KR20220004973A

KR20220004973A - 보체-매개 용해에 대한 세포 감수성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20220004973A
Application number: KR1020217033593A
Authority: KR
Inventors: 조 텍터; 맷 텍터
Original assignee: 더 유에이비 리서치 파운데이션
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-01-12
Also published as: CN114127560A; BR112021018557A2; JP2022525474A; AU2020241879A1; EP3942298A1; US20210405065A1; WO2020191255A1; CA3134654A1; EP3942298A4

Abstract

잠재적인 이식 수혜자 환자가 수혜자에 의한 공여자 기관의 수용을 감소시키거나 또는 방지할 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 설정하는 보체-의존적 세포 세포독성 분석의 민감도를 증가시키는 방법이 제공된다. 보체 억제제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자는 후보 이식 기관으로부터 유래된 세포에서 불활성화된다. 이러한 변형된 세포는, 더이상 적어도 하나의 보체 억제제를 생성하지 않기 때문에, 잠재적인 이식 수혜자로부터의 혈청 샘플에 배치될 때, 혈청 보체의 효과적인 활성을 감소시키지 않는다. 더 낮은 수준의 수혜자 환자 혈청 항체는 공여자 세포의 검출가능한 용해를 유도하는 데 효과적이게 된다.

Description

보체-매개 용해에 대한 세포 감수성을 증가시키는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 3월 21일 출원된 "METHOD FOR INCREASING CELL SUSCEPTIBILITY TO COMPLEMENT-MEDIATED LYSIS"이라는 발명의 명칭의 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/821,641호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 2020년 3월 18일 생성된 "2221042940_ST25"라는 파일명의 ASCII.txt 파일로 전자 형식으로 제출된 서열 목록을 함유한다. 서열 목록의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.

이종이식(상이한 종의 공여자로부터의 기관, 조직 및 세포의 이식)은 인간 공여자 췌장의 부족을 효과적으로 해결할 수 있다. 이종이식물은 또한 유리하게는 (i) 예측가능한, 비응급성 근거로 제공되고; (ii) 제어 환경에서 생산되며; (iii) 이식 전에 특성화 및 연구에 이용가능하다.

공여자 및 수혜자 종 사이의 관계에 따라, 이종이식물은 일치 또는 불일치로 기재될 수 있다. 일치 종은 계통 발생적으로 밀접하게 관련된 종이다(예를 들어, 마우스와 래트). 불일치 종은 밀접하게 관련되지 않는다(예를 들어, 돼지와 인간). 돼지는 인간과 많은 해부학적 및 생리학적 특징을 공유하므로, 이종이식 분야에서 대부분의 연구의 초점이 되었다. 돼지는 또한 임신 기간이 비교적 짧고, 병원체가 없는 환경에서 사육될 수 있고 식품 공급원으로서 통상적으로 사용되지 않는 동물(예를 들어, 영장류)과 연관된 동일한 윤리적 문제를 나타내지 않을 수 있다. 돼지에서 영장류로의 이종이식 분야에서 과학적 지식 및 전문지식은 지난 10 년에 걸처 빠르게 성장하여, 생명을 구하는 돼지 이종이식편의 영장류 수혜자의 생존을 상당히 연장시켰다. (Cozzi et al., Xenoplantation 16: 203-214. 2009).

이종이식편 거부반응은 다음의 3 단계로 나눠질 수 있다: 초급성 거부반응, 급성 체액 이종이식편 거부반응, 및 T 세포-매개 세포 거부반응. 초급성 거부반응(HAR)은 이식편 재관류 후 수분 내지 수 시간 이내에 비가역성 이식편 손상 및 손실을 초래하는 매우 빠른 이벤트이다. 이는 이식 시 수혜자 내에 존재하는 이종반응성 천연 항체의 존재에 의해 촉발된다. 인간은 돼지 세포에서 발견된 α1,3-갈락토스(Gal) 에피토프에 대한 자연 발생 항체를 갖는다. 이 항체는 대량으로 생산되고 HAR의 주요 매개자이다. αGT(GTKO)로서 돼지 세포로부터 α1,3-갈락토스(Gal) 에피토프의 유전적 제거는 HAR을 겪지 않은 GTKO 돼지를 초래한다.

본 발명의 일 측면은 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법의 구현예를 포함하며, 상기 방법은 (a) 세포 집단을 유전적으로 변형시킴으로써 동물 또는 인간 기관으로부터 유래된 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계; (b) 유전적으로 변형된 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 유전적으로 변형된 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소하도록 유전적으로 변형되지 않은 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계를 포함한다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포 집단은 후보 이식 기관으로부터 유래될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포 집단은 공여자 림프구일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포 집단은 신장으로부터 유래될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포 집단은 신장 내피 세포일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 방법은 (i) 기관으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 (ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 세포를 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 기관-유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제에 특이적인 것인, 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 불활성 보체 억제제 암호화 유전자는 CD46, CD55, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 불활성화시키는 가이드 RNA는 서열번호: 1, 서열번호: 3; 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 9, 및 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2, 서열번호: 4; 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 및 서열번호: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46-유사일 수 있고 CRISPR Cas9-기반 불활성화를 위한 가이드 RNA는 생리학적 조건 하에 서열번호: 19의 서열, 또는 이의 보체와 혼성화할 수 있고, 서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드 PX330 또는 PX458일 수 있고 플라스미드가 포유류 세포 내로 형질감염될 때 발현 플라스미드는 Cas9를 발현한다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호: 13-18로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법의 구현예를 포함하며, 상기 방법은 (a) 세포 집단을 유전적으로 변형시킴으로써 후보 동물 또는 인간 이식 공여자 신장으로부터 유래된 신장 내피 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계로, 여기서 유전적 변형은 다음 단계에 의해 이루어질 수 있는 것인, 단계: (i) 신장 또는 림프구로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 (ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 신장 내피 세포를 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 CD46 보체 억제제-암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 신장-유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제 CD46에 특이적이고 서열번호: 1 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 발현 벡터는 서열번호: 13 또는 16으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 것인, 단계; (b) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소되도록 유전적으로 변형되지 않은 신장 내피 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계를 포함한다.

또한 본 개시내용의 또 다른 측면은 유전적으로 변형된 포유류 세포이며, 여기서 세포는 공여자 조직으로부터 유래되고, 여기서 세포는 보체 억제제의 발현이 감소되거나 또는 발현되지 않도록 유전적으로 변형된다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46, CD55, 또는 CD59일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46-유사, CD46, CD55, 또는 CD59일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46-유사일 수 있고 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90% 유사한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 보체 억제제는 CD46-유사일 수 있고 서열번호: 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포는 보체 억제제를 암호화하는 세포 게놈의 전부 또는 단편의 CRISPR Cas9에 의한 결실에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포는 배양된 세포 집단일 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 공여자 조직은 신장, 폐, 심장, 근육, 피부 조직, 또는 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 기관으로부터 수득될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 세포는 후보 공여자 기관으로부터 수득된다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 후보 기관은 신장, 폐, 심장, 근육, 및 피부 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 후보 기관은 신장이다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 포유류 세포는 신장 내피 세포 또는 림프구이다.

