KR20210141447A - 항-ctla4 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20210141447A
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마가렛 카로우
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실리오 디벨럽먼트, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항체, 이중특이적 항체, 및 키메라 수용체) 및 암을 치료하고 예방하는 데 있어서 이들의 용도뿐만 아니라, 항-CTLA4 결합 단백질을 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다.

Description

항-CTLA4 항체 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 26일자로 출원한 미국 특허 가출원 제62/785,111호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
ASCII 텍스트 파일을 이용한 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일을 이용한 다음 제출물의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 컴퓨터 판독 가능 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 737762002540.txt, 기록일: 2019년 12월 23일, 크기: 39.5 KB).
기술분야
본 발명은 항-세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA4) 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체) 및 이의 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.
암은 미국에서 두 번째 주요 사망 원인이며, 사망자가 차지하는 비중은 그 다음 5가지 주요 사망 원인(만성 호흡기 질환, 뇌졸중, 사고, 알츠하이머병, 및 당뇨병)에 의한 사망자 비중보다 더 많다. 특히 표적 요법을 통해 큰 진전이 이루어졌지만, 이 분야에서 해야 할 많은 일이 남아 있다. 면역요법과 이 분야의 한 가지인 면역 종양학은 악성 종양을 치료하기 위한 실행 가능하고 흥미로운 치료 방법을 생성하고 있다. 구체적으로는, 암의 한 가지 특징이 면역 회피라는 것이 이제 인식되고 있고, 암을 인식하고 치료하기 위해, 많은 노력을 들여 면역 체계를 재활성화하기 위해 표적을 확인하고 이들 표적에 대한 치료법을 개발해 왔다. 실제로, 항-세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA4) 항체인 이필리무맙은 III/IV기 악성 흑색종을 앓고 있는 환자의 장기 생존을 유도하였다. 이필리무맙은 CTLA4를 차단함으로써 T 세포의 억제를 방해하는 면역 관문 길항제이며, T 조절 세포(Treg)의 고갈을 초래할 수 있다(Korman, A. 등의 문헌[2005. Tumor immunotherapy: preclinical and clinical activity of anti-CTLA4 antibodies. Current Opinion in Investigational Drugs 6:582-591]; Quezada 등의 문헌[J. Exp. Med., 206(8):1717-1725, 2009]; Selby 등의 문헌[Cancer Immunol Res., 1(1);32-42, 2013] 참조). 안타깝게도, 이필리무맙은 T 세포 의존성 면역 반응의 전신 활성화(종양 비특이적 활성화)를 유발하고, 이는 면역 관련 부작용으로 이어지는데, 면역 관련 부작용은 흔히 투여량 제한 및 치료 제한이며 생명을 위협할 수 있다(Weber, J.S. 등의 문헌[2008. Phase I/II study of ipilimumab for patients with metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology 26:5950-5956] 참조). 면역 관련 부작용에는 소장대장염, 피부염, 뇌하수체염, 포도막염, 간염, 신염, 및 사망이 포함된다. 소장대장염은 가장 흔한 주요 독성이다(환자의 약 20%에 영향을 미침). 면역 매개 이상 반응과 관련된 심각한 안전성 위험으로 인해 FDA는 위해성 평가 및 완화 전략(Risk Evaluation and Mitigation Strategy, REMS)과 더불어 이필리무맙을 승인하였다. 최근에, PD1을 표적으로 하는 제2 면역 관문 조절제(예: 니볼루맙)과 이필리무맙의 공동 투여는 이필리무맙 단독 투여와 비교했을 때 흑색종에 대한 면역요법의 효능을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 증가는 3/4등급 이상 반응의 빈도 증가와 또 다시 연관이 되었는데, 병용 치료를 받는 환자의 50% 이상에게 영향을 미쳤다(Wolchok, J.D. 등의 문헌[2013. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med] 참조).
이러한 결과는, 이필리무맙과 같은 항-CTLA4 항체와 연관된 부작용 없이 종양을 효과적으로 표적화하는 항-CTLA4 단백질 치료제를 개발해야 한다는 것을 의미한다. 이러한 요구를 해결하기 위한 항-CTLA 결합 단백질, 이의 조성물, 및 이의 사용 방법이 본원에 제공된다.
특허 출원, 특허 공개, 및 과학 문헌을 포함하여, 본원에 인용된 모든 참조 문헌은, 각각의 개별 참조 문헌이 참조로서 통합되도록 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것처럼, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
항-세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA4) 결합 단백질, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
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제공된 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
제공된 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
제공된 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함한다. 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E, 또는 둘 다를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 38의 CH 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 CL 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나; 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스 결핍이다.
임의의 구현예 중 일부에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 튜불린 중합의 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd이다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하며, VL 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 항원에 특이적 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하고; VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E, 또는 둘 다를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 38의 CH 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 CL 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나; 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄 및 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며; 여기서 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄 및 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며; 여기서 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스 결핍이다.
이러한 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 튜불린 중합의 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd이다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 암호화하는 핵산이 또한 본원에 제공된다.
본원에 제공된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본원에 제공된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 제공된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 숙주 세포는 비푸코실화되거나 푸코오스 결핍인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산할 수 있다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 숙주 세포는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라아제(Fut8) 넉아웃을 갖는다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 숙주 세포는 β1,4-N-아세틸글리코스민일트랜스퍼라아제 III(GnT-III)을 과발현한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 숙주 세포는 골지 μ-만노시다아제 I(ManII)을 과발현한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 제공된 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함한다.
비푸코실화되었거나 푸코오스 결핍 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 제공된 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함한다.
이러한 구현예들 중 일부에서, 상기 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 또한 포함한다.
본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 제공된다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물이 또한 제공된다.
대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서, 제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 용도가 또한 제공된다.
제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 또는 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 제공된 조성물 중 어느 하나의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 양태는 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구현예는 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 기술된다.
도 1a 및 도 1b는 일정 범위의 항체 농도에 걸쳐 인간 CTLA4-Fc에 대한 항-CTLA4 항체의 결합을 보여주는 그래프이다. 도 1a는 일정 범위의 항체 농도에 걸쳐 인간 CTLA4-Fc에 대한 항체 1 형태(항체 1-1 및 항체 1-2)의 결합을 보여주며, 이는 도시된 항체 간에 결합이 유사함을 입증하였다. 도 1b는 일정 범위의 항체 농도에 걸쳐 인간 CTLA4-Fc에 대한 항체 2 형태(항체 2-1, 항체 2-2, 항체 2-3, 항체 2-4, 및 항체 2-5)의 결합을 보여주며, 이는 도시된 항체 간에 결합이 유사함을 입증한 것이다. 도 1c 내지 도 1e는 ELISA에 의해 평가했을 때, 인간 CTLA-Fc 및 인간화 항-CTLA4 항체와 변이체(예를 들어, Fc 영역에 돌연변이를 갖거나 비푸코실화 버전), 즉 항체 1(도 1c), 항체 2(도 1d), 또는 이필리무맙(도 1e)의 결합 결과를 보여준다. 도시된 바와 같이, 형태 각각의 모든 변이체는 유사하게 인간 CTLA4-Fc에 결합하였다.
도 2a는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 항체 2-6(Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전) 또는 이필리무맙과 인간 CTLA4(huCTLA4) 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2b는 도 2a에 도시된 결과에 대한 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 평형 해리 상수(KD), 및 항체 2-6과 이필리무맙 간의 배수 차이를 제공한다. 도 2c는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 이필리무맙의 Fab(이필리무맙-Fab) 또는 항체 2의 Fab(항체 2-Fab)와 rhCTLA4-Fc 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2d는 도 2c에 도시된 결과에 대한 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 평형 해리 상수(KD), 및 카이2 값을 제공한다. 도 2e는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 이필리무맙의 Fab(이필리무맙-Fab) 또는 항체 2의 Fab(항체 2-Fab)와 cynoCTLA4-Fc 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2f는 도 2e에 도시된 결과에 대한 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 평형 해리 상수(KD), 및 카이2 값을 제공한다.
도 3은 다양한 농도에서 항체 2-1(야생형 Fc 영역을 갖는 항체 2의 버전), 항체 2-6(Fc 영역에서 S239D 돌연변이, I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전), 또는 이필리무맙과 인간 FcγRIIIa(CD16a) 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는 포도구균 장독소 B(SEB) 검정을 사용해 결정했을 때, 항체 1 및 항체 2에 대한 IL-2 수준(pg/mL)(도 4a 및 도 4c) 또는 IL-2 수준의 배수 변화(도 4b 및 도 4d)를 나타내는 그래프이다. 항체 1(항체 1-1 및 1-2)(도 4a 및 도 4b) 및 항체 2(항체 2-1, 항체 2-2, 항체 2-3, 항체 2-4, 및 항체 2-5)(도 4c 및 도 4d)를 말초 단핵구로부터 IL-2 생성을 촉진하는 이들의 능력에 대해 SEB 검정을 사용하여 시험하였다. 시험된 모든 형태의 항체 1 및 항체 2는 항체가 없는 대조군과 비교했을 때 IL-2 수준을 증가시키는 능력을 입증하였다(도 4a 및 도 4c). 도 4e는 다양한 버전의 항-CTLA4 항체 1[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 1-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 1-2), 및 항체 1의 비푸코실화 버전(항체 1-aFuc)], 항체 2[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 2-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 2-6), 및 항체 2의 비푸코실화 버전(항체 2-aFuc)], 또는 이필리무맙[야생형 Fc를 갖는 버전(이필리무맙), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(이필리무맙-m), 및 이필리무맙의 비푸코실화 버전(이필리무맙-aFuc)]을 이용해 SEB 검정의 결과를 보여준다.
도 5a 내지 도 5d는 항체 1 변이체(도 5a), 항체 2 변이체(도 5b), 이필리무맙 변이체(도 5c), 및 모든 3개의 항체의 비푸코실화 버전(도 5d)에 대한 ADCC, FcγRIIIa 리포터 생물검정으로부터의 리포터 활성화 곡선 및 EC50 값을 보여준다.
도 6a 내지 도 6d는 다음을 포함하는 마커를 발현하는 CD45+ 세포의 비율을 평가한 면역 표현형 분석 연구의 결과를 도시한다: CD3+/ICOS+, CD3+ T 세포, CD4+/Ki67+, CD3+/Ki67+, CD4+/ICOS+, CD4+ T 세포, CD8+/ICOS+, CD8+ T 세포, Tregs+/ICOS+, CD8+/Ki67+, Tregs, Tregs+/Ki67+. 시험된 항체는 다음과 같다: 1군: IgG, 2군: 항체 2-1; 4군: 이필리무맙; 5군: 이필리무맙-aFuc
도 7a 내지 도 7d는 다음과 같이 20 μg, 7 μg, 또는 2 μg의 시험 항체를 1회 주사로 투여한 후 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 그래프를 도시한다: 도 7a(군 평균) 및 도 7b(개별 마우스)는 항체 2-6, 이필리무맙, 또는 이필리무맙의 비푸코실화 형태(이필리무맙-aFuc)를 주입한 마우스를 대상으로 시간 경과에 따른 종양 부피(mm3)를 나타내고; 도 7c(20 μg), 도 7d(7 μg) 및 도 7e(2 μg)는 각각의 투여량으로 상이한 항체를 투여한 후 시간 경과에 따른 종양 부피(mm3)를 비교하여 보여준다.
도 8a는 투여 후 5일차에 말초 혈액에서 CD4+Ki67+ 세포(좌측) 및 CD4+ICOS+ 세포(우측)의 백분율을 이용한 효능 연구의 결과를 그래포로 도시하며, 이는 T 세포 활성화의 수준을 나타낸다. 도 8b는 10 mg/kg(RSV-m 대조군) 또는 3 mg/kg(이필리무맙 또는 항체 2-6)으로 치료한 마우스를 대상으로 7일차에 평가했을 때의 종양 중량(좌측) 및 CD8/Treg 비율(우측)을 보여주는 그래프를 도시한다. 도 8c는 RSV-m 대조군, 이필리무맙, 또는 항체 2-6을 마우스에게 투여한 후 종양 미세환경에서의 조절 T 세포(좌측) 및 종양 미세환경에서의 CD8+ T 세포(우측)를 보여주는 그래프를 도시한다. 도 8d는 RSV-m 대조군, 이필리무맙, 또는 항체 2-6을 포함하는 항체를 0.3 mg/kg씩 투여한 후 마우스에서 시간 경과에 따른 종양 부피(mm3)를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 9는 항체 2-6, 이필리무맙, 또는 이소형 대조군의 투여 후 총 CD4+ 세포 중 Ki67+ 세포의 백분율을 평가함으로써 시노몰구스 원숭이에서 약력학 효과를 평가한 2세트의 실험(실험 1 및 실험 2) 결과를 보여주는 그래프를 도시한다.
관문 억제제와 같은 치료제는 암에서 전례 없는 반응을 나타내지만, 이들의 사용은 면역 관련 이상 반응(irAE) 및 기타 독성(예: 뇌하수체염)에 의해 제한된다. 증가된 지속적인 반응 속도 및 개선된 안전성 프로파일을 달성하기 위해, 예를 들어 종양 미세환경에서 CTLA4에 특이적으로 결합하는 단백질 치료제가 본원에 제공된다. 개선된 결합 친화도, ADCC와 같은 증가된 기능적 활성, 및 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 제공된 CTLA4 결합 단백질의 본원에 기술된 바와 같은 다른 장점은 요법에 대한 반응의 개선 및 안정성 프로파일의 개선(예를 들어, 특정 면역요법과 연관될 수 있는 이상 반응을 감소시키거나 최소화하는 것)을 유도할 수 있다.
I. 정의.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 당연히 다양할 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 단지 기술하기 위한 것이고, 한정하도록 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 내용에 의해 명백히 달리 표시되지 않는 한, 단수형("a", "an", 및 "the")은 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체(an antibody)"를 지칭하는 것은 임의로 둘 이상의 이러한 항체 등의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)"은 이러한 기술 분야에서 당업자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약(about)"의 값 또는 파라미터에 대한 참조는 해당 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함하고 이를 기술한다.
본원에 기술된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는 것", "이로 이루어지는 것", 및 "본질적으로 이로 이루어지는 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "항체"는 다클론 항체, 단클론 항체(면역 글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체, 디아바디, 및 단쇄 분자뿐만 아니라 항체 단편(예: Fab, F(ab')2, 및 Fv)를 포함한다. 용어 "면역글로불린(Ig)"은 본원에서 "항체"와 상호 교환적으로 사용된다.
염기성 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 염기성 이종사량체 단위로 구성되고, 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, IgA 항체는 2~5개의 염기성 4-쇄 단위를 포함하는데, 이는 중합화되어 J 사슬과 함께 다가 집합체를 형성할 수 있다. IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬 내 이황화 브릿지를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에서 α 및 γ 사슬 각각에 대한 가변 도메인(VH)과 이어지는 3개의 불변 도메인(CH), 및 μ 및 ε 이소형에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서, 가변 도메인(VL)과 이의 다른 단부에 있는 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에서 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL을 함께 페어링하면 단일 항원 결합 부위가 형성된다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어,Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71쪽 및 6장을 참조한다.
임의의 척추동물 종 유래의 L 사슬은 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 항체의 중쇄(CH) 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소형에 할당될 수 있다. 5가지 부류의 면역글루불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들은 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지정된 중쇄를 각각 갖는다. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능에 있어서의 비교적 미미한 차이를 기준으로 하위 부류로 더 나누어진다. 예를 들어, 인간은 다음의 하위 부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. IgG1 항체는 알로타입으로 명명된 다수의 다형성 변이체로 존재할 수 있으며(Jefferis 및 Lefranc의 문헌[2009 mAbs Vol 1 Issue 4 1 7]에서 검토됨), 이들 중 어느 것도 본 발명에 사용하기에 적합하다. 인간 모집단에서 흔한 알로타입 변이체는 글자 a, f, n, z에 의해 지정된 것들이다.
"단리된" 항체는 (예를 들어, 자연적으로 또는 재조합적으로) 그의 생산 환경의 성분으로부터 식별, 분리 및/또는 회수된 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 그의 생산 환경으로부터의 모든 다른 성분과의 연관성을 갖지 않는다. 생산 환경의 오염 성분, 예컨대 재조합 형질감염 세포로부터 생성된 것 등은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하게 될 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는: (1) 예를 들어, Lowry 방법에 의해 결정했을 때 항체의 95중량% 초과로, 및 일부 구현예에서는, 99중량% 초과로 정제되거나; (1) 스피닝 컵 배열 결정기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나; (3) 쿠마시 블루 또는 실버 염색을 사용해 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균질하게 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않게 되므로 재조합 세포 내의 제자리 항체(antibody in situ)를 포함한다. 그러나, 일반적으로 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종 항체(homogeneous antibody)의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 모집단을 포함하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 미미한 양으로 존재할 수 있는 전사 후 변형(예: 이성질체화, 아미드화)를 제외하고는 동일하다. 일부 구현예에서, 단클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄에서 C-말단 절단을 갖는다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에서 절단된다. 일부 구현예에서, C-말단 절단은 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거한다. 일부 구현예에서, 단클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄에서 N-말단 절단을 갖는다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단에서 절단된다.
