KR20220029556A

KR20220029556A - 전령 rna의 정제 방법

Info

Publication number: KR20220029556A
Application number: KR1020217039631A
Authority: KR
Inventors: 조나단 아비살; 프랭크 데로사; 요렐 바르가스; 카메론 엠. 스미스
Original assignee: 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-03-08
Also published as: EP3969584A1; BR112021022910A2; US11453877B2; AU2020275885A1; CN114127283A; CA3139679A1; MX2021013954A; US20230062449A1; JP2022532214A; US20210002635A1; IL288022A; SG11202112350XA; WO2020232371A1

Abstract

무엇보다도, 본 발명은 임의의 가성 용매 또는 가연성 용매를 사용하지 않고, 임상 용도에 적합한 고품질 전령 RNA(mRNA)를 정제하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 mRNA의 무결성 및 고 순도를 유지하면서 에탄올을 사용하지 않는 선택적 침전 및 세척에 의해 mRNA를 성공적으로 정제할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 대규모 제조 공정 치료 응용예에서 임의의 가성 용매 또는 불연성 용매를 사용하지 않고 RNA를 정제하는 효과적이고, 신뢰할 수 있으며, 보다 안전한 방법을 제공한다.

Description

전령 RNA의 정제 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 5월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/848,412호 및 2019년 8월 26일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/891,781호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

전령 RNA(mRNA) 요법은 다양한 질환의 치료를 위한 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. mRNA 요법은 시험관 내에서 전사된(IVT) 고도로 순수한 전령 RNA(mRNA)를 포함하는 완제의약품을 상기 요법을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것; 및 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 생산하는 것을 포함한다. 따라서, 치료 용도에 적합한 고도로 순수한 mRNA 생성물을 효율적으로 및 대규모로 생산하는 것이 필요하다.

전통적으로, 시험관 내 전사를 통해 생성된 mRNA는 상업적으로 이용 가능한 크로마토그래피 시스템(예: HPLC)을 사용해 정제되고/되거나 유기 혼합물(페놀:클로로포름:이소아밀 알코올) 내로 추출한 다음 에탄올 침전에 의해 정제된다. 그러나, 컬럼 시스템을 사용하는 것은 비용이 많이 들고 까다로우며, mRNA의 추출에 가성 용매 또는 가연성 용매를 사용하는 것은 특히 대규모 적용 시 안전 및 비용 문제를 야기할 수 있다.

치료 용도로 허용 가능한 고도로 순수한 mRNA를 생산하는 안전하고 비용 효율적인 방법이 현재로서는 없다.

본 발명은 무엇보다도, 전령 RNA(mRNA)를 정제하는 매우 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명은, 소량의 휘발성 유기 화합물을 사용하거나 휘발성 유기 화합물을 사용하지 않고 고도의 무결성을 갖는 고순도의 mRNA를 수득하는 mRNA 정제 방법의 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 임의의 가성 용매 또는 가연성 용매를 사용하지 않고도 치료 응용예의 대규모 제조 방법에 사용될 수 있는 효과적이고, 신뢰할 수 있으며, 더 안전한 mRNA 정제 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명은 전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법을 제공하면, 상기 방법은 a) 고몰 염 용액 및 양친매성 중합체를 포함하는 현탁액에 mRNA를 침전시켜 침전된 mRNA를 제공하는 단계; b) 침전된 mRNA를 포획하는 단계; c) 단계 b)에서 포획된 침전된 mRNA를 세척액으로 세척하여 침전된 mRNA를 정제하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 침전된 mRNA를 가용화 용액으로 가용화시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물은 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 짧은 미성숙 RNA 종을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제된 mRNA 조성물은 약 1% 미만의 짧은 미성숙 RNA 종을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 긴 미성숙 RNA 종을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제된 mRNA 조성물은 모세관 겔 전기영동(CGE)에 의해 결정했을 때 약 55% 이하의 긴 미성숙/분해된 종을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제된 mRNA 조성물은 1% 미만의 이중-가닥 RNA를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 잔류 플라스미드 DNA를 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제된 mRNA 조성물은 10 pg/mg 이하의 잔류 플라스미드 DNA를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 잔류 시험관 내 효소를 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제된 mRNA 조성물 15 μg마다 0.3 ng 미만의 중합효소가 존재한다. 정제된 mRNA 조성물 15 μg마다 0.3 ng 미만의 캡 효소가 존재한다. 정제된 mRNA 조성물 15 μg마다 0.3 ng 미만의 테일 효소가 존재한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 잔류 용매를 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 조성물는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 잔류 플라스미드 DNA를 정제된 mRNA의 10 pg/mg 이하로 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 플루로닉, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 또는 폴리프로필렌 산화물과 같은 폴리에테르, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 플루로닉이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리비닐 피롤리돈이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리비닐 알코올이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리에테르이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 폴리프로필렌 산화물이다.

일부 구현예에서, 현탁액은 유기 용매를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 양친매성 중합체는 PEG이다. 일부 구현예에서, 현탁액은 유기 용매를 포함하지 않으며, mRNA는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용해 침전된다. 일부 구현예에서, 현탁액은 mRNA를 침전시키기 위한 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 10% 내지 약 100% w/v 농도로 PEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 약 50% w/v 농도로 PEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 25% w/v 미만의 최종 농도로 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 5% 내지 20% w/v의 최종 농도로 PEG를 포함한다. 특정 구현예에서, 현탁액은 10% 내지 15% w/v, 예를 들어 12% w/v의 최종 농도로 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 2000 내지 약 10000 g/mol이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 4000 내지 약 8000 g/mol이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 6000 g/mol이다(예: PEG-6000). 실시예에 나타낸 바와 같이, 약 12% w/v의 현탁액 중 분자량이 약 6000 g/mol(예: PEG-6000)인 최종 농도의 PEG가 효과적인 정제를 보장하고 고도로 순수한 mRNA 샘플을 제공하였다.

일부 구현예에서, 현탁액은 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 mRNA를 침전시키기 위한 TEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 10% 내지 약 100% w/v 농도로 TEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 약 50% w/v 농도로 TEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 mRNA를 침전시키기 위한 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 10% 내지 약 100% w/v 농도로 MTEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 약 50% w/v 농도로 MTEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 약 15% 내지 약 45% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 20% 내지 약 40% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 20% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 25% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 30% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 35% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 고몰 염 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN)를 포함한다. 일부 구현예에서, GSCN의 최종 농도는 약 2~4 M이다. 일부 구현예에서, GSCN의 최종 농도는 2.5~3 M이다. 특정 구현예에서, GSCN의 최종 농도는 약 2.7 M이다.

일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 플루로닉, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 또는 폴리프로필렌 산화물과 같은 폴리에테르, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 플루로닉이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리비닐 피롤리돈이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리비닐 알코올이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리에테르이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 폴리프로필렌 산화물이다.

일부 구현예에서, 세척액은 유기 용매를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세척액은 유기 용매를 포함하지 않으며 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 90 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 80 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 70 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 60 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 50 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 40 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 30 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 20 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액에 사용되는 PEG는 10 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 세척액에 사용하기에 적합한 PEG는 PEG-400과 같이 25℃에서 약 90 센티스트로크의 점도를갖는다. 따라서, 특정 구현예에서, 세척액에 사용된 PEG는 PEG-400이다.

일부 구현예에서, 세척액은 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 TEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액은 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르(MTEG)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, MTEG는 약 90% 내지 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 특정 구현예에서, MTEG는 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다.

실시예에 나타낸 바와 같이, MTEG는 침전된 mRNA를 침전된 형태로 유지하면서 이를 효과적으로 세척하는 세척액에 사용하기에 적합하다. MTEG는 실온에서 약 7 센티스트로크의 점도를 갖는다. 따라서, MTEG는 사용된 정제 공정(예를 들어, 유동 여과, 심층 여과, 또는 원심분리)에 관계없이 mRNA의 매우 효율적인 정제 및 회수를 가능하게 한다.

일부 구현예에서, 세척액 중의 양친매성 중합체는 PEG이다. 특정 구현예에서, 세척액 중 PEG의 분자량은 약 200 g/mol 내지 약 600 g/mol이다. 특정 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 약 400 g/mol의 분자량을 갖는다(예: PEG-400).

일부 구현예에서, PEG는 약 10% 내지 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다.

일부 구현예에서, PEG는 약 50% 내지 약 90% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 90% 내지 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다.

일부 구현예에서, PEG는 약 90% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 특정 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 약 400 g/mol의 분자량을 갖는다(예: PEG-400). 일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG의 분자량은 약 400 g/mol이며(예: PEG-400), 농도는 약 90% 내지 약 100% w/v이다. 특정 구현예에서, 세척액 중의 PEG의 분자량은 약 400 g/mol이며(예: PEG-400), 농도는 약 90% w/v이다.

일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 g/mol이다. 일부 구현예에서, 세척액 중 PEG의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 g/mol이다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척액 모두 중 PEG의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 g/mol이다. 특정 구현예에서, 현탁액 중 PEG의 분자량은 약 2,000 g/mol 내지 약 10,000 g/mol이고, 세척액 중 PEG의 분자량은 약 200 g/mol 내지 약 600 g/mol이다. 특정 구현예에서, 현탁액 중의 PEG는 PEG-6000이고, 세척액 중의 PEG는 PEG-400이다.

일부 구현예에서, 현탁액 중의 PEG는 선형이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 PEG는 분지형이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 PEG는 Y-형상이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중의 PEG는 다중 아암 구성이다.

일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 선형이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 분지형이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 Y-형상이다. 일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 다중 아암 구성이다.

일부 구현예에서, 현탁액 및 세척액 모두 중의 PEG는 선형이다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척액 모두 중의 PEG는 분지형이다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척액 모두 중의 PEG는 Y-형상이다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척액 모두 중의 PEG는 다중 아암 구성이다.

일부 구현예에서, 현탁액은 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1,000, PEG 1,500, PEG 2,000, PEG 3,000, PEG 3,350, PEG 4,000, PEG 6,000, PEG 8,000, PEG 10,000, PEG 20,000, PEG 35,000, 및 PEG 40,000으로부터 선택된 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 트리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 테트라에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 200을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 300을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 400을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 600을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 1,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 1,500을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 2,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 3,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 3,350을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 4,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 6,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 8,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 10,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 20,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 35,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 40,000을 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 6,000을 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 6,000을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 400이다.

일부 구현예에서, 현탁액은 PEG 150이다.

일부 구현예에서, 현탁액은 하나 이상의 PEG 중합체의 혼합물을 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 분자량을 갖는 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 기하학적 구성을 갖는 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액은 수성이다.

일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 약 50% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.01% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 약 50% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 45% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 40% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 35% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 30% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 25% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 20% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 15% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 10% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 5% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 2% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 1% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 0.5% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 현탁액은 현탁액 총 부피의 0.1% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 많은 휘발성 유기 화합물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 벤질 알코올을 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액에는 휘발성 유기 화합물이 없다.

일부 구현예에서, 현탁액에는 알코올이 없다.

일부 구현예에서, 현탁액에는 에탄올이 없다. 일부 구현예에서, 현탁액에는 이소프로필 알코올이 없다. 일부 구현예에서, 현탁액에는 벤질 알코올이 없다.

일부 구현예에서, 현탁액은 비수성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액의 비수성 성분은 에탄올이다. 일부 구현예에서, 현탁액의 비수성 성분은 이소프로필 알코올이다. 일부 구현예에서, 현탁액의 비수성 성분은 벤질 알코올이다.

일부 구현예에서, 세척액은 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1,000, PEG 1,500, PEG 2,000, PEG 3,000, PEG 3,350, PEG 4,000, PEG 6,000, PEG 8,000, PEG 10,000, PEG 20,000, PEG 35,000, 및 PEG 40,000으로부터 선택된 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 트리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 테트라에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 200을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 300을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 400을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 600을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 1,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 1,500을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 2,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 3,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 3,350을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 4,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 6,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 8,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 10,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 20,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 35,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액은 PEG 40,000을 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액은 PEG 6,000을 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액은 PEG 6,000을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 세척액은 PEG 400이다.

일부 구현예에서, 세척액은 하나 이상의 PEG 중합체의 혼합물을 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액 중 PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 분자량을 갖는 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액 중 PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 기하학적 구성을 갖는 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액은 수성이다.

일부 구현예에서, 세척액에는 휘발성 유기 화합물이 없다.

일부 구현예에서, 세척액에는 알코올이 없다.

일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 약 50% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.01% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 약 50% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 45% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 40% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 35% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 30% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 25% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 20% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 15% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 10% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 5% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 2% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 1% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 0.5% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 일부 구현예에서, 세척액은 세척액 총 부피의 0.1% 미만을 포함하는 휘발성 유기 화합물을 갖는다. 많은 휘발성 유기 화합물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 벤질 알코올을 포함한다.

일부 구현예에서, 세척액에는 에탄올이 없다. 일부 구현예에서, 세척액에는 이소프로필 알코올이 없다. 일부 구현예에서, 세척액에는 벤질 알코올이 없다.

일부 구현예에서, 세척액은 비수성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척액의 비수성 성분은 에탄올이다. 일부 구현예에서, 세척액의 비수성 성분은 이소프로필 알코올이다. 일부 구현예에서, 세척액의 비수성 성분은 벤질 알코올이다.

일부 구현예에서, 현탁액 및 세척 완충액은 모두 수성이다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척 완충액은 모두 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척 완충액은 모두 수성이고 동일한 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액 및 세척 완충액은 모두 수성이고, 현탁액은 제1 PEG를 포함하고, 세척 완충액은 제1 PEG와 상이한 제2 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG의 분자량은 약 2000 내지 약 10000 g/mol이고, 세척 완충액 중 PEG의 분자량은 약 200 내지 600 g/mol이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG의 분자량은 약 4000 내지 약 8000 g/mol이고, 세척 완충액 중 PEG의 분자량은 약 300 내지 500 g/mol이다. 일부 구현예에서, 현탁액 중 PEG의 분자량은 약 6000 g/mol(예:PEG-6000)이고, 세척 완충액 중 PEG의 분자량은 약 400 g/mol(예: PEG-400)이다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 포획하는 단계는 필터 상에서 일어난다. 일부 구현예에서, 필터는 미세여과 필터 또는 한외여과 필터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.05 μm 내지 1.0 μm의 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.05 μm, 0.10 μm, 0.20 μm, 0.3 μm, 0.4 μm, 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 또는 1.0 μm의 기공 크기를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.05 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.10 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.20 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.30 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.40 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.50 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.60 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.70 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.80 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 0.90 μm의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세여과 필터는 1.0 μm의 기공 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 필터는 100 kDa 내지 1,000 kDa의 명목 분자량 한계(NMWL)를 가지게 된다. 일부 구현예에서, 필터는 200 kDa 내지 700 kDa의 NMWL을 가지게 된다. 일부 구현예에서, 필터는 200 kDa 내지 500 kDa의 NMWL을 가지게 된다. 일부 구현예에서, 필터는 300 kDa의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 500 kDa의 NMWL을 갖는다.

일부 구현예에서, 미세여과 필터는 1,000 킬로달톤(kDa) 초과의 명목 분자량 한계(NMWL)를 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 0.05 μm 미만의 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 약 1 kDa 내지 1,000 kDA의 NMWL을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 1 kDA, 5 kDA, 10 kDA, 15 kDA, 20 kDA, 25 kDA, 50 kDA, 100 kDA, 150 kDA, 200 kDA, 250 kDA, 300 kDA, 350 kDA, 400 kDA, 450 kDA, 500 kDA, 550 kDA, 600 kDA, 650 kDA, 700 kDA, 750 kDA, 800 kDA, 850 kDA, 900 kDA, 950 kDA, 또는 1,000 kDA의 NMWL을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 1 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 5 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 10 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 15 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 20 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 25 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 50 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 100 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 150 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 200 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 250 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 300 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 350 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 400 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 450 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 500 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 550 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 600 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 650 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 700 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 750 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 800 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 850 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 900 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 950 kDA의 NMWL을 갖는다. 일부 구현예에서, 한외여과 필터는 1,000 kDA의 NMWL을 갖는다.

일부 구현예에서, 단계 c)에서 침전된 mRNA를 정제하는 데 접선 유동 여과(TFF) 또는 정용여과(diafiltration)가 사용된다. 따라서, 일부 구현예에서, 단계 c)에서 침전된 mRNA를 정제하는 데 TFF가 사용된다. 일부 구현예에서, 단계 c)에서 침전된 mRNA를 정제하는 데 정용여과가 사용된다.

일부 구현예에서, 필터 보조제가 사용된다.

일부 구현예에서, 필터 보조제는 셀룰로오스계이다. 특정 구현예에서, 셀룰로오스계 필터 보조제는 1:10의 침전된 mRNA 대 필터 보조제의 질량비로 현탁액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스계 필터 보조제는 약 5 내지 약 500 μm 길이의 정제된 셀룰로오스 섬유를 포함한다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 섬유는 길이가 약 10 내지 약 100 μm이다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 섬유는 길이가 약 20 μm, 30 μm, 40 μm, 또는 50 μm이다. 특정 구현예에서, 셀룰로오스계 필터 보조제는 약 20 μm 길이의 정제된 셀룰로오스 섬유(예를 들어, Solka-Floc® 또는 Sigmacell Cellulose 20)를 포함한다.

일부 구현예에서, 필터 보조제는 규조토(diatomaceous earth) 및/또는 화산재(volcanic ash)를 포함한다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 규조토를 포함한다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 화산재를 포함한다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 규조토 및 화산재를 포함한다.