본 개시내용의 추가의 측면은 첨부 도면과 함께 취해질 때, 하기에 기재된 다양한 구현예의 상세한 설명의 검토 시 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1a-1c는 CD46이 결핍된 신장 내피 세포(REC)의 생성을 도시한다. CRISPR/Cas9를 사용하여 GGTA1 유전자 및 클래스 I SLA 유전자가 결핍된 창시자 내피 세포를 제조하였다. 결과적으로, 클래스 I SLA 단백질 및 알파 갈락토스 탄수화물은 이들 세포의 표면에서 발현되지 않았다. 창시자 세포의 유세포 분석 분석법은 점선 히스토그램으로 표시된다. 음성 대조군 세포는 염색되지 않았고(회색 히스토그램), 온전한 클래스 I SLA 및 GGTA1 유전자가 있는 양성 대조군 REC는 실선 히스토그램으로 도시되어 있다. 이러한 불멸의 REC를 CD46 유전자에 대해 표적화된 CRISPR/Cas9로 처리하였다.
도 1a는 모노클로날 항체를 사용하여 검출된 클래스 I 단백질(패널 A) 및 알파 갈 에피토프의 발현을 검출하는 데 사용된 IB4 렉틴(패널 B)을 도시한다.
도 1b는 CD46 유전자가 파괴되었다는 것을 나타내는 PCR 산물의 결여("-"로 표시된 레인)를 도시한다. 세포를 단리하고 역-전사효소 PCR을 사용하여 CD46 유전자의 전사에 대해 평가하였다. 온전한 CD46 유전자를 갖는 모 REC를 양성 대조군으로 사용하였고, CD46 유전자 산물을 나타내는 명확한 밴드를 입증하였다("+"로 표시된 레인).
도 1c는 모 세포(실선 히스토그램), 및 CD46 녹아웃(knockout)(점선 히스토그램)에서 평가된 세포-표면 CD46 발현을 도시한다. 염색되지 않은 세포를 음성 대조군(회색 히스토그램)으로 사용하였다.
도 2a는 CD46 KO REC에 의한 2 개의 알려진 외항원의 발현을 도시한다. 모 REC를 B4GalNT2 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9로 처리하였다. B4GalNT2 효소에 의해 생성된 이종항원인 N-아세틸-갈락토사민을 조사하기 위해 DBA 렉틴을 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 모(패널 A) 및 CD46-KO(패널 B) 세포 둘 다를 테스트하였다. 결과는 점선 히스토그램으로 나타낸다. 동일한 음성 대조군(회색 히스토그램-제시 염색되지 않은 세포) 및 온전한 B4GalNT2가 있는 양성 대조군 세포(실선 히스토그램)를 패널 A 및 B에서 사용하였다.
도 2b는 또한 Neu5Gc-특이적 모노클로날 항체를 사용하여 평가된 제2 이종항원인 Neu5Gc의 발현 수준을 도시한다. 염색되지 않은 세포를 음성 대조군(회색 히스토그램)으로 사용하였다. 모 세포에 의한 Neu5Gc의 발현은 실선 히스토그램으로 제시한 반면 점선 히스토그램은 CD46-KO 세포를 나타낸다.
도 3은 CD46(+) 모 REC 대 CD46(-) REC의 보체-의존적 세포 세포독성 분석을 도시한다. 두 가지 유형의 REC를 13 명의 상이한 인간으로부터 수집된 순환 항체와 배양함으로써 유세포 분석 기반 CDC 검정을 수행하였다. % 사멸 세포는 새끼 토끼 보체에 더하여 인간 항체로 관찰된 사멸 대비 새끼 토끼 보체 단독으로 관찰된 사멸 %를 차감하여 계산하였다. 선은 두 세포주에서 각 인간 항체 샘플에 대해 관찰된 사멸 수준을 강조한다. 실험은 13 개 샘플 모두에 대해 2 회 수행하였다.
도 4a-4d는 세포 용해 활성과 IgM 및 IgG 결합 수준의 비교를 도시한다. 도 3에서 사용된 세포를 13 명의 인간 샘플에 대한 IgM 및 IgG 결합 수준에 대해 테스트하였다. CDC 결과의 3 가지 패턴을 사용하여 다양함 샘플을 분류하였다. 도 3에 제시된 데이터로부터의 대표적인 예가 이러한 분류를 강조하기 위해 제시되어 있다.
도 4a는 CD46의 존재 또는 부재와 관계없이 양성인(20% 초과의 사멸 세포) CDC의 2 가지 예를 도시한다.
도 4b는 CD46의 존재 또는 부재와 관계 없이 음성인(20% 미만의 사멸 세포) CDC의 2 가지 예를 도시한다.
도 4c는 CD46(+) 세포를 사용할 때 음성이지만, CD46(-) 세포에서 양성이 되는 CDC를 도시한다.
도 4d는 CD46(+) 세포보다 CD46(-) 세포의 용해가 적게 나타나는 CDC를 도시한다. 이러한 샘플에 대한 항체 결합의 유세포 분석 분석법은 CD46(+) 및 CD46(-) REC에 대한 상대 IgG 및 IgM 결합을 조사하기 위해 삼중으로 수행하였다. 각 CDC 플롯 아래의 막대 그래프는 IgG 및 IgM 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 서열번호: 1-12의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 6은 서열번호: 13-18의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 7은 수탁 번호 XM_003482667.3을 갖고 돼지 CD46-유사 보체 억제제를 암호화하는 mRNA 뉴클레오티드 서열인 뉴클레오티드 서열(서열번호: 19)을 도시한다. gRNA 위치는 밑줄로 표시되어 있다. 가이드 RNS 서열(서열번호: 20이 또한 도시되어 있다).
도 8은 인간 CD46(서열번호: 21); 돼지 CD46(서열번호: 22), 및 돼지 CD46-유사 (서열번호: 23) 보체 억제제의 아미노산 서열 사이의 유사성을 나타내는 아미노산 서열 정렬을 도시한다.

본 개시내용은 기재된 특정 구현예로 제한되지 않고, 물론 이와 같이 달라질 수 있다. 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하는 목적으로 제공되며, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한치 및 하한치 및 해당 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값 사이에서, 하한치 단위의 10분의 1까지 각 중간 값이 본 개시내용 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 언급됨 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 제한을 조건으로 본 개시내용 내에 포함된다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 개시내용에 포함된다.

본 개시내용의 구현예는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 의학, 유기 화학, 생화학, 분자 생물학, 약리학 등의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.

하기 실시예는 본원에 개시되고 청구된 조성물 및 화합물의 방법 및 용도를 수행하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하려는 노력이 이루어졌지만, 일부 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이고, 압력은 대기압 또는 부근이다. 표준 온도 및 압력은 20℃ 및 1 기압으로 정의된다.

본 개시내용의 구현예를 상세하게 기재하기 전에, 달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용이 특정 물질, 시약, 반응 물질, 제조 공정, 치수, 주파수 범위, 적용 등을 제한하지 않고 이와 같이 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 또한 논리적으로 가능한 경우, 단계는 상이한 순서로 실행될 수 있음이 본 개시내용에서 가능하다. 또한 본 개시내용의 구현예는 본원에 기재된 실시예를 넘어서는 측정을 수반하는 추가 구현예에 적용될 수 있으며, 이는 제한하려는 것으로 의도되지 않는 것이 가능하다. 또한 본 개시내용의 구현예는 본원에 기재된 실시예를 넘어서는 다른 측정 기술과 조합되거나 또는 통합될 수 있으며, 이는 제한하려는 것으로 의도되지 않는 것이 가능하다.

명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "지지체"에 대한 언급은 복수의 지지체를 포함한다. 본 명세서 및 하기 청구범위에서, 달리 반대 의도가 명백하지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 정의되어야 하는 다수의 용어가 언급될 것이다.

이 텍스트에 인용된 각 출원 및 특허, 뿐만 아니라 각 출원 및 특허에 인용된 각 문서 또는 참고문헌(각 발행된 특허의 출원 동안 포함; "출원 인용된 문서"), 및 이들 출원 및 특허 중 임의의 것으로부터의 우선권에 상응하고/하거나 주장하는 각 PCT 및 외국 출원 또는 특허, 및 각 출원 인용된 문서에서 인용되거나 또는 참조된 각 문서는 본원에 참조로 명시적으로 포함된다. 추가로, 이 텍스트, 청구범위 이전의 참고 목록, 또는 텍스트 자체에 인용된 문서 또는 참고문헌; 및 이들 문서 또는 참고문헌("본원에 인용된 참고문헌") 각각, 뿐만 아니라 본원에 인용된 참조(임의의 제조업체의 사양, 지침 등 포함) 각각에 인용된 각 문서 또는 참고문헌은 본원에 참조로 명시적으로 포함된다.

다양한 구현예를 기재하기 전에, 다음 정의가 제공되며 달리 나타내지 않는 한 사용되어야 한다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "보체-의존적 세포독성"(CDC)은 IgG 및 IgM 항체의 효과기 기능을 지칭한다. 이들이 표적 세포(예를 들어 박테리아 또는 바이러스 감염된 세포, 또는 이식된 기관의 세포와 같은 외래 세포) 상의 표면 항원에 결합된 경우, 고전적인 보체 경로는 이러한 항체에 단백질 C1q를 결합시킴으로써 촉발되어, 막 공격 복합체(MAC) 형성 및 표적 세포 용해를 초래한다. 보체 시스템은 인간 IgG1, IgG3 및 IgM 항체에 의해 효과적으로 활성화되고, IgG2 항체에 의해 약하게 활성화되며 IgG4 항체에 의해 활성화되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD46 보체 조절 단백질"(또한 CD46, 분화 클러스터 46, 막 보조인자 단백질로도 알려짐)은 CD46 유전자에 의해 암호화되고 CD46이 억제 보체 수용체인 단백질을 지칭한다. 유전자는 보체 시스템의 구조적 구성성분을 암호화하는 다른 유전자와 함께 클러스터에서 발견된다. 14 개의 상이한 이소형을 암호화하는 적어도 14 개의 상이한 전사체 변이체가 이 유전자에 대해 발견되었다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 I형 막 단백질이고 보체 시스템의 조절 부분이다. 암호화된 단백질은 보체에 의한 손상으로부터 숙주 세포를 보호하는 혈청 인자 I에 의한 보체 구성성분 C3b 및 C4b의 (절단을 통한) 불활성화를 위한 보조인자 활성을 갖는다.

