만 활성화 후에만 기존 T-세포에서 상향조절된다. CTLA-4는 T-세포에 억제 신호를 전달하여 면역 체크포인트 역할을 한다. CTLA-4는 T-세포 공동자극 단백질인 CD28과 상동성이며, 두 분자 모두 CD80(B7-1 또는 B7.1로도 알려짐) 및 CD86(B7-2 또는 B7.2로도 알려짐) 리간드에 결합한다. 항원제시세포(APC)에 대해 리간드에 대한 CTLA-4의 결합은 T-세포에 억제 신호를 전달하는 반면, CD28의 결합은 자극 신호를 전달한다.
T-세포 활성화 후 CTLA-4 수용체가 유도되어 APC 표면의 CD80 및 CD86 리간드에 결합하기 위해 T-세포의 CD28 수용체를 능가한다. CTLA-4는 CD80 및 CD86에 CD28보다 더 큰 친화력과 결합력으로 결합하여 리간드에 대해 CD28을 능가하여 억제 신호를 T-세포에 전달하고 면역억제 반응을 유발한다. T-세포 수용체와 CD28을 통한 T-세포 활성화는 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
최적의 T-세포 프라이밍은 T-세포 CD28과 CD80 및/또는 CD86의 리게이션으로 인한 공동자극 신호가 필요하다. CTLA-4가 이러한 리간드에 결합하는 것을 차단하면 T-세포 프라이밍이 향상되고 항종양 면역 반응이 유도된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 균주는 항-CTLA-4 scFv(예를 들어, 예시적인 인간 항-CTLA-4 scFv 단편에 대해서는 SEQ ID NO: 403 참조), 및 항-CTLA-4 scFv-Fc(예시적인 인간 항-CTLA-4 scFv-Fc 및 scFv-Fc 단편에 대해서는 동시계류중인 PCR 출원 국제 PCT 출원 PCT/US2020/060307호 참조; 또한 실시예 25 참조)와 같으나 이로 제한되지 않는 항-CTLA-4 항체 및 이의 단편을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다.
d. 추가 예시적인 체크포인트 표적
scFv, 또는 이에 대한 임의의 다른 재조합 항체 단편이 제조될 수 있거나 본원에 예시된 예시적인 면역 체크포인트 표적은 하기 표에 열거된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00017
4. 면역조절성 단백질의 조합은 상승작용 효과 및/또는 보완 효과를 가질 수 있다
사이토카인은 항종양 면역 반응의 강력한 조절자이다. 사이토카인 조합은 T-세포, NK 세포 및 골수성 세포(수지상 세포 및 대식세포 포함)를 포함하는 다양한 면역 구획에 깊은 상승 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 사이토카인은 수지상 세포에 의한 항원 프라이밍, 내재성 면역 세포 및 항원 특이적 T-세포의 생존과 증식, 및 NK 세포 및 T-세포의 세포독성 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 사이토카인 조합은 생물학적 반응을 최대화하고 항종양 면역력을 강화하기 위해 적절하게 선택되어야 한다. 예를 들어, 간염의 뮤린 모델에서 IFN-α 단독은 바이러스 감염된 세포의 CD8+ T-세포 세포용해 기능을 향상시키는 반면, IL-15 단독은 활성화된 림프구의 증식을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 더불어, 이는 B형 간염(HBV) 감염을 최대한 억제하였다(예를 들어, Di Scala et al. (2016) J. Virol. 90(19):8563-8574). 또 다른 예에서, 사이토카인 IL-15 + IL-18, 및 IL-15 + IL-21의 조합은 인간 NK 및 T-세포로부터 IFN-γ의 생산을 향상시킬 수 있었다(예를 들어, Strengell 등 (2003) J. Immunol.170(11):5464-5469). 또 다른 예에서, IL-2 + IL-18은 상승작용을 일으켜 IFN-γ 생산을 향상시키고 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포 및 NK 림프구의 세포용해 기능을 증가시켰다(예를 들어, Son 등 (2001) Cancer Res. 61(3):884-888). 추가로, IL-12 및 IL-18은 상승작용을 일으켜 인간 T-세포로부터 항원-CD3 T-세포 리게이션-비의존적 IFN-γ 생산을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, Tominaga et al. (2000) Int. Immunol. 12(2):151-160). 사이토카인의 조합은 T-세포 기능의 강력한 증강제이지만 FDA 승인 항암 사이토카인은 너무 독성이 있어 전신적으로 투여할 수 없으므로 거의 사용되지 않으며 전신 투여되는 사이토카인의 조합은 독성을 악화시킬 뿐이다(예를 들어, Conlon 등 (2019) J. 인터페론 사이토카인 Res. 39(1):6-21).
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이러한 문제를 해결한다. 사이토카인 조합의 종양-특이적 전달, 및/또는 다른 치료 생성물, 예컨대 본원에 논의된 유형 I 인터페론의 유도제 및 공동자극성 분자, 케모카인, 항체 및 이의 단편을 포함하는 다른 것의 조합을 허용하는 면역조절 단백질과 같은 다중 치료제를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공된다. 이러한 면역자극성 박테리아는 사이토카인 및 다른 치료제의 직접 IV 투여와 관련된 전신 독성 및 약동학적(PK) 책임 없이 강력하고 상승작용적인 면역 활성화를 달성한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 플라스미드에 인코딩될 수 있는 치료 생성물의 조합에는 예를 들어 2개 이상의 사이토카인; 하나 이상의 사이토카인 및 유형 I IFN의 유도제(예를 들어, STING, IRF3, IRF7, MDA5, RIG-I 및 항시적으로 활성인 GOF 변이체), 및/또는 공동자극성 분자(예를 들어, 4-1BBL 및 4-1BBLΔcyt); TGF-β 유인 수용체 및 하나 이상의 사이토카인; TGF-β 유인 수용체 및 유형 I IFN의 유도제; TGF-β 유인 수용체, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 유형 I IFN의 유도제, 및/또는 공동자극성 분자; 항체(예를 들어, CTLA-4와 같은 면역 체크포인트에 대한 항체) 및 하나 이상의 사이토카인; 항체 및 유형 I IFN의 유도제; 항체, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 유형 I IFN의 유도제, 및/또는 공동자극성 분자; 공동자극성 분자 작용제(예를 들어, CD40 작용제) 및 하나 이상의 사이토카인; 공동자극성 분자 작용제 및 유형 I IFN의 유도제; 및 공동자극성 분자 작용제, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 유형 I IFN의 유도제, 및/또는 공동자극성 분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
하기 논의된 바와 같이, 다중 치료 생성물 발현 카세트는 단일 프로모터 작제물 및/또는 이중/다중 프로모터 작제물, 뿐만 아니라 전사후 조절 요소, 및 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 신호 펩타이드 등과 같은 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 단백질 발현을 증가시키기 위해 최적화된 코돈일 수 있고, 일반적으로 진핵생물 프로모터의 제어 하에 있다. 특정 작제물 및 이의 세부사항은 본원의 다른 곳에서 설명된다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아 중에는 면역자극성 단백질(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 공동자극성 분자) 및/또는 종양 미세환경에서 면역 반응을 증가시키는 기능-획득 돌연변이를 갖는 유전자 생성물(예를 들어, 유형 I IFN을 유도하는 세포질 DNA/RNA 센서), 및/또는 항체 및 이의 단편, 및/또는 TGF-β 및/또는 IL-6 유인 수용체와 같은 항종양 반응을 향상시키는 다른 치료제, 및/또는 TGF-β 길항 폴리펩타이드를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 것이 있다. 사이토카인, 기능-획득 생성물/유형 I IFN 경로 단백질, 및/또는 케모카인, 및/또는 공동자극성 분자, 및/또는 항체 및 이의 단편, 예를 들어 단일 사슬 항체, 및 본원에서 논의된 다른 치료 생성물을 인코딩하는 이러한 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경, 종양 및 종양-체류 면역 세포에 우선적으로 침투하는 면역자극성 박테리아를 포함한다. 면역자극성 박테리아는 또한, 게놈이 변형되어 종양-체류 면역 세포에서 세포 사멸을 덜 유도하여 면역자극성 박테리아가 종양-체류 골수성 세포에 축적되어, 다중화된 유전 페이로드의 높은 수준의 이소성 발현을 표적 세포에서 달성하고, 치료 생성물/면역자극성 단백질을 종양 미세환경(TME)에 전달하여, 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다. 특히, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 아데노신 영양요구성, csgD - , pagP - , msbB - , 플라젤린-(fliC - /fljB - ), purI - , ansB - , asd -, 및 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 골수성 세포에의 표적화 또는 축적을 개선하거나, 안전성 및 내약성(더 높은 용량을 허용함)을 개선하며, 면역억제성 사이토카인 프로파일을 감소시키고, T-세포 품질 및 기능을 개선하며, 건강한 조직에서 복제를 제한하고, 생물막을 제거하며, 항종양 반응을 개선하거나, 본원 어디에서나 논의된 임의의 바람직하고 유리한 특성을 부여하는 것으로 본원에 기재되거나 알려진 임의의 다른 변형을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본원에 기재된 바와 같은 최대 약 8개 또는 8개의 변형을 포함한다.
면역자극성 박테리아는 특정 종양에 대한 반응을 향상시키기 위해 대상체의 종양에서 유래한 종양 항원과 같은 다른 치료제를 추가로 인코딩할 수 있다. 본원에 제공되고 상기 및 하기에 기재된 임의의 면역자극성 박테리아는 사이토카인, 케모카인, 공동자극성 분자 및 기능-획득 유형 I IFN 경로 생성물(들)과 같은 치료 생성물을 인코딩하도록 변형될 수 있다. 치료 생성물은 숙주에 의해 인식되는 프로모터의 제어 하에 플라스미드, 및 인간, 또는 다른 동물 또는 포유동물과 같은 진핵생물에서 인식되는 임의의 다른 원하는 조절 서열에 인코딩된다. 일반적으로 생성물을 인코딩하는 핵산은 RNA 중합효소 II 프로모터의 제어 하에 있다. 추가로, 변형을 위해 본원에 기재된 임의의 박테리아, 예컨대 살모넬라, 시겔라, 이. 콜라이, 비피도박테리아, 리케치아, 비브리오, 리스테리아, 클레브시엘라, 보르데텔라, 네이쎄리아, 애로모나스, 프란치셀라, 콜레라, 코리네박테리움, 시트로박터, 클라미디아, 해모필루스, 브루셀라, 미코박테리움, 미코플라즈마, 레지오넬라, 로도콕커스, 슈도모나스, 헬리코박터, 바실러스, 및 에리시펠로트릭스의 임의의 균주, 또는 이의 약독화된 균주, 또는 이의 변형된 균주는 숙주에 의해 인식되는 RNA 폴리머라제 프로모터의 제어 하에 치료 생성물을 인코딩하는 핵산(들)을 함유하는 플라스미드를 함유하거나 도입하거나 박테리아 내 플라스미들 상에서 인코딩함으로써 변형될 수 있다. 치료 생성물은 감염된 대상체의 세포에서 발현된다. 면역자극성 박테리아는 종양, TME 및/또는 종양-체류 골수성 세포에 축적되거나 우선적으로 감염시키도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 것을 포함한다. 예를 들어, IFN-베타와 같은 유형 I 인터페론(IFN), 및/또는 본원에 논의된 바와 같은 다른 치료 생성물의 발현 또는 항시적 발현을 유도하는 기능-획득 생성물을 인코딩하는 면역자극성 박테리아는 추가로, 상피 세포를 감염시키는 능력이 감소되거나 능력이 없지만 종양-체류 면역 세포를 포함한 식세포를 감염시킬 수 있도록 변형되고/되거나 면역자극성 박테리아가 감염된 식세포를 사멸화시키지 않도록 변형된다.
본원에 기재된 바와 같이, SPI-1 경로에 관여하는 유전자 및 편모는 식세포(면역 세포)에서 인플라마솜을 활성화시켜 파이롭토시스를 유발한다. SPI-1 유전자 및 편모를 인코딩하는 유전자를 넉아웃시키는 것은 식세포의 파이롭토시스를 감소 또는 제거하고, 또한 상피 세포의 감염을 제거하여 식세포의 감염을 증가시킨다. 식세포, 특히 종양-체류 면역 세포, 예를 들어 골수 유래 억제 세포(MDSC), 종양-연관 대식세포(TAM) 및 수지상 세포(DC)에 축적되는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 여기서 이는 RNA 폴리머라제 II에 의해 인식되는 것과 같은 진핵 프로모터에 의해 제어되는 플라스미드에 인코딩된 유전자 페이로드/치료 생성물을 발현하고, 본원에 논의된 바와 같이 다른 진핵 조절 신호를 포함한다. 발현된 치료 생성물에는 종양 미세환경에서 숙주 반응을 증가시키는 유형 I 인터페론을 증가시키거나 유도하는 경로를 통해 면역 반응을 유발하는 생성물이 포함된다. 면역자극성 박테리아는 또한 본원에 논의된 바와 같이 면역자극성 단백질, 예컨대 IL-2 및/또는 다른 사이토카인, 및/또는 다른 면역자극성 단백질 및 치료 생성물을 인코딩할 수 있으며, 이는 종양 미세환경에서 면역 반응을 추가로 향상시킨다.
면역자극성 박테리아는 세포의 세포질에서 RNA, DNA, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드, 환식 뉴클레오타이드, 환식 디뉴클레오타이드 및 다른 이러한 분자와 같은 핵산에 노출될 때 면역 반응을 일으키는 세포질 DNA/RNA 센서라고 하는 생성물을 인코딩할 수 있다. 본원에서 면역자극성 박테리아는 면역 반응을 항시적으로 유발하는 변형된 치료 생성물을 인코딩하고, 세포질에서 DNA/RNA의 존재를 필요로 하지 않는다. 유형 I 인터페론 발현을 유도하는 경로의 구성요소가 이러한 예이다. 본원에서 고려되는 치료 생성물은 유형 I 인터페론(들)이 세포의 세포질에서 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드, 환식 뉴클레오타이드, 환식 디뉴클레오타이드 및 다른 이러한 리간드의 부재 하에 발현되거나 생성되도록 항시적 활성 또는 증가된 활성(즉, 기능-획득 생성물)을 갖는 이러한 세포질 DNA/RNA 센서의 변형된 형태를 포함한다. 세포, 특히 종양-체류 면역 세포를 포함하는 종양 세포에서 이러한 변형된 생성물의 발현은 종양 미세환경에서 인터페론-β를 비롯한 유형 I 인터페론의 항시적 발현을 유도한다. 이러한 기능-획득 생성물을 발현하는 면역자극성 박테리아가 종양 세포/TME/종양-체류 면역 세포에 축적되거나 우선적으로 감염시키기 때문에, 치료제는 종양 미세환경에서 발현되어 종양 미세환경에서 면역 반응을 증가시킨다.
면역자극성 박테리아 및 다른 비히클에서 인코딩될 수 있는 예시적인 유전자 생성물은 세포질 DNA/RNA를 인식하고 유형 I 인터페론 생산을 활성화하는 내재성 경로를 감지하거나 이에 관여하는 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유형 I 인터페론을 활성화하는 내재성 DNA/RNA 인식과 관련된 단백질에는 하기가 포함되지만 이로 제한되지 않는다: STING, RIG-I, MDA5, IRF3, IRF7, TRIM56, RIP1/RIPK1, Sec5/EXOC2, TRAF2, TRAF3, TRAF6, STAT1, LGP2/DHX58, DDX3/DDX3X, DHX9/DDX9, DDX1, DDX21, DHX15/DDX15, DHX33/DDX33, DHX36/DDX36, DDX60, 및SNRNP200. 항시적 유형 I 인터페론 발현을 초래하는 이러한 단백질의 기능-획득 돌연변이는 알려져 있거나 식별될 수 있으며, 돌연변이는 예컨대 식세포의 감염에 의해 또는 종양 세포를 표적화하고 결합함으로써 면역자극성 박테리아에 의해 종양 미세환경으로 전달될 수 있다.
기능-획득 돌연변이에는 항시적 유형 I 인터페론 발현으로 인한 장애가 있는 개체에서 식별된 돌연변이가 포함된다. 기능-획득 생성물의 예는 인터페론병증이 있는 대상체에서 발생하는 생성물이다. 위에서 언급한 바와 같이 돌연변이는 스크리닝에 의해 식별되어 기능-획득 생성물도 생성할 수 있다.
치료 생성물을 인코딩하는 핵산은 발현 특성을 개선하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 변형에는 예를 들어 포유동물, 특히 인간 대상체에서 전사 효율을 증가시키기 위한 코돈 최적화, 예를 들어 GC 함량 또는 CpG 디뉴클레오타이드 함량 감소, 크립틱(cryptic) 스플라이싱 부위 제거, CpG 섬의 첨가 또는 제거(일반적으로 제거), 샤인-달가노(SD) 서열의 대체, 및 전사 효율을 증가시키기 위한 TATA 박스 및/또는 말단 신호의 대체를 포함한다. 코돈 용법 편향 변경, GC 함량 감소, mRNA 2차 구조 감소, 조기 PolyA 부위 제거, RNA 불안정성 모티프(ARE) 제거, mRNA의 안정적인 자유 에너지 감소, 내부 카이(chi) 부위 및 리보솜 결합 부위의 변형, 및 RNA 2차 구조 감소에 의해 번역 효율을 높이기 위해 코돈을 최적화할 수 있다. 발현을 개선하고 박테리아 적합성을 유지 또는 향상시키기 위한 추가 변형이 면역자극성 박테리아에 통합되었다. 이는 아래 섹션에 설명되어 있으며 아래 작업 실시예에서 상세하고 예시되어 있다.
상기 기재된 바와 같이, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 환식 디뉴클레오타이드(CDN) 및 다른 이러한 형태의 핵산과 같은 세포질 핵산의 숙주 인식에 의해 매개되는 유형 I 인터페론 유도 경로는 유형 I IFN을 유도한다. 또한 세포질에서 단일 가닥(ss) 및 이중 가닥(ds) RNA의 숙주 인식에 의해 매개되는 톨-유사 수용체(TLR)-독립형 유형 I IFN 경로가 있다. 이는 레티노산-유도성 유전자 I(RIG-I), 흑색종 분화-연관 유전자 5(MDA5)를 포함한 RNA 헬리카제에 의해 그리고 IFN-β의 유도를 유도하는 IRF3 전사 인자의 IFN-β 프로모터 자극제 1(IPS-1) 어댑터 단백질-매개 인산화를 통해 감지된다(예를 들어, Ireton and Gale (2011) 바이러스 3(6):906-919 참조). 본원에서 논의된 바와 같이, 이러한 경로의 단백질은 변형될 수 있거나 변이체로 존재할 수 있으며, 이는 IFN-α 및 IFN-β를 포함하는 유형 I 인터페론(인터페론 유형 1로도 지칭됨)의 항시적 발현을 초래한다. 이러한 단백질의 예는 본원에 제공된 것을 포함하여 기재된 변형된 STING 단백질이다. 이는 유형 I 인터페론의 항시적 발현을 초래하는 돌연변이를 가져서 인터페론이 유도의 부재 하에 발현되게 되는 변형된 STING 단백질을 포함하며, 변형된 비(非)인간 STING 단백질 및 인간 STING 단백질, 및 또한 키메라 STING 단백질, 예컨대 C-말단 테일(CTT) 부분이 제2 종의 STING 단백질로부터의 CTT 부분으로 대체된 것을 포함하며, 여기서 제2 종의 STING 단백질은 인간 STING의 NF-κB 신호전달 활성보다 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성을 가지며, CTT의 TRAF6 결합 부위는 선택적으로 결실되고, 하나 이상의 기능-획득 돌연변이를 추가로 포함하는 키메라 STING 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아를 이용하는 요법은 체크포인트 저해제 요법, 및 상기 및 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 다른 암 치료 및 화학요법을 비롯한 임의의 다른 항암 요법과 조합될 수 있다.
5. 전구약물을 활성화시키는 분자
본원에 제공되는 면역자극성 박테리아의 플라스미드는 효소적 절단에 의해 활성화되는 화학요법 전구약물, 특히 독소를 포함하는 전구약물과 같은 치료 생성물의 일부를 절두함으로써 활성화하는 분자, 예컨대 효소를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 그 결과, 불활성 전구약물은 전신 투여될 수 있고 불활성이다. 효소와 같은 플라스미드-인코딩 활성화 분자는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 전달 후 종양 미세환경에서 발현되어, 불활성 전구약물이 종양 미세환경에서 활성화되어 항종양 효과를 발휘한다. 특정 뉴클레오사이드 및 독소 접합체를 포함하는 이러한 전구약물의 많은 예가 있다. 많은 이러한 전구약물 및 효소가 알려져 있다(예를 들어, 예를 들어, Malekshah et al., (2016) Curr. Pharmacol. Rep. 2:299-308 참조). 이는 5-플루오로우라실(5-FU), 옥사자포스포린, 백금 약물, 및 데아미나제, 니트로리덕타제, 포스포릴라제, 시토크롬 P450 효소 등과 같은 효소의 전구약물, 및 많은 다른 것을 포함한다.
6. 병용 요법을 전달하는 면역자극성 박테리아
본원에서 면역자극성 박테리아는 하나 이상의 치료 생성물, 특히 항암 요법을 위한 생성물을 제공하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 생성물은 항종양 면역 반응을 강화하고 재프로그래밍하기 위한 보완 생성물이다. 본원에 기재된 게놈 변형, 특히 asd -, 플라젤린-(예컨대 fliC -/fljB -), pagP -, csgD -, purI - , 아데노신 영양요구성, msbB -, ansB -, 및 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 임의의 다른 변형 중 몇몇 또는 모두의 조합에 의한 면역자극성 박테리아는 종양 미세환경(TME)에 축적되어 종양-체류 면역 세포(골수성 세포)를 감염시킨다. 면역자극성 박테리아는 숙주에 의해 인식되는 프로모터의 제어 하에 보완 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드, 및 인간, 다른 동물 또는 포유동물과 같은 진핵생물에서 인식되는 임의의 다른 원하는 조절 서열을 함유하여, 인코딩된 생성물의 발현 및 생성물의 분비를 발휘한다. 면역자극성 박테리아는 TME, 특히 골수 유래 억제 세포(MDSC), 종양-연관 대식세포(TAM) 및 수지상 세포(DC)를 포함하는 종양-체류 면역 세포에 축적되며, 여기서 인코딩된 치료 생성물은 발현된 다음 종양 미세환경으로 분비되어 항종양 효과를 달성한다. 생성물의 적절한 조합에 의해 다양한 생성물과 숙주 면역계의 상호작용 덕분에 항종양 효과가 향상될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 단일 프로모터 및 개방 리딩 프레임(ORF)을 갖는 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아는 캡(cap)-독립적인 바이러스 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용을 통해 또는 2A 펩타이드(예를 들어, T2A, P2A, E2A, F2A)의 번역 판독, 및 동일하게 발현되는 공동단백질로의 후속적인 자가-절단을 통해 2개(또는 그 이상)의 단백질을 발현할 수 있다. 대안적으로, 유전자 페이로드/치료 생성물은 이중 또는 다중 프로모터 작제물을 사용하여 발현될 수 있으며, 여기서 각각의 단백질은 별도의 프로모터의 제어 하에 발현된다. 3개 이상의 단백질을 발현하기 위한 단일 및 이중/다중 프로모터 작제물의 조합도 플라스미드에 포함될 수 있다. 일반적으로, 치료 생성물을 인코딩하는 핵산은 RNA 중합효소 II 프로모터의 제어 하에 있다. 예를 들어, 프로모터는 EF-1α, CMV, SV40, UBC, CBA, PGK, GUSB, GAPDH, EIF41A, CAG, CD68 및 합성 MND 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 플라스미드는 전사후 조절 요소(PRE; 예를 들어, WPRE, HPRE), 폴리아데닐화 신호 서열, 종결인자, 인핸서, 분비 신호(신호 펩타이드/서열, 리더 펩타이드/서열로도 알려짐), DNA 핵 표적화 서열(DTS), 및 본원의 다른 곳에서 기재되거나 당업자에게 알려진 다른 조절 요소와 같은 다른 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이는 인코딩된 치료 생성물의 발현 및/또는 분비를 향상시키거나 증가시킬 수 있다.
플라스미드에 인코딩된 유전자 페이로드 또는 치료 생성물에는 사이토카인, 케모카인 및 공동자극성 분자와 같은 면역자극성 단백질; 유형 I IFN 및 기능-획득/항시적으로 활성인 돌연변이체/변이체를 유도하는 세포질 DNA/RNA 센서; 항체 및 이의 단편; 이중특이적 T-세포 연계자(BiTEs®); TGF-β, 또는 TGF-β 길항 폴리펩타이드에 결합하기 위한 유인물로 작용하는 가용성 TGF-β 수용체; IL-6 결합 유인 수용체; 간섭 RNA(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA); 및 하기 및 본원의 다른 곳에서 논의되고 당업계에 알려진 바와 같은 다른 치료 생성물; 및 모든 선행 치료 생성물의 보완적 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 막횡단 도메인 및 콜라겐-결합 도메인과 같은 막 고정 모티프와 함께 면역자극성 박테리아 내의 플라스미드 상에 인코딩될 수 있다.
플라스미드에 인코딩될 수 있는 사이토카인, 케모카인 및 공동자극성 분자를 비롯한 면역자극성 단백질에는 IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-15/IL-15Rα 사슬 복합체, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36 감마, 인터페론-α, 인터페론-β, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질, CD40, CD40 리간드(CD40L), OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), 세포질 도메인이 결여된 4-1BBL(4-1BBLΔcyt), ICOS, CD27, B7-CD28 계열의 구성원, 및 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 면역자극성 단백질은 또한 예를 들어 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1 및 OX40L과 같은 절두된 공동자극성 분자를 포함하며, 이는 항원 제시 세포(APC)에서의 발현을 위한 세포질 도메인 결실을 갖고, 여기서 절두된 유전자 생성물은 공동자극 수용체 결합을 통해 T-세포에 항시적 면역자극 신호를 전달할 수 있고 결실된 세포질 도메인으로 인한 APC에 대한 역조절 신호를 할 수 없다.
유형 I IFN 생성을 유도하거나 활성화하는 세포질 DNA/RNA 센서에는 STING, RIG-I, MDA5, IRF3, IRF5 및 IRF7 및 기능-획득(GOF) 또는 이의 항시적으로 활성 변이체가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 유형 I IFN 반응을 활성화하며 항시적 유형 I IFN 발현을 생산하도록 변형될 수 있고 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있는 DNA/RNA의 인식에 관여하는 다른 단백질에는 TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF2, TRAF3, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60 및 SNRNP200이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 면역자극성 박테리아에 의해 전달되는 플라스미드에 인코딩될 수 있거나 박테리아와 공동 투여될 수 있고 항종양 반응을 향상 또는 증가시키는 다른 치료 생성물에는 항체 및 이의 단편, 예를 들어, TGF-β 저해성 항체; 항-IL-6 항체; PD-1, PD-L1 및 CTLA-4와 같은 체크포인트 저해제에 대한 항체; 및 VEGF, CD73, CD38, Siglec-15, EGFR, Her2, 메조텔린 및 BCMA에 대한 항체 또는 저해제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 플라스미드에서의 발현 또는 본원의 면역자극성 박테리아와의 공동 투여를 위해 또한 고려되는 것은 이중특이적 T-세포 연계자(BiTEs®), IL-6 결합 유인 수용체, TGF-베타 결합 유인 수용체 및 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제이다. 이러한 항체, 저해제, 또는 유인 수용체 중 임의의 것은 본원에서 면역자극성 박테리아와 공동-투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PARP(폴리(ADP)-리보스 폴리머라제) 저해제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 및/또는 화학요법은 또한 단독으로 또는 임의의 조합으로 상기 열거된 임의의 치료제와 공동 투여될 수 있다.
본원에서 면역자극성 박테리아 내 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있는 치료 생성물의 보완 병용의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
IL-2 및 IL-12p70; IL-2 및 IL-21; IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
IL-15/IL-15Rα 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); IL-15/IL-15Rα 및 IL-12p70; IL-15/IL-15Rα 및 IL-21; IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
IL-12p70 및 IL-21; IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); IL-12p70 및 STING GOF 변이체; IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); IL-12p70 및 IL-18; IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; 및 IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-21; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); TGF-β 유인 수용체 및 IL-12p70; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-18; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 TGF-β 유인 수용체 및 STING GOF 변이체;
항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-21; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 항-CTLA-4 항체 및 IL-12p70; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-18; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; 항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 항-CTLA-4 항체 및 STING GOF 변이체;
CD40 작용제, IL-2, 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-2, 및 IL-21; CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 CD40 작용제, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및
CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-21; CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); CD40 작용제 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-18; CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체; CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함); 및 CD40 작용제 및 STING GOF 변이체.
하기 표는 실시예에서 논의되고 실증된 IL-15 또는 IL-15 복합체의 조합의 상승작용 효과를 포함하여 면역자극성 박테리아의 플라스미드에 인코딩될 수 있는 예시적인 생성물과 이러한 생성물의 일부 효과/특성을 나열한다.
Figure pct00018
위의 임의의 상보적 조합에서 TGF-β 유인 수용체는 TGF-β 길항 폴리펩타이드로 대체될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, TGF-β 유인 수용체는 TGF-β에 결합하여 이를 제거하는 유인체로 작용하거나 TGF-β 길항 폴리펩타이드(예를 들어, 항-TGF-베타 항체 또는 항체 단편, 및 항-TGF-베타 수용체 항체 또는 항체 단편)이다. 유형 I IFN 생산을 유도하거나 활성화하는 STING 단백질, 또는 다른 DNA/RNA 센서는 GOF/항시적 활성 변이체일 수 있거나, 본원에 기재되고 제공되는 변형된 STING 폴리펩타이드 및 키메라 STING 폴리펩타이드를 포함하는 야생형 단백질일 수 있다 . 상기 상보적 조합 중 임의의 것은 또한 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-L1 항체, 항-IL-6 항체, 항-Siglec-15 항체, 항-VEGF 항체, 항-CD73 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-메조텔린 항체, 항-BCMA 항체 및 이의 항체 단편, 뿐만 아니라 PARP 저해제, HDAC 저해제, 또는 화학요법, 및 이의 조합 중 하나 이상과 병용 투여될 수 있다.
본원에 제공된 플라스미드 및 면역자극성 박테리아는 치료 페이로드의 조합을 인코딩한다. 여기에는 위의 표에 나열된 생성물 중 일부 또는 전체를 인코딩하는 핵산의 조합이 포함된다. 상보적 페이로드의 조합이 평가되었으며, 예시적인 조합 및 그 효과가 실시예에 설명되어 있다. 다양한 조합의 페이로드가 항원 특이적 T-세포의 활성화와 항종양 T-세포 모집에 관여하는 핵심 케모카인인 골수성 세포에 의한 CXCL10 분비에 미치는 영향을 평가하였다. 예를 들어, 페이로드의 조합은 골수 수지상 세포(BMDC)에 의한 CXCL10의 강력한 분비를 유도할 수 있다. IL-36γ와 IL-12p70 및 STING R284G tazCTT의 조합은 BMDC에 의한 CXCL10 및 IFN-γ의 더 높은 분비를 유도하였다. 많은 조합이 CD8+ T-세포 반응(예를 들어, 4-1BB 발현)의 활성화 및 IFN-γ의 분비를 유도한다. 특정 사이토카인 조합은 T-세포를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, IL-12p70 + IL-15의 조합; IL-12p70 + IL-15 + IFN-α2; IL-12p70 + IL-15 + 항-4-1BB 작용 항체; IL-12p70 + IL-15 + IL-36γ; IL-12p70 + IL-15 + IL-21; IL-12p70 + IL-21 + IL-36γ; IL-12p70 + IL-36γ + IFN-α2; IL-12p70 + IL-36γ + 항-4-1BB 작용 항체; IL-15 + IL-36γ + IFN-α2; 및 IL-15 + IL-36γ + 항-4-1BB 작용 항체는 T-세포에서 높은 수준의 IFN-γ를 분비하지만 상대적으로 낮은 수준의 IL-6을 분비하여 최적의 T-세포 활성화, 종양 미세환경에서 항종양 면역력 유도를 위한 이상적인 조합을 만든다.
추가로, 사이토카인(IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, IL-12, IL-12p70, IL-15, IL-21, IL-36γ)과 4-1BB 결합의 여러 조합은 CD4+ 및 CD8+ T-세포에 대해 항-CD3ε 작용 항체에 의한 TCR 자극과 함께 그리고 이러한 자극 없이 높은 수준의 IFN-γ를 분비하도록 T-세포를 활성화시킨다. 본원에 기재된 STING 변이체 및 IL-12는 인간 CD8+ T-세포의 항원 특이적 활성화를 증가시킬 수 있다. 데이터는 또한 결장직장암의 마우스(mu) 모델에서 IL-15, 또는 4-1BBLΔcyt + IL-12의 조합을 발현하는 면역자극성 박테리아 균주가 4-1BBL(Δcyt) 또는 IL-12를 단독으로 발현하는 동일한 균주보다 종양 성장 저해를 보다 강력하게 억제한다는 것을 보여주었고, 높은 완전 반응율(50% 치료율)을 초래한다. 다른 조합도 시험되었으며 생체 내에서 강력한 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났다.
페이로드의 조합은 OX40L 폴리펩타이드 또는 4-1BBL 폴리펩타이드와 같은 공동자극성 분자, 또는 이의 세포질 결실 또는 절두된 변이체, 및/또는 본원에 기재되고 예시된 이의 변형된 형태 중 하나; 또는 항-CTLA-4 scFv-Fc 또는 항-CTLA-4 scFv와 같은 항-면역 체크포인트 항체 또는 이의 단편(각각 실시예 25 및 SEQ ID NO: 428 및 429 참조); 하나 이상의 사이토카인/케모카인, 예를 들어 IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IFN-β, IFN-α2 및 CXCL10; TGF-β 결합 유인 수용체 및 다른 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 예를 들어 인간 IgG1 Fc와 융합된 인간 가용성 TGFβ 수용체 II(hu sTGFβRII-Fc; SEQ ID NO: 437), 항-TGF-베타 항체 또는 항체 단편, 항-TGF-베타 수용체 항체 또는 항체 단편, 및 가용성 TGF-베타 길항제 폴리펩타이드; 및 본원에 기재되고 예시된 바와 같은 STING 단백질 또는 변형 및/또는 키메라 STING 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
페이로드/생성물/폴리펩타이드는 단일 프로모터(즉, 단일 프로모터 시스템) 및 필요에 따라 다른 조절 서열의 제어 하에 다시스트론 작제물로서 인코딩될 수 있으며, 또한 2A 폴리펩타이드 또는 다른 개별 생성물의 번역을 초래하는 이러한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 페이로드는 또한 각각 상이한 프로모터(즉, 이중 프로모터 시스템)의 제어 하에 2개의 개별 개방 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 플라스미드에서 발현될 수 있다. 페이로드의 예시적인 조합은 플라스미드에 인코딩된 순서로 다시스트론 작제물에 인코딩된 2A 펩타이드를 포함하여 하기 표에 제시되어 있다. 표는 2A 펩타이드를 포함하지만, 다른 이러한 펩타이드는 치환될 수 있고/있거나 생성물은 별개로 인코딩될 수 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
생성물의 다른 조합이 고려된다(상기 논의 및 실시예 참조). 관심의 다른 이러한 조합은 임의의 변형된 STING 단백질 및 사이토카인, 예컨대 키메라 STING, 예컨대 태즈메이니아 데빌 CTT, 특히 하나 이상의 기능-획득 돌연변이, 예컨대 N154S/R284G를 갖는 인간 키메라를 포함한다. 본원에 논의된 보완 조합은 상승작용 결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 제시된 키메라 STING 폴리펩타이드와 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc)의 조합은 상승작용적으로 작용하여 항종양 효과성을 향상시킨다.
종양-체류 골수성 세포 및 TME에서의 축적과 같은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 특성, 및 발현될 수 있는 생성물/페이로드의 조합은 암 면역 주기를 커버하도록 선택될 수 있다. 주기의 각각의 단계와 면역자극성 박테리아 및 페이로드의 역할은 하기와 같이 요약된다:
1) 암 세포 항원의 방출 - 면역자극성 박테리아가 종양-체류 골수성 세포에 축적됨.
2) 암 항원 제시 - 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 STING 폴리펩타이드와 이의 변이체, 및 IL-12와 같은 면역 자극 인자를 인코딩하고 발현하여 IFN-α 및 IFN-β를 포함한 유형 I 인터페론의 발현을 유도함.
3) 프라이밍 및 활성화 - 면역자극성 박테리아는 STING 폴리펩타이드와 이의 변이체, 및 4-1BBL과 IL-12와 같은 공동자극 단백질을 인코딩함.
4) T-세포를 종양으로 트래피킹 - 인코딩된 STING 변이체가 발현되어 결과적으로 IFN-α 및 IFN-β가 발현됨.
5) 종양으로 T-세포의 침윤 - 면역억제 골수성 세포의 혈관 누출 및 재분극;
6) T-세포에 의한 암세포 인식 - 유형 I IFN, IFNγ 및 MHC의 상향 조절; 및
7) 암세포 사멸 - 인코딩된 사이토카인/케모카인, 예를 들어 IL-12, IL-15, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc), IL-21 및/또는 IL-36γ의 조합으로서, 이는 T-세포 증식 및 IFN-γ의 방출, 및 가용성 TGF-β 유인 수용체의 발현을 유도함.
당업자는 본원의 개시내용 및 그들의 지식에 기초하여, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 항종양 활성을 향상시키기 위해 면역 활성화 및/또는 면역억제 효과를 갖는 다시스트론 작제물에 인코딩된 바와 같은 다른 생성물 페이로드 조합 및 생성물의 다른 순서를 확인할 수 있다.
E. 항바이러스 치료제 및 다른 감염성 병원체에 대한 치료제로서의 면역자극성 박테리아
숙주 면역 반응의 면역억제는 많은 감염성 질환, 특히 지속적 바이러스 감염에서, 뿐만 아니라 종양 면역억제에서 역할을 한다. 지속적 감염에서, 바이러스는 감염된 개체의 특정 세포에 남아 있다. 몇몇 유형의 지속적 바이러스-숙주 상호작용이 존재한다: 잠재, 만성, 및 느린 감염. 잠재 감염에서, 재발 질환의 에피소드 사이에 어떠한 검출 가능한 감염성 바이러스도 존재하지 않는다; 만성 감염에서, 1차 감염 후 감염성 바이러스의 지속적인 존재가 있고, 만성 또는 재발 질환이 존재한다. 느린 감염은 연장된 인큐베이션 기간, 뒤이어 진행성 질환을 특징으로 한다. 지속적 감염 동안, 바이러스 게놈은 세포성 DNA 내로 안정하게 통합될 수 있거나, 에피솜적으로 유지될 수 있다. 지속적 감염은 인간 T-세포 백혈병 바이러스(T-Cell leukemia virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 대상 포진 바이러스(varicella zoster virus), 홍역 바이러스(measles virus), 파포바바이러스(papovavirus), 프리온(prion), 간염 바이러스(hepatitis virus)(A형, B형, C형, D형 및 E형 포함), 아데노바이러스(adenovirus), 파보바이러스(parvovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 로타바이러스(rotavirus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 및 유두종바이러스(papillomavirus)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 수많은 바이러스 및 감염성 병원체에 의해 발생한다.
박테리아는 백신 및 다른 항병원체 치료제를 위한 전달 비히클로서 사용되어 왔고, 박테리아 벡터에 대해 외래인 펩타이드에 대해 면역 반응을 이끌어내기 위한 백신으로서 사용되어 왔다. 예를 들어, VEGFR2-인코딩 플라스미드를 함유하는 에스. 티피 TY21a 균주는 인간에서 VEGFR2-특이적 T-세포 반응을 유도한다(예를 들어, Schmitz-Winnenthal et al. (2016) Journal of Clinical Oncology 34(15_suppl):3091-3091, DOI: 10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.3091 참조). 그러나, 박테리아를 백신 비히클로서 사용하는 선행 접근법은 제한된 임상적 성공을 가졌다. FDA-승인된 박테리아-기초 백신만 다른 박테리아 질환에 대해 사용 가능하고. 인간에서 항종양 또는 항바이러스 면역을 효과적으로 유도하지 않았다. 본원에 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아가 이러한 문제점을 해결한다.
항바이러스 백신이 작동하는 하나의 방식은 외피화된 바이러스의 표면 당단백질에 특이적이거나 비(非)외피화된 바이러스의 캡시드 단백질에 특이적인 항체를 유도하는 항원의 전달에 의한 것이다. 항체는 적응 면역력의 1차 요소이고, 이는 보호적 수준에서 사전에 존재하도록 그리고 바이러스 병원체에의 재노출 동안 존재하거나 유도되도록 설계된다. 기존의 항체는 내재성 면역의 속도로, 그러나 더 큰 특이성, 더 높은 결합력(avidity), 및 표적화된 기능성으로 작용한다. 면역화를 위한 면역학적 목표는 지속적인 보호적 항체 반응의 유도이다. 보호적 항체 반응은 일반적으로 이것이 감염을 중화시키고 저해할 때 최상으로 작동한다. 중화는 3개의 주요 기전에 의해 발생할 수 있다. 제1 현상인 바이러스의 응집 또는 고정은 바이러스가 표적 세포에 도달하는 것을 방지함으로써 감염성 접종물을 감소시킨다. 제2 기전은 수용체-결합 도메인을 차단함으로써 표적 세포에의 바이러스의 부착을 직접적으로 차단하는 항체를 수반한다. 제3 기전인 중화는 세포 내로의 바이러스의 진입을 방지함으로써 또는 융합 저해를 통한 탈코팅(uncoating)에 의해 표적 세포에의 바이러스의 후부착(post-attachment)을 발생시킬 수 있다. 중화 항체는 이의 본래의 상태에서 또는 융합 과정의 완료 전에 일시적으로 존재할 수 있는 중간 형태에서 올리고머성 표면 단백질을 인식할 필요가 있다. 이러한 에피토프는 일반적으로 회전배열이고, 종종 4차 에피토프이고, 종종 단량체성 형태의 바이러스 단백질 상에 존재하지 않는다.
항체가 백신-유도 보호적 면역의 1차 기전으로서 인식되긴 하지만, 바이러스-특이적 CD8+ T-세포 반응 또한 바이러스 감염을 제어하고 질환의 중증도를 제한하는 데 중요하다(예를 들어, Graham (2013) Immunol. Rev. 255(1):230-242 참조). 항체-매개 이펙터 기전은 감염을 예방하기 위한 것이다; CD8+ T-세포-매개 이펙터 기전은 바이러스-감염 세포를 인식하고 청소하기 위한 것이다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아가 골수성 세포를 감염시키기 때문에, 면역자극성 박테리아는 T-세포 매개 반응을 포함하여 T-세포에의 항원 제시를 증강시킬 수 있다. 항원-특이적 세포독성 T-림프구(CTL)는, 포유류 세포의 세포기질성 단백질에 대한 제시 경로인, 세포 표면 상에서 주조직적합성 복합체 부류 I(MHC I)과의 복합체로 존재하는 항원과의 상호작용에 의해 활성화되는 CD8+ T-세포의 하위군이다. 항원은 박테리아 병원체에 의해 합성되거나, 박테리아 백신은 항원을 세포질 내로 방출시켜, CTL에 의한 세포성 면역 반응을 이끌어낸다. 이러한 활성화 후, CTL은 관련 항원 펩타이드를 MHC I과의 복합체로 표시하는 감염된 세포에 대해 유도된다. 항원은 또한, 항체의 B-세포 생산을 촉진할 수 있는 CD4+ 헬퍼 세포에게 APC(항원-제시 세포) 상의 MHC 부류 II 분자에 의해 직접적으로 제시될 수 있다.
선행 박테리아 백신 및 항병원체 전략의 한계는 이것이 박테리아 감지 경로를 본원에 기재된 바와 같이 강한 적응성 항바이러스 또는 항종양 면역력을 유발하지 않는 아쥬반트로서 의존한다는 점이다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 이러한 한계를 해결한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 강한 바이러스-감지 면역 경로의 맥락에서 효과적인 항바이러스 백신화, 및 또한 항종양 치료를 유발하는 바이러스 항원을 포함한 이종성 단백질 및 다른 항바이러스 치료제의 프라이밍을 제공한다. 본원에 상술된 바와 같이, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 많은 박테리아 TLR 감지 경로가 결여되고, 항바이러스 경로를 보유하는 한편 내재성 항박테리아 반응으로의 면역력의 왜곡(skewing)을 무효화시킨다. 바이러스 감염 동안, 뿐만 아니라 암을 갖는 대상체에서, 톨-유사 수용체(TLR), 레티노산 유도적 유전자-I(RIG-I)-유사 수용체(RLR), 및 세포질 DNA 센서를 포함한 내재성 면역 신호전달 경로는 항바이러스 분자, 예컨대 유형 I 인터페론(IFN) 및 전염증성 사이토카인의 합성을 위해 활성화된다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 게놈 변형, 및 또한, 인코딩된 치료적 카고(cargo)(들), 예컨대 STING 단백질 및 변형된 STING 단백질, 사이토카인 및 케모카인으로 인해 이러한 경로를 자극시키도록 설계된다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 유리하게는 게놈 변형으로 인해, 그리고 선택적인 인코딩된 치료 생성물은 자연상에서 항바이러스에 대한 숙주 면역 반응을 지시할 수 있다. 논의된 바와 같이 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 인코딩된 항병원체 치료 생성물, 예컨대 항원, 항체 및 다른 인코딩된 치료제를 전달하기 위해 골수성 세포를 감염시키고, 숙주의 면역 반응을 증강시키기 위해 추가의 생성물, 예컨대 면역자극성 단백질을 인코딩할 수 있다. 그러므로, 면역자극성 박테리아는n 병원체 상에서 여러 가지 공격을 제공할 수 있다.
종양을 갖는 대상체에서 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양-체류 면역 세포에 축적된다. 종양을 갖지 않는 대상체에서, 박테리아는, 진핵 머시너리에 의해 판독되고 이의 자연 맥락에서 단백질을 생산할 수 있는 플라스미드를 매우 잘 전달할 수 있는 세포인 포식성 항원-제시 세포(APC)를 주로 또는 이것만 감염시킨다. 플라스미드는 예를 들어, 바이러스 항원 및 다른 항바이러스 치료제를 포함한 단일의 또는 다수의 이종성 단백질을 인코딩하고, 또한 항바이러스 면역-감지 경로를 유도하는 단일의 또는 다중화된 면역 페이로드를 인코딩할 수 있다. 결과는 적절한 APC 활성화 및 T-세포의 항원 프라이밍이며, 이는 억제성 골수성 세포가 적응 면역력을 방지하는 만성 감염 환경에서도 지속적인 체액성 및 세포성 항바이러스 면역을 유발한다.
그러므로, 단백질 항원과 항체, 및 병원체에 대한 백신화 또는 지속적 바이러스 감염을 포함하여 생성된 감염의 치료를 위한 다른 치료제를 전달하는 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 병원체는 질환 및 장애를 야기하는 박테리아, 원생동물, 바이러스, 및 프리온, 및 다른 프리온-유사 입자를 포함한다. 면역자극성 박테리아 중에는 그리고 이러한 박테리아의 예는 살모넬라, 예컨대 에스. 티피무리움의 균주/종이다. 면역자극성 박테리아는 박테리아 또는 진핵 프로모터의 제어 하에 항병원체 생성물을 인코딩할 수 있다. 프로모터는 항시적일 수 있거나 유도적일 수 있다. 프로모터 및 다른 조절 서열의 선택은 특정 생성물, 생성물의 발현 시기, 및 박테리아의 사용, 예컨대 이것이 기존의 감염의 치료를 위한 것인지 또는 백신화를 위한 것인지의 여부를 포함한 인자에 의존한다. 일반적으로 asd - 인 박테리아는 플라스미드 상에서 asd를 인코딩하여 항생제 선택 카세트에 대한 임의의 필요성 없이 박테리아에 의한 숙주 세포의 감염 시 복제를 허용할 수 있다. 이는 박테리아가 생체내에서 복제되는 것을 허용한다. 대안으로서, 자살 시스템은 페이로드(즉, 치료 생성물)를 조직-체류 골수성 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, 박테리아는 생체내에서 보완 asd 유전자 카세트를 함유하는 플라스미드가 결여된 asd - 균주를 사용하여 투입된다. 시험관내에서, 디아미노피멜산(DAP)은 기능적 asd 유전자의 부재 하에 박테리아 복제를 용이하게 하기 위해 첨가된다; 이러한 박테리아는 생체내에서 성장할 수 없다. 박테리아 핵산의 하나의 볼루스는 포식작용 및 박테리아의 세포내 파괴 후 조직-체류 골수성 세포로 전달된다.
살모넬라를 포함한 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 감염된 유기체에서 항원-제시 세포(APC)를 포함한 골수성 세포를 특이적으로 표적화한다. APC는 림프절, 비장 및 간 내로 이동하여, 림프절 체류 T-세포에의 발현된 항원의 제시를 제공할 수 있다. 박테리아는 수지상 세포에 의해 흡수될 수 있으며, 이 세포는 그 후에 MHC I 및 MHC II에 의한 제시 경로를 위한 항원을 발현하고, 이는 다시 특이적 T-세포 반응을 개시한다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 병원체, 예컨대 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2로서, COVID-19를 야기함), 포르피로모나스 긴기발리스, 및 본원에 제시되고/되거나 당업자에 알려진 바와 같은 다른 것에 대해 보호하기 위해 백신으로서 또는 바이러스 항원 및/또는 다른 단백질을 인코딩하기 위해 사용될 때 이러한 경로를 활용할 수 있다. 표적은 단백질, 예컨대 코로나바이러스의 스파이크 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 438 참조), 및 포르피로모나스 긴기발리스의 긴기파인(gingipain) 프로테아제(예를 들어, SEQ ID NO: 442-447 참조), 특히 피. 긴기발리스 균주 ATCC 332277로부터의 라이신-긴기파인 프로테아제(Kgp 또는 Lys-긴기파인)(예를 들어, SEQ ID NO: 444 참조), 및 균주 83, FDC381, 및 HG66을 포함한 포르피로모나스 긴기발리스의 다른 균주로부터의 라이신-긴기파인 프로테아제(예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 445-447)를 포함한다. 박테리아 병원체는 예를 들어, 에스케리키아, 클레브시엘라(Klebsiella), 스타필로콕커스, 악시네토박터(Acinetobacter), 및 슈도모나스의 종, 특히 약물-내성 종 및 균주를 포함한다. 당업자는 항원을 표적에 식별시킬 수 있다. 항종양 적용을 위해, 종양 항원(예를 들어, 예시적인 종양 항원에 대한 예), 및 프로테아제, 역전사효소(RNA 바이러스의 경우), 및 DNA 폴리머라제, 및 다른 복제 효소가 표적일 수 있다. 병원체성 박테리아의 예시적인 종은: 이. 콜라이, 에스. 아우레우스(S. aureus), 피. 애루기노사(P. aeruginosa), 케이. 뉴모니애(K. pneumoniae), 이. 패칼리스(E. faecalis), 및 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)를 팬데믹으로 되게 하는 원인 제제(causative agent)인 신규 베타-코로나바이러스이다. 코로나바이러스 비리온은 숙주 세포 안지오텐신-전환 효소 2(ACE2) 수용체에 결합하고 숙주 막과 바이러스 막의 융합을 통해 진입을 매개하는 자가 표면 스파이크(S) 당단백질을 함유한다. ACE2 수용체에의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합은 준안정한 융합전 회전배열로부터 고도로 안정한 융합후 회전배열로의 스파이크 단백질의 더 큰 회전배열 재배열을 야기하며, 이는 막 융합을 용이하게 한다. 이것이 세포 부착 및 진입을 매개하기 때문에, 스파이크(S) 단백질은 바이러스 생활 주기에 필수적이며, 중화 항체에 대한 1차 표적이고, 중요한 백신 항원이다(예를 들어, Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505).
최상의 또는 양호한 CD8+를 초래한 SARS-COV2 바이러스 단백질은 하기를 포함한다(Cohen et al. (2021) Cell. Rep. Med. 2:100354):
Figure pct00021
스파이크 단백질의 S1 하위단위 내 수용체-결합 도메인(RBD; 예를 들어, SEQ ID NO: 440 참조)은 ACE2와 직접적으로 상호작용한다. S 단백질의 준안정한 융합전 회전배열은 "놓거나 아래로(laying or down)"인 것으로 지칭될 수 있는 한편, ACE2-실현 가능한 회전배열로의 회전배열 재배열은 "위로 또는 서 있는(up or standing)" 것으로 지칭될 수 있다. "아래로" 및 "위로"의 자세는 RBD의 회전배열 재배열에 기초하여 구별될 수 있다; 아래-위(down-to-up) 재배열은 수용체 결합을 용이하게 하는 한편, 위-아래(up-to-down)의 재배열은 바이러스가 면역 감시를 피하는 것을 돕는다(예를 들어, Shah et al. (2020) Computational and Structural Biotechnology Journal 18:3401-3414).
ACE2 수용체에의 결합에 뒤이어 막횡단 프로테아제 세린 2(TMPRSS2)의 절단이 이어진다. ACE2와 TMPRSS2는 둘 다 기도, 폐, 및 비강/구강 점막, 뿐만 아니라 장에서 풍부하게 발현된다. S 단백질에서 천연 발생 돌연변이는 중국(H49Y), 유럽(V367F 및 D614G), 및 미국(G476S 및 V483A)에서 식별되어 왔고, SARS-CoV-2의 세포 진입에 미치는 이의 효과에 대해 연구되어 왔다; ACE2 및 TMPRSS2를 발현하는 세포에서, G476S 돌연변이는 감소된 세포 진입을 초래하고, V483A 돌연변이는 세포 진입에 어떠한 효과도 갖지 않는 반면, D614G, V367F, 및 H49Y 돌연변이는 야생형 S 단백질과 비교하여 증강된 세포 진입을 초래한다. D614G 돌연변이는 인간 소기도 상피 세포에서도 관찰된 효과인, 야생형 S 단백질과 비교하여 3.5배 더 높은 수준의 진입 활성을 나타낸다. D614G 돌연변이는 또한 ACE2 수용체에 대해 증가된 결합 친화도를 초래한다. 더욱이, D614G 돌연변이체는 SARS-CoV-2 바이러스의 중화 민감도를 보유한다; 항-SARS-CoV-2 환자 혈청은 야생형 SARS-CoV-2와 D614G 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2를 둘 다 효과적으로 중화시킬 수 있었다(예를 들어, Ozono et al. (2021) Nature Communications 12:848). S 단백질은 삼량체로서 존재하고, 구조 분석은 D614G 돌연변이가 안정화되고 따라서 S 삼량체의 조기 해리를 방지함을 나타낸다(예를 들어, Zhang et al. (2021) Science 372:525-530). V367F 돌연변이체는 또한 2019년 12월 우한에서 처음으로 단리된 바와 같은 기준 균주 Wuhan-Hu-1과 비교하여 ACE2에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내는데, 이는 RBD 구조의 안정화로 인한 것일 수 있다. 바이러스 단리물은 또한 V367F 돌연변이와 D614G 돌연변이 둘 다로 식별되어 왔다. 계통 분석은 V367F 돌연변이가 D614G 돌연변이와 더불어 진화하였음을 시사하며, 이는 증가된 감염성의 상승작용 효과를 시사한다(예를 들어, Ou et al. (2021) bioRvix, doi:10.1101/2020.03.15.991844).
N501Y 돌연변이는 영국(B.1.1.7, 또는 20B/501Y.v1) 및 남아프리카(B.1.351, 또는 20C/501Y.v2)에서 SARS-CoV-2 계열에서 자연스럽게 출현하였고, SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD 상의 인간 ACE2 결합 부위에서 발생한다. 분자의 역동적 자극은 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD에서의 N501이 인간 ACE2의 소수성 잔기 부근에 있음을 드러낸다; 그러므로, 친수성 N501로부터 소수성 잔기로의 돌연변이는 S 단백질과 인간 ACE2 사이의 상호작용을 향상시킬 수 있다. 실험적 스크린은, V, F, W 또는 Y로의 N501의 돌연변이가 RBD와 인간 ACE2의 결합을 증강시킬 수 있음을 시시한다. 이러한 결과는 시험관내 연구에서 확증되어 왔고, 돌연변이 N501Y, N501F, N501W, 및 N501V가 스파이크 단백질의 RBD와 인간 ACE2 사이에서 증강된 결합 친화도를 초래함을 보여준다(예를 들어, Luan et al. (2021) FEBS Letters, doi:10.1002/1873-3468.14076).
"HexaPro"로 표기된 프롤린 치환 F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, 및 V987P를 갖는 SARS-CoV-2 S-2P 변이체 스파이크 단백질의 돌연변이체(예를 들어, Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505)는 이의 부모 작제물과 비교하여 증가된 발현 수준 및 안정성을 나타내었다. HexaPro 돌연변이체의 높은 수율 및 증가된 안정성은 하위단위 백신의 산업 생산을 가능하게 해야 한다; 이는 핵산 분자당 더 많은 항원을 생산하여 효능을 향상시키고/시키거나 필요한 투입량을 감소시킴으로써 DNA-기초 또는 mRNA-기초 백신을 향상시킬 수 있다(예를 들어, Hsieh et al. (2020) Science 369:1501-1505).
발현 및/또는 ACE2 수용체에의 결합을 증강시키거나 향상시킬 수 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에서의 다른 돌연변이는 예를 들어, V417K(예를 들어, Shah et al. (2020) Computational and Structural Biotechnology Journal 18:3402-3414); G502D, N501T, 및 Q498Y, 뿐만 아니라 잔기 N439/R426, L452/R426, T470/N457, E484/P470, Q498/Y484 및 N501/T487에서의 돌연변이(예를 들어, Verkhivker et al. (2021) bioRxiv preprint; doi: 10.1101/2021.02.21.432165); 및 W436R 및 D364Y(예를 들어, Ou et al. (2021) bioRvix, doi:10.1101/2020.03.15.991844; 및 미국 특허 제10, 973,908호)를 포함한다.
병원체, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2로서, COVID-19를 야기함)에 대해 보호하기 위해 백신으로서 사용되거나 바이러스 항원 및/또는 다른 단백질을 인코딩하기 위해 사용될 때 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 전장 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 438)을 인코딩할 수 있거나, SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SEQ ID NO: 440)의 전장 수용체 결합 도메인(RBD)을 인코딩할 수 있거나, 면역 반응을 유도하거나 야기하기에 그리고/또는 SARS-CoV-2에 대해 면역화하거나 백신화하거나 보호하기에 충분한 스파이크 단백질 RBD의 부분을 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한, 스파이크 단백질 또는 RBD 또는 이의 일부의 발현을 증가시키거나 증강시키고/시키거나 ACE2 수용체에의 스파이크 단백질 또는 RBD 또는 이의 일부의 결합을 증가시키거나 증강시키는, 스파이크 단백질 또는 이의 일부, 예컨대 RBD 또는 이의 일부에 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 돌연변이체를 인코딩할 수 있다. 스파이크 단백질 또는 스파이크 단백질 RBD 돌연변이체는 돌연변이 V367F, D614G, G476S, V483A, H49Y, N501Y, N501F, N501W, N501V, F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, V987P, V417K, G502D, N501T, Q498Y, W436R 및 D364Y를 포함하는 것, 및 스파이크 단백질 또는 이의 일부의 잔기 N439/R426, L452/R426, T470/N457, E484/P470, Q498/Y484 및 N501/T487에 상응하는 잔기에 돌연변이를 포함하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본원에 기재되고 당업자에게 알려진 임의의 것을 포함한다. 면역자극성 박테리아는 예를 들어, 미국 특허 제10,973,908호 및 제10,702,600호에 기재된 스파이크 단백질 또는 RBD 또는 이의 일부를 포함한 임의의 항원 서열 또는 변형된 형태를 인코딩함으로써 SARS-CoV-2에 대한 백신으로서 사용될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한, Pfizer-BioNTech COVID-19 백신, 또는 Moderna COVID-19 백신에 활용되는 mRNA 서열을 전달하기 위해 백신으로서 사용될 수 있으며, 여기서:
1) 세계 보건 기구에 의해 발표된 바와 같이 Pfizer-BioNTech COVID-19 백신에서 mRNA의 서열은 5'-캡핑 구조, 5' 비번역 영역(UTR), S 당단백질의 연장된 신호 서열, 돌연변이 K986P 및 V987P를 함유하는 전장 스파이크(S) 당단백질 서열을 인코딩하는 핵산, 및 poly(A) 테일을 포함하고, 하기 서열을 포함하며:
Figure pct00022
Figure pct00023
여기서 ψ = 1-메틸-3'-슈도우리딜릴이고, 서열은 하기 특징을 갖고:
Figure pct00024
Figure pct00025
5' 캡핑 구조의 구조는 하기이며:
Figure pct00026
m1ψ = 1-메틸-3'-슈도우리딜릴일 구조는 하기이고:
Figure pct00027
; 및
2) Moderna COVID-19 백신의 서열은 예를 들어, github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies%20of%20putative%20SARS-CoV2-spike-encoding%20mRNA%20sequences%20for%20vaccines%20BNT-162b2%20and%20mRNA-1273.docx.pdf로부터 입수 가능하다.
대안적으로, github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies%20of%20putative%20SARS-CoV2-spike-encoding%20mRNA%20sequences%20for%20vaccines%20BNT-162b2%20and%20mRNA-1273.docx.pdf로부터 입수 가능한 바와 같이 Pfizer-BioNTech COVID-19 백신에서 mRNA에 대한 서열이 사용될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 또한, 진드기-매개 및 다른 곤충-매개 질환, 및 다른 감염성 병원체, 예컨대 프리온 및 말라리아 병원체, 예컨대 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 뿐만 아니라 박테리아 및 바이러스 병원체로부터 보호하고/하거나 이를 치료하가 위해 항원을 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한, 플라스모듐, 씨. 디피실레(C. difficile), 및 리스테리아를 포함한 박테리아 및 원생동물 병원체에 대한 백신으로서 사용될 수 있다. 살모넬라 및 다른 박테리아는 백신에 사용되어 왔고; 임의의 이러한 기지의 백신은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 항원(들)을 인코딩함으로써 향상될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 병원체, 특히 바이러스 병원체에 대한 면역력 또는 면역 반응을 유도하여 효과적인 항체 및 T-세포 반응을 초래할 수 있다. 면역자극성 박테리아, 예컨대 살모넬라 박테리아는 이러한 박테리아가 골수성 세포를 주로 또는 단독으로 감염시키게 하는 변형을 포함하고, 항바이러스 면역 반응을 자극시키거나 유도하는 치료 생성물, 예컨대 항원 및 항체, 뿐만 아니라 추가의 면역-자극 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 전달한다. 면역자극성 박테리아는 이러한 항원-제시 세포를 감염시키며, 여기서 인코딩된 치료 생성물(들)이 발현된다.
면역자극성 박테리아는 항원을 인코딩할 수 있으며, 이는 바이러스 또는 박테리아 또는 다른 병원체가 감염된 세포에 도달하기 전에 이를 인식하는 항체를 포함하여 항체를 생산하는 숙주의 면역계를 초래한다. 항바이러스로서 사용하기 위한 면역자극성 박테리아는 항원을 인코딩할 수 있을 뿐만 아니라, 이는 항체 및 면역자극성 단백질을 인코딩하여 숙주의 항바이러스 반응을 증강시킬 수 있다. 백신으로서 사용하기 위해, 항원 및 다른 이종성 단백질을 인코딩하는 면역자극성 박테리아는 면역을 초래하거나 질환의 감소된 중증도를 초래하거나, 지속적 바이러스 감염의 재발을 방지한다. 인코딩된 항체는 이의 단일-사슬 형태, 예컨대 단일-사슬 가변 단편(scFv), 나노체(nanobody), 및 다른 이러한 구조를 포함한다. 항바이러스 면역 반응을 증강시키거나 촉진하는 인코딩 면역자극성 단백질(본원에 기재됨), 예컨대 STING으로부터 유래되는 것 및 또한 박테리아의 게놈 변형, 예컨대 아스파라기나제 II의 발현을 무효화시키거나 감소시켜 T-세포 반응을 증강시키는 변형을 포함한 박테리아의 면역자극성 특성은 유형 I IFN의 활성화를 포함하여 강력한 항병원체 치료제를 초래한다. 본원에 논의된 바와 같이, 비활성화된 병원체 백신, 예컨대 결핵에 대한 BCG 백신은 병원체를 변형시켜 아스파라기나제 활성을 비활성화시키거나 무효화시킴으로써 향상될 수 있다. 아스파라기나제는 백신에 대한 면역 반응을 감소시키거나 저해할 수 있다; 아스파라기나제 활성을 무효화시키거나 감소시키는 것은 백신, 예컨대 BCG 백신의 효과성을 향상시킬 수 있다.
F. 박테리아 전달을 위한 치료 생성물을 인코딩하는 예시적인 플라스미드의 작제
본원에서 면역자극성 박테리아는 항종양 반응을 촉진하거나, 유도하거나, 증강시킬 수 있는 면역조절성 단백질을 포함한 하나 이상의 치료 생성물을 인코딩하도록 변형될 수 있다. 치료 생성물은 진핵생물 대상체, 특히 면역자극성 박테리아가 투여될 대상체, 예컨대 인간에서의 발현을 위해 진핵생물 프로모터, 예컨대 RNA 폴리머라제 II에 의해 인식되는 프로모터의 제어 하에 박테리아 내 플라스미드 상에서 인코딩될 수 있다. 치료 생성물(들)을 인코딩하는 핵산은 진핵생물 프로모터에 더하여, 세포에서의 발현 또는 트래피킹을 위해, 예컨대 세포 표면 상에서의 분비 또는 발현을 위해 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. 면역자극성 단백질은 적절한 환경, 예컨대 종양 미세환경(TME)에서 면역자극성 박테리아가 투여되는 대상체에 의한 항종양 반응을 촉진하거나 이에 참여하거나 이를 증강시킬 수 있는 것이다. 면역자극성 단백질은 사이토카인, 케모카인, 및 공동자극성 분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이는 사이토카인, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, IL-2, IL-7, IL-12, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-15/IL-15Rα 사슬 복합체, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, IFN-α, 및 IFN-β; 케모카인, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10, 및 CXCL11; T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질; 및/또는 공동자극성 분자, 예컨대 그러나 이로 제한되지 않는, CD40, CD40L, OX40, OX40L, 4-1BB, 4-1BBL, 세포질 도메인의 결실을 갖는 4-1BBL(4-1BBLΔcyt), ICOS, ICOS 리간드, CD27, CD27 리간드, CD80, CD86, TNF/TNFR 슈퍼계열의 구성원, 및 B7-CD28 계열의 구성원을 포함한다. 당업자에게 알려진 종양의 치료에 사용되거나 항종양 반응을 촉진하거나, 증강시키거나, 다르게 증가시키거나 발생시킬 수 있는 다른 이러한 면역자극성 단백질은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에서 인코딩하는 데 고려된다.
본원의 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩되는 다른 치료 생성물은 STING, MDA5, RIG-I, IRF3 및 IRF7을 포함하여 유형 I 인터페론 생산을 유도하거나 활성화시키는 세포질 DNA/RNA 센서, 뿐만 아니라 이의 기능-획득 및 항시적 활성 변이체, 및 본원에 기재된 바와 같은 키메라 STING 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 항시적으로 활성인 STING 변이체는 돌연변이 V147L, N154S, V155M, C206Y, R281Q, 및/또는 R284G, 및 이의 조합, 예컨대 N154S/R284G, 및 본원에 기재되고 당업계에 알려진 다른 것을 포함하는 반면, 항시적으로 활성인 IRF3 변이체는 돌연변이 S396D, S398D, S402D, T404D, 및/또는 S405D, 및 본원에 기재되고 당업계에 알려진 다른 돌연변이를 갖는 것을 포함한다. 본원의 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩되는 다른 치료 생성물에는 단일 사슬 단편 가변(scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화 결합 Fv(dsFvs), Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 Fab(scFab), 이중체, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간 항체, 비-인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 인트라바디, 또는 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 비롯한 항체 및 항체 단편이 포함된다. 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, IDO 1 및 2, CTNNB1(β-카테닌), SIRPα, VISTA 및 TREX-1 및 다른 당업계에 알려지거나 본원에 기재된 바와 같은 면역 체크포인트에 대해 지시될 수 있거나, TGF-β, VEGF, HER2, EGFR, STAT3 및 IL-6과 같은 다른 표적, 및 저해가 항종양 반응을 개선하는 다른 이러한 표적에 대해 지시될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한 TREX1과 같은 면역 체크포인트에 대한 siRNA(shRNA 및 miRNA)와 같은 RNAi, 및 저해, 억제 또는 방해가 항종양 반응을 개선하는 다른 표적을 인코딩할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 면역자극성 박테리아는 IL-2, IL-7, IL-12(IL-12p70(IL-12p4 0+ IL-12p35)), IL-15(및 IL-15:IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15/IL-Rα)), IL-18, IL-21, IL-23, IL-36 감마, IFN-알파 및 IFN-베타를 포함하지만 이로 제한되지 않는 면역계를 자극하기 위해 하나 이상의 사이토카인을 인코딩하도록 조작된다. 사이토카인은 종양 부위에서 면역 이펙터 세포와 기질 세포를 자극하고 세포독성 세포에 의한 종양 세포 인식을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 면역자극성 박테리아는 예를 들어 CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 및 CXCL11 중 하나 이상과 같은 케모카인을 인코딩하도록 조작될 수 있다. 임의의 치료 생성물의 상보적 조합은 인코딩되어 종양 미세환경으로 전달되어 면역자극성 박테리아의 항종양 효능을 향상시킬 수 있다. 이러한 변형 및 이를 인코딩하는 면역자극성 박테리아는 위에서 논의되고 아래에 예시되어 있다.
1. 단백질의 이종성 발현을 위한 항시적 프로모터
본원에 제공된 플라스미드는 포유동물 대상체에서 발현될 때 종양 미세환경에서 항종양 면역력을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질과 같은 치료 생성물을 인코딩하도록 설계되었으며; 면역자극성 단백질 또는 다른 치료 생성물은 RNA 중합효소 II(RNAP II)에 의해 인식되는 프로모터와 같은 진핵 프로모터의 제어 하에 박테리아의 플라스미드에 인코딩된다. 일반적으로 프로모터는 후기 진핵생물 바이러스 프로모터와 같은 항시적 프로모터이다. 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 및 이의 유도체 프로모터 CAGG 또는 CAG, β-글루쿠로니다제(GUSB) 프로모터, MND 프로모터(골수증식성 육종 바이러스 인핸서 및 결실된 음성 대조군 영역이 있는 변형된 MoMuLV(몰로니 뮤린 백혈병 바이러스) LTR의 U3 영역을 포함하는 합성 프로모터), 진핵생물 개시 인자 4A-I(EIF4A1) 프로모터, CD68 프로모터 및 GAPDH 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다(예를 들어, Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57). CAG 프로모터는 하기로 구성된다: (C) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소; (A) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론; 및 (G) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체. MND는 변형된 MoMuLV(몰로니 뮤린 백혈병 바이러스) LTR의 U3 영역과 골수증식성 육종 바이러스 인핸서 및 결실된 음성대조군 영역과 함께 포함하는 합성 프로모터이다(뮤린백혈병 바이러스 유래 MND 프로모터(골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성대조군 결실, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환됨), 예를 들어 Li 등 (2010) J. Neurosci. Methods 189:56-64 참조).
이들 프로모터 중 2개 이상은 플라스미드 상의 다중 개방 리딩 프레임(ORF)에 인코딩될 수 있다. CMV를 포함하지만 이로 제한되지 않는 특정 프로모터는 다중 cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB) 부위를 포함한다. 이러한 요소를 포함하는 플라스미드가 세포질로 방출될 때, 예를 들어 박테리아 방해 후 세포질로 방출되는 에스. 티피무리움 내에 포함된 플라스미드는 CREB-매개 숙주 미세소관 기구를 사용하여 핵으로 효율적으로 셔틀될 수 있다(예를 들어, Bai 등 (2017) Biosci. Rep. 37(6):BSR20160616).
플라스미드는 asd의 발현을 위한 박테리아 프로모터, 및 치료제의 발현을 위한 진핵생물 프로모터를 포함하는 다중 프로모터를 포함할 수 있다. 다양한 구성의 프로모터 및 다른 조절 서열이 치료 생성물의 발현을 개선하고 박테리아 성장 및 적합성을 개선하기 위해 평가되었다. 예를 들어, 시험된 구성 중에서 플라스미드 상의 진핵생물 발현 카세트의 방향을 역전시키고 하나 이상의 박테리아 종결인자를 포함하는 것은 인코딩된 페이로드 발현의 효율을 증가시킬 수 있고 박테리아 적합도를 개선할 수 있다.
2. 다수의 치료 생성물 발현 카세트
a. 단일 프로모터 작제물
단일 작제물로부터 동일한 세포에서 다중 유전자의 발현이 달성될 수 있으며, 항종양 반응과 같은 원하는 생물학적 효과를 이끌어내기 위해 여러 단백질의 동시 발현이 필요할 때 유리하다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열은 단일 프로모터의 제어 하에 2개의 인코딩 서열을 분리하는 데 사용되었지만, 제2 단백질의 발현 수준은 제1 단백질와 비교하여 감소될 수 있고, IRES 서열의 길이는 포장 용량이 작은 바이러스를 사용할 때와 같은 특정 경우에는 금지된다. 리보솜 건너뛰기 이벤트를 매개하는 2A 펩타이드로 알려진 짧은(약 18개 내지 22개 아미노산 길이) 바이러스 유래 펩타이드 서열의 발견으로 단일 mRNA에서 유사한 수준의 여러 개별 펩타이드 생성물을 생성할 수 있다. 2A 펩타이드 인코딩 서열은 폴리펩타이드-코딩 이식유전자 사이에 포함된다(예를 들어, Daniels 등 (2014) PLoS One 9(6):e100637 참조).
IRES 요소 및 2A 펩타이드는 하나의 전사체에서 여러 유전자의 공동 발현을 위해 상이한 기전을 사용한다. 예를 들어, IRES 요소를 사용하여 하나의 mRNA에서 여러 유전자를 발현하는 경우, 프로모터의 바로 다운스트림에 있는 유전자는 표준 캡 의존성 기전에 의해 번역되고 IRES 요소의 다운스트림에 있는 유전자는 캡-독립적 기전에 의해 번역되며, 이는 캡 의존성 메카니즘보다 번역 효율이 낮아 IRES 구동 유전자의 낮은 발현과 함께 불균형 발현을 초래한다(예를 들어, Chng 등 (2015) mAbs 7(2):403-412 참조). 반면에 2A 연결된 유전자는 하나의 개방 리딩 프레임(ORF)에서 번역된다. 2A 서열에 의해 분리된 단백질의 절두는 펩타이드 결합이 종종 2A 펩타이드의 C-말단 글리신과 프롤린 사이에서 형성되지 않는(즉, 펩타이드 결합이"건너뛴") 비전통적인 과정에서 동시 번역적으로 발생한다. 그럼에도 불구하고 번역이 진행되고 두 개의 별개의 단백질이 동일한 양으로 생성된다. 2A 펩타이드 서열의 약 20개 아미노산을 인코딩하는 짧은 스트레치는 결합 건너뛰기를 유발하기에 충분하다. 그러나 결합 건너뛰기가 발생하지 않으면 이후에 절두되지 않는 융합 단백질이 생성된다(예를 들어, Daniels 등 (2014) PLoS One 9(6):e100637 참조).
이들 2A 펩타이드 중 다수는 테사 아시그나 바이러스로부터의 T2A(예를 들어 SEQ ID NO: 327 참조), 돼지 테스코바이러스-1로부터의 P2A(예를 들어 SEQ ID NO: 328), 말 비염 A 바이러스로부터의 E2A(SEQ ID NO: 329 참조), 및 구제역 바이러스로부터의 F2A(예를 들어 SEQ ID NO: 330 참조)를 포함한다. 여러 연구에서 다양한 2A 펩타이드의 상충되는 절단 효율이 보고되었으며, 2A 펩타이드의 절두 효율은 발현된 단백질의 특성, 2A 서열을 플랭킹하는 유전자의 순서, 사용된 2A 펩타이드의 길이 및 업스트림 단백질과 2A 펩타이드 사이의 링커에 의해 영향을 받을 수 있다. 절단 효율 및 강화된 단백질 발현은 종종 펩타이드 푸린 절단 서열, RRKR과 같은 업스트림 바이러스 절단 서열의 사용을 통해 개선될 수 있을 뿐만 아니라 GSG 및 SGS 펩타이드 링커, V5 에피토프 태그(GKPUPNPLLGLDST), 또는 2A 바로 앞에 있는 3xFlag 에피토프 태그를 삽입함으로써 개선될 수 있다(예를 들어, Chng 등 (2015) mAbs 7(2):403-412 참조).
단일 프로모터 및 ORF를 갖는 면역조절 단백질과 같은 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 본원의 면역자극성 박테리아는 캡 독립적인 바이러스 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용을 통해 또는 2A 펩타이드의 번역 판독 및 동일하게 발현된 공동 단백질로의 후속 자가 절단을 통해 2개 이상의 단백질을 발현할 수 있다. 플라스미드는 하기 및 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 다른 조절 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 작제물(실시예 14 참조)은 CMV-muIL-2 CO_T2A_muIFN-α2-WPRE이며, 여기서 코돈 최적화된 뮤린 IL-2는 CMV 프로모터 및 T2A 펩타이드를 사용하여 뮤린 IFN-α2와 공동 발현된다. 또한 WHP(우드척 간염 바이러스) 전사후 조절 요소(WPRE)가 포함되어 발현을 향상시킨다. 예를 들어, 제3 치료제가 플라스미드에 의해 발현되는 경우, 2A 서열은 제1 프로모터, 예를 들어, CMV의 제어 하에 발현되는 처음 2개의 단백질에 의해 플랭킹되고, 제3 단백질은 제2 프로모터, 예를 들어 EF-1α의 제어 하에 인코딩된다. 이러한 작제물의 예는 CMV-muIL-15Rα/IL-15sc_T2A_muSTING-R283G + EF-1α-muIL-18-WPRE이며, 여기서 뮤린 15Rα/IL-15sc 및 대체 R283G 또는 N153S/R283G(인간 STING에서 R284G 또는 N154S/R284G에 각각 상응함)를 갖는 뮤린 STING은 T2A를 사용하는 CMV 프로모터의 제어 하에 공동발현되고 뮤린 IL-18은 EF-1α 프로모터의 제어 하에 별도로 발현된다. 이 예시적인 작제물은 또한 향상된 발현을 위해 WPRE를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 면역자극성 박테리아는, 인코딩된 항원(들)이 박테리아에서 전사를 위해 박테리아 프로모터의 제어 하에 발현되지만 박테리아에서의 번역을 방지하는 조절 서열, 예컨대 IRES를 포함하나, 진핵 숙주, 예컨대 인간에서의 번역을 용이하게 하거나 허용하는 백신으로서 사용될 수 있다. 이러한 항원을 인코딩하는 핵산 작제물은 선택적으로 추가의 면역계/반응 증강 단백질, 예컨대 STING 단백질, 및/또는 사이토카인, 및/또는 다른 조합을 인코딩할 수 있으며, 이는 효과면에서 아쥬반트로서 작용한다.
b. 이중/다중 프로모터 작제물
대안적으로, 유전자 페이로드/치료 생성물은 이중 또는 다중 프로모터 구성을 사용하여 발현될 수 있으며, 여기서 각각의 단백질은 별도의 프로모터의 제어 하에 발현된다. 따라서, 조합으로 발현되는 면역조절 단백질과 같은 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드는 다중 프로모터를 함유할 수 있으며, 각각은 적절한 정지 코돈 처리(즉, 이중/다중 프로모터 구성)로 개별 온전한 ORF를 제어하며; 또는 다중 단백질은 2A 펩타이드(즉, 단일 프로모터 작제물)의 사용을 통해 단일 ORF에서 발현될 수 있으며; 또는 플라스미드는 상기 기재된 바와 같이 3개 이상의 단백질을 발현하기 위해 단일 및 이중/다중 프로모터 작제물의 혼합물을 함유할 수 있다.
3. 조절 요소
a. 전사-후 조절 요소
단일 플라스미드로부터 단일 및 다중 치료제/면역조절 단백질의 발현을 향상시키기 위해, 관심 단백질(들)의 전사 및 번역을 향상시키는 조절 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 우드척 간염 바이러스(WPRE)의 전사후 조절 요소(PRE)는 ORF의 3' 비번역 영역에 삽입될 때 발현 수준을 몇 배 향상시킬 수 있다(예를 들어, Zufferey et al. (1999) J. Virol. 73(4):2886-2892). 유사하게는, B형 간염 바이러스 PRE(HPRE)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 요소도 발현을 향상시킬 수 있다. 이의 조합은 단일 플라스미드에서 다중 단백질의 발현을 개선하기 위해 다중 ORF의 3' 말단에 사용될 수 있다.
PRE WPRE 및 HPRE는 핵으로부터 mRNA 내보내기를 촉진하여 세포질 mRNA의 축적을 증가시킬 수 있고, 전사후 가공 및 안정성을 향상시킬 수 있는 헤파드나바이러스 cis-작용 RNA 요소이다.
b. 폴리아데닐화 신호 서열 및 종결인자
단백질 발현을 향상시킬 수 있는 플라스미드의 다른 요소에는 폴리아데닐화 신호 서열 및 종결인자가 포함된다. 폴리아데닐화는 번역을 위해 성숙한 mRNA를 생성하는 과정의 일부인 mRNA 전사체의 3' 단부에 폴리(A) 테일을 전사후 첨가하는 것이다. 폴리아데닐화 신호 서열은 핵 외수송, mRNA 안정성 및 효율적인 번역에 중요하다. 종결인자는 전사체의 단부를 한정하여 자유 3' 단부를 만들고 전사 머시너리로부터 새로 합성된 mRNA의 방출을 개시하는 서열이다. 그러면 폴리(A) 테일을 첨가하기 위해 자유 3' 단부를 사용할 수 있다. 종결인자는 전사되는 유전자의 다운스트림에서 발견되며 일반적으로 폴리아데닐화 또는 폴리(A) 신호와 같은 3' 조절 요소 바로 뒤에 발생한다. 발현 플라스미드에서 일반적으로 사용되는 포유동물 종결인자는 시미안 바이러스 40(SV40), 인간 성장 호르몬(hGH), 소 성장 호르몬(BGH 또는 bGH) 및 토끼 베타-글로빈(rbGlob) polyA 서열을 포함하며, 이는 서열 모티프 AAUAAA(SEQ ID NO: 398)를 포함하고, 폴리아데닐화와 종결을 둘 다 촉진한다.
ORF의 3' 단부에 위치할 때, 시미안 바이러스 40 폴리 A(SV40pA) 또는 소 성장 호르몬 폴리 A(bGHpA) 신호와 같은 서열은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 발현을 몇-배 증가시킨다(예를 들어, Powell et al. (2015) Discov. Med. 19(102):49-57). 이러한 요소 및 다른 이러한 요소는 단일 플라스미드에서 발현되는 면역조절 단백질을 비롯한 여러 치료제의 발현 및 번역을 추가로 향상시킬 수 있다.
c. 인핸서
프로모터와 인핸서는 플라스미드에서 다중 복제 부위(MCS)의 업스트림에서 발견되며 전사 속도를 결정하기 위해 협력한다. 인핸서는 DNA를 루프하고 특정 프로모터를 개시 복합체에 가져오기 위해 활성화제 단백질에 결합하여 전사 속도를 증가시키는 서열이다. 이는 영향을 미치는 프로모터에 인접하거나 멀리 있을 수 있으며 CMV, EF-1α, SV40 및 합성 인핸서, 또는 MND 프로모터를 포함하며, 이는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서와 함께 변형된 MoMuLV(몰로니 뮤린 백혈병 바이러스) LTR의 U3 영역을 포함하는 합성 프로모터이다. 본원의 면역자극성 박테리아는 플라스미드 상에 인코딩된 치료 생성물/단백질의 발현을 증진시키기 위한 인핸서(들)를 포함할 수 있는 플라스미드를 함유한다.
d. 분비 신호
신호 서열 또는 펩타이드, 리더 서열 또는 펩타이드, 또는 국소화 신호 또는 서열로도 알려진 분비 신호는 분비될 새로 합성된 단백질의 N-말단에 있는 짧은 펩타이드이다. 신호 펩타이드는 일반적으로 세포막으로 단백질을 전위하도록 세포를 촉진한다. 단백질 분비의 효율성은 신호 펩타이드에 의해 강하게 결정된다. 따라서, 본원의 면역자극성 박테리아는 인코딩된 치료제(들)의 발현 또는 분비를 촉진 및/또는 증가시키기 위해 신호 펩타이드/분비 신호 펩타이드를 포함할 수 있는 플라스미드를 함유한다.
e. 박테리아 적합도의 향상
치료 생성물을 인코딩하는 면역자극성 박테리아의 플라스미드에는 박테리아 유전자의 발현과 복잡한 다시스트론성 진핵생물 페이로드의 발현을 위해 제공되는 유전자 및 조절 요소가 포함된다. 이러한 진화적으로 분기된 유기체 사이의 전환은 원핵생물과 진핵생물에서 적절한 기능에 대한 문제를 야기한다. 박테리아는 시험관 내에서 배양된 다음, 페이로드가 발현, 처리 및 트래피킹되는 암 대상체의 세포, 특히 종양-체류 골수성 세포에 플라스미드가 전달되는 진핵 대상체에게 투여된다. 박테리아에서 CMV 프로모터와 같은 진핵 프로모터로부터의 전사 누출은 큰 진핵생물 유전자 및 조절 서열과 결합되어 낮은 주입 스톡 생존율로 나타나는 감소된 박테리아 적합성, 및 및 배양물 배양에서 감소된 성장률을 초래할 수 있다.
4. 복제 원점 및 플라스미드 복제수
플라스미드는 복제 원점을 통해 박테리아 내에서 유지되는 자율 복제, 염색체외, 원형 이중 가닥 DNA 분자이다. 복제수는 플라스미드 안정성에 영향을 미친다. 고-복제수는 일반적으로 세포 분열에서 무작위 분할이 발생할 때 플라스미드의 더 큰 안정성을 초래한다. 플라스미드의 고-복제수는 일반적으로 성장 속도를 감소시키며, 따라서 플라스미드가 거의 없는 박테리아 세포가 더 빨리 성장하기 때문에 배양을 지배할 수 있다. 이는 고-복제수로 존재할 때 박테리아에 유독할 수 있는 플라스미드 상의 특정 유전자의 발현을 제한하는 유전자 약독화 및 유전자 투여 전략을 사용하여 개선될 수 있다. 복제의 기원은 또한 플라스미드의 호환성, 즉 동일한 박테리아 세포 내에서 다른 플라스미드와 함께 복제하는 능력을 결정한다. 동일한 복제 시스템을 사용하는 플라스미드는 동일한 박테리아 세포에 공존할 수 없으며; 동일한 호환성 군에 속한다고 한다. 동일한 호환성 군의 제2 플라스미드 형태로 새로운 기원의 도입은 상주 플라스미드 복제 결과를 모방한다. 따라서 두 플라스미드가 올바른 복제전 복제수를 생성하기 위해 다른 세포로 분리될 때까지 추가 복제가 방지된다.
