KR20220133911A - 호흡기 바이러스 면역화 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 호흡기 바이러스 리보핵산(RNA) 백신 뿐만 아니라 상기 백신을 사용하는 방법 및 상기 백신을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

호흡기 바이러스 면역화 조성물
관련 출원
본 출원은 2020년 1월 30일에 출원된, 미국 가출원 일련 번호 제62/967,888호의 출원일에 대해 35 U.S.C. 119(e) 하에 이점을 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
호흡기 질환은 고등 유기체에서 가스 교환을 가능하게 하는 기관 및 조직에 영향을 미치는 병리학적 상태를 포괄하는 의학 용어이며, 이는 상기도, 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 흉막 및 흉막강, 및 호흡의 신경 및 근육을 포함한다. 호흡기 질환은 감기와 같은 경미하고 자가-제한적인 것에서부터 세균성 폐렴, 폐색전증, 급성 천식 및 폐암과 같은 생명을 위협하는 실체에 이르기까지 다양하다. 호흡기 질환은 전 세계적으로 질병 및 사망의 흔하고 중요한 원인이다. 미국에서는, 매년 대략 10억 건의 "감기(common cold)"가 발생한다. 호흡기 병태는 어린이가 입원하는 가장 흔한 이유 중 하나이다.
인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV)는 뉴모비리나에(Pneumovirinae) 속의 네거티브-센스(negative-sense), 단일-가닥 리보핵산(RNA) 바이러스이다. 바이러스는 주로 표면 G 당단백질의 차이로 인해 그룹 A 및 그룹 B로 알려진 적어도 2개의 항원성 서브그룹에 존재한다. 2개의 hRSV 표면 당단백질 - G 및 F -는 호흡기 상피 세포와의 부착 및 부착을 매개한다. F 표면 당단백질은 이웃하는 세포의 합체를 매개한다. 이는 세포융합 세포의 형성을 초래한다. hRSV는 세기관지염의 가장 흔한 원인이다. 대부분의 감염된 성인은 울혈, 미열 및 천명과 같은 가벼운 감기와 유사한 증상이 발병된다. 영유아는 세기관지염 및 폐렴과 같은 더 심각한 증상을 겪을 수 있다. 상기 질환은 호흡기 분비물과의 접촉을 통해 인간 간에 전염될 수 있다.
인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 뉴모비리나에 속 및 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과의 네거티브-센스, 단일-가닥 RNA 바이러스이며, 이는 조류 메타뉴모바이러스(AMPV) 서브그룹 C와 밀접한 관련이 있다. 2001년 네덜란드에서 배양된 세포에서 성장하는 알려지지 않은 바이러스를 동정하기 위해 RAP-PCR(RNA 임의로 프라이밍된 PCR) 기법을 이용하여 처음으로 분리되었다. hMPV는 소아에서 바이러스성 하기도 질환(LRI)의 중요한 원인으로서 hRSV에 이어 두 번째이다. hMPV의 계절적 역학은 hRSV와 유사한 것으로 보이지만, 감염 및 질병의 발생률은 상당히 낮은 것으로 보인다.
hMPV와 마찬가지로, 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(PIV3)은 또한 뉴모비리나에 속 및 파라믹소비리대 과의 네거티브-센스, 단일-가닥 센스 RNA 바이러스이며, 이는 유아기 및 초기 아동기의 아주 흔한 급성 호흡기 감염의 주요 원인이다. 발병률은 생후 4-12개월경에 최고조에 달하며, 이 바이러스는 주로 세기관지염 및 폐렴으로 인해 입원의 3-10%를 차지한다. PIV3는 치명적일 수 있으며, 일부 경우에는 열성 경련과 같은 신경계 질환과 관련이 있다. 또한, 이환율의 중요한 원인인 기도 리모델링(airway remodeling)을 유발할 수 있다. 세계의 개발 도상국에서, 영유아는 1차 PIV3 바이러스 감염 또는 박테리아 감염과 같은 2차 결과로 인한 사망 위험이 가장 높다. hMPV와 마찬가지로, 인간 파라인플루엔자 바이러스(hPIV) 유형 1, 2 및 3(hPIV1, hPIV2 및 hPIV3 각각)은 또한 유아기에서 바이러스 LRI의 중요한 원인으로서 hRSV에 이어 두 번째이다.
hMPV, hPIV3 및 hRSV와 관련된 지속적인 건강 문제는 국제적으로 우려되며, 이러한 바이러스에 대한 효과적이고 안전한 백신 후보 개발의 중요성을 강화한다.
요약
일부 구현예에서, 호흡기 바이러스 항원, 예컨대 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 항원, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 항원, 및/또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(hPIV3) 항원에 대한 강력한 중화 항체 반응을 유도할 수 있는 고도의 면역원성 항원을 암호화하는 RNA를 포함하는 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신 및 다른 면역원성 조성물)이 본원에 제공된다. 놀랍게도, 본원에 제공된 데이터는 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 hRSV RNA를 포함하는 면역화 조성물이, 동물에게 투여되는 경우, 대조군 조성물보다 대략 5배 더 낮은 용량에서도 hRSV F 당단백질에 대한 고도로 중화 항체 반응을 유도함을 보여준다.
본 개시의 일부 측면은 세포질 꼬리가 없고 야생형 hRSV F 당단백질에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산(RNA)을 포함하는 조성물(예를 들어, 면역화, 면역원성, 및/또는 백신 조성물)을 제공한다.
본 개시의 다른 측면은 세포질 꼬리가 없는 RSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 전장 야생형 RSV F 당단백질에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산(RNA); hMPV F 당단백질을 암호화하는 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) RNA; 및 hPIV3 F 당단백질을 암호화하는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(hPIV3) RNA를 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것인 메신저 리보핵산(mRNA)을 제공한다. 본 개시의 추가의 측면은 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 메신저 리보핵산(mRNA)을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA는 세포질 꼬리가 없는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산 F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 전장 야생형 RSV F 당단백질에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 7의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 지질 나노입자 내 제형화된다.
일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 20-30개, 20-25개, 15-30개, 15-25개, 15-20개, 10-30개, 10-25개, 10-20개, 10-15개, 5-30개, 5-25개, 5-20개, 또는 5-15개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 25개의 아미노산, 20개의 아미노산, 15개의 아미노산, 또는 10개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 하기 C-말단 아미노산으로 구성된다:
CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 25); TPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 26); SKDQLSGINNIAFSN (서열번호 27); 또는 SGINNIAFSN (서열번호 28).
일부 구현예에서, hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다: P102X 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149X 치환, S155X 치환, S190X 치환, V207X 치환, S290X 치환, L373X 치환, I379X 치환, M447X 치환, 및 Y458X 치환(상기 X는 임의의 아미노산임).
일부 구현예에서, hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환.
일부 구현예에서, hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기 변형을 추가로 포함한다: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환.
일부 구현예에서, 야생형 hRSV F 당단백질은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 7의 서열을 포함하는 ORF를 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hRSV RNA는 서열번호 15의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hMPV F 당단백질은 서열번호 11의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hMPV F 당단백질은 서열번호 11의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 10의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ORF를 포함한다. 일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 10의 서열을 포함하는 ORF를 포함한다.
일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 16의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hMPV RNA는 서열번호 16의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hPIV3 F 당단백질은 서열번호 14의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hPIV3 F 당단백질은 서열번호 14의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 13의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ORF를 포함한다. 일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 13의 서열을 포함하는 ORF를 포함한다.
일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 17의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hPIV3 RNA는 서열번호 17의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 7mG(5')ppp(5')NlmpNp 캡을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 선택적으로 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 화학적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 1-메틸슈도우리딘이다.
일부 구현예에서, 조성물은 25 μg - 200 μg의 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 PEG-변형된 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 지질의 혼합물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 지질의 혼합물은 0.5-15 몰%의 PEG-변형된 지질; 5-25 몰%의 비-양이온성 지질; 25-55 몰%의 스테롤; 및 20-60 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, PEG-변형된 지질은 1,2 디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜(PEG2000 DMG)이고, 비-양이온성 지질은 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 스테롤은 콜레스테롤이며; 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1의 구조를 갖는다:
Figure pct00001
(화합물 1).
일부 구현예에서, 지질의 혼합물은 지질 나노입자를 형성한다.
일부 구현예에서, hRSV RNA, hMPV RNA, 및 hPIV3 RNA는 지질 나노입자 내 제형화된다.
본 개시의 일부 측면은 hRSV, hMPV, 및/또는 hPIV3에 대한 중화 항체 반응을 대상체에서 유도하기에 효과적인 양으로 선행하는 청구항 중 임의의 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 대상체는 면역손상된 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 폐질환을 갖는 것이다.
일부 구현예에서, 대상체는 5세 이하이다. 다른 구현예에서, 대상체는 65세 이상이다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 2회 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
국제출원번호 PCT/US2016/058327호(공개번호 WO2017/07062호) 및 국제출원번호 PCT/US2017/065408호(공개번호 WO2018/107088호)의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
도 1은 RSV F 당단백질 변이체(mRNA-1345에 의해 암호화됨) 및 야생형 RSV F 당단백질의 모식도를 나타낸다.
도 2a-2b는 2개의 시점에서 HEK293T 세포에서 상이한 특징을 갖는 mRNA의 시험관내 스크리닝을 나타낸다. RSV F 당단백질의 융합 전 형태에 특이적인 단클론성 항체인 AM14를 유세포 분석에 사용하였다. 도 2a에서, 상부 리드(lead)는 형질감염 후 24시간 및 48시간에 도시된다. 특징 1은 최적화된 5' UTR을 지칭하고, 특징 2는 야생형 RSV F 당단백질의 F1 영역 내의 6개 아미노산 점 돌연변이를 지칭한다(도 1). 도 2b는 후보 작제물의 3가지 상이한 용량 후의 발현 수준을 도시한다. "dCT"는 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA를 나타낸다.
도 3a-3b는 마우스에서 상이한 특징을 갖는 mRNA의 생체내 스크리닝을 나타낸다. mRNA의 2회 용량 후, 융합 후 형태 RSV F 단백질 수준(도 3a) 및 RSV-A 중화 역가(도 3b)를 측정하였다.
도 4a-4b는 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA를 사용한 융합 전 형태 RSV F 당단백질의 시험관내 발현 수준을 나타낸다. 도 4a는 3개의 상이한 시점에서의 결과를 나타낸다. 도 4b는 두 특징(코돈 최적화 및 세포질 꼬리 절단)의 조합을 각각의 특징을 개별적으로 갖는 mRNA와 비교한다. AM14 및 D25는 2개의 융합 전 RSV F 당단백질-특이적 항체이다. 모타비주맙은 융합 전 및 융합 후 RSV F 당단백질을 모두 검출한다.
도 5a-5b는 HEK293T 세포(도 5a) 및 THP-1 세포(도 5b)에서 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA를 사용한 RSV F 당단백질의 융합 전 형태의 시험관내 발현 수준을 예시한다.
도 6a-6b는 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA에 대한 생체내 데이터를 나타낸다. mRNA의 투여로 인한 RSV F 당단백질 IgG 역가 수준의 융합 후 형태는 제1 용량 후(도 6a) 및 제2 용량 후(도 6b)로 도시된다.
도 7은 지시된 mRNA(대조군 (RSV F 당단백질을 암호화하는 대안적인 mRNA), RSV F 변이체, 또는 mRNA 없음)로 24시간(좌측) 및 48시간(우측) 인큐베이션 후 융합 전 형태 RSV F 당단백질-양성 CD14+ 단핵구의 빈도를 나타내는 2개의 그래프를 나타낸다.
도 8은 지시된 농도 및 mRNA(대조군 (RSV F 당단백질을 암호화하는 대안적인 mRNA), 코돈-최적화된 RSV F 당단백질 mRNA, 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA, 조합 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA (세포질 꼬리 절단으로 코돈-최적화됨) 또는 mRNA 없음)로 24시간(좌측) 및 48시간(우측) 인큐베이션 후 융합 전 형태의 RSV F 당단백질-양성 CD14+ 단핵구의 빈도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 현미경 실험 후 세포 당 평균 강도(평균화)를 나타내는 그래프이다. HeLa 세포를 지시된 200 ng의 mRNA(대조군 (RSV F 당단백질을 암호화하는 대안적인 mRNA), RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA, 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA, 조합 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA (세포질 꼬리 절단으로 코돈-최적화됨) 또는 mRNA 없음)로 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하고, 평균 강도를 측정하였다.
도 10a-10b는 56일째 백신 접종 후 RSV 항체 역가를 나타낸다. 도 10a는 RSV 중화 역가를 나타내고, 도 10b는 RSV 융합 전 F 단백질 IgG 역가를 나타낸다. 별표(*)로 표시된 그룹은 지시된 조성물의 1회 용량만 받은 그룹이다. "Lot100"은 1:100의 포르말린-불활성화된 RSV 그룹(FI-RSV)을 지칭한다.
도 11a-11b는 RSV 접종 후의 폐 바이러스 부하량(도 11a) 및 코 바이러스 부하량(도 11b)을 나타낸다(실시예 4 참조). 별표(*)로 표시된 그룹은 지시된 조성물의 1회 용량만 받은 그룹이다. "Lot100"은 1:100의 포르말린-불활성화된 RSV 그룹(FI-RSV)을 지칭한다.
본 개시는 호흡기 바이러스 항원에 대한 강력한 중화 항체를 유도하는 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)을 제공한다. 본원에서 용어 "호흡기 바이러스 항원"은 본 개시의 RNA에 의해 암호화되는 hRSV 항원(예를 들어, hRSV F 당단백질), hMPV 항원(예를 들어, hMPV F 당단백질), hPIV3 항원(예를 들어, hPIV3 F 당단백질), 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, hRSV 및 hMPV, hRSV 및 hPIV3, hMPV 및 hPIV3, 또는 hRSV, hMPV, 및 hPIV3)을 포함한다. 용어 "RNA" 및 "RNA 작제물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물은 hRSV F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA))를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역화 조성물은 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 당단백질을 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA)를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역화 조성물은 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(hPIV3) F 당단백질을 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA)를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역화 조성물은 hRSV F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA), hMPV F 당단백질을 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA), 및 hPIV3 F 당단백질을 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, hRSV F 당단백질, hMPV F 당단백질, 및 hPIV3 F 당단백질의 융합 전 형태는 동일한 (단일) RNA에 의해 암호화되는 반면, 다른 구현예에서 이들은 다중 RNA(하나는 융합 전 hRSV F를 암호화하고, 하나는 hMPV F를 암호화하고, 하나는 hPIV3 F를 암호화함)에 의해 독립적으로 암호화된다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 5' UTR, ORF, 3' UTR, 및 폴리(A) 꼬리를 갖는) 하나의 RNA는 융합 전 hRSV F 당단백질을 암호화하고, 다른 RNA는 hMPV F 당단백질 및 hPIV3 F 당단백질 둘 다를 암호화한다.
hRSV의 외피(envelope)는 3가지 표면 당단백질, F, G 및 SH를 포함한다. G 및 F 단백질은 보호 항원이며 중화 항체의 표적이다. 그러나, F 단백질은 hRSV 균주 및 유형(A 및 B)에 걸쳐 더 보존된다. hRSV F 단백질은 hRSV-A 및 hRSV-B 항원성 서브그룹을 포함하는, 임상 분리주 간에 잘 보존된 유형 I 융합 당단백질이다. F 단백질은 융합 전과 더 안정적인 융합 후 상태 사이에서 전이되며, 이에 따라 표적 세포로의 진입을 촉진한다. hRSV F 당단백질은 F0 전구체 단백질로서 초기에 합성된다. hRSV F0는 삼량체로 폴딩되며, 이는 F1 및 F2 서브유닛을 포함하는 성숙한 융합 전 단백질로 퓨린 절단에 의해 활성화된다(Bolt 등, Virus Res., 68:25, 2000). 단클론성 항체를 중화시키는 표적이 F 단백질의 융합 후 형태 상에 존재하지만, 중화 Ab 반응은 주로 hRSV에 자연적으로 감염된 사람에서 F 단백질 융합 전 형태를 표적화한다(Magro M 등, Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(8): 3089-94; Ngwuta JO 등, Sci Transl Med 2015; 7(309): 309ra162). 이와 일관되게, 융합 전 형태에서 안정화된 hRSV F 단백질은 융합 후 형태에서 안정화된 hRSV F 단백질로 관찰된 것보다 동물 모델에서 더 큰 중화 면역 반응을 생성한다(McLellan 등, Science, 342: 592-598, 2013). 따라서, 안정화된 융합 전 hRSV F 단백질은 hRSV 백신에 포함하기에 우수한 후보이다.
본원에 사용된 바와 같이, 불안정하고, 고-에너지 상태로 존재하는 안정화된 융합 전 RSV F 단백질은 단백질이 이의 융합 후 형태로의 전이를 방지하기 위한 돌연변이(예를 들어, 안정화 돌연변이)를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 안정화된 융합 전 RSV F 단백질은 프롤린 잔기(예를 들어, S215P 치환) 및/또는 이소류신(예를 들어, N67I 치환) 치환을 포함한다. 예를 들어, 안정화된 융합 전 RSV F 단백질인, DS-Cav1 변이체는 추가의 이황화물 결합(S155C/S290C) 뿐만 아니라 2개의 공동-충전 돌연변이(S190F/V207L)를 포함한다. 또 다른 안정화된 융합 전 RSV F 단백질은 하나의 프롤린 치환(S215P) 및 F2 서브유닛(N67I)에서 하나의 돌연변이를 포함하는 PR-DM이다.
본원에 기술된 hRSV RNA 백신은 여러 면에서 현재 백신보다 우수하다. 예를 들어, 본원에 사용된 지질 나노입자(LNP) 전달 시스템은 문헌에 기술된 프로타민-기반 접근법을 포함하는 다른 제제와 비교하여 RNA 백신의 효능을 증가시킨다. 이 LNP 전달 시스템의 사용은 치료 결과(예를 들어, 생산 중화 항체 역가)를 생성하기 위해 추가의 보조제를 필요로 하지 않으면서, 화학적으로-변형된 RNA 백신 또는 비변형된 RNA 백신의 효과적인 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 hRSV RNA 백신은 근육내(IM) 또는 피내(ID) 투여시 적어도 10배, 20배, 40배, 50배, 100배, 500배, 또는 1,000배의 인자에 의해 통상적인 백신보다 우수하다. 이러한 결과는 지질 기반 제형의 다른 부류에 사용된 RNA 용량과 비교하여 현저하게 더 낮은 용량의 RNA(예를 들어, mRNA)가 투여되는 경우에도 달성될 수 있다.