CD46에 상동성인 하나의 유리한 표적 보체 억제제는 서열번호: 23에 따른 아미노산 서열을 갖는 돼지 CD46-유사 폴리펩티드이며, 서열번호: 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "보체 붕괴-촉진 인자"(또한 CD55 또는 DAF로도 알려짐)는 CD55 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. DAF는 세포 표면 상의 보체 시스템을 조절한다. 이는 C4(고전적 또는 렉틴 경로) 또는 C3(대체 경로)의 활성화 동안 생성되는 C4b 및 C3b 단편을 인식한다. DAF와 고전적 및 렉틴 경로의 세포-관련 C4b의 상호작용은 C2의 C2b로의 전환을 방해하여, C4b2b C3-전환효소의 형성을 방지하고, DAF와 대체 경로의 C3b의 상호작용은 인자 D에 의한 인자 B의 Bb로의 전환을 방해하여, 대체 경로의 C3bBb C3 전환효소의 형성을 방지한다. 따라서, 보체 캐스케이드의 증폭 전환효소를 제한함으로써, DAF는 막 공격 복합체 형성을 간접적으로 차단한다. 이러한 당단백질은 조혈 및 비-조혈 세포 중에 광범위하게 분포되어 있다.

용어 "CD59 당단백질"(또한 MAC-억제 단백질(MAC-IP), 반응성 용해의 막 억제제(MIRL), 또는 프로텍틴으로도 알려짐)은 인간에서 CD59 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 이는 LY6/uPAR/알파-신경독소 단백질 패밀리에 속한다.CD59는 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커를 통해 숙주 세포에 부착된다. 보체 활성화가 숙주 세포 상의 C5b678의 침착으로 이어질 때, CD59는 C9가 중합되고 보체 막 공격 복합체를 형성하는 것을 방지할 수 있다. 또한 CD59-CD9 복합체의 세포내이입과 같은 활성 조치를 수행하기 위해 세포에 신호를 보낼 수 있다.

용어 "녹아웃"은 주어진 유전자가 변경되거나, 제거되거나, 또는 파괴된 유전자이식 비-인간 포유동물 또는 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비자연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환가능하고 사람 손의 개입을 나타낸다. 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 언급할 때, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 자연에서 자연적으로 회합되고 자연에서 발견되는 적어도 하나의 다른 구성성분이 적어도 실질적으로 없다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성"은 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 다른 비전통적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과의 수소 결합을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 퍼센트는 상보적으로 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10 중 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적임). "완전히 상보적"은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접한 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보적"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%. 90%, 95%. 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 또는 엄격한 조건 하에 혼성화하는 2 개의 핵산을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 혼성화를 위한 "엄격한 조건"이라는 용어는 표적 서열에 상보성을 갖는 핵산이 주로 표적 서열과 혼성화하고, 실질적으로 비-표적 서열에 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이고, 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y에 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식에 의해 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2 개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3 개 이상의 가닥, 단일 자기-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "보체"로서 지칭된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터(예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체 내로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 내로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "CRISPR 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 지칭됨), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나 또는 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로서 지칭됨) 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다.

CRISPR 복합체 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 이때 표적 서열 및 가이드 서열 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체 형성을 촉진한다. 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요하지는 않다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵생물 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 있을 수 있다. 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 현재 개시된 주제의 측면에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형으로 지칭될 수 있다. 현재 개시된 주제의 측면에서, 재조합은 상동 재조합이다.

일부 구현예에서, 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열과 같은 하나 이상의 삽입 부위(또한 "클로닝 부위"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 초과의 삽입 부위)는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열가 사용될 때, 단일 발현 작제물은 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적에 대한 CRISPR 활성을 표적하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개 초과의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 초과의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있고, 임의적으로 세포에 전달될 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. 예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 Swissport 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 CRISPR 효소는 Cas9와 같은 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서 CRISPR 효소는 Cas9이고, 에스. 피오게네스 또는 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)로부터의 Cas9일 수 있다.

일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기 쌍 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화한다.

일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 코딩 서열은 진핵생물 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 진핵생물 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비-인간 영장류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포 또는 이로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 초과의 코돈)을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 사이의 코돈 용법의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 변역 효율과 상관관계가 있으며, 결국 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRAN) 분자의 이용가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춰질 수 있다. 코돈 용법 표는 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 용이하게 이용가능하고, 이러한 표는 다양한 방식으로 조정될 수 있다. 특정 숙주 세포에서 발현을 위한 특성 서열을 최적화하는 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 서열에서 하나 이상의 코돈(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.

일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하도록 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 6/0, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 97.5%/0, 99% 이상, 또는 약 50%, 6/0, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 97.5%/0, 99% 초과이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어 Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(캘리포니아주 샌디에이고 일루미나 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능), 및 Maq를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상, 또는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 초과의 뉴클리오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다.

표적 서열에 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 테스트될 가이드 서열을 포함하여 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 구성성분은 CRISPR 서열의 구성성분을 암호화하는 벡터로의 형질감염과 같이 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공된 다음, 본원에 기재된 바와 같은 Surveyor 검정에 의해서와 같이 표적 서열 내의 우선적 절단의 평가가 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 테스트될 가이드 서열 및 테스트 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 구성성분을 제공하고, 테스트 및 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 테스트 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 발생할 것이다.

본 출원이 전형적인 비-인간 동물(돼지)을 기재하고 있지만, 다른 동물의 세포가 유사하게 유전적으로 변형될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 돼지는 인간에게 기관 이식하기에 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돼지"는 야생 돼지, 가축 돼지, 미니 돼지, 수스 스크로파(Sus scrofa) 돼지, 수스 스크로파 도메스티쿠스(Sus scrofa domesticus) 돼지, 뿐만 아니라 사육 돼지를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 돼지를 지칭한다. 돼지 기관, 조직 또는 세포는 돼지로부터의 기관, 조직, 약화된 동물 조직, 및 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "공여자 기관"은 이종이식편으로서 사용하기 위한 동물로부터의 기관, 조직 및/또는 세포를 지칭한다. 이식 물질은 기관 이식이 필요한 인간 대상체를 위한 일시적 또는 영구적 기관 대체물로서 사용될 수 있다. 뇌, 심장, 폐, 눈, 위, 췌장, 신장, 간, 내장, 자궁, 방광, 피부, 모발, 손톱, 귀, 땀샘, 코, 입, 입술, 비장, 잇몸, 치아, 혀, 침샘, 편도선, 인두, 식도, 대장, 소장, 소장, 직장, 항문, 갑상선, 흉선, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 부신, 골격근, 평활근, 혈관, 혈액, 척수, 기도, 요관, 요도, 시상하부, 뇌하수체, 유문, 부신, 난소, 난관, 자궁, 질, 유선, 고환, 정낭, 음경, 림프, 림프절 및 림프관을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 돼지 기관이 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "합성" 및 "조작된"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고 사람 손에 의해 생성되거나 또는 변형된 비자연 발생 물질(예를 들어, 이의 게놈에서 하나 또는 미리 결정된 조작된 유전적 변형을 갖는 유전적으로 변형된 동물 또는 세포)을 지칭하거나 또는 이러한 물질(예를 들어, 이러한 유전적으로 변형된 동물로부터 수득된 조직 또는 기관)을 사용하여 유래된다. 하나 이상의 합성 또는 조작된 핵산을 포함하는 세포는 조작된 또는 유전적으로 변형된 세포인 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조작된 조직"은 조작된/유전적으로 변형된 세포의 응집체를 지칭한다.