다수의 박테리아 복제 원점이 당업자에게 알려져 있다. 원점을 선택하여 원하는 복제수를 얻을 수 있다. 복제 원점은 DNA-의존성 DNA 중합효소를 통한 플라스미드 복제의 개시 부위로 인식되는 서열을 포함한다(예를 들어, del Solar 등 (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2):434-464 참조) . 상이한 복제 원점은 각각의 세포 내에서 다양한 플라스미드 복제 수준을 제공하며 세포당 1개에서 수백 개의 복제 범위일 수 있다. 일반적으로 사용되는 박테리아 플라스미드 복제 원점에는, pUC와 같은 매우 높은 복사 유도체와 pBR322와 같은 낮은 복사 유도체, ColE1, p15A 및 pSC101을 갖는 pMB1 유래 원점, 및 낮은 복제수를 가진 다른 원점이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 원점은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, pUC19 기원은 세포당 500-700개 사본의 복제수를 생성한다. pBR322 기원은 세포당 15-20개 사본의 알려진 복제수를 갖고 있다. 이러한 기원은 단일 염기쌍에 의해서만 다르다. ColE1 원점 복제수는 15-20이고, pBluescript와 같은 유도체는 300-500 범위의 복제수를 갖고 있다. 예를 들어, 플라스미드 pACYC184에 있는 p15A 원점은 약 10개의 복제수를 생성한다. pSC101 원점은 약 5의 복제수를 부여한다. 복제 원점을 얻을 수 있는 다른 낮은 복제수 벡터는 예를 들어, pWSK29, pWKS30, pWSK129 및 pWKS130을 포함한다(예를 들어, Wang et al. (1991) 유전자 100:195-199 참조). 중 내지 저 복제수는 150 미만, 또는 100 미만이다. 저 복제수는 20, 25, 30 미만이다. 일반적으로 중 미만의 복제수는 150 미만의 복제수이며, 저 미만의 복제수는 약 25 미만 또는 25 미만의 복제수이고, 일반적으로 복제수는 조제물에서 박테리아당 플라스미드의 평균 복제수를 나타낸다. 당업자는 저, 중, 또는 고 복제수를 갖는 플라스미드를 식별할 수 있다. 예를 들어, 복제수가 높은지 낮은지 실험적으로 결정하는 한 가지 방법은 미니프렙을 수행하는 것이다. 고 복제수 플라스미드는 1 ml LB 배양당 3-5 μg DNA를 산출해야 하며; 저 복제수 플라스미드는 LB 배양 1 ml당 0.2-1 μg의 DNA를 산출할 것이다. 복제 원점의 식별 및 서열을 포함하는 박테리아 플라스미드의 서열은 잘 알려져 있다(예를 들어, snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/ 참조). 예시적인 복제 원점 및 이의 플라스미드 복제수는 하기 표에 요약되어 있다.
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높은 복제수 플라스미드는 시험관내 단백질의 이종성 발현을 위해 선택되는데, 그 이유는 유전자 투여량이 염색체 유전자와 비교하여 증가하고, 단백질의 더 높은 비수율(specific yield)이 있고, 치료 박테리아의 경우 인코딩된 치료제의 더 높은 치료 투여량이 있기 때문이다. 그러나, 본원에서는 에스. 티피무리움과 같은 치료 생성물(예를 들어, 면역조절 단백질)을 인코딩하는 플라스미드의 전달을 위해 일부 구현예에서 높은 복제수 플라스미드가 유리할 수 있음을 보여준다.
박테리아가 높은 복제 플라스미드를 유지해야 하는 요구 사항은 발현된 분자가 유기체에 독성인 경우 문제가 될 수 있다. 이러한 플라스미드를 유지하기 위한 대사 요구 사항은 생체 내에서 복제 적합성을 희생해야 할 수 있다. 치료 생성물의 전달을 위한 최적의 플라스미드 복제수는 플라스미드를 전달하도록 조작된 균주의 약독화 기전에 따라 달라질 수 있다. 필요한 경우, 당업자는 본원의 개시내용을 고려하여 특정 면역자극 종 및 박테리아 균주에 대한 적절한 복제수를 선택할 수 있다.
인코딩된 생성물이 박테리아에서 발현되는 백신으로서 사용하기 위해 그리고/또는 RNA(예컨대 mRNA)를 전달하기 위해, 플라스미드는 더 높은 복제수 또는 높은 복제수(150 초과)로 존재하여, 생산되는 RNA 또는 mRNA의 양을 증가시킬 수 있다.
5. CpG 모티프 및 CpG 섬
비메틸화된 시티딘-포스페이트-구아노신(CpG) 모티프는 박테리아에서 널리 퍼져 있지만 척추동물의 게놈 DNA에서는 그렇지 않다. 병원성 DNA 및 CpG 모티프를 포함하는 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)는 숙주 방어 기전을 활성화하여 내재성 및 후천적 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 비메틸화된 CpG 모티프는 중앙에 비메틸화된 CG 디뉴클레오타이드와 플랭킹 영역을 포함한다. 인간의 경우 구조의 차이와 이것이 유도하는 면역 반응의 특성에 따라 4가지 유형의 CpG ODN이 식별되었다. K형 ODN(B형이라고도 함)은 일반적으로 포스포로티오에이트 백본에 1개 내지 5개의 CpG 모티프를 포함한다. D형 ODN(A형이라고도 함)은 포스포디에스테르/포스포로티오에이트 백본이 혼합되어 있고 단일 CpG 모티프가 있으며, 스템 루프 구조의 형성을 허용하는 회문 서열과 3'과 5' 단부에서 polyG 모티프에 의해 플랭킹된다. C형 ODN은 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있으며 스템 루프 구조 또는 이량체를 형성할 수 있는 다중 회문 CpG 모티프를 포함한다. P-부류 CpG ODN은 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있으며, GC가 풍부한 3' 단부에서 헤어핀을 형성할 수 있는 이중 회문을 가진 다중 CpG 모티프를 포함한다(예를 들어, Scheiermann 등 (2014) 백신 32(48):6377-6389). 본원의 목적을 위해, CpG는 플라스미드 DNA에 인코딩되고; 이는 모티프로서 또는 유전자에 도입될 수 있다.
톨-유사 수용체(TLR)는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 감지하고 병원체에 대한 내재성 면역을 활성화하기 위한 핵심 수용체이다(예를 들어, Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680). TLR9는 포유동물 DNA에서 자연적으로 발생하지 않는 원핵생물의 DNA에서 저메틸화된 CpG 모티프를 인식한다(예를 들어, McKelvey 등 (2011) J. Autoimmun. 36:76-86 참조). CpG 모티프의 인식은 면역 세포 하위집합의 엔도솜으로 병원체의 식균 작용 시 내재성 및 적응성 면역을 활성화한다.
CpG 섬 또는 모티프를 함유하는 플라스미드를 보유하는 에스. 티피무리움 균주와 같은 살모넬라 종과 같은 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 이 박테리아는 TLR9를 활성화할 수 있다. 본원에 예시된 바와 같이, 저메틸화된 CpG 섬을 함유하는 박테리아 플라스미드는 내재성 및 적응성 항종양 면역 반응을 둘 다 유도할 수 있으며, 이는 플라스미드 상에서 인코딩되는 치료 생성물, 예컨대 면역자극성 단백질 및 STING의 항시적 활성 변이체, IRF3 및 다른 세포질 DNA/RNA 센서와 조합되어, 상승작용적 또는 증강된 항종양 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, asd 유전자(예를 들어 SEQ ID NO: 48 참조)는 저메틸화된 CpG 섬의 높은 빈도를 인코딩한다. CpG 모티프는 면역자극성 박테리아에 본원의 설명으로부터 기재되거나 명백한 임의의 치료 생성물과 조합하여 포함될 수 있으며, 이로써 치료 대상체에서 항종양 면역 반응을 향상시키거나 개선할 수 있다.
면역자극성 CpG는 유전자 생성물을 인코딩하는, 전형적으로 박테리아 유전자로부터의 핵산을 포함하고, 또한 CpG 모티프를 인코딩하는 핵산을 첨가함으로써 플라스미드에 포함될 수 있다. 본원의 플라스미드는 CpG 모티프를 포함할 수 있다. 예시적인 CpG 모티프가 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,232,259, 8,426,375 및 8,241,844 참조). 여기에는 일반식: (CpG)n과 함께 예를 들어 10 내지 100개, 10 내지 20개, 10 내지 30개, 10 내지 40개, 10 내지 50개, 또는 10 내지 75개 염기쌍 길이인 합성 면역자극 올리고뉴클레오타이드가 포함되며, 여기서 n은 반복부의 수이다. 일반적으로 적어도 하나 또는 두 개의 반복부가 사용되며; 비-CG 염기가 산재될 수 있다. 당업자는 TLR, 특히 TLR9를 조절함으로써 면역 반응을 유도하기 위한 CpG 모티프의 일반적인 용도에 매우 익숙하다.
6. 플라스미드 유지/선택 구성요소
실험실 환경에서 플라스미드의 유지는 일반적으로 플라스미드에 항생제 내성 유전자를 포함하고 성장 배지에 항생제를 사용함으로써 보장된다. 상술한 바와 같이, 플라스미드 상의 기능성 asd 유전자로 보완된 asd 결실 돌연변이체의 사용은 항생제를 사용하지 않고 시험관내 플라스미드 선택을 가능하게 하고, 생체내 플라스미드 유지를 가능하게 한다. asd 유전자 보체 시스템은 이러한 선택/유지를 제공한다(예를 들어, Galan 등 (1990) Gene 94(1):29-35 참조). 종양 미세환경에서 플라스미드를 유지하기 위한 asd 유전자 보체 시스템의 사용은 면역자극성 단백질, 항시적으로 활성인 세포질 DNA/RNA 센서, 항체, 항체 단편, 또는 본원에서 논의된 바와 같은 다른 이러한 생성물와 같은 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 전달하도록 설계된 에스. 티피무리움 및 다른 면역자극성 박테리아 균주의 약효를 증가시킨다.
7. DNA 핵 표적화 서열
SV40 DTS와 같은 DNA 핵 표적화 서열(DTS)은 핵공 복합체를 통한 DNA 서열의 전위를 매개한다. 이 수송의 기전은 핵 국소화 서열을 포함하는 DNA 결합 단백질의 결합에 의존하는 것으로 보고된다. 핵 수송 및 발현을 증가시키기 위해 플라스미드에 DTS를 포함시키는 것이 입증되었으며(예를 들어, Dean, D.A. 등 (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722 참조), 에스. 티피무리움에 의해 전달된 플라스미드로부터 유전자 발현을 증가시키기 위해 사용되었다(예를 들어, Kong 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419 참조).
이. 콜라이의 rrnB 유전자의 T1 종결인자와 같은 Rho-독립적 또는 부류 I 전사 종결인자는 전사 신장 복합체의 해리를 유발하는 2차 구조를 형성하는 DNA 서열을 포함한다. 전사 종결인자는 에스. 티피무리움 전사 머시너리에 의한 이종성 단백질의 발현을 방지하기 위해 플라스미드에 포함된다. 이는 치료 생성물의 발현이 숙주 세포 전사 머시너리에 국한되도록 한다.
에스. 티피무리움과 같은 살모넬라의 형질전환에 사용되는 플라스미드는 본원에 기재된 암 치료제로서 다음 속성의 전부 또는 일부를 포함한다: 1) 단백질의 이종성 발현을 위한 하나 이상의 항시적 프로모터; 2) 하나 이상의 인간 면역조절 발현 카세트; 3) 박테리아 복제 원점 및 최적화된 플라스미드 복제수; 4) 면역자극성 CpG 섬; 5) 플라스미드 유지 및 선택을 위한 asd 유전자 선택가능 마커; 6) DNA 핵 표적화 서열; 및 7) 전사 종결인자.
G. 백신 및 치료제로서 사용하기 위한 예시적인 박테리아 균주 및 작용 기전
전반에 걸쳐 기재된 바와 같이, 항암 치료제로서, 병원체에 대한 백신으로서, 그리고 RNA에 대한 전달 비히클로서 사용하기 위한 특성을 향상시키는 게놈 변형을 함유하는 면역자극성 박테리아가 제공되며, 이는 치료 생성물로서 사용될 수 있거나 다양한 용도를 위한 면역자극성 생성물, 항원, 및 이의 조합을 제공하도록 변역될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 항암 치료제로서 사용하기 위한, 백신 및 RNA 전달 플랫폼을 위해 특성을 향상시키고 또한 박테리아의 염증 특성을 감소시키고, 이러한 적용을 위해 박테리아의 특성으로 증강을 시키거나 작용하는 페이로드 생성물의 조합을 포함하는 페이로드를 포함하는 전반적으로 논의된 게놈 변형을 포함한다. 페이로드 및 게놈 변형은 본원의 개시내용 전반에 걸쳐 논의되고 기재되며, 아래 작업예에서 예시된다. 하기는 특히 백신으로서의 사용에 유리한 예시적인 박테리아, 게놈 변형과 페이로드의 조합의 논의이다. 전반에 걸친 개시내용은 암 및 다른 질환과 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 적절한 면역 자극 또는 조절에 일반적으로 유용한 치료제로서 그리고 암 치료제로서 사용하기 위한 특성, 페이로드, 및 변형을 기재한다.
당업자는 유사한 효과 및 결과를 달성하기 위해 다른 박테리아 종 및 균주, 예컨대 이. 콜라이, 및 리스테리아에서 유사한 게놈 변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 추가로, 상기 논의된 바와 같이 비(非)살모넬라 종은 rck 유전자, 예컨대 살모넬라로부터의 rck 유전자를 인코딩하도록 변형되어, 보체에 대한 내성을 증가시킬 수 있다.
백신화를 위해, 본원에 제공된 박테리아에 대한 용도 및 일반적인 작용 기전은 항원 또는 생성물에 대한 현장에서 면역 반응을 생성하기 위해 예컨대 근육내 주사, 흡입, 피부내 투여, 질 투여, 및 다른 이러한 경로에 의한 투여, 특히 직접적인 조직 투여를 포함하며, 이는 병원체 또는 암에 대한 예방(면역보호 반응을 발달시키기 위한 면역화) 또는 치료를 위한 것일 수 있다. 박테리아는 지속적인 적응 항바이러스 면역을 유도한다. 박테리아는 선택된 경로를 위해 적합하게 제형화된다. 이는 적절하다면 예를 들어 에어로졸, 정제, 에멀젼, 분말로서의 제형을 포함할 수 있다. 이렇게 해서 제형화된 투여된 박테리아는 포식작용에 의해 조직-체류 식세포 내로 흡수된다. 이러한 목적을 위해, 박테리아는 이것이 생체내에서 복제되지 않지만 이의 페이로드를 세포, 예컨대 조직-체류 포식성 항원-제시 세포(APC) 내로 전달하도록 변형된다. 인코딩된 생성물은 예를 들어 유형 I IFN을 유도하기 위해 제시를 위한 항원, STING을 포함한다. 인코딩된 생성물은 림프절 내로 들어가서 CD4+ 및 CD8+ 프라이밍을 통해 항체를 초래할 수 있고, APC는 IFN-감마를 자극시키는 항원-특이적 CD8+ 세포의 프라이밍 및 활성화를 위해 제시되고, 또한 바이러스에 의해 감염된 세포의 직접적인 사멸화에 참여한다; 대식세포는 세포자멸사 감염 세포를 식세포작용하여, 에피토프를 확산시키고, 이는 추가의 T-세포 활성화를 초래한다.
1. 예시적인 면역자극성 박테리아 ― 현장에서 암 백신화 작용 기전(MOA)
본원에 제공된 면역자극성 박테리아 중에는 종양-체류 골수성 세포, 예컨대 대식세포에 축적되도록 설계된 면역자극성 박테리아가 있다. 이러한 박테리아는 항바이러스/항종양 면역 반응을 유도하는 면역자극성 단백질 및 이의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 게놈 변형은 편모의 무효화, LPS의 변경, 및 컬리 핌브리애의 무효화를 포함한다. 유사한 효과를 갖는 박테리아 균주에서 이러한 또는 변형은 TLR2/4/5 반응/신호전달을 감소시키고, 종양 미세환경 및 골수성 세포에서 축적을 초래한다. 다른 변형은 영양 요구체, 예컨대 박테리아가 생체내에서 성장할 수 없게 만드는 asd - 또는 ThyA - ; 및 다른 영양 요구체, 예컨대 면역억제성인 상승된 아데노신을 가질 수 있는, 박테리아를 아데노신에 대해 영양 요구성으로 만들고 종양 미세환경에서 이의 축적을 증가시키는 purI - ; 및 T 세포를 저해할 수 있는 아스파라기나제를 무효화시키거나 비활성화시키는 게놈 변형을 포함한다. 이러한 박테리아 변형 중 일부 또는 모두의 조합은 종양 미세환경 및 종양 내의 대식세포에 축적되는 박테리아를 초래한다. 이러한 면역자극성 박테리아의 예는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI 균주로 표기된 균주이다. 균주는 예를 들어, 현장에서 암 항원 백신화를 위해 사용될 수 있으며, 여기서 균주는 진핵 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터의 제어 하에 발현되는 페이로드의 조합을 생산하는 STING, eSTING(조작된 STING, 예컨대 본원에 제공된 것, 특히 유형 I 인터페론을 항시적 유도하는 것을 지칭함), IL-15(또는 IL-15 수용체 복합체) + eSTING, 및 다른 유형 I IFN을 발현하는 플라스미드를 함유한다. 플라스미드는 추가로 전장 종양 항원 또는 펩타이드 항원 단편의 개방 리딩 프레임을 인코딩하는 서열을 함유한다. 투여 경로는 IV이며, 이로써 균주는 종양으로 트래픽(traffic)되고 종양-체류 대식세포에 의해 흡수되어, 핵으로의 플라스미드 이동 및 페이로드의 발현을 초래한다. 유형 I IFN의 부재 하에, 대식세포는 종양 내에서 CD8+ T-세포 프라이밍, 뿐만 아니라 림프절로의 트래피킹(trafficking)을 위한 암 항원을 처리하고 제시하여, CD4+ 및 CD8+ T-세포를 프라이밍한다. 프라이밍되고 활성화된 CD8+ T-세포는 프라이밍된 항원을 보유하는 종양 세포를 무효화시키며, 장기 수명의 조직-체류 기억 CD8+ T-세포, 뿐만 아니라 종양이 제거된 후 순환형 기억 T-세포를 유도하여, 종양 재발을 예방한다.
2. 말초 암 백신화를 위한 예시적인 면역자극성 박테리아 및 작용 기전
추가의 티미딘 영양 요구체를 함유하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI/△thyA 균주는 말초 암 항원 백신화에 사용된다. 균주는 티미딘 보충의 부재 하에 증식할 수 없고, 사지 내로의 근육내 주사에 의해 투여 시 이는 예컨대 팔에서 IM 주사 후 조직-체류 대식세포에 의해 포식된다. 균주는 박테리아 프로모터 및 IRES 서열 또는 진핵 프로모터로부터 STING, eSTING, IL-15 + eSTING, 또는 다른 유형 I IFN 생산 조합, 뿐만 아니라 전장 종양 항원 또는 펩타이드의 서열을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 균주를 함유하는 박테리아 프로모터의 경우, 박테리아는 이러한 인코딩된 페이로드의 RNA를 전사하고 조직-체류 대식세포에 의한 포식작용 및 파괴 시 이러한 전달할 것이다. 진핵 프로모터 함유 균주의 경우, 식세포는 RNA를 전사한다. 생성된 mRNA는 단백질로 번역되고, 인코딩된 항원은 CD8+ T-세포 프라이밍을 위해 유형 I IFN의 존재 하에 대식세포에 의해 제시된다. 암 항원-프라이밍된 CD8+ T-세포는 암 세포, 예컨대 수술적 종양 절제 후 남아 있는 것을 순환시키고 무효화시킨다. 이와 같은 균주는 특정 암을 발증시킬 위험을 감소시키기 위해, 예컨대 종양 형성을 유발할 수 있을 가족력 유전자 돌연변이에 대한 백신화를 위해 예방적 백신으로서 사용된다.
3. 병원체 백신화를 위한 예시적인 면역자극성 박테리아 및 작용 기전(MOA)
또한, 추가의 영양 요구체, 예컨대 thyA - 균주를 포함하는 박테리아 균주가 제공된다. 이의 예는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI/△thyA 균주를 포함하며, 이는 추가의 티미딘 영양 요구체를 갖는다. 이러한 균주는 티미딘 보충의 부재 하에 증식할 수 없다. 이러한 균주는 병원체에 대한 백신화에 사용될 수 있다. 이는 특정 병원체에 의한 감염이 자연적으로 발생하는 경로에 의해 투여된다. 예컨대, 감염이 자연적으로 발생하는 부위 또는 부위들에 따라 근육내, 비내, 흡입 또는 경구 전달 또는 이의 조합에 의한 투여 후, 이는 조직-체류 대식세포로부터 제거되어, 플라스미드를 남긴다. 이러한 균주는 박테리아 프로모터의 전사적 제어 하에 면역자극성 단백질 또는 이의 조합, 예컨대 STING, 조작된 STING (eSTING), IL-15 + eSTING, 또는 다른 유형 I IFN 생성 단백질 또는 단백질의 조합, 및 또한 항원 및/또는 펩타이드의 병원체 서열을 인코딩하지만 진핵 리보솜에 의한 번역을 위해 진핵 서열, 예컨대 IRES를 포함하는 플라스미드를 함유한다. 박테리아는 이러한 페이로드를 인코딩하는 RNA를 생산하고, 투여 후, 포식작용 및 조직-체류 대식세포에 의한 파괴 시, 인코딩된 mRNA를 전달한다. mRNA는 진핵 숙주 세포에 의해 단백질로 번역되고, 항원은 CD8+ T-세포 프라이밍을 위해 유형 I IFN의 존재 하에 대식세포에 의해 제시된다. 유형 I IFN은 인코딩된 면역자극성 단백질, 예컨대 STING 또는 변형된 STING에 의해 자극될 수 있다. 추가로, 박테리아는 박테리아 프로모터 및 박테리아 전사와 번역을 위한 서열과 함께 플라스미드를 사용하여 유형 I IFN 및 병원체 항원을 단백질로서 제공할 수 있다. 그 후에, 대식세포는 조직에서 CD8+ T-세포를 프라이밍할 뿐만 아니라 림프절로 트래픽하여 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 프라이밍한다. 그 후에, 프라이밍되고 활성화된 CD8+ T-세포는 패트롤링(patrolling) 기억 T-세포로서 순환할 뿐만 아니라 기원 조직으로 다시 트래픽하여 조직-체류 기억 CD8+ T-세포로서 남게 된다. 프라이밍된 CD4+ T-세포는 B-세포 활성화를 유도하여 높은 역가의 지속적인 중화 항체를 생산한다. 이러한 백신화 전략은 질환이 자연적으로 발생할 조직에 투여되는 고도로 성공적인 천연두, 소아마비, 홍역, 수두, 및 다른 생(live)-약독화된 백신을 모방한다.
H. 약학적 생성, 조성물, 및 제형
본원에서는 본원에 제공된 임의의 면역자극성 박테리아 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 첨가제를 함유하는 제조 방법, 약학적 조성물 및 제형을 제공한다. 약학적 조성물은 종양 또는 암과 같은 과증식성 질환 또는 병태와 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 단일 제제 요법으로 투여될 수 있거나, 추가 제제(들) 또는 치료(들)와의 병용 요법으로 투여될 수 있다. 병용 요법은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 및/또는 다른 전달 비히클, 면역요법, 예컨대 CAR-T 요법 및 체크포인트 저해제, 방사선, 수술, 화학요법제, 예컨대 뉴클레오사이드 유사체 및 백금 화합물, 및 세포 요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 다른 항암 요법 또는 치료와의 병용 요법을 포함한다. 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 다중 투여량 투여를 위해 제형화될 수 있다. 제제는 직접 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물은 액체 또는 건조 제형으로 제공될 수 있다.
1. 제조
a. 세포 은행 제조
본원에 기재된 면역치료제의 활성 성분은 조작된 자가-복제 박테리아로 구성되기 때문에, 선택된 조성물은 장기간 보관을 위해 유지될 일련의 세포 은행으로 확장될 것이며 약물 성분 제조를 위한 출발 물질로 사용될 것이다. 세포 은행은 연방 규정(CFR) 21 파트 211 또는 다른 관련 규제 기관에 따라 적절한 제조 시설에서 현행 우수 제조 관행(cGMP)에 따라 생산된다. 면역치료제의 활성제는 살아있는 박테리아이기 때문에 여기에 기재된 생성물은 정의상 비멸균이며 최종적으로 멸균될 수 없다. 오염을 방지하기 위해 제조 공정 전반에 걸쳐 무균 절차가 사용되도록 주의를 기울여야 한다. 따라서 모든 원료 및 용액은 제조 공정에 사용하기 전에 멸균해야 한다.
마스터 세포 은행(MCB)은 출발 물질에 오염 물질이 존재하지 않도록 선택된 박테리아 균주의 순차적인 단일 콜로니 분리에 의해 생성된다. 멸균 배지(복합 배지, 예를 들어 LB 또는 MSB 또는 정의된 배지, 예를 들어 적절한 영양소가 보충된 M9일 수 있음)를 포함하는 멸균 배양 용기에 잘 단리된 단일 박테리아 콜로니를 접종하고 37℃에서 진탕하면서 인큐베이션하여 박테리아를 복제할 수 있다. 그 다음, 박테리아는 동결보호제(들)를 함유하는 용액에 현탁함으로써 동결보존을 위해 준비된다.
동결 보호제의 예는 인간 또는 소 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린과 같은 단백질; 단당류(예를 들어, 갈락토스, D-만노스, 소르보스 등) 및 이의 비환원성 유도체(예를 들어, 메틸글루코사이드), 이당류(트레할로스, 수크로스 등), 사이클로덱스트린 및 다당류(예를 들어, 라피노스, 말토덱스트린, 덱스트란 등)를 포함한 탄수화물; 아미노산(예를 들어, 글루타메이트, 글리신, 알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘, 트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등); 베타인과 같은 메틸아민; 3가 이상의 당 알코올, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 폴리올; 프로파일렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 계면활성제, 예를 들어 Pluronic®; 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 유기-황 화합물, 및 이의 조합을 포함한다. 동결보존 용액은 염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘) 및/또는 완충제, 예를 들어 인산나트륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 및 당업자에게 알려진 다른 완충제를 또한 함유하는 하나 이상의 동결보존제를 포함할 수 있다.
동결보존 용액에서 박테리아의 현탁액은 농축된 동결보호제 또는 동결보호제들을 배양 물질에 첨가하여 동결 및 해동 과정 동안 박테리아의 생존력을 보존하는 최종 농도를 달성함으로써(예를 들어, 최종 0.5% 내지 20% 글리세롤 농도), 또는 박테리아를 수합하고(예를 들어, 원심분리에 의해) 적절한 최종 농도의 동결 보호제(들)를 함유하는 동결 보존 용액에 현탁함으로써 달성될 수 있다. 그 후에, 동결보존 용액에 있는 박테리아 현탁액을 동결 조건(예를 들어, 부틸 마개 및 크림프 씰)에서 밀폐 무결성을 유지할 수 있는 용기 밀폐 시스템이 있는 적절한 멸균 바이알(플라스틱 또는 유리)에 충전한다. 그 후에, 마스터 세포 은행의 바이알을 냉동한다(속도 조절 냉동기를 사용하여 천천히 또는 냉동기에 직접 넣어 빠르게). 그 후에, MCB는 장기 생존 가능성을 보존하는 온도(예를 들어, -60℃ 이하)에서 냉동 보관된다. 해동된 마스터 세포 은행 물질은 해당 당국의 규정에 따라 식별성, 순도 및 활성을 보장하기 위해 철저히 특성화된다.
작업 세포 은행(WCB)은 마스터 세포 은행과 거의 동일한 방식으로 생산되지만 출발 물질은 MCB에서 유래된다. MCB 물질은 멸균 배지가 들어 있는 발효 용기로 직접 옮기고 위와 같이 확장할 수 있다. 그 후에, 박테리아를 동결보존 용액에 현탁시키고 용기에 채우고 밀봉한 다음 -20℃ 이하에서 동결한다. MCB 재료로 여러 WCB를 생산할 수 있으며 WCB 재료를 사용하여 추가 세포 은행(예를 들어, 제조업체의 작업 세포 은행(MWCB))을 만들 수 있다. WCB는 냉동 보관되며 식별성, 순도 및 활성을 보장하는 특성이 있다. WCB 물질은 일반적으로 조작된 박테리아와 같은 생물학적 제제의 약물 성분 생산에 사용되는 출발 물질이다.
b. 약물 성분 제조
약물 성분은 상기 기재된 대로 cGMP에 따라 무균 공정을 사용하여 제조된다. 작업 세포 은행 물질은 일반적으로 cGMP에 따라 약물 성분 제조를 위한 출발 물질로 사용되지만 다른 세포 은행도 사용할 수 있다(예를 들어, MCB 또는 MWCB). 무균 처리는 박테리아 세포-기초 요법을 포함한 모든 세포 요법의 생산에 사용된다. 세포 은행의 박테리아는 발효에 의해 확장되며; 이는 예비-배양물(예를 들어, 진탕 플라스크)을 생성하거나 발효기의 직접 접종을 통해 달성할 수 있다. 발효는 일회용 또는 재사용이 가능한 멸균 생물반응기 또는 플라스크에서 수행된다. 박테리아는 농축에 의해 수합된다(예를 들어, 원심분리, 연속 원심분리 또는 접선 흐름 여과). 농축된 박테리아는 완충제로 배지를 교환하여(예를 들어, 정용여과에 의해) 배지 구성요소 및 박테리아 대사산물로부터 정제된다. 벌크 약물 성분은 중간체(예를 들어, 냉동 또는 건조)로 제형화 및 보존되거나 약물 생성물로 직접 가공된다. 약물 성분은 식별성, 강도, 순도, 약효 및 품질에 대해 시험된다.
c. 약물 생성물 제조
약물 생성물은 최종 용기에 들어 있는 활성 성분의 최종 제형으로 정의된다. 약물 생성물은 cGMP에 따라 무균 공정을 사용하여 제조된다. 약물 생성물은 약물 성분에서 생산된다. 약물 성분을 해동하거나 필요한 경우 재구성한 다음 적절한 목표 농도로 제형화한다. 약물 생성물의 활성 성분은 살아있는 조작된 박테리아이기 때문에, 강도는 현탁액에 포함된 콜로니 형성 단위(CFU)의 수에 의해 결정된다. 벌크 생성물은 아래에 설명된 대로 보관 및 사용에 적합한 최종 제형으로 희석된다. 용기는 용기 마개 시스템으로 채워지고 밀봉되며 약물 성분에 라벨이 붙여진다. 약물 생성물은 안정성을 유지하기 위해 적절한 온도에서 보관되고, 식별성, 강도, 순도, 역가 및 품질에 대해 시험되고 표기된 허용 기준을 충족하는 경우 인체 사용을 위해 출시된다.
2. 조성물
약학적으로 허용 가능한 조성물은 규제 기관 또는 다른 기관에 대한 승인을 고려하여 제조되고/되거나 동물 및 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 약전에 따라 제조된다. 조성물은 용액, 현탁액, 분말 또는 지속 방출 제형으로 제조될 수 있다. 전형적으로, 화합물은 당업계에 널리 알려진 기술 및 절차를 사용하여 약학적 조성물로 제형화된다(예를 들어, Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126 참조). 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
조성물은 근육내, 정맥내, 피부내, 병변내, 복강내, 피하, 종양내, 경막외, 비강, 경구, 질, 직장, 국소(topical), 국재(local), 귀, 흡입, 협측(예를 들어, 설하) 및 경피 투여를 비롯한 당업자에게 알려진 임의의 경로에 의한, 또는 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 다른 투여 모드도 고려된다. 투여는 치료 부위에 따라 국소적, 국소적 또는 전신적일 수 있다. 치료가 필요한 부위로의 국소 투여는 예를 들어 수술 중 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사, 카테터에 의한 주사, 좌제를 사용하거나 임플란트를 사용한다. 조성물은 또한 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물로 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 또한 펌프에 의한 것과 같은 제어 방출 제형 및 장치 제어 방출을 포함하는 제어 방출 시스템을 포함할 수 있다.
주어진 경우에 가장 적합한 경로는 질환의 특성, 질환의 진행, 질환의 중증도 및 사용되는 특정 구성과 같은 다양한 요인에 따라 다르다. 약학적 조성물은 각각의 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 조성물은 전신, 국소, 복강내, 경구 또는 직접 투여를 위한 임의의 적합한 약학적 조제물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 피하, 근육내, 종양내, 정맥내 또는 피부내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 투여 방법은 항원 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 개입과 같은 분해 과정에 대한 활성제의 노출을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예로는 치료 부위의 국소 투여 또는 연속 주입이 있다.
면역자극성 박테리아는 경피 패치 제제 및 건조 분말 흡입기뿐만 아니라 경구 투여를 위한 용액, 현탁액, 정제, 분산성 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 또는 엘릭셔와 같은 적합한 약학적 조제물로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 화합물은 당업계에 널리 알려진 기술 및 절차를 사용하여 약학적 조성물로 제형화된다(예를 들어, Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, page 126 참조). 일반적으로 제형 방식은 투여 경로의 함수이다. 조성물은 건조(동결건조 또는 다른 형태의 유리화) 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다. 조성물이 건조된 형태로 제공되는 경우, 적절한 완충액, 예를 들어 멸균 식염수를 첨가하여 사용 직전에 재구성할 수 있다.
3. 제형
a. 액체, 주사제, 에멀젼
제형은 일반적으로 투여 경로에 맞게 만들어진다. 일반적으로 피하, 근육내, 종양내, 정맥내 또는 피부내 주사 또는 주입을 특징으로 하는 비경구 투여가 본원에서 고려된다. 비경구 투여용 박테리아 제제에는 주사용 현탁액(직접 투여), 사용 전에 해동된 냉동 현탁액, 사용 직전에 재현탁 용액과 조합할 준비가 된 동결 건조 분말과 같은 건조 가용성 생성물 및 에멀젼이 포함된다. 동결건조 제형과 같은 건조된 열안정성 제형은 나중에 사용하기 위해 단위 용량을 저장하는 데 사용할 수 있다.
약학적 조제물은 동결된 액체 형태, 예를 들어 현탁액일 수 있다. 냉동 액체 형태로 제공되는 경우 약물 생성물은 농축 조제물로 제공되어 사용 전에 해동되고 치료적 유효 농도로 희석될 수 있다.
약학적 조제물은 또한 사용을 위해 해동 또는 희석을 필요로 하지 않는 투여 형태로 제공될 수 있다. 이러한 액체 조제물은 현탁제(예를 들어, 소르비톨, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방)와 같은 적절한 경우 약학적으로 허용 가능한 첨가제; 유화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르 또는 분별 식물성 오일); 및 미생물 치료제와 함께 사용하기에 적합한 방부제와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 약학적 조제물은 사용 전에 물 또는 다른 멸균 적합한 비히클로 재구성하기 위해 동결건조 또는 분무 건조와 같은 건조 형태로 제공될 수 있다.
적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스 또는 글리세롤이다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내 투여되는 경우, 적절한 담체에는 생리식염수 또는 인산완충 식염수(PBS) 및 정맥내 수화에 사용되는 다른 완충 용액이 포함된다. 종양내 투여의 경우, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로파일렌 글리콜, 오일 에멀젼 및 이의 혼합물과 같은 증점제를 함유하는 용액이 주사제의 국소화를 유지하는 데 적절할 수 있다.
약학적 조성물은 담체 또는 다른 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 약학적 조성물은 희석제(들), 보조제(들), 부착방지제(들), 결합제(들), 코팅(들), 충전제(들), 풍미제(들), 착색제(들), 윤활제(들), 활택제(들), 보존제(들), 세제(들) 또는 흡착제(들), 및 이의 조합, 또는 변형된 치료 박테리아가 투여되는 비히클 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 예를 들어, 비경구 조제물에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 수성 비히클, 비수성 비히클, 등장화제, 완충제, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 격리 또는 킬레이트제, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 물질을 포함한다. 액체 조제물을 비롯한 제형은 약학적으로 허용 가능한 첨가제 또는 부형제를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin의"Remington's Pharmaceutical Sciences"에 설명되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태의 치료적 유효량의 화합물 또는 작용제를 함유할 것이다. 이러한 약학적 담체는 물과 같은 멸균 액체 및 석유, 동물성, 식물성 오일을 포함하는 오일, 또는 땅콩 오일, 대두 오일, 광유 및 참기름과 같은 합성 기원일 수 있다. 물은 전형적인 운반체이다. 식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 수용액도 특히 주사용액의 경우 액체 담체로 사용할 수 있다. 조성물은 활성 성분과 함께, 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카르복시메틸셀룰로스와 같은 희석제; 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크 등의 윤활제; 및 전분, 아카시아 검과 같은 천연 검, 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈, 및 당업자에게 알려진 다른 이러한 결합제과 같은 결합제를 포함한다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 포도당, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 탈지분유 건조, 글리세롤, 프로파일렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 예를 들어, 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 원하는 경우, 조성물은 또한 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 향상제, 및 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로덱스트린과 같은 다른 제제와 같은 다른 소량의 무독성 보조 물질을 함유할 수 있다.
비경구 제제에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체에는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 격리 또는 킬레이트제, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 물질이 포함된다. 수성 비히클의 예로는 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로스 주사액, 멸균 물 주사액, 및 덱스트로스 및 젖산 링거 주사액이 있다. 비수성 비경구 비히클에는 식물성 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩유가 포함된다. 등장제는 소듐 클로라이드 및 덱스트로스를 포함한다. 완충제에는 포스페이트 및 시트레이트가 포함된다. 항산화제에는 소듐 비설페이트가 포함된다. 국소 마취제에는 프로카인 하이드로클로라이드가 포함된다. 현탁제 및 분산제는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로파일 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 예를 들어 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 80(TWEEN 80)을 포함한다. EDTA와 같은 금속 이온의 격리 또는 킬레이트제가 포함될 수 있다. 약학적 담체에는 또한 수혼화성 비히클용 폴리에틸렌 글리콜 및 프로파일렌 글리콜, pH 조정용 소듐 하이드록사이드, 염산, 시트르산 또는 젖산이 포함된다. 비항균성 방부제가 포함될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 향상제와 같은 다른 소량의 무독성 보조 물질, 및 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 사이클로덱스트린과 같은 다른 제제를 함유할 수 있다. 일정한 수준의 투여량이 유지되도록 서방성 또는 서방성 시스템의 이식(예를 들어, 미국 특허 번호 3,710,795 참조)이 또한 본원에서 고려된다. 이러한 비경구 조성물에 함유된 활성 화합물의 백분율은 화합물의 활성 및 대상체의 요구뿐만 아니라 이의 특정 성질에 크게 의존한다.
b. 건조된 열안정성 제형
박테리아는 건조될 수 있다. 동결건조 또는 분무 건조 분말 및 유리화 유리와 같은 건조된 열안정성 제제는 용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로 투여하기 위해 재구성될 수 있다. 건조된 열안정성 제형은 상기 기재된 현탁액과 같은 임의의 액체 제형으로부터 제조될 수 있다. 약학적 조제물은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위해 동결건조 또는 유리화된 형태로 제공될 수 있다.
열안정성 제형은 건조된 화합물을 멸균 용액으로 재구성함으로써 투여용으로 제조된다. 용액은 분말로부터 제조된 활성 물질 또는 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 특성을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 열안정성 제형은 덱스트로스, 소르비톨, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 포도당, 수크로스 또는 다른 적합한 제제와 같은 부형제를 시트레이트, 나트륨 또는 포타슘 포스페이트와 같은 적합한 완충제 당업자에게 알려진 다른 이러한 완충제에 용해함으로써 제조된다. 그 후에, 생성된 혼합물에 약물 성분을 첨가하고 혼합될 때까지 교반한다. 생성된 혼합물을 건조용 바이알에 분배한다. 각각의 바이알에는 바이알당 1x105 내지 1x1011 CFU가 포함된 단일 용량이 들어 있다. 건조 후 생성물 바이알은 습기나 오염 물질이 밀봉된 바이알에 들어가는 것을 방지하는 용기 마개 시스템으로 밀봉된다. 건조된 생성물은 -20℃, 4℃ 또는 실온과 같은 적절한 조건에서 보관할 수 있다. 이 건조 제형을 물 또는 완충 용액으로 재구성하면 비경구 투여용 제형이 제공된다. 정확한 양은 치료되고 선택된 화합물에 따라 다르다. 이러한 양은 경험적으로 결정할 수 있다.
4. 다른 투여 경로를 위한 조성물
치료되는 상태에 따라, 국소 적용, 경피 패치, 및 경구 및 직장 투여와 같은 비경구 이외에 다른 투여 경로가 또한 본원에서 고려된다. 상기 기재된 현탁액 및 분말은 경구 투여될 수 있거나, 경구 투여를 위해 재구성될 수 있다. 직장 투여용 약학적 제형은 직장 좌제, 캡슐제, 전신 효과를 위한 정제 및 젤 캡슐제이다. 직장 좌제는 체온에서 녹거나 부드러워져 하나 이상의 약리학적 또는 치료학적 활성 성분을 방출하는 직장으로 삽입하기 위한 고형체를 포함한다. 직장 좌제에서 약학적으로 허용 가능한 물질은 염기 또는 비히클 및 융점 상승제이다. 염기의 예로는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, CARBOWAX®(폴리옥시에틸렌 글리콜) 및 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세리드의 적절한 혼합물이 있다. 다양한 염기의 조합이 사용될 수 있다. 좌제의 융점을 높이는 약제에는 경랍 및 왁스가 있다. 직장 좌제은 압축 방법 또는 성형으로 제조될 수 있다. 직장 좌제의 일반적인 중량은 약 2 내지 3 그램이다. 직장 투여용 정제 및 캡슐제는 경구 투여용 제형과 동일한 약학적으로 허용 가능한 물질 및 동일한 방법으로 제조된다. 직장 투여에 적합한 제형은 단위 용량 좌제로 제공될 수 있다. 이는 약물 물질을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음 생성된 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
경구 투여를 위해, 약학적 조성물은 예를 들어 결합제(예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 하이드록시프로파일 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들어, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다.
협측(설하) 투여에 적합한 제형에는 예를 들어, 풍미 베이스, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스에 활성 화합물을 함유하는 로젠지; 및 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 염기에 화합물을 함유하는 알약이 포함된다.
국소 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 설명된 대로 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭셔, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 폼, 에어로졸, 관개, 스프레이, 좌제, 붕대, 피부 패치, 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제형으로 제형화된다.
조성물은 흡입과 같은 국소 적용을 위한 에어로졸로서 제형화될 수 있다(예를 들어, 폐 질환의 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을 기재하는 미국 특허 제4,044,126호, 제4,414,209호 및 제4,364,923호 참조). 호흡기에 투여하기 위한 이러한 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액의 형태, 또는 흡입용 미세 분말로서 단독으로 또는 락토스와 같은 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 경우에, 제형의 입자는 전형적으로 50 미크론 미만, 또는 10 미크론 미만의 직경을 가질 것이다.
화합물은 국재 또는 국소, 예컨대 피부 및 점막, 예컨대 눈에의 국소 적용을 위해 겔, 크림, 및 로션의 형태로, 그리고 눈에의 적용을 위해, 또는 수조내 또는 척수내 적용을 위해 제형화될 수 있다. 경피 전달을 위해, 또한 눈 또는 점막에 투여하기 위해, 또는 흡입 요법을 위해 국소 투여가 고려된다. 활성 화합물의 비강 용액은 단독으로, 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하여 또한 투여될 수 있다.
경피 투여에 적합한 제형이 제공된다. 장기간 동안 수용자의 표피와 밀접하게 접촉된 상태를 유지하도록 구성된 개별 패치와 같은 임의의 적합한 형식으로 제공될 수 있다. 이러한 패치는 활성 화합물에 대해 예를 들어 0.1 내지 0.2 M 농도의 임의로 완충된 수용액에 활성 화합물을 함유한다. 경피 투여에 적합한 제형은 또한 이온삼투에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Tyle, P. (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326 참조), 전형적으로 활성 화합물의 임의로 완충된 수용액의 형태를 취할 수 있다.
약학적 조성물은 또한 제어 방출 제형 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533; 및 5,733,566 참조).
5. 투여량 및 투여
조성물은 단일 투여 또는 다중 투여 투여를 위한 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 면역자극성 박테리아는 치료받는 환자에 대한 바람직하지 않은 부작용이 없는 상태에서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 약학적 활성 화합물의 농도는 주사가 원하는 약리학적 효과를 생성하기 위한 유효량을 제공하도록 조정된다. 치료 유효 농도는 알려진 시험관내 및 생체내 시스템에서 면역자극성 박테리아를 시험함으로써, 예를 들어 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 검정을 사용함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 표준 임상 기술을 사용할 수 있다. 시험관내 분석 및 동물 모델을 사용하여 최적의 투여량 범위를 식별할 수 있다. 경험적으로 결정할 수 있는 정확한 용량은 환자 또는 동물의 연령, 체중, 체표면적 및 상태, 투여되는 특정 면역자극성 박테리아, 투여 경로, 치료할 질환의 유형 및 질환의 중증도에 의존할 수 있다.
따라서, 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료되는 질환의 함수이며, 알려진 시험 프로토콜을 사용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽함으로써 경험적으로 결정할 수 있는 것으로 이해된다. 농도 및 투여량 값은 완화될 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 임의의 특정 대상에 대해, 특정 투여 요법은 개별적 필요 및 조성물의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정되어야 하며, 농도 범위는 예시일 뿐이며 이를 포함하는 조성물 및 조합의 범위 또는 사용을 제한하려는 것은 아닌 것으로 본원에 설명된 것으로 추가로 이해되어야 한다. 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 또는 1회 투여될 수 있다. 일반적으로 투여 요법은 독성을 제한하기 위해 선택된다. 주치의는 독성, 또는 골수, 간, 신장 또는 다른 조직 기능 장애로 인해 투여량을 낮추기 위해 요법을 종료, 중단 또는 조정하는 방법과 시기를 알고 있음을 유의해야 한다. 반대로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않은 경우(독성 부작용 제외) 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 방법과 시기를 알고 있다.
면역자극성 박테리아는 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 조성물에 포함된다. 예를 들어, 이러한 양은 암과 같은 과증식성 질환 또는 상태의 치료에서 치료 효과를 달성하는 양, 또는 백신으로서 효과적이거나 mRNA를 전달하는 데 효과적인 양이다. 예시적인 용량은 약 1 x 109 CFU/m2일 수 있지만, 투여 경로에 의존한다. 아래 표와 위에서 언급한 바와 같이 더 높은 용량을 투여할 수 있다. 마우스 모델에서의 실험에서 얻은 아래 데이터는 본원에 기재된 바와 같은 게놈 변형을 갖는 균주가 균주 VNP20009와 비교하여 약 15배 이상 현저하게 개선된 내약성을 가지며, 따라서 더 많은 양으로 투여될 수 있음을 보여준다.
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본원에 기재되고 제공된 면역자극성 박테리아는 예컨대 비강/비내 투여에 의한 그리고 폐 내로의 흡입에 의한 정맥내(IV), 및 점막을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이는 특히 박테리아가 예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 포함한 병원체, 예컨대 박테리아 및 바이러스 병원체에 대한 백신으로서 사용되는 유리한 구현예이다. 박테리아는 정제, 분말, 액체 또는 다른 적합한 제형으로서 제공될 수 있다; 이는 제형에 따라 냉동 또는 냉장 보관되거나 실온에서 보관될 수 있다. 그러므로, mRNA를 제공하는 박테리아는 여러 가지 경로를 통해 투여될 수 있고, 편리하게 보관되고 제형화될 수 있다.
약학적으로 및 치료적으로 활성인 화합물 및 이의 유도체는 일반적으로 단위 투여 형태 또는 다중 투여 형태로 제제화 및 투여된다. 각각의 단위 용량은 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께 원하는 치료 효과를 생성하기에 충분한 치료 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다. 단위 투여 형태는 적합한 양의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 함유하는 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 비경구 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액, 및 수중유 에멀젼을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 단위 용량 형태는 바이알, 앰플 및 주사기 또는 개별 포장된 정제 또는 캡슐에 포함될 수 있다. 단위 투여 형태는 분획 또는 이의 배수로 투여될 수 있다. 다중 투여 형태는 분리된 단위 투여 형태로 투여될 단일 용기에 포장된 복수의 동일한 단위 투여 형태이다. 다중 투여 형태의 예에는 바이알, 정제 또는 캡슐 병, 또는 파인트 또는 갤런 병이 포함된다. 따라서 다중 용량 형태는 포장에서 분리되지 않은 단위 용량의 배수이다. 일반적으로, 0.005% 내지 100% 범위의 활성 성분을 함유하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있으며 나머지는 무독성 담체로 구성된다. 약학적 조성물은 각각의 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다.
단위 용량 비경구 조제물은 앰플, 바이알 또는 바늘이 달린 주사기에 포장된다. 약학적 활성 화합물을 함유하는 액체 용액 또는 재구성된 분말 조제물의 부피는 치료될 질환 및 포장을 위해 선택된 특정 제조 물품의 함수이다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 알려져 있고 실행되는 바와 같이 멸균되어야 한다.
표시된 바와 같이, 본원에 제공된 조성물은 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 병변내, 복강내, 경막외, 질, 직장, 국소, 귀, 또는 경피 투여, 또는 임의의 투여 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 알려진 임의의 경로에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 경로에 적합한 제형은 당업자에게 알려져 있다. 조성물은 또한 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물로 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 제어 방출 제형 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,660; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,556; 5,591,767 5,639,476, 5,674,533, 5,733,566 참조). 다양한 전달 시스템이 알려져 있고 선택된 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있고, 본원에서 사용하기 위해 고려되며, 이러한 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
6. 포장 및 제조 물품
또한, 포장재, 본원에 제공된 임의의 약학적 조성물, 및 조성물이 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 병태의 치료에 사용됨을 나타내는 라벨을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 예를 들어, 라벨은 치료가 종양 또는 암에 대한 것임을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 면역자극성 박테리아 및 또 다른 치료제의 조합은 또한 제조 물품에 포장될 수 있다. 한 예에서, 제조 물품은 면역자극성 박테리아 조성물을 함유하고 추가 제제 또는 치료를 함유하지 않는 약학적 조성물을 함유한다. 다른 예에서, 제조 물품은 다른 항암제와 같은 또 다른 추가 치료제를 함유한다. 이 예에서, 제제는 제조 물품으로 포장하기 위해 함께 또는 별도로 제공될 수 있다.
본원에 제공된 제조 물품에는 포장재가 포함되어 있다. 약물 성분 포장에 사용하기 위한 포장 재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호를 참조하며, 이러한 각각은 그 전체가 여기에 포함된다. 제약 포장 재료의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병 및 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료 모드에 적합한 임의의 포장 재료가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 제조 물품의 예는 단일 챔버 및 이중 챔버 용기를 포함하는 용기이다. 용기에는 튜브, 병 및 주사기가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 용기는 정맥내 투여용 바늘을 추가로 포함할 수 있다.
포장재의 선택은 제제, 그리고 이러한 조성물이 함께 포장될 것인지 또는 별도로 포장될 것인지의 여부에 의존한다. 일반적으로 포장은 그 안에 포함된 조성물과 반응하지 않는다. 다른 예에서, 구성요소 중 일부는 혼합물로서 포장될 수 있다. 다른 예에서 모든 구성요소는 별도로 포장된다. 따라서, 예를 들어, 구성요소는 투여 직전 혼합 시 함께 직접 투여될 수 있는 별도의 조성물로 포장될 수 있다. 대안적으로, 구성요소는 별개의 투여를 위한 별도의 조성물로서 포장될 수 있다.
이의 제조 물품을 포함하는 선택된 조성물은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기재된 약학적 조성물, 및 제조 물품으로서 제공되는 투여용 항목을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 투여용 항목에 포함될 수도 있고, 추후 추가될 수 있도록 별도로 제공될 수도 있다. 키트는 선택적으로 투여량, 투여 요법 및 투여 방식에 대한 지침을 포함하는 적용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 약학적 조성물 및 진단용 아이템을 포함할 수 있다.
I. 치료 방법 및 용도
본원에 제공된 방법은 암과 같은 박테리아의 투여에 의해 증상이 개선되거나 완화될 수 있는 질환 또는 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위해 면역자극성 박테리아를 투여하거나 사용하는 방법을 포함한다. 특정 예에서, 질환 또는 병태는 종양 또는 암이다. 본원에 제공된 박테리아는 또한 상기 섹션에서 논의된 백신 및 다른 이러한 적용에 사용될 수 있다. 일부 경우, 박테리아는 이 섹션에서 기재된 바와 같이 그리고 항암제로서 사용하기 위한 참조문헌으로 기재된 바와 같이 투여될 수 있을 뿐만 아니라 다양한 병원체의 자연적인 진입 경로를 모방하는 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 섹션에서 논의된 바와 같이, 예컨대 바이러스, 예컨대 호흡기 바이러스에 대한 백신화를 위해, 이는 코 또는 폐 내로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 박테리아는 이것이 투여되는 조직, 예컨대 코, 식도 및 폐에서 T 세포 반응 및 면역 반응을 이끌어내어 현장에서 면역 반응을 촉진하여, 항원-특이적인 기억 T 세포, 뿐만 아니라 B 세포를 초래하여 장기간 반응을 제공할 것이다.
추가로, 항암제 또는 항-히알루로난제와 같은 치료를 위한 하나 이상의 추가 제제와의 조합 요법의 방법이 또한 제공된다. 박테리아는 비경구, 전신, 국소 및 국소, 예컨대 종양내, 정맥내, 직장, 경구, 근육내, 점막 및 다른 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 박테리아의 변형으로 인해 전신 투여와 관련된 문제가 해결된다. 각각의 투여 경로에 적합한 제형이 제공된다. 당업자는 적절한 요법 및 용량을 설정할 수 있고 투여 경로를 선택할 수 있다.
1. 치료를 위한 환자 선택 및 치료 모니터링을 위한 진단
a. 환자 선택
바이오마커는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아를 사용한 요법에 반응할 가능성이 있는 환자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아데노신 시그니처 및 골수 시그니처는 NanoString 유전자 발현 패널에 의해 평가될 수 있으며, 종양의 T-세포 침윤은 Immunoscore® 시험에 의해 평가될 수 있으며, 이는 종양 부위에서 숙주 면역 반응을 측정하여 초기 결장암 환자에서 재발 위험을 예측하는 데 사용되는 시험관내 진단 시험이다. 종양 또는 체액이 면역 반응성 또는 면역 반응을 나타내는 환자는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아를 사용한 치료에 반응할 가능성이 더 높다.
다른 바이오마커에는 종양 침윤 림프구(TIL), CD73, CD39, TNAP(조직 비특이적 알칼리 인산분해효소), CD38, CD68, PD-L1 및 FoxP3가 포함된다. 예를 들어, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아로 치료될 수 있는 종양은 T-세포가 배제되고, 높은 수준의 퓨린/아데노신을 나타내고, PD-1/PD-L1 표적화 요법에 반응하지 않는다.
다양한 NanoString 유전자 발현 패널을 사용하여 결정할 수 있는 유전자 발현 프로파일(GEP)은 예를 들어 종양의 "아데노신 시그너처"를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 높은 농도의 아데노신은 결장직장암(CRC), 비소세포폐암(NSCLC) 및 췌장암을 비롯한 특정 종양에서 발견된다. 고농도의 퓨린/아데노신을 나타내는 종양을 가진 환자는 본원의 면역자극성 박테리아가 퓨린/아데노신이 풍부한 종양 미세환경에서 축적되고 복제되기 때문에 요법에 반응할 가능성이 있다. 따라서 "아데노신 특징"을 발현하는 종양의 식별은 치료에 대한 환자의 반응을 예측하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 본원의 면역자극성 박테리아는 종양-체류 골수성 세포에 우선적으로 축적되고 이를 감염시킨다. 따라서 "골수 시그너처"는 면역자극성 박테리아 치료에 대한 환자의 반응을 예측하는 데에도 사용할 수 있다. 예를 들어, "아데노신 시그너처"는 신장 세포 암종(RCC) 환자에서 아테졸리주맙(항 PD-L1) 단독 요법에 대한 불량한 반응과 관련된 "골수 시그너처"와 거의 동일한 것으로 나타나고, 이는 항-PD-L1 요법으로부터의 종양 탈출에서 아데노신의 역할에 대해 설명한다(예를 들어, McDermott 등 (2018) Nature Medicine 24:749-757 참조). 종양 골수성 및 종양 아데노신 NanoString 시그너처 패널을 사용할 수 있으며 환자 선택에 사용할 수 있다.
대식세포는 예를 들어 삼중 음성 유방암에서 T-세포가 고형 종양으로 침투하는 것을 제한하고 그 기능을 억제한다(예를 들어, Keren 등 (2018) Cell 174:1373-1387 참조). CRC와 같은 특정 암에서 대식세포는 종양내 면역 집단을 지배하고 T-세포 배제를 촉진하며, 결과적으로 종양-연관 대식세포는 CRC에서 불량한 예후와 연관된다(예를 들어, Bindea et al. (2013) 면역 39:782-795). 암에 침투하여 암을 둘러싸고 있는 면역 세포를 기초로 암 환자의 예후를 추정하는 방법인 Immunoscore®는 T-세포 배제 또는 T-세포 침윤을 측정하는 데 사용할 수 있다. Immunoscore®는 숙주 면역 반응의 효과를 암 분류에 통합하고 예후 정확도를 향상시킨다. 종양의 중심과 주변에 있는 2개의 T 림프구 집단(CD3/CD8, CD3/CD45RO 또는 CD8/CD45RO)의 밀도를 측정하고 둘 다의 밀도가 낮을 때 0(I0) 범위의 점수를 제공하고, 세포 유형은 두 영역에서 모두 고밀도가 발견되는 경우 Immunoscore 4(I4)까지 발견된다. T 림프구의 낮은 침투는 높은 위험과 상관관계가 있는 낮은 Immunoscore®를 초래하는 반면, T 림프구의 높은 침투는 낮은 위험과 상관관계가 있는 높은 Immunoscore®를 초래한다. 따라서 Immunoscore®는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아를 사용한 치료에 반응할 환자를 식별하기 위한 전향적 바이오마커로 평가될 수 있다. 예를 들어, T-세포 불량/염증이 없는 종양은 치료될 수 있는데, 이는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아가 저온 종양에서 T-세포 침윤을 유도하기 때문이다. 이러한 종양은 체크포인트 억제에 불응성인 높은 충족되지 않은 수요 집단을 나타낸다.
세포외 아데노신은 종양 기질 세포에서 발현되는 막 관련 외효소인 CD39(엑토-뉴클레오사이드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1 또는 NTPDase1)와 CD73(엑토-5'-뉴클레오티다제)의 순차적 활성에 의해 생성되며, 함께, 죽거나 죽어가는 세포에서 생성되는 ATP 또는 ADP의 인산가수분해에 의해 아데노신을 생성한다. CD39는 세포외 ATP(또는 ADP)를 5'-AMP로 전환하고, 이는 CD73에 의해 아데노신으로 전환된다. 종양 미세환경의 저산소 상태에서 내피 세포에서 CD39 및 CD73의 발현이 증가하여 아데노신 수준이 증가한다. 따라서, CD39 및 CD73은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아로 표적화될 수 있는 아데노신이 풍부한 종양을 나타내는 바이오마커로서 사용될 수 있다.
순환 ADP 리보스 가수분해효소로도 알려진 CD38은 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, B 림프구 및 자연 살해 세포를 비롯한 많은 면역 세포의 표면에서 발견되는 당단백질이다. 세포 활성화의 마커인 CD38의 손실은 손상된 면역 반응과 관련이 있으며 백혈병, 골수종 및 고형 종양과 관련이 있다. 또한, CD38의 증가된 발현은 만성 림프구성 백혈병에서 바람직하지 않은 진단 마커이며 증가된 질환 진행과 관련이 있다. CD38은 또한 다발성 골수종 치료제로 승인된 다라투무맙(Darzalex®)의 표적으로 사용된다. CD68은 단핵구, 순환하는 대식세포 및 조직 대식세포(예를 들어, 쿠퍼 세포, 미세아교세포)에 의해 고도로 발현된다. FoxP3는 면역계 반응에 관여하고 면역억제성인 조절 T-세포(또는 Treg)의 발달 및 기능에서 조절자 역할을 한다. 암에서 과도한 조절 T-세포 활성은 면역계가 암세포를 방해하는 것을 방지할 수 있다. 따라서, CD38, CD68 및 FoxP3는 또한 본원의 면역자극성 박테리아를 사용한 요법에 반응할 가능성이 있는 환자의 선택을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
b. 면역자극성 박테리아의 활성을 평가하거나 검출하기 위한 진단은 치료의 효과성을 나타낸다
바이오마커는 치료 후 면역자극성 박테리아를 모니터링하는 데 사용할 수 있다. 바이오마커는 종양 시료 및/또는 혈액, 혈장, 소변, 타액 및 다른 체액과 같은 체액 시료에서 발생한다. 검증된 말초 혈액 바이오마커는 치료 전과 치료 중 환자의 면역 상태를 평가하고 치료 효과와 상관관계가 있는 면역 상태의 변화를 결정하는 데 사용된다. 항종양 면역 반응 상태의 변화 또는 증가는 면역자극성 박테리아 치료가 효과가 있음을 나타낸다. 예를 들어, 용량 증량 및 확장 연구에서 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 면역조절 활성이 평가될 수 있다. 바이오마커를 조사하면 질환(예를 들어, 종양) 상태 및 치료와 관련된 예후 및 예측 요인이 밝혀져 치료 모니터링에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 종양 미세환경을 평가하면 면역 요법에 대한 종양 반응의 기전에 대한 통찰력을 얻을 수 있다. 면역자극성 박테리아의 면역조절 활성을 검출하기 위한 혈청 바이오마커는 CXCL10(IP-10), CXCL9, 인터페론-β, 인터페론-γ, 전염증성 혈청 사이토카인(예를 들어, IL-6, TNF-α, MCP-1/CCL1), 및 IL-18 결합 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
CXCL10 및 CXCL9는 예를 들어 면역 요법에 대한 반응으로 CD8+ T-세포 활성화 및 종양으로의 이동에 필요한 케모카인이다. 항-PD-1 면역체크포인트저해제 니볼루맙(nivolumab)의 전이성 신세포암(mRCC) 환자 치료를 위한 3상 시험에서 용량에 관계없이 대다수 환자가 공유하는 면역 약력학적 효과 투여가 확인되었다. IFN-γ 조절 혈청 케모카인 CXCL9 및 CXCL10의 평가는 Luminex 기술(Myriad® Rules-Based Medicine(RBM))에 기반한 다중 패널을 사용하여 수행되었으며, 그 결과 CXCL9 및 CXCL10 혈청 수준이 증가할 뿐만 아니라 종양에서의 전사는 임상 반응과 상관관계가 있는 것으로 실증되었다. 기준선에서 니볼루맙으로 치료한 후 케모카인 수준의 중앙값 증가는 말초혈액에서 CXCL9의 경우 101%, CXCL10의 경우 37%였다(예를 들어, Choueiri 등 (2016) Clin. Cancer Res. 22(22):5461-5471). 또한, 진행성 고형 종양 또는 림프종 환자를 MK-1454 STING 작용제(Merck)로 치료하면 종양 내 투여 후 혈청 CXCL10이 용량 의존적으로 증가하였다(예를 들어, Harrington et al. ESMO Annual Meeting (2018)).
ADU-S100 STING 작용제(Aduro)의 종양내 투여 후 IFN-β의 혈청 수준의 용량 의존적 증가가 관찰되었다(예를 들어, Meric-Bernstam 등 ASCO Annual Meeting(2019) 참조). 또한, VNP20009의 정맥내 투여는 전염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 혈청 수준에서 용량 의존적 증가를 유도하였다(예를 들어, Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152).
IL-18은 세포내 박테리아, 진균 및 바이러스에 대한 보호 면역 반응에 참여하고 폐암, 유방암, 육종 및 흑색종의 전임상 모델에서 항종양 활성을 입증하였다. IL-18의 생물학적 활성은 IFN-γ를 통해 유도된 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 의해 음성 피드백 루프에서 조절된다. 따라서, IL-18BP의 혈청 수준은 임상 IFN-γ 활성을 예측한다. 진행성 암 환자에게 재조합 인간 IL-18(rhIL-18)을 정맥내 투여하면 용량 의존적으로 IL-18 결합 단백질뿐만 아니라 IFN-γ, GM-CSF, 및 가용성 Fas 리간드의 혈청 농도가 증가하였다(예를 들어, Robertson 등 (2006) Clin. Cancer Res. 12(14):4265-4273 참조). 또한, 소변과 혈청의 IL-18BP 수준은 전립선암 환자의 종양 상태와 상관관계가 있는 것으로 관찰되었으며; 전립선암이 있는 경우와 없는 경우 간에 요 중 IL-18BP 수준의 상당한 차이가 발견되었으며, 증가된 혈청 IL-18BP 수준은 전립선암 글리슨 점수(Gleason score) 증가와 상관관계가 있어 전립선암 세포에서 IL-18BP 분비가 증가하면 암에 의해 면역 감시를 피하기 위한 시도를 나타낼 수 있음을 보여준다(예를 들어, Fujita 등 (2011) Int. J. Cancer 129(2):424-432 참조). 따라서 IL-18BP는 종양 면역 반응에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다.
2. 종양
본원에 제공된 면역자극성 박테리아, 조합, 용도 및 방법은 예를 들어 폐암, 방광암, 비-소세포 폐암, 위암, 두경부암, 난소암, 간암, 췌장암, 신장암, 유방암, 대장암 및 전립선암을 포함한 암을 포함한 모든 유형의 종양, 특히 고형 종양을 치료하는 데 적용 가능하다. 방법은 또한 혈액암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아, 조성물, 조합, 용도 및 방법에 의해 치료되는 종양 및 암에는 면역계, 골격계, 근육 및 심장, 유방, 췌장, 위장관, 중추 및 말초 신경계, 신장계, 생식계, 호흡기계, 피부, 관절을 포함한 결합 조직계, 지방 조직, 및 혈관벽을 포함한 순환계에서 기원하는 종양 및 암이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아로 치료될 수 있는 종양의 예는 암종, 신경교종, 육종(지방육종 포함), 선암종, 선육종 및 선종을 포함한다. 이러한 종양은 예를 들어 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 두경부, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부 또는 간을 비롯한 신체의 거의 모든 부분에서 발생할 수 있다.
골격계의 종양은 예를 들어 육종 및 골육종, 연골육종 및 연골모세포종과 같은 모세포종을 포함한다. 근육 및 심장 종양은 골격 및 평활근 둘 다의 종양, 예를 들어 평활근종(평활근의 양성 종양), 평활근육종, 횡문근종(골격근의 양성 종양), 횡문근육종 및 심장 육종을 포함한다. 위장관의 종양에는 예를 들어 입, 식도, 위, 소장 및 결장의 종양 및 결장직장 종양뿐만 아니라 침샘, 간, 췌장 및 담관과 같은 위장 분비 기관의 종양이 포함된다. 중추 신경계(CNS)의 종양은 뇌, 망막 및 척수의 종양을 포함하며 관련 결합 조직, 뼈, 혈관 또는 신경 조직에서 기원할 수도 있다. 말초 신경계 종양의 치료도 고려된다. 말초 신경계의 종양에는 악성 말초 신경초 종양이 포함된다. 신장계의 종양에는 신장의 종양, 예를 들어 신세포 암종, 뿐만 아니라 요관 및 방광의 종양이 포함된다. 생식 기관의 종양에는 자궁경부, 자궁, 난소, 전립선, 고환 및 관련 분비선의 종양이 포함된다. 면역계의 종양은 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 혈액-기초 및 고형 종양을 모두 포함한다. 호흡계 종양에는 비강, 기관지 및 폐의 종양이 포함된다. 유방의 종양은 예를 들어 소엽 및 도관 암종 둘 다를 포함한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아 및 방법에 의해 치료될 수 있는 종양의 다른 예는 카포시 육종, CNS 신생물, 신경모세포종, 모세혈관모세포종, 수막종 및 뇌 전이, 흑색종, 위장관 및 신장 암종 및 육종, 횡문근육종, 교모세포종(다형성 교모세포종) 및 평활근육종을 포함한다. 본원에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 다른 암의 예는 림프종, 모세포종, 신경내분비 종양, 중피종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 예로는 혈액 악성종양, 예를 들어 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(버킷 림프종, 소림프구성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 외투세포 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 변연부 림프종, 모세포 백혈병 및 림프형질구성 백혈병), B-세포 급성 림프모구 백혈병/림프종 및 T-세포 급성 림프모구 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구체 세포의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙한 T 및 NK 세포의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 급성 골수성 백혈병과 같은 골수 신생물, 성숙을 동반한 급성 골수성 백혈병(AML), 분화 없는 AML, 급성 전골수구성 백혈병 골수단구성 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 골수이형성 증후군 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수증식성 장애; 신경교종, 교모세포종, 신경모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막종 및 망막모세포종과 같은 중추신경계 종양; 두경부 고형 종양(예를 들어, 비인두암, 타액선 암종 및 식도암), 폐(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종 및 폐암 편평상피암), 소화기 계통(예를 들어, 위암 또는 위암, 위장관암, 담관암 또는 담도암, 결장암, 직장암, 결장직장암 및 항문암 포함), 생식계(예를 들어, 고환, 음경, 전립선, 자궁, 질, 외음부, 자궁경부암, 난소암 및 자궁내막암), 피부(예를 들어, 흑색종, 기저세포암, 편평세포암, 광선각화증 및 피부 흑색종), 간(예를 들어, 간암, 간암, 간세포암, 및 간암), 뼈(예를 들어, 파골세포종 및 골용해성 뼈암), 추가 조직 및 기관의 고형 종양(예를 들어, 췌장암, 방광암, 신장 또는 신장암, 갑상선암, 유방암, 복막암, 및 카포시 육종), 혈관계의 종양(예를 들어, 혈관육종 및 혈관주위세포종), 윌름 종양, 망막모세포종, 골육종 및 에윙 육종을 포함한다.
3. 투여
본원의 용도 및 방법을 실행함에 있어서, 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 종양을 갖거나 신생물 세포를 갖는 대상체를 포함하는 대상체, 또는 면역화될 대상체에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 단계는 면역자극성 박테리아를 투여하기에 적절한 상태로 대상체를 진단하고, 대상체의 면역적격을 결정하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 대상체에 면역자극성 박테리아를 투여하기 전, 동시에 또는 이후에 수행될 수 있다. 대상체를 면역화하거나, 화학요법제로 대상체를 치료하거나, 방사선으로 대상체를 치료하거나, 대상체를 외과적으로 치료하는 것을 포함한다.
치료 목적을 위해 종양-보유 대상체에게 면역자극성 박테리아를 투여하는 것을 포함하는 구현예의 경우, 대상체는 전형적으로 이전에 신생물 상태로 진단된 적이 있다. 진단 방법은 또한 신생물 상태의 유형을 결정하고, 신생물 상태의 단계를 결정하고, 대상체에서 하나 이상의 종양의 크기를 결정하고, 대상체의 림프절에서 전이성 또는 신생물성 세포의 존재 또는 부재를 결정하고, 또는 대상체에서 전이의 존재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
대상체에 면역자극성 박테리아를 투여하기 위한 치료 방법의 일부 구현예는 원발성 종양의 크기 또는 신생물성 질환의 병기를 결정하는 단계를 포함할 수 있고, 원발성 종양의 크기가 임계 부피 이상인 경우 또는 신생물 질환의 단계가 역치 단계 이상인 경우, 면역자극성 박테리아가 대상체에게 투여된다. 유사한 구현예에서, 원발성 종양의 크기가 역치 부피 미만인 경우 또는 신생물 질환의 단계가 역치 단계 이하인 경우, 면역자극성 박테리아는 대상체에게 아직 투여되지 않고; 이러한 방법은 종양 크기 또는 신생물성 질환 단계가 역치 양에 도달할 때까지 대상체를 모니터링한 다음, 대상체에게 면역자극성 박테리아를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 역치 크기는 종양의 성장 속도, 종양을 감염시키는 면역자극성 박테리아의 능력 및 대상체의 면역적격성을 비롯한 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 역치 크기는 면역자극성 박테리아가 숙주의 면역계에 의해 완전히 제거되지 않고 종양 내부 또는 근처에서 축적 및 복제하기에 충분한 크기일 것이며 일반적으로 일정 기간 동안 박테리아 감염을 지속하기에 충분한 크기일 것이며, 숙주가 종양 세포에 대한 면역 반응을 일으킬 만큼 충분히 길며, 일반적으로 약 1주 이상, 약 10일 이상, 또는 약 2주 이상이다. 예시적인 역치 병기는 가장 낮은 병기를 넘어선 임의의 병기(예를 들어, 병기 I 또는 등가물), 또는 원발성 종양이 역치 크기보다 큰 임의의 병기, 또는 전이성 세포가 검출되는 임의의 병기이다.
면역자극성 박테리아가 종양 또는 전이에 들어갈 수 있도록 하는 투여 방식이 제공된다면, 대상체에 대한 미생물의 임의의 투여 방식이 사용될 수 있다. 투여 방식은 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소, 종양내, 다천자, 흡입, 비강내, 경구, 공동내(예를 들어, 카테터를 통해 방광에 투여하거나 좌제 또는 관장), 귀, 직장 및 안구 투여를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
당업자는 대상체 및 박테리아와 양립할 수 있는 임의의 투여 방식을 선택할 수 있으며, 이는 또한 박테리아가 종양 및/또는 전이에 도달하게 할 가능성이 있다. 투여 경로는 질환의 성질, 종양의 종류, 및 약학적 조성물에 함유된 특정 박테리아를 포함하는 다양한 인자 중 임의의 것에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 표적 부위에 대한 투여는 예를 들어 탄도 전달에 의해, 또는 콜로이드성 분산 시스템으로서 수행될 수 있거나, 전신 투여는 동맥에 주사함으로써 수행될 수 있다.
투여 요법은 임의의 다양한 방법 및 양일 수 있고, 알려진 임상 인자에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 단일 용량은 면역 자극이 치료에 영향을 미치는 질환 또는 장애를 치료하는 데 치료적으로 효과적일 수 있다. 이러한 자극의 예는 특이적 면역 반응 및 비특이적 면역 반응 중 하나 또는 둘 다, 특이적 및 비특이적 반응, 내재성 반응, 1차 면역 반응, 적응 면역력 , 2차 면역 반응, 기억 면역 반응, 면역 세포 활성화, 면역 세포 증식, 면역 세포 분화 및 사이토카인 발현을 포함하지만 이로 제한되지 않는 면역 반응이다.
의학 분야에 알려진 바와 같이, 대상체에 대한 투여량은 대상체의 종, 크기, 체표면적, 연령, 성별, 면역적격성 및 일반적인 건강, 투여할 특정 박테리아, 투여의 기간 및 경로, 질환의 종류 및 병기, 예를 들어 종양의 크기, 및 동시에 투여되는 약물과 같은 다른 화합물을 비롯한 많은 요인에 따라 의존할 수 있다. 상기 인자에 더하여, 이러한 수준은 당업자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 박테리아의 감염성 및 박테리아의 성질에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 방법에서, 박테리아의 적절한 최소 투여량 수준은 박테리아가 종양 또는 전이에서 생존, 성장 및 복제하기에 충분한 수준일 수 있다. 65 kg 인간에게 박테리아를 투여하기 위한 예시적인 최소 수준은 적어도 약 5 x 106 콜로니 형성 단위(CFU), 적어도 약 1 x 107 CFU, 적어도 약 5 x 107 CFU, 적어도 약 1 x 108 CFU 또는 적어도 약 1 x 109 CFU를 포함할 수 있다. 본 방법에서, 박테리아의 적절한 최대 투여량 수준은 숙주에 독성이 없는 수준, 3배 이상의 비장비대를 일으키지 않는 수준, 또는 약 1일 후, 또는 약 3일 후, 또는 약 7일 후 정상 조직 또는 기관에서 콜로니 또는 플라크를 생성하지 않는 수준일 수 있다. 65 kg 인간에게 박테리아를 투여하기 위한 예시적인 최대 수준은 약 5 x 1011 CFU 이하, 약 1 x 1011 CFU 이하, 약 5 x 1010 CFU 이하, 약 1 x 1010 CFU 이하, 또는 약 1 x 109 CFU 이하를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 용도는 대상체에 대한 면역자극성 박테리아의 단일 투여, 또는 대상체에 대한 면역자극성 박테리아의 다중 투여, 또는 다른 항종양 치료제 및/또는 치료와의 조합 요법을 비롯한 다양한 요법의 다른 것을 포함할 수 있다. 여기에는 예를 들어 변형된 면역 세포의 투여와 같은 세포 요법; CAR-T 요법; CRISPR 요법; 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 및 항-CTLA-4 항체, 및 다른 이러한 면역요법)와 같은 체크포인트 저해제; 뉴클레오사이드 유사체와 같은 화학요법 화합물; 수술; 및 방사선 요법이 포함된다. 다른 암 요법은 또한 항-VEGF, 항-VEGFR, 항-VEGFR2, 항-TGF-β 또는 항-IL-6 항체, 또는 이의 단편, 암 백신, 및 종양용해성 바이러스를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 투여는 박테리아가 콜로니화할 수 있고 대상체에서 항종양 반응을 유발하거나 향상시킬 수 있는 종양에서 면역자극성 박테리아를 확립하기에 충분하다. 다른 구현예에서, 본원의 방법에 사용하기 위해 제공된 면역자극성 박테리아는 상이한 경우에 투여될 수 있고, 일반적으로 적어도 1일까지 시간적으로 분리될 수 있다. 별개의 투여는 박테리아를 종양 또는 전이로 전달할 가능성을 증가시킬 수 있으며, 이전 투여는 박테리아를 종양 또는 전이로 전달하는 데 효과적이지 않았을 수 있다. 구현예에서, 별개의 투여는 박테리아 콜로니화/증식이 발생할 수 있는 종양 또는 전이 상의 위치를 증가시킬 수 있거나, 그렇지 않으면 종양에 축적된 박테리아의 역가를 증가시킬 수 있으며, 이는 숙주의 항종양 면역 반응을 이끌어내거나 향상시킬 수 있다.
별개의 투여가 수행되는 경우, 각각의 투여는 다른 투여 투여량과 비교하여 동일하거나 상이한 투여량일 수 있다. 한 구현예에서, 모든 투여 투여량은 동일하다. 다른 구현예에서, 제1 투여량은 하나 이상의 후속 투여량보다 더 큰 투여량, 예를 들어 후속 투여량보다 적어도 10배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 더 클 수 있다. 제1 투여량이 하나 이상의 후속 투여량보다 많은 별개의 투여 방법의 한 예에서, 모든 후속 투여량은 제1 투여와 비교하여 동일하고 더 적은 양일 수 있다.
별개의 투여는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 투여를 포함하는 임의의 수의 2개 이상의 투여를 포함할 수 있다. 당업자는 치료 방법을 모니터링하기 위한 당업계에 알려진 방법 및 본원에 제공된 다른 모니터링 방법에 따라 수행할 투여 횟수 또는 하나 이상의 추가 투여를 수행하는 것이 바람직함을 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 면역자극성 박테리아의 1회 이상의 투여를 제공하는 방법을 포함하며, 여기서 투여 횟수는 대상체를 모니터링함으로써 결정될 수 있고, 모니터링 결과에 기초하여 하나 이상의 추가 투여를 제공할지의 여부를 결정한다. 하나 이상의 추가 투여를 제공할지의 여부를 결정하는 것은 종양 성장의 표시 또는 종양 성장의 억제, 새로운 전이의 출현 또는 전이의 억제, 대상체의 항박테리아 항체 역가, 대상체의 항종양 항체 역가, 대상체의 전반적인 건강 및 대상체의 체중을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 모니터링 결과에 기반할 수 있다.
투여 사이의 기간은 다양한 기간 중 임의의 것일 수 있다. 투여 사이의 기간은 투여 횟수와 관련하여 설명된 모니터링 단계, 대상체가 면역 반응을 일으키는 시간, 대상체가 정상 조직에서 박테리아를 제거하거나 종양 또는 전이에서 박테리아 콜로니화/증식 기간을 포함한 여러 가지 인자 중 임의의 인자의 함수일 수 있다. 한 예에서, 기간은 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간의 함수일 수 있고; 예를 들어, 기간은 약 1주 초과, 약 10일 초과, 약 2주 초과, 또는 약 1개월 초과와 같이 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 길 수 있다. 다른 예에서, 기간은 약 1주 미만, 약 10일 미만, 약 2주 미만, 또는 약 1개월 미만과 같이 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 짧을 수 있다. 다른 예에서, 기간은 종양 또는 전이에서 박테리아 콜로니화/증식을 위한 기간의 함수일 수 있고; 예를 들어, 기간은 약 3일, 약 5일, 약 1주일, 약 10일, 약 2주, 또는 약 1개월과 같이 검출 가능한 마커를 발현하는 미생물의 투여 후 종양 또는 전이에서 검출 가능한 신호가 발생하는 시간보다 길 수 있다.
본원에 사용된 방법은 또한 본원에 제공된 면역자극성 박테리아를 함유하는 현탁액 및 다른 제제와 같은 조성물을 투여함으로써 수행될 수 있다. 이러한 조성물은 본원에 제공되거나 당업자에게 알려진 바와 같은 박테리아 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 비히클을 함유한다.
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 용도 및 방법은 또한 대상체에게 면역자극성 박테리아를 투여하는 것 이외에 항종양 화합물 또는 다른 암 치료제와 같은 하나 이상의 치료 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 치료 화합물은 종양 치료 효과를 위해 독립적으로 또는 면역자극성 박테리아와 함께 작용할 수 있다. 독립적으로 작용할 수 있는 치료 화합물은 종양 성장을 억제하거나, 전이 성장 및/또는 형성을 억제하거나, 종양 또는 전이의 크기를 감소시키거나, 종양 또는 전이를 제거할 수 있는, 면역자극성 박테리아는 종양에 축적되고, 종양에서 복제되며, 대상체에서 항종양 면역 반응을 유발하거나 향상시킨다. 이러한 화학요법제의 예에는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판, 피포술판 등의 알킬 설포네이트; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄 및 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄 및 트리로스탄과 같은 항아드레날; 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카루비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노루비시노류신, 도에피노루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston®); 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 벤조데파, 카르보쿠온, 메투레데파 및 우레데파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸올 멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸멜라민; 엽산과 같은 엽산 보충제; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 아르기닌 데이미나제 및 아스파라기나제와 같은 단백질; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 및 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁산, 및 이의 알부민화 형태(즉, nab-파클리탁셀 및 nab-도세탁셀); RFS-2000과 같은 토포이소머라제 저해제; Tomudex®와 같은 티미딜레이트 합성효소 저해제; 및 아세글라톤을 포함한 추가 화학요법제; 알도포스파미드 배당체; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포스파미드; 데메콜신; 디아지쿠온; 디플루오로메틸오르니틴(DFMO); 에플로르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 질산염; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 배꼽빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다®; 이반드로네이트; CPT-11; 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 이리노테칸과 같은 토포이소머라제 저해제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체가 또한 사용될 수 있다.
면역자극성 박테리아와 함께 작용하는 치료 화합물은, 예를 들어 인코딩된 치료 생성물, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 공동자극성 분자, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 체크포인트 유전자(들)의 발현을 저해, 억제 또는 방해하는 RNAi 분자, 다른 표적에 대한 체크포인트 저해제 항체 및 항체들 또는 이의 단편, 또는 박테리아 콜로니화/증식을 추가로 증가시킬 수 있는 화합물의 발현을 증가시킴으로써 박테리아의 면역 반응 유도 특성을 증가시키는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 유전자 발현 변경 화합물은 플라스미드에 인코딩된 외인성 유전자와 같은 박테리아에서 유전자의 전사를 유도하거나 증가시켜 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. IPTG 및 RU486을 포함하여 유전자 발현을 변경할 수 있는 임의의 매우 다양한 화합물이 당업계에 알려져 있다. 발현이 상향조절될 수 있는 예시적인 유전자는 독소, 전구약물을 항종양 약물로 전환시킬 수 있는 효소, 사이토카인, 전사 조절 단백질, shRNA, siRNA 및 리보자임을 포함하는 RNA 분자 및 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역자극성 박테리아와 함께 작용하여 박테리아의 콜로니화/증식 또는 면역 반응 유도 특성을 증가시킬 수 있는 치료 화합물은 박테리아로 인코딩된 유전자 생성물과 상호작용할 수 있는 화합물이고, 이러한 상호작용은 대상체에서 종양 세포의 증가된 사멸, 또는 증가된 항종양 면역 반응을 초래할 수 있다. 박테리아로 인코딩된 유전자 생성물과 상호작용할 수 있는 치료 화합물에는 예를 들어 이의 대상체에게 투여된 형태에서 독성, 또는 다른 생물학저 활성이 거의 없거나 전혀 없으나, 박테리아-인코딩된 유전자 생성물과 상호작용 후, 화합물이 세포독성, 세포자멸사 유도 능력 또는 면역 반응을 유발하는 능력을 포함하지만 이로 제한되지 않는 종양 세포 사멸을 초래하는 특성을 발달시킬 수 있는 전구약물 또는 다른 화합물이 포함될 수 있다. 간사이클로비르, 5-플루오로우라실, 6-메틸퓨린 데옥시리보시드, 세팔로스포린-독소루비신, 4-[(2-클로로에틸)(2-메술옥시에틸)아미노]벤조일-L-글루탐산, 아세트아미노펜, 인돌-3-아세트산, CB1954, 7-에틸-10-[4-(1-피페리디노)-1-피페리디노]카르보닐옥시캄프토테신, 비스-(2-클로로에틸)아미노-4-하이드록시페닐아미노메탄온 28, 1-클로로메틸-5-하이드록시-1,2-디히로-3H-벤즈[e]인돌, 에피루비신-글루쿠로나이드, 5'-데옥시5-플루오로우리딘, 시토신 아라비노시드 및 리나마린을 비롯한 다양한 전구약물 유사 물질이 당업계에 알려져 있다.
4. 모니터링
본원에 제공된 방법은 대상체 모니터링, 종양 모니터링, 및/또는 대상체에 투여된 면역자극성 박테리아 모니터링의 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 종양 크기 모니터링, 전이의 존재 및/또는 크기 모니터링, 대상체의 림프절 모니터링, 대상체의 체중, 또는 혈액 또는 소변 마커를 포함하는 다른 건강 지표의 모니터링, 항박테리아 항체 역가 모니터링, 검출 가능한 유전자 생성물의 박테리아 발현 모니터링, 및 대상체의 종양, 조직 또는 기관에서 박테리아 역가 직접 모니터링을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 다양한 모니터링 단계가 본원에 제공된 방법에 포함될 수 있다.