일부 구현예에서, 절단된 형태의 단클론 항체는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 일부 구현예에서, 단클론 항체는 고도로 특이적이며, (이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체와 같이) 다수의 항원 부위에 대해 유도된다. 수식어로서의 "단클론성(monoclonal)"은 실질적으로 동종 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 항체가 임의의 특정 방법에 의해 생산되어야 하는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 기술, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다.
용어 "부모 항체"는 변형 전의 항체를 지칭한다.
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 또는 "전체 항체"는 항체 단편과 반대로 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 작동자 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 온전한 항체의 항원 결합 영역 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항원 결합 항체 단편의 예는 도메인 항체(dAbs), Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata 등의 Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]; 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 단일 중쇄 항체 또는 단일 경쇄 항체는 조작될 수 있거나, 중쇄의 경우, 단일 중쇄 분자를 생산하도록 조작된 카멜리드, 상어, 라이브러리 또는 마우스로부터 단리될 수 있다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 쉽게 결정화될 수 있는 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 생성하였다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인(VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이며, 즉 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원 결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원을 가교 결합할 수 있는 하나의 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은, 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여, CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 추가 잔기를 가지는 것만큼 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래는 이들 사이에서 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합도 알려져 있다.
Fc 단편은 이황화에 의해 함께 유지되는 양 H 사슬의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해서도 인식되는 Fc 영역의 서열 및 글리칸에 의해 결정된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 단단하고, 비공유 결합된 하나의 중쇄 가변 영역 도메인 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이들 2개의 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, sFv 폴리펩티드는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에서 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토는, Pluckthun의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본 발명의 항체의 "기능적 단편"은 온전한 항체의 일부를 포함하며, 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역 또는 FcR 결합 능력을 보유하거나 변형시킨 항체의 Fv 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원의 단클론 항체는 특이적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함하며, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이고, 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동이다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) 참조). 본원의 관심 키메라 항체는 PRIMATIDED® 항체를 포함하며, 여기서 항체의 항원 결합 영역은 예를 들어, 관심 항원으로 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkeys)를 면역화함으로써 생산된 항체로부터 유래된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위 집합으로서 사용된다.
비인간(예: 쥣과) 항체의 "인간화" 형태가 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도, 및/또는 능력을 갖는 비인간 종, 예컨대 쥣과, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기(공여자 항체)로 치환되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 결합 친화도와 같은 항체 성능을 추가로 정제하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 서열의 것들에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것들에 상응하지만, FR 영역은 결합 친화도, 이성질체화, 면역원성 등과 같은 항체 성능을 개선하는 하나 이상의 FR 잔기 치환을 포함할 수 있는, 적어도 하나, 및 일반적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하게 된다. 일부 구현예에서, FR에서 이들 아미노산 치환의 수는 H 사슬에서 6개 이하, L 사슬에서 3개 이하이다. 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 또한 포함하게 된다. 추가의 세부 사항은, 예를 들어, Jones 등의 문헌[Nature 321:522-525(1986)]; Riechmann 등의 문헌[Nature 332:323-329 (1988)]; 및 Presta의 문헌[Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]를 참조한다. 또한, 예를 들어, Vaswani 및 Hamilton의 Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris의 Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle 및 Gross의 Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 다수의 항원 부위에 대해 유도된다. 대안적인 인간화 방법은 미국 특허 제7,981,843호 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0134098호에 기술되어 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "가변 영역" 및 "가변 도메인"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일한 부류의 다른 항체에 비해) 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원 결합 부위를 함유한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 임의의 이용 가능한 방법 또는 넘버링 체계를 사용하여 결정될 수 있고, 예를 들어, WO 2018/207701에 기술된 바와 같은 가변 도메인을 포함할 수 있다(상기 문헌의 내용은 본원에 참조로서 통합됨). 일부 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인은 가변 도메인의 카복실 말단(즉, 제4 프레임워크 도메인의 카복실 말단)에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여될 수 있으며, 이는 특정 넘버링 체계에 기초하여 가변 도메인의 설명에 달리 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인은 가변 도메인의 카복실 말단(즉, 제4 프레임워크 도메인의 카복실 말단)에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 특정 넘버링 체계에 기초하여 가변 도메인의 설명에 달리 포함되지 않을 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR, 즉 VH에서 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 가장 다양한 6개의 HVR을 나타내며, 특히 H3은 항체에게 미세한 특이성을 부여하는 데 고유한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, Xu 등의 문헌[Immunity 13:37-45 (2000)]; Johnson 및 Wu의 문헌[Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드 항체는 경쇄가 없을 때에도 기능적이고 안정적이다. 예를 들어, Hamers-Casterman 등의 문헌[Nature 363:446-448 (1993)] 및 Sheriff 등의 문헌[Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
다수의 HVR 윤곽이 사용되고 있으며 본원에 포함된다. Kabat 상보성 결정 영역(CDR)인 HVR은 서열 변동성에 기초하며 가장 흔히 사용된다(Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). Chothia HVR은 대신에 구조 루프의 위치를 지칭한다(Chothia 및 Lesk J.의 문헌[Mol. 196:901-917 (1987)] 참조). "접촉" HVR은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 이들 HVR 각각의 잔기는 아래에 표시되어 있다.
Figure pct00001
달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인 잔기(HVR 잔기 및 프레임워크 영역 잔기)는 Kabat 등의 전술한 문헌에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 것과 같은 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기들이다.
"Kabat에서와 같은 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산-위치 넘버링"이라는 표현 및 이의 변형된 표현은 Kabat 등의 전술한 문헌의 항체 목록 중 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a)을 포함할 수 있고 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은, 상동성 영역에서 항체의 서열을 "표준" Kabat 넘버링 서열과 정렬함으로써, 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 "유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 선재성 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 선재성 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존성 치환은 서열 정체성의 일부로서 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 당업자에게 알려진 다양한 방식으로 달성될 수 있으며, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장 대비 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 또는 주어진 아미노산 서열 B와 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 백분율(%)(주어진 아미노산 서열 B에 대해, 또는 주어진 서열 B와 특정 아미노산 서열 동일성 백분율을 갖는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
X/Y * 100
(식 중, X는 해당 프로그램의 A와 B 정렬에서 서열에 의해 동일한 일치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 백분율과 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 백분율이 같지 않을 것임을 이해할 것이다.
특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "결합하는", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 당업계에 공지된 방법(예: 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA))에 의해 측정했을 때, 무관한 비-CTLA4 폴리펩티드에 대한 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합은 CTLA4에 결합하는 항체의 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, CTLA4(예: 쥣과 CTLA4 및/또는 인간 CTLA4)에 결합하는 결합 단백질(예: 항체)은 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.7 nM, ≤0.6 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다.
본원에서 제공된 바와 같이, 용어 "CTLA4" 또는 "CTLA4 단백질"은 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA4)의 단백질 활성을 (예를 들어 CTLA4 대비 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 활성 이내로) 유지하는 재조합 형태 또는 자연 발생 형태의 CTLA4 또는 이의 변이체 또는 상동체 중 어느 하나를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CTLA4 폴리펩티드 대비 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CTLA4는 NCBI 서열 기준 GI:83700231에 의해 확인된 것과 같은 단백질, 이의 상동체 또는 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, CTLA4는 인간 CTLA4이다. 일부 구현예에서, CTLA4는 쥣과 CTLA4이다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능의 예는 다음을 포함한다: 항체 효과기 기능의 예는: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가, 이들 세포독성 효과기 세포를 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합시키고, 이어서 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키며, 이러한 메커니즘에 의해 표적 세포를 사멸시키는 데 필요하다. ADCC를 매개하기 위한 주된 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 Fc 발현은 Ravetch 및 Kinet의 문헌[Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]의 464쪽 표 3에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 강화된 ADCC를 갖도록 조작되거나, Fc 글리칸을 푸코실화하는 능력이 결여된 세포에서 발현된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 것과 같은 시험관 내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, Clynes 등의 문헌[PNAS USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. ADCC 활성 및 다른 항체 특성을 변경하는 다른 Fc 변이체는 하기 문헌에 개시된 것들을 포함한다: Ghetie 등의 문헌[Nat Biotech. 15:637-40, 1997]; Duncan 등의 문헌[Nature 332:563-564, 1988]; Lund 등의 문헌[J. Immunol 147:2657-2662, 1991]; Lund 등의 문헌[Mol Immunol 29:53-59, 1992]; Alegre 등의 문헌[Transplantation 57:1537-1543, 1994]; Hutchins 등의 문헌[Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995]; Jefferis 등의 문헌[Immunol Lett. 44:111-117, 1995]; Lund 등의 문헌[FASEB J9:115-119, 1995]; Jefferis 등의 문헌[Immunol Lett 54:101-104, 1996]; Lund 등의 문헌[J Immunol 157:4963-4969, 1996]; Armour 등의 문헌[Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999]; Idusogie 등의 문헌[J Immunol 164:4178-4184, 200]; Reddy 등의 문헌[J Immunol 164:1925-1933, 2000]; Xu 등의 문헌[Cell Immunol 200:16-26, 2000]; Idusogie 등의 문헌[J Immunol 166:2571-2575, 2001]; Shields 등의 문헌[J Biol Chem 276:6591-6604, 2001]; Jefferis 등의 문헌[Immunol Lett 82:57-65. 2002]; Presta 등의 문헌[Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002]; Lazar 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006]; 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 제7,335,742호; 및 제7,317,091호.
본원의 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용되며, 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에 있는 아미노산 잔기(또는 Pro230)으로부터 이의 카르복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. 본 발명의 항체에 사용하기에 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 상대(예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다. 일부 구현예에서, CTLA4에 대한 결합 단백질(예: 항체)의 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당업계에 공지된 흔한 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 활성도(binding avidity)"은 분자(예: 항체) 및 이의 결합 상대(예: 항원)의 다중 결합 부위의 결합 강도를 지칭한다.
본원의 항체를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는, 핵산 분자가 생산된 환경에서 통상적으로 연관되는 적어도 하나의 오염 물질 핵산 분자로부터 확인되어 분리되는 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 생산 환경과 연관된 모든 성분과의 연관성을 갖지 않는다. 본원의 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 형태이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 세포에서 자연적으로 존재하는 본원의 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 핵산과 구별된다.
용어 "약학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있게 하는 형태의 제제로서, 제형이 투여될 대상체가 감내할 수 없는 독성의 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 무균이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 사용된 투여량 및 농도에서 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용 가능한 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르긴닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 TWEEN??, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS??과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리학의 과정 동안 치료되는 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태를 개선 또는 완화시키는 것, 및 관해 또는 예후의 개선을 포함한다. 예를 들어, 장애(예: 신생물 질환)와 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되는 경우, 개체는 성공적으로 "치료된다". 예를 들어, 치료가 질환을 앓고 있는 사람들의 삶의 질을 개선하고, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 약물의 투여량을 감소시키고, 질환의 재발 빈도를 감소시키고, 질환의 중증도를 경감시키고, 질환의 발생 또는 진행을 지연시키고/시키거나 개체의 생존을 연장시키는 결과를 초래하는 경우, 개체는 성공적으로 "치료된다".
본원에서 사용되는 바와 같이, "함께" 또는 "조합으로"는 하나의 치료 방식을 다른 치료 방법에 추가하여 투여하는 것을 지칭한다. 이와 같이, "함께" 또는 "조합으로"는 하나의 치료 방법을 다른 치료 방법을 개체에게 투여하기 전, 투여하는 동안, 또는 투여한 후에 투여하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방(prevention)"은 개체에서 질환의 발생 또는 재발에 대한 예방(prophylaxis)을 제공하는 것을 포함한다. 개체는 장애에 걸리기 쉽거나, 취약하거나, 장애 발생의 위험이 있을 수 있지만, 아직 장애로 진단되지는 않았다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체)은 장애의 발생을 지연시키는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 장애가 발생할 "위험이 있는" 개체는 검출 가능한 질환 또는 질환의 증상을 가지거나 가지지 않을 수 있으며, 본원에 기술된 치료 방법 이전에 검출 가능한 질환 또는 질환의 증상을 나타낸 적이 있거나 그렇지 않을 수 있다. "위험이 있는(at risk)"는 개체가 당업계에 알려진 것과 같은 질환의 발생과 상관되는 측정 가능한 파라미터인 하나 이상의 위험 인자를 가고 있음을 나타낸다. 이들 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 개체는 이들 위험 인자 중 하나 이상이 없는 개체보다 장애가 발생할 확률이 더 높다.
"유효량"은 치료적 또는 예방적 결과를 포함하여, 원하는 효과 또는 표시된 효과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 적어도 투여량으로 유효한 양을 지칭한다. 유효량은 한 번 이상 투여될 수 있다. "치료적 유효량"은 적어도 특정 장애의 측정 가능한 개선에 영향을 미치는 데 필요한 적어도 최소한의 농도이다. 본원의 치료적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 항체의 치료적으로 유익한 효과가 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것일 수도 있다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량으로 유효한 양을 지칭한다. 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로, 예방적 투여량은 질환 이전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에게 사용되므로, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 수 있다.
"만성" 투여는 초기 치료 효과(활성)를 장기간 동안 유지하기 위해, 급성 모드와 반대로 연속 모드로 의약(들)을 투여하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 실시되지 않는 치료이며, 오히려 본질적으로 주기적인 치료이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "개체(individual)" 또는 "대상체(subject)"는 포유동물이다. 치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠용 동물, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌 쥐, 마우스, 페렛, 랫트, 고양이 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
II. 항-CTLA4 결합 단백질
세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA4)에 결합하는 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나, CTLA4 결합 도메인을 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 CTLA4에 결합하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 예를 들어, CTLA 결합 도메인을 함유하는 이중특이적 항체이다. 일 양태에서, CTLA4 결합 도메인을 포함하는 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 본원에 기술된 CTLA4 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은, 예를 들어, CTLA4에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인에 의해 CTLA4에 결합하는 키메라 수용체이다.
본원에 제공된 CTLA4 결합 단백질은 다양한 종 유래의 CTLA4에 결합할 수 있는데, 예를 들어, 일부는 인간 CTLA4 및/또는 쥣과 CTLA4, 또는 시노몰구스 CTLA4에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: (1) CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하고, (2) 생체내에서 종양 부위에서 CTLA4에 결합한다.
일 양태에서, CTLA4가 역할을 하는 신생물 질환의 치료에 특히 유용한 CTLA4 결합 단백질이 본원에 제공된다. 본원에서 제공된 바와 같이, CTLA4 결합 단백질은 세포(예를 들어, 암 세포 또는 T 세포)의 표면에서 발현된 CTLA4 단백질과 상호작용할 수 있는 (예를 들어, 이에 결합할 수 있는) 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하는 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 이량체이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 동종이량체이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 이종이량체, 예컨대 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 단쇄 단백질, 예컨대 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 단쇄 단백질이다.
또한, 전술한 구현예 중 어느 하나의 항체, 이중특이적 항체, 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 또는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 또한, 전술한 구현예의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 또한, 전술한 구현예의 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
또한, 항체, 이중특이적 항체, 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 또는 키메라 수용체를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체, 이중특이적 항체, 또는 키메라 수용체를 생산하는 조건 하에서 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라아제(Fut8) 넉아웃을 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 β1,4-N-아세틸글리코스민일트랜스퍼라아제 III(GnT-III)을 과발현한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 골지 μ-만노시다아제 II(ManII)를 추가로 과발현한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부는, 숙주 세포에 의해 생산된 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 또는 키메라 수용체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 키메라 수용체는 전술한 방법에 의해 생산된다.
또한, 전술한 구현예 중 어느 하나의 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 또는 키메라 수용체를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예는 전술한 구현예의 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 또는 키메라 수용체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적 조성물이다.
또한, 전술한 구현예 중 어느 하나의 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 차폐된 키메라 수용체, 또는 조성물을 함유하는 키트가 제공된다.
또한, 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술한 구현예 중 어느 하나의 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 키메라 수용체, 또는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 신생물 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 백혈병, 림프종, 두경부암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경아세포종, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암, 또는 고환암이다.
CTLA4 결합 단백질
본원에서 제공된 용어 "CTLA4 결합 단백질"은 CTLA4 단백질에 결합할 수 있거나 달리 CTLA4 단백질에 대한 친화도를 나타낼 수 있는 CTLA4 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항원 결합 단편, 단쇄 항체 등이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 따라서, 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 단백질은 CTLA4에 결합하는 키메라 항원 수용체의 성분이다.
용어 "CTLA4 결합 도메인"은 세포 내에서 또는 세포 상에서 발견되는 CTLA4 단백질에 결합할 수 있거나 달리 이에 대한 친화도를 나타낼 수 있는 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 도메인을 지칭한다. CTLA4 결합 도메인의 CTLA4에 대한 결합 정도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CTLA4 결합 도메인은 CTLA4에 결합할 수 있는 항체이다. 일부 구현예에서, CTLA4는 인간 CTLA4이다. 일부 구현예에서, CTLA4는 쥣과 CTLA4이다. 일부 구현예에서, 항체는 쥣과 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 단편(항원 결합 단편 포함), 예를 들어, dAb, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이량체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 이종이량체, 예컨대 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬(예를 들어, 경쇄 및 중쇄)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 제1 사슬 및 2개의 제2 사슬(예를 들어, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄이고; 제2 사슬은 중쇄이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 제1 사슬 및 2개의 제2 사슬을 함유한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄 가변 도메인이고; 제2 사슬은 중쇄 가변 도메인이다. 이러한 구현예 중 일부에서, 항원 결합 단편은 dAb, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다.