유전자 산물의 발현은 유전자 산물의 전체 발현이 감소되거나, 변경된 크기의 유전자 산물이 생산될 때, 또는 유전자 산물이 변경된 작용성을 나타낼 때 감소된다. 따라서, 유전자가 야생형 양의 생성물을 발현하지만 생성물이 변경된 효소적 활성, 변경된 크기, 변경된 세포 국소화 패턴, 변경된 수용체-리간드 결합 또는 다른 변경된 활성을 갖는 경우, 해당 유전자 산물의 발현은 감소된 것으로 간주된다. 발현은 RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western blot), 노던 블롯(Northern blot), 마이크로어레이 분석, 면역침전, 방사선학적 검정, 폴리펩티드 정제, 분광광도 분석, 아크릴아미드 겔의 쿠마시(Coomassie) 염색, ELISA, 2-D 겔 전기영동, 제자리 혼성화, 화학발광, 은 염색, 효소적 검정, 폰소우(ponceau) S 염색, 멀티플렉스 RT-PCR, 면역조직화학적 검정, 방사선면역검정, 비색 분석, 면역방사계측 검정, 양성자 방출 단층촬영, 형광 검정, 투과된 세포의 형광 활성화 세포 분류기 염색, 방사성면역흡착 검정, 실시간 PCR, 혼성화 검정, 샌드위치 면역검정, 유세포 분석, SAGE, 차등 증폭, 또는 전자 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, Ausubel et al., eds. (2002) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, New York; Coligan et al., (2002) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience, New York, New York을 참조하며; 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 특이적으로 결합하여 또 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직과 상보적인 것으로 정의되는 면역글로불린을 지칭한다. 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 또는 재조합 항체일 수 있고, 숙주 면역화 및 혈청(폴리클로날) 수집과 같이 당업계에 널리 알려진 기술에 의해 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질(모노클로날)을 수집함으로써, 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 돌연변이화된 버전을 클로닝 및 발현함으로써 제조될 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 이의 단편을 포함할 수 있으며, 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM, IgY 등과 같은 다양한 클래스 및 이소형을 포함한다. 이의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')₂, Fab', scFv 등을 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 또는 이의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체는 특정 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한 적절한 경우에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 항체 어레이 상에 배치된 항체에 결합하고 항체 상의 적어도 하나의 공유된 형태적 에피토프를 포함하는 임의의 개체(entity)를 지칭한다. 항원은 단백질, 펩티드, 항체, 소분자, 지질, 탄수화물, 핵산, 및 알레르겐일 수 있다. 항원은 순수한 형태이거나 또는 항원이 다른 구성성분와 혼합된 샘플 내에 있을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "암호화하는" 서열은 적절한 조절 서열(또는 "제어 요소")의 제어 하에 배치될 때 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자를 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3'(카르복시) 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프라이머"는 증폭되거나 또는 복제될 DNA 세그먼트에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적으로 프라이머는 PCR에서 사용된다. 프라이머는 주형 DNA와 혼성화되고(또는 이에 "어닐링"하고) 복제/증폭 과정을 위한 시작점으로서 폴리머라제 효소에 의해 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현된" 또는 "발현"은 유전자의 2 개의 핵산 가닥 중 하나의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 핵산 분자를 제공하기 위한 유전자로부터의 전사를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현된" 또는 "발현"은 또한 단백질, 아미노산 서열 또는 이의 일부를 제공하기 위한 상기 RNA 핵산 분자로부터의 번역을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 본원에 사용된 단백질을 암호화하는 DNA를 발현하고 단백질을 생성하는 데 유용한 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 다양한 원핵생물 및/또는 진핵생물 숙주 세포에서 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하고 이 단백질을 생성하는 한 제한되지 않는다. 효모, 동물 세포, 또는 곤충 세포가 숙주로서 사용될 때, 발현 벡터는 바람직하게는 적어도 프로모터, 개시 코돈, 단백질을 암호화하는 DNA 및 종결 코돈을 포함한다. 또한 신호 펩티드를 암호화하는 DNA, 인핸서 서열, 단백질을 암호화하는 유전자의 5'- 및 3'-비번역된 영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 선택가능한 마커 영역, 및 레플리콘(replicon)을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 필요에 따라 일반적으로 사용되는 유전자 증폭을 위한 유전자(마커)를 함유할 수 있다.

박테리아에서 단백질을 발현하는 프로모터/오퍼레이터 영역은 프로모터, 오퍼레이터, 및 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열(예를 들어, AAGG)을 포함한다. 예를 들어, 숙주가 에스케리키아(Escherichia)인 경우, 바람직하게는 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, 람다.PL 프로모터, b 1pp 프로모터, tac 프로모터 등을 포함한다. 숙주가 포유류 세포와 같은 진핵생물 세포인 경우, 이의 예는 SV40-유래 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 열 충격 프로모터 등이다. 물론, 프로모터는 상기 예로 제한되지 않는다. 또한, 인핸서를 사용하면 발현에 효과적이다. 바람직한 개시 코돈은 예를 들어, 메티오닌 코돈(ATG)이다. 통상적으로 사용되는 종결 코돈(예를 들어, TAG, TAA, 및 TGA)이 종결 코돈으로 예시된다. 일반적으로, 사용된 천연 또는 합성 종결인자는 종결인자 영역으로 사용된다. SV40으로부터 유래된 것과 같이 당업계에서 일반적으로 사용되는 인핸서 서열, 폴리아데닐화 부위, 및 스플라이싱 접합부가 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 이용되는 선택가능한 마커는 일반적인 방법에 따라 사용될 수 있다. 이의 예는 테트라사이클린, 암피실린, 또는 카나마이신과 같은 항생제에 대한 내성 유전자이다.

본원에 사용되는 발현 벡터는 적어도 상기 언급된 프로모터, 개시 코돈, 단백질을 암호화하는 DNA, 종결 코돈, 및 종결인자 영역을 적절한 레플리콘에 연속적으로 및 순환적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 경우, 적절한 DNA 단편(예를 들어, 링커, 제한 부위 등)은 제한 효소로의 소화 또는 T4 DNA 리가제로의 결찰과 같은 방법에 의해 사용될 수 있다. 형질전환체는상기 언급된 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 단백질 또는 핵산과 같은 분자의 "단편"이라는 용어는 아미노산 또는 뉴클레오티드 유전자 서열의 임의의 부분을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 기능적 단백질-, 폴리펩티드-, 또는 펩티드-암호화 핵산 단위를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은, 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된 바와 같은 폴리펩티드 사이의 서열 관련성 정도를 지칭한다. "동일성" 및 "유사성"은 Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, NY, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., Ed., Academic Press, NY, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. & and Griffin, H.G., Eds., Humana Press, NJ, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. & Devereux, J., Eds., M Stockton Press, NY, 1991; 및 Carillo & Lipman (1988) SIAM J. Applied Math., 48: 1073에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.

동일성을 결정하는 바람직한 방법은 테스트된 서열 사이의 가장 큰 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 2 개 서열 사이의 퍼센트 동일성은 니들만 및 부니쉬((1970) J. Mol. Biol., 48: 443-453) 알고리즘(예를 들어, NBLAST 및 XBLAST)을 혼입하는 분석 소프트웨어(즉, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용함으로써 결정될 수 있다. 디폴트 파라미터는 본 개시내용의 폴리펩티드에 대한 동일성을 결정하는 데 사용된다.

예로서, 폴리펩티드 서열은 참조 서열과 동일할 수 있으며, 즉 100% 동일할 수 있거나, 또는 퍼센트 동일성이 100% 미만이 되도록 참조 서열과 비교하여 최대 특정 정수의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환(보존적 및 비-보존적 치환 포함), 또는 삽입으로부터 선택되고, 여기서 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 또는 참조 서열 내의 아미노산 중에서, 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에서 개별적으로 산재되어 있는 이러한 말단 위치 사이의 어디서든 발생할 수 있다. 주어진 퍼센트 동일성에 대한 아미노산 변경의 수는 참조 폴리펩티드 내의 아미노산의 총 수에 각각의 퍼센트 동일성의 수치 퍼센트(100으로 나눈 값)를 곱한 다음 참조 폴리펩티드 내 아미노산의 상기 총 수에서 해당 생성물을 차감하여 결정된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이의 유도체, 단편 및 상동체를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 유리하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. "뉴클레오시드"는 당에 연결된 염기를 지칭한다. 염기는 아데닌(A), 구아닌(G)(또는 이의 대체물, 이노신(I)), 시토신(C), 또는 티민(T)(또는 이의 대체물, 우라실(U))일 수 있다. 당은 리보스(RNA에서 천연 뉴클레오티드의 당) 또는 2-데옥시리보스(DNA에서 천연 뉴클레오티드의 당)일 수 있다. "뉴클레오티드"는 단일 포스페이트 기에 연결된 뉴클레오시드를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일련의 연결된 뉴클레오티드 잔기를 지칭하며, 올리고뉴클레오티드는 PCR 반응에 사용되기에 충분한 수의 뉴클레오티드 염기를 갖는다. 짧은 올리고뉴클레오티드 서열은 게놈 또는 cDNA 서열을 기반으로 하거나, 또는 이로부터 설계될 수 있고 특정 세포 또는 조직에서 동일하거나, 유사하거나 또는 상보적인 DNA 또는 RNA의 존재를 증폭하거나, 확인하거나, 또는 입증하는 데 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있고 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 프로브 및 프라이머를 포함하여 표적 핵산의 검출 또는 식별을 용이하게 하는 데 사용되는 3 개 초과의 염기 길이의 임의의 뉴클레오티드를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환체"는 발현 벡터가 도입된 수혜자 세포 또는 세포들을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이 기능적 용어는 게놈 서열, cDNA 서열, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편(및 이의 조합), 뿐만 아니라 사용자에 의해 설계되고/되거나 변경될 수 있었던 것들을 포함하는 유전자 산물을 포함한다. 정제된 유전자, 핵산, 단백질 등은 일반적으로 연관된 적어도 하나의 오염 핵산 또는 단백질로부터 식별되고 분리될 때 이러한 개체를 지칭하는 데 사용된다.