일부 구현예에서, 가용화 용액은 물, Tris-EDTA(TE), 구연산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 물이다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 TE이다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 구연산나트륨이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 수율은 약 50% 내지 약 100%이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 수율은 약 70% 내지 약 99%이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 수율은 약 90% 내지 약 99%이다. 특정 구현예에서, 정제된 mRNA의 수율은 약 93% 초과, 예를 들어, 약 94% 초과, 특히 약 95% 초과이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 약 60% 내지 약 100%이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 약 80% 내지 99%이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 약 90% 내지 약 99%이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 원심분리하여 mRNA 펠릿을 수득한다.

일부 구현예에서, mRNA 펠릿을 완충액에 재현탁시킨다.

일부 구현예에서, 완충액은 물, TE, 구연산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 완충액은 물이다. 일부 구현예에서, 완충액은 TE이다. 일부 구현예에서, 완충액은 구연산나트륨이다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 100 mg, 1 g, 10 g, 100 g, 1 kg, 10 kg, 100 kg, 1 미터톤, 또는 10 미터톤의 mRNA 또는 그 사이의 임의의 양을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 100 mg을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 1 g을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 10 g을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 100 g을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 1 kg을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 10 kg을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 100 kg을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 1 미터톤을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 적어도 10 미터톤을 포함한다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 1 kg을 초과하는 mRNA를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법에는 에탄올이 사용되지 않는다.

일부 양태에서, 본 발명은 전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: a) PEG를 포함하는 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN) 용액에서 mRNA를 침전시키는 단계; b) 용액을 원심분리하여 mRNA 펠릿을 생성하는 단계; c) mRNA 펠릿을 완충액에 재현탁하는 단계; d) 필터 상에서 mRNA를 포획하는 단계; e) 단계 d)의 mRNA를 PEG 용액으로 세척하는 단계; f) 세척된 mRNA를 가용화시켜 실질적으로 오염물질이 없는 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 mRNA를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소를 혼합함으로써 시험관 내 전사(IVT)를 수행하여 전장 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 생성하는 단계; (b) 현탁액에 고몰 염과 양친매성 중합체를 제공하여 전장 mRNA를 침전시키고, 현탁액에 침전된 전장 mRNA를 제공하는 단계; (c) 현탁액을 필터에 도포하여 침전된 전장 mRNA를 포획하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 침전된 전장 mRNA를 수성 용매로 세척하여 수용액 중에서 정제된 전장 mRNA를 수득하는 단계; 및 (e) 단계 (d)의 침전된 mRNA를 가용화시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (d)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에는 (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 RNA 중합효소는 SP6 중합효소이다.

일부 구현예에서, 단계 (e)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (v) 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 현탁액은 분자량이 약 6000 g/mol인 PEG(예: PEG-6000)를 약 5% 내지 20% w/v의 최종 농도로 포함하고 GSCN을 약 2~4M의 최종 농도로 포함한다. 특정 구현예에서, 현탁액은 분자량이 약 6000 g/mol인 PEG(예: PEG-6000)를 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% w/v의 최종 농도로 포함하고, GSCN을 약 2.5 내지 3 M의 최종 농도로 포함한다. 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 현탁액 중 최종 농도가 20% 미만인 PEG를 이용한 중합체 유도 침전은 정제 후 매우 순수한 mRNA 샘플을 생성하였다. 또한, 현탁액 중 PEG의 최종 농도 약 12%(예를 들어, 50% PEG-6000의 하나의 비율) 및 2.7 M의 최종 GSCN 농도로 매우 효과적인 mRNA 정제를 달성하였다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA의 현탁액을 제공하기 위해 PEG 대신에 MTEG가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 목적을 위해 MTEG는 약 15% 내지 약 45% w/v의 최종 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 20% 내지 약 40% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 20% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 25% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 30% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 35% w/v의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 35% w/v 미만의 최종 농도로 MTEG를 포함한다. MTEG-유도 침전에 사용된 나머지 조건은 PEG-유도 침전에 사용된 것과 동일하다. 실시예에 나타낸 바와 같이, mRNA, GSCN, 및 MTEG를 포함하되 MTEG를 35% w/v 미만의 최종 농도로 포함하는 현탁액은 공정 효소의 원치 않는 침전 없이 mRNA를 효율적으로 회수할 수 있게 하였다. 공정 효소의 원치 않는 침전 없이 mRNA를 효율적으로 회수하는 데 특히 적합한 것은, 침전된 mRNA와의 질량비가 약 10:1인 필터 보조제(예를 들어, 셀룰로오스계 필터 보조제)에 추가하여, mRNA, GSCN, 및 MTEG를 포함하되, MTEG는 약 25%의 최종 농도로 포함하는 현탁액이다.

다음 도면은 단지 예시를 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아니다.
도 1은 5 mg의 IVT 반응과 상이한 침전 조건으로 정제한 mRNA의 수율을 보여준다.
도 2는 상이한 침전 조건으로 정제한 mRNA의 은 염색 겔을 보여준다. 은 염색 겔은 오염 공정 효소의 존재를 나타내기 위해 사용하였다. 겔의 좌측에 화살표로 표시된 겔 밴드는 SP6 RNA 중합효소의 이동을 나타낸다.
도 3은 다양한 비율의 PEG-6000을 이용한 중합체-유도 침전에 의해 정제된 mRNA의 수율을 보여준다.
도 4는 다양한 비율의 PEG-6000을 이용한 중합체-유도 침전에 의해 정제된 mRNA의 은 염색 겔을 보여준다.
도 5는 사용된 상이한 중합체 세척 완충액 및 농도에 대해, 중합체-유도 침전 및 중합체 세척을 통한 에탄올-무함유 mRNA 정제의 수율을 도시한다.
도 6은 90% 및 100% PEG-400 세척 완충액(각각 레인 3 및 4)에 대해, 에탄올-무함유 mRNA 정제 중합체-유도 침전 및 중합체 세척의 은 염색 겔을 도시한다.
도 7은 상이한 mRNA 작제물(OTC 및 CFTR)에 대해, 중합체-유도 침전 및 중합체 세척을 통한 에탄올-무함유 mRNA 정제의 회수율을 5 mg, 1 g 및 10 g 규모에서 보여준다.
도 8은 상이한 mRNA 작제물(OTC 및 CFTR)에 대해, 중합체-유도 침전 및 중합체 세척을 통해 정제된 mRNA의 무결성을 입증하는 모세관 전기영동(CE) 프로파일을 5 mg, 1 g 및 10 g 규모에서 보여준다.
도 9는 상이한 mRNA 작제물(OTC 및 CFTR)에 대해, 중합체-유도 침전 및 중합체 세척을 통한 에탄올-무함유 mRNA 정제의 은 염색 겔을 5 mg, 1 g 및 10 g 규모에서 보여준다.
도 10은 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제(OTC) mRNA를 10 그램, 5 mg, 또는 1 g 규모로 정제한 후 dsRNA의 존재 또는 부재를 나타내는 일련의 점 블롯이다. 정제 조건은 겔 위에 표시되어 있으며, 다음을 포함한다: 양성 대조군 레인(2 ng dsRNA 대조군, 25 ng dsRNA 대조군, 양성 대조군), 10 g의 OTC mRNA의 에탄올 기반 정제, 및 10 g, 5 g 또는 1 g의 OTC mRNA의 에탄올-무함유 정제.
도 11은 중합체-유도 침전과 다양한 w/v 농도의 MTEG를 이용한 세척을 통해 정제한 mRNA의 회수를 보여준다.
도 12는 현탁액 중 다양한 비율의 mRNA:염:MTEG를 사용하는 MTEG-유도 침전 및 95% w/v 농도의 MTEG를 이용한 세척을 통해 정제한 mRNA의 은 염색 겔을 보여준다.
도 13은 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 심층 여과 단계 및 세척 단계 후, 7.5 g OTC mRNA 샘플의 CE 도말 분석(smear analysis)을 보여준다.
도 14는 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 심층 여과 단계 및 세척 단계 후, 7.5 g OTC mRNA 샘플의 은 염색 겔을 보여준다.
도 15는 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 심층 여과 단계 및 세척 단계 후, 15 g CFTR mRNA 샘플의 CE 도말 분석을 보여준다.
도 16은 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 심층 여과 단계 및 세척 단계 후, 15 g CFTR mRNA 샘플의 은 염색 겔을 보여준다.
도 17은 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 원심분리 여과 단계 및 세척 단계 후, 15 g CFTR mRNA 샘플의 CE 도말 분석을 보여준다.
도 18은 침전을 위한 중합체로서 MTEG를 사용하는 원심분리 여과 단계 및 세척 단계 후, 15 g CFTR mRNA 샘플의 은 염색 겔을 보여준다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체를 통하여 설명된다.

"이상(or more)", "적어도(at least)", "초과(more than)" 등과 같은 용어, 예를 들어 "적어도 하나"는 명시된 값보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 이상 더 많은 것을 포함하는 것으로 이해되지만 이에 한정되지는 않는다. 임의의 더 큰 수 또는 그 사이의 분수도 포함된다.

역으로, 용어 "이하(no more than)"는 명시된 값보다 작은 각각의 값을 포함한다. 예를 들어, "100 뉴클레오티드 이하"는 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 및 0개의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 더 적은 수 또는 그 사이의 분수도 포함된다.

"복수의", "적어도 2개의", "둘 이상의", "적어도 두 번째" 등의 용어는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 or 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 이상을 포함하는 것으로 이해되지만 이에 한정되지는 않는다. 임의의 더 큰 수 또는 그 사이의 분수도 포함된다.

대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 또는 0.001% 이내인 것을 의미한다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값은 용어 "대략" 또는 "약"에 의해 수식된다.

배치(batch): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배치"는 한 번에 정제된, 예를 들어, 동일한 제조 사이클 동안 단일 제조 순서에 따라 정제된 mRNA의 수 또는 양을 지칭한다. 배치는 한 번의 반응에서 정제된 mRNA의 양을 지칭할 수 있다.

생물학적으로 활성인(biologically active): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어구 "생물학적으로 활성이 있는"은 생물학적 체계(biological system)에서, 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 제제의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 본 유기체에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성이 있는 것으로 여겨진다.

포함(comprising): 본원에서 사용되는 바와 같이, "포함(comprising, 또는 이의 변형인 comprises 또는 comprising)"은 명시된 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 그룹을 배제하지는 않는다는 것을 이해할 것이다.

dsRNA: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "dsRNA"는 시험관 내 전사(IVT) 반응 동안 생성된 상보적 RNA 서열을 지칭한다. 상보적 RNA 서열은 다음을 포함하는 다양한 이유로 생성될 수 있다: 예를 들어, 초기 RNA 가닥에서의 상보적 서열에 혼성화될 수 있는 짧은 미성숙 전사체, RNA 의존성 RNA 독립성 RNA 전사에 프라이머로서 작용하는 짧은 미성숙 전사체, 및 가능한 RNA 중합효소 템플릿 역전.

발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 서열의 "발현"은 mRNA가 폴리펩티드(예: 항체의 중쇄 또는 경쇄)로 번역되는 것, 다수의 폴리펩티드(예: 항체의 중쇄 또는 경쇄)가 온전한 단백질(예: 항체)로 조립되는 것, 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 조립된 단백질(예: 항체)가 번역 후 변형시키는 것을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 문법적으로 동등한 표현은 상호 교환적으로 사용된다.

기능적인(functional): 본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적인(functional)" 생물학적 분자는 해당 분자가 특징으로 하는 성질 및/또는 활성을 나타내는 형태를 가진 생물학적 분자이다.

개선(improve), 증가(increase) 또는 감소(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적으로 동등한 표현은 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정치 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 대상체(또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정치와 같은 기준선 측정치(baseline measurement)와 관련된 값들을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료 받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린, 치료 받는 대상체와 거의 동일한 연령인 대상체이다.

불순물(impurities): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 "오염물질"로도 지칭된다.

시험관내(In Vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험관내(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 지칭한다.

생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템에 반대되는) 생세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.

단리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된"은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성 성분으로부터 분리된 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티(entity)를 말한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 최초에 결합된 다른 구성 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 보다 높은 순도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 다른 성분이 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 엔티티의 순도 백분율의 계산에는 부형제(예컨대, 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.).

전령 RNA (mRNA): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전령 RNA(messenger RNA, mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 것과 같은 mRNA는 변형된 RNA 및 변형되지 않은 RNA 둘 다를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 영역 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다.

mRNA 무결성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 무결성"은 일반적으로 mRNA의 품질을 말한다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성은 정제 공정 후에 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 지칭한다. mRNA 무결성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용해, 예를 들어, RNA 아가로오스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Weley & Sons, Inc., 1997] 참조).

핵산(nucleic acid): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예: 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당업계에 공지되어 있고, 백본 내에 인산다이에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖는, 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 용어 "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴형 버전(degenerate version)이고/이거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 RNA는 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형체 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예컨대, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-디옥시리보스, 아라비노오스 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포아미다이트 결합)이거나 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 구체적으로는, 전달을 용이하게 하거나 전달을 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않은 핵산(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함하는, 뉴클레오티드 및 잔기)를 의미하는 "비변형 핵산"에 관한 것이다.

침전(precipitation): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "침전(또는 이의 임의의 문법적 동의어)"은 용액 중에서 고형분이 형성되는 것을 지칭한다. mRNA와 관련하여 사용될 때, 용어 "침전"은 액체 중에서 불용성 형태 또는 고형 형태의 mRNA를 형성하는 것을 지칭한다.

조기 미성숙 RNA 서열(prematurely aborted RNA sequences): 본원에서 사용되는 용어 "조기 미성숙 RNA 서열", "짧은 미성숙 RNA 종", "쇼트머(shortmer)", 및 "긴 미성숙 RNA 종"은 mRNA 합성 반응(예를 들어, 시험관 내 합성 반응)의 불완전 산물을 지칭한다. 다양한 이유로, RNA 중합효소는 DNA 템플릿의 전사를 항상 완성하지는 않으며; 예를 들어, RNA 합성이 조기에 종결된다. RNA 합성의 조기 종결의 가능한 원인은 DNA 템플릿의 품질, 템플릿에 존재하는 특정 중합효소에 대한 중합효소 종결자 서열, 분해된 완충액, 온도, 리보뉴클레오티드의 고갈, 및 mRNA 이차 구조를 포함한다. 조기 미성숙 RNA 서열은 원하는 전사 산물의 의도된 길이보다 짧은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 조기 미성숙 mRNA 서열은 1000 염기 미만, 500 염기 미만, 100 염기 미만, 50 염기 미만, 40 염기 미만, 30 염기 미만, 20 염기 미만, 15 염기 미만, 10 염기 미만, 또는 더 짧을 수 있다.

염(salt): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 이온 화합물을 지칭한다.

실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.

실질적으로 없는(substantially free): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 제거될 물질(예를 들어, 조기 미성숙 RNA 서열)의 양이 상대적으로 거의 없거나 전혀 없는 상태를 지칭한다. 예를 들어, "조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 미성숙 RNA 서열이 불순물의 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%(w/w)보다 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다. 대안적으로, "조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 미성숙 RNA 서열이 약 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg보다 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자가 공통적으로 이해하고, 본 출원이 속하는 기술 분야에서 공통적으로 사용되는 것과 같은 의미를 가지며; 이러한 기술 분야는 그 전체가 참조에 의해 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

본 발명은, 무엇보다도, 정제 공정에서 알코올을 사용하지 않고 mRNA를 정제하는 개선된 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 양태는 다음의 섹션들에서 상세히 기술된다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본원에서, 달리 명시되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다.

정제 방법

mRNA를 정제하는 데 가성 용매 또는 가연성 용매를 사용하는 것은 특히 대규모 제조에서 안전 문제 및 비용 문제를 야기할 수 있다. 본 발명은 가성 용매 또는 가연성 용매를 사용하지 않고 mRNA를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 방법은 대부분의 임상적 및 상업적 요구를 충족시킬 수 있는 규모로 제조된 mRNA의 효율적인 포획, 세척, 및 고수율 단리를 가능하게 한다. 따라서, 본 개시는 mRNA 대체 요법에 대한 대책을 제공하여, mRNA 대체 요법이 현재 이용 가능한 보다 전통적인 효소 대체 요법 및 생물치료제에 대한 실행 가능하고 성공적인 대안이 될 수 있게 한다.

실행 가능하고 성공적인 대안이 되려면, 모든 임상 및 상업적 요구를 충족하는 대규모 제조 능력이 확립될 수 있도록 mRNA 정제 방법이 안전하고, 비용 효율적이며, 강력하고, 확장 가능해야 한다. 적절한 mRNA 정제 방법은 현재 이용 가능한 업계 표준 mRNA 정제 방법과 비교했을 때 동등하거나 더 나은 제품을 제공함과 동시에 안전하고, 비용 효율적이며, 쉽게 확장될 수 있는 것이다. 특히, 본원에 제공된 방법은 가성 용매 또는 가연성 용매의 사용을 배제하고, 정제 후 mRNA 수율을 높이고, 정제 후 mRNA 무결성을 유지하며, 공정 관련 오염 물질(예를 들어, 조기 미성숙 RNA 서열(짧은 미성숙 RNA 종 또는 "쇼트머"), 긴 미성숙 RNA 종, 이중-가닥 RNA(dsRNA), 플라스미드 DNA, 잔류 용매, 잔류 염, 및 시험관 내 잔류 전사 효소)을 제거한다.