모니터링의 목적은 단순히 대상체의 건강 상태 또는 대상체의 치료 진행 상황을 평가하기 위한 것일 수도 있고, 동일하거나 다른 면역자극성 박테리아의 추가 투여가 필요한지 여부를 결정하거나, 화합물이 치료 방법의 효능을 증가시키는 작용을 할 수 있거나, 화합물이 대상체에게 투여된 박테리아의 병원성을 감소시키는 작용을 할 수 있는 경우 대상체에게 화합물을 투여할지 여부를 결정하기 위한 것일 수도 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 박테리아 발현 유전자를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 제공되거나 당업계에 알려진 것과 같은 박테리아는 검출 가능한 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 검출 가능한 유전자 생성물을 발현할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이, 박테리아에서 발현되는 검출 가능한 유전자 생성물의 측정은 대상체에 존재하는 박테리아 수준의 정확한 측정을 제공할 수 있다. 본원에 추가로 제공되는 바와 같이, 예를 들어 단층촬영 방법을 비롯한 영상화 방법에 의한 검출 가능한 유전자 생성물의 위치 측정은 대상체에서 박테리아의 위치를 결정할 수 있다. 따라서, 검출 가능한 박테리아 유전자 생성물을 모니터링하는 것을 포함하는 본원에 제공된 방법은 대상체의 하나 이상의 기관 또는 조직에서 박테리아의 존재 또는 부재, 및/또는 또는 대상체의 종양 또는 전이에서 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 검출 가능한 박테리아 유전자 생성물을 모니터링하는 것을 포함하는 본원에 제공된 방법을 사용하여 하나 이상의 기관, 조직, 종양 또는 전이에 존재하는 박테리아의 역가를 결정할 수 있다. 정상 조직 및 기관의 박테리아 감염, 특히 감염 수준이 박테리아의 병원성을 나타낼 수 있기 때문에 대상체에서 박테리아의 위치 및/또는 역가를 모니터링하는 것을 포함하는 방법은 박테리아의 병원성을 결정하는 데 사용할 수 있다. 대상체에서 면역자극성 박테리아의 국소화 및/또는 역가를 모니터링하는 것을 포함하는 방법은 여러 시점에서 수행될 수 있으며, 따라서 대상체의 하나 이상의 장기 또는 조직에서 박테리아 복제 속도를 포함하여 대상체에서 박테리아 복제 속도를 결정할 수 있으며; 따라서, 박테리아 유전자 생성물을 모니터링하는 것을 포함하는 방법은 박테리아의 복제 능력을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 다양한 기관 또는 조직, 및 종양 또는 전이에 존재하는 면역자극성 박테리아의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있으며, 이로써 대상체에서 박테리아의 우선적 축적 정도를 나타낼 수 있고; 따라서, 박테리아 유전자 생성물 모니터링은 정상 조직 또는 기관보다 우선적으로 종양 또는 전이에 축적되는 박테리아의 능력을 결정하는 방법에 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용된 면역자극성 박테리아는 전체 종양에 축적될 수 있거나 종양의 여러 부위에 축적될 수 있고 전이에도 축적될 수 있기 때문에, 박테리아 유전자 생성물을 모니터링하기 위해 본원에 제공된 방법을 사용하여 종양의 크기, 또는 대상체에 존재하는 전이의 수를 결정할 수 있다. 일정 기간 동안 종양 또는 전이에서 박테리아 유전자 생성물의 존재를 모니터링하는 것은 종양의 성장 또는 축소, 또는 새로운 전이의 발달 또는 전이의 소실을 포함하는 종양 또는 전이의 변화를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 또한 종양의 성장 또는 축소 속도, 또는 새로운 전이의 진행 속도 또는 전이의 소멸 속도, 또는 종양의 성장 또는 축소 속도의 변화, 또는 새로운 전이의 진행 속도 또는 전이의 소멸 속도의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 박테리아 유전자 생성물의 모니터링은 종양의 성장 또는 축소 속도, 또는 새로운 전이의 진행 또는 전이의 소멸, 또는 종양의 성장 또는 축소 속도의 변화, 또는 새로운 전이의 진행 또는 전이의 소멸 속도의 변화를 결정함으로써 대상체에서 신생물 질환을 모니터링하거나 신생물 질환의 치료 효능을 결정하는 데 사용될 수 있다.
임의의 다양한 검출 가능한 단백질은 모니터링에 의해 검출될 수 있으며, 그 예시는 임의의 다양한 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질), 임의의 다양한 루시페라제, 트랜스페린 또는 다른 철-결합 단백질; 또는 수용체, 결합 단백질 및 항체(여기서, 수용체, 결합 단백질 또는 항체에 특이적으로 결합하는 화합물은 검출 가능한 제제일 수 있거나 검출 가능한 물질(예를 들어, 방사성핵종 또는 영상화 제제)로 표지될 수 있다.
종양 및/또는 전이 크기는 외부 평가 방법, 또는 단층 촬영 또는 자기 영상화 방법을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 다양한 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 당업계에 알려진 방법에 첨가하여, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 박테리아 유전자 발현을 모니터링하는 방법을 사용하여 종양 및/또는 전이 크기를 모니터링할 수 있다.
여러 시점에 걸쳐 크기를 모니터링하는 것은 종양 또는 전이의 크기의 증가 또는 감소에 관한 정보를 제공할 수 있고, 또한 대상체에서 추가 종양 및/또는 전이의 존재에 관한 정보를 제공할 수 있다. 여러 시점에 걸쳐 종양 크기를 모니터링하는 것은 대상체에서 신생물성 질환의 치료 효능을 포함하여 대상체에서 신생물성 질환의 발달에 관한 정보를 제공할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 대상체에 대한 면역자극성 박테리아의 투여에 반응하여 생성된 항체를 포함하여 대상체에서 항체 역가를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 투여된 박테리아는 내인성 박테리아 항원에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 투여된 박테리아는 또한 박테리아에 의해 발현되는 외인성 유전자에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 투여된 박테리아는 또한 종양 항원에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 박테리아 항원, 박테리아로 발현된 외인성 유전자 생성물 또는 종양 항원에 대한 항체 역가 모니터링은 박테리아의 독성을 모니터링하거나, 치료 방법의 효능을 모니터링하거나, 생산 및/또는 수합용 유전자 생성물(들) 또는 항체의 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있다.
항체 역가 모니터링은 박테리아의 독성을 모니터링하는 데 사용할 수 있다. 박테리아에 대한 항체 역가는 대상체에 박테리아를 투여한 후 기간에 따라 변할 수 있으며, 여기서 일부 특정 시점에서 낮은 항-(박테리아 항원) 항체 역가는 더 낮은 독성을 나타낼 수 있는 반면, 다른 시점에서는 높은 항(박테리아 항원) 항체 역가는 더 높은 독성을 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용된 박테리아는 면역원성일 수 있으며, 따라서 대상체에게 박테리아를 투여한 직후에 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 일반적으로 대상체의 면역계가 강한 면역반응을 일으킬 수 있는 면역자극성 박테리아는 대상체의 면역계가 모든 정상 장기나 조직에서 박테리아를 제거할 수 있을 때 독성이 낮은 박테리아일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체에게 박테리아를 투여한 직후에 박테리아 항원에 대한 높은 항체 역가는 박테리아의 낮은 독성을 나타낼 수 있다.
다른 구현예에서, 항체 역가를 모니터링하여 치료 방법의 효능을 모니터링할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서, 항-(종양 항원) 항체 역가와 같은 항체 역가는 종양 질환을 치료하기 위한 치료 방법과 같은 치료 방법의 효능을 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 치료 방법은 종양 및/또는 전이에 대한 면역 반응을 유발하거나 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 항(종양 항원) 항체 역가를 모니터링함으로써, 종양 및/또는 전이에 대한 면역 반응을 유발하거나 향상시키는 치료 방법의 효능을 모니터링하는 것이 가능하다.
다른 구현예에서, 항체 역가 모니터링은 생산 및/또는 수합을 위한 유전자 생성물(들) 또는 항체의 수준을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, 방법은 종양, 종양 미세환경 및/또는 종양-체류 면역 세포에 축적된 미생물에서 외인성 유전자를 발현함으로써 단백질, RNA 분자 또는 다른 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 단백질, RNA 분자 또는 다른 화합물에 대한 항체 역가를 모니터링하면 종양 축적 미생물에 의한 단백질, RNA 분자 또는 다른 화합물의 생산 수준을 나타낼 수 있으며, 또한 이러한 단백질, RNA 분자 또는 다른 화합물에 특이적인 항체의 수준을 직접 나타낼 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 대상의 건강을 모니터링하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법 중 일부는 신생물성 질환 치료 방법을 비롯한 치료 방법이다. 대상체의 건강을 모니터링하는 것은 당업계에 알려진 바와 같이 치료 방법의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 본원에 제공된 바와 같은 면역자극성 박테리아를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체의 건강을 모니터링하는 것은 대상체에 투여된 면역자극성 박테리아의 병원성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 신생물 질환, 감염성 질환, 또는 면역 관련 질환과 같은 질환을 모니터링하기 위한 다양한 건강 진단 방법 중 임의의 것이 당업계에 알려진 바와 같이 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 체중, 혈압, 맥박, 호흡, 색, 온도 또는 대상체의 다른 관찰 가능한 상태는 대상체의 건강을 나타낼 수 있다. 또한, 대상체의 시료에서 하나 이상의 성분의 존재 또는 부재 또는 수준은 대상체의 건강을 나타낼 수 있다. 전형적인 시료은 혈액 및 소변 시료을 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 구성요소의 존재 또는 부재 또는 수준은 예를 들어 혈액 패널 또는 소변 패널 진단 시험을 수행하여 결정할 수 있다. 대상체의 건강을 나타내는 예시적인 구성요소에는 백혈구 수, 헤마토크릿 및 c-반응성 단백질 농도가 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 제공된 방법은 요법을 모니터링하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 치료적 결정은 모니터링의 결과에 기초할 수 있다. 본원에 제공된 치료 방법은 대상체에게 면역자극성 박테리아를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 박테리아는 종양, 종양 미세환경, 또는 종양-체류 면역 세포 및/또는 전이에 우선적으로 축적될 수 있고, 박테리아는 항종양 면역 반응을 유발하거나 향상시킬 수 있다. 이러한 치료 방법은 특정 면역자극성 박테리아의 다중 투여, 제2 면역자극성 박테리아의 투여, 또는 치료 화합물의 투여를 포함하는 다양한 단계를 포함할 수 있다. 대상체에게 투여할 면역자극성 박테리아 또는 화합물의 양, 시기 또는 유형의 결정은 대상체 모니터링으로부터의 하나 이상의 결과에 기반할 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 항체 역가는 면역자극성 박테리아 및 선택적으로 화합물을 투여하는 것이 바람직한지의 여부, 투여할 박테리아 및/또는 화합물의 양, 및 투여할 박테리아의 유형 및/또는 화합물의 유형을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 예를 들어 낮은 항체 역가는 추가 면역자극성 박테리아, 상이한 면역자극성 박테리아 및/또는 치료 화합물, 예를 들어 박테리아 유전자 발현을 유도하는 화합물, 또는 면역자극성 박테리아와 독립적으로 효과적인 치료 화합물을 투여하는 것이 바람직함을 나타낼 수 있다.
또 다른 예에서, 대상체의 전반적인 건강 상태는 면역자극성 박테리아 및 선택적으로 화합물, 투여할 박테리아 및/또는 화합물의 양, 및 투여할 박테리아 및/또는 화합물의 유형을 투여하는 것이 바람직한지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 예를 들어 대상체가 건강한 것으로 결정하는 것은 추가의 박테리아, 상이한 박테리아, 또는 박테리아 유전자/유전자 페이로드/치료 생성물 발현을 유도하는 화합물과 같은 치료 화합물을 투여하는 것이 바람직함을 나타낼 수 있다. 또 다른 예에서, 검출 가능한 박테리아-발현 유전자 생성물의 모니터링은 면역자극성 박테리아 및 임의로 화합물, 투여할 박테리아 및/또는 화합물의 양, 및 박테리아의 유형 및 /또는 투여할 화합물, 예를 들어 대상이 건강한 것으로 결정하는 것은 추가의 박테리아, 상이한 박테리아, 또는 박테리아 유전자/유전자 페이로드/치료 생성물 발현을 유도하는 화합물과 같은 치료 화합물을 투여하는 것이 바람직함을 나타낼 수 있다. 이러한 모니터링 방법은 치료 방법이 효과적인지 여부, 치료 방법이 대상체에 병원성인지 여부, 박테리아가 종양 또는 전이에 축적되었는지 여부, 박테리아가 정상 조직이나 기관에서 축적되었는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. 이러한 결정을 기초로 추가 치료 방법의 바람직함 및 형태를 도출할 수 있다.
또 다른 예에서, 모니터링은 면역자극성 박테리아가 종양 또는 대상체의 전이에 축적되었는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 결정에 따라, 추가 박테리아, 상이한 면역자극성 박테리아, 및 선택적으로 화합물을 대상체에게 추가로 투여하기로 결정할 수 있다.
J. 실시예
하기 실시예는 예시적인 목적을 위해 포함될 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
에스. 티피무리움 의 영양요구성 균주
살모넬라 균주 YS1646은 아데노신에 대해 영양요구성이다
본원에 제공된 균주는 아데노신에 대해 영양요구성이 되도록 조작된다. 그 결과, 정상 조직의 낮은 아데노신 농도에서는 복제할 수 없기 때문에 생체 내에서 약독화되고, 콜로니화는 주로 아데노신 수준이 높은 고형 종양 미세환경(TME)에서 발생한다. 살모넬라 균주 YS1646은 야생형 균주 ATCC 14028의 유도체이며 purI 유전자(purM과 동의어)의 방해로 인해 퓨린에 대한 영양요구성이 되도록 조작되었다(예를 들어, Low et al. (2004) Methods Mol. Med. 90:47-60). YS1646의 전체 게놈에 대한 후속 분석은 purI 유전자가 실제로 결실된 것이 아니라 염색체 역전(in버전)에 의해 방해되었음을 보여주고(예를 들어, Broadway 등 (2014) J. Biotechnol. 192:177-178 참조), 전체 유전자는 삽입 서열에 의해 플랭킹되는 YS1646 염색체의 두 부분 내에 여전히 포함되어 있으며, 그 중 하나는 활성 트랜스포사제를 갖고 있다. 염색체 재결합에 의해 방해된 purI 유전자의 완전한 유전 서열의 존재는 야생형 유전자로의 복귀 가능성을 열어 둔다. 이전에 YS1646의 퓨린 영양요구성이 시험관 내에서 >140회 연속 계대 후에 안정한 것으로 입증되었지만, 복귀율이 무엇인지는 분명하지 않았다(예를 들어, Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002).
아데노신이 제공될 때 균주 YS1646은 최소 배지에서 복제할 수 있는 반면, 야생형 모 균주 ATCC 14028은 아데노신이 보충되지 않은 최소 배지에서 성장할 수 있음이 본원에서 제시된다. 균주 YS1646을 리소젠 브로스(LB) 배지에서 밤새 성장시키고, M9 최소 배지로 세척하고, 아데노신을 함유하지 않거나 증가하는 농도의 아데노신을 함유하는 M9 최소 배지로 희석시켰다. 37℃에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 OD600을 15분마다 판독하여 성장을 측정하였다.
그 결과 모든 농도의 아데노신에서 성장할 수 있었던 야생형 균주(ATCC 14028)와 달리 YS1646 균주는 아데노신이 11 내지 300 마이크로몰 범위의 농도로 제공되었을 때만 복제할 수 있었고 완전히 M9 단독 또는 130 나노몰 아데노신이 보충된 M9에서는 복제할 수 없었다. 이러한 데이터는 purI 돌연변이가 종양 미세환경에서 발견되는 아데노신 농도에서 복제할 수 있지만 정상 조직에서 발견되는 농도에서는 복제할 수 없음을 실증한다. 본원에 예시된 조작된 아데노신 영양요구성 균주는 야생형으로의 복귀를 방지하기 위해 purI 개방 리딩 프레임의 전부 또는 일부가 염색체로부터 결실된 균주를 포함한다. 이러한 유전자 결실은 하기 기재된 바와 같이 람다 레드 시스템을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
살모넬라 균주 YS1646은 ATP에 대해 영양요구성이다
퓨린과 아데노신 영양요구성 외에 purI-결실된 균주도 ATP를 소거할 수 있는지 여부가 결정되었다. ATP는 죽어가는 종양 세포의 누출로 인해 종양 미세환경에서 높은 수준으로 축적된다. ATP가 제공될 때 균주 YS1646은 최소 배지에서 복제할 수 있지만 ATP가 보충되지 않으면 성장할 수 없다는 것이 여기서 제시된다. 이를 입증하기 위해 균주 YS1646을 LB 배지에서 밤새 성장시키고 M9 최소 배지로 세척하고 ATP를 함유하지 않거나 ATP 농도를 증가시키는 M9 최소 배지로 희석시켰다(Fisher). 37℃에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 OD600을 15분마다 판독하여 성장을 측정하였다. 결과는 ATP가 0.012 mM의 농도로 제공될 때 균주 YS1646이 복제할 수 있지만 M9 단독에서는 복제할 수 없음을 입증하였다.
실시예 2
세포내 복제에서의 결함은 msbB 돌연변이에 기인한다
YS1646 균주는 고농도의 퓨린, 아데노신 또는 ATP를 포함하는 부위로 복제를 제한하는 purI의 돌연변이와 TLR4-매개 전염증 신호전달을 줄이기 위해 지질다당류(LPS) 표면 코트를 변경하는 msbB의 돌연변이를 포함한다. 또한 야생형 살모넬라와 달리 YS1646 균주는 대식세포에서 복제할 수 없다는 것이 확인되었다. 이러한 유전적 돌연변이 중 어느 것이 야생형 균주 ATCC 14028 내에서 그 표현형을 부여하는 데 책임이 있는지 결정하기 위해 실험이 수행되었다.
이 분석에서, 마우스 RAW 대식세포(InvivoGen, San Diego, CA)는 purI, msbB 또는 둘 다에 결실을 포함하는 야생형 살모넬라 균주로 감염되었으며, 세포당 약 5개 박테리아의 감염 다중도(MOI)에서 30분 후, PBS로 세포를 세척하고, 겐타마이신이 함유된 배지를 첨가하여 세포외 박테리아를 사멸시켰다. 세포내 박테리아는 세포막을 통과할 수 없기 때문에 겐타마이신에 의해 죽지 않는다. 감염 후 다양한 시점에서 세포 단층을 물로 삼투압 충격에 의해 용해시키고, 세포 용해물을 희석시키고 LB 한천에 평판배양하여 생존 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하였다.
아래 표에 나타난 바와 같이, purI-돌연변이만을 포함하는 야생형 살모넬라 균주는 여전히 복제할 수 있었다. 이는 종양 미세환경에 대한 높은 수준의 특이성을 달성하면서 purI 결실 단독으로 관찰된 내약성의 개선이 미미한 이유를 설명한다. msbB - 돌연변이만 포함하는 균주와 purI - 및 msbB - 돌연변이를 포함하는 균주는 복제할 수 없었고 48시간 이내에 세포에서 빠르게 제거되었다.
Figure pct00030
실시예 3
살모넬라 asd 유전자 넉아웃 균주 조작 및 특징화
균주 YS1646△asd를 준비하였다. 이는 asd 유전자가 결실되도록 조작된 YS1646 균주(ATCC에서 구입할 수 있음, 카탈로그 번호 202165)에서 유래된 약독화된 살모넬라 티피무리움 균주이다. 이 예에서 살모넬라 티피무리움 균주 YS1646△asd는 아래에 설명된 대로 Datsenko와 Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)) 방법의 변형을 사용하여 조작되었다.
람다 레드 헬퍼 플라스미드를 균주 YS1646에 도입
YS1646 균주는 LB에서 배양물을 성장시키고 100배로 농축한 다음, 얼음처럼 차가운 10% 글리세롤로 3회 세척함으로써 이전에 기재된 바와 같이(Sambrook J. (1998) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory) 전기적격(electrocompetent)이 되도록 준비하였다. 전기적격 균주를 2.5 kV, 186 ohm 및 50 μF 설정에서 0.2 cm 갭 큐벳을 사용하여 람다 레드 헬퍼 플라스미드 pKD46(SEQ ID NO: 218)으로 전기천공하였다. pKD46을 운반하는 형질전환체를 30℃에서 앰피실린 및 1 mM L-아라비노스를 함유한 5 mL SOC 배지에서 성장시키고, 앰피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트에서 선택하였다. 그 후에, 람다 레드 헬퍼 플라스미드 pKD46을 함유하는 YS1646 클론을 균주 YS1646에 대해 상기 기재된 바와 같이 전기적격으로 만들었다.
asd 유전자 넉아웃 카세트의 작제
균주 YS1646의 게놈으로부터의 asd 유전자(Broadway 등 (2014) J. Biotechnology 192:177-178)는 asd 유전자 넉아웃 카세트를 설계하는데 사용되었다. asd 유전자의 좌측 및 우측 영역에 각각 상동성의 204 및 203 염기쌍(bp)을 포함하는 플라스미드를 DH5-알파 적격 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질전환시켰다. loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 이 플라스미드에 클로닝하였다. 그 다음 asd 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 asd-1 및 asd-2를 사용하여 PCR 증폭하고(표 1 참조), 겔 정제하였다.
asd 유전자 제거
플라스미드 pKD46을 보유하는 YS1646 균주를 겔-정제된 선형 asd 유전자 넉아웃 카세트로 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 SOC 배지에서 회수하고 카나마이신(20 μg/mL) 및 디아미노피멜산(DAP, 50 μg/mL)이 보충된 LB 한천 플레이트에 평판배양하였다. 이 단계 동안, 람다 레드 재조합효소는 kan 카세트와 염색체 asd 유전자의 상동 재조합을 유도하고(염색체 asd 유전자의 업스트림 및 다운스트림에 상동 플랭킹 서열의 존재로 인해), asd 유전자의 염색체 사본의 넉아웃이 발생한다. 선택된 카나마이신 내성 클론에서 방해된 asd 유전자의 존재는 방해 부위(프라이머 asd-3)를 플랭킹하는 YS1646 게놈의 프라이머와 다중 클로닝 부위(프라이머 scFv-3)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 확인되었다(표 1 참조). 콜로니는 또한 DAP 영양요구성을 입증하기 위해 보충 DAP가 있거나 없는 LB 플레이트에 복제 평판배양되었다. asd 유전자가 결실된 모든 클론은 보충 DAP가 없는 상태에서 성장할 수 없었고, 이는 DAP 영양요구성을 실증한다.
Figure pct00031
카나마이신 유전자 카세트 제거
kan 선택 마커는 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 시스템을 사용하여 제거되었다. YS1646△asd 유전자 KanR 돌연변이체를 Cre 재조합효소를 발현하는 온도 민감성 플라스미드인 pJW168(SEQ ID NO: 224)로 형질전환시켰다. AmpR 콜로니는 30℃에서 선택되었고; pJW168은 이후 42℃에서 성장에 의해 제거되었다. 선택된 클론은 카나마이신이 있거나 없는 LB 한천 플레이트에 복제 평판배양하여 kan 손실에 대해 시험하고 방해 부위를 플랭킹하는 YS1646 게놈의 프라이머를 사용하여 PCR 검증으로 확인하였다(프라이머 asd-3 및 asd-4; 프라이머 서열의 경우, 표 1 참조).
기능적 asd 결실 돌연변이체 균주 YS1646Δasd의 확인(AST-101로도 표기됨)
Δasd 돌연변이는 37℃에서 LB 한천 플레이트에서 성장할 수 없었지만 50 μg/mL 디아미노피멜산(DAP)을 포함하는 LB 플레이트에서는 성장할 수 있었다. Δasd 돌연변이 성장 속도는 LB 액체 배지에서 평가되었으며; 이는 액체 LB에서 성장할 수 없었지만 600 nM에서 흡광도를 측정하여 결정된 바와 같이 50 μg/mL DAP가 보충된 LB에서 성장할 수 있었다.
asd 유전자 결실 후 균주 YS1646Δasd에서 asd 좌위 서열의 서열 확인
asd 유전자 결실 균주는 프라이머 asd-3 및 asd-4를 사용하여 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다(표 1 참조). asd 좌위를 플랭킹하는 영역의 시퀀싱을 수행하였고, 그 서열은 asd 유전자가 YS1646 염색체에서 결실된 것을 확인하였다.
플라스미드로부터 asd 발현에 의한 asd 결실의 보완
플라스미드 pATIU6(SEQ ID NO: 225)을 화학적으로 합성하고 조립하였다. 플라스미드는 하기와 같은 특징을 포함하였다: 고 복제수(pUC19) 복제 원점, 짧은 헤어핀의 발현을 유도하기 위한 U6 프로모터, 후속 제거를 위한 HindIII 제한 부위에 의해 플랭킹된 앰피실린 내성 유전자, 개시 코돈의 업스트림에서 85개의 염기쌍의 서열을 포함하는 asd 유전자(SEQ ID NO: 246). 이 벡터에 뮤린 TREX1을 표적화하는 shRNA는 SpeI 및 XhoI를 사용한 제한 소화 및 이. 콜라이 DH5-알파 세포로의 리게이션 및 클로닝에 의해 도입되었다. 생성된 플라스미드를 pATI-shTREX1로 지정하였다.
면역자극성 박테리아 균주로 플라스미드의 전기천공
면역자극성 단백질 및 기능성 asd 유전자를 인코딩하는 발현 카세트를 함유하는 선택된 플라스미드를 0.2 cm 갭 큐벳(BTX, San Diego, CA)을 사용하고 하기 설정에서 BTX® ECM600 전기천공기로 asd 유전자가 결여된 에스. 티피무리움 균주에 전기천공하였다: 2.5 kV, 186 ohm 및 50 μF. 전기천공된 세포를 50 μM 디아미노피멜산(DAP)이 보충된 1 mL SOC에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 DAP가 포함되지 않은 한천 플레이트에 펼쳐 기능적 asd 유전자가 있는 플라스미드를 받은 균주를 선택하였다. 단일 콜로니 분리 후, 멸균 리소제니 브로스(LB) 플라스크에 에스. 티피무리움의 단일 웰 분리 콜로니를 접종하고 250 RPM에서 교반하면서 37℃에서 배양하여 세포 은행을 생성하였다. 배양물을 정지기으로 성장시킨 후, 박테리아를 10% 글리세롤을 함유하는 PBS로 세척하고, -60℃ 미만에서 동결된 분취액에 저장하였다.
플라스미드 pATI-shTREX1을 이. 콜라이에서 증폭하고 LB Amp 플레이트에서 전기천공 및 클론 선택에 의해 YS1646△asd 균주로의 형질전환을 위해 정제하여 균주 YS1646△asd-shTREX1을 생성하였다. pATIU6 유래 플라스미드로 보완된 YS1646△asd 돌연변이체는 DAP가 없는 LB 한천 및 액체 배지에서 성장할 수 있었다.
후속 반복에서 pATI-shTREX1의 앰피실린 내성 유전자(AmpR)는 카나마이신 내성 유전자로 대체되었다. 이는 HindIII로 pATI-shTREX1 플라스미드를 분해한 다음 AmpR 유전자를 제거하기 위한 겔 정제에 의해 달성되었다. 카나마이신 내성(KanR) 유전자를 프라이머 APR-001 및 APR-002(각각 SEQ ID NO: 226 및 SEQ ID NO: 227)를 사용한 PCR에 의해 증폭한 후, HindIII로 분해하고, 정제된 겔로의 리게이션하고, pATIU6 플라스미드로 분해하였다.
후속 반복에서 Q5® 부위-특정 돌연변이형성 키트(New England Biolabs) 및 프라이머 APR-003(SEQ ID NO: 228) 및 APR-004(SEQ ID NO: 229)를 사용하여 pUC19 복제 원점에서 pATIKan 플라스미드에 단일 점 돌연변이를 도입하여, 위치 148의 뉴클레오타이드 T를 C로 변화시켰다. 이러한 돌연변이는 pBR322 복제 원점과 상동성인 복제 원점을 만들고, 이는 저 복제수 복제 원점이며, 이로써, 플라스미드 복제수를 감소시킨다.
asd 보체 시스템을 사용하여 생체 내에서 입증된 플라스미드 유지 관리
이 실시예에서, CT26 종양 보유 마우스는 TREX1을 표적화하는 shRNA(YS1646-shTREX1)를 발현하는 플라스미드를 포함하는 균주 YS1646, 또는 기능성 asd 유전자 및 TREX1을 표적화하는 shRNA(YS1646△asd-shTREX1)를 갖는 플라스미드를 함유하는 YS1646의 asd-결실 균주로 치료하였다.
CT26(대장 종양 #26)은 BALB/c 마우스를 N-니트로-N-메틸우레탄(NMU)에 노출시켜 발생하는 종양 모델로, 공격적이고 미분화된 체크포인트 불응성 인간 결장직장 암종을 재현하는 고도의 전이성 암종을 유발한다(예를 들어, Castle 등 (2014) BMC Genomics 15(1):190 참조). 결장에 동소적으로 이식하는 것과 대조적으로 옆구리에 피하 이식할 때 종양 면역표현형은 훨씬 더 면역억제적이고 체크포인트 불응성이다. T-세포 침윤이 크게 부족하지만 종양은 대식세포 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)와 같은 골수성 세포가 풍부하다(예를 들어, Zhao 등 (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787 참조). 이 모델은 인간 미세위성 안정(MSS) 결장직장암과 더 유사하기 때문에 본원에 제공된 치료 접근법을 평가하는 이상적인 모델이다.
이 실험을 위해 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스(군당 3마리)에 CT26(ATCC에서 구입) 종양 세포(100 μL PBS에 2x105 세포)를 우측 옆구리에 피하(SC) 접종하였다. 8일된 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 8, 15 및 23일에 YS1646△asd-shTREX1 균주 또는 모(부모) YS1646-shTREX1 균주의 5 x 106 CFU를 3회 정맥내(IV) 주사하였다. 플라스미드는 예시적인 치료제로서 shTREX1을 인코딩하고; 임의의 다른 원하는 치료 생성물 또는 생성물들로 치환될 수 있다.
체중 및 종양을 매주 2회 측정하였다. 전자 캘리퍼스(Fowler, Newton, MA)를 사용하여 종양 측정을 수행하였다. 종양 부피는 변형된 타원체 공식, 1/2(길이 × 너비2)을 사용하여 계산되었다. IACUC 규정에 따라 종양 크기가 체중의 >20%에 도달하거나 괴사가 되면 마우스를 안락사시켰다.
최종 살모넬라 주사 후 12일에 종양을 균질화하고 균질액을 연속 희석하여 LB 한천 플레이트에 평판배양하여, 존재하는 콜로니 형성 단위(CFU)의 총 수를 열거하거나 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에서 카나마이신 내성 콜로니의 수를 열거하였다.
결과는 에스. 티피무리움 균주 YS1646-shTREX1이 shRNA 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력을 갖지 않았으며 카나마이신 내성(KanR) 콜로니의 백분율이 10% 미만이었기 때문에 상당한 플라스미드 손실을 입증했음을 입증하였다. 플라스미드 유지를 위해 asd 유전자 보체 시스템을 사용한 균주인 YS1646△asd-shTREX1은 거의 동일한 수의 카나마이신 내성 및 카나마이신 민감성 CFU를 가졌다. 이러한 데이터는 asd 유전자 보체 시스템이 마우스의 종양 미세환경과 관련하여 플라스미드를 유지하기에 충분하다는 것을 보여준다.
asd 보체 시스템을 사용한 증강된 항종양 효능
asd 보체 시스템은 플라스미드 손실을 방지하고 생체내 에스. 티피무리움 균주에 의한 치료 생성물 전달의 항종양 효능을 강화하도록 설계된다. 이를 시험하기 위해 shTREX1 플라스미드(YS1646△asd-shTREX1)를 포함하는 YS1646△asd 균주 또는 기능성 asd 유전자 카세트를 포함하는 스크램블 대조군(YS1646△asd-shSCR)을 뮤린 결장 암종 모델에서 asd 유전자 카세트가 결여되어 플라스미드 유지 기전이 없는 플라스미드인 플라스미드 pEQU6-shTREX1(YS1646-shTREX1)을 포함하는 균주 YS1646과 항종양 효능에 대해 비교하였다. shTREX1은 예시적인 치료제이다.
이 실험을 위해, 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스(군당 8마리 마우스)에 CT26 세포(100 μL PBS에서 2x105 세포)로 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 8일째와 18일째에 5x106 CFU의 YS1646△asd-shTREX1 또는 YS1646-shTREX1을 두 번 IV 주사하고, PBS 대조군과 비교하였다.
YS1646-shTREX1 균주는 시간 경과에 따른 플라스미드 손실이 입증되었음에도 불구하고 PBS(70% 종양 성장 저해(TGI), 28일째)와 비교하여 향상된 종양 제어를 입증하였다. asd 유전자 보체 시스템과 shTREX1(YS1646△asd-shTREX1)이 있는 플라스미드를 포함하는 Δasd 균주는 PBS(82% TGI, p = 0.002, 25일째)와 비교하여 우수한 종양 성장 저해를 보여주었다. 이러한 데이터는 asd 유전자 보체 시스템이 없는 플라스미드를 포함하는 YS1646과 비교하여 asd 보체 시스템을 사용하여 플라스미드 손실을 방지하고 shTREX1을 전달함으로써 개선된 효능이 달성된다는 것을 보여준다. 따라서, asd 보체 시스템을 가진 균주는 우수한 항암 치료제이다.
실시예 4
fliC 및 fljB 유전자의 결실에 의한 에스. 티피무리움 플라젤린 넉아웃
균주 조작 및 특징화
본원의 실시예에서, asd 유전자 결실을 함유하는 약독화된 생 에스. 티피무리움 YS1646 균주는 두 플라젤린 하위단위를 제거하기 위해 fliC 및 fljB 유전자를 결실시키도록 추가로 조작되었다. 이는 전염증 신호를 줄이고 항종양 적응 면역력을 개선하기 위해 전염증 TLR5 활성화를 제거한다.
fliC 유전자의 결실
이 예에서, fliC는 이전 예에서 자세히 설명된 바와 같이 Datsenko 및 Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)) 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd 균주의 염색체에서 결실되었다. 간단히 말해서, fliC 유전자를 플랭킹하는 상동 서열의 224개 및 245개 염기를 함유하는 합성 fliC 유전자 상동성 아암 서열을 pSL0147(SEQ ID NO: 230)이라고 하는 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후에, cre/loxP 부위가 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 플라스미드 pSL0147에 클로닝하고, fliC 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 flic-1(SEQ ID NO: 232) 및 flic-2(SEQ ID NO: 233)로 PCR 증폭한 다음, 겔 정제한 다음, 전기천공법에 의해 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 YS1646Δasd 균주에 도입하였다. 전기천공된 세포를 SOC + DAP 배지에서 회수하고, 카나마이신(20 μg/mL) 및 디아미노피멜산(DAP, 50 μg/mL)이 보충된 LB 한천 플레이트에 평판배양하였다. 콜로니를 선택하고 프라이머 flic-3(SEQ ID NO: 234) 및 flic-4(SEQ ID NO: 235)를 사용한 PCR에 의해 넉아웃 단편의 삽입에 대해 스크리닝하였다. 그 후에, pKD46은 선택된 카나마이신 내성 균주를 42℃에서 배양하고 앰피실린 내성 손실을 스크리닝하여 경화되었다. 그 후에, 카나마이신 내성 마커는 Cre 재조합효소(pJW168)를 발현하는 온도 민감성 플라스미드의 전기천공에 의해 경화되었고, AmpR 콜로니는 30℃에서 선택되었으며; pJW168은 이후에 42℃에서 배양물을 성장시킴으로써 제거되었다. 선택된 fliC 넉아웃 클론은 방해 부위(flic-3 및 flic-4)를 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 카나마이신 마커의 손실에 대해 시험하고 아가로스 겔에서 전기영동 이동성을 평가하였다.
fljB 유전자의 결실
fljB 유전자는 상기 기재된 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔfliC 균주에서 결실되었다. fljB 유전자를 플랭킹하는 각각 249개 및 213개 염기의 좌측 및 우측 서열을 함유하는 합성 fljB 유전자 상동성 아암 서열을 합성하고 pSL0148(SEQ ID NO: 231)이라고 하는 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후에, cre/loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 pSL0148에 클로닝하고 fljB 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 fljb-1(SEQ ID NO: 236) 및 fljb-2(SEQ ID NO: 237)로 PCR 증폭하였다(표 1 참조). 겔 정제되고 전기천공에 의해 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 보유하는 균주 YS1646Δasd/ΔfliC에 도입되었다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 상기 기재된 대로 Cre-매개 재조합에 의해 경화되었고 온도 민감성 플라스미드는 비허용 온도에서 성장에 의해 경화되었다. fliC 및 fljB 유전자 넉아웃 서열은 각각 프라이머 flic-3 및 flic-4, 또는 fljb-3(SEQ ID NO: 238) 및 fljb-4(SEQ ID NO: 239)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고; DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 균주 YS1646의 이러한 돌연변이 유도체는 YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB, 또는 줄여서 YS1646Δasd/ΔFLG로 지정되었다.
조작된 에스. 티피무리움 플라젤린 넉아웃 균주의 시험관내 특성화
fliC 및 fljB 모두의 결실을 보유하는 YS1646 유래 asd - 돌연변이체 균주(본원에서 YS1646Δasd/ΔFLG로 지칭됨)는 수영 플레이트(0.3% 한천 및 50 mg/mL DAP를 함유하는 LB)에 10 마이크로리터의 밤새 배양물을 스포팅함으로써 수영 운동성에 대해 평가되었다. 운동성은 YS1646Δasd 균주에서 관찰되었지만 YS1646Δasd/ΔFLG 균주에서는 운동성이 분명하지 않았다. 그 후에, YS1646Δasd/ΔFLG 균주를 asd 유전자를 함유하는 플라스미드로 전기천공하고, DAP 부재하에서의 성장률을 평가하였다. asd 보완 플라스미드가 있는 YS1646Δasd/ΔFLG 균주는 보충 DAP 없이 LB에서 복제할 수 있었고 asd 보완 플라스미드를 포함하는 YS1646Δasd 균주에 필적하는 속도로 성장하였다. 이 데이터는 플라젤린의 제거가 시험관 내 에스. 티피무리움의 적합성을 감소시키지 않는다는 것을 보여준다.
편모를 제거하면 쥐 대식세포에서 파이로토시스가 감소한다
5x105 마우스 RAW 대식세포(InvivoGen, San Diego, CA)를 겐타마이신 보호 분석에서 약 100의 MOI에서 YS1646Δasd/ΔFLG 균주 또는 모 YS1646Δasd 균주로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 배양 상층액을 수집하고 Pierce™ LDH 세포독성 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 대식세포 세포 사멸의 마커로서 젖산 탈수소효소 방출에 대해 평가하였다. YS1646Δasd 균주는 최대 75%의 LDH 방출을 유도한 반면, YS1646Δasd/ΔFLG 균주는 최대 54%의 LDH 방출을 유도하여 플라젤린 유전자의 결실이 감염된 대식세포의 에스. 티피무리움에 의해 유발된 파이롭토시스를 감소시킨다는 것을 입증하였다.
편모-결실된 돌연변이체는 감염된 인간 단핵구에서 파이롭토시스 감소로 이어진다
YS1646Δasd/ΔFLG 균주가 대식세포에서 세포사를 일으키는 능력이 감소되었음을 입증하기 위해 THP-1 인간 대식세포(ATCC 카탈로그 번호 202165)를 에스. 티피무리움 균주 YS1646 및 YS1646Δasd/ΔFLG로 감염시켰으며, Δasd 균주는 플라스미드 유지를 보장하기 위해 기능성 asd 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 5x104 세포를 DMEM 및 10% FBS가 있는 96웰 접시에 넣었다. 세척된 에스. 티피무리움의 대수기로 세포당 100 CFU의 MOI로 세포를 1시간 동안 감염시킨 후, PBS로 세포를 세척하고, 배지를, 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 μg/mL 겐타마이신 및 단핵구를 대식세포 표현형으로 전환시키기 위한 50 ng/mL의 IFNγ가 포함된 배지로 대체하였다. 24시간 후, THP-1 세포를 CellTiter-Glo® 시약(Promega)으로 염색하고, SpectraMax® M3 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 발광 세포 생존력 분석을 사용하여 생존 세포의 백분율을 결정하여 발광성을 정량화하였다. YS1646 균주에 감염된 세포는 생존율이 38%에 불과한 반면, YS1646Δasd/ΔFLG 균주에 감염된 세포는 51%의 생존율을 나타내, 플라젤린 유전자의 결실이 매우 높고 초생리학적 MOI임에도 불구하고 인간 대식세포의 세포 사멸을 덜 유도함을 나타낸다.
전신 투여 후 종양 콜로니화에는 편모가 필요하지 않다
결장 암종의 뮤린 모델에서 투여된 플라젤린 넉아웃 균주의 영향을 평가하기 위해 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스(군당 5마리)에 CT26 세포(100 μL PBS 중 2x105 세포)로 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 10일 동안 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 단일 용량의 3 x 105 CFU의 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주 또는 모 YS1646Δasd-shTREX1 균주를 IV 주사하였다. 종양 이식 후 35일째에, 마우스를 안락사시키고, 종양을 균질화하고 LB 플레이트에 평판배양하여 종양 조직 그램당 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 계산하였다. YS1646Δasd-shTREX1 균주는 종양 조직 그램당 평균 5.9 x107 CFU로 종양을 콜로니화한 반면, 편모-결실된 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주는 평균 1.1 x 108 CFU/g 종양 조직의 거의 2배 증가로 종양을 콜로니화하였다. YS1646Δasd-shTREX1 균주의 비장 콜로니화는 비장 조직의 1.5 x 103 CFU/g의 평균으로 계산된 반면 편모가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주의 비장 콜로니화는 평균 1.2 x 103 CFU/g 비장 조직으로 약간 더 낮았다.
이러한 데이터는 편모의 부재가 IV 투여 후 종양 콜로니화에 부정적인 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 편모-온전한 균주와 비교하여 종양 콜로니화를 향상시킨다는 것을 실증한다. 중요하게도, 편모의 결실은 비장 콜로니화를 약간 감소시켜 100,000배의 종양 대 비장 비율을 제공한다. 이러한 데이터는 당업계의 예상과 달리 편모가 종양 콜로니화에 필요하지 않을 뿐만 아니라 그들의 제거가 비장 콜로니화를 감소시키면서 종양 콜로니화를 향상시킨다는 것을 실증한다.
편모-결실된 균주는 마우스에서 향상된 항종양 활성을 보여준다
결장암의 뮤린 모델에서 투여된 플라젤린 넉아웃 균주의 영향을 평가하기 위해 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스(군당 5마리)에 CT26 세포(2x105 세포 100 μL PBS)를 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 단일 용량 3 x105 CFU의 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주 또는 YS1646Δasd-shTREX1 균주를 IV 주사하고 PBS 대조군과 비교하였다. 종양 성장에 대한 캘리퍼스 측정에 의해 마우스를 모니터링하였다.
결과는 편모를 만들 수 없는 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주가 모 YS1646Δasd-shTREX1 균주(27% TGI, 24일)와 비교하여 향상된 종양 조절을 보였고 PBS 대조군(73% TGI, p = 0.04, 24일째)과 비교하여 유의한 종양 대조군이었다. 이러한 데이터는 편모가 종양 콜로니화에 필요하지 않을 뿐만 아니라 그 손실이 항종양 효능을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
편모-결실된 균주는 뮤린 종양 모델에서 향상된 적응 면역력을 실증한다
면역 반응에 대한 플라젤린의 결실의 영향과 shRNA의 종양 골수성 세포 전달에서 STING 체크포인트 유전자 TREX1로의 STING 활성화가 적응형 유형 I IFN 면역 신호를 촉진하는지 여부를 평가하였다. 결장암의 CT26 뮤린 모델이 사용되었으며, 여기서 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스(군당 5마리 마우스)에 CT26 세포(100 μL PBS에서 2x105 세포)로 우측 옆구리에 SC를 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주, 또는 모 YS1646Δasd-shTREX1 또는 스크램블된 플라스미드 대조군 균주 YS1646Δasd-sh의 5 x106 CFU를 종양 이식 후 11일에 IV 주사하고 PBS 대조군과 비교하였다. 소듐 헤파린 코팅된 튜브(Becton Dickinson)에서 투여 후 7일째에 마우스를 채혈하였다. 그 후에, 응고되지 않은 혈액을 동일한 부피의 PBS에 희석시키고 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Lympholyte®-M 세포 분리 시약(Cedarlane)을 사용하여 전혈의 간기 층으로부터 분리하였다. 단리된 PBMC를 실온에서 3분 동안 1300 RPM에서 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 세척하고, 유동 완충액에 재현탁시켰다. V-바닥 96웰 플레이트의 웰당 100만 개의 PBMC를 시딩하였다. 세포를 실온(RT)에서 3분 동안 1300 RPM에서 원심분리하고 형광색소 결합 AH1 펩타이드:MHC 부류 I 사량체(MBL International) 및 세포 표면 유세포분석 항체 CD4 FITC 클론 RM4-5; CD8a BV421 클론 53-6.7; F4/80 APC 클론 BM8; CD11b PE-Cy7 클론 M1/70; CD45 BV570 클론 30-F11; CD3 PE 클론 145-2C11; Ly6C BV785 클론 HK1.4; I-A/I-E APC-Cy7 클론 M5/114.15.2; Ly6G BV605 클론 1A8; 및 CD24 PercP-Cy5.5 클론 M1/69(모두 BioLegend로부터)를 포함하는 100 μL의 유동 완충액에 실온 및 암실에서 45분 동안 재현탁하였다. 45분 후, 세포를 1200 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 두 번 세척하였다. 그 후에, 세포를 PBS + DAPI(4',6-디아미노-2-페닐인돌; 사멸/생존 염색)를 함유하는 PBS에 재현탁하고 NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.) 및 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
다음 세포 유형이 총 살아있는 세포의 백분율로 열거되었다: CD11b+ Gr1+ 호중구(생체외 기능 분석에서 추가 표현형 분석이 필요할지라도 MDSC일 수 있음), CD11b+ F4/80+ 대식세포, CD8+ T-세포, 및 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV) 관련 세포 표면 항원의 외피 유전자의 생성물인 CT26 종양 거부 항원 gp70(AH1)을 인식하는 CD8+ T-세포(예를 들어, Castle 등 (2014) BMC Genomics 15(1) :190).
아래 표에 요약된 결과는 비특이적 스크램블된 shRNA를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 YS1646Δasd-shSCR 균주가 PBS, 편모-무손상 YS1646Δasd-shTREX1 균주(p = 0.02) 및 편모-결실된 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1(p = 0.01)와 비교하여 유의하게 증가된 호중구의 전형적인 항박테리아 면역 프로파일을 이끌어냄을 보여주고(p = 0.02), 이는 순환 호중구 수준이 가장 낮았다. 유사하게는, 박테리아로 유도된 대식세포는 PBS(p = 0.01), YS1646Δasd-shTREX1 균주(p = 0.01) 및 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주(p = 0.01)와 비교하여 YS1646Δasd-shSCR 균주에서 상당히 증가되었다. 따라서 유형 I IFN 유도 페이로드를 운반하는 두 균주는 호중구와 대식세포를 통해 박테리아 감염을 제거하고 적응 T-세포-매개 면역을 유도하지 않는 정상적인 항박테리아 면역 반응을 덮어쓸 수 있었다. 그러나 CD8+ T-세포의 전체 순환 수준은 모든 군에서 유사하였으나 편모가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1 균주는 PBS와 비교하여 AH1-사량체+ CD8+ T-세포의 백분율이 유의하게 증가한 것으로 나타났다(p = 0.04).
이러한 데이터는 바이러스와 같은 유형 I IFN 유도 플라스미드를 종양-체류 골수성 세포에 전달하도록 박테리아를 조작하는 가능성을 보여준다. 이는 더 많은 바이러스와 더 적은 박테리아의 면역 프로파일에 대한 면역 반응의 극적인 재프로그래밍을 초래한다. 편모의 결실은 박테리아가 모집한 호중구 및 대식세포로부터 상당히 증가된 종양 항원 특이적 CD8+ T-세포로의 이동을 더욱 강화하였다. 따라서 박테리아 TLR5-매개 염증을 제거하면 적응 면역력이 향상될 수 있다.
Figure pct00032
편모-결실된 균주는 생체내에서 포식 골수성 면역 세포 구획으로 제한된다
문헌에 따르면, ΔfljB/ΔfliC 균주는 SPI-1 매개된 비-식세포 세포로의 진입과 관련된 많은 다운스트림 유전자의 억제를 보여준다. YS1646Δasd/ΔFLG 균주가 또한 비-식세포 세포 흡수에 대해 결핍되었는지 여부를 결정하기 위해, 박테리아 rpsM 프로모터 하에 mCherry(적색 형광 단백질)를 항시적으로 발현하는 YS1646Δasd/ΔFLG 균주를 MC38 피하 옆구리 종양 보유 마우스에게 IV 투여하였다.
MC38(뮤린 결장 선암종 #38) 모델은 돌연변이유발을 사용하지만 디메틸히드랄라진과 C57BL/6 마우스 균주를 사용하여 CT26 모델과 유사하게 유도되었다(예를 들어, Corbett 등 (1975) Cancer Res. 35(9) 참조 ):2434-2439). CT26과 유사하게는, 피하 이식은 결장에 동소 이식될 때보다 더 많은 T-세포 배제 및 면역억제성 종양 미세환경을 초래한다(예를 들어, Zhao 등 (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787 참조). MC38은 CT26보다 돌연변이 부담이 높고 CD8+ T-세포에서 검출할 수 있는 유사한 바이러스 유래 gp70 항원(p15E)이 있지만 거부 항원으로 간주되지는 않는다. MC38의 변이체가 체크포인트 요법에 부분적으로 반응하는 것으로 밝혀졌지만, 세포주의 대부분의 변이체는 체크포인트 불응성으로 간주되고 T-세포는 여기에 사용된 MC38 세포를 포함하여 제외된다(예를 들어, Mariathasan 등 (2018) Nature 555:544-548 참조).
이 실험을 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)의 우측 옆구리에 MC38 세포(100 μL PBS 중 5x105 세포)를 SC 접종하였다. 큰 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 1x106 CFU의 YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry 균주를 34일째에 IV 주사하였다. 종양을 IV 투여 후 7일째에 절제하고, 2.5 mL 효소 혼합물(1 mg/mL 콜라게나제 IV 및 20 μg/mL DNase I가 포함된 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640)으로 채워진 gentleMACS™ C 튜브(Miltenyi Biotec)로 2-3mm 조각으로 절단하였다. OctoMACS™(Miltenyi Biotec) 특이적 해리 프로그램(마우스 이식 종양)을 사용하여 종양 조각을 해리하고 전체 세포 제제를 37℃에서 45분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 45분 인큐베이션 후, OctoMACS™(마우스 이식 종양) 프로그램을 사용하여 제2 분리 라운드를 수행하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 70 μM 나일론 메쉬를 통해 50 mL 튜브로 여과하였다. 나일론 메쉬를 5 mL의 RPMI-1640 + 10% FBS로 한 번 세척하고, 새로운 70 μM 나일론 메쉬를 사용하여 새 50 mL 튜브에 세포를 제2로 여과하였다. 나일론 메쉬를 5 mL의 RPMI-1640 + 10% FBS로 세척한 후, 여과된 세포를 1000 RPM에서 7분 동안 원심분리하였다. 생성된 해리된 세포를 PBS에 재현탁하고 염색 공정 전에 얼음에 보관하였다.
유세포분석 염색을 위해 100 μL의 단일 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 사멸/생존 염색(Dead/live stain)(Zombie Aqua™, BioLegend) 및 Fc 차단 시약(BD Biosciences)을 포함하는 PBS를 웰당 100 μL씩 첨가하고 세포를 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 형광색소 결합 항체(CD4 FITC 클론 RM4-5; CD8a BV421 클론 53-6.7; F4/80 APC 클론 BM8; CD11b PE-Cy7 클론 M1/70; CD45 BV570 클론 30-F11, CD3 PE 클론 145-2C11, Ly6C BV785 클론 HK1.4, I-A/I-E APC-Cy7 클론 M5/114.15.2, Ly6G BV605 클론 1A8 및 CD24 PercP-Cy5.5 클론 M1/69, 모두 BioLegend)를 함유하는 PBS + 2% FBS에 재현탁시키고, 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고, 유세포분석 고정 완충액(Thermo Fisher Scientific)에 재현탁시켰다. 유세포분석 데이터는 NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
결과는 종양 침윤 단핵구의 7.27%가 종양 미세환경에서 편모가 결실된 mCherry 균주를 흡수했음을 보여주었다. 유사하게는, 종양-연관 대식세포(TAM) 인구의 8.96%와 종양 침윤 수지상 세포(DC)의 3.33%가 편모가 결실된 mCherry 균주를 차지하였다. 대조적으로, 간질 및 종양 세포에 해당하는 CD45-집단 내에서, 0.076%만이 mCherry 발현에 대해 양성을 나타내었다(0.067% 배경 염색과 비교). 이러한 데이터는 편모와 SPI-1에 대한 이의 다운스트림 신호전달 영향이 상피 세포 감염을 가능하게 하는 데 필요하며, 이의 결여가 박테리아의 흡수를 종양 미세환경(즉, 종양-체류 면역/골수성 세포))의 식세포 면역 세포 구획으로만 제한한다는 것을 실증한다.
편모의 제거는 적응 면역력을 억제하는 TLR5 유도 염증성 사이토카인 제거, 대식세포 파이롭토시스 감소, 전신 투여 시 종양-특이적 농축 유지(또는 강화)를 포함하여 면역자극성 에스. 티피무리움 균주에 여러 이점을 부여한다. 종양-체류 식세포에 국한된다.
실시예 5
살모넬라 pagP 유전자 넉아웃 균주 조작 및 특징화
이 예에서 YS1646Δasd/ΔFLG 균주는 pagP를 결실하도록 추가로 변형되었다. pagP 유전자는 에스. 티피무리움의 감염성 생활사 동안 유도되며, 지질 A를 팔미테이트로 변형시키는 효소(지질 A 팔미토일트랜스퍼라제)를 인코딩한다. 야생형 에스. 티피무리움에서 pagP의 발현은 헵타-아실화된 지질 A 분자를 생성한다. 지질 A의 말단 아실 사슬이 추가될 수 없는 msbB-돌연변이에서, pagP의 발현은 헥사-아실화된 지질 A 분자를 생성한다. 헥사-아실화된 지질 A가 있는 LPS는 염증유발성이 높고 TLR4에 대해 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다(야생형에서 발견되는 헵타-아실화된 LPS는 TLR4에 대해 가장 높은 친화도를 가짐). 이 예에서, pagP 및 msbB가 결실된 균주는 펜타-아실화된 지질 A만을 생성할 수 있으며, 이는 박테리아가 면역 조절 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 전달하도록 조작될 때 TLR4에 대한 낮은 친화도, 향상된 내약성 및 증가된 적응 면역력으로 인해 더 낮은 전염증성 사이토카인을 허용한다.
ΔpagP 균주 작제
pagP 유전자는 이전 실시예에 기재된 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔFLG 균주로부터 결실되었다. pagP 유전자를 플랭킹하는 각각 좌측 및 우측 서열의 203개 및 279개 염기를 함유하는 합성 pagP 유전자 상동성 아암 서열을 합성하고 pSL0191(SEQ ID NO: 331)이라고 하는 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후에, cre/loxP 부위가 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 pSL0191로 클로닝하고, pagP 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 pagp-1(SEQ ID NO: 315) 및 pagp-2(SEQ ID NO: 316)로 PCR 증폭하였다(표 1 참조), 겔 정제되고 전기천공법에 의해 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 보유하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG에 도입된다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 상기 기재된 대로 Cre-매개 재조합에 의해 경화되었고 온도 민감성 플라스미드는 비허용 온도에서 성장에 의해 경화되었다. pagP 유전자 넉아웃 서열은 프라이머 pagp-3(SEQ ID NO: 317) 및 pagp-4(SEQ ID NO: 318)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. YS1646의 생성된 돌연변이 유도체는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP로 지정되었다.
pagP 결실 돌연변이체는 펜타-아실화 지질 A와 함께 LPS를 갖고, 감소된 염증성 사이토카인을 유도한다
pagP 유전자는 Datsenko 및 Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)) 및 상기에 기재된 바와 같이 람다 유래 레드 재조합 시스템을 사용하여 YS1646Δasd 균주로부터 결실되어, 균주 YS1646Δasd/ΔpagP를 생성하였다. 그 후에, 이 균주를 기능적 asd 유전자를 함유하는 플라스미드로 전기천공하여 결실된 asd 유전자를 보완하고 생체내 플라스미드 유지를 보장하였다. 그 후에, 지질 A를 이 균주에서 추출하고 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법(MALDI MS)으로 평가하고 야생형 에스. 티피무리움 균주 ATCC 14028, YS1646 균주(이는 결실 msbB 및 purI에 대해 결실됨) 및 YS1646Δasd 균주로부터의 지질 A를 비교하였다. 야생형 살모넬라는 기능성 msbB 유전자의 존재로 인해 각각 헵타-아실화 및 헥사-아실화 종에 해당하는 2034의 질량으로 작은 지질 A 피크와 1796의 질량을 가진 주요 피크를 가졌다. msbB 결실 균주 YS1646 및 YS1646Δasd는 1828 및 1585에서 주요 피크를 가졌으며, 이는 헥사-아실화 및 펜타-아실화 지질 A의 혼합물에 해당한다. msbB 및 pagP 결실 균주 YS1646Δasd/ΔpagP는 단일 피크 펜타-아실화 지질 A에 해당하는 1585의 질량으로. 이러한 데이터는 pagP의 결실이 지질 A의 팔미토일화를 방지하여 이를 단일 펜타-아실화 종으로 제한한다는 것을 실증한다.
ΔpagP 돌연변이체 균주로부터의 펜타-아실화된 지질 A를 갖는 LPS가 TLR4 신호전달을 감소시켰는지 여부를 결정하기 위해, 야생형 균주, YS1646 균주 또는 YS1646Δasd/ΔpagP 균주로부터 정제된 LPS 4 μg을 THP-1 인간 단핵구 세포(ATCC 카탈로그 # TIB-202)에 첨가하고, 상층액을 24시간 후 사이토메트릭 비드 어레이(CBA) 키트(BD Biosciences)를 사용하여 염증성 사이토카인의 존재에 대해 평가하였다. 그 결과 YS1646Δasd/ΔpagP 균주의 LPS는 야생형 LPS와 비교하여 25%의 TNFα 양을 유도하였고, 야생형 LPS보다 7배 적은 IL-6을 유도함을 보여주었다. YS1646Δasd/ΔpagP 균주의 LPS는 균주 YS1646보다 22배 적은 IL-6을 유도하였으며, 이는 ΔpagP 돌연변이의 펜타-아실화된 LPS 종이 인간 세포에서 훨씬 덜 염증을 나타내고 ΔpagP 돌연변이가 인간에서 더 잘 견딜 수 있음을 나타낸다.
pagP 의 결실은 1차 인간 M2 대식세포에서 현저히 적은 IL-6을 유도한다
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주가 또한 1차 인간 M2 대식세포로부터 덜 염증성 및 용량-제한 IL-6을 이끌어낸다는 것을 입증하기 위해 균주를 평가하고 YS1646Δasd/ΔFLG 및 모 YS1646 균주와 비교하였다. 인간 공여자로부터 유래된 M2 대식세포는 T-세포 배제 고형 종양이 매우 풍부한 면역억제 표현형을 대표한다. 건강한 인간 공여자로부터 분리된 냉동 인간 PBMC를 완전 배지(RPMI-1640 + 1X 비필수 아미노산 + 5% 인간 AB 혈청)에서 해동하고 실온에서 800 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. PBMC는 PBS + 2% FBS에 재현탁되었고 단핵구는 CD16 고갈 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 음성으로 분리되었다. 그 후에, 분리된 비접촉 단핵구를 PBS + 2% FBS에서 원심분리하여 세척하고 100 ng/mL 인간 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지에 재현탁시켰다. 그 후에, 분리된 단핵구(웰당 3e5)를 750 μL의 최종 부피로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 접종 2일 후, 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 새로운 완전 배지로 교체하였다. 이틀 후(4일째), 사이토카인 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지 500 μL를 48시간 동안 웰당 첨가하였다. 6일째에, 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 사이토카인이 없는 신선한 완전 배지 단독으로 또는 MOI 20에서 에스. 티피무리움 균주의 대수기 배양물을 함유하는 배지로 교체하였다. 세포를 1시간 동안 감염시키고, 그 후에, PBS로 세척하고 배지를 50 μg/mL 겐타마이신을 포함하는 새로운 배지로 교체하여 세포외 박테리아를 죽였다. 그 후에, 웰을 세척하고 새로운 배지로 교체하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 48시간 후, 상층액을 수합하고 제조업체의 설명서에 따라 인간 IL-6 세포측정 비드 어레이(CBA) 키트(BD Biosciences)를 사용하여 사이토카인에 대해 분석하였다.
결과는 모 균주 YS1646에 감염된 인간 1차 M2 대식세포에서 분비된 IL-6 수준이 평균 14839 ± 926 pg/mL를 산출한 반면 YS1646Δasd/ΔFLG 균주의 IL-6 수준은 2075± 723 pg/mL(p = 0.004)에서 상당히 더 낮음을 입증하였다. 이는 편모의 결실 및 TLR5 신호전달의 제거가 IL-6의 유도에 미치는 영향을 더욱 확증한다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주는 332 ± 100 pg/mL에서 가장 낮은 IL-6 수준을 이끌어내었으며, 이는 TLR4를 자극하는 이 변형된 LPS 코팅의 감소된 능력을 입증하고 결과적으로 염증성 IL-6 생성을 극적으로 감소시켰다.
조합된 편모 및 pagP 결실은 마우스의 내약성을 크게 향상시킨다
상기 기재된 변형된 균주가 모 균주 YS1646보다 더 약독화되었는지 여부를 결정하기 위해 중앙 치사량(LD50) 연구를 수행하였다. 6-8주령 BALB/c 마우스(군당 5마리)에 YS1646 균주 또는 유래 균주 YS1646Δasd/ΔFLG, YS1646Δasd/ΔpagP 및 YS1646Δasd/ΔFL의 3e5 내지 3e7 CFU의 용량 범위를 정맥 주사하였다. YS1646 균주와 달리 유래 균주는 전신 투여 시 상당한 독성을 나타내는 FDA 승인 사이토카인인 뮤린 IL-2를 인코딩하는 플라스미드도 갖고 있다.
YS1646 균주에 대한 LD50은 이전에 발표된 YS1646의 LD50 보고서와 일치하는 4.4 x 106 CFU(2개 연구의 평균)로 밝혀졌으며 야생형 에스. 티피무리움과 비교하여 >1000배 개선되었다(예를 들어, Clairmont 등 (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002). YS1646Δasd/ΔFLG 균주에 대한 LD50은 2.07 x 107 CFU로 결정되었으며, 이는 균주 YS1646과 비교하여 독성이 4.5배 이상 감소되었음을 나타낸다. YS1646Δasd/ΔpagP 균주에 대한 LD50은 1.39 x 106 CFU로 결정되었으며, 이는 균주가 여전히 높은 염증성 편모를 갖고 있다는 점을 감안할 때 예상되는 균주 YS1646과 비교하여 독성이 최소 3.2배 감소하는 것을 보여준다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주에 대한 LD50은 주어진 최고 용량에서 사망한 마우스가 없었기 때문에 확립될 수 없었지만 >6.2 x 107 CFU였다. 따라서 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주는 모 YS1646 균주와 비교하여 독성에서 >14배 감소를 나타낸다. 이러한 데이터는 상기 기재된 유전자 변형이 임상 에스. 티피무리움 균주 YS1646(VNP20009로도 알려짐)의 독성을 감소시키고 따라서 인간의 내약성을 증가시킨다는 것을 실증한다.
VNP20009의 I상 임상 시험에서(예를 들어, Toso 등 (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152 참조), 환자의 종양에서 박테리아의 존재는 다음에서 부분적으로만 관찰되었다. 시험된 2개의 최고 용량, 3 x 108 CFU/m2(33% 존재) 및 1 x 109 CFU/m2(50% 존재)는 VNP20009의 허용 용량이 종양 콜로니화를 달성하기에는 너무 낮음을 나타낸다. 상기 기재된 변형을 통해 균주의 내약성을 개선함으로써 필요한 경우 >14배 더 높은 용량을 투여할 수 있으며, 종양이 콜로니화될 환자의 비율을 개선하고 종양당 치료 콜로니화 수준을 증가시켜 VNP20009에서 관찰된 문제를 해결할 수 있다.
조합된 편모 및 pagP 결실은 마우스에서 항- 에스.티피무리움 항체 생성을 크게 제한한다.
위에서 설명된 3 x 106 CFU 투여 군(N=5, YS1646 투여 군에서 N=4 제외)에서 살아남은 마우스를 IV-투여 후 40일 동안 유지하였으며, 이 시간에 혈청을 채혈하고 평가하였다. 변형된 흐름-기초 항체 역가 시스템에 의해 에스. 티피무리움에 대한 항체 역가에 대해. YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry 균주의 밤새 배양물을 세척하고 유세포분석 고정 완충액으로 고정하였다. 이전에 처리한 마우스와 미접촉 대조군 마우스의 혈청을 96웰 플레이트에 접종하고 PBS에서 연속 희석을 수행하였다. 다음으로, 1 x 106 CFU를 포함하는 YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry 배양물 25 μL를 혈청에 첨가하고 실온(RT)에서 25분 동안 배양하였다. 그 후에, 박테리아를 4000 RPM에서 5분 동안 회전시켜 PBS로 두 번 세척하였다. 마지막 세척 후, 박테리아를 2차 염소 항-마우스 Fc AF488 항체(스톡에서 1/400 희석)를 포함하는 PBS에 재현탁하고 실온에서 25분 동안 인큐베이션하고 빛으로부터 보호하였다. 그 후에, 박테리아를 4000 RPM에서 5분 동안 회전시켜 PBS로 3회 세척하였다. 마지막 세척 후, 박테리아를 PBS에 재현탁하고 NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 데이터를 획득하고 MFI FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
유세포분석으로 결과를 평가하기 위해 모든 군에서 신호가 있는 가장 높은 희석액을 선택하고(1250X 혈청 희석액) 해당하는 평균 형광 강도(MFI) 값을 플로팅하였다. 검출 한계(LOD)는 MFI 1000에서 선택하였는데, 이는 염색 없이 얻은 MFI 뿐만 아니라 염소 항-마우스 Fc AF488 항체만을 사용한 배경 염색으로 얻은 것이다. 따라서 MFI 값이 1000보다 크면 양의 신호로 간주하고, MFI 값이 있음에도 이 값 이하이면 모두 음의 결과로 간주한다.
이 검정의 결과는 YS1646이 혈청 항체(중화되지 않음)를 생성할 수 있다는 이전에 발표된 데이터에 따라 3 x 106 CFU의 YS1646 균주(29196.3 ± 20730의 MOI)로 처리된 마우스의 높은 MFI 역가의 항-에스. 티피무리움 혈청 항체를 보여주었다. YS1646Δasd/ΔFLG 균주(11257 ± 9290의 MOI)로 처리한 마우스에서 더 적은 수의 항체가 검출되었는데, 이는 편모에서 보조제 활성이 부족하기 때문일 수 있다. YS1646Δasd/ΔpagP 균주로 처리된 마우스에서는 변경된 LPS 표면 코팅으로 인한 것일 수 있는 균주 YS1646(p = 0.033)와 비교하여 훨씬 적은 수의 항체가 생성되었다(4494 ± 3861의 MFI). 혈청 항체의 가장 현저한 감소는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 처리군(1930 ± 2445의 MFI)에서 입증되었으며, 여기서 몇몇 마우스는 1000 미만의 MFI 역가를 나타내므로 혈청 항체에 대해 음성으로 간주되었다(p = 0.021, 대 균주 YS1646). 따라서, 편모와 pagP 유전자의 결합된 결실은 개선된 안전성뿐만 아니라 현저하게 감소된 면역원성을 모두 가능하게 하여 인간에서 높은 CFU의 반복 투여를 가능하게 할 것이다.
pagP 및 편모 결실 균주 및 이의 조합은 균주 YS1646와 비교하여 인간 혈청에서 상당히 더 높은 생존력을 보여준다
균주 YS1646은 전신 투여 후 인간에서 제한된 종양 콜로니화를 나타낸다. 균주 YS1646이 인간 혈액의 보체 인자에 의해 비활성화되는 것이 본원에서 제시된다. 이를 입증하기 위해, 균주 YS1646 및 이. 콜라이 D10B를 박테리아의 표면을 변경하는 추가 돌연변이를 함유하는 본원에 제공된 예시적인 면역자극성 박테리아와 비교하였다. 이러한 예시적인 변형된 균주는 YS1646Δasd/ΔpagP, YS1646Δasd/ΔFLG, 및 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP였다. YS1646 및 이. 콜라이 D10B 배양에 첨가하여 이러한 3개의 균주를 풀링된 마우스 혈액 또는 풀링된 건강한 인간 공여자(n=3)로부터의 혈청 또는 열-비활성화(HI) 혈청과 함께 3시간 동안 인큐베이션하였다. 37℃ 혈청과 함께 인큐베이션한 후, 박테리아를 연속적으로 희석시키고 LB 한천 플레이트에 평판배양하고 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하였다.
마우스 혈청에서 모든 균주는 100% 생존 상태로 남아 있었고 보체 비활성화에 대해 완전히 내성이 있었다. 인간 혈청에서 모든 균주는 열 비활성화 혈청에서 100% 생존하였다. 이. 콜라이 D10B 균주는 전체 인간 혈청에서 3시간 후에 완전히 제거되었다. 전체 인간 혈청에서 YS1646 균주는 살아있는 콜로니의 6.37%만 나타내어 YS1646 임상 균주의 종양 콜로니화가 인간 혈액에서 보체 비활성화로 인해 제한되었음을 입증하였다. YS1646Δasd/ΔFLG 균주의 경우 31.47%의 살아있는 콜로니이 남아 있었고, YS1646Δasd/ΔpagP 균주의 경우 3시간 동안 인간 혈청과 인큐베이션한 후 살아있는 콜로니의 72.9%가 남아 있었다. 결합된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주는 인간 혈청의 보체에 대해 완전히 내성이 있었다.
이러한 데이터는 YS1646 균주(VNP20009)가 전신 투여될 때 종양 콜로니화가 매우 낮은 이유를 설명한다. 균주 YS1646은 인간 혈청에서 보체 비활성화에 매우 민감하지만 마우스 혈청에서는 그렇지 않다는 것이 본원에서 제시된다. 이 데이터는 왜 제한된 종양 콜로니화가 인간에서 관찰된 반면 마우스 종양은 높은 수준에서 콜로니화되었는지를 설명한다. fljB/fliC 또는 pagP 결실, 또는 이러한 돌연변이의 조합은 이 표현형을 부분적으로 또는 완전히 구출한다. 따라서, YS1646Δasd/ΔpagP, YS1646Δasd/ΔFLG, 및 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주를 사용하여 인간 혈청에서 관찰된 향상된 안정성은 인간 종양 콜로니화의 증가를 제공한다.
실시예 6
살모넬라 ansB 유전자 넉아웃 균주 조작 및 특징화
이 예에서 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주는 박테리아 L-아스파라기나제 II를 인코딩하는 유전자인 ansB를 결실하도록 추가로 변형되었다. T-세포의 존재 하에 에스. 티피무리움에 의한 L-아스파라기나제 II의 분비는 T-세포 수용체(TCR) 발현을 감소시키고 세포용해성 사이토카인 생산을 손상시킴으로써 T-세포 기능을 직접적으로 손상시키는 것으로 나타났다. 결과적으로 박테리아 유래 아스파라기나제는 수십 년 동안 급성 림프모구성 백혈병(ALL)을 치료하는 데 성공적으로 사용되었다. 박테리아 게놈으로부터 ansB의 결실은 L-아스파라기나제 II를 생성하는 에스. 티피무리움 균주의 능력을 제거하여 박테리아 군집화된 종양 미세환경에서 T-세포의 기능을 향상시킨다.
ΔansB 균주 작제
ansB 유전자는 이전 실시예에 기재된 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주로부터 결실되었다. ansB 유전자를 플랭킹하는 좌측 및 우측 서열의 각각 236개 및 251개 염기를 포함하는 합성 ansB 유전자 상동성 아암 서열을 합성하고 pSL0230(SEQ ID NO: 332)이라고 하는 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후에, cre/loxP 부위가 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 플라스미드 pSL0230에 클로닝하고 ansB 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 ansb-1(SEQ ID NO: 319) 및 ansb-2(SEQ ID NO: 320)로 PCR 증폭시키고, 겔을 정제하고, 전기천공법에 의해 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP에 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 상기 기재된 대로 Cre-매개 재조합에 의해 경화되었고 온도 민감성 플라스미드는 비허용 온도에서 성장에 의해 경화되었다. ansB 유전자 넉아웃 서열은 프라이머 ansb-3(SEQ ID NO: 321) 및 ansb-4(SEQ ID NO: 322)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고(표 1 참조), DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 생성된 YS1646 돌연변이체 유도체를 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB로 명명하였다.
ansB 의 결실은 시험관 내 아스파라기나제 활성을 제거한다
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주가 L-아스파라기나제 II를 덜 생산하는지 여부를 결정하기 위해, ansB-온전한 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주와 함께 이 균주의 배양물을 LB에서 성장시키고 정지기에 도달하도록 하였다. 이때 배양물에서 50 μL의 조절 배지를 제조사의 지침에 따라 비색 아스파라기나제 검정 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 아스파라기나아제 활성을 분석하였다. 40분 인큐베이션 후, 570 nm의 흡광도 파장에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 흡광도 단위를 판독하였다.
1.95의 흡광도를 제공한 재조합 L-아스파라기나제 II 양성 대조군과 비교하여 ansB-무손상 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주의 흡광도는 0.82였다. 그러나 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주에서 ansB의 결실은 0.109의 흡광도에서 검출된 아스파라기나제 활성의 배경 수준을 초래하였다. 이러한 데이터는 ΔansB 돌연변이가 아스파라기나제 활성을 완전히 제거한다는 것을 확인한다.
ansB 의 결실은 시험관 내 공동배양 분석에서 T-세포 기능을 복원한다
T-세포에 대한 감소된 L-아스파라기나제 II 활성의 영향에 대해 ansB가 결실된 균주를 기능적으로 특성화하기 위해, 비장 정제 T-세포와의 배양물에서 균주에 감염된 뮤린 1차 골수 유래 대식세포(BMM)를 사용하여 공동배양 분석을 확립하였다. 이 분석을 위해 건강한 BALB/c 마우스의 비장을 분리하여 분리하였으며 제조업체의 설명서에 따라 마우스 T-세포 분리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 비장 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 분리하였다. 분리된 T-세포에서 2e5 세포를 5 μg/ml의 항-마우스 CD3ε 항체(클론 145-2C11, Thermo Fisher Scientific)로 코팅되었던 편평-바닥 96웰 플레이트에 웰당 첨가하였다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 및 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 배양물로부터의 조건화된 LB 배지를 정지기으로 성장시키고, 0.45 μM 나일론 메쉬를 통해 여과하고 공동자극을 위한 10 μg/ml 작용성 항-CD28 항체의 첨가 여부에 관계없이 T-세포에 첨가하였다. 20 U/mL의 재조합 아스파라기나제를 함유하는 대조군 및 정상 배양 배지를 검정에서 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 24시간에 100 μL의 공동배양 상층액을 웰에서 수합하고 뮤린 Th1-특이적 사이토카인 비드 어레이(CBA, BioLegend)를 수행하였다. 동시에, T-세포를 수합하고 유세포분석에 의한 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 표면 T-세포 수용체 β(TCRβ) 발현과 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 세포내 염색에 대해 분석하였다.
결과는 대식세포를 감염시키는 데 사용된 ansB 온전한 균주(YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP)가 T-세포와 공동배양된 후 깊은 T-세포 면역억제를 유도한다는 것을 확인하였다. 이는 배지 대조군 및 20 U/mL의 농도에서 재조합 아스파라기나제의 양성 대조군과 비교하여 CD4+ 및 CD8+ T-세포(아래 표 참조) 모두에서 TCRβ 표면 발현의 현저한 하향조절에 의해 나타났다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주에서 ansB의 결실은 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주와 비교하여 CD4+(p = 0.004) 및 CD8+ T-세포(p = 0.002) 모두에서 TCRβ 표면 발현을 유의하게 회복시켰다.
Figure pct00033
공동배양 24시간 후 사이토카인의 T-세포 분비를 T-세포 세포용해 기능의 마커로 측정하였다. 아래 표에 나타난 바와 같이, 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 T-세포 생산은 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주로 처리한 후 배지 대조군와 비교하여 현저히 낮았으며, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주에서 ansB 결실(IFNγ(p = 0.05), TNFα(p = 0.012) 및 IL-2(p = 0.006)). 이러한 데이터는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주에서 ansB의 결실이 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주와 비교하여 T-세포 세포용해 기능을 유의하게 회복시킨다는 것을 나타낸다.
Figure pct00034
ansB 의 결실은 생체내에서 종양-체류 T-세포 TCRβ 발현을 복구시킨다
시험관 내 공동배양 분석에서 ansB의 발현은 유세포분석에 의한 T-세포에 대한 TCR의 하향 조절을 포함하여 T-세포 기능에 대한 면역억제 효과를 입증하였다. 이것이 생체 내에서 유사하게 발생할지 여부를 평가하기 위해 결장직장암의 MC38 마우스 모델을 사용하였다.
이 실험을 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 4마리 마우스)의 우측 옆구리에 MC38 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 큰 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry 균주의 1x107 CFU를 17일째에 IV 주사하였다. 종양을 IV 투여 후 7일째에 절제하고 2.5 mL 효소 믹스(1 mg/mL 콜라게나제 IV 및 20 μg/mL DNase I가 포함된 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640)로 채워진 gentleMACS™ C 튜브(Miltenyi Biotec)로 2-3mm 조각으로 절단하였다. OctoMACS™(Miltenyi Biotec) 특이적 해리 프로그램(마우스 이식 종양)을 사용하여 종양 조각을 해리하고 전체 세포 제제를 37℃에서 45분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 45분의 인큐베이션 후, OctoMACS™(마우스 이식 종양) 프로그램을 사용하여 제2 분리 라운드를 수행하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 70 μM 나일론 메쉬를 통해 50 mL 튜브로 여과하였다. 나일론 메쉬를 5 mL의 RPMI-1640 + 10% FBS로 한 번 세척하고, 세포를 새로운 70 μM 나일론 메쉬를 사용하여 새 50 mL 튜브에 제2로 여과하였다. 나일론 메쉬를 5 mL의 RPMI-1640 + 10% FBS로 세척한 후, 여과된 세포를 1000 RPM에서 7분 동안 원심분리하였다. 생성된 해리된 세포를 PBS에 재현탁하고 염색 공정 전에 얼음에 보관하였다.
유세포분석 염색을 위해 100 μL의 단일 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 사멸/생존 염색(Zombie Aqua™, BioLegend) 및 Fc 차단 시약(BD Biosciences)이 포함된 PBS를 웰당 100 μL씩 첨가하고, 세포를 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 형광색소 결합 항체(CD45 BV570 클론 30-F11, TCR PE 클론 H57-597, CD4 FITC 클론 RM4-5, 모두 BioLegend에서 제공) 및 DAPI(BioLegend)를 포함하는 PBS + 2% FBS에 재현탁하였다. 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 배양한다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고, 유세포분석 고정 완충액(Thermo Fisher Scientific)에 재현탁시켰다. 유세포분석 데이터는 ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 표에 나타난 바와 같이, 종양 침윤성 CD4+ T-세포에서 TCRβ의 표면 발현에 대한 평균 평균 형광 강도(MFI)는 종양 내에서 콜로니화된 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP 균주와의 상호작용 후 유의하게 낮았다. ansB가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주(p = 0.042)를 사용하여 PBS 대조군 처리 마우스보다 더 높았다.
Figure pct00035
종합하면, 이러한 데이터는 면역억제성 L-아스파라기나아제 II의 박테리아 생성으로 인한 T-세포 기능 회복을 위해 ansB 유전자 결실의 필요성을 확인하고, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주에서 ansB 결실로 관찰되는 강화된 T-세포 기능을 실증한다.
실시예 7
살모넬라 csgD 유전자 넉아웃 균주 조작 및 특징화
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주는 에스. 티피무리움 컬리 핌브리애 형성, 셀룰로스 생산 및 c-디-GMP 생산을 제어하는 마스터 유전자인 csgD를 결실하도록 추가로 변형되었다. csgD 유전자 결실은 셀룰로스-매개 생물막 형성 가능성을 제거하고 염증 유발 신호를 감소시키며 숙주 식세포에 의한 흡수를 향상시킨다. 세포내 국소화의 이러한 증가는 플라스미드 전달 및 면역조절 단백질 생산의 효율성을 향상시킬 것이다.
ΔcsgD 균주 작제
csgD 유전자는 이전 실시예에 기재된 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주로부터 결실되었다. 좌측 및 우측 염기서열의 207개 및 209개 염기를 각각 포함하는 합성 csgD 유전자 상동성 아암 서열을 csgD 유전자에 인접하여 합성하고 pSL0196(SEQ ID NO: 333)이라고 하는 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후에, cre/loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 플라스미드 pSL0196에 클로닝하고, csgD 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 csgd-1(SEQ ID NO: 323) 및 csgd-2(SEQ ID NO: 324)로 PCR 증폭하였다. 겔 정제하고, 전기천공법에 의해 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 보유하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ansB에 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 상기 기재된 바와 같이 Cre-매개 재조합에 의해 경화되었고, 온도 민감성 플라스미드는 비허용 온도에서 성장에 의해 경화되었다. csgD 유전자 넉아웃 서열은 프라이머 csgd-3(SEQ ID NO: 325) 및 csgd-4(SEQ ID NO: 326)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 모 균주 YS1646의 생성된 돌연변이 유도체를 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD로 명명하였다.
csgD 가 결실된 균주는 콩고 레드 플레이트에서 RDAR 콜로니를 형성할 수 없음
콩고 레드 플레이트에서 성장한 후 RDAR(Rough Dry And Red) 콜로니를 형성하는 능력은 박테리아 생물막 형성에 대한 검증된 분석이다. 거칠고 건조한 질감은 셀룰로스 생산을 통해 발생하며 빨간색은 곱슬 섬유소 표면 구조에 의한 안료 축적으로 인한 것이다. 이 분석을 위해 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주는 콩고 레드 한천 플레이트에서 배양 후 RDAR 표현형을 형성하는 능력에 대해 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주와 비교되었다.
콩고 레드 한천 플레이트는 대두(10 g/L) 및 효모 추출물(5 g/L)(NaCl 없이 변형된 LB)로 준비하고 콩고 레드(40 mg/L)와 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(20 mg/L)로 보충하였다. 5 마이크로리터의 정지기 박테리아 배양물을 콩고 레드 플레이트에 점적하고 37℃에서 16시간 동안 배양한 다음 30℃로 옮기고 추가로 120시간 동안 배양하였다. 콜로니 형태 및 색상의 시각적 분석을 수행하고 매일 기록하여 RDAR 콜로니 형태형의 존재 또는 부재를 확인하였다.
두 균주 간의 콜로니 형태형을 비교하면, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주는 부드러운 표현형을 보였고, 콜로니는 색소가 부족하였다. 이와 비교하여 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주는 여전히 csgD 유전자를 함유하고 있으며 고전적인 거칠고 건조한 외관과 색소 흡수의 명확한 증거를 보여주었다. 따라서, 기능적 분석은 ΔcsgD 균주가 컬리 핌브리애 및 셀룰로스 생산이 부족하기 때문에 생물막을 형성할 수 없음을 확인한다.
csgD 가 결실된 균주는 삼중 음성 유방암의 성불응이 높은 마우스 모델에서 우수한 항종양 효능을 보여준다
면역자극성 박테리아 요법이 종양에 콜로니를 형성하지만 제한된 효능을 보인 모델에서 csgD 결실의 영향이 평가되었다. 이는 종양-체류 골수성 세포로의 흡수를 제한할 수 있는 박테리아 생성 셀룰로스의 존재를 나타낼 수 있으며, 이에 따라 치료 이점을 제한할 수 있다(예를 들어, Crull 등 (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233 참조). 인간 삼중음성 유방암의 대표적인 모델인 치료가 어려운 EMT6 모델이 활용되었다(예를 들어, Yu 등 (2018) PLoS ONE 13(11):e0206223 참조). EMT6 종양 세포가 옆구리에 피하가 아니라 유선 지방 패드에 동소적으로 투여되는 경우, 모델은 T-세포가 배제되고 고도로 전이되며 승인된 모든 체크포인트 항체를 포함한 면역 요법에 대해 매우 성불응이다(예를 들어, Mariathasan 참조). 등 (2018) Nature 554: 544-548).
이 실험을 위해 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스(군당 5마리)에 EMT6 종양 세포(ATCC # CRL-2755)(100 μL PBS 중 2x105개 세포)가 있는 좌측 유선 지방 패드에 접종하였다. 13일 된 확립된 유선 종양(약 55 mm3)을 보유한 마우스에 csgD가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주, 또는 모 YS1646/Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB 균주의 단일 용량 1 x107 CFU를 IV 주사하고, PBS 대조군과 비교하였다. 박테리아 균주는 항시적으로 활성인 뮤린 STING(EF-1α muSTING R283G)을 인코딩하는 플라스미드를 함유하였다.
PBS 치료된 마우스의 종양은 고르게 성장하여 35일째에 최대 종양 부피에 도달하였다(1199.0 ± 298.1 mm3). csgD-무손상 균주로 처리된 마우스, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB는 이 모델에서 항종양 효능의 증거를 입증하지 않았으며 또한 35일째에 최대 종양 부피에 도달하였다(1689.1 ± 537.0). 이러한 종양의 생체외 LB 평판배양은 모든 종양이 콜로니화되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, csgD가 결실된 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD는 5마리 중 3마리의 마우스가 원발성 및 전이성 질환 모두에서 완전히 치유되었다(60일 이상). 전체 종양 성장 저해(TGI)는 45.7%였으며 나머지 두 종양 중 하나는 결국 성장하기 전에 부분적으로 반응하였다. 두 박테리아 균주는 동일한 플라스미드 페이로드를 포함하였으나 단 하나만 상당한 항종양 효능을 나타냈다. 따라서, 가장 다루기 어렵고 고도로 전이된 동계 종양 모델 중 하나인 동소성 EMT6에서 csgD가 결실된 균주는 전신 항종양 효능을 유도할 수 있었고 60% 완전한 반응을 보였다.
csgD-결실된 균주는 생체 내에서 향상된 세포내 흡수를 보여준다
csgD가 제거된 균주가 종양-체류 골수성 세포로의 더 큰 박테리아 흡수로 인해 개선된 효능을 입증했는지 여부를 결정하기 위해 생체외 겐타마이신 보호 분석을 수행하였다(예를 들어 Crull 등 (2011) Cellular Microbiology 13(8): 1223-1233 참조). 이 실험을 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 4마리 마우스)의 우측 옆구리에 MC38 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 큰 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 17일째에 csgD가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주(N=12) 또는 모 YS1646 균주(N=4)의 1x107 CFU를 IV 주사하였다. 종양을 IV 투여 후 7일에 절제하고, 칭량하고, 1 mg/mL 콜라게나제 IV 및 20 mg/mL DNase I이 보충된 RPMI에서 잘게 썰고, 37℃에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 30분 후, 현탁액을 70 mm 필터에 통과시키고 회수된 부피를 2개의 별개의 동일한 시료로 나누었다. 겐타마이신(Thermo Fisher Scientific)을 200 mg/mL의 농도로 쌍을 이룬 각각의 시료 중 하나에 첨가하여 세포외 박테리아를 죽이고 시료을 37℃에서 90분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포 현탁액 시료을 세척하고 0.05% Triton X로 용해하고 LB 한천 플레이트에 평판배양하여 CFU를 계산하였다.
결과는 겐타마이신 처리 없이 YS1646 처리된 종양의 CFU(11925 ± 19859 CFU)와 비교하여 겐타마이신 처리가 종양에서 매우 적은 수의 CFU(51 ± 45 CFU)가 검출되었음을 보여준다. 이는 박테리아가 이러한 종양에서 대부분 세포외에 존재하고 따라서 겐타마이신 제거에 민감함을 나타낸다. csgD가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 치료군에서 겐타마이신 처리되지 않은 종양은 잘 콜로니화된 종양에서 예상한 대로 높은 CFU를 산출하였으며 겐타마이신 치료는 더 적은 CFU(1276 ± 2410 CFU)를 산출하였다. 모 YS1646 계통 처리된 종양보다 훨씬 더 많다. 이는 csgD가 제거된 박테리아가 세포 내에 더 많이 존재하여 겐타마이신으로부터 보호되기 때문이다. 이러한 데이터는 csgD 결실이 박테리아의 세포내 흡수를 개선하여 생체내 면역조절 단백질의 플라스미드 전달을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 8
pATI-1.75 및 pATI-1.76 벡터 작제
플라스미드는 pBR322 복제 원점, asd 유전자, 경화를 위한 HindIII 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 내성 유전자, 발현 카세트 삽입을 위한 다중 복제 부위를 포함하는 설계 및 합성되었다. 발현 카세트는 다양한 구성으로 조립된 진핵생물 프로모터, 개방 리딩 프레임(ORF), 전사후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 여러 요소로 구성된다.