용어 "형질감염"은 제제가 세포에 도입되는 과정을 지칭한다. 형질감염될 수 있는 제제의 목록은 광범위하고 가이드 RNA, 센스 및/또는 안티센스 서열, 하나 이상의 유전자를 암호화하고 발현 플라스미드로 조직화된 DNA, 단백질, 단백질 단편 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전기천공법, 칼슘 포스페이트-기반 형질감염, DEAE-덱스트란-기반 형질감염, 지질-기반 형질감염, 분자 접합체-기반 형질감염(예를 들어, 폴리리신-DNA 접합체), 미세주입 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 제제를 세포에 형질감염시키는 다수의 방법이 있다.

논의

항종양 치료 항체의 개발은 표적 세포를 사멸시키기 위해 CDC를 촉발하는 능력을 포함하는 효과기 기능의 생체내 분석을 수반한다. 고전적인 접근법은 항체를 표적 세포 및 보체 공급원(즉 혈청)과 함께 배양하는 것이다. 그런 다음 세포 사멸은 여러 접근법으로 결정된다:

CDC 검정은 기관 또는 골수 이식에 적합한 공여자, 즉 조직접합성 시스템 HLA의 표현형이 일치하는 공여자를 찾는 데 사용된다. 환자 및 공여자의 HLA 표현형을 결정하기 위해 HLA 타이핑을 수행한 후, 환자가 이식편 거부반응을 유발할 수 있는 공여자-특이적 항-HLA 항체를 생성하는 것을 제외하기 위해 교차일치 테스트를 수행한다.

CDC HLA 타이핑(또는 혈청학적 타이핑)은 특성화된 동종이계 항혈청 또는 모노클로날 항체로부터의 항-HLA 항체 배치를 사용한다. 이러한 항체는 환자 또는 공여자의 림프구 및 보체 공급원과 하나씩 배양될 수 있다. 사멸 세포의 양(및 따라서 양성 결과)은 사멸 또는 생존 세포 염색에 의해 측정된다.

따라서, CDC 검정은 전형적으로 환자의 혈청과 공여자의 림프구의 배양 및 토끼 보체 첨가 후 두번째 배양을 수반한다. 사멸 세포의 존재(양성 테스트)는 공여자가 이러한 특정 환자에 적합하지 않다는 것을 의미한다. 최소 배양 시간 연장, 항-인간 글로불린(AHG) 첨가, 보체 첨가 전에 결합되지 않은 항체 제거, T 세포 및 B 세포 서브셋 분리를 포함하는 테스트 민감성을 증가시키기 위해 이용가능한 변형이 있다. CDC 교차일치 이외에도 보다 민감하고 심지어 보체 비-활성화 항체를 검출할 수 있는 유세포 분석 교차일치가 이용가능하다. 그러나, 후보 공여자 세포를 용해하여, 궁극적으로 조직 거부반응을 생성하는 능력을 갖는 매우 낮은 수준의 모 항체를 검출할 수 있어야 할 필요성이 여전히 있다.

본 개시내용은 잠재적인 이식 수혜자 환자가 수혜자에 의해 공여자 기관의 수용을 감소시키거나 또는 방지할 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 확립하는 보체-의존적 세포 세포독성 분석의 민감성을 증가시키는 방법을 포함한다. 따라서, CRISP Cas9-기반 절차를 사용하면 보체 억제제를 암호화하는 적어도 하나의 유전자로부터의 발현은 후보 이식 기관으로부터 유래된 세포에서 불활성화될 수 있다. 이러한 변형된 세포는 더이상 적어도 하나의 보체 억제제를 생성하지 않기 때문에, 잠재적인 이식 수혜자로부터의 혈청 샘플에 배치될 때, 혈청 보체의 효과적인 활성을 감소시키지 않는다. 결과적으로, 더 낮은 수준의 수혜자 환자 혈청 항체는 공여자 세포의 용해를 유도하는 데 효과적이게 된다. 본 개시내용의 방법은 잠재적인 공여자 기관으로부터 유래된 세포에 유용하게 적용될 수 있으며, 여기서 세포는 1차 세포, 배양된 세포, 또는 단리된 공여자 기관 세포로부터 생성되고 당업계에 알려진 기술에 의해 불멸화된 불멸화 세포주일 수 있지만, 상기 방법은 또한 공여자 림프구와 같은 세포에 적용될 때 유용하다.

따라서, 본 개시내용의 일 측면은 후보 공여자 기관이 잠재적인 수혜자 환자의 항체에 의한 거부반응의 대상이 될 수 있는지를 결정하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 후보 기관으로부터 제거되고, CRISPR Cas9 유전자 편집 시스템에 의해 보체 억제제를 암호화하는 유전자는 세포의 게놈으로부터 결실된다. 적합한 표적화된 보체 억제제는 CD46-유사, CD46, CD55, 및 CD59를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이 방법의 일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포를 생성하는 데 요구되는 필요 시간은 환자에게 유의하게 영향을 미치지 않을 것으로 고려된다.

또한 본 개시내용에 따른 유전적으로 변형된 세포는 다수의 환자로부터 다수의 혈청 샘플을 테스트하는 데 사용하기 위해 당업자에게 널리 알려진 방법에 의해 불멸화 및 배양되거나 또는 저장될 수 있으며, 따라서 각 테스트에 대한 공여자-유래 세포를 유전적으로 변형할 필요성을 피하는 것으로 의도된다. 이는 보다 비용 효과적이고 빠르게 수행되는 접근법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 이종이식물 공여자의 다수의 기관으로부터의 세포에 의해 보체 억제제의 발현을 불활성화시키는 데 사용하기에 적합한 가이드 RNA 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일 예에서, 제한하려는 것으로 의도되는 것은 아니지만, 보체 억제제 CD46을 발현하는 능력은 신장 내피 세포의 게놈으로부터 제거되었다.

게놈-편집 기술은 조작된 II형 CRISPR/Cas9 시스템의 사용을 통해 가장 효율적인 게놈 편집을 포함한다. 합성 가이드 RNA(gRNA)와 커플링된 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성에 의존하는 CRISPR 작제물은 합성이 간단하고 빠르며, 다중화될 수 있다. 그러나, 합성의 상대적 용이성에도 불구하고, CRISPR은 Cas9 자체의 특성 및 gRNA의 합성 둘 다의 기능이 있는, 표적가능한 게놈 공간에 대한 접근과 관련된 기술적 제한이 있다.

CRISPR 시스템에 의한 절단은 20-뉴클레오티드 DNA 서열 및 표적 부위의 3'에서 발견된 짧은 뉴클레오티드 모티프인 필수 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)에 대한 gRNA의 상보적 염기 쌍형성을 필요로 한다(Jinek et al., (2012) Science 337: 816-821). 이론적으로, CRISPR 기술을 사용하여 게놈에서 임의의 고유한 N₂₀-PAM 서열을 표적할 수 있다. 이용되는 특이적 Cas9의 기원 종에 따라 달라지는 PAM 서열의 DNA 결합 특이성은 한 가지 제약을 제공한다. 현재, 최소로 제한적이고 가장 통상적으로 사용되는 Cas9 단백질은 에스. 피오게네스로부터 유래되며, 이는 서열 NGG를 인식하고, 따라서 게놈에서 임의의 고유한 21-뉴클레오티드 서열 이어서 2 개의 구아노신 뉴클레오티드(N₂₀NGG)를 표적화할 수 있다. 단백질 구성성분에 의해 부과되는 이용가능한 표적화 공간의 확장은 변경된 PAM 요건이 있는 신규 Cas9 단백질의 발견 및 사용으로 제한되거나, 또는 돌연변이생성 또는 유도 진화를 통한 신규 Cas9 변이체의 생성을 보류한다.

CRISPR 시스템의 두번째 기술적 제한은 5' 구아노신 뉴클레오티드에서 개시하는 gRNA 발현으로부터 생겨난다. RNA 폴리머라제 III 프로모터의 III형 클래스의 사용은 gRNA 발현에 유용하였는데, 잘 정의된 단부를 갖는 이러한 짧은 비-코딩 전사체, 및 1+ 뉴클레오티드를 제외하고 전사에 필요한 모든 요소가 상류 프로모터 영역에 함유되어 있기 때문이다. 그러나, 통상적으로 사용되는 U6 프로모터는 전사를 개시하기 위해 구아노신 뉴클레오티드를 필요로 하므로, U6 프로모터의 사용은 GN₁₉NGG에 대한 게놈 표적화 부위를 추가로 제한한다.