본원에 제공된 방법은 광범위한 규모로 사용할 수 있다. 예를 들어, 그리고 본원에서 추가로 논의된 바와 같이, 제공된 방법은 다양한 규모, 예컨대 100 mg 이하 내지 1 kg 초과의 규모의 정제를 가능하게 한다. 또한, 본원에 제공된 데이터는 본 발명이, mRNA의 정제를 위해 알코올과 같은 가연성 용매의 사용에 의존하는 현재 이용 가능한 방법에 대한 유능한 (및 비용이 더 낮은) 대안임을 보여준다. 본원에 제공된 mRNA 정제 방법은, 예를 들어 실험적 용도, 임상적 용도, 또는 상업적 용도를 포함하는 다양한 용도에 적합하다. 또한, 본 발명은 산업 표준 방법 및 키트로는 이용할 수 없는 확장성이라는 상당한 부가적인 이점을 갖는다. 마지막으로, 본원에 개시된 방법은, 알코올 용매 및/또는 크로마토그래피를 포함하는 여과 방법과 같은 현재 공정에 비해 매우 비용 효율적이다. 예를 들어, WO　2011/068810; WO　2012/075040; WO　2014/152659; WO　2014/152673; WO　2014/152966; WO　2015/164773; WO　2016/004318; US　62/420,413; 및 PCT/US16/57044를 참조한다.

따라서, 본원에 기술된 방법은 mRNA의 대규모 양(예: 본원에 기술된 임의의 배치 크기 또는 로딩 부피)을 포함하는 mRNA의 정제에 유리하다. 기술된 바와 같은 정제 방법은 높은 수준의 무결성과 치료적 용도로 허용 가능한 순도를 가진 mRNA를 제공할 수 있으며, 정제의 측면에서 전장 mRNA의 손실을 최소화할 수 있다.

본원에 기술된 mRNA를 정제하는 방법은 mRNA를 침전시키는 단계, 침전된 mRNA를 포획하는 단계, 및 포획된 침전된 mRNA를 세척하여 실질적으로 오염물질이 없는 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함한다. 이들 단계의 각각은 다음 섹션에 자세히 기술되어 있다.

mRNA의 침전

mRNA를 정제하는 방법은, 고몰 염 용액 및 양친매성 중합체를 포함하는 현탁액에 mRNA를 침전시키는 단계, mRNA를 포획하는 단계, 및 mRNA를 세척하여 실질적으로 오염물질이 없는 mRNA를 수득하는 단계를 포함한다.

본원에 기술된 방법은 mRNA를 포함하는 제공된 현탁액(예를 들어, 시험관 내 합성 반응 혼합물)에서 mRNA를 정제하는 데 적합하다. 현탁액은 다양한 오염물질, 예를 들어 플라스미드 DNA 및 효소를 가질 수 있다.

일 구현예에서, 염(예: 구아니딘 티오시아네이트(GSCN)와 같은 카오트로픽 염(chaotropic salt))을 mRNA 함유 현탁액에 첨가하여 오염 단백질을 변성시키고 가용화시킨다. 따라서, 일 구현예에서, GSCN은 현탁액 중에 고몰 용액으로 존재한다. 이어서, 양친매성 중합체를 첨가하여 mRNA를 선택적으로 침전시킨다. mRNA 침전 후, 생성된 침전된 mRNA를 필터 또는 막을 사용해 포획하고, 세척하여 오염물질(예를 들어, 짧은 미성숙 RNA 종, 긴 미성숙 RNA 종, dsRNA, 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 염, 및 잔류 용매)이 없는 침전물을 수득한다. 이어서 침전된 mRNA를 물로 용해시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득한다.

일부 구현예에서, mRNA의 침전을 촉진하는 하나의 제제는 구아니딘 티오시아네이트(예를 들어, 약 1~5M 구아니딘 티오시아네이트를 포함하는 용액)를 포함한다. 예를 들어, 용액은 약 1M, 1.5M, 2.0M, 2.5M, 3.0M, 3.5M, 4.0M, 4.5M, 또는 약 5M GSCN을 포함한다. 적절한 GSCN 완충액의 예는, 예를 들어, 4M 구아니딘 티오시아네이트, 25 mM 구연산나트륨 pH 6.5, 0.5% N-라우로일사르코신 나트륨 염을 포함하는 수용액을 포함한다. GSCN 완충액의 추가의 예는 10 mM 디티오트레이톨(DTT) 완충액 중 5M GSCN을 포함하는 수용액이다. 일부 구현예에서, GSCN의 최종 농도는 2~4 M이다. 일부 구현예에서, GSCN(예를 들어 5M GSCN-10mM DTT 완충액)의 최종 농도는 2.5~3 M이다. 특정 구현예에서, GSCN의 최종 농도는 약 2.7 M이다.

많은 양친매성 중합체가 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본원의 방법에 사용된 양친매성 중합체는 플루로닉류(pluronics), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: PEG 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1,000, PEG 1,500, PEG 2,000, PEG 3,000, PEG 3,350, PEG 4,000, PEG 6,000, PEG 8,000, PEG 10,000, PEG 20,000, PEG 35,000, 및 PEG 40,000, 또는 이들의 조합. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 2가지 이상의 분자량의 PEG 중합체가 사용된 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12가지 분자량의 PEG 중합체가 양친매성 중합체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG 용액은 하나 이상의 PEG 중합체의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 분자량을 갖는 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 현탁액에서 mRNA를 침전시키는 단계는 하나 이상의 양친매성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액에서 mRNA를 침전시키는 단계를 위한 PEG 중합체를 포함한다. 다양한 종류의 PEG 중합체가 당업계에서 인식되며, 이들 중 일부는 구별되는 기하학적 구성을 갖는다. 본원의 방법에 적합한 PEG 중합체는, 예를 들어 선형, 분지형, Y-형상, 또는 다중 아암 구성을 갖는 PEG 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 구별되는 기하학적 구성을 갖는 하나 이상의 PEG를 포함하는 현탁액이다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG-6000을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG-400을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 터트-부틸-TEG-O-프로피오네이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이메틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이비닐 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-모노부틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-메틸 에테르 메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-모노데실 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이벤조에이트를 사용해 달성될 수 있다. 이들 PEG 또는 TEG-계 시약 중 어느 하나는 mRNA를 침전시키기 위한 구아니디늄 티오시아네이트와 조합하여 사용될 수 있다. 이들 시약 각각의 구조는 아래 표 A에 나타나 있다.

[표 A] mRNA의 정제(mRNA의 침전 및/또는 세척)를 위한 비-유기 용매 시약

일부 구현예에서, 현탁액에서 mRNA를 침전시키는 단계는 PEG 중합체를 포함하되, PEG 중합체는 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG-2K)이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 DOPA-PEG 접합체이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 폴록사머-PEG 접합체이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 DOTAP를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 콜레스테롤을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA는 양친매성 중합체를 포함하는 현탁액에 침전된다. 일부 구현예에서, mRNA는 전술한 PEG 시약 중 어느 하나를 포함하는 현탁액에 침전된다. 일부 구현예에서, PEG는 약 10% 내지 약 100% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PEG는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% w/v 농도, 및 그 사이의 임의의 값으로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 5% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 6% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 7% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 8% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 9% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 10% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 12% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 15% w/v로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 18% w/v로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 20% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 25% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 30% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 35% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 40% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 45% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 50% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 55% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 60% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 65% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 70% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 75% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 80% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 85% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 90% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 95% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 100% w/v의 농도로 현탁액 중에 존재한다.

일부 구현예에서, 현탁액에 mRNA를 침전시키는 단계는 약 0.1 내지 약 5.0의 PEG 대 총 mRNA 현탁액 부피의 부피:부피 비율을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PEG는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, 4.0, 4.25, 4.5, 4.75, 5.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG는 약 0.1의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.2의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.3의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.4의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.5의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.6의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.7의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.8의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 0.9의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 1.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 1.25의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 1.5의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 1.75의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 2.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 2.25의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 2.5의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 2.75의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 3.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 3.25의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 3.5의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 3.75의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 4.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 4.25의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 4.50의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 4.75의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 5.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다. 특정 구현예에서, PEG는 약 1.0, 약 1.5, 또는 약 2.0의 부피:부피 비율로 mRNA 현탁액에 존재한다.

일부 구현예에서, mRNA 침전을 위한 반응 부피는 GSCN 및 PEG를 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA 침전을 위한 반응 부피는 약 4000 내지 약 8000 g/mol, 예를 들어 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG(예를 들어, PEG-6000) 및 GSCN을 포함한다. GSCN은 일반적으로 2M 내지 4M의 최종 농도이다. PEG는 일반적으로 약 10% 내지 약 20%(w/v)의 최종 농도이다.

일부 구현예에서, mRNA를 정제하는 방법은 무알코올 방법이다.

일부 구현예에서, 비수성 용매(예: 알코올)가 첨가되어 mRNA를 침전시킨다. 일부 구현예에서, 용매는 이소프로필 알코올, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합일 수 있다. 구현예에서, 용매는 알코올 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올)이다. 구현예에서, 용매는 케톤 용매(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 또는 메틸 이소부틸 케톤)이다. 일부 구현예에서, 비수성 용매는 양친매성 용액과 혼합된다.

일부 구현예에서, 수성 용매가 첨가되어 mRNA를 침전시킨다. 일부 구현예에서, 수용액은 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용액은 PEG 중합체를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질을 변성시키고(예를 들어, 전사 후에 첨가되어 DNA 템플릿을 제거하는 RNA 중합효소 및 DNase I)/시키거나 수성 매질에서 단백질을 가용성인 상태로 유지시키는 하나 이상의 제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질을 변성시키고/시키거나 수성 매질에서 단백질을 가용성인 상태로 유지시키는 하나 이상의 제제는 염, 예를 들어, 카오트로픽 염이다.

일부 구현예에서, 침전시키는 단계는 카오트로픽 염(예를 들어, 구아니딘 티오시아네이트) 및/또는 양친매성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜의 수용액) 및/또는 알코올 용매(예를 들어, 무수 에탄올 또는 수성 에탄올 용액과 같은 알코올의 수용액)의 사용을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 침전시키는 단계는 GSCN 및 PEG와 같은 양친매성 중합체 및 카오트로픽 염의 사용을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA의 침전을 촉진하는 제제는 변성제를 포함하거나 변성 조건으로 부터 생성된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변성 조건"은 mRNA의 변성을 유발할 수 있는 임의의 화학적 또는 물리적 조건을 지칭한다. 예시적인 변성 조건은 화학 시약의 사용, 고온, 극단적인 pH 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 변성 조건은 정제될 mRNA를 함유하는 불순한 제제에 하나 이상의 변성제를 첨가함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 변성제는 단백질 및/또는 DNA 변성제이다. 일부 구현예에서, 변성제는 1) 효소(예컨대, 세린 단백분해효소 또는 DNase), 2) 산, 3) 용매, 4) 가교제, 5) 카오트로픽제, 6) 환원제, 및/또는 7) 높은 염 농도를 통한 높은 이온 강도일 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 제제는 이들 카테고리 중 둘 이상에 포함될 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 효소가 변성제로서 사용되어 mRNA 합성에 사용된 DNA 주형 및 단백질을 분해할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 효소는 키모트립신 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제, 트립신 및 트립신-유사 세린 프로테아제, 엘라스타아제 및 엘라스타아제-유사 세린 프로테아제, 서브틸리신 및 서브틸리신-유사 세린 프로테아제, 및 이들의 조합; 데옥시리보뉴클레아제 I, II, 및/또는 IV와 같은 데옥시리보뉴클레아제(DNase), EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, SpeI, SphI, StuI, XbaI와 같은 제한 효소, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

일부 구현예에서, 산이 변성제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 산은 아세트산, 포름산, 옥살산, 구연산, 벤조산, 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 아스코르브산, 설포살리실산, 및 이들의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, 용매가 변성제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용매에는 가성제 또는 가연성 제제가 없다. 일부 구현예에서, 용매에는 에탄올이 없다. 일부 구현예에서, 용매에는 이소프로필 알코올, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합이 없다. 일부 구현예에서, 용매에는 알코올 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올)가 없다. 일부 구현예에서, 용매에는 케톤 용매(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 또는 메틸 이소부틸 케톤)가 없다.

일부 구현예에서, 용매가 변성제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용매는 에탄올이다. 일부 구현예에서, 용매는 이소프로필 알코올, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 용매는 알코올 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올)이다. 일부 구현예에서, 용매는 케톤 용매(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 또는 메틸 이소부틸 케톤)이다.

일부 구현예에서, 카오트로픽 제제가 변성제로서 사용될 수 있다. 카오트로픽 제제는 수소 결합 및 반데르 발스 힘과 같은 비공유력을 방해함으로써 단백질 및 핵산과 같은 거대분자의 구조를 파괴하는 물질이다. 일부 구현예에서, 카오트로픽 제제는 우레아, 티오우레아, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 소듐 도데실 설페이트, 리튬 퍼클로레이트, 및 이들의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, 환원제가 변성제로서 사용될 수 있다. 환원제는 다른 종에 전자를 공여하여 스스로 산화되는 화합물이다. 일부 구현예에서, 환원제는 리튬 알루미늄 하이드라이드, 소듐 아말감, 디보란, 소듐 보로하이드라이드, 설파이트, 디이소부틸알루미늄 하이드라이드, 포스파이트, 일산화탄소, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀, 및 이들의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, pH, 열, 및/또는 중금속(예컨대, 납, 수은, 또는 카드뮴) 중 하나 이상이 변성 조건을 제공하기 위한 변성제로서 사용될 수도 있다. 극단적인 pH는 단백질을 변성시키는 것으로 알려져 있다. 단백질 사슬의 백본은 중성이지만, 단백질을 포함하는 아미노산 잔기는 종종 산성 및 염기성 기를 함유한다. 이들 기는 일반적으로 하전되고, 반대 전하의 기와 염 브릿지를 형성할 수 있다. 따라서, pH의 극단은 이들 산성 및 염기성 기 상에서 전하를 변화시켜 염 브릿지를 파괴할 수 있다.

일부 구현예에서, pH의 덜 급격한 변화도 단백질의 활성 및 가용성에 영향을 미칠 수 있다. 개별 아미노산과 마찬가지로, 단백질은 음전하의 수가 양전하의 수와 동일한 등전점을 갖는다. 흔히 이는 최소 수용해도의 지점이다. 등전 pH에서, 분자 상에는 순 전하가 없다. 개별 분자는 서로에게 접근하여 응고하고, 용액으로부터 침전되는 경향이 있다. 등전 pH보다 높거나 낮은 pH에서, 분자는 각각 순 음전하 또는 양전하를 갖는다. 따라서, 단백질 분자가 서로 접근할 때 이들의 전체 전하는 동일하고 서로 반발하게 된다.

일부 구현예에서, 열이 변성제로서 사용될 수 있다. 열은 단백질 분자에 동역학 에너지를 공급하여 원자가 더 빠르게 진동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 수소 결합 및 소수성 상호작용과 같은 비교적 약한 힘을 파괴하게 된다. 열은 멸균에도 사용되어 박테리아 중의 효소를 변성시켜 파괴한다.

일부 구현예에서, 수은(II), 납(II), 및 은과 같은 금속 이온의 염은, 이황화 기와 강한 결합을 형성하고 산성 아미노산의 카복실레이트 이온과도 강한 결합을 형성하는 이들의 능력으로 인해 변성제로서 사용될 수 있다. 따라서, 이들은 이황화 브릿지 및 염 연결을 모두 파괴하고, 단백질을 용액으로부터 불용성 금속-단백질 염으로서 침전시킨다.

일부 구현예에서, 고농도의 염(고 염도)이 변성제로서 사용될 수도 있다. 고농도의 염은 단백질 및 핵산 둘 다를 수용액으로부터 침전시키는 것으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 1M 내지 10M일 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 2M 내지 9M일 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 2M 내지 8M일 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 2M 내지 5M일 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 1M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 2M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 3M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 4M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 5M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 6M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 7M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 고농도의 염은 8M 농도를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 염이 변성제로서 사용된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 염이 변성제로서 사용된다.

일부 구현예에서, 변성제로서 사용되는 염은 칼슘 염, 철 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 나트륨 염, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서 변성제로서 사용하기에 적합한 예시적인 특이적 염은 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 염화리튬(LiCl), 염화칼슘(CaCl₂), 브롬화칼륨(KBr), 브롬화나트륨(NaBr), 브롬화리튬(LiBr)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 불순한 제제인 변성제는 염화칼륨(KCl)으로 처리된다. 일부 구현예에서, KCl은 생성되는 KCl 농도가 약 1M 이상이 되도록 첨가된다. 일부 구현예에서, KCl은 생성되는 KCl 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 또는 5M 이상이 되도록 첨가된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 원심분리하여 mRNA 펠릿을 수득한다. 그런 다음, mRNA 펠릿을 완충액, 예컨대 물, TE, 구연산나트륨, 또는 이들의 조합에 재현탁시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, mRNA 펠릿은 물에 재현탁된다. 일부 구현예에서, mRNA 펠릿은 TE에 재현탁된다. 일부 구현예에서, mRNA 펠릿은 염화나트륨에 재현탁된다.