예시적인 프로모터는 CMV 즉시 초기 인핸서 서열의 직접 다운스트림에 인코딩된 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 코어 프로모터, 및 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α)에 대한 코어 프로모터를 포함한다. 개방 리딩 프레임(ORF)은 각각이 단백질로 번역되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있고, 2A 서열의 삽입에 의해 별개의 폴리펩타이드로 분리될 수 있으며, 이에 의해 진핵생물 리보솜은 2A 서열 내부의 Gly 및 Pro 잔기 사이에 펩타이드 결합을 삽입하지 못한다. 2A 서열의 예는 테사 아시그나 바이러스(TaV) 캡시드 단백질의 T2A 펩타이드(예를 들어 SEQ ID NO: 327 참조) 및 돼지 테스코바이러스(PTV)의 P2A 펩타이드(예를 들어 SEQ ID NO: 328 참조)이다. 업스트림 푸린 절두 부위(RRKR) 및 다른 인핸서 요소는 발현된 단백질을 분리하기 위해 절두를 용이하게 하기 위해 업스트림에 배치된다.
전사후 조절 요소(PRE)의 예는 우드척 간염 바이러스 PRE(WPRE; SEQ ID NO: 346) 및 B형 간염 바이러스 PRE(HPRE; SEQ ID NO: 347)를 포함하며, 이는 다음의 세포질로 mRNA 핵 외수송을 촉진하여 3' 말단 처리 및 안정성을 향상시키는 유전자의 세포질 mRNA의 축적을 증가시킨다. 폴리아데닐화 신호 서열의 예는 SV40 폴리아데닐화(SV40polyA, 또는 SV40pA) 신호 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpolyA, 또는 bGHpA) 신호를 포함하며, 둘 다 전사 종결을 촉진하는 역할을 하는 3' 조절 요소이며 RNA 절두 복합체에 의해 인식되는 서열 모티프를 포함한다.
도 1a 내지 도 1c는 pATI-1.75 및 pATI-1.76(각각 도 1a 및 도 1b) 플라스미드 삽입물을 도시한다; 도 1c는 샤인-달가노 서열이 진핵 세포, 예컨대 골수성 세포에서 번역을 위해 코작 서열로 대체됨을 보여준다. 이러한 서열을 갖는 플라스미드 및 작제는 박테리아가, 박테리아 숙주에 의해 번역될 수 없으나 진핵생물에서 생체내에서 번역될 수 있는 RNA를 전달하도록 설계된 구현예에서 사용될 수 있다.
실시예 9
설계된 이종성 단백질 발현 플라스미드는 인간 세포로부터 기능적 단백질 생성을 유도한다
인간 세포에서 확립된 사이토카인의 최적의 발현
면역자극성 사이토카인이 인간 세포에서 설계된 플라스미드로부터 발현될 수 있다는 것을 예시하기 위해, 사이토카인 패널을 EF-1α 프로모터의 제어 하에 pATI-1.75 플라스미드에 클로닝하였다. 사이토카인은 뮤린 IL-2(muIL-2), muIL-12p70, muIL-23 및 인간 IL-2(huIL-2)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. IL-15 단일 사슬(muIL-15Rα-IL-15sc)에 융합된 muIL-15 수용체-α에 대해 EF-1α 및 CMV 프로모터를 시험하였다. HEK293T STING Null Cells(InvivoGen)를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 시딩하여 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날, 200 ng의 각각의 사이토카인 플라스미드 DNA를 무혈청 배지에서 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하고 형질주입되지 않은 웰을 음성 대조군(2벌 중복)으로 사용하였다. 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입 후 24시간에 수집하고 각각의 사이토카인에 대해 특이적인 ELISA에 의해 단백질 발현에 대해 평가하였다.
muIL-2 작제물은 제조업체의 설명서에 따라 뮤린 IL-2 ELISA(R&D Systems)에서 평가되었으며 코돈 최적화(muIL-2 CO)가 있는 추가 버전의 muIL-2도 평가되었다. 순수한 상층액의 농도를 시험한 결과, muIL-2 작제물의 경우 평균 1680 pg/mL의 muIL-2가 생성되었고, muIL-2 CO 작제물의 경우 1812 pg/mL의 muIL-2가 생성되었다. 이 데이터는 구조의 기능을 확인하고 코돈 최적화로 수율을 향상시킬 수 있음을 보여주었다. muIL-12p70 구조는 제조업체의 프로토콜에 따라 뮤린 IL-12 ELISA(R&D Systems)에서 평가되었다. 상층액을 순수하게 첨가하였을 때 분비된 muIL-12p70의 평균 400 pg/mL가 측정되었지만 이는 선형 범위를 벗어났다. 상층액을 5배 희석시켰을 때 분비된 muIL-12p70의 평균 105 pg/mL가 검출되었다. muIL-23 플라스미드의 경우, 키트 지침에 따라 뮤린 IL-23 ELISA(BioLegend)를 사용하여 단백질 검출을 달성하였다. 상층액을 순수하게 첨가하면 평균 966 pg/mL의 muIL-23이 검출되었다. 인간 IL-2 플라스미드의 경우 키트 지침에 따라 인간 IL-2 ELISA(Invitrogen)를 사용하여 단백질을 검출하였다. 순수 첨가된 상층액으로, 평균 1422 pg/mL의 huIL-2가 검출되었다. EF-1α 또는 CMV 프로모터를 사용하여 발현된 muIL-15Rα-IL-15sc 작제물의 경우 키트 지침에 따라 뮤린 IL-15 ELISA(eBioscience, Inc.)가 사용되었다. 순수하게 첨가하였을 때, EF-1α 프로모터가 있는 muIL-15Rα-IL-15sc 플라스미드는 평균 131 pg/mL를 생성한 반면, CMV 프로모터가 있는 muIL-15Rα-IL-15sc 플라스미드는 평균 289 pg/mL를 생성하였다.
이 데이터는 인간 세포에서 마우스와 인간 모두의 면역조절 사이토카인을 인코딩하는 플라스미드 발현 작제물을 검증한다. 또한, 이는 코돈 최적화 및 CMV와 같은 프로모터의 사용이 단백질 발현을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
전사후 조절 요소는 사이토카인 발현을 향상시킨다
ORF의 3' 말단에 추가된 전사후 조절 요소(PREs)가 EF-1α 프로모터의 제어 하에 인간 세포에서 면역자극성 사이토카인의 발현, huIL-2의 발현을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해, pATI-1.75 플라스미드에 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 첨가하거나 첨가하지 않고 시험하였다.
HEK293T STING Null Cells(InvivoGen)를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 시딩하여 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날, 200 ng의 각각의 사이토카인 플라스미드 DNA를 무혈청 배지에서 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하고 형질주입되지 않은 웰을 음성 대조군(2벌 중복)으로 사용하였다. 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입 후 24시간에 수집하고 제조업체의 설명서에 따라 인간 IL-2 ELISA(Invitrogen)로 활성을 평가하였다. 상층액을 순수하게 첨가하거나 5배 희석시켰다.
결과는 상층액이 순수하게 첨가되었을 때, 평균 1540 pg/mL를 분비하는 WPRE가 없는 huIL-2 작제물과 비교하여, WPRE가 있는 huIL-2 작제물이 3.6배 증가의 5511 pg/mL를 분비함을 입증하였다. 5배 희석된 상층액에서, 비-WPRE huIL-2 작제물은 315 pg/mL의 huIL-2를 분비한 반면, WPRE가 있는 huIL-2 작제물은 4.6배 증가된 1441 pg/mL를 분비하였다. 따라서 WPRE로 예시되지만 이로 제한되지 않는 3' 전사후 조절 요소의 추가는 인간 세포에서 단백질 발현을 상당히 개선할 수 있다.
프로모터 최적화 및 전사후 조절 요소는 1차 M2 대식세포에서 사이토카인 생산을 향상시킨다
muIL-15Rα-IL-15sc와 같은 사이토카인의 발현은 CMV 프로모터를 사용하여 인간 HEK293T-세포에서 향상되었지만, 사이토카인의 발현이, T-세포에서 우세한 대식세포 표현형이 배제된 고형 인간 종양, 공여자 유래 1차 인간 M2 대식세포에서 유사하게 향상될 수 있는지 여부가 결정되었다. 또한 WPRE와 같은 전사후 조절 요소가 이러한 세포에서 발현을 향상시킬 수 있는지 여부가 결정되었다.
단백질 발현이 개선될 수 있는지 확인하기 위해 프로모터 EF-1α 및 CMV를 사용하여 muIL-2의 발현 조절을 시험하고 WPRE 전사후 조절 요소를 huIL-2의 발현에 대해 시험하였다. 건강한 인간 공여자로부터 분리된 동결된 인간 PBMC를 완전 배지(RPMI-1640 + 1X 비필수 아미노산 + 5% 인간 AB 혈청)에서 해동하고, 실온에서 800 RPM으로 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. PBMC는 PBS + 2% FBS에 재현탁되었고 단핵구는 CD16 고갈 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 음성으로 분리되었다. 분리된 단핵구를 M-CSF 및 IL-4를 포함하는 RPMI 배지에서 6일 동안 배양하여 M2 대식세포를 생성하였다. 이를 위해, 분리되지 않은 단핵구를 PBS + 2% FBS에서 원심분리하여 세척하고, 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지에 재현탁시켰다. 그 후에, 분리된 단핵구(웰당 3e5개)를 750 마이크로리터의 최종 부피로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 접종 2일 후, 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 새로운 완전 배지로 교체하였다. 이틀 후(4일차), 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지 500 μL를 웰당 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 6일째에 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 형질주입 시약(Lipocalyx)으로 형질주입시키기 위해 사이토카인이 없는 새로운 완전 배지로 교체하였다.
Viromer® RED를 사용한 형질주입은 제조업체의 설명서에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, EF-1α-muIL-2 작제물, CMV-muIL-2 작제물, EF-1α-huIL-2 구조 또는 EF-1α-huIL-2 구조를 포함하는 500 ng의 플라스미드 DNA + WPRE 작제물 및 형질주입되지 않은 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고 0.2 L의 Viromer® RED와 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되도록 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 천천히 첨가하고(2벌 중복으로) 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 24시간에 수합하고, 키트 지침에 따라 뮤린 IL-2 ELISA(R&D Systems) 또는 인간 IL-2 ELISA(Invitrogen)를 사용하여 사이토카인에 대해 분석하였다.
결과는 EF-1α 프로모터의 제어 하에 muIL-2 작제물로 형질주입된 1차 인간 M2 대식세포로부터 수합한 순수 상층액으로부터 muIL-2의 발현이 평균 59.7 pg/mL의 muIL-2을 분비한다는 것을 입증하였다. CMV 프로모터가 있는 muIL-2 작제물은 평균 275 pg/mL muIL-2를 생성하였으며, 이는 거의 5배 증가하였다. 인간 IL-2 ELISA의 경우, WPRE가 결여된 플라스미드로 형질주입된 세포의 순수한 상층액은 평균 170 pg/mL huIL-2를 산출하였다. WPRE를 함유하는 huIL-2 작제물은 평균 219 pg/mL huIL-2를 산출하였다. 이러한 데이터는 CMV와 같은 프로모터 및 WPRE와 같은 전사후 조절 요소가 1차 인간 M2 대식세포를 비롯한 여러 세포 유형에서 사이토카인 발현을 유의하게 개선할 수 있음을 확인한다.
인간 세포에서 발현되는 공동자극 수용체 리간드 4-1BBL
4-1BBL과 같은 공동자극성 분자는 항원 제시 세포(APC)에서 발현될 때 T-세포에서 발현된 4-1BB와 결합하여 최적의 T-세포 기능을 촉진할 수 있다. 4-1BBL은 세포질 신호전달 도메인에 의해 부정적으로 조절된다. 대식세포를 T-세포에 연결하는 4-1BBL의 후기 단계에서, 4-1BBL 세포질 도메인의 역 신호전달은 4-1BBL의 표면 전위를 유도하여 TLR4와 신호전달 복합체를 결합하고 형성한다. 이는 TLR4의 LPS 활성화에 필적하는 높은 수준의 TNF-α를 유도하여 적응 면역 반응의 면역억제를 유도한다(예를 들어, Ma 등 (2013) Sci. Signal. 6(295):ra87 참조).
이 예에서, 뮤린 4-1BBL을 인코딩하는 서열은 pATI-1.75 벡터로 클로닝되었다. T-세포를 최대로 결합시키기 위해, 4-1BBL 세포질 도메인의 역 신호전달은 세포질 도메인(SEQ ID NO: 344의 아미노산 잔기 1-82에 상응)을 결실시켜 제거되어 mu4-1BBL△cyt를 생성하였다. mu4-1BBL△cyt가 인간 세포 표면에서 기능적으로 발현될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 HEK-293T-세포를 이용하였다. HEK293T STING Null Cells(InvivoGen)를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 접종하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날, mu4-1BBL△cyt를 인코딩하는 200ng의 플라스미드 DNA를 무혈청 배지에 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하고 형질주입되지 않은 웰을 음성 대조군으로 사용하였다(2벌 중복). 48시간 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 PBS + 2% FBS에 재현탁시키고, PE-접합된 뮤린 항-4-1BBL 항체(클론 TKS-1, BioLegend) 및 DAPI(사멸/생존 염색)로 염색하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고, PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 유세포분석 데이터는 ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
살아있는 세포의 백분율로서, 형질주입되지 않은 대조군 세포는 14.6의 뮤린 4-1BBL에 대한 양성 염색 백분율을 나타내었다. 이와 비교하여 mu4-1BBL△cyt를 인코딩하는 플라스미드로 형질주입된 세포의 93.4%가 4-1BBL의 표면 발현에 대해 양성이었다. 이러한 데이터는 pATI-1.75 플라스미드가 인간 세포 표면에서 높은 수준으로 4-1BBL을 발현하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 실증한다.
인간 세포에서 발현되는 가용성 TGFβ 수용체 II
가용성 마우스 TGFβ 수용체 II 변이체는 전체 TGFβ 수용체 II의 세포질 및 막횡단 부분을 제거하여 설계되었다. 또한 검출을 위해 FLAG 또는 Fc 태그가 추가되었다. 이러한 변이체는 CMV 프로모터 및 3' WPRE의 제어 하에 pATI-1.75 벡터에 클로닝되었다. 서열는 Sanger 시퀀싱에 의해 확인되었다. 1.5 x 106 HEK293T-세포를 하루 전에 폴리-L-리신으로 코팅된 6웰 플레이트에 평판배양하여 80% 합류도를 달성하였다. 형질주입 당일 3g의 DNA를 무혈청 배지에 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하였다. 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 인큐베이션 48시간 후에 수집하였다. 일부 상층액은 10kDa 스핀 컬럼(Millipore)에서 농축되었다. 마우스 TGF-β1(R&D Systems)을 사용한 직접 ELISA를 형질주입된 HEK293T-세포의 상층액에서 수행하였다. 450 nm에서의 흡광도를 갖는 ELISA 데이터가 아래 표에 제공되어 있다.
Figure pct00036
이러한 구성의 기능은 T-세포 분석에서 시험되었다. 자기 격리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 비장에서 마우스 T-세포를 수합하였다. T-세포는 다양한 농도의 마우스 TGF-베타에서 가용성 수용체가 있거나 없는 항-마우스 CD3ε 항체와 함께 배양되었다. T-세포 활성화는 마우스 TH1 CBA 키트(BioLegend) 및 CD4, CD8, 4-1BB 및 CD69의 유세포분석 라벨링을 사용하여 정량화되었다.
이러한 데이터는 면역자극성 박테리아에 의해 인간과 같은 진핵생물 세포로의 전달을 위해 조작된 플라스미드로부터 Fc 도메인에 융합된 세포외 수용체와 같은 이종성 분자를 발현하는 능력을 실증한다.
인간 세포로부터 CD3xCD19 이중특이적 T-세포 연계자의 발현
플래그 태그와 His 태그를 포함하는 CD3xCD19 이중특이적 T-세포 연계자(BiTE®)를 CMV 프로모터의 제어 및 3' WPRE를 사용하여 pATI-1.75 벡터에 클로닝하였다. 서열는 Sanger 시퀀싱에 의해 확인되었다. 1.5 x 106 HEK293T-세포를 하루 전에 폴리-L-리신으로 코팅된 6웰 플레이트에 평판배양하여 80% 합류도를 달성하였다. 형질주입 당일 3g의 DNA를 무혈청 배지에 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하였다. 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 인큐베이션 48시간 후에 수집하였다. 일부 상층액은 10kDa 스핀 컬럼(Millipore)에서 농축되었다.
이 작제물의 기능은 CD3xCD19 BiTE®를 Raji 및 Jurkat-Lucia™ NFAT-세포(InvivoGen)에 결합하여 시험하였다. BiTE®는 유세포분석을 사용하여 항-FLAG-APC(BioLegend)를 사용하여 검출되었다. 각각의 조건에 대해 50,000개 세포 중 하나의 웰을 실행하였다. APC 양성 이벤트의 평균 형광 강도(MFI) 및 APC 양성으로 게이트된 세포의 수가 아래 표에 나와 있다.
Figure pct00037
추가로, 이 구성은 Raji 및 Jurkat-Lucia™ NFAT-세포의 공동배양에서 시험되었다. 세포를 CD3xCD19 BiTE®와 함께 또는 없이 인큐베이션하고, BiTE®의 첨가 후 6시간 및 24시간에 발광(NFAT 활성화로부터 비롯되는 Lucia™ 루시퍼라제 활성에 상응함)이 검출되었다. 이 분석의 발광 판독값은 아래 표에 나와 있다.
Figure pct00038
이러한 데이터는 본원의 면역자극성 박테리아에 의해 전달될 수 있는 조작된 플라스미드로부터 인간과 같은 진핵 세포에서 scFv, 대안적 항체 작제물 및 이중특이적 T-세포 연계자와 같은 이종성 분자를 발현하는 능력을 실증한다.
실시예 10
면역자극성 박테리아 균주는 인간 세포에서 플라스미드를 효율적으로 전달하고 사이토카인을 발현한다
뮤린 IL-2를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 편모-결실된 균주는 인간 단핵구에서의 감염 후 기능적 IL-2 단백질 발현을 유도한다
상기 기재된 대로 플라젤린 유전자 fljB 및 fliC는 asd 유전자가 결실된 에스. 티피무리움의 YS1646 균주에서 결실되어 균주 YS1646△asd/△FLG를 생성하였다. 이 균주는 EF-1α 프로모터 및 뮤린 사이토카인 IL-2(muIL-2)가 있는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드로 전기천공되었다. 또한, YS1646△asd/△FLG 균주는 비동족 사이토카인에 대한 대조군으로서 뮤린 IL-15δ를 인코딩하는 발현 플라스미드로 전기천공되었다. CMV 프로모터를 사용하여 추가 작제물을 생성하였다.
발현 플라스미드를 함유하는 이러한 균주가 인간 단핵구를 감염시키고 뮤린 IL-2의 생산을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 감염 하루 전에 THP-1 인간 단핵구 세포를 RPMI 1640(Gibco™) + 10% Nu-혈청™(Corning®)에서 평판배양하였다. 세포를 RPMI에서 1시간 동안 MOI 50에서 다양한 균주로 감염시킨 다음 PBS로 3회 세척하고 RPMI + 100 μg/mL 겐타마이신(Sigma)에 재현탁시켰다. 48시간 후 상층액을 96-웰 플레이트에서 수집하고 ELISA(R&D Systems)에 의해 뮤린 IL-2 농도를 평가하였다.
YS1646△asd/△FLG-IL15δ 대조군 웰에서 검출된 muIL-2의 농도는 예상대로 매우 낮았으며(6.52 pg/mL), 내인성 인간 IL-2 수용체에 대한 일부 교차 반응성을 반영하는 것 같다. 대조적으로, YS1646△asd/△FLG-muIL-2 균주는 평균 35.1 pg/mL의 muIL-2를 유도하였다. 이러한 데이터는 인간 단핵구에서 에스. 티피무리움 면역조절 플랫폼 균주로부터 IL-2와 같은 기능적 이종성 단백질을 발현하고 분비하는 가능성을 실증한다.
뮤린 IL-2를 인코딩하는 플라스미드 포함하는 편모가 결실되고 pagP가 결실된 균주가 1차 인간 M2 대식세포에서 형질주입된 muIL-2 DNA와 비교하여 향상된 IL-2 발현 입증
muIL-2의 발현에 대한 1차 인간 M2 대식세포에서 형질주입(즉, 플라스미드 DNA의 직접 전달) 대 박토펙션(즉, 본원의 면역자극성 박테리아 균주에 의한 플라스미드 DNA의 전달)의 상대적 효율을 비교하였다. 건강한 인간 공여자로부터 분리된 동결된 인간 PBMC를 완전 배지(RPMI-1640 + 1X 비필수 아미노산 + 5% 인간 AB 혈청)에서 해동하고 실온에서 800 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. PBMC는 PBS + 2% FBS에 재현탁되었고 단핵구는 CD16 고갈 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 음성으로 분리되었다. 그 후에, 분리되지 않은 단핵구를 PBS + 2% FBS에서 원심분리에 의해 세척하고, 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지에 재현탁시켰다. 그 후에, 분리된 단핵구(웰당 3e5개)를 750마이크로리터의 최종 부피로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 접종 2일 후, 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 새로운 완전 배지로 교체하였다. 이틀 후(4일차), 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지 500 μL를 웰당 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 6일째에 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 형질주입 시약(Lipocalyx)으로 형질주입시키기 위해 사이토카인이 없는 새로운 완전 배지로 교체하였다.
Viromer® RED를 사용한 형질주입은 키트 지침에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, EF-1α 프로모터(EF-1α-muIL-2)의 제어 하에, 또는 CMV 프로모터(CMV-muIL-2)의 제어 하에, muIL-2를 인코딩하는 작제물로부터 500 ng의 플라스미드 DNA 대조군 또는 형질주입되지 않은 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고 0.2 μL의 Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되도록 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 단핵구를 포함하는 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 천천히 첨가하고(2벌 중복으로) 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 추가 웰은 EF-1α-muIL-2 작제물를 포함하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP 균주 또는 CMV-muIL-2 작제물을 포함하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP 균주로 450의 MOI에서 RPMI에서 1시간 동안 감염시킨 다음, PBS로 3회 세척하고, RPMI + 100 μg/mL 겐타마이신(Sigma)에 재현탁시켰다.
24시간 후, 세포를 β-머캅토에탄올(β-ME)과 함께 350 μL 완충제 RLT(Qiagen)로 용해하고, 하기와 같이 변형된 Qiagen RNeasy® Mini Kit를 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. RNase-Free DNase 키트(Qiagen)를 사용하는 게놈 DNA 제거 단계가 키트에 포함되어 전체 RNA에서 게놈 DNA를 제거하였다. 총 RNA 농도는 NanoDrop™ OneC UV-Vis 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정되었다. 각각의 시료의 순도는 A260/A230 흡수 비율에서도 평가되었다. RNA는 역전사가 수행될 때까지 동결-해동 없이 -80℃에서 보관되었다. cDNA 합성은 제조업체의 설명서에 따라 30 μL 반응에서 C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad) 및 SuperScript™ VILO™ Master Mix(Invitrogen)를 사용하여 0.4-1 μg의 주형 RNA를 사용하여 수행되었다.
qPCR(정량적 중합효소 연쇄 반응)은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad)으로 수행되었다. 뮤린 IL-2용 SYBR® 프라이머(분석 ID: qMmuCED0060978)는 Bio-Rad에서 구입하였다. iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 프로토콜당 qPCR 반응(20 μL)을 수행하였다. Bio-Rad CFX96™ 실시간 시스템의 표준 열순환 프로그램은 30초 동안 95℃ 변성 후 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 40 주기로 구성되었다. 주형이 없는 대조군을 사용한 반응은 각각의 플레이트의 각각의 프라이머 세트에 포함되었다. 모든 시료을 이중으로 실행하고 평균 Cq 값을 계산하였다. 표적 mRNA의 정량화는 Gapdh(글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소) 기준 mRNA(Bio-Rad, 분석 ID: qMmuCED0027497)를 사용하여 정규화되었다. ΔCq는 표적(mu-IL2)과 기준(Gapdh) 유전자 간의 차이로 계산되었다. ΔΔCq는 처리의 ΔCq 값을 비처리 대조군의 ΔCq 값으로 정규화하여 얻었다. 폴드 증가는 2^-ΔΔCq로 계산되었다. 형질주입되지 않은/감염되지 않은 대조군와 비교하여 증가하는 배수는 아래 표에 나와 있다.
Figure pct00039
결과는 형질주입 또는 박토펙션에서 CMV 프로모터가 1차 인간 M2 대식세포에서 EF-1α 프로모터와 비교하여 muIL-2의 우수한 발현을 입증했음을 보여준다. 현재 이용 가능한 가장 효율적인 시약을 사용한 형질주입이 가장 높은 수준의 muIL-2 발현을 제공한 반면, 박토펙션은 또한 높은 수준의 muIL-2를 이끌어내어 본원에 제공된 박테리아 플랫폼을 사용한 이종성 유전자 전달의 높은 효능을 입증하였다.
실시예 11
박테리아 균주는 생체내에서 면역조절성 플라스미드를 효율적으로 전달하고 강력한 항종양 활성을 실증한다
뮤린 IL-2를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 편모-결실된 균주는 결장직장 암종의 마우스 모델에서 독성 없이 강력한 종양 저해를 유도한다
muIL-2 발현 플라스미드를 함유하는 에스. 티피무리움 균주가 추가 독성 없이 항종양 효능을 유도할 수 있음을 입증하기 위해, muIL-2 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG 균주를 MC38 결장직장 선암종 모델에서 피하 측면에서의 안전성 및 효능에 대해 PBS 대조군과 비교하였다. 이 연구를 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)에 MC38 세포(100 μL PBS에서 5x105 세포)를 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 11일째에 YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2 균주의 5x105 CFU 또는 PBS 비히클 대조군을 IV 주사하였다. 종양 측정 및 체중을 매주 2회 기록하였다.
결과는 YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2 균주가 PBS(76.7% TGI, P = 0.005, 21일째)와 비교하여 PBS 마우스가 안락사되었을 때 상당한 종양 성장 저해(TGI)를 나타내었으며 종양은 이식 후 40일째까지 잘 제어됨을 보여주었다. 요법은 추가 균주 약독화 없이도 내약성이 우수하였으며 초기의 체중 감소는 일시적이었고 40일째 PBS 대조군과 비교하여 체중이 3.4% 감소하였다. 따라서 muIL-2를 강력하게 발현하는 면역자극 균주 결장직장암 모델에서 안전하고 독성이 없는 방식으로 종양 성장 저해를 억제한다.
뮤린 IL-2를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 편모가 결실된 균주는 생체 내에서 IL-2의 종양-특이적 생산을 유도한다
비장에 대한 종양 muIL-2 발현 수준은 전달의 종양-특이적 특성을 확인하기 위해 결정되었다. 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 10일째에 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2의 5x105 CFU 또는 PBS 비히클 대조군을 IV 주사하였다. 종양 이식 후 31일에 종양 및 비장을 절제하고 2 mL의 PBS에서 gentleMACS™ Octo Dissociator 및 M 튜브(Miltenyi Biotec) 분자 설정을 사용하여 종양 추출물에 대해 처리하였다. 균질액을 1300 RPM에서 10분 동안 회전시키고 상층액을 수집하고 제조업체의 설명서에 따라 muIL-2 CBA 키트(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 결과는 pg/mL의 muIL-2로 정량화되고 조직 그램당 표준화되었다.
PBS 대조군 종양은 종양 조직 그램당 평균 134 pg/mL로 종양에서 muIL-2의 배경 수준을 나타내었다. YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2 처리된 종양은 종양 조직 그램당 389.9 pg/mL muIL-2의 훨씬 더 높은 평균을 산출하여 종양-체류 골수성 세포에서 플라스미드 전달로 인한 상승된 muIL-2 수준을 검출하는 능력을 실증한다. 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2를 주사한 마우스의 비장에서 muIL-2 수준은 조직 그램당 평균 6.6 pg/mL였으며, 이는 PBS 대조군보다 낮았다. 종양에 대한 이러한 특이성은 종양을 표적으로 하지 않는 기존의 사이토카인 요법보다 훨씬 안전한 방식으로 IL-2의 면역 조절 수준을 전달할 수 있다.
뮤린 공동자극 수용체 리간드 4-1BBL을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 약독화 박테리아 균주는 생체 내에서 치료 효과를 보여준다
4-1BBL과 같은 공동자극성 분자의 종양-특이적 전달이 항종양 효능을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해, 4-1BBL(Δcyt)을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 균주 CMV 프로모터 및 3' WPRE를 함유하는 결장직장 선암종의 MC38 쥐 모델에서 평가되었다. 이 연구를 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리 마우스)에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS에서 5x105 세포)를 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 CMV-4-1BBL(Δcyt)-WPRE 플라스미드를 함유하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB의 1x107 CFU를 10일째에 IV 주사하거나 PBS 비히클 대조군으로 IV 주사하였다.
치료는 매우 잘 견디어 3일 후에 완전히 회복된 초기 체중 감소가 2.2%에 불과하였다. PBS와 비교하여 4-1BBL(Δcyt) 요법은 매우 효과적이고 치유적이었다(90.7% TGI, 60% 완전 반응(CR), 30일째). 이러한 데이터는 종양-특이적 방식으로 공동자극성 분자를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아를 전달하는 효능 및 안전성을 실증한다.
실시예 12
항시적 유형 I 인터페론 생성을 촉진하는 유전자에서 기능-획득 돌연변이의 식별
심각한 자가염증성 상태와 원인을 알 수 없는 혈관병증을 나타내는 개체의 사례가 발생하며 종종 돌연변이에서 유래된다. 이러한 상태의 원인은 확인되었으며 확인될 수 있다. 이러한 병리의 돌연변이 기반을 확인하는 단계는 하기와 같다. 1단계에서는 증상이 있는 환자와 건강한 개인으로부터 온전한 게놈 DNA를 수득한다. 전체 게놈 시퀀싱을 수행한 다음 인트론과 엑손을 분석한다. 유형 I 인터페론(IFN)의 발현과 관련된 경로에서 유전자 분석 및 생성물의 돌연변이 식별이 수행된다. 이 분석에서, 인코딩된 단백질의 항시적 기능적 활성화 및 후속적으로 유형 I IFN의 지속적인 발현을 유도하는 것으로 알려진 유전자에서 돌연변이가 발견된다.
돌연변이의 확인 후, 확인된 돌연변이(들)가 있거나 없는 전장 유전자를 인코딩하는 cDNA는 유형 I IFN의 발현을 측정하는 리포터 세포주로 형질주입된다. 예를 들어, 루시페라제의 발현이 IFN-β에 대한 프로모터의 제어 하에 놓이는 리포터 세포주가 생성될 수 있다. 항시적으로 활성인 기능-획득(GOF) 돌연변이는 IFN-β의 발현을 촉진하지만 자극되지 않은 야생형(WT) 단백질은 그렇지 않다. 알려진 STING SAVI(유아기 발병이 있는 STING 관련 혈관병증) 돌연변이의 경우, IFN-β의 WT-STING 자극은 WT-STING을 직접 활성화하기 위해 외인성 수준의 cGAMP를 증가시키는 추가를 필요로 한다. 항시적으로 활성인 돌연변이는 cGAMP와 무관한 방식으로 IFN-β의 발현을 자극한다. 각각의 STING, RIG-I, MDA5, IRF3, 및 IRF7에서의 예시적인 기능-획득 돌연변이는 하기 실시예 15에서 제시되고 본원의 다른 곳에서 논의된다. 기능-획득 돌연변이가 대상체에서 확인되거나 시험관내 돌연변이 및 스크리닝에 의해 생성될 수 있는 이러한 다른 유전자에는 TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60 및 SNRNP200이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
인간 세포에서 기능적 구성 유형 I IFN 돌연변이체의 발현
인간 STING(대립유전자 R232) 및 IRF3 기능-획득(GOF) 돌연변이체(아래 표 참조)를 pATI-1.75 벡터에 클로닝하고 PCR로 서열을 확인하였다. STING 및 IRF3 GOF 발현 플라스미드가 인간 세포에서 기능적 유형 I IFN을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 플라스미드는 내인성 STING을 포함하지 않는 HEK293T STING Null 리포터 세포(InvivoGen)를 사용하여 평가되었다. 이 세포는 내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어 하에 배치된 분비된 배아 알칼리성 인산분해효소(SEAP)를 발현하며, 여기서 ISRE의 인코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 SEAP ORF로 대체되었다. 유형 I 인터페론 활성은 세포 배양 상층액에서 유형 I IFN 자극 SEAP 생산을 모니터링하여 평가할 수 있다.
각 GOF 돌연변이에 의한 유형 I IFN의 상대적 생산을 시험하기 위해, 1x105 293T-Dual™ Null Cells(InvivoGen)를 하루 전에 24-웰 플레이트에서 폴리-L-리신으로 코팅된 플레이트에 평판배양하여 24시간 동안 80% 합류도를 달성하였다. 형질주입 당일, STING 야생형(WT) 및 IRF3 WT 대조군을 포함하는 STING 및 IRF3 GOF 돌연변이체 패널을 인코딩하는 플라스미드 200 ng, 문헌에 보고되지 않은 것으로 보고된 음성 대조군 STING 돌연변이체 인간 세포(STING V155R 음성 대조군(NC))에서 기능하는 세포를 무혈청 배지에 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하였다. 밤새 배양 후 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 채취하고 SEAP 측정에 사용되는 50 μL QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen)에 10 μL의 세포 배양 상층액을 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 650 nm의 흡광도 파장에서 SpectraMax® M3 분광 광도계(Molecular Devices)에서 ISRE 유도 SEAP 활성을 측정하여 결정되었다.
하기 표에 나타난 바와 같이, 모든 GOF 돌연변이체는 유형 I IFN 활성을 유도하지 않은 야생형 및 음성 대조군과 비교하여 인간 세포에서 STING 리간드 독립적인 방식으로 유형 I IFN 활성을 유도할 수 있었다. 인간 STING R284G 변이체 및 인간 IRF3 S396D 포스포모방체 변이체에서 가장 높은 수준의 유형 I IFN 유도가 관찰되었다. 이러한 데이터는 기능적, 항시적으로 활성인 STING 및 항시적으로 활성인 포스포모방체 IRF3를 생성하는 GOF 돌연변이체를 인코딩하는 플라스미드의 능력을 뒷받침하며, 이는 cGAMP 독립적인 방식으로 유형 I IFN을 유도할 수 있다.
Figure pct00040
항시적으로 활성인 유형 I IFN 돌연변이를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 편모가 결실된 균주의 감염은 인간 M2 대식세포를 유형 I IFN 생성 M1 대식세포로 변환한다
항시적으로 활성인 유형 I IFN GOF 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 편모가 결실된 균주로 감염된 1차 인간 M2 대식세포가 CXCL10(IP-10으로도 알려짐)과 같은 유형 I IFN 및 다운스트림 케모카인의 생산자로 전환될 수 있는지 여부가 결정되었다.
건강한 인간 공여자로부터 분리된 동결된 인간 PBMC를 완전 배지(RPMI-1640 + 1X 비필수 아미노산 + 5% 인간 AB 혈청)에서 해동하고 실온에서 800 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. PBMC는 PBS + 2% FBS에 재현탁되었고 단핵구는 CD16 고갈 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 음성으로 분리되었다. 1차 인간 M2 대식세포를 생성하기 위해, 분리되지 않은 단핵구를 PBS + 2% FBS에서 원심분리하여 세척하고, 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지에 재현탁시켰다. 그 후에, 분리된 단핵구(웰당 3e5개)를 750마이크로리터의 최종 부피로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 접종 2일 후, 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 새로운 완전 배지로 교체하였다. 2일 후(4일째), 100 ng/mL 인간 M-CSF 및 10 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 완전 배지 500 μL를 웰당 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 6일째에 세포 배양 배지를 완전히 흡인하고 사이토카인이 없는 신선한 완전 배지로 교체하였다. 복제 웰을 450 MOI에서 RPMI에서 1시간 동안 다음 균주로 감염시켰다: 야생형(WT) 인간(hu) STING을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG; huSTING R284G 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG; WT huIRF3을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG; huIRF3 S396D 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG; 또는 플라스미드 대조군을 포함하는 균주. 그 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고 RPMI + 100 μg/mL 겐타마이신(Sigma)에 재현탁시켰다. 대조군으로 임상 화합물 ADU-S100의 유사체인 STING 작용제 3'5' RpRp c-디-AMP(InvivoGen)를 10 μg/mL의 농도로 세포에 첨가하였다.
24시간 후, 세포를 β-ME와 함께 350 L 완충제 RLT(Qiagen)로 용해하고, 하기와 같이 변형된 Qiagen RNeasy® Mini Kit를 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. RNase-Free DNase 키트(Qiagen)를 사용하는 게놈 DNA 제거 단계를 포함하여 전체 RNA에서 게놈 DNA를 제거하였다. 총 RNA 농도는 NanoDrop™ OneC UV-Vis 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다. 각각의 시료의 순도는 A260/A230 흡수 비율에서도 평가되었다. RNA는 역전사가 수행될 때까지 동결-해동 없이 -80℃에서 보관되었다. cDNA 합성은 제조업체의 설명서에 따라 30 μL 반응에서 C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad) 및 SuperScript™ VILO™ Master Mix(Invitrogen)를 사용하여 0.4-1 μg의 주형 RNA에서 수행되었다.
qPCR은 CFX96™ 실시간 시스템(Bio-Rad)으로 수행되었다. huCXCL10(qHsaCED0046619), huIRF3(qHsaCID0013122), huSTING(qHsaCID0010565) 및 huIFNβ1(qHsaCED0046851)용 SYBR® 프라이머는 Bio-Rad에서 구입하였다. iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 프로토콜당 qPCR 반응(20 μL)을 수행하였다. BioRad CFX96™ 실시간 시스템의 표준 열순환 프로그램은 30초 동안 95℃ 변성, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 40주기로 구성되었다. 주형이 없는 대조군과의 반응은 각각의 플레이트의 각각의 프라이머 세트에 포함되었다. 모든 시료을 이중으로 실행하고 평균 Cq 값을 계산하였다. 표적 mRNA의 정량화는 Gapdh 기준 mRNA(Bio-Rad, qMmuCED0027497)를 사용하여 정규화되었다. ΔCq는 표적 유전자와 기준 유전자의 차이로 계산되었다. ΔΔCq는 처리의 ΔCq 값을 무처리 대조군의 ΔCq 값으로 정규화하여 얻었다. 폴드 증가는 2^-ΔΔCq로 계산되었다. 값은 중복 웰의 평균으로 아래 표에 나와 있다.
하기 표에 나타난 바와 같이, WT huSTING 및 huSTING R284G를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG 균주는 플라스미드 대조군의 감염과 비교하여 높은 수준의 STING 발현을 유도하였고, 이는 플라스미드 대조군 또는 작은 분자 STING 작용제와 비교하여 상당히 더 높았다. 유사하게는, WT huIRF3 및 huIRF3-S396D를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 균주는 플라스미드 대조군 또는 저분자 STING 작용제보다 상당히 높은 높은 수준의 IRF3 발현을 유도하였다. huSTING R284G 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 균주는 WT huSTING을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 균주와 비교하여 IFNβ 및 CXCL10의 훨씬 더 높은 발현을 유도하였다. 이는 항시적으로 활성인 STING GOF 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 균주가 인간 1차 면역억제성 M2 대식세포를 M1, 유형 I IFN 생성 세포로 전환시키는 능력을 실증한다. WT huIRF3 및 huIRF3-S396D를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 균주는 둘 다 더 많거나 유사한 수준의 IFNβ를 유도하였으나 huSTING-R284G 변이체보다 CXCL10을 덜 유도하였다.
Figure pct00041
이러한 데이터는 인간 1차 M2 대식세포에서 항시적으로 활성인 GOF 유형 I IFN 변이체의 발현 및 이러한 세포를 M1-유사, 유형 I IFN 생성 세포로 전환시키는 것을 실증한다.
실시예 13
항시적 유형 I IFN 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아는 결장직장암의 뮤린 모델에서 강력한 항종양 면역력을 실증한다
인간 GOF STING 돌연변이체는 마우스 모델에서 항종양 활성을 보여준다
항시적으로 활성인 STING 변이체를 인코딩하는 발현 플라스미드를 함유하는 면역자극성 박테리아 균주가 항종양 효능을 유도한다는 것을 입증하기 위해 균주 YS1646Δasd/ΔFLG(플라젤린 유전자 fljB 및 fliC 모두의 넉아웃)를 인간 STING용 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 전기천공하였다. 대립유전자 R232 및 GOF 돌연변이 V155M(huSTING V155M), 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터 뒤에 있고, 균주 YS1646 단독 및 PBS 비히클 대조군과 비교하였다. huSTING V155M을 인코딩하는 유전자는 DNA 합성을 사용하여 생성되었고 pATI-1.75 벡터에 클로닝되었다. 항시적으로 활성인 인간 STING 변이체가 마우스에서 항종양 활성을 나타낼 수 있는지 여부를 평가하기 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105 세포)를 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양을 보유하고 있는 마우스에 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-huSTING V155M의 5x105 CFU, 균주 YS1646 또는 PBS 대조군을 8일째에 IV 주사하였다.
결과는 YS1646 모 균주가 항종양 요법으로서 약간만 효과적이었고 치유적이지 않다는 것을 보여주었고(35% TGI, p = NS(중요하지 않음), 28일째), 이전에 발표된 데이터와 일치한다. 그러나 항시적으로 활성인 인간 STING, YS1646Δasd/ΔFLG-huSTING V155M을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 더 약독화된 균주는 PBS와 비교하여 유의한 종양 제어(60% TGI, p < 0.05, 28일째)를 이끌어내었고, 치료율은 20%였다. 따라서, 항시적으로 활성인 STING 변이체를 전달하는 면역자극성 박테리아 균주는 종양 성장을 강력하게 억제하고 결장직장 선암종 모델에서 치료 효과를 보여준다.
뮤린 인산모방체 IRF3는 생체 내에서 치료 효과를 보여준다
인산모방체 인간 IRF3 변이체의 쥐 버전이 설계되고 muIRF3-S388D로 지정되었으며 결장직장 선암종의 쥐 모델에서 평가되었다. 균주 YS1646Δasd/ΔFLG를 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터 뒤에 GOF 돌연변이 S388D(muIRF3-S388D)를 갖는 뮤린 IRF3용 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 전기천공하고, PBS 비히클 대조군과 비교하였다. muIRF3-S388D를 인코딩하는 유전자는 DNA 합성을 사용하여 생성되었고 pATI-1.75 벡터에 클로닝되었다. 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 10일째에 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-EF-1α-muIRF3-S388D의 5 x105 CFU를 IV 주사하고 PBS 비히클 대조군과 비교하였다.
이 요법은 초기 체중 감소 최저치가 0.3%에 불과하여 내약성이 매우 우수하였다. PBS와 비교하여 muIRF3-S388D GOF 돌연변이를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 균주는 매우 효과적이고 치료적이었다(81.8% TGI, 60% CR, 42일째). 이러한 데이터는 종양-특이적 방식으로 변이체를 유도하는 항시적으로 활성인 유형 I IFN 전달의 효능 및 안전성을 실증한다.
뮤린 STING GOF 변이체는 강력하고 치료적인 항종양 활성을 나타낸다
인간 환자에서 발견된 인간 STING 변이체의 뮤린 오르토로그 패널이 설계되었다. 이 오르토로그는 인간 변이체와 하나의 코돈이 다르며 EF-1α 프로모터의 제어 하에 pATI-1.75 벡터에 클로닝되어 다음 돌연변이 세트를 생성한다: muSTING N153S, muSTING V154M, muSTING R280Q, muSTING V146L, muSTING R283G 및 muSTING C205Y 등이 있다. STING 변이체는 항종양 효능에 대해 쥐 선암종의 MC38 모델에서 평가되었다. 연구를 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 10일째 5 x 105 CFU의 균주 YS1646Δasd/ΔFLG를 IV 주사하였으며, 이는 muSTING N153S, muSTING V154M, muSTING R280Q, muS83 또는 muSTING V146L의 발현을 유도하는 EF-1α이 있는 플라스미드, 또는 스크램블된 shRNA 플라스미드 대조군를 포함하였고, PBS 비히클 대조군과 비교하였다.
이 실험에서 균주 YS1646Δasd/ΔFLG-EF-1α-shSCR(스크램블된 플라스미드 대조군)은 YS1646 모 균주보다 훨씬 더 강력한 PBS 대조군(73% TGI, 26일째)과 비교하여 항종양 효능을 입증하였다. 역사적으로 보여주었다. 이는 CpG 및 RNAi 자극 요소와 같은 플라스미드 자체의 본질적으로 면역 자극 요소 때문일 수 있다. 그러나 이 요법은 군 중 가장 내약성이 낮았으며 9.9%의 체중 감소 최하점을 보여 연구의 맨 끝에만 해결되었다. 대조적으로, 항시적으로 활성인 뮤린 STING 돌연변이체는 일시적이고 수일 내에 해결되는 더 낮은 체중 감소를 초래하였다. 이러한 변이체의 상대적인 항종양 효능은 활성의 차이를 나타냈으며, 플라스미드 대조군인 muSTING N153S 및 muSTING R283G와 비교하여 치료 효과 및 강화된 효능을 나타내는 변이체 두 개뿐이다.
Figure pct00042
후속 연구에서 뮤린 STING C205Y 변이체를 R283G 및 N153S 변이체와 함께 시험하여 항종양 효능을 비교하였다. 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리)의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 9일째에 5 x 105 CFU의 균주 YS1646Δasd/ΔFLG를 IV 주사하였고, 이는 EF-1α가 포함된 플라스미드가 muSTING N153S, muSTING R283G 또는 muSTING C205Y의 발현을 유도하고 PBS 비히클 대조군과 비교되었다. 이전과 마찬가지로 STING 변이체는 내약성이 우수하였으며 일시적인 체중 감소만 관찰되어 빠르게 해결되었다. 이는 저분자 STING 작용제에서도 관찰되기 때문에 표적 치료로 인한 것 같다. 2개의 항시적으로 활성인 뮤린 STING 균주인 muSTING N153S 및 muSTING R283G의 효능은 이전 연구와 거의 동일하였으나, 체중 감소는 불분명한 이유로 훨씬 적었다. muSTING C205Y 균주도 치료 효과는 없었지만 매우 효과적이었다.
Figure pct00043
이 연구에서 STING으로 치료된 마우스는 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS에서 5x105 세포)로 반대쪽 측면 SC에 초기 종양 이식 후 40일째에 다시 공격을 받았다. 모든 종양이 성장한 미접촉 마우스(N=5)와 비교하여 STING으로 치료된 모든 마우스는 종양을 거부하여 적응 면역력의 참여를 입증하였다.
이러한 데이터는 결장직장암의 쥐 모델에서 인간 항시적으로 활성인 STING 변이체의 쥐 버전의 안전성과 효능을 검증하고 다른 STING 변이체와 비교하여 효능이 향상된 변이의 작은 하위 집합을 나타낸다. 이러한 고도로 활성적인 변이체는 또한 보호 면역을 이끌어내어 유형 I 인터페론의 종양-특이적 생성의 효능을 보여준다.
뮤린 STING GOF 변이체는 IV 투여 후 상당한 종양 리모델링을 보여준다
항시적으로 활성인 STING 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 균주가 IV 투여 후 종양 미세환경(TME)을 리모델링하는 능력의 차이를 나타내는지 여부가 다음으로 결정되었다. 이를 시험하기 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리 마우스)의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS 중 5x105개 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 8일째에 muSTING N153S, muSTING V154M, muSTING R280Q, muSTING STING V146L, muSTING R280Q, muS3G V146L의 발현을 유도하는 EF-1α이 있는 플라스미드 또는 플라스미드 대조군을 포함하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG의 5 x105 CFU를 IV 주사하고, PBS 비히클 대조군과 비교하였다.
종양 이식 후 28일째에, 분석을 위해 종양을 절제하였다. 종양을 2-3mm 조각으로 절단하여 2.5 mL 효소 믹스(RPMI-1640 + 1 mg/mL 콜라게나제 IV 및 20 μg/mL DNase I가 포함된 10% FBS)로 채워진 gentleMACS™ C 튜브(Miltenyi Biotec)로 절단하였다. OctoMACS™(Miltenyi Biotec) 특이적 해리 프로그램(마우스 이식 종양)을 사용하여 종양 조각을 해리하고 전체 세포 제제를 37℃에서 45분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 45분의 인큐베이션 후, OctoMACS™(마우스 이식 종양) 프로그램을 사용하여 제2 분리 라운드를 수행하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 70 μM 나일론 메쉬를 통해 50 mL 튜브로 여과하였다. 나일론 메쉬를 5 mL의 RPMI-1640 + 10% FBS로 한 번 세척하고, 새로운 70 μM 나일론 메쉬를 사용하여 새 50 mL 튜브에 세포를 제2로 여과하였다. 나일론 메쉬를 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 5 mL로 세척한 후, 여과된 세포를 1000 RPM에서 7분 동안 원심분리하였다. 생성된 해리된 세포를 PBS에 재현탁하고 염색 공정 전에 얼음에 보관하였다.
다양한 GOF muSTING 돌연변이를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG의 투여 후 CD4+ Treg, CD4+ Th1 세포, CD8+ T-세포, 호중구, 단핵구, 수지상 세포(DC), M1 대식세포 및 M2 대식세포를 포함한 살아있는 종양 침윤 백혈구(TIL)의 백분율은 유세포분석에 의해 결정되었다. 유세포분석 염색을 위해 100 μL의 단일 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 사멸/생존 염색(Zombie Aqua™, BioLegend) 및 Fc 차단 시약(BD Biosciences)을 포함하는 PBS를 웰당 100 μL씩 첨가하고, 암실에서 얼음 위에서 30분간 배양하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 형광색소 결합 항체(CD4 FITC 클론 RM4-5; CD8a BV421 클론 53-6.7; F4/80 APC 클론 BM8; CD11b PE-Cy7 클론 M1/70; CD45 BV570 클론 30-F11; CD3 PE 클론 145-2C11; Ly6C BV785 클론 HK1.4; I-A/I-E APC-Cy7 클론 M5/114.15.2; Ly6G BV605 클론 1A8; 및 CD24 PercP-Cy5.5 클론 M1/69; 모두 BioLegend)를 함유하는 PBS + 2% FBS에 재현탁하고, 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고 유세포분석 고정 완충액(Thermo Fisher Scientific)에 재현탁하였다. 유세포분석 데이터는 ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 표에서 볼 수 있듯이, EF-1α 플라스미드 대조군이 있는 YS1646Δasd/ΔFLG 균주는 일부 CD8+ T-세포 모집에도 불구하고 플라스미드의 면역자극 요소로 인해 주로 높은 호중구 침윤을 나타냈다. 대조적으로, 다른 muSTING 변이체는 고유한 종양 침윤 면역 세포 특징을 가지고 있으며, muSTING V146L 및 muSTING R283G와 같은 일부는 PBS 대조군보다 면역억제성 호중구가 더 적다. 가장 유리한 면역 프로파일은 muSTING R283G 및 muSTING N153S 돌연변이가 투여된 마우스의 종양에서 관찰되었으며, CD4+ Th1 세포 및 CD8+ T-세포의 수가 많고 호중구 수가 적으며, 이는 적응 면역 반응에서 생성에 매우 유리한 조건을 나타낸다. 또한, muSTING R283G 및 muSTING N153S 돌연변이체는 PBS와 비교하여 종양에서 유의하게 더 높은 p15e 종양-항원-특이적 CD8+ T-세포를 가졌다. 이러한 경향은 아래와 같이 총 세포 수에서도 요약되었다. 따라서, 항시적으로 활성인 STING 변이체를 종양-체류 골수성 세포에 전달하면 면역억제성 종양 미세환경이 적응성 항종양 표현형으로 완전히 리모델링되고, 박테리아 표현형이 제거되고, 이는 내재성 면역 촉진 및 적응 면역력의 억제를 특징으로 한다.
Figure pct00044
Figure pct00045
실시예 14
조합적 플라스미드 발현 카세트를 사용한 다수의 면역조절성 단백질의 발현
멀티-모듈러 플라스미드 발현 카세트는 인간 세포에서 다수의 면역조절성 단백질을 생성하는 능력을 실증한다
GOF 유형 I IFN 유도 변이체 및 사이토카인을 인코딩하는 핵산 조합을 CMV 및 EF-1α 프로모터(이중 프로모터 시스템)의 제어 하에 ORF 및 하나의 프로모터(단일 프로모터 시스템) 내에서 두 개의 개별 ORF를 사용하거나 T2A 서열을 사용하여 pATI-1.75 벡터에 클로닝하였다. 작제물은 또한 선택적으로 3' WPRE 또는 HPRE와 같은 전사후 조절 요소(PRE) 및/또는 SV40 또는 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호와 같은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하였다. 제조된 작제물은 사이토카인 muIL-2, 코돈 최적화가 있는 mu-IL-2(muIL-2 CO), muIL-21, muIL-12p70, muIL-15Rα-IL-15sc, muIL-18 및 muIFN-α2, 및 이의 조합; 돌연변이 R283G를 갖는 muSTING 변이체; 및/또는 세포질 도메인(mu4-1BBLΔcyt)이 결실된 뮤린 공동자극성 분자 4-1BBL을 인코딩하는 것을 포함하였다. 서열은 PCR로 확인하였다.
GOF 유형 I IFN 유도 변이체를 포함하는 조합 플라스미드가 인간 세포에서 기능적 유형 I IFN을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 플라스미드를 내인성 STING을 포함하지 않는 HEK293T STING Null 리포터 세포(InvivoGen)를 사용하여 평가하였다. 이 세포는 내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어 하에 배치된 분비된 배아 알칼리성 인산분해효소(SEAP)를 발현하며, 여기서 ISRE의 인코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 SEAP ORF로 대체되었다. 유형 I 인터페론 활성은 세포 상층액에서 유형 I IFN 자극 SEAP 생산을 모니터링하여 평가할 수 있다. 또한, 배양 상층액을 수집하고 ELISA에 의해 상대적 사이토카인 농도를 평가하였다.
유형 I IFN 및 공동-발현된 사이토카인의 상대적 생산을 시험하기 위해 2x105 293T-Dual™ Null Cells(InvivoGen)를 폴리-L-라이신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 하루 전에 평판배양하여 80% 합류도를 달성하였다. 형질주입 당일, 단독으로 또는 다양한 조합으로 GOF 변이체, 사이토카인 및 공동자극성 분자 패널을 인코딩하는 플라스미드 500 ng을 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였다. 각각의 시료의 세포 배양 상층액을 밤새 배양한 후 수집하고 20 μL의 세포 배양 상층액을 180 μL QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen)에 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 650 nm의 흡광도 파장에서 SpectraMax® M3 분광 광도계(Molecular Devices)에서 ISRE 유도 SEAP 활성을 측정하여 결정되었다. muIL-2 작제물은 제조업체의 설명서에 따라 뮤린 IL-2 ELISA(R&D Systems)에서 muIL-2 발현에 대해 평가되었다. muIL-12p70 구조는 제조업체의 권장 사항에 따라 뮤린 IL-12 ELISA(R&D Systems)에서 평가되었다. muIL-15Rα-IL-15sc 작제물의 경우, 키트 지침에 따라 뮤린 IL-15 ELISA(eBioscience)를 사용하였다. IFN-α2는 RAW-Lucia™ ISG 리포터 세포주(InvivoGen)를 사용하여 측정되었다. 뮤린 IL-18 및 뮤린 IL-21을 ELISA(Invitrogen)로 측정하였다.
하기 표에 나타난 바와 같이, 분비된 기능성 단백질의 존재를 검출하기 위해 수행된 검정은 다중 조합 페이로드의 높은 발현을 입증하였다. 여기에는 사이토카인 조합뿐만 아니라 유형 I IFN 유도 GOF 변이체 및/또는 공동자극 페이로드와의 조합이 포함된다. 이러한 데이터는 단일 발현 카세트로부터 다중 면역조절 단백질을 발현하는 본원에 제공된 플랫폼의 능력을 검증한다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
항시적으로 활성인 유형 I IFN 유도 변이체는 독특한 사이토카인 및 케모카인 프로파일을 갖는다
상기 기재된 바와 같이 시험한 인간 유형 I IFN 유도 GOF 변이체 패널을 사용한 HEK293T 형질주입 실험에서 수합한 상층액은 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 항바이러스 CBA 패널(BD Biosciences)을 사용하여 다운스트림 신호전달 차이에 대해 평가되었다. 각각의 형질주입을 이중으로 수행하고 사이토카인 수준을 측정하였다. 두 측정값의 평균을 계산하였다. 평균 사이토카인 분비의 배수 증가는 평균 사이토카인 분비가 1.00으로 설정된 형질주입되지 않은 웰과 비교하여 계산되었다.
아래 표에 나타난 바와 같이 세포에서 낮은 수준의 인간 IL-12p70이 생성되었다. 그러나 GOF 변이체를 유도하는 몇몇 인간 유형 I IFN은 인산모방체 IRF3 변이체(huIRF3-S396D)와 여러 항시적으로 활성인 STING 변이체를 포함하여 유형 I IFN-α2 및/또는 IFN-β의 생산을 유도하였다. 다수의 이러한 GOF 변이체는 분비된 CXCL10을 높은 수준으로 생성하여 이러한 발현된 변이체가 T-세포를 종양 미세환경으로 모집하는 능력을 보여준다. 가장 높은 수준의 CXCL10 발현은 돌연변이 R284G를 갖는 huSTING 변이체의 발현 후에 관찰되었다.
이러한 데이터는 CXCL10/IP-10과 같은 기능적 다운스트림 사이토카인 및 케모카인의 유도를 위한 유형 I IFN 유도 GOF 변이체를 포함하는 다중 플라스미드 발현 작제물물의 사용을 검증한다. 이러한 변이체는 모두 고유한 서명을 가지고 있으며 STING GOF 변이체는 최고 수준의 CXCL10 분비, 특히 huSTING-R284G(muSTING-R283G에 상응함)를 유도하였다.
Figure pct00049
면역 세포 공동배양 검정은 면역조절성 표적의 최적 조합을 식별한다
T-세포 모집 및 활성화를 이끌어내기 위한 사이토카인의 최적 조합을 결정하기 위해 대식세포 및 T-세포 공동배양 분석에서 패널을 시험하였다. 골든 티켓(STING 결핍) 뮤린 1차 골수 유래 대식세포(BMM)를 24-웰 플레이트를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 생성하였다(실시예 6 참조). FuGENE® 형질주입 시약(Promega)을 사용하여 각각의 웰을 적절한 DNA 구성물로 형질주입하였다. 작제물은 muIL-2 CO, muIL-12p70, muSTING-R283G, muIL-2 CO + muIL-12p70, muIL-15Rα-IL-15sc + muIL-12p70, 및 muIL-12p70 + muSTING-R283G + muIL-18을 인코딩하는 것을 포함하였다.
형질주입 24시간 후, 유세포분석-기초 사이토카인 비드 어레이(CBA)를 위해 100 μL의 세포 배양 상층액을 웰에서 수합하였다. 동시에, C57BL/6 마우스의 비장 2개를 해부하고, 마우스 T-세포 분리 키트(StemCell Technologies)의 지침에 따라 비장 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 분리하였다. 웰당 200,000개의 분리된 T-세포를 CD3ε 항체(클론 145-2C11, BioLegend)의 유무에 관계없이 웰당 0.5 μg/ml의 최종 농도로 형질주입된 세포에 첨가하였다. T-세포를 형질주입된 세포에 첨가한 후 24시간 및 48시간에 100 μL의 공동배양 상층액을 유세포분석-기초 사이토카인 비드 어레이를 위해 웰에서 수합하였다. 형질주입된 골수 대식세포(BMM) 및 골수 대식세포/T-세포 공동배양물의 상층액을 각각 뮤린 항바이러스 및 뮤린 Th1 특이적 사이토카인 비드 어레이를 사용하여 사이토카인 함량에 대해 분석하였다.
아래 표에서 볼 수 있듯이 muSTING-R283G를 인코딩하는 플라스미드만 대식세포에서 CXCL10 생산을 이끌어낸 한편, muIL-12p70을 인코딩하는 플라스미드 단독 또는 다른 단백질과 함께 공동배양된 T-에서 가장 높은 수준의 IFNγ를 이끌어내었다. CD3ε 자극으로 인한 배경 양보다 더 많은 세포. muIL-12p70 + muIL-18 + muSTING-R283G의 조합은 대식세포로부터의 CXCL10 생산과 공동배양된 T-세포로부터의 IFNγ 생산을 모두 유도할 수 있었다.
이러한 데이터는 단일 플라스미드에서 다중 면역조절 페이로드를 발현할 수 있는 가능성과 이러한 조합의 상승작용 활성을 보여준다.
Figure pct00050
병용 면역요법은 결장직장 선암종의 뮤린 모델에서 증강된 항종양 활성을 실증한다
사이토카인 조합의 종양-특이적 전달이 항종양 효능을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해 muIL-12p70, muIL-18 및 muSTING-R283G(CMV-muIL-12p70_T2A_ muIL-18 + EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)는 결장직장 선암종의 MC38 뮤린 모델에서 평가되었다. 이 연구를 위해 6-8주령 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5마리 마우스)에 MC38 결장직장 선암종 세포(100 μL PBS에서 5x105 세포)를 우측 옆구리에 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에게 muIL-12p70, muIL-18 및 muSTING-R283G(CMV-muIL-12p70_T2A_muIL-18 + EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB의 1x107 CFU를 또는 PBS 비히클 대조군과 함께 10일째에 IV 주사하였다.
병용 요법은 초기 체중 감소가 3.6%로 3일 후에 완전히 회복되어 내약성이 매우 우수하였다. 이는 이러한 사이토카인(IL-12p70 및 IL-18)의 전신 투여에서 관찰된 독성과 현저한 대조를 이룬다. PBS 대조군과 비교하여 병용 요법은 매우 효과적이고 치유적이었다(92.3% TGI, 60% 치료율, 30일째). 이러한 데이터는 본원에 기재된 면역자극성 박테리아 균주를 사용하여 종양-특이적 방식으로 사이토카인 조합을 전달하는 효능 및 안전성을 실증한다.
실시예 15
STING, RIG-I, MDA5, IRF3, IRF7, 및 다른 인터페론 경로 유전자에서 향상된 기능-획득 돌연변이를 식별하기 위한 단백질 조작 스크리닝
항시적으로 활성이고 인터페론병증을 촉진하는 기능-획득(GOF) 아미노산 돌연변이는 인간에서 확인된다. 많은 GOF 돌연변이는 유전자의 특정 위치에서 아미노산 코돈을 변경하는 단일 염기쌍 뉴클레오타이드 변화로 인해 발생한다. 예를 들어, STING에서 V147L 돌연변이는 c.439G->C에서의 돌연변이로 인해 발생한다. N154S는 c.461A->G에서의 돌연변이로 인해 발생한다. 그리고 V155M은 c.463G->A에서의 돌연변이로 인해 발생한다. 스크리닝의 목적은 높은 수준의 유형 I 인터페론 발현을 유도하는 항시적으로 활성인 돌연변이체를 확인하는 것이었다. 인간 환자에서 돌연변이되었을 때 인터페론병증을 촉진하는 것으로 알려진 부위에서 설계된 돌연변이는 더 많은 수의 아미노산 치환을 시험할 수 있다. 이 예에서 설계된 아미노산을 사용한 부위 지정 돌연변이유발은 알려진 돌연변이(아래 표 참조, 인터페론병증을 촉진하는 유전자의 돌연변이 나열)의 위치에서 수행되어 높은 수준의 유형 I 인터페론 발현을 유발하는 활성이 강화된 돌연변이를 식별한다.
Figure pct00051
Figure pct00052
SEQ ID NO: 305-309로 표시된 인간 STING의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 R197, D205, R310, R293, T294, E296, S272, Q273, E316, D231, R232, K236, S358, E360, S366 및 R238은 SEQ ID NO: 369로 표시된 뮤린 STING의 서열을 기준으로 각각 아미노산 잔기 R196, D204, R309, R292, T293, E295, S271, Q272, E315, D230, R231, K235, S357, E359, S365 및 R237에 상응한다.
PCR 프라이머는 유전자의 상동성 cDNA 서열이 있는 5' 및 3' 말단에 설계된 치환으로 생성된다. QuikChange® 부위-특정 돌연변이형성 키트(Agilent) 또는 다른 유사한 상용 키트를 사용하여 설계된 돌연변이를 포함하는 PCR 생성물을 생성한다. PCR 증폭된 플라스미드는 DpnI로 처리된 다음 유능한 이. 콜라이 세포에 전기천공된다. 개별 클론을 분리하고 플라스미드 미니 준비를 수행하고 원하는 돌연변이의 서열 동일성을 확인한다. 그 후에, 더 큰 규모의 플라스미드 준비가 수행되고(Qiagen 키트 사용) DNA가 내인성 STING을 포함하지 않는 HEK293T STING 리포터 세포(InvivoGen)에 형질주입된다. 이러한 세포는 내인성 IFN-β 프로모터의 제어 하에 있는 분비된 루시퍼라제인 Lucia™ 루시퍼라제를 발현한다. IFN-β의 인코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 Lucia™ 루시퍼라제 ORF로 대체되었다. 항시적으로 활성화된 돌연변이체는 루시페라제 활성의 IFN-β 프로모터 유도 발현의 측정에 의해 확인되고 순위가 매겨진다.
실시예 16
살모넬라 티피무리움 에서의 결실에 상응하는 비활성화 결실을 갖는 면역자극성 박테리아의 다양한 종
상기 실시예는 면역 상주 골수성 세포 및 종양 미세환경에서 살모넬라 티피무리움의 표적화 및 축적을 증가시키고, 종양에 치료제/페이로드를 전달하고, 다른 세포 유형을 감염시키는 능력을 제거한다. 이러한 유전적 변형은 유사하게는, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이 다른 종에서 상응하는 유전자의 결실에 의해 다른 박테리아 균주 및 종에 도입될 수 있다.
에스케리키아 콜라이
lpxM, purM, asd, fliC, fliE, pagP, ansB 및 csgD 유전자의 프레임 내 염색체 결실은 Datsenko 및 Wanner에 기반한 기법을 사용하여 이. 콜라이 균주에서 순차적으로 제조하였다(Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000)). 이. 콜라이의 유전자는 하기와 같다:
1) lpxM, 미리스토일-아실 담체 단백질-의존적 아실트랜스퍼라제를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 945143];
2) purM, 포스포리보실포르밀글리신아미드 사이클로-리가제를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 946975];
3) asd, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 947939];
4) fliC, 편모 필라멘트 구조 단백질을 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 949101];
5) fliE, 편모 기저체 단백질 FliE를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 946446];
6) pagP, 지질 IVA 팔미토일트랜스퍼라제를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 946360];
7) ansB, L-아스파라기나제 2를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 947454];
8) csgD, DNA-결합 전사 이중 조절자 CsgD를 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 949119]; 및
9) rpsM, 30S 리보솜 하위단위 단백질 S13(프로모터)을 인코딩함[이. 콜라이 균주 K-12, 하위균주 MG1655; NCBI 유전자 ID: 947791].
간단히 말해서, 특정 염색체 서열은 상동성 아암에 의해 플랭킹된 선택 가능한 항생제 내성 마커로 대체되고, 이후 cre/loxP 시스템에 의해 제거된다. 각각의 표적 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 서열이 확인되고 항생제 내성 유전자의 반대면에 있는 플라스미드 벡터에 클로닝된다. 항생제 내성 유전자와 측면 5' 및 3' 상동성 아암을 포함하는 유전자 결실 카세트는 PCR 증폭되고, 겔 정제되고, 전기천공에 의해 이. 콜라이 균주에 도입된다. 전기천공된 세포를 회수하고 항생제 플레이트에서 형질전환체를 선택한다. 그 후에, 항생제 마커는 cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 처리되며, 여기서 항생제 내성 클론은 cre-발현 온도 의존성 플라스미드로 형질전환된다. 콜로니는 30℃에서 선택되고 42℃에서 연속 계대에 의해 제거된 다음 항생제 내성 손실에 대해 스크리닝된다. 항생제 감수성 클론은 콜로니 PCR 및 서열 분석에 의해 유전자 결실에 대해 확인된다.
내성 증가 또는 인간 보체에 내성이 있는 에스케리키아 콜라이 렌더링
이. 콜라이 △lpxM/△purM/△asd/△fliC/△fliE/△pagP/△ansB/△csgD에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail(부착 침입 좌위) 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE(외막 세린 프로테아제) 유전자의 발현은 플라스미드에서 이. 콜라이 또는 에스. 티피무리움 rpsM과 같은 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하여(asd 보체 시스템 호환 가능) 또는 박테리아 염색체에 삽입하여(lpxM, purM, asd, fliC, fliE, pagP, ansB 또는 csgD 좌위 중 하나에서) 달성된다.
살모넬라 티피
msbB, purM, asd, fliC, flgB, pagP, ansB 및 csgD 유전자의 프레임 내 염색체 결실은 이. 콜라이-기초 균주에 대해 상기 기재된 기술을 사용하여 에스. 티피 균주에서 순차적으로 이루어진다.
에스. 티피 △msbB/△purM/△asd/△fliC/△flgB/△pggP/△ansB/△csgD 균주에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE 유전자의 발현은 플라스미드(asd 보체 시스템 호환)에서 에스. 티피무리움 또는 에스. 티피 rpsM과 같은 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하거나 박테리아 염색체에 삽입하여 달성된다(msbB, purM, asd, fliC, flgB, pagP, ansB 또는 csgD 좌위 중 하나에서). 에스. 티피의 유전자는 하기와 같다:
1) msbB(STY2097), 지질 A 아실트랜스퍼라제를 인코딩함[살모넬라 엔테리카하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1248440];
2) purM(STY2740), 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1249054];
3) asd(STY4271), 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1250488];
4) fliC(STY2167), 플라젤린을 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1248507];
5) flgB(STY1213), 편모 기저체 간상체 단백질 FlgB를 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1247617];
6) pagP(STY0677), 항미생물 펩타이드 내성 및 지질 A 아실화 단백질을 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1247137];
7) ansB(STY3259), L-아스파라기나제를 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1249541];
8) csgD(STY1179), 조절 단백질 CsgD를 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1247585]; 및
9) rpsM(STY4380), 30S 리보솜 하위단위 단백질 S13(프로모터)을 인코딩함[살모넬라 엔테리카 하위종 엔테리카 혈청 변이형 티피, 균주 CT18; NCBI 유전자 ID: 1250594].
리스테리아 모노사이토게네스
리스테리아 모노사이토게네스에서 purA, purQ, purS, asd, flaA, fliC, flgB 및 ansB 유전자의 프레임 내 염색체 결실은 항생제 내성을 부여하는 pKSV7과 같은 온도에 민감한 셔틀 벡터를 사용하는 대립형질 교환 기술에 의해 달성된다. 저온(30℃)에서는 복제가 가능하지만 고온(43℃)에서는 복제할 수 없다. 각각의 표적 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 확인하고 pKSV7 벡터에 동시에 클로닝한다. 이 벡터는 수용체 리스테리아 모노사이토게네스로 형질전환되고 항생제가 있는 한천 플레이트에 평판배양하여 선택된다. 플라스미드의 염색체 통합은 선택 하에 42℃에서 항생제 내성 형질전환체의 연속 계대에 의해 유도된다. 후속적으로 30℃에서 균주를 계대 배양하면 플라스미드가 제2 교차 이벤트를 통해 절제되어 원래의 야생형 유전자로 복귀하거나 5' 및 3' 플랭킹 서열 상동성 아암이 통합되는 세포의 하위 집단이 생성되어, 표적 결실 돌연변이를 생성한다. 항생제 감수성 클론은 이 단계에서 콜로니 PCR 및 서열 분석에 의해 스크리닝된다.
보체 내성을 증가시키기 위해 리스테리아 모노사이토게네스 △purA/△purQ/△purS/△asd/△flaA/△fliC/△flgB/△ansB 균주에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE 유전자의 발현은 플라스미드(asd 보체 시스템 호환)에서 Phyper 또는 P헬퍼와 같은 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하거나 박테리아 염색체에 삽입하여 달성된다(purA, purQ, purS, asd, flaA, fliC, flgB 또는 ansB 좌위 중 하나에서). 엘. 모노사이토게네스의 유전자는 하기와 같다:
1) purA (lmo0055), 아데닐로숙시네이트 합성효소를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 986069];
2) purQ (lmo1769), 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 II를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 985972];
3) purS (lmo1771), 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 하위단위 PurS를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 985970];
4) asd (lmo1437), 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 986492];
5) flaA (lmo0690), 플라젤린을 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 987167];
6) fliE (lmo0712), 편모 후크-기저체 단백질 FliE를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 985062];
7) flgB (lmo0710), 편모 기저체 간상체 단백질 FlgB를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID 985059]; 및
8) ansB (lmo1663), 아스파라긴 합성효소를 인코딩함[리스테리아 모노사이토게네스 균주 EGD-e; NCBI 유전자 ID: 985663].
msbB 및 pagP 유전자는 그람 양성 박테리아인 리스테리아 모노사이토게네스에 없다. CsgD는 리스테리아 모노사이토게네스에도 존재하지 않는다. 대신, 리스테리아는 생물막 형성에 관여하는 리스테리아 셀룰로스 결합 단백질을 인코딩하는 lcp를 발현하며, 이 또한 결실될 수 있다.
비피도박테리움 롱검
비피도박테리움 롱검에서 BL1122(purM), BL0492(asd) 및 BL1142(L-아스파라기나제 전구체 인코딩)의 프레임 내 염색체 결실은 조건부 복제 벡터가 있는 비호환 플라스미드 벡터 시스템을 사용하는 대립형질 교환 기술에 의해 달성된다. pBS423-△repA와 같은 플라스미드 복제 유전자인 repA는 처음에 게놈에 통합되어 항생제 내성을 제공한다. repA 유전자를 인코딩하는 pTBR101-CM과 같은 제2 플라스미드는 후속적으로 형질전환되고 초기 통합체의 절제를 선택하는 제2 교차 이벤트를 촉진한다. 각각의 표적 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 서열이 확인되고 repA가 없는 조건부 복제 벡터에 나란히 복제되고 비피도박테리움 롱검 △BL1122/△BL0492/△BL1142 균주로 형질전환된다. 교차 재조합 이벤트는 상동성 아암 서열에서 발생할 수 있으며 성공적인 플라스미드 통합체가 항생제 플레이트에 대해 선택되고 분리된다. 그 후에, 통합체는 repA의 기능적 사본을 인코딩하는 비호환성 플라스미드로 형질전환되며, 이는 제2 교차 이벤트 및 repA 결핍 플라스미드의 절두를 촉진하며, 이는 플라스미드 비호환성으로 인해 후속적으로 손실된다. 게놈 결실은 콜로니 PCR 및 서열 분석에 의해 확인되고, 나머지 플라스미드는 선별 및 후속 Rif 처리를 제거함으로써 경화된다.
비피도박테리움 롱검 △BL1122/△BL0492/△BL1142 균주에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE 유전자의 발현은 플라스미드(asd 보체 시스템 호환)에서 P갭과 같은 강한 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하거나 박테리아 염색체에 삽입하여 달성된다(BL1122, BL0492 또는 BL1142 좌위 중 하나에서). 비피도박테리움 롱검의 유전자는 하기와 같다:
1) purM (BL1122), 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩함[비피도박테리움 롱검 균주 NCC2705; NCBI 유전자 ID: 1022669];
2) asd (BL0492), 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 인코딩함[비피도박테리움 롱검 균주 NCC2705; NCBI 유전자 ID: 1023089];
3) BL1142, L-아스파라기나제 전구체를 인코딩함(Ntn_아스파라기나제_2_유사; NTN-하이드롤라제 슈퍼계열의 L-아스파라기나제 유형 2-유사 효소)[비피도박테리움 롱검 균주 NCC2705; NCBI 유전자 ID: 1023120]; 및
4) BL1363 갭(프로모터)[비피도박테리움 롱검 균주 NCC2705; NCBI 유전자 ID: 1022828].
비피도박테리움 롱검은 운동성이 없고 플라젤린이 결핍되어 있으며 그람 양성이고 msbB와 pagP가 결여되어 있다. ansB 유전자가 존재하지만, 아스파르테이트로부터 푸마레이트 형성을 촉매하는 아스파르테이트 암모니아-리아제를 인코딩한다(aspA/ansB)[BL0338, 비피도박테리움 롱검 균주 NCC2705; NCBI 유전자 ID: 1023259].
클로스트리디움 노비
NT01CX_RS09765, NT01CX_RS07625 및 NT01CX_RS04325(asd)의 프레임 내 염색체 결실; 플라젤린 유전자 NT01CX_RS04995, NT01CX_RS04990, NT01CX_RS05070, 및 NT01CX_RS05075; 및 클로스트리디움의 편모 기저체 간상체 단백질 유전자 NT01CX_RS05080(flgB), NT01CX_RS05085(flgC) 및 NT01CX_RS05215(flgG)는 독소-항독소 프로모터를 포함하는 역선택 방법을 요구하는 대립유전자 교환 기술에 의해 달성되며, 이는 이. 콜라이 mRNA 인터페라제 mazF와 같은 유도적 프로모터 및 독성 유전자를 필요로 한다. 각각의 표적 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 서열은 대립형질 교환 역선택-함유 벡터에서 frt-플랭킹된 항생제 내성 카세트의 반대 면에 있는 구성으로 식별되고 클로닝되며, 클로스트리디움 노비로 형질전환된다. mazF 유전자는 대립형질 교환 벡터의 유도성 lac 프로모터의 제어 하에 인코딩되며, 유당이 보충된 한천 플레이트에서 성장에 의한 이중 교차 이벤트의 선택을 허용한다. 게놈 결실은 콜로니 PCR 및 서열 분석에 의해 확인된다. 그 후에, Flp-frt 재조합을 사용하여 염색체에서 항생제 내성 카세트를 치료할 수 있다.
비피도박테리움 롱검 △BL1122/△BL0492/△BL1142 균주에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE 유전자의 발현은 플라스미드(asd 보체 시스템 호환)에서 P갭과 같은 강한 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하거나 박테리아 염색체에 삽입하여 달성된다(BL1122, BL0492 또는 BL1142 좌위 중 하나에서). 비피도박테리움 롱검의 유전자는 하기와 같다:
클로스트리디움 노비 △NT01CX_RS09765/△ NT01CX_RS07625/△NT01CX_RS04325/△NT01CX_RS04995/△NT01CX_RS04990/△NT01CX_RS05070/△NT01CX_RS05075 /△NT01CX_RS05080/△NT01CX_RS05085/△NT01CX_RS05215 균주에서 살모넬라 티피무리움 rck(보체 사멸에 대한 내성) 유전자, 예르시니아 엔테로콜리티카 상동체 ail 또는 살모넬라 티피무리움 pgtE 유전자의 발현은 플라스미드(상용 가능한 asd 보체 시스템)상에서 Pthl, Pptb 또는 다른 변이체와 같은 강한 항시적 프로모터의 다운스트림 rck, ail 또는 pgtE 유전자 서열을 인코딩하거나 박테리아 염색체에 삽입하여 달성된다(NT01CX_RS09765, NT01CX_RS07625, NT01CX_RS04325, NT01CX_RS04995, NT01CX_RS04990, NT01CX_RS05070, NT01CX_RS05075, NT01CX_RS05080, NT01CX_RS05085, 또는 NT01CX_RS05215 중 임의의 것에서). 클로스트리디움 노비 유전자는 하기와 같다.
1) NT01CX_RS09765, AIR 합성효소를 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4541583];
2) NT01CX_RS07625, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 사이클로-리가제를 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4540669];
3) NT01CX_RS04325 (asd), 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4541762];
4) NT01CX_RS04995, 플라젤린을 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4541703];
5) NT01CX_RS04990, 플라젤린을 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4539984];
6) NT01CX_RS05070, 플라젤린을 인코딩함[클로스트리디움 노비 NT; NCBI 유전자 ID: 4539886];
7) NT01CX_RS05075, 플라젤린을 인코딩함[클로스트리디움 노비 NT; NCBI 유전자 ID: 4539699];
8) NT01CX_RS05080 (flgB), 편모 기저체 간상체 단백질 FlgB를 인코딩함[클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4540637];
9) NT01CX_RS05085 (flgC), 편모 기저체 간상체 단백질 FlgC를 인코딩함 [클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4540143]; 및
10) NT01CX_RS05215 (flgG), 편모 기저체 간상체 단백질 FlgG를 인코딩함 [클로스트리디움 노비 균주 NT; NCBI 유전자 ID: 4540245].
클로스트리듐 노비는 그람-양성이고, msbB 및 pagP가 결여되어 있다.
실시예 17
인간 STING보다 더 강한 유형 I IFN 신호전달 및/또는 더 약한 NF-κB 신호전달을 유도하는 척추동물 STING 변이체를 발현하도록 변형된 면역자극성 박테리아
STING 신호전달은 두 가지 신호 경로를 활성화한다. 제1 경로는 TANK 결합 키나제 1(TBK1)/IRF3 축으로, 유형 I IFN을 유도하고 수지상 세포(DC)를 활성화하고 종양 항원을 교차 제시하여 CD8+ T-세포-매개 항-종양 면역을 활성화시킨다. 제2 경로는 활성화된 B 세포(NF-κB) 신호전달 축의 핵 인자 카파-경쇄 증강 인자로, 전염증 반응을 유발하지만 항종양 면역력에 필요한 DC 및 CD8+ T-세포의 활성화에는 영향을 미치지 않는다. 박테리아-기초 암 면역 요법은 종양 항원 교차 제시 및 지속적인 항종양 면역력을 촉진하는 데 필요한 CD8+ T-세포를 모집하고 활성화하기 위해 유형 I IFN을 유도하는 능력이 제한적이다. 따라서, 유형 I IFN 신호전달을 유도 및/또는 증가시키고 NF-κB 신호전달을 감소시켜 CD8+ T-세포-매개 항종양 면역력의 유도를 증가시키고 박테리아의 치료 효능을 향상시키는 면역자극성 박테리아가 본원에 제공된다. 위에서 설명된 면역자극성 박테리아는 야생형 STING과 비교하여 유형 I IFN의 유도를 증가시키거나 유형 I IFN의 발현을 항시적으로 만들 수 있는 STING의 기능-획득 돌연변이인 변형된 STING 단백질을 인코딩한다. 이 실시예에서(또한 상세한 설명에 기재됨), STING 단백질은 NF-κB 신호전달 활성을 감소 또는 제거하고, 유형 I IFN을 유도하는 능력을 유지하도록 변형되고, 및/또는 증가되거나 항시적인 유형 I IFN 발현에 대해 변형된다. 이는 항종양 면역력을 유도하고 일반적으로 박테리아 병원체에 의한 감염으로 인해 발생하는 NF-κB 신호를 유도하지(또는 덜 유도하는) 면역자극성 박테리아를 생성한다.
다른 종의 STING 단백질은 다른 수준의 유형 I IFN 및 NF-κB 신호전달 활성을 나타낸다. 예를 들어, 인간 및 마우스 세포에서 STING 신호전달은 강력한 유형 I IFN 반응 및 약한 전염증성 NF-κB 반응을 초래한다. 이와 비교하여 연어 및 제브라피쉬와 같은 지느러미가 있는 어류의 STING 신호전달은 주로 NF-κB-기초 반응의 강력한 활성화를 이끌어내며, 이는 IRF3-기초(즉, 유형 I IFN 유도) 반응과 비교하여 100배 이상 높다. 태즈메이니아 데빌과 같은 다른 종에서 STING 신호전달은 유형 I IFN 반응을 나타내지만 본질적으로 NF-κB 반응은 없다. 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 NF-κB 반응의 수반되는 유도 없이 유형 I IFN 반응을 유도하는 STING의 능력을 이용하기 위해 태즈메이니아 데빌 STING과 같은 비인간 종으로부터의 STING을 인코딩한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 비-인간 STING 단백질은 또한 돌연변이에 의해 변형되어 유형 I IFN 반응을 증가시키거나 이를 항시적으로 제공한다. 인간 STING에서 이러한 효과를 갖는 확인된 돌연변이는 비인간 STING 단백질에 도입된다. 상응하는 잔기는 정렬에 의해 식별된다.
STING의 C-말단 테일(CTT)가 NF-κB 신호전달 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 제2(예를 들어, 비인간) 종의 STING 단백질로부터의 CTT로 인간과 같은 한 종에서 대체된 키메라가 또한 제공된다. CTT는 STING 인산화 및 IRF3 모집에 필요한 서열 모티프를 포함하는 약 40개 아미노산의 구조화되지 않은 스트레치이다. 유형 I IFN과 NF-κB 신호전달 간의 균형을 변경하여 다운스트림 면역을 형성할 수 있다. 이는 IRF3, TBK1 및 TRAF6 결합 모듈을 포함하여 CTT의 독립적인 모듈을 통해 제어된다. 예를 들어, 인간 STING 잔기 S366(예를 들어, SEQ ID NO: 305-309 참조)은 CTT에서 LxIS 모티프의 일부인 1차 TBK1 인산화 부위이며, 이는 IRF3 결합에 필요한 반면, 제2 PxPLR 모티프는, 잔기 L374를 포함하여 TBK1 결합에 필요하다. LxIS 및 PxPLR 모티프는 모든 척추동물 STING 대립유전자에서 고도로 보존된다. 예를 들어, 인간 STING의 CTT를 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 교체하면 유형 I IFN 반응을 유도하지만 NF-κB 반응은 유도하지 않는 STING 변이체가 생성된다.
이 실시예에서, 면역자극성 박테리아는 야생형(WT) 인간 STING과 비교하여 증가된 유형 I IFN 신호전달 및/또는 감소된 NF-κB 신호전달을 갖는 STING 변이체를 발현하도록 조작된다(예를 들어, SEQ ID NO: 305-309 참조). STING 변이체는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류와 같은 인간이 아닌 척추동물에서 유래할 수 있다. 비-인간 STING 단백질이 유래된 종에는 태즈메이니아 데빌(사르코필루스 하리시이; SEQ ID NO: 349), 마모셋(칼리트릭스 야쿠스; SEQ ID NO: 359), 소(보스 타우루스; SEQ ID NO: 360), 고양이(펠리스 카투스; SEQ ID NO: 356), 타조(스트루티오 카멜루스 오스트랄리스; SEQ ID NO: 361), 따오기(니포니아 니폰; SEQ ID NO: 362), 실러캔스(라티메리아 칼룸내, SEQ ID NO: 361) ID NOs:363-364), 야생돼지(수스 스크로파; SEQ ID NO: 365), 박쥐(로우세투스 애깁티아쿠스; SEQ ID NO: 366), 바다소(트리케쿠스 마나투스 라티로스트리스; SEQ ID NO: 367), 은상어(칼로린쿠스 밀리이) ; SEQ ID NO: 368), 및 마우스(무스 무스쿨루스; SEQ ID NO: 369)가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 척추동물 STING 단백질은 인간 세포에서 면역 신호전달을 쉽게 활성화하여 STING 신호전달의 분자 기전이 척추동물에서 공유됨을 나타낸다(예를 들어, de Oliveira Mann 등 (2019) Cell Reports 27:1165-1175 참조). 이러한 종의 STING 단백질은 인간 STING보다 적은 NF-κB 신호 활성화 및/또는 더 많은 유형 I IFN 신호 활성화를 유도한다(예를 들어, de Oliveira Mann 등 (2019), 도 1a 참조). 상이한 비-인간 종으로부터의 야생형 또는 변형된 STING 단백질은 인간 및 비-인간 STING 단백질의 키메라와 같이 본원의 면역자극성 박테리아에 의해 발현될 수 있다.