CD46-유사, CD46, CD55, 및 CD59와 같으나 이에 제한되지 않는 보체 억제제 암호화 유전자를 표적화하는 gRNA의 구현예. 일부 구현예에서, 조성물은 (a) 다음을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비자연 발생 뉴클레아제 시스템(예를 들어, CRISPR)을 포함하며: i) 뉴클레아제 시스템 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터(예를 들어, 이방향 H1 프로모터), 여기서 gRNA는 대상체의 세포에서 DNA 분자의 보체 억제제-암호화 표적 서열과 혼성화하고, 여기서 DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 산물을 암호화함; 및 ii) 게놈-표적화 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 단백질)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소, 여기서 구성성분 (i) 및 (ii)는 시스템의 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 여기서 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화하고 뉴클레아제는 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 시스템은 단일 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자 또는 플라스미드에 패키징된다. 일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV)는 51 개의 인간 아데노바이러스 혈청형 중 임의의 것(예를 들어, 혈청형 2, 5, 또는 35)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 하나 이상의 유전자 산물을 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 시스템은 적어도 하나의 유전자 돌연변이를 절제한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 a) gRNA를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 한 방향으로 전사를 제공하는 제어 요소; 및 b) 게놈-표적화된 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 반대 방향으로 전사를 제공하는 제어 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현에 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 gRNA에 작동가능하게 연결된다.

일부 구현예에서, 현재 개시된 방법은 다음을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비자연 발생 CRISPR 시스템을 포함하는 조성물을 활용하며: a) CRISPR 시스템 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터, 여기서 gRNA는 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화하고, 여기서 DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 산물을 암호화함; 및 b) Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소, 여기서 구성성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 여기서 gRNA는 표적 서열을 표적화하고 이와 혼성화하고 Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 현재 개시된 방법은 다음을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비자연 발생 CRISPR 시스템을 포함하는 조성물을 활용할 수 있으며: a) CRISPR 시스템 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터, 여기서 gRNA는 진핵생물 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화하고, 여기서 DNA 분자는 진핵생물 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 산물을 암호화함; 및 b) II형 Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물 세포에서 작동가능한 조절 요소, 여기서 구성성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하여, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화하고 Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시킨다. 일 측면에서, 표적 서열은 임의의 뉴클레오티드, 예를 들어, N₂₀NGG로 시작하는 표적 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN₁₉NGG를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GN₁₉NGG를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 CN₁₉NGG를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 TN₁₉NGG를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN.₁₉NGG 또는 GN₁₉NGG를 포함한다. 또 다른 측면에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 또 다른 측면에서, Cas9 단백질은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 추가의 측면에서, 진핵생물 세포는 포유류 또는 인간 세포이다. 또한 또 다른 측면에서, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 감소된다.

따라서, 본 개시내용의 일 측면은 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법의 구현예를 포함하며, 상기 방법은 (a) 세포 집단을 유전적으로 변경시킴으로써 동물 또는 인간 기관으로부터 유래된 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계; (b) 유전적으로 변형된 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 유전적으로 변형된 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소되도록 유전적으로 변형되지 않는 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계를 포함한다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 방법은 (i) 기관으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 (ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 기관 유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제에 특이적인 것인, 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에서, 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 불활성화시키는 가이드 RNA는 서열번호: 1, 서열번호: 3; 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 9, 및 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2, 서열번호: 4; 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 및 서열번호: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티스 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법의 구현예를 포함하며, 상기 방법은 (a) 세포 집단을 유전적으로 변경시킴으로써 후보 동물 또는 인간 이식 공여자 신장으로부터 유래된 신장 내피 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계로, 여기서 유전적 변형은 다음 단계에 의해 이루어질 수 있는 것인, 단계: (i) 신장 또는 림프구로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 (ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 신장 내피 세포를 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 CD46 보체 억제제-암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 신장-유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제 CD46에 특이적이고 서열번호: 1 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 발현 벡터는 서열번호: 13 또는 16으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 것인, 단계; (b) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내는 것이고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소되도록 유전적으로 변형되지 않은 신장 내피 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계를 포함한다.

또한 본 개시내용의 또 다른 측면은 유전적으로 변형된 포유류 세포이며, 여기서 세포는 공여자 조직으로부터 유래되고, 여기서 세포는 보체 억제제의 발현을 감소시키거나 또는 발현하지 않도록 유전적으로 변형된다.

본 개시내용의 구현예는 실시예 및 상응하는 텍스트 및 도면과 함께 기재되지만, 이러한 설명의 구현예로 본 개시내용을 제한하려는 의도는 아니다. 반대로, 의도는 본 개시내용의 구현예의 취지 및 범위 내에 포함된 모든 대안, 변형, 및 등가물을 포괄하는 것이다.

실시예

실시예 1

모 세포주 배양: GGTA1/B4GalNT2/SLA1 KO를 함유하는 불멸화된 신장 내피 세포주를 37℃ 및 5% CO₂에서 부착 인자-코팅된 플레이트(Thermo Fisher, 매사추세츠주 월섬 소재) 상에서 10% Cosmic 송아지 혈청(HyClone, 유타주 로건 소재), 100ug/ml 내피 세포-특이적 성장 인자(Corning, 매사추세츠주 베드포드 소재) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(HyClone, 유타주 로건 소재)으로 보충된 Rosewell Park Memorial Institute(RPMI) 배지 1640(gibco,캘리포니아주 칼즈배드 소재)에서 배양하였다. 세포는 DyLight 649 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴 I, 이소렉틴 B4(Vector Labs, 캘리포니아주 벌링게임 소재)와의 배양에 의해 갈락토스-α1,3-갈락토스 음성이고, SLA 클래스 I(Invitrogen, 일리노이주 록퍼드 소재)과의 배양에 의해 SLA 클래스 I 음성인 것으로 확인되었고 알라바마 대학 버밍험 종합적 유세포 분석 코어에서 BD FACS Aria II를 사용하여 분석하였다.

실시예 2

gRNA 발현 벡터 생성: 플라스미드 pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Addgene 플라스미드 48138)를 사용하여 설계된 어닐링된 올리고(표 I)를 클로닝하여 CRISPR 연관된 Cas9 뉴클레아제 시스템을 사용하여 가이드 RNA를 생성하였다. 1 ug의 플라스미드 pX458을 BbsI(New England Biolabs, 매사추세츠주 입시치 소재)로 37℃에서 30 분 동안 소화시켰다. 각 쌍의 포스포릴화된 올리고를 37℃에서 30 분 동안 시작하여 Bio-RAD 열 순환기(Applied Biosystems, Foster city, California)를 사용하여 어닐링한 후, 95℃에서 5 분 동안 단계를 수행한 다음 5℃/분으로 25℃로 낮추었다. 소화된 pX458을 실온에서 10 분 동안 올리고의 어닐링된 par에 결찰시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라, 결찰 반응을 사용하여 TOP10 적격 세포(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 형질전환하였다. QIAprep 키트(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 처리 당 8 개의 콜로니로부터 플라스미드를 단리하였다. DNA 클론을 서열분석하였다(Heflin center Genomics Core-DNA, UAB).

실시예 3

표적 세포의 형질감염 및 식별: 돼지 REC를 제조업체의 지침에 따라 Neon 형질감염 시스템(Life Technologies, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)을 사용하여 전기천공법에 의해 형질감염시켰다. Cas9-발현 플라스미드 및 세포 수의 농도를 형질감염 당 2 μg/ 1 x 10⁶ 개의 세포로 일정하게 유지하였다. Cas9 발현 벡터는 녹색 형광 단백질(GFP)의 존재 또는 부재에 의해서만 상이하였다. 세포를 항생제 무함유 배양 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후, GFP-발현 벡터로 형질감염된 세포를 BD FACS Aria II에서 분류하였다. 게이트를 설정하여 가장 밝은 세포를 유지하였으며; 이는 총 집단의 5% 미만으로 제한되었다. 높은 수준의 GFP 발현을 갖는 세포를 FACS Aria 유세포 분석기에 의해 96-웰 플레이트 내로 웰당 하나의 세포를 분류하였다. 분류 후 합류될 때까지 14 일 동안 세포를 배양물에서 유지하였다.