이러한 구현예 중 일부에서, 항체는 쥣과 항체이다.
이러한 구현예 중 일부에서, 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체이다. 이러한 구현예 중 일부에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 이러한 구현예 중 일부에서, IgG1은 다음의 아미노산 치환을 함유하며: S298A, E333A, 및 K334A; S239D 및 I332E; S239D, A330L, 및 I332E; P247I 및 A339D 또는 A339Q; S298D 또는 S298V가 있거나 없는 D280H, K290S; F243L, R292P, 및 Y300L; F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L; G236A, S239D, 및 I332E; K326A 및 E333A; K326W 및 E333S; 또는 K290E 또는 K290N, S298G, T299A, 및/또는 K326E; 아미노산 잔기는 Kabat의 문헌에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다.
이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 28의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 28의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고/하거나; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 29의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 29의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고/하거나; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 33의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 33의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고/하거나; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 34의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 34의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고/하거나; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 28, 29, 33, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다.
CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄, 및 항원(예를 들어, 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 함유하는 이중특이적 항체가 또한 본원에 제공된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체는 쥣과 항체이다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, IgG1은 다음과 같은 아미노산 치환을 함유하며: S298A, E333A, 및 K334A; S239D 및 I332E; S239D, A330L, 및 I332E; P247I 및 A339D 또는 A339Q; S298D 또는 S298V가 있거나 없는 D280H, K290S; F243L, R292P, 및 Y300L; F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L; G236A, S239D, 및 I332E; K326A 및 E333A; K326W 및 E333S; 또는 K290E 또는 K290N, S298G, T299A, 및/또는 K326E; 아미노산 잔기는 Kabat의 문헌에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 함유하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 함유하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 및 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 27 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 28, 29, 33, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체는 제1 사슬 및 제2 사슬을 함유하며, 여기서 제1 사슬은 (i) 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 함유하고/하거나, 제2 사슬은 (i) 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 사슬은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 및 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 제1 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 26의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 26의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 31의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 31의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 바와 같은 효과기 기능을 향상시키는 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 이소형을 갖는다.
일부 구현예에서, CTLA4 결합 도메인은 이중특이적 항체의 항원 결합 아암의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 (i) 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; 중쇄는 (i) 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄는 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄는 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄는 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄는 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 25의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 26의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 26. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 30의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 31의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 31.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 중쇄 가변 영역은 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체의 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
이중특이적 항체의 임의의 구현예 중 일부에서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체의 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 28, 29, 33, 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 28, 29, 33, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 28의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 33의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 33. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 34. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이적 항체의 일부 구현예에서, CTLA4는 인간 CTLA4이다. 이중특이적 항체의 일부 구현예에서, CTLA4는 쥣과 CTLA4이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 쥣과 항체이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 본원에 기술된 바와 같은 효과기 기능을 향상시키는 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 이소형을 갖는다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이량체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 이종이량체, 예컨대 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하거나; 제1 사슬은 경쇄 가변 영역이거나 이를 포함하고, 제2 사슬은 중쇄 가변 영역이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA4 결합 도메인은 CTLA4에 결합하는 제2 사슬 및 제1 사슬, 예컨대 키메라 수용체에 사용하기 위한 리간드 결합 도메인의 일부를 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 사슬은 중쇄 가변 도메인이다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 (i) 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; 제2 사슬은 (i) 서열번호 4 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제2 사슬은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제2 사슬은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제2 사슬은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제2 사슬은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 사슬은 서열번호 31의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖거나 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 사슬은 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다. 키메라 수용체의 일부 구현예에서, 제1 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 사슬은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
CTLA4 결합 단백질은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법에 의해 추가 분자에 접합될 수 있다. 용어 "접합체" 및 "접합체 화학"은 비교적 경미한 조건 하에서 진행되는 알려진 반응성 기와의 반응을 지칭한다. 이들은 친핵성 치환(예를 들어, 아민 및 알코올과 아실 할로겐화물, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 에나민 반응), 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 첨가(예를 들어, 마이클 반응, 디엘-알더 첨가)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이들 및 다른 유용한 반응은, 예를 들어, March의 문헌[Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985]; Hermanson의 문헌[Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996]; 및 Feeney 등의 문헌[Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982]에서 논의되었다.
본원의 접합체 화학에 사용되는 유용한 반응성 작용기는, 예를 들어: (a) 카복실기 및 이의 다양한 유도체(N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할로겐화물, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 방향족 에스테르를 포함하지만 이들로 한정되지는 않음); (b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실기; (c) 할로겐화물이 예를 들어 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 탄소 음이온, 또는 알콕사이드 이온과 같은 친핵성 기로 나중에 치환되어 할로겐 원자의 부위에 새로운 기의 공유 부착을 유도할 수 있는 할로알킬기; (d) 디엘-알더 반응에 참여할 수 있는 친디엔성 기(예: 말레이미도기); (e) 예를 들어, 아민, 하이드로존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체의 형성을 통하거나, 그리냐르 첨가(Grignard addition) 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통해 후속 유도체화를 가능하게 하는 알데히드 또는 케톤 기; (f) 예를 들어, 설폰아미드를 형성하기 위한 아민과의 후속 반응을 위한 설포닐 할라이드 기; (g) 이황화물로 전환되거나, 아실 할라이드와 반응하거나, 금과 같은 금속에 결합될 수 있는 티올기; (h) 예를 들어, 아실화, 알킬화, 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴 기; (i) 예를 들어, 환화 첨가, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있는 알켄; (j) 예를 들어, 아민 화합물 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭시드; (k) 핵산 합성에 유용한 포스포라미다이트 및 다른 표준 작용기; (i) 금속 실리콘 산화물 결합; 및 (l) 예를 들어, 인산디에스테르 결합을 형성하는 반응성 인 기(예: 포스핀)에 대한 금속 결합을 포함한다.
반응성 작용기는 본원에 기술된 조성물의 화학적 안정성에 관여하지 않거나, 이를 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 반응성 작용기는 가교 결합 반응에 참여하지 않도록 보호기의 존재에 의해 보호될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법에 의해 추가의 분자 및/또는 CTLA4 결합 단백질에 융합되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 추가의 분자 및/또는 CTLA4 결합 단백질을 포함하는 링커를 암호화하여 숙주 세포로부터 재조합 발현될 때 융합 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다.
예시적인 CTLA4 결합 단백질
하기는 전술한 바와 같은 특정 특징을 함유하는 CTLA4 결합 단백질의 예시적인 특정 구현예를 기술한다. 이들 구현예는 단지 예시적인 것이며 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
일부 구현예에서, CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 임의의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 제1 사슬 및 2개의 제2 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄이고 제2 사슬은 중쇄이다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄 가변 도메인이고 제2 사슬은 중쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, a) 항체의 제1 사슬은 경쇄이고, 항체의 제2 사슬은 경쇄이거나; b) 항체의 제1 사슬은 중쇄이고, 항체의 제2 사슬은 중쇄이거나; c) 항체의 제1 사슬은 경쇄이고, 항체의 제2 사슬은 중쇄이다.
일부 구현예에서, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 양태에서, 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
추가 양태에서, 서열번호 27 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열번호 28, 29, 33, 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 기준 서열에 비해 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체는 CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산)은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 기준 서열에 비해 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체는 CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산)은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
5가지 부류의 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들은 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 각각 갖는다. γ 및 α 부류는 하위 부류로 더 나누어진다. 예를 들어, 인간은 다음의 하위 부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. IgG1 항체는 알로타입으로 명명된 다수의 다형성 변이체로 존재할 수 있으며(Jefferis 및 Lefranc의 문헌[2009 mAbs Vol 1 Issue 4 1 7]에서 검토됨), 이들 중 어느 것도 본원의 일부 구현예에서 사용하기에 적합하다. 인간 모집단에서 흔한 알로타입 변이체는 글자 a, f, n, z, 또는 이들의 조합에 의해 지정된 것들이다. 본원의 구현예 중 일부에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1 이소형(예: 인간 IgG1 이소형)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 항체 또는 본원에 기술된 항-CTLA4 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CTLA4가 역할을 하는 신생물 질환, 예컨대 본원에 열거된 것들의 치료를 위한 약학적 제형이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CTLA4 결합 단백질은 CTLA4에 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 CTLA4에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 결합 특이성이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 CTLA4의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 양태에서, a) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄, 및 b) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, a) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 CTLA4와 상이한 항원이다. 일부 구현예에서, 제1 쌍 또는 제2 쌍의 경쇄는 본원에 기술된 임의의 경쇄이다. 일부 구현예에서, 제1 쌍 또는 제2 쌍의 중쇄는 본원에 기술된 임의의 경쇄이다. 일부 구현예에서, 제1 사슬의 경쇄는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제1 사슬의 중쇄는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 사슬의 경쇄는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 제2 사슬의 중쇄는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CTLA4의 상이한 에피토프이다.
이중특이적 항체에 사용하기 위해 본원에서 고려되는 이중특이적 항체는 쥣과 이중특이적 항체, 인간화 이중특이적 항체, 키메라 이중특이적 항체, 및 인간 이중특이적 항체를 포함한다. 본원의 구현예 중 일부에서, 이중특이적 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 IgG1 이소형(예: 인간 IgG1 이소형)을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 이소형을 갖거나, 본원에 기술된 바와 같이 효과기 기능을 향상시키는 Fc 글리칸을 푸코실화하는 능력이 없거나 능력이 감소된 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체가 본원에서 제공되며, 상기 항체는 서열번호 25 및 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 추가 양태에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체가 본원에서 제공되며, 상기 항체는 서열번호 27 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열번호 28, 29, 33 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 기준 서열에 비해 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체는 CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산)은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 25 및 30으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 기준 서열에 비해 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체는 CTLA4(예: 인간 CTLA4)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산)은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25 또는 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 CTLA4 결합 단백질은 CTLA4에 결합할 수 있는 키메라 수용체(예: 키메라 항원 수용체(CAR))이다. CAR은 원하는 항원(예: CTLA4)에 대한 항체 기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적 항종양 세포 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다. 일 구현예에서, T 세포 항원 수용체 복합체 제타 사슬(예: CD3 제타)의 세포내 신호전달 도메인에 융합된, 본원에 기술된 CTLA4 결합 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함하도록 조작된 키메라 수용체가 본원에 제공된다. 키메라 수용체는, T 세포에서 발현될 때, 세포외 도메인에 의한 항원 결합 특이성에 기초하여 항원 인식을 재유도할 수 있다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 도메인은 바람직하게는 공자극 분자 및 제타 사슬 중 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된다. 일부 구현예에서, CTLA4 결합 도메인은 CD137(4-1BB) 신호 전달 도메인, CD28 신호 전달 도메인, CD3zeta 신호 도메인, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된다.
일부 양태에서, a) CTLA4에 결합하는 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 c) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄 가변 도메인이고; 제2 사슬은 중쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 서열번호 25 및 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 사슬은 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, a) CTLA4에 결합하는 제1 사슬 및 제2 사슬을 포함하는 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 d) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 경쇄 가변 도메인이고; 제2 사슬은 중쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 사슬은 서열번호 25 및 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 사슬은 서열번호 26 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 1) CTLA4에 결합하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 리간드-결합 도메인; 2) 막관통 도메인; 및 3) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에 제공되며, 여기서 a) VL 도메인은 서열번호 25의 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나; b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 양태에서, 1) CTLA4에 결합하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 리간드 결합 도메인; 2) 막관통 도메인; 및 3) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에 제공되며, 여기서 a) VL 도메인은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (iii) 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; b) VL 도메인은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; c) VL 도메인은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; d) VL 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나; VH 도메인은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양태에서, 제공된 키메라 수용체 중 어느 하나에서, a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 제공된 키메라 수용체 중 어느 하나에서, a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
1. 결합 친화도
예컨대, 항체와 항체가 특이적인 항원 사이의 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는, 상호 작용의 평형 해리 상수(KD)의 관점에서 표현될 수 있으며, 여기서 KD가 작을수록 친화도는 더 크다. 단백질의 면역학적 결합 특성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 정량화할 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원 결합 단백질(예: 항체)/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 이러한 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호 작용의 친화도, 및 양 방향으로 속도에 동일한 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 따라 달라진다. "온 속도 상수"(Kon) 및 "오프 속도 상수"(Koff) 둘 다는 농도, 및 결합과 해리의 실제 속도를 계산하여 결정될 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화도와 무관한 모든 파라미터의 취소를 가능하게 하며, 평형 해리 상수 KD와 동일하다. Davies 등의 문헌[Annual Rev Biochem. 59:439-473, (1990)] 참조.
일부 양태에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 상이한 항-CTLA4 결합 단백질과 비교했을 때, 대략 동일하거나 더 높은 친화도로 CTLA4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-CTLA4 결합 단백질은 ≤ 1μM, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 약 50 pM 내지 약 5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 표적 단백질(예: CTLA4 단백질)에 결합한다. 결합 친화도를 평가하기 위한 검정은, 예를 들어 본원의 실시예 1에 기술된 검정에서와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
2. 생물학적 활성 분석
일부 양태에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질은 생체 내 쥣과 동물 종양 모델에서 종양 부피를 감소시킨다. 종양 부피의 감소를 평가하기 위한 검정은, 예를 들어 본원의 실시예 1에 기술된 검정에서와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
III. 항-CTLA4 결합 단백질의 제조
본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질은 당업계에서 이용 가능한 기술을 사용하여 제조되며, 이의 예시적인 방법은 다음 섹션에서 보다 상세히 기술된다.
1. 항-CTLA4 결합 단백질: 항체 단편
본 발명은 항-CTLA4 결합 단백질로서 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 효소 소화와 같은 전통적인 수단에 의하거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 상황에서는, 전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 이점이 있다. 특정 항체 단편의 검토는, Hudson 등의 문헌[(2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유래되었다(예를 들어, Morimoto 등의 문헌[Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 Brennan 등의 문헌[Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv, 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균 및 다른 세포 유형에서 발현되고 이들로부터 분비될 수 있으므로, 이들 단편을 대량으로 용이하게 생산할 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 배양 배지로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter 등의 문헌[Bio/Technology 10: 163-167 (1992)] 참조). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. FcRN/구제 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호 참조. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이며; 따라서, 이들은 생체 내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단 중 어느 하나에서 효과기 단백질의 융합을 생성하도록 작제될 수 있다. Borrebaeck(ed.)의 전술한 문헌[Antibody Engineering] 참조. 또한, 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 이중-scFv는 이중특이적 항체로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 3개 이상의 scFv를 포함하는 다중-scFv가 다중특이적 항체로서 사용될 수 있다.
본 발명은 적절한 링커를 통해 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단쇄 면역글로불린 또는 (예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 것과 같은) 선형 항체를 포함한다. 이러한 선형 항체 또는 면역글로불린은 단일 특이적이거나 이중 특이적일 수 있다. 이러한 단쇄 면역글로불린은 이량체화되어 원래 사량체인 항체와 유사한 구조 및 활성을 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 단일 중쇄 가변 영역을 갖고 경쇄 서열은 갖지 않는 항체일 수 있다. 이러한 항체는 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 나노바디로 불린다. 이들 항체는 본 발명에 따른 항체의 기능적 단편의 의미로도 포함된다.
2. 항-CTLA4 결합 단백질: 인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 인간화 항체는 본원에 제공된 지침에 따라 생성된다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로서 지칭되며, 이는 대개 "유입" 가변 도메인으로부터 가져온 것이다. 인간화는 본질적으로 Winter의 방법에 따라(Jones 등의 문헌[(1986) Nature 321:522-525]; Riechmann 등의 문헌[(1988) Nature 332:323-327]; Verhoeyen 등의 문헌[(1988) Science 239:1534-1536]), 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체이며(미국 특허 제4,816,567호), 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비인간 종의 상응하는 서열로 치환된 것이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위에 있는 잔기로 치환되는 인간 항체이다.
3. 항-CTLA4 결합 단백질: 인간 항체
본 발명의 인간 항-CTLA4 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 알려진 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 작제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 단클론 항-CTLA4 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주 및 쥣과-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어, Kozbor의 문헌[J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; Brodeur 등의 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 Boerner 등의 문헌[J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기술되어 있다. 인간 항체는 본원에 제공된 지침에 따라 생성된다.
4. 항-CTLA4 결합 단백질: 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 CTLA4에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 결합 특이성이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 CTLA4의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를 CTLA4를 발현하는 세포에 국소화하는 데 사용될 수도 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 본원에 제공된 지침에 따라 생성된다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. Milstein 및 Cuello의 문헌[Nature, 305: 537 (1983)], 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829, Traunecker 등의 문헌[EMBO J., 10: 3655 (1991)]; Kontermann 및 Brinkmann의 문헌[Drug Discovery Today, 20(7):838-847] 참조. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 대한 추가적인 세부 사항은, 예를 들어, Suresh 등의 문헌[Methods in Enzymology, 121:210(1986)]을 참조한다. 이중특이적 항체는 가교 결합 항체 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있고, 다른 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적절한 가교제는 당업계에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 다수의 가교 결합 기술과 함께 개시되어 있다.