다양한 비-인간 STING 단백질이 변형되어 비-인간 STING이 인간 STING보다 더 낮은 NF-κB 활성화 및 선택적으로 더 높은 유형 I 인터페론 활성화를 갖는다. 이러한 비인간 STING 단백질은 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하도록 변형되어 세포질 핵산 리간드(예를 들어, CDN)의 부재 하에 증가된 유형 I IFN 활성을 갖거나 항시적으로 작용한다. 돌연변이는 일반적으로 인간의 인터페론병증과 관련된 기능-획득 돌연변이와 같은 아미노산 돌연변이이다. 상응하는 돌연변이는 비인간 종 STING 단백질에 도입되고, 여기서 상응하는 아미노산 잔기는 정렬에 의해 확인된다. 예를 들어, 돌연변이에는 SEQ ID NO: 305-309에 기재된 인간 STING의 서열을 기준으로 S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, 및 S324A/S326A가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 다른 종의 STING에 해당하는 돌연변이가 아래 표에 나열되어 있다. 비-인간 STING 단백질의 생성된 변이체는 이러한 돌연변이 중 하나 이상, 및 임의로 CTT 대체, 및 임의로 TRAF6 결합 부위의 결실을 포함한다.
STING 변이체는 인산화 부위에서 아미노산 세린(S) 또는 트레오닌(T)을 인산화 유사체인 아스파르트산(D)으로 하나 이상 대체하여 활성을 증가시키거나 구성하는 것을 포함한다. 다른 돌연변이에는 STING에서 324-326 SLS -> ALA와 같은 인산화 부위 또는 부위의 결실 또는 교체, 및 STING에서 NF-κB 신호전달을 감소시키기 위해 인산화 부위를 제거하기 위한 다른 교체가 포함된다. 추가로, 다른 종의 STING이 있는 인간 STING의 키메라가 제공되며, 여기서 인간 STING의 C-말단 테일(CTT)는 더 낮은 NF-κB 신호 활성 및/또는 더 높은 수준을 갖는 다른 종의 STING의 CTT로 대체된다. 유형 I IFN 신호 활성. 변이체 STING 단백질은 NF-κB 신호전달을 감소시키기 위해 CTT의 TRAF6 결합 부위에 결실을 포함할 수 있다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
예를 들어, 변형된 STING 변이체는 돌연변이 C206Y(SEQ ID NO: 350) 또는 R284G(SEQ ID NO: 351)를 갖는 태즈메이니아 데빌 STING; 인간 STING의 CTT가 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체된 변이체(SEQ ID NO: 352); 돌연변이 C206Y(SEQ ID NO: 353) 또는 R284G(SEQ ID NO: 354)를 갖는 인간 STING, 여기서 CTT는 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체됨; TRAF6 결합 도메인(잔기 377-379(DFS)에 상응함)에 결실이 있는 야생형 인간 STING(SEQ ID NO: 355); 돌연변이 C205Y(SEQ ID NO: 357) 또는 R283G(SEQ ID NO: 358)를 갖는 고양이 STING; 및 다른 이러한 변형된 STING 변이체가 포함된다.
STING 돌연변이에 대한 상응하는 아미노산 잔기를 결정하기 위해, 다양한 비인간 종의 야생형 STING 단백질 서열 각각을 야생형 인간 STING 단백질 서열(SEQ ID NO: 305(R232)의 대립유전자 변이체의 대립형질) 또는 SEQ ID NO: 306(H232 대립형질)). ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/에서 사용 가능한 Kalign 서열 정렬 도구 또는 ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/에서 사용 가능한 EMBOSS 바늘 서열 정렬 도구를 사용하여 정렬을 수행하였다. 도 2 내지 14는 각각 태즈메이니아 데블, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 따오기, 실러캔스, 제브라피쉬, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 은상어 및 마우스 종의 STING 단백질과 비교한 인간 STING에 대한 예시적인 서열 정렬을 묘사한다.
STING GOF 하이브리드 변이체는 수지상 세포에서 NF-κB에 대한 유형 I 인터페론의 활성 비율이 크게 향상되었음을 보여준다.
마우스에서 최고 수준의 CD8+ T-세포 케모카인 CXCL10을 이끌어내는 최적의 STING GOF 돌연변이를 결정하기 위해 STING 돌연변이 패널을 뮤린 1차 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서 시험하였다. 여기에는 항시적으로 활성인 인간 GOF 돌연변이 C206Y(tazSTING C206Y; SEQ ID NO: 350) 또는 R284G(tazSTING R284G; SEQ ID NO: 351)가 있는 태즈메이니아 데빌 STING; 항시적 GOF 돌연변이 C205Y(muSTING C205Y) 또는 R283G(muSTING R283G)를 갖는 뮤린 STING; 항시적 GOF 돌연변이체 C205Y(catSTING C205Y; SEQ ID NO: 357) 또는 R283G(catSTING R283G; SEQ ID NO: 358)를 갖는 cat STING; 뿐만 아니라 인간 STING의 CTT(SEQ ID NO: 370)가 태즈메이니아 데빌 STING(SEQ ID NO: 371)의 CTT로 대체되고 야생형 인간 STING(huSTING tazCTT; 참조, 예를 들어, , SEQ ID NO: 352), 또는 인간 STING GOF 돌연변이 C206Y(huSTING C206Y tazCTT; 예를 들어, SEQ ID NO: 353 참조), 또는 R284G(huSTING R284G tazCTT; 예를 들어, SEQ ID NO: 354 참조). 또한 항시적 GOF 돌연변이 C206Y(huSTING C206Y) 또는 R284G(huSTING R284G)를 갖는 인간 STING 변이체가 포함되었다.
이를 시험하기 위해 뮤린 골수를 분리하고 1.5 mL Eppendorf 튜브에 플러싱하고 5분 동안 1200RPM으로 회전하여 골수성 세포를 수집하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에서 1회 세척한 다음, RPMI-1640 + 10% FBS 및 20 ng/mL GM-CSF의 96웰 TC 처리 플레이트에 시딩하였다. 2일마다 배지의 50%를 새로운 완전 배지로 교체하였다. 6일 후, 비부착 세포를 웰에서 피펫으로 분리하고 형질주입을 위해 96웰 플레이트에서 RPMI-1640 + 10% FBS에서 웰당 1e5 세포로 다시 시딩하였다. 세포는 제조업체의 설명서에 따라 Viromer® RED를 사용하여 형질주입되었다. 간단히 말해서, STING GOF 돌연변이 패널의 플라스미드 DNA 200ng 및 형질주입되지 않은 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고 Viromer® RED 0.08 μL와 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 DNA/Viromer® RED 복합체를 형성한다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 천천히 첨가하고(2벌 중복으로) 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 상층액을 48시간에 수합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 유세포분석-기초 사이토카인 비드 어레이(CBA)를 사용하여 쥐 CXCL10(IP-10)에 대해 분석하였다.
하기 표에 나타난 바와 같이, 뮤린 CXCL10의 가장 높은 발현을 유도한 작제물은 GOF 돌연변이 R284G를 포함하고 인간 STING의 CTT를 태즈메이니아 데빌 STING(huSTING R284G tazCTT)의 CTT로 대체한 인간 STING이었다. CXCL10의 다음으로 높은 발현은 GOF 돌연변이 C206Y(huSTING C206Y)를 포함하는 인간 STING 변이체 및 인간 STING GOF 돌연변이 R284G(tazSTING R284G)를 포함하는 태즈메이니아 데빌 STING 작제물에 의해 유도되었다. 인간 STING GOF 돌연변이체(huSTING C206Y 및 huSTING R284G)는 상응하는 뮤린 STING GOF 돌연변이체(각각 muSTING C205Y 및 muSTING R283G)보다 더 강력하였으며, 이는 1차 뮤린 수지상 세포에서 동일한 GOF 돌연변이를 포함하는 고양이 STING 돌연변이체(각각 catSTING C205Y 및 catSTING R283G)보다 훨씬 덜 강력하였다.
Figure pct00056
이 데이터는 태즈메이니아 데빌과 같은 다른 종에서 얻은 STING 단백질이 항시적 GOF 인간 STING 돌연변이와 결합되어 강력한 T-세포 모집 케모카인을 이끌어낼 수 있음을 보여준다.
STING GOF 하이브리드 변이체는 인간 단핵구에서 NF-κB에 대한 유형 I 인터페론의 활성 비율이 크게 향상됨을 보여준다
다른 종의 STING GOF 하이브리드 변이체를 사용하여 NF-κB 신호에 대한 STING 유도 유형 I 인터페론의 비율을 변경할 수 있음을 입증하기 위해 인간 단핵구 세포주에서 패널을 시험하였다. 패널에는 야생형 인간 STING(huSTING) 및 항시적 인간 GOF 돌연변이 C206Y 또는 R284G를 갖는 huSTING 돌연변이; 야생형 태즈메이니아 데빌 STING(tazSTING), 및 항시적 GOF 돌연변이 C206Y 또는 R284G를 갖는 tazSTING 돌연변이; 야생형 고양이 STING, 및 항시적 GOF 돌연변이 C205 또는 R283G를 갖는 catSTING 돌연변이체; 항시적 GOF 돌연변이 C205Y, 또는 R283G를 갖는 뮤린 STING 돌연변이체; 및 인간 STING의 CTT가 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체되고 야생형 인간 STING 또는 인간 GOF STING 돌연변이 C206Y 또는 R284G를 포함하는 변이체가 포함되었다. TRAF6 결합 도메인(잔기 377-379, DFS에 상응, 예를 들어, SEQ ID NO: 355 참조)에 결실이 있는 야생형 인간 STING 및 야생형 제브라피쉬 STING도 포함되었다.
본 실험에서는 내인성 STING이 결여되고 내인성 IFN-β 프로모터의 제어 하에 있는 분비형 루시페라아제인 Lucia™ 루시퍼라제를 발현하도록 변형된 THP1-Dual™ KO STING 세포를 사용하였다. 그 후에, 항시적으로 활성인 STING GOF 돌연변이를 확인하고 루시페라제 활성의 IFN-β 프로모터 유도 발현을 측정하여 순위를 매겼다. 이 세포는 또한 내인성 NF-κB 프로모터의 제어 하에 있는 분비된 배아 알칼리성 인산분해효소(SEAP)를 발현하며, 여기서 NF-κB의 인코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 SEAP ORF로 대체되었다. STING GOF 돌연변이에 의해 유도된 NF-κB 활성은 세포 상층액에서 SEAP 생산을 모니터링하여 평가할 수 있다.
이 실험을 위해 제조업체의 설명서에 따라 Viromer® RED를 사용하여 THP1-Dual™ KO STING 세포를 형질주입하였다. 간단히 말해서, STING GOF 돌연변이 패널의 플라스미드 DNA 200ng 및 형질주입되지 않은 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고 Viromer® RED 0.08 μL와 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 DNA/Viromer® RED 복합체를 형성한다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 천천히 첨가하고(2벌 중복으로) 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 또한, 야생형 STING 변이체는 임상 화합물 ADU-S100의 유사체인 STING 작용제 3'5' RpRp c-디-AMP(CDN, InvivoGen)의 유무에 관계없이 처리되었으며, 이는 10 μg/mL에서 24시간 배양하였다. 상층액을 48시간에 수합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 NF-κB-SEAP 및 IFN-Lucia 리포터 신호에 대해 분석하였다. 간단히 말해서, 10 μL의 세포 배양 상층액을 50 μL QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen)(SEAP 측정에 사용됨)에 첨가하였다. NF-κB 활성화는 650 nm의 흡광도(Abs) 파장에서 SpectraMax® M3 분광 광도계(Molecular Devices)에서 NF-κB 유도 SEAP 활성을 측정하여 결정되었다. IFN-Lucia에서 유형 I 인터페론 활성을 측정하기 위해 SpectraMax® M3 광도계를 사용하여 정량화되고 상대 광도 단위(RLU)로 표시된 광 신호를 생성하는 루시페라제 반응을 위한 코엘렌테라진 기질을 포함하는 50 μL QUANTI-Luc™에 10 μL의 세포 배양 상층액을 첨가하였다.
아래 표와 같이 인간 STING의 CTT가 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체되고 인간 STING GOF 돌연변이 R284G(huSTING R284G tazCTT)를 함유한 변이체, 뿐만 아니라 CDN STING 작용제를 사용한 야생형 제브라피시 STING(zfSTING WT + CDN)으로부터 가장 높은 유형 I IFN 반응이 관찰되었다. 그러나, 매우 높은 NF-κB 신호전달을 갖는 야생형 제브라피쉬 STING과 달리, huSTING R284G tazCTT 변이체는 훨씬 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성과 함께 높은 유형 I IFN 신호전달을 가졌다. 더 낮은 NF-κB 신호전달에 대한 더 높은 유형 I IFN의 가장 좋은 비율은 인간 STING GOF 돌연변이 R284G(tazSTING R284G)를 포함하는 태즈메이니아 데빌 STING 변이체에서 발견되었다.
Figure pct00057
이 데이터는 인간 단핵구에서 면역억제성 NF-κB 활성을 최소화하면서 유익한 유형 I 인터페론 활성을 향상시키기 위해 태즈메이니아 데빌의 STING 단백질과 같은 비인간 STING 단백질을 사용하고 인간 항시적 기능-획득 STING 돌연변이와 결합하는 것을 추가로 보여준다.
실시예 18
lppA 및 lppB 유전자의 결실에 의한 에스. 티피무리움 지질단백질 넉아웃
Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 유전자 결실을 함유하는 약독화된 생 에스. 티피무리움 YS1646 균주는 막 표면 지질단백질을 제거하기 위해 lppA(SEQ ID NO: 387) 및 lppB(SEQ ID NO: 388)를 결실시키도록 조작되었다. 이는 면역억제성 사이토카인을 감소시키고 항종양 적응 면역력을 향상시키는 전염증성 TLR2 활성화를 감소시킨다. 하기에 나타낸 바와 같이, 이는 또한 종양에서 플라스미드 전달 및 인코딩된 단백질 발현을 향상시킨다.
스트레인 조작 및 특성화
lppA 유전자의 결실
lppA 유전자는 Datsenko 및 Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000))의 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주의 염색체에서 결실되었다. lppA 유전자를 플랭킹하는 각각 231개 및 200개 염기의 좌측 및 우측 서열을 함유하는 합성 lppA 유전자 상동성 아암 서열을 합성하고 pSL0148(SEQ ID NO: 231)이라고 하는 플라스미드로 클로닝하였다. lppA 유전자에 대한 서열은 SEQ ID NO: 387에 제시되어 있고; PCR 증폭을 위한 적절한 프라이머는 유전자 서열을 사용하여 설계되었다. 그 후에, cre/loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 플라스미드 pSL0148에 클로닝하고 lppA 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 lppA-1 및 lppA-2로 PCR 증폭하고 겔 정제한 다음 온도에 민감한 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD에 전기천공법에 의해 도입하였다. 전기천공된 세포를 SOC + DAP 배지에서 회수하고, 카나마이신(20 μg/mL) 및 디아미노피멜산(DAP, 50 μg/mL)이 보충된 LB 한천 플레이트에 평판배양하였다. 프라이머 lppA-3 및 lppA-4를 사용하여 PCR에 의해 넉아웃 단편의 삽입에 대해 콜로니를 선택하고 스크리닝하였다. 그 후에, pKD46은 선택된 카나마이신 내성 균주를 42℃에서 배양하고 앰피실린 내성 손실을 스크리닝하여 경화되었다. 그 후에, 카나마이신 내성 마커는 Cre 재조합효소(pJW168)를 발현하는 온도 민감성 플라스미드의 전기천공에 의해 경화되었고, AmpR 콜로니는 30℃에서 선택되었다. pJW168은 이후에 42℃에서 배양물을 성장시킴으로써 제거되었다. 선택된 lppA 넉아웃 클론은 방해 부위(lppA-3 및 lppA-4)을 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 카나마이신 마커의 손실에 대해 시험하고 전기영동 이동성의 평가를 아가로스 겔에서 수행하였다. 균주 YS1646의 이 돌연변이 유도체는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppA로 지정되었다.
lppB 유전자의 결실
그 후에, 상기 기재된 방법의 변형을 사용하여 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppA 균주에서 lppB 유전자를 결실시켰다. 각각 lppB 유전자를 플랭킹하는 224개 및 231개 염기의 좌측 및 우측 서열을 함유하는 합성 lppB 유전자 상동성 아암 서열을 합성하고 pSL0148(SEQ ID NO: 231)이라고 하는 플라스미드로 클로닝하였다. lppB 유전자에 대한 서열은 SEQ ID NO: 388에 제시되어 있고; PCR 증폭을 위한 적절한 프라이머는 유전자 서열을 사용하여 설계되었다. 그 후에, cre/loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 플라스미드 pSL0148에 클로닝하고, lppB 유전자 넉아웃 카세트를 프라이머 lppB-5 및 lppB-6으로 PCR 증폭하고, 겔 정제하고, 온도에 민감한 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppA에 전기천공법에 의해 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 상기 기재된 바와 같이 Cre-매개 재조합에 의해 경화되었고, 온도 민감성 플라스미드는 비허용 온도에서 성장에 의해 경화되었다. lppA 및 lppB 유전자 넉아웃 서열은 각각 lppA-3 및 lppA-4 및 lppB-7 및 lppB-8로 명명된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 균주 YS1646의 이 돌연변이 유도체는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB로 지정되거나 YS1646ΔlppAB로 별명을 붙였다.
조작된 에스. 티피무리움 지질단백질 넉아웃 균주의 시험관내 특성화
lppA 및 lppB가 결실된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB 균주를 LB에서 밤새 배양하여 성장에 대해 평가하였다. 37℃에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 OD600을 15분마다 판독하여 성장을 측정하였다. 결과는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB가 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주에 필적하는 성장률로 LB에서 복제할 수 있음을 입증하였다. 이 데이터는 지질단백질의 제거가 시험관 내 에스. 티피무리움의 적합성을 감소시키지 않는다는 것을 보여준다.
지질단백질 제거는 전신 투여 후 종양으로의 플라스미드 전달을 향상시킨다
TLR2가 혈관 내피 세포에서 발현되고 TLR2의 활성화가 혈관 투과성을 향상시킴에 따라, 종양 콜로니화에 대한 ΔlppAB 변형의 효과 및 TLR2 작용제의 후속 감소가 평가되었다. 페이로드 표현에 대한 영향도 평가되었다. 하기에 나타낸 바와 같이, 종양의 콜로니화는 다소 감소된 반면, 플라스미드 전달 및 인코딩된 유전자 발현은 전신 투여 후 유의하게 증가하였다.
삼중 음성 유방암의 쥐 모델에서 지질단백질 넉아웃 균주의 영향을 입증하기 위해 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스(군당 4마리)에 EMT6 세포가 있는 4번째 유선 지방 패드에 동소 접종하였다(100 μL PBS에서 5x105 세포). 10일 동안 확립된 옆구리 종양이 있는 마우스에 1 x107 CFU의 단일 용량의 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB 균주 또는 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주를 IV 주사하였으며, 각각은 CMV 프로모터의 제어 하에 분비되는(secNanoLuc®) 루시퍼라제 단백질(나노루시퍼라제® 루시퍼라제, 또는 NanoLuc®, Promega)을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. IV 투여 후 7일째에, 마우스를 안락사시키고 종양을 균질화하고 LB 플레이트에 평판배양하여 종양 조직 그램당 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 계산하였다. 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주는 종양 조직 그램당 평균 3.3 x106 CFU로 종양을 콜로니화한 반면, 지질단백질이 제거된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/Δlpp 균주는 1.18 x 106 CFUs/g 종양 조직의 2배 평균 감소로 종양을 콜로니화하였다.
종양으로의 플라스미드 전달과 이종성 유전자 발현 및 단백질 분비를 측정하기 위해 secNanoLuc®의 활성을 측정하였다. 이를 위해 NanoGlo® 검출 시약(Promega)을 사용하여 균질화된 종양을 루시퍼라제 활성에 대해 평가하고 SpectraMax® M3 분광 광도계/루미노미터(Molecular Devices)에서 판독하였다. 모 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주는 4482.6의 평균 발광 상대 광 단위(RLU)를 유도한 반면, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB 균주는 3배, 96.3배에 가까운 RLU를 유도하였다. 이러한 데이터는 종양 콜로니화를 개선하고 페이로드 발현을 향상시키는 지질단백질 제거 균주의 능력을 실증한다.
이러한 데이터는 지질단백질의 결실이 IV 투여 후 종양 콜로니화를 다소 감소시키는 반면, 종양에서 플라스미드 전달 및 페이로드 발현을 상당히 향상시킨다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는 이러한 유전자의 결실이 콜로니화를 감소시킬 것이라는 당업계의 예상과 달리, 지질단백질 결실이 종양 미세환경 및 종양에서 플라스미드 전달 및 단백질 발현을 향상시킨다는 것을 실증한다.
실시예 19
살모넬라 완전 purI 클린 결실 유전자 넉아웃 균주 조작 및 특징화
YS1646 균주(VNP20009)의 purI 유전자는 결실되지 않았으며; 이는 트랜스포존(Tn10) 삽입에 의해 방해를 받아 16.6 kbp(킬로 염기쌍) 게놈 역전 사건을 초래하였으며, 이에 의해 2개의 삽입 서열(IS) 요소를 게놈 내로 후속적으로 혼입하였고, purI(purM) 유전자 내에 하나, 그리고 다른 하나는 acrD 유전자의 3'-단부에 의해 바로 플랭킹된 유전자간 영역에서 16.6 kbp 업스트림에 혼입하였다. 두 IS 요소 사이의 영역은 반전되며 yffB, DC51_2568, upp, uraA, yfgE, yfgD, DC51_2573, perM, purC 등을 포함한 18개의 유전자를 포함한다. 유전자간 영역의 삽입 서열 요소는 완전히 기능적인 트랜스포사제를 인코딩하고 잠재적인 유전적 안정성 문제를 나타낸다(예를 들어, Broadway 등 (2014) J. Biotechnology 192:177-178 참조). 인간 요법으로서 균주의 개발을 위해 이러한 요소를 균주로부터 제거하였다. 염색체 재결합에 의해 방해된 purI 유전자의 완전한 유전 서열의 존재는 야생형 유전자로의 복귀 가능성을 열어 둔다. 치료 균주에서 이러한 트랜스포존의 존재는 가능한 유전적 안정성 염려를 제시한다.
균주 YS1646의 msbB 유전자도 완전히 결실되지 않았지만 유전적으로 조작된 511bp 결실(972bp 유전자 중)에 의해 방해되어 pykA 유전자(피루베이트 키나제 인코딩)가 확장되어 마지막 5개 아미노산이 대체되었다. 13개의 새로운 코돈을 갖는 코돈(예를 들어, Broadway 등 (2014) J. Biotechnology 192:177-178 참조).
균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD를 purI 유전자의 나머지 부분 및 균주 YS1646에 존재하는 2개의 트랜스포존-연관 삽입 서열 요소를 결실시키도록 변형시켰다. 아래에서 purI의 완전 넉아웃과 함께, 생성된 박테리아 세포는, 부모 YS1646 균주에서와 같이 유전자가 방해에 의해 비활성화된 세포보다 더 높은 생존력을 갖는 것으로 제시된다.
A. purI 유전자 단편 및 트랜스포존-연관 삽입 서열 요소의 결실
yffB와 purN 유전자 사이에 위치하고 하기를 포함하는 제1 영역: 1) Broadway et.al(2014)(GenBank 기탁 번호 CP007804 및 CP008745 참조)로부터 입수된 서열 내 DC51_2586으로 표기된 1,209 bp 트랜스포존 삽입 서열 요소; 및 2) 나머지 891 bp purI 유전자 단편(본원에서 큰 purI 유전자 단편으로 지칭됨) 중 740 bp를 Datsenko 및 Wanner의 방법의 변형을 사용하여 결실을 위해 표적화하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 97:6640-6645 (2000)). 891 bp(대형) purI 유전자 단편의 작은 151 bp 부분은 인접한 다운스트림 유전자인 purN(인코딩 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라제)에 영향을 미치는 것을 피하기 위해 손상되지 않은 채로 남겨졌다. DC51_2586 삽입 서열 요소 및 purI 유전자 단편의 좌측 및 우측 영역에 각각 284 및 262bp의 상동성을 함유하는 플라스미드 pSL0165를 DH5-알파 적격 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질전환시켰다. loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 이 플라스미드에 클로닝하고, 생성된 벡터를 pSL0174로 지정하였다. 그 후에, DC51_2586 삽입 서열 요소 및 큰 purI 유전자 단편 넉아웃 카세트를 프라이머 purm-1 및 purm-2(각각 SEQ ID NO: 419 및 420; 아래 표 2 참조)를 사용하여 PCR 증폭하고, 겔 정제하고, 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD에 전기천공법에 의해 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자를 상기 기재된 바와 같이 Cre-매개 재조합에 의해 경화시켰고, 온도-민감성 플라스미드를 비허용 온도에서의 성장에 의해 경화시켰다. DC51_2586 삽입 서열 요소 및 큰 purI 유전자 단편 넉아웃 서열을 프라이머 purm-3 및 purm-4(각각 SEQ ID NO: 421 및 422; 표 2 참조)를 사용한 PCR로 확인하고, DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 모 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD의 생성된 돌연변이 유도체를 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(크고 깔끔)로 지정하였다.
acrD와 DC51_2568 유전자 사이에 위치하며 하기를 포함하는 제2 영역: 1) Broadway et. al(2014)(GenBank 기탁 번호 CP007804 및 CP008745 참조)에서 입수한 서열 내 DC51_2566으로 표기된 1,209 bp 트랜스포존 삽입 서열 요소; 및 2) 나머지 231 bp purI 유전자 단편(본원에서 작은 purI 유전자 단편으로 지칭됨)을 Datsenko 및 Wanner의 방법의 변형을 사용하여 결실을 위해 표적화하였다(참조, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645(2000)). DC51_2566 삽입 서열 요소 및 작은 purI 유전자 단편의 좌측 및 우측 영역에 각각 241 및 265 bp의 상동성을 함유하는 플라스미드 pSL0210을 DH5-알파 적격 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질전환시켰다. loxP 부위에 의해 플랭킹된 카나마이신 유전자 카세트를 이 플라스미드에 클로닝하고 생성된 벡터를 pSL0212로 지정하였다. DC51_2566 삽입 서열 요소 및 작은 purI 유전자 단편 넉아웃 카세트를 프라이머 acrd-1 및 purm-5(각각 SEQ ID NO: 425 및 423, 표 2 참조)를 사용하여 PCR 증폭하고, 겔 정제하고, 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pKD46을 운반하는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(크고 깔끔)에 전기천공법에 의해 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자를 상기 기재된 바와 같이 Cre-매개 재조합에 의해 경화시켰고, 온도-민감성 플라스미드를 비허용 온도에서의 성장에 의해 경화시켰다. DC51_2566 삽입 서열 요소 및 작은 purI 유전자 단편 넉아웃 서열을 프라이머 purm-6 및 acrd-3(각각 SEQ ID NO: 424 및 426; 표 2 참조)을 사용하는 PCR에 의해 확인하고, DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 모 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(크고 깔끔)의 생성된 돌연변이 유도체는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(전체 깔끔), 또는 대안적으로 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI로 지정되었다.
Figure pct00058
Figure pct00059
B. 균주 YS1646△ asd /△FLG/△ pagP /△ ansB /△ csgD /F-△ purI 는 증강된 주사 스탁 세포 생존력을 보여준다
박테리아의 시험관내 적합도에 미치는 잔여 purI 유전자 서열 단편 및 트랜스포존-연관 삽입 서열 요소의 결실의 효과를 평가하기 위해, 완전 purI 유전자 결실(F-△purI)을 갖고 갖지 않고 동일한 플라스미드를 운반하는 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD의 세포 생존력을 비교하였다.
냉동된 주사 스탁에 대한 배양물 가공 후 생존 가능한 CFU를 직접적으로 비교함으로써 플라스미드 ADN-657(pATI1.76 CMV muIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA), 또는 플라스미드 ADN-750(pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA)을 함유하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI의 균주의 세포 생존력 및 동일한 플라스미드(ADN-657 및 ADN-750)를 발현하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD의 균주의 세포 생존력을 평가하였다. 플라스미드 ADN-657은 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc 및 변형된 인간 STING 키메라를 인코딩하고, 이때 인간 STING의 CTT를 태즈메니아 데빌 STING 및 GOF 돌연변이 N154S/R284G를 갖는 CTT(huSTING N154S/R284G tazCTT)로 대체하였다. 2개의 페이로드는 CMV 프로모터의 제어 하에 T2A 펩타이드를 포함하는 이시스트론성(bicistronic) 작제물로부터 발현된다. 작제물은 또한 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(bGHpA)을 포함한다. 플라스미드 ADN-750은 인간 IL-15Rα-IL-15sc 및 동일한 변형된 인간 STING 키메라를 인코딩하며, 여기서 2개의 페이로드의 발현은 CMV 프로모터의 제어 하에 있고, 단일 프로모터 시스템은 2개의 페이로드를 모두 인코딩하는 핵산의 업스트림에 놓인 혈관 내피 성장 인자 및 유형 1 콜라겐 유도 단백질(VCIP; SEQ ID NO: 434)로도 알려진 내인성 인간 IRES(내부 리보솜 진입 부위), 뿐만 아니라 2개의 ORF 사이에 놓인 T2A 펩타이드 서열을 사용하여 달성된다.
이 실험을 위해, 100 μl의, 동등한 OD600nm 광학 밀도(OD) 값의 밤새 정지기 배양물을 사용하여 환기 캡이 있는 250 ml 배플 진탕기 플라스크에서 25 ml의 4XYT 배지에 접종하였고, 배양물을 37℃에서 진탕하면서(225 RPM에서) 대략 6시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 동등한 OD600nm 값에서 정지기에서 수합하고, 2회 세척하고, OD600nm = 2로 조정하고, 분취하고, -80℃에서 냉동시켰다. 이튿날, 각각의 균주의 2개 분취물을 해동시키고, OD600nm 값을 측정하고, 균주를 한천 플레이트 상에 평판배양하여, 역가 및 생존력을 결정하였다. 생존력 %를 CFUs/ml에 대한 OD600nm의 비로부터 결정하였다.
균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-657) 주사 스탁은 77% 생존 가능한 것으로 결정된 한편, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-(ADN-657) 주사 스탁은 62% 생존 가능한 것으로 결정되었다. 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-750) 주사 스탁은 72% 생존 가능한 것으로 결정된 한편, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-(ADN-750) 주사 스탁은 63% 생존 가능한 것으로 결정되었다.
이러한 데이터는 부모 균주, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD와 비교하여 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI에 대해 유사한 또는 증강된 적합도 프로파일을 실증한다. 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI는 냉동된 주사 스탁 제조 후 향상된 생존력을 나타내었으며, 이는 게놈 결실이 잠재적인 유전적 불안정성 문제를 줄일 뿐만 아니라 증가된 세포 생존력으로 나타난 바와 같이 대사 이익을 제공한다.
C. 균주 YS1646△ asd /△FLG/△ pagP /△ ansB /△ csgD /F-△ purI 는 YS1646△ asd /△FLG/△ pagP /△ ansB /△ csgD 부모 균주와 비교하여 브로쓰 배지에서 유사한 성장 특징을 나타낸다
박테리아 균주의 시험관내 적합도에 미치는 잔여 purI 유전자 서열 단편 및 트랜스포존-연관 삽입 서열 요소의 결실의 효과를 평가하기 위해, 플라스미드 ADN-657(pATI1.76 CMV muIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA) 또는 플라스미드 ADN-750(pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA)을 발현하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI의 균주와 동일한 플라스미드(ADN-657 및 ADN-750)를 발현하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD의 균주 사이에서 브로쓰 배지 성장을 비교하였다. 냉동된 주사 스탁을 실온에서 해동시키고, PBS에서 희석시킴으로써 1x107 CFU/mL로 정규화하였다. 10 μL의 정규화된 시료를 사용하여 300 μL의 LB 배지(1x105 CFU/웰)을 깨끗한 편평-바닥 96-웰 플레이트에 기술적 4벌 중복으로 접종하였다. 플레이트를 37℃에서에서 진탕하면서 인큐베이션하고, OD600nm 값을 16시간의 경과에 걸쳐 15분 간격으로 모니터링하였다. OD600nm 값을 플롯화하여 성장 곡선을 작제하고, 성장의 로그기의 기울기를 계산하고 이를 사용하여 각각의 균주에 대한 배가 시간(doubling time)을 결정하였다.
각각의 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-657), YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-(ADN-657), YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-750) 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD(ADN-750)는 대등할 만한 성장 프로파일을 생성하였고, 정지기에서 유사한 세포 밀도에 도달하였다. 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-657)은 77분의 배가 시간을 가지며, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-(ADN-657)는 62분의 배가 시간을 갖고, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI-(ADN-750)은 72분의 배가 시간을 가지며, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-(ADN-750)은 63분의 배가 시간을 가졌다. 이러한 데이터는 부모 균주, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD와 비교하여 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI에 대해 유사한 적합도 프로파일을 실증한다. 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI는 브로쓰 배지에서 약간 증가된 배가 시간을 나타내었으나, 부모 균주와 비교하여 유사한 성장 곡선 프로파일 및 정지기 세포 밀도를 생성하였다.
실시예 20
유전적으로 변형된 균주는 전체 인간 혈액 및 1차 인간 대식세포에서 염증을 감소시킨다
면역자극성 박테리아 균주의 상이한 변이체의 투여로부터 비롯된 염증성 프로파일을 평가하기 위해, 각각의 플라스미드(루시퍼라제 나노루시퍼라제®(Promega)를 인코딩하는 CMV NanoLuc®)를 운반하는 균주 ATCC # 14028(야생형(WT) 에스. 티피무리움), YS1646, YS1646△asd, YS1646△asd/△FLG, YS1646△asd/△FLG/△pagP, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI, 및 이. 콜라이 균주 NEB 5-알파를 37℃에서 2시간 동안 인간 혈액과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 96-웰 포맷에서 200 μl의 혈액 및 5x103 CFU의 박테리아로 수행하였다. 감염-후 2시간째에, 혈액을 300 상대 원심력(rcf)으로 5분 동안 원심분리하고, 혈청을 인간 항바이러스 사이토카인 비드 어레이 분석(BioLegend)에 의해 제조업체의 설명서에 따라 사이토카인 프로파일 분석을 위해 단리하였다.
인간 혈액으로부터 방출되고 다양한 균주와의 인큐베이션 후 사이토카인의 수준 분석은, 균주 YS1646과의 인큐베이션이 WT 균주 ATCC 14028과의 인큐베이션과 비교하여 전염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 감소된 수준을 초래하였음을 보여주었다. 추가의 게놈 변형은 인간 혈액으로부터 방출된 전염증성 사이토카인의 수준을 추가로 감소시켰다.
Figure pct00060
박테리아, 예컨대 에스. 티피무리움에서 게놈 변형이 1차 인간 골수성 세포의 감염 동안 염증에 어떤 영향을 미치는지 결정하기 위해, 인간 M2 대식세포의 박토펙션을 수행하였다. 1차 인간 단핵구를 100 ng/ml 인간 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)를 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)에서 5일 동안 분화시켰다. 제6일에, 세포에 150 ng/ml M-CSF 및 60 ng/ml huIL-4를 함유하는 추가의 배지를 48시간 동안 보충하여, M2 대식세포를 생성하였다. 그 후에, 세포를 정지기 박테리아 균주(상기 기재된 균주)로 감염시키고, 이를 4XYT 배지에서 37℃에서 밤새 10의 MOI로 성장시켰다. 세포에 박테리아를 접종하고, 500 rcf에서 5분 동안 원심분리하고, 뒤이어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 DPBS로 2회 세척한 다음, 신선한 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지에서 100 μg/ml 겐타마이신과 함께 인큐베이션하였다. 감염후 0시간, 2시간, 6시간, 24시간 및 48시간째에 상층액을 수합하였다. 사이토카인 측정을 MESO 스케일 분석에 의해 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다.
아래 표에 요약된 결과는, 감염후 24시간째에 균주 YS1646, YS1646△asd, 및 YS1646△asd/△FLG로 감염된 대식세포가 최고 수준의 IL-6을 방출하였고, WT 박테리아(균주 ATCC 14028)는 더 적은 IL-6을 유도하였음을 보여준다. 성공적인 게놈 변형은 저하된 수준의 IL-6 분비를 초래하였고, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△csgD 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD는 최저 수준의 IL-6을 유도하였다. 유사한 경향은 TNF-α로 관찰되었다.
Figure pct00061
실시예 21
csgD-결실 균주는 인간 혈관 내피 세포에서 혈관 누출을 유도한다
혈관 누출을 촉진하는 능력은 종양 혈관구조 내로의 박테리아 진입을 용이하게 하고, 더 큰 종양 콜로니화를 촉진하는 데 유리한 특징이다. 이 실시예에서 △csgD 균주는 이러한 특징을 소유하는 것으로 제시된다.
부모 균주 YS1646을 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 내재성 면역 감지를 활성화시키는 능력, 및 내피 단층 투과성에서의 후속적인 증가를 자극시키는 능력에 대해 유도체 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD를 비교하였다. 이를 시험관내 혈관 투과성 검정 키트(Millipore, Catalog No. ECM642)를 사용하여 평가하였다. 각각이 분비된 나노루시퍼라제® (EF-1α secNanoLuc®)를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD의 균주를 사용하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 96-웰 플레이트 챔버에서 제조업체의 설명서에 따라 반투과성 콜라겐-코팅된 막 삽입물 내로 5x105 세포/웰의 농도로 시딩하였다. 내피 단층 형성이 확인되고 막 공극을 효율적으로 가리는 것으로 결정될 때까지(시딩후 96시간째) 합류도(confluency)를 매일 모니터링하였다.
박테리아 균주를 3 ml의 4XYT 배지(TEKNOVA, Catalog No. 2Y1085)에서 환기 캡 50 mL 코니칼 바이얼에서 37℃에서 밤새 정지기까지 진탕하면서 성장시키고, 이튿날 펠렛화하고 PBS에 재현탁시킴으로써 제조하였다. 박테리아 시료를 OD600nm에 의해 2.5x108 CFU/mL의 농도로 정규화하고, HUVEC 삽입물 웰에 100 μL 부피로 첨가하여, 50의 MOI를 달성하였다. 플레이트를 500 rcf에서 5분 동안 회전시켜, CFU와 HUVEC의 연계를 싱크로나이즈한 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 겐타마이신을 삽입물 웰에 200 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 박토펙션-후 24시간째에, 삽입물 내 배지를 수집하고(사이토카인 분석을 위해 비축하고), 75 μL의 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란(FITC-덱스트란; 1:40 희석에서)을 첨가하고, 혼합물을 암실, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 수용기 트레이로부터의 배지를 수집하고, 분광광도계 상에서 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 흡광도 파장에서 분석하고, 1:40 FITC-덱스트란 용액을 양성 대조군으로서 직접적으로 진행시켰다.
박토펙션-후 24시간째에, 그리고 FITC-덱스트란 용액과의 인큐베이션 후, 조작된, 약독화된 에스. 티피무리움 균주(즉, 배지 단독)로 처리되지 않은 웰은 매우 낮은 형광 값(35)을 생성하였고, 이는 합류도 및 투과성의 교란이 거의 없음을 나타낸다. 부모 YS1646-처리 웰은 가장 많은 양의 FITC-덱스트란이 막을 통과하도록 허용하였으며(형광 = 155), 이는 가장 강한 내재성 면역 자극 및 혈관 투과성의 증가를 나타내고, 한편 조작된, 약독화된 에스. 티피무리움 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP 및 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD는 FITC-덱스트란이 거의 통과하지 않게 하였으나(각각 형광 = 84 및 91), 여전히 혈관 투과성을 촉진하는 능력을 유지하고 있었다.
이러한 효과가 HUVEC으로부터 방출되는 사이토카인, 특히 IL-6에 의존하였는지의 여부를 시험하기 위해, 인간 항바이러스 사이토카인 비드 어레이 분석(BioLegend)을 감염후 6시간째에 HUVEC 상층액 상에서 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. 부모 YS1646 균주로 감염된 HUVEC은 감염되지 않은 대조군(27.19 pg/mL)과 비교하여 매우 높은 IL-6 수준(1769.2 pg/mL)을 나타내었다. YS1646△asd/△FLG/△pagP 균주는 더 낮은 수준의 IL-6(543.3 pg/mL)를 유도하였고, 가장 적은 양의 IL-6은 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD 균주(272.8 pg/mL)로 관찰되었다. 따라서, 혈관 누출을 유도하는 더 낮은 수준의 전염증성 사이토카인을 생산함에도 불구하고, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD 균주는 YS1646△asd/△FLG/△pagP 균주보다 더 높은 수준의 누출을 실증하였다. 그러므로, 혈관 누출을 촉진하는 능력은 종양 혈관구조 내로의 박테리아 진입을 용이하게 하고 더 큰 종양 콜로니화를 가능하게 하기 위한 중요한 특징이다. 본원에 기재되고 제공된 균주는 이러한 특징을 소유한다.
실시예 22
STING 기능-획득 변이체는 1차 인간 M2 대식세포에서 IL-6에 대한 CXCL10(IP-10)의 증가된 비율 및 IL-6에 대한 IFN-β의 증가된 비율을 실증한다
인간 M2 대식세포에서 다운스트림 사이토카인 신호전달에 미치는 다양한 STING 기능-획득(GOF) 돌연변이체(GOF 돌연변이를 갖는 키메라 STING 단백질 포함)의 효과를 결정하기 위해, GOF 돌연변이체를 상기 실시예 8에 기재된 pATI-1.75(pATI1.75로도 지칭됨) 벡터 내로 클로닝한 다음, 이를 발현을 위해 인간 M2 대식세포 내로 형질주입하고, 세포 상층액을 분비된(발현된) 사이토카인에 대해 검정하였다.
건강한 인간 공여자로부터 단리된 냉동된 인간 단핵구를 완전 배지(RPMI-1640 + 10% FBS)에서 해동시키고, 실온에서 600 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세척하였다. 단핵구를 100 ng/mL의 인간 M-CSF + 20 ng/mL의 인간 IL-4 + 20 ng/mL의 인간 IL-10을 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)에 재현탁시켰다. 그 후에, 단핵구(웰당 8e5 내지 1e6 세포)를 24-웰 플레이트에 75 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 3일 후에, 750 μL의, 100 ng/mL 인간 M-CSF + 20 ng/mL 인간 IL-4 + 20 ng/mL 인간 IL-10을 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 4일 이상 동안 인큐베이션하였다. 제7일에, Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 형질주입 시약(Lipocalyx GmbH)을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포를 형질주입하였다. STING GOF 돌연변이체 패널, 뿐만 아니라 감염되지 않은 대조군으로부터의 500 ng의 플라스미드 DNA를 제공된 완충액에 희석시키고, Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되게 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에(3벌 중복으로) 서서히 첨가하고, 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 48시간의 인큐베이션 후 상층액을 수합하고, 유세포분석-기초 인간 항바이러스 사이토카인 비드 어레이(BioLegend)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 인간 CXCL10(IP-10) 및 IL-6에 대해 검정하였다. 3개 측정의 평균을 계산하고, IP-10 농도를 IL-6 농도로 나누어서 IL-6에 대한 IP-10의 비율을 계산하였다.
아래 표에 요약된 결과는, IL-6에 대한 IP-10의 가장 높은 비율을 초래한 STING 변이체가 huSTING N154S/R284G tazCTT 변이체(즉, CTT를 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체하고 변형된 인간 STING 및 GOF 돌연변이 N154S/R284G를 함유하는 키메라 STING 단백질)였음을 보여준다. 인간 STING의 CTT를 태즈메이니아 데빌 STING의 CTT로 대체한 STING 변이체(huSTING tazCTT)는 동일한 돌연변이를 갖는 상응하는 완전 인간 STING 변이체보다 IL-6에 대한 IP-10의 더 높은 비율을 나타내었고, 그러므로, 향상된 항종양 반응을 실증하였다.
Figure pct00062
다양한 STING 변이체의 발현 후 인간 M2 대식세포에서 IL-6 유전자 발현에 대한 IFN-β의 비율을 평가하였다. 건강한 인간 공여자로부터 단리된 냉동된 인간 단핵구를 완전 배지(RPMI-1640 + 10% FBS)에서 해동시키고, 실온에서 600 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세척하였다. 단핵구를, 200 ng/mL 인간 M-CSF + 20 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 RPMI-1640 + 1X 비필수 아미노산(NEAA) + 5% 인간 AB 혈청에 재현탁시켰다. 그 후에, 단핵구(웰당 8e5 내지 1e6 세포)를 24-웰 플레이트에 75 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 3일 후에, 750 μL의, 5% 인간 AB 혈청 + NEAA와 함께 200 ng/mL 인간 M-CSF + 20 ng/mL 인간 IL-4를 함유하는 RPMI를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 4일 이상 동안 인큐베이션하였다. 제7일에, Viromer® RED 형질주입 시약을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포를 형질주입하였다. 변형된 키메라 STING 단백질을 포함한 STING GOF 돌연변이체 패널, 뿐만 아니라 감염되지 않은 대조군으로부터의 500 ng의 플라스미드 DNA를 제공된 완충액에 희석시키고, Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되게 하였다. 양성 대조군으로서, 임상 화합물 ADU-S100의 유사체인 STING 작용제 3'5' RpRp c-디(di)-AMP(InvivoGen)를 세포에 10 μg/mL의 농도로 첨가하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에(3벌 중복으로) 서서히 첨가하고, 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
형질주입-후 48시간째에 qPCR을 위해 세포를 수합하고, 베타-머캅토에탄올(Qiagen)과 함께 350 μL의 완충액 RLT 용해 완충액으로 용해시켰다. Qiagen RNeasy® Plus Mini 키트를 하기 변형으로 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. RNase-Free DNase 키트(Qiagen)를 사용하는 게놈 DNA 무효화 단계를 키트에 포함시켜, 게놈 DNA를 총 RNA로부터 제거하였다. NanoDrop™ OneC UV-Vis 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 총 RNA 농도를 측정하였다. 각각의 시료의 순도를 또한 A260/A230 흡광도 비율로부터 평가하였다. 역전사를 수행할 때까지 RNA를 냉동-해동 없이 -80℃에 보관하였다.
20 μL 반응에서 RT-qPCR(Bio-Rad)을 위해 CFX96™ 실시간 시스템(Bio-Rad) 및 iScript™ 역전사 Supermix를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 0.5-1 μg의 주형 RNA로부터 cDNA의 합성을 수행하였다. qPCR을 CFX96™ 실시간 시스템(Bio-Rad)으로 수행하였다. 인간 IFNβ1(huIFNβ1; 검정 ID: qHsaCEP0054112; Bio-Rad) 및 huIL-6(검정 ID: qHsaCEP0051939; Bio-Rad)을 위한 프라이머를 qPCR에 사용하였다. SsoAdvanced™ Universal SYBR®Green Supermix, 또는 iQ™ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 qPCR 반응(20 μL)을 프로토콜에 따라 실시하였다. Bio-Rad CFX96™ 실시간 시스템 상에서의 표준 열순환 프로그램은 95℃에서 150초 동안의 변성 단계, 뒤이어 95℃에서 15초 동안의 39개 주기, 및 60℃에서 55초 동안을 포함하였다. 액틴 기준 mRNA(Bio-Rad, 검정 ID: qHsaCEP0036280)를 사용하여 표적 mRNA의 정량화를 정규화하였다. △Cq를 표적(huIFNβ 또는 huIL-6)과 기준(액틴) 유전자 사이의 차이로서 계산하였다. 치료(형질주입)의 △Cq 값을 비치료(즉, 비형질주입) 대조군의 △Cq 값으로 정규화함으로써 △△Cq를 수득하였다. IL-6 △△Cq에 대한 IFNβ △△Cq의 비율을 아래 표에 제시한다.
아래 표에 요약된 결과는, 스크리닝된 모든 STING GOF 돌연변이체 중에서, huSTING N154S/R284G tazCTT 변이체가 전염증성 IL-6 발현에 대한 면역자극성 IFN-β의 최고 비율을 초래함을 보여준다. 추가로, 인간 STING의 CTT를 태즈메니아 데빌 STING의 CTT(예를 들어 huSTING tazCTT)로 대체한 키메라 STING 작제물은 일반적으로 동일한 GOF 돌연변이(들)를 포함하는 상응하는 완전 인간 STING 작제물보다 IL-6 발현에 대한 IFN-β의 최고 비율을 유도하였다.
IFN-β의 증가된 발현은 증가된 IRF3/유형 I IFN 신호전달을 나타내며, 이는 면역자극성이고 유익하고, 한편 저하된 IL-6 발현은 감소된 NF-κB 신호전달을 나타내고, 이는 전염증성이며 항종양 반응에 기여하지 않는다. IL-6 발현에 대한 IFN-β의 더 높은 비율은 증가된 항종양/항바이러스 유형 반응 및 저하된 전염증성 반응을 나타낸다. 그러므로, STING 단백질에서 CTT의 대체, 뿐만 아니라 기능-획득 돌연변이는 STING 단백질, 그러므로 면역자극성 박테리아의 항종양 활성을 증가시킨다.
Figure pct00063
실시예 23
IL-15 수용체-α 및 IL-15 단일-사슬 융합 단백질의 설계
인간 단백질 또는 마우스 단백질을 함유하는 융합 단백질을 제조하였다. 마우스 단백질은 마우스 모델에 사용하기 위한 것이다; 인간 단백질은 인간 치료제에서 사용될 면역자극성 박테리아에서 인코딩하기 위한 것이다.
인간 IL-15 단일-사슬(sc)에 융합된 인간 IL-15 수용체-α(IL-15Rα)를 하기와 같이 설계하였다. IL-15-Rα의 리더 서열 및 스시(sushi) 도메인에 상응하는 인간 IL-15Rα(SEQ ID NO: 401)의 아미노산 잔기 1-108(+ IL-15Rα의 추가의 13개 아미노산 잔기; 예를 들어, Bouchaud et al. (2008) J. Mol. Biol. 382(1):1-12)을, 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 4개 반복부(즉, (GGGGS)4)를 갖는 Gly-Ser 링커와 인프레임으로 첨가하였다. 리더 서열 또는 프로펩타이드가 없는 완전 성숙 인간 IL-15sc에 상응하고 SEQ ID NO: 403의 아미노산 잔기 48-162에 상응하는 폴리펩타이드 서열을 링커 다음에 첨가하였다. 생성된 인간 IL-15α-IL-15sc 융합 단백질(SEQ ID NO: 404)의 서열은 하기와 같으며:
Figure pct00064
여기서, 인간 IL-15Rα의 잔기 1-108에 상응하는 잔기는 밑줄 표시되어 있으며; Gly-Ser 링커는 볼드체로 표시되어 있고; 인간 IL-15의 잔기 48-162에 상응하는 잔기는 이중 밑줄 표시되어 있다.
유사하게는, 뮤린 IL-15 수용체-α(IL-15Rα) 단백질의 일부를 뮤린 IL-15 단일-사슬(sc) 단백질의 일부에 융합시킴으로써 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc 융합 단백질(SEQ ID NO: 407)을 제조하였다. IL-15-Rα의 리더 서열 및 스시 도메인을 포함하는 뮤린 IL-15Rα(SEQ ID NO: 405)의 아미노산 잔기 1-132를 (GGGGS)4 링커와 인프레임으로 첨가하였다. 리더 서열 또는 프로펩타이드가 없는 완전 성숙 뮤린 IL-15sc에 상응하고 SEQ ID NO: 406의 아미노산 잔기 49-162에 상응하는 폴리펩타이드 서열을 링커 다음에 첨가하였다. 마우스 모델 실험에 사용된 생성된 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc 융합 단백질(SEQ ID NO: 407)의 서열은 하기와 같으며:
Figure pct00065
여기서, 뮤린 IL-15Rα의 잔기 1-132에 상응하는 잔기는 밑줄 표시되어 있으며; Gly-Ser 링커는 볼드체로 표시되어 있고; 뮤린 IL-15의 잔기 49-162에 상응하는 잔기는 이중 밑줄 표시되어 있다.
실시예 24
IL-15Rα-IL-15sc는 결장직장 암종의 마우스 모델에서 종양 재시도로부터 치유 효과 및 보호를 유도한다
이 실시예는 IL-15Rα-IL15sc 융합 단백질(본원에서 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, IL-15/IL-15Rα 사슬 복합체, 및 IL-15/IL-15Rα로도 지칭됨)을 인코딩하는 면역자극성 박테리아가 항종양 효능을 단독요법으로서 유도함을 실증한다. 이를 실증하기 위해, 뮤린 IL-15Rα-IL15sc(muIL-15Rα-IL15sc)를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 에스. 티피무리움 균주를 제조하였다. muIL-15Rα-IL15sc를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD 균주(즉, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-muIL-15Rα-IL15sc; 마우스 IL-15Rα-IL15sc를 마우스 모델에서 수행된 실험에 사용하였음)를 피하(SC) 옆구리(flank) MC38 결장직장 선암종 모델에서 안전성 및 효능에 대해 PBS 대조군과 비교하였다. 이 연구를 위해, 6 내지 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스(군당 5 마리의 마우스)의 우측 옆구리에 MC38 세포(100 μL PBS 중 5x105 세포)를 SC 접종하였다. 확립된 옆구리 종양을 보유한 마우스에게 2x107 CFU의 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-muIL-15Rα-IL15sc 균주, 또는 PBS 비히클 대조군을 제8일에 정맥내(IV) 주사하였다. 종양 측정 및 체중을 매주 2회 기록하였다.
결과는, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-muIL-15Rα-IL15sc 균주가 단일 IV 주사 후 50% 치유(4/8 vs. PBS의 경우 0/8, p = 0.005, 제21일)를 실증하였음을 보여주었다. 종양 이식-후 66일째에(IV 투약-후 제57일), 치유된 마우스(N=4)의 반대쪽 옆구리 상에 5x105 MC38 세포를 재이식하고, 종양 성장을 미접촉, 연령-매칭된 마우스(N=5)와 비교하였다. 재이식-후 제30일까지, 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-muIL-15Rα-IL15sc로 치유된 군 내의 모든 마우스는 종양이 없는 채로 있었고, 반면 미접촉 군 내의 모든 마우스는 최대 종양 부피에 도달하였다. 이러한 데이터는 면역자극성 박테리아, 예컨대 균주 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD-muIL-15Rα-IL15sc를 통한 IL-15Rα-IL15sc 융합 단백질의 전달의 강력한 치유 효과를 실증하고, 결장직장 암종의 모델에서 지속적인 보호 면역 기억의 유도를 실증한다.
실시예 25
항-CTLA-4 scFv-Fc는 항-CTLA-4 scFv와 비교하여 CD80/CTLA-4 및 CD86/CTLA-4 상호작용의 우수한 차단을 실증한다
인간 CTLA-4에 특이적인 scFv-Fc(각각 핵산 및 단백질 서열에 대해 SEQ ID NO: 427 및 428 참조)를 이필리무맙의 아미노산 서열을 사용하여 설계하였다. 이필리무맙은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 완전 인간 IgG1κ 단일클론 항체(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0086014 및 미국 특허 번호 6,984,720에서 10D1로 표기된 항체 참조)로, CD80(B7.1 또는 B7-1이라고도 함) 및 CD86(B7.2 또는 B7-2라고도 함)과의 상호작용을 저해하는 CTLA-4의 면역을 차단한다.
이필리무맙 scFv 항체 단편(SEQ ID NO: 429 참조)을 생성하기 위해, 이필리무맙의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 20개 아미노산 길이의 글리신-세린(GS) 링커((GGGGS)4)로 연결하였다. scFv-Fc 항체 단편(SEQ ID NO: 428 참조)을 생성하기 위해, 이필리무맙 scFv의 가변 중쇄를 힌지 영역의 유리 시스테인의 세린으로의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 Fc에 연결하였다(SEQ ID NO: 428에서 위치 272). 리더 서열(METPAQLLFLLLLWLPDTTG; SEQ ID NO: 428의 잔기 1-20에 상응함)은 인간 면역글로불린 카파 가변 3-20(IGKV3-20) 단백질의 서열로부터 유래되었다. 서열은 GenScrip GenSmart™ 코돈 최적화 도구를 사용하여 코돈 최적화되었다.
항-CTLA-4 scFv-Fc의 중화 능력은, CTLA-4와 이의 리간드인 CD80과 CD86 사이의 상호작용을 차단하는 각각의 항체 단편의 능력을 측정하기 위해 경쟁 ELISA를 사용하여 항-CTLA-4 scFv(인간 IgG1 Fc 부분 결여)의 중화 능력과 비교하였다. HEK293T-세포는 적절한 시약:DNA 비율에서 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)을 사용하여 항-CTLA-4 scFv-Fc 또는 항-CTLA-4 scFv 항체 단편 작제물을 인코딩하는 3 마이크로그램의 DNA로 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, HEK293T 무세포 배양 상층액을 수합하고, 여과하고, 항-CTLA-4 항체 단편의 차단 활성을 평가하기 위해 경쟁 ELISA에 사용하였다.
경쟁 ELISA의 경우, 마우스 CD80 또는 CD86 재조합 단백질(R&D Systems)을 100 ng/mL 농도의 고단백질 결합 96웰 플레이트에서 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 1회 세척하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 ELISA 차단 완충액으로 차단하였다. 그 다음, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 1회 세척하였다. 각각의 항-CTLA-4 항체 단편을 함유하는 HEK293T-세포 배양 상층액을 10 ng/mL의 재조합 뮤린 CTLA-4-인간 IgG1 Fc 키메라(R&D Systems)와 혼합하고, 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후에, PBS 0.05% Tween-20으로 웰을 3회 세척하고, HRP(호스래디쉬 퍼옥시다제)가 결합된 항-인간 IgG1 항체를 웰(Jackson ImmunoResearch)에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고, 검출 시약(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), Thermo Fisher Scientific)을 웰에 첨가하였다. 효소 반응을 황산(BioLegend)으로 중단하고 450 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.
경쟁 ELISA의 결과는 아래 표에 요약되어 있다. 항-CTLA-4 scFv-Fc는 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 75.5%만큼 차단하였고, CD80에 대한 CTLA-4의 결합을 40.6% 차단한 반면, 항-CTLA-4 scFv는 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 32.5%만큼 차단하고, CD80에 대한 CTLA-4의 결합을 7%만큼 차단하였다. 두 항체 단편 모두에서 더 높은 정도의 CD86/CTLA-4 차단 활성(CD80/CTLA-4 차단 활성과 비교하여)이 관찰되었고, 항 CTLA-4 scFv와 비교하여 항-CTLA-4 scFv-Fc에서 보다 우수한 중화 활성이 관찰되었다.
Figure pct00066
9D9 클론으로부터 유래된 항-뮤린 CTLA-4 scFv(SEQ ID NO: 430) 및 항-뮤린 CTLA-4 scFv-Fc(SEQ ID NO: 431)를 또한 상응하는 인간 항-CTLA-4 항체 단편에 대해 상기 논의된 바와 같이 제조하였다. scFv는 IgK 리더 마우스 서열, 및 (Gly4Ser)3 링커를 통해 연결된 클론 9D9로부터의 VL 도메인과 VH 도메인을 함유한다. scFv-Fc는 또한 VH 도메인에 연결된 마우스 IgG2a Fc를 함유한다.
본원에 제공된 면역자극성 박테리아 중에는 플라스미드 상에 항-CTLA-4 scFv 항체 단편 및 항-CTLA-4 scFv-Fc 항체 단편을 포함하는 항-CTLA-4 항체 및 이의 단편을 인코딩하는 것이 포함된다. 본원에 제공된 바와 같이, 뿐만 아니라 다른 치료제를 인코딩하는 핵산 분자와의 조합을 포함한다.
실시예 26
인코딩된 치료 생성물의 높은 수준의 멀티플렉스 발현을 위한 최적화된 발현 카세트
내부 리보솜 진입 부위(IRES)로도 알려진 요소는 5' mRNA 캡의 모방을 통해 mRNA의 리보솜 결합 및 안정화를 증강시킴으로써 단백질 번역을 촉진할 수 있다. 바이러스 및 포유류 세포로부터의 IRES 요소는 잘 알려져 있다. 이 중에서, 혈관 내피 성장 인자 및 유형 1 콜라겐 유도 단백질(VCIP)로도 알려진 내인성 인간 IRES는 반딧불이 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제를 인코딩하는 이시스트론성 벡터로부터의 발현을 증강시키는 것으로 실증되었고, 여기서, 다운스트림 유전자(즉, VCIP IRES 후에 인코딩됨)인 레닐라 루시퍼라제는 제2 프로모터에 필요성 없이 시험관내에서 그리고 생체내에서 발현되었다(예를 들어, Licursi et al. (2011) Gene Therapy 18(6):631-636).
이시스트론성 및 다시스트론성(polycistronic) 작제물이 2A 펩타이드를 함유하는 인간 또는 마우스 IL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT, 또는 인간 또는 마우스 IL-15Rα-IL-15sc, huSTING N154S/R284G tazCTT, 및 항-CTLA-4 scFv-Fc의 조합을 함유하는 플라스미드를 단일 발현인자 대조군에 대한 각각의 인코딩된 페이로드/생성물의 발현에 대해 시험하였다. 추가로, VCIP IRES를 함유하는 조합 작제물을 또한 시험하였다.
HEK293T STING Null Cells(293-DualTM Null Cells; InvivoGen)를 사용하였고,이는 내인성 STING을 함유하지 않고, 내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어 하에 놓인 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 발현하며, 여기서 ISRE의 코딩 서열을 녹인(knock-in) 기술을 사용하여 SEAP ORF에 의해 대체한다. 그러므로, 유형 I IFN 유도 SEAP 생산을 모니터링함으로써 STING 활성을 평가할 수 있다. 293-DualTM Null Cells는 또한 내인성 IFN-β 프로모터의 제어 하에 놓인 Lucia™ 루시퍼라제, 분비된 루시퍼라제를 발현한다; IFN-β의 코딩 서열을 녹인 기술을 사용하여 Lucia™ 루시퍼라제 ORF로 대체하였다. 이는 IFN-β의 발현을 모니터링함으로써 STING 활성의 평가를 가능하게 한다. 이러한 세포를 사용하여, Lucia™ 루시퍼라제의 ISRE-유도 SEAP 생산 및/또는 IFN-β-의존적 발현을 모니터링함으로써 STING 활성을 평가할 수 있다. 2개의 리포터 단백질인 SEAP 및 Lucia™ 루시퍼라제를 세포 상층액에서 표준 검정 및 검출 시약, 예컨대 QUANTI-Blue™ 및 QUANTI-Luc™ 검출 시약(InvivoGen)을 각각 사용하여 측정할 수 있다.
세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 웰당 200,000 세포로 시딩하였고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하여, 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날, 300 ng의 각각의 플라스미드 DNA, 및 40 ng의 CMV-GFP 벡터(즉, CMV 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터)를 무혈청 배지에 희석시키고, FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였고, 이때 비형질주입 웰은 음성 대조군으로서 역할을 하였다(2벌 중복으로). 형질주입-후 48시간째에 각각의 시료로부터 세포 배양 상층액을 수집하였다.
ISRE-SEAP 및 IFN-β-Lucia™ 리포터 시스템을 사용하여 huSTING N154S/R284G tazCTT 변이체의 STING 활성을 평가하였다. 세포 상층액 내 유형 I IFN-자극 SEAP 생산을 모니터링함으로써 유형 I 인터페론(IFN) 활성(STING에 의해 유도됨)을 평가하였다. 20 μL의 세포 배양 상층액을 180 μL의 QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen)에 첨가하였고, 이는 SEAP를 측정하는 데 사용된다. SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices) 상에서 650 nm의 흡광도 파장에서 ISRE-유도 SEAP 활성을 측정함으로써 유형 I 인터페론 활성화를 결정하였다. 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극 Lucia™ 루시퍼라제 생산을 모니터링함으로써 유형 I 인터페론(IFN) 활성(STING에 의해 유도됨)을 또한 평가하였다. 20 μL의 세포 배양 상층액을 50 μL의 QUANTI-Luc™ 시약(InvivoGen)에 첨가하였고, 이는 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 측정하는 데 사용된다. 발광 설정에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices) 상에서 IFNβ-유도 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 유형 I 인터페론 활성화를 결정하였다.
세포 배양 상층액을 또한 인간 또는 마우스 IL-15Rα-IL-15sc(실시예 23)의 발현, 및 인간 또는 마우스 항-CTLA-4 scFv-Fc(실시예 25 참조)의 발현에 대해 평가하였다. muIL-15Rα-IL-15sc 작제물의 경우, 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc ELISA(R&D)를 키트 설명서에 따라 사용하였다. huIL-15Rα-IL-15sc 작제물의 경우, 인간 IL-15Rα-IL-15sc ELISA(R&D)를 키트 설명서에 따라 사용하였다. 인간 및 마우스 CTLA-4-Fc(R&D Systems)와 함께 직접적인 ELISA를, 항-인간 CTLA-4 scFv-Fc 및 항-뮤린 CTLA-4 scFv-Fc를 인코딩하는 플라스미드로 형질주입된 세포의 세포 배양 상층액 상에서 수행하여, 이러한 단백질의 발현 수준을 측정하였다.
GFP 생산을 유세포분석법에 의해 검출하고, 형질주입을 서로에 대해 정규화하는 데 사용하였다. 형질주입-후 48시간째에, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 DAPI(사멸/생존 염색)와 함께 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 유세포분석 데이터를 ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고, FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 표에 제시된 바와 같이, huSTING N154S/R284G tazCTT 변이체를 함유하는 모든 작제물은 ISRE-SEAP 리포터 활성 및 IFNβ-Lucia™ 루시퍼라제 리포터 활성을 나타내었다. muIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합의 발현을 위해 VCIP IRES 및 T2A 펩타이드를 함유하는 2.1 CMV VCIP muIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT로 표기된 작제물은 GFP 공동형질주입에 의해 정규화되었을 때 가장 높은 발현 수준의 muIL-15Rα-IL-15sc를 초래한다. 유사하게는, huIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합의 발현을 위해 VCIP IRES 및 T2A 펩타이드를 함유하는 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT로 표기된 작제물은 GFP 공동형질주입에 의해 정규화되었을 때 가장 높은 발현 수준의 huIL-15Rα-IL-15sc를 초래한다. 1.76 CMV mu 항-CTLA-4 scFv-Fc로 표기된 작제물은 GFP 공동형질주입에 의해 정규화되었을 때 가장 높은 발현 수준의 뮤린 항-CTLA-4 scFv-Fc를 초래하고, 1.76 CMV hu 항-CTLA-4 scFv-Fc로 표기된 작제물은 가장 높은 발현 수준의 인간 항-CTLA-4 scFv-Fc를 초래한다.
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
실시예 27
huIL-15Rα-IL-15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 인코딩하는 발현 플라스미드
huIL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT의 가장 높은 발현을 갖는 플라스미드(들)를 식별하기 위해, 상이한 2A 펩타이드(예를 들어, T2A 또는 P2A), 및/또는 상이한 전사후 조절 요소(예를 들어, HPRE 또는 WPRE), 및/또는 상이한 poly(A) 테일(예를 들어, 소 성장 호르몬 poly(A) (bGHpA) 또는 시미안 바이러스(simian virus) 40 poly(A) (SV40pA))과 함께 huIL-15Rα-IL-15sc 및/또는 huSTING N154S/R284G tazCTT를 인코딩하는 핵산 분자를 함유하고 그리고/또는 VCIP IRES를 함유하는 플라스미드를 클로닝하였다. 추가로, 일부 작제물에서, 제1 페이로드(즉, huIL-15Rα-IL-15sc)를 인코딩하는 핵산 다음에 그리고 2A 펩타이드를 인코딩하는 핵산 앞에서 RRKR 및 RAKR을 포함한 짧은 펩타이드 스페이서, 및 상이한 길이의 다른 스페이서를 인코딩하였다. RRKR 및 RAKR을 푸린(furin) 프로테아제 절단 부위에서 설계하고, 해당 위치에 배치하여 2A 펩타이드 서열의 적절한 가공을 용이하게 하였다. 플라스미드를 우선 HEK293T STING Null Cells(ISG/KI-IFNβ) 세포(InvivoGen)에서의 형질주입에 의한 발현 및 기능성에 대해 평가하였다.
내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어 하에 놓인, 내인성 STING을 함유하지 않고 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 발현하는 HEK293T STING Null Cells(293-Dual™ Null Cells(ISG-SEAP/KI-[IFN-β]Lucia; InvivoGen)를 사용하였으며, 여기서 ISRE의 코딩 서열을 녹인 기술을 사용하여 SEAP ORF로 대체한다. 상기 논의된 바와 같이, 293-DualTM Null Cells는 또한 내인성 IFN-β 프로모터의 제어 하에 있는 분비된 루시퍼라제인 Lucia™ 루시퍼라제를 발현하며, 여기서 IFN-β의 코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 Lucia™ 루시퍼라제 ORF로 대체되었다. 세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 웰당 200,000 세포로 시딩하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하여, 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날, 300 ng의 각각의 플라스미드 DNA, 및 40 ng의 CMV-GFP 벡터를 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였으며, 이때 비형질주입 웰은 음성 대조군으로서 역할을 하였다(2벌 중복으로). 형질주입-후 48시간째에 각각의 시료로부터 세포 배양 상층액을 분석을 위해 수집하였다.
huSTING N154S/R284G tazCTT 변형된 STING 단백질의 STING 활성을 HEK293T STING Null(ISG-SEAP/KI-[IFN-β]Lucia) 리포터 세포주(InvivoGen)로 평가하였다. 이러한 세포를 사용하여, 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극 Lucia™ 루시퍼라제 생산을 모니터링함으로써 유형 I 인터페론(IFN) 활성(STING에 의해 유도됨)을 평가한다. IFNβ 유도를 IFNβ-Lucia 리포터로 측정한다. 20 μL의 세포 배양 상층액을 50 μL의 QUANTI-Luc™ 시약(InvivoGen)에 첨가하였고, 이를 Lucia™ 루시퍼라제 활성의 측정에 사용한다. 발광 설정에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices) 상에서 IFNβ-유도 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 유형 I 인터페론 활성화를 결정하였다. 세포 배양 상층액을 또한 ELISA(R&D)에 의해 키트 설명서에 따라 인간 IL-15Rα-IL-15sc의 발현에 대해 평가하였다.
GFP를 유세포분석에 의해 검출하였고, GFP의 발현 수준(형광에 의해 측정됨)을 사용하여, 형질주입을 서로에 대해 정규화하였다. 형질주입-후 48시간째에, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 DAPI(사멸/생존 염색)와 함께 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 유세포분석 데이터를 ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 획득하고, FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 2개의 표에 제시된 바와 같이, 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 플라스미드 작제물은 IFNβ-Lucia™ 리포터로부터 가장 높은 정규화된 발광 값(아래 첫번째 표), 및 또한 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 발현된 huIL-15Rα-IL-15sc의 가장 높은 정규화된 농도(아래 두번째 표)를 초래하였다.
아래 첫번째 표에 제시된 바와 같이, huIL-15Rα-IL-15sc 단독을 인코딩하는 작제물(그리고 STING 변이체 없음)은 예상된 바와 같이 STING-유도 유형 I IFN 활성을 나타내지 않는다. huSTING N154S/R284G tazCTT만 인코딩하는 작제물은 높은 수준의 STING-유도 유형 I IFN 활성을 나타낸다. 페이로드를 둘 다 인코딩하는 작제물의 경우, P2A 펩타이드와 WPRE의 조합은 T2A 및 P2A와 HPRE의 조합 또는 T2A와 WPRE의 조합보다 더 높은 수준의 STING 활성(즉, 더 높은 수준의 STING의 발현)을 초래한다. 추가로, 더 높은 수준의 STING 활성은 SV40 poly(A) 테일보다 bGH poly(A) 테일을 함유하는 작제물로 관찰되었다. 짧은 펩타이드 스페이서, 예컨대 RAKR 또는 RRKR의 첨가는 이러한 스페이서를 함유하지 않는 동일한 작제물과 비교하여 STING 활성 수준을 약간 증가시킨다. 특정한 작제물, 예컨대 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA; 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc P2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA; 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT WPRE bGHpA; 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT WPRE SV40pA; 및 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc RAKR-T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 것에서, VCIP IRES의 첨가는 VCIP IRES를 함유하지 않는 동일한 작제물과 비교하여 STING 활성 수준을 증가시킨다.
아래 두번째 표에 제시된 바와 같이, huIL-15Rα-IL-15sc의 발현 수준은 SV40 poly(A) 테일보다 bGH poly(A) 테일을 함유하는 작제물로부터 더 높고, 일반적으로, WPRE를 함유하는 작제물은 HPRE를 함유하는 동일한 작제물보다 더 높은 수준의 huIL-15Rα-IL-15sc를 초래한다. CMV huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA를 인코딩하는 작제물에서 huIL-15Rα-IL-15sc를 인코딩하는 핵산 서열 다음의 RAKR 짧은 펩타이드 스페이서의 첨가는 huIL-15Rα-IL-15sc의 발현 수준을 증가시켰다. 2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc P2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE SV40pA로 표기된 것을 제외한 모든 작제물에서, 작제물의 업스트림에서 VCIP IRES(2A 펩타이드에 더하여)의 첨가는 huIL-15Rα-IL-15sc의 유의하게 증가된 발현을 초래한다. 예를 들어 1.76 CMV huIL-15Rα-IL-15sc VCIP huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 작제물에서 2A 펩타이드로부터 VCIP IRES로의 대체는 유사한 발현 수준의 huIL-15Rα-IL-15sc를 초래한다. 2A 펩타이드로부터 VCIP IRES로의 대체, 및 예를 들어, 1.76 CMV huIL-15Rα-IL-15sc 더 긴 스페이서 VCIP huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 작제물에서 huIL-15Rα-IL-15sc를 인코딩하는 핵산과 VCIP IRES 사이에서 더 긴 스페이서의 첨가는 huIL-15Rα-IL-15sc의 유의하게 증가된 발현 수준을 초래한다. 작제물 내 스페이서 서열은 제1 ORF의 정지 코돈과 제2 ORF의 업스트림의 VCIP IRES 사이에 놓인 핵산 서열이다. 예를 들어 아래 표에서 "새로운 스페이서"로 표기된 스페이서는 서열 ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC(SEQ ID NO: 408)를 갖고, 아래 표에서 "더 긴 스페이서"로 표기된 스페이서는 서열 TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC(SEQ ID NO: 409)를 갖는다.
이러한 결과는, VCIP IRES의 첨가가 일반적으로 이시스트론성 작제물 상에서 인코딩된 제1 페이로드의 발현 수준을 증가시키고, 특정한 작제물에서 제2 페이로드의 발현 수준을 증가시킨다.
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
상이한 huIL-15Rα-IL-15sc and huSTING N154S/R284G tazCTT 작제물에 의해 인간 M2 대식세포에서 유도된 다운스트림 IFN-β 신호전달의 차이를 결정하였다. huIL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT를 인코딩하는 핵산을, huIL-15Rα-IL-15sc 또는 huSTING N154S/R284G tazCTT 코딩 서열의 개시 코돈 앞에 놓인 VCIP IRES와 함께 그리고 없이 벡터 내로 클로닝하였다.
건강한 인간 공여자로부터 단리된 냉동된 인간 단핵구를 완전 배지(RPMI-1640 + 10% FBS)에서 해동시키고, 실온에서 600xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 세척하였다. 100 ng/mL 인간 M-CSF를 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)에서 단핵구를 재현탁시켰다. 그 후에, 단핵구(웰당 5e5 세포)를 24-웰 플레이트에 500 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 5일 후에, 250 μL의, 300 ng/mL 인간 M-CSF + 60 ng/mL 인간 IL-4 + 60 ng/mL 인간 IL-10을 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 2일 더 인큐베이션하였다. 제7일에, 세포를 Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 형질주입 시약을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 형질주입하였다. 750 ng의, 상이한 플라스미드 작제물 패널로부터의 플라스미드 DNA, 뿐만 아니라 "DNA 무함유" 대조군(secNanoLuc®를 인코딩함)을 제공된 완충액에 희석시키고, Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되게 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에(3벌 중복으로) 서서히 첨가하고, 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 배양 상층액을 48시간 후에 수합하고, 인간 사이토카인 패널 U-Plex 검정(Meso Scale Discovery)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 IFN-β에 대해 검정하였다. 3개 측정의 평균을 계산하고, DNA 무함유 대조군으로부터의 배경 신호를 차감하여, 순수한(net) IFN-β 발현 수준을 계산하였다.
아래 표에 요약된 결과는 huIL-15Rα-IL-15sc 단독을 인코딩하는(STING 없음) 작제물이 형질주입된 인간 M2 대식세포에서 임의의 IFN-β 발현을 유도하지 않음을 보여준다. 형질주입된 인간 M2 대식세포에서 가장 높은 수준의 IFN-β 발현을 초래한 작제물은 pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 작제물이다. 이러한 작제물(pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기됨)은 pATI1.76 백본을 갖고 VCIP IRES를 전혀 갖지 않거나 huIL-15Rα-IL-15sc의 ORF와 huSTING N154S/R284G tazCTT(즉, 여기서 VCIP IRES는 2A 서열을 대체함) 사이에서 VCIP IRES를 갖는 작제물보다 더 높은 수준의 IFN-β 발현을 초래한다. pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA로 표기된 작제물은 T2A 서열 대신에 P2A 서열을 함유하는 상응하는 작제물과 비교하여 더 높은 IFN-β 신호를 초래한다. 이러한 결과는, 2개의 ORF의 업스트림에 VCIP IRES를 함유하고 2개의 ORF 사이에 2A 서열, 특히 T2A를 함유하는 이시스트론성 작제물이 제2 인코딩된 페이로드(이 경우, 변형된 STING 단백질)의 더 높은 발현 수준을 초래함을 나타낸다.
Figure pct00074
실시예 28
플라스미드 전달 을 향상시키기 위한 방법으로서의 포스포리파제 D의 발현
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피무리움은 이의 발병의 일부로서, 골수성 세포에 의해 표식되고 독성(virulence) 프로그램을 활성화시켜, 식포(phagosome)를 살모넬라-함유 액포(SCV)로 변경시킨다. 플라스미드 상에서 인코딩된 유전자의 이소성 발현이 SCV로부터 핵으로의 플라스미드 전좌를 필요로 하는 한편, 이러한 전좌 사건의 기전은 알려져 있지 않다. 이러한 예는 조작된 면역자극성 박테리아로부터의 플라스미드 이동을 향상시키기 위한 조작 접근법을 제공한다.
리켓치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii)는 숙주 세포기질에 접근하고 복제하기 위해 식포 구획을 탈출해야 하는 그람-음성 세포내 병원체이다. 이전의 연구는, 분비된 알. 프로와제키이(R. prowazekii) 독성 인자인 포스포리파제 D(Pld)가 에스. 엔테리카(S. enterica)로 클로닝되어, SCV로부터의 탈출을 용이하게 할 수 있음을 보여주었다(예를 들어, Whitworth et al. (2005) Infection and 면역 73(10):6668-6673). 박테리아가 포식 세포 내로 전달된 후 높은 발현을 보장하기 위해 Pld(SEQ ID NO: 433)를 인코딩하는 pld 유전자(SEQ ID NO: 432)를 SCV에서 유도되는 ssaG 프로모터의 제어 하에 배치시켰다(예를 들어, Walthers et al. (2007) Molecular Microbiology 65(2):477-493). 이러한 박테리아 발현 카세트를 CMV-NanoLuc® 및 EF1α-NanoLuc®로 표기된 2개의 나노루시퍼라제® 리포터 플라스미드의 백본 내로 클로닝하였고, 플라스미드 전달을 인간 대식세포에서 평가하였다.
감염된 세포 내로의 플라스미드 전달을 측정하기 위해, 1차 인간 단핵구를 100 ng/ml GM-CSF를 함유하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지(StemCell Technologies)에서 5일 동안 분화시켰다. 제6일에, 세포에 150 ng/ml GM-CSF 및 60 ng/ml huIL-4를 함유하는 추가의 배지를 48시간 동안 보충하였다. 그 후에, 세포를 CMV-NanoLuc® , CMV-NanoLuc® + pld, EF1α-NanoLuc® , 또는 EF1α-NanoLuc® + pld 플라스미드 중 하나를 포함하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD 박테리아의 정지기 균주로 박토펙션시켰다. 박테리아 균주를 4XYT 배지에서 37℃에서 밤새 100의 MOI(감염 다중도: multiplicity of infection)로 성장시켰다. 감염된 세포를 500 rcf에서 5분 동안 원심분리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 후에 세포를 DPBS로 3회 세척하고, 100 μg/ml 겐타마이신을 함유하는 신선한 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지에서 인큐베이션하여, 임의의 세포외 박테리아를 제거하였다. 감염후 24시간 및 48시간째에, 세포 상층액을 수합하고, NanoLuci-ferase® 루시퍼라제 함량을 루시퍼라제 검정(Promega)을 사용하여 측정하였다. 세포를 또한 PBS 중 0.1% Triton X로 용해시키고 평판배양하여, 세포 내부에 남아 있는 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 나열하였다.
아래 표에 요약된 결과는, CMV 프로모터의 제어 하에 배치되었을 때, pld-인코딩 군(즉, CMV-NanoLuc® 루시퍼라제 + pld 플라스미드)으로부터 발현된 나노루시퍼라제®의 수준이 감염후 24시간째에 CMV-NanoLuc® 루시퍼라제 플라스미드 단독으로부터 발현된 나노루시퍼라제®의 수준보다 더 컸음을 보여주었다; 이러한 차이는 감염-후 48시간째에 규모가 커졌다.
pld를 인코딩하는 조작된 면역자극성 박테리아에 의한 세포의 박토펙션은 또한, NanoLuc®가 EF-1α 프로모터의 제어 하에 배치되었을 때 pld가 없는 상응하는 감염보다 더 높은 발광 수준을 초래하였다. 이러한 효과는 CMV 프로모터를 이용하는 군에서 관찰된 것보다 더 낮았으며, 이는 일부 pld 발현이 CMV 프로모터로부터의 누출에 의해 증강됨을 나타낸다.
Figure pct00075
결과는 또한, 감염후(hpi) 24시간 및 48시간째에 세포 내부에 남아 있는 CMV-NanoLuc® + pld-인코딩 균주의 CFU 수가 CMV-NanoLuc® 루시퍼라제 플라스미드 단독을 보유하는 박테리아의 CFU 수보다 더 큰 비율로 저하되었음을 보여주었고, 이는 동일한 세포 내의 각각의 균주에 대한 상이한 운명을 나타낸다.
Figure pct00076
박테리아 플라스미드 내 인코딩 포스포리파제 D가 동일한 플라스미드 상에서 인코딩된 면역조절성 페이로드의 전달을 증강시키는지 결정하기 위해, RAW-Dual™ TLR4-KO 세포(STING을 발현함; InvivoGen)를, pld를 인코딩하는 핵산과 함께 그리고 없이 박테리아 균주 함유 플라스미드로 감염시켰다. RAW-Dual™ TLR4-KO 세포는 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)의 제어 하에 Lucia™ 루시퍼라제 리포터를 인코딩한다. 세포를 DMEM + 10% FBS에서 배양하고, 웰 내로 시딩하고, 밤새 부착되게 하였다. 박토페션을, ssaG 프로모터의 제어 하에 pld를 인코딩하는 핵산과 함께 또는 없이 huIL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD의 균주를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 비감염 세포, 및 5 μg/ml의 STING 작용제 3'5' RpRp c-디-AMP로 처리된 비감염 세포를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 감염-후 48시간째에, 세포 상층액을 수합하고, 발현된 Lucia™ 루시퍼라제의 수준을 루시퍼라제 검정(Promega)을 사용하여 측정하였다.
아래 표에 제시된 결과는, pld가 감염 동안 인간 IL-15Rα-IL-15sc 및 STING 돌연변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 플라스미드로부터 발현되었을 때, ISRE 활성(Lucia™ 루시퍼라제 발현에 의해 측정된 바와 같음)이 pld 발현의 부재 하에서보다 더 높았음을 보여준다. ISRE 활성은 STING-유도 유형 I IFN 활성의 측정치이고, 그러므로, 세포에서 STING 변이체를 인코딩하는 플라스미드의 전달 및 STING 변이체의 발현을 나타낸다. 그러므로, 포스포리파제 D(pld)의 발현은 면역조절성 페이로드를 또한 인코딩하는 플라스미드의 전달을 증강시킨다.
Figure pct00077
실시예 29
뮤린 IL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합, 및 뮤린 항-CTLA-4 scFv-Fc와의 이의 조합은 골수성 세포로부터 CXCL10의 분비를 유도하고 T-세포의 활성화를 유도한다
T-세포 및 골수성 세포의 활성화 및 기능에 미치는 면역조절성 페이로드 및 이의 조합의 발현의 영향을 평가하였다. 이 실시예는 항원-특이적 T-세포(CD25 발현 및 IFN-γ 분비의 측면에서)의 활성화 및 골수성 세포에 의한 항종양 T-세포의 모집에 관여하는 핵심 케모카인인 CXCL10의 분비에 미치는 본원에 제공된 면역자극성 박테리아에 의한 다양한 면역조절성 페이로드 조합의 전달의 영향을 기재하고 실증한다. 분비된 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IFN-β, 및 CXCL10(IP-10)의 수준을 보호적 항종양 면역력의 상관관계로서 측정하고, CD25 세포 표면 발현을 T-세포 활성화의 마커로서 모니터링하였다. 이를 마우스 골수 유래 수지상 세포(BMDCs)를 페이로드의 다양한 조합을 인코딩하는 플라스미드로 형질주입하고, 형질주입된 수지상 세포를 자가 마우스 T-세포와 공동배양한 다음, 생성된 사이토카인을 식별험으로써 평가하였다.
면역조절성 페이로드/단백질을 인코딩하는 플라이스미드는 단일 페이로드를 인코딩하는 것, 뿐만 아니라 페이로드의 조합을 인코딩하는 것을 포함하였다. 예를 들어, 아래 표에 제시된 것과 같이, 인코딩된 페이로드는 뮤린(mu) IL-15Rα-IL-15sc(IL-15/IL-15Rα 복합체, IL-15/IL-15Rα 사슬 복합체, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, IL-15 복합체, 및 IL-15cplex로도 지칭됨); 뮤린 항-CTLA-4 scFv-Fc(클론 9D9); 및 huSTING N154S/R284G tazCTT(인간 STING을 GOF 돌연변이 N154S 및 R284G와 함께 함유하고 인간 STING의 C-말단 테일(CTT)을 태즈메니아 데빌 STING의 CTT로 대체한 키메라 단백질); 및 이의 조합을 포함하였다.
페이로드의 조합은, T2A 및/또는 P2A 펩타이드를 사용하여 단일 플라스미드에 발현되는 2개 또는 3개의 페이로드를 포함하여, 단백질은 동일한 프로모터의 제어 하에 인코딩된다. 페이로드 조합은 하기를 포함하였다: 1) 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc 및d 인간 STING N154S/R284G tazCTT; 및 2) 뮤린 항-CTLA-4 scFv-Fc, 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc, 및 인간 STING N154S/R284G tazCTT.
골수-유래 수지상 세포(BMDCs)를 STING 결핍인 Goldenticket 마우스로부터 분화시켰고, 세포를 조사된 페이로드의 다양한 조합을 인코딩하는 플라스미드로 형질주입하였다. 형질주입후 24시간째에, 세포 상층액을 수합하고, BMDC 배양 상층액에서 분비된 CXCL10의 수준을 Meso Scale Discovery의 U-Plex 검정 플랫폼을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.