추가로, 면역원성 반응을 생성하기 위해 충분한 RNA를 세포에 전달하기 위해 바이러스 복제 경로에 의존하는 자가-복제 RNA 백신과 달리, 본 개시의 조성물은 강력한 면역 반응을 야기하기에 충분한 단백질을 생성하기 위해 바이러스 복제를 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 개시의 조성물은 자가-복제 RNA를 포함하지 않고 바이러스 복제에 필요한 성분을 포함하지 않는다.
본원에 제공된 RNA는 특정 바이러스 균주(예를 들어, hRSV, hMPV 및/또는 hPIV3)에 의해 제한되지 않는다. mRNA의 기반이 되는 바이러스 균주는 임의의 바이러스 균주일 수 있다.
본 개시의 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)은 자연적으로 발생하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본원에 제공된 바와 같은 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 RNA 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발생하지 않는다. 또한, 본원에 기술된 RNA 폴리뉴클레오티드는 자연에 존재하는 바이러스 단백질 및 바이러스 지질로부터 단리된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같이, 지질 나노입자에 제형화된 RNA를 포함하는 면역화 조성물은 예를 들어, 바이러스를 배제한다(즉, 조성물은 바이러스가 아니며, 이를 함유하지도 않는다).
항원
항원은 면역 반응을 유도할 수 있는(예를 들어, 면역 시스템이 항원에 대한 항체를 생성하도록 할 수 있는) 단백질이다. 본원에서, 용어 "항원"의 사용은 달리 명시되지 않는 한, 면역원성 단백질 및 면역원성 단편((적어도 하나의) 호흡기 바이러스, 예를 들어, hRSV, 또는 hRSV, hMPV, 및 hPIV3)에 대한 면역 반응을 유도하는 (또는 유도할 수 있는) 면역원성 단편)을 포함한다. 용어 "단백질"은 펩티드를 포함하고, 용어 "항원"은 항원성 단편을 포함한다는 것을 이해해야 한다.
호흡기 바이러스 항원 및 본 개시의 조성물의 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 RNA의 예시적인 서열은 표 1에 제공된다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 8의 서열을 포함하는 hRSV F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 11의 서열을 포함하는 hMPV F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 14의 서열을 포함하는 hPIV3 F 당단백질의 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함한다.
본원에 기술된 RNA에 의해 암호화되는 항원 중 임의의 하나는 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 이해해야 한다.
핵산
본 개시의 조성물은 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 갖는 (적어도 하나의) RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 5' UTR, 3' UTR, 폴리(A) 꼬리 및/또는 5' 캡 유사체를 추가로 포함한다.
또한, 본 개시의 hMPV/hPIV3 mRNA 백신은 임의의 5' 비번역 영역(UTR) 및/또는 임의의 3' UTR을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예시적인 UTR 서열은 서열 목록(예를 들어, 서열번호 2-5)에 제공되고; 그러나, 다른 UTR 서열은 본원에 기술된 임의의 UTR 서열에 대해 사용되거나 교환될 수 있다. UTR은 또한 본원에 제공된 RNA 폴리뉴클레오티드로부터 생략될 수 있다.
핵산은 뉴클레오티드의 중합체(뉴클레오티드 단량체)를 포함한다. 따라서, 핵산은 폴리뉴클레오티드로도 지칭된다. 핵산은 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(β-D-리보 배열을 갖는 LNA, α-L-리보 배열을 갖는 α-LNA(LNA의 부분입체 이성질체), 2'-아미노 작용기를 갖는 2'-아미노, 및 2'-아미노 작용기를 갖는 2'-아미노-α-LNA를 포함하는, LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 사이클로헥세닐 핵산(CeNA) 및/또는 키메라 및/또는 이들의 조합이거나 이를 포함할 수 있다.
메신저 RNA(mRNA)는 (적어도 하나의) 단백질(천연-발생, 비-천연-발생 또는 아미노산의 변형된 중합체)을 암호화하는 임의의 RNA이며, 이는 시험관내, 생체내, 제자리(in situ) 또는 생체외에서 암호화된 단백질을 생성하도록 변역될 수 있다. 당업자는 달리 언급되지 않는 한, 본 출원에 제시된 핵산 서열은 대표적인 DNA 서열에서 "T"를 언급할 수 있지만, 서열이 RNA(예를 들어, mRNA)를 나타내는 경우, "T"는 "U"로 치환될 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본원에서 특정 서열 식별 번호에 의해 개시되고 확인된 임의의 DNA는 또한 DNA에 상보적인 상응하는 RNA(예를 들어, mRNA) 서열을 개시하며, 이때 DNA 서열의 각 "T"는 "U"로 치환된다.
오픈 리딩 프레임(ORF)은 시작 코돈(예를 들어, 메티오닌(ATG 또는 AUG))으로 시작하고 종료 코돈(예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA, 또는 UAA, UAG 또는 UGA)으로 끝나는 DNA 또는 RNA의 연속적인 스트레치이다. ORF는 전형적으로 단백질을 암호화한다. 본원에 개시된 서열은 추가 요소, 예를 들어 5' 및 3' UTR을 추가로 포함할 수 있지만, 이러한 요소는 ORF와 달리 본 개시의 RNA 폴리뉴클레오티드에 반드시 존재할 필요는 없다는 것이 이해될 것이다.
변이체
일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 호흡기 바이러스 항원 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다. 항원 변이체 또는 다른 폴리펩티드 변이체는 이들의 아미노산 서열이 야생형, 천연 또는 참조 서열과 상이한 분자를 지칭한다. 항원/폴리펩티드 변이체는 천연 또는 참조 서열과 비교하여, 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유할 수 있다. 일반적으로, 변이체는 야생형, 천연 또는 참조 서열에 대해 적어도 50%의 동일성을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체는 야생형, 천연 또는 참조 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 공유한다.
본 개시의 핵산에 의해 암호화되는 변이체 항원/폴리펩티드는 예를 들어, 대상체에서 이들의 면역원성을 향상시키고, 이들의 발현을 향상시키고/시키거나, 이들의 안정성 또는 PK/PD 특성을 개선시키는, 다수의 바람직한 특성 중 임의의 것을 부여하는 아미노산 변화를 함유할 수 있다. 변이체 항원/폴리펩티드는 정례적인 돌연변이 유발 기술을 사용하여 만들 수 있으며, 원하는 특성을 보유하는지의 여부를 결정하기 위해 적절하게 분석될 수 있다. 발현 수준 및 면역원성을 결정하기 위한 분석은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예시적인 해당 분석은 실시예 섹션에 제시되어 있다. 유사하게, 단백질 변이체의 PK/PD 특성은 예를 들어, 시간 경과에 따라 백신 접종된 대상체에서 항원의 발현을 결정하고/하거나, 유도된 면역 반응의 지속성을 관찰함으로써 당업계에서 인정된 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 변이체 핵산에 의해 암호화된 단백질(들)의 안정성은 열 안정성 또는 요소(urea) 변성 시 안정성을 분석함으로써 측정될 수 있거나 또는 인실리코 예측을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 실험 및 인실리코 측정을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 본원에 제공된 서열 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA ORF를 포함하거나(예를 들어, 서열 목록 및 표 1 참조), 본원에 제공된 서열 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 항원) 또는 폴리뉴클레오티드(핵산)의 서열 간의 관계를 지칭한다. 동일성은 또한 2개 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 잔기의 스트링 사이의 일치 수에 의해 결정되는 바와 같이 서열 간의 또는 서열 중의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, "알고리즘")에 의해 처리된 (만약에 있다면) 갭 정렬을 가진 2개 이상의 서열 중 더 작은 것 간의 동일한 일치 퍼센트를 측정한다. 관련된 항원 또는 핵산의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 적용함에 따라 "퍼센트(%) 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 동일성을 달성하기 위해, 서열 정렬 및 갭 도입 후 제2 서열의 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서의 잔기와 동일한 후보 아미노산 또는 핵산 서열에서의 잔기(아미노산 잔기 또는 핵산 잔기)의 백분율로서 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 동일성은 퍼센트 동일성의 계산에 좌우되지만 계산에서 도입된 갭 및 패널티로 인해 값이 상이할 수 있음을 이해한다. 일반적으로, 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항원)의 변이체는 본원에 기재된 그리고 당업자에게 공지된 서열 정렬 프로그램 및 매개변수에 의해 결정되는 바와 같이 그 특정 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 정렬을 위한 도구는 BLAST 묶음(Stephen F. Altschul 등 (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)의 것들을 포함한다. 또 다른 대중적인 로컬 정렬 기술은 Smith-Waterman 알고리즘(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences". J. Mol. Biol. 147:195-197)을 기반으로 한다. 동적 프로그래밍을 기반으로 하는 일반 전반적 정렬 기술은 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins". J. Mol. Biol. 48:443-453)이다. 보다 최근에, Needleman-Wunsch 알고리즘을 포함하는, 다른 최적의 전반적인 정렬 방법보다 빠르게 뉴클레오티드 및 단백질 서열의 전반적인 정렬을 생성한다고 알려진 신속한 최적의 전반적인 서열 정렬 알고리즘(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm; FOGSAA)이 개발되었다.
이와 같이, 참조 서열, 특히 본원에 개시된 폴리펩티드(예를 들어, 항원) 서열에 대하여 치환, 삽입 및/또는 부가, 결실 및 공유 변형을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 개시의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 서열 태그 또는 아미노산, 예컨대 하나 이상의 라이신은 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 끝에서) 펩티드 서열에 부가될 수 있다. 서열 태그는 펩티드 검출, 정제 또는 국부화에 사용될 수 있다. 라이신은 펩티드 용해도를 증가시키거나, 비오틴화를 허용하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 및 아미노 말단 영역에 위치한 아미노산 잔기는 선택적으로 결실되어 절단된 서열을 제공할 수 있다. 특정 아미노산(예를 들어, C-말단 또는 N-말단 잔기)은 예를 들어, 가용성이거나 고체 지지체에 연결된 더 큰 서열의 일부로서 서열의 발현과 같이 서열의 사용에 따라 대안적으로 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 서열, 종결 서열, 막횡단 도메인, 링커, (예를 들어, 폴던 영역과 같은) 다량체화 도메인 등에 대한 (또는 암호화) 서열은 동일 또는 유사한 기능을 달성하는 대안적인 서열로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 코어 내의 공동은 예를 들어, 더 큰 아미노산을 도입함으로써 안정성을 개선시키기 위해 채워질 수 있다. 다른 구현예에서, 매립된 수소 결합 네트워크는 안정성을 개선시키기 위해 소수성 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 글리코실화 부위를 제거하고 적절한 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 서열은 당업자에게 용이하게 식별가능하다. 또한, 본원에 제공된 서열 중 일부는 예를 들어, RNA(예를 들어, mRNA) 백신의 제조에 사용하기 전에, 결실될 수 있는 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 끝에서) 서열 태그 또는 말단 펩티드 서열을 함유한다는 것을 이해해야 한다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 단백질 단편, 기능성 단백질 도메인, 및 상동성 단백질은 또한 관심 호흡기 바이러스 항원의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 예를 들어, 단편이 면역원성이고 호흡기 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 부여한다면, 참조 단백질의 임의의 단백질 단편(참조 항원 서열보다 적어도 하나의 아미노산 잔기가 더 짧지만 다른 것은 동일한 폴리펩티드 서열을 의미함)이 본원에 제공된다. 참조 단백질과 동일하지만 절단된 변이체 외에도, 일부 구현예에서, 항원은 본원에 제공되거나 언급된 임의의 서열에 나타낸 바와 같은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다. 항원/항원성 폴리펩티드는 길이가 약 4개, 6개, 또는 8개 아미노산에서 전장 단백질까지의 범위일 수 있다.
hRSV 항원 변이체
일부 구현예에서, 조성물은 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 20-30개, 20-25개, 15-30개, 15-25개, 15-20개, 10-30개, 10-25개, 10-20개, 10-15개, 5-30개, 5-25개, 5-20개, 또는 5-15개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질의 C-말단 25개의 아미노산(예를 들어, CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 25))을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질의 C-말단 20개의 아미노산(예를 들어, TPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 26))을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질의 C-말단 15개의 아미노산(예를 들어, SKDQLSGINNIAFSN (서열번호 27))을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질의 C-말단 10개의 아미노산(예를 들어, SGINNIAFSN (서열번호 28))을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질(예를 들어, 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 hRSV F 당단백질) 또는 세포질 꼬리가 없는 야생형 hRSV F 당단백질에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 8의 서열을 포함하는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 ORF 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질(예를 들어, 서열번호 1)에 비해, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다: P102X 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149X 치환, S155X 치환, S190X 치환, V207X 치환, S290X 치환, L373X 치환, I379X 치환, M447X 치환, 및 Y458X 치환(상기 X는 임의의 아미노산임) (예를 들어, A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, 또는 V).
일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질에 비해 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 P102A 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 A149C 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 S155C 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 S190F 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 V207L 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 S290C 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 L373R 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 I379V 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 M447V 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 Y458C 치환을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포질 꼬리가 없는 hRSV F 당단백질 변이체는 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기 변형을 추가로 포함한다: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환.
hMPV 항원 변이체
일부 구현예에서, 조성물은 야생형 hMPV F 당단백질에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 hMPV F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 11의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 hMPV F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 11의 서열을 포함하는 hMPV F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 hMPV F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 10의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 ORF 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 hMPV F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 16의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
hPIV3 항원 변이체
일부 구현예에서, 조성물은 야생형 hPIV3 F 당단백질에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 hPIV3 F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 14의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 hPIV3 F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 14의 서열을 포함하는 hPIV3 F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 hPIV3 F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 13의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 ORF 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 hPIV3 F 당단백질 변이체를 암호화하는 RNA를 포함하고, 상기 RNA는 서열번호 17의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
안정화 요소
천연-발생 진핵생물 mRNA 분자는 5'-캡 구조 또는 3'-폴리(A) 꼬리와 같은, 다른 구조적 특징 외에, 이들의 5'-말단(5' UTR) 및/또는 3'-말단(3' UTR)의 비번역 영역(UTR)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 안정화 요소를 함유할 수 있다. 5' UTR과 3' UTR은 모두 전형적으로 게놈 DNA로부터 전사되며, 미성숙한 mRNA의 요소이다. 5'-캡 및 3'-폴리(A) 꼬리와 같은 성숙한 mRNA의 특징적인 구조적 특징은 일반적으로 mRNA 처리 동안 전사된 (미성숙한) mRNA에 추가된다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 변형, 적어도 하나의 5' 말단 캡을 갖는 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 지질 나노입자 내에 제형화된다. 폴리뉴클레오티드의 5'-캡핑은 제조업체 프로토콜에 따라 5'-구아노신 캡 구조를 생성하기 위해 하기와 같은 화학적 RNA 캡 유사체를 사용하여 시험관내-전사 반응 동안 동시에 완료될 수 있다: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5') G [ARCA 캡]; G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). 변형된 RNA의 5'-캡핑은 "Cap 0" 구조를 생성하기 위해 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 전사-후 완료될 수 있다: m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). 캡 1 구조는 m7G(5')ppp(5')G-2'-O-메틸을 생성하기 위해 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 모두 사용하여 생성할 수 있다. 캡 2 구조는 캡 1 구조로부터 생성된 후 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5'-맨 끝에서 세번째(antepenultimate) 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화에 의해 생성될 수 있다. 캡 3 구조는 캡 2 구조로부터 생성된 후 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5'-맨 끝에서 네번째(preantepenultimate) 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화에 의해 생성될 수 있다. 효소는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
3'-폴리(A) 꼬리는 전형적으로 전사된 mRNA의 3'-말단에 부가된 아데닌 뉴클레오티드의 스트레치이다. 일부 경우에, 최대 약 400개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3'-폴리(A) 꼬리의 길이는 개별 mRNA의 안정성과 관련하여 필수적인 요소일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 안정화 요소를 포함한다. 안정화 요소는 예를 들어 히스톤 스템-루프(stem-loop)를 포함할 수 있다. 스템-루프 결합 단백질(SLBP), 32 kDa 단백질이 확인되었다. 핵 및 세포질 모두에서 히스톤 메신저의 3'-말단에 있는 히스톤 스템-루프와 관련이 있다. 이의 발현 수준은 세포 주기에 의해 조절되고; 히스톤 mRNA 수준이 또한 상승된 경우, S-기 동안 최고조에 달한다. 단백질은 U7 snRNP에 의해 히스톤 전(pre)-mRNA의 효율적인 3'-말단 처리에 필수적인 것으로 나타났다. SLBP는 처리 후 스템-루프와 계속 연관되며, 이후 성숙한 히스톤 mRNA가 세포질에서 히스톤 단백질로의 번역을 자극시킨다. SLBP의 RNA 결합 도메인은 후생동물 및 원생동물을 통해 보존되고; 히스톤 스템-루프에 대한 결합은 루프의 구조에 좌우된다. 최소 결합 부위는 스템-루프에 대해 적어도 3개의 뉴클레오타이드 5' 및 2개의 뉴클레오타이드 3'을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 암호화 영역, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프, 및 선택적으로, 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 암호화된 단백질의 발현 수준을 향상시켜야 한다. 암호화된 단백질은, 일부 구현예에서, 히스톤 단백질, 리포터 단백질(예를 들어, 루시퍼라아제, GFP, EGFP, β-갈락토시다아제, EGFP), 또는 마커 또는 선택 단백질(예를 들어, 알파-글로빈, 갈락토키나제 및 잔틴:구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(GPT))가 아니다.
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호 및 적어도 하나의 히스톤 스템-루프의 조합은 포함하지만, 둘 다 천연에서 대안적인 기전을 나타내더라도, 개별 요소 중 하나에서 관찰된 수준 이상으로 단백질 발현을 증가시키기 위해 상승적으로 작용한다. 폴리(A) 및 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 조합의 상승작용 효과는 요소의 순서 또는 폴리(A) 서열의 길이에 좌우되지 않는다.
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 히스톤 다운스트림 요소(HDE)를 포함하지 않는다. "히스톤 다운스트림 요소"(HDE)는 U7 snRNA에 대한 결합 부위를 나타내는, 천연 발생 스템-루프의 대략 15 내지 20개의 뉴클레오티드 3'의 퓨린-풍부 폴리뉴클레오티드 스트레치를 포함하며, 이는 히스톤 전(pre)-mRNA를 성숙한 히스톤 mRNA로 처리하는 데 관여한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인트론을 포함하지 않는다.