일부 구현예에서, mRNA는 다음을 포함하는 현택액에서 침전된다: 약 2~4 M의 최종 농도의 GSCN; 약 4000 내지 약 8000 g/mol의 분자량을 갖는, 예를 들어, 약 5% 내지 약 20 %(w/v)의 최종 농도에서 약 6000 g/mol(예: PEG-6000)의 분자량을 갖는 PEG; 및 침전된 mRNA와 약 2:1, 약 5:1, 약 10:1, 또는 약 15:1의 질량비의 필터 보조제(예를 들어, 셀룰로오스계 여과 보조제). 일부 구현예에서, mRNA는 다음을 포함하는 현택액에서 침전된다: 약 2.5~3 M의 최종 농도의 GSCN; 약 10% 내지 15%(w/v)의 최종 농도에서 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG(예: PEG-6000); 및 침전된 mRNA와 약 10:1의 질량비의 필터 보조제(예를 들어, 셀룰로오스계 여과 보조제). 일부 구현예에서, mRNA는 다음을 포함하는 현택액에서 침전된다: 약 2.7M의 최종 농도의 GSCN; 약 12%(w/v)의 최종 농도에서 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG(예: PEG-6000); 및 침전된 mRNA와 필터 보조제(예를 들어, 셀룰로오스계 여과 보조제, 예를 들어 Solka-Floc)의 약 10:1의 질량비. 실시예에 나타낸 바와 같이, 이러한 농도의 mRNA, 염, 및 PEG를 포함하는 현탁액은 침전 공정 효소 없이 mRNA를 매우 효과적으로 정제한다.

예를 들어, GSCN은 (예를 들어, 10mM DTT 완충액 중) 4~8M 용액으로서 제공될 수 있는데, 그런 다음 이를 mRNA 및 MTEG와 조합하여 침전된 mRNA의 현탁액을 제조한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2~3:1~2의 부피비로 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2~2.5:1~2의 부피비로 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2.3:1~2의 부피비로 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2.3:2의 비율로 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2.3:1.7의 부피비로 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 침전된 mRNA, 카오트로픽 염(예를 들어 GSCN), 및 MTEG를 1:2.3:1의 비율로 포함한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, mRNA, GSCN, 및 MTEG를 1:2.3:1, 1:2.3:1.7, 및 1:2.3:2의 부피비로 포함하는 현탁액은, 약 95%의 최종 농도의 MTEG 세척액과 함께 중합체-유도 정제 방법에 특히 적합하며 - 이들 단계를 조합하는 경우 원치 않는 침전 공정 없이 mRNA의 효율적인 회수를 보장한다.

mRNA의 포획

본원에 기술된 바와 같은 mRNA를 정제하는 방법의 또 다른 단계는 mRNA를 포획하는 단계를 포함한다. mRNA를 포획하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 함유하는 불순한 제제는, 침전된 mRNA가 막 또는 필터에 의해 포획되거나 걸러지도록 막 여과를 포함하는 정제 공정을 거친다. 따라서, 일부 구현예에서, 불순한 제제는, 불용성 물질을 제거하기 위한 전처리 없이, 침전 후 막 여과를 거치게 된다.

다양한 유형의 막 여과를 사용하여 침전된 mRNA를 포획하거나 걸러낼 수 있다. 일반적으로, 막 여과는 하나 이상의 개재된 투과성 막을 사용해 유체로부터 고형분을 분리하는 것을 포함한다. 막 여과는 기상 샘플로부터 입자를 여과하는 데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 두 가지 주된 형태의 막 여과가 있는데, 수동 여과(passive filtration)는 용액-확산에 의해서만 진행되며, 능동 여과(active filtration)는 양압 또는 음압(즉, 진공)을 사용하여 강제로 액체 또는 가스를 막을 통과시킨다. 일반적으로, 막 여과는 로딩, 세척, 및 용리 단계를 포함한다.

필터 상에 mRNA를 포획하는 단계는, 침전된 mRNA를 포함하는 용액을 막 또는 필터 상에 로딩하는 단계를 포함한다. 이 단계는 일반적으로 로딩 단계로서 지칭된다. 로딩 단계는, 피드(예를 들어, 침전된 mRNA를 함유하는 불순한 제제)를 막 또는 필터 상에 로딩하고, 양압 또는 음압에 의해 이를 강제로 막 또는 필터를 통과시켜, 잔류물을 포획되거나 걸러진 상태에 막 상에 남기는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "잔류물"은 막에 의해 걸러진 임의의 비투과성 용질 및/또는 불용성 물질을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 침전된 mRNA는 막의 의해 잔류물로서 포획된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "막" 또는 "필터"는 임의의 다공성 물질의 층 또는 시트를 지칭한다. 본원에서, 용어 "막"은 필터와 상호 교환 가능하게 사용된다.

일부 구현예에서, 적합한 막은, 불순물(가용성 불순물 및/또는 기공 크기보다 작은 크기의 불용성 불순물을 포함함)을 투과물로서 통과시키면서, 침전된 mRNA를 포획하거나 걸러내기에 적절한 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 막은 약 0.10 μm, 0.20 μm, 0.22 μm, 0.24 μm, 0.26 μm, 0.28 μm, 0.30 μm, 0.40 μm, 0.5 μm, 또는 1.0 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 적합한 막은 약 0.22μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 막은 약 1.0 μm, 1.5 μm, 2.0 μm, 2.5 μm, 3.0 μm, 3.5 μm, 4.0 μm, 4.5 μm, 5.0 μm, 5.5 μm, 6.0 μm, 6.5 μm, 7.0 μm, 7.5 μm, 8.0 μm, 8.5 μm, 9.0 μm, 9.5 μm, 및 10 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 정상 유동 여과(NFF) 또는 심층 여과와 함께 사용하기에 적합한 막은 약 5 μm 내지 약 8 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, NFF 또는 심층 여과와 함께 사용하기에 적합한 막은 약 7 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 원심분리 여과와 함께 사용하기에 적합한 막은 약 0.5 μm 내지 약 2.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 원심분리 여과와 함께 사용하에 적합한 막은 약 1 μm이다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 걸러내기에 적절한 기공 크기는, 분자량 컷오프(MWCO)로도 지칭되는, 침전된 mRNA의 명목 분자량 한계(NMWL)에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 침전된 mRNA의 NMWL 또는 MWCO보다 작은 기공 크기를 갖는 막이 사용된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA의 NMWL 또는 MWCO보다 2 내지 6배(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6배) 작은 기공 크기를 갖는 막이 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막은 약 100 킬로달톤(kDa), 300 kDa, 500 kDa, 1,000 kDa, 1,500 kDa, 2,000 kDa, 2,500 kDa, 3,000 kDa, 3,500 kDa, 4,000 kDa, 4,500 kDa, 5,000 kDa, 5,500 kDa, 6,000 kDa, 6,500 kDa, 7,000 kDa, 7,500 kDa, 8,000 kDa, 8,500 kDa, 9,000 kDa, 9,500 kDa, 또는 10,000 kDa 이상의 기공 크기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 막은 mRNA의 NMWL 및 MWCO보다 크지만, 침전된 mRNA의 NMWL 및 MWCO보다 작은 기공 크기를 갖는다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 mRNA를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: 고몰 염 용액 및 PEG 중합체를 포함하는 현탁액에서 mRNA를 침전시켜 현탁액에 침전된 mRNA를 제공하는 단계; 침전된 mRNA의 NMWL 및 MWCO보다 크지만 침전된 mRNA의 NMWL 및 MWCO보다는 작은 기공 크기를 갖는 필터 상에 침전된 mRNA를 포획하는 단계; 및 포획된 침전된 mRNA를 세척하여 실질적으로 오염물질이 없는 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에 적합한 막은 임의의 물질로 제조될 수 있다. 예시적인 막 물질은, (비변형) 폴리에테르설폰(PES), 폴리에테르설폰(mPES) 중공 섬유막, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, MCE(혼합 셀룰로오스 에스테르), 초고 MW 폴리에틸렌(UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌(PTFE), 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르 설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리비닐 클로라이드, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 막은 약 1.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는 폴리프로필렌 필터이다.

본 발명에 적합한 막은 다양한 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 막은 mRNA의 대규모 생산을 용이하게 하기에 충분히 큰 표면적을 갖는다. 예를 들어, 적합한 막은 약 2,000 cm², 2,500 cm², 3,000 cm², 3,500 cm², 4,000 cm², 4,500 cm², 5,000 cm², 7,500 cm², 10,000 cm², 5 m², 10 m², 12 m², 15m², 20m², 24 m², 25 m², 30m², 또는 50 m² 이상의 표면적을 가질 수 있다.

막 여과는 침전된 mRNA를 포획하기 위해 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 막 여과는 접선 유동 여과(TFF)의 일부로서 수행된다. 일부 구현예에서, 막 여과는 정상 유동 여과(NFF) 또는 심층 여과를 포함한다. 일부 구현예에서, 막 여과는 원심분리 여과를 포함한다.

필터 보조제(분산제 포함)

일부 구현예에서, 필터 보조제가 본원에 기술된 방법에 사용된다. 필터 보조제는 여과 원심분리기를 사용해 침전된 mRNA를 정제할 때 사용될 수 있다. 필터 보조제는, 침전된 mRNA를 여과 원심분리기의 필터 상에 걸러내고, 걸러낸 mRNA를 여과 원심분리기의 필터 표면으로부터 제거하는 데 도움을 줄 수 있다.

일부 구현예에서, 필터 보조제는 분산제이다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 재, 점토, 규조토, 펄라이트, 유리 비드, 플라스틱 비드, 중합체, 폴리프로필렌 비드, 폴리스티렌 비드, 염(예를 들어, 셀룰로오스 염), 모래, 화산재, 규조토, 및/또는 당류 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 분산제는 비드이다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA 조성물은 분산제를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, mRNA의 침전을 촉진하는 하나 이상의 제제를 첨가하는 단계는 임의의 분산제가 없을 때 수행된다.

일부 구현예에서, mRNA의 침전을 촉진하는 하나 이상의 제제를 첨가하는 단계는 적어도 하나의 분산제가 있을 때 수행된다.

일부 구현예에서, mRNA의 침전을 촉진하는 하나 이상의 제제의 첨가 후에 수득된 슬러리에 분산제가 첨가된다.

따라서, 일부 구현예에서, 정제 방법은 정제된 mRNA 침전물로부터 분산제를 분리하기 위한 하나 이상의 단계, 예를 들어, 케이크를 세척하고 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 분산액을 여과하면서, 정제된 mRNA를 수성 매질(예를 들어 물)을 사용해 케이크로부터 가용화시키고 용리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, 침전시키는 단계 및 건조시키는 단계가 동시에 수행될 수 있다.

구현예에서, 여과 보조제는 셀룰로오스이다. 구현예에서, 셀룰로오스 여과 보조제는 분말화된 셀룰로오스 섬유(예: Solka-Floc® 또는 Sigmacell Cellulose 20)이다. 구현예에서, 셀룰로오스 여과 보조제는 분말화된 셀룰로오스 섬유(예: Solka-Floc® 200 NF 또는 Sigmacell Cellulose Type 20(20 μm))이다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 화산재이다. 일부 구현예에서, 필터 보조제는 규조토이다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA와 필터 보조제(예를 들어, Solka Floc과 같은 분말화된 셀룰로오스 섬유)의 질량비는 1:2; 1:5; 1:10, 또는 1:15이다. 특정 구현예에서, 침전된 mRNA와 필터 보조제(예를 들어, Solka Floc과 같은 분말화된 셀룰로오스 섬유)의 질량비는 1:10이다.

포획된 mRNA의 세척

mRNA를 정제하는 방법은, 포획된 불용성 mRNA를 세척하여 막 상에 걸러진 불순물을 제거하는 단계를 용리하는 단계 이전에 포함한다.

일부 구현예에서, 양친매성 중합체가 세척 단계에 사용된다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 따라서, 일부 구현예에서, 포획된 mRNA를 세척하는 데 PEG 용액("PEG 세척액")이 사용된다. PEG 세척액은 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1,000, PEG 1,500, PEG 2,000, PEG 3,000, PEG 3,350, PEG 4,000, PEG 6,000, PEG 8,000, PEG 10,000, PEG 20,000, PEG 35,000, 및 PEG 40,000, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 트리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 테트라에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 200을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 용액은 PEG 300을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 400을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 600을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 1,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 1,500을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 2,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 3,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 3,350을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 4,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 6,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 8,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 10,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 20,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 35,000을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액은 PEG 40,000을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 90 센티스트로크 이하의 점도를 갖는 PEG를 포함하는 1회 이상의 세척을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 80 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 70 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 60 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 50 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 40 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 30 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 20 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 10 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜(TEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 터트-부틸-TEG-O-프로피오네이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이메틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이비닐 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-모노부틸을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-메틸 에테르 메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-모노데실 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이벤조에이트를 사용해 달성될 수 있다. 이들 시약 각각의 구조는 상기 표 A에 나타나 있다.

액체 용액의 점도는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 점도계를 사용해 실온(예를 들어, 약 18 내지 25℃)에서 측정할 수 있다.

일부 구현예에서, PEG 세척액 중의 PEG는 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 세척액 중의 PEG는 PEG-변형 지질 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG-2K)이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 DOPA-PEG 접합체이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 폴록사머-PEG 접합체이다. 일부 구현예에서, PEG 변형 지질은 DOTAP를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 지질은 콜레스테롤을 포함한다.

일부 구현예에서, PEG 세척액은 2가지 이상의 분자량의 PEG 중합체의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12가지 분자량의 PEG 중합체가 PEG 세척액을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG 세척액은 하나 이상의 PEG 중합체의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 분자량을 갖는 중합체를 포함한다.

PEG 세척액에 사용된 PEG는 다양한 기하학적 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 적합한 PEG 중합체는 선형, 분지형, Y-형상, 또는 다중 아암 구성을 갖는 PEG 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 구별되는 기하학적 구성을 갖는 하나 이상의 PEG를 포함하는 현탁액이다.

일부 구현예에서, 세척액 중의 PEG는 약 10% 내지 약 100% w/v의 농도로 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PEG는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% w/v 농도, 및 그 사이의 임의의 값의 w/v 농도로 세척액에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 10% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 15% w/v로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 20% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 25% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 30% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 35% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 40% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 45% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 50% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 55% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 60% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 65% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 70% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 75% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 80% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 85% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 90% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, PEG는 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다.

일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 80 내지 100%의 농도로 PEG-400을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 80%의 농도로 PEG-400을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 85%의 농도로 PEG-400을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 90%의 농도로 PEG-400을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 95%의 농도로 PEG-400을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 100%의 농도로 PEG-400을 포함한다.

일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 양친매성 중합체를 포함하는 용액 중에서 세척된다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 PEG이다. 침전된 mRNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 10회를 초과하여 세척될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 1회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 2회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 3회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 4회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 5회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 6회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 7회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 8회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 9회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 10회 세척된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA는 PEG 중합체를 포함하는 용액으로 10회를 초과하여 세척된다.

일부 구현예에서, 포획된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 세척액은 수성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 세척액에는 에탄올, 이소프로필 알코올, 또는 벤질 알코올과 같은 알코올이 없다.

일부 구현예에서, PEG 세척액은, 예를 들어, 에탄올, 이소프로필 알코올, 또는 벤질 알코올과 같은 비수성 성분을 포함한다.

일부 구현예에서, 세척 단계는 양친매성 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)를 포함하는 용액을 사용하는 다수의 헹굼 사이클을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 하나 이상의 구별되는 양친매성 중합체를 포함하는 용액을 사용하는 다수의 헹굼 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 약 10% 내지 약 100% 양친매성 중합체를 포함하는 용액을 사용하여 다수의 헹굼 사이클에 의해 수행될 수 있다. 소정의 구현예에서, 다수의 헹굼 사이클은 2 사이클, 3 사이클, 4 사이클, 5 사이클, 6 사이클, 7 사이클, 8 사이클, 9 사이클, 10 사이클, 또는 10 사이클 초과를 포함한다.

일부 구현예에서, PEG는 약 90% 내지 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 특정 구현예에서, PEG(예: PEG-400)는 약 90% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 약 400 g/mol의 분자량을 갖는 PEG(예를 들어, PEG-400)의 약 90% 내지 약 100% w/v의 최종 농도가 세척 단계에 특히 적합한데, 이는 이러한 세척액을 통해서 높은 수율 및 고도로 순수한 mRNA 샘플을 생성했기 때문이다.

일부 구현예에서, MTEG는 약 75% 내지 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, MTEG는 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 일부 구현예에서, MTEG는 약 90% 내지 약 100% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 특정 구현예에서, MTEG는 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 약 90 또는 약 95% w/v의 MTEG의 최종 농도가 세척 단계에 특히 적합한데, 이는 이러한 최종 농도를 통해 공정 효소를 침전시키지 않고도 mRNA의 매우 효율적인 회수를 달성했기 때문이다.

용리 또는 수집

일반적으로, 포획되거나 잔류된 mRNA는 침전된 mRNA를 용액으로 재가용화함으로써 용리되거나 회수될 수 있다. 예를 들어, 포획된 mRNA는 RNase-무함유 물로 용리될 수 있다. 소정의 구현예에서, 포획된 mRNA를 용리하는 단계는 RNase-무함유 물을 재순환시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, RNase-무함유 물은 약 5~30분 동안 (예를 들어, 약 5~25분, 약 5~20분, 또는 약 5~15분 동안) 순환될 수 있다. 특정 구현예에서, RNase-무함유 물은 약 5~10분 동안(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분 동안) 재순환된다. TE 및/또는 구연산나트륨과 같은 다른 완충액을 사용해 mRNA를 재가용화시킬 수 있다. 용어 "용리"는, 예를 들어 심층 여과를 수반하는 정제 공정의 맥락에서 사용될 수 있는 반면, 용어 "수집"은 원심분리를 수반하는 정제 공정의 맥락에서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 재가용화된 mRNA는 원하는 농도의 원하는 제형으로 투석될 수 있다. 다양한 제형이 투석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 1 mM 구연산나트륨을 사용해 투석된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 아세트산나트륨, 탄산암모늄, 중탄산암모늄, 아세트산피리디늄, 포름산피리디늄, 아세트산암모늄, 요소, 염화칼륨 등을 사용해 투석된다. 관심 mRNA의 크기에 따라, 적절한 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 투석 막이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투석 막은 약 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 또는 500 kDa의 MWCO를 가질 수 있다.