CD8+ T-세포 활성화를 측정하기 위해, 형질주입된 BMDC에 CD8+ T-세포에 의해 인식되는 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 I(H-2Kb)-제한 펩타이드 에피토프인 닭 오브알부민(OVA) SIINFEKL(OVA257-264) 펩타이드로 감작시켰다. MHC 부류 I 분자 H-2Kb에 의해 제시되는 SIINFEKL에 특이적인 T-세포 수용체(TCRs)를 발현하는 Rag1-/- OT-I 마우스로부터 단리된 비장 T-세포를 공동배양을 위해 BMDC에 첨가하였다. 24시간의 BMDC/T-세포 공동배양 후, 상층액을 수합하고, 분비된 IFN-γ의 수준을 Meso Scale Discovery로부터의 U-Plex 검정 플랫폼을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.
공동배양된 세포를 또한 수합하고, CD8+ T-세포를 피코에리트린(PE)-접합 뮤린 항-CD25 항체(클론 PC61, BioLegend)로 염색하여, CD25 T-세포 활성화 마커의 발현 수준을 결정하였다.
결과를 아래 표에 요약하며, 이는 다양한 단일 및 조합 페이로드를 인코딩하는 플라스미드를 사용한 형질주입에 대한 반응으로 BMDC에 의해 분비된 CXCL10의 수준, 뿐만 아니라 CD8+ T-세포에 의해 분비된 IFN-γ의 수준, 및 형질주입된 BMDC와 공동배양 후 T-세포 활성화(CD25 발현의 측면에서)의 수준을 보여준다.
결과는 huSTING N154S/R284G tazCTT 단독이 BMDC에 의한 매우 높은 수준의 CXCL10 분비를 유도함을 보여준다. 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합 또는 뮤린 항-CTLA-4 scFv-Fc + 뮤린 IL-15Rα-IL-15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합도 BMDC에 의한 높은 수준의 CXCL10 분비를 유도한다.
결과는 또한 인간 T-세포에 의한 높은 수준의 IFN-γ 분비를 유도하고 T-세포의 활성화(CD25 발현)를 유도하는 인코딩된 페이로드의 예시적인 조합을 보여준다. 증가된 효과는 muIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합으로 관찰되었다. muIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합은 또한 CD8+ T 세포 반응의 활성화 및 CD25의 발현을 증가시킨다. 이러한 결과는 IL-15Rα-IL-15sc와 기능 획득 돌연변이 및 NF-κB 신호전달을 감소시키는 CTT 대체를 갖는 돌연변이를 갖는 STING 키메라의 변형의 조합을 종양 미세환경으로 전달하는 것이 유리한 항종양 면역 반응을 증가시키고 바람직하지 않은 염증 반응을 감소시킴을 나타낸다.
Figure pct00078
종양-체류 골수성 세포 및/또는 종양 미세환경에서 페이로드의 발현을 위해 본원에 제공된 면역자극성 박테리아 또는 종양용해성 바이러스 또는 벡터와 같은 다른 전달 비히클에 의한 인코딩된 페이로드의 이러한 조합의 전달은 치료받은 대상체에서 증가된 항종양 반응을 제공한다. 아래 실시예에서 또한 제시된 바와 같이, 키메라를 포함하여 기능-획득 돌연변이를 갖는 변형된 STING 단백질과 사이토카인의 조합은 치료받은 대상체에서 추가적인 유리한 항종양 반응을 초래한다.
실시예 30
저분자 STING 작용제와 조합된 인간 재조합 IL-15는 골수성 세포로부터 CXCL10의 분비를 유도하고, T-세포의 활성화를 유도한다
이 실시예는 T-세포 및 골수 세포의 활성화 및 기능에 대한 인간 면역조절 페이로드 및 이의 조합의 발현의 영향을 보여준다. IFN-γ 및 CXCL10(IP-10)과 같은 분비된 사이토카인의 수준을 보호 항종양 면역력의 지표로 측정하였다. 이 실시예는 재조합 단량체 인간 IL-15 사이토카인 및 2'3'-c-디-AM(PS)2(Rp, Rp), 저분자 STING(smSTING) 작용제가, 항종양 T 세포 모집에 관여하는 케모카인인 골수 세포에 의한 CXCL10의 분비 및 항원 특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 분비에 미치는 영향을 기재하고 실증한다. smSTING 작용제는 소포체-체류 STING에 의해 인식된 후 유형 I 인터페론(IFN)의 생산을 유도하는 것으로 알려진 환식 디뉴클레오타이드(CDN)이다. 2'3'-c-디-AM(PS)2(Rp, Rp)는 3'3'-환식 아데노신 모노포스페이트(c-디-AMP)의 2'3'-비스포스포로티오에이트 유사체의 Rp,Rp-이성질체이다. 이는 2'-5', 3'-5' 혼합 결합의 존재로 인해 c-디-AMP보다 STING에 대한 친화력이 더 높다. 이 유사체는 숙주 세포 또는 전신 순환계에 존재하는 포스포디에스테라아제에 의한 분해로부터 보호하기 위해 2개의 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 포함한다. 2'3'-c-디-AM(PS)2(Rp, Rp)는 관련 세포에서 유형 I IFN 및 CXCL10 생산을 강력하게 유도한다.
인간 단핵구 유래 수지상 세포(ModDCs)와 자가 인간 T-세포를 저분자(smSTING) 작용제 및 재조합 IL-15와 함께 공동배양하여 생성된 분비 사이토카인을 확인하였다. 인간 단핵구 유래 수지상 세포(ModDC)는 ImmunoCult™ 수지상 세포 배양 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 6일 동안 음성으로 분리된 단핵구로부터 분화되었다. 분화 6일 후, ModDC를 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 인플루엔자 바이러스(Flu)(인간 CD8에 대한 확장된 CEF 펩타이드 풀 T 세포, MABTECH)로부터의 32개의 MHC 부류 I-제한 바이러스 펩타이드 풀로 감작시킨 후, 자가 CD8+ T 세포를 첨가하고, 2.5 nM의 재조합 인간 IL-15 및/또는 5 μg/ml의 smSTING으로 처리하였다. 수지상 세포를 바이러스 펩타이드로 감작시키면 수지상 세포가 바이러스 항원을 세포 표면에 제시하고 항원 특이적 T 세포를 자극하여 IFN-감마를 생성한다. ModDC/T 세포 공동배양 48시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Meso Scale Discovery의 U-Plex 검정 플랫폼을 사용하여 세포 배양 상층액에서 분비된 IFN-γ 및 CXCL10의 수준을 측정하였다.
아래 표에 요약된 결과는 항원 특이적 자극 시 인간 수지상 세포에 의한 CXCL10 분비에 대한 STING 활성화 및 인간 IL-15 활성의 부가적인 효과를 보여준다. 결과는 또한 STING 활성화와 인간 IL-15와 같은 사이토카인의 조합이 상승작용적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 활성화하고 활성화된 CD8+ T 세포에 의해 높은 수준의 IFN-γ 분비를 유도한다는 것을 보여준다.
Figure pct00079
실시예 31
기능 획득 STING 변이체와 사이토카인의 조합은 항종양 면역 반응을 증강시킨다
인간 IL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합은 골수 세포에서 IFN-β의 분비를 유도하고 T 세포의 활성화를 유도한다
이 실시예는 인간 T-세포 및 수지상 세포의 활성화 및 기능에 대한 TME 및/또는 종양-체류 골수 세포에서 발현을 위해 전달되는 코딩된 인간 면역조절 페이로드 및 이의 조합의 영향을 실증한다. IFN-γ 및 IFN-β와 같은 수지상 세포 및 T-세포에 의해 분비되는 사이토카인의 수준은 방어적 항종양 면역력의 상관관계로서 측정되었다. 이 실시예는 본원에 예시된 면역자극성 박테리아 및/또는 본원에 기재된 다른 전달 비히클과 같은 종양 미세환경에 대한 다양한 면역조절 페이로드 조합의 전달이 항원-특이적 T-세포의 활성화 및 항종양 면역 반응에 관여하는 핵심 인자인 IFN-β의 분비에 미치는 영향을 설명하고 실증한다(IFN-γ 분비에 의해 실증된 바와 같이). 이는 페이로드의 다양한 조합을 인코딩하는 플라스미드로 인간 단핵구 유래 수지상 세포(ModDC)를 형질주입시키고, 형질주입된 수지상 세포를 자가 인간 T-세포와 공동배양하고, 그 결과 분비되는 사이토카인을 확인함으로써 달성되었다. 면역조절 페이로드/단백질을 인코딩하는 플라스미드는 단일 페이로드를 인코딩하는 플라스미드와 페이로드 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 예를 들어 아래 표와 같이 인코딩된 페이로드는 huIL-15Rα-IL-15sc 단독, huSTING N154S/R284G tazCTT 단독 및 huIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 포함하였다.
인간 단핵구 유래 수지상 세포(ModDC)는 제조업체의 설명서에 따라 6일 동안 ImmunoCult™ 수지상 세포 배양 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 음성으로 분리된 단핵구로부터 분화되었다. 분화 6일 후, Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 DNA 형질주입 시약(Origene)을 사용하여 다양한 조사된 페이로드 및 이의 조합을 인코딩하는 플라스미드로 ModDC를 형질주입하였다. 형질주입 4시간 후, ModDC를 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 인플루엔자 바이러스(Flu)로부터의 32개의 MHC 부류 I-제한 바이러스 펩타이드 풀(인간 CD8 T 세포에 대한 확장된 CEF 펩타이드 풀, MABTECH) CEF 펩타이드 풀)로 감작시킨 후, 자가 CD8+ T 세포를 세포 배양에 첨가하였다. 형질주입된 수지상 세포를 또한 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) 역전사효소로부터의 무관한 펩타이드로 감작시키고, T-세포의 펩타이드 자극을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. HIV-1 음성 공여자의 CD8+ T 세포를 사용하였다. ModDC/T 세포 공동배양 48시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Meso Scale Discovery의 U-Plex 검정 플랫폼을 사용하여 세포 배양 상층액에서 T 세포에 의해 분비된 IFN-γ의 수준을 측정하였다.
별도의 실험에서 ModDC를 Viromer® RED mRNA 및 플라스미드 DNA 형질주입 시약(Origene)을 사용하여 조사된 다양한 페이로드 및 이의 조합을 인코딩하는 플라스미드로 형질주입하였고 48시간 동안 배양하였다. 형질주입된 ModDC의 세포 배양 상층액을 형질주입 48시간 후 수합하고 분비된 IFN-β의 수준을 Meso Scale Discovery의 U-Plex 검정 플랫폼을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하였다. 인간 수지상 세포에 의한 IFN-β의 분비에 미치는 인코딩된 페이로드의 영향을 분석하기 위해, 플라스미드 대조군(베타-액틴)에 대해 측정된 IFN-β의 농도를 다른 모든 군에서 차감하였고, 이는 인코딩된 페이로드의 활성에서만 발생하는 순 IFN-β 농도를 제공하였다.
하기 표에 요약된 결과는 인간 수지상 세포에 의한 IFN-β의 분비에 미치는 huIL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT 활성의 조합의 상승 효과를 보여준다. 결과는 또한 항원 특이적 CD8+ T-세포의 활성화 및 활성화된 T 세포에서 높은 수준의 분비된 IFN-γ에 미치는 적어도 부가적인 huIL-15Rα-IL-15sc와 huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합 효과를 보여준다.
Figure pct00080
인코딩된 페이로드의 조합 효과가 암의 마우스 모델에서 관찰된 치유에 의해 입증된 바와 같이 상승작용 결과를 유발한다는 것은 다음 실시예에서 제시된다.
실시예 32
muIL-15Rα-IL15sc, huSTING N154S/R284G tazCTT 및 뮤린 항i-CTLA-4 scFv-Fc의 조합은 삼중 음성 유방암의 고도로 불응성인 마우스 모델에서 우수한 항종양 효능을 실증한다
이전의 실시예(실시예 31)에서 관찰된 상승작용 효과가 이 실시예에서 추가로 제시되며, 이는 페이로드의 조합이 치유를 수행함에 있어 상승작용적으로 작용함을 보여준다. CPI(면역 체크포인트 저해제) 성불응 삼중 음성 유방암의 동소성, T 세포 배제 및 전이성 모델에서 생체내 효능에 대해 다양한 페이로드 조합을 평가하였다. 이 실험을 위해 6-8 주령의 암컷 BALB/c 마우스(군당 8 마리)에 EMT6 종양 세포(ATCC® CRL-2755™)(100 μL PBS 중 1x106 세포)를 왼쪽 유선 지방 패드에 접종하였다. 7일된 유선 종양(부피 약 65 mm3)이 있는 마우스에 다양한 페이로드를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주의 1 x107 CFU의 단일 용량을 정맥내(IV) 주사하거나, 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙 100 μg을 매주 복강내(IP) 주사와 함께 투여하였다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주는 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT, 또는 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT + muAnti-CTLA-4 scFv-Fc, 또는 β-액틴을 인코딩하는 대조군 플라스미드를 PBS 대조군으로 처리한 것과 비교하였다.
결과는 아래 표에 요약되어 있다. PBS 치료된 마우스의 종양은 고르게 성장하여 31일에 최대 종양 부피에 도달하였다. 대조군 β-액틴 플라스미드로 마우스를 처리한 결과 항종양 효능의 많은 증거가 실증되지 않았으며(5% 종양 성장 저해(TGI), 2/8 치유), IP 항-PD-L1 단독 치료(17.9% TGI, 1/8 치유)도 하지 않았다. muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 균주로 IV 처리된 마우스는 단일요법 효능(59.8% TGI, 3/8 치유)을 실증하였으며, 이는 IP 항-PD-L1의 조합으로 향상되었다(77.3% TGI, 5/8 치유). muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT + muAnti-CTLA-4 scFv-Fc의 조합도 상당한 단일요법 효능(62.4% TGI, 4/8 치료)을 실증하였다.
치료용 페이로드 조합은 내약성이 매우 우수하였으며 마우스는 연구 중에 체중이 감소하지 않았다. 이러한 데이터는 동소, T 세포 제외 및 체크포인트 저해제 불응 삼중 음성 유방암(TNBC)의 전이성 모델에서 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT 단독 또는 IP 투여된 항-PD-L1로 증강된 조합, 및 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT + muAnti-CTLA-4 scFv-Fc를 인코딩하는 IV 투여된 면역자극성 박테리아의 생체내 효능을 실증한다.
Figure pct00081
고용량 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT 병용 요법의 효능을 평가하고 별개의 투여된 muIL-15Rα-IL15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT의 효능과 비교하기 위해 후속 연구를 수행하였다. muIL-15Rα-IL15sc, huSTING N154S/R284G tazCTT 또는 이의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주를 3e7 CFU 용량으로 정맥내(IV) 투여하여 7 일된 확립된 유선 종양을 PBS 대조군과 비교하였다. PBS 치료된 마우스의 종양은 고르게 성장하여 31일에 최대 종양 부피에 도달하였다. 아래 표에 표시된 바와 같이, muIL-15Rα-IL15sc를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 균주로 처리된 마우스 또는 huSTING N154S/R284G tazCTT 단독은 각각 2/10이 치료되는 반면, muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합은 7/10이 치료되었다.
Figure pct00082
이러한 데이터는 완전한 반응을 촉진하기 위한 사이토카인과 변형된 STING 단백질의 조합, 예컨대 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합의 상승작용 효과를 보여준다. 이러한 결과는 조합의 일반적인 항종양 치료 효능을 강조하는 매우 불응성인 유방암 모델에서 달성되었기 때문에 특히 중요한다. 이러한 결과는 IL-15Rα-IL15sc 융합 단백질과 같은 사이토카인과 STING 단백질, 특히 고도로 활성인 STING 단백질, 예를 들어 기능 획득의 항시적 활성 STING 변이체, 또는 NF-κB 신호 전달이 감소하도록 추가로 변형된 기능 획득의 항시적 활성 STING 변이체의 조합의 상승작용적 항종양 약효를 나타낸다.
muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT 병용 치료군(상기 기재됨)의 치유된 마우스는 동소 EMT6 종양 재공격 연구 및 CD8+ T-세포 의존적 방식에서 지속적인 항종양 면역력을 촉진하는 능력에 대해 평가되었다. 이 연구를 위해 20 마리의 치유된 마우스를 각각 10 마리씩 2개 군으로 나누고, 종양 재공격 전 제3일 및 제1일(각각 초기 종양 이식 후 제56일 및 제58일)에 각각의 마우스에 100 μg의 항-CD8β 항체(CD8α+ 수지상 세포를 고갈시키지 않음) 또는 100 μg의 IgG 이소형 대조군을 IP 주사하였다. 마우스는 CD8+ T-세포 고갈을 확인하기 위해 종양 재공격 전에 채혈되었고, 평균 순환 CD8+ T-세포는 이소형 대조군의 경우 5.72%, 항-CD8β 항체의 경우 0.48%인 것으로 결정되었다. 그 후에, 마우스를 1e6 EMT6 종양 세포로 반대쪽 유선 지방 패드에서 동소적으로 재공격하고 미접촉 연령-일치 대조군 마우스(N=10)와 비교하였다. 미접촉 군의 마우스는 모두 30일까지 종양이 최대 종양 부피로 성장하였다. 항-CD8β 항체 고갈 군의 재공격된 마우스는 미접촉 마우스보다 훨씬 더 공격적으로 종양이 성장한 반면, IgG 아이소타입의 모든 10 마리의 재공격된 마우스는 종양을 성장시켰다. 항체 대조군(즉, CD8+ T-세포 고갈이 없는 마우스)은 종양 재공격으로부터 보호되었다. 이러한 데이터는 예를 들어 muIL-15Rα-IL15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 박테리아 균주와 같은 면역자극성 박테리아에서 전달될 때 사이토카인과 변형된 기능 획득의 항시적 활성 STING 단백질 변이체의 조합의 중요하고 지속적인 항종양 효능을 실증한다. 치료 페이로드/단백질의 조합은 박테리아의 IV 투여 후 높은 치료율을 유도하고 마우스는 CD8+ T 세포 의존 방식으로 종양 재공격으로부터 보호된다.
실시예 33
DLL3xCD3 TCRA(T-세포 재지향 항체) 설계
T-세포 재지향 항체(TCRA) 또는 T-세포 재지향 이중특이적 항체(TRBA)는 T-세포 수용체(TCR) 기능 독립적인 T-세포 기초 면역 요법으로, TCR 복합체의 구성요소인 분화 클러스터 3(CD3)의 엡실론(ε) 도메인은 하나의 결합 도메인에 의해 표적화되는 반면, 제2 결합 도메인은 종양 세포 표면 항원을 표적으로 한다. TCRA에는 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 2개의 단일 사슬 가변 단편(scFvs)의 융합 단백질인 조작된 항체 기초 면역 요법인 이중특이적 T 세포 연계자(상표 BiTEs®로 판매됨)가 포함된다.
TCRA는 종양 세포 표면 항원과 T 세포의 CD3에 동시에 결합하여 T 세포의 세포용해 활성을 표적 종양 세포에 선택적으로 지향시킴으로써 MHC 독립적 및 TCR 기능 독립적인 방식으로 T 세포와 종양 세포 사이의 세포용해성 시냅스 형성을 유도한다. 세포용해 시냅스의 형성 후, T 세포는 퍼포린 및 그랜자임(예를 들어 그랜자임 B)과 같은 세포독성 단백질을 방출하여 종양 세포의 세포자멸사를 유발한다. T 세포의 활성화는 사이토카인의 방출로 이어져 다른 면역 세포와 결합하고 더 광범위한 항종양 면역 반응을 유도한다. 이로 인해 염증이 없는(또는 차가운) 종양 환경이 염증이 있는(또는 뜨거운) 환경으로 전환되어 T 세포의 침투 및 증식과 종양 세포의 사멸을 초래한다. 원래 BiTE® 항체는 반감기가 짧다; 후기 세대 BiTE® 항체는 Fc에 대한 융합으로 인해 연장된 반감기를 갖는다(예를 들어, Hipp et al. (2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268; 및 Strohl, W. R. 및 Naso, M. (2019) 항체 8:41).
델타 유사 리간드 3(DLL3)은 배아 발달 동안 노치 신호 전달에서 역할을 하는 저해성 노치 경로 리간드이다. DLL3은 정상 조직에서 배아 발달 동안 세포내에서 발현되며 태아 뇌에서 가장 많이 발현되지만 성인 정상 조직에서는 존재하지 않는다. DLL3은 소세포 폐암(SCLC) 및 다른 고등급 신경내분비 종양과 같은 특정 종양에서 과발현되며, 세포 내에서 발현되는 대신 세포 표면으로 탈출하여 항체 기초 치료제로 표적화할 수 있다(예를 들어, Hipp et al.(2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268 참조). DLL3은 또한 흑색종, 다형 교모세포종, 소세포 방광암, 전이성 거세 저항성 전립선암 및 신경내분비 폐 종양을 포함하는 신경내분비 기원의 다른 종양 유형에서 발현된다(예를 들어, Owen et al. (2019) Journal of Hematology & 종양학 12:61); 따라서 TCRA 기초 요법의 유용한 표적이다.
DLL3xCD3 TCRA(각각 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO: 410 및 411 참조; 또한 Hipp et al. (2020) Clin. Cancer Res. 26:5258-5268 참조)를 항-DLL3 클론 hSC16.56 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역(각각 VL 및 VH)(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 2013/126746 참조), 및 항-CD3ε 클론 145-2C11 항체(BioLegend에서 입수 가능)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터 제조하였다.
작제물은 TCRA의 분비를 위한 pSecTag2 벡터(SEQ ID NO: 411의 잔기 1-21에 해당; 예를 들어, addgene.org 참조)로부터의 마우스 IgGκ 리더/신호 서열을 포함하였다. 항-DLL3 VH 도메인(SEQ ID NO: 411의 잔기 22-139에 상응함)은 15개 아미노산 길이 (Gly4Ser)3 링커(SEQ ID NO: 411의 잔기 140-154에 상응함)를 통해 항-DLL3 VL 도메인(SEQ ID NO: 411의 잔기 155-261에 상응함)에 연결되어, 항-DLL3 scFv를 형성하였다. 5개 아미노산 길이의 Gly4Ser 링커(SEQ ID NO: 411의 잔기 262-266에 상응함)를 항-DLL3 scFv와 항-CD3 scFv 사이에 삽입하였다. 항-CD3 scFv는 제2 (Gly4Ser)3 링커(SEQ ID NO: 411의 잔기 383-397에 상응함)를 통해 항-CD3 VL 도메인(SEQ ID NO: 411의 잔기 398-504에 상응함)에 연결된 항-CD3 VH 도메인(SEQ ID NO: 411의 잔기 267-382에 상응함)을 함유한다. 이 작제물은 항-DLL3 및 항-CD3 항체의 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변 도메인이 분자에 나타나는 순서를 나타내기 위해 DLL3HL x CD3HL로 표기되었다. 검출을 위해 플래그 태그(DYKDDDDK; SEQ ID NO: 412)를 이 작제물의 C-말단 단부에 첨가할 수 있다(플래그 태그-표지화된 DLL3xCD3 TCRA의 경우 DLL3HL x CD3HL-FLAG TCRA로 표기됨, SEQ ID NO: 413 참조).
DLL3LH x CD3HL TCRA(각각 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대해 SEQ ID NO: 414 및 415 참조)로 표기된 또 다른 DLL3xCD3 TCRA 작제물을 DLL3HL x CD3HL 작제물과 유사하게 작제하였으나, 표기가 의미하는 바와 같이 항-DLL3 scFv는 항-DLL3 VH 도메인에 대해 N-말단에 배치된 항-DLL3 VL 도메인을 함유한다. TCRA의 항-CD3 scFv 부분, GS 링커 및 분비를 위한 리더 서열은 모두 위에서 DLL3HL x CD3HL 구조에 대해 설명한 것과 같다. DLL3LH x CD3HL-FLAG TCRA로 표기된 DLL3LH x CD3HL TCRA 작제물의 플래그 태그-표지된 버전(각각 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대해 SEQ ID NO: 416 및 417 참조)을 또한 작제하였다.
실시예 34
표적 결합, 접합 및 세포독성에 대한 T-세포 재지향 항체(TCRA)의 평가
CD19 및 CD3와 같은 CD(분화 클러스터) 항원에 대한 항체는 항암 표적이다. 특정 CD 항원의 발현은 특정 계통 림프조혈 세포로 제한된다. 림프구 특이 항원에 대한 항체가 치료제로 개발되었다. CD19는 B 세포에서 발현되고, 떨어져 나가지 않고, 모든 림프종 세포에서 균일하게 발현되며, 줄기세포에는 없기 때문에 유용한 표적이다. CD3는 CD3ε, CD3δ 및 CD3γ의 세 가지 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로 T 세포에서 발현된다. 고정된 항-CD3 항체에 의한 것과 같은 T-세포 상의 CD3 클러스터링은 T-세포 수용체(TCR)의 결합과 유사한 T-세포 활성화를 초래하지만, 이의 클론의 전형적인 특이성과는 독립적이다. 각각의 CD19 및 CD3 항원에 대한 이중특이적 항체는 MHC-독립적 방식으로 그리고 T-세포 사전-자극 또는 공동자극 없이 CD-19 양성 세포(예를 들어 림프종 세포)에 대한 T-세포 세포독성을 재표적화한다. 따라서, 이러한 분자는 지속적인 T-세포 매개 항종양 면역력을 유도하고 항암 치료제로서 특히 유용하다.
항-CD19 및 항-CD3 TCRA의 FLAG-태그 변이체 서열, MT103(SEQ ID NO: 418; 또한 만료된 미국 특허 번호 7,112,324 참조)을 pATI1.75(상기 기재됨)로 표기된 벡터 내로 클로닝하였다. MT103 TCRA 작제물은 리더 서열(SEQ ID NO: 418의 잔기 1-19에 상응함), 뒤이어 플래그 태그(DYKDDDDK; SEQ ID NO: 418의 잔기 20-27에 상응함) 및 항-CD3 scFv에 연결된 항-CD19 scFv를 함유한다. 항-CD19 scFv는 (GGGGS)3 링커(SEQ ID NO: 418의 잔기 139-153에 상응함)를 통해 항-CD19 VH 도메인(SEQ ID NO: 418의 잔기 154-277에 상응함)에 연결된 항-CD19 VL 도메인(SEQ ID NO: 418의 잔기 28-138에 상응함)을 포함한다. 항-CD19 scFv는 GGGGS 링커(SEQ ID NO: 418의 잔기 278-282에 상응함)를 통해 항-CD3 scFv에 연결된다. 항-CD3 scFV는 펩타이드 링커(VEGGSGGSGGSGGSGGVD; SEQ ID NO: 418의 잔기 402-419에 상응함)를 통해 항-CD3 VL 도메인(SEQ ID NO: 418의 잔기 420-525에 상응함)에 연결된 항-CD3 VH 도메인(SEQ ID NO: 418의 잔기 283-401에 상응함)을 함유한다. 작제물은 또한 His 태그(His6; SEQ ID NO: 418의 잔기 526-531에 상응함)를 포함한다.
HEK293T STING Null Cells(293-Dual™ Null Cells; InvivoGen)를 폴리-L-리신으로 코팅된 6-웰 플레이트에 웰당 1.5e6개 세포로 시딩하고 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 80% 합류도를 달성할 때까지 밤새 배양하였다. 이튿날, 3000 ng의 MT103 플라스미드 DNA를 무혈청 배지에 희석시키고 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 첨가하고 형질주입되지 않은 웰을 음성 대조군(2벌 중복)으로 사용하면서 세포에 형질주입하였다. 각 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입후 48시간째에 수집하였다. 상층액을 깔끔하게 유지시키거나 Amicon® Ultra 4 mL 원심분리 필터(Millipore Sigma)를 사용하여 농축시켰다.
발현된 MT103(CD19xCD3) TCRA의 기능성을 확인하기 위해, Raji 세포(ATCC에서 구입) 및 Jurkat-Lucia™ NFAT 세포(InvivoGen)를 사용한 유세포분석 실험을 수행하였다. Raji 세포는 CD19를 고도로 발현하는 인간 림프구 세포이고, Jurkat 세포는 CD3를 발현하는 인간 T-림프구이다. 200,000개의 Raji 세포 및 200,000개의 Jurkat 세포를 각각 PBS + 2% FBS에서 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 세척하였다. 그 후에, 발현된 TCRA를 포함하는 순수 또는 농축 세포 배양 상층액 50 μL를 세포에 첨가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 PBS + 2% FBS에 재현탁하고 APC 표지 항-플래그 태그 항체(BioLegend)로 염색하였다. APC 표지된 항-플래그 태그 항체는 Raji 세포의 CD19 및/또는 Jurkat 세포의 CD3에 결합하는 모든 MT103 TCRA(플래그 태그 포함)를 표지하기 위해 첨가된다. 30분 인큐베이션 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 2회 세척한 다음, DAPI(사멸/생존 염색)가 있는 PBS + 2% FBS에 재현탁하였다. Raji 세포 상의 CD19에 대한 CD19xCD3 MT103 TCRA의 임의의 결합 및/또는 Jurkat 세포 상의 CD3에 대한 TCRA의 결합을 검출하기 위해 유세포분석을 수행하였다. 각 시료에 대해 50,000개의 이벤트가 수집되었다. ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석 데이터를 수집하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 표에 나타난 바와 같이, 순수한 또는 농축된 MT103 함유 세포 배양 상층액과 함께 인큐베이션된 Raji 및 Jurkat 세포에서 검출된 APC의 중간 형광 강도(MFI)는 형질주입되지 않은 세포 배양 상층액과 함께 인큐베이션된 세포에서 검출된 MFI보다 훨씬 높았으며, 이는 MT103 TCRA가 CD19- 및 CD3-발현 세포에 결합함을 나타낸다.
Figure pct00083
추가로, CD19xCD3 MT103 TCRA 작제물은 Raji 및 Jurkat-Lucia™ NFAT 세포의 공동배양에서 시험되었다. Jurkat-Lucia™ NFAT 리포터 세포주는 NFAT 유도성 Lucia™ 구조를 포함하고 있으며, 여기서 Lucia™ 루시퍼라제의 발현은 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자; 전사 인자) 컨센서스(consensus) 전사 반응 요소의 6개 복사체에 융합된 ISG54 최소 프로모터에 의해 구동된다. 따라서 Jurkat-Lucia™ NFAT 세포는 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 모니터링하여 NFAT 활성화를 연구하는 데 사용할 수 있다; Lucia™ 루시퍼라제 검출 시약인 QUANTI-Luc™을 사용하여 세포 배양 상층액에서 Lucia™ 루시퍼라제 수준을 측정할 수 있다. 이 실험에서 CD19를 발현하는 Raji 세포와 CD3를 발현하는 Jurkat 세포 모두에 대한 MT103 TCRA의 결합은 Jurkat 세포(T 세포)를 활성화시켜, Jurkat 세포의 활성화 수준을 결정하기 위해 측정될 수 있다.
Jurkat 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 5e4 세포로 시딩하였다. Raji 세포는 각각 1:2 또는 1:1의 이펙터:표적(Jurkat:Raji) 비율에 대해 웰당 1e5 또는 5e4 세포로 시딩되었다. 공동배양된 세포는 순수한 또는 농축된 MT103 함유 세포 배양 상층액과 함께 또는 없이 배양되었다. 순수한 또는 농축된 상층액의 10배, 100배 및 1000배 희석액을 준비하고 공동배양물과 함께 인큐베이션하였다. 유도된 NFAT 리포터로 인한 발광(즉, 분비된 Lucia™ 루시퍼라제 활성)은 공동배양물에 TCRA를 첨가한 후 6시간 및 24시간에 검출되었다.
결과는 아래 표에 요약되어 있으며, 이는 MT103 TCRA의 활성이 MT103을 첨가하지 않은 대조군 시료 및 Raji(표적) 세포와의 공동배양이 없는 대조군 시료와 비교하여 Jurkat-Lucia™ NFAT 리포터 세포주로부터 증가된 발광을 초래함을 보여준다. NFAT-inducible Lucia™ 리포터 구조에서 발생하는 발광은 용량 의존 방식으로 MT103의 희석에 따라 감소한다. 더 긴 배양 시간(24시간 대 6시간)은 예상대로 증가된 발광을 초래하며, 이는 증가된 T 세포 활성화를 나타낸다.
Figure pct00084
Figure pct00085
인간 CD8+ T 세포와 Raji 세포(버킷 림프종 세포, 즉 종양 세포)의 공동배양을 사용하여 세포독성 분석을 수행하였다. EasySep™ 인간 T-세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 인간 CD8+ T-세포를 분리한 다음 RPMI + 2% FBS에 재현탁하고 96-웰 플레이트에 시딩하였다. CD8+ T 세포를 웰당 1e5 세포 또는 웰당 5e4 세포로 시딩하고, Raji 세포를 웰당 10,000개 세포로 시딩하여 이펙터:타겟(T 세포:Raji 세포) 비율을 10:1 또는 5:1로 하였다. 농축 또는 순수 MT103 함유 상층액을 RPMI + 2% FBS에서 10배, 100배 및 1000배 희석한 다음 각 상층액 시료 50 μL를 공동배양에 첨가하였다. 5시간의 공동배양 인큐베이션 후 상층액을 수집하고 제조업체의 설명서에 따라 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석(Promega)을 사용하여 분석하였다. % 세포독성은 제조업체의 설명서에 따라 계산되었다.
아래 표에 나타난 바와 같이, MT103의 양이 많을수록(농도) % 세포독성이 높아진다. % 세포독성은 MT103 함유 상층액이 용량 의존적으로 10배, 100배, 1000배 희석됨에 따라 감소한다.
Figure pct00086
실시예 35
발현 플라스미드에서 인코딩된 종양-연관 항원의 면역자극성 박테리아 전달
이 실시예는 면역자극성 박테리아에 의해 전달될 수 있는 예시적인 종양-연관 항원(TAA)을 기재한다. 조작된 면역자극성 박테리아로 치료할 때 종양-연관 항원을 대식세포 및 수지상 세포와 같은 종양-체류 골수 세포로 전달하면 항종양 반응을 일으키는 항원 특이적 T 세포의 프라이밍 및 활성화가 가능하다.
면역자극성 박테리아의 플라스미드에 의해 코딩되는 종양-연관 항원 중에는 종양태아 또는 암바이러스로 분류되는 항원이 있다. 일부 항원은 과발현되거나 종양에 축적된다. 항원에는 혈통 제한, 돌연변이 또는 번역 후 변경된 항원이 포함된다. 이러한 각각의 범주에서 종양-연관 항원의 비제한적 예 및 관련 암 유형(적응증)이 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00087
Figure pct00088
실시예 36
진핵 세포에서 박테리아-유래 RNA 전달로부터의 이소성 단백질 합성
상세한 설명에 기재된 바와 같이, 플라스미드 DNA 전달에 더하여, 면역자극성 박테리아를 사용하여 mRNA와 같은 박테리아 유래 RNA를 감염된 골수 세포로 직접 전달할 수 있다. RNA의 직접 전달은 숙주 세포 핵으로의 플라스미드 DNA의 적절한 트래피킹뿐만 아니라 진핵 전사 및 번역 머시너리에 의존하는 플라스미드 DNA 전달의 필요성을 제거한다. mRNA와 같은 RNA의 직접 전달은 숙주 트래피킹 및 전사 과정을 우회하여 단백질 생산을 위한 진핵 번역 머시너리에만 의존한다. 박테리아 유래 RNA의 전달은 박테리아에서 외래 단백질의 문제 번역을 방지하기 위해 박테리아 번역에서 박테리아 전사의 분리를 필요로 한다. 많은 진핵 단백질은 적절한 접힘 조건, 소포체, 이황화 결합을 포함한 적절한 번역 후 변형, 접힘을 위한 숙주 샤페론을 필요로 하는 복잡한 단백질이다. 박테리아에서 외래 단백질의 과발현은 균주 적합성을 감소시키고 배가 시간을 감소시키며 균주 안정성을 감소시킬 수 있다.
면역자극성 박테리아로 치료하는 동안 mRNA 전달이 일어난다는 것을 입증하기 위해 일련의 플라스미드를 개입 뇌척수심근염(encephalo-myocarditis) 리보솜 진입 부위(EMCV IRES)의 존재 및 부재 하에 mu4-1BBL_T2A_muIL-12p70 HPRE bGHpA의 발현을 유도하는 진핵생물 또는 박테리아 프로모터로 조작하였다. 박테리아에서 기능하지 않는 EMCV IRES는 원핵생물의 번역을 감소시키고 진핵생물의 번역을 향상시킨다. 박테리아에서 기능하는, 바이러스의 디시스트로비리대(Dicistroviridae) 과로부터의 알려진 진핵 IRES는 단 하나뿐이다(예를 들어, Colussi et al. (2015) Nature 519(7541):110-113 참조). 따라서 일반적으로 IRES 요소는 박테리아에서 기능하지 않는다. 프로모터-IRES(또는 프로모터-코작) 조합도 mCherry 형광 리포터 유전자(Takara Bio)에 클로닝하여 조절 서열의 박테리아 발현을 형광으로 신속하게 평가할 수 있다.
형광 mCherry 단백질의 박테리아 발현을 측정하기 위해 박테리아 균주의 밤새 배양물을 PBS에서 세척하고 OD600에서 0.1로 정규화하였다. 모든 박테리아 배양에 대해 NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석기로 mCherry 발현 백분율을 분석하였다. 감염된 1차 인간 M2 대식세포와 HEK-Blue™ IL-12 리포터 세포(InvivoGen)의 공동배양 시스템을 사용하여 박토펙션 후 이소성 유전자 발현 수준을 측정하였다. HEK-Blue™ IL-12 세포는 IL-12 수용체뿐만 아니라 IL-12 신호 경로의 유전자 및 STAT4 유도성 SEAP 리포터 유전자를 발현하는 HEK293 세포이다. HEK-Blue™ IL-12 세포 표면에 있는 IL-12 수용체에 대한 IL-12의 결합은 STAT-4의 활성화로 이어지는 신호 캐스케이드를 촉발하고 이후 SEAP를 생성한다. HEK-Blue™ IL-12 세포의 상층액에서 SEAP 검출은 QUANTI-Blue™ 용액을 사용하여 쉽게 평가할 수 있다. 따라서, 이러한 리포터 세포는 IL-12의 발현을 측정하는 데 사용된다.
일차 인간 단핵구는 100 ng/ml M-CSF를 포함하는 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지에서 3일 동안 분화한 다음, 200 ng/ml M-CSF, 20 ng/ml IL-4, 및 20 ng/ml IL-10을 함유하는 추가 배지로 4일 더 보충하였다. 그 후에, 세포를 정지기 면역자극성 박테리아로 감염시키고 4XYT 배지에서 37℃, MOI 50에서 밤새 성장시켰다. 세포에 박테리아를 접종하고 500 rcf에서 5분 동안 원심분리한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 DPBS로 두 번 세척한 다음 100 μg/ml 겐타마이신을 함유한 신선한 ImmunoCult™-SF 대식세포 배지에서 인큐베이션하여 세포외 박테리아를 제거하였다. 감염된 대식세포를 HEK-Blue™ IL-12 리포터 세포와 2.5:1의 비율로 공동배양하였다(대식세포 대 HEK-Blue™ 세포). 감염 후 48시간째에 세포 배양 상층액 5 μl를 QUANTI-Blue™ 용액(SEAP를 검출함) 180 μl와 함께 배양하고 37℃에서 인큐베이션하여 발색되도록 하였다. 따라서 감염된 대식세포에 의한 IL-12의 발현은 세포 표면의 IL-12 수용체에 IL-12가 결합할 때 HEK-Blue™ 세포에 의해 생성되는 상층액의 SEAP 수준을 측정하여 평가된다.
아래 표에 요약된 결과는 감염된 대조군(EF-1α-NanoLuc® 루시페라아제)이 일차 인간 M2 대식세포에서 IL-12 발현의 기준선 수준을 자극하고 박테리아에서 mCherry 발현으로부터 매우 적은 형광을 나타냄을 보여준다. CMV-코작 쌍은 박토펙션 후 더 높은 수준의 IL-12 발현과 더 높은 수준의 mCherry 단백질 발현을 유도한다. 이는 박테리아의 CMV 프로모터에서 발생하는 낮은 수준의 박테리아 "누출" 때문이다. 시험된 2개의 박테리아 프로모터인 rpsM 및 MTL은 코작 서열과 쌍을 이룰 때 CMV 프로모터보다 낮지만 EF-1α-나노루시퍼라제 대조군보다 높은 1차 인간 M2 대식세포에서 IL-12 발현 수준을 유도하고, 두 프로모터 모두 박테리아에서 높은 수준의 mCherry 단백질 발현을 유도한다. 이러한 결과는 박테리아 프로모터가 진핵 숙주에서 기능하지 않기 때문에 mRNA 전달이 발생하고 있음을 나타낸다. IL-12 리포터 단백질의 발현 수준은 박테리아 프로모터가 IRES와 결합될 때 더 높으며, 이는 전달된 mRNA로부터의 단백질 발현이 진핵 IRES의 존재에 의해 번역 수준에서 향상됨을 나타낸다. IRES의 존재는 또한 박테리아에서 mCherry 발현의 양을 감소시키며, 이는 RNA의 2차 구조가 박테리아 프로모터와 결합된 경우에도 발현을 저해함을 나타낸다.
작제물에 IRES를 포함하면 프로모터의 다운스트림 및 개시 코돈 앞에 박테리아의 번역이 저해되거나 방지되어 박테리아가 mRNA의 전달제 역할을 한다. 본 출원에서 제공되는 면역자극성 박테리아와 같은 박테리아는 조직-체류 대식세포(예를 들어, 종양-체류 골수 세포)와 같은 숙주 세포를 감염시키고 인코딩된 RNA를 숙주 세포로 전달하도록 설계된다. 박테리아는 asd - 와 같이 영양요구성이어서 시험관 내에서 성장할 수 있지만 인간과 같은 숙주에 도입되면 성장하지 않는다. 박테리아는 내용물을 숙주 세포에 전달하고 번식하지 않는다.
Figure pct00089
박테리아는 인코딩된 RNA를 생성하기 위해 시험관 내에서 배양되며, IRES 또는 박테리아 번역을 방지하거나 저해하는 다른 그러한 조절 서열의 존재로 인해 박테리아에 의한 RNA와 같은 RNA의 생성을 초래한다. 박테리아에 의한 인간 대식세포와 같은 진핵 숙주 세포의 감염 시, RNA는 번역되어, 예를 들어 항원과 같은 인코딩된 생성물을 생성한다.
박테리아는 RNA 전달을 위한 유리한 용기인데, 박테리아는 대량으로 쉽게 배양된 다음 저장 및/또는 제형화되거나 분말, 정제 또는 주사용 액체로 제공될 수 있기 때문이다. 이는 정맥내 및 코 또는 폐를 통한 점막을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이는 매우 안정적이며 많은 양의 RNA를 안정적으로 제공할 것이다.
본원에서 제공되는 면역자극성 박테리아는 예를 들어 백신으로 사용되거나 바이러스 항원 및/또는 다른 단백질을 인코딩하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(COVID-19를 유발하는 SARS-CoV-2)는 전장 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(예를 들어 SEQ ID NO: 438 참조)을 인코딩하거나 전장 수용체 결합 도메인( SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SEQ ID NO: 440 참조)의 RBD) 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SEQ ID NO: 440 참조), 또는 면역 반응을 유도하거나 유발하기 위해 그리고/또는 SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화 또는 백신화하거나 보호하기 위해 충분한 스파이크 단백질 RBD(예를 들어 SEQ ID NO: 441 참조)의 일부를 인코딩할 수 있다. 면역자극성 박테리아는 또한, 스파이크 단백질 또는 이의 일부의 발현을 증가시키거나 증강시키고/시키거나 ACE2 수용체에의 스파이크 단백질 또는 RBD 또는 이의 일부의 결합을 증가시키거나 증강시키는 RBD 또는 이의 부분와 같은 스파이크 단백질 또는 이의 일부에서의 돌연변이와 함께 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 돌연변이체를 인코딩하는 mRNA를 전달할 수 있다.
스파이크 단백질 또는 스파이크 단백질 RBD 돌연변이체는 스파이크 단백질 또는 이의 일부의 돌연변이 V367F, D614G, G476S, V483A, H49Y, N501Y, N501F, N501W, N501V, F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, V987P, V417K, G502D, N501T, Q498Y, W436R 및 D364Y, 및 잔기 N439/R426, L452/R426, T470/N457, E484/P470, Q498/Y484 및 N501/T487에 상응하는 잔기에 돌연변이를 포함하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본원에 기재되고 당업계에 알려진 임의의 것을 포함한다. 면역자극성 박테리아는 예를 들어 U.S. 특허 번호 10,973,908 및 10,702,600. 면역자극성 박테리아는 또한 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 Pfizer-BioNTech COVID-19 백신 및 Moderna COVID-19 백신에서 mRNA를 전달하기 위해 백신/mRNA 전달용으로 사용될 수 있다. 항원으로 사용하기 위한 SARS-CoV-2 단백질은 예를 들어 스파이크 단백질, 뉴클레오캡시드 및 M 단백질 및 이의 항원 부분을 포함한다. 면역자극성 박테리아는 인플루엔자 유형 A 균주(H1 및 H3) 및 인플루엔자 유형 B 균주와 같은 다양한 균주로부터 HA 단백질에 대한 항체를 이끌어내는 독감 백신과 같은 범용 독감 항원을 전달하는 데 사용될 수 있다. 다른 조합에는 FlusMos-v1과 같은 HA 에피톱의 반복 패턴이 포함된다. 예를 들어, 키메라 헤마글루티닌 기초 범용 인플루엔자 백신을 제공하는 Nachbaguer et al. (2021) Nature Medicine 27:106-114를 참조한다.
실시예 37
인간 IL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT를 포함하는 면역조절 균주는 자가 뮤린 종양을 콜로니화한다
이전에 약독화 살모넬라 균주 YS1646이 4T1 뮤린 유방 이식 모델(평균 종양 크기 400 mm3, 평균 CFUs/g = 108)에서 종양을 콜로니화할 수 있지만 자발적인 BALB-NeuT 유선 종양 모델(평균 종양 크기 400 mm3, 평균 CFUs/g = 103; 예를 들어, Drees et al. (2015) J. Cancer 6(9):843-848 참조)를 콜로니화할 수 있는 능력이 현저히 낮다고 보고되었다.
본원에서 제공되는 면역자극성 박테리아가 이식된 종양과 비교하여 자발적 종양 콜로니화에서 유사한 결핍을 갖지 않음을 보여주기 위해, 동소 이식된 유방암의 EMT6 마우스 모델로부터 종양을 수집하고, 자발적 MMTV-PyMT 유방암 모델로부터 수집한 종양과 비교하였다. EMT6 모델의 경우, 6-8 주령의 암컷 BALB/c 마우스(군당 5 마리)에게 EMT6 세포(100 μL PBS 중 1x106 세포)를 4번째 유선 지방 패드에 동소적으로 접종하였다. 7일 동안 확립된 옆구리 종양(평균 종양 크기 56 mm3)이 있는 마우스에게 huIL-15Rα-IL-15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주의 단일 용량 3 x107 CFU를 IV 주사하였다. IV 투약 후 제4일에, 마우스를 안락사시키고 종양을 균질화하고 LB 플레이트에 평판배양하여 종양 조직 그램당 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 열거하였다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주는 종양 조직 그램당 평균 1.7 x107 CFU로 종양을 콜로니화하였다.
자발적 유방암 모델의 경우, 가장 큰 종양의 부피가 평균 272 mm3로 측정되었을 때 MMTV-PyMT 마우스에 동일한 세균 균주의 3 x107 CFU를 IV 주사하였다. IV 투약 후 6일째에 종양을 수집하였다. 종양을 균질화하고 LB 플레이트에 평판배양하여 종양 조직 그램당 CFU의 수를 계산하였다. 수집된 모든 종양은 평균 2.89 x 106 CFUs/g의 종양 무게 범위(0.05 g 내지 0.36 g, N=7)에도 불구하고 잘 콜로니화된 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는 부모 YS1646 균주와 달리, huIL-15Rα-IL-15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 코딩하는 플라스미드를 함유하는 면역조절 YS1646Δasd/ΔASd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주가 이식된 EMT6 종양과 유사한 수준의 MMTV-PyMT 종양(P = 0.18, NS)을 자발적으로 콜로니화할 수 있었음을 실증한다.
이식된 종양과 달리 자발적 종양은 인간 종양과 더 유사한 혈관 구조를 갖기 때문에, 이러한 데이터는, 부모 YS1646 균주가 진행성 암 환자의 I 상 임상 시험에서 보고된 것보다 훨씬 더 높은 비율/수준으로 면역자극성 박테리아가 인간 종양을 콜로니화할 것임을 나타낸다(예를 들어, Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152 참조).
실시예 38
인간 IL-15Rα-IL-15sc 및 huSTING N154S/R284G tazCTT를 인코딩하는 플라스미드 또는 나노루시퍼라제® 루시퍼라제 대조군 플라스미드를 함유하는 면역 조절 세균 균주는 비인간 영장류에서 내약성이 우수하다
I 상 임상 시험에서 부모 YS1646 균주의 최대 허용 용량(MTD)은 3 x 108 CFUs/m2이고 용량 제한 독성(DLT) 용량은 1 x 109 CFUs/m2인 것으로 보고되었다(예를 들어, Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152 참조). 이 용량에서 발열, 저혈압, 혈소판 감소증, 빈혈, 구토, 설사, 메스꺼움, 저인산혈증과 같은 독성 및 부작용은 IV 투여 후 4시간째에 측정된, TNF-α(약 500,000 pg/mL), IL-6(약 500,000 pg/mL) 및 IL-1β(약 200 pg/mL)를 포함한 전염증성 사이토카인의 혈청 수치가 매우 높기 때문이었다. 별도의 연구에서 YS1646 균주는 시노몰구스 원숭이를 사용한 비인간 영장류(NHP) 연구에서 평가되었다. 이 연구에서 1 x 109 CFUs/원숭이는 MTD(인간 동등 용량(HED) = 4 x 109 CFUs/m2)인 한편, 1 x 1010 CFUs/원숭이의 용량은 허용되지 않는 것으로 간주되었다(HED = 4 x 1010 CFU/m2). 최고 용량에서의 DLT는 간 관련 부작용(AE)에 기인하였으며 혈청 사이토카인은 측정되지 않았다(예를 들어 Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25 참조). NHP는 인간보다 훨씬 더 나은 균주 YS1646에 대해 내약성이 있었고, 인간 MTD보다 로그의 MTD 값이 더 높았기 때문에, 원숭이의 사이토카인 수준이 인간에서 측정된 것보다 대략 로그 더 낮을 것이라고 추론할 수 있다.
편모가 없고 msbB - /pagP - 인 균주와 같은 본원에 제공된 면역자극성 박테리아의 MTD 및 혈청 사이토카인 프로파일을 결정하기 위해 NHP에서 내약성 연구를 수행하였다. 이 연구를 위해 이전에 치료를 받지 않은 24 개월령 내지 50 개월령 사이의 수컷 시노몰구스 원숭이 15 마리를 사용하였다. NHP는 huIL-15Rα-IL-15sc + huSTING N154S/R284G tazCTT의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI 균주(위에서 논의됨)를 3 x 108 CFUs/원숭이, 1 x 109 CFUs/원숭이, 또는 3 x 109 CFUs/원숭이(투여군당 3 NHP)의 용량으로 IV 투여하거나, 나노루시퍼라제® 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주를 3 x 108 CFUs/원숭이(군당 3 NHP)의 투여량으로 IV 투여하고, 식염수 비히클 대조군(N=3)과 비교하였다. NHP는 투여 전, 투여 후 4시간째 및 투여 후 24시간째에 채혈하고, 원숭이 사이토카인 U-Plex 패널(Meso Scale Discovery)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 혈청 사이토카인 수준을 측정하였다.
아래 표에 요약된 결과는 박테리아 균주가 시험된 모든 용량 수준에서 내약성이 우수하였으며 식염수(PBS) 대조군과 크게 다른 임상 결과가 보고되지 않았음을 보여준다. 따라서 이 연구에서는 MTD가 확립될 수 없었다. 혈청 사이토카인 수준은 전반적으로 매우 낮았으며, 특히 YS1646 균주를 사용한 인간 임상 시험에서 용량 제한 독성(DLT)에 기인한 사이토카인, 예를 들어 3 x 109 CFUs/원숭이 투여군(HED = 1.2 x 1010 CFUs/m2)에서 IV 투역후 4시간째에 측정된 TNF-α(평균 농도 4.6 pg/mL), IL-6(평균 농도 376.9 pg/mL) 및 IL-1β(평균 농도 0.88 pg/mL)를 포함한 사이토카인의 경우에 그러하였다. IP-10/CXCL10(평균 농도 10,549.6 pg/mL) 및 MCP-1/CCL2(평균 농도 6247.7 pg/mL)의 혈청 사이토카인 수치만이 투여후 4시간째에 최고 투여량 군에서 높았고, 투여후 24시간째에 상승된 상태를 유지하였다. 이러한 분석물은 독성과 관련이 없으며 더 유리한 면역 프로파일을 나타낼 수 있다. 요약하면, 페이로드를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 것을 포함하여 본원에 제공된 면역자극성 박테리아는 NHP에서 내약성이 매우 우수하다. 따라서, 이러한 데이터로부터 인간에서 면역자극성 박테리아 균주의 높은 수준의 내약성이 있을 것이라고 추론할 수 있다.
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
실시예 39
티미딘 영양 요구체 균주
살모넬라 티피무리움 필수 유전자 thyA는 DNA 합성의 핵심 효소인 티미딜레이트 신타제를 인코딩한다. 유전자의 결실 또는 돌연변이는 균주를 티미딘에 대한 영양요구성으로 만든다. 보완 기질의 결핍 시, 박테리아 세포 사멸이 일어나고, 티미딘 결핍 시 thyA 돌연변이체로부터 거대분자가 방출되지 않아(Loessner et al., FEMS Microbiol Lett. 265(1): 81-88 (2006)), PAMP의 잠재적 방출 및 선천적 염증 반응의 후속 활성화를 감소시킨다는 것이 실증되었다. 생체 내에서 복제할 수 없고 보충된 티미딘이 없을 때 빠르게 사멸하는 티미딘 영양 요구체를 생성하기 위해, 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI에서 thyA를 결실시켰다.
thyA 유전자(SEQ ID NO: 464; DC51_3078)를 함유하는 690 bp 영역은 Datsenko 및 Wanner의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645 (2000))의 변형을 사용하여 결실을 위해 표적화되었다. thyA 유전자를 파괴하기 위해 중첩 PCR에 의해 thyA 유전자 녹아웃 카세트를 작제하였다. 이 카세트에는 2개의 I-SceI 절단 부위 옆에 있는 카나마이신 저항성(KanR) 카세트와 재조합을 용이하게 하기 위해 5' 말단(345 bp)과 3' 말단(332 bp) 모두에 상동 영역이 포함되어 있다. KanR 카세트의 바로 5'에는 KanR 카세트의 3'에 있는 75 bp와 완벽하게 상동인 75 bp의 DNA 서열이 있다. 이 반복 요소(thyA MHA)는 KanR 카세트의 절제 시 흉터 없는 결실을 남긴다.
구체적으로, 하기 표의 서열을 참조하여 thyA 좌측 상동성 아암(arm) 서열을 프라이머 thya-1 및 thya-2를 사용하여 YS1646으로부터 증폭시키고, 프라이머 thya-1을 사용하여 KanR 카세트와 PCR 중첩시키고, scFv-thyA 우측 상동성 아암 서열을 프라이머 thya-3 및 thya-4를 사용하여 YS1646으로부터 증폭시키고, thyA MHA와 PCR 중첩시켰다(프라이머 loxp-4 및 thya-4를 사용하여 공급업체(IDT)로부터의 합성 gBlock 유전자 단편으로 제조됨).
Figure pct00095
Figure pct00096
그 후에, 전체 길이 thyA 유전자 녹아웃 카세트를 프라이머 thya-1 및 thya-4(상기 표 참조)를 사용하는 중첩 PCR에 의해 작제하고, 겔 정제하고, 온도 민감성 람다 레드 재조합 플라스미드 pSL0304를 갖는 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI에 전기천공에 의해 도입하였다. 그 후에, 카나마이신 내성 유전자는 이전에 Yang and Yang(Applied and Environmental Microbiology, 80: 3826-3834 (2014))에 기재된 바와 같이 I-SceI/람다 레드 매개 재조합에 의해 치유되었고, 온도 민감성 플라스미드는 비- 허용 온도에서 성장에 의해 치유되었다. thyA 유전자 단편 녹아웃 서열은 프라이머 thya-5 및 thya-6(표 2)을 사용하여 PCR에 의해 확인되었고, DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 부모 균주 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI의 생성된 돌연변이체 유도체를 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA로 표기하였다.
티미딘 결실 균주를 250 μg/mL 티미딘이 보충된 DasGip 발효 시스템에서 6시간 동안 성장시켰고, 이어서 배양 물질을 주입 스톡을 위해 가공하였다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA를 250 μg/mL 티미딘(Sigma Aldrich T1895-1G) 및 50 μg/mL 디아미노피멜산의 존재 하에 배양하여 일렉트로컴피턴트 세포를 생성하였다. YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA를 플라스미드 ADN-86, ADN-870 또는 ADN-872(아래 표 참조)로 형질전환하여 균주 STST-321, STST-326 및 STST-328을 각각 생성하였다. 명시된 플라스미드(하기 표 참조)를 함유하는 STST-321, STST-326 및 STST-328로 표기된 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA 균주를, 티미딘 보충 부재 하에 CRST-2000, YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI 보유 플라스미드 ADN-838과 병렬로 250 μg/mL 티미딘 존재 하에 6시간 동안 DasGip 발효 시스템에서 1 L 규모로 성장시켰다.
Figure pct00097
발효 배양물은 발효 내내 OD600에 대해 분석되었다. 티미딘 결실 균주의 성장은 CRST-2000 대조군과 비슷한 것으로 관찰되었다.
티미딘 영양요구성을 확인하기 위해, 균주 STST-321, STST-326 및 STST-328의 성장을 대조군 CRST-2000과 비교하여 250 μg/mL 티미딘 보충이 있거나 없는 배지에서 평가하였다. 주입 스톡을 실온에서 해동하고 2.5 μL를 사용하여 투명한 바닥 96웰 플레이트의 3중 웰에서 250 μL 배지 +/- 티미딘을 접종하였다; Spectramax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 OD600으로 37℃에서 진탕하면서 12시간 동안 성장을 평가하였다. 티미딘 결실 균주를 250 μg/mL 티미딘 보충 유무에 관계없이 브로쓰에서 성장시켰고, OD600을 12시간 동안 15분 간격으로 모니터링하였다.
결과는 티미딘 보충의 부재 하에 STST-321, STST-326 및 STST-328에 대해 어떠한 성장도 관찰되지 않은 반면, CRST-2000은 정지기까지 견실한 성장을 실증하였음을 보여준다. 250 μg/mL의 티미딘 보충이 있는 경우, STST-321, STST-326 및 STST-328은 CRST-2000과 유사한 성장 프로파일을 가진 정지기로 성장하여 티미딘에 대한 정확하고 제어된 영양요구성을 보여준다.
실시예 40
IRF3, IFNα2, 및 IFN-β 발현 카세트의 최적화된 발현
인간 IRF3 S396D 또는 마우스 IRF3 S388D, 또는 인간 또는 마우스 IFNα2 또는 인간 또는 마우스 IFN-β의 조합을 포함하는 플라스미드(여기서 이시스트론 구조는 T2A 펩타이드를 포함함)를 단일 발현물 대조군에 대한 각각 인코딩된 페이로드/생성물의 발현에 대해 시험하였다.
HEK293T STING Null Cells(293-DualTM Null Cells; InvivoGen)는 내인성 STING을 포함하지 않고 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 발현하며 내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어를 받으며, 여기서 ISRE의 코딩 서열은 녹인(knock-in) 기술을 사용하는 SEAP ORF로 대체되어 사용되었다. 따라서 STING 활성은 유형 I IFN 유도 SEAP 생산을 모니터링하여 평가된다. 293-DualTM Null Cells는 또한 내인성 IFN-β 프로모터의 제어를 받는 분비 루시퍼라제인 Lucia™ 루시퍼라제를 발현한다; IFN-β의 코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 Lucia™ 루시퍼라제 ORF로 대체되었다. 이를 통해 IFN-β의 발현을 모니터링하여 STING 활성을 평가할 수 있다. 이러한 세포를 사용하여 STING 활성은 ISRE 유도 SEAP 생산 및/또는 Lucia™ 루시페라아제의 IFN-β 의존적 발현을 모니터링하여 평가할 수 있다. 2개의 리포터 단백질인 SEAP 및 Lucia™ 루시퍼라제는 각각 QUANTI-Blue™ 및 QUANTI Luc™ 검출 시약(InvivoGen)과 같은 표준 분석 및 검출 시약을 사용하여 세포 상층액에서 측정할 수 있다.
세포를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날 각 플라스미드 DNA 300 ng과 CMV-GFP 벡터(즉, CMV 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터) 40 ng을 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였으며, 이때 형질주입되지 않은 웰은 음성 대조군(2벌 중복)으로서 역할을 하였다. 각 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입후 48시간째에 수집하였다.
작제물의 활성은 ISRE-SEAP 및 IFN-β-Lucia™ 리포터 시스템을 사용하여 평가되었다. 유형 I 인터페론(IFN) 활성은 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극된 SEAP 생산을 모니터링함으로써 평가되었다. SEAP 측정에 사용되는 QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen) 180 μL에 세포 배양 상층액 20 μL를 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 650 nm의 흡광도 파장에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 ISRE 유도 SEAP 활성을 측정하여 결정되었다. 유형 I 인터페론(IFN) 활성은 또한 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극된 Lucia™ 루시페라제 생산을 모니터링하여 평가되었다. Lucia™ 루시퍼라제 활성 측정에 사용되는 QUANTI-Luc™ 시약(InvivoGen) 50 μL에 세포 배양 상층액 20 μL를 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 발광 설정에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 IFNβ-유도된 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 측정하여 결정되었다.
A. BMDC에서 마우스 IRF3, IFNα2, 및 IFNb의 형질주입으로 인한 사이토카인
마우스 IRF3 S388D, 마우스 IFNα2, 마우스 IFN-β를 포함하는 다양한 단일 발현 플라스미드 및 조합 플라스미드를 hSTING N154S/R284G tazCTT 플라스미드와 비교하였다. 발현 결과는 아래 표에 나와 있다. ISRE-SEAP 리포터 활성은 mIFNα2 T2A mIRF3 S388D 및 mIRF3 S388D T2A mIFNα2, 뿐만 아니라 모든 인간 작제물에서 hSTING N154S/R284G tazCTT보다 높다. IFNβ-루시아 리포터 활성은 인산유사 hIRF3 단독, hIFNα2 T2A hIRF3 S388D 및 hIRF3 S388D T2A hIFNα2에 대해 hSTING N154S/R284G tazCTT보다 높다. 이러한 결과는 높은 수준의 유형 I IFN 생산이 개별 유형 I IFN 신호 구성요소뿐만 아니라 구성 유형 I IFN 신호 구성요소의 조합을 발현함으로써 유도될 수 있음을 보여준다.
Figure pct00098
B. 인간 IRF3 S396D 또는 마우스 IRF3 S388D, 또는 인간 또는 마우스 IFNα2, 또는 인간 또는 마우스 IFN-β, 및 이의 조합의 조합을 함유하는 플라스미드를 뮤린 1차 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서 형질주입에 의한 발현에 대해 시험하였으며, 여기서 이시스트론 작제물은 T2A 펩타이드를 함유한다.
이를 시험하기 위해 Golden Ticket 뮤린골수를 분리하여 1.5 mL Eppendorf 튜브에 넣고 1200 RPM에서 5분 동안 회전시켜 골수 세포를 수집하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에서 1회 세척한 다음, RPMI-1640 + 10% FBS에서 20 ng/ml GM-CSF를 포함하는 96-웰 TC 처리 플레이트에 접종하였다. 4일 후, 비부착성 세포를 웰에서 피펫팅하고 형질주입을 위해 96웰 플레이트에서 RPMI-1640 + 10% FBS에 웰당 2e5 세포로 다시 시딩하였다. 제조업체의 설명서에 따라 Viromer® RED를 사용하여 세포를 형질 감염시켰다. 간단히 말해서, 300 ng의 플라스미드 DNA와 "DNA 없음" 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고 0.08 μL의 Viromer® RED와 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 DNA/Viromer® RED가 복합체를 형성하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 96-웰 플레이트의 각 웰에 천천히 첨가하고(2벌 중복) 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션하였다. 48시간에 상층액을 수합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 유세포분석 기초 사이토카인 비드 어레이(CBA)를 사용하여 뮤린 IFNα, IFN-β, CXCL10(IP-10) 및 IL-6에 대해 분석하였다.
마우스 IRF3 S388D, 마우스 IFNα2, 마우스 IFN-β를 인코딩하는 다양한 단일 발현 플라스미드 및 조합 플라스미드를 hSTING N154S/R284G tazCTT 플라스미드와 비교하였다. 아래 표에서 볼 수 있듯이 mIFNα2, mIFN-β 및 mIFNα2 T2A mIFN-β 구조를 사용한 형질주입은 hSTING N154S/R284G tazCTT보다 더 높은 수준의 IFN-α 및 IFN-β를 가졌다. mIFN-β 및 mIFNα2 T2A mIFN-β 작제물은 hSTING N154S/R284G tazCTT보다 CXCL10 수치가 더 높았다. mIRF3 S388D, mIFNα2 T2A mIRF3 S388D 및 mIRF3 S388D T2A mIFNα2 작제물은 모두 hSTING N154S/R284G tazCTT보다 IL-6 수치가 낮았다. 이러한 데이터는 발현된 유형 I IFN 구성요소의 단독 및 조합의 다중 조합을 통해 염증 유발 IL-6의 최소 유도와 함께 유형 I IFN 신호전달을 유도하는 능력을 실증한다. IFN-β 단독의 발현은 시험된 모든 표적의 가장 높은 유형 I IFN 활성을 유도한다.
Figure pct00099
C. 마우스 IFNα2 T2A IFN-β는 뮤린 동소 유방암 모델에서 생체 내에서 발현된다.
이 실험을 위해, 6-8 주령의 암컷 BALB/c 마우스(군당 5마리)에게 EMT6 종양 세포(ATCC # CRL-2755)(100 μL PBS 중 1x106 세포)를 왼쪽 유선 지방 패드에 접종하였다. 9일간 확립된 유선 종양(부피 약 100 mm3)이 있는 마우스에게 mIFNα2 T2A mIFN-β를 인코딩하는 이시스트론 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(대형 세정) 균주 2 x107 CFU의 단일 용량을 IV 주사하고, PBS 대조군과 비교하였다.
액틴에 비하여 종양 mIFNα2 및 mIFN-β 발현 수준을 결정하여 종양 특이적 페이로드 전달을 평가하였다. IV 주사 후 4일째에 종양을 절제하고 1.2 mL의 RLT + 용해 완충액에서 TissueLyser II(Qiagen)를 사용하여 RNA 추출을 위해 처리하였다. 제조업체의 설명서에 따라 RNeasy® Plus Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA 분리를 위해 균질물을 수집하였다. 총 RNA 농도는 NanoDrop™ 2000 UV-Vis 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다. 각 시료의 순도 또한 A260/A230 흡수 비율로 평가하였다. cDNA 합성은 CFX96™ 실시간 시스템(Bio-Rad) 및 iScript™ gDNA Clear cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 20 μL 반응에서 0.5-1 μg의 주형 RNA로부터 수행되었다. qPCR은 CFX96 실시간 시스템(Bio-Rad)으로 수행되었다. mIFNα2(qMmuCEP0043629), mIFNβ1(qMmuCEP0058870)에 대한 PrimePCR™ Probe Assay는 Bio-Rad에서 구입하였다. qPCR 반응(20 μL)은 SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 또는 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)를 사용하여 프로토콜별로 수행되었다. Bio-Rad CFX96 실시간 시스템의 표준 열순환 프로그램은 95℃에서 150초 동안 변성한 다음 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 55초 동안 39주기로 구성되었다. 액틴 기준 mRNA(Bio-Rad, qMmuCEP0039589)를 사용하여 표적 mRNA의 정량화를 정규화하였다. ΔCq는 표적 유전자와 기준 유전자 사이의 차이로 계산되었다.
값은 5 마리 마우스(PBS 군) 또는 3 마리 마우스(mIFNα2 + mIFN-β 군)의 평균으로 아래 표에 표시된다. PBS 대조군과 비교하여 mIFNα2 및 mIFN-β를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI (크고 깔끔) 균주는 EMT6 종양에서 mIFNα2 및 mIFN-β 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰다.
Figure pct00100
종양으로의 플라스미드 전달 및 이후의 이종 유전자 발현 및 단백질 분비를 측정하기 위해 이러한 종양에서 mIFNα2 및 mIFN-β 단백질의 양을 측정하였다. 이를 위해 균질화된 종양에서 용해물을 수합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 유세포분석 기초 사이토카인 비드 어레이(CBA)를 사용하여 단백질 발현을 평가하였다.
아래 표에서 볼 수 있듯이 mIFNα2 및 mIFN-β를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI (크고 깔끔) 균주는 PBS 대조군 종양과 비교하여 종양 그램당 높은 수준의 mIFNα2 및 mIFN-β 단백질을 나타내었으며, 이는 mIFNα2 및 mIFN-β가 IV 투여 후 종양으로 강력하게 전달됨을 실증한다.
Figure pct00101
실시예 41
마우스 및 인간 세포에서 막 결합 인간 및 마우스 IL-12의 발현
마우스 막 결합된 IL-12p70(SEQ ID NO: 466)은 마우스 IL-12p40(SEQ ID NO: 399의 잔기 3009-4010)에 이어서 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO: 480; GGGGSGGGGSGGGGS), 및 IL-12p35(SEQ ID NO: 399의 잔기 4056-4634)로 작제되었다. 뮤린 CD80(SEQ ID NO: 481; PPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL)의 막횡단 및 세포질 부분은 이 서열을 따른다. 인간 막 결합 IL-12p70(SEQ ID NO:467)은 인간 IL-12p40 (SEQ ID NO: 482; MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS)과 뒤이어 15개 아미노산 링커 서열(GGGGSGGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 480) 및 인간 IL-12p35 (RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS, SEQ ID NO:483)로 작제되었다. 인간 CD80(SEQ ID NO: 484; DNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV)의 막횡단 및 세포질 부분은 이 서열을 따른다.
HEK 세포를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날 각 플라스미드 DNA 300 ng과 CMV-GFP 벡터(즉, CMV 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터) 40 ng을 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였으며, 이때 형질주입되지 않은 웰은 음성 대조군 역할을 하였다(2벌 중복). 각 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입후 48시간째에 수집하였다.
작제물의 활성은 HEK-Blue IL-12(InvivoGen) 세포와 형질주입된 HEK 세포의 공동배양을 사용하여 평가되었다. 형질주입 24시간 후, 5e4 HEK 세포를 분리하고 96웰 TC 플레이트에 시딩하였다. 또한, 5e4 HEK-Blue IL-12 세포를 동일한 웰에 시딩하였다. 형질주입 48시간 후, 각각의 시료로부터의 세포 배양 상층액을 형질주입후 48시간째에 수집하였다. 인간 및 마우스 IL-12 생물활성은 수용체에 결합하는 IL-12의 다운스트림의 STAT-4 경로의 활성화를 측정하는 SEAP 리포터를 측정함으로써 결정되었다. IL-12 생물활성은 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 흡광도 파장 650 nm에서 ISRE로 유도된 SEAP 활성을 측정하여 결정하였다.
작제물의 발현 결과는 아래 표에 제공된다. 각각의 뮤린 및 인간 막 결합 IL-12p70은 HEK-Blue IL-12 세포에서 적어도 가용성 뮤린 및 인간 IL-12p70과 동일한 정도로 STAT4-SEAP 리포터를 활성화하였으며, 이로써 작제물의 기능을 확인하였다.
Figure pct00102
막 결합된 IL-12p70 작제물을 유세포분석에 의해 형질주입된 HEK 세포의 표면에서의 발현에 대해 시험하였다. 상기와 동일한 조건을 사용하여 뮤린 또는 인간 IL-12p70으로 형질주입된 HEK 야생형 세포를 형질주입후 48시간째에 수합하였다. 세포를 PBS로 분리하고 V-바닥 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 1회 세척하였다. 그 후에, 세포를 1:10으로 희석된 항-인간 IL-12p70 APC(Miltenyi) 또는 1:10으로 희석된 항-마우스 IL-12p70 APC(Miltenyi)를 함유하는 50 uL PBS + 2% FBS에 재현탁하고, 얼음 위에서 어둠 속에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고 PBS + 2% FBS에 1:6000 희석된 DAPI에 재현탁하였다. ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석 데이터를 수집하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 형질주입되지 않은 세포의 1.67%만이 APC 양성인 반면, 막 결합된 인간 IL-12p70은 40.4% 양성이었고 막 결합된 뮤린 IL-12p70은 59.9%였다. 따라서, 이러한 막 결합된 IL-12 작제물은 인간 세포에서 잘 발현된다.
인간 또는 뮤린 막 결합된 IL-12p70을 함유하는 플라스미드를 뮤린 1차 골수-유래 수지상 세포(BMDC)에서의 형질주입에 의한 발현에 대해 시험하였다. 야생형 뮤린 골수를 분리하여 1.5 mL Eppendorf 튜브에 넣고 1200 RPM에서 5분 동안 회전시켜 골수 세포를 수집하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에서 1회 세척한 다음, 96-웰 TC-처리 플레이트에서 20 ng/ml GM-CSF와 함께 RPMI-1640 + 10% FBS에 시딩하였다. 제3일에, 추가의 20 ng/ml GM-CSF와 함께 RPMI-1640 + 10% FBS를 세포에 첨가하였다. 6일 후에, 비부착성 세포를 웰로부터 피펫팅하고, 형질주입을 위해 96-웰 플레이트에서 RPMI-1640 + 10% FBS에 웰당 2e5개 세포로 재시딩하였다. Viromer® RED 형질주입 시약을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포를 형질주입하였다. 간략하게는, 300 ng의 플라스미드 DNA, 뿐만 아니라 "DNA 무함유"(형질주입 시약 단독) 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고, 0.08 μL의 Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되게 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 (2벌 중복으로) 서서히 첨가하고, 플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포를 형질주입-후 48시간째에 수합하고, 유세포분석법을 사용하여 IL-12 표면 발현에 대해 검정하였다.
세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 1회 세척하였다. 그 후에, 세포를 1:10으로 희석된 항-인간 IL-12p70 APC(Miltenyi) 또는 1:10으로 희석된 항-마우스 IL-12p70 APC(Miltenyi), 1:200으로 희석된 CD11b PE, 1:200으로 희석된 ClassII APC-Cy7을 함유하는 50 μL PBS + 2% FBS에 재현탁시키고, 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고 PBS + 2% FBS에 1:6000으로 희석된 DAPI 염색에 재현탁하였다. ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석 데이터를 수집하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 수지상 세포 집단에서 형질주입되지 않은 세포의 0.205% ± 0.021%와 VCIP IRES CMV NanoLuc 형질주입된 세포의 0.685% ± 0.262%만이 APC 양성인 반면, 막 결합 인간 IL-12p70은 6.14% ± 1.27% 양성이었고 막 결합 뮤린 IL-12p70은 2.64% ± 0.87% 양성이었다. 이러한 결과는 막 결합된 IL-12 작제물이 마우스 골수 수지상 세포 표면에서 배경을 능가하여 검출되었음을 보여준다.
뮤린 막 결합 IL-12p70을 함유하는 플라스미드는 또한 뮤린 1차 골수-유래 대식세포(BMM)에서의 형질주입에 의한 발현에 대해 시험되었다. 야생형 뮤린 골수를 단리하고, 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내로 플러쉬하고, 1200 RPM에서 5분 동안 회전시켜, 골수 세포를 수집하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에서 1회 세척한 다음, 24-웰 TC-처리 플레이트에서 20 ng/ml M-CSF와 함께 RPMI-1640 + 10% FBS에 시딩하였다. 3일 후, 배지를 흡인하고, 20 ng/ml M-CSF를 보충하였다. Viromer® RED 형질주입 시약을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포를 형질주입하였다. 간략하게는, 750 ng의 플라스미드 DNA, 뿐만 아니라 "DNA 무함유" 대조군을 제공된 완충액에 희석시키고, Viromer® RED 형질주입 시약과 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, DNA/Viromer® RED 복합체가 형성되게 하였다. 그 후에, DNA/Viromer® RED 복합체를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 (2벌 중복으로) 서서히 첨가하고, 플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포를 형질주입-후 48시간째에 수합하고, 유세포분석법을 사용하여 IL-12 표면 발현에 대해 탈착시켰다.
세포를 10 mM EDTA로 분리하고 PBS + 2% FBS로 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 1회 세척하였다. 그 후에, 세포를 1:10으로 희석된 항-인간 IL-12p70 APC(Miltenyi) 또는 1:200으로 희석된 항-마우스 IL-12p70 APC(Miltenyi), 1:200으로 희석된 CD11b PE, 및 1:200으로 희석된 ClassII APC-Cy7을 함유하는 50 uL PBS + 2% FBS에 재현탁시키고, 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고 PBS + 2% FBS에 1:6000 희석된 DAPI에 재현탁하였다. ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석 데이터를 수집하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 형질주입되지 않은 세포의 0.01% ± 0.003%와 VCIP IRES CMV NanoLuc 형질주입된 세포의 0.36% ± 0.028%만이 APC 양성인 반면 막 결합 뮤린 IL-12p70은 1.945% ± 0.106%였다. 따라서, 이러한 막 결합된 IL-12 작제물은 배경 위의 마우스 골수 대식세포 표면에서 검출되었다.
실시예 42
인간 세포로부터의 DLL3xCD3 이중특이적 T-세포 연계자의 발현
소세포 폐암에서 선택적으로 발현되는 델타 유사 리간드 3을 표적으로 하는 DLL3xCD3 이중특이적 T 세포 연계자(상표 BiTE®로 판매됨), 및 플래그 태그를 포함하는 CD3+ T 세포는 항-DLL3 항체 SC16.15, SC16.34 및 SC16.56의 아미노산 서열을 사용하여 설계되었으며, 예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 2017/031458 A2를 참조한다. 이 BiTE 작제물의 항-CD3 아암은 클론 145-2C11에서 설계되었다. 이러한 항체는 CMV 프로모터의 제어 하에 3' HPRE와 함께 pATI-1.76 벡터에 클로닝된 완전 뮤린 서열이다. 인간 투여를 위해 항체는 적절하게 인간화될 수 있다. 서열은 Sanger 시퀀싱으로 확인되었다.
생성된 작제물의 서열은 하기와 같다:
SC16.56 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO: 485)
작제물은 SEQ ID NO: 485로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.56 VH, 15 아미노산 GS 링커, SC16.56 VL, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00103
SC16.56 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO: 486)
작제물은 SEQ ID NO: 486으로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.56 VL, 15 아미노산 GS 링커, SC16.56 VH, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00104
SC16.15 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO: 487)
작제물은 SEQ ID NO: 487로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.15 VH, 15 아미노산 GS 링커, SC16.15 VL, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00105
SC16.15 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO: 488)
작제물은 SEQ ID NO: 488로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.15 VL, 15 아미노산 GS 링커, SC16.15 VH, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00106
SC16.34 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO: 489)
작제물은 SEQ ID NO: 489로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.34 VH, 15 아미노산 GS 링커, SC16.34 VL, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00107
SC16.34 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO: 490)
작제물은 SEQ ID NO: 490으로 그리고 아래 표시된 바와 같이 마우스 IgGK 리더, SC16.34 VL, 15 아미노산 GS 링커, SC16.34 VH, 5 아미노산 링커, 145-2C11 VH, 15 아미노산 GS 링커, 145-2C11 VL, 및 플래그 태그를 이 순서로 포함한다:
Figure pct00108
1.5 x 106 HEK293T 세포를 폴리-L-리신으로 코팅된 6-웰 플레이트에 하루 전에 평판배양하여 80% 합류도를 달성하였다. 형질주입 당일, 3 μg의 DNA를 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였다. 각 시료의 세포 배양 상층액을 48시간 배양 후 수집하였다. 일부 상층액을 10 kDa 스핀 컬럼(Millipore)에서 농축시켰다.
DLL3xCD3 BiTE 인코딩 플라스미드로 형질주입된 이러한 세포의 기능성은 표면에 DLL3을 갖는 SHP77 세포(ATCC)에 대한 세포 상의 DLL3xCD3 이중특이적 T-세포 연계자의 결합에 의해 입증되었다. 500,000개의 SHP77 세포를 V-바닥 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 1회 세척하였다. 세포를 형질주입되지 않은 세포 또는 BiTE로 형질주입된 세포에 상응하는 농축된 HEK 상층액을 함유하는 50 uL PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 30분 후, 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 1:100 희석의 항-Flag 비오틴(Sigma) 또는 1:200 희석의 단백질 L 비오틴(Genscript)을 함유하는 50 uL PBS + 2% FBS에 재현탁하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리에 의해 PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 세포를 스트렙타비딘 APC(Biolegend)로 1:200 희석으로 염색하고 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다.
세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리하여 PBS + 2% FBS로 2회 세척하고 PBS + 2% FBS에 1:6000 희석된 DAPI에 재현탁하였다. ACEA NovoCyte® 유세포분석기(ACEA Biosciences, Inc.)를 사용하여 유세포분석 데이터를 수집하고 FlowJo™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
아래 표는 BiTE로 염색되고 단백질 L 또는 항-Flag 항체에 의해 검출되는 세포에 상응하는 APC 양성으로 게이팅된 양성 세포의 백분율을 제공한다. SC16.56 DLL3LHxCD3HL, SC16.34 DLL3HLxCD3HL 및 SC16.34 DLL3LHxCD3HL BiTE는 모두 SHP77 세포에서 유사하게 검출되지만 다른 BiTE는 검출되지 않는다. 따라서 SC16.56 DLL3LHxCD3HL, SC16.34 DLL3HLxCD3HL 및 SC16.34 DLL3LHxCD3HL은 DLL3에 결합된다.
Figure pct00109
발현된 DLL3xCD3 이중특이적 T-세포 연계자는 또한 ELISA로 DLL3 및 CD3에 대한 결합에 대해 평가되었다. 이 ELISA는 동일한 분석에서 DLL3 및 CD3에 결합하는 올바르게 접힌 DLL3xCD3 이중특이적 T 세포 연계자를 검출하기 위해 개발되었다. 인간 DLL3(R&D Systems)을 고단백질 결합 96-웰 플레이트에 1 ug/ml의 농도로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 ELISA 차단 완충액으로 웰을 차단하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다. DLL3xCD3 이중특이적 T-세포 연계자를 함유하는 HEK293T 세포 배양 상층액을 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 인간 IgG Fc 접합 CD3e를 웰에 첨가하고(Acro Biosystems) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 HRP(호스래디쉬 퍼옥시다제) 결합 항인간 항체를 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 검출 시약(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), Thermo Fisher Scientific)을 웰에 첨가하였다. 황산(BioLegend)으로 효소 반응을 정지시키고 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다.
아래 표는 450 nm에서의 흡광도로 표시된 이 ELISA의 결과를 제공한다. 모든 SC16.56 DLL3LHxCD3HL, SC16.34 DLL3HLxCD3HL 및 SC16.34 DLL3LHxCD3HL BiTE 항체가 검출되었으며, 이는 이러한 BiTEs 항체가 완전히 기능함을 보여준다. SC16.34 DLL3LHxCD3HL은 이 ELISA에서 가장 높은 결합을 나타내지만, 세포 상층액이 이 분석에 사용되었기 때문에 이것이 이 이중특이적 T-세포 연계자의 더 높은 농도에서 기인하는지 또는 다른 3개의 이중특이적 T 세포 연계자와 비교하여 이의 표적에 대한 더 높은 친화력에서 기인하는지 구별할 수 없다. 별도의 실험에서, ANTI-FLAG M2 친화도 겔(Sigma)을 사용하여 이중특이적 T 세포 연계자를 정제하고 이 ELISA에서 실행하였다. SC16.34 DLL3LHxCD3HL은 ELISA 신호를 배경을 능가하여 나타내는 유일한 정제된 BiTE였다.
Figure pct00110
실시예 43
항-CTLA-4 scFv-Fc는 CD80/CTLA-4 및 CD86/CTLA-4 상호작용의 차단을 실증하고 인간 STING N154S/R284G tazCTT를 공동발현시킨다
인간 CTLA-4에 특이적인 scFv-Fc(각각 핵산 및 단백질 서열에 대해 SEQ ID NO: 427 및 428 참조)는 이필리무맙의 아미노산 서열을 사용하여 설계하였다. 이필리무맙은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 완전 인간 IgG1κ 모노클로날 항체(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0086014 및 미국 특허 번호 6,984,720에서 10D1로 표기된 항체 참조)로, CD80(B7.1 또는 B7-1이라고도 함) 및 CD86(B7.2 또는 B7-2라고도 함)과의 CTLA-4와 면역 저해제 상호작용을 차단한다.
이필리무맙 scFv 항체 단편(SEQ ID NO: 429 참조)을 생성하기 위해, 이필리무맙의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 20개 아미노산 길이의 글리신-세린(GS) 링커((GGGGS)4)와 연결하였다. scFv-Fc 항체 단편(SEQ ID NO: 428 참조)을 생성하기 위해, 이필리무맙 scFv의 가변 중쇄를 힌지 영역에 있는 유리 시스테인의 세린으로의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc에 연결하였다(SEQ ID NO: 428에서 위치 272). 리더 서열(METPAQLLFLLLLWLPDTTG; SEQ ID NO: 428의 잔기 1-20에 상응함)은 인간 면역글로불린 카파 가변 3-20(IGKV3-20) 단백질의 서열에서 유래되었다. 서열은 GenScript GenSmart™ 코돈 최적화 도구(ATGGAGACACCTGCCCAGCTGCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCCGACACCACCGGC)를 사용하여 인간에 대해 코돈 최적화되었고; 서열은 SEQ ID NO: 491로 표시되어 있다.
항-CTLA-4 scFv-Fc의 중화 능력은 CTLA-4와 이의 리간드, CD80 및 CD86 사이의 상호작용을 차단하는 항체 단편의 능력을 측정하기 위해 경쟁적 ELISA를 사용하여 결정되었다. HEK293T 세포를 적절한 시약:DNA 비율로 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)을 사용하여 항-CTLA-4 scFv-Fc 항체 단편 작제물을 인코딩하는 3 마이크로그램의 DNA로 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, HEK293T 무세포 배양 상층액을 수합하고, 여과하고, 경쟁 ELISA에 사용하여 항-CTLA-4 항체 단편의 차단 활성을 평가하였다.
경쟁적 ELISA를 위해 인간 CD80 또는 CD86 재조합 단백질(R&D Systems)을 고단백질 결합 96-웰 플레이트에서 100 ng/ml의 농도로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 ELISA 차단 완충액으로 웰을 차단하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다. 각각의 항-CTLA-4 항체 단편을 포함하는 HEK293T 세포 배양 상층액을 10 ng/ml의 재조합 인간 CTLA-4-인간 IgG1 Fc 키메라(R&D Systems)와 혼합하고 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 HRP(호스래디쉬 퍼옥시다제) 결합 항-인간 IgG1 항체를 웰에 첨가하고(Jackson ImmunoResearch), 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 검출 시약(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), Thermo Fisher Scientific)을 웰에 첨가하였다. 황산(BioLegend)으로 효소 반응을 정지시키고 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다.
경쟁 ELISA의 결과는 아래 표에 요약되어 있다. 항-CTLA-4 scFv-Fc는 CTLA-4와 CD86의 결합을 94.14% 차단하고 CTLA-4와 CD80의 결합을 83.46% 차단하였다. CTLA4 scFv-Fc는 CD80/CTLA-4 차단 활성과 비교하여 더 높은 정도의 CD86/CTLA-4 차단 활성을 가졌다.