RNA(예를 들어, mRNA)는 변형 또는 비변형될 수 있거나 활성화 또는 불활성화될 수 있는, 인핸서 및/또는 프로모터 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 히스톤 스템-루프는 일반적으로 히스톤 유전자로부터 유래되고, 구조의 루프를 형성하는, 짧은 서열로 구성되는, 스페이서에 의해 분리된 2개의 이웃한 부분적으로 또는 전체적으로 역 상보적인 서열의 분자내 염기 쌍을 포함한다. 쌍을 이루지 않은 루프 영역은 전형적으로 스템 루프 요소 중 하나와 염기 쌍을 이룰 수 없다. 이는 많은 RNA 2차 구조의 핵심 성분인 것처럼, RNA에서 더 종종 발생하지만, 단일가닥 DNA에서도 존재할 수 있다. 스템-루프 구조의 안정성은 일반적으로 길이, 불일치 또는 돌출의 수, 및 쌍을 이루는 영역의 염기 조성에 좌우된다. 일부 구현예에서, 워블 염기 쌍(비-왓슨-크릭 염기 쌍)이 생길 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열은 15 내지 45개의 뉴클레오티드의 길이를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 제거된 하나 이상의 AU-풍부 서열을 갖는다. 때때로 AURES로 지칭되는 이들 서열은 3' UTR에서 발견되는 불안정화 서열이다. AURES는 RNA 백신으로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, AURES는 RNA 백신에 남아있을 수 있다.
신호 펩티드
일부 구현예에서, 조성물은 호흡기 바이러스 항원에 융합된 신호 펩티드를 암호화하는 ORF를 갖는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함한다. 단백질의 N-말단 15-60개 아미노산을 포함하는 신호 펩티드는 전형적으로 분비성 경로 상의 막을 가로지르는 전위에 필요하며, 따라서 진핵생물 및 원핵생물 모두에서 대부분의 단백질의 분비성 경로로의 진입을 보편적으로 제어한다. 진핵생물에서, 초기 전구체 단백질(전-단백질)의 신호 펩티드는 리보솜을 조면 소포체(ER) 막으로 안내하고, 처리를 위해 막을 가로지르는 성장하는 펩티드 사슬의 수송을 개시한다. ER 처리는 성숙한 단백질을 생성하고, 상기 신호 펩티드는 전형적으로 숙주 세포의 ER-상주 신호 펩티다아제에 의해 전구체 단백질로부터 절단되거나, 이들은 절단되지 않은 채로 남아있고 막 앵커로서 기능한다. 신호 펩티드는 또한 단백질의 세포막으로의 표적화를 용이하게 할 수 있다.
신호 펩티드는 15-60개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드는 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 또는 60개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 20-60개, 25-60개, 30-60개, 35-60개, 40-60개, 45-60개, 50-60개, 55-60개, 15-55개, 20-55개, 25-55개, 30-55개, 35-55개, 40-55개, 45-55개, 50-55개, 15-50개, 20-50개, 25-50개, 30-50개, 35-50개, 40-50개, 45-50개, 15-45개, 20-45개, 25-45개, 30-45개, 35-45개, 40-45개, 15-40개, 20-40개, 25-40개, 30-40개, 35-40개, 15-35개, 20-35개, 25-35개, 30-35개, 15-30개, 20-30개, 25-30개, 15-25개, 20-25개, 또는 15-20개의 아미노산의 길이를 갖는다.
(천연에서 호흡기 바이러스 항원 이외의 유전자의 발현을 조절하는) 이종 유전자로부터의 신호 펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 원하는 특성에 대해 시험한 다음 본 개시의 핵산에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 하기 서열 중 하나를 포함할 수 있다: MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLPQGVVG (서열번호 18), MDWTWILFLVAAATRVHS (서열번호 19); METPAQLLFLLLLWLPDTTG (서열번호 20); MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS (서열번호 21); MKCLLYLAFLFIGVNCA (서열번호 22); MWLVSLAIVTACAGA (서열번호 23).
융합 단백질
일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 항원성 융합 단백질을 암호화하는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함한다. 따라서, 암호화된 항원 또는 항원들은 함께 연결된 2개 이상의 단백질(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 단편)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 hPIV3 F 당단백질에 융합된 hMPV F 당단백질을 암호화한다. 대안적으로, 단백질 항원이 융합된 단백질은 그 자체에 강한 면역 반응을 촉진하지 않고, 오히려 호흡기 바이러스 항원에 대한 강한 면역 반응을 촉진한다. 항원성 융합 단백질은, 일부 구현예에서, 각각의 원래 단백질로부터 기능적 특성을 보유한다.
스캐폴드 모이어티
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같이 RNA(예를 들어, mRNA) 백신은 스캐폴드 모이어티에 연결된 호흡기 바이러스 항원을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이러한 스캐폴드 모이어티는 본 개시의 핵산에 의해 암호화되는 항원에 원하는 특성을 부여한다. 예를 들어, 스캐폴드 단백질은 예를 들어, 항원의 구조를 변경함으로써, 항원의 흡수 및 처리를 변경함으로써, 및/또는 항원이 결합 파트너에 결합하도록 함으로써 항원의 면역원성을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 면역 시스템의 다양한 세포와 최적의 상호작용을 위한 매우 적합한 크기 범위인, 10-150 nm의 직경을 갖는, 고도로 대칭적이고, 안정적이며, 구조적으로 구성된 단백질 나노입자로 자가-조립될 수 있는 단백질이다. 일부 구현예에서, 바이러스 단백질 또는 바이러스-유사 입자를 사용하여 안정한 나노입자 구조를 형성할 수 있다. 이러한 바이러스 단백질의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)이다. HBsAg는 ~22 nm의 평균 직경을 갖는 구형 입자를 형성하고, 이는 핵산이 없으며, 따라서 비-감염성이다(Lopez-Sagaseta, J. 등 Computational and Structural Biotechnology Journal 14 (2016) 58-68). 일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 24-31 nm 직경의 입자로 자가-조립되는 B형 간염 코어 항원(HBcAg)이며, 이는 HBV-감염된 인간 간으로부터 수득된 바이러스 코어와 유사하다. 자가-조립으로 생성된 HBcAg는 180개 또는 240개의 프로토머에 상응하는, 300 Å 및 360 Å 직경의 서로 다른 크기의 나노입자 두 가지 부류로 나뉜다. 일부 구현예에서, 호흡기 바이러스 항원은 HBsAG 또는 HBcAG에 융합되어 호흡기 바이러스 항원을 제시하는 나노입자의 자가-조립을 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 박테리아 단백질 플랫폼이 사용될 수 있다. 이러한 자가-조립 단백질의 비-제한적인 예는 페리틴, 루마진 및 인캡슐린을 포함한다.
페리틴은 세포내 철 저장이 이의 주요 기능인, 단백질이다. 페리틴은 주요 기능이 세포내 철 저장인 단백질이다. 페리틴은 24개의 서브유닛으로 구성되며, 각각은 8면체 대칭을 갖는 4차 구조로 자가-조립되는 4개의 알파-나선 묶음(bundle)으로 구성된다(Cho K. J. 등 J Mol Biol. 2009; 390: 83-98). 페리틴의 여러 고해상도 구조는 헬리코박터 파일로리 페리틴이 24개의 동일한 프로토머로 구성되어 있는 반면, 동물의 경우 단독으로 조립되거나 24개의 서브유닛 입자 내로 상이한 비율로 결합할 수 있는 페리틴 경쇄 및 중쇄가 있음을 확인하여 결정되었다(Granier T. 등 J Biol Inorg Chem. 2003;8:105-111; Lawson D.M. 등 Nature. 1991;349:541-544). 페리틴은 강력한 열적 및 화학적 안정성을 가진 나노입자로 자가-조립된다. 따라서, 페리틴 나노입자는 항원을 운반하고 노출시키는 데 매우 적합하다.
루마진 합성효소(LS)는 항원 제시를 위한 나노입자 플랫폼으로도 매우 적합하다. 리보플라빈의 생합성에서 끝에서 두 번째(penultimate) 촉매 단계를 담당하는 LS는 고세균, 박테리아, 곰팡이, 식물 및 진균을 포함하는 다양한 유기체에 존재하는 효소이다(Weber S.E. Flavins and Flavoproteins. Methods and Protocols, Series: Methods in Molecular Biology. 2014). LS 단량체는 150개의 아미노산 길이이며, 이의 측면에 탠덤 알파-나선 플랭킹과 함께 베타-시트로 구성된다. LS에 대해 다수의 상이한 4차 구조가 보고되었으며, 이는 호모펜타머에서 150 Å 직경의 캡시드를 형성하는 12개의 5량체의 대칭성 조립에 이르기까지 형태학적 다양성을 보여준다. 100개 이상의 서브유닛의 LS 케이지도 기술되었다(Zhang X. 등 J Mol Biol. 2006;362:753-770).
호열성 세균 써모토가 마리티마로부터 단리된 신규 단백질 케이지 나노입자인 인캡슐린은 자가-조립 나노입자의 표면 상에 항원을 제시하는 플랫폼으로서 사용될 수도 있다. 인캡슐린은 내부 및 외부 직경이 각각 20 및 24 nm인 얇고 20면체 T = 1 대칭성 케이지 구조를 갖는 동일한 31 kDa 단량체의 60개 복제물로부터 조립된다(Sutter M. 등 Nat Struct Mol Biol. 2008; 15: 939-947). T. 마리티마에서 인캡슐린의 정확한 기능은 아직 명확하게 이해되지는 않았으나, 이의 결정 구조는 최근에 해결되었고, 이의 기능은 산화 스트레스 반응에 관여하는 DyP(탈염료 퍼옥시다아제) 및 Flp(페리틴 유사 단백질)과 같은 단백질을 캡슐화하는 세포 구획으로서 가정되었다(Rahmanpour R. 등 FEBS J. 2013; 280: 2097-2104).
링커 및 절단 가능한 펩티드
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 본원에서 융합 단백질로 지칭되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 융합 단백질의 적어도 하나 또는 각각의 도메인 사이에 위치한 링커를 추가로 암호화한다. 링커는 예를 들어, 절단 가능한 링커 또는 프로테아제-민감성 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 F2A 링커, P2A 링커, T2A 링커, E2A 링커, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 2A 펩티드로 지칭되는, 자가-절단 펩티드 링커의 패밀리는 당업계에 기술되어 있다(예를 들어, Kim, J.H. 등 (2011) PLoS ONE 6:e18556 참조). 일부 구현예에서, 링커는 F2A 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 GGGS 링커이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 도메인-링커-도메인-링커-도메인 구조를 갖는, 개재 링커(intervening linker)를 가진 3개의 도메인을 함유한다.
당업계에 공지된 절단 가능한 링커는 본 개시와 관련하여 사용될 수 있다. 예시적인 이러한 링커에는 F2A 링커, T2A 링커, P2A 링커, E2A 링커가 포함된다(예를 들어, WO2017127750호 참조). 당업자는 다른 기술분야에서 인정된 링커가 본 개시의 RNA에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 다른 폴리시스트론 RNA(예를 들어, 동일한 분자 내에서 하나 이상의 항원/폴리펩티드를 별도로 암호화하는 mRNA)가 본원에 제공된 바와 같이 사용하기에 적합할 수 있음을 마찬가지로 이해할 것이다.
서열 최적화
일부 구현예에서, 본 개시의 항원을 암호화하는 ORF는 코돈 최적화된다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 서열 중 임의의 하나 이상의 ORF는 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는, 일부 구현예에서, 적절한 폴딩을 보장하기 위해 표적 및 숙주 유기체에서 코돈 빈도를 일치시키는데; mRNA 안정성을 증가시키기 위해 또는 2차 구조를 감소시키기 위해 GC 함량을 편향시키는데; 유전자 작제 또는 발현을 손상시킬 수 있는 연쇄 반복 코돈 또는 염기 실행을 최소화하는데; 전사 및 번역 제어 영역을 맞춤화하는데; 단백질 트래피킹 서열을 삽입 또는 제거하는데; 암호화된 단백질내 번역 후 변형 부위(예를 들어, 글리코실화 부위)를 제거/첨가하는데; 단백질 도메인을 첨가, 제거 또는 셔플링하는데; 제한 부위를 삽입 또는 제거하는데; 리보솜 결합 부위 및 mRNA 분해 부위를 변형시키는데; 단백질의 다양한 도메인을 적절하게 폴딩하도록 하는 번역 속도를 조정하는데; 또는 폴리뉴클레오티드 내의 문제 2차 구조를 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 코돈 최적화 도구, 알고리즘 및 서비스는 당업계에 알려져 있으며 - 비-제한적인 예는 GeneArt(Life Technologies), DNA2.0(Menlo Park CA) 및/또는 독점 방법으로부터의 서비스를 포함한다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열은 최적화 알고리즘을 사용하여 최적화된다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열 ORF(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 95% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 90% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 85% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 75% 미만의 서열 동일성을 공유한다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 65% 내지 85%(예를 들어, 약 67% 내지 약 85% 또는 약 67% 내지 약 80%) 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 천연-발생 또는 야생형 서열(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 천연-발생 또는 야생형 mRNA 서열)에 대해 65% 내지 75% 또는 약 80% 서열 동일성을 공유한다.
일부 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 비-코돈-최적화된 서열에 의해 암호화되는 호흡기 바이러스 항원만큼 면역원성인 항원을 암호화하거나, 보다 면역원성(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 100%, 또는 적어도 200% 이상)인 항원을 암호화한다.
포유동물 숙주 세포 내로 형질감염될 때, 변형된 mRNA는 12 내지 18시간 또는 18시간 초과, 예를 들어, 24, 36, 48, 60, 72, 또는 72시간 초과의 안정성을 갖고, 이는 포유동물 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 RNA는 G/C의 수준이 향상된 것일 수 있다. 핵산 분자(예를 들어, mRNA)의 G/C-함량은 RNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 증가된 양의 구아닌(G) 및/또는 시토신(C) 잔기를 갖는 RNA는 다량의 아데닌(A) 및 티민(T) 또는 우라실(U) 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 보다 기능적으로 더 안정할 수 있다. 예로서, WO02/098443호는 번역된 영역에서 서열 변형에 의해 안정화된 mRNA를 함유하는 약학적 조성물을 개시한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 변형은 기존 코돈을 생성된 아미노산을 변경하지 않으면서 더 큰 RNA 안정성을 촉진하는 코돈으로 치환함으로써 작동한다. 접근법은 RNA의 암호화 영역으로 제한된다.
화학적으로 비변형된 뉴클레오티드
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 화학적으로 변형되지 않으며 아데노신, 구아노신, 시토신 및 우리딘으로 구성된 표준 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 전사된 RNA(예를 들어, A, G, C, 또는 U)에 존재하는 것과 같은 표준 뉴클레오시드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 DNA(예를 들어, dA, dG, dC, 또는 dT)에 존재하는 것과 같은 표준 데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다.
화학적 변형
본 개시의 조성물은 일부 구현예에서, 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 RNA를 포함하며, 상기 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 표준(비변형됨) 또는 변형될 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 천연-발생 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 또는 비-천연 발생 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드일 수 있다. 이러한 변형은 당업계에서 인식되는 바와 같이 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드의 당, 백본, 또는 핵염기 부분에서의 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 천연-발생 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드는 당업계에 일반적으로 공지되거나, 인식된 바와 같은 것이다. 이러한 천연 발생 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 특히 광범위하게 인식된 MODOMICS 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 비-천연 발생 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 당업계에 일반적으로 공지되거나, 인식된 바와 같은 것이다. 이러한 비-천연 발생 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 비-제한적인 예는 특히, 공개된 미국 출원 번호 PCT/US2012/058519호; PCT/US2013/075177호; PCT/US2014/058897호; PCT/US2014/058891호; PCT/US2014/070413호; PCT/US2015/36773호; PCT/US2015/36759호; PCT/US2015/36771호; 또는 PCT/IB2017/051367호에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 본 개시의 핵산(예를 들어, DNA 핵산 및 RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)은 표준 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 천연-발생 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 비-천연-발생 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 핵산(예를 들어, DNA 핵산 및 RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)은, 일부 구현예에서, 다양한 (하나 초과의) 상이한 유형의 표준 및/또는 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산의 특정 영역은 1개, 2개 이상의 (선택적으로 상이한) 유형의 표준 및/또는 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포 또는 유기체에 도입된 변형된 RNA 핵산(예를 들어, 변형된 mRNA 핵산)은 표준 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 포함하는 비변형된 핵산에 비해 각각 세포 또는 유기체에서 감소된 분해를 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포 또는 유기체에 도입된 변형된 RNA 핵산(예를 들어, 변형된 mRNA 핵산)은 표준 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 포함하는 비변형된 핵산에 비해 각각 세포 또는 유기체에서 감소된 면역원성(예를 들어, 감소된 선천적 반응)을 나타낼 수 있다.
핵산(예를 들어, RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)은, 일부 구현예에서, 원하는 기능 또는 특성을 달성하기 위해 핵산의 합성 동안 또는 합성 후 도입되는 비-천연 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형은 뉴클레오티드간 연결, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 당에 존재할 수 있다. 변형은 화학적 합성 또는 사슬의 말단 또는 사슬의 다른 곳에서 폴리머라제 효소를 사용하여 도입될 수 있다. 핵산의 임의의 영역은 화학적으로 변형될 수 있다.
본 개시는 핵산(예를 들어, RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)의 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 제공한다. "뉴클레오시드"는 유기 염기(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체(본원에서 "핵염기"로도 지칭됨)와 조합하여 당 분자(예를 들어, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물을 지칭한다. "뉴클레오티드"는 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 뉴클레오시드를 포함하기 위해, 예를 들어, 화학적으로, 효소적으로, 또는 재조합적으로와 같은 임의의 유용한 방법에 의해 합성될 수 있다. 핵산은 연결된 뉴클레오시드의 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 가변적인 백본 연결을 가질 수 있다. 연결은 표준 포스포디에스테르 연결일 수 있으며, 이 경우 핵산은 뉴클레오티드의 영역을 포함할 것이다.
