KR20220038365A - Mrna-로딩된 지질 나노입자의 안정한 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

Mrna-로딩된 지질 나노입자의 안정한 조성물 및 제조 방법 Download PDF

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KR20220038365A
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Abstract

본 발명은 mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 제조하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 뛰어난 안정성을 갖는 mRNA-LNP를 제공하며, 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 LNP가 필요한 경우에 특히 유용하다.

Description

MRNA-로딩된 지질 나노입자의 안정한 조성물 및 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 23일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/877,597호의 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
전령 RNA 요법(MRT)은 다양한 질환의 치료에 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. MRT는 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 생산하기 위한 요법을 필요로 하는 환자에게 전령 RNA(mRNA)를 투여하는 것을 포함한다. 지질 나노입자는 mRNA의 효율적인 생체 내 전달을 위해 mRNA를 캡슐화하는 데 일반적으로 사용된다.
지질 나노입자를 사용하여 mRNA의 생체 내 전달 및/또는 발현을 향상시킬 수 있는 개선된 방법 및 조성물을 개발하기 위한 많은 노력이 이루어졌는데, 이는 확장 가능하고 비용 효율적인 제조 공정에 적용될 수 있다. 동시에, mRNA의 생체 내 전달 및/또는 발현에 대한 이러한 임의의 강화가 지질 매개 mRNA 전달과 관련된 조성물의 안전성 및 내약성을 유지하거나 개선한다는 것도 중요하다.
본 발명은, 무엇보다도, mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 제조하기 위한 더 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 앞서, PEG-변형 지질은 일반적으로 지질 나노입자(LNP) 제형에 포함되었는데, 이는 이들이 보관 안정성 및 생체 내 순환 시간을 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문이다. 반면, PEG-변형 지질은 무엇보다도 항-PEG 항체를 생산함으로써 가속화된 혈중 소실(accelerated blood clearance; ABC) 및/또는 선천 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, PEG-변형 지질이 없는 mRNA-LNP를 제조하기 위한 시도가 이루어졌다. 그러나, PEG-변형 지질 또는 PEG의 부재 하에 형성된 mRNA-로딩된 LNP는 특히 냉동 및 해동 후 크고 불안정한 크기를 갖거나, 침전되는 경향이 있으며, 이는 상기 LNP를 치료 용도에 부적합하게 만든다는 것이 관찰되었다. 본 발명은, 폴록사머와 같은 양친매성 블록 공중합체의 존재 하에 mRNA와 지질을 혼합함으로써 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 예상 외로 안정한 mRNA-로딩된 LNP를 제조할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 이하에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 mRNA-LNP는 통상적인 양의 PEG-변형 지질을 함유하는 종래의 LNP와 유사한 크기를 가지며, 보다 중요하게는, 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 안정적이다. 특히, 본 발명에 따른 mRNA-LNP는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 50% 이내에서, 일부 경우에는 10% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 또한, 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는(예를 들어, 0.5% 미만의 PEG-변형 지질을 포함하는) 폴록사머로 차폐된 LNP는 종래의 LNP(예를 들어, 5%의 PEG-변형 지질을 포함하는)와 유사한 생체 내 단백질 발현 프로파일을 달성하였다. 따라서, 본 발명은 뛰어난 안정성을 갖는 추가로 개선된 mRNA-LNP를 제공하며, 예를 들어, 항-PEG 항체의 생성 및/또는 ABC를 회피하기 위해 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 LNP가 바람직한 경우에 특히 유용하다.
일 양태에서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물을 제공하며, 여기서 지질 나노입자 각각은 하나 이상의 양이온성 지질 및 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함하고, 1회 이상의 동결 해동 후에 안정하다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 비-양이온성 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질로서의 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 및 약 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질로서의 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE), 및 약 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 50% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 40% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 30% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 20% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 10% 이내에서 평균 직경을 유지한다. 일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 5% 이내에서 평균 직경을 유지한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 50% 내지 99%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 60% 내지 90%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 60%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 70%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 80%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 90%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.4% 이하의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.3% 이하의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.2% 이하의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.1% 이하의 PEG-변형 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 PEG-변형 지질을 실질적으로 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 2.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 2% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 1.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 1% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.05% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로 0.05% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로 0.04% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로 0.03% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로 0.02% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 양친매성 블록 공중합체의 잔류물을 포함한다.
일부 구현예에서, 적합한 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머이다.
일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 84이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 101이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 105이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 108이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 122이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 123이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 124이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 181이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 182이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 183이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 184이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 185이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 212이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 215이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 217이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 231이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 234이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 235이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 237이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 238이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 282이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 284이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 288이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 304이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 331이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 333이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 334이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 335이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 338이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 401이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 402이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 403이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 407이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 이들의 조합이다.
일 양태에서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물을 제공하며, 여기서 지질 나노입자의 각각은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 폴록사머를 포함하되 PEG-변형 지질 또는 PEG를 실질적으로 포함하지 않으며, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 안정하다.
일 양태에서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물을 제공하며, 여기서 지질 나노입자의 각각은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 폴록사머를 포함하되 PEG-변형 지질 또는 PEG를 실질적으로 포함하지 않으며, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 적은 량의 항-PEG 항체를 생성하거나 생성하지 않고/않거나 가속화된 혈중 소실(ABC)을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 0.1% 미만의 양으로 지질 나노입자에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 0.05% 미만의 양으로 지질 나노입자에 존재한다.
일부 구현예에서, 적합한 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다. 일부 구현예에서, 적합한 비-양이온성 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE)이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 콜레스테롤계 지질을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 각각은 2성분 지질 나노입자이다.
일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 10개 내지 약 150개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다.
일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 10개 내지 약 100개의 프로필렌 옥사이드 단위를 갖는다.
일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol 내지 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol 내지 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 2,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 3,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 5,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 6,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 7,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 8,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 9,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 10,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 25,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 30,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 40,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 250 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 200 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 180 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 160 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 150 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 140 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 130 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 120 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 110 nm 이하의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 100 nm 이하의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.3 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.25 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.20 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.18 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.17 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.16 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.15 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.14 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.13 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.12 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.11 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.10 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.09 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.08 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.07 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.06 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.05 이하의 다분산성 지수(PDI)를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 무엇보다도 생체 내에서 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 전령 RNA(mRNA)의 전달 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 안정한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 무엇보다도 생체 내에서 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 전령 RNA(mRNA)의 전달 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 안정한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 안정한 조성물을 투여하는 상기 단계는 대상체에서 항-PEG 항체를 생성하지 않고/않거나 가속화된 혈중 소실(ABC)을 유발하지 않는다.
일 양태에서, 본 발명은 무엇보다도 단백질 또는 펩티드가 결핍된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 안정한 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여하는 단계는 대상체에서 적은 량의 항-PEG 항체를 생성하거나 생성하지 않는다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여하는 단계는 대상체에서 가속화된 혈중 소실(ABC)을 감소시키거나 회피한다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물은 폐 전달에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물은 근육내 전달에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 6시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 12시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 18시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 24시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 30시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 36시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 48시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 72시간 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 5일 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 1주일 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 2주일 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 3주일 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드가 투여 후 적어도 약 4주일 동안 발현된다.
일 양태에서, 본 발명은 무엇보다도, 지질 나노입자 내에 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴록사머의 존재 하에 mRNA 용액과 지질 용액을 혼합하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA 용액 및/또는 지질 용액의 온도는 주변 온도보다 높은 소정의 온도이다.
일부 구현예에서, 폴록사머가 먼저 mRNA 용액에 첨가된다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 임계 미셀 농도(CMC)보다 낮은 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 1% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 2% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 3% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 4% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 5% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 6% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 7% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 8% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 9% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 10% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 15% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 20% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 25% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 30% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 35% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 40% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 45% 더 낮은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 50% 더 낮은 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 폴록사머를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 투석에 의해 제거된다.
일부 구현예에서, 제거 후 약 0.1% 미만의 폴록사머가 남는다. 일부 구현예에서, 제거 후 약 0.05% 미만의 폴록사머가 남는다. 일부 구현예에서, 제거 후 약 0.01% 미만의 폴록사머가 남는다.
일부 구현예에서, 제거 후 폴록사머의 잔류량이 남는다.
일부 구현예에서, 제거 후 남은 폴록사머의 양은 검출되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 임의의 콜레스테롤 지질을 혼합하는 단계를 포함하지 않는다.
일 양태에서, 본 발명은, 무엇보다도, 본원에 개시된 방법에 따라 형성된 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서, 달리 명시되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 본 개시에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함(comprise)" 및 이 용어의 다양한 형태, 예컨대 "포함하는(comprising) 및 포함하다(comprises)" 등은 다른 첨가물, 구성 요소, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은 동등하게 사용된다. 두 용어는 당업자가 이해하는 임의의 표준적인 변동폭을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 자명해진다. 하지만, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위가 본 발명의 구현예를 나타내지만, 이는 제한을 위해서가 아니라 단지 예시를 위해 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.
다음 도면은 단지 예시를 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아니다.
도 1은 예시적인 LNP-mRNA 캡슐화 방법의 개략도를 도시하며, 상기 방법은 펌프 시스템을 사용해 mRNA를 포함하는 수용액을 지질 용액과 혼합하여 LNP 형성 용액에서 mRNA-LNP를 생성한 다음, LNP 형성 용액을 완제의약품 제형 용액으로 교환하는 단계를 포함한다.