Figure pct00111
인간 항-CTLA4 scFv-Fc(SEQ ID NO: 427)는 혈관 내피 성장 인자 및 유형 1 콜라겐 유도적 단백질(VCIP) IRES를 포함하거나 포함하지 않는 huSTING N154S/R284G tazCTT를 사용하여 발현 벡터로 클로닝되었다. HEK293T STING Null Cells(293-DualTM Null Cells; InvivoGen)를 사용하였는데, 이는 내인성 STING을 함유하지 않고 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 발현하며 내인성 IFN-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터의 제어 하에 놓였으며, 여기서 ISRE의 코딩 서열은 녹인 기술을 사용하는 SEAP ORF로 대체된다. 따라서 STING 활성은 유형 I IFN 유도 SEAP 생산을 모니터링하여 평가된다. 293-DualTM Null Cells는 또한 내인성 IFN-β 프로모터의 제어를 받는 분비 루시퍼라제인 Lucia™ 루시퍼라제를 발현한다; IFN-β의 코딩 서열은 녹인 기술을 사용하여 Lucia™ 루시퍼라제 ORF로 대체되었다. 이를 통해 IFN-β의 발현을 모니터링하여 STING 활성을 평가할 수 있다. 이러한 세포를 사용하여 STING 활성은 ISRE 유도 SEAP 생산 및/또는 Lucia™ 루시페라아제의 IFN-β 의존적 발현을 모니터링하여 평가할 수 있다. 2개의 리포터 단백질인 SEAP 및 Lucia™ 루시퍼라제는 각각 QUANTI-Blue™ 및 QUANTI Luc™ 검출 시약(InvivoGen)과 같은 표준 분석 및 검출 시약을 사용하여 세포 상층액에서 측정할 수 있다.
세포를 웰당 200,000개의 세포로 폴리-L-리신으로 코팅된 24-웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 80% 합류도를 달성하였다. 이튿날 각 플라스미드 DNA 300 ng과 CMV-GFP 벡터(즉, CMV 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터) 40 ng을 무혈청 배지에 희석시키고 FuGENE® 형질주입 시약(Promega)에 적절한 시약:DNA 비율로 첨가하였으며, 이때 형질주입되지 않은 웰이 음성 대조군으로서 역할을 하였다(2벌 중복). 각 시료의 세포 배양 상층액을 형질주입후 48시간째에 수집하였다.
huSTING N154S/R284G tazCTT 변이체의 STING 활성은 ISRE-SEAP 및 IFN-β-Lucia™ 리포터 시스템을 사용하여 평가되었다. 유형 I 인터페론(IFN) 활성(STING에 의해 유도됨)은 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극된 SEAP 생산을 모니터링함으로써 평가되었다. SEAP 측정에 사용되는 QUANTI-Blue™ 시약(InvivoGen) 180 μL에 세포 배양 상층액 20 μL를 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 650 nm의 흡광도 파장에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 ISRE 유도 SEAP 활성을 측정하여 결정되었다. 유형 I 인터페론(IFN) 활성(STING에 의해 유도됨)은 또한 세포 상층액에서 유형 I IFN-자극된 Lucia™ 루시페라제 생성을 모니터링함으로써 평가되었다. Lucia™ 루시퍼라제 활성 측정에 사용되는 QUANTI-Luc™ 시약(InvivoGen) 50 μL에 세포 배양 상층액 20 μL를 첨가하였다. 유형 I 인터페론 활성화는 발광 설정에서 SpectraMax® M3 분광광도계(Molecular Devices)에서 IFNβ-유도된 Lucia™ 루시퍼라제 활성을 측정하여 결정되었다.
세포 배양 상층액을 또한 인간 CTLA4 scFv-Fc의 발현에 대해 평가하였다. 인간 CTLA4(R&D Systems)를 고단백질 결합 96-웰 플레이트에 1 ug/ml의 농도로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 ELISA 차단 완충액로 웰을 차단하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다. 항-CTLA4 scFv-Fc를 함유하는 HEK293T 세포 배양 상층액을 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고, HRP(호스래디쉬 퍼옥시다제)-접합 항-인간 항체를 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후에, 웰을 PBS 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 검출 시약(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), Thermo Fisher Scientific)을 웰에 첨가하였다. 황산(BioLegend)으로 효소 반응을 정지시키고 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다.
인간 항-CTLA4 scFv-Fc + hSTING N154S/R284G tazCTT 구조의 발현 결과는 아래와 같다. 두 페이로드를 모두 포함하는 작제물은 각 단백질의 발현을 유지하였다. 인간 항-CTLA4 scFv-Fc T2A hSTING N154S/R284G tazCTT 작제물은 VCIP IRES 없이 더 나은 STING 활성을 가졌다. 항-CTLA4 scFv-Fc의 발현은 VCIP IRES가 없는 작제물로부터의 ELISA에 의해 더 높았으며, 이는 개별 표적이 개선된 발현을 위해 고유한 요소를 요구할 수 있음을 실증한다.
Figure pct00112
실시예 44
대식세포의 박테리아 균주 감염은 MHC-I 분자에 의한 면역원성 펩타이드의 제시를 허용한다
이 실시예는 본원에 제공된 박테리아가 mRNA 전달 또는 플라스미드 DNA 전달로 항원 제시 세포를 박토펙트하고, 그 결과 발현된 생성물이 항원 제시 세포에 의해 제시됨을 보여준다. 이 증명에 사용된 항-SIINFEKL/H-2Kb 항체는 IC21 세포의 표면에서 MHC-1(H-2Kb)에 의해 제시될 때만 오브알부민 SIINFEKL[SEQ ID NO: 492] 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 이는 STING + IL-15 수용체 복합체 + 암 항원을 인코딩하는 것과 같은 본원에 제공된 백신 균주가 면역 부재 종양을 치료할 수 있고, 네오아쥬반트 환경에서 암 백신으로 사용될 수 있고, 또한 예방적 백신화를 위한 병원성 항원을 제시하는 플랫폼으로서 사용될 수 있고, 예를 들어 MRSA, 만성 바이러스 간염 감염, 만성 피. 긴기발리스, HIV 및 다른 만성 감염, 뿐만 안리ㅏ 급성 감염과 같은 병원체 감염에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 실증한다.
위의 설명에서, 이 실시예의 실험은 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD로 표기된 예시적인 균주에 의한 항원 제시 세포의 감염이 어떻게 주조직적합성 복합체 부류-I(MHC-I)에 의한 CD8+ T 세포로의 면역원성 펩타이드의 제시를 유도하는지를 보여준다. 뇌심근염 바이러스(EMCV) 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 따르거나 따르지 않고 진핵생물 CMV 프로모터 및 원핵생물 MTL 프로모터 하에 닭 오브알부민을 인코딩하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주가 생성되었다. 닭 오브알부민은 모델 항원이고, 닭 오브알부민으로부터 유도된 면역-우성 SIINFEKL 펩타이드는 항원 제시 세포의 표면에서 마우스 H-2Kb MHC-I 분자에 의한 제시에 대해 모니터링되었다. 뮤린 복막 대식세포 세포주 IC21(ATCC)을 검정에서 항원 제시 세포로 사용하였다.
96웰 편평한 바닥 플레이트의 웰당 50,000개의 IC21 세포를 100 ul RPMI 10% FBS에 시딩하고 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 두었다. 이튿날, IC21 세포를 CMV 또는 MTL 프로모터의 조절 하에 닭 오브알부민을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD 균주로 감염시켰다. 배양된 세포에 박테리아 균주를 첨가하고 플레이트를 500 g에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 그 후에, 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하고 50 ug/ml의 최종 농도가 되도록 겐타마이신을 포함하는 배양 배지를 첨가하였다. 감염된 세포를 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 7시간 동안 방치하였다. 감염 7시간 후, PBS 10 mM EDTA를 사용하여 IC21 세포를 탈착하고 항-뮤린 F4/80 APC-접합 항체 및 항-SIINFEKL/H-2Kb PE-접합 항체(둘 다 Biolegend)로 염색하고, ACEA Novocyte 유세포분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다.
항-SIINFEKL/H-2Kb 항체는 IC21 세포의 표면에서 MHC-1(H-2Kb)에 의해 제시될 때만 오브알부민 SIINFEKL 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 감염 7시간 후 IC21 세포에 의한 H-2Kb/SIINFEKL 제시에 대한 평균 형광 강도를 측정하였다. 결과는 감염되지 않은 세포에 대해 오브알부민 인코딩 균주로 처리된 군에서 관찰된 순 평균 형광 강도(Net MFI)를 보여주는 아래 표에 제시되어 있다.
Figure pct00113
이 실시예는 YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD와 같은 균주가 항원 제시 세포에 의해 처리되고 전달 시 CD8+ T 세포에 제시되는 항원을 전달하여, 병원체 또는 암세포와 관련이 있거나 이로부터의 항원에 대한 T 세포 특이적 반응을 일으키는 능력을 보여준다.
변형이 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING - RECTIFICATION <110> Glickman, Laura Hix Peterson, Bret Nicholas Kehoe, Haixing Iannello, Alexandre Charles Michel Thanos, Christopher D. <120> IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA-BASED VACCINES, THERAPEUTICS, AND RNA DELIVERY PLATFORMS <130> 62131-1708PC <140> PCT/US21/45832 <141> 2021-08-12 <150> 63/188,443 <151> 2021-05-13 <150> 63/064,869 <151> 2020-08-12 <150> 17/320,200 <151> 2021-05-13 <160> 495 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 1 <400> 1 gtagagtatg gtagcaata 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 2 <400> 2 gccgactaca agcgaatta 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 3 <400> 3 gacaagcagt gaccatcaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 4 <400> 4 gaatcaacac aacaactaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 5 <400> 5 gcacatcctc caaatgaaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PD-L1 shRNA target 6 <400> 6 gtagcactga cattcatct 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 1 <400> 7 gacagactgc cttcaaatt 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 2 <400> 8 gcagctggaa ttctttcta 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 3 <400> 9 gactaccagt tgtggttaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 4 <400> 10 ggacacagca gcaatttgt 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 5 <400> 11 ggatgttcac aaccgaatt 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTNNB1 shRNA target 6 <400> 12 gccacaagat tacaagaaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human SIRP-alpha shRNA target 1 <400> 13 gccaggtgag gaagttcta 19 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DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human Trex1 shRNA target 4 <400> 22 gccacaacca ggaacacta 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human Trex1 shRNA target 5 <400> 23 gcaggggtac caaggatct 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human Trex1 shRNA target 6 <400> 24 gccacactgt atggactat 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 1 <400> 25 gatgtgacct tctacaaga 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 2 <400> 26 gaccaccatg gcaacttct 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 3 <400> 27 ggtgcagaca ggcaaagat 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 4 <400> 28 gtgcctgcat cgtaggaat 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 5 <400> 29 gcaacattca agggattga 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VISTA shRNA target 6 <400> 30 gtccctgact ctccaaact 19 <210> 31 <211> 870 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> programmed death-ligand 1 (PD-L1), isoform 1 <400> 31 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60 gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120 aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180 gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240 tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300 atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360 gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420 attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480 cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540 accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600 acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660 acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720 ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780 ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840 aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg 870 <210> 32 <211> 2343 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CTNNB1 (Beta-catenin), isoform 1 <400> 32 atggctactc aagctgattt gatggagttg gacatggcca tggaaccaga cagaaaagcg 60 gctgttagtc actggcagca acagtcttac ctggactctg gaatccattc tggtgccact 120 accacagctc cttctctgag tggtaaaggc aatcctgagg aagaggatgt ggatacctcc 180 caagtcctgt atgagtggga acagggattt tctcagtcct tcactcaaga acaagtagct 240 gatattgatg gacagtatgc aatgactcga gctcagaggg tacgagctgc tatgttccct 300 gagacattag atgagggcat gcagatccca tctacacagt ttgatgctgc tcatcccact 360 aatgtccagc gtttggctga accatcacag atgctgaaac atgcagttgt aaacttgatt 420 aactatcaag atgatgcaga acttgccaca cgtgcaatcc ctgaactgac aaaactgcta 480 aatgacgagg accaggtggt ggttaataag gctgcagtta tggtccatca gctttctaaa 540 aaggaagctt ccagacacgc tatcatgcgt tctcctcaga tggtgtctgc tattgtacgt 600 accatgcaga atacaaatga tgtagaaaca gctcgttgta ccgctgggac cttgcataac 660 ctttcccatc atcgtgaggg cttactggcc atctttaagt ctggaggcat tcctgccctg 720 gtgaaaatgc ttggttcacc agtggattct gtgttgtttt atgccattac aactctccac 780 aaccttttat tacatcaaga aggagctaaa atggcagtgc gtttagctgg tgggctgcag 840 aaaatggttg ccttgctcaa caaaacaaat gttaaattct tggctattac gacagactgc 900 cttcaaattt tagcttatgg caaccaagaa agcaagctca tcatactggc tagtggtgga 960 ccccaagctt tagtaaatat aatgaggacc tatacttacg aaaaactact gtggaccaca 1020 agcagagtgc tgaaggtgct atctgtctgc tctagtaata agccggctat tgtagaagct 1080 ggtggaatgc aagctttagg acttcacctg acagatccaa gtcaacgtct tgttcagaac 1140 tgtctttgga ctctcaggaa tctttcagat gctgcaacta aacaggaagg gatggaaggt 1200 ctccttggga ctcttgttca gcttctgggt tcagatgata taaatgtggt cacctgtgca 1260 gctggaattc tttctaacct cacttgcaat aattataaga acaagatgat ggtctgccaa 1320 gtgggtggta tagaggctct tgtgcgtact gtccttcggg ctggtgacag ggaagacatc 1380 actgagcctg ccatctgtgc tcttcgtcat ctgaccagcc gacaccaaga agcagagatg 1440 gcccagaatg cagttcgcct tcactatgga ctaccagttg tggttaagct cttacaccca 1500 ccatcccact ggcctctgat aaaggctact gttggattga ttcgaaatct tgccctttgt 1560 cccgcaaatc atgcaccttt gcgtgagcag ggtgccattc cacgactagt tcagttgctt 1620 gttcgtgcac atcaggatac ccagcgccgt acgtccatgg gtgggacaca gcagcaattt 1680 gtggaggggg tccgcatgga agaaatagtt gaaggttgta ccggagccct tcacatccta 1740 gctcgggatg ttcacaaccg aattgttatc agaggactaa ataccattcc attgtttgtg 1800 cagctgcttt attctcccat tgaaaacatc caaagagtag ctgcaggggt cctctgtgaa 1860 cttgctcagg acaaggaagc tgcagaagct attgaagctg agggagccac agctcctctg 1920 acagagttac ttcactctag gaatgaaggt gtggcgacat atgcagctgc tgttttgttc 1980 cgaatgtctg aggacaagcc acaagattac aagaaacggc tttcagttga gctgaccagc 2040 tctctcttca gaacagagcc aatggcttgg aatgagactg ctgatcttgg acttgatatt 2100 ggtgcccagg gagaacccct tggatatcgc caggatgatc ctagctatcg ttcttttcac 2160 tctggtggat atggccagga tgccttgggt atggacccca tgatggaaca tgagatgggt 2220 ggccaccacc ctggtgctga ctatccagtt gatgggctgc cagatctggg gcatgcccag 2280 gacctcatgg atgggctgcc tccaggtgac agcaatcagc tggcctggtt tgatactgac 2340 ctg 2343 <210> 33 <211> 1512 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> signal regulatory protein alpha (SIRP-alpha) isoform 1 <400> 33 atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60 gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120 aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 180 atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 240 aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 300 aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360 tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 420 gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 480 acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 540 accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 600 gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 660 gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 720 cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 780 cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 840 cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 900 accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 960 tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1020 gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1080 gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1140 accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1200 gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1260 acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1320 gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1380 cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1440 acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1500 gtcccgagga ag 1512 <210> 34 <211> 1108 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TREX1 isoform 1 <400> 34 aatgggccct ggagctcgca gacagggcag gattgtgcag ggaaggcctg agatgtgctt 60 ctgcccaccc cctaccccac tccctcccct tcggatctta acactgggca ctcacacacc 120 caccccatgc tcctctccag gctcagcagc aggtacgtac ccaaccatgg gctcgcaggc 180 cctgcccccg gggcccatgc agaccctcat ctttttcgac atggaggcca ctggcttgcc 240 cttctcccag cccaaggtca cggagctgtg cctgctggct gtccacagat gtgccctgga 300 gagccccccc acctctcagg ggccacctcc cacagttcct ccaccaccgc gtgtggtaga 360 caagctctcc ctgtgtgtgg ctccggggaa ggcctgcagc cctgcagcca gcgagatcac 420 aggtctgagc acagctgtgc tggcagcgca tgggcgtcaa tgttttgatg acaacctggc 480 caacctgctc ctagccttcc tgcggcgcca gccacagccc tggtgcctgg tggcacacaa 540 tggtgaccgc tacgacttcc ccctgctcca agcagagctg gctatgctgg gcctcaccag 600 tgctctggat ggtgccttct gtgtggatag catcactgcg ctgaaggccc tggagcgagc 660 aagcagcccc tcagaacacg gcccaaggaa gagctatagc ctaggcagca tctacactcg 720 cctgtatggg cagtcccctc cagactcgca cacggctgag ggtgatgtcc tggccctgct 780 cagcatctgt cagtggagac cacaggccct gctgcggtgg gtggatgctc acgccaggcc 840 tttcggcacc atcaggccca tgtatggggt cacagcctct gctaggacca agccaagacc 900 atctgctgtc acaaccactg cacacctggc cacaaccagg aacactagtc ccagccttgg 960 agagagcagg ggtaccaagg atcttcctcc agtgaaggac cctggagccc tatccaggga 1020 ggggctgctg gccccactgg gtctgctggc catcctgacc ttggcagtag ccacactgta 1080 tggactatcc ctggccacac ctggggag 1108 <210> 35 <211> 933 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> V-domain Ig suppressor of T cell activation (VISTA) <400> 35 atgggcgtcc ccacggccct ggaggccggc agctggcgct ggggatccct gctcttcgct 60 ctcttcctgg ctgcgtccct aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120 ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180 gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240 cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300 catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360 tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420 agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480 catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540 tacccatcct cctcccagga tagtgaaaac atcacggctg cagccctggc tacgggtgcc 600 tgcatcgtag gaatcctctg cctccccctc atcctgctcc tggtctacaa gcaaaggcag 660 gcagcctcca accgccgtgc ccaggagctg gtgcggatgg acagcaacat tcaagggatt 720 gaaaaccccg gctttgaagc ctcaccacct gcccagggga tacccgaggc caaagtcagg 780 caccccctgt cctatgtggc ccagcggcag ccttctgagt ctgggcggca tctgctttcg 840 gagcccagca cccccctgtc tcctccaggc cccggagacg tcttcttccc atccctggac 900 cctgtccctg actctccaaa ctttgaggtc atc 933 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-encoding sequence for huPD-L1 <400> 36 gtagagtatg gtagcaatat ctagagtatt gctaccatac tctac 45 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-encoding sequence for huCTNNB1 <400> 37 gacagactgc cttcaaattt ctagagaatt tgaaggcagt ctgtc 45 <210> 38 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-encoding sequence for huSIRPalpha <400> 38 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tatgttttaa aatggactat catatgctta 900 ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 960 aggtagagta tggtagcaat atctagagta ttgctaccat actctacttt tttcgagtag 1020 ctagagaatt catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt 1080 cccataaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa 1140 tagggggcgt acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta 1200 aatagtccac ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg 1260 tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg 1320 taagttatgt aacgcggaac tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt 1380 actattaata actagaccca gctttcttgt acaaagttgg cattataaga aagcattgct 1440 tatcaatttg ttgcaacgaa caggtcacta tcagtcaaaa taaaatcatt atttgccatc 1500 cagctgatat cccctatagt gagtcgtatt acatggtcat agctgtttcc tggcagctct 1560 ggcccgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa 1620 caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac 1680 gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca 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cgcccacctt cggcgacacc tccaccggca cgctacagga cgcttttgat 180 ctggatgcgc taaaagcgct cgatatcatc gtgacctgcc agggcggcga ttataccaac 240 gaaatttatc caaagctgcg cgaaagcgga tggcagggtt actggattga tgcggcttct 300 acgctgcgca tgaaagatga tgccattatt attctcgacc cggtcaacca ggacgtgatt 360 accgacggcc tgaacaatgg cgtgaagacc tttgtgggcg gtaactgtac cgttagcctg 420 atgttgatgt cgctgggcgg tctctttgcc cataatctcg ttgactgggt atccgtcgcg 480 acctatcagg ccgcctccgg cggcggcgcg cgccatatgc gcgagctgtt aacccagatg 540 ggtcagttgt atggccatgt cgccgatgaa ctggcgacgc cgtcttccgc aattcttgat 600 attgaacgca aagttacggc attgacccgc agcggcgagc tgccggttga taactttggc 660 gtaccgctgg cgggaagcct gatcccctgg atcgacaaac agctcgataa cggccagagc 720 cgcgaagagt ggaaaggcca ggcggaaacc aacaagattc tcaatactgc ctctgtgatt 780 ccggttgatg gtttgtgtgt gcgcgtcggc gcgctgcgct gtcacagcca ggcgttcacc 840 atcaagctga aaaaagaggt atccattccg acggtggaag aactgctggc ggcacataat 900 ccgtgggcga aagtggtgcc gaacgatcgt gatatcacta tgcgcgaatt aaccccggcg 960 gcggtgaccg gcacgttgac 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tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600 ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660 gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720 tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780 tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840 gatggacact gctcttggcc cctc 864 <210> 51 <211> 933 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> programmed cell death protein 2 (PD-2), isoform 1 <400> 51 atggctgccg ccggggccag gcctgtggag ctgggcttcg ccgagtcggc gccggcgtgg 60 cgactgcgca gcgagcagtt ccccagcaag gtgtatgcgc cgctgcctgg ccgcccggac 120 gccttccacc gctgcatctt cctcttctgc tgccgcgagc agccgtgctg tgccggcctg 180 cgagttttta ggaatcaact acccaggaaa aacgattttt actcatatga gccaccttct 240 gagaatcctc ccccagaaac aggagaatca gtgtgtctcc agcttaagtc tggtgctcat 300 ctctgcaggg tttgtggctg tttaggcccc aaaacgtgct ccagatgcca caaagcatat 360 tactgcagca aggagcatca gaccctagac tggagattgg gacataagca ggcttgtgca 420 caaccagatc atctggacca 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ccacatacct caagtccaag tgagggacga aggacagtac 300 caatgcataa tcatctatgg ggtcgcctgg gactacaagt acctgactct gaaagtcaaa 360 gcttcctaca ggaaaataaa cactcacatc ctaaaggttc cagaaacaga tgaggtagag 420 ctcacctgcc aggctacagg ttatcctctg gcagaagtat cctggccaaa cgtcagcgtt 480 cctgccaaca ccagccactc caggacccct gaaggcctct accaggtcac cagtgttctg 540 cgcctaaagc caccccctgg cagaaacttc agctgtgtgt tctggaatac tcacgtgagg 600 gaacttactt tggccagcat tgaccttcaa agtcagatgg aacccaggac ccatccaact 660 tggctgcttc acattttcat cccctcctgc atcattgctt tcattttcat agccacagtg 720 atagccctaa gaaaacaact ctgtcaaaag ctgtattctt caaaagacac aacaaaaaga 780 cctgtcacca caacaaagag ggaagtgaac agtgctatc 819 <210> 53 <211> 669 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), isoform 1 <400> 53 atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60 ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120 gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180 gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240 gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300 tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360 gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420 ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480 gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540 ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600 tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660 cccatcaat 669 <210> 54 <211> 969 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD47 transcript variant 1 <400> 54 atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60 ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120 tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180 aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240 tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag 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gtgctcatta gagtcaaatc cctcagtccg tgagtttgtc 960 ctttcaaaag gtgatgctgg cctgcgggaa gcttatgacg cctgtgtgaa agctctggtc 1020 tccctgagga gctaccatct gcaaatcgtg actaagtaca tcctgattcc tgcaagccag 1080 cagccaaagg agaataagac ctctgaagac ccttcaaaac tggaagccaa aggaactgga 1140 ggcactgatt taatgaattt cctgaagact gtaagaagta caactgagaa atcccttttg 1200 aaggaaggt 1209 <210> 56 <211> 1260 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) 2 <400> 56 atgttgcatt ttcattatta tgatacttca aacaaaataa tggagcccca cagaccgaat 60 gtgaagacag cagtgccatt gtctttggaa agctatcaca tatctgaaga gtatggcttt 120 cttcttccag attctctgaa agaacttcca gatcattata ggccttggat ggaaattgcc 180 aacaaacttc ctcaattgat tgatgctcac cagcttcaag ctcatgtgga caagatgccc 240 ctgctgagct gccagttcct gaagggtcac cgggagcagc gcctggccca cctggtcctg 300 agcttcctca ccatgggtta tgtctggcag gaaggagagg cgcagcctgc agaggtcctg 360 ccaaggaatc ttgcccttcc atttgtcgaa gtctccagga acttggggct ccctcctatc 420 ctggtccact cagacttggt gctgacgaac tggaccaaaa aagatccaga 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transducer and activator of transcription 3 (STAT3) <400> 57 atggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag 60 ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt 120 caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc 180 ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag 240 cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag 300 attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc 360 actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag 420 cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag 480 aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag 540 agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg 600 cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag 660 ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg 720 gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta 780 gatcggctag aaaactggat 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taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc 1680 ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg 1740 aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact 1800 aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact 1860 ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac 1920 acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg 1980 gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag 2040 gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt 2100 agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat 2160 accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat 2220 ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag 2280 ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg 2310 <210> 58 <211> 1575 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> lymphocyte-activation gene 3 (LAG3) <400> 58 atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60 aagcctctcc agccaggggc 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ggagacaatg gcgactttac ccttcgacta 960 gaggatgtga gccaggccca ggctgggacc tacacctgcc atatccatct gcaggaacag 1020 cagctcaatg ccactgtcac attggcaatc atcacagtga ctcccaaatc ctttgggtca 1080 cctggatccc tggggaagct gctttgtgag gtgactccag tatctggaca agaacgcttt 1140 gtgtggagct ctctggacac cccatcccag aggagtttct caggaccttg gctggaggca 1200 caggaggccc agctcctttc ccagccttgg caatgccagc tgtaccaggg ggagaggctt 1260 cttggagcag cagtgtactt cacagagctg tctagcccag gtgcccaacg ctctgggaga 1320 gccccaggtg ccctcccagc aggccacctc ctgctgtttc tcatccttgg tgtcctttct 1380 ctgctccttt tggtgactgg agcctttggc tttcaccttt ggagaagaca gtggcgacca 1440 agacgatttt ctgccttaga gcaagggatt caccctccgc aggctcagag caagatagag 1500 gagctggagc aagaaccgga gccggagccg gagccggaac cggagcccga gcccgagccc 1560 gagccggagc agctc 1575 <210> 59 <211> 903 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 (TIM-3) <400> 59 atgttttcac atcttccctt tgactgtgtc ctgctgctgc tgctgctact acttacaagg 60 tcctcagaag tggaatacag agcggaggtc 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cgttttgatg agaatgctgt ggtccgcaac 840 acccagatcg acaactcctg ggggtctgag gagcgaagtc tgccccgaaa aatgcccttc 900 gtccgtggcc agagcttctc agtgtggatc ttgtgtgaag ctcactgcct caaggtggcc 960 gtggatggtc agcacctgtt tgaatactac catcgcctga ggaacctgcc caccatcaac 1020 agactggaag tggggggcga catccagctg acccatgtgc agaca 1065 <210> 62 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> LIGHT/TNSF14 <400> 62 atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60 ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg 120 ggtctcttgc tgttgctgat gggggccggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag 180 ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg 240 gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg 300 gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg 360 gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac 420 tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc 480 accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg 540 gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc 600 agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggaga aggtggtcgt ccgtgtgctg 660 gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg 720 <210> 63 <211> 849 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HVEM/TNSFR14 (receptor for LIGHT ligand) <400> 63 atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 60 ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120 tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180 tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240 ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300 ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360 tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420 tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 480 ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 540 caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 600 tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 660 ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 720 gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 780 cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 840 ccaaaccac 849 <210> 64 <211> 660 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 <400> 64 atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggaaacaag 60 attttggtga agcagtcgcc catgcttgta gcgtacgaca atgcggtcaa ccttagctgc 120 aagtattcct acaatctctt ctcaagggag ttccgggcat cccttcacaa aggactggat 180 agtgctgtgg aagtctgtgt tgtatatggg aattactccc agcagcttca ggtttactca 240 aaaacggggt tcaactgtga tgggaaattg ggcaatgaat cagtgacatt ctacctccag 300 aatttgtatg ttaaccaaac agatatttac ttctgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 360 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 420 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 480 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 540 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 600 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 660 <210> 65 <211> 1578 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1, or CD66a) <400> 65 atggggcacc tctcagcccc acttcacaga gtgcgtgtac cctggcaggg gcttctgctc 60 acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg cccagctcac tactgaatcc 120 atgccattca atgttgcaga ggggaaggag gttcttctcc ttgtccacaa tctgccccag 180 caactttttg gctacagctg gtacaaaggg gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattgta 240 ggatatgcaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg caaacagcgg tcgagagaca 300 atatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctac 360 accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggaca gttccatgta 420 tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccctgt ggaggacaag 480 gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggaca caacctacct gtggtggata 540 aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600 actctactca gtgtcacaag gaatgacaca ggaccctatg agtgtgaaat acagaaccca 660 gtgagtgcga accgcagtga cccagtcacc ttgaatgtca cctatggccc ggacaccccc 720 accatttccc cttcagacac ctattaccgt ccaggggcaa acctcagcct ctcctgctat 780 gcagcctcta acccacctgc acagtactcc tggcttatca atggaacatt ccagcaaagc 840 acacaagagc tctttatccc taacatcact gtgaataata gtggatccta tacctgccac 900 gccaataact cagtcactgg ctgcaacagg accacagtca agacgatcat agtcactgag 960 ctaagtccag tagtagcaaa gccccaaatc aaagccagca agaccacagt cacaggagat 1020 aaggactctg tgaacctgac ctgctccaca aatgacactg gaatctccat ccgttggttc 1080 ttcaaaaacc agagtctccc gtcctcggag aggatgaagc tgtcccaggg caacaccacc 1140 ctcagcataa accctgtcaa gagggaggat gctgggacgt attggtgtga ggtcttcaac 1200 ccaatcagta agaaccaaag cgaccccatc atgctgaacg taaactataa tgctctacca 1260 caagaaaatg gcctctcacc tggggccatt gctggcattg tgattggagt agtggccctg 1320 gttgctctga tagcagtagc cctggcatgt tttctgcatt tcgggaagac cggcagggca 1380 agcgaccagc gtgatctcac agagcacaaa ccctcagtct ccaaccacac tcaggaccac 1440 tccaatgacc cacctaacaa gatgaatgaa gttacttatt ctaccctgaa ctttgaagcc 1500 cagcaaccca cacaaccaac ttcagcctcc ccatccctaa cagccacaga aataatttat 1560 tcagaagtaa aaaagcag 1578 <210> 66 <211> 864 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD80/B7-1 <400> 66 atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60 cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120 gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180 caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240 atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300 attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360 tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420 gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480 atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540 gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600 agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660 ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720 gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780 tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840 agaagggaaa gtgtacgccc tgta 864 <210> 67 <211> 995 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD86/B7-2 <400> 67 cagccaaaat ggatccccag tgcactatgg gactgagtaa cattctcttt gtgatggcct 60 tcctgctctc tggtgctgct cctctgaaga ttcaagctta tttcaatgag actgcagacc 120 tgccatgcca atttgcaaac tctcaaaacc aaagcctgag tgagctagta gtattttggc 180 aggaccagga aaacttggtt ctgaatgagg tatacttagg caaagagaaa tttgacagtg 240 ttcattccaa gtatatgggc cgcacaagtt ttgattcgga cagttggacc ctgagacttc 300 acaatcttca gatcaaggac aagggcttgt atcaatgtat catccatcac aaaaagccca 360 caggaatgat tcgcatccac cagatgaatt ctgaactgtc agtgcttgct aacttcagtc 420 aacctgaaat agtaccaatt tctaatataa cagaaaatgt gtacataaat ttgacctgct 480 catctataca cggttaccca gaacctaaga agatgagtgt tttgctaaga accaagaatt 540 caactatcga 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gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080 atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140 tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200 gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag g 1251 <210> 70 <211> 1614 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD122/nectin-2 <400> 70 atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60 ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120 gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180 cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240 aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300 gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360 caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa 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aggaaatttt gaacaatcat ggaaaatcta aaacgtgctg tgaaaacaaa 1200 gaagagaaat gttgcaggaa agattgttta aaactaatga aatacctttt agaacagctg 1260 aaagaaaggt ttaaagacaa aaaacatctg gataaattct cttcttatca tgtgaaaact 1320 gccttctttc acgtatgtac ccagaaccct caagacagtc agtgggaccg caaagacctg 1380 ggcctctgct ttgataactg cgtgacatac tttcttcagt gcctcaggac agaaaaactt 1440 gagaattatt ttattcctga attcaatcta ttctctagca acttaattga caaaagaagt 1500 aaagaatttc tgacaaagca aattgaatat gaaagaaaca atgagtttcc agtttttgat 1560 gaattt 1566 <210> 89 <211> 1137 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Stimulator of Interferon Genes (STING)(H232 Allele) <400> 89 atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60 gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120 gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180 aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240 tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300 ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360 cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420 ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480 tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540 acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600 ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660 ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccatgctg gcatcaagga tcgggtttac 720 agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780 tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840 cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900 gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960 agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020 gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080 cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctct 1137 <210> 90 <211> 972 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <220> <223> lipid A biosynthesis myristoyltransferase (msbB) <400> 90 ttatttgatg ggataaagat ctttacgctt atacggctga atctcgcctg gcttgcgggt 60 tttgagcagc ttcaggatcc aggtgtactg ttccggatgc gggccgacaa aaatttcgac 120 ctcttcgttc atccgtctgg cgatagtgtg gtcgtcagcc gtgagcagat cgtccattgg 180 cgggcgaatc tggatagtca ggcgatgcgt tttaccatta tacaccggga aaagcggtat 240 cacgcgtgcg cggcacactt tcatcagccg accaattgca ggcagcgtcg ctttgtatgt 300 cgcaaagaaa tcaacgaatt cactatgctc cgggccgtga tcctggtccg gcaggtagta 360 accccagtag ccctgacgaa cagactgaat aaagggttta atcccgtcat tacgcgcatg 420 caaacgtccg ccgaaacgcc gacgcactgt gttccagata tagtcaaaaa ccggattacc 480 ctgattatga aacatcgccg ccattttttg cccctgagag gccatcagca tggctggaat 540 gtcgacgccc cagccatgcg gtacgagaaa aatgactttt tcgtcgttac gacgcatctc 600 ctcgataatc tccagacctt cccagtcaac acgctgttga atttttttcg gaccgcgcat 660 cgccaactca gccatcatcg ccattgcctg tggcgcggtg gcgaacatct catcgacaat 720 cgcttcgcgc tcagcttcgc tacgctgcgg aaagcacaac gacagattaa ttagcgcccg 780 gcgacgagaa ctcttcccca gccgtccggc aaaacgcccc agcgtcgcca gcaaagggtc 840 gcggaatgat gccggtgtta atgcgatccc cgccattgcc gccgcgccca accaggcgcc 900 ccaatactgt ggatagcgaa aggatttttc gaattcaggg atatactcac tattattttt 960 tttggtttcc at 972 <210> 91 <211> 1038 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <220> <223> Phosphoribosylaminoimidazole synthetase (purI) <400> 91 ttattcaata accacacgct gttcggaatc agaggctttg atgataccga ttttccatgc 60 gttttcacct ttctcgttta gcagagcaag cgctttgtcc gcttccggag cggagagcgc 120 aatcaccatg ccgacgccgc agttaaaggt acggtacatt tcatgtcggc tgacattacc 180 ggcggtttgc agccaggtaa agatggcggg ccactgccag gacgactcat taattaccgc 240 ctgggtattc tccggcagaa cgcgcggaat attttcccaa aagcccccgc cggtgaggtg 300 ggcgatagcg tgtacatcga cgttttcaat cagttccaga accgatttta cgtagatacg 360 ggtcggttca agcagatgat cggccagcgg cttcccttcc agcagagtgg tttgtgggtc 420 gcagccgcta acgtcaataa ttttccgcac cagcgaatat ccattcgagt gcgggccgct 480 ggagccgagt gcaatcagca cgtcgccttc ggcaacccgg gagccgtcga tgatttctga 540 tttttcgact acgccgacgc agaaacccgc cacatcgtaa tcttcgccgt gatacatgcc 600 cggcatttcc gccgtctcgc cgccgaccag cgcgcagccg gattgcaggc agccttcggc 660 aataccgttg atcacgctgg cggcggtatc gacatccagt ttacccgtgg catagtaatc 720 gaggaaaaac agcggttccg cgccctgaac gaccagatcg tttacgcaca ttgccaccag 780 atcaataccg atagcgtcgt gacgctttaa gtccatcgcc aggcgaagtt tggtacctac 840 gccgtcagtg ccggaaacca gtaccggttc acgatatttt tgcggcaacg cgcacagcgc 900 accgaaaccg cccagaccgc ccataacctc cgggcggcga gttttcttca ctacgccttt 960 gattcgatca accagagcgt tacccgcatc aatatcgacg ccggcatctt tatagctaag 1020 agaggtctta tcggtcac 1038 <210> 92 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Survivin (SVN)/BIRC5, isoform 1 <400> 92 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120 gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180 ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240 tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300 tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360 aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420 atggat 426 <210> 93 <211> 285 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> araBAD promoter (pBAD) <400> 93 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcttacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccat 285 <210> 94 <211> 459 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Interleukin 2 (IL-2) <400> 94 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 459 <210> 95 <211> 567 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Interferon (IFN) alpha <400> 95 atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctctgggct gtgatctccc tgagacccac agcctggata acaggaggac cttgatgctc 120 ctggcacaaa tgagcagaat ctctccttcc tcctgtctga tggacagaca tgactttgga 180 tttccccagg aggagtttga tggcaaccag ttccagaagg ctccagccat ctctgtcctc 240 catgagctga tccagcagat cttcaacctc tttaccacaa aagattcatc tgctgcttgg 300 gatgaggacc tcctagacaa attctgcacc gaactctacc agcagctgaa tgacttggaa 360 gcctgtgtga tgcaggagga gagggtggga gaaactcccc tgatgaatgc ggactccatc 420 ttggctgtga agaaatactt ccgaagaatc actctctatc tgacagagaa gaaatacagc 480 ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccctctcttt atcaacaaac 540 ttgcaagaaa gattaaggag gaaggaa 567 <210> 96 <211> 729 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD48, isoform 1 <400> 96 atgtgctcca gaggttggga ttcgtgtctg gctctggaat tgctactgct gcctctgtca 60 ctcctggtga ccagcattca aggtcacttg gtacatatga ccgtggtctc cggcagcaac 120 gtgactctga acatctctga gagcctgcct gagaactaca aacaactaac ctggttttat 180 actttcgacc agaagattgt agaatgggat tccagaaaat ctaagtactt tgaatccaaa 240 tttaaaggca gggtcagact tgatcctcag agtggcgcac tgtacatctc taaggtccag 300 aaagaggaca acagcaccta catcatgagg gtgttgaaaa agactgggaa tgagcaagaa 360 tggaagatca agctgcaagt gcttgaccct gtacccaagc ctgtcatcaa aattgagaag 420 atagaagaca tggatgacaa ctgttatctg aaactgtcat gtgtgatacc tggcgagtct 480 gtaaactaca cctggtatgg ggacaaaagg cccttcccaa aggagctcca gaacagtgtg 540 cttgaaacca cccttatgcc acataattac tccaggtgtt atacttgcca agtcagcaat 600 tctgtgagca gcaagaatgg cacggtctgc ctcagtccac cctgtaccct ggcccggtcc 660 tttggagtag aatggattgc aagttggcta gtggtcacgg tgcccaccat tcttggcctg 720 ttacttacc 729 <210> 97 <211> 1602 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD276/B7-H3, isoform 1 <400> 97 atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60 ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca 120 ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg 180 gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct 240 gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg 300 gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc 360 acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420 ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg 480 gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat 540 gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc 600 ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc 660 ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag 720 agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg 780 ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag 840 ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc 900 cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa 960 ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc 1020 ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac 1080 tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc 1140 atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag 1200 ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt 1260 gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg 1320 cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg 1380 acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg 1440 ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat 1500 gcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg 1560 aaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc 1602 <210> 98 <211> 846 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> B7-H4/VTCN1 <400> 98 atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct 60 ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact 120 actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct 180 gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc 240 catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg 300 acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg 360 caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat 420 gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat 480 gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc 540 tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag 600 ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac 660 aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg 720 acagaatcgg agatcaaaag gcggagtcac ctacagctgc taaactcaaa ggcttctctg 780 tgtgtctctt ctttctttgc catcagctgg gcacttctgc ctctcagccc ttacctgatg 840 ctaaaa 846 <210> 99 <211> 867 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> BTLA/CD272, isoform 1 <400> 99 atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60 ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120 aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180 aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240 aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300 cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360 tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420 gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480 ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg 540 caccaaggaa agcaaaatga actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat 600 gctcacctta agagtgagca aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtactgcta 660 tcagaaactg gaatttatga taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct 720 gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg 780 aaccattctg tcattggacc gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca 840 gaatatgcat ccatatgtgt gaggagt 867 <210> 100 <211> 276 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Chemokine (C-C motif) ligand 4 (CCL4) <400> 100 atgaagctct gcgtgactgt cctgtctctc ctcatgctag tagctgcctt ctgctctcca 60 gcgctctcag caccaatggg ctcagaccct cccaccgcct gctgcttttc ttacaccgcg 120 aggaagcttc ctcgcaactt tgtggtagat tactatgaga ccagcagcct ctgctcccag 180 ccagctgtgg tattccaaac caaaagaagc aagcaagtct gtgctgatcc cagtgaatcc 240 tgggtccagg agtacgtgta tgacctggaa ctgaac 276 <210> 101 <211> 3537 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD103/ITGAE <400> 101 atgtggctct tccacactct gctctgcata gccagcctgg ccctgctggc cgctttcaat 60 gtggatgtgg cccggccctg gctcacgccc aagggaggtg cccctttcgt gctcagctcc 120 cttctgcacc aagaccccag caccaaccag acctggctcc tggtcaccag ccccagaacc 180 aagaggacac cagggcccct ccatcgatgt tcccttgtcc aggatgaaat cctttgccat 240 cctgtagagc atgtccccat ccccaagggg aggcaccggg gagtgaccgt tgtccggagc 300 caccacggtg ttttgatatg cattcaagtg ctggtccggc ggcctcacag cctcagctca 360 gaactcacag gcacctgtag cctcctgggc cctgacctcc gtccccaggc tcaggccaac 420 ttcttcgacc ttgaaaatct cctggatcca gatgcacgtg tggacactgg agactgctac 480 agcaacaaag aaggcggtgg agaagacgat gtgaacacag ccaggcagcg ccgggctctg 540 gagaaggagg aggaggaaga caaggaggag gaggaagacg aggaggagga ggaagctggc 600 accgagattg ccatcatcct ggatggctca ggaagcattg atcccccaga ctttcagaga 660 gccaaagact tcatctccaa catgatgagg aacttctatg aaaagtgttt tgagtgcaac 720 tttgccttgg tgcagtatgg aggagtgatc cagactgagt ttgaccttcg ggacagccag 780 gatgtgatgg cctccctcgc cagagtccag aacatcactc aagtggggag tgtcaccaag 840 actgcctcag ccatgcaaca cgtcttagac agcatcttca cctcaagcca cggctccagg 900 agaaaggcat ccaaggtcat ggtggtgctc accgatggtg gcatattcga ggaccccctc 960 aaccttacga cagtcatcaa ctcccccaaa atgcagggtg ttgagcgctt tgccattggg 1020 gtgggagaag aatttaagag tgctaggact gcgagggaac tgaacctgat cgcctcagac 1080 ccggatgaga cccatgcttt caaggtgacc aactacatgg cgctggatgg gctgctgagc 1140 aaactgcggt acaacatcat cagcatggaa ggcacggttg gagacgccct tcactaccag 1200 ctggcacaga ttggcttcag tgctcagatc ctggatgagc ggcaggtgct gctcggcgcc 1260 gtcggggcct ttgactggtc cggaggggcg ttgctctacg acacacgcag ccgccggggc 1320 cgcttcctga accagacagc ggcggcggcg gcagacgcgg aggctgcgca gtacagctac 1380 ctgggttacg ctgtggccgt gctgcacaag acctgcagcc tctcctacat cgcgggggct 1440 ccacggtaca aacatcatgg ggccgtgttt gagctccaga aggagggcag agaggccagc 1500 ttcctgccag tgctggaggg agagcagatg gggtcctatt ttggctctga gctgtgccct 1560 gtggacattg acatggatgg aagcacggac ttcttgctgg tggctgctcc attttaccac 1620 gttcatggag aagaaggcag agtctacgtg taccgtctca gcgagcagga tggttctttc 1680 tccttggcac gcatactgag tgggcacccc gggttcacca atgcccgctt tggctttgcc 1740 atggcggcta tgggggatct cagtcaggat aagctcacag atgtggccat cggggccccc 1800 ctggaaggtt ttggggcaga tgatggtgcc agcttcggca gtgtgtatat ctacaatgga 1860 cactgggacg gcctctccgc cagcccctcg cagcggatca gagcctccac ggtggcccca 1920 ggactccagt acttcggcat gtccatggct ggtggctttg atattagtgg cgacggcctt 1980 gccgacatca ccgtgggcac tctgggccag gcggttgtgt tccgctcccg 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gtgatgcgtc ccatcacgga accgggcgtc 900 tactcctcag gcattccgct gcaacccaac aaagtatggc gtaaaactgc tgcactggtg 960 atgaacattg atgatatgag caagcgtctc aaagcgattg agcgcaaggt taatcaacaa 1020 gac 1023 <210> 106 <211> 918 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> htrB <400> 106 atgacgaatc tacccaagtt ctccaccgca ctgcttcatc cgcgttattg gttaacctgg 60 ttgggtattg gcgtactttg gttagtcgtg caattgccct acccggttat ctaccgcctc 120 ggttgtggat taggaaaact ggcgttacgt tttatgaaac gacgcgcaaa aattgtgcat 180 cgcaacctgg aactgtgctt cccggaaatg agcgaacaag aacgccgtaa aatggtggtg 240 aagaatttcg aatccgttgg catgggcctg atggaaaccg gcatggcgtg gttctggccg 300 gaccgccgaa tcgcccgctg gacggaagtg atcggcatgg aacacattcg tgacgtgcag 360 gcgcaaaaac gcggcatcct gttagttggc atccattttc tgacactgga gctgggtgcg 420 cggcagtttg gtatgcagga accgggtatt ggcgtttatc gcccgaacga taatccactg 480 attgactggc tacaaacctg gggccgtttg cgctcaaata aatcgatgct cgaccgcaaa 540 gatttaaaag gcatgattaa agccctgaaa aaaggcgaag tggtctggta cgcaccggat 600 catgattacg gcccgcgctc aagcgttttc gtcccgttgt ttgccgttga gcaggctgcg 660 accacgaccg gaacctggat gctggcacgg atgtccggcg catgtctggt gcccttcgtt 720 ccacgccgta agccagatgg caaagggtat caattgatta tgctgccgcc agagtgttct 780 ccgccactgg atgatgccga aactaccgcc gcgtggatga acaaagtggt cgaaaaatgc 840 atcatgatgg caccagagca gtatatgtgg ttacaccgtc gctttaaaac acgcccggaa 900 ggcgttcctt cacgctat 918 <210> 107 <211> 717 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <220> <223> ompR <400> 107 atgcaagaga attataagat tctggtggtt gatgacgata tgcgtctgcg ggcgctactg 60 gaacgttatc tgaccgagca gggcttccag gttcgaagcg tcgctaacgc tgagcagatg 120 gatcgtctgc tgacccgtga atctttccat ctcatggtac tggatttaat gctgccaggt 180 gaagatggtc tgtcgatttg tcgtcgcctg cgtagtcaaa gtaatccaat gccgatcatt 240 atggtcacgg cgaagggtga agaggttgac cgtatcgtcg ggctggaaat cggcgccgat 300 gactacattc ctaaaccgtt taacccgcgc gagctgttgg cgcgtattcg gcccgtgtta 360 cgtcgtcagg caaacgaact gcccggcgcg ccgtcgcagg aagaggccgt tatcgcgttc 420 ggtaagttta aactgaacct cggtacgcgc gagatgttcc gtgaagatga accgatgccg 480 ctgaccagcg gggagtttgc ggtactgaaa gcgttagtca gccatccgcg cgagccgctc 540 tctcgcgata agctgatgaa tctggcccgt ggccgcgagt attccgcgat ggaacgctcc 600 atcgacgtcc agatctcccg cctgcgccgt atggtggaag aagatccggc acatccgcgt 660 tatattcaga ccgtctgggg cctgggctac gtctttgtac cggacggttc taaagca 717 <210> 108 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Inteferon (IFN) gamma <400> 108 atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 60 tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 120 ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 180 gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 240 aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 300 aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 360 tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 420 gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 480 ggtcgaagag catcccag 498 <210> 109 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Tumor necrosis factor (TNF) alpha <400> 109 atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60 acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120 gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180 gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240 tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300 cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360 gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420 aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480 gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540 accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600 cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660 gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699 <210> 110 <211> 825 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Atg5 long isoform <400> 110 atgacagatg acaaagatgt gcttcgagat gtgtggtttg gacgaattcc 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ggtcgcctgc ccagtgttcc cgtggaatgg 900 aatgagatta atgctgcttg gggccagact gtgttgctgc tccatgctct ggccaataag 960 atgggtctga aatttcagag ataccgactt gttccttacg gaaaccattc atatctggag 1020 tctctgacag acaaatctaa ggagctgccg ttatactgtt ctggggggtt gcggtttttc 1080 tgggacaaca agtttgacca tgcaatggtg gctttcctgg actgtgtgca gcagttcaaa 1140 gaagaggttg agaaaggcga gacacgtttt tgtcttccct acaggatgga tgtggagaaa 1200 ggcaagattg aagacacagg aggcagtggc ggctcctatt ccatcaaaac ccagtttaac 1260 tctgaggagc agtggacaaa agctctcaag ttcatgctga cgaatcttaa gtggggtctt 1320 gcttgggtgt cctcacaatt ttataacaaa 1350 <210> 112 <211> 2352 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Toll-like receptor 2 (TLR2) <400> 112 atgccacata ctttgtggat ggtgtgggtc ttgggggtca tcatcagcct ctccaaggaa 60 gaatcctcca atcaggcttc tctgtcttgt gaccgcaatg gtatctgcaa gggcagctca 120 ggatctttaa actccattcc ctcagggctc acagaagctg taaaaagcct tgacctgtcc 180 aacaacagga tcacctacat tagcaacagt gacctacaga ggtgtgtgaa cctccaggct 240 ctggtgctga catccaatgg aattaacaca atagaggaag 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tcacaccatc ccgtgggcct 660 gtgtctccat ctgtctcctt ccagcccctg gcccgttcca cccccagggc aagccgcttg 720 cctggaccca cagggtcagt tgtatctact ggcacctcct tctcctcctc atcccctggc 780 ttggcctctg caggggctgc agagggtaaa cagggtgcag agagtgacca ggccgagcct 840 atcatctgct ccagtggggc agaggcacct gccaactctc tgccctccaa agtgcctacc 900 accttgatgc ctgtgaacac agtggccctg aaagtgcctg ccaacccagc atctgtcagc 960 acagtgccct ccaagttgcc aactagctca aagccccctg gtgcagtgcc ttctaatgcg 1020 ctcaccaatc cagcaccatc caaattgccc atcaactcaa cccgtgctgg catggtgcca 1080 tccaaagtgc ctactagcat ggtgctcacc aaggtgtctg ccagcacagt ccccactgac 1140 gggagcagca gaaatgagga gaccccagca gctccaacac ccgccggcgc cactggaggc 1200 agctcagcct ggctagacag cagctctgag aataggggcc ttgggtcgga gctgagtaag 1260 cctggcgtgc tggcatccca ggtagacagc ccgttctcgg gctgcttcga ggatcttgcc 1320 atcagtgcca gcacctcctt gggcatgggg ccctgccatg gcccagagga gaatgagtat 1380 aagtccgagg gcacctttgg gatccacgtg gctgagaacc ccagcatcca gctcctggag 1440 ggcaaccctg ggccacctgc ggacccggat ggcggcccca ggccacaagc 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tgctgcctcc 180 aagaacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 240 agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac 300 aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg 360 aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta 420 aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgagc 459 <210> 131 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL-10 <400> 131 atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60 ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120 cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180 ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240 caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300 caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360 ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420 caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480 tttgacatct tcatcaacta 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780 acacctggag tactccacat tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca 840 agagcaagag agaaaagaaa gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct 900 gccgcaaaaa tgccagcatt agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga 960 gcgaatgggc atctgtgccc tgcagt 986 <210> 134 <211> 276 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> MIP-1 alpha/ CCL3 <400> 134 atgcaggtct ccactgctgc ccttgctgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60 ttctctgcat cacttgctgc tgacacgccg accgcctgct gcttcagcta cacctcccgg 120 cagattccac agaatttcat agctgactac tttgagacga gcagccagtg ctccaagccc 180 ggtgtcatct tcctaaccaa gcgaagccgg caggtctgtg ctgaccccag tgaggagtgg 240 gtccagaaat atgtcagcga cctggagctg agtgcc 276 <210> 135 <211> 1530 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD39/ENTPD1, isoform 1 <400> 135 atggaagata caaaggagtc taacgtgaag acattttgct ccaagaatat cctagccatc 60 cttggcttct cctctatcat agctgtgata gctttgcttg ctgtggggtt gacccagaac 120 aaagcattgc cagaaaacgt taagtatggg attgtgctgg atgcgggttc ttctcacaca 180 agtttataca tctataagtg gccagcagaa 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ccttcaaccc caaggttgtc tgcatggata agtacaggct gagctgcctg 1740 gaggaggaac ggctgctgtt ggtggtgacc agtacgtttg gcaatggaga ctgccctggc 1800 aatggagaga aactgaagaa atcgctcttc atgctgaaag agctcaacaa caaattcagg 1860 tacgctgtgt ttggcctcgg ctccagcatg taccctcggt tctgcgcctt tgctcatgac 1920 attgatcaga agctgtccca cctgggggcc tctcagctca ccccgatggg agaaggggat 1980 gagctcagtg ggcaggagga cgccttccgc agctgggccg tgcaaacctt caaggcagcc 2040 tgtgagacgt ttgatgtccg aggcaaacag cacattcaga tccccaagct ctacacctcc 2100 aatgtgacct gggacccgca ccactacagg ctcgtgcagg actcacagcc tttggacctc 2160 agcaaagccc tcagcagcat gcatgccaag aacgtgttca ccatgaggct caaatctcgg 2220 cagaatctac aaagtccgac atccagccgt gccaccatcc tggtggaact ctcctgtgag 2280 gatggccaag gcctgaacta cctgccgggg gagcaccttg gggtttgccc aggcaaccag 2340 ccggccctgg tccaaggtat cctggagcga gtggtggatg gccccacacc ccaccagaca 2400 gtgcgcctgg aggccctgga tgagagtggc agctactggg tcagtgacaa gaggctgccc 2460 ccctgctcac tcagccaggc cctcacctac ttcctggaca tcaccacacc cccaacccag 2520 ctgctgctcc 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tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg 180 atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240 gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300 ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360 gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420 tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc 480 aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat 540 tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat 600 ggggttattt ccgttacgac taacgtcgca gcgcgtgata tggcccagat gtgcaaactg 660 gcagcagaag aacattttgc cgaggcacgc gttattaatc agcgtctgat gccattacac 720 aacaaactat ttgtcgaacc caatccaatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggaactgggt 780 cttgtggcga ccgatacgct gcgcctgcca atgacaccaa tcaccgacag tggtcgtgag 840 acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctg 876 <210> 170 <211> 819 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> dapB <400> 170 atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg 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tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 188 <211> 1212 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Caspase-1, isoform alpha <400> 188 atggccgaca aggtcctgaa ggagaagaga aagctgttta tccgttccat gggtgaaggt 60 acaataaatg gcttactgga tgaattatta cagacaaggg tgctgaacaa ggaagagatg 120 gagaaagtaa aacgtgaaaa tgctacagtt atggataaga cccgagcttt gattgactcc 180 gttattccga aaggggcaca ggcatgccaa atttgcatca catacatttg tgaagaagac 240 agttacctgg cagggacgct gggactctca gcagatcaaa catctggaaa ttaccttaat 300 atgcaagact ctcaaggagt actttcttcc tttccagctc ctcaggcagt gcaggacaac 360 ccagctatgc ccacatcctc aggctcagaa gggaatgtca agctttgctc cctagaagaa 420 gctcaaagga tatggaaaca aaagtcggca gagatttatc caataatgga caagtcaagc 480 cgcacacgtc ttgctctcat tatctgcaat gaagaatttg acagtattcc tagaagaact 540 ggagctgagg ttgacatcac aggcatgaca atgctgctac aaaatctggg gtacagcgta 600 gatgtgaaaa aaaatctcac tgcttcggac atgactacag agctggaggc atttgcacac 660 cgcccagagc acaagacctc tgacagcacg ttcctggtgt tcatgtctca tggtattcgg 720 gaaggcattt gtgggaagaa acactctgag caagtcccag atatactaca actcaatgca 780 atctttaaca tgttgaatac caagaactgc ccaagtttga aggacaaacc gaaggtgatc 840 atcatccagg cctgccgtgg tgacagccct ggtgtggtgt ggtttaaaga ttcagtagga 900 gtttctggaa acctatcttt accaactaca gaagagtttg aggatgatgc tattaagaaa 960 gcccacatag agaaggattt tatcgctttc tgctcttcca caccagataa tgtttcttgg 1020 agacatccca caatgggctc tgtttttatt ggaagactca ttgaacatat gcaagaatat 1080 gcctgttcct gtgatgtgga ggaaattttc cgcaaggttc gattttcatt tgagcagcca 1140 gatggtagag cgcagatgcc caccactgaa agagtgactt tgacaagatg tttctacctc 1200 ttcccaggac at 1212 <210> 189 <211> 885 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> cyclin-D1/CCND1 <400> 189 atggaacacc agctcctgtg ctgcgaagtg gaaaccatcc gccgcgcgta ccccgatgcc 60 aacctcctca acgaccgggt gctgcgggcc atgctgaagg cggaggagac ctgcgcgccc 120 tcggtgtcct acttcaaatg tgtgcagaag gaggtcctgc cgtccatgcg gaagatcgtc 180 gccacctgga tgctggaggt ctgcgaggaa cagaagtgcg aggaggaggt cttcccgctg 240 gccatgaact acctggaccg cttcctgtcg ctggagcccg tgaaaaagag ccgcctgcag 300 ctgctggggg ccacttgcat gttcgtggcc tctaagatga aggagaccat ccccctgacg 360 gccgagaagc tgtgcatcta caccgacaac tccatccggc ccgaggagct gctgcaaatg 420 gagctgctcc tggtgaacaa gctcaagtgg aacctggccg caatgacccc gcacgatttc 480 attgaacact tcctctccaa aatgccagag gcggaggaga acaaacagat catccgcaaa 540 cacgcgcaga ccttcgttgc cctctgtgcc acagatgtga agttcatttc caatccgccc 600 tccatggtgg cagcggggag cgtggtggcc gcagtgcaag gcctgaacct gaggagcccc 660 aacaacttcc tgtcctacta ccgcctcaca cgcttcctct ccagagtgat caagtgtgac 720 ccggactgcc tccgggcctg ccaggagcag atcgaagccc tgctggagtc aagcctgcgc 780 caggcccagc agaacatgga ccccaaggcc gccgaggagg aggaagagga ggaggaggag 840 gtggacctgg cttgcacacc caccgacgtg cgggacgtgg acatc 885 <210> 190 <211> 996 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> A2b receptor (ADORA2B) <400> 190 atgctgctgg agacacagga cgcgctgtac gtggcgctgg agctggtcat cgccgcgctt 60 tcggtggcgg gcaacgtgct ggtgtgcgcc gcggtgggca cggcgaacac tctgcagacg 120 cccaccaact acttcctggt gtccctggct gcggccgacg tggccgtggg gctcttcgcc 180 atcccctttg ccatcaccat cagcctgggc ttctgcactg acttctacgg ctgcctcttc 240 ctcgcctgct tcgtgctggt gctcacgcag agctccatct tcagccttct ggccgtggca 300 gtcgacagat acctggccat ctgtgtcccg ctcaggtata aaagtttggt cacggggacc 360 cgagcaagag gggtcattgc tgtcctctgg gtccttgcct ttggcatcgg attgactcca 420 ttcctggggt ggaacagtaa agacagtgcc accaacaact gcacagaacc ctgggatgga 480 accacgaatg aaagctgctg ccttgtgaag tgtctctttg agaatgtggt ccccatgagc 540 tacatggtat atttcaattt ctttgggtgt gttctgcccc cactgcttat aatgctggtg 600 atctacatta agatcttcct ggtggcctgc aggcagcttc agcgcactga gctgatggac 660 cactcgagga ccaccctcca gcgggagatc catgcagcca agtcactggc catgattgtg 720 gggatttttg ccctgtgctg gttacctgtg catgctgtta actgtgtcac tcttttccag 780 ccagctcagg gtaaaaataa gcccaagtgg gcaatgaata tggccattct tctgtcacat 840 gccaattcag ttgtcaatcc cattgtctat gcttaccgga accgagactt ccgctacact 900 tttcacaaaa ttatctccag gtatcttctc tgccaagcag atgtcaagag tgggaatggt 960 caggctgggg tacagcctgc tctcggtgtg ggccta 996 <210> 191 <211> 1242 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HHLA2, isoform 1 <400> 191 atgaaggcac agacagcact gtctttcttc ctcattctca taacatctct gagtggatct 60 caaggcatat tccctttggc tttcttcatt tatgttccta tgaatgaaca aatcgtcatt 120 ggaagacttg atgaagatat aattctccct tcttcatttg agaggggatc cgaagtcgta 180 atacactgga agtatcaaga tagctataag gttcacagtt actacaaagg cagtgaccat 240 ttggaaagcc aagatcccag atatgcaaac aggacatccc ttttctataa tgagattcaa 300 aatgggaatg cgtcgctatt tttcagaaga gtaagccttc tggacgaagg aatttacacc 360 tgctatgtag gaacagcaat tcaagtgatt acaaacaaag tggtgctaaa ggtgggagtt 420 tttctcacac ccgtgatgaa gtatgaaaag aggaacacaa acagcttctt aatatgcagc 480 gtgttaagtg tttatcctcg tccaattatc acgtggaaaa tggacaacac acctatctct 540 gaaaacaaca tggaagaaac agggtctttg gattcttttt ctattaacag cccactgaat 600 attacaggat caaattcatc ttatgaatgt acaattgaaa attcactgct gaagcaaaca 660 tggacagggc gctggacgat gaaagatggc cttcataaaa tgcaaagtga acacgtttca 720 ctctcatgtc aacctgtaaa tgattatttt tcaccaaacc aagacttcaa agttacttgg 780 tccagaatga aaagtgggac tttctctgtc ctggcttact atctgagctc ctcacaaaat 840 acaattatca atgaatcccg attctcatgg aacaaagagc tgataaacca gagtgacttc 900 tctatgaatt tgatggatct taatctttca gacagtgggg aatatttatg caatatttct 960 tcggatgaat atactttact taccatccac acagtgcatg tagaaccgag ccaagaaaca 1020 gcttcccata acaaaggctt atggattttg gtgccctctg cgattttggc agcttttctg 1080 ctgatttgga gcgtaaaatg ttgcagagcc cagctagaag ccaggaggag cagacaccct 1140 gctgatggag cccaacaaga aagatgttgt gtccctcctg gtgagcgctg tcccagtgca 1200 cccgataatg gcgaagaaaa tgtgcctctt tcaggaaaag ta 1242 <210> 192 <211> 1128 <212> DNA <213> Herpes simplex <220> <223> herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) <400> 192 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatgtcg ggggggaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128 <210> 193 <211> 1173 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform 1 <400> 193 atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60 ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120 gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180 agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300 gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360 tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420 cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480 aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540 tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600 accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660 gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720 accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780 atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840 gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900 gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020 gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080 ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140 aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173 <210> 194 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF <400> 194 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420 aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480 aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 540 ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 600 acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 660 aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 699 <210> 195 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform 1 shRNA target 1 <400> 195 gaaacccaca acgaaatct 19 <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 2 <400> 196 gtacacacag catatatat 19 <210> 197 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 3 <400> 197 ctgctgaggc tcaagttaa 19 <210> 198 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 4 <400> 198 gtggagctgt accagaaat 19 <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 5 <400> 199 gactcgccag agtggttat 19 <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 6 <400> 200 gagccgtgga ggggaaatt 19 <210> 201 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 7 <400> 201 cctgtgacag cagggataa 19 <210> 202 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 8 <400> 202 gccctggaca ccaactatt 19 <210> 203 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human TGF-beta isoform1 shRNA target 9 <400> 203 ccctgtacaa ccagcataa 19 <210> 204 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 1 <400> 204 gagatcgagt acatcttca 19 <210> 205 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 2 <400> 205 gcagattatg cggatcaaa 19 <210> 206 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 3 <400> 206 gatagagcaa gacaagaaa 19 <210> 207 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 4 <400> 207 ggagaaagca tttgtttgt 19 <210> 208 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 5 <400> 208 gatccgcaga cgtgtaaat 19 <210> 209 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human VEGF shRNA target 6 <400> 209 gcgaggcagc ttgagttaa 19 <210> 210 <211> 3888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARI-134 <400> 210 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240 tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300 gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360 acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420 caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480 gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540 aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600 ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660 agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga gaattggtac catatttgca tgtcgctatg 720 tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat ttgggaatct tataagttct 780 gtatgagacc actccctagg ccacactgta tggactattc tagagatagt ccatacagtg 840 tggctttttt cgacagatct ggcgcgccat agtggccagc ggccgcaggt aagccagccc 900 aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac 960 aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt cctcaggtct gcccgggtgg 1020 catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 1080 accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 1140 aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc ccaagttaac ttgtttattg 1200 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 1260 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 1320 tccaaggtcg ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1380 tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1440 caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1500 tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 1560 tatatcttgt ggaaaggacg aaactaggcc gactacaagc gaattatcta gagtaattcg 1620 cttgtagtcg gcttttttcg agtagctaga gaattcatgg taatagcgat gactaatacg 1680 tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg 1740 ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt 1800 actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct 1860 attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc 1920 ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta 1980 tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag acccagcttt cttgtacaaa 2040 gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt 2100 caaaataaaa tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg 2160 gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 2220 caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 2280 aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 2340 gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 2400 atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 2460 agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 2520 cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 2580 gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 2640 attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 2700 ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 2760 ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 2820 aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 2880 tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2940 gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 3000 tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 3060 aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg 3120 taacactggc 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSC101 origin of replication <400> 256 gagttataca cagggctggg atctattctt tttatctttt tttattcttt ctttattcta 60 taaattataa ccacttgaat ataaacaaaa aaaacacaca aaggtctagc ggaatttaca 120 gagggtctag cagaatttac aagttttcca gcaaaggtct agcagaattt acagataccc 180 acaactcaaa ggaaaaggac tagtaattat cattgactag ccc 223 <210> 257 <211> 602 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> ColE1 origin of replication <400> 257 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 60 accgctacca acggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 120 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagtcggg 180 ccactacttc aagaactctg tagcaccgtt tgtgccatca tcgctctgct aatccggtta 240 ccagtggctg ctgccagtgg cgttaaggcg tgccttaccg ggttggactc aagacgatag 300 ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360 gagcgaacga cctacaccga actgagatac caacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420 cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480 cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540 cacctctgac ttgagcgtct atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600 aa 602 <210> 258 <211> 201 <212> DNA <213> Pseudomonas syringae <220> <223> pPS10 origin of replication <400> 258 acctgaccgg cgcggaagcg ctcttgatct ttttttcttg tttttacttg ttgttccttg 60 ttttcgtaat tttaactata tgatttataa gaaaaaaaag ggtttaaagg ggacagattc 120 agggtttaaa ggggacagat tcagggttta aaggggacag attcagggtt taaaggggac 180 agattcaggc tgatatccac a 201 <210> 259 <211> 617 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> RK2 origin of replication <400> 259 ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60 aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga taccacgcgg 120 aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180 ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240 cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300 caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360 gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgatga cagatgaggg gcgcacctat 420 tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480 ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540 tttttaacca gggctgcgcc ctggcgcgtg accgcgcacg ccgaaggggg gtgccccccc 600 ttctcgaacc ctcccgg 617 <210> 260 <211> 639 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> R6K alpha origin of replication <400> 260 tcttacttct ttgcgtagct gttaaataca gcgttgtttt gataaaatca tcattatcat 60 cgataatgct ttcttcaatt tttttatcct tactctttaa taaagcactt gctaataact 120 tcataccttt tgcaactgtc aaatttggtt catcagggta aatgctttta aggcatacta 180 acaaataatc atggtcttca tcttcaactc taaactgaat ttttttcatc ataactccca 240 acaagaaccg actgtaggtc accgggcaaa cgctgaaaaa taacgtcgaa tgacgtcatt 300 ttgcggcgtt tgccctatcc tgcatcgcag tagaaaatgc cacaactgaa attgtgcttc 360 agtatgtaca gaaatgcaaa atctgaggga tttcgtagct gaaagatcgc cagtcttcga 420 ccgtaaggat aggagttgct gtaagacctg tgcggggcgt tcgcttcgcg aacgggtctg 480 gcagggggca caagcgctgt gctgtgatat atgcaaaaga agccacccac gaacgggagg 540 gcttcggcga atcgactata gtgatctatt tacccggctg attgtcgcct tctagccctc 600 gcgggcatca tgcaaccagt gcctgaattt agttatatg 639 <210> 261 <211> 1027 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> R6K beta origin of replication <400> 261 tgaagctttt tttatgaatt tatctgaagc tgatgcagct tttctcaagg tatttgatga 60 aaccgtacct cccaaaaaag ctaaggggtg atatatggct aaaatttacg atttccctca 120 aggagccgaa cgccgcagga tgcaccgcaa aatccagtgg aacaacgctg taaaattatc 180 taaaaatggc tggagtaagc cagaggttaa acgctggtct tttttagcat tcatctcaac 240 tggctggtat tactttcgcc tttcggtagc agtcattttc catatcatta ctatttgtgg 300 tttagctgtg ctcgcggcgt taagcaatac gatattctgg attggtggcg cgatatgtct 360 tgtaacctgg tatacaaatg accatcaaat ttggagtact aacaatctta ctatccctat 420 tgttttcgga ctttgggtgt taagtttagt agctgcacca ctcatagatt ttttcagtca 480 aaaattgccc ttttatcgtc ttcttgtgcc tgatgcgaag cgtgaggaag tgggcgaaga 540 tgattcttaa agccctgccc tgtacggctt taacgccttc tcgcggtaga tctatggatg 600 ttgagaatgt agtatggtta tactgcgatg caggataggg caaacgccgt aaaatgacgt 660 ctttgacgtt atttttcagc gcttgcccgg tgacctacag tcggtgcttg ttgggagatt 720 ttatgaagtt tactagtaaa ggattttatc agtgataaat atgcaaaggc tattaacatt 780 ttaaatgata accttaaaga aaactactat gttttttatg gtgtaaggtt aagtgaaatt 840 ctttttcctg caagtgatta tggtacagat gattttttta aggagtttga ggaaataaac 900 aacgttacct tgcctttagt tgtttttgaa ataaatgaac gtgaacctgt gattgtaatt 960 ggttttgatg aaataaatcc tgcgattctt atagagaaat ccggtataaa ggttttagta 1020 atcggac 1027 <210> 262 <211> 442 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> R6K gamma origin of replication <400> 262 gatcgctagt ttgttttgac tccatccatt agggcttcta aaacgccttc taaggccatg 60 tcagccgtta agtgttcctg tgtcactgaa aattgctttg agaggctcta agggcttctc 120 agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa ccttaaaagc tttaaaagcc 180 ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag aggctattta agttgctgat 240 ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta 300 cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt agttcgttaa acatgagagc 360 ttagtacgtt aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga gagcttagta cgtactatca 420 acaggttgaa ctgctgatct tc 442 <210> 263 <211> 242 <212> DNA <213> Enterobacteria phage P1 <220> <223> P1 origin of plasmid replication oriR <400> 263 tttcccgtca acacacatcc tatatcccgc cagcacacat tagcaacccg tcagcacaca 60 tttttatccc tccagcacac atcgttttcc ctccagcaca catcgcgata cacttctaag 120 ccagacgtgg cgcggcctgc aacgatcagg gatctatatg gatctaattg ggatctgtat 180 ggacctgatt attggatcta tccagtggat aatgtggata agtgaaaaac cggccaacgt 240 ag 242 <210> 264 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 origin of replication <400> 264 ttatccacat ttaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag 60 cgccagccgc cagtcttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt 120 taaactactt aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca 180 gacagatatg cacctcccac cgcaagcggc gggccccgac cggagccact ttagttacaa 240 cacacaaaaa caacctccag aaaaaccccg gtccagcgca gaaccgaaac cacaaagccc 300 ctccctcata actgaaaagc ggccccgccc cggcccaaag ggccggaaca gagtcgcttt 360 taattatgaa tgttgtaact acatcttcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca 420 gtacacgctc gtaagcggcc ctcacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg 480 taaaccctcg tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg 540 tatggtctgg cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 600 ccgggcttcg gcggttttac tcctgtatca tatgaaacaa cagagtgccg ccttccatgc 660 cgctgatgcg gcatatcctg gtaacgatat ctgaattgtt atacatgtgt atatacgtgg 720 taatgacaaa aataggacaa gttaaaaatt tacaggcgat gcaatgattc aaacacgtaa 780 tcaatatctg ca 792 <210> 265 <211> 2920 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pWSK origin of replication <400> 265 ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 60 atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca gggtgccggc 120 agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 180 gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 240 caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccg acgcgctggg 300 ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg ctggatggcc ttccccatta tgattcttct 360 cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt gcaggccatg ctgtccaggc aggtagatga 420 cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct cgcggctctt accagcctaa cttcgatcat 480 tggaccgctg atcgtcacgg cgatttatgc cgcctcggcg agcacatgga acgggttggc 540 atggattgta ggcgccgccc tataccttgt ctgcctcccc gcgttgcgtc gcggtgcatg 600 gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc cggcggcacc tcgctaacgg attcaccact 660 ccgcagaccc gccataaaac gccctgagaa gcccgtgacg ggcttttctt gtattatggg 720 tagtttcctt gcatgaatcc ataaaaggcg cctgtagtgc catttacccc cattcactgc 780 cagagccgtg agcgcagcga actgaatgtc acgaaaaaga cagcgactca ggtgcctgat 840 ggtcggagac aaaaggaata ttcagcgatt tgcccgagct tgcgagggtg ctacttaagc 900 ctttagggtt ttaaggtctg ttttgtagag gagcaaacag cgtttgcgac atccttttgt 960 aatactgcgg aactgactaa agtagtgagt tatacacagg gctgggatct attcttttta 1020 tcttttttta ttctttcttt attctataaa ttataaccac ttgaatataa acaaaaaaaa 1080 cacacaaagg tctagcggaa tttacagagg gtctagcaga atttacaagt tttccagcaa 1140 aggtctagca gaatttacag atacccacaa ctcaaaggaa aaggactagt aattatcatt 1200 gactagccca tctcaattgg tatagtgatt aaaatcacct agaccaattg agatgtatgt 1260 ctgaattagt tgttttcaaa gcaaatgaac tagcgattag tcgctatgac ttaacggagc 1320 atgaaaccaa gctaatttta tgctgtgtgg cactactcaa ccccacgatt gaaaacccta 1380 caaggaaaga acggacggta tcgttcactt ataaccaata cgctcagatg atgaacatca 1440 gtagggaaaa tgcttatggt gtattagcta aagcaaccag agagctgatg acgagaactg 1500 tggaaatcag gaatcctttg gttaaaggct ttgagatttt ccagtggaca aactatgcca 1560 agttctcaag cgaaaaatta gaattagttt ttagtgaaga gatattgcct tatcttttcc 1620 agttaaaaaa attcataaaa tataatctgg aacatgttaa gtcttttgaa aacaaatact 1680 ctatgaggat ttatgagtgg ttattaaaag aactaacaca aaagaaaact cacaaggcaa 1740 atatagagat tagccttgat gaatttaagt tcatgttaat gcttgaaaat aactaccatg 1800 agtttaaaag gcttaaccaa tgggttttga aaccaataag taaagattta aacacttaca 1860 gcaatatgaa attggtggtt gataagcgag gccgcccgac tgatacgttg attttccaag 1920 ttgaactaga tagacaaatg gatctcgtaa ccgaacttga gaacaaccag ataaaaatga 1980 atggtgacaa aataccaaca accattacat cagattccta cctacataac ggactaagaa 2040 aaacactaca cgatgcttta actgcaaaaa ttcagctcac cagttttgag gcaaaatttt 2100 tgagtgacat gcaaagtaag tatgatctca atggttcgtt ctcatggctc acgcaaaaac 2160 aacgaaccac actagagaac atactggcta aatacggaag gatctgaggt tcttatggct 2220 cttgtatcta tcagtgaagc atcaagacta acaaacaaaa gtagaacaac tgttcaccgt 2280 tacatatcaa agggaaaact gtccatatgc acagatgaaa acggtgtaaa aaagatagat 2340 acatcagagc ttttacgagt ttttggtgca ttcaaagctg ttcaccatga acagatcgac 2400 aatgtaacag atgaacagca tgtaacacct aatagaacag gtgaaaccag taaaacaaag 2460 caactagaac atgaaattga acacctgaga caacttgtta cagctcaaca gtcacacata 2520 gacagcctga aacaggcgat gctgcttatc gaatcaaagc tgccgacaac acgggagcca 2580 gtgacgcctc ccgtggggaa aaaatcatgg caattctgga agaaatagcg ctttcagccg 2640 gcaaaccggc tgaagccgga tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc 2700 cgtttgcggg cagcaaaacc cgtacttttg gacgttccgg cggttttttg tggcgagtgg 2760 tgttcgggcg gtgcgcgcaa gatccattat gttaaacggg cgagtttaca tctcaaaacc 2820 gcccgcttaa caccatcaga aatcctcagc gcgattttaa gcaccaaccc ccccccgtaa 2880 cacccaaatc catactgaaa gtggctttgt tgaataaatc 2920 <210> 266 <211> 37 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> ColE2 origin of replication <400> 266 aaaatgagac cagataagcc ttatcagata acagcgc 37 <210> 267 <211> 668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC origin of replication <400> 267 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 60 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 120 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 180 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 240 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 300 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 360 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 420 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 480 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 540 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 600 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 660 ttttctac 668 <210> 268 <211> 457 <212> DNA <213> Bacteriophage F1 <220> <223> F1 origin of replication <400> 268 gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120 acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180 agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420 aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaattt 457 <210> 269 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL-7 <400> 269 atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60 ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120 ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180 aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240 ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300 gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360 gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420 aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480 caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca ctga 534 <210> 270 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL12B <400> 270 atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300 ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987 <210> 271 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL12A <400> 271 atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60 catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120 ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180 gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240 gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300 gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360 ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420 aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480 atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540 atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600 atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660 gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720 gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762 <210> 272 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL-15 <400> 272 atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60 ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120 gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180 gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240 cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300 gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360 agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420 gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480 acttcttga 489 <210> 273 <211> 804 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> IL15RA <400> 273 atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60 ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120 cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180 tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240 acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300 caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta acgacggcag gggtgacccc acagccagag 360 agcctctccc cttctggaaa agagcccgca gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg 420 gccacaacag cagctattgt cccgggctcc cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca 480 ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc tcccacggca ccccctctca gacaacagcc 540 aagaactggg aactcacagc atccgcctcc caccagccgc caggtgtgta tccacagggc 600 cacagcgaca ccactgtggc tatctccacg tccactgtcc tgctgtgtgg gctgagcgct 660 gtgtctctcc tggcatgcta cctcaagtca aggcaaactc ccccgctggc cagcgttgaa 720 atggaagcca tggaggctct gccggtgact tgggggacca gcagcagaga tgaagacttg 780 gaaaactgct ctcaccacct atga 804 <210> 274 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CXCL9 <400> 274 atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60 caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120 atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180 attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240 gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300 aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360 caaaagaaga ctacataa 378 <210> 275 <211> 297 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CXCL10 <400> 275 atgaatcaaa ctgccattct gatttgctgc cttatctttc tgactctaag tggcattcaa 60 ggagtacctc 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gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184 <210> 315 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pagp-1 primer <400> 315 gcgtgacggt tctgagtgct 20 <210> 316 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pagp-2 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atcgccactg 1740 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1800 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1860 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1920 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1980 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 2040 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 2100 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 2160 tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 2220 tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 2280 gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 2340 gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 2400 aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 2460 gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2520 ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2580 tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2640 atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2700 ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2760 ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2820 ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2880 atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2940 gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 3000 tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 3060 ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 3120 acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 3180 tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 3214 <210> 333 <211> 3141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pSL0196 <400> 333 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 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catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 1020 gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 1080 gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 1140 cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1200 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1260 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1320 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1380 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1440 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1500 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1560 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1620 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1680 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1740 ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1800 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1860 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1920 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1980 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2040 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 2100 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 2160 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 2220 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 2280 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2340 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2400 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2460 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2520 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2580 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2640 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2700 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2760 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2820 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2880 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2940 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 3000 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 3060 aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 3120 gtatcacgag gccctttcgt c 3141 <210> 334 <211> 1217 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <220> <223> ansB (L-asparaginase II) <400> 334 tggcgcagat cgtatctgcg cctttttatt ctgttttttc ctgcattttg ttatccatct 60 ctaaaaaata ctctctgtcg gatatatatc gctggttaat cgtatggcgt cacattattc 120 gtctgcaata tagagataat gcgaccagtt gacataactg gagatataac atggagtttt 180 tcaggaaaac ggcattagct gctctggtaa tgggtttcag cggcgcagcg ttcgctttac 240 cgaatatcac catcttagcg accggcggaa cgatcgctgg cggtggtgat tcagcaacaa 300 aatcaaatta tacggcaggt aaagtcggcg tcgaaaatct ggtggatgcc gttcctcaat 360 tgaaggacat tgcggtagtg aaaggcgagc aggtcgttaa cattggctcg caggatatga 420 acgatgaagt ctggctcacg ctggcgaaaa aaatcaatac cgagtgcgac agcaccgacg 480 gtttcgtgat cacccacggt actgatacga tggaagagac cgcttatttc ctcgatctga 540 ccgtgaaatg caataaaccg gtggtactgg tcggcgcgat gcgtccttcc acgtcaatga 600 gcgcagatgg cccgttcaac ctctataatg cggtagtaac agcggctgat aaacagtctg 660 ccaaccgcgg cgtgctggtg gtaatgaatg ataccgtcat ggacggacgc gacgtcacta 720 agaccaatac gactgacgtg gcgacgttta aagcggttaa ctacggcccg ctgggttata 780 tccacaacgg taaaattgac taccagcgta cgccagagcg taaacatacc acctccaccc 840 cgttcgacgt gtcgaagctg accgcgttgc cgaaagtcgg tatcgtttat aactatgcga 900 atgcgtccga tctgccggca aaagcgctgg tagacgcggg ttatgacggg atcgtgagcg 960 caggagtggg taacggcaac ctgtataaaa cggtctttga taccctggcg accgccgcgc 1020 acaacggtac ggtagtggtg cgttcttcac gagtgccgac tggcgcaacc acgcaggatg 1080 cggaagttga cgatgcaaaa tacggctttg 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cgttatcccc tgattctgtg 1500 gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1560 cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggta gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1620 gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 1680 agtgagcgca acgcaagtcg acccgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 1740 ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 1800 atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 1860 gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 1920 cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 1980 tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 2040 ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 2100 ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 2160 acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tggtttagtg 2220 aaccgtctta agcgctagcg attacgccaa gctcggccac catgctctac ggcctggtgg 2280 ccttggtgct cctcctgctg attgccgcct gtgtgccgat 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Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Thr Phe Thr Glu Gly Ser 325 330 335 Gly Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Leu Trp Phe Cys Val Gly Glu Ser Trp 340 345 350 Pro Gln Asp Gln Pro Trp Thr Lys Arg Leu Val Met Val Lys Val Val 355 360 365 Pro Thr Cys Leu Arg Ala Leu Val Glu Met Ala Arg Val Gly Gly Ala 370 375 380 Ser Ser Leu Glu Asn Thr Val Asp Leu His Ile Asp Asn Ser His Pro 385 390 395 400 Leu Ser Leu Thr Ser Asp Gln Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln Asp Leu Val 405 410 415 Glu Gly Met Asp Phe Gln Gly Pro Gly Glu Ser 420 425 <210> 494 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IFN alpha 2 <400> 494 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His 65 70 75 80 Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val 115 120 125 Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys 130 135 140 Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro 145 150 155 160 Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu 165 170 175 Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 180 185 <210> 495 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IFN beta <400> 495 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185

Claims (393)

  1. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서, 박테리아는 이러한 박테리아가 활성 티미딜레이트 신타제(synthase)를 생성하지 않고 성장용 보조제를 필요로 하는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 성장용 보조제는 티민, 티민 유도체, 티미딘, 티미딘 유도체, 티민 전구체(들), 티미딘 전구체(들), 또는 티미딘 모노포스페이트 전구체(들)를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아는 TLR2, 및 선택적으로 TLR4 및/또는 TLR5의 활성화를 감소시키거나 무효화시키는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  4. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    박테리아는 이러한 박테리아가 활성 아스파라기나제를 분비하지 않는 게놈 변형을 포함하고;
    박테리아는 TLR2, 및 선택적으로 TLR4 및/또는 TLR5의 활성화를 감소시키거나 무효화시키는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아의 게놈은 L-아스파라기나제 II를 인코딩하는 유전자 ansB의 모든 부분 또는 충분한 부분의 결실이나 방해 또는 변형에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 ansB -이고 활성 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않는, 면역자극성 박테리아.
  6. TLR2의 활성화를 감소시키거나 무효화시키며 이로써 유형 I IFN의 유도가 TLR2에 의해 저해되지 않는 게놈 변형(들)을 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아는 이러한 박테리아가 생체내에서 복제할 수 없으나 시험관내에서 영양 보조제와 함께 성장될 때 복제할 수 있는 게놈 변형(들)을 포함하고;
    게놈 변형(들)은 티미딜레이트 신타제를 무효화시키거나 비활성화시키며, 이로써 박테리아는 thyA - 인, 면역자극성 박테리아.
  7. TLR2의 활성화를 감소시키거나 무효화시키며 이로써 유형 I IFN의 유도가 TLR2에 의해 저해되지 않는 게놈 변형(들)을 포함하는 면역자극성 박테리아로서, 여기서 면역자극성 박테리아는 인터페론을 인코딩하거나, 유형 I 인터페론을 항시적으로 유도하는 변형된 STING 단백질을 인코딩하고 병원체 또는 종양으로부터의 항원 또는 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  8. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 모든 부분 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 변형되어 펜타-아실화된 지질 A를 갖는 지질다당류(LPS)를 생산하며;
    헥사-아실화된 지질 A를 갖는 지질다당류는 야생형 박테리아와 비교하여 적어도 10배만큼 실질적으로 감소되거나, 부재하고;
    박테리아의 게놈은 필수 영양소에 대해 영양 요구성(auxotrophic)이 되도록 변형되며;
    박테리아의 게놈은 박테리아 자체가 감염된 면역 세포에서 유형 I 인터페론(IFN)의 유도를 저해하거나 방지하지 않도록 변형되고;
    박테리아의 게놈은 이러한 박테리아가 활성 아스파라기나제 및/또는 티미딜레이트 신타제를 인코딩하거나 생성하지 않도록 변형되는, 면역자극성 박테리아.