변형된 뉴클레오티드 염기 쌍은 표준 아데노신-티민, 아데노신-우라실, 또는 구아노신-시토신 염기 쌍, 뿐만 아니라 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드 사이에 형성된 염기 쌍을 포함하며, 여기서 수소 결합 공여체 및 수소 결합 수용체의 배열은 예를 들어 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 핵산에서와 같이 비-표준 염기 및 표준 염기 사이 또는 2개의 상보적 비-표준 염기 구조 사이의 수소 결합을 허용한다. 이러한 비-표준 염기 쌍의 하나의 예는 변형된 뉴클레오티드 이노신 및 아데닌, 시토신 또는 우라실 사이의 염기 쌍이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합은 본 개시의 핵산으로 혼입될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)에서 변형된 핵염기는 1-메틸-슈도우리딘(m1Ψ), 1-에틸-슈도우리딘(e1Ψ), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 5-메틸-시티딘(m5C), 및/또는 슈도우리딘(Ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, RNA 핵산, 예컨대 mRNA 핵산)에서 변형된 핵염기는 5-메톡시메틸 우리딘, 5-메틸티오 우리딘, 1-메톡시메틸 슈도우리딘, 5-메틸 시티딘, 및/또는 5-메톡시 시티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리리보뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 전술한 변형된 핵염기 중 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 핵산의 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 1-메틸-슈도우리딘(m1Ψ) 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 핵산의 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 1-메틸-슈도우리딘(m1Ψ) 치환 및 핵산의 하나 이상 또는 모든 시티딘 위치에서 5-메틸 시티딘 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 핵산의 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 슈도우리딘(Ψ) 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 핵산의 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 슈도우리딘(Ψ) 치환 및 핵산의 하나 이상 또는 모든 시티딘 위치에서 5-메틸 시티딘 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 mRNA는 핵산의 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 특정 변형에 대해 균일하게 변형(예를 들어, 완전히 변형, 전체 서열에 걸쳐 변형)된다. 예를 들어, 핵산은 1-메틸-슈도우리딘으로 균일하게 변형될 수 있으며, 이는 mRNA 서열에서 모든 우리딘 잔기가 1-메틸-슈도우리딘으로 대체됨을 의미한다. 유사하게는, 핵산은 상기 제시된 것들과 같은 변형된 잔기로 대체함으로써 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다.
본 개시의 핵산은 분자의 전체 길이에 따라 부분적으로 또는 완전히 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상 또는 모든 또는 주어진 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C 중 임의의 하나 이상 또는 모두)는 본 개시의 핵산, 또는 이의 미리 결정된 서열 영역(예를 들어, 폴리(A) 꼬리를 포함하거나 또는 제외한 mRNA)에서 균일하게 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 (또는 이의 서열 영역)에서 모든 뉴클레오티드 X는 변형된 뉴클레오티드이며, 상기 X는 뉴클레오티드 A, G, U, C 중 임의의 하나, 또는 조합 A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C 또는 A+G+C 중 임의의 하나일 수 있다.
핵산은 약 1% 내지 약 100%의 변형된 뉴클레오티드(전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드, 즉, A, G, U, 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 또는 임의의 중간 백분율(예를 들어, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%)을 함유할 수 있다. 임의의 나머지 백분율은 비변형된 A, G, U, 또는 C의 존재에 의해 고려되는 것으로 이해될 것이다.
mRNA는 최소 1% 및 최대 100%의 변형된 뉴클레오티드, 또는 적어도 5% 변형된 뉴클레오티드, 적어도 10% 변형된 뉴클레오티드, 적어도 25% 변형된 뉴클레오티드, 적어도 50% 변형된 뉴클레오티드, 적어도 80% 변형된 뉴클레오티드, 또는 적어도 90% 변형된 뉴클레오티드와 같은 임의의 중간 백분율을 함유할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 변형된 우라실 또는 시토신과 같은 변형된 피리미딘을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 내 우라실의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%가 변형된 우라실(예를 들어, 5-치환된 우라실)로 대체된다. 변형된 우라실은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 내 시토신의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%가 변형된 시토신(예를 들어, 5-치환된 시토신)으로 대체된다. 변형된 시토신은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다.
비번역 영역(UTR)
본 개시의 mRNA는 비번역 영역으로서 작용하거나 기능하는 하나 이상의 영역 또는 부분을 포함할 수 있다. mRNA가 적어도 하나의 관심 항원을 암호화 하도록 디자인된 경우, 핵산은 이러한 비번역 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 핵산의 야생형 비번역 영역은 전사되나 번역되지는 않는다. mRNA에서, 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만, 시작 코돈은 포함하지 않는다; 반면, 3' UTR은 정지 코돈 직후에 시작하여 전사 종결 신호까지 계속된다. 핵산 분자 및 번역의 안정성 측면에서 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 대한 증거 체제가 증가하고 있다. UTR의 조절 기능은 무엇보다도 분자의 안정성을 향상시키기 위해, 본 개시의 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 특정 기능은 바람직하지 않은 기관 부위로 잘못 지시되는 경우 전사체의 제어된 하향-조절을 보장하기 위해 혼입될 수도 있다. 다양한 5' UTR 및 3' UTR 서열은 공지되어 있고 당업계에서 이용가능하다.
5' UTR은 시작 코돈 (리보솜에 의해 번역된 mRNA 전사체의 제1 코돈)으로부터 바로 업스트림 (5')인 mRNA의 영역이다. 5' UTR은 단백질을 암호화하지 않는다(이는 비-암호화임). 천연 5' UTR은 번역 개시에 역할을 하는 기능을 갖는다. 이들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 수반되는 것으로 통상적으로 알려진 코작(Kozak) 서열과 같은 특징을 가지고 있다. 코작 서열은 공통 CCR(A/G)CCAUGG (서열번호 29)를 가지며, 여기서 R은 시작 코돈(AUG)의 상류에 있는 퓨린(아데닌 또는 구아닌) 3개 염기이며, 그 뒤에 또 다른 'G'가 있다. 5' UTR은 또한 신장 인자 결합에 관여하는 2차 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 5' UTR은 이종 UTR, 즉, 상이한 ORF와 연관된 천연에서 발견되는 UTR이다. 또 다른 구현예에서, 5' UTR은 합성 UTR, 즉 천연에서 발생하지 않는다. 합성 UTR은 이들의 특성을 개선하기 위해, 예를 들어, 유전자 발현을 증가시키기 위해 돌연변이된 UTR 뿐만 아니라 완전히 합성된 UTR을 포함한다. 예시적인 5' UTR은 제노프스(Xenopus) 또는 인간 유래 a-글로빈 또는 b-글로빈(8278063; 9012219), 인간 시토크롬 b-245 폴리펩티드, 및 하이드록시스테로이드(17b) 탈수소효소, 및 담배 식각 바이러스(US8278063호, 9012219)를 포함한다. CMV 극초기 1(IE1) 유전자(US20140206753호, WO2013/185069호), 서열 GGGAUCCUACC(서열번호 30)(WO2014144196호)도 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, TOP 유전자의 5' UTR은 5' TOP 모티프(올리고피리미딘 트랙)가 결여된 TOP 유전자의 5' UTR(예를 들어, WO/2015101414호, WO2015101415호, WO/2015/062738호, WO2015024667호, WO2015024667호이고; 리보솜 단백질 Large 32(L32) 유전자로부터 유래된 5' UTR 요소(WO/2015101414호, WO2015101415호, WO/2015/062738호), 하이드록시스테로이드(17-β) 탈수소효소 4 유전자(HSD17B4)의 5' UTR로부터 유래된 5' UTR 요소(WO2015024667호), 또는 ATP5A1의 5' UTR로부터 유래된 5' UTR 요소(WO2015024667호)가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)가 5' UTR 대신 사용된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 5' UTR은 서열번호 3 및 서열번호 4로부터 선택되는 서열을 포함한다.
3' UTR은 정지 코돈(번역의 종결을 신호하는 mRNA 전사체의 코돈)으로부터 바로 다운스트림(3')인 mRNA의 영역이다. 3' UTR은 단백질을 암호화하지 않는다(이는 비-암호화임). 천연 또는 야생형 3' UTR은 그들에 함입된 아데노신 및 우리딘의 스트레치(stretch)를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 AU 풍부한 특징은 높은 전환율을 갖는 유전자에서 특히 보편적이다. 이들의 서열 특징 및 기능적 특성에 기반하여, AU 풍부 요소(ARE)는 3가지 부류로 분리될 수 있으며(Chen 등, 1995): 클래스 I ARE는 U-풍부 영역 내에서 AUUUA 모티프의 몇몇 분산된 복제물을 함유한다. C-Myc 및 MyoD는 클래스 I ARE를 함유한다. 클래스 II ARE는 2개 이상의 중복 UUAUUUA(U/A)(U/A)(서열번호 31) 노나머를 갖는다. 이 유형의 ARE를 함유하는 분자는 GM-CSF 및 TNF-a를 포함한다. 클래스 III ARES는 덜 제대로 정의된다. 이들 U 풍부 영역은 AUUUA 모티프를 함유하지 않는다. c-Jun 및 마이오게닌은 이 부류의 2가지 잘 연구된 예이다. ARE에 대한 대부분의 단백질 결합은 메신저를 불안정하게 하는 것으로 알려져 있는 반면, ELAV 패밀리의 구성원, 가장 현저하게는 HuR은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 보고되었다. HuR은 모두 3가지 부류의 ARE에 결합한다. 핵산 분자의 3' UTR에 HuR 특이적 결합 부위를 조작하는 것은 HuR 결합을 유도할 것이고, 따라서 생체내 메신저의 안정화를 유도할 것이다.
3' UTR AU 풍부 요소(ARE)의 도입, 제거 또는 변형은 본 개시의 핵산(예를 들어, RNA)의 안정성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 특정 핵산을 조작할 때, 본 개시의 핵산을 덜 안정하게 만들기 위해 ARE의 하나 이상의 복제물이 도입될 수 있고, 이에 의해 번역을 축소시키며 생성된 단백질의 생산을 감소시킨다. 마찬가지로, ARE는 세포내 안정성을 증가시키기 위해 동정되고 제거되거나 또는 돌연변이될 수 있고, 따라서, 생성된 단백질의 번역 및 생산을 증가시킨다. 형질감염 실험은 본 개시의 핵산을 이용하여, 적절한 세포주에서 수행될 수 있고, 단백질 생산은 형질감염 후 다양한 시점에 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포는 상이한 ARE-조작 분자로 형질감염될 수 있고, 적절한 단백질에 대해 ELISA 키트를 이용하여 형질감염 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 7일에 생성된 단백질을 분석한다.
3' UTR은 이종 또는 합성일 수 있다. 3' UTR과 관련하여, 제노푸스 β-글로빈 UTR 및 인간 β-글로빈 UTR을 포함하는, 글로빈 UTR이 당업계에 공지되어 있다(8278063, 9012219, US20110086907호). 2개의 순차적인 인간 β-글로빈 3' UTR을 머리에서 꼬리로 클로닝함으로써 일부 세포 유형에서 안정성이 향상된 변형된 β-글로빈을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)이 개발되었으며, 당업계에 잘 알려져 있다(US2012/0195936호, WO2014/071963호). 또한, a2-글로빈, a1-글로빈, UTR 및 이들의 돌연변이체도 당업계에 공지되어 있다(WO2015101415호, WO2015024667호). 비특허 문헌의 mRNA에 기술된 다른 3' UTR에는 CYBA(Ferizi 등, 2015) 및 알부민(Thess 등, 2015)이 포함된다. 다른 예시적인 3' UTR에는 (야생형 또는 변형된) 소 또는 인간 성장 호르몬(WO2013/185069호, US20140206753호, WO2014152774호), 토끼 β 글로빈 및 B형 간염 바이러스(HBV)의 것이 포함되고, α-글로빈 3' UTR 및 바이러스 VEEV 3' UTR 서열도 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 서열 UUUGAAUU(WO2014144196호)가 사용된다. 일부 구현예에서, 인간 및 마우스 리보솜 단백질의 3' UTR이 사용된다. 다른 예에는 rps9 3' UTR (WO2015101414호), FIG4 (WO2015101415호), 및 인간 알부민 7(WO2015101415호)이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 3' UTR은 서열번호 5 및 서열번호 6으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
당업자는 이종 또는 합성인 5' UTR이 임의의 원하는 3' UTR 서열과 함께 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 이종 5' UTR은 이종 3' UTR이 있는 합성 3' UTR과 함께 사용될 수 있다.
비-UTR 서열은 또한 핵산 내의 영역 또는 서브영역으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 인트론 또는 인트론 서열의 일부는 본 개시의 핵산의 영역에 혼입될 수 있다. 인트론 서열의 혼입은 핵산 수준 뿐만 아니라 단백질 생산을 증가시킬 수 있다.
특징의 조합은 측부 영역(flanking region)에 포함될 수 있고, 다른 특징 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, ORF는 강한 코작 번역 개시 신호를 포함할 수 있는 5' UTR 및/또는 폴리-A 꼬리의 주형 첨가를 위한 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있는 3' UTR에 의해 플랭크될 수 있다. 5' UTR은 본원에 그 전체가 참조로 포함된 미국 출원 공개 번호 제20100293625호 및 PCT/US2014/069155호에 기재된 5' UTR과 같은 동일하고/하거나 상이한 유전자로부터의 제1 폴리뉴클레오티드 단편 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
임의의 유전자로부터의 임의의 UTR이 핵산 영역에 포함될 수 있음을 이해해야 한다. 더욱이, 임의의 알려진 유전자의 다중 야생형 UTR이 활용될 수 있다. 야생형 영역의 변이체가 아닌 인공 UTR을 제공하는 것도 본 개시의 범위 내에 있다. 이러한 UTR 또는 이의 일부는 이들이 선택된 전사체와 동일한 방향으로 배치될 수 있거나 방향 또는 위치가 변경될 수 있다. 따라서 5' 또는 3' UTR은 하나 이상의 다른 5' UTR 또는 3' UTR로 반전되고, 단축되고, 연장되고, 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, UTR 서열과 관련하여 용어 "변경된"은 UTR이 참조 서열과 관련하여 어떤 방식으로든 변화되었음을 의미한다. 예를 들어, 3' UTR 또는 5' UTR은 상기 교시된 방향 또는 위치의 변화에 의해 야생형 또는 천연 UTR에 비해 변경될 수 있거나, 추가 뉴클레오티드의 포함, 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 교체 또는 전위에 의해 변경될 수 있다. "변경된" UTR (3'이든 5'이든)을 생성하는 이러한 변화들 중 임의의 것은 변이체 UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' UTR 또는 3' UTR과 같은 이중, 삼중 또는 사중 UTR이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "이중" UTR은 동일한 UTR의 2개의 복제물이 연속하여 또는 실질적으로 연속하여 암호화된 것이다. 예를 들어, 이중 베타-글로빈 3' UTR은 미국 특허 공개 제20100129877호에 기재된 바와 같이 사용될 수 있으며, 이 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
또한 패턴화된 UTR에 대한 본 개시의 범주 내에 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "패턴화된 UTR"은 ABABAB 또는 AABBAABBAABB 또는 ABCABCABC 또는 1회, 2회, 또는 3회 이상 반복되는 이의 변이체와 같은 반복 또는 교대 패턴을 반영하는 UTR이다. 이러한 패턴에서, 각각의 문자, A, B 또는 C는 뉴클레오티드 수준에서 상이한 UTR을 나타낸다.
일부 구현예에서, 측부 영역은 단백질이 공통 기능, 구조, 특징 또는 특성을 공유하는 전사체 패밀리로부터 선택된다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 발달 동안 특정 세포, 조직에서 또는 일부 시간에 발현되는 단백질 패밀리에 속할 수 있다. 임의의 이들 유전자로부터의 UTR은 동일하거나 상이한 단백질 패밀리의 임의의 다른 UTR로 교체되어 새로운 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질 패밀리"는 적어도 하나의 기능, 구조, 특징, 국소화, 기원 또는 발현 패턴을 공유하는 2개 이상의 관심 폴리펩티드의 그룹을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다.
비번역 영역은 또한 번역 인핸서 요소(TEE)를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, TEE는 본원에 그 전체가 참조로 포함된 미국 출원 번호 제20090226470호에 기재된 것들, 및 당업계에 공지된 것들을 포함할 수 있다.
RNA의 시험관내 전사
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 cDNA는 시험관내 전사(IVT) 시스템을 사용하여 전사될 수 있다. RNA의 시험관내 전사는 당업계에 공지되어 있고, 국제 공개 WO/2014/152027호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, RNA 전사체는 RNA 전사체를 생성하기 위해 시험관내 전사 반응에서 비-증폭된, 선형화된 DNA 주형을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 주형 DNA는 단리된 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 DNA는 cDNA이다. 일부 구현예에서, cDNA는 RNA 폴리뉴클레오티드, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 호흡기 바이러스 mRNA의 역전사에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, E. coli, 예를 들어, DH-1 세포는 플라스미드 DNA 주형으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염된 세포는 플라스미드 DNA를 복제하기 위해 배양되며, 이는 이후 단리되고 정제된다. 일부 구현예에서, DNA 주형은 관심 유전자의 5'에 위치하고 작동가능하게 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터, 예를 들어, T7 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 시험관내 전사 주형은 5' 비번역(UTR) 영역을 암호화하고, 오픈 리딩 프레임을 함유하고, 3' UTR 및 폴리(A) 꼬리를 암호화한다. 시험관내 전사 주형의 특정 핵산 서열 조성 및 길이는 주형에 의해 암호화된 mRNA에 의존할 것이다.
"5' 비번역 영역"(UTR)은 폴리펩티드를 암호화하지 않는 시작 코돈 (즉, 리보솜에 의해 번역된 mRNA 전사체의 제1 코돈)으로부터 바로 업스트림 (즉, 5')인 mRNA의 영역을 지칭한다. RNA 전사체가 생성되는 경우, 5' UTR은 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프로모터 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 프로모터 서열은 본 개시의 백신에 존재하지 않을 것임을 이해해야 한다.
"3' 비번역 영역"(UTR)은 폴리펩티드를 암호화하지 않는 정지 코돈 (즉, 번역의 종결을 신호하는 mRNA 전사체의 코돈)으로부터 바로 다운스트림 (즉, 3')인 mRNA의 영역을 지칭한다.
"오픈 리딩 프레임"은 시작 코돈 (예를 들어, 메티오닌(ATG))으로 시작하여, 정지 코돈 (예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA)으로 종료하는 DNA의 연속적인 스트레치이며 폴리펩티드를 암호화한다.
"폴리(A) 꼬리"는 다중, 연속적인 아데노신 모노포스페이트를 함유하는 3' UTR로부터, 다운스트림, 예를 들어, 바로 다운스트림 (즉, 3')인, mRNA의 영역이다. 폴리(A) 꼬리는 10 내지 300 아데노신 모노포스페이트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 꼬리는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300 아데노신 모노포스페이트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 50 내지 250 아데노신 모노포스페이트를 함유한다. 관련된 생물학적 설정에서 (예를 들어, 세포에서, 생체내에서), 폴리(A) 꼬리는, 예를 들어, 세포질에서 효소적 분해로부터 mRNA를 보호하는 기능을 하고, 전사 종결, 및/또는 핵으로부터 mRNA의 유출, 및 번역을 돕는다.