도 2는 1회 또는 2회의 동결/해동 사이클 전 및 후에 표 3에 나타낸 mRNA-LNP 제형의 크기 및 캡슐화 효율을 예시적인 그래픽 표현으로 도시한 것이다.
도 3은 표 4에 나타낸 바와 같이, PEG-변형 지질의 백분율(%) 및 폴록사머의 백분율(%)이 변할 때 mRNA-LNP 제형의 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 예시적인 그래픽 표현으로 도시한 것이다.
도 4는 표 4에 나타낸 바와 같이, 다양한 PEG-변형 지질의 백분율(%) 및 폴록사머에서 mRNA-LNP 제형의 크기 및 캡슐화 효율을 예시적인 그래픽 표현으로 도시한 것이다.
도 5는 투여 후 6시간 및 24시간차에 ELISA를 통해 측정한 단백질 수준의 예시적인 그래프를 도시한다. 검출된 단백질은, 표 7에 나타낸 LNP 제형 내에 캡슐화된 mRNA의 생체 내 번역의 결과이며, 상기 캡슐화된 mRNA는 피하 투여 또는 정맥 내 투여에 의해 마우스에게 전달된 것이다.
도 6a 및 6b는 폴록사머의 양을 정량화하기 위한 예시적인 방법을 보여준다. 도 6a는 청색 침전물이 형성되는 폴록사머와 코발트 티오시아네이트 간의 화학 반응을 도시한다. 도 6b는 알려진 농도의 폴록사머에 대해 624 nM에서 측정한 표준 곡선을 보여준다.
도 7은 투여 후 24시간차에 ELISA를 통해 측정한 OTC 단백질 수준의 예시적인 그래프를 도시한다. 검출된 단백질은, 표 8에 나타낸 LNP 제형 내에 캡슐화된 mRNA의 생체 내 번역의 결과이며, 상기 캡슐화된 mRNA는 정맥 내 투여에 의해 마우스에게 전달된 것이다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 문맥으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 나타낸다.
전달: 본원에서 사용되는 용어 "전달"은 국소적인 전달과 전신 전달 둘 다를 포함한다. 예를 들어, mRNA의 전달은: mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 표적 조직 내에 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"로도 지칭됨); 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 발현되고, 환자의 순환계(예컨대, 혈청) 내로 분비되고, 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수되는 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"로도 지칭됨)을 포함한다.
효능: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능" 또는 문법적으로 동등한 표현은, 관련 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 전달과 관련하여, 생물학적으로 관련된 평가변수가 개선되는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생물학적 평가변수는 투여 후 소정의 시점에 염화암모늄 접종에 대항하여 보호하는 것이다.
캡슐화: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 개별 mRNA 분자를 나노입자 내에 가두는 공정을 지칭한다.
발현: 본원에서 사용되는 바와 같이, mRNA의 "발현"은 mRNA를 펩티드(예: 항원), 폴리펩티드, 또는 단백질(예: 효소)로 번역하는 것을 지칭하며, 문맥으로 나타나는 바와 같이, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 완전 조립된 단백질(예: 효소)의 번역 후 변형을 포함할 수도 있다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 문법적으로 동등한 표현은 상호교환적으로 사용된다.
개선(improve), 증가(increase) 또는 감소(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 "개선", "증가" 또는 "감소", 또는 문법적으로 동등한 표현은 베이스라인 측정치, 예컨대, 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 샘플 또는 대상체(또는 다수의 대조군 샘플 또는 대상체)에서의 측정치에 대한 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 샘플"은 시험 항목을 제외하고는, 시험 샘플과 동일한 조건을 거치는 샘플이다. "대조군 대상체"는 치료받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린 대상체로서, 치료받는 대상체와 거의 동일한 연령이다.
시험관내(In Vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체외(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.
생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 활세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.
전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전령 RNA(mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산되고 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5' 에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 슈도우리딘, 및 5-메틸시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예컨대, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-디옥시리보스, 아라비노오스 및 헥소오스(hexose)); 및/또는 변형된 포스페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트(phosphorothioates) 및 5'-N-포스포아미다이트(5'-N-phosphoramidite) 결합)이거나 또는 이들을 포함한다.
N/P 비율:본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "N/P 비율"은 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 음으로 하전된 분자 단위 대비 해당 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 양으로 하전된 분자 단위의 몰비를 지칭한다. 　 이와 같이, N/P 비율은 일반적으로, 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 인산염 기의 몰 대비 해당 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 아민 기의 몰의 비율로 계산된다.
핵산: 본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다.
환자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 예컨대, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다.
약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable): 본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합하고, 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 물질을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 염: 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19에서 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠설폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캄퍼산염(camphorate), 캄퍼설폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 디글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄설폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄설폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌설폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닌산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔설폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할로겐화물, 수산화물, 카복시산염(carboxylate), 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온(counterion)을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로부터 형성된 염을 포함한다.
대상체(subject): 본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 가는 인간을 지칭하는 것으로, 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.
실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.
치료: 본원에서 사용되는, 용어 "치료(treat, treatment, 또는 treating)"는 부분적으로 또는 완전하게 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 지칭한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상에게 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은, 무엇보다도, mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 제조하기 위한 더 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 앞서, PEG-변형 지질은 일반적으로 지질 나노입자(LNP) 제형에 포함되었는데, 이는 이들이 보관 안정성 및 생체 내 순환 시간을 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문이다. 반면, PEG-변형 지질은 무엇보다도 항-PEG 항체를 생산함으로써 가속화된 혈중 소실(accelerated blood clearance; ABC) 및/또는 선천 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, PEG-변형 지질이 없는 mRNA-LNP를 제조하기 위한 시도가 이루어졌다. 그러나, PEG-변형 지질 또는 PEG의 부재 하에 형성된 mRNA-로딩된 LNP는 특히 냉동 및 해동 후 크고 불안정한 크기를 갖거나, 침전되는 경향이 있으며, 이는 상기 LNP를 치료 용도에 부적합하게 만든다는 것이 관찰되었다. 본 발명은, 폴록사머와 같은 양친매성 블록 공중합체의 존재 하에 mRNA와 지질을 혼합함으로써 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 예상 외로 안정한 mRNA-로딩된 LNP를 제조할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 뛰어난 안정성을 갖는 추가로 개선된 mRNA-LNP를 제공하며, 예를 들어, 항-PEG 항체의 생성 및/또는 ABC를 회피하기 위해 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 LNP가 바람직한 경우에 특히 유용하다.
본 발명은 LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 본 발명의 방법, 및 이에 의해 생성된 안정한 mRNA-LNP 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)의 존재 하에 mRNA 용액과 지질 용액을 혼합함으로써 LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 방법을 제공한다. 양친매성 중합체는 예를 들어, 투석에 의해 mRNA-LNP로부터 제거될 수 있다. 본 발명은 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 데 특히 유용하다.
본 발명의 다양한 양태는 다음의 섹션들에서 상세히 기술된다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다.
LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 과정
본 발명은 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)의 존재 하에 LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA를 캡슐화하는 방법은, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자가 형성되도록 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 존재 하에 지질 용액을 mRNA 용액과 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)는 혼합 전에 mRNA 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)는 혼합 전에 지질 용액에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 mRNA 용액과 지질 용액을 혼합하는 동안 첨가된다.
일부 구현예에서, 적합한 mRNA 용액은 관심 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA를 원하는 농도로 포함하는 수용액이다. 적합한 mRNA 용액은 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예시적인 방법은 US 2016/0038432, US 2018/0153822 및 US 2018/0125989에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질 및 비-양이온성 지질(헬퍼 지질로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 비-양이온성 지질(헬퍼 지질로도 지칭됨), 및 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 비-양이온성 지질(헬퍼 지질로도 지칭됨), 콜레스테롤계 지질, 및 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함한다. 다양한 지질을 바람직한 각각의 양 및/또는 비율로 적절한 용매에 용해시켜 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 지질 용액을 제조할 수 있다. 적합한 지질 용액은 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예시적인 방법은 US 2016/0038432, US 2018/0153822 및 US 2018/0125989에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 몰 기준으로 총 지질의 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 중량 기준으로 총 지질의 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 몰 기준으로 총 지질의 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만 또는 0.01% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 중량 기준으로 총 지질의 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만 또는 0.01% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다.
일반적으로, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 임계 미셀 농도(CMC)보다 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다.
일부 구현예에서, mRNA 용액 또는 지질 용액, 또는 둘 다는 혼합 전에, 주변 온도보다 높은 소정의 온도로 가열될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 혼합 전에 소정의 온도로 별도로 가열될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 주변 온도에서 혼합되지만, 혼합 후에는 소정의 온도로 가열된다. 일부 구현예에서, 지질 용액이 소정의 온도로 가열되고 주변 온도의 mRNA 용액과 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액이 소정의 온도로 가열되고 주변 온도의 지질 용액과 혼합된다.
일부 구현예에서, 주변 온도인 mRNA 모액을 가열된 완충액에 첨가하여 바람직한 소정의 온도를 달성함으로써, mRNA 용액이 소정의 온도로 가열된다.