규모 및 회수량

본 발명에 의해 제공되는 특정 장점은 mRNA, 특히 시험관 내에서 합성된 mRNA를 대규모로 또는 상업적 규모로 정제하는 능력이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시험관 내에서 합성된 mRNA는 배치당 약 100 mg, 1 g, 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1 미터톤, 10 미터톤 또는 그 이상의 규모로 정제된다. 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 약 1 kg 이상의 규모로 정제된다.

일 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 10 g의 규모로 정제된다. 일 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 20 g의 규모로 정제된다. 일 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 25 g의 규모로 정제된다. 일 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 50 g의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 100 g의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 1 kg의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 10 kg의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 100 kg의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 1,000 kg의 규모로 정제된다. 또 다른 특정 구현예에서, 시험관 내 합성된 mRNA는 배치당 10,000 kg의 규모로 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA는 배치당 1 g, 5 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, 30 g, 35 g, 40 g, 45 g, 50 g, 75 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g, 500 g, 550 g, 600 g, 650 g, 700 g, 750 g, 800 g, 850 g, 900 g, 950 g, 1 kg, 2.5 kg, 5 kg, 7.5 kg, 10 kg, 25 kg, 50 kg, 75 kg, 100 kg 이상의 규모로 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA를 포함하는 용액은 적어도 1 g, 10 g, 100 g, 1 kg, 10 kg, 100 kg, 1 미터톤, 10 미터톤 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 양의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일정량의 mRNA를 정제하는 데 사용되며, 상기 양은 적어도 약 250 mg의 mRNA이다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일정량의 mRNA를 정제하는 데 사용되며, 상기 양은 적어도 약 250 mg의 mRNA, 약 500 mg의 mRNA, 약 750 mg의 mRNA, 약 1000 mg의 mRNA, 약 1500 mg의 mRNA, 약 2000 mg의 mRNA, 또는 약 2500 mg의 mRNA이다. 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일정량의 mRNA를 정제하는 데 사용되며, 상기 양은 적어도 약 250 mg의 mRNA 내지 약 500 g의 mRNA이다. 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일정량의 mRNA를 정제하는 데 사용되며, 상기 양은 적어도 약 500 mg의 mRNA 내지 약 250 g의 mRNA, 약 500 mg의 mRNA 내지 약 100 g의 mRNA, 약 500 mg의 mRNA 내지 약 50 g의 mRNA, 약 500 mg의 mRNA 내지 약 25 g의 mRNA, 약 500 mg의 mRNA 내지 약 10 g의 mRNA, 또는 약 500 mg의 mRNA 내지 약 5 g의 mRNA이다. 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일정량의 mRNA를 정제하는 데 사용되며, 상기 양은 적어도 약 100 mg의 mRNA 내지 약 10 g의 mRNA, 약 100 mg의 mRNA 내지 약 5 g의 mRNA, 또는 약 100 mg의 mRNA 내지 약 1 g의 mRNA이다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%인 정제된 mRNA의 회수량(또는 "수율")을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 40%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 45%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 50%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 55%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 60%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 65%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 70%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 75%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 75%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 80%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 85%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 90%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 91%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 92%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 93%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 94%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 95%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 96%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 97%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 98%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 99%이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 100%이다.

특정 구현예에서, 정제된 mRNA의 회수량은 약 80% 초과 또는 약 90% 초과, 예를 들어 약 90% 내지 100%이다.

정제된 mRNA의 특성 분석

본원에 제공된 mRNA 정제 방법은, 짧은 미성숙 RNA 종, 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없는 정제된 mRNA 조성물을 생성한다.

본원에 기술된 방법은 약 60% 내지 약 100%의 순도를 갖는 정제된 mRNA를 생성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 60%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 65%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 70%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 75%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 80%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 85%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 90%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 91%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 92%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 93%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 94%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 95%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 96%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 97%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 98%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 99%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 100%의 순도를 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 mRNA는 전장 mRNA 이외의 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 및/또는 0.1% 미만의 불순물을 갖는다. 불순물은 IVT 오염물질, 예를 들어, 단백질, 효소, DNA 템플릿, 유리 뉴클레오티드, 잔류 용매, 잔류 염, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 조기 미성숙 RNA 서열("쇼트머" 또는 "짧은 미성숙 RNA 종"), 및/또는 긴 미성숙 RNA 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA에는 공정 효소가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만, 약 2 pg/mg 미만, 약 3 pg/mg 미만, 약 4 pg/mg 미만, 약 5 pg/mg 미만, 약 6 pg/mg 미만, 약 7 pg/mg 미만, 약 8 pg/mg 미만, 약 9 pg/mg 미만, 약 10 pg/mg 미만, 약 11 pg/mg 미만, 또는 약 12 pg/mg 미만이다. 따라서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 2 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 3 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 4 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 5 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 6 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 7 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 8 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 9 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 10 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 11 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 12 pg/mg 미만이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 고도의 조기 미성숙 RNA 서열("쇼트머"로도 알려짐)을 제거하거나 없앤다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 실질적으로 모든 조기 미성숙 RNA 서열을 제거한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA에는 조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 5% 미만(예를 들어, 약 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)의 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)의 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(예: 숄더 피크 또는 별도 피크), 에티듐 브롬화물, 쿠마시 염색, 모세관 전기영동, 또는 글리옥살 겔 전기영동(예: 별도의 하부 밴드의 존재)에 의해 결정했을 때 검출 불가능한 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "쇼트머(shortmer)", "짧은 미성숙 RNA 종", "조기 미성숙 RNA 서열" 또는 "긴 미성숙 RNA 종"은 전장보다 짧은 임의의 전사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "쇼트머", "짧은 미성숙 RNA 종", 또는 "조기 미성숙 RNA 서열"은 길이가 100 뉴클레오티드 미만, 90 뉴클레오티드 미만, 80 뉴클레오티드 미만, 70 뉴클레오티드 미만, 60 뉴클레오티드 미만, 50 뉴클레오티드 미만, 40 뉴클레오티드 미만, 30 뉴클레오티드 미만, 20 뉴클레오티드 미만, 또는 10 뉴클레오티드 미만이다. 일부 구현예에서, 쇼트머는 5'-캡 및/또는 3'-폴리 A 꼬리를 첨가한 후에 검출되거나 정량화된다. 일부 구현예에서, 조기 미성숙 RNA 전사체는 15개 미만의 염기(예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3개 미만의 염기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조기 미성숙 RNA 전사체는 약 8~15개, 8~14개, 8~13개, 8~12개, 8~11개, 또는 8~10개의 염기를 함유한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 T7 RNA 중합효소, DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제를 포함하되 이들로 한정되지 않는, 시험관 내 합성에 사용되는 고도의 효소 시약을 제거하거나 없앤다. 일부 구현예에서, 본 발명은 T7 RNA 중합효소를 제거하는 데 특히 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약의 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과, 또는 실질적으로 전부를 제거한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA에는 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약의 약 5% 미만(예를 들어, 약 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약의 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는, 예를 들어, 은 염색, 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC), 및/또는 모세관 전기영동, 브롬화 에티듐 및/또는 쿠마시 염색에 의해 결정했을 때, 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약을 검출 불가능한 정도로 함유한다.

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 정제된 mRNA는 고도의 무결성을 유지한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 무결성"은 일반적으로 정제 후 mRNA의 품질을 지칭한다. mRNA 무결성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 RNA 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성은 RNA 아가로스 겔 전기영동의 밴딩 패턴(banding pattern)에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 RNA 아가로오스 겔 전기영동의 기준 밴드와 비교하여 밴딩을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 95% 초과의 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98%, 99% 초과의) 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 98% 초과의 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 99% 초과의 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 대략 100%의 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 더 낮은 백분율의 전장 mRNA 분자를 갖는 조성물에 비해 활성이 예를 들어 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 이상 증가된 번역된 폴리펩티드를 갖는 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 다음 특성 중 하나 이상에 대해 평가된다: 외관, 동일성, 양, 농도, 불순물의 존재, 미생물학적 평가, pH 수준, 및 활성. 일부 구현예에서, 허용 가능한 외관은 본질적으로 가시적인 미립자가 없는 투명한 무색 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA의 동일성은 시퀀싱 방법에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 농도는 UV 분광광도계와 같은 적절한 방법에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 적절한 농도는 약 90% 내지 110%의 공칭 농도(0.9~1.1 mg/mL)이다.

일부 구현예에서, mRNA의 순도를 평가하는 단계는 mRNA 무결성의 평가, 잔류 플라스미드 DNA의 평가, 및 잔류 용매의 평가를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성의 허용 가능한 수준은 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가된다. 겔을 분석하여 밴딩 패턴 및 겉보기 뉴클레오티드 길이가 분석 기준 표준과 일치하는지 여부를 결정한다. RNA 무결성을 평가하기 위한 추가적인 방법은, 예를 들어 모세관 겔 전기영동(CGE)을 사용하여 정제된 mRNA를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CGE에 의해 결정했을 때, 정제된 mRNA의 허용 가능한 순도는 정제된 mRNA 조성물이 약 55% 이하의 긴 미성숙/분해된 종을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 잔류 플라스미드 DNA는 당업계의 방법, 예를 들어 qPCR의 사용에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 10 pg/mg 미만(예를 들어, 10 pg/mg 미만, 9 pg/mg 미만, 8 pg/mg 미만, 7 pg/mg 미만, 6 pg/mg 미만, 5 pg/mg 미만, 4 pg/mg 미만, 3 pg/mg 미만, 2 pg/mg 미만, 또는 1 pg/mg 미만)이 잔류 플라스미드 DNA의 허용 가능한 수준이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 10,000 ppm, 9,000 ppm, 8,000 ppm, 7,000 ppm, 6,000 ppm, 5,000 ppm, 4,000 ppm, 3,000 ppm, 2,000 ppm, 1,000 ppm 이하이다. 따라서, 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 10,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 9,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 8,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 7,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 6,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 5,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 4,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 3,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 2,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 1,000 ppm 이하이다.

일부 구현예에서, 미생물학적 시험이 정제된 mRNA에 대해 수행되며, 이에는 예를 들어 박테리아 내독소의 평가가 포함된다. 일부 구현예에서, 박테리아 내독소는 < 0.5 EU/mL, < 0.4 EU/mL, < 0.3 EU/mL, < 0.2 EU/mL 또는 < 0.1 EU/mL이다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.5 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.4 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.3 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.2 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.2 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.1 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/10 mL, 1 CFU/25 mL, 1CFU/50 mL, 1CFU/75 mL 이하, 또는 1 CFU/100 mL 이하를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/10 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/25 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/50 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/75 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/100 mL를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 pH가 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 허용 가능한 pH는 5 내지 8이다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 8의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 번역 충실도(translational fidelity)가 평가된다. 번역 충실도는 다양한 방법에 의해 평가될 수 있고, 이에는 예를 들어 형질감염 및 웨스턴 블롯 분석이 포함된다. 정제된 mRNA의 허용 가능한 특성은, 웨스턴 블롯 상에서 기준 표준과 유사한 분자량에서 이동하는 밴딩 패턴을 포함한다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 전도도에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 허용 가능한 특성은 기준 표준의 약 50% 내지 150%의 전도도를 포함한다.

정제된 mRNA는 Cap 백분율 및 폴리A 꼬리 길이에 대해서도 평가된다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 Cap 백분율은 Cap1, 면적(%): NLT90을 포함한다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 100~1500 뉴클레오티드(예를 들어, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, and 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 또는 1500 뉴클레오티드)이다. 따라서, 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 100 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 200 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 250 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 300 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 350 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 400 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 450 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 500 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 550 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 600 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 650 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 700 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 750 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 800 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 850 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 900 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 950 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1000 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1100 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1200 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1300 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1400 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 1500 뉴클레오티드이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 임의의 잔류 PEG에 대해서도 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 10 ng PEG/mg(정제된 mRNA) 내지 1000 ng PEG/mg(mRNA)를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 10 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 100 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 250 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 500 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 750 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 1000 ng 미만의 PEG를 갖는다.

mRNA 순도를 검출하고 정량화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 블롯팅, 모세관 전기영동, 크로마토그래피, 형광, 겔 전기영동, HPLC, 은 염색, 분광법, 자외선(UV), 또는 UPLC, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 겔 전기영동 이전에 글리옥살 염료에 의해 먼저 변성된다("글리옥살 겔 전기영동"). 일부 구현예에서, 합성된 mRNA의 특성을 캡핑 또는 테일링 전에 분석한다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA의 특성을 캡핑 및 테일링 후에 분석한다.

기술된 방법에 적합한 핵산

어떤 종류의 핵산도 본원에 기술된 방법을 사용해 정제할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 시험관 내 전사된(IVT) mRNA이다. 간략하게, IVT는 일반적으로 프로모터를 포함하는 선형 또는 원형 DNA 템플릿, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 일부 구현예에서, IVT 반응은 2단계 과정을 포함하는데, 제1 단계는 mRNA의 시험관 내 전사에 이어지는 정제 단계를 포함하고, 제2 단계는 시험관 내 전사된 mRNA의 캡핑 및 테일링에 이어지는 제2 정제 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, IVT 반응은 1단계 과정으로서, 이를 통해 캡핑 및 테일링된 mRNA가 시험관 내에서 전사된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시험관 내 전사를 통해 캡핑 및 테일링된 mRNA가 생산되고, 이어서 정제된다. 이는, 예를 들어, 폴리T 영역 및/또는 CleanCap®을 포함하는 플라스미드를 사용함으로써 달성된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다. 이들 시약의 존재는 여러 구현예에 따른 최종 생성물에서 바람직하지 않으며, 따라서 불순물로서 지칭될 수 있고, 이들 불순물 중 하나 이상을 함유하는 제제는 순수하지 않은 제제로서 지칭될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 mRNA를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소를 혼합함으로써 시험관 내 전사(IVT)를 수행하여 전장 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 생성하는 단계; (b) 현탁액에 고몰 염과 양친매성 중합체를 제공하여 전장 mRNA를 침전시키고, 현탁액에 침전된 전장 mRNA를 제공하는 단계; (c) 현탁액을 필터에 도포하여 침전된 전장 mRNA를 포획하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 침전된 전장 mRNA를 수성 용매로 세척하여 수용액 중에서 정제된 전장 mRNA를 수득하는 단계; 및 (e) 단계 (d)의 침전된 mRNA를 가용화시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (d)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에는 (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 DNA 템플릿은 선형 DNA 템플릿이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 중합효소는 SP6 중합효소이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 혼합하는 단계는 리보뉴클레오티드 삼인산염의 풀을 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 혼합하는 단계는 RNase 억제제, 예를 들어 RNase I 억제제, RNase A, RNase B, 및 RNase C를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 고몰 염은 GSCN이다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 고몰 염은 GSCN을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 양친매성 중합체는 PEG 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 양친매성 중합체는 MTEG를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (b)에서의 고몰 염은 GSCN을 포함하고, 양친매성 중합체는 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG(예: PEG-6000) 또는 MTEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 필터는, 침전된 전장 mRNA보다 작지만 전장 mRNA보다는 큰 MWCO를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 필터는 심층 필터이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 필터는 원심분리와 함께 사용된다.

일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 수성 용매는 양친매성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 수성 용매 중의 양친매성 중합체는 단계 (b)에서 사용된 양친매성 중합체와 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 수성 용매 중의 양친매성 중합체는 단계 (b)에서 사용된 양친매성 중합체와 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 양친매성 중합체는 PEG 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 수성 용매 중의 PEG 중합체는 단계 (b)에서 사용된 PEG 중합체와 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 수성 용매 중의 PEG 중합체는 단계 (b)에서 사용된 PEG 중합체와 상이하다.

일부 구현예에서, 단계 (e)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (iv) 조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 조기 미성숙 RNA 서열은 쇼트머를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (v) 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 단계 (e)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (iv) 조기 미성숙 RNA 서열 및 (v) 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 RNA 중합효소는 SP6 중합효소이고, 단계 (d)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (v) 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 이러한 제조 방법은 고도로 순수한 mRNA를 수득하기 위해 크로마토그래피를 사용하지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 제조 방법은 고도로 순수한 mRNA를 수득하기 위해 알코올계 용매를 사용하지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 제조 방법은 고도로 순수한 mRNA를 수득하기 위해 크로마토그래피를 사용하지 않고 알코올계 용매를 사용하지 않는다.

다양한 구현예에 따르면, 본 발명은 다양한 길이의 시험관 내 합성된 mRNA를 정제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 또는 15 kb를 초과하는 시험관 내 합성된 mRNA를 정제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 일반적으로 안정성을 강화하는 하나 이상의 변형을 함유하는 mRNA를 정제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형 뉴클레오티드, 변형 당 인산 골격, 및 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 시험관 내 합성된, 변형되지 않은 mRNA를 정제하는 데 사용된다.