5. 항-CTLA4 결합 단백질: 단일 도메인 항체
일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 본원에 제공된 지침에 따라 생성된다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호). 일 구현예에서, 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성된다.
6. 항-CTLA4 결합 단백질: 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내에 있는 잔기를 결실하는 것, 및/또는 삽입하는 것, 및/또는 치환하는 것을 포함한다. 최종 작제물이 바람직한 특성을 갖는다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합을 최종 작제물에 도달시킬 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 데 유용한 방법은 Cunningham 및 Wells의 문헌[(1989) Science, 244:1081-1085]에 의해 기술된 것과 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로서 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어 아미노산과 항원의 상호 작용에 영향을 미친다. 그런 다음, 치환에 대한 작용성 민감도를 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에 또는 치환 부위에 대한 추가 변이체 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, Ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린이 원하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입체는, 길이 범위가 하나의 잔기에서 수백 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체뿐만 아니라 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열 내 삽입체를 포함한다. 말단 삽입체의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드를 항체의 N-말단 또는 C-말단에 융합시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 약동학을 개선시키는 FcRn 돌연변이는 M428L, T250Q/M428L, M252Y/S254T/T256E, P257I/N434H, D376V/N434H, P257I/Q3111, N434A, N434W, M428L/N434S, V259I/V308F, M252Y/S254T/T256E, V259I/V308F/M428L, T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434A, V308P/N434A, N434H, V308P를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 돌연변이는 낮은 pH에서 FcRn에 대한 항체 결합을 향상시키지만, 중성 pH에서는 항체 친화도를 변화시키지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 당질화는 통상적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 존재하면 잠재적인 당질화 부위가 생성된다. O-연결 당질화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 사용될 수도 있지만, 가장 보편적으로는 세린 또는 트레오닌인 하이드록시아미노산에 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 크실로오스 중 하나가 부착되는 것을 지칭한다.
항체에 대한 당질화 부위의 추가 또는 결실은, (N-연결 당질화 부위에 대한) 전술한 트리펩티드 서열 중 하나 이상이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 (O-연결 당질화 부위에 대한) 원래 항체의 서열에 추가하거나, 결실시키거나, 치환함으로써 이루어질 수도 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코오스가 결여된 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 제2003/0157108호(Presta, L.)에 기술되어 있다. 또한 US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 이등분 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878, Jean-Mairet 등의 미국 특허 제6,602,684호, Umana 등의 문헌에 참조되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087(Patel 등)에 보고되어 있다. 변경된 탄수화물이 Fc 영역에 부착된 항체에 관해서는 WO 1998/58964(Raju, S.) 및 WO 1999/22764(Raju, S.)를 또한 참조한다. 변형된 당질화를 갖는 항원 결합 분자에 대해서는 US 2005/0123546(Umana 등)를 참조한다.
특정 구현예에서, 당질화 변이체는 Fc 영역을 포함하되, Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코오스가 결여되어 있거나 푸코오스가 감소된다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 임의로, Fc 영역은 그 안에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는데, 이는 ADCC, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 추가로 개선한다. "비푸코실화", "탈푸코실화" 또는 "푸코오스-결핍" 항체와 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki 등의 문헌[J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; Yamane-Ohnuki 등의 문헌[Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산하는 세포주의 예는: 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka 등의 문헌[Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)], 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams 등) 중 특히 실시예 11), 및 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포와 같은 넉아웃 세포주(Yamane-Ohnuki 등의 문헌[Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]), 및 β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스퍼라아제 III(GnT-III) 및 골지 μ-만노시다아제 II(ManII)를 포함한다.
본원의 구현예 중 어느 하나에서, 항-CTLA4 결합 단백질은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 개선하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 결합 단백질은 알파1,6-푸코실트랜스퍼라아제(Fut8) 넉아웃을 갖는 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 항-CTLA4 결합 단백질은 β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스퍼라아제 III(GnT-III)을 과발현하는 세포주에서 생산될 수 있다. 추가 구현예에서, 세포주는 골지 μ-만노시다아제 II(ManII)를 추가로 과발현한다. 본원의 구현예 중 일부에서, 항-CTLA4 결합 단백질은 ADCC 활성을 개선하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 Fc 영역에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 그의 혈청 반감기를 개선하도록 변경된다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기술된 바와 같이 FcRN /구제 수용체 결합 에피토프를 항체(특히 항체 단편) 내로 혼입할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자(예: IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다(US 2003/0190311, 미국 특허 제6,821,505호; 미국 특허 제6,165,745호; 미국 특허 제5,624,821호; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제6,165,745호; 미국 특허 제5,834,597호).
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로 치환된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환성 돌연변이 유발을 위한 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 표 1에 "바람직한 치환"으로 표시된 열에 표시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성에 있어서 바람직한 변화를 유발하는 경우, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명된(또는 아미노산 분류를 참조하여 아래에 추가로 기술된 바와 같은) 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
원래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나; (b) 표적 부위에 있는 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나; (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 데 미치는 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 이들의 측쇄의 특성에 있어서의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다(A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통 측쇄의 특성에 기초하여 그룹으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함하게 된다. 이러한 치환된 잔기는 보존적 치환 부위 내로 도입되거나, 나머지 (비보존) 부위 내로 도입될 수도 있다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성된 부모 항체에 비해 변형된(예를 들어, 개선된) 생물학적 특성을 가지게 된다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙을 포함한다. 요약하자면, 여러 개의 초가변 영역 부위(예: 6~7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 그렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질(예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합으로서 필라멘트성 파지 입자로부터 디스플레이된다. 그런 다음, 파지 디스플레이된 변이체를 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 스캐닝 돌연변이 유발(예: 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본원에 설명된 것을 포함하여, 당업계에 공지된 기술에 따른 치환의 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 변이체 패널을 대상으로 스크리닝을 수행하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은, (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 천연 공급원으로부터의 단리, 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지향성) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 이전에 제조된 항체의 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하여 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CTLA4 이중특이적 항체)은 효과기 기능이 강화된 IgG1 이소형을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 증가된 수준의 만노오스 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 증가된 수준의 이등분 글리칸 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CTLA4 이중특이적 항체는 증가된 수준의 만노오스 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, IgG1은 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CTLA4 이중특이적 항체는 IgG1 이소형(예를 들어, 인간 IgG1 이소형)을 갖는다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 S298A, E333A, 및 K334A를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 S239D 및 I332E를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 S239D, A330L, 및 I332E를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 P247I 및 A339D 또는 A339Q를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 D280H, K290S(S298D 또는 S298V가 있거나 없음)를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 F243L, R292P, 및 Y300L을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 G236A, S239D, 및 I332E를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 K326A 및 E333A를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 K326W 및 E333S를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일 구현예에서, IgG1은 아미노산 치환 K290E 또는 K290N, S298G, T299A, 및/또는 K326E를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함된 예시적인 중쇄 불변 영역은 서열 번호 35~38에 제시된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함된 예시적인 경쇄 불변 영역은 서열 번호 39에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 CTLA4 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 설명 및 당해 기술의 교시에 따르면, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 야생형 상대 항체와 비교하여, 예를 들어 Fc 영역에서 하나 이상의 변경을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 그럼에도 불구하고, 이들 항체는 이들의 야생형 상대와 비교하여 치료적 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 예를 들어, 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있고, 이는 예를 들어 WO99/51642에 기술된 바와 같이, C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경(즉, 개선 또는 감소)시키게 될 것으로 여겨진다. Fc 영역 변이체의 다른 예시에 관해서는 Duncan & Winter의 문헌[Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351을 또한 참조한다. WO00/42072(Presta) 및 WO 2004/056312(Lowman)는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체를 기술한다. 이들 특허 공개문헌의 내용은 구체적으로 본원에 참조로서 통합된다. Shields 등의 문헌[J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]도 참조한다. 반감기가 증가되고, 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것(Guyer 등의 문헌[J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 Kim 등의 문헌[J. Immunol. 24:249 (1994)])을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체는 US2005/0014934A1(Hinton 등)에 기술되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가되거나 감소된 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 제6,194,551B1호, WO99/51642에 기술되어 있다. 이들 특허 공개문헌의 내용은 구체적으로 본원에 참조로서 통합된다. Idusogie 등의 문헌[J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
7. 항체-약물 접합체
본 발명은 또한 항-약물 접합체(ADC)를 제공하며, ADC는 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소와 같은 하나 이상의 세포독성제에 접합된, 본원에서 제공된 항-CTLA4 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 항체-약물 접합체에 접합된 하나 이상의 약물은은 다음을 포함하되 이들로 한정되지는 않는다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호; 제 5,416,064호, 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)와 같은 아우리스타틴(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호, 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리키마이신 또는 이의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; Hinman 등의 문헌[Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 Lode 등의 문헌[Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신과 같은 안트라시클린(Kratz 등의 문헌[Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; Jeffrey 등의 문헌[Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; Torgov 등의 문헌[Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; Nagy 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; Dubowchik 등의 문헌[Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; King 등의 문헌[J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀과 같은 탁산; 트리코테센; 및 CC1065.
또 다른 구현예에서, 항체-약물 접합체에 접합된 하나 이상의 약물은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 튜불린 중합화 억제제(예를 들어, 메이탄시노이드 및 아우리스타틴), DNA 손상제(예를 들어, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키아미신, 듀오카마이신 및 인도-리노벤조디아제핀 이량체), 및 DNA 합성 억제제(예를 들어, 엑사테칸 유도체 Dxd).
또 다른 구현예에서, 항체-약물 접합체는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된, 본원에 기술된 것과 같은 항체를 포함한다: 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소독소 A 사슬(녹농균 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 비누풀(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.
또 다른 구현예에서, 항체-약물 접합체는 방사성 원소에 접합되어 방사성 접합체를 형성하는, 본원에 기술된 것과 같은 항체를 포함한다. 방사성 접합체의 생산을 위해 다양한 방사성 동위원소를 이용할 수 있다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 방사성 동위원소 Lu가 있다. 방사성 접합체가 검출에 사용될 때, 방사성 접합체는 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자(예를 들어 tc99m 또는 I123), 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화, MRI로도 알려짐)를 위한 스핀 표지(예를 들어, 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철)를 포함할 수 있다.
항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)과 세포독성제의 접합체는, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT)과 같은 다양한 이기능성 단백질 결합제; 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예: 디메틸 아디피미데이트 HCl); 활성 에스테르(예: 디숙신이미딜 수베레이트); 알데히드(예: 글루타르알데히드); 비스-아지도 화합물(예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민); 비스-디아조늄 유도체(예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민); 디이소시아네이트(예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트); 및 비스-활성 불소 화합물(예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용해 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소(ricin immunotoxin)는 Viteta 등의 문헌[Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026 참조. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-반응성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광-반응성 링커, 디메틸 링커, 또는 이황화물-함유 링커가 사용될 수 있다(Chari 등의 문헌[Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호).
본원의 ADC는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 가교제로 제조된 이러한 접합체를 명시적으로 고려하지만 이에 한정되지는 않는다: (예를 들어서, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A에서) 상업적으로 이용 가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, 및 sulfo-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트).
8. 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산을 단리하여, 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내에 삽입한다. 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용해 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 많은 벡터가 이용 가능하다. 벡터의 선택은 사용될 숙주 세포에 따라 부분적으로 달라진다. 일반적으로, 숙주 세포는 원핵 생물 기원이거나 진핵 생물(일반적으로 포유류) 기원이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여, 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
9. 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 결합 단백질 생성하기
a) 벡터 작제
본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생성 세포로부터 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 원핵 생물 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내에 삽입된다. 이용 가능하고 당업계에 알려져 있는 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입할 핵산의 크기 및 벡터로 형질변환시킬 특정 숙주 세포에 따라 달라지게 된다. 각각의 벡터는 그 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 상주하는 특정 숙주 세포와의 호환성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분에는 일반적으로: 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체, 및 전사 종결 서열이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 비슷한 종으로부터 유래된 복제 서열 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 일반적으로 복제 부위뿐만 아니라, 형질변환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 표지 서열도 가진다. 예를 들어, 대장균(E. coli)은 일반적으로 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질변환된다. pBR322는 유전자 암호화 암피실린(Amp) 및 테트라시클린(Tet) 저항성을 함유하므로 형질변환된 세포를 확인하기 위한 쉬운 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지도 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나, 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 사용된 pBR322 유도체의 예는 Carter 등의 미국 특허 제5,648,237호에 상세하게 기술되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 양립 가능한 복제 서열 및 조절 서열을 함유하는 파지 벡터가 이들 숙주와 관련된 형질변환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM.TM.-11과 같은 박테리오파지가 대장균 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질변환시키는 데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 폴리펩티드 성분의 각각을 암호화하는 둘 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 상류(5')에 위치한 미번역 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 일반적으로 유도성 및 구성성의 2가지 부류로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 시스트론의 전사 수준의 증가를 개시하고 이를 조절하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내에 삽입함으로써, 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 모두가 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터가 사용되는데, 이는 이종 프로모터가 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교했을 때, 발현된 표적 유전자의 더 큰 전사 및 더 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 tac 또는 trc 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아에서 기능적인 다른 프로모터(예를 들어, 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열이 공개됨으로써, 당업자는 임의의 필요한 제한 부위를 공급하는 링커 또는 어댑터를 사용해 표적 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 시스트론에 이들 서열을 작동 가능하게 연결시킬 수 있다(Siebenlist 등의 문헌[(1980) Cell 20: 269] 참조).
본 발명의 일 양태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 전좌를 막을 가로질러 유도하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분이거나, 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리 인산분해효소, 페니실린분해효소, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA, 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 생물 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 일 구현예에서, 발현 시스템의 시스트론 모두에 사용된 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 발생할 수 있으므로, 각 시스트론 내에 분비 신호 서열이 존재할 필요가 없다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 추가 분자 등에 대한 서열의 유무와 상관없이 발현되어, 접히고 조립되어 세포질 내에서 기능성 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 대장균 trxB-균주)는 이황화 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 접힘 및 조립을 허용한다. Proba 및 Pluckthun의 문헌[Gene, 159:203 (1995)] 참조.
항-CTLA4 결합 단백질은, 분비되고 적절하게 조립된 본 발명의 항체의 수율을 최대화하기 위해, 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적 비율을 조절할 수 있는 발현 시스템을 사용함으로써 생산될 수도 있다. 이러한 조절은 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도를 동시에 조절함으로써 적어도 부분적으로 달성된다.
본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질을 발현하기에 적합한 원핵 숙주 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria)를 포함한다. 유용한 박테리아의 예에는 대장균(예: E. coli), 바실리균(예: B. 서브틸리스), 장내세균, 슈도모나스 종(예: 녹농균), 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아 마르세스칸, 클레브시엘라, 프로테우스, 시겔라, 리조비아, 비트레오스실라, 또는 파라코커스 등이 있다. 일 구현예에서, 그램 음성 세포가 사용된다. 일 구현예에서, 대장균 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 대장균 균주의 예는 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 수탁번호 27,325) 및 이의 변이체를 포함하며, 이에는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3이 포함된다(미국 특허 제5,639,635호). 대장균 294(ATCC 31,446) 대장균 B, 대장균λ 1776(ATCC 31,537), 및 대장균 RV308(ATCC 31,608)과 같은 다른 균주 및 이들의 변이체도 적합하다. 이들 예는 한정적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 정의된 유전자형을 갖는 전술한 박테리아 중 어느 하나의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Bass 등의 문헌[Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 박테리아 세포에서 레플리콘의 재현성을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 대장균, 세라티아, 또는 살모넬라 종은 잘 알려진 플라스미드, 예컨대 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하는데 사용될 때 숙주로서 적절히 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 바람직하게는 추가 프로테아제 억제제가 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
b) 결합 단백질 생산
숙주 세포를 전술한 발현 벡터로 형질변환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질변환체를 선택하거나, 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 종래의 영양 배지에서 배양한다.
형질변환은 DNA가 염색체 외 요소로서 복제되거나 염색체 통합제에 의해 복제될 수 있도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 치료는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 형질변환을 위한 다른 방법에는 폴리에틸렌 글리콜/DMSO가 사용된다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질을 생산하는 데 사용되는 원핵 세포는 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 당업계에 공지된 배지에서 성장시킨다. 적절한 배지의 예는, 루리아 브로스(LB) + 필요한 영양 보충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용도록 발현 벡터의 작제에 기초하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 암피실린을 배지에 첨가한다.