일부 구현예에서, mRNA-LNP는 형성 후 가열된다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 방법 중에 (형성 전, 형성 도중, 또는 형성 후) 가열 단계를 포함하는 것이 달리 동일하지만 가열 단계가 없는 방법과 비교했을 때 mRNA-LNP의 특히 더 높은 캡슐화를 제공한다는 것이 놀랍게도 확인되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "주변 온도"는 실내 온도, 또는 가열 또는 냉각이 없는 상태에서 관심 대상을 둘러싸는 온도를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 16℃ 이하이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 15~35℃, 약 15~30℃, 약 15~25℃, 약 15~20℃, 약 20~35℃, 약 25~35℃, 약 30~35℃, 약 20~30℃, 약 25~30℃, 또는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 20~25℃이다.
따라서, 주변 온도보다 높은 소정의 온도는 일반적으로 약 25℃보다 높다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나 더 높다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 적합한 소정의 온도는 약 65℃이다.
일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 펌프를 사용하여 혼합된다. 이러한 혼합을 이용한 캡슐화 절차는 광범위한 규모로 수행될 수 있기 때문에, 바람직한 규모를 감당할 수 있는 상이한 유형의 펌프가 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 무펄스 유동 펌프를 사용하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 무펄스 유동 펌프는 안정적인 유속으로 연속 유동을 확립할 수 있는 임의의 펌프를 지칭한다. 적합한 펌프의 유형은 기어 펌프 및 원심 펌프를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 기어 펌프는 콜-파머(Cole-Parmer) 또는 디에너(Diener) 기어 펌프를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 원심 펌프는 그레인저(Grainger) 또는 콜-파머에 의해 제조되는 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
mRNA 용액과 지질 용액은 다양한 유속으로 혼합될 수 있다. 일반적으로, mRNA 용액은 지질 용액보다 더 빠른 속도로 혼합될 수 있다. 예를 들어, mRNA 용액은 지질 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 빠른 속도로 혼합될 수 있다.
혼합을 위한 적절한 유속은 규모에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 40~400 ml/분, 60~500 ml/분, 70~600 ml/분, 80~700 ml/분, 90~800 ml/분, 100~900 ml/분, 110~1000 ml/분, 120~1100 ml/분, 130~1200 ml/분, 140~1300 ml/분, 150~1400 ml/분, 160~1500 ml/분, 170~1600 ml/분, 180~1700 ml/분, 150~250 ml/분, 250~500 ml/분, 500~1000 ml/분, 1000~2000 ml/분, 2000~3000 ml/분, 3000~4000 ml/분, 또는 4000~5000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 200 ml/분, 약 500 ml/분, 약 1000 ml/분, 약 2000 ml/분, 약 3000 ml/분, 약 4000 ml/분, 또는 약 5000 ml/분의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, 지질 용액은 약 25~75 ml/분, 20~50 ml/분, 25~75 ml/분, 30~90 ml/분, 40~100 ml/분, 50~110 ml/분, 75~200 ml/분, 200~350 ml/분, 350~500 ml/분, 500~650 ml/분, 650~850 ml/분, 또는 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 혼합된다.
일반적으로, 본원에 기술된 본 발명의 방법은 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법 중에 첨가된 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)는 mRNA-LNP의 형성 후에 후속하여 제거된다. 예를 들어, 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)는 투석과 같은 완충액 교환 기술에 의해 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 형성 용액은 완제의약품 제형 용액을 구성하는 용액으로 교환된다. 예를 들어, 형성된 mRNA-LNP를 함유하는 혼합물이 하나 이상의 제형 용액에서 투석되어 mRNA-LNP를 형성하는 동안 존재하는 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)를 제거할 수 있다. 적합한 제형은 당업계에 공지되어 있고, 예시적인 제형은 본 출원의 제형 섹션에 기술되어 있다.
mRNA-LNP를 포함하는 용액을 LNP 형성 용액에서 제형 용액으로 교환하는 것은 당업계에 공지된 다양한 완충액 교환 기술 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 형성 용액을 제형 용액으로 교환하는 단계에는 mRNA-LNP의 정제 및/또는 농축이 수반된다. 다양한 방법을 사용하여 mRNA-LNP의 정제 또는 용액 중 mRNA-LNP의 농축과 함께 용액 교환을 달성할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 용액의 교환은 투석여과에 의해 달성된다. 투석여과는, 이들 나노입자의 용액 중 농도를 변화시키지 않으면서도 원치 않는 작은 입자는 필터를 통과시키고, 원하는 더 큰 나노입자는 잔류물 내에 남게 하는 분획화 공정이다. 투석여과는 종종 용액으로부터 염 또는 반응 완충액을 제거하는 데 사용된다. 투석여과는 연속적이거나 불연속적일 수 있다. 연속 투석여과의 경우, 여액이 생성되는 것과 동일한 속도로 투석여과 용액이 샘플 피드에 첨가된다. 불연속 투석여과의 경우, 먼저 용액을 희석한 다음, 시작 농도로 다시 농축시킨다. 불연속 투석여과는 원하는 농도의 나노입자에 도달할 때까지 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 용액이 교환되고, mRNA-LNP는 접선 유동 여과를 사용하여 정제된다. 십자류 여과(cross-flow filtration)로도 지칭되는 접선 유동 여과(TFF)는 여과될 재료가 필터를 관통하기 보다는 접선 방향으로 필터를 교차하여 통과하는 유형의 여과 방식이다. TFF에서, 원하지 않는 투과물은 필터를 관통하는 반면, 원하는 잔류물(mRNA-LNP 및 유리 mRNA)은 필터를 따라 통과하여 하류에서 수집된다. 일부 구현예에서, 원하는 물질은 TFF의 잔류물에 함유되는데, 이는 전통적인 전량 여과 방식(dead-end filtration)에서 일반적으로 발생하는 것과는 반대이다.
다양한 TFF 기술이 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 TFF 정제 방법은 US 2016/0040154 및 US 2015/0376220에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, LNP 내에 mRNA를 캡슐화하는 것은, mRNA-LNP를 비롯하여 LNP 형성 용액에서 캡슐화되지 않은 일부 유리 mRNA도 포함하는 제형 용액을 본원에 기술된 바와 같이 소정의 온도로 가열함으로써 추가로 향상될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 중에 존재하는 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 원래 양의 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만이 제거 후에 남는다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 잔류량이 제거 후에 제형 중에 남는다.. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA-LNP의 형성 중에 존재하던 양친매성 중합체(예: 폴록사머)와 함께 과량의 mRNA도 제거된다.
양친매성 블록 공중합체
다양한 양친매성 블록 공중합체가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양친매성 블록 공중합체는 계면활성제 또는 비-이온성 계면활성제로도 지칭된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머(Pluronic®), 폴록사민(Tetronic®), 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르(polysorbates), 및 폴리비닐 피롤리돈(PVP)으로부터 선택된다.
폴록사머
일부 구현예에서, 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머이다. 예를 들어, 적합한 폴록사머는 다음 구조를 가지며:
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식 중 a는 10 내지 150의 정수이고 b는 20 내지 60의 정수이다. 예를 들어, a는 약 12이고 b는 약 20이거나, a는 약 80이고 b는 약 27이거나, a는 약 64이고 b는 약 37이거나, a는 약 141이고 b는 약 44이거나, a는 약 101이고 b는 약 56이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 폴록사머는 약 10개 내지 약 150개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 약 10개 내지 약 100개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다.
기타 양친매성 중합체
일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴록사민, 예를 들어 테트로닉(tetronic) 304 또는 테트로닉 904이다.
일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 예컨대 3 kDa, 10 kDa, 또는 29 kDa의 분자량을 갖는 PVP이다.
일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르(Brij), 폴리소르베이트, 소르비탄, 및 이들의 유도체이다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리소르베이트, 예컨대 PS 20이다.
일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-I)의 화합물:
Figure pct00002
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 t는 1 내지 100의 정수이고; R1BRIJ는 독립적으로 Cio-40 알킬, Cio-40 알케닐, 또는 Cio-40 알키닐이며; 임의로 R5PEG의 하나 이상의 메틸렌 기는 C3-10 카보시클릴렌, 4원 내지 10원 헤테로시클릴렌, C6-10 아릴렌, 4원 내지 10원 헤테로아릴렌, -N(RN)-, -0-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NR C(O)N(R)-, -C(O)0- -OC(O)-, -OC(O)0- - OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)0- -C(O)S- -SC(O)-, -C(=NRN)-,-C(=NR )N(R )-, -NRNC(=NRN)- -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)0- -OS(O)0- -OS(O)2- -S(O)20- -OS(O)20- -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)- -N(RN)S(O)N(RN)- -OS(O)N(RN)- -N(RN)S(O)0- -S(O)2- -N(RN)S(O)2- -S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)- -OS(O)2N(RN)- 또는 -N(RN)S(O)20-으로 독립적으로 치환되고; RN의 각 인스턴스는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 또는 질소 보호기이다.
일부 구현예에서, R1BRIJ는 Cis 알킬이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-la)의 화합물:
Figure pct00003
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 s는 1 내지 100의 정수이다.
일부 구현예에서, R1BRIJ는 Cis 알케닐이다. 예를 들어, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-lb)의 화합물:
Figure pct00004
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 s는 1 내지 100의 정수이다.