  9. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 모든 부분 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 변형되어 펜타-아실화된 지질 A를 갖는 지질다당류(LPS)를 생산하며;
    헥사-아실화된 지질 A를 갖는 지질다당류는 야생형 박테리아와 비교하여 적어도 10배만큼 실질적으로 감소되거나, 부재하고;
    박테리아의 게놈은 이러한 박테리아가 활성 티미딜레이트 신타제를 생성하지 않으며 이로써 박테리아가 thyA - 가 되도록 변형되는, 면역자극성 박테리아.
  10. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 모든 부분 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 편모가 결여되며;
    비변형된 면역자극성 박테리아는 편모를 갖고;
    박테리아의 게놈은 이러한 박테리아가 활성 티미딜레이트 신타제를 생성하지 않도록 변형되는, 면역자극성 박테리아.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 게놈 변형은 결실, 삽입, 및/또는 대체를 포함하며, 이로써 박테리아는 thyA - 인, 면역자극성 박테리아.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 변형되어, 박테리아는 컬리 핌브리애(curli fimbriae)가 결여되는, 면역자극성 박테리아.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 TLR4 및/또는 TLR5의 활성화를 감소시키거나 무효화시키는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    게놈 변형은 편모를 갖지 않는 박테리아를 초래하고;
    박테리아의 야생형은 편모를 갖는, 면역자극성 박테리아.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 컬리 핌브리애를 생성하지 않는, 면역자극성 박테리아.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 변형은 펜타-아실화된 지질다당류를 초래하는, 면역자극성 박테리아.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 편모가 결여되고, msbB - /pagP - 인, 면역자극성 박테리아.
  18. TLR2의 활성화를 감소시키거나 무효화시키며 이로써 유형 I IFN의 유도가 TLR2에 의해 저해되지 않는 게놈 변형을 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아는 진핵 숙주에서 생체내에서 복제할 수 있고;
    면역자극성 박테리아는 종양-연관 항원을 인코딩하거나, 종양 항원 및 STING 단백질을 인코딩하거나, 종양-연관 항원 및 인터페론 알파를 인코딩하거나, 종양-연관 항원 및 인터페론 베타를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는, 비변형된 인간 STING 단백질과 비교하여 유형 I 인터페론의 유도를 증가시킨 변형된 STING 단백질인 STING 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  20. 제19항에 있어서, 변형된 STING 단백질은 제406항 내지 제431항 중 어느 한 항의 변형된 STING 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  21. 제20항에 있어서, 변형된 STING 단백질은 대체 N154S/R284G를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드에서 인코딩되는 치료 생성물은 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부이거나, 인코딩된 생성물은 인터페론-알파 또는 인터페론-베타이거나, 인코딩된 생성물은 IFN-알파와 IFN-베타 둘 다인, 면역자극성 박테리아.
  23. 제22항에 있어서, 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 치료 생성물은 STING 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 병원체 또는 종양으로부터의 항원, 에피토프(들), 또는 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  25. 이종성 생성물의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    면역자극성 박테리아의 게놈은 유전자 또는 유전자들의 모든 부분 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 TLR2, 및 선택적으로 TLR4 및 TLR5 중 하나 또는 둘 다에 의한 약독화된(attenuated) 인식을 가지며;
    하나의 생성물은 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부이고;
    항원, 에피토프 또는 에피토프들로부터의 제2 생성물은 병원체 또는 종양에 대한 면역화를 위한 항원이거나 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  26. 제25항에 있어서, 박테리아의 게놈은 박테리아가 컬리 핌브리애를 갖지 않도록 변형되는, 면역자극성 박테리아.
  27. 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    핵산은 원핵생물에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 인코딩하며, 이로써 RNA는 박테리아에서 생성되고;
    인코딩된 RNA는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이 결여되고/되거나 내부 리보솜 진입 부위(IRES: Internal Ribosome Entry Site), 및/또는 2A 펩타이드를 통한 번역 판독물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  28. 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 면역자극성 박테리아로서, 여기서 핵산은 원핵생물에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  29. 제28항에 있어서, RNA는 샤인-달가노 서열이 결여된, 면역자극성 박테리아.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2A 펩타이드는 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 중 하나 이상인, 면역자극성 박테리아.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 생성물을 인코딩하는 핵산은 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결되며,
    핵산은 원핵생물에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 인코딩하며, 이로써 RNA는 박테리아에서 생성되고,
    RNA는 샤인-달가노 서열이 결여되고, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 2A 펩타이드를 통한 번역 판독물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 프로모터는 박테리아 프로모터 또는 박테리오파지(bacteriophage) 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  33. 제32항에 있어서, 프로모터는 박테리오파지 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 파지 RNA 폴리머라제를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  35. 제32항에 있어서, 프로모터는 임의의 SEQ ID NO: 393-396을 각각 포함하는 프로모터로부터 선택되는, 면역자극성 박테리아:
    Figure pct00114
    또는
    Figure pct00115
    또는
    Figure pct00116
    또는
    Figure pct00117
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 이러한 박테리아가 조직-체류 골수성 세포를 감염시키고 상피 세포를 감염시키지 않는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  37. 제36항에 있어서,
    박테리아는 편모가 결여되고;
    게놈 변형이 없는 박테리아는 편모를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  38. 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서, 박테리아에 의한 대식세포의 감염은 인간 M2 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형 대식세포로 전환시키는, 면역자극성 박테리아.
  39. 제38항에 있어서, 치료 생성물은 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인, 면역자극성 박테리아.
  40. 제39항에 있어서, 유형 I IFN의 발현은 항시적인, 면역자극성 박테리아.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 치료 생성물은 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 치료 생성물의 기능-획득(GOF) 변이체이고, 변이체 GOF 생성물은 유형 I IFN의 발현을 초래하기 위해 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드를 필요로 하지 않는, 면역자극성 박테리아.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 변이체 STING 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아에 의한 감염은 인간 M2 대식세포를 M1-유사 유형 I IFN 생성 세포로 전환시키는, 면역자극성 박테리아.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 편모가 결여되며, 야생형 박테리아는 편모를 갖고, pagP - /msbB - 인, 면역자극성 박테리아.
  45. 제44항에 있어서, 살모넬라(Salmonella) 균주인, 면역자극성 박테리아.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 항암 치료제인, 면역자극성 박테리아.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 항바이러스 치료제 또는 항병원체성 박테리아 치료제인, 면역자극성 박테리아.
  48. 제47항에 있어서, 항바이러스 치료제는 바이러스 효소를 저해하거나 바이러스 복제를 저해하는, 면역자극성 박테리아.
  49. 제47항에 있어서, 치료제는 바이러스 항원의 발현이 바이러스에 대한 면역-보호 반응을 초래하는 항바이러스 치료제이거나, 항바이러스 치료제는 바이러스 항원에 결합하거나 이와 상호작용하는 항체이며, 이로써 바이러스는 저해 또는 차단되거나, 항바이러스 면역력이 초래되는, 면역자극성 박테리아.
  50. 제47항에 있어서, 치료제는 박테리아 항원의 발현이 박테리아 병원체에 대한 면역-보호 반응을 초래하는 박테리아 항원인 항박테리아 치료제이거나, 항박테리아 치료제는 박테리아 항원에 결합하거나 이와 상호작용하는 항체이며, 이로써 병원체성 박테리아는 저해 또는 차단되거나, 항병원체성 박테리아 면역력이 초래되는, 면역자극성 박테리아.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 지속적 감염을 야기하는 바이러스 또는 감염성 병원체(infectious agent)를 치료하기 위한 항바이러스 치료제를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  52. 제47항 내지 제49항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항바이러스 치료제는 바이러스 항원 또는 항원의 에피토프이고, 항원은 바이러스 표면 단백질, 또는 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, 또는 바이러스 비구조 단백질, 또는 바이러스 개방 리딩 프레임(open reading frame) 단백질을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  53. 제51항에 있어서, 바이러스 또는 감염성 병원체는 만성 감염을 야기하는, 면역자극성 박테리아.
  54. 제51항에 있어서, 바이러스 또는 감염성 병원체는 잠재 감염(latent inferction)을 야기하는, 면역자극성 박테리아.
  55. 제51항에 있어서, 바이러스 또는 감염성 병원체는 느린 감염(slow infection)을 야기하는, 면역자극성 박테리아.
  56. 제51항에 있어서, 바이러스 또는 감염성 병원체는 T-세포 백혈병 바이러스(T-Cell leukemia virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 대상 포진 바이러스(varicella zoster virus), 홍역 바이러스(measles virus), 파포바바이러스(papovavirus), 프리온(prion), A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스(hepatitis virus type A, B, C, D and E), 아데노바이러스(adenovirus), 파보바이러스(parvovirus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus), 코로나바이러스(coronavirus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 로타바이러스(rotavirus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 및 유두종바이러스(papillomavirus) 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  57. 제51항에 있어서, 바이러스는 HIV이거나 간염 바이러스인, 면역자극성 박테리아.
  58. 제51항에 있어서, 감염성 병원체는 프리온 또는 원생동물인, 면역자극성 박테리아.
  59. 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 숙주에서 면역 반응을 생성하기에 충분한 바이러스 표면 항원 또는 이의 일부인, 면역자극성 박테리아.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 바이러스 유전자 발현 또는 복제를 방해하는, 면역자극성 박테리아.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 면역자극성 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  62. 제61항에 있어서, 면역자극성 단백질은 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질, 변형된 STING 단백질, 사이토카인, 케모카인, 또는 공동자극성 수용체 또는 리간드인, 면역자극성 박테리아.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 이러한 박테리아에서 편모가 결여되는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 이러한 박테리아가 pagP - 또는 msbB - /pagP - 가 되는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아는 이러한 박테리아가 아스파라기나제를 발현하지 않거나 분비되는 아스파라기나제의 합성을 활성화시키지 않는 박테리아 게놈 변형을 포함하며; 및/또는
    면역자극성 박테리아의 게놈은 L-아스파라기나제 II를 인코딩하는 유전자 ansB의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되어, 박테리아는 ansB -이고 활성 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않는, 면역자극성 박테리아.
  66. 제65항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 종양 및/또는 종양 미세환경을 콜로니화하며, 이로써 ansB - 표현형은 활성 아스파라기나제의 생성을 감소시키거나 무효화시키는 항암 치료제인, 면역자극성 박테리아.
  67. 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    핵산은 원핵생물에 의한 번역에 필요한 서열이 결여된 RNA를 포함하며, 이로써 RNA는 박테리아에서 생성되나 박테리아에 의해 변역될 수 없으며;
    박테리아는 감염이 골수성 세포에 제한되는 게놈 변형을 갖고;
    RNA는 치료 생성물을 인코딩하거나 치료 생성물인, 면역자극성 박테리아.
  68. 골수성 세포를 주로 또는 독점적으로 감염시키고 원핵 프로모터의 제어 하에 박테리아에 의해 인코딩되는 RNA를 포함하는 면역자극성 박테리아를 포함하는 RNA 전달 시스템으로서,
    RNA는 박테리아에 의한 번역에 필요한 조절 서열이 결여되고;
    RNA는 치료 생성물을 인코딩하거나 치료 생성물인, RNA 전달 시스템.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 전사된 RNA는 샤인-달가노 서열이 결여된, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  70. 제67항 또는 제68항에 있어서, 전사된 RNA는 샤인-달가노 서열이 결여되고 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)을 포함하는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  71. 제70항에 있어서, 코작 컨센서스 서열은 ACCAUGG(SEQ ID NO: 397)인, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  72. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 편모가 결여되고 게놈 변형을 함유하며, 이로써 박테리아는 pagP - /msbB - 인, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물을 인코딩하거나 치료 생성물인 RNA는 플라스미드 상에서 인코딩되는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 인코딩하는 핵산은 유도적인 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  75. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 인코딩하는 핵산은 항시적인 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 인코딩하는 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아의 게놈은 L-아스파라기나제 II를 인코딩하는 유전자 ansB의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 ansB -이고 활성 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아의 게놈은 L-아스파라기나제 II를 인코딩하는 유전자 ansB의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해, 그리고 유전자 csgD의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 변형되며, 이로써 박테리아는 ansB -이며 활성 L-아스파라기나제 II를 발현하지 않고, csgD -이고 컬리 핌브리애의 합성을 활성화시키지 않는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 게놈은 편모를 인코딩하는 유전자의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해를 추가로 포함하며, 이로써 박테리아는 플라젤린-이고 편모를 생성하지 않고, 야생형 박테리아는 편모를 갖는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 박테리아의 게놈은 유전자 csgD의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 추가로 변형되며 이로써 박테리아는 csgD -이거나, 게놈에 또 다른 또는 추가 변형을 가지며 이로써 생물막 형성이 손상되는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  81. 제79항에 있어서, 박테리아의 게놈은 유전자의 모두 또는 충분한 부분의 결실 또는 방해에 의해 추가로 변형되며, 이로써 박테리아는 csgD -/msbB - /pagP - 인, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  82. 제69항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 이러한 박테리아에서 편모가 결여되는 게놈의 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아 또는 RNA 전달 시스템.
  83. 박테리아에서 편모가 결여되며 lppA - /lppB - 이고 선택적으로 csgD - 가 되는 게놈 변형을 포함하는 면역자극성 박테리아.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 퓨린에 대해 영양요구성인, 면역자극성 박테리아.
  85. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 아데노신에 대해 영양요구성이거나 아데노신, 아데닌 및 ATP에 대해 영양요구성인, 면역자극성 박테리아.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 purI -인, 면역자극성 박테리아.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 pagP -인, 면역자극성 박테리아.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 asd - 또는 thyA - 또는 둘 다인, 면역자극성 박테리아.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-(asd -)이고, 박테리아는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(asd)를 인코딩하는 내인성 유전자의 모두 또는 일부의 방해 또는 결실로 인해 asd -이며 이로써 내인성 asd는 발현되지 않거나 기능적 효소는 생성되지 않거나, 내인성 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 일부의 방해 또는 결실로 인해 thyA - 이며 이로써 내인성 티미딜레이트 신타제는 발현되지 않거나 기능적 효소는 생성되지 않는, 면역자극성 박테리아.
  90. 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-(asd -)인 면역자극성 박테리아로서,
    박테리아는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(asd)를 인코딩하는 내인성 유전자의 모두 또는 일부의 방해 또는 결실로 인해 asd -이며 이로써 내인성 asd는 발현되지 않거나 기능적 효소는 생성되지 않고;
    박테리아는 내인성 유전자 또는 유전자들의 모두 또는 일부의 방해 또는 결실로 인해 thyA - 이며 이로써 내인성 티미딜레이트 신타제는 발현되지 않거나 기능적 효소는 생성되지 않는, 면역자극성 박테리아.
  91. 제90항에 있어서, 비변형된 박테리아는 살모넬라 박테리아인, 면역자극성 박테리아.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 프로모터의 제어 하에 플라스미드 상에서 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(asd)를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 msbB -인, 면역자극성 박테리아.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, asd -, purI -, msbB -, 플라젤린-, 및 pagP -인, 면역자극성 박테리아.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린- 및 pagP -; 또는 thyA - , csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린- 및 pagP인, 면역자극성 박테리아.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, ansB -, asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린- 및 pagP -; 또는 ansB -, thyA - , csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린- 및 pagP -인, 면역자극성 박테리아.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 항암 치료제인, 면역자극성 박테리아.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 변형된 STING 및 IL-15 또는 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체를 인코딩하고, STING은 cGAS 및/또는 임의의 STING 리간드의 부재 하에 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는, 면역자극성 박테리아.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 ansB -, thyA - , csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린- 및 pagP -인, 면역자극성 박테리아.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물을 인코딩하는 핵산은 분비 신호를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되며, 이로써 발현될 때 치료 생성물이 분비되는, 면역자극성 박테리아.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 항바이러스 생성물인, 면역자극성 박테리아.
  102. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 바이러스 항원인, 면역자극성 박테리아.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 항바이러스 항체인, 면역자극성 박테리아.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    인코딩된 치료 생성물은 항바이러스 생성물이고;
    선택된 바이러스는 만성 감염 또는 잠재 감염을 야기하는 바이러스인, 면역자극성 박테리아.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
    인코딩된 치료 생성물은 항바이러스 생성물이고;
    바이러스는 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상 포진 바이러스, 수두바이러스, 홍역 바이러스, 및 레트로바이러스 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드의 복제수는 150 초과인, 면역자극성 박테리아.
  107. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드의 복제수는 150 복제수 이하이거나 150 이하인, 면역자극성 박테리아.
  108. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 저 복제수로 존재하고, 저 복제수는 25 미만, 20 미만, 약 25 미만, 또는 약 20 미만의 복제수인, 면역자극성 박테리아.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 핵산 또는 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  110. 제109항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 인코딩된 치료 생성물(들)은 항암 치료(들)인, 면역자극성 박테리아.
  113. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 인코딩된 치료 생성물(들)은 항바이러스 치료(들)인, 면역자극성 박테리아.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 박테리아는 사이토카인, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 및 공동자극성 수용체 또는 분자 중에서 선택되는 2개 이상의 생성물을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  115. 제114항에 있어서, 공동자극성 분자는 세포질 도메인이 결여되는, 면역자극성 박테리아.
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물 또는 생성물들 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산은, 박테리아를 포함하는 세포로부터 치료 생성물(들)의 분비를 위한 신호를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 생성물을 인코딩하는 핵산은 진핵생물 숙주에 의해 인식되는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는, 면역자극성 박테리아.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 2개 이상의 생성물을 인코딩하며, 각각의 생성물의 발현은 별개의 프로모터의 제어 하에 있거나 모두의 발현은 단일 프로모터의 제어 하에 있고, 각각의 생성물은 2A 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되어 각각의 인코딩된 치료 생성물의 별개의 번역을 발휘하는, 면역자극성 박테리아.
  119. 제118항에 있어서, 핵산은 T2A, F2A, E2A, 또는 P2A 펩타이드를 인코딩하여, 단일 프로모터의 제어 하에 발현되는 치료 생성물의 별개의 발현을 발휘하는, 면역자극성 박테리아.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  121. 제120항에 있어서, 프로모터는 바이러스 프로모터인 RNA 폴리머라제 II 프로모터 또는 포유류 RNA 폴리머라제 II 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  122. 제121항에 있어서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 헤르페스 바이러스 프로모터, 및 아데노바이러스 프로모터 중에서 선택되는 바이러스 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  123. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 인코딩된 치료 생성물 또는 이종성 단백질 중 하나 이상의 발현을 제어하는 프로모터는 신장 인자-1(EF-1) 알파 프로모터, 또는 MND 프로모터, 또는 UBC 프로모터, 또는 PGK 프로모터, 또는 CAG 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  124. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 인코딩된 치료 생성물 또는 이종성 단백질 중 하나 이상의 발현을 제어하는 프로모터는 EF-1 알파, 아데노바이러스 2 또는 5 후기(late), CMV, SV40, MND, PGK, EIF4A1, CAG, 또는 CD68 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  125. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 상에서 인코딩된 치료 생성물 또는 이종성 단백질 중 하나 이상의 발현을 제어하는 프로모터는 후기 프로모터인 바이러스 프로모터인, 면역자극성 박테리아.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 SV40, hGH, BGH, MND, 닭 베타-글로불린, 및 rbGlob(토끼 글로불린) 유전자 중에서 선택되는 종결인자 및/또는 프로모터(들)를 포함하는 조절 서열을 포함하여, 치료 생성물(들)의 발현을 제어하는, 면역자극성 박테리아.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물(들)은 플라스미드를 함유하는 세포로부터의 분비를 위해 신호 서열에 작동 가능하게 연결되는, 면역자극성 박테리아.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드는 인핸서, 프로모터, 치료 생성물 또는 이종성 단백질을 인코딩하는 개방 리딩 프레임, 및 polyA 테일을 포함하는 작제물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 인핸서, 프로모터, IRES, 치료 생성물 또는 이종성 단백질을 인코딩하는 개방 리딩 프레임, 및 polyA 테일을 포함하는 작제물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  130. 제1항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 인핸서, 프로모터, IRES, 위치화 서열, 치료 생성물 또는 이종성 단백질을 인코딩하는 개방 리딩 프레임, 및 polyA 테일을 포함하는 작제물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  131. 제130항에 있어서, 치료 생성물 또는 이종성 단백질을 인코딩하는 플라스미드 상의 작제물은 우드척 간염 바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사후 조절 요소(Posttranscriptional Regulatory Element)(WPRE), 또는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 치료 생성물 또는 이러한 치료 생성물의 변이체를 인코딩하는 핵산을 함유하는, 면역자극성 박테리아.
  133. 제132항에 있어서, 치료 생성물은 이의 비변형된 형태에서 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드를 감지하거나 이와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여, 유형 I IFN의 발현을 유도하고, 변이체 단백질은 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드의 감지 또는 상호작용의 부재 하에 유형 I IFN의 발현을 유도하는, 면역자극성 박테리아.
  134. 제132항에 있어서, 치료 생성물은 대상체에서 발현될 때 유형 I IFN의 항시적 발현을 유발하는 변이체인, 면역자극성 박테리아.
  135. 제132항에 있어서, 치료 생성물은 유형 I IFN의 발현을 초래하는 데 있어서 세포기질 핵산, 뉴클레오타이드, 디뉴클레오타이드 또는 환식 디뉴클레오타이드를 필요로 하지 않는 기능-획득(GOF) 변이체인, 면역자극성 박테리아.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 STING, RIG-I, MDA-5, IRF-3, IRF-5, IRF-7, IRF-8, TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 및 SNRNP200 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  137. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 및 SNRNP200 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 증가된 활성을 갖거나, 유형 I 인터페론(IFN)의 항시적 발현을 초래하는 변이체인, 면역자극성 박테리아.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 인간에서 인터페론병증(interferonopathy)을 촉진하거나 야기하는 단백질의 기능-획득, 항시적 활성 변이체를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  140. 제132항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은, 단백질에서 인산화 부위를 무효화하여, 활성화된 B-세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(NF-κB) 신호전달을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 변이체인, 면역자극성 박테리아.
  141. 제132항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 I IFN을 유도하는 치료 생성물은 STING, RIG-I, IRF-3, 또는 MDA5이거나; 유형 I IFN을 유도하는 치료 생성물은 IRF-5 또는 IRF-8인, 면역자극성 박테리아.
  142. 제132항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
    유형 I IFN의 발현을 유도하는 치료 생성물은 증가된 활성 또는 항시적 활성을 갖는 이의 변이체이고;
    치료 생성물은 STING, RIG-I, IRF-3, IRF-5, IRF-8, 또는 MDA5인, 면역자극성 박테리아.
  143. 제132항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 유형 I IFN의 증가된 발현을 초래하는 기능-획득 돌연변이를 포함하는 STING, RIG-I, IRF-3, IRF-5, IRF-8, 또는 MDA5의 변이체인, 면역자극성 박테리아.
  144. 제132항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 STING, RIG-I, IRF-3, IRF-5, IRF-8, 또는 MDA5의 변이체이며, 여기서 바이러스 감염의 결과 인산화되는 하나 이상의 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기(들)는 아스파르트산(D)으로 대체되며, 이로써 생성된 변이체는 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 인산모방체(phosphomimetic)인, 면역자극성 박테리아.
  145. 제132항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 생성물은 SEQ ID NO: 312를 기준으로 위치 396, 398, 402, 404 및 405의 잔기에서 하나 이상의 대체(들)를 갖는 IRF-3이고;
    잔기는 아스파르트산 잔기로 대체되는, 면역자극성 박테리아.
  146. 제145항에 있어서, IRF-3은 SEQ ID NO: 312를 기준으로 대체 S396D를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  147. 제145항에 있어서, IRF-3은 SEQ ID NO: 312를 기준으로 대체 S396D/S398D/S402D/T404D/S405D를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  148. 제132항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 STING, RIG-I, MDA-5, IRF-3, IRF-7, IRF-5, IRF-8, TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 및 SNRNP200 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  149. 제132항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포기질성 DNA/RNA를 감지하는 치료 생성물은 변이체 STING, MDA5, RIG-I 또는 IRF-3이고;
    비변형된 STING은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 서열을 가지며, 비변형된 MDA5는 SEQ ID NO: 310으로 표시된 서열을 갖고, 비변형된 RIG-I는 SEQ ID NO: 311로 표시된 서열을 가지며, 비변형된 IRF-3은 SEQ ID NO: 312로 표시된 서열을 갖는, 면역자극성 박테리아.
  150. 제132항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 생성물은 STING, MDA5, IRF-3, 및 RIG-I 중에서 선택되고, STING, MDA5, IRF-3, IRF-5, IRF-8, 또는 RIG-I가 항시적으로 활성으로 되는 기능-획득 돌연변이(들)를 포함하며, 이로써 유형 I IFN의 발현은 항시적인, 면역자극성 박테리아.
  151. 제149항 또는 제150항에 있어서, 돌연변이는 하기로부터 선택되는, 면역자극성 박테리아:
    a) STING에서, SEQ ID NO: 305-309를 기준으로, S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, N154S/R284G, 및 S324A/S326A 중에서 선택되는 하나 이상;
    b) MDA5에서, SEQ ID NO: 310을 기준으로, T331I, T331R, A489T, R822Q, G821S, A946T, R337G, D393V, G495R, R720Q, R779H, R779C, L372F, 및 A452T 중 하나 이상;
    c) RIG-I에서, SEQ ID NO: 311을 기준으로, E373A 및 C268F 중 하나 또는 둘 다; 및
    d) IRF-3에서, SEQ ID NO: 312를 기준으로, S396D.
  152. 제132항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 SEQ ID NO: 305-309를 기준으로, S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, N154S/R284G, 및 S324A/S326A, 및 이의 보존적 대체 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노 대체(들)를 함유하는 변이체 STING인, 면역자극성 박테리아.
  153. 제114항 및 제132항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 I IFN은 인터페론-α 또는 인터페론-β인, 면역자극성 박테리아.
  154. 제1항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  155. 제154항에 있어서, 이중특이적 항체는 이중특이적 T-세포 연계자(engager)인, 면역자극성 박테리아.
  156. 제1항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 DLL3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 T-세포 연계자 항체를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  157. 제156항에 있어서, 이중특이적 T-세포 연계자 항체는 항-DLL3 항체 및 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서, 이중특이적 T-세포 연계자 항체는, 서열이 SEQ ID NO: 485-490으로 표시되는 DLL3 및 CD3 각각에 결합하는 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 인코딩하는 SC16.15, SC16.34, 및 SC16.56으로 표기된 작제물에서 인코딩된 것, 또는 이의 인간화(humanized) 변이체, 및 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 이중특이적 T-세포 연계자 항체는 a) 내지 f)의 조합을 포함하며, 이로써 생성된 작제물은 DLL3 및 CD3 각각에 결합할 수 있는, 면역자극성 박테리아:
    a) SEQ ID NO: 487의 아미노산 잔기 154-260, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는 경쇄; 및
    b) SEQ ID NO: 487의 아미노산 잔기 22-138로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는 중쇄; 및
    c) SEQ ID NO: 489의 아미노산 잔기 155-261로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는 경쇄; 및
    d) SEQ ID NO: 489의 아미노산 잔기 22-139로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는 중쇄; 및
    e) 중쇄 및 경쇄로서,
    경쇄는 SEQ ID NO: 485의 아미노산 잔기 155-261로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하고;
    중쇄는 SEQ ID NO: 485의 아미노산 잔기 22-139로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 중쇄 및 경쇄; 및
    f) 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄로서,
    항-CD3 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 485의 아미노산 잔기 398-504로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하고;
    항-CD3 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 485의 아미노산 잔기 267-382로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄.
  160. 제156항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 이중특이적 T-세포 연계자 항체 작제물은 리더(leader) 서열을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  161. 제160항에 있어서, 리더 서열은 IgGK 리더 서열인, 면역자극성 박테리아.
  162. 제156항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체는 하나 이상의 경쇄 및 중쇄를 연결하는 Gly-Ser 링커를 포함하고;
    Gly-Ser 링커는 이중특이적 T-세포 연계자 항체의 항-DLL3 부분 및 항-CD3 부분을 연결하는, 면역자극성 박테리아.
  163. 제162항에 있어서, 링커는 SEQ ID NO: 485의 잔기 383-397로 표시된 아미노산의 서열을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  164. 제156항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 T-세포 연계자 항체는 플래그 태그(flag tag)를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  165. 제164항에 있어서, 플래그 태그는 SEQ ID NO: 485의 잔기 505-512로 표시된 아미노산의 서열을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  166. 제156항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열, 항-DLL 항체의 중쇄와 경쇄, 및 항-CD3 항체의 중쇄와 경쇄, 및 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커, 및 선택적으로 플래그 태그를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  167. 제156항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 이중특이적 T-세포 연계자 항체 작제물은 임의의 SEQ ID NO: 485-491로 표시된 아미노산 잔기의 서열, 또는 이의 인간화 변이체, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체, 및 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  168. 제1항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 종양-연관 항원을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  169. 제1항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 유형 I 인터페론을 항시적으로 유도하는 변형된 STING 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  170. 제169항에 있어서, STING 단백질은 대체 N154S, 또는 R284G, 또는 N154S/R284G를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  171. 제1항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 IL-15 또는 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  172. 제1항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 변형된 STING, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, 종양-연관 항원 및/또는 이중특이적 T-세포 연계자 항체의 조합을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  173. 제1항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 하기 중 하나 이상 중에서 선택되는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아: IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc), IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, CCL3, CCL4, CCL5, T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질, CD40, CD40 리간드(CD40L), CD28, OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), B7-CD28 계열의 구성원, CD47 길항제, 항-IL-6 항체 또는 IL-6 결합 유인 수용체, TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 및 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원.
  174. 제173항에 있어서,
    면역자극성 단백질은 선택적으로 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 절두되거나 세포질 도메인이 결여된 CD40, CD40 리간드(CD40L), CD28, OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 및 4-1BB 리간드(4-1BBL) 중에서 선택되는 공동자극성 분자이고;
    절두된 유전자 생성물은 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고, 결실된 세포질 도메인으로 인해 항원-제시 세포(APC)에 역조절(counter-regulatory) 신호를 할 수 없는, 면역자극성 박테리아.
  175. 제173항 또는 제174항에 있어서, 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질은 사이토카인 또는 케모카인인, 면역자극성 박테리아.
  176. 제173항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질은 공동자극성 분자 또는 이의 세포질 도메인-결실 형태인, 면역자극성 박테리아.
  177. 제176항에 있어서, 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질은 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, CD24L, B7RP1, 및 OX40L 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  178. 제1항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 TGF-베타 폴리펩타이드 길항제인 치료 생성물을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  179. 제1항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 면역자극성 박테리아.
  180. 제179항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 Fv(scFv), Fv, dsFv, 나노체(nanobody), 이중체(diabody) 단편, 및 단일-사슬 항체 중에서 선택되는 항원-결합 단편인, 면역자극성 박테리아.
  181. 제179항 또는 제180항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화이거나 인간인, 면역자극성 박테리아.
  182. 제179항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, VEGF, VEGFR2, CD24, 또는 IL-6의 길항제인, 면역자극성 박테리아.
  183. 제1항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 하기 중에서 선택되는 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아:
    a) 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질;
    b) 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 단백질, 또는 유형 I IFN의 발현을 증가시키도록 증가된 활성을 갖는 이의 변이체, 또는 유형 I IFN의 항시적 발현을 초래하는 이의 변이체 중 하나 이상; 및
    c) 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  184. 제183항에 있어서, 면역자극성 단백질은 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 또는 이의 충분한 부분이 결여된 공동자극성 분자이며, 이로써 절두된 공동자극성 분자는 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고 항원 제시 세포(APC)에 역조절 신호를 할 수 없는, 면역자극성 박테리아.
  185. 단일 프로모터의 제어 하에 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 면역자극성 박테리아로서,
    치료 생성물은 하기 중에서 선택되고:
    a) 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 부여하거나 이에 기여하는 면역자극성 단백질;
    b) 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 일부인 단백질, 또는 유형 I IFN의 발현을 증가시키도록 증가된 활성을 갖는 이의 변이체, 또는 유형 I IFN의 항시적 발현을 초래하는 이의 변이체 중 하나 이상; 및
    c) 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분;
    인코딩 핵산은 IRES 서열 또는 2A 펩타이드에 의해 분리되고, 각각의 생성물을 인코딩하는 각각의 핵산은 선택적으로 신호 서열을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되며, 이로써 인코딩된 mRNA의 번역 시, 각각의 생성물은 박테리아 및/또는 플라스미드를 포함하는 세포로부터 별개로 발현되고 분비되는, 면역자극성 박테리아.
  186. 제185항에 있어서, 면역자극성 단백질은 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 또는 이의 충분한 부분이 결여된 공동자극성 분자이며, 이로써 절두된 공동자극성 분자는 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고 항원 제시 세포(APC)에 역조절 신호를 할 수 없는, 면역자극성 박테리아.
  187. 제1항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 사이토카인, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 공동자극성 분자, 및 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중에서 선택되는 적어도 2개의 치료 생성물을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  188. 제1항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 사이토카인, 유형 I IFN을 항시적으로 유도하는 단백질, 공동자극성 분자, 및 항암 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중에서 선택되는 적어도 2개의 치료 생성물을 인코딩하고 또한 항원 또는 항원 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  189. 제188항에 있어서, 항원은 종양-연관 항원인, 면역자극성 박테리아.
  190. 제189항에 있어서, 종양-연관 항원은 종양태아(oncofetal) 항원, 종양바이러스(oncoviral) 항원, 및 과발현/축적된 항원, 암-고환(cancer-Testis) 항원, 선형 제한(linear restricted) 항원, 돌연변이화된 항원, 번역후 변경된 항원, 또는 이디오타입(idiotypic) 항원인, 면역자극성 박테리아.
  191. 제190항에 있어서, 종양-연관 항원은 하기 항원 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아:
    Figure pct00118

    Figure pct00119
  192. 제1항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 치료제인, 면역자극성 박테리아.
  193. 제192항에 있어서, 인코딩된 페이로드(payload)는 진핵 프로모터의 제어 하에 발현되는, 면역자극성 박테리아.
  194. 제1항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 플라젤린-, asd - , msbB - , pagP - , 및 csgD - 이거나, ansB -, asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린-, 및 pagP -로 되는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  195. 제194항에 있어서, 박테리아가 thyA - , asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린-, 및 pagP -로 되는 게놈 변형을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  196. 제1항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 암 또는 병원체로부터의 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신인, 면역자극성 박테리아.
  197. 제196항에 있어서, 인코딩된 페이로드는 원핵 프로모터의 제어 하에 발현되고, 페이로드를 인코딩하는 핵산은 박테리아 리보솜에 의해서가 아니라 진핵 리보솜에 의해 인식되는 번역 조절 신호를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  198. 제1항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아 내의 플라스미드는 병원체로부터의 항원 또는 이의 단백질 또는 에피토프(들)를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  199. 제198항에 있어서, 병원체는 만성 바이러스 감염, 예컨대 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상 포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 호흡기 융합 바이러스(RSV), 및 홍역 바이러스에 의한 감염을 야기하거나; 대상체를 만성적으로 감염시키는 바이러스 또는 다른 병원체이거나; 급성 감염, 예컨대 만성 인플루엔자 및 코로나바이러스, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV: Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV: Middle East Respiratory Syndrome coronavirus), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2: Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2로서, COVID-19를 야기함)에 의한 초기 감염을 야기하는 병원체인, 면역자극성 박테리아.
  200. 제199항에 있어서, 플라스미드는 병원체로부터의 항원 또는 이의 에피토프 또는 에피토프의 조합, 예컨대 필수 바이러스 단백질로부터의 항원, 예컨대 코로나바이러스의 경우 뉴클레오캡시드로부터의 항원, M 및/또는 S 단백질을 인코딩하며, 이는 중화 항체, 및 장기-수명의 순환형 및 조직-체류 CD8+ T-세포의 증강을 초래할 수 있는, 면역자극성 박테리아.
  201. 제198항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 항원, 에피토프, 또는 항원 단백질을 인코딩하는 핵산은 박테리아에 의해 인식되는 원핵 프로모터에 작동 가능하게 연결되며; 인코딩 서열은 진핵 리보솜에 의해 인식되는 번역을 위한 조절 서열을 포함하며 이로써 박테리아는 인코딩된 RNA를 번역할 수 없거나, 인코딩 서열은 박테리아 리보솜에 의해 인식되는 샤인 달가노 서열을 포함하지 않아 인코딩된 mRNA가 번역되지 않고; mRNA는 진핵 숙주 세포에 전달되고 이러한 진핵 숙주 세포 내로 박테리아가 전달되는, 면역자극성 박테리아.
  202. 제1항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드는 단일 프로모터의 제어 하에 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하고;
    생성물 중 적어도 2개 또는 모두를 인코딩하는 핵산의 발현은 단일 프로모터의 제어 하에 있고, 각각의 생성물을 인코딩하는 핵산은 2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되며, 이로써 번역 시 각각의 생성물은 별개로 발현되는, 면역자극성 박테리아.
  203. 제198항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산은 발현된 생성물(들)의 분비를 지시하는 서열을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는, 면역자극성 박테리아.
  204. 제1항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 생성물은 항원-제시 세포(APC) 상에서의 발현을 위해 세포질 도메인 결실을 갖는 공동자극성 분자이고;
    절두된 유전자 생성물은 세포질 도메인 결실로 인해 공동자극성 수용체 연계를 통해 T-세포에 항시적 면역자극성 신호전달을 할 수 있고 항원 제시 세포(APC)에 역조절 신호를 할 수 없는, 면역자극성 박테리아.
  205. 제204항에 있어서, 세포질 도메인이 결여된 공동자극성 분자는 4-1BBL, CD80, CD86, CD27L, B7RP1, CD24L, 또는 OX40L인, 면역자극성 박테리아.
  206. 제1항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 치료 생성물을 인코딩하며, 적어도 하나의 생성물은 a)로부터 선택되고, 적어도 하나는 b)로부터 선택되며,
    a)는 IL-2, IL-7, IL-12p70(IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-23, IL-36 감마, IL-2Ra에 대해 약독화된 결합을 갖는 IL-2, IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체(IL-15Rα-IL-15sc), IL-18, IL-2Ra에 결합하지 않도록 변형된 IL-2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 인터페론-α, 인터페론-β, CCL3, CCL4, CCL5, T-세포의 모집 및/또는 지속에 관여하거나 이를 발휘하거나 강화시키는 단백질, CD40, CD40 리간드(CD40L), OX40, OX40 리간드(OX40L), 4-1BB, 4-1BB 리간드(4-1BBL), B7-CD28 계열의 구성원, TGF-베타 폴리펩타이드 길항제, 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼계열의 구성원이고;
    b)는 STING, RIG-I, MDA-5, IRF-3, IRF-5, IRF-7, IRF-8, TRIM56, RIP1, Sec5, TRAF3, TRAF2, TRAF6, STAT1, LGP2, DDX3, DHX9, DDX1, DDX9, DDX21, DHX15, DHX33, DHX36, DDX60, 또는 SNRNP200인, 면역자극성 박테리아.
  207. 제1항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-베타 저해성 항체, TGF-베타 결합 유인 수용체, 항-IL-6 항체, 및 IL-6 결합 유인 수용체 중 하나 이상을 인코딩하거나 추가로 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  208. 제1항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 생성물의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아:
    IL-2 및 IL-12p70;
    IL-2 및 IL-21;
    IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함), 여기서 Δcyt는 결실된 세포질 도메인임;
    IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα 및 IL-12p70;
    IL-15/IL-15Rα 및 IL-21;
    IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 IL-21;
    IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 IL-18;
    IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-18;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-18;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, 및 IL-12p70;
    CD40 작용제, IL-2, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제 및 IL-12p70; CD40 작용제, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-18;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    종양-연관 항원;
    CD40 작용제 및 STING GOF 변이체.
  209. 제208항에 있어서, 종양-연관 항원을 추가로 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  210. 제208항 또는 제209항에 있어서, STING 기능-획득(GOF) 변이체는 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항에 표시된 것 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  211. 치료 생성물의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 면역자극성 박테리아 또는 세포:
    IL-2 및 IL-12p70;
    IL-2 및 IL-21;
    IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함), 여기서 Δcyt는 결실된 세포질 도메인임;
    IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα 및 IL-12p70;
    IL-15/IL-15Rα 및 IL-21;
    IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 IL-21;
    IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    IL-12p70 및 IL-18;
    IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-21;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체 및 IL-12p70;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, 및 IL-18;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    TGF-β 유인 수용체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    TGF-β 유인 수용체 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-21;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체 및 IL-12p70;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, 및 IL-18;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    항-CTLA-4 항체, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    항-CTLA-4 항체 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, 및 IL-12p70;
    CD40 작용제, IL-2, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-2, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-2, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-12p70;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-15/IL-15Rα, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-21;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-21, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제 및 IL-12p70;**
    CD40 작용제, IL-12p70, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제, IL-12p70, 및 IL-18;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, 및 STING GOF 변이체;
    CD40 작용제, IL-12p70, IL-18, STING GOF 변이체, 및 4-1BBL(4-1BBLΔcyt 포함);
    CD40 작용제 및 STING GOF 변이체;
    이중특이적 T-세포 연계자(BiTe) + STING 단백질, BiTe + IL-15, BiTe + IL-15 + STING 단백질, 여기서 BiTe는 DLL3, EGFR, Her2, CEA, 메소텔린(Mesothelin), PSMA, EpCAM, CD74, 폴레이트 수용체, Nectin4, EphA2, CA-IX, B7H3, Siglec-15, Muc1, 또는 루이스 Y 항원을 표적화함;
    종양 항원(들) + STING 기능-획득 변이체;
    종양 항원(들)과 IL-15의 치료 조성물;
    종양 항원(들) + IL-15 + STING 기능-획득 변이체의 치료 조성물;
    하나 이상의 항원 및 IFN;
    하나 이상의 항원 및 IFNα;
    하나 이상의 항원, 및 IFNα2 또는 IFNα1-16;
    하나 이상의 항원 및 임의의 IFNα-16;
    하나 이상의 항원 및 IFN-β;
    하나 이상의 항원, IFNα2, 및 IFN-β;
    하나 이상의 항원 및 돌연변이 S396D를 갖는 IRF3 GOF 변이체;
    하나 이상의 항원, IFNα2 또는 IFNα1-16, 및 돌연변이 S396D를 갖는 IRF3 GOF 변이체;
    IFN알파2 + IRF3-S396D;
    IFNα1-16 + IRF3-S396D;
    IFN알파2 + IFN-베타;
    IFNα1-16 + IFN-베타
    단독으로 또는 다른 면역자극성 단백질과 조합되어, FLT-3L, 또는 시알리다제(sialidase), 또는 IL-12p35, 또는 아주린(Azurin), 또는 막 앵커링된 IL-2, IL-12, IL-12p35, IL-21, IL-15, FLT-3L; 및
    TLR8 작용제, 여기서 작용제는 단독으로 또는 임의의 면역자극성 단백질과 조합되어 polyU 또는 polyU/G, microRNA, 또는 miR-21임.
  212. 제202항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 종양-연관 항원을 추가로 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  213. 제1항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드는 제191항에 제시된 바와 같은 종양-연관 항원을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  214. 제1항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 이중특이적 T-세포 연계자인, 면역자극성 박테리아.
  215. 제214항에 있어서, 이중특이적 T-세포 연계자는 델타-유사 리간드 3(DLL3) 및 CD3에 결합하는, 면역자극성 박테리아.
  216. 제1항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 및 변형된 또는 변이체 STING 단백질을 인코딩하는, 면역자극성 박테리아.
  217. 제215항에 있어서, STING 단백질은 제406항 내지 제436항 중 어느 한 항의 STING 단백질인, 면역자극성 박테리아.
  218. 제215항 또는 제216항에 있어서, 사이토카인은 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, 또는 IL-15, 또는 IL-12인, 면역자극성 박테리아.
  219. 제215항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-15/IL-15R 알파 사슬 복합체, 또는 IL-15인, 면역자극성 박테리아.
  220. 제215항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, STING 단백질은 태즈메이니아 데빌(Tasmanian devil)로부터의 CTT와 함께 인간 STING 단백질을 포함하는 키메라 STING 단백질이거나, 태즈메이니아 데빌로부터의 CTT와 함께 그리고 하나 이상의 기능-획득 돌연변이를 갖는 인간 STING 단백질을 포함하는 키메라 STING인, 면역자극성 박테리아.
  221. 제215항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, STING 단백질은 N154S, 또는 R284G, 또는 N154S/R284G인 기능-획득 돌연변이를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  222. 제214항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, STING 기능-획득 변이체는 제405항 내지 제430항 중 어느 한 항에 제시된 것 중에서 선택되는, 면역자극성 박테리아.
  223. 제1항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 Fc 도메인을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  224. 제1항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 B7 단백질 막횡단 도메인을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  225. 제1항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 종양-연관 항원인, 면역자극성 박테리아.
  226. 제1항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 생성물은 이중특이적 T-세포 연계자 항체인, 면역자극성 박테리아.
  227. 제1항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 GPI-앵커(anchored)되는, 면역자극성 박테리아.
  228. 제1항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 인코딩된 생성물의 혈청 반감기를 증가시키는 인간 혈청 알부민 또는 이의 유도체를 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  229. 제1항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 치료 생성물은 콜라겐에 대한 융합을 포함하는, 면역자극성 박테리아.
  230. 제1항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI, 또는 YS1646△asd/△FLG/△pagP/△ansB/△csgD/F-△purI/△thyA로 표기된 균주인, 면역자극성 박테리아.
  231. 톨-유사 수용체(TLR) 2, 4 및 5에 의한 반응이 게놈 변형을 갖지 않는 박테리아와 비교하여 감소되는 게놈 변형을 포함하는 게놈 변형된 박테리아로서,
    박테리아는 필요한 영양소 또는 인자에 대해 영양 요구성이 되는 추가의 게놈 변형을 포함하며, 따라서 이는 진핵 숙주에서 복제할 수 없으나 영양소 또는 인자와 함께 공급될 때 시험관내에서 복제할 수 있으며;
    박테리아는 생성물을 인코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드를 포함하거나, 생성물을 인코딩하는 RNA를 포함하고;
    핵산 또는 RNA에 의해 인코딩된 생성물은 항원 서열 또는 병원성 바이러스, 박테리아, 또는 기생충인 병원체로부터의 서열이거나, 종양 항원이며, 이로써 숙주에서 인코딩된 항원의 발현 시, 숙주는 병원성 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 종양 항원에 대한 면역-보호 반응 또는 면역화 반응을 발달시키거나, 생성물은 치료 생성물이며;
    항원 서열(들)의 발현은 원핵 프로모터의 제어 하에 있어서, 항원(들)을 인코딩하는 RNA가 박테리아에서 생성되고;
    항원을 인코딩하는 핵산은 박테리아 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지만 진핵 숙주 리보솜에 의한 인코딩된 RNA의 번역을 저해하거나 방지하지 않는 조절 서열을 포함하며, 이로써 번역은 박테리아에서 전사로부터 분리되며;
    생성된 박테리아는 진핵 대상체에게 투여될 때 식세포를 감염시키기 위해 선택되고, 핵산을 RNA가 번역되는 식세포 내로 전달하는, 박테리아.
  232. 제231항에 있어서, 항원 서열(들)을 인코딩하는 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 포함하며, 이로써 숙주 세포 번역은 용이하게 되거나 증강되고, 박테리아 번역은 저해되거나 방지되는, 박테리아.
  233. 제232항에 있어서, IRES는 혈관 내피 성장 인자 및 유형 1 콜라겐 유도적 단백질(VCIP) IRES인, 박테리아.
  234. 제232항 또는 제233항에 있어서, 항원(들)을 인코딩하는 핵산은 박테리아에서 번역을 저해하거나 감소시키고 진핵 숙주에서 번역을 허용하고 선택적으로 촉진하거나 증강시키는 VCIP 또는 다른 IRES를 포함하는, 박테리아.
  235. 제232항 또는 제233항에 있어서, IRES 또는 VCIP IRES는 프로모터의 3' 및 항원(들) 코딩 서열의 5'인 위치에서 플라스미드에 포함되는, 박테리아.
  236. 제233항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, VCIP IRES의 서열은 SEQ ID NO: 434로 표시되는, 박테리아.
  237. 제231항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체는 박테리아 또는 바이러스인, 박테리아.
  238. 제231항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 항원은 종양 항원인, 박테리아.
  239. 제231항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 바이러스 감염 또는 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기 위한 백신인, 박테리아.
  240. 제236항에 있어서, 병원체는 만성 바이러스 감염을 야기하는 바이러스 중에서 선택되는, 박테리아.
  241. 제240항에 있어서, 감염은 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상 포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 호흡기 융합 바이러스(RSV), 홍역 바이러스, 및 대상체를 만성적으로 감염시키는 다른 바이러스에 의한 감염 중에서 선택되는, 박테리아.
  242. 제239항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 감염은 급성 감염인, 박테리아.
  243. 제242항에 있어서, 감염은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 또는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2로서, COVID-19를 야기함)에 의한 감염인, 박테리아.
  244. 제231항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체는 에스케리키아(Escherichia), 스타필로콕커스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 액티노박테리아(Actinobacteria), 아캐오박테리아(Archaeobacteria), 미코박테리아(Mycobacterium) 또는 포르피로모나스(Porphyromonas)의 종인, 박테리아.
  245. 제231항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체는 피. 긴기발리스(P. gingivalis), SARS-CoV, 또는 이. 콜라이(E. coli), 또는 해모필루스(Haemophilus) 인플루엔자인, 박테리아.
  246. 제231항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 내 플라스미드는 면역자극성 단백질 또는 다른 아쥬반트를 추가로 인코딩하는, 박테리아.
  247. 제246항에 있어서, 플라스미드는 면역자극성 단백질 또는 다른 치료 단백질의 조합을 인코딩하는, 박테리아.
  248. 제247항에 있어서, 면역자극성 단백질은 STING 단백질인, 박테리아.
  249. 제248항에 있어서, STING 단백질은 기능-획득 돌연변이를 포함하고/하거나 키메라 STING 단백질인, 박테리아.
  250. 제248항 또는 제249항에 있어서, STING 단백질은 제406항 내지 제436항 중 어느 한 항의 STING 단백질인, 박테리아.
  251. 제231항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 치료 생성물의 조합을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, 박테리아.
  252. 제250항에 있어서, 제1항 내지 제251항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 면역자극성 박테리아인, 박테리아.
  253. 제231항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역자극성 단백질(들) 및/또는 다른 치료 단백질은 박테리아에 의해 인식되는 원핵 프로모터의 제어 하에 항원의 발현과 함께 다시스트론성(polycistronic) 서열의 부분으로서 플라스미드에서 인코딩되거나;
    면역자극성 단백질(들) 및/또는 다른 치료 단백질은 진핵 숙주에 의해 인식되는 진핵 프로모터의 제어 하에 플라스미드 상에서 인코딩되는, 박테리아.
  254. 제231항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 시험관내에서 박테리아를 배양함으로써 생성되는 원핵 프로모터의 제어 하에 발현되는 항원(들) 및 임의의 다른 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 박테리아.
  255. 제231항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 편모가 결여되고 펜타-아실화된 지질 A를 갖는 LPS를 생성하게 되는 게놈 변형을 포함하는, 박테리아.
  256. 제231항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, asd - 또는 thyA - 또는 둘 다인, 박테리아.
  257. 제231항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, o 아데노신 영양 요구체, 및 csgD - 중 하나 또는 둘 다이고, 선택적으로 ansB - 인, 박테리아.
  258. 제231항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, TLR8 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 박테리아.
  259. 제258항에 있어서, TLR8 작용제는 polyU, polyU/G, microRNA, 또는 miR-21인, 박테리아.
  260. 제231항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, msbB - /pagP - 이며, 편모가 결여되고, asd - 또는 thyA - 이거나 asd - 와 thyA - 둘 다인, 박테리아.
  261. 제1항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아, 리스테리아(Listeria), 미코박테리아, 또는 살모넬라의 종 또는 균주인, 박테리아.
  262. 제1항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 살모넬라의 균주인, 박테리아.
  263. 제262항에 있어서, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주인, 박테리아.
  264. 제262항 또는 제263항에 있어서, 비변형된 살모넬라는 야생형 균주이거나, 비변형된 살모넬라 균주는 약독화되는, 박테리아.
  265. 제1항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 균주 VNP20009 또는 YS1646으로부터, 또는 균주 ATCC 14028로부터, 또는 균주 ATCC 14028의 모든 식별화 특징(identifying characteristic)을 갖는 균주로부터 유래되는, 박테리아.
  266. 제231항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 변형은 유전자에서의 결실, 삽입, 방해, 및 다른 변형 중 하나 이상이며, 이로써 유전자에 의해 인코딩되는 생성물은 생성되지 않거나, 생성된 바와 같이 비활성인, 박테리아.
  267. 제231항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 프로모터는 박테리아 프로모터 또는 박테리아 파지 프로모터인, 박테리아.
  268. 제231항 내지 제267항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 숙주는 인간인, 박테리아.
  269. 대상체에게 투여되어 대상체에서 적응 면역 반응을 이끌어내기 위한 양으로 비히클에 제1항 내지 제268항 중 어느 한 항의 박테리아를 포함하는 백신.
  270. 제269항에 있어서, 에어로졸로서, 또는 분말로서, 또는 정제 또는 좌제로서 제형화되는, 백신.
  271. 제269항 또는 제270항에 있어서, 경구 투여, 비내 투여, 흡입 투여, 직장 투여, 질 투여, 안내 투여, 두개내 투여, 피부내 투여, 또는 근육내 투여를 위해 제형화되는, 백신.
  272. 바이러스로부터의 단백질 또는 비내 또는 폐 흡입을 위해 제형화된 바이러스 코로나 바이러스로부터의 단백질로부터의 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신으로서, 여기서 백신은 TRL2를 충분히 활성화시키지 못하며, 이로써 백신은 유형 I IFN을 유도하는, 백신.
  273. 제272항에 있어서, 바이러스는 코로나 바이러스인, 백신.
  274. 제273항에 있어서, 바이러스는 SARS-COV2인 코로나 바이러스인, 백신.
  275. 제272항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 I IFN을 저하시키거나 저해하기에 충분한 TLR4 및/또는 TRL5 반응을 또한 활성화시키지 않는, 백신.
  276. 병원체 또는 종양으로부터의 항원 또는 단백질 또는 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신으로서,
    백신은 병원체 또는 종양에 대한 면역 반응을 이끌어내며;
    병원체는 폐 및/또는 비인두(naso-pharynx)를 포함한 호흡계를 감염시키는 호흡기 병원체이고;
    종양은 폐 종양이며;
    백신은 코 또는 폐를 통한 흡입을 위해 제형화되고;
    백신은 핵산을 포식성 대식세포에 전달하여 면역억제성 포식성 대식세포를, CD8+ T-세포에의 현장(in situ) 항원 교차-제시를 할 수 있고 림프절로 이동하여 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 프라이밍할 수 있는 면역자극성 포식성 대식세포로 전환시키는, 백신.
  277. 제276항에 있어서, 유형 I IFN을 저하시키거나 저해하기에 충분한 TLR4 및/또는 TRL5 반응을 또한 활성화시키지 않는, 백신.
  278. 제276항 또는 제277항에 있어서, 유형 I IFN을 저하시키거나 저해하기에 충분할 정도로 TLR2/4/5를 활성화시키지 않는, 백신.
  279. 제272항 내지 제278항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 바이러스에 대한 면역 반응을 이끌어내는, 백신.
  280. 제279항에 있어서, 병원체는 바이러스인, 백신.
  281. 제269항 내지 제280항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체는 RNA 바이러스인, 백신.
  282. 제281항에 있어서, 바이러스는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스인, 백신.
  283. 제282항에 있어서, 바이러스는 코로나 바이러스인, 백신.
  284. 제283항에 있어서, 바이러스는 SARS 바이러스인, 백신.
  285. 제284항에 있어서, 바이러스는 SARS-COV2 바이러스인, 백신.
  286. 제269항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, 항원, 단백질 또는 에피토프는 바이러스 항원, 단백질 또는 에피토프인, 백신.
  287. 제286항에 있어서, 단백질은 캡시드 또는 뉴클레오단백질인, 백신.
  288. 제269항 내지 제287항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 SARS-COV2이고, 단백질 또는 에피토프는 S1, S2, 외피(E), 막(M), 뉴클레오캡시드(N), ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b, 및 ORF8에 의해 지정되거나 인코딩되는 단백질이거나 이로부터의 것인, 백신.
  289. 제269항 내지 제288항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 SARS-COV2이고, 단백질 또는 에피토프는 스파이크(spike) 단백질이거나 이로부터의 것인, 백신.
  290. 제269항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 단백질 또는 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 백신.
  291. 제290항에 있어서, mRNA는 mRNA의 안정성 또는 인코딩된 단백질 또는 항원 또는 에피토프의 안정성을 증가시키도록 변형되는, 백신.
  292. 제290항에 있어서, mRNA는 변형된 바이러스 단백질을 인코딩하며, 여기서 변형은 단백질의 구조를 변경시켜 숙주 세포 단백질과의 상호작용을 변경시키는, 백신.
  293. 제269항 내지 제292항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체로부터의 항원 또는 단백질을 인코딩하거나, 종양 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 전달 비히클인, 백신.
  294. 제269항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아를 포함하고, 여기서 박테리아는 게놈 변형을 포함하며, 이로써 이러한 박테리아는 펜타-아실화된 지질다당류(LPS)를 갖고, 편모가 결여되며, 야생형 박테리아는 편모를 갖는, 백신.
  295. 제294항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 게놈 변형(들)을 가지며, 이로써 이러한 박테리아는 컬리 핌브리애를 생성하지 않는, 백신.
  296. 제294항 또는 제295항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 병원체에 대한 항원 또는 종양 항원을 인코딩하는 플라스미드를 포함하는, 백신.
  297. 제296항에 있어서, 플라스미드는 유형 I 인터페론(IFN)의 발현을 유발하는 세포기질성 DNA/RNA 센서 경로의 부분인 치료 생성물을 인코딩하는, 백신.
  298. 제297항에 있어서, 생성물은 STING, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, MDA5, RIG-I 또는 기능-획득 돌연변이를 포함하는 이의 변형된 형태이며, 이로써 유형 I 인터페론의 발현은 항시적인, 백신.
  299. 제1항 내지 제298항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 박테리아이거나 그람-음성 박테리아이거나, 그람-양성 박테리아인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  300. 제1항 내지 제299항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 살모넬라, 시겔라(Shigella), 이. 콜라이, 비피도박테리아(Bifidobacteriae), 리케치아(Rickettsia), 비브리오(Vibrio), 리스테리아, 클레브시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 네이쎄리아(Neisseria), 애로모나스(Aeromonas), 프란치셀라(Francisella), 콜레라(Cholera), 코리네박테리움(Corynebacterium), 시트로박터(Citrobacter), 클라미디아(Chlamydia), 해모필루스, 브루셀라(Brucella), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라즈마(Mycoplasma), 레지오넬라(Legionella), 로도콕커스(Rhodococcus), 슈도모나스, 헬리코박터(Helicobacter), 바실러스(Bacillus), 또는 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 또는 아캐오박테리아의 균주, 또는 박테리아 균주의 임의의 전술한 목록의 이의 약독화된 균주 또는 이의 변형된 균주인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  301. 제1항 내지 제299항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 리케치아 리케치애(Rickettsia rickettsiae), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamuchi), 리케치아 무세리(Rickettsia mooseri), 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이쎄리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 유크레노필라(Aeromonas eucrenophila), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 프란치셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 시트로박터 프룬디이(Citrobacter freundii), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 해모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 로도콕커스 에퀴(Rhodococcus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 헬리코박터 무스텔래(Helicobacter mustelae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 로칼리마애 퀸타나(Rochalimaea quintana), 또는 애그로박테리움 투메르파시움(Agrobacterium tumerfacium)인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  302. 제1항 내지 제301항 중 어느 한 항에 있어서, 살모넬라의 균주인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  303. 제302항에 있어서, 살모넬라 티피무리움 균주인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  304. 제302항 또는 제303항에 있어서, 비변형된 살모넬라는 야생형 균주인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  305. 제302항 또는 제303항에 있어서, 비변형된 살모넬라 균주는 약독화되는, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  306. 제1항 내지 제305항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 균주 VNP20009 또는 YS1646, 또는 균주 ATCC 14028, 또는 균주 ATCC 14028의 식별 특징을 모두 갖는 균주로부터 유래되는, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  307. 제301항 내지 제305항 중 어느 한 항에 있어서, ansB -, asd -, csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린-, 및 pagP -이거나 ansB -, thyA - , csgD -, purI -, msbB -, 플라젤린-, 및 pagP인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  308. 제1항 내지 제307항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 보체 사멸화 내성(rck) 유전자를 인코딩하고 발현하는, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  309. 제308항에 있어서, rck 유전자는 살모넬라 rck 유전자인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  310. 제308항 또는 제309항에 있어서, 이. 콜라이 균주인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  311. 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아 또는 백신의 박테리아를 약학적으로 허용 가능한 비히클에 포함하는 약학적 조성물.
  312. 제311항에 있어서, 전신 투여를 위해 제형화되는, 약학적 조성물.
  313. 제311항 또는 제312항에 있어서, 비경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 종양내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 직장 투여, 질 투여, 안내 투여, 피부내 투여, 두개내 투여, 점막 투여, 또는 입이나 코 내로의 흡입에 의한 투여를 위해 제형화되는, 약학적 조성물.
  314. 대상체에서 고형 종양 또는 혈액학적 악성물을 포함한 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아, 박테리아 또는 백신, 또는 제311항 내지 제313 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  315. 제269항 내지 제298항 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 면역화 방법.
  316. 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아, 박테리아, 바이러스, 또는 백신 또는 제311항 내지 제313항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 용도로서, 대상체에서 고형 종양 또는 혈액학적 악성물을 포함한 암의 치료를 위한, 용도.
  317. 대상체에서 고형 종양 또는 혈액학적 악성물을 포함한 암의 치료 또는 면역화에 사용하기 위한, 또는 병원체에 대한 면역화에 사용하기 위한, 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아, 박테리아, 바이러스, 또는 백신 또는 제311항 내지 제313항 중 어느 한 항의 약학적 조성물.
  318. 제314항 내지 제317항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신.
  319. 제314항 내지 제318항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 고형 종양을 포함하거나 혈액학적 악성물을 포함하는 암을 갖는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신.
  320. 제314항 내지 제319항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 제2 항암 제제 또는 치료가 투여되는 병용 요법을 포함하는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신.
  321. 제320항에 있어서, 제2 항암 제제 또는 치료는 면역자극성 박테리아 또는 약학적 조성물 전에, 이와 동시에, 이후에, 또는 간헐적으로 투여되는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  322. 제320항 또는 제321항에 있어서, 제2 항암 제제 또는 치료는 면역요법인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  323. 제314항 내지 제322항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신의 투여는 비경구인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  324. 제314항 내지 제322항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신의 투여는 경구, 또는 직장(rectal)이거나, 폐 및/또는 코 내로, 또는 점막에, 또는 두개내로, 피부내로 또는 종양내로 에어로졸에 의한 것인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  325. 제314항 내지 제324항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물의 투여는 정맥내, 근육내, 비내, 또는 피하인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  326. 제314항 내지 제325항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 백혈병; 림프종; 위암; 및 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 두경부, 결장직장, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부, 및 간의 암 중에서 선택되는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 약학적 조성물, 또는 백신.
  327. 제314항 내지 제326항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법은 항-PD-1, 또는 항-PD-L1, 또는 항-CTLA-4 항체의 투여를 포함하는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  328. 제314항 내지 제327항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 살모넬라, 시겔라, 리스테리아, 또는 이. 콜라이 종인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  329. 제314항 내지 제328항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 살모넬라 종인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  330. 제314항 내지 제329항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 살모넬라 티피무리움 균주인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  331. 제314항 내지 제330항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아의 투여는 복강내 또는 종양내 투여에 의한 것인, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  332. 제314항 내지 제331항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 전이암을 갖는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  333. 제314항 내지 제332항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항암 치료를 투여하는 단계를 포함하고, 제2 치료는 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-PD-L1, 항-IL-6, 항-Siglec-15, 항-VEGF, 항-CD73, 및 항-CD38 항체 중에서 선택되는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  334. 제314항 내지 제333항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 또는 추가 항암 치료를 투여하는 단계를 포함하고, 제2 또는 추가 치료는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 저해제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제, 화학치료제, 항-EGFR 항체, CAR-T-세포, 항-Her2 항체, 항-메조텔린 항체, 및 항-B-세포 성숙화 항원(BCMA) 항체 중에서 선택되는, 방법, 용도, 면역자극성 박테리아, 백신, 또는 약학적 조성물.
  335. 바이러스 감염 또는 또 다른 감염성 병원체에 의한 감염의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하며, 면역자극성 박테리아 또는 백신은 바이러스 또는 병원체로부터의 항원, 단백질, 또는 이의 에피토프를 포함하거나 인코딩하는, 방법.
  336. 제335항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 박테리아에 의해 인식되는 프로모터의 제어 하에 항원, 단백질 또는 이의 에피토프를 인코딩하고; 면역자극성 박테리아는 이러한 박테리아가 생체내에서 복제하지 않게 되는 게놈 변형(들)을 포함하는, 방법.
  337. 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항, 또는 제335항 또는 제336항에 있어서, 바이러스 감염 또는 또 다른 감염성 병원체에 의한 감염을 치료하는 데 사용하기 위한, 면역자극성 박테리아, 백신 또는 방법.
  338. 바이러스 또는 다른 감염성 병원체에 의한 감염을 예방하기 위해(이의 위험을 감소시키기 위해) 면역화시키는 방법으로서, 면역화 용량의 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하고, 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩된 생성물은 항바이러스 또는 항병원체성 치료제 또는 항원, 에피토프, 또는 단백질인, 방법.
  339. 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 또는 또 다른 감염성 병원체에 의한 감염에 대해 면역화하기 위해, 이에 대해 보호하기 위해, 또는 이의 중증도를 감소시키거나 이의 위험을 감소시키기 위해 사용하기 위한 것이고, 면역자극성 박테리아에 의해 인코딩되는 생성물은 항바이러스 또는 항병원체성 치료제 또는 항원, 에피토프, 또는 단백질인, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  340. 제335항 내지 제339항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 병원체는 바이러스인, 면역자극성 박테리아, 백신 또는 방법.
  341. 제1항 내지 제340항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 박테리아에 존재하는 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 RNA를 인코딩하는 플라스미드를 포함하며, 여기서 진핵 숙주 세포의 감염 시, RNA는 진핵 숙주의 세포질 내로 방출되는, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  342. 제341항에 있어서, 진핵 숙주의 세포질 내로 방출되는 RNA는 mRNA인, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  343. 제341항 또는 제342항에 있어서, 프로모터는 유도적 프로모터인, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  344. 제341항 내지 제343항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 또한 프로모터를 인식하는 폴리머라제를 인코딩하는, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  345. 제341항 내지 제344항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제인, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  346. 제341항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극성 박테리아는 asd - 또는 thyA - 또는 둘 다인, 면역자극성 박테리아, 백신, 약학적 조성물, 방법 또는 용도.
  347. 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 바이러스 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 것이며, 박테리아는 항암 또는 항바이러스 치료 생성물을 인코딩하거나, 항원, 단백질 또는 에피토프 또는 이의 조합은 바이러스 또는 종양을 형성하는, 면역자극성 박테리아 또는 백신.
  348. 암 또는 바이러스 감염의 치료 방법으로서, 암 및/또는 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 제68항 내지 제80항 중 어느 한 항의 RNA 전달 시스템, 또는 종양-연관 항원 또는 바이러스 항원, 단백질 또는 에피토프를 인코딩하는 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  349. M2 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형으로 전환시키는 방법으로서, 항바이러스 또는 항종양 면역 반응을 증강시킴으로써 치료되는 병태, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 제38항 내지 제82항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  350. 제38항 내지 제82항 중 어느 한 항, 또는 제38항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항바이러스 또는 항종양 면역 반응을 증강시킴으로써 치료되는 병태, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 M2 대식세포를 M1 또는 M1-유사 표현형 대식세포로 전환시키기 위한, 면역자극성 박테리아의 용도 또는 면역자극성 박테리아.
  351. 제349항 또는 제350항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태는 암 및/또는 바이러스 또는 다른 병원체 감염인, 방법, 용도 또는 박테리아.
  352. 치료 생성물을 인코딩하는 RNA를 전달하는 방법으로서, 질환, 병태 또는 장애의 치료를 위해 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  353. 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항 또는 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 병태 또는 장애의 치료를 위한 치료 생성물을 인코딩하는 RNA를 전달하는 데 사용하기 위한, 면역자극성 박테리아의 용도, 또는 면역자극성 박테리아.
  354. 제352항 또는 제353항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태는 암 및/또는 바이러스 또는 다른 병원체 감염인, 방법, 용도 또는 박테리아.
  355. 제231항 내지 제310항 중 어느 한 항의 박테리아를 약학적으로 허용 가능한 비히클에 포함하는 약학적 조성물.
  356. 제355항에 있어서, 백신으로서, 액체, 분말 또는 정제로서 제형화되는, 약학적 조성물.
  357. 제231항 내지 제313항, 제355항 및 제356항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 병태, 감염 또는 암을 치료하거나 예방하는(발증시킬 위험을 감소시키는) 데 사용하기 위한, 박테리아 또는 약학적 조성물.
  358. 질환, 병태, 감염 또는 암을 치료하거나 예방하는(발증시킬 위험을 감소시키는) 방법으로서, 제231항 내지 제313항, 제355항 및 제356항 중 어느 한 항의 박테리아 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  359. RNA를 전달하는 방법으로서, 제231항 내지 제310항 및 제355항 내지 제357항 중 어느 한 항의 박테리아 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  360. 제231항 내지 제310항 및 제355항 내지 제357항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 전달하는 데 사용하기 위한, 박테리아.
  361. 제359항 또는 제360항에 있어서, RNA는 mRNA인, 방법 또는 박테리아.
  362. 제231항 내지 제310항 및 제355항 내지 제357항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물은 치료 생성물이고, 박테리아 내 플라스미드는 생성물을 인코딩하여, 박테리아에 의해 번역되지 않는 mRNA를 생성하는, 박테리아.
  363. RNA를 대상체에게 전달하는 방법으로서, 제362항의 박테리아를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  364. 제362항에 있어서, RNA를 대상체에게 전달하는 데 사용하기 위한, 박테리아.
  365. RNA를 대상체에게 전달하는 데 사용하기 위한 박테리아로서, 이종성 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 포함하며,
    이종성 생성물을 인코딩하는 핵산은 박테리아에 의해 인식되는 프로모터에 연결되고;
    생성물을 인코딩하는 핵산은 박테리아에 의해 인식되지 않는 번역을 위한 진핵 서열을 포함하며, 이로써 박테리아는 RNA를 생성하나 RNA를 번역하지 않는, 박테리아.
  366. 제365항에 있어서, 제1항 내지 제310항 중 어느 한 항의 면역자극성 박테리아이고, RNA를 인코딩하는 핵산은 치료 생성물을 인코딩하는, 박테리아.
  367. 제365항 또는 제366항에 있어서, 박테리아는 항원 또는 단백질에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위해 병원체 또는 종양으로부터의 항원 또는 단백질을 인코딩하는, 박테리아.
  368. 비-인간 종으로부터의 변형된 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질로서, 비-인간 STING은 인간 STING과 비교하여 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성, 및 선택적으로 인간 STING과 비교하여 더 높은 유형 I 인터페론(IFN) 경로 신호전달 활성을 갖는 것이며,
    비-인간 STING 단백질은 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하도록 변형되어, 세포기질 핵산의 부재 하에 증가된 활성을 갖거나 항시적으로 작용하고;
    돌연변이는 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 대체이며;
    STING 단백질은 선택적으로 TRAF6 결합 부위의 결실 또는 방해를 갖는, 변형된 STING 단백질.
  369. 비-인간 종으로부터의 변형된 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질, 또는 키메라 인간 STING 단백질 및 이의 변형으로서, 인코딩된 STING 단백질의 항시적 활성화 및/또는 증강된 민감도, 또는 내인성 리간드에 대한 증가된 친화도 또는 결합을 초래하는 기능-획득(GOF)과 관련된 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하며, 이로써 STING 단백질은 아미노산 또는 아미노산들의 삽입, 결실, 및 대체 중 하나 이상에 의해 변형되며;
    STING 단백질은 인간 STING과 비교하여, IFN-베타 신호전달 활성, 및 활성화된 B 세포(NF-κB) 신호전달 활성의 약독화된 핵 인자 카파-경쇄-인핸서를 갖고;
    돌연변이 또는 돌연변이들은 IFN-베타 생성을 유도하는 데 있어서 증가된 STING 활성 또는 항시적 활성을 초래하는, 변형된 STING 단백질.
  370. 제368항 또는 제369항에 있어서, 인간 STING 단백질은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 서열을 포함하거나, 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 아미노산의 서열과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 이의 인간 대립유전자(allelic) 변이체인, 변형된 STING 단백질.
  371. 제368항 내지 제370항 중 어느 한 항에 있어서,
    STING 단백질은 제1 종으로부터의 STING 단백질 내 C-말단 테일(CTT) 영역으로부터 제2 종으로부터의 STING 단백질의 CTT로의 대체를 포함하는 키메라이며;
    제2 종의 STING 단백질은 인간 STING의 NF-κB 신호전달 활성보다 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성을 갖고;
    CTT 내 TRAF6 결합 부위는 선택적으로 결실되는, 변형된 STING 단백질.
  372. 제368항 내지 제371항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 자가-염증성 질환 STING-연관 혈관병증(SAVI: STING-associated vasculopathy)과 관련된 것에 상응하는 임의의 것인, 변형된 STING 단백질.
  373. 키메라인 변형된 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질로서, 제1 종으로부터의 STING 단백질 내 CTT(C-말단 테일) 영역으로부터 제2 종으로부터의 STING 단백질의 CTT로의 대체를 포함하며,
    제2 종의 STING 단백질은 인간 STING의 NF-κB 신호전달 활성보다 더 낮은 NF-κB 신호전달 활성을 갖고;
    CTT 내 TRAF6 결합 부위는 선택적으로 결실되는, 변형된 STING 단백질.
  374. 제368항 내지 제373항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 STING 단백질은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 서열을 포함하거나, 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 아미노산의 서열과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 이의 인간 대립유전자 변이체인, 변형된 STING 단백질.
  375. 제368항 내지 제373항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 종은 인간이고, 제2 종은 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스(coelacanth), 마우스, 및 은상어 중에서 선택되는, 변형된 STING 단백질.
  376. 제368항 내지 제375항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 I IFN 신호전달 활성은 야생형 인간 STING 단백질의 활성의 적어도 또는 적어도 약 30%인, 변형된 STING 단백질.
  377. 제368항 내지 제376항 중 어느 한 항에 있어서, NF-κB 신호전달 활성은 야생형 인간 STING NF-κB 신호전달 활성보다 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만인, 변형된 STING 단백질.
  378. 제368항 내지 제377항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 종 또는 제2 종은 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스, 마우스, 및 은상어 중에서 선택되는, 변형된 STING 단백질.
  379. 제368항 내지 제378항 중 어느 한 항에 있어서, STING의 변형은 인간 STING을 기준으로 이와 정렬에 의해 인터페론병증에서 발생하는 돌연변이에 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들이고, 여기서 정렬이 발휘되는 인간 STING의 서열은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시되는, 변형된 STING 단백질.
  380. 제368항 내지 제379항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 테일(CTT)로부터 인간 STING의 NF-κB 신호전달 활성과 비교하여 감소된 NF-κB 신호전달 활성을 갖는 STING 단백질로부터의 CTT로의 대체를 포함하는, 변형된 STING 단백질.
  381. 제380항에 있어서, CTT의 대체는 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스, 마우스, 또는 은상어 STING 단백질로부터의 것인, 변형된 STING 단백질.
  382. 제380항에 있어서, CTT의 대체는 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스, 마우스, 또는 은상어 STING 단백질로부터의 것이고, 이는 인간 STING CTT를 대체하는, 변형된 STING 단백질.
  383. 제381항 또는 제382항에 있어서, CTT의 대체는 하기 종 중에서 선택되고, 하기 서열을 갖는, 변형된 STING 단백질:
    태즈메이니아 데빌 RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF SEQ ID NO: 371,
    마모셋 EEEEVTVGSLKTSEVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRSDLF SEQ ID NO: 372,
    소 EREVTMGSTETSVMPGSSVLSQEPELLISGLEKPLPLRSDVF SEQ ID NO: 373,
    고양이 EREVTVGSVGTSMVRNPSVLSQEPNLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO: 374,
    타조 RQEEYTVCDGTLCSTDLSLQISESDLPQPLRSDCL SEQ ID NO: 375,
    야생돼지 EREVTMGSAETSVVPTSSTLSQEPELLISGMEQPLPLRSDIF SEQ ID NO: 376,
    박쥐 EKEEVTVGTVGTYEAPGSSTLHQEPELLISGMDQPLPLRTDIF SEQ ID NO: 377,
    바다소 EREEVTVGSVGTSVVPSPSSPSTSSLSQEPKLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO: 378,
    따오기 CHEEYTVYEGNQPHNPSTTLHSTELNLQISESDLPQPLRSDCF SEQ ID NO: 379,
    실러캔스
    (변이체 1) QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKRQVC SEQ ID NO: 380,
    실러캔스
    (변이체 2) QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKSGF SEQ ID NO: 381,
    은상어 LTEYPVAEPSNANETDCMSSEPHLMISDDPKPLRSYCP SEQ ID NO: 383, 및
    마우스 EKEEVTMNAPMTSVAPPPSVLSQEPRLLISGMDQPLPLRTDLI SEQ ID NO: 384,
    또는 이와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 이러한 각각의 서열의 대립유전자 변이체.
  384. 제382항 또는 제383항에 있어서, 인간 CTT는 서열 EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(SEQ ID NO: 370)를 포함하거나, 이와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 대립유전자 변이체인, 변형된 STING 단백질.
  385. 제373항 내지 제384항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 STING 단백질은, 인간 STING CTT가 태즈메이니아 데빌 STING으로부터의 CTT로 대체되는 키메라인, 변형된 STING 단백질.
  386. 제385항에 있어서, 태즈메이니아 데빌 STING으로부터의 C-말단 테일(CTT)은 서열: RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF(SEQ ID NO: 371)를 포함하거나, 이와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 대립유전자 변이체인, 변형된 STING 단백질.
  387. 제368항 내지 제386항 중 어느 한 항에 있어서, TRAF6 결합 부위의 결실 또는 방해를 포함하는, 변형된 STING 단백질.
  388. 제387항에 있어서, STING 단백질은 인간 STING 단백질이고, TRAF6 결합 부위는 C-말단에 아미노산 잔기 DFS를 포함하는, 변형된 STING 단백질.
  389. 제368항 내지 제388항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 I 인터페론 신호전달 활성을 증가시키거나, 세포기질 핵산의 부재 하에 활성을 항시적으로 만드는 변형을 포함하는, 변형된 STING 단백질.
  390. 제389항에 있어서, 변형은 인간 STING을 기준으로 이와 정렬에 의해, 인터페론병증에서 발생하는 돌연변이에 상응하고, 여기서 인간 STING 단백질은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 서열을 갖는, 변형된 STING 단백질.
  391. 제368항 내지 제390항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 인간 STING의 서열을 기준으로, S102P, V147L, V147M, N154S, V155M, G166E, C206Y, G207E, S102P/F279L, F279L, R281Q, R284G, R284S, R284M, R284K, R284T, R197A, D205A, R310A, R293A, T294A, E296A, R197A/D205A, S272A/Q273A, R310A/E316A, E316A, E316N, E316Q, S272A, R293A/T294A/E296A, D231A, R232A, K236A, Q273A, S358A/E360A/S366A, D231A/R232A/K236A/R238A, S358A, E360A, S366A, R238A, R375A, 및 S324A/S326A 중 하나 이상에 상응하는 하나 이상의 아미노산 대체인, 변형된 STING 단백질.
  392. 제391항에 있어서, 임의의 SEQ ID NO: 305-309로 표시된 인간 STING의 서열을 기준으로, C206Y 또는 R284G에 상응하는 대체를 포함하는, 변형된 STING 단백질.
  393. 제392항에 있어서, 태즈메이니아 데빌, 마모셋, 소, 고양이, 타조, 야생돼지, 박쥐, 바다소, 따오기, 실러캔스, 마우스, 또는 은상어 STING 단백질인, 변형된 STING 단백질.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852698B (zh) * 2021-01-30 2022-11-29 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用
WO2023086796A2 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
EP4241790A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Expression system for the treatment of cancer
EP4241791A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Combined gene and radio therapy for the treatment of cancer
KR20240034391A (ko) * 2022-09-07 2024-03-14 주식회사 젠라이프 폐암 진단용 전자코 센서 및 이를 이용한 폐암 진단용 전자코 시스템
WO2024096123A1 (ja) * 2022-11-04 2024-05-10 株式会社バイオパレット 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法
CN116676324B (zh) * 2023-07-28 2023-10-27 四川大学华西医院 基于Kil蛋白构建释放抗肿瘤效应蛋白的系统及方法

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US3936354A (en) 1974-04-29 1976-02-03 Lapointe Jean Rock Anti-tumour product of bacterial origin
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
GB8322007D0 (en) 1983-08-16 1983-09-21 Wellcome Found Pharmaceutical delivery system
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
DE69334305D1 (de) 1992-08-21 2010-01-28 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte Ketten
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
WO1999013053A1 (en) 1997-09-10 1999-03-18 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
WO1999018221A1 (en) * 1997-10-07 1999-04-15 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for introducing and expressing rna in animal cells
JP2001010973A (ja) 1999-06-29 2001-01-16 Dnavec Research Inc がんワクチン
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
AU7993600A (en) 1999-10-04 2001-05-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Non-invasive tumor imaging by tumor-targeted bacteria
EP1322655B1 (en) 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US7344710B2 (en) 2001-11-21 2008-03-18 The Johns Hopkins University Combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
US20040043003A1 (en) * 2002-01-31 2004-03-04 Wei Chen Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions
CN1646147A (zh) 2002-02-06 2005-07-27 约翰斯霍普金斯医学院 用于将系统性免疫应答靶向于特定器官或组织的方法和组合物
US7390646B2 (en) 2003-09-17 2008-06-24 The Regents Of The University Of California Bacterial vectors and methods of use thereof
US20070298012A1 (en) 2003-12-16 2007-12-27 Ivan King Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules
US8501198B2 (en) 2004-06-07 2013-08-06 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to treat cancers
WO2006004992A1 (en) 2004-06-29 2006-01-12 Anticancer, Inc. Cancer selective auxotrophs
JP5601756B2 (ja) 2004-12-17 2014-10-08 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター， インコーポレイテッド 細菌によって媒介される遺伝子サイレンシングのための組成物およびその使用方法
US8426375B2 (en) 2005-10-12 2013-04-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
CN1974759B (zh) 2006-07-26 2010-06-09 吉林大学 运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用
FR2920158B1 (fr) * 2007-08-24 2010-03-12 Centre Nat Rech Scient Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques
US8241844B2 (en) 2008-10-03 2012-08-14 Ralph Clark, legal representative Methods and compositions for modulating an immune response with immunogenic oligonucleotides
US20120009153A1 (en) 2009-08-13 2012-01-12 Hongnian Guo Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using the same
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
EP2620159A1 (en) 2012-01-24 2013-07-31 Institut Pasteur Improved cancer treatment by immunotherapy with bcg or antigenically related non-pathogenic mycobacteria
CN103374538B (zh) 2012-04-27 2017-12-01 山东新创生物科技有限公司 包含戈氏梭菌(Clostridiumghonii)的衍生细菌菌株的组合物及其使用方法
JP6208750B2 (ja) * 2012-06-08 2017-10-04 エスリス ゲーエムベーハーｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ メッセンジャーｒｎａの肺送達
ES2391108B1 (es) 2012-07-26 2013-10-07 Universitat Autonoma De Barcelona Uso de mycobacterium brumae para el tratamiento del cáncer de vejiga
US9539290B2 (en) 2012-12-24 2017-01-10 Anticancer Inc. Individualized bacterial treatment of pancreatic cancer
AU2014255733B2 (en) 2013-04-18 2019-05-16 Tilt Biotherapeutics Oy Enhanced adoptive cell therapy
JP6896420B2 (ja) 2013-07-03 2021-06-30 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 抗癌組成物
US10987432B2 (en) 2013-09-05 2021-04-27 The University Of Hong Kong Therapeutic delivery and expression system, methods and uses thereof
AU2014338864C1 (en) 2013-10-25 2020-07-16 Akamis Bio Limited Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
US20170020931A1 (en) 2014-03-31 2017-01-26 The Johns Hopkins University Use of bacteria, bacterial products, and other immunoregulatory entities in combination with anti-ctla-4 and/or anti-pd-1 antibodies to treat solid tumor malignancies
WO2016025582A2 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Forbes Neil S Targeting epigenetic regulators using a bacterial delivery system
US9688967B2 (en) 2014-12-05 2017-06-27 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases associated with hyperammonemia
US20160206666A1 (en) 2014-12-22 2016-07-21 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases that benefit from reduced gut inflammation and/or tighten gut mucosal barrier
PL3294760T3 (pl) 2015-05-13 2021-11-08 Synlogic Operating Company, Inc. Zmodyfikowane bakterie do redukowania hiperfenyloalaninemii
US11273184B2 (en) 2015-08-31 2022-03-15 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
WO2017043815A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Sillajen, Inc. Modified oncolytic vaccinia viruses expressing a cytokine and a car- boxylesterase and methods of use thereof
DE20164728T1 (de) 2015-10-22 2021-09-30 Modernatx, Inc. Impfstoffe gegen atemwegsvirus
EP3426271A4 (en) 2016-03-10 2019-10-16 Cold Genesys, Inc. METHODS OF TREATING SOLID OR LYMPHATIC TUMORS BY POLYTHERAPY
WO2018006005A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Oncorus, Inc. Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
KR20190086681A (ko) 2016-10-26 2019-07-23 모더나티엑스, 인크. 면역 반응을 향상시키기 위한 메신저 리보핵산 및 그의 사용 방법
BR112019013863A2 (pt) 2017-01-06 2020-03-03 Synlogic Operating Company, Inc. Micro-organismos programados para produzir moduladores imunes e terapêuticos anticâncer em células tumorais
CN110709416A (zh) 2017-01-25 2020-01-17 特沙公司 TGF-β诱饵受体
RU2022106357A (ru) 2017-02-01 2022-03-24 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Противораковые рнк-вакцины
WO2018191654A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 Cold Genesys, Inc. Methods of treating bladder cancer
US11168326B2 (en) 2017-07-11 2021-11-09 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
JP2021508490A (ja) 2017-12-15 2021-03-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用
BR112021000315A2 (pt) 2018-07-11 2021-08-03 Actym Therapeutics, Inc. cepas bacterianas imunoestimulantes modificadas geneticamente e seus usos
BR112021016728A2 (pt) 2019-02-27 2022-01-11 Actym Therapeutics Inc Bactérias imunostimulatórias projetadas para colonizar tumores, residentes em tumores células imunológicas e o microambiente tumoral
US20200270613A1 (en) 2019-02-27 2020-08-27 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
EP4058578A2 (en) 2019-11-12 2022-09-21 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria delivery platforms and their use for delivery of therapeutic products
JP2023509964A (ja) * 2020-01-11 2023-03-10 シベック バイオテクノロジーズ エルエルシー 真核生物翻訳可能ｍＲＮＡの生成および真核生物への送達のための微生物システム
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Also Published As

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