탄소, 질소, 및 무기 인산염 공급원 이외의 임의의 필요한 보충제가 적절한 농도로 포함될 수도 있고, 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같은 다른 보충제 또는 매질과의 혼합물로서 도입될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타틴, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨, 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적절한 온도에서 배양한다. 특정 구현예에서, 대장균 생장을 위한 생장 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃; 약 25℃ 내지 약 37℃의 범위이거나; 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 특정 구현예에서, 대장균의 경우, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 일 양태에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 조절하는 데 사용된다. 따라서, 형질변환된 숙주 세포는 유도를 위해 인산염 제한 배지에서 배양된다. 특정 구현예에서, 인산염 제한 배지는 C.R.A.P. 배지이다(예를 들어, Simmons 등의 문헌[J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용된 벡터 작제물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현된 항-CTLA4 결합 단백질은 숙주 세포의 주변질 내로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 충격, 초음파 처리, 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전체 세포가 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은, 예를 들어 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지 내로 수송되어 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고, 생성된 단백질의 추가 정제를 위해 배양물 상청액을 여과하고 농축시킬 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 흔히 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리되고 확인될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 항-CTLA4 결합 단백질 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 재조합 단백질의 생산을 위해 다양한 대규모 유가식 발효 절차를 이용할 수 있다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량을 가지며, 특정 구현예에서는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이러한 발효기는 교반기 임펠러를 사용하여 산소와 영양소, 특히 포도당을 분배한다. 소규모 발효는 일반적으로 대략 100 리터 이하의 부피 용량을 갖는 발효기에서의 발효를 지칭하며, 용량은 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 일반적으로 적절한 조건 하에서 원하는 밀도, 예를 들어, 약 180 내지 220의 OD550까지 세포를 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 고정상에 있다. 당업계에 공지되고 전술한 바와 같이, 사용된 벡터 작제물에 따라 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 세포는 유도 전에 더 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 더 길거나 더 짧은 유도 시간이 사용될 수 있지만, 세포는 일반적으로 약 12~50시간 동안 유도된다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 접힘을 개선하기 위해, Dsb 단백질(DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, 및/또는 DsbG) 또는 FkpA(샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이성화 효소)와 같은 샤페론 단백질을 과발현하는 추가 벡터를 사용해 숙주 원핵 세포를 공변환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 접힘 및 가용성을 촉진하는 것으로 입증되었다. Chen 등의 문헌[(1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605]; Georgiou 등의 미국 특허 제6,083,715호; Georgiou 등의 미국 특허 제6,027,888호; Bothmann 및 Pluckthun의 문헌[2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; Ramm 및 Pluckthun의 문헌[(2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; Arie 등의 문헌[(2001) Mol. Microbiol. 39:199-210] 참조.
발현된 이종 단백질(특히 단백질 분해에 민감한 것들)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI, 및 이들의 조합과 같은 공지된 박테리아 프로테아제를 암호화하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 일부 대장균 프로테아제-결핍 균주를 이용할 수 있고, 예를 들어, 전술한 Joly 등의 전술한 (1998) 문헌; Georgiou 등의 미국 특허 제5,264,365호; Georgiou 등의 미국 특허 제5,508,192호; Hara 등의 문헌[Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질변환된 대장균 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
c) 결합 단백질 정제
일 구현예에서, 본원에서 생산된 항체 단백질은 추가의 검정 및 용도를 위해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 다음 절차는 적절한 정제 절차의 예시이다: 면역친화도 컬럼 또는 이온-교환 컬럼을 이용한 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, DEAE와 같은 양이온 교환 수지 또는 실리카를 이용한 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 Sephadex G-75를 사용하는 겔 여과.
일 양태에서, 고상으로 고정된 단백질 A가 본 발명의 항체 생성물의 면역 친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 황색포도구균의 41 kD 세포벽 단백질로서, 항체의 Fc 영역에 높은 친화도로 결합한다. Lindmark 등의 문헌[(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13] 참조. 단백질 A가 고정되는 고상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 또는 제어된 기공 유리 컬럼, 또는 규산 컬럼일 수 있다. 일부 응용예에서, 컬럼은 글리세롤과 같은 제제로 코팅되어, 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 전술한 바와 같은 세포 배양물으로부터 유래된 제제를 고상에 고정된 단백질 A 상에 도포하여, 관심 항체를 단백질 A에 특이적으로 결합시킬 수 있다. 그런 다음, 고상을 세척하여 고상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거하게 된다. 마지막으로, 관심 항체는 용리에 의해 고상으로부터 회수한다.
10. 진핵 생물 숙주 세포를 사용하여 결합 단백질 생성하기
진핵 생물 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 일반적으로 다음의 비제한적인 성분 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
a) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것일 수 있다. 포유류 세포 발현의 경우, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호를 이용할 수도 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임에서 항체를 암호화하는 DNA에 연결된다.
b) 복제의 기원
일반적으로, 복제 기원 성분은 포유류 발현 벡터의 경우 필요하지 않다. 예를 들어, 일반적으로는 SV40 기점이 유일하게 사용될 수 있는데, 이는 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택성 표지로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련 있는 경우, 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 절차의 일 예는 약물을 사용해 숙주 세포의 성장을 정지시키는 것이다. 이종 유전자로 성공적으로 형질변환된 이들 세포는 약물 내성을 부여함으로써 선택 요법으로부터 살아남는 단백질을 생산한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산, 및 히그로마이신을 사용하는 것이다.
포유류 세포에 대한 적절한 선택성 마커의 또 다른 예는 핵산을 암호화하는 항-CTLA4 결합 단백질을 흡수할 수 있는 세포를 식별할 수 있게 하는 것들, 예컨대, DHFR, 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나아제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, DHFR 선택 유전자로 형질변환된 세포는 DHFR의 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)가 담긴 배양 배지에서 모든 형질변환체를 배양함으로써 먼저 식별된다. 일부 구현예에서, 야생형 DHFR이 사용될 때의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다(예: ATCC CRL-9096).
대안적으로, 항-CTLA4 결합 단백질, 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라아제(APH)와 같은 또 다른 선택성 마커를 암호화하는 DNA 서열로 형질변환되었거나 공동-형질변환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제(예: 네카마이신, 네오마이신, 또는 G418)과 같은 선택성 마커에 대한 선택제를 함유하는 배지에서 세포를 성장시킴으로써 선택될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호 참조. 숙주 세포는 글루타민 합성효소(GS)가 결핍된 세포주를 포함하는 NS0을 포함할 수 있다. 포유류 세포에 대한 선택성 마커로서 GS를 사용하는 방법은 미국 특허 제5,122,464호 및 미국 특허 제5,891,693호에 기술되어 있다.
d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고, 관심 항-CTLA4 결합 단백질을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵 생물에 대해 알려져 있다. 예를 들어, 사실상 모든 진핵 생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기만큼 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사가 시작되는 부위로부터 70 내지 80개 염기만큼 상류에 서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있는데, 이는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 첨가하기 위한 신호일 수 있다. 특정 구현예에서, 이들 서열 중 어느 하나 또는 전부는 진핵 생물 발현 벡터 내에 적절히 삽입될 수 있다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 유인원 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터; 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이종 포유류 프로모터로부터; 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 조절되며, 단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 호환될 수 있어야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, SV40 바이러스의 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 거대세포바이러스의 극 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 기술되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기술되어 있다. 단순 포진 바이러스 유래의 티미딘 키나아제 프로모터의 조절 하에 쥣과 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현을 기술하는 Reyes 등의 문헌[Nature 297:598-601 (1982)]도 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
e) 인핸서 요소 성분
본 발명의 항체를 암호화하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터 내에 삽입함으로써 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열이 이제 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 생물 세포 바이러스 유래의 인핸서를 사용하게 된다. 예로는 복제 기원의 후기 측에 있는 SV40 인핸서(bp 100~270), 인간 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 쥣과 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 생물 프로모터를 활성화하기 위한 인핸서 요소를 기술하는 Yaniv의 문헌[Nature 297:17-18 (1982)]도 참조한다. 인핸서는 항체 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.
f) 전사 종결 성분
진핵 생물 숙주 세포에 사용된 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 생물의 5' 미번역 영역 및, 드물게는 3' 미번역 영역으로부터 이용할 수 있고, 바이러스 DNA 또는 cDNA로부터 이용할 수 있다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 동 문헌에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
g) 숙주 세포의 선택 및 형질변환
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하여, 본원에 기술된 고등 진핵 생물 세포를 포함한다. 배양물(조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 전파가 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝한 293 또는 293 세포, Graham 등의 문헌[J. Gen Virol. 36:59 (1977)] 참조); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)] 참조); 쥣과 세르톨리 세포(TM4, Mather의 문헌[Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)] 참조); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 쥣과 유방암 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather 등의 문헌[Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)] 참조); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포(Hep G2) 등이다.
항-CTLA4 결합 단백질 생산을 위해, 전술한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 숙주 세포를 형질 변환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질 변환체를 선택하거나, 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭시키기 위해 적절히 변형된 종래의 영양 배지에서 배양한다.
h) 숙주 세포 배양
본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질을 생산하는 데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 추가로, Ham 등의 문헌[Meth. Enz. 58:44 (1979)], Barnes 등의 문헌[Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 재4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 30,985에 관한 미국 특허에 기술된 배지들 중 어느 하나가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 하나는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, GENTAMYCIN?? 약물), 미량 요소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 보충제가 당업자에게 알려지게 될 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다.
결합 단백질의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항-CTLA4 결합 단백질은 세포 내에서 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 어느 하나인 미립자 부스러기를 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 항-CTLA4 결합 단백질이 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용해 먼저 농축할 수 있다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위한 전술한 단계 중 어느 하나에 포함될 수 있고, 외래성 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조한 항체 조성물은, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있는데, 여기서 친화성 크로마토그래피가 편리한 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는 데 사용될 수 있다(Lindmark 등의 문헌[J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983)] 참조). 단백질 G는 모든 쥣과 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다(Guss 등의 문헌[EMBO J. 5:15671575(1986)] 참조). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스를 이용할 수도 있다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같이 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX?? 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 컬럼을 이용한 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카을 이용한 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예: 폴리아스파르트산 컬럼)를 이용하는 헤파린 SEPHAROSE?? 크로마토그래피를 이용한 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전 등도 회수 대상 항체에 따라 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 결합 단백질 및 오염물이 포함된 혼합물을 대상으로, 예를 들어, 약 2.5~4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용해 저염 농도(예를 들어, 약 0~0.25M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가 정제를 수행할 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 다양한 방법론이 당업계에 잘 확립되어 있는데, 이는 전술한 방법론과 일치하고/하거나 특정 관심 항체에 대해 적절한 것으로 당업자에 의해 간주된다.
IV. 조성물
일부 양태에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질 중 어느 하나를 포함하는 조성물(예: 약학적 조성물)이 또한 본원에 제공된다.
치료 제형은 원하는 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관용으로 제조된다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Philadelphia., Palphia. 2000 참조). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충액, 아스코르브산을 포함하는 항산화제, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨; 보존제, 등장화제, 안정화제, 금속 복합체(예: Zn-단백질 복합체); EDTA와 같은 킬레이트제, 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
완충액은 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 조절하는데 사용될 수 있으며, 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 사용될 수 있다. 완충액은 약 20 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산과 이의 염 모두를 포함한다. 예를 들어, 시트르산염, 인산염, 숙신산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 글루코네이트, 옥살레이트, 락트산염, 아세테이트 등이다. 추가적으로, 완충액은 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스로 구성될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 방지하기 위해 첨가될 수 있고, 일반적으로 약 0.2% 내지 1.0%(w/v)의 범위로 존재한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 할로겐화물(예: 염화물, 브롬화물, 요오드화물), 벤제토늄 염화물; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸을 포함한다.
때때로 "안정화제"로 알려진 등장성 제제는 조성물 중 액체의 등장성을 조절하거나 유지하기 위해 존재할 수 있다. 단백질 및 항체와 같은 크고 하전된 생체 분자와 함께 사용될 때, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용할 수 있고, 이에 따라 분자간 및 분자 내 상호작용의 가능성을 감소시킬 수 있기 때문에 종종 "안정화제"로 불린다. 등장성 제제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 약 0.1중량% 내지 약 25중량% 또는 약 1 내지 약 5중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 등장성 제제는 다가 당 알코올, 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가 부형제는 다음 중 하나 이상의 역할을 할 수 있는 제제를 포함한다: (1) 벌크화제, (2) 용해도 증강제, (3) 안정화제, 및 (4) 변성 또는 용기 벽 접착 방지제. 이러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가당 알코올(위에서 열거됨); 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등과 같은 아미노산; 유기당 또는 수크로오스와 같은 당 알코올, 락토오스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노오스, 소르보오스, 크실로스, 리보오스, 리비톨, 미오니시토오스, 미오이니시톨, 갈락토오스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨(예: 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티오크산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤, 및 티오황산나트륨; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라,틴 또는 다른 면역글로불린과 같은 저 분자량 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 단당류(예: 크실로스, 만노오스, 과당, 포도당; 이당류(예: 락토오스, 말토오스, 수크로오스); 라피노오스와 같은 삼당류; 및 덱스트린 또는 덱스트란과 같은 다당류.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려짐)는, 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 야기하지 않고 제형이 전단 표면 응력에 노출될 수 있게 하는, 교반-유도 응집으로부터 치료 단백질을 보호할 뿐만 아니라 치료제를 용해시키는 것을 돕기 위해 존재할 수 있다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml 또는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재한다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 0.1% w/v 또는 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v 또는 약 0.01% 내지 약 0.025% w/v의 범위로 존재한다.
적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188, 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스, 및 카복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 다이옥틸 소듐 설포숙시네이트, 및 다이옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토늄을 포함한다.
제형이 생체 내 투여에 사용되기 위해서는 멸균 상태여야 한다. 제형은 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 가가진 용기, 예를 들어, 정맥주사액 주머니 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가진 바이알 내에 담길 수 있다.
투여 경로는 알려지고 허용된 방법에 따르며, 예를 들어, 적절한 방식으로 장기간에 걸쳐 한 번 또는 여러 번 투여되는 볼루스 또는 주입에 의한다. 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내, 또는 관절내 경로로, 국소 투여, 흡입에 의하거나, 서방형 또는 지연 방출형 수단에 의해 투여된다.
본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 단독으로 사용되거나, 예컨대 본원에 기술된 방법에서 다른 치료제와 병용으로 사용될 수 있다. 용어 "병용(in combination with)"는 둘 이상의 치료제(예: 항-CTLA4 결합 단백질 및 치료제)가 동일하거나 별도의 제형에 포함되는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, "병용" 투여는 "동시" 투여를 지칭하며, 이 경우, 본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질의 투여는 하나 이상의 추가 치료제의 투여와 동시에 (예를 들어, 항-CTLA4 결합 단백질의 투여(들)와 하나 이상의 추가 치료제의 투여가 동시에, 또는 1시간 이내의 간격으로) 이루어진다. 일부 구현예에서, "병용"은 순차적 투여를 지칭하며, 이 경우, 본 발명의 항-CTLA4 결합 단백질의 투여는 하나 이상의 추가 치료제의 투여 이전 및/또는 이후에 발생한다(예를 들어, 항-CTLA4 결합 단백질의 투여(들)와 하나 이상의 추가 치료제의 투여 사이의 간격이 1시간을 초과함). 본원에서 고려되는 제제는 세포독성제, 사이토카인, 면역 관문 분자 표적화제, 면역 자극 분자를 표적화제, 또는 성장 억제제를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원의 제형은 필요에 따라 치료되는 특정 적응증을 위한 둘 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 세포독성제, 사이토카인, 면역 관문 분자 또는 자극 분자 표적화제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다.