일부 구현예에서, 핵산은 200 내지 3,000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 핵산은 200 내지 500, 200 내지 1000, 200 내지 1500, 200 내지 3000, 500 내지 1000, 500 내지 1500, 500 내지 2000, 500 내지 3000, 1000 내지 1500, 1000 내지 2000, 1000 내지 3000, 1500 내지 3000, 또는 2000 내지 3000개의 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
시험관내 전사 시스템은 전형적으로 전사 완충액, 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP), RNase 억제제 및 폴리머라제를 포함한다.
NTP는 사내에서 제조될 수 있거나, 공급자로부터 선택될 수 있거나, 본원에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. NTP는 천연 및 비천연 (변형된) NTP를 포함하는 본원에 기재된 것들로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
임의의 수의 RNA 폴리머라제 또는 변이체가 본 개시의 방법에서 사용될 수 있다. 상기 폴리머라제는 이에 제한되지는 않으나, 파지 RNA 폴리머라제, 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 및/또는 변이 폴리머라제, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 화학적으로 변형된 핵산 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는, 변형된 핵산 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 혼입할 수 있는 폴리머라제로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예는 DNase의 사용을 배제한다.
일부 구현예에서, RNA 전사체는 효소적 캡핑을 통해 캡핑된다. 일부 구현예에서, RNA는 5' 말단 캡, 예를 들어 7mG(5')ppp(5')NlmpNp를 포함한다.
화학적 합성
고체상 화학적 합성. 본 개시의 핵산은 고체상 기술을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 제조될 수 있다. 핵산의 고체상 화학적 합성은 분자가 고체 지지체 상에 고정화되고, 반응 용액에서 단계별로 합성되는 자동화된 방법이다. 고체상 합성은 핵산 서열의 화학적 변형의 부위-특이적 도입에 유용하다.
액체상 화학적 합성. 단량체 빌딩 블록의 순차적 첨가에 의한 본 개시의 핵산 합성은 액체상에서 수행될 수 있다.
합성 방법의 조합. 상기 논의된 합성 방법은 이들 각각의 장점 및 한계를 갖는다. 이러한 방법을 조합하여 한계를 극복하려는 시도가 이루어지고 있다. 이러한 방법의 조합은 본 개시의 범위 내에 있다. 효소적 결찰과 조합하여 고체상 또는 액체상 화학적 합성의 사용은 화학적 합성 단독으로 수득할 수 없는 긴 사슬 핵산을 생성하는 효율적인 방법을 제공한다.
핵산 영역 또는 서브 영역의 결찰
리가아제에 의해 핵산을 조립하는 것도 사용될 수 있다. DNA 또는 RNA 리가아제는 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬의 5' 및 3' 말단의 분자간 결찰을 촉진한다. 키메라 폴리뉴클레오티드 및/또는 원형 핵산과 같은 핵산은 하나 이상의 영역 또는 서브 영역의 결찰에 의해 제조될 수 있다. DNA 단편은 리가아제 촉매화 반응에 의해 결합되어 상이한 기능을 갖는 재조합 DNA를 생성할 수 있다. 하나는 5' 인산기가 있고, 다른 하나는 유리 3' 하이드록실기가 있는, 2개의 올리고데옥시뉴클레오티드는 DNA 리가아제의 기질 역할을 한다.
정제
본원에 기술된 핵산의 정제는 핵산 정화, 품질 보증 및 품질 관리를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정화는 이에 제한되지 않는, AGENCOURT® 비드(Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), 폴리-T 비드, LNATM 올리고-T 포획 프로브(EXIQON® Inc, Vedbaek, Denmark)와 같은 당업계에 공지된 방법 또는 이에 제한되지 않는, 강한 음이온 교환 HPLC, 약한 음이온 교환 HPLC, 역상 HPLC(RP-HPLC), 및 소수성 상호작용 HPLC(HIC-HPLC)와 같은 HPLC 기반 정제 방법에 의해 수행될 수 있다. "정제된 핵산"과 같은 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "정제된"은 적어도 하나의 오염물로부터 분리된 것을 지칭한다. "오염 물질"은 다른 부적합하거나, 불순물이 섞여있거나, 열등하게 만드는 임의의 물질이다. 따라서, 정제된 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA)은 천연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 설정으로 존재하거나, 처리 또는 정제 방법을 적용하기 전에 존재했던 것과 상이한 형태 또는 설정으로 존재한다.
품질 보증 및/또는 품질 관리 검사는 겔 전기영동, UV 흡광도 또는 분석용 HPLC와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 핵산은 역전사 효소-PCR을 포함하나 이에 제한되지 않는 방법에 의해 시퀀싱될 수 있다.
정량화
일부 구현예에서, 본 개시의 핵산은 엑소좀에서 또는 하나 이상의 체액으로부터 유래된 경우에 정량화될 수 있다. 체액에는 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액(CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수액, 양수액, 귀지, 모유, 기관지 폐포 세척액, 정액, 전립선액, 쿠퍼액 또는 사정전 액(pre-ejaculatory fluid), 땀, 대변, 모발, 눈물, 낭종액, 흉막 및 복막액, 심낭액, 림프, 미즙, 유미(chyle), 담즙, 간질액, 월경, 고름, 피지, 구토, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌장액, 누강의 세척액, 기관지 폐 흡인물, 배반포 강 유체(blastocyl cavity fluid), 및 제대혈이 포함된다. 대안적으로, 엑소좀은 폐, 심장, 췌장, 위, 장, 방광, 신장, 난소, 정소, 피부, 결장, 유방, 전립선, 뇌, 식도, 간 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기관으로부터 회수될 수 있다.
분석은 항원-특이적 프로브, 세포측정법, qRT-PCR, 실시간 PCR, PCR, 유세포 분석법, 전기영동, 질량 분석법 또는 이들의 조합을 사용하여 수행될 수 있는 반면, 엑소좀은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 방법과 같은 면역조직화학적 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 엑소좀은 또한 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리, 차등 원심분리, 나노막 한외여과, 면역흡착 포획, 친화성 정제, 미세유체 분리, 또는 이들의 조합에 의해 단리될 수 있다.
이러한 방법은 조사자가 남아 있거나 전달되는 핵산 수준을 실시간으로 모니터링할 수 있는 능력을 제공한다. 이는 본 개시의 핵산이 일부 구현예에서, 구조적 또는 화학적 변형으로 인해 내인성 형태와 상이하기 때문에 가능하다.
일부 구현예에서, 핵산은 이에 제한되지 않는, 자외선 가시 분광법(UV/Vis)과 같은 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. UV/Vis 분광계의 비-제한적인 예는 NANODROP® 분광계(ThermoFisher, Waltham, MA)이다. 상기 정량화된 핵산은 핵산이 적절한 크기일 수 있는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있으며, 핵산의 분해가 일어나지 않았음을 확인한다. 핵산의 분해는 이에 제한되지 않는, 아가로스 겔 전기영동과 같은 방법, 이에 제한되지 않는, 강한 음이온 교환 HPLC, 약한 음이온 교환 HPLC, 역상 HPLC(RP-HPLC), 및 소수성 상호작용 HPLC(HIC-HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LCMS), 모세관 전기영동(CE) 및 모세관 겔 전기영동(CGE)과 같은 HPLC 기반 정제 방법으로 확인할 수 있다.
지질 나노입자(LNP)
일부 구현예에서, 본 개시의 RNA(예를 들어, mRNA)는 지질 나노입자(LNP)로 제형화된다. 지질 나노입자는 전형적으로 관심 핵산 카고(cargo)와 함께 이온화 가능한 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤 및 PEG 지질 성분을 포함한다. 본 개시의 지질 나노입자는 당업계에 일반적으로 공지된 성분, 조성물, 및 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 예를 들어 PCT/US2016/052352호; PCT/US2016/068300호; PCT/US2017/037551호; PCT/US2015/027400호; PCT/US2016/047406호; PCT/US2016000129호; PCT/US2016/014280호; PCT/US2016/014280호; PCT/US2017/038426호; PCT/US2014/027077호; PCT/US2014/055394호; PCT/US2016/52117호; PCT/US2012/069610호; PCT/US2017/027492호; PCT/US2016/059575호 및 PCT/US2016/069491호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시의 백신은 전형적으로 지질 나노입자 내 제형화된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 이온화 가능한 양이온성 지질, 적어도 하나의 비-양이온성 지질, 적어도 하나의 스테롤, 및/또는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 20-60% 몰비의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 20-50%, 20-40%, 20-30%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 40-60%, 40-50%, 또는 50-60% 몰비의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 20%, 30%, 40%, 50, 또는 60% 몰비의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 5-25% 몰비의 비-양이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-25%, 10-20%, 10-25%, 15-25%, 15-20%, 또는 20-25% 몰비의 비-양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 몰비의 비-양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 25-55% 몰비의 스테롤을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 25-50%, 25-45%, 25-40%, 25-35%, 25-30%, 30-55%, 30-50%, 30-45%, 30-40%, 30-35%, 35-55%, 35-50%, 35-45%, 35-40%, 40-55%, 40-50%, 40-45%, 45-55%, 45-50%, 또는 50-55% 몰비의 스테롤을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 55% 몰비의 스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.5-15% 몰비의 PEG-변형된 지질을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 0.5-10%, 0.5-5%, 1-15%, 1-10%, 1-5%, 2-15%, 2-10%, 2-5%, 5-15%, 5-10%, 또는 10-15% 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% 몰비의 PEG-변형된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 20-60% 몰비의 이온화 가능한 양이온성 지질, 5-25% 몰비의 비-양이온성 지질, 25-55% 몰비의 스테롤, 및 0.5-15% 몰비의 PEG-변형된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 이온화 가능한 양이온성 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
Figure pct00002
(I),
식 중:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, C1-14 알킬, C2-14 알케닐, R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 C3-6 카르보사이클, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, 및 비치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Q는 카르보사이클, 헤테로사이클, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2,
-N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(R)N(R)2C(O)OR로부터 선택되며, 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'는 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8은 C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R9는 H, CN, NO2, C1-6 알킬, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6 알케닐, C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br, 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 서브세트(subset)는 R4가 -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, 또는 -CQ(R)2인 경우, (i) n이 1, 2, 3, 4 또는 5일 때, Q는 -N(R)2가 아니거나, 또는 (ii) n이 1 또는 2일 때, Q는 5, 6, 또는 7-원 헤테로사이클로알킬이 아닌 화합물들을 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, C1-14 알킬, C2-14 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 C3-6 카르보사이클, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, 및 비치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Q는 C3-6 카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5-원 내지 14-원 헤테로아릴, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, 및 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 가지며 옥소(=O), OH, 아미노, 모노- 또는 디-알킬아미노, 및 C1-3 알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 5-원 내지 14-원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되고, 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기, 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8은 C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R9는 H, CN, NO2, C1-6 알킬, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6 알케닐, C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br, 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, C1-14 알킬, C2-14 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 C3-6 카르보사이클, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, 및 비치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Q는 C3-6 카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5-원 내지 14-원 헤테로사이클, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(=NR9)N(R)2로부터 선택되고, 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되고; Q가 5-원 내지 14-원 헤테로사이클일 때 (i) R4는 -(CH2)nQ이고 이때 n은 1 또는 2이거나, 또는 (ii) R4는 -(CH2)nCHQR이고 이때 n은 1이거나, 또는 (iii) R4는 -CHQR, 및 -CQ(R)2이고, 이때 Q는 5-원 내지 14-원 헤테로아릴 또는 8-원 내지 14-원 헤테로사이클로알킬이고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8은 C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R9는 H, CN, NO2, C1-6 알킬, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6 알케닐, C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, C1-14 알킬, C2-14 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 C3-6 카르보사이클, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, 및 비치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Q는 C3-6 카르보사이클, N, O, 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5-원 내지 14-원 헤테로아릴, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, 및 -C(=NR9)N(R)2로부터 선택되고, 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8은 C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R9는 H, CN, NO2, C1-6 알킬, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6 알케닐, C3-6 카르보사이클 및 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, C2-14 알킬, C2-14 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 -(CH2)nQ 또는 -(CH2)nCHQR이고, 이때 Q는 -N(R)2이며, n은 3, 4 및 5로부터 선택되고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C1-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R"M'R'로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 C1-14 알킬, C2-14 알케닐, -R*YR", -YR", 및 -R*OR"로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3은 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카르보사이클을 형성하며;
R4는 -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, 및 -CQ(R)2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 Q는 -N(R)2이며, n은 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택되고;
각각의 R5는 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R6은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R은 C1-3 알킬, C2-3 알케닐, 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R'은 C1-18 알킬, C2-18 알케닐, -R*YR", -YR", 및 H로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R"은 C3-14 알킬 및 C3-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C1-12 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카르보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 서브세트는 하기 화학식 (IA)의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
Figure pct00003
(IA),
식 중, l은 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택되고; m은 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택되고; M1은 결합 또는 M'이고; R4는 비치환된 C1-3 알킬, 또는 -(CH2)nQ이고, 이때 Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이며; M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고; R2 및 R3은 H, C1-14 알킬, 및 C2-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 서브세트는 하기 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
Figure pct00004
(II),
식 중, l은 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택되며; M1은 결합 또는 M'이고; R4는 비치환된 C1-3 알킬, 또는 -(CH2)nQ이며, 이때 n은 2, 3 또는 4이고, Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M'은 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, 아릴기 및 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고; R2 및 R3은 H, C1-14 알킬 및 C2-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 서브세트는 하기 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), 또는 (IIe)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
Figure pct00005
(IIa),
Figure pct00006
(IIb),
Figure pct00007
(IIc), 또는
Figure pct00008
(IIe),
식 중, R4는 본원에 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물의 서브세트는 하기 화학식 (IId)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함한다:
Figure pct00009
(IId),
식 중, n은 2, 3 또는 4이고; m, R', R" 및 R2 내지 R6은 본원에 기재된 바와 같다. 예를 들어, R2 및 R3의 각각은 C5-14 알킬 및 C5-14 알케닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 이온화 가능한 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00010
(화합물 I).
일부 구현예에서, 본 개시의 이온화 가능한 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00011
(화합물 II).
일부 구현예에서, 본 개시의 비-양이온성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2 콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨 염(DOPG), 스핑고미엘린, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 PEG 변형된 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤, PEG-변형된 디알킬글리세롤, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형된 지질은 DMG-PEG, PEG-c-DOMG(PEG-DOMG로도 지칭됨), PEG-DSG 및/또는 PEG-DPG이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 스테롤은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 화합물 1의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하며, 상기 비-양이온성 지질은 DSPC이고, 구조적 지질은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 DMG-PEG이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 45 - 55 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 5 - 15 몰%의 DSPC를 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 몰%의 DSPC를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 35 - 40 몰%의 콜레스테롤을 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 몰%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 1 - 2 몰%의 DMG-PEG를 포함한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 1, 1.5, 또는 2 몰%의 DMG-PEG를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 50 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질, 10 몰%의 DSPC, 38.5 몰%의 콜레스테롤, 및 1.5 몰%의 DMG-PEG를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 2:1 내지 약 30:1의 N:P 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 6:1의 N:P 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 3:1의 N:P 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 10:1 내지 약 100:1의 이온화 가능한 양이온성 지질 성분 대 RNA의 wt/wt 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 20:1의 이온화 가능한 양이온성 지질 성분 대 RNA의 wt/wt 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 10:1의 이온화 가능한 양이온성 지질 성분 대 RNA의 wt/wt 비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 50 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 70 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다.
다가 백신
본원에 제공된 바와 같은, 조성물은 동일하거나 상이한 종의 2개 이상의 항원을 암호화하는 RNA 또는 다중 RNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 2개 이상의 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 RNA 또는 다중 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 이상의 호흡기 바이러스 항원을 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 hRSV F 당단백질을 암호화하는 RNA, hMPV F 당단백질을 암호화하는 RNA, 및 hPIV3 F 당단백질 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원을 암호화하는 2개 이상의 상이한 RNA(예를 들어, mRNA)가 동일한 지질 나노입자 내 제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원을 암호화하는 2개 이상의 상이한 RNA는 별개의 지질 나노입자 내 제형화될 수 있다(각각의 RNA는 단일 지질 나노입자 내 제형화됨). 지질 나노입자는 이후 (예를 들어, 다중 항원을 암호화하는 다중 RNA를 포함하는) 단일 백신 조성물로서 조합되어 투여될 수 있거나, 개별적으로 투여될 수 있다.
조합 백신
본원에 제공된 바와 같은, 조성물은 동일하거나 상이한 바이러스 균주의 2개 이상의 항원을 암호화하는 RNA 또는 다중 RNA를 포함할 수 있다. 하나 이상의 hRSV 항원(들) 및 hMPV 및/또는 hPIV3와 같은 상이한 유기체의 하나 이상의 항원(들)을 암호화하는 RNA를 포함하는 조합 백신이 또한 본원에서 제공된다. 따라서, 본 개시의 백신은 동일한 균주/종의 하나 이상의 항원, 또는 상이한 균주/종의 하나 이상의 항원, 예를 들어, 호흡기 바이러스 감염의 위험이 높은 동일한 지리적 영역에서 발견되는 유기체 또는 호흡기 바이러스에 노출될 때 개체가 이에 노출될 가능성이 있는 유기체에 대한 면역을 유도하는 항원을 표적으로 하는 조합 백신일 수 있다.
약학적 제제
예를 들어, 인간 및 다른 포유동물에서 호흡기 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물(예를 들어, 약학적 조성물), 방법, 키트 및 시약이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 조성물은 치료제 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 이들은 호흡기 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNA를 함유하는 호흡기 바이러스 백신은 대상체(예를 들어, 포유류 대상체, 예컨대 인간 대상체)에게 투여될 수 있고, RNA 폴리뉴클레오티드는 항원성 폴리펩티드(항원)를 생산하기 위해 생체내에서 번역된다.