안정한 mRNA-LNP 조성물
무엇보다도, 본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 mRNA-LNP를 제공한다. 특히, 본 발명은 PEG-변형 지질 또는 PEG를 적은 양(예를 들어, 중량 또는 몰 기준으로 0.5% 미만)으로 포함하거나 전혀 포함하지 않는 mRNA-LNP를 포함하는 안정한 조성물을 제공한다. 이러한 mRNA-LNP는 생체 내에서 mRNA를 효과적으로 전달하고 발현시키는데 적합하다. 본 출원에서, LNP 및 mRNA-LNP는 명시적으로 달리 표시되지 않는 한 상호 교환 가능하게 사용된다. 예를 들어, 본원에 사용된 mRNA-LNP는 명시적으로 달리 표시되지 않는 한 mRNA-로딩된 LNP 및 공 LNP(empty LNP) 둘 다를 포함한다.
일반적으로, LNP 조성물과 관련하여 용어 "안정한(stable)"은 침전 없이 실온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 밤새 보관될 수 있는 LNP 조성물을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 안정한 조성물은 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 60% 이내에서 평균 직경을 유지하는 LNP를 포함한다.
양이온성 지질(Cationic Lipids)
본원에서 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 생리적인 pH(physiological pH)와 같은 선택된 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 띄는 임의의 많은 지질 및 지질 종을 말한다. 몇몇 양이온성 지질은 문헌에 개시되어 있고, 그 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/144740호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00005
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2013/149140호에 기재된 이온화(ionizable) 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화학식 중 하나의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00006
식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C1-C20 알킬, 및 임의로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군에서 선택되고, L1 및 L2는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-C30 알킬, 임의로 치환된 가변 불포화 C1-C30 알케닐, 및 임의로 치환된 C1-C30 알키닐로 이루어진 군에서 선택되며, m 및 o는 각각 독립적으로 0 및 임의의 양의 정수(예컨대, m은 3)로 이루어진 군에서 선택되고, n은 0이거나 임의의 양의 정수(예컨대, n은 1)이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-l-일) 테트라코사-15,18-디엔-1-아민("HGT5000") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00007
(HGT-5000).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민("HGT5001") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00008
(HGT-5001).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민("HGT5002") 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00009
(HGT-5002).　
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/053572호에 아미노 알코올 리피도이드로 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00010
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118725호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00011
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118724호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00012
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 이온은 14,25-디트리데실 15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄의 화학식을 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2013/063468호 및 WO 2016/205691호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00013
식 중, RL의 각 인스턴스는 독립적으로 임의 치환된 C6-C40 알케닐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00014
(cKK-E12).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00015
(OF-02).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00016
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00017
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/184256호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00018
식 중, 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 Y는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 m은 독립적으로 0 내지 20이고, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 6이고, 각각의 RA는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴(carbocyclyl), 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴(heterocyclyl), 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이고, 각각의 RB는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "표적 23" 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure pct00019
(표적 23).　
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/004202호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00020
Figure pct00021
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00022
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00023
.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 가출원 제62/758,179호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00024
식 중 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00025
(화합물 1).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00026
(화합물 2).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00027
(화합물 3).
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 J. McClellan, M. C. King, Cell 2010, 141, 210-217 및 Whitehead 등의, Nature Communications (2014) 5:4277에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00028
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/199952호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00029
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00031
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00032
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00033
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00034
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00035
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00036
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00037
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00038
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00039
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00040
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00041
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/004143호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00042
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00043
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00044
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00045
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00046
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00047
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00048
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00049
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00050
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00051
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00052
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00053
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00054
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00055
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00056
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00057
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00058
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/075531호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00059
식 중, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa-, 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O) x, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, ,NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이거나 직접 결합이고, G1 및 G2는 각각 독립적으로 치환되지 않은 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고, G3는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 시클로알킬렌, C3-C8 시클로알케닐렌이고, Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고, R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5 C(=O)R4이고, R4는 C1-C12 알킬이고, R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/117528호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00060
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00061
.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00062
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/049245호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 양이온성 지질은 다음의 식 중 하나의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00063
Figure pct00064
이들 네 개의 화학식 중 어느 하나에 있어서, R4는 -(CH2)nQ 및 -(CH2) nCHQR에서 독립적으로 선택되고, Q는 -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R) 및 헤테로고리로 이루어진 군에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00065
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00066
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00067
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00068
.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/173054호 및 WO 2015/095340호에 기술된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00069
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00070
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00071
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00072
.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 다른 적절한 양이온성 지질은 콜레스테롤계 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00073
(ICE).
　
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2012/170889호에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00074
식 중, R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 임의로 치환된 알킬 아미노(예컨대, 디메틸아미노와 같은 알킬 아미노) 및 피리딜로 이루어진 군에서 선택되고, R2는 다음의 두 화학식 중 하나로 이루어진 군에서 선택되고,
Figure pct00075
식 중, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 임의로 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 알킬, 및 임의로 치환된, 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실이고, n은 0 또는 임의의 양의 정수(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4001" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00076
(HGT4001).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4002" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00077
(HGT4002).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4003" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00078
(HGT4003).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4004" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00079
(HGT4004).
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "HGT4005" 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00080
(HGT4005).
　
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 2018년 5월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기재된 것과 같은 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 특허 가출원 제62/672,194호에 기술된 일반 식 중 어느 하나 또는 구조 (1a)-(21a) 및 (1b)-(21b) 및 (22)-(237) 중 어느 하나에 해당하는 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 식 (I')에 따른 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:
Figure pct00081
(I')
식 중 RX는 독립적으로 -H, -L1-R1, 또는 -L5A-L5B-B'이고; L1, L2, 및 L3의 각각은 독립적으로 공유 결합, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S-, 또는 -C(O)NRL-이고; 각각의 L4A 및 L5A는 독립적으로 -C(O)-, -C(O)O-, 또는 -C(O)NRL-이고; 각각의 L4B 및 L5B는 독립적으로 C1-C20 알킬렌, C2-C20 알케닐렌, 또는 C2-C20 알키닐렌이고; 각각의 B 및 B'은 NR4R5 또는 5원 내지 10원 질소-함유 헤테로아릴이고; 각각의 R1, R2, 및 R3은 독립적으로 C6-C30 알킬, C6-C30 알케닐, 또는 C6-C30 알키닐이고; 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, 또는 C2-C10 알키닐이며; 각각의 RL은 독립적으로 수소, C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, 또는 C2-C20 알키닐이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질, 즉 62/672,194의 화합물 (139)를 포함한다:
Figure pct00082
("18:1 탄소 꼬리-리보스 지질").
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 N-[l-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 포함한다. (본원에 참조로서 통합된 Feigner 등의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)]; 미국 특허 제4,897,355호 참조). 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 기타 양이온성 지질은 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신디옥타데실아미드("DOGS"); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복스아미도에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄("DOSPA")(Behr 등의 문헌[Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)]; 미국 특허 제5,171,678호; 미국 특허 제5,334,761호); l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판("DODAP"); l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판("DOTAP")을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 양이온성 지질의 추가 예시는 또한 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DSDMA"); 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DODMA"); 1,2-디리놀레일옥시(dilinoleyloxy)-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DLinDMA"); l,2-디리놀레닐옥시(dilinolenyloxy)-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DLenDMA"); N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드("DODAC"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드("DDAB"); N-(l,2-디미리스틸옥시프로프(dimyristyloxyprop)-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드("DMRIE"); 3-디메틸아미노-2-(콜레스트(cholest)-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판("CLinDMA"); 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸 l-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데칸디엔옥시)프로판("CpLinDMA"); N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민("DMOBA"); 1 ,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판("DOcarbDAP"); 2,3-디리놀레오일옥시(Dilinoleoyloxy)-N,N-디메틸프로필아민("DLinDAP"); l,2-N,N'-디리놀레일카바밀-3-디메틸아미노프로판("DLincarbDAP"); l,2-디리놀레오일카바밀-3-디메틸아미노프로판("DLinCDAP"); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[l,3]-디옥솔란("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N,N-디메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민("Octyl-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-디메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민("Octyl-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, fsl-dimethyh3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민("Octyl-CLinDMA (2S)"); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥솔란("DLin-K-XTC2-DMA"); 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔-1-일)-l ,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민("DLin-KC2-DMA")을 포함한다(본원에 참조로서 통합된 WO 2010/042877호; Semple 등의 문헌[Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)] 참조). (Heyes, J. 등의 J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV. 등의 Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); 국제 특허 공개 WO 2005/121348호 참조). 일부 구현예에서, 양이온성 지질 중 하나 이상은 이미다졸, 디알킬아미노, 또는 구아니디늄 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 하나 이상의 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에틸)테트라하이드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]디옥솔-5-아민("ALNY-100") 및/또는 4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드("NC98-5")를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 또는 70 중량%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 몰%, 10 몰%, 20 몰%, 30 몰%, 35 몰%, 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 60 몰%, 65 몰%, 70 몰%, 또는 80 몰%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 중량%(예컨대, 약 30~65 중량%, 약 30~60 중량%, 약 30~55 중량%, 약 30~50 중량%, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 약 30~70 몰%(예컨대, 약 30~65 몰%, 약 30~60 몰%, 약 30~55 몰%, 약 30~50 몰%, 약 30~45 몰%, 약 30~40 몰%, 약 35~50 몰%, 약 35~45 몰%, 또는 약 35~40 몰%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 스테롤계 양이온성 지질이 본원에 기술된 양이온성 지질 대신 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. 적합한 스테롤계 양이온성 지질은 디알킬아미노-, 이미다졸-, 및 구아니디늄-함유 스테롤계 양이온성 지질이다. 예를 들어, 소정의 구현예는 아래의 구조식 (I)로 표시된 바와 같이, 이미다졸, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함하는 하나 이상의 스테롤계 양이온성 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, 다음 구조식으로 표시된 바와 같이, 기능성 단백질을 암호화하는 RNA(예컨대, mRNA)를 전달하기 위한 지질 나노입자는 하나 이상의 이미다졸계 양이온성 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 즉 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함할 수 있다:
Figure pct00083
(ICE).