실시예 4

유전자형 분석: 게놈 DNA를 QIAmp.RTM DNA 미니 키트(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 돼지 세포로부터 단리하였다. RNA 샘플을 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 단리하였다. RNA 품질 및 양을 NanoDrop 분광 광도계(ND-1000, 델라웨어주 윌밍턴 소재)에 의해 확인하였다. RNA 샘플을 OneStep RT-PCR Kit(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 역 전사하였다. PCR 생성물을 정제하고 pCR4-TOPO TA(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 내로 결찰시켰다. 형질전환된 박테리아를 클론 선택을 위해 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 Luria-Bertani 한천 위에 플레이팅하였다. 플라스미드를 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 단리하였다. 뉴클레오티드 서열을 Sanger 방법에 의해 수행하였다.

실시예 5

표현형 분석: 돼지 CD46의 발현을 측정하여 표현형-특이적 돌연변이 효율을 분석하였다. 세포를 항-CD46 항체(클론 6D8/8, FITC)(Lifespan Biosciences, 워싱턴주 시애틀 소재)로 염색하여 유전자 발현 기능을 설명하였다. 표지되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 유세포 분석 데이터를 BD FACS Aria II에서 수집하고, FlowJo 버전 10(Treestar Inc, 오리건주 애슐랜드 소재)으로 분석을 수행하였다.

실시예 6

서열 분석: 뉴클레오티드 서열을 Geneious 11.0.4를 사용하여 분석하였다. 중첩 정방향 및 역방향 서열 단편은 각 대립유전자의 완전한 코딩 서열을 어셈블리하였다. 각 유전자좌에 대해 다중 서열 정렬을 생성하였다. NCBI 참조 서열: NM_213888.1을 사용하여 서열을 확인하였다.

실시예 7

보체-매개 세포독성: 96-웰 V-바닥 검정 플레이트에서, 13 명의 신장 이식 대기 목록 환자로부터의 연속으로 희석된 열 불활성화 인간 혈청 100 μl를 모 돼지 CD46KO로부터 REC의 100 μl 분취량과 혼합하였다. 인간 혈청을 IgM 분열 제제 디티오트레이톨(DTT)(최종 2.5mM)이 있거나 또는 없이 37℃에서 30 분 동안 처리하였다. 각 웰에서 REC의 최종 농도는 1 x 10⁶/ml였고 혈청 농도는 희석에 의해 달라졌다(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 %). 검정을 4℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 6 분 동안 원심분리하고(400 g), 옮겨 붓고 HBSS로 세척하였으며; 이 단계를 2 회 반복하였다. 인간 혈청의 열 불활성화는 저장된 혈청 내에서 보체의 다양한 존재가 결과에 영향을 미치는 것을 방지한다. 낮은-TOX-H 토끼 보체(Cedarlane, 미국 노스캐롤라이나주 버링턴 소재)를 HBSS에서 1:15로 희석하고 140μl를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 6 분 동안 원심분리하고(400 g), 옮겨 붓고 HBSS로 세척하였으며; REC를 프로피듐 요오다이드(PI)(2.5mg/ml, Sigma-Aldrich)로 실온에서 15 분 동안 표지하였다. 데이터를 BD Accuri C6 유세포 분석기 및 소프트웨어(BD Biosciences, 미시간주 앤아버 소재)를 사용하여 수집하였다.

실시예 8

항체 결합: 각 그룹의 2 x 10⁵ 개의 REC를 13 명의 신장 이식 대기 목록 환자로부터의 25% 열 불활성화된 인간 혈청과 함께 4℃에서 30 분 동안 배양하였다. 이어서 샘플을 행크의 완충 염 용액(HBSS)으로 3 회 세척하였다. 인간 IgG 및 IgM을 Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)에 접합된 항인간 2차 항체로 4℃에서 30 분 동안 개별적으로 검출하였다. PBMC를 HBSS에서 3 회 세척하였다. 형광 검출은 Accuri C6 유세포 분석기(Accuri, 미국 미시간주 앤아버 소재)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은 FlowJo 버전 10(Treestar Inc., 미국 오리건주 애슐랜드 소재)으로 수행하였다.

실시예 9

도 7에는 수탁 번호 XM_003482667.3을 갖고 돼지 CD46-유사 보체 억제제를 암호화하는 mRNA 뉴클레오티드 서열인 뉴클레오티드 서열(서열번호: 19)이 제시된다. 서열번호: 19의 서열에 혼성화하는 유리한 gRNA 서열은 서열번호: 20으로 제공된다(도 7)