(예를 들어, RNA를 포함하는) 조성물의 "유효량"은, 적어도 부분적으로, 상기 표적 조직, 표적 세포 유형, 투여 수단, RNA의 물리적 특징(예를 들어, 길이, 뉴클레오티드 조성물, 및/또는 변형된 뉴클레오시드의 정도), 백신의 다른 성분, 및 다른 결정인자, 예컨대, 대상체의 연령, 체중, 키, 성별 및 일반적인 건강을 기반으로 한다. 전형적으로, 유효량의 조성물은 대상체의 세포에서 항원 생산의 기능으로서 유도된 또는 부스팅된 면역 반응을 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 RNA 폴리뉴클레오티드를 함유하는 유효량의 조성물은 동일한 항원 또는 펩티드 항원을 암호화하는 상응하는 비변형된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물보다 더 효율적이다. 증가된 항원 생산은 증가된 세포 형질감염(RNA 백신으로 형질감염된 세포의 백분율), 폴리뉴클레오티드로부터의 증가된 단백질 번역 및/또는 발현, (예를 들어, 변형된 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 번역 기간 증가에 의해 입증된 바와 같이) 감소된 핵산 분해, 또는 숙주 세포의 변경된 항원 특이적 면역 반응에 의해 입증될 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 특히 적합하게 조성물을 만드는, 불활성 또는 활성인, 담체와 활성제의 조합을 지칭한다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 또는 대상체 상에 투여된 후, 바람직하지 않은 생리학적 효과를 야기시키지 않는다. 약학적 조성물 내 담체는 활성 성분과 양립가능하고, 이를 안정화시킬 수 있다는 의미에서 또한 "허용가능"해야 한다. 하나 이상의 가용화제는 활성제의 전달을 위한 약학적 담체로서 이용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는, 투약 형태로서 사용가능한 조성물을 달성하기 위한, 생체적합성 비히클, 보조제, 첨가제, 및 희석제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 담체의 예는 콜로이드성 산화규소, 마그네슘 스테아르산, 셀룰로오스, 및 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다. 추가의 적합한 약학적 담체 및 희석제, 뿐만 아니라 이들의 용도를 위한 약학적 필수품은 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, (폴리뉴클레오티드 및 이들의 암호화된 폴리펩티드를 포함하는) 본 개시에 따른 조성물은 호흡기 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 조성물은 건강한 개체에 대한 능동 면역화 계획의 일부로서 예방적으로 또는 치료적으로, 또는 잠복기 동안 또는 증상의 발병 후 활성 감염 동안 감염 초기에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 조직 또는 대상체에 제공되는 RNA의 양은 면역 예방에 효과적인 양일 수 있다.
조성물은 다른 예방적 또는 치료적 화합물과 함께 투여될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 예방적 또는 치료적 화합물은 보조제 또는 부스터일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 예방적 조성물, 예컨대 백신을 언급할 때, 용어 "부스터"는 예방적 (백신) 조성물의 추가 투여를 지칭한다. 부스터 (또는 부스터 백신)는 예방적 조성물의 초기 투여 후에 주어질 수 있다. 예방적 조성물의 초기 투여와 부스터 사이의 투여 시간은, 이에 제한되지는 않으나, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 36시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 10일, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 18개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 45년, 50년, 55년, 60년, 65년, 70년, 75년, 80년, 85년, 90년, 95년 또는 99년 이상일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 예방적 조성물의 초기 투여와 부스터 사이의 투여 시간은, 이에 제한되지 않으나, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 1년일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 당업계에 공지된 불활성화된 백신의 투여와 유사하게 근육내로, 비강내로 또는 진피내로 투여될 수 있다.
조성물은 감염의 유병률 또는 충족되지 않은 의학적 요구의 정도 또는 수준에 따라 다양한 환경에서 활용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, RNA 백신은 다양한 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하는데 활용될 수 있다. RNA 백신은 상업적으로 이용가능한 백신보다 훨씬 더 큰 항체 역가를 생성하고, 면역을 더 잘 중화시키며, 더 오래 지속되는 면역 반응을 생성하고/하거나, 더 빨리 반응을 생성한다는 점에서 우수한 특성을 갖는다.
선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 RNA 및/또는 복합체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
RNA는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 성분과 함께 제형화거나 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역화 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 보조제(adjuvant)를 포함하는 다른 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물은 보조제를 포함하지 않는다(이들은 보조제가 없음).
RNA는 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 부형제와 조합하여 제형화되거나 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 예를 들어, 치료적-활성 물질, 예방적-활성 물질, 또는 둘 다의 조합과 같은 적어도 하나의 추가 활성 물질을 포함한다. 백신 조성물은 무균, 발열원-무함유 또는 무균 및 발열원-무함유 둘 다일 수 있다. 약제, 예컨대 백신 조성물의 제형 및/또는 제조의 일반적인 고려사항은, 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005(이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에게 투여된다. 본 개시의 목적을 위해, 어구 "활성 성분"은 일반적으로, 상기 성분 내에 함유된 RNA 백신 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 항원을 암호화하는 RNA 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA 폴리뉴클레오티드)를 지칭한다.
본원에 기재된 백신 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비 방법은 활성 성분(예를 들어, mRNA 폴리뉴클레오티드)을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키고, 그 다음, 필요하고/하거나 바람직한 경우, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 개시에 따른 약학적 조성물 내의 활성 성분, 약학적으로 허용가능한 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료된 대상체의 동일성, 크기, 및/또는 상태 및 추가로 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 본 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들어, 0.5 내지 50%, 1 내지 30%, 5 내지 80%, 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA는 (1) 안정성 증가; (2) 세포 형질감염의 증가; (3) (예를 들어, 데포 제형으로부터) 지속 또는 지연 방출의 허용; (4) 생체 분포의 변경(예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적); (5) 생체내 암호화된 단백질 번역의 증가; 및/또는 (6) 생체내 암호화된 단백질(항원)의 방출 프로파일 변경을 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화된다. 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산물 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제와 같은 전통적인 부형제 이외에, 부형제는 제한 없이, 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩티드, 단백질, (예를 들어, 대상체 내로 이식을 위해) RNA로 형질감염된 세포, 하이알루로니다제, 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
투약/투여
인간 및 다른 포유동물에서 호흡기 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신), 방법, 키트 및 시약이 본원에 제공된다. 면역화 조성물은 치료제 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역화 조성물은 호흡기 바이러스 감염으로부터 예방적 보호를 제공하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 면역화 조성물은 호흡기 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예, 구현예에서, 면역화 조성물은 예를 들어, 생체외에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 활성화하기 위해 면역 이펙터 세포의 프라이밍에 사용되며, 이는 이후 대상체 내로 주입(재주입)된다.
대상체는 비인간 영장류 및 인간 대상체를 포함하는, 임의의 포유동물일 수 있다. 전형적으로, 대상체는 인간 대상체이다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)은 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 대상체(예를 들어, 포유류 대상체, 예컨대 인간 대상체)에게 투여된다. 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 RNA는 생체내에서 발현되고 번역되어 항원을 생성하고, 이는 이후 대상체에서 면역 반응을 자극한다.
호흡기 바이러스로부터의 예방적 보호는 본 개시의 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)의 투여 후에 달성될 수 있다. 면역화 조성물은 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여될 수 있으나, 백신을 1회 투여하는 것으로 충분할 가능성이 있다(선택적으로 단일 부스터가 뒤따름). 덜 바람직하지만, 치료 반응을 달성하기 위해 감염된 개체에게 면역화 조성물을 투여하는 것이 가능하다. 투약은 이에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다.
호흡기 바이러스 항원(또는 다중 항원)에 대한 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본 개시의 측면에서 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 호흡기 바이러스 항원(예를 들어, hRSV F 당단백질, hMPV F 당단백질, 및/또는 hPIV3 F 당단백질)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함하는 면역화 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 대상체에서 호흡기 바이러스 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하고, 여기서 상기 대상체에서 항-항원 항체 역가는 항원에 대한 전통적 백신의 예방적 유효량으로 백신 접종된 대상체에서 항-항원 항체 역가에 비해 백신 접종 후 증가된다. "항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 혈청 항체이다.
예방적 유효량은 임상적으로 허용가능한 수준에서 바이러스에 의한 감염을 예방하는 유효량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 백신용 포장 삽입물에서 나열된 용량이다. 본원에 사용된 바와 같이, 전통적 백신은 본 개시의 mRNA 백신 이외의 백신을 지칭한다. 예를 들어, 전통적 백신은 이에 제한되지는 않으나, 살아있는 미생물 백신, 사멸된 미생물 백신, 서브유닛 백신, 단백질 항원 백신, DNA 백신, 바이러스 유사 입자(VLP) 백신 등을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 전통적 백신은 규제 승인을 획득하고/하거나 국가 약물 규제 기관, 예를 들어 미국 식품의약국(FDA) 또는 유럽 의약품청(EMA)에 의해 등록된 백신이다.
일부 구현예에서, 대상체에서의 항-항원 항체 역가는 호흡기 바이러스 또는 백신 미접종된 대상체에 대한 예방적 유효량의 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 항-항원 항체 역가에 비해 백신 접종 후 1 log 내지 10 log 증가된다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 항-항원 항체 역가는 호흡기 바이러스 또는 백신 미접종된 대상체에 대한 예방적 유효량의 전통적 백신이 백신 접종된 대상체에서의 항-항원 항체 역가에 비해 백신 접종 후 1 log, 2 log, 3 log, 4 log, 5 log 또는 10 log 증가된다.
호흡기 바이러스에 대한 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본 개시의 다른 측면에서 제공된다. 상기 방법은 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 대상체에서 호흡기 바이러스에 특이적인 면역 반응을 유도하고, 여기서 상기 대상체에서의 면역 반응은 면역화 조성물에 비해 투여량 수준의 2배 내지 100배에서 호흡기 바이러스에 대한 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다.
일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 2배의 투여량 수준에서 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 3배의 투여량 수준에서 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 4배, 5배, 10배, 50배, 또는 100배의 투여량 수준에서 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 10배 내지 1000배의 투여량 수준에서 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 100배 내지 1000배의 투여량 수준에서 전통적 백신으로 백신 접종된 대상체에서의 면역 반응과 동등하다.
다른 구현예에서, 면역 반응은 대상체에서의 [단백질] 항체 역가를 결정함으로써 평가된다. 다른 구현예에서, 면역화된 대상체로부터의 혈청 또는 항체의 능력은 바이러스 흡수를 중화하거나 인간 B 림프구의 호흡기 바이러스 형질전환을 감소시키는 이의 능력에 대해 시험된다. 다른 구현예에서, 강력한 T 세포 반응(들)을 촉진하는 능력은 당업계에 인정된 기법을 사용하여 측정된다.
다른 측면에서, 본 개시는 호흡기 바이러스 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 RNA를 포함하는 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)을 대상체에게 투여함으로써 호흡기 바이러스에 대한 대상체에서의 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 이에 따라 대상체에서 호흡기 바이러스 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하고, 여기서 상기 대상체에서의 면역 반응은 호흡기 바이러스에 대한 전통적 백신의 예방적 유효량으로 백신 접종된 대상체에서 유도된 면역 반응에 비해 2일 내지 10주 더 일찍 유도된다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 본 개시의 면역화 조성물에 비해 2배 내지 100배의 투여량 수준에서 전통적 백신의 예방적 유효량으로 백신 접종된 대상체에서 유도된다.
일부 구현예에서, 대상체에서의 면역 반응은 예방적 유효량의 전통적 백신으로 백신 접종을 받은 대상체에서 유도된 면역 반응에 비해 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 5주 또는 10주 더 일찍 유도된다.
또한 제1 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 RNA를 대상체에게 투여함으로써 호흡기 바이러스에 대한 대상체에서의 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 RNA는 안정화 요소를 포함하지 않고, 여기서 보조제는 백신과 공동-제형화되거나 공동-투여되지 않는다.
면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)은 치료적으로 효과적인 결과를 초래하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은, 이에 제한되지는 않으나, 진피내, 근육내, 비강내 및/또는 피하 투여를 포함한다. 본 개시는 RNA 백신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 요구된 정확한 양은, 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 병태, 질환의 중증도, 특정 조성물, 이의 투여 방식, 이의 활성 방식 등에 따라 대상체마다 다를 수 있다. RNA는 전형적으로 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화된다. 그러나, RNA의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대하여 특정 치료적으로 효과적인, 예방적으로 효과적인, 또는 적절한 이미징 용량 수준은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 화합물의 활성; 이용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 이용된 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 속도; 치료 기간; 이용된 특정 화합물과 조합으로 또는 동시에 사용된 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
본원에 제공된 바와 같은, RNA의 유효량은 예를 들어 단일 용량으로 또는 2회의 10 μg 용량으로 투여되는 20 μg 만큼 낮을 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 20 μg-300 μg 또는 25 μg-300 μg의 총 용량이다. 예를 들어, 유효량은 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 50 μg, 55 μg, 60 μg, 65 μg, 70 μg, 75 μg, 80 μg, 85 μg, 90 μg, 95 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg, 160 μg, 170 μg, 180 μg, 190 μg, 200 μg, 250 μg, 또는 300 μg의 총 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 25 μg-300 μg의 총 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 20 μg의 총 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 25 μg의 총 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 75 μg의 총 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 150 μg의 총 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 300 μg의 총 용량이다.
본원에 기술된 RNA는 비강내, 기관내 또는 (예를 들어, 정맥내로, 안내로, 유리체내로, 근육내로, 피내로, 심장내로, 복강내로 및 피하로) 주사가능한 것과 같은 본원에 기술된 제형으로 제제화될 수 있다.
백신 효능
본 개시의 일부 측면은 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)의 제제를 제공하고, 상기 RNA는 대상체에서 항원 특이적 면역 반응(예를 들어, 호흡기 바이러스 항원에 특이적인 항체의 생산)을 생성하기 위한 유효량으로 제제화된다. "유효량"은 항원-특이적 면역 반응을 생성하는데 효과적인 RNA의 용량이다. 또한 대상체에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시의 백신 또는 LNP에 대한 면역 반응은 백신에 존재하는 (하나 이상의) 호흡기 바이러스 단백질(들)에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 대상체에서의 발달이다. 본 개시의 목적을 위해, "체액성" 면역 반응은 예를 들어, 분비(IgA) 또는 IgG 분자를 포함하는, 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 지칭하는 반면, "세포성" 면역 반응은 T-림프구(예를 들어, CD4+ 헬퍼 및/또는 CD8+ T 세포(예를 들어, CTL) 및/또는 기타 백혈구에 의해 매개되는 면역 반응이다. 세포성 면역의 하나의 중요한 측면은 세포용해성 T-세포(CTL)에 의한 항원-특이적 반응을 수반한다. CTL은 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 암호화되고 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질과 관련하여 제시되는 펩티드 항원에 대한 특이성을 갖는다. CTL은 세포내 미생물의 파괴 또는 이러한 미생물에 감염된 세포의 용해를 유도하고 촉진하는 데 도움이 된다. 세포성 면역의 또 다른 측면은 헬퍼 T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 수반한다. 헬퍼 T-세포는 기능을 자극하는 데 도움이 되도록 작용하고, 이들의 표면 상에 MHC 분자와 관련하여 펩티드 항원을 나타내는 세포에 대해 비특이적 이펙터 세포의 활성을 집중시킨다. 세포성 면역 반응은 또한 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 것들을 포함하는 활성화된 T-세포 및/또는 기타 백혈구에 의해 생성되는 사이토카인, 케모카인, 및 기타 해당 분자의 생산을 유도한다.
일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 반응은 본원에 제공된 바와 같은 면역화 조성물이 투여된 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가를 측정하는 것을 특징으로 한다. 항체 역가는 대상체 내에서 항체, 예를 들어, 특정 항원(예를 들어, 항-hRSV F 당단백질) 또는 항원의 에피토프에 특이적인 항체의 양의 측정이다. 항체 역가는 긍정적인 결과를 제공하는 가장 큰 희석의 역수로서 전형적으로 표현된다. 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 예를 들어 항체 역가를 결정하기 위한 일반적인 분석법이다.
일부 구현예에서, 항체 역가는 대상체가 감염되었는지 여부를 평가하는데 또는 면역화가 필요한지 여부를 결정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 항체 역가는 자가면역 반응의 강도를 결정하는데, 부스터 면역화가 필요한지 여부를 결정하는데, 이전의 백신이 효과적인지 여부를 결정하는데, 그리고 임의의 최근 또는 이전의 감염을 확인하는데 사용된다. 본 개시에 따르면, 항체 역가는 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)에 의해 대상체에서 유도된 면역 반응의 강도를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 1 log까지 증가된다. 예를 들어, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 2.5, 또는 적어도 3 log까지 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 log까지 증가된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 1-3 log까지 증가된다. 예를 들어, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 1-1.5, 1-2, 1-2.5, 1-3, 1.5-2, 1.5-2.5, 1.5-3, 2-2.5, 2-3, 또는 2.5-3 log까지 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 2배 증가된다. 예를 들어, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 증가된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 2-10배 증가된다. 예를 들어, 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9, 또는 9-10배 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 반응은 hRSV, hMPV, 및/또는 hPIV3에 대한 혈청 중화 항체 역가의 기하평균비율(GMR)로 지칭되는, 기하평균역가(GMT)의 비율로 측정된다. 기하평균역가(GMT)는 모든 값을 곱하고 상기 수의 n제곱근을 취하여 계산된 대상체 그룹에 대한 평균 항체 역가이며, 상기 n은 사용 가능한 데이터를 가진 대상체의 수이다.
대조군은, 일부 구현예에서, 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)이 투여되지 않은 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가이다. 일부 구현예에서, 대조군은 재조합 또는 정제된 단백질 백신이 투여된 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가이다. 재조합 단백질 백신은 전형적으로 이종 발현 시스템(예를 들어, 박테리아 또는 효모)에서 생산되거나 다량의 병원성 유기체로부터 정제된 단백질 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 효과적인 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)의 능력은 뮤린 모델에서 측정된다. 예를 들어, 면역화 조성물은 뮤린 모델 및 중화 항체 역가의 유도에 대해 분석된 뮤린 모델에 투여될 수 있다. 바이러스 접종(challenge) 연구는 또한 본 개시의 백신의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역화 조성물은 뮤린 모델에 투여될 수 있고, 뮤린 모델은 바이러스로 접종되고, 뮤린 모델은 생존 및/또는 면역 반응(예를 들어, 중화 항체 반응, T 세포 반응(예를 들어, 사이토카인 반응))에 대해 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)의 유효량은 재조합 단백질 백신의 표준 치료 용량과 비교하여 감소된 용량이다. 본원에 제공된 바와 같은 "표준 치료"는, 의학적 또는 심리적 치료 지침을 지칭하고 일반적이거나 특이적일 수 있다. "표준 치료"는 주어진 병태의 치료에 관련된 의료 전문가 간의 과학적 증거 및 공동 작업을 기반으로 한 적절한 치료를 구체화한다. 의사/임상의가 특정 유형의 환자, 병 또는 임상 상황에 대해 따라야 하는 진단 및 치료 과정이다. 본원에 제공된 바와 같은 "표준 치료 용량"은 의사/임상의 또는 다른 의료 전문가가 호흡기 바이러스 감염 또는 관련된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 표준 치료 지침을 따르는 동안, 호흡기 바이러스 감염 또는 관련된 병태를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 투여하는 재조합 또는 정제된 단백질 백신, 또는 생약독화된 또는 불활성화된 백신, 또는 VLP 백신의 용량을 지칭한다.
일부 구현예에서, 면역화 조성물의 유효량이 투여된 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 재조합 또는 정제된 단백질 백신, 또는 생약독화된 또는 불활성화된 백신, 또는 VLP 백신의 표준 치료 용량이 투여된 대조군 대상체에서 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가와 동등하다.