일부 구현예에서, 리포솜 내 양이온성 지질의 백분율은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들)은 리포솜의 약 30~50 중량%(예컨대, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예컨대, ICE 지질)은 몰비 기준으로 리포솜의 약 30%, 약 35%, 약 40 %, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%를 구성한다.
비-양이온성 지질/헬퍼 지질
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 비-양이온성 지질/헬퍼 지질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비양이온성 지질"은 임의의 중성, 쌍성이온성(zwitterionic), 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "음이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 음전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다. 비-양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine, POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복시산염(dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylate, DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(dimyristoylphosphoethanolamine, DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine, DSPE), 16-O-모노메틸 PE(16-O-monomethyl PE), 16-O-디메틸 PE(16-O-dimethyl PE), 18-1-트랜스 PE(18-1-trans PE), l-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(phosphatidyethanolamine(l-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine, SOPE), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 중량 또는 몰 기준으로 총 지질의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 또는 70%를 구성한다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질(들)은 중량 또는 몰 기준으로 총 지질의 약 30~50%(예를 들어, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 구성한다.
콜레스테롤계 지질
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 예를 들어, 적합한 콜레스테롤계 양이온성 지질은 예를 들어, DC-Choi(N,N-디메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991)]; Wolf 등의 문헌[BioTechniques 23, 139 (1997)]; 미국 특허 제5,744,335호) 또는 ICE를 포함한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질(들)은 중량 또는 몰 기준으로 총 지질의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%를 구성한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질(들)은 중량 또는 몰 기준으로 총 지질의 약 30~50%(예컨대, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질(들)은 중량 또는 몰 기준으로 총 지질의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70% 마만을 구성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 콜레스테롤계 지질을 포함하지 않는다.
PEG-변형 지질
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 적은 양(예를 들어, 몰 또는 중량 기준으로 0.5% 미만)의 하나 이상의 PEG-변형 지질("PEG화 지질"로도 알려짐) 또는 PEG를 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질 및 N-옥타노일-스핑고신-l-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하여 유도된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도된 지질의 사용이 또한 본 발명에서 고려된다. 고려된 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유 결합된 최대 2 kDa, 최대 3 kDa, 최대 4 kDa, 또는 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질 또는 PEG화 지질은 PEG화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 일부 구현예에서, 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 기준으로 총 지질의 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 중량 기준으로 총 지질의 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.4% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG, 0.3% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG, 0.2% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG, 또는 0.1% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.09% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.08% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.07% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.06% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.05% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.04% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.03% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.02% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 몰 또는 중량 기준으로 총 지질의 0.01% 이하의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 PEG-변형 지질 또는 PEG를 실질적으로 포함하지 않는다.
양친매성 블록 공중합체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA-LNP는 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 함유한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 2.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 2% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 1.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 1% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 0.5% 미만의 (예를 들어, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 미만의) 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 잔류량의 양친매성 중합체(예: 폴록사머)를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.
전령 RNA(mRNA)
본 발명은 임의의 mRNA를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. mRNA는 일반적으로 DNA로부터 리보솜에 정보를 전달하는 유형의 RNA로 간주된다. 일반적으로, 진핵 생물에서, mRNA 가공은 5' 말단 상에 "캡"을 추가하고 3' 말단 상에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 통상적인 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결되는 구아노신인, 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. 꼬리의 추가는 일반적으로 폴리아데닐화 이벤트이며, 이에 의해 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 첨가된다. 이러한 "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 전령 RNA는 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.
mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간단히 말하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 시험관 내 합성 mRNA는 mRNA 합성 중에 사용되는 다양한 효소 및 기타 시약을 포함하는 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위해, 제형화 및 캡슐화 전에 정제될 수 있다.
본 발명은 다양한 길이의 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb보다 큰, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1~20 kb, 약 1~15 kb, 약 1~10 kb, 약 5~20 kb, 약 5~15 kb, 약 5~12 kb, 약 5~10 kb, 약 8~20 kb, 또는 약 8~15 kb 범위인, 시험관 내에서 합성된 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 변형되지 않은 mRNA 또는 일반적으로 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 변형 뉴클레오티드, 변형 당 인산 골격, 및 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, mRNA의 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 변형 mRNA는 예를 들어, 골격 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하되 이에 한정되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 퓨린과 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예컨대, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 디하이드로우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-유사우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 유사우리딘, 5-메틸시티딘, 및 이노신 등으로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 및 미국 등록특허 번호 제5,700,642호에서 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
일반적으로, mRNA 합성은 5' 말단에 "캡"을 추가하고 3' 말단에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
따라서, 일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate, GTP)이 구아닐릴(guanylyl) 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 2'-O-메틸화는 또한 7-메틸 구아노신 트리포스페이트 잔기 다음의 제1 염기 및/또는 제2 염기에서 일어날 수 있다. 캡 구조의 예는 이에 제한되지 않지만, m7GpppNp-RNA, m7GpppNmp-RNA, 및 m7GpppNmpNmp-RNA(여기서 m은 2'-O메틸 잔기를 나타냄)를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개의 뉴클레오티드이거나 더 길 수 있다.
시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 구현예에서 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 mRNA를 포함하는 본 발명의 범위 내에서 다른 mRNA 공급원이 고려된다.
본 발명은 다양한 단백질을 암호화하는 mRNA를 제형화하고 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 mRNA의 비제한적인 예는 에리트로포이에틴(EPO) 및 반딧불 루시페라아제(FFL)를 암호화하는 mRNA를 포함한다.
제형
다양한 제형이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 완충제 또는 염을 포함할 수 있다. 예시적인 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은, 동결 보호제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은, 트레할로스, 수크로오스, 만노오스, 락토오스, 및 만니톨 중 하나 이상과 같은 당류를 포함하지만 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 수크로오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 만노오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 락토오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 만니톨을 포함한다.
일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 당류, 예컨대 트레할로스, 수크로오스, 만노오스, 락토오스, 및 만니톨을 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 트레할로스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 만노오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 락토오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 5% 내지 20%(w/v)의 만니톨을 포함하는 수용액이다.
일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 당류, 예컨대 트레할로스, 수크로오스, 만노오스, 락토오스, 및 만니톨을 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 트레할로스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 만노오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 락토오스를 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10%(w/v)의 만니톨을 포함하는 수용액이다.
일부 구현예에서, 에탄올과 같은 비수성 용매 및 구연산염 중 하나 또는 둘 다는 완제의약품 제형 용액에 없다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 잔류 구연산염만을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 잔류 비수성 용매, 예컨대 에탄올만을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 10 mM 미만의 (예를 들어, 약 9 mM 미만, 약 8 mM, 약 7 mM, 약 6 mM, 약 5 mM, 약 4 mM, 약 3 mM, 약 2 mM, 또는 약 1 mW 미만의) 구연산염을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 약 25% 미만의 (예를 들어, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의) 비수성 용매, 예컨대 에탄올을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 동결 건조 전에 임의의 추가적인 하류 처리(예: 완충액 교환 및/또는 추가 정제 단계 및/또는 추가 부형제)를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 멸균 충전물(sterile fill)을 바이알, 주사기, 또는 다른 용기에 투여하기 전에 임의의 추가적인 하류 처리(예: 완충액 교환 및/또는 추가 정제 단계 및/또는 추가 부형제)를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 대상체에게 투여되기 전에 임의의 추가적인 하류 처리(예: 완충액 교환 및/또는 추가 정제 단계 및/또는 추가 부형제)를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 4.5 내지 pH 7.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 5.0 내지 pH 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 5.5 내지 pH 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 4.5를 초과하는 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 5.0을 초과하는 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 5.5를 초과하는 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 6.0을 초과하는 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 pH 6.5를 초과하는 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 가열 후 적합한 제형 용액 중 mRNA-LNP의 개선된 또는 강화된 캡슐화 양은 완제의약품 제형 용액의 후속 동결-해동 후 유지된다. 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 10% 트레할로스이고 안정적으로 동결될 수 있다.
일부 구현예에서, 가열 후 적합한 제형 용액 중의 mRNA-LNP는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 트레할로스 용액에서 안정적으로 동결될 수 있다(예를 들어, 향상된 캡슐화를 유지함). 일부 구현예에서, 적합한 제형 용액은 임의의 하류 정제 또는 처리를 필요로 하지 않으며, 동결된 형태로 안정적으로 저장될 수 있다.