V. 치료 방법
대상체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 또는 이의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체(예를 들어, 인간 환자)는 신생물 장애(예를 들어, 암)로 진단받았거나 이러한 장애의 발생 위험이 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 활성제의 적절한 투여량은, 위에서 정의된 바와 같이, 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 제제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 대상체의 병력 및 제제에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 제제는 한 번에 대상체에게 투여되거나 일련의 치료 과정에 걸쳐 적절히 투여된다. 본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여 사이의 간격은 약 1개월 이상이다. 일부 구현예에서, 투여 사이의 간격은 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월 또는 그 이상이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 투여 사이의 간격은 항체의 1회 투여와 항체의 다음 투여 사이의 기간을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약 1개월의 간격은 4주를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 사이의 간격은 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 8주, 약 12주, 약 16주, 약 20주, 약 24주 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 치료는 항체의 다회 투여를 포함하되, 투여 사이의 간격은 달라질 수 있다. 예를 들어, 제1 투여와 제2 투여 사이의 간격은 약 1개월이고, 후속 투여들 사이의 간격은 약 3개월이다. 일부 구현예에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 간격은 약 1개월이고, 제2 투여와 제3 투여 사이의 간격은 약 2개월이고, 후속 투여들 사이의 간격은 약 3개월이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 균일 투여량(flat dose)으로 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있으며, 투여는 예를 들어, 1회 이상 별도로 투여되거나, 연속 주입될 수 있다. 하나의 통상적인 일일 투여량은 전술한 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 병태에 따라 수 일에 걸쳐 또는 더 이상 반복 투여되는 경우, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 투여량 당 약 25 mg 내지 약 500 mg의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 1.0 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 약 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 또는 10.0 mg/kg 중 어느 하나의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 전술한 투여 빈도 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
본원에 고려되는 치료 방법은 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)로 장애 또는 질환을 치료하는 것이다. 본 발명의 제형으로 치료 가능한 장애 또는 질환은 백혈병, 림프종, 두경부암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경아세포종, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암(예를 들어, 메르켈 세포 암종) 또는 고환암을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 신경내분비 종양, 암종 및 육종을 포함하여, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 본원에서 제공된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 약학적 조성물, 또는 방법으로 치료할 수 있는 예시적인 암은 림프종, 육종, 방광암, 골암, 뇌 종양, 자궁경부암, 대장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 골수종, 갑상선암, 백혈병, 전립선암, 유방암(예: 삼중 음성, ER 양성, ER 음성, 화학요법 내성, 허셉틴 내성, HER2 양성, 독소루비신 내성, 타목시펜 내성, 담관 암종, 소엽 암종, 일차, 전이성), 난소암, 췌장암, 간암(예: 간세포 암종), 폐암(예: 비소세포 폐암, 편평 세포 폐암증, 선암종, 대세포 폐암종, 소세포 폐암종, 카르시노이드, 육종), 다형성 교아종, 신경교종, 흑색종, 전립선암, 거세 저항성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 교아세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종(예를 들어, 머리, 목, 또는 식도), 결장직장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, 또는 다발성 골수종을 포함한다. 추가적인 예는 다음을 포함한다: 갑상선암, 내분비계암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 식도암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 또는 속질모세포종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 신경교종, 다형성 교아종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장성 백반증, 악성 유암종, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 또는 외분비 췌장의 신생물, 갑상선 수질암, 갑상선 수질 암종, 흑색종, 대장암, 유두상 갑상선암, 간세포 암종, 유두의 파제트병, 엽상 종양, 소엽 암종, 담관 암종, 췌장 성상 세포의 암, 간성상 세포의 암, 또는 전립선암.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 백혈병을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 용어 "백혈병"은 혈액 형성 기관의 진행성 악성 질환을 광범위하게 지칭하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 이의 전구체의 왜곡된 증식 및 발생을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 다음을 기준으로 임상적으로 분류된다: (1) 질환의 기간과 특성 - 급성 또는 만성; (2) 관련 세포의 유형; 골수(골수성), 림프(림프성), 또는 단핵구성; 및 (3) 혈액에서 비정상적인 세포 수의 증가 또는 비증가를 - -백혈병성 또는 비백혈병성(준백혈병성). 본원에서 제공된 화합물, 약학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 백혈병은, 예를 들어, 급성 비림프구성 백혈병 (acute nonlymphocytic leukemia), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia), 급성 과립구성 백혈병 (acute granulocytic leukemia), 만성 과립구성 백혈병 (chronic granulocytic leukemia), 급성 전골수성 백혈병 (acute promyelocytic leukemia), 성인 T-세포 백혈병 (adult T-cell leukemia), 무백혈병성 백혈병 (aleukemic leukemia), 백혈구병성 백혈병 (leukocythemic leukemia), 호염기성 백혈병 (basophilic leukemia), 아세포 백혈병 (blast cell leukemia), 소 백혈병 (bovine leukemia), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelocytic leukemia), 피부 백혈병 (leukemia cutis), 배아 백혈병 (embryonal leukemia), 호산구성 백혈병 (eosinophilic leukemia), 그로스 백혈병 (Gross' leukemia), 모양세포 백혈병 (hairy-cell leukemia), 성혈세포성 백혈병 (hemoblastic leukemia), 혈구아세포성 백혈병 (hemocytoblastic leukemia), 조직구성 백혈병 (histiocytic leukemia), 줄기세포 백혈병 (stem cell leukemia), 급성 단구성 백혈병 (acute monocytic leukemia), 백혈구 감소성 백혈병 (leukopenic leukemia), 림프구성 백혈병 (lymphatic leukemia), 림프아세포 백혈병 (lymphoblastic leukemia), 림프모구 백혈병 (lymphocytic leukemia), 림프행성 백혈병 (lymphogenous leukemia), 림프구성 백혈병 (lymphoid leukemia), 림프육종 세포 백혈병 (lymphosarcoma cell leukemia), 비만세포 백혈병 (mast cell leukemia), 거대핵세포 백혈병 (megakaryocytic leukemia), 미세골수아구성 백혈병 (micromyeloblastic leukemia), 단구성 백혈병 (monocytic leukemia), 골수아구 백혈병 (myeloblastic leukemia), 골수성 백혈병 (myelocytic leukemia), 골수 과립구성 백혈병 (myeloid granulocytic leukemia), 골수단구성 백혈병 (myelomonocytic leukemia), 네겔리 백혈병 (Naegeli leukemia), 형질세포 백혈병 (plasma cell leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 형질구성 백혈병 (plasmacytic leukemia), 전골수성 백혈병 (promyelocytic leukemia), 리더 세포 백혈병 (Rieder cell leukemia), 쉴링 백혈병 (Schilling's leukemia), 줄기세포 백혈병 (stem cell leukemia), 아백혈병성 백혈병(subleukemic leukemia), 또는 미분화 세포 백혈병 (undifferentiated cell leukemia)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 육종을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 용어 "육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 이루어진 종양을 지칭하며, 일반적으로 원섬유성 물질 또는 균질 물질에 매립된 밀접하게 채워진 세포로 구성된다. 본원에서 제공된 화합물, 약학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 육종은 연골육종 (chondrosarcoma), 섬유육종 (fibrosarcoma), 림프육종 (lymphosarcoma), 흑색육종 (melanosarcoma), 점액육종 (myxosarcoma), 골육종 (osteosarcoma), 아베메티 육종 (Abemethy's sarcoma), 지방조직 육종 (adipose sarcoma), 지방육종 (liposarcoma), 포상연부 육종 (alveolar soft part sarcoma), 법랑아 육종 (ameloblastic sarcoma), 포도상형 육종 (botryoid sarcoma), 녹색종 육종 (chloroma sarcoma), 융모막 암종 (chorio carcinoma), 배아 육종 (embryonal sarcoma), 빌름스 종양 육종 (Wilms' tumor sarcoma), 자궁내막 육종 (endometrial sarcoma), 간질 육종 (stromal sarcoma), 유잉 육종 (Ewing' s sarcoma), 근막 육종 (fascial sarcoma), 섬유아세포 육종 (fibroblastic sarcoma), 거대 세포 육종 (giant cell sarcoma), 과립구성 육종 (granulocytic sarcoma), 호지킨 육종 (Hodgkin's sarcoma), 특발성 다발성 색소출혈성 육종 (idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma), B 세포의 면역아세포성 육종 (immunoblastic sarcoma of B cells), 림프종 (lymphoma), T-세포의 면역아세포성 육종 (immunoblastic sarcoma of T-cells), 젠센 육종 (Jensen's sarcoma), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 쿠퍼 세포 육종 (Kupffer cell sarcoma), 혈관육종 (angiosarcoma), 백혈구육종 (leukosarcoma), 악성 간엽 육종 (malignant mesenchymoma sarcoma), 방골성 육종 (parosteal sarcoma), 망상세포 육종 (reticulocytic sarcoma), 라우스 육종 (Rous sarcoma), 혈청세포 육종 (serocystic sarcoma), 활막 육종 (synovial sarcoma), 또는 모세혈관확장성 육종 (telangiectaltic sarcoma)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 흑색종을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 용어 "흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포 계통에서 발생하는 종양을 의미하는 것으로 간주된다. 본원에 제공된 화합물, 약학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 흑색종은, 예를 들어, 선단 흑자성 흑색종 (acral-lentiginous melanoma), 무멜라닌성 흑색종 (amelanotic melanoma), 양성 소아 흑색종 (benign juvenile melanoma), 클라우드만 흑색종 (Cloudman's melanoma), S91 흑색종 (S91 melanoma), 하딩-파세이 흑색종 (Harding-Passey melanoma), 소아 흑색종 (juvenile melanoma), 악성 흑색점 흑색종 (lentigo maligna melanoma), 악성 흑색종 (malignant melanoma), 결절성 흑색종 (nodular melanoma), 손톱밑 흑색종 (subungual melanoma), 또는 표재 확장성 흑색종 (superficial spreading melanoma)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 암종을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 용어 "암종"은 주변 조직에 침윤하여 전이를 유발하는 경향이 있는 상피 세포로 이루어진 악성 신규 성장물을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 약학적 조성물, 또는 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 암종은 예를 들어 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 가족성 갑상선 수질 암종(familial medullary thyroid carcinoma), 선방 암종(acinar carcinoma), 선방상 암종(acinous carcinoma), 선낭성 암종(adenocystic carcinoma), 샘낭 암종(adenoid cystic carcinoma), 암종 선암종(carcinoma adenomatosum), 부신 피질의 암종(carcinoma of adrenal cortex), 포상 암종(alveolar carcinoma), 포상 세포 암종(alveolar cell carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma, carcinoma basocellulare), 기저세포모양 암종(basaloid carcinoma), 기저편평 세포 암종(basosquamous cell carcinoma), 세기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 세기관지 암종(bronchiolar carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 대뇌모양 암종(cerebriform carcinoma), 담관세포 암종(cholangiocellular carcinoma), 융모막 암종(chorionic carcinoma), 콜로이드 암종(colloid carcinoma), 면포형 암종(comedo carcinoma), 체부 암종(corpus carcinoma), 사상형 암종(cribriform carcinoma), 흉부 갑옷 암종(carcinoma en cuirasse), 피각 암종(carcinoma cutaneum), 원통 암종(cylindrical carcinoma), 원통 세포 암종(cylindrical cell carcinoma), 관 암종(duct carcinoma), 경성 암종(carcinoma durum), 배아 암종(embryonal carcinoma), 뇌양 암종(encephaloid carcinoma), 표피양 암종(epiermoid carcinoma), 선양 상피성 암종(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 암종(exophytic carcinoma), 궤양성 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유성 암종(carcinoma fibrosum), 젤라틴형 암종(gelatiniforni carcinoma), 교양성 암종(gelatinous carcinoma), 거대 세포 암종(giant cell carcinoma, carcinoma gigantocellulare), 샘 암종(glandular carcinoma), 과립막 세포 암종(granulosa cell carcinoma), 모기질 암종(hair-matrix carcinoma), 간세포양 암종(hematoid carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 허들 세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 유리질 암종(hyaline carcinoma), 유부신종 암종(hypernephroid carcinoma), 소아형 배아 암종(infantile embryonal carcinoma), 제자리 암종(carcinoma in situ), 표피내 암종(intraepidermal carcinoma), 상피내 암종(intraepithelial carcinoma), 크롬페쳐의 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨치스키-세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 대세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체양 암종(carcinoma lenticulare), 지방종성 암종(lipomatous carcinoma), 소엽성 암종(lobular carcinoma ), 림프상피 암종(lymphoepithelial carcinoma), 수양 암종(carcinoma medullare), 유두상 암종(medullary carcinoma), 색소세포성 암종(melanotic carcinoma), 흑색 암종(carcinoma molle), 점액성 암종(mucinous carcinoma), 점액분비 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 점액 암종(carcinoma mucosum, mucous carcinoma), 점액종중 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 귀리 세포 암종(oat cell carcinoma), 골화성 암종(carcinoma ossificans), 유골 암종(osteoid carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 문맥주위 암종(periportal carcinoma), 전침윤 암종(preinvasive carcinoma), 가시 세포 암종(prickle cell carcinoma), 풀모양 암종(pultaceous carcinoma), 신장의 신세포 암종(renal cell carcinoma of kidney), 예비 세포 암종(reserve cell carcinoma), 육종성 암종(carcinoma sarcomatodes), 슈나이더 암종(schneiderian carcinoma), 섬유질 암종(scirrhous carcinoma), 음낭 암종(carcinoma scroti), 인환 세포 암종(signet-ring cell carcinoma), 단순 암종(carcinoma simplex), 소세포 암종(small-cell carcinoma), 솔라노이드 암종(solanoid carcinoma), 구상 세포 암종(spheroidal cell carcinoma), 방추 세포 암종(spindle cell carcinoma), 해면양 암종(carcinoma spongiosum), 편평 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 스트링 암종(string carcinoma), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectaticum, carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma), 결절성 암종(carcinoma tuberosum, tuberous carcinoma), 세관 암종(tubular carcinoma), 우상 암종(verrucous carcinoma), 또는 융모상 암종(carcinoma villosum)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예: 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여에 의해 전이성 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전이", "전이성", 및 "전이성 암"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 신생물 질환 또는 장애(예: 암)가 하나의 기관 또는 또 다른 비인접 기관 또는 신체 부위로부터 확산되는 것을 지칭한다. 암은 기원 부위(예: 유방)에서 발생하는데, 이 부위는 원발성 종양(예: 원발성 유방암)으로 지칭된다. 원발성 종양 또는 기원 부위의 일부 암세포는 국소 영역에서 주변 정상 조직을 침투 및 침윤하는 능력 및/또는 시스템을 통해 신체 내 다른 부위 및 조직으로 순환하는 림프계 또는 혈관계의 벽을 침투하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암세포로부터 형성된 제2 임상적으로 검출 가능한 종양은 전이성 또는 이차 종양으로 지칭된다. 암세포가 전이될 때, 전이성 종양 및 이의 세포는 원래 종양의 것과 유사한 것으로 추정된다. 따라서, 폐암이 유방으로 전이되면, 유방 부위의 이차 종양은 비정상적인 폐 세포로 구성되고 비정상적인 유방 세포로 구성되지 않는다. 유방 내 이차 종양은 전이성 폐암으로 지칭된다. 따라서, 전이성 암이라는 문구는 대상체가 원발성 종양을 갖거나 가졌고 하나 이상의 이차 종양을 갖는 질환을 지칭한다. 비전이성 암 또는 전이성이 아닌 암을 가진 대상체라는 문구는 대상체가 원발성 종양을 가지지만 하나 이상의 이차 종양을 가지지 않는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 전이성 폐암은 원발성 폐 종양을 앓고 있거나 병력이 있고, 제2 위치 또는 다수의 위치에서, 예를 들어 유방에서, 하나 이상의 이차 종양을 가진 대상체에서의 질환을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CTLA4 결합 단백질에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애는 CTLA4 또는 CTLA4 활성 또는 기능에 의해 (전적으로 또는 부분적으로) 야기된 질환(예: 당뇨병, 암(예: 전립선암, 신장암, 전이성 암, 흑색종, 거세 저항성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 교아세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종(예를 들어, 머리, 목, 또는 식도), 결장직장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, 또는 다발성 골수종)), 또는 CTLA4 또는 CTLA4 활성 또는 기능에 의해 (전적으로 또는 부분적으로) 야기된 질환의 증상을 포함한다.
VI. 제조 물품 또는 키트
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 제조 물품 또는 키트는 본 발명의 방법에서 결합 단백질을 사용하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 개체에서 장애(예: 암)를 치료하거나 예방하기 위한 방법에서 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 사용하기 위한 지침을 포함하며, 상기 방법은 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 개체는 백혈병, 림프종, 두경부암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경아세포종, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암, 또는 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는다.
제조 물품 또는 키트는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알(예를 들어, 이중 챔버 바이알), 주사기(예를 들어, 단일 또는 이중 챔버 주사기), 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기에는 제형이 담긴다. 일부 구현예에서, 제형은 동결 건조된 제형이다.
제조 물품 또는 키트는 용기 상에 있거나 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있는데, 이는 제형의 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 표시할 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제형이 개체에서 장애(예를 들어, 암)를 치료하거나 예방하는데 유용하다는 것, 또는 피하 투여, 정맥내 투여, 또는 다른 투여 방식을 위해 의도되었음을 추가로 나타낼 수 있다. 제형이 담기는 용기는 일회용 바이알이거나 재구성된 제형의 반복 투여를 허용하는 다회용 바이알일 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 적절한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 상업적, 치료적, 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이에는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 담긴 패키지 삽입물이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 단일 투여량-투여 단위용 키트를 제공한다. 이러한 키트는 치료 항체의 수성 제형의 용기를 포함하며, 이에는 단일 챔버형 또는 다중 챔버형 사전 충진된 주사기 둘 다가 포함된다. 예시적인 사전 충진된 주사기는 Vetter GmbH(Ravensburg, Germany)로부터 입수 가능하다.
본원의 제조 물품 또는 키트는 임의로 제2 의약이 포함된 용기를 추가로 포함하며, 여기서 항-CTLA4 결합 단백질(예를 들어, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 제1 의약이고, 상기 물품 또는 키트는 유효량의 제2 의약으로 대상체를 치료하기 위한 지침을 라벨 또는 패키지 삽입물 상에 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 자동 주사기 장치를 이용해 투여하기 위한 본원에 기술된 제형을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 본원에 제공된다. 자동 주사기는, 활성화 시, 환자 또는 투여자의 추가적인 필요한 조치 없이 그 내용물을 전달하게 되는 주사 장치로서 기술될 수 있다. 이들 장치는, 전달 속도가 일정해야 하고 전달 시간이 다소 길 때, 치료 제형의 자가 투약에 특히 적합하다.
예시적인 구현예
예시적인 구현예가 아래에 제공된다.
1. 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
a) VL 도메인은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
b) VL 도메인은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
c) VL 도메인은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
d) VL 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 구현예 1에 있어서,
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서,
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 구현예 7 또는 8에 있어서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E 또는 둘 다를 포함하고, 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 CH 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 CL 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 구현예 1 또는 12 중 어느 하나에 있어서:
a) 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스-결핍인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합되는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 구현예 17에 있어서, 제제는 튜불린 중합 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 구현예 17에 있어서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하거나;
a) VL 도메인은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
b) VL 도메인은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
c) VL 도메인은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
d) VL 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
21. 구현예 20에 있어서,
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. 구현예 20 또는 21에 있어서,
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하거나;
a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
25. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
26. 구현예 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
27. 구현예 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
28. 구현예 26 또는 27에 있어서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E 또는 둘 다를 포함하고, 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
29. 구현예 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 CH 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
30. 구현예 20 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
31. 구현예 20 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39의 CL 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
32. 구현예 20 내지 31 중 어느 하나에 있어서,
a) 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
33. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되; 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
34. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되; 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
35. 구현예 20 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스-결핍인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
36. 구현예 20 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합되는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
37. 구현예 36에 있어서, 제제는 튜불린 중합 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
38. 구현예 36에 있어서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
39. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산.