백신 효능은 표준 분석을 사용하여 평가될 수 있다(예를 들어, Weinberg 등, J Infect Dis. 2010 Jun 1;201(11):1607-10 참조). 예를 들어, 백신 효능은 이중-맹검, 무작위화된, 임상 제어된 시험에 의해 측정될 수 있다. 백신 효능은 백신 미접종된(ARU)과 백신 접종된(ARV) 코호트 연구 간의 질환 발병률(AR)의 비례 감소로서 표현될 수 있고, 하기 공식을 사용하여 백신 접종된 군 간의 질환의 상대 위험도(RR)로부터 계산될 수 있다:
효능 = (ARU - ARV)/ARU x 100; 및
효능 = (1-RR) x 100.
마찬가지로, 백신 유효성은 표준 분석을 사용하여 평가될 수 있다(예를 들어, Weinberg 등, J Infect Dis. 2010 Jun 1;201(11):1607-10 참조). 백신 유효성은 (높은 백신 효능을 갖는 것으로 이미 입증될 수 있는) 백신이 모집단에서 질환을 얼마나 감소시키는지의 평가이다. 이러한 측정은 통제된 임상 시험에서보다 자연 현장 조건 하에서 백신 자체 뿐만 아니라 백신 접종 프로그램의 이점 및 역효과의 순 균형을 평가할 수 있다. 백신 유효성은 백신 효능(역가)에 비례하지만, 또한 모집단의 표적 그룹이 얼마나 면역화되었는지에 의해, 뿐만 아니라 입원, 외래 방문, 또는 비용의 "실사회" 결과에 영향을 주는 다른 비-백신-관련된 인자에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 일련의 감염된 사례 및 적절한 대조군 간의 백신 접종률을 비교하는 후향적 사례 대조군 분석이 사용될 수 있다. 백신 유효성은 백신 접종에도 불구하고 감염이 발병하는 경우 오즈비(OR)를 사용하여 비율 차이로서 표현될 수 있다:
유효성 = (1 - OR) x 100.
일부 구현예에서, 면역화 조성물(예를 들어, RNA 백신)의 효능은 백신 미접종 대조군 대상체에 비해 적어도 60%이다. 예를 들어, 면역화 조성물의 효능은 백신 미접종 대조군 대상체에 비해 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%일 수 있다.
살균 면역. 살균 면역은 숙주로의 효과적인 병원체 감염을 방지하는 독특한 면역 상태를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역화 조성물의 유효량은 적어도 1년 동안 대상체에서 살균 면역을 제공하기에 충분하다. 예를 들어, 본 개시의 면역화 조성물의 유효량은 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 대상체에서 살균 면역을 제공하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역화 조성물의 유효량은 대조군에 비해 적어도 5배 더 낮은 용량으로 대상체에서 살균 면역을 제공하기에 충분하다. 예를 들어, 유효량은 대조군에 비해 적어도 10배 낮은, 15배, 또는 20배 낮은 용량으로 대상체에서 살균 면역을 제공하기에 충분할 수 있다.
검출가능한 항원. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역화 조성물의 유효량은 투여 후 1-72시간에 대상체의 혈청에서 측정된 바와 같이 검출가능한 수준의 호흡기 바이러스 항원을 생성하기에 충분하다.
역가. 항체 역가는 대상체 내의 항체, 예를 들어, 특정 항원(예를 들어, 항-호흡기 바이러스 항원)에 특이적인 항체 수의 측정이다. 항체 역가는 전형적으로 양성 결과를 제공하는 최대 희석액의 역수로 표시된다. 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 예를 들어 항체 역가를 측정하기 위한 일반적인 분석법이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역화 조성물의 유효량은 투여 후 1-72시간에 대상체의 혈청에서 측정된 바와 같이 호흡기 바이러스 항원에 대한 중화 항체에 의해 생산된 1,000-10,000의 중화 항체 역가를 생성하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 유효량은 투여 후 1-72시간에 대상체의 혈청에서 측정된 바와 같이 호흡기 바이러스 항원에 대한 중화 항체에 의해 생산된 1,000-5,000의 중화 항체 역가를 생성하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 유효량은 투여 후 1-72시간에 대상체의 혈청에서 측정된 바와 같이 호흡기 바이러스 항원에 대한 중화 항체에 의해 생산된 5,000-10,000의 중화 항체 역가를 생성하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 중화 항체 역가는 적어도 100 NT50이다. 예를 들어, 중화 항체 역가는 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 NT50일 수 있다. 일부 구현예에서, 중화 항체 역가는 적어도 10,000 NT50이다.
일부 구현예에서, 중화 항체 역가는 밀리리터 당 적어도 100 중화 단위(NU/mL)이다. 예를 들어, 중화 항체 역가는 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 NU/mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 중화 항체 역가는 적어도 10,000 NU/mL이다.
일부 구현예에서, 대상체 내 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 1 log 만큼 증가된다. 예를 들어, 대상체 내 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 log 만큼 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체 내 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 2배 증가된다. 예를 들어, 대상체 내 생산된 항-호흡기 바이러스 항원 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 증가된다.
일부 구현예에서, n 수의 곱의 n제곱근 기하 평균은 비례 성장을 기술하는 데 일반적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 기하 평균은 대상체 내 생산된 항체 역가를 특성화하는 데 사용된다.
대조군은 예를 들어, 백신 미접종 대상체, 또는 바이러스 약독화 생백신, 불활성화된 바이러스 백신, 또는 단백질 서브유닛 백신을 투여받은 대상체일 수 있다.
실시예
야생형 hRSV F 당단백질에 대한 상이한 특징(예를 들어, 변형)의 효과를 조사하였다. 도 1은 본원에 기술된 F 단백질과 RSV F 변이체를 암호화하는 야생형 mRNA 간의 차이를 예시하는 모식도이다. RSV F 변이체는 세포질 꼬리가 없는 것 외에도, 인터프로토머 이황화물 안정화 돌연변이 및 공동-충전(cavity-filing) 돌연변이를 포함하는 코돈-최적화된, 막-고정된, 단일 사슬 mRNA이다.
실시예 1 - mRNA 스크리닝: 독립적인 특징
세포 상에서 RSV F 당단백질의 융합 전 형태가 증가함에 따라 동물에서 면역원성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이 실시예에서, 다양한 mRNA가 상이한 특징(예를 들어, 상이한 코돈 최적화 전략, 돌연변이, 특정 변형, 구조적 변화) 및 결과적인 발현 수준에 미치는 영향을 시험하도록 디자인되었다.
HEK293T 세포를 다양한 농도의 상이한 mRNA로 형질감염시켰다. 세포 표면 융합 전 RSV F 당단백질은 융합 전 RSV F 당단백질(AM14)에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 24시간 및 48시간 후에 검출되었다. 도 2a에 제시된 결과는, 시험된 2가지의 특징인 코돈 최적화 및 세포질 꼬리 절단("dCT")이 세포 표면 융합 전 RSV F 당단백질에서 가장 큰 증가를 생성하였음을 입증한다. 예를 들어, 48시간 그룹에서 2가지 특징은 20 ng의 농도에서 대조군(2가지 특징을 포함하지 않는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA)보다 15-31배 증가하는 것으로 입증되었다. 이 결과는 또한 5 ng만큼 낮은 농도에서도 나타났다(도 2b).
코돈-최적화된 mRNA 및 세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA를 생체내에서 스크리닝하였다. 8주령 BALB/c 마우스(그룹당 n=8)에 지질 나노입자(예를 들어, 0.5-15%의 PEG-변형된 지질; 5-25%의 비-양이온성 지질; 25-55%의 스테롤; 및 20-60%의 이온화 가능한 양이온성 지질) 내 제형화된 후보 mRNA를 근육내(IM)로 투여하였다. mRNA를 3주 간격으로 투여하고, 혈청을 각각의 투여 후에 수집하였다. F 당단백질에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA로 결정하였다. 2회 용량 후(2회 용량 후에서, "PD2"), 융합 후 F-특이적 IgG 역가를 측정하였다. 코돈-최적화된 mRNA 및 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA는 대조군(2가지 특징을 포함하지 않는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA)보다 각각 2-3배 더 높고, 2-4배 더 높은 역가를 나타내었다(도 3a).
또한, RSV 중화 역가는 미세중화 분석을 사용하여 제2 용량(PD2) 후에 측정하였다. 개별 마우스 혈청은 하기 절차를 사용하여 RSV-A(Long 균주)의 중화에 대해 평가하였다:
1. 모든 혈청 샘플은 30분 동안 56℃로 설정된 건조 배스 인큐베이터에 위치시킴에 의해 열 불활성화시켰다. 이후, 샘플 및 대조군 혈청을 바이러스 희석액(EMEM 중 2% FBS)에서 1:3으로 희석하고, 2회 반복 샘플을 검정 플레이트에 첨가하고 연속적으로 희석하였다.
2. RSV-Long 스톡 바이러스를 냉동고에서 제거하고, 37℃ 워터 배스에서 신속하게 해동시켰다. 바이러스는 바이러스 희석액에서 2000 pfu/mL로 희석하였다.
3. 희석된 바이러스는 한 컬럼의 세포를 제외하고는, 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
4. HEp-2 세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 바이러스 희석액에 1.5 x 105개 세포/ml로 재현탁시키고, 100 mL의 현탁된 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 세척하고, PBS에 용해된 80% 아세톤을 사용하여 16-24℃에서 10-20분 동안 고정시켰다. 고정제를 제거하고 플레이트를 공기-건조시켰다.
6. 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈으로 철저히 세척하였다. 검출 단클론성 항체, 143-F3-1B8 및 34C9를 2.5로 희석한 다음 플레이트를 PBS + 0.05%로 철저히 세척하고, 이후 50 플레이트를 PBS + 0.으로 96-웰 플레이트의 웰을 철저히 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 로커 상에서 60-75분 동안 16-24℃의 습한 챔버에서 인큐베이션하였다.
7. 인큐베이션한 후, 플레이트를 철저히 세척하였다.
8. 비오틴화된 말 항-마우스 IgG를 분석 희석액에서 1:200으로 희석하고, 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 상기와 같이 인큐베이션하고 세척하였다.
9. IRDye 800CW 스트렙트아비딘(1:1000 최종 희석), Sapphire 700(1:1000 희석) 및 5mM DRAQ5 용액(1:10,000 희석)의 칵테일을 분석 희석액에서 제조하고, 50 mL의 칵테일을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암(dark) 상태에서 상기와 같이 인큐베이션하고, 세척하고, 공기 건조시켰다.
10. 그런 다음 Aerius Imager를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 이후, 혈청 중화 역가는 Graphpad Prism에서 4개 매개변수 곡선 피팅을 사용하여 계산하였다.
2회 용량 후(PD2) 측정된 마우스 면역원성 연구에 대한 혈청 중화 항체 역가는 도 3b에 나타내었다. 코돈-최적화된 mRNA 및 세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA는 대조군 역가 수준의 1-3배 및 2-40배를 보이고, 이는 중화 항체 역가가 강력함을 나타낸다. 따라서, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서, 2개의 mRNA가 RSV F 당단백질 및 RSV-A 중화 역가의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 2 - mRNA 스크리닝: 2가지 특징
코돈-최적화 및 세포질 꼬리 절단 모두 RSV F 단백질의 발현 및 결과적인 면역원성을 개선하는 것으로 나타났으므로, 동일한 mRNA에서 두 특징의 조합을 시험하였다("RSV F 변이체"). 시험관내 실험에서, HEK293T 세포는 시험된 특징의 상이한 조합을 갖는 20 ng 또는 200 ng의 mRNA로 형질감염시켰다. 각 특징을 개별적으로 포함하는 MRNA를 또한 스크리닝하였다. 세포 표면 융합 전 RSV F 당단백질은 융합 전 RSV F 당단백질(AM14)에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 24시간 및 48시간 후에 검출하였다. 코돈-최적화 및 세포질 꼬리 절단의 조합은 대조군(2가지 특징을 포함하지 않는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA)에 비해 5-50배 더 높은 RSV F 당단백질 발현 수준을 야기하는 것으로 확인되었다. 단독으로 또는 서로 조합된 다른 특징 중 어느 것도, 상기 선택된 조합이 한 수준으로 RSV F 당단백질을 생성하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
사용된 대조군 RSV F-암호화된 단백질은 하기와 같다: Ctrl1은 야생형 RSV F 당단백질에 비해 F1 영역에서 4개의 아미노산 돌연변이를 함유하고(도 1), 아미노산 103과 145 사이의 결실을 함유하지 않는다. 결과적으로, Ctrl1은 야생형 퓨린 절단 부위를 포함하고 세포질 도메인을 보유한다. 또 다른 대조군 변이체인 Ctrl2는 도 1에 나타낸 RSV F 변이체로부터 유래되지만, C 말단 결실이나 다른 RNA 최적화 및 향상을 포함하지 않는다.
그런 다음 RSV F 변이체를 추가로 스크리닝하였다. RSV F 당단백질의 시험관내 발현은 500 ng의 mRNA RSV F 변이체, 대조군 mRNA로 형질감염된, 또는 mRNA가 없는(음성 대조군) HEK293T 세포에서 측정하였다. 그런 다음, 24시간, 48시간 및 72시간 후, RSV F 당단백질의 수준을 유세포 분석기로 측정하였다. RSV F 당단백질을 측정하기 위해 3가지 상이한 항체를 사용하였다: AM14 및 D25(RSV F 당단백질의 융합 전 형태에 특이적인 항체임) 및 SYNAGIS®/모타비주맙(RSV F 당단백질의 융합 전 및 융합 후 형태에 공통적인 에피토프에 관한 것임). 도 4a는 RSV F 변이체가 융합 전 형태로 정확하게 폴딩된 RSV F 당단백질을 생성하고, 또한 대조군과 비교하여 더 높고 더 긴 발현 수준을 나타냄을 입증한다. 또한, 도 5a 및 5b는 발현 경향이 HEK293T 세포에 제한되지 않고, THP-1 세포(인간 단핵구 세포주)에서 수행될 때 유지된다는 것을 입증한다.
추가 실험에서, 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 200 ng의 mRNA(RSV F 변이체, 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA, RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA, Ctrl1 및 Ctrl2 mRNAs, 또는 mRNA 없음)로 형질감염시킨 후 48시간 후에 HEK293T 세포에서 RSV F 당단백질의 시험관내 발현을 비교하였다. RSV F 변이체는 코돈-최적화된 mRNA 및 세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 단백질을 암호화하는 mRNA에 비해 적어도 부가적인 발현 수준을 나타내었다(도 4b).
인간 말초혈액 단핵세포(huPBMC)에서 RSV F 당단백질의 시험관내 발현을 조사하였다. HuPBMC를 1 x 106개 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 그런 다음 1000 ng의 mRNA(RSV F 변이체 또는 2가지 특징을 포함하지 않는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 세포를 AM14-FITC(RSV F 단백질의 융합 전 형태를 표적화함), D25-PE(RSV F 단백질의 융합 전 형태를 표적화함) 또는 모타비주맙-APC(RSV F 단백질의 융합 전 및 융합 후 형태에 공통적인 에피토프를 표적화함)로 염색하였다. 대조군 mRNA 및 형질감염되지 않은 세포와 관련하여 RSV F 단백질의 더 높은 수준이 사용된 항체에 관계없이, 24시간 시점 및 48시간 시점 모두에서 관찰되었다(도 7).
인간 간암 HeP3B(HeP3B) 세포에서 변이체 RSV F mRNA의 시험관내 발현을 조사하였다. HeP3B 세포를 24웰 플레이트에 플레이팅하고, 500 ng, 100 ng 또는 20 ng의 mRNA로 형질감염시켰다. 플레이트를 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, RSV F 단백질의 융합 전 형태를 표적으로 하여 AM14-FITC로 세포를 염색하였다. 각각의 개별 특징(예를 들어, 코돈-최적화된 mRNA 및 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA)을 갖는 mRNA와 관련하여 RSV F 변이체(코돈 최적화 및 세포질 꼬리 절단)와 함께 인큐베이션한 후 더 높은 수준의 RSV F 단백질을 관찰하였다. 대조군 mRNA(2가지 특징을 포함하지 않는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA), 및 형질감염되지 않은 세포("mRNA 없음")는 특히 48시간 및 시험된 가장 낮은 용량에서 RSV F 변이체보다 낮은 발현 수준을 나타내었다(도 8). 현미경 실험에서, HeLa 세포에서 발현 경향이 일치함을 확인하였다. HeLa 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅한 다음 200 ng의 mRNA(RSV F 변이체, RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA, 절단된 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 mRNA, 2가지 특징을 포함하지 않는 대조군 mRNA)로 형질감염시키거나, (음성 대조군으로서) mRNA를 사용하지 않았다. 플레이트를 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션한 다음, 4% PFA/PBS에서 15분 동안 고정하고 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 플레이트의 절반을 0.5% Triton-X에 5분 동안 투과시킨 후, PBS로 2회 세척하였다. 이후, 세포를 실온에서 30분 동안 1% BSA/PBS로 차단하였다. 그런 다음, 1차 항체인 항-RSV 항체(D25, Cambridge Bio)(1% BSA/PBS에 1:100으로 희석됨)를 1시간 동안 적용한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후, 플레이트를 1% BSA로 10분 동안 차단하였다. 2차 항체를 30분 동안 적용한 후(BSA/PBS에 1:2000으로 희석됨), 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다. 이후, NucBlue Fixed와 CellMask Red를 30분 동안 적용한 후 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 생성된 플레이트를 ALEXA488™을 사용하여 단백질 발현에 대해 측정하였다. 평균 형광 강도는 세포질 분할을 기반으로 세포 당 측정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, RSV F 변이체(세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA)는 가장 높은 수준의 RSV F 단백질을 산출하였다. 대조군과 RSV F 변이체 간의 차이는 약 2배인 것으로 확인되었다.
실시예 3 - 생체내 면역원성 연구(마우스)
그런 다음 RSV F 변이체(세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA)를 생체내에서 평가하였다. 8주령 BALB/c 마우스(그룹당 n=8)는 지질 나노입자(예를 들어, 0.5-15%의 PEG-변형된 지질; 5-25%의 비-양이온성 지질; 25-55%의 스테롤; 및 20-60%의 이온화 가능한 양이온성 지질) 내 제형화된 RSV F 변이체 또는 대조군 mRNA를 이용하여 근육내(IM)로 면역화시켰다. mRNA는 3주 간격으로 투여하였고, 혈청을 각각의 면역화 후에 수집하였다. F 당단백질에 대한 혈청 항체 역가는 ELISA로 측정하였다. 1차 및 2차 용량 후, 융합 후 F-특이적 IgG 역가를 측정하였다. RSV F 변이체는 저용량(200 ng)에서 대조군(RSV F 당단백질을 암호화하는 대안적인 mRNA)의 적어도 3-5배의 역가를 보였다(도 6a 및 6b).