치료적 용도
소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 대상체에게 전달하거나 인간 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물은 대상체의 폐 또는 폐 세포 내로의 전달을 위해 사용된다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 폐 질환의 치료에 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전달 조절자, 즉 CFTR을 암호화하는 mRNA를 제조하는 방법에 유용하다. CFTR mRNA는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 치료 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐에 전달된다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 간 질환 또는 대사 질환의 치료에 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 요소 회로 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론산혈증과 관련된 것들, 또는 풍부한 전장 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 치료적 이점이 되는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 요소 순환 장애와 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 카바모일 포스페이트 합성효소 I 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아르기나아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 알파 갈락토시다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 이두로니다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 헤파린 N-설파타아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 갈락토사민-6 설파타아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 리소좀 리파아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 아랄설파타아제 B (N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 전사 인자 EB(TFEB)를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 산성 알파-글루코시다아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루코스-6-포스파타아제(G6PC) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 간 글리코겐 포스포릴라아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 뮤타아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 아미노산 대사와 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 데하이드로제나아제 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카복실라아제 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 옥살라아제 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 지질 대사 장애 또는 섬유증 장애와 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론 관련 발달성 조절물질 1 (IFRD1), 및 시르투인 1(SIRT1) 중 하나 이상을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론산혈증과 관련된 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 뮤타아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 에피머라아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 간에 전달하거나 간을 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 포스포빌리노겐 데아미나아제 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X와 같은 하나 이상의 응고 효소를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증(HFE) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 병태를 치료하거나 대상체의 심혈관 세포에 전달하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-9 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포에 전달하거나 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포에 전달하거나 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포에 전달하거나 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATP 결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포에 전달하거나 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나아제(Bruton's tyrosine kinase) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포에 전달하거나 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 IV형 콜라겐 알파 5 사슬 (COL4A5) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포에 전달하거나 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 ATP 결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 망막층간분리 단백질(retinoschisin protein)을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CEP290)을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하거나 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 로타바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예컨대 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 유두종바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암과 연관되었거나 대상체의 암 세포로부터 식별된 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 대상체 본인의 암 세포로부터 결정된 항원, 즉 맞춤화된 암 백신을 제공하기 위한 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 돌연변이체 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 소정의 구현예에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (b)에서 2개의 별도의 mRNA-LNP는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA-LNP 조성물은 상이한 지질 조성물을 포함하는 LNP, 및 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP의 조합을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 LNP는 동일하지 않다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 OX40에 대한 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 VEGF에 대한 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CD3에 대한 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 CD19에 대한 항체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 면역조절물질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 12를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 23을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 36 감마를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 인터페론 유전자 자극제(STING) 단백질의 구성적 활성 변이체를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제를 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 메가뉴클레아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 징크 핑거 뉴클레아제 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 안구 질환을 치료하기 위한 펩티드 또는 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 망막층간 단백질을 전달하는 본원에 기술된 mRNA-LNP를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 데 사용된다.
실시예
본 발명의 특정 화합물, 조성물, 및 방법이 소정의 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1. 폴록사머를 사용하여 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 지질 나노입자 내에 mRNA 캡슐화하기
본 실시예는 방법 A를 적용하여 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 지질 나노입자 내에 mRNA를 캡슐화하는 예시적인 방법을 보여준다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 방법 A는, 미국 특허 가출원 제2018/0008680호(그 전체는 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 바와 같이, 예를 들어 지질을 지질 나노입자로 미리 형성하지 않고, mRNA를 지질 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 종래의 방법을 지칭한다.
예시적인 제형화 방법은 도 1에 도시되어 있다. 이 방법에서, 지질 용액(예를 들어, 에탄올 용액)과 mRNA 및 폴록사머를 포함하는 수용액을 별도로 제조하였다. 특히, 지질(양이온성 지질, 헬퍼 지질, 쌍성 이온성 지질, PEG-변형 지질 등) 용액은 지질을 에탄올에 용해시켜 제조하였다. 수용액은 mRNA와 폴록사머를 구연산염 완충액에 용해시켜 제조하였다. 그런 다음, 펌프 시스템을 사용해 이들 2가지 용액을 혼합하여 mRNA가 캡슐화된 LMP를 제공하였다. 침전을 방지하기 위해 혼합물 중의 폴록사머의 양을 임계 미셀 농도(CMC) 미만으로 유지하는 것이 바람직하다는 것을 주목할 만한 가치가 있다. 그런 다음, mRNA-LNP를 포함하는 LNP 형성 용액을 10% 트레할로스를 포함하는 용액에 대해 투석하여, 실온에서 몇 시간 동안 그리고 그 다음 밤새 4℃에서 여분의 mRNA 및 폴록사머를 제거하였다. 투석 후, mRNA가 로딩된 제형 용액을 농축시키고 후속 분석을 위해 보관하였다.
전술한 캡슐화 방법에 의해 5가지 상이한 LNP 제형을 제조하여, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 분석하였다.
다양한 양의 PEG-변형 지질 및 폴록사머가 포함된 mRNA-LNP
제형 PEG-변형 지질 캡슐화 방법 동안 포함시킨 폴록사머 크기 (nm) PDI 캡슐화 효율 (%)
1 0.0% 0.5% 124 0.177 54
2 0.2% 0.5% 123 0.186 58
3 0.4% 0.5% 109 0.165 59
4 0.0% 0.0% n/a n/a n/a
5 0.4% 0.0% 337 0.069 92
PEG-변형 지질과 폴록사머 둘 다가 없는 안정한 LNP는 형성할 수 없었는데, 제형 용액이 충돌하고 침전하였기 때문이다(표 1, 제형 4). 폴록사머가 없는 경우, 적은 량의 PEG-변형 지질(예를 들어, 0.4%)이 포함된 LNP는 337 nm의 큰 입자 크기를 가졌다(표 1, 제형 5). 전술한 바와 같이 캡슐화 방법 동안 0.5% 폴록사머를 사용한 경우, 놀랍게도, LNP의 크기가 1/3로 상당히 감소하였다. (표 1, 제형 1~3). 또한, PEG-변형 지질이 없는 경우에도 안정한 LNP를 형성할 수 있었다(표 1, 제형 1).
본 실시예는 캡슐화 방법 중에 폴록사머를 포함시킴으로써 적은 량의 PEG-변형을 함유하거나 전혀 함유하지 않는 안정한 mRNA-LNP를 생성하였음을 입증한다. 중요하게는, 폴록사머 차폐가 LNP의 크기를 상당히 감소시켜, 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 전혀 포함하지 않고, 치료적 용도에 특히 적합한 200 nm 미만의 크기를 갖는 mRNA-LNP를 생성하였다.
실시예 2. LNP 형성 후 가열은 LNP의 캡슐화 효율을 증가시켰다
본 실시예는 mRNA-LNP 형성 후 이를 가열하는 추가의 단계가 캡슐화 효율을 증가시킨다는 것을 보여준다.
구체적으로, 전술한 바와 같이 방법 A에 의해 mRNA를 LNP로 캡슐화한 후, 생성된 mRNA-LNP 제형 용액을 주변 온도 이상으로 가열하였다. 가열 후, mRNA-LNP 용액을 냉각시키고 후속 분석을 위해 보관하였다. 각각의 제형에 대해, 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 가열 전과 후에 측정하였다.
mRNA-LNP 형성 후 가열 단계의 효과
제형 PEG-변형 지질 캡슐화 방법 동안 포함시킨 폴록사머 mRNA-LNP 형성 후 가열하지 않음 mRNA-LNP 형성 후 가열함
크기 (nm) PDI EE (%) 크기 (nm) PDI EE (%)
1 0.0% 0.5% 121 0.202 66 124 0.177 54
2 0.2% 0.5% 122 0.195 32 123 0.186 58
3 0.4% 0.5% 110 0.180 47 109 0.165 59
표 2에 나타낸 바와 같이, 0.2% 및 0.4%의 PEG-변형 지질을 각각 포함하는 제형 2 및 3의 캡슐화 효율(EE (%))은, 가열 전 동일한 제형의 캡슐화 효율과 비교했을 때 형성 후 가열 단계 후에 상당히 증가하였다. 시험된 모든 제형의 PDI는 약간 감소하였고, 입자 크기는 상대적으로 일정하게 유지되었다.
실시예 3. mRNA-LNP는 다수의 동결/해동 사이클 후 안정하다
본 실시예는 본 발명에 따라 제조된 mRNA-로딩된 LNP가 다수의 동결/해동 사이클 후에 안정함을 보여준다.
구체적으로, 다양한 PEG-변형된 지질 및 폴록사머가 포함된 3가지 상이한 LNP 제형을 전술한 캡슐화 방법에 의해 제조하였다. 각각의 제형에 대해, 크기 및 캡슐화 효율을 동결/해동 사이클 전과 후에 측정하였다.
Figure pct00084
도 2에 도시된 바와 같이, 0.4% 및 0%의 PEG를 각각 함유하고, 2% 폴록사머의 존재 하에 형성된 LNP 제형 7 및 8은 2회의 동결/해동 사이클 후에 약 100 nm의 평균 입자 크기를 유지하였다. 보다 구체적으로, 1회 및 2회의 동결/해동 사이클 후 입자 크기의 증가는 각각의 원래 평균 크기의 10% 이내인 것으로 나타났다. 제형 6은 0.4% PEG를 함유하며 폴록사머 없이 형성되었다. 동결/해동 전에 상기 제형의 평균 입자 크기는 약 370 nm였고, 2회의 동결/해동 사이클 후에는 평균 크기가 400 nm를 초과하여 증가하였다. 더 놀랍게도, mRNA-LNP 캡슐화 방법 중에 2% 폴록사머를 포함시킨 제형 7 및 8의 경우 캡슐화 효율이 첫 번째 동결/해동 사이클 후에 상당히 증가하였다.