전형적으로, mRNA는 안정성을 강화하도록 변형된다. mRNA의 변형은 예를 들어 RNA의 뉴클레오티드가 변형되는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 mRNA는 예를 들어, 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 암호화하는 항체(예를 들어, mRNA를 암호화하는 중쇄 및 경쇄)는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하되 이에 한정되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 퓨린 및 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 다이하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시히드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 및 이노신 등으로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는, 예를 들어 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호, 미국 특허 제5,700,642호에서 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 개시 내용은 그 전체 범주가 참조로서 본원에 통합된다.

일반적으로, mRNA 합성은 N-말단(5') 단부에 "캡"을 첨가하고, C-말단(3') 단부에 "꼬리"를 첨가하는 것을 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법을 사용해 정제된 mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate, GTP)이 구아닐릴(guanylyl) 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 이에 제한되지 않지만, m7G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함한다.

시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 구현예에서 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하는 본 발명의 범위 내에서 다른 mRNA 공급원이 고려된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에서 정제하기 위한 mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.

일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개의 뉴클레오티드이거나 더 길 수 있다.

본 발명은 임의의 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 정제된 mRNA의 비제한적인 예는 아래 섹션에 제시되어 있다.

실시예

실시예 1. mRNA의 합성

IVT 반응 조건

다음의 실시예에서, 달리 기술되지 않는 한, mRNA는 T7 중합효소 또는 SP6 중합효소를 사용하여 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성하였다. 간략하게, SP6 중합효소 IVT 반응에 있어서, 전사된 mRNA의 1 g 마다, RNA 중합효소-특이적 프로모터, SP6 RNA 중합효소, RNase 억제제, 피로포스파타아제, 5 mM NTP, 10 mM DTT, 및 반응 완충액(10x - 250 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 20 mM 스피르미딘, 50 mM NaCl)이 포함된 20 mg의 선형 이중 가닥 DNA 플라스미드를 함유하는 반응물을 RNase-무함유 물로 제조한 다음, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, DNase I 및 DNase I 완충액(10x - 100 mM 트리스-HCl, 5 mM MgCl₂, 및 25 mM CaCl₂, pH 7.6)을 첨가하여 반응물을 퀀칭시켜, 정제를 위해 제제 중의 이중-가닥 DNA 템플릿의 분해를 용이하게 하였다. 최종 반응물 부피는 204 mL였다.

5' 캡

달리 기술되지 않는 한, IVT 반응의 일부로서 캡 구조를 포함시킴으로써, IVT 전사된 mRNA를 이의 5' 말단에서 캡핑하거나 후속 효소 단계에서 캡핑하였다. IVT 반응의 일부로서 캡핑하는 경우, 캡 유사체를 제1 "염기"로서 초기 RNA 가닥에 혼입할 수 있다. 캡 유사체는 캡 0, 캡 1, 캡 2, ^m6A_m, 또는 비천연 캡일 수 있다. 대안적으로, IVT 후에 예를 들어 구아닐레이트 트랜스퍼라아제를 사용하여 5' N⁷-메틸구아닐레이트 캡 0 구조를 첨가하고, Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.의 문헌["Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249]에 기술된 것과 같이 2' O-메틸트랜스퍼라아제를 사용해 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2' O 위치에 메틸기를 첨가하여 캡 1 구조를 생성함으로써, 캡핑되지 않고 정제된 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA가 캡을 포함하도록 이를 효소적으로 변환시켰다.

3' 테일

달리 기술되지 않는 한, IVT 반응의 일부로서 mRNA를 테일링하는 테일 템플릿을 선형화된 플라스미드에 포함시킴으로써 IVT 전사된 mRNA를 이의 3' 단부에서 테일링하거나, 후속 효소 단계에서 테일링하였다. IVT 반응의 일부로서의 테일링하는 경우, 폴리-T 또는 유사한 테일링 특징부를 pDNA 템플릿에 혼입하는 것은, IVT 공정의 일부로서 폴리A 테일 또는 유사한 적절한 테일이 mRNA 상에 형성되도록 수행된다. 대안적으로, IVT 반응 후에 IVT-생성된 mRNA의 3' 말단에 폴리-A 꼬리를 예를 들어 폴리-A 중합효소를 사용하여 효소적으로 첨가할 수 있다.

실시예 2. VOC-무함유 중합체 유도식 mRNA의 침전을 통한 mRNA의 정제

본 실시예는, mRNA 정제의 mRNA 침전 단계 동안 에탄올과 같은 휘발성 유기 화합물(VOC) 대신에 중합체가 사용될 수 있음을 예시한다. 이러한 중합체 유도식 침전 방법은 치료적 용도에 적합한 최종 수율 및 순도 수준을 제공한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 IVT 합성을 통해 5 mg씩 3개의 CFTR mRNA 배치를 합성하였으며, 각각의 배치는 아래에 기술된 3개의 상이한 조건으로 침전시켰다.

조건 1: 에탄올 및 GSCN (실험 대조군)

1부피의 mRNA를 2.3부피의 5M GSCN-10mM DTT 완충액과 혼합하여, GSCN의 최종 농도를 2M으로 만들었다. 그런 다음, 1.7부피의 100% 에탄올을 현탁액에 첨가하고, 34%의 에탄올의 최종 농도를 얻었다.

조건 2: PEG-6000 및 GSCN (에탄올-무함유 중합체 유도식 침전)

1부피의 mRNA를 2.3부피의 5M GSCN-10mM DTT 완충액과 혼합하여, GSCN의 최종 농도를 2M으로 만들었다. 그런 다음, 1.7부피의 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 17%로 만들었다.

조건 3: PEG-6000 및 NaCl (에탄올-무함유 중합체 유도식 침전)

침전 단계는 Schmitz 등의 문헌[Notes & Tips, Anal Biochem. (2006) 311-313]에 기술된 조건에서 수행하였다. 1볼륨의 mRNA를 NaCl과 혼합하여 NaCl의 최종 농도를 500 mM으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 19%로 만들었다.

각각의 조건에서 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 10 ml의 80% 에탄올로 2회 세척하고, 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시켰다. 용해된 mRNA 샘플의 농도를 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계로 정량화하였다. 각 침전 조건에 대한 수율은 도 1에 도시되어 있다. 또한, 잔류 공정 효소의 존재는 아래에 기술된 은 염색을 통해 검출하였으며, 그 결과는 도 2에 도시되어 있다.

데이터는 3가지 침전 조건이 정제 후 유사한 mRNA 수율을 유도하였음을 보여준다. 침전 조건 1 및 2는 도 2에 도시된 바와 같이, 은 염색에 의해 관찰 가능한 공정 효소 없이, 고도로 순수한 mRNA 샘플을 생성하였다. 그러나, PEG-6000 및 NaCl을 통한 중합체-유도식 침전(조건 3)은 공정 효소가 존재하는 것과 동일한 밴딩을 나타내는 샘플을 생성하였는데, 치료적 용도로 허용할 수 있기 위해서는 추가 정제 단계를 필요로 할 것이다. 본원의 데이터는, 치료적 용도를 위한 충분한 수율과 순도 수준을 달성하기 위해 조건 2에 의한 mRNA 침전이 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있음을 뒷받침한다.

mRNA 순도-잔류 공정 효소 검출 (은 염색)

잔류 IVT 효소 및 임의로 캡 및/또는 꼬리 효소에 대한 mRNA 순도를 은 염색에 의해 평가하였다. 특히, 다음의 잔류 공정 효소 각각은 이러한 접근법을 사용하여 검출할 수 있다: RNA 중합효소, RNA 억제제, 피로포스파타아제, 구아닐트랜스퍼라아제 (GuaT), 2'OM, 및 폴리A 중합효소를 비롯하여, 은 염색 겔 제조의 일부로서 사용되는 효소인 RNase I. 특히, Invitrogen 키트에 따라 은 염색 겔을 다음의 염색 전 샘플 제제와 함께 흘렸다. 37℃에서 4 μl의 RNaseI(100 U/mL, Invitrogen)로 30분 동안 처리한 15.5 μl의 1 mg/ml RNA. 환원 시약을 이용해 Invitrogen LDS 로딩 완충액에서 샘플을 제조하고, 최종적으로 10% 비스-트리스 겔 상에 로딩하였다. 200V에서 35분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔을 Silver Quest 염색 키트를 사용하여 염색하고, 8분 동안 현상하였다. 특정 공정 효소에 대한 밴드가 보이지 않는 경우, 정제된 mRNA를 포함하는 샘플에는 특정 공정 효소가 실질적으로 없는 것으로 간주하였다.

실시예 3. 중합체-유도식 mRNA 침전에서 중합체 비율 범위 시험하기

본 실시예는, 다양한 구현예에 따라, 치료 용도에 적합한 mRNA를 정제하기 위한 중합체-유도식 mRNA 침전에 상이한 비율의 중합체가 사용될 수 있음을 예시한다.

전술한 바와 같이 IVT 합성을 통해 5 mg씩 7개의 CFTR mRNA 배치를 합성하였으며, 각각의 배치는 아래 표 1에 나타낸 상이한 조건에서 침전시켰다.

mRNA 정제를 위한 침전 조건
샘플	에탄올의 최종 백분율(%)	첨가된 50% PEG-6000의 비율	PEG-6000의 최종 백분율(%)	GSCN의 최종 농도 (M)
1	34	0	0	2.3
2	0	0.5	7	3.0
3	0	1.0	12	2.7
4	0	1.5	16	2.4
5	0	2.0	19	2.2
6	0	2.5	22	2.0
7	0	3.0	24	1.8

각각의 조건에서 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 10 ml의 80% 에탄올로 2회 세척하고, 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시켰다. 용해된 mRNA 샘플의 농도를 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계로 정량화하였다. 각 침전 조건에 대한 수율은 도 3에 도시되어 있다. 또한, 잔류 공정 효소의 존재는 실시예 2에 기술된 은 염색을 통해 검출하였으며, 그 결과는 도 4에 도시되어 있다.

데이터는, 중합체-유도식 mRNA 침전을 사용해 정제한 mRNA의 여섯 가지 조건 모두가 정제 후 높은 mRNA 수율을 유도하였는데, 이는 전통적인 에탄올 침전 방법과 유사하였다(도 3). 또한, 20% 미만의 최종 PEG 농도의 PEG(또는 2.0 미만의 비율의 50% PEG-6000)를 이용한 중합체-유도식 침전을 통해 정제한 mRNA 샘플은, 도 4에 도시된 은 염색에 의해 관찰 가능한 공정 효소 없이 매우 순수한 mRNA 샘플을 생성하였다(레인 5~8). 그러나, 20%를 초과하는 최종 농도의 PEG-6000을 이용해 중합체-유도식 침전을 통해 정제된 mRNA 샘플은 잔류 공정 효소를 나타냈다(레인 9). 흥미롭게도, 24% PEG-6000을 이용한 중합체-유도식 침전은, 22% PEG-6000을 이용한 중합체-유도식 침전 샘플에서보다 정제된 샘플에서 더 많은 잔류 공정 효소를 생성하였다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, PEG-6000의 백분율이 높을수록 핵산 및 공정 효소 모두의 침전이 더 용이해지는 것으로 고려된다.

종합하면, 본원의 데이터는, 중합체-유도식 침전을 통한 mRNA 정제는 치료적 용도를 위한 충분한 수율 및 순도 수준을 달성하기 위한 실행 가능한 mRNA 정제 방법이라는 것을 추가로 뒷받침한다. 7~24%의 최종 PEG-6000 농도를 이용한 중합체-유도식 침전은 효율적인 mRNA 침전 및 회수를 유도한다. 나머지 실시예의 경우, 12%의 최종 PEG-6000 농도를 중합체-유도식 침전에 사용하였다.

실시예 4. mRNA의 무-에탄올 정제 및 세척 단계에서 상이한 중합체의 효과.

본 실시예는, mRNA 침전 및 세척 단계 모두에서 에탄올과 같은 임의의 VOC 없이 중합체를 사용해 치료 용도에 적합한 수율 및 순도 수준으로 mRNA를 정제할 수 있다는 것을 예시한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이, IVT 합성을 통해 5 mg씩 12개의 CFTR mRNA 배치를 합성하고 5' 캡과 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 생성된 12개의 5 mg IVT mRNA 배치를 중합체-유도식 침전을 통해 각각 침전시켰다. 각각의 5 mg 배치에 대해, 5M GSCN-10mM DTT 완충액을 첨가하여 GSCN의 최종 농도를 2.7 M으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 12%로 만들었다. 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 80% 에탄올 대신에 아래 표 2에 열거된 다음의 중합체 세척 완충액 10 ml로 2회 세척하였다. IVT 합성된 mRNA의 정제에는 VOC 또는 알코올을 전혀 사용하지 않았다. 특히, 침전 단계 또는 세척 단계에는 VOC 또는 알코올을 사용하지 않았다.

중합체 세척 완충액
샘플	중합체	세척액 중 중합체의 최종 비율(%)
1	트리에틸렌 글리콜(TEG)	70
2	트리에틸렌 글리콜(TEG)	80
3	트리에틸렌 글리콜(TEG)	90
4	트리에틸렌 글리콜(TEG)	100
5	100% PEG-400	70
6	100% PEG-400	80
7	100% PEG-400	90
8	100% PEG-400	100
9	50% PEG-6000	35
10	50% PEG-6000	40
11	50% PEG-6000	45
12	50% PEG-6000	50

12개의 샘플을 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계로 농도를 정량화하였다. 각 침전 조건에 대한 수율은 도 5에 도시되어 있다. 또한, 잔류 공정 효소의 존재는 실시예 2에 기술된 은 염색을 통해 검출하였으며, 그 결과는 도 6에 도시되어 있다.

도 5에 도시된 바와 같이, 세척 완충액 중 중합체의 백분율과 mRNA의 회수량 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, 이들 세척 완충액에 물을 첨가하면 이들 세척 단계 동안 mRNA가 가용화되는 것으로 여겨진다.

전반적으로, 데이터는, 놀랍게도, mRNA가 중합체-유도식 침전에 이어지는 중합체 세척을 통해 완전히 무-에탄올로 정제되어 치료적 용도에 적합한 놀라운 수율 및 순도 수준을 달성할 수 있음을 보여준다. 90~100%의 최종 농도로 PEG-400을 포함하는 세척 완충액은 도 5에 도시된 바와 같이 높은 수율 및, 도 6(레인 3~4)에 도시된 은 염색에 의해 관찰 가능한 공정 효소가 없는 고도로 순수한 mRNA 샘플을 생성하였다. PEG-400은 시험된 완충액 중 가장 낮은 점도를 가지므로, 상이한 시스템에서 상이한 규모로 쉽게 사용할 수 있다. 이들 데이터를 종합하면, 본원에 기술된 중합체-유도식 침전 및 중합체 세척을 통한 무-에탄올 mRNA 정제는, 에탄올을 포함하여 알코올과 같은 VOC를 사용하는 산업 표준 mRNA 정제 방법과 동등하거나 더 우수한 회수율, 무결성 프로파일, 순도, 및 기능성을 갖는 고품질 mRNA를 효율적으로 정제하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 또한, 본 발명은 확장성 및 안전성의 상당한 부가적인 이점을 가지는데, 이는 에탄올을 포함하여 알코올과 같은 VOC를 사용하는 기존의 산업 표준 방법에서는 이용할 수 없는 것이다.

실시예 5. OTC 및 CFTR mRNA의 무-에탄올 정제 및 분석

본 실시예는 전술한 무-에탄올 mRNA 정제 방법이 mRNA 작제물물 크기 또는 뉴클레오티드 조성에 관계없이 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있음을 예시한다. 또한, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 높은 수율, 순도, 및 무결성을 유도한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 IVT 합성을 통해 OTC mRNA의 5 mg 배치(약 1400 nt) 및 CFTR mRNA의 5 mg 배치(약 4600 nt)를 합성하였다. 생성된 IVT mRNA 샘플을 중합체-유도식 침전을 통해 침전시켰다. 각각의 5 mg 배치에 대해, 5M GSCN-10mM DTT 완충액을 첨가하여 GSCN의 최종 농도를 2.7 M으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 12%로 만들었다. 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 10 ml의 90% PEG-400 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세척된 샘플을 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 100 kD Amicon 스핀 컬럼을 사용하여 초순수로 완충액을 교환하고, 2 mg/ml까지 농축시켰다.

그런 다음, 정제되고 농축된 IVT mRNA를 실시예 1에 기술된 바와 같은 효소 단계를 통해 캡핑하고 테일링하였다. 5' 캡 및 3' 꼬리를 갖는 mRNA를 중합체-유도식 침전 및 중합체 세척을 통해 에탄올 없이 정제하였다. 특히, 각각의 배치에 대한 정제 단계를 위해, 5M GSCN-10mM DTT 완충액을 첨가하여 GSCN의 최종 농도를 2.7 M으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 12%로 만들었다. 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 10 ml의 90% PEG-400 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세척된 샘플을 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 100 kD Amicon 스핀 컬럼을 사용하여 초순수로 완충액을 교환하고, 1 mg/ml까지 농축시켰다.

도 7에 도시된 바와 같이, 각각의 최종 mRNA 산물에 대한 수율을 결정하였다. 데이터는, 5 mg 규모의 OTC 및 CFTR mRNA에 대한 mRNA 수율이 각각 80 및 78%임을 입증하였다. 이들 값은 산업 표준 mRNA 정제 방법의 수율 이내이거나 이를 초과하였다.