40. 구현예 39의 핵산을 포함하는 벡터.
41. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 39의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
42. 구현예 41에 있어서, 숙주 세포는 비푸코실화되거나 푸코오스 결핍인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산할 수 있는, 숙주 세포.
43. 구현예 41 또는 42에 있어서, 숙주 세포는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라아제(Fut8) 넉아웃을 갖는, 숙주 세포.
44. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스프라아제 III(GnT-III)을 과발현하는, 숙주 세포.
45. 구현예 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 골지 μ-만노시다아제 I(ManII)을 과발현하는, 숙주 세포.
46. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 구현예 41 내지 45 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 비푸코실화되었거나 푸코오스 결핍 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 구현예 42 내지 45 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
48. 구현예 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
49. 구현예 46 내지 48 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
50. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 조성물.
51. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
52. 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
53. 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서, 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
54. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
55. 대상체에서 신생물 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 20 내지 38 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 49의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 50 내지 52 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예
본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다. 본원에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 이에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고, 이는 본 출원의 사상과 범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1: CTLA4에 결합하는 항-CTLA4 항체의 시험관 내 특성 분석: 저밀도 항원 결합 ELISA 및 SPR
항-CTLA4 항체들 및 변이체들 간의 CTLA4 또는 FcγRIIIa(CD16a)에 대한 결합을 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다.
방법
항체
시험된 항체는 항체 1 및 항체 2로 명명된 인간화 항-CTLA4 항체, 및 이의 변이체/형태/버전을 포함한다. 특정 넘버링 체계에 따르면, 항체 1은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. Kabat 넘버링 체계에 따르면, 항체 1은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 특정 넘버링 체계에 따르면, 항체 2는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. Kabat 넘버링 체계에 따르면, 항체 2는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들어 Fc 도메인에서 특정 돌연변이를 함유하는 항체 1의 다양한 형태 또는 항체 1의 비푸코실화된 버전을 생성하여 평가하고, 이들 각각을 "항체 1-#"에 따라 명명하였고, 예를 들어 Fc 도메인에서 특정 돌연변이를 함유하는 항체 2의 다양한 형태 또는 항체의 비푸코실화된 버전을 생성하여 평가하고, 이들 각각을 "항체 2-#"에 따라 명명하였다.
ELISA
모든 ELISA는 아래의 설명과 실질적으로 유사한 방식으로 수행하거나 당업계에 공지된 방법과 전체적으로 일치하는 방식으로 수행하였다. 폴리스티렌 96-웰 마이크로플레이트(Fisher #07-200-591)를 웰 당 1 μg/mL의 인간 CTLA4-Fc(R&D #7268-CT)로 코팅하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 플레이트를 TBS 중 0.05% Tween(TBS-T)으로 세척하고, 1% BSA(Sigma Aldrich #B4287-25G)로 차단하고, TBS-T로 세척하였다. 아래에 기술된 항-CTLA4 항체를 함유하는 샘플의 연속 희석물을 검정 완충액(PBS + 0.05% Tween + 1% BSA) 중에서 만들고, 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 100 RPM에서 궤도 진탕하였다. TBS-T로 세척한 후, 검정 완충액 중에서 1:8000으로 희석된 항-인간 카파 경쇄[클론: SB81a]-HRP(Abcam #ab79115)를 웰에 도포하고 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 플레이트를 TBS-T로 세척하고, HRP 기질(Super Signal Pico 화학 발광 기질, Thermo #37069)을 플레이트에 도포하고, 분광광도계(BioTek)를 사용하여 발광을 기록하였다. 데이터를 GraphPad Prism으로 분석하였다.
SPR
모든 표면 플라스마 공명(SPR) 분석은 아래의 설명과 실질적으로 유사한 방식으로 수행하거나 당업계에 공지된 방법과 전체적으로 일치하는 방식으로 수행하였다. 항체 또는 이의 단편과 및 표적 단백질, 예컨대 인간 CTLA4(huCTLA4), 시노몰구스 CTLA4(cynoCTLA4), 또는 FcγRIIIa(CD16a) 간의 결합을 평가하기 위해 특정 항체를 대상으로 SPR을 수행하였다. 일부 연구에서, 인간 CTLA4에 대한 특정 항체, 예를 들어, 항체 2-6(Fc 영역에서 S239D 돌연변이, I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전) 및 항-CTLA4 항체 이필리무맙의 결합을 시험하기 위해서 SPR 분석을 수행하였다. 일부 연구에서, 재조합 인간 CTLA4(rhCTLA4)에 대한 특정 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 2 및 이필리무맙과 같은 항체의 Fab의 결합을 시험하기 위해 SPR 분석을 수행하였다. 일부 연구에서, cynoCTLA4-Fc에 대한 특정 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 2 및 이필리무맙과 같은 항체의 Fab의 결합을 시험하기 위해 SPR 분석을 수행하였다. SPR은 GE Biacore T200 기기를 이용해 37℃에서 수행하였다. 항체 및 이소형 대조군(기준 채널)을 100 RU 고정 수준에서 CM5 칩(GE Healthcare)에 결합시켰다. 펩티드를 합성하고 HBS-EP+ 영동 완충액(GE Healthcare)으로 희석하였다. 결합 데이터는 Biacore Evaluation Software 버전 3.0을 사용하여 분석하였다.
결과
ELISA
도 1a 및 도 1b는 ELISA에 의해 평가했을 때, 전술한 바와 같은 인간화 항-CTLA4 항체인 항체 1 및 항체 2 또는 이들의 변이체의 인간 CTLA-Fc에 대한 결합 연구의 결과를 보여준다. 도 1a는 야생형 Fc 영역을 갖는 항체 1의 버전(항체 1-1)과 Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 1의 버전(항체 1-2)의 인간 CTLA4-Fc에 대한 결합 간에는 검출 가능한 차이를 나타내지 않는다. 도 1b는 다음을 포함하는 다양한 형태의 항체 2의 CTLA4 결합을 비교한다: 야생형 Fc 영역을 갖는 항체 2의 버전(항체 2-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전(항체 2-2), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖고 2개의 힌지 영역 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전(항체 2-3), Fc 영역에서 S239D, I332E, 및 A330L 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전(항체 2-4), 및 Fc 영역에서 S239D, I332E, 및 A330L 돌연변이를 갖고 2개의 힌지 영역 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전(항체 2-5). 도 1b에 도시된 바와 같이, 모든 형태의 항체는 유사하게 인간 CTLA4-Fc에 결합하였다. 시험한 항체에 대한 평균 EC50 값은 아래 표 2에 제공되어 있다.
인간 CTLA4-Fc에 대한 항체 결합
항체 EC50 (nM) 2
R
항체 1-1 0.32 ± 0.01 0.9984
항체 1-2 0.32 ± 0.01 0.998
항체 2-1 0.44 ± 0.02 0.9978
항체 2-2 0.39 ± 0.01 0.9979
항체 2-3 0.40 ± 0.02 0.9967
항체 2-4 0.40 ± 0.02 0.9962
항체 2-5 0.41 ± 0.02 0.9968
도 1c 내지 도 1e는 ELISA에 의해 평가했을 때, 인간화 항-CTLA4 항체인 항체 1, 항체 2, 또는 이필리무맙, 또는 Fc 영역에 돌연변이를 함유한 이들의 변이체 또는 비푸코실화 버전의 인간 CTLA-Fc에 대한 결합 연구의 결과를 보여준다. 시험한 항체에 대한 평균 EC50 값은 각각의 도면에 제공되어 있다. 도 1c에서는 야생형 Fc 영역을 갖는 항체 1의 버전(항체 1-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 1의 버전(항체 1-2), 및 항체 1의 비푸코실화 버전(항체 1-aFuc)의 인간 CTLA4-Fc에 대한 결합 간에 검출 가능한 차이가 보이지 않는다. 도 1d에서는 야생형 Fc 영역을 갖는 항체 2의 버전(항체 2-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전(항체 2-6), 및 항체 2의 비푸코실화 버전(항체 2-aFuc)의 인간 CTLA4-Fc에 대한 결합 간에 검출 가능한 차이가 보이지 않는다. 도 1e에서는 야생형 Fc를 갖는 이필리무맙의 버전(이필리무맙), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 이필리무맙의 버전(이필리무맙-m), 및 이필리무맙의 비푸코실화 버전(이필리무맙-aFuc)의 인간 CTLA4-Fc에 대한 결합 간에 검출 가능한 차이가 보이지 않는다. 도 1c 내지 도 1e에 도시된 바와 같이, 항체 각각의 모든 변이체는 유사하게 인간 CTLA4-Fc에 결합하였다.
SPR
도 2a는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 항체 2-6(Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전) 또는 이필리무맙과 인간 CTLA4(huCTLA4) 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2b는 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 평형 해리 상수(KD), 및 항체 2-6과 이필리무맙 간의 배수 차이에 관한 도 2a에 도시된 결합 결과를 요약한 것이다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 항체 2-6은 91 pM의 KD를 갖는 반면, 이필리무맙은 1640 pM의 KD를 갖는데, 이는 KD에 의해 측정했을 때, 항체 2-6이 huCTLA4에 대해 이필리무맙보다 약 18배 더 큰 결합 친화도를 갖는다는 것을 입증한다. 항체 2-6과 cynoCTLA4 간의 결합에 대한 SPR 분석은 131 pM의 KD를 나타냈다.
도 2c는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 이필리무맙의 Fab(이필리무맙-Fab) 또는 항체 2의 Fab(항체 2-Fab)와 rhCTLA4-Fc 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2d는 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 평형 해리 상수(KD), 및 카이2 값에 관한 도 2c에 도시된 결합 결과를 요약한 것이다. 도 2d에 도시된 바와 같이, 이필리무맙-Fab는 4.74 nM 의 KD 값을 갖는 반면, 항체 2-Fab는 4.53 pM의 KD 값을 갖는데, 이는 KD에 의해 측정했을 때, 항체 2-Fab가 rhCTLA4-Fc에 대해 이필리무맙-Fab보다 훨씬 더 큰 결합 친화도를 갖는다는 것을 입증한다. rhCTLA4-Fc와 이필리무맙-Fab 또는 항체 2-Fab 중 어느 하나 간의 추가 결합 친화도 데이터가 아래 표 3에 제공되어 있는데, 이는 이필리무맙-Fab의 경우 평균 KD가 5.71 +/- 0.87 nM이고 항체 2-Fab의 경우 대한 평균 KD가 3.86 +/- 2.1 pM임을 보여준다.
채널 샘플 ka (1/(M*s)) kd (1/초) K D 카이2
Ch1 이필리무맙-Fab 2.45e+5 1.40e-3 4.74 nM 1.40
Ch2 이필리무맙-Fab 2.17e+5 1.40e-3 6.43 nM 4.83
Ch3 이필리무맙-Fab 2.18e+5 1.30e-3 5.97 nM 5.48
이필리무맙-Fab 5.71 +/- 0.87 nM
(평균)
Ch1 항체 2-Fab 3.61e+5 1.63e-6 4.53 pM 2.85
Ch2 항체 2-Fab 3.45e+5 5.19e-7 1.51 pM 1.66
Ch3 항체 2-Fab 3.31e+5 1.84e-6 5.55 pM 3.03
항체 2-Fab 3.86 +/- 2.1 pM
(평균)
도 2e는 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 및 2 nM에서 이필리무맙의 Fab(이필리무맙-Fab) 또는 항체 2의 Fab(항체 2-Fab)와 cynoCTLA4-Fc 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 도 2f는 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 평형 해리 상수(KD), 및 카이2 값에 관한 도 2e에 도시된 결합 결과를 요약한 것이다. 도 2f에 도시된 바와 같이, 이필리무맙-Fab는 28.6 nM 의 KD 값을 갖는 반면, 항체 2-Fab는 0.623 nM의 KD 값을 갖는데, 이는 KD의 측면에서, 항체 2-Fab가 cynoCTLA4-Fc에 대해 이필리무맙-Fab보다 훨씬 더 큰 결합 친화도를 갖는다는 것을 입증한다. cynoCTLA4-Fc와 이필리무맙-Fab 또는 항체 2-Fab 중 어느 하나 간의 추가 결합 친화도 데이터가 아래 표 4에 제공되어 있는데, 이는 이필리무맙-Fab의 경우 평균 KD가 23.1 +/- 6.3 nM이고 항체 2-Fab의 경우 대한 평균 KD가 0.779 +/- 0.15 nM임을 보여준다.
채널 샘플 ka (1/(M*s)) kd (1/초) K D 카이2
Ch1 이필리무맙-Fab 3.33e+5 9.51e-3 28.6 nM 1.97
Ch2 이필리무맙-Fab 3.66e+5 8.93e-3 24.4 nM 1.70
Ch3 이필리무맙-Fab 5.15e+5 8.37e-3 16.2 nM 1.61
이필리무맙-Fab 23.1 +/- 6.3 nM
(평균)
Ch1 항체 2-Fab 3.63e+5 2.26e-4 0.623 nM 2.30
Ch2 항체 2-Fab 2.89e+5 2.29e-4 0.794 nM 2.10
Ch3 항체 2-Fab 2.54e+5 2.34e-4 0.920 nM 1.49
항체 2-Fab 0.779 +/- 0.15 nM
(평균)
도 3은 다양한 농도에서 항체 2-1(야생형 Fc 영역을 갖는 항체 2의 버전), 항체 2-6(Fc 영역에서 S239D 돌연변이, I332E 돌연변이를 갖는 항체 2의 버전), 또는 이필리무맙과 인간 FcγRIIIa(CD16a) 간의 결합을 나타내는 SPR 분석의 결과를 보여준다. 동역학 및 친화도는 상기 결과를 기준으로 계산할 수 없었다.
실시예 2: 장독소 분석
포도상구균 장독소 B(SEB) 검정을 사용하여 말초 혈액 단핵구(PBMC)로부터 IL-2 생성을 촉진하는 다양한 항체의 능력을 조사하였다.
방법
SEB 검정
SEB 검정을 위해, 선택된 항체의 희석물을 미리 가온된 배지(RPMI + 10% 열 불활성화 FBS + 1% HEPES + 1% MEM NEAA + 1% 피루브산 나트륨)에서 제조하였다. 항체 용액을 3회 도말하고, 배지만을 "PBMC + SEB" 웰, "PBMC 단독" 웰, 및 외측 경계 벽에 첨가하였다. 미리 가온된 배지에서 SEB 용액을 제조하고, "PBMC 단독"을 제외한 모든 실험 웰에 첨가하였다. PBMC(BioIVT)를 37℃의 수조에서 해동하였다. 세포를 원뿔형 튜브에 적가하고, 미리 가온된 20x 배지를 첨가하여 세포를 세척하였다. 세포를 원심분리하고 배지를 흡인하였다. 세포를 20 mL의 미리 가온된 배지에 재현탁하고, 계수를 위해 분취하였다. 나머지 세포를 원심분리하고 세포를 1 x 106 세포/mL로 만들 수 있는 부피로 재현탁하였다. 세포를 웰 당 100 μL씩 도말하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 5일차에, 플레이트를 1000 RPM으로 5분 동안 회전시켰다. 각 웰로부터, 250 μL의 세포를 새로운 96 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 다시 회전시키고 225 μL의 세포를 PCR 스트립으로 옮겼다. ELISA로 분석하기 전까지 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
IL-2 ELISA
전술한 프로토콜을 사용하여 생산된 세포 상청액의 IL-2 수준을 인간 IL-2 ELISA MAX Deluxe 세트(BioLegend, Cat. #431806)로 분석하여 결정하였다. 세포 상청액 샘플이 표준 곡선 내에 포함되도록 검정 완충액으로 희석하였다.
샘플을 GraphPad Prism 및 Tukey의 다중 비교 검정(일원 ANOVA)을 사용해 분석하여 치료군들 간의 통계적 유의성을 결정하였다.
결과
다양한 형태의 항체 1 및 항체 2를 SEB 검정에서 시험하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 항체 1-1 또는 항체 1-2의 존재 하에 생산되었거나, 항체가 없을 때 생산된 IL-2의 수준을 보여주는 데이터가 도 4a에 도시되어 있다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 항체 2-1, 항체 2-2, 항체 2-3, 항체 2-4, 및 항체 2-5의 존재 하에 생산되었거나, 항체가 없을 때 생산된 IL-2의 수준을 보여주는 데이터가 도 4c에 도시되어 있다. 시험된 모든 항체는 항체가 없는 대조군과 비교했을 때 IL-2 수준을 증가시키는 능력을 입증하였다. 각 항체에 대한 항체가 없는 대조군 대비 IL-2 수준의 배수 증가는 이소형 대조군에 대한 비교와 함께 도 4b(항체 1 및 변이체의 경우) 및 도 4d(항체 2 및 변이체 경우)에 도시되어 있다.