실시예 4. 폴록사머의 존재 하에 적은 량의 PEG-변형 지질을 포함하거나 전혀 포함하지 않는 mRNA-LNP의 형성
본 실시예는 폴록사머의 존재 하에 만들어진 PEG-변형 지질을 적은 량으로 포함하거나 전혀 포함하지 않는 mRNA-LNP가 치료 용도에 적합한 평균 크기 및 크기 분포를 갖는다는 것을 추가로 보여준다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 다양한 양의 PEG-변형 지질 및 폴록사머를 포함하는 상이한 LNP 제형을 전술한 캡슐화 방법에 의해 만들고 분석하였다. 특히, 동일한 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 및 mRNA를 사용하여 본 실시예의 LNP 제형을 제조하였다.
다양한 양의 PEG-변형 지질 및 폴록사머가 포함된 예시적인 mRNA-LNP
제형 PEG-변형 지질 캡슐화 방법 동안 포함시킨 폴록사머
9 0.0% 0.5%
10 0.0% 1.0%
11 0.0% 2.0%
12 0.4% 0.5%
13 0.4% 1.0%
14 0.4% 2.0%
PEG-변형 지질의 부재 하에 mRNA-로딩된 LNP를 형성하였다(제형 9~11). 이는 전술한 바와 같이 캡슐화 방법 중에 폴록사머를 첨가함으로써 달성하였다. 특히, PEG-변형 지질이 없는 mRNA-LNP는 낮은 백분율(예: 0.5%)의 폴록사머로 만들었다(제형 9). 도 3에 도시된 바와 같이, 다양한 양의 폴록사머로 만들어진 0.4%의 PEG-변형 지질을 함유하는 모든 LNP의 평균 크기는 100 nm 미만이었다. 다양한 양의 폴록사머로 만들어진 PEG-변형 지질을 포함하지 않는 모든 LNP의 평균 크기는 130 nm 미만이었다. 다양한 양의 폴록사머로 만들어진 PEG-변형 지질을 포함하거나 포함하지 않는 모든 LNP에 대한 PDI는 약 0.25 이하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, PEG-변형 지질의 효과(%)도 시험하였다. 도 4는 mRNA-LNP가, 평균 크기가 100 nm 미만이고 PDI가 0.25 미만인 폴록사머의 존재 하에 PEG-변형 지질이 매우 적거나 전혀 없는 상태로 제조되었음을 보여준다. 동일한 지질 성분(예: 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 콜레스테롤) 및 동일한 mRNA를 사용하여 mRNA-LNP를 제조하였으므로, 본 실시예에서 관찰된 변화는 PEG-변형 지질 및/또는 폴록사머의 변화율로 인한 것이다.
실시예 5. 폴록사머는 성분계가 더 낮은 LNP를 안정화시킨다
본 실시예는 4개 미만의 성분을 갖는 mRNA-LNP가 본 발명에 따라 제조될 수 있고 치료 용도에 적합한 평균 크기를 가질 수 있음을 보여준다.
구체적으로, 상이한 성분(예를 들어, 4, 3 및 2가지)을 포함하는 mRNA-LNP를 전술한 바와 같이 폴록사머의 존재 하에 제조하고 그 특성을 분석하였다. 상이한 제형에 대한 특정 성분, 평균 입자 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 표 5에 나타냈다. 특히, 동일한 지질 성분(예를 들어, 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 및/또는 콜레스테롤) 및 동일한 mRNA를 사용하여 본 실시예의 LNP 제형을 제조하였다.
상이한 성분이 포함된 LNP
제형 성분의 수 성분 크기 (nm) PDI 캡슐화 효율 (%)
16 4 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤, PEG-변형 지질(폴록사머 없음) 87 0.184 87
1 3 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤 (+폴록사머) 124 0.177 54
17 2 양이온성 지질, 헬퍼 지질 (50:50) (+폴록사머) 113 0.185 75
18 2 양이온성 지질, 헬퍼 지질 (25:75) (+폴록사머) 112 0.188 95
표 5에 나타낸 바와 같이, mRNA-LNP는 캡슐화 방법 중에 폴록사머를 포함시켰을 때, 3가지 또는 2가지 성분으로 만들었다. 모두는 허용 가능한 PDI(예를 들어, 0.20 미만) 및 캡슐화 효율과 함께 작은 크기(예를 들어, 125 nm 미만)를 갖는다. 주목할 것은, 양이온성 지질 대 헬퍼 지질의 비가 상이한 2성분 LNP(제형 17 및 18)는 둘 다 작은 평균 크기(120 nm 미만) 및 높은 캡슐화 효율(예: > 75%)을 가졌다.
실시예 6. PEG-변형 지질이 실질적으로 없는 안정한 LNP는 상이한 양이온성 지질 및 다양한 폴록사머로 형성될 수 있다.
본 실시예는, 다양한 양이온성 지질 및 상이한 mRNA를 함유하되 PEG-변형 지질은 실질적으로 포함하지 않는 안정한 mRNA-LNP를 생산하는데 본 발명을 사용할 수 있음을 보여준다.
구체적으로, 표 6에 나타낸 바와 같이, EPO 또는 FFL 단백질을 암호화하는 mRNA를 폴록사머 407의 존재 하에 4의 N/P 비율로 상이한 양이온성 지질을 함유하는 LNP 내로 캡슐화하였다.
폴록사머 407을 포함하는 mRNA-LNP는 상이한 양이온성 지질 및 mRNA 작제물로 형성된다
양이온성 지질 mRNA 크기 (nm) PDI EE (%)
CCBene EPO 97 0.143 60
FFL 92 0.164 41
ML-7 EPO 114 0.166 58
FFL 108 0.155 94
MC-3 EPO 93 0.156 32
FFL 92 0.178
ML-2 EPO 140 0.094 86
FFL 280 0.091
결과는 PEG-변형 지질이 실질적으로 없는 안정한 mRNA-LNP가 다양한 양이온성 지질 및 mRNA 작제물로 형성될 수 있음을 보여준다. CCBene, ML-7, 및 MC3을 포함하는 LNP는 120 nm 미만의 특히 작은 크기의 LNP를 나타냈다.
실시예 7. 폴록사머를 사용하여 형성된 mRNA-LNP의 전달에 의한 성공적인 생체 내 발현
본 실시예는 폴록사머를 이용해 형성된 mRNA-LNP을 투여한 결과 성공적인 생체 내 단백질 발현이 이루어졌음을 보여준다. 특히, EPO mRNA-로딩된 LNP를 피하(SC) 및 정맥내(IV) 경로를 통해 CD-1 마우스에 투여하고, 투여 후 6시간차 및 24시간차에 마우스의 간과 혈청에서 EPO 단백질 발현 수준을 검출하였다. 다양한 양의 PEG-변형 지질 및 0.5% 폴록사머를 이용해 형성된 4가지 상이한 LNP를 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 시험하였다. 5% PEG-변형 지질이 포함된 종래의 LNP도 대조군으로서 투여하였다(표 7에 나타낸 그룹 B 및 F).
폴록사머를 포함하는 mRNA-LNP의 동물 연구
그룹 ROA 동물의 수 제형 PEG-변형 지질 캡슐화 방법 동안 포함시킨 폴록사머 투여량 수준 (mg/kg)
A SC 4 식염수 0.0
B SC 4 16 5.0% 0.0% 0.8
C SC 4 3 0.4% 0.5% 0.8
D SC 4 2 0.2% 0.5% 0.8
E SC 4 1 0.0% 0.5% 0.8
F IV 4 16 5.0% 0.0% 0.4
G IV 4 3 0.4% 0.5% 0.4
H IV 4 2 0.2% 0.5% 0.4
I IV 4 1 0.0% 0.5% 0.4
도 5에 도시된 바와 같이, PEG-변형 지질이 적거나 전혀 없는 폴록사머 차폐된 LNP는 종래의 LNP(예를 들어, 5% PEG-변형 지질을 갖는 것들)와 유사한 생체 내 단백질 발현 프로파일을 달성하였다. 이들 데이터는 PEG-변형된 지질 또는 PEG를 적은 양으로(예를 들어, < 0.5%) 포함하거나 전혀 포함하지 않고, 본 발명에 따른 폴록사머를 사용하여 만들어진 mRNA-LNP가 치료를 목적으로 한 생체 내 단백질 발현에 성공적으로 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 8. mRNA-LNP 제형 중 폴록사머의 정량화
본 실시예는 본 발명에 따라 만들어진 mRNA-LNP 중 폴록사머의 최종 농도를 정량화하는 예시적인 방법을 보여준다.
구체적으로, 이 방법은 폴록사머가 코발트 티오시아네이트와 경쟁하고 도 6a에 도시된 바와 같이 청색 침전물을 형성한다는 사실을 이용한다. 침전물이 형성된 후, 청색 침전물을 아세톤에 용해시키고, 폴록사머에 정비례하는 색도를 624 nm 파장에서 측정한다. 알려진 농도의 폴록사머를 이용한 표준 곡선을 도 6b에 도시된 바와 같이 도표화하였다. 이러한 표준 곡선은 주어진 샘플 중 폴록사머의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다.