최종 mRNA 산물의 순도 및 무결성을 아래에 기술된 바와 같이 분석하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 모세관 전기영동을 사용하여 무결성 및 폴리A 꼬리 길이를 평가하였다. 결과는 5 mg 규모의 OTC mRNA 정제 및 CFTR mRNA 정제의 최종 산물이 대조군(현재 에탄올 10 g OTC)의 피크와 유사한 잘 정의된 피크를 갖는다는 것을 나타냈다. 또한, 두 작제물 모두의 꼬리 길이는 500 nt의 목표 범위 내에 있었다(OTC = 468 nt이고 CFTR = 649 nt임). 은 염색을 통해 평가했을 때, 잔류 공정 효소의 존재는 각 mRNA 작제물의 5 mg 규모 정제에서는 검출되지 않았다. 순도는 아래에 기술된 바와 같이, dsRNA J2 점 블롯을 통해 추가로 확인하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 dsRNA가 각 작제물의 최종 산물에서 검출되지 않았음을 입증하였다. 마지막으로, 표 3에 나타낸 바와 같이, 투석 단계 동안 PEG가 완전히 제거되었음을 확인하기 위해 ELISA를 사용하였다.

ELISA를 사용한 최종 mRNA 샘플 내 PEG의 정량화
	PEG (ng/mg RNA)
샘플	원 농도(neat)	1:10 희석	1:100 희석
현재 에탄올 10 g OTC	BQL	BQL	BQL
에탄올 무함유 5 mg OTC	BQL	BQL	BQL
에탄올 무함유 1 g OTC	BQL	BQL	BQL
에탄올 무함유 10 g OTC	BQL	BQL	BQL
현재 에탄올 10 g CFTR	BQL	BQL	BQL
에탄올 무함유 5 mg CFTR	BQL	BQL	BQL
에탄올 무함유 10 g CFTR	BQL	BQL	BQL
정량화 한계	RNA 1 mg당 10 ng PEG	RNA 1 mg당 100 ng PEG	RNA 1 mg당 1000 ng PEG

BQL=검출 한계 미만

종합적으로, 데이터는 본원에 기술된 중합체-유도식 침전 및 중합체 세척을 통한 mRNA의 무-에탄올 정제가 길이 및 작제물이 상이한 mRNA의 정제에 적용될 수 있음을 보여주었다. 본원에 기술된 방법에 의해 정제된 mRNA는 전술한 임계 방출 특성과 관련하여 과거 대규모 mRNA 로트를 충족시키거나 이를 초과한다. 따라서, 본원에 기술된 방법의 고 수율, 무결성, 및 순도 수준은 치료적 용도에 적합하다.

정제된 mRNA 무결성의 분석

RNA 무결성 분석 (단편 분석기 - 모세관 전기영동)

RNA 무결성 및 꼬리 길이는 CE 단편 분석기 및 상업적으로 이용 가능한 RNA 검출 키트를 사용하여 평가하였다. 무결성에 대한 피크 프로파일 및 테일 길이에 대한 크기 이동의 분석은 원시 데이터뿐만 아니라 정규화된 데이터 세트에 대해서도 분석하였다.

mRNA 캡 종 분석 (HPLC/MS)

최종 정제된 mRNA 산물에 존재하는 캡 종을 미국 특허 제9,970,047호에 기술된 크로마토그래피 방법을 사용하여 정량화하였다. 이 방법은 캡핑되지 않은 mRNA를 전체 mRNA의 백분율로서 정확하게 정량화할 수 있다. 이 방법은 특정 캡 구조의 양, 예컨대 캡G, 캡0, 및 캡1 양도 정량화할 수 있고, 이는 총 mRNA의 백분율로서 보고될 수 있다.

dsRNA 검출 (J2 점 블롯)

개별 mRNA 샘플 내 dsRNA의 존재는 이전에 Kariko 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 2011. 39, No. 21]에 기술된 J2 항-dsRNA 점 블롯을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 200 ng의 RNA 또는 25 ng의 dsRNA 대조군을 초 하전된 Nytran 상에 블롯팅하였다. 블롯을 건조시키고, 5% 무지방 분유로 차단한 다음, 블롯 당 1 μg의 J2 항체로 프로브하였다. 블롯을 세척하고, HRP-접합된 당나귀 항-마우스로 프로브한 후, 다시 세척하였다. ECL 플러스 웨스턴 블롯 검출 시약으로 블롯을 검출하고, 이미지를 필름 상에 캡쳐하였다. 아무런 dsDNA가 없는 대조군과 비교했을 때 각각의 블롯이 가시적으로 더 짙은 착색을 나타내지 않은 경우, 정제된 mRNA를 포함하는 샘플에는 실질적으로 dsRNA가 없는 것으로 간주하였다.

PEG 정량화/검출 ELISA (Abcam 키트)

mRNA 샘플 내 다양한 분자량 PEG 종의 존재는 Abcam의 PEG-ELISA 키트를 사용하여 결정하였다. 간략하게, 샘플 중 PEG를 낮게는 10 ng/mL까지 검출하고, 해당 수준에서 큰 분자량의 PEG를 정확하게 정량화할 수 있는 경쟁 억제 ELISA를 사용하였다. mRNA 샘플은 표준 에탄올 기반 침전 방법뿐만 아니라 아래에 언급된 무-에탄올 방법을 사용해 원 농도, 1/10 희석물, 및 1/100 희석물에서 정제하였다. 검출 한계는 원 농도, 1/10 희석물, 및 1/100 희석물에서 각각 RNA 1 mg 당 10 ng, RNA 1 mg 당 100 ng, 및 RNA 1 mg 당 1 ug이다.

실시예 6. 1 g 및 10 g 규모의 무-에탄올 mRNA 정제

본 실시예는 전술한 무-에탄올 mRNA 정제 방법이 치료 용도에 필요한 규모 및 품질로 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있음을 예시한다. 본원에 기술된 방법에 따라 1 g 및 10 g 규모로 정제된 mRNA는 고 수율, 순도, 및 무결성을 유도함으로써, 상기 방법의 확장성을 입증한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 IVT 합성을 통해, OTC mRNA를 1 g 및 10 g 규모로 합성하고, CFTR mRNA를 10 g 규모로 합성하였다. 생성된 IVT mRNA 샘플을 중합체-유도식 침전을 통해 침전시켰다. 각각의 mRNA 샘플에 대해, 5M GSCN-10mM DTT 완충액을 첨가하여 GSCN의 최종 농도를 2.7 M으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 12%로 만들었다. Solka-Floc 셀룰로오스계 여과 보조제를 침전된 mRNA에 10:1의 필터 보조제:RNA 비율(wt/wt)로 첨가하고, 잘 혼합하였다. 필터 보조제와 함께, 1 g 규모로 침전된 mRNA 샘플을 0.22 μm 폴리에테르설폰(PES) 진공 필터 플라스크 상에 포획하였다. 필터 보조제와 함께, 10 g 규모로 침전된 mRNA 샘플을 1 μm 폴리프로필렌 필터 백을 이용해 H300P 여과 원심분리기 상에 포획하였다. 그런 다음, 1 g 및 10 g mRNA 샘플을 1L 또는 10L의 90% PEG-400 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세척한 침전된 mRNA를 필터로부터 수동으로 제거하거나, 1 μm 폴리프로필렌 필터 백을 이용해 H300P 여과 원심분리기를 통해 여과하여 제거하였다. 그런 다음, 세척한 침전된 mRNA를 1L 또는 10L의 RNase-무함유 물에서 가용화시키고, 100kD 스펙트럼 TFF 컬럼(mPES)을 사용해 초순수로 완충액을 교환하고, 2 mg/ml로 농축시켰다.

그런 다음, 정제되고 농축된 IVT mRNA를 실시예 1에 기술된 바와 같은 효소 반응에 의해 캡핑하고 테일링하였다. 5' 캡 및 3' 꼬리를 갖는 mRNA를 중합체-유도식 침전 및 중합체 세척을 통해 에탄올 없이 정제하였다. 각각에 대해, 5M GSCN-10mM DTT 완충액을 첨가하여 GSCN의 최종 농도를 2.7 M으로 만들었다. 그런 다음, 50%의 PEG-6000을 현탁액에 첨가하고, PEG-6000의 최종 농도를 12%로 만들었다. Solka-Floc 셀룰로오스계 여과 보조제를 침전된 mRNA에 10 내지 1의 비율로 첨가하고, RNA에 대한 여과 보조제 비율(wt/wt)을 첨가하고, 잘 혼합하였다. 침전된 mRNA를 1L 또는 10L의 90% PEG-400 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세척한 mRNA 샘플을 필터로부터 수동으로 제거하거나, 1 μm 폴리프로필렌 필터 백을 이용해 H300P 여과 원심분리기를 통해 여과하여 제거하였다. mRNA 샘플을 1L 또는 10L의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 100kD 스펙트럼 TFF 컬럼(mPES)을 사용해 초순수로 완충액을 교환하고, 1 mg/ml로 농축시켰다.

도 7에 도시된 바와 같이, 각각의 최종 mRNA 산물에 대한 수율을 결정하였다. 데이터는 1 g 및 10 g 규모의 OTC mRNA 및 10 g 규모의 CFTR mRNA에 대한 mRNA 수율이 모두 80%를 초과하였고, 높게는 93%였음을 입증하였다. 이들 값은 산업 표준 mRNA 정제 방법의 수율 이내이거나 이를 초과하였다.

최종 mRNA 산물의 순도 및 무결성을 전술한 바와 같이 분석하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 모세관 전기영동을 사용하여 무결성 및 폴리A 꼬리 길이를 평가하였다. 결과는 1 g 및 10 g 규모의 OTC mRNA 정제 및 CFTR mRNA 정제의 최종 산물이 대조군(현재 에탄올 10 g OTC)의 피크와 유사한 잘 정의된 피크를 갖는다는 것을 나타냈다. 10 g 규모로 정제된 mRNA의 경우, 실시예 2에 기술된 바와 같이 HPLC-MS 검정을 사용하여 캡 종을 정량화하였다. 또한, 두 작제물 모두의 꼬리 길이는 목표 범위 내에 있었다(1 g에서 OTC = 306 nt이고; 10 g에서 CFTR = 158 nt이고; 10 g에서 CFTR = 712 nt임). 은 염색을 통해 평가했을 때, 잔류 공정 효소의 존재는, 도 9에 도시된 바와 같이, 두 mRNA 작제물 모두의 1 g 및 10 g 규모 정제에서는 검출되지 않았다. 순도는 실시예 5에 기술된 바와 같이, dsRNA J2 점 블롯을 통해 추가로 확인하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 dsRNA가 1 g 및 10 g 규모 모두에서의 최종 산물에서 검출되지 않았음을 입증하였다. 마지막으로, 투석 단계 동안 PEG가 완전히 제거되었음을 확인하기 위해 ELISA를 사용하였다.

종합적으로, 데이터는, 임상 치료적 용도에 요구되는 필수 규모 및 품질로 mRNA를 정제하는 중합체-유도식 침전 및 중합체 세척을 통해 mRNA의 무-에탄올 정제의 확장성을 입증한다. 본원에 기술된 방법에 의해 1 g 및 10 g 규모로 정제된 mRNA는, 전술한 임계 방출 특성과 관련하여, 과거 대규모 mRNA 로트를 충족시키거나 이를 초과하여, mRNA 제조 및 치료에 사용하기에 상기 방법이 적합함을 입증한다.

본 발명은 임의의 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법을 사용하여 정제된 mRNA의 비제한적인 예가 기술된다.

실시예 7. mRNA의 무-에탄올 정제 및 세척 단계에서 MTEG의 효과.

본 실시예는, 세척 단계에서 에탄올과 같은 임의의 VOC 없이 양친매성 중합체 MTEG를 사용해 치료 용도에 적합한 수율 및 순도 수준으로 mRNA를 정제할 수 있다는 것을 예시한다.

표 4는 선행 실시예에서 시험한 중합체 대비 MTEG의 특성을 보여준다. TEG와 유사한 분자량을 가짐에도 불구하고, MTEG는 메틸기의 존재로 인해 훨씬 더 낮은 점도를 갖는다. 이는 MTEG가 물에 훨씬 더 가까운 점도를 갖는다는 것을 의미하며, 이는 펌핑이 더 용이함을 의미한다. 또한, 이는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 "안전한" 것으로 분류되는 반면, TEG, PEG-400, 및 PEG-6000(50%)은 "일반적으로 안전한 것으로 인식되는"(GRAS) 것으로 분류된다.

중합체 특성

MTEG	164.2	7.0	안전함
TEG	150.2	42.4	GRAS
PEG-400	400	90.0	GRAS
PEG-6000 (50%)	6000	88.0	GRAS

실시예 1에 기술된 바와 같이, 5 mg의 CFTR mRNA 배치 5개를 IVT 합성을 통해 합성하고, 5' 캡 및 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 생성된 5 mg의 IVT mRNA 배치 5개를 중합체-유도 침전을 통해 각각 침전시켰다. 침전 반응에서 mRNA, GSCN(5M GSCN-10mM DTT 완충액), 및 MTEG(100% w/v)의 부피비는 1:2.3:1이었다. 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 80% 에탄올 대신에 아래 표 5에 열거된 다음의 MTEG 세척 완충액 중 하나로(2.5 ml) 2회 세척하였다. IVT 합성 mRNA의 정제에는 VOC 또는 알코올을 사용하지 않았다. 특히, 침전 단계 또는 세척 단계에서는 VOC 또는 알코올을 사용하지 않았다.

중합체 세척 완충액
샘플	중합체	세척액 중 중합체의 최종 비율(%)
1	MTEG	75
2	MTEG	80
3	MTEG	85
4	MTEG	90
5	MTEG	95

5개의 샘플을 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계로 농도를 정량화하였다. 회수된 RNA의 농도를 도 11에 표시하였다.

도 11에 도시된 바와 같이, 세척 완충액 중 MTEG의 백분율과 mRNA의 회수량 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. 위에서 개략된 바와 같이, 임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, 이들 세척 완충액에 물을 첨가하면 이들 세척 단계 동안 mRNA가 가용화되는 것으로 여겨진다. 도 11에 도시된 바와 같이, 90 내지 95%의 최종 농도로 MTEG를 포함하는 세척 완충액은, 이론적으로 달성 가능한 수준인 100% 회수에 가까운 매우 높은 수율을 초래하였다. 순도 및 회수율은 80% 에탄올을 사용하는 세척 조건과 비슷하였다. 나머지 실시예에서 세척 완충액으로서 사용하기 위해 95%의 MTEG 농도를 선택하였다.

이들 데이터는 mRNA가 완전한 무-에탄올 공정을 사용하여 정제될 수 있음을 추가로 입증한다.

실시예 8. mRNA의 무-에탄올 정제 및 세척 단계에서 MTEG의 효과.

본 실시예는, mRNA 침전 및 세척 단계 모두에서 에탄올과 같은 임의의 VOC 없이 양친매성 중합체 MTEG를 사용해 치료 용도에 적합한 수율 및 순도 수준으로 mRNA를 정제할 수 있다는 것을 예시한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이, IVT 합성을 통해 5 mg씩 5개의 CFTR mRNA 배치를 합성하고 5' 캡과 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 생성된 5개의 5 mg IVT mRNA 배치 중 4개를 중합체-유도식 침전을 통해 각각 침전시켰다. 각각의 5 mg 배치에 대해, mRNA, 5M GSCN-10mM DTT 완충액, 및 MTEG를 아래 표 6에 제공된 부피로 조합하여 침전된 mRNA의 현탁액을 형성하였다. 침전된 mRNA 샘플을 Qiagen RNeasy maxi 컬럼 상에 포획하고, 2.5 ml의 95% MTEG로 2회 세척하였다. IVT 합성된 mRNA의 정제에는 VOC 또는 알코올을 전혀 사용하지 않았다. 특히, 침전 단계 또는 세척 단계에서는 VOC 또는 알코올을 사용하지 않았다. 실험 대조군으로서, 실시예 2에 기술된 바와 같이 1:2.3:1.7의 부피비의 mRNA, GSCN, 및 에탄올(100% 중w/v)로 하나의 mRNA 배치를 침전시키고, 2 ml의 80% 에탄올을 사용하여 2회 세척하였다.

중합체 세척 완충액
샘플	성분 w/v의 비율			세척액 중 최종 비율(%)
샘플	mRNA	5M GSCN	MTEG	세척액 중 최종 비율(%)
1	1	2.3	1	95% MTEG
2	1	2.3	1.7	95% MTEG
3	1	2.3	2	95% MTEG
4	1	2.3	2.5	95% MTEG
	에탄올 대조군			80% 에탄올

5개의 샘플을 5 ml의 RNase-무함유 물에 용해시키고, 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계로 농도를 정량화하였다. 은 염색을 사용하여 관찰했을 때, 침전 및 세척 단계에서 생성된 mRNA 샘플의 순도는 도 12(레인 6~10)에 도시되어 있다. MTEG를 사용한 침전 및 세척은 매우 효율적인 mRNA 회수 및 mRNA 정제를 달성하였다. 1 부피의 mRNA 및 2.3 부피의 GSCN에 1~2 부피의 MTEG를 첨가한 결과, 유사한 수준의 순도 및 수율이 나타났다. 1 부피의 mRNA 및 2.3 부피의 GSCN에 2.5 부피의 MTEG를 첨가한 결과 도 12에 나타낸 바와 같이 겔 상에 희미한 추가 밴드가 생성되었다. 이는 더 높은 MTEG 농도가 IVT 반응에서 단백질을 침전시킨다는 것을 시사하는 것일 수 있다.

종합하면, 이들 데이터는, 침전 단계 동안 및 세척 완충액 중 모두에 MTEG를 사용하는 mRNA 정제가 치료적 용도를 위한 충분한 수율 및 순도 수준을 달성하기 위한 실행 가능한 mRNA 정제 방법이라는 것을 뒷받침한다.