실시예 10

도 8에는 인간 CD46(서열번호: 21); 돼지 CD46(서열번호: 22), 및 돼지 CD46-유사(서열번호: 23) 보체 억제제의 아미노산 서열 사이의 유사성을 나타내는 아미노산 서열 정렬이 제시된다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Alabama Research Foundation <120> METHOD FOR INCREASING CELL SUSCEPTIBILITY TO COMPLEMENT-MEDIATED LYSIS <130> 222104-2940 <150> 62/821,641 <151> 2019-03-21 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD46 gRNA-1 primer <400> 1 caccgctcat ggacccctat tgacg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD46 gRNA-2 primer <400> 2 aaaccgtcaa taggggtcca tgagc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD55 gRNA-1 primer <400> 3 caccggcgcc atgagtcccc tgccg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD55 gRNA-2 primer <400> 4 aaaccggcag gggactcatg gcgcc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD59 gRNA-1 primer <400> 5 caccgaatcc atagacggtc acgat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pig CD59 gRNA-2 primer <400> 6 aaacatcgtg accgtctatg gattc 25 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540 cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600 ttt 603 <210> 17 <211> 616 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human CD55 in PX330 <400> 17 acgtatcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaggac gaaacaccgg gcgcgccatg 60 accgtcgcgg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 120 tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa 180 taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggct ctagaggtac 240 ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 300 tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 360 ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 420 acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca gtacatgacc ttatgggact 480 ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc 540 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 600 ttatttttta attatt 616 <210> 18 <211> 619 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human CD59 in PX330 <400> 18 tcggttgcga tttcttggct ttatatatct tgtggaagga cgaaacaccg atcacaatgg 60 gaatccaagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120 ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 180 ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagaggta 240 cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300 ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360 cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc agtacatgac cttatgggac 480 tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 540 cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600 tttatttttt aattatttt 619 <210> 19 <211> 2675 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 19 ttgttgcgtc tggtaagcct accctaaaag ctgtctcatg ggttggcctc agatttcccg 60 ctgatttccc caaacatgac ggtggcttgc gcaccgcgca aggcacctcc cgagcgccca 120 gagaggcctc ctttttcctg gtgctgcgtg gggattcttt tgctggcttt agtgttcccg 180 ctacccttat 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<220> <223> Pig CD46 crispr target <400> 20 gcatgggaag caggaacact a 21 <210> 21 <211> 392 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Glu Pro Pro Gly Arg Arg Glu Cys Pro Phe Pro Ser Trp Arg Phe 1 5 10 15 Pro Gly Leu Leu Leu Ala Ala Met Val Leu Leu Leu Tyr Ser Phe Ser 20 25 30 Asp Ala Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly 35 40 45 Lys Pro Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys 50 55 60 Lys Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys 65 70 75 80 Asp Arg Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg 85 90 95 Glu Thr Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro 100 105 110 Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn 115 120 125 Glu Gly Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys 130 135 140 Gly Ser Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val 145 150 155 160 Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser 165 170 175 Glu Val Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val 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<211> 378 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 22 Met Met Ala Phe Cys Ala Leu Arg Lys Ala Leu Pro Cys Arg Pro Glu 1 5 10 15 Asn Pro Phe Ser Ser Arg Cys Phe Val Glu Ile Leu Trp Val Ser Leu 20 25 30 Ala Leu Val Phe Leu Leu Pro Met Pro Ser Asp Ala Cys Asp Glu Pro 35 40 45 Pro Lys Phe Glu Ser Met Arg Pro Gln Val Leu Asn Thr Thr Tyr Arg 50 55 60 Pro Gly Asp Arg Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Phe Gln Pro Met 65 70 75 80 Val Pro Ala Leu Pro Thr Ser Ser Val Cys Gln Asp Asp Asn Thr Trp 85 90 95 Ser Pro Leu Gln Glu Ala Cys Arg Arg Lys Ala Cys Ser Asn Leu Pro 100 105 110 Asp Pro Leu Asn Gly Gln Val Ser Tyr Pro Asn Gly Asp Thr Leu Phe 115 120 125 Gly Ser Lys Ala Gln Phe Thr Cys Asn Thr Gly Phe Tyr Ile Ile Gly 130 135 140 Ala Glu Thr Val Tyr Cys Gln Val Ser Gly Asn Val Met Ala Trp Ser 145 150 155 160 Glu Pro Ser Pro Leu Cys Glu Lys Ile Leu Cys Lys Pro Pro Gly Glu 165 170 175 Ile Pro Asn Gly Lys Tyr Thr Asn Ser His Lys Asp Val Phe Glu Tyr 180 185 190 Asn Glu Val Val Thr Tyr Ser Cys Leu Ser Ser Thr Gly Pro Asp Glu 195 200 205 Phe Ser Leu Val Gly Glu Ser Ser Leu Phe Cys Ile Gly Lys Asp Glu 210 215 220 Trp Ser Ser Asp Pro Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Pro Tyr Pro 225 230 235 240 Val Val Pro Asn Gly Glu Ile Val Ser Gly Phe Gly Ser Lys Phe Tyr 245 250 255 Tyr Lys Ala Glu Val Val Phe Lys Cys Asn Ala Gly Phe Thr Leu His 260 265 270 Gly Arg Asp Thr Ile Val Cys Gly Ala Asn Ser Thr Trp Glu Pro Glu 275 280 285 Met Pro Gln Cys Ile Lys Glu Ser Thr Pro Pro Asn Thr Gln Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Ser Val Ser Asp Ser Lys Pro Thr Asp Pro Pro Ala Thr Pro 305 310 315 320 Gly Pro Ser His Pro Gly Pro Pro Ser Pro Ser Asp Ala Ser Pro Pro 325 330 335 Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asp Gly Gly Ile Ile Ala Ala Ile Val Val 340 345 350 Gly Val Leu Ala Ala Ile Ala Val Ile Ala Gly Gly Val Tyr Phe Phe 355 360 365 His His Lys Tyr Asn Lys Lys Arg Ser Lys 370 375 <210> 23 <211> 427 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 23 Met Thr Val Ala Cys Ala Pro Arg Lys Ala Pro Pro Glu Arg Pro Glu 1 5 10 15 Arg Pro Pro Phe Ser Trp Cys Cys Val Gly Ile Leu Leu Leu Ala Leu 20 25 30 Val Phe Pro Leu Pro Leu Phe Ala Phe Val Val Cys Pro Asp Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Lys Ser Ala Val Leu Thr Ser Val Leu Gln Gln Arg Tyr Tyr 50 55 60 Pro Gly Asp Lys Ile Glu Tyr Arg Cys Arg Pro Gly Tyr Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Phe Glu Thr Arg Lys Ser Ser Cys Glu Ala Asn Gly Ser Trp Thr 85 90 95 Pro Ile Asp Glu Ala Cys Phe Arg Lys Ser Cys Pro Lys Pro Thr Ile 100 105 110 Glu His Gly Ile Tyr Ala Pro Gln Arg Asn Phe Glu Phe Glu Ser Glu 115 120 125 Val His Ile Ser Cys Ile Glu Gly Tyr His Leu Lys Gly Lys Gly Ile 130 135 140 Leu Thr Cys Gln Leu Ile Gly Gln Asp Val Phe Trp Ser Asp Arg Met 145 150 155 160 Pro Gln Cys Glu Arg Val Tyr Cys Gly Arg Pro Pro Gln Ile Lys Asn 165 170 175 Gly Lys His Thr Asn Ser Tyr Arg Asn Ile Phe Glu Tyr Asn Glu Leu 180 185 190 Val Thr Tyr Thr Cys Asn Pro Ser Asn Gly Pro Asp Glu Tyr Ser Leu 195 200 205 Val Gly Glu Ser Lys Leu Phe Cys Ser Ala Pro Gly Lys Trp Ser Ser 210 215 220 Ala Pro Pro Gln Cys Lys Val Val Lys Cys Glu Arg Pro Glu Leu Lys 225 230 235 240 His Gly Val Ile Val Ser Gly Ser Arg Glu Lys Phe Ser Tyr Gln Ala 245 250 255 Val Val Ile Phe Gly Cys Leu Gln Gly Phe Tyr Leu Asn Gly Ser Asn 260 265 270 Val Val Phe Cys Ser Gly Asn Asn Thr Trp Glu Pro Glu Ile Pro Lys 275 280 285 Cys Ile Lys Gly Tyr Arg Pro Thr Tyr Pro Thr Lys Asn Pro Val Asp 290 295 300 Lys Tyr Pro Gly Tyr Pro Asn Pro Asp Phe Glu Ile Pro Ser Leu Asp 305 310 315 320 Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ala Gly Ile Ile Ala Leu Met Ala Leu Thr 325 330 335 Ala Ile Val Ala Val Ala Val Val Phe Thr Cys Leu Tyr Arg Cys Leu 340 345 350 Arg Ser Glu Lys Glu Val Val Lys Asp Lys Lys Gly Glu Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gln Lys Glu Glu Lys Lys Glu Lys Glu Glu Glu Thr Glu Lys Lys 370 375 380 Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Lys Glu Lys 385 390 395 400 Lys Lys Lys Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ala Val Ser Ala Thr Gln Met 405 410 415 Glu Lys Pro Thr Ser Pro Ser Val Gln Lys His 420 425

Claims

하기 단계를 포함하는, 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법:
(a) 세포 집단을 유전적으로 변형시킴으로써 동물 또는 인간 기관으로부터 유래된 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계;
(b) 유전적으로 변형된 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(c) 유전적으로 변형된 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내는 것이고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소되도록 유전적으로 변형되지 않은 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계.
제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 후보 이식 기관으로부터 유래되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 공여자 림프구인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 신장으로부터 유래되는 것인, 방법.
제4항에 있어서, 상기 세포 집단이 신장 내피 세포인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)가 하기 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법:
(i) 기관으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및
(ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 세포를 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 기관 유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제에 특이적인 것인, 단계.
제6항에 있어서, 상기 불활성 보체 억제제 암호화 유전자가 CD46-유사, CD46, CD55, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 서열번호: 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90% 유사한 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불활성 보체 억제제 암호화 유전자를 불활성화시키는 가이드 RNA가 서열번호: 1, 서열번호: 3; 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 9, 및 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2, 서열번호: 4; 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 및 서열번호: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 생리학적 조건 하에 서열번호: 19의 서열, 또는 이의 보체와 혼성화하는 CRISPR Cas9-기반 불활성화를 위한 가이드 RNA가 서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 발현 벡터가 플라스미드 PX330 또는 PX458이고 플라스미드가 포유류 세포에 형질감염될 때 발현 플라스미드가 Cas9를 발현하는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열번호: 13-18로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
하기 단계를 포함하는, 환자에서 이식 공여자 기관-반응성 항체를 검출하는 방법:
(a) 세포 집단을 유전적으로 변형시킴으로써 후보 동물 또는 인간 이식 공여자 신장으로부터 유래된 신장 내피 세포 집단에 의해 적어도 하나의 보체 억제제의 발현을 감소시키는 단계로, 여기서 유전적 변형은 다음 단계에 의해 이루어지는 것인, 단계:
(i) 신장으로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 및
(ii) 가이드 RNA 및 CRISPR Cas9를 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터로 신장 내피 세포를 형질감염시킴으로써 생성된 불활성 CD46 보체 억제제-암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 신장-유래 세포 집단을 생성하는 단계로, 여기서 가이드 RNA는 보체 억제제 CD46에 특이적이고 서열번호: 1 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호: 2 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 발현 벡터는 서열번호: 13 또는 16으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 단계;
(b) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단을 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자로부터 단리된 혈청 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(c) 유전적으로 변형된 신장 내피 세포 집단의 용해를 검출하는 단계로, 여기서 용해는 이식 공여자 기관을 받기를 원하는 환자가 공여자 기관-반응성 항체를 발현하는지를 나타내는 것이고, 여기서 용해는 기관으로부터 유래되고 적어도 하나의 발현된 보체 억제제에서 감소되도록 유전적으로 변형되지 않은 신장 내피 세포 집단과 비교할 때 검출가능하거나 또는 증가되는 것인, 단계.
공여자 조직으로부터 유래되고, 보체 억제제의 발현을 감소시키거나 또는 발현하지 않도록 유전적으로 변형된, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사, CD46, CD55, 또는 CD59인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90% 유사한 아미노산 서열을 갖는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 서열번호: 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 보체 억제제가 CD46-유사이고 서열번호: 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 세포가 보체 억제제를 암호화하는 세포의 게놈 전부 또는 단편의 CRISPR Cas9에 의한 결실에 의해 유전적으로 변형되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 세포가 배양된 세포 집단인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 공여자 조직이 신장, 폐, 심장, 근육, 및 피부 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 기관으로부터 수득되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 세포가 후보 공여자 기관으로부터 수득되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 후보 기관이 신장, 폐, 심장, 근육, 피부 조직, 또는 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 후보 기관이 신장인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.
제15항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 포유류 세포가 신장 내피 세포 또는 림프구인, 유전적으로 변형된 포유류 세포.