혈청 샘플에서 HRSV-특이적 중화 항체를 검출하기 위해 HRSV-A 바이로스팟 검정을 수행하였다. 간략하게, 샘플은 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 불활성화시켰다. 후속적으로, 샘플의 연속 2배 희석은 1:8의 희석(1:16의 시험에서 제1 혈청 희석)으로 시작하여 96-웰 플레이트에서 3회 반복으로 감염 배지에서 제조하였다. 그런 다음 샘플 희석액을 37℃에서 1시간 동안 고정된 양의 HRSV-A와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 바이러스-항체 혼합물을 HEp-2 세포 배양 단층을 갖는 플레이트로 옮겼다. 37℃에서 1일 동안 인큐베이션한 후, 단층을 고정하고 염색하였다. 배양 상층액을 제거하고, 단층을 PBS로 1회 세척한 후 50%/50% 메탄올/에탄올로 고정하였다. 고정 후, 플레이트를 HRSV-A에 대한 마우스 단클론성 항체, 2차 HRP-표지된 항-마우스 항체 및 TrueBlue를 사용하여 염색하였다. IMMUNOSPOT® 분석기를 사용하여 염색된 플레이트를 스캔하고, 50% 플라크 감소 역가를 Zielinska 등에 의해 기술된 공식으로 계산하였다(Zielinska, Virology Journal 2005; 2(84): 1-5):
X = (a-b)(e-c)/(c-d) + a
식 중: X = 중화 결과
a = log10의 희석 초과의 50% 감소점
b = log10의 희석 미만의 50% 감소점
c = 평균 SC 초과의 50% 감소점(a와 상응함)
d = 평균 SC 미만의 50% 감소점(b와 상응함)
e = 평균 바이러스 대조군 수의 50% 감소 값.
실시예 4 - 생체내 면역원성 연구(랫트)
그런 다음 RSV F 변이체(세포질 꼬리 절단을 갖는 RSV F 당단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 mRNA)를 코튼 랫트에서 생체내 평가하였다. 연구는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 코튼 랫트 모델에서 mRNA 백신의 면역원성, 효능 및 안전성을 평가하는 것을 목표로 하고, 접종 후 검출가능한 바이러스 복제를 허용하는 차선의 중화 항체 역가를 유도하는 것을 포함한, 용량 수준의 범위에 걸쳐 백신-강화된 호흡기 질환(ERD)에 대한 잠재성의 평가를 포함한다.
RSV F 변이체 또는 대조군 mRNA는 지질 나노입자(예를 들어, 0.5-15%의 PEG-변형된 지질; 5-25%의 비-양이온성 지질; 25-55%의 스테롤; 및 20-60%의 이온화 가능한 양이온성 지질) 내 제형화되었다. 지질 나노입자의 성분은 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(6-옥소-6(운데실옥시)헥실)아미노)옥타노에이트(화합물 1); 1,2-디미리스토일-racn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜(PEG2000-DMG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 및 콜레스테롤을 포함한다.
암컷 코튼 랫트(6-8주령)는 10마리 동물의 14개 그룹과 4마리 동물의 대조군 그룹으로 나누었다. 랫트는 하기 표 2에 나타낸 일정에 따라 면역화하였다. 그룹 1-13은 동물 당 100 μL 용량의 mRNA-LNP 조성물을 이용하여 근육내로 면역화시켰고; 그룹 14는 동물 당 105 플라크 형성 단위(PFU)로 100 μL 용량의 RSV/A2를 이용하여 비강내로 감염시켰다. 일부 그룹은 2회(0일 및 28일) 면역화시킨 반면, 다른 그룹은 표 2에 나타낸 바와 같이 0일에만 면역화시켰다. 56일째, 마우스는 0.1 mL의 5.0 log10 RSV/A2의 비강내 투여로 접종하였다. 61일째, 동물을 희생시키고, 코 조직은 바이러스 적정 측정을 위해 수확하고, 폐는 일괄적으로 수확하여 3등분하였으며; 바이러스 적정을 위한 좌측 섹션, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위한 설측(lingular) 엽, 그리고 우측 섹션은 팽창시켜 강화된 RSV 질환(ERD) 및 호산구 증가증에 대한 조직병리학을 위해 사용하였다.
표 2. 코튼 랫트 연구 개요
Figure pct00012
분석을 위해 RSV/A2 폐 및 코 바이러스 적정을 수행하였다. 폐 및 코 균질물을 원심분리에 의해 정화하고, 이글의 최소필수배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM)에 희석하였다. 융합성(confluent) Hep-2 세포 단층을 24웰 플레이트에서 희석된 균질액으로 2회 반복으로 감염시켰다. 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로오스 배지로 오버레이하였다. 인큐베이션 4일 후, 오버레이를 제거하고, 세포를 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 고정한 다음 헹구고 공기 건조시켰다. 플라크를 계수하고 바이러스 역가를 조직 그램 당 플라크 형성 단위로 표현하였다. 바이러스 역가는 그룹의 모든 동물에 대한 기하학적 평균 + 표준 오차로서 계산되었다.
실시예 3에 기술된 바와 같이 혈청 샘플에서 HRSV-특이적 중화 항체를 검출하기 위해 HRSV-A 바이로스팟 검정을 수행하였다.
RSV-F 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 수행하여 동물의 혈청에 존재하는 항체 역가를 결정하였다. 간략하게, 96-웰 미세역가 플레이트를 1ug/mL의 융합 전 RSV-F 단백질로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20으로 4회 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 차단하였다(SuperBlock- Pierce #37515). 세척 후, 코튼 랫트 혈청의 연속 희석액을 첨가하였다(분석 희석액은 PBS + 5% 염소 혈청임). 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, HRP-접합된 닭 항-코튼 랫트 IgG(ICL #CCOT-25P)를 분석 희석액에 1:10,000 희석액으로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척하였다. 결합된 항체는 TMB 기질(SeraCare #5120-0077)로 검출하였다. TMB 정지 용액(SeraCare #5150-0021)을 첨가하여 반응을 정지시키고, OD450nm에서 흡광도를 측정하였다. 역가는 GraphPad Prism에서 4개-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 사용하여 결정되었으며, 대략 OD450nm = 1.0에서 역수 희석(reciprocal dilution)으로서 정의되었다.
상기 RSV 항체 역가를 도 11a-11b에 나타내었다. RSV F 변이체(코돈-최적화되고 절단된 세포질 꼬리)는 용량-의존성 RSV 중화 항체(도 10a) 및 RSV 융합 전 F 단백질-특이적 IgG 결합 항체(도 10b)를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 접종 후 폐(도 11a) 및 코(도 11b) 바이러스 부하량은 RSV F 변이체가 (특히, 더 높은 프라임 용량 및 부스터 용량에서의) 접종으로부터 코튼 랫트를 보호함을 입증하였다.
서열 목록
야생형 RSV F 당단백질
Figure pct00013
본원에 기술된 mRNA 서열 중 임의의 것이 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. UTR 서열은 하기 서열로부터 선택되거나, 다른 공지된 UTR 서열이 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 mRNA 중 임의의 것이 폴리(A) 꼬리 및/또는 캡(예를 들어, 7mG(5')ppp(5')NlmpNp)을 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 추가로, 본원에 기술된 다수의 mRNA 및 암호화된 항원 서열은 신호 펩티드 및/또는 펩티드 태그(예를 들어, C-말단 His 태그)를 포함하지만, 표시된 신호 펩티드 및/또는 펩티드 태그가 다른 신호 펩티드 및/또는 펩티드 태그로 대체될 수 있거나, 신호 펩티드 및/또는 펩티드 태그가 생략될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 기재된 임의의 mRNA 서열은 완전히 또는 부분적으로 화학적으로 변형(예를 들어, N1-메틸슈도우리딘에 의해) 될 수 있음을 추가로 이해해야 한다. 하기 표 1에서, 서열번호는 비변형된/N1-메틸슈도우리딘에 의해 완전히 변형된 것으로 제공된다.
Figure pct00014
표 1.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
* 표 1에 기재된 오픈 리딩 프레임 및/또는 상응하는 아미노산 서열 중 임의의 하나는 신호 서열을 포함하거나 제외할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 신호 서열은 상이한 신호 서열, 예를 들어, 서열번호 18-34 중 임의의 하나로 대체될 수 있음을 이해해야 한다.
등가물
본원에 개시된 모든 참조, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서의 전체를 포함할 수 있다.
상기 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 바와 같이, 부정관사 "한(a)" 및 "하나의(an)"는 명백하게 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 명백하게 반대로 표시되지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에 있어서, 상기 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 상기 방법의 단계 또는 행위가 인용되는 순서로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
청구항에서 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 전환 어구(transitional phrase), 예컨대 "포함하는", "비롯한", "동반하는", "갖는", "함유하는", "포괄하는", "보유하는", "구성된" 등은 개방형으로, 즉, 포함하나 이에 제한되지 않는 의미로 이해되어야 한다. 단지 상기 전환 어구 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"은 미국 특허청의 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전환 어구일 수 있다.
선행하는 수치의 용어 "약" 및 "실질적으로"는 인용된 수치의 평균 ± 10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상단과 하단 사이 및 이를 포함하는 각 값이 본원에 구체적으로 고려되고 기술된다.
국제출원번호 PCT/US2015/02740호, PCT/US2016/043348호, PCT/US2016/043332호, PCT/US2016/058327호, PCT/US2016/058324호, PCT/US2016/058314호, PCT/US2016/058310호, PCT/US2016/058321호, PCT/US2016/058297호, PCT/US2016/058319호, 및 PCT/US2016/058314호의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ModernaTX, Inc. <120> RESPIRATORY VIRUS IMMUNIZING COMPOSITIONS <130> M1378.70143WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/967,888 <151> 2020-01-30 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Thr Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala 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Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 460 Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Ala Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln 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Claims (101)

  1. 세포질 꼬리가 없고 야생형 hRSV F 당단백질에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 hRSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산(RNA)을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 20-30개, 20-25개, 15-30개, 15-25개, 15-20개, 10-30개, 10-25개, 10-20개, 10-15개, 5-30개, 5-25개, 5-20개, 또는 5-15개의 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 25개의 아미노산, 20개의 아미노산, 15개의 아미노산, 또는 10개의 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 하기 C-말단 아미노산으로 구성되는 것인, 조성물:
    CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 25); TPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 26); SKDQLSGINNIAFSN (서열번호 27); 또는 SGINNIAFSN (서열번호 28).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, P102X 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149X 치환, S155X 치환, S190X 치환, V207X 치환, S290X 치환, L373X 치환, I379X 치환, M447X 치환, 및 Y458X 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하고, 상기 X는 임의의 아미노산인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기 변형: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 hRSV F 당단백질은 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 7의 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 15의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 7mG(5')ppp(5')NlmpNp 캡을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 선택적으로 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 화학적 변형을 포함하는 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 완전히 변형된 것인, 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 화학적 변형은 1-메틸슈도우리딘인, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 25 μg - 200 μg의 hRSV RNA를 포함하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-변형된 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 지질의 혼합물을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 지질의 혼합물은 0.5-15 몰%의 PEG-변형된 지질; 5-25 몰%의 비-양이온성 지질; 25-55 몰%의 스테롤; 및 20-60 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 것인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 지질의 혼합물은 1-5 몰%의 PEG-변형된 지질; 10-20 몰%의 비-양이온성 지질; 35-45 몰%의 스테롤; 및 40-50 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 것인, 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 PEG-변형된 지질은 1,2 디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜(PEG2000 DMG)이고, 상기 비-양이온성 지질은 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤이며; 상기 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1의 구조를 갖는 것인, 조성물:
    Figure pct00019
    (화합물 1).
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질의 혼합물은 지질 나노입자를 형성하는 것인, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 지질 나노입자 내 제형화되는 것인, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 포유동물 세포로 상기 조성물의 전달 후 적어도 24시간에 대조군 수준보다 적어도 5배 더 높은 수준으로 hRSV F 당단백질의 융합 전 형태의 세포 표면 발현을 야기하는 것인, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 포유동물 세포로 상기 조성물의 전달 후 적어도 48시간에 대조군 수준보다 적어도 50배 더 높은 수준으로 hRSV F 당단백질의 안정화된 융합 전 형태의 세포 표면 발현을 야기하는 것인, 조성물.
  31. 대상체에서 hRSV에 대한 중화 항체 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체는 면역손상된 것인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 대상체는 폐질환을 갖는 것인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 5세 이하인, 방법.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 65세 이상인, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 안정화된 융합 전 형태(conformation)로 폴딩되는 것인, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 24시간 투여 후 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 대조군에 비해 적어도 5배 더 높은 수준으로 대상체에서 발현되는 것인, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 48시간 투여 후 상기 RSV F 당단백질 변이체는 대조군에 비해 적어도 50배 더 높은 수준으로 대상체에서 발현되는 것인, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 대조군에 비해 적어도 24시간 이상 동안 대상체에서 발현되는 것인, 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중화 항체 반응은 대조군에 비해 적어도 5배 더 낮은 조성물의 용량을 사용하여 대상체에서 유도되는 것인, 방법.
  42. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 기준선, 야생형 RSV F 당단백질을 암호화하는 RSV RNA의 투여, 또는 세포질 꼬리를 갖는 RSV F 당단백질의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하는 RSV RNA의 투여인 것인, 방법.
  43. 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 메신저 리보핵산(mRNA).
  44. 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 메신저 리보핵산(mRNA).
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 mRNA는 세포질 꼬리가 없는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산 F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 전장 야생형 RSV F 당단백질에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 것인, mRNA.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임은 서열번호 7의 서열을 포함하는 것인, mRNA.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 서열번호 15의 서열을 포함하는 것인, mRNA.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자 내 제형화되는 것인, mRNA.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 0.5-15 %의 PEG-변형된 지질; 5-25 %의 비-양이온성 지질; 25-55 %의 스테롤; 및 20-60 %의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 것인, mRNA.
  50. 제49항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 1-5 몰%의 PEG-변형된 지질; 10-20 몰%의 비-양이온성 지질; 35-45 몰%의 스테롤; 및 40-50 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 것인, mRNA.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-변형된 지질은 1,2 디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜(PEG2000 DMG)이고, 상기 비-양이온성 지질은 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤이며; 상기 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1의 구조를 갖는 것인, mRNA:
    Figure pct00020
    (화합물 1).
  52. 세포질 꼬리가 없는 RSV F 당단백질 변이체의 안정화된 융합 전 형태를 암호화하고, 상기 RSV F 당단백질 변이체는 전장 야생형 RSV F 당단백질에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(hRSV) 리보핵산(RNA);
    hMPV F 당단백질을 암호화하는 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) RNA; 및
    hPIV3 F 당단백질을 암호화하는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(hPIV3) RNA
    를 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 20-30개, 20-25개, 15-30개, 15-25개, 15-20개, 10-30개, 10-25개, 10-20개, 10-15개, 5-30개, 5-25개, 5-20개, 또는 5-15개의 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 C-말단 25개의 아미노산, 20개의 아미노산, 15개의 아미노산, 또는 10개의 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 세포질 꼬리는 hRSV F 당단백질 변이체의 하기 C-말단 아미노산으로 구성되는 것인, 조성물:
    CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 25); TPVTLSKDQLSGINNIAFSN (서열번호 26); SKDQLSGINNIAFSN (서열번호 27); 또는 SGINNIAFSN (서열번호 28).
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, P102X 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149X 치환, S155X 치환, S190X 치환, V207X 치환, S290X 치환, L373X 치환, I379X 치환, M447X 치환, 및 Y458X 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함하고, 상기 X는 임의의 아미노산인, 조성물.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 hRSV F 당단백질 변이체는, 야생형 hRSV F 당단백질에 비해, 하기 변형: P102A 치환, 링커 분자를 갖는 아미노산 104-144의 치환, A149C 치환, S155C 치환, S190F 치환, V207L 치환, S290C 치환, L373R 치환, I379V 치환, M447V 치환, 및 Y458C 치환을 추가로 포함하는 것인, 조성물:.
  59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 hRSV F 당단백질은 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 hRSV F 당단백질 변이체는 서열번호 8의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 7의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것인, 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 7의 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 것인, 조성물.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 15의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 hRSV RNA는 서열번호 15의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  68. 제52항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hMPV F 당단백질은 서열번호 11의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 hMPV F 당단백질은 서열번호 11의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  70. 제52항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 10의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 10의 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 16의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 hMPV RNA는 서열번호 16의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  76. 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hPIV3 F 당단백질은 서열번호 14의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 hPIV3 F 당단백질은 서열번호 14의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  78. 제52항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 13의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 13의 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 것인, 조성물.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 2의 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 4의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 17의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 hPIV3 RNA는 서열번호 17의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  84. 제52항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 7mG(5')ppp(5')NlmpNp 캡을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  85. 제52항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 선택적으로 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  86. 제52항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 화학적 변형을 포함하는 것인, 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA는 완전히 변형된 것인, 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 화학적 변형은 1-메틸슈도우리딘인, 조성물.
  89. 제52항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 25 μg - 200 μg의 hRSV RNA, hMPV RNA, 및/또는 hPIV3 RNA를 포함하는, 조성물.
  90. 제52항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-변형된 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 지질의 혼합물을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 지질의 혼합물은 0.5-15 %의 PEG-변형된 지질; 5-25 %의 비-양이온성 지질; 25-55 %의 스테롤; 및 20-60 %의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 것인, 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 1-5 몰%의 PEG-변형된 지질; 10-20 몰%의 비-양이온성 지질; 35-45 몰%의 스테롤; 및 40-50 몰%의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는, 조성물.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 PEG-변형된 지질은 1,2 디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜(PEG2000 DMG)이고, 상기 비-양이온성 지질은 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤이며; 상기 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1의 구조를 갖는 것인, 조성물:
    Figure pct00021
    (화합물 1).
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질의 혼합물은 지질 나노입자를 형성하는 것인, 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 상기 hRSV RNA, hMPV RNA, 및 hPIV3 RNA는 지질 나노입자 내 제형화되는 것인, 조성물.
  96. 대상체에서 hRSV, hMPV, 및/또는 hPIV3에 대한 중화 항체 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 제52항 내지 제95항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 대상체는 면역손상된 것인, 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 대상체는 폐질환을 갖는 것인, 방법.
  99. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 5세 이하인, 방법.
  100. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 65세 이상인, 방법.
  101. 제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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