이들 데이터를 종합하면, 본원에 MTEG mRNA 정제가, 에탄올을 포함하여 알코올과 같은 VOC를 사용하는 산업 표준 mRNA 정제 방법과 동등하거나 더 우수한 회수율, 무결성 프로파일, 순도를 유도하는 고품질 mRNA를 효율적으로 정제하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. MTEG는 침전 동안 에탄올 및 PEG-6000과 같은 고분자량 중합체 둘 다를 대체할 수 있다. 또한, MTEG는 세척 단계에서 에탄올 또는 PEG-400과 같은 저 분자량 중합체를 대체할 수 있으므로, 무-에탄올 정제에 사용하기 위한 가장 다목적인 중합체가 될 수 있다. 또한, 위에서 개략한 바와 같이, MTEG 기반 정제는, 본원에 기술된 다른 중합체 기반 무-에탄올 방법과 마찬가지로, 확장성 및 안전성의 상당한 부가적인 이점을 가지며, 이는 에탄올을 포함하여 알코올과 같은 VOC를 사용하는 기존의 산업 표준 방법에서는 이용할 수 없는 것이다.

실시예 9. 심층 여과 및 원심분리를 사용한 정제에 적용 가능한 MTEG 중합체 유도식 침전 및 MTEG 세척 완충액.

본 실시예는, MTEG의 낮은 점도 및 뛰어난 취급 특성으로 인해, MTEG가 놀랍게도 다목적이고 다양한 규모의 다양한 무-에탄올 mRNA 정제 방법에 사용되어, 90%를 초과하는 회수율을 얻을 수 있음을 입증한다.

상기 실시예와 같은 방식으로 샘플을 제조하고 심층 여과(DF) 또는 원심분리를 사용하여 이를 정제하였다.

심층 여과 정제

더 작은 배치의 경우, IVT 합성을 통해 7.5 g의 OTC mRNA를 합성하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 및 규모별 반응 조건에 따라 5' 캡 및 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 실시예 7에 나타낸 것과 동일한 MTEG 중합체-유도식 침전을 사용하여 mRNA를 침전시켰다. 따라서, 침전 반응에서 mRNA, GSCN(5M GSCN-10mM DTT 완충액), 및 MTEG(100% w/v)의 부피비는 1:2.3:1이었다. 바닥에 임펠러(impeller)가 장착된 60L Lee 용기에서 60 Hz의 속도로 현탁액을 혼합한 후, 68 g/m²의 로딩 용량을 갖는 0.11 m²의 심층 필터 상에 60 L/분/m²의 유속으로 로딩하였다. 침전되어 걸러진 mRNA를 90% MTEG를 사용해 60 L/분/m²의 유속으로 세척하였다.

더 큰 배치의 경우, IVT 합성을 통해 15 g의 CFTR mRNA를 합성하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 및 규모별 반응 조건에 따라 5' 캡 및 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 실시예 7에 나타낸 것과 동일한 MTEG 중합체-유도식 침전을 사용하여 mRNA를 침전시켰다. 따라서, 침전 반응에서 mRNA, GSCN(5M GSCN-10mM DTT 완충액), 및 MTEG(100% w/v)의 부피비는 1:2.3:1이었다. 바닥에 임펠러(impeller)가 장착된 60L Lee 용기에서 60 Hz의 속도로 현탁액을 혼합한 후, 68 g/m²의 로딩 용량을 갖는 0.11 m²의 심층 필터 상에 60 L/분/m²의 유속으로 로딩하였다. 침전되어 걸러진 mRNA를 95% MTEG를 사용해 60 L/분/m²의 유속으로 세척하였다. 세척 동안 압력이 증가될 때 유속을 30L/분/m²로 감소시켰다. 동일한 0.11 m² 심층 필터 상에서 여과 공정을 반복하였다.

원심분리 정제

IVT 합성을 통해 15 g의 CFTR mRNA를 합성하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 및 규모별 반응 조건에 따라 5' 캡 및 3' 폴리A 꼬리를 첨가하였다. 실시예 7에 나타낸 것과 동일한 MTEG 중합체-유도식 침전을 사용하여 mRNA를 침전시켰다. 따라서, 침전 반응에서 mRNA, GSCN(5M GSCN-10mM DTT 완충액), 및 MTEG(100% w/v)의 부피비는 1:2.3:1이었다. 바닥에 임펠러가 장착된 60L Lee 용기에서 60 Hz의 속도로 현탁액을 혼합하고, 1:10의 mRNA:필터 보조제의 질량비로 셀룰로오스 필터 보조제를 첨가하였다. 현탁액을 여과 원심분리기에 로딩하고 95% MTEG로 세척하였다.

두 가지 정제 전략 모두에 대해, 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 NanoDrop2000 분광 광도계에 의해 최종 mRNA 수율을 정량화하였다. RNA의 회수율(%)은 아래 표 7에 나타나 있다. 또한, mRNA의 무결성은 CE 도말 분석을 사용해 평가하였고, mRNA 순도는 잔류 공정 효소를 검출하는 은 염색 분석을 사용하여 검출하였다.

결과

7.5 g 이상의 배치 크기에서, 침전 중합체 및 세척 완충액 성분으로서 MTEG의 사용은 mRNA의 매우 높은 회수율(%)을 보장하였다. 표 7에 예시된 바와 같이, 동일한 침전 프로토콜을 사용할 때, MTEG는 원심분리 기반 정제 공정을 비롯하여, 필터 막 또는 필터 카트리지 기반 정제 공정, 예컨대 심층 여과(DF)에서 침전 완충액 및 세척 완충액 둘 다로서 사용될 수 있다. 원심분리를 사용하는 경우, 100%에 가까운 mRNA 회수율을 얻었다(하기 표 7 참조).

상이한 정제 공정에서 MTEG를 사용해 효율적으로 mRNA 회수하기
정제 플랫폼	규모 (g)	필터 보조제 (g)	회수율(%)
DF	7.5	n/a	약 93%
DF	15	n/a	약 82%
H300P	15	150	약 100%

또한, 침전 단계와 세척 단계 모두에서 MTEG의 사용은 mRNA 무결성 및 순도를 유지하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 최종 OTC 무결성(CE)은 약 92%였다. 또한, 은 염색에서 잔류 공정 효소는 검출되지 않았다(도 14 참조). 심층 여과 후 15 g CFTR 샘플의 경우, 무결성은 약 73%였고(도 15 참조), 은 염색에 공정 효소가 없다는 점을 감안할 때 순도는 매우 높았다(도 16). 마지막으로, 원심분리 후 15 g CFTR 샘플의 경우, 수율이 100%였을 뿐만 아니라 무결성은 약 82%였으며(도 17), 은 염색은 잔류 공정 효소를 나타내지 않았다(도 18). 따라서, MTEG는, 에탄올을 사용하지 않고 중합체 유도 침전을 사용하여 mRNA를 정제하는 데 매우 적합한 중합체이다.

균등물 및 범주

당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

Claims

전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서,
a) 고몰 염용액 및 양친매성 중합체를 포함하는 현탁액에 mRNA를 침전시켜 침전된 mRNA를 제공하는 단계;
b) 침전된 mRNA를 포획하는 단계;
c) 단계 b)에서 포획된 침전된 mRNA를 세척액으로 세척하여 침전된 mRNA를 정제하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 침전된 mRNA를 가용화시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 정제된 mRNA 조성물에는 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없는, 방법.
제2항에 있어서, 잔류 플라스미드 DNA는 10 pg/mg 이하인, 방법.
제1항에 있어서, 양친매성 중합체는 플루로닉, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제4항에 있어서, 양친매성 중합체는 PEG인, 방법.
제5항에 있어서, 현탁액은 약 10% 내지 약 100% w/v 농도로 PEG를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 현탁액은 약 50% w/v 농도로 PEG를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 고몰 염 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN)를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 중합체를 포함하는 세척액이 단계 c)에서 mRNA를 세척하는 데 사용되는, 방법.
제9항에 있어서, 양친매성 중합체는 PEG를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, PEG는 약 10% 내지 약 100% w/v 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제10항에 있어서, PEG는 약 50% 내지 약 90% w/v 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제12항에 있어서, PEG는 약 90% w/v 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PEG의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 g/mol인, 방법.
제14항에 있어서, PEG는 선형, 분지형, Y-형상, 또는 다중 아암 구성인, 방법.
제15항에 있어서, PEG는 선형인, 방법.
제16항에 있어서, PEG 용액은 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1,000, PEG 1,500, PEG 2,000, PEG 3,000, PEG 3,350, PEG 4,000, PEG 6,000, PEG 8,000, PEG 10,000, PEG 20,000, PEG 35,000, 및 PEG 40,000으로부터 선택된 PEG를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, PEG 용액은 PEG 6,000을 포함하는, 방법.
제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 용액은 PEG 6,000을 포함하지 않는, 방법.
제17항에 있어서, PEG는 PEG 400인, 방법.
제5항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 용액은 하나 이상의 PEG 중합체의 혼합물을 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 분자량을 갖는 중합체를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, PEG 중합체의 혼합물은 구별되는 기하학적 구성을 갖는 중합체를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액은 수성인, 방법.
제24항에 있어서, 세척액에는 알코올이 없는, 방법.
제25항에 있어서, 세척액에는 에탄올, 이소프로필 알코올, 또는 벤질 알코올이 없는, 방법.
제5항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 용액은 비수성 성분을 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 비수성 성분은 에탄올, 이소프로필 알코올, 또는 벤질 알코올인, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 포획하는 단계는 필터 상에서 일어나는, 방법.
제29항에 있어서, 필터는 미세여과 필터 또는 한외여과 필터로부터 선택되는, 방법.
제30항에 있어서, 미세여과 필터는 0.05 μm 내지 1.0 μm의 기공 크기를 갖는, 방법.
제31항에 있어서, 미세여과 필터는 1,000 킬로달톤(kDa) 초과의 명목 분자량 한계(NMWL)를 갖는, 방법.
제30항에 있어서, 한외여과 필터는 0.05 μm 미만의 기공 크기를 갖는, 방법.
제33항에 있어서, 한외여과 필터는 약 1 kDa 내지 1,000 kDA의 NMWL을 갖는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 접선 유동 여과(TFF) 또는 정용여과가 단계 c)에서 침전된 mRNA를 정제하는 데 사용되는, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 보조제가 사용되는, 방법.
제36항에 있어서, 필터 보조제는 셀룰로오스계인, 방법.
제37항에 있어서, 필터 보조제는 규조토 및/또는 화산재를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 원심분리하여 mRNA 펠릿을 수득하는, 방법.
제40항에 있어서, mRNA 펠릿은 완충액에 재현탁되는, 방법.
제41항에 있어서, 완충액은 물, 트리스-EDTA(TE), 구연산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 50% 내지 약 100%인, 방법.
제43항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 70% 내지 약 99%인, 방법.
제44항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 90% 내지 약 99%인, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 60% 내지 약 100%인, 방법.
제46항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 80% 내지 약 99%인, 방법.
제47항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 90% 내지 약 99%인, 방법.
전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서,
a) 고몰 염 용액 및 양친매성 중합체를 포함하는 현탁액에서 mRNA를 침전시키는 단계;
b) mRNA를 필터 상에 포획하는 단계; 및
c) 단계 b)의 mRNA를 PEG 용액으로 세척하여 실질적으로 오염물질이 없는 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제49항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 50% 내지 약 100%인, 방법.
제50항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 70% 내지 약 99%인, 방법.
제51항에 있어서, 정제된 mRNA의 수율은 약 90% 내지 약 99%인, 방법.
제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 60% 내지 약 100%인, 방법.
제53항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 80% 내지 약 99%인, 방법.
제54항에 있어서, 정제된 mRNA의 순도는 약 90% 내지 약 99%인, 방법.
제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA는 적어도 100 mg, 1 g, 10 g, 100 g, 1 kg, 10 kg, 100 kg, 1 미터톤, 또는 10 미터톤의 mRNA 또는 그 사이의 임의의 양을 포함하는, 방법.
제55항에 있어서, 침전된 mRNA는 1 kg 초과의 mRNA를 포함하는, 방법.
제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 중합체는 플루로닉, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제58항에 있어서, 양친매성 중합체는 PEG인, 방법.
제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 고몰 염 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN)를 포함하는, 방법.
제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 에탄올이 없는, 방법.
제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA 조성물에는 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없는, 방법.
전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서,
a) PEG를 포함하는 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN) 용액에서 mRNA를 침전시키는 단계;
b) 단계 a)의 용액을 원심분리하여 mRNA 펠릿을 생성하는 단계;
c) mRNA 펠릿을 완충액에 재현탁하는 단계;
d) mRNA를 필터 상에 포획하는 단계;
e) 단계 d)의 mRNA를 PEG 용액으로 세척하는 단계; 및
f) 단계 e)의 세척된 mRNA를 가용화시켜 실질적으로 오염물질이 없는 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제63항에 있어서, 정제된 mRNA 조성물에는 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없는, 방법.
mRNA를 제조하는 방법으로서,
a) (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소를 혼합함으로써 시험관 내 전사(IVT)를 수행하여 전장 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 생성하는 단계
b) 고몰 염 및 양친매성 중합체를 현탁액에 제공하여 전장 mRNA를 침전시키고, 현탁액에 침전된 전장 mRNA를 제공하는 단계;
c) 현탁액을 필터에 도포하여 침전된 전장 mRNA를 포획하는 단계;
d) 단계 (c)의 침전된 전장 mRNA를 수성 용매로 세척하여 수용액 중의 정제된 전장 mRNA를 수득하는 단계; 및
e) 단계 (d)에서 침전된 mRNA를 가용화시켜 정제된 mRNA 조성물을 수득하는 단계를 포함하되, 단계 (d)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에는 (i) 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿 및 (ii) RNA 중합효소가 실질적으로 없는, 방법.
제65항에 있어서, 단계 (a)에서의 RNA 중합효소는 SP6 중합효소인, 방법.
제65항 또는 제66항에 있어서, 단계 (e)에서 제공된 수용액 중의 정제된 전장 mRNA에도 (v) 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없는, 방법.
제1항, 제49항, 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 중합체는 MTEG를 포함하는, 방법.
제68항에 있어서, 현탁액은 침전된 mRNA, 고몰 염 용액, 및 MTEG를 포함하되, MTEG는 약 15% 내지 약 45% w/v의 최종 농도인, 방법.
제69항에 있어서, 현탁액은 침전된 mRNA, 고몰 염 용액, 및 MTEG를 포함하되, MTEG는 약 20% 내지 약 40% w/v의 최종 농도인, 방법.
제70항에 있어서, 현탁액은 침전된 mRNA, 고몰 염 용액, 및 MTEG를 포함하되, MTEG는 약 20%, 약 25%, 약 30%, 또는 약 35% w/v의 최종 농도인, 방법.
제1항, 제49항, 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁액은 침전된 mRNA, 고몰 염 용액, 및 PEG 또는 MTEG를 포함하는, 방법.
제5항, 제59항 또는 제65항에 있어서, 고몰 염은 약 2~4M의 최종 농도이고, PEG는 약 5% 내지 약 20% w/v의 최종 농도인, 방법.
제73항에 있어서, 고몰 염은 약 2.5~3M의 최종 농도이고, PEG는 약 10% 내지 약 15% w/v의 최종 농도인, 방법.
제74항에 있어서, 고몰 염은 약 2.7M의 최종 농도이고, PEG는 약 12% w/v의 최종 농도인, 방법.
제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 고몰 염 용액은 GSCN을 포함하는, 방법.
제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 (예를 들어, PEG-6000인), 방법.
제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁액은 침전된 mRNA와 2:1, 5:1, 10:1, 또는 15:1의 질량비로 필터 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
제78항에 있어서, 필터 보조제는 침전된 mRNA와의 질량비가 10:1인, 방법.
제78항 또는 제79항에 있어서, 필터 보조제는 셀룰로오스계인, 방법.
제9항에 있어서, 양친매성 중합체는 MTEG를 포함하는, 방법.
제81항에 있어서, MTEG는 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% w/v의 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제82항에 있어서, MTEG는 약 90% 내지 100% w/v 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제83항에 있어서, MTEG는 약 95% w/v 농도로 세척액 중에 존재하는, 방법.
제63항의 단계 a)에 있어서, GSCN은 약 2~4M의 최종 농도이고, PEG는 약 5% 내지 약 20% w/v의 최종 농도인, 방법.
제85항에 있어서, GSCN은 약 2.7M의 최종 농도이고, PEG는 약 12% w/v의 최종 농도인, 방법.
제85항 또는 제86항에 있어서, PEG는 약 6000 g/mol의 분자량을 갖는 (예를 들어, PEG-6000인), 방법.
제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 침전된 mRNA와 2:1, 5:1, 10:1, 또는 15:1의 질량비로 필터 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
제88항에 있어서, 필터 보조제는 침전된 mRNA와의 질량비가 10:1인, 방법.
제88항 또는 제89항에 있어서, 필터 보조제는 셀룰로오스계인, 방법.
제63항의 단계 e)에 있어서, PEG 용액 중의 PEG는 약 50% 내지 약 95% w/v 농도인, 방법.
제63항의 단계 e)에 있어서, PEG 용액 중의 PEG는 약 90% 내지 약 100% w/v 농도인, 방법.
제90항에 있어서, PEG 용액 중의 PEG는 약 90% w/v 농도인, 방법.