실시예 9. 다양한 폴록사머 및 비양이온성 지질을 포함하는 mRNA-LNP의 성공적인 생체 내 발현
본 실시예는 다양한 폴록사머 및 비-양이온성 지질이 PEG-변형 지질을 실질적으로 포함하지 않는 안정한 mRNA-LNP를 생산하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 본 실시예는 폴록사머를 이용해 형성된 mRNA-LNP을 투여한 결과 성공적인 생체 내 단백질 발현이 이루어졌음을 추가로 보여준다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 다양한 폴록사머 및 비-양이온성 지질, 및 다양한 양의 PEG-변형 지질을 포함하는 상이한 LNP 제형을 양이온성 지질 cDD-TE4-E12를 이용해 전술한 캡슐화 방법에 의해 만들고 분석하였다. 본 특정 실험에서는, OTC(오르니틴 트랜스카르바밀라아제)를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하였다.
다양한 성분이 포함된 예시적인 mRNA-LNP
제형 폴록사머
(Pluronic)		 비율
(PEG:양이온성 지질:콜레스테롤:비-양이온성 지질)		 비-양이온성 지질 크기 (nm) PDI EE (%)
A P-234
(P-84)		 0.5:40:27.5:32 DOPE 95 0.075 100
B P-407
(F127)		 0.5:40:27.5:32 DOPE 87 0.134 87
C P-234
(P-84)		 0:40:28:32 DOPE 충돌함
D P-407
(F127)		 0:40:28:32 DOPE 92 0.152 89
E P-338
(P108)		 0:40:28:32 DOPE 97 0.146 낮음
F P-234
(P-84)		 0.5:40:27.5:32 DEPE 125 0.080 100
G P-407
(F127)		 0.5:40:27.5:32 DEPE 133 0.140 99
H P-338
(P108)		 0.5:40:27.5:32 DEPE 126 0.090 99
I 폴록사머 없음 3:40:25:32 DEPE
J 폴록사머 없음 2:40:26:32 DEPE
K 폴록사머 없음 1.5:40:26.5:32 DOPE
PEG-변형 지질이 없거나 매우 적은 양으로(예: 0.5%) 존재하는 가운데 mRNA-로딩된 LNP를 형성하였다(제형 A~H). 이는 전술한 바와 같이 캡슐화 방법 중에 폴록사머를 첨가함으로써 달성하였다. 다양한 폴록사머 및 비-양이온성 지질을 사용해 캡슐화 공정을 최적화할 수 있다. 본 실시예에서 만들어진 모든 LNP의 평균 크기는 약 130 nm 이하였고, PDI는 약 0.15 이하였으며, 캡슐화 효율은 약 90% 이상이었다. 대조군으로서, 폴록사머를 포함하지 않고 다양한 비율의 PEG-변형 지질을 포함하는 mRNA-로딩된 LNP를 제조하였다(제형 I~K).
표 8에서 OTC mRNA를 포함하는 mRNA-LNP 제형을 정맥내(IV) 경로를 통해 마우스에게 투여하고, OTC 단백질 발현 수준을 측정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 적은 양의 PEG-변형 지질을 포함하고 폴록사머로 차폐된 LNP는 목표 발현 수준과 비슷하거나 더 높은 생체 내 단백질 발현을 달성하였다. 이들 데이터는 다양한 폴록사머 및 비-양이온성 지질을 사용하여 만들어지고, 적은 양의 PEG-변형 지질을 포함하거나 전혀 포함하지 않는 mRNA-LNP가 치료를 목적으로 한 생체 내 단백질 발현에 성공적으로 사용될 수 있음을 입증한다. 제형 I 및 J는 폴록사머가 포함된 제형 A~H보다 더 높은 효능을 달성하였다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

Claims (66)

  1. 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물로서, 지질 나노입자의 각각은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함하고, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 후에 안정한, 안정한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 하나의 양이온성 지질, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 및 약 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함하는, 안정한 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 50% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 10% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 5% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 50% 내지 99%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는, 안정한 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함하는, 안정한 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 0.4% 이하의 PEG-변형 지질, 0.3% 이하의 PEG-변형 지질, 0.2% 이하의 PEG-변형 지질, 또는 0.1% 이하의 PEG-변형 지질을 포함하는, 안정한 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 PEG-변형 지질을 실질적으로 포함하지 않는, 안정한 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 양친매성 블록 공중합체를 포함하는, 안정한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 2.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 2% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 1.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 1% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 0.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 0.05% 미만의 양친매성 블록 공중합체, 또는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함하는, 안정한 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 조성물은 중량 기준으로 총 조성물의 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체를 포함하는, 안정한 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 조성물은 양친매성 블록 공중합체의 잔류량을 포함하는, 안정한 조성물.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머인, 안정한 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 폴록사머는 폴록사머 84, 폴록사머 101, 폴록사머 105, 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 304, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403, 폴록사머 407, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 안정한 조성물.
  16. 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물로서, 지질 나노입자의 각각은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 폴록사머를 포함하되 PEG-변형 지질 또는 PEG를 실질적으로 포함하지 않으며, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 안정한, 안정한 조성물.
  17. 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정한 조성물로서, 지질 나노입자의 각각은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 폴록사머를 포함하되 PEG-변형 지질 또는 PEG를 실질적으로 포함하지 않으며, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 적은 량의 항-PEG 항체를 생성하거나 생성하지 않고/않거나 가속화된 혈중 소실(ABC)을 감소시키는, 안정한 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 폴록사머는 0.1% 미만의 양으로 지질 나노입자에 존재하는, 안정한 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 0.05% 미만의 양으로 지질 나노입자에 존재하는, 안정한 조성물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)인, 안정한 조성물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 50% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 10% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 지질 나노입자는 1회 이상의 동결 해동 사이클 후에 원래 평균 크기의 5% 이내에서 평균 직경을 유지하는, 안정한 조성물.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 50% 내지 99%의 mRNA 캡슐화 효율을 갖는, 안정한 조성물.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함하는, 안정한 조성물.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 콜레스테롤계 지질을 포함하지 않는, 안정한 조성물.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자의 각각은 2성분 지질 나노입자인, 안정한 조성물.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 약 10 내지 약 150의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는, 안정한 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 폴록사머는 약 10 내지 약 100의 프로필렌 옥사이드 단위를 갖는, 안정한 조성물.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 약 4,000 g/mol 내지 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는, 안정한 조성물.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 폴록사머 84, 폴록사머 101, 폴록사머 105, 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 304, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403, 폴록사머 407, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 안정한 조성물.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 200 nm 미만의 평균 크기를 갖는, 안정한 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 평균 크기는 약 150 nm, 140 nm, 130 nm, 120 nm, 110 nm, 100 nm 이하인, 안정한 조성물.
  34. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 0.25 이하, 0.2 이하, 0.15 이하, 0.1 이하의 다분산 지수(PDI)를 갖는, 안정한 조성물.
  35. 생체 내에서 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 전령 RNA(mRNA)의 전달 방법으로서, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 안정한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 생체 내에서 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 전령 RNA(mRNA)의 전달 방법으로서, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 안정한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 안정한 조성물을 투여하는 상기 단계는 대상체에서 항-PEG 항체를 생성하지 않고/않거나 가속화된 혈중 소실(ABC)을 야기하지 않는, 방법.
  37. 단백질 또는 펩티드 결핍증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 안정한 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여되는, 방법.
  39. 제35항 또는 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 조성물은 폐 전달에 의해 투여되는, 방법.
  40. 제35항 또는 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 조성물은 근육내 전달에 의해 투여되는, 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 조성물을 투여한 결과, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드는 투여 후 적어도 약 12, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간 동안 발현되는, 방법.
  42. 지질 나노입자 내에 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법으로서, 폴록사머의 존재 하에 mRNA 용액과 지질 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 0.5% 미만의 PEG-변형 지질 또는 PEG를 포함하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 지질 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액 및/또는 지질 용액의 온도는 주변 온도보다 높은 소정의 온도인, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 먼저 mRNA 용액에 첨가되는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 임계 미셀 농도(CMC)보다 낮은 양으로 존재하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 폴록사머는 이의 CMC보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 더 낮은 양으로 존재하는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 폴록사머는 이의 CMC의 약 50% 미만의 양으로 존재하는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 폴록사머를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 폴록사머는 투석에 의해 제거되는, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 제거 후 약 0.05% 미만의 폴록사머가 남는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 제거 후 약 0.01% 미만의 폴록사머가 남는, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 제거 후 폴록사머의 잔류량이 남는, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제거 후 남은 폴록사머의 양은 검출되지 않는, 방법.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 약 10 내지 약 150의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 폴록사머는 약 10 내지 약 100의 프로필렌 옥사이드 단위를 갖는, 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 약 4,000 g/mol 내지 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는, 방법.
  59. 제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 폴록사머 84, 폴록사머 101, 폴록사머 105, 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 304, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403, 폴록사머 407, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)인, 방법.
  61. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 임의의 콜레스테롤 지질을 혼합하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  62. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 적어도 50%의 캡슐화 효율을 갖는, 방법.
  63. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 60% 내지 99%의 캡슐화 효율을 갖는, 방법.
  64. 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 200 nm 이하의 평균 크기를 갖는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 지질 나노입자는 약 150 nm 이하, 140 nm 이하, 130 nm 이하, 120 nm 이하, 110 nm 이하, 또는 약 100 nm 이하의 평균 크기를 갖는, 방법.
  66. 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물.
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