다양한 버전의 항-CTLA4 항체 1[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 1-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 1-2), 및 항체 1의 비푸코실화 버전(항체 1-aFuc)], 항체 2[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 2-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 2-6), 및 항체 2의 비푸코실화 버전(항체 2-aFuc)], 또는 이필리무맙[야생형 Fc를 갖는 버전(이필리무맙), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(이필리무맙-m), 및 이필리무맙의 비푸코실화 버전(이필리무맙-aFuc)]을 이용한 SEB 검정의 유사한 평가 결과가 도 4e에 도시되어 있다. 결과는 Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체가 더 높은 IL-2 생성을 초래하였음을 보여주었다.
실시예 3: 항-CTLA4 항체에 의한 ADCC 활성
항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 유발하는 항-CTLA4 항체의 능력을 FcγRIIIa 리포터 생물검정을 사용하여 평가하였다.
방법
FcγRIIIa 리포터 생물검정
다양한 항-CTLA4 항체를 사용하여 FcγRIIIa 리포터 생물검정을 수행하였다. 항체를 미리 가온된 완전한 배지(RPMI1640이 포함된 FBS)에서 희석하였다. CTLA4 효과기 세포(표적 세포: Promega J158A)를 해동하고 완전한 배지가 담긴 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 혼합하여 계수하고, 세포의 밀도를 1 x 106 세포/mL로 조정하였다. 표적 세포를 96 웰 플레이트(Corning, Cat: #3917)의 각 웰에 첨가하였다. 희석된 항체를 적절한 웰에 첨가하고 2회 시험하였다. 각 웰의 내용물을 부드럽게 혼합하고 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 효과기 세포(FcγRIIIa 발현 Jurkat 세포)를 해동하고 완전한 배지가 담긴 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 혼합하여 계수하고, 세포의 밀도를 3 x 106 세포/mL로 조정하였다. 즉시, 작동자 세포를 각 웰에 분배하고 부드럽게 혼합하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 37℃에서 6시간 동안 방치하였다. 측정 1시간 전에, Bio-Glo 기질 및 Bio-Glo 완충액을 4℃에서 제거하였다. Bio-Glo 완충액을 Bio-Glo 기질이 담긴 병으로 옮겨 Bio-Glo 시약을 만들고, 뒤집어 가면서 부드럽게 혼합하였다. 병을 실온에서 유지시켰다. 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내서 10분 동안 실온에 방치하였다. Bio-Glo 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 발광분석기로 판독하였다.
시험된 항체에는 항-CTLA4 항체 1[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 1-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 1-2), 및 항체 1의 비푸코실화 버전(항체 1-aFuc)], 항체 2[야생형 Fc 영역을 갖는 버전(항체 2-1), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(항체 2-6), 및 항체 2의 비푸코실화 버전(항체 2-aFuc)], 또는 이필리무맙[야생형 Fc를 갖는 버전(이필리무맙), Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 버전(이필리무맙-m), 및 이필리무맙의 비푸코실화 버전(이필리무맙-aFuc)]을 포함시켰다.
결과
도 5a 내지 도 5d는 항체 1 변이체(도 5a), 항체 2 변이체(도 5b), 이필리무맙 변이체(도 5c), 및 모든 3개의 항체의 비푸코실화 버전(도 5d)에 대한 ADCC 리포터 생물검정으로부터의 리포터 활성화 곡선 및 EC50 값을 보여준다. 결과는 Fc 영역에서 S239D 돌연변이 및 I332E 돌연변이를 갖는 항체 및 비푸코실화 항체가 각각의 항체에 대한 야생형 Fc 영역을 갖는 각각의 버전에 비해 더 높은 활성화를 초래하였음을 보여주었다.
실시예 4. 인간 CTLA4 를 발현하는 종양 보유 마우스 모델을 대상으로 항-CTLA4 항체 투여 후 면역 세포의 생체 내 면역표현형 분석
면역 세포의 면역표현형은 인간 CTLA4 녹인을 통해 유전자 조작된 MC38 종양 보유 마우스 모델을 대상으로 다양한 항-CTLA4 항체를 투여한 후 결정하였다.
방법
인간 CTLA4를 유전자 주입(knock-in)한 마우스 모델 내에 MC38 세포(1 x 106)를 피하 주사하였다. 0일차에, 종양 부피 측정치를 기준으로 마우스를 무작위 배정하고 200 μg의 시험 항체(항체 2-1, 이필리무맙, 이필리무맙의 비푸코실화 형태(이필리무맙-aFuc), 또는 IgG 대조군을 1회 주사량을 복강내 주사하였다. 면역표현형 분석은 주사 후 5일차에 CD45+ 비장 세포 및 CD45+ 종양내 세포를 이용해 수행하였다. CD3+/ICOS+, CD3+ T 세포, CD4+/Ki67+, CD3+/Ki67+, CD4+/ICOS+, CD4+ T 세포, CD8+/ICOS+, CD8+ T 세포, Treg+/ICOS+, CD8+/Ki67+, Treg, Treg+/Ki67+를 포함하는 마커의 발현에 대해 CD45+ 세포를 평가하되, 이들 마커를 발현하는 CD45+ 세포의 상대 비율을 평가하였다.
결과
MC38 종양을 가진 CTLA4 넉인 마우스의 면역표현형 분석의 결과는 도 6a 내지 도 6d에 도시되어 있으며, 여기서 CD45+ 비장 세포의 상대 비율(도 6a 및 도 6b) 또는 CD45+ 종양내 세포의 상대 비율(도 6c 및 도 6d)이 CD3+/ICOS+, CD3+ T 세포, CD4+/Ki67+, CD3+/Ki67+, CD4+/ICOS+, CD4+ T 세포, CD8+/ICOS+, CD8+ T 세포, Tregs+/ICOS+, CD8+/Ki67+, Tregs, Tregs+/Ki67+에 대한 마커별로 제공되어 있다. 통계는 표 5(비장 세포) 및 표 6(종양내 세포)에 제공되어 있다: 1군: IgG, 2군: 항체 2-1; 4군: 이필리무맙; 5군: 이필리무맙-aFuc
바틀렛 ANOVA/
Kruskal		 1 대
2		 1 대
4		 1 대
5		 2 대
4		 2 대
5		 4 대
5
CD3+ICOS+ 0.11 0.10 0.48 0.16 0.82 0.10 0.65 0.14
CD3+KI67+ 0.25 0.18 0.70 0.23 0.94 0.13 0.78 0.22
CD3T세포 0.09 0.16 0.83 0.14 0.76 0.13 0.66 0.19
CD4+ICOS+ 0.14 0.19 0.18 0.41 0.41 0.14 0.48 0.24
CD4+KI67+ 0.13 0.00 0.01 0.88 0.05 0.05 0.31 0.15
CD4T세포 0.10 0.25 0.25 0.38 0.62 0.16 0.45 0.28
CD8+ICOS+ 0.01 0.22 0.33 0.05 0.54 0.18 1.00 0.24
CD8+KI67+ 0.50 0.29 0.27 0.08 0.44 0.26 0.87 0.27
CD8T세포 0.01 0.16 0.18 0.02 0.54 0.18 0.94 0.24
Treg 0.02 0.00 0.01 0.54 0.01 0.06 0.59 0.13
Treg+ICOS+ 0.03 0.00 0.00 0.08 0.00 0.06 0.59 0.13
Treg+KI67+ 0.04 0.01 0.01 0.93 0.02 0.09 0.82 0.13
바틀렛 ANOVA/
Kruskal		 1 대
2		 1 대
4		 1 대
5		 2 대
4		 2 대
5		 4 대
5
CD3+ICOS+ 0.00 0.03 0.08 0.09 0.03 0.66 0.79 0.24
CD3+KI67+ 0.00 0.10 0.08 0.31 0.24 0.18 0.66 0.31
CD3T세포 0.26 0.08 0.13 0.32 0.04 0.38 0.55 0.15
CD4+ICOS+ 0.02 0.05 0.05 0.18 0.09 0.18 0.93 0.18
CD4+KI67+ 0.00 0.02 0.01 0.18 0.18 0.05 0.79 0.31
CD4T세포 0.17 0.19 0.12 0.35 0.08 0.43 0.86 0.33
CD8+ICOS+ 0.14 0.03 0.11 0.26 0.04 0.31 0.39 0.09
CD8+KI67+ 0.00 0.09 0.05 0.13 0.04 0.43 0.79 0.39
CD8T세포 0.24 0.05 0.12 0.31 0.04 0.32 0.44 0.10
Treg 0.03 0.11 0.93 0.09 0.82 0.43 0.54 0.59
Treg+ICOS+ 0.03 0.02 0.54 0.02 0.04 0.54 0.79 0.70
Treg+KI67+ 0.00 0.06 0.01 0.09 0.18 0.13 1.00 0.48
실시예 5: 인간 CTLA4를 발현하는 종양 보유 마우스 모델에서 항-CTLA4 항체의 생체 내 종양 성장 억제
인간 CTLA4 넉인을 통해 유전자 조작된 MC38 종양 보유 마우스에게 다양한 항-CTLA4 항체를 투여한 후 종양 성장 억제 활성을 평가하였다.
인간 CTLA4 세포외 도메인 코딩 영역의 녹인을 함유하는 마우스 모델에게 MC38 세포(1 x 106)를 피하 주사하였다. 마우스에게 20 μg, 7 μg, 또는 2 μg의 시험 항체[항체 2-6, 이필리무맙, 이필리무맙의 비푸코실화 형태(이필리무맙-aFuc), 또는 Fc 도메인(RSV-m)에 S239D 및 I332E 돌연변이를 갖는 RSV 항체]를 1회 주사량으로 복강내 주사하였다. 시험 항체를 1회 주사한 후, 시간 경과에 따른 종양 부피를 측정하였다.
결과는 도 7a 내지 도 7d에 도시되어 있다. 도 7a(군 평균) 및 도 7b(개별 마우스)는 항체 2-6, 이필리무맙, 또는 이필리무맙의 비푸코실화 형태(이필리무맙-aFuc)가 주입된 마우스를 대상으로 시간 경과에 따른 종양 부피(mm3)를 보여주며, 결과는 시험된 모든 항체가 종양 성장 억제를 나타내는 것으로 나타났다. 도 7c(20 μg), 도 7d(7 μg) 및 도 7e(2 μg)는 각각의 투여량으로 상이한 항체를 투여한 후 시간 경과에 따른 종양 부피(mm3)를 비교하여 보여준다. 결과는 항체 2-6이 2 μg 및 7 μg 투여량에서 최상의 종양 성장 억제를 나타냈고, 이필리무맙의 투여량 20 μg에서와 유사한 종양 성장 억제를 나타냈다는 것을 보여주었다.
실시예 6: MB49 쥣과 방광 종양 모델에서 항-CTLA4 항체의 효능 및 약력학
방법
항-CTLA4 항체의 효능 및 약력학(PD)을 MB49 쥐 방광 종양 모델을 사용하여 평가하였다. 효능은 각각의 시험 항체(RSV-m 대조군 항체, 이필리무맙, 및 항체 2-6)를 투여한 다음 종양 부피 및 체중을 평가함으로써 평가하였다. 항-RSV 대조군 항체는 S239D 및 I332E 돌연변이를 함유한다(RSV-m 대조군 항체). 5일차에 말초 면역 표현형 분석도 수행하였는데, 이를 통해 투여 후 5일차에 말초 혈액에서 CD4+Ki67+ 세포의 백분율 및 CD4+ICOS+ 세포의 백분율을 평가하였다. 표 7에 나타낸 것과 같은 mg/kg 단위 투여량으로, 마우스를 효능 연구에 대해 평가하였다. 본원에서 사용되는 바와 같이, mg/kg 단위 투여량은 "mpk"로도 지칭된다. MB49 세포를 C57/BL6-huCTLA4 마우스에게 피하 접종하였다. 치료는 종양이 약 350 mm3에 도달했을 때 시작하였다. Dunnett 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA를 수행하여 대조군(RSV-m 대조군) 대비 치료의 통계적 유의성을 결정하였다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001.
코호트 항체 투여량 (mg/kg)
1 RSV-m 대조군 10
2 이필리무맙 0.3
3 이필리무맙 1
4 이필리무맙 3
5 항체 2-6 0.3
6 항체 2-6 1
7 항체 2-6 3
8 항체 2-6 10
약력학은 5개의 마우스 개 코호트 각각에게 표 8에 나타낸 것과 같은 투여량(mg/kg)으로 항체를 투여하여 평가한다. 종양, 간, 비장, 및 혈액을 대상으로 다른 판독 값 가운데서 면역 표현형 분석을 수행하였다. T 세포는 CD4+ 세포의 백분율로서 Foxp3+CD25+ 세포를 측정함으로써 평가하고, CD8+ 세포는 CD45+ 세포의 백분율로서 측정한다.
코호트 항체 투여량 (mg/kg)
1 RSV-m 대조군 10
2 이필리무맙 3
3 항체 2-6 3
결과
도 8a는 투여 후 5일차에 말초 혈액에서 CD4+Ki67+ 세포(좌측) 및 CD4+ICOS+ 세포(우측)의 백분율을 이용한 효능 연구의 결과를 보여주는데, 이는 T 세포 활성화의 수준을 나타낸다.
도 8에 도시된 바와 같이, 10 mg/kg(RSV-m 대조군) 또는 3 mg/kg(이필리무맙 또는 항체 2-6)으로 치료한 마우스를 대상으로 7일차에 종양 중량 및 CD8/Treg 비율을 평가하였다. 항체 2-6으로 치료한 마우스는 3 mg/kg에서 7일차에 가장 낮은 종양 중량 및 종양에서 더 높은 CD8/Treg 비율을 나타냈다. 체중, 비장 중량, 신장 중량 또는 간 중량에 있어서의 변화는 이들 치료군 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
도 8c에 도시된 바와 같이, 조절 T 세포 고갈 및 CD8+ T 세포 활성화는 항체 2-6에서 관찰되지만, 이필리무맙에서는 관찰되지 않는다.
도 8d에 도시된 바와 같이, 항-CTLA4 항체로 치료한 후 강력한 항종양 활성이 관찰되었다. 0.3 mg/kg의 투여량에서, 항체 2-6은 이필리무맙과 비교했을 때 우월한 항종양 활성을 나타냈다.
실시예 7: 시노몰구스 원숭이에서 항-CTLA4 항체의 생체 내 평가
항-CTLA4 항체의 약력학(PD) 효과를 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 상이한 두 세트의 실험에서, 시노몰구스 원숭이에게 이필리무맙, 항체 2-6, 또는 이소형 대조군을 투여하고, CD4+ 세포에서 Ki67+ 세포의 백분율(%)을 측정함으로써 약력학(PD) 효과를 평가하였다.
제1 및 제2 세트의 PD 실험의 결과는 도 9에 도시되어 있다. 이필리무맙과 비교했을 때 항체 2-6은, CD4+ 세포에서 Ki67+ 세포의 백분율 증가로 나타난 바와 같이, 말초 PD 효과를 유도하는 데 있어서 이필리무맙보다 더 강력하다.
10 mg/kg의 시험 항체(RSV-m 대조군, 이필리무맙, 또는 항체 2-6)를 정맥 내 투여한 후 시노몰구스 원숭이를 사용하여 약동학도 평가하였다. 혈장 내 각 항체의 수준을 측정하고, 반감기(일), Cmax(μg/mL), 곡선 아래 면적(AUC)(일* μg/mL)을 2개의 연구에서 결정하였다. 시험한 각 항체에 대한 약동학 연구의 반감기(일), Cmax(μg/mL), 및 곡선 아래 면적(AUC)(일* μg/mL) 결과를 계산하였다. 이필리무맙은 가장 긴 반감기와 가장 큰 AUC를 가졌다. 항체 2-6은 이필리무맙과 대략 동일한 Cmax를 가졌다.
SEQUENCE LISTING <110> AKREVIA THERAPEUTICS INC. KAROW, Margaret <120> ANTI-CTLA4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 73776-20025.40 <140> Not yet assigned <141> Concurrently herewith <150> US 62/785,111 <151> 2018-12-26 <160> 39 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 Antibody 1 <400> 1 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 Antibody 1 <400> 2 Leu Val Ser 1 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 Antibody 1 <400> 3 Val Gln Gly Thr His Asp Pro 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 Antibody 1 <400> 4 Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly Tyr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 Antibody 1 <400> 5 Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 Antibody 1 <400> 6 Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 7 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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 39 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain Constant Domain <400> 39 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (55)

  1. 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    a) VL 도메인은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    c) VL 도메인은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    d) VL 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E 또는 둘 다를 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 CH 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39의 CL 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서:
    a) 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스-결핍인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합되는, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 제제는 튜불린 중합 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제17항에 있어서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd인, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
    2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하거나;
    a) VL 도메인은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    c) VL 도메인은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나;
    d) VL 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고/하거나, VH 도메인은 (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서,
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
    2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 제1 쌍의 경쇄는 VL 도메인을 포함하고, 제1 쌍의 중쇄는 VH 도메인을 포함하거나;
    a) VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 35~38로 이루어진 군으로부터 선택된 CH 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, CH는 아미노산 치환 S239D 또는 I332E 또는 둘 다를 포함하고, 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 CH 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39의 CL 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
    2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되; 제1 쌍은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    1) CTLA4에 특이적으로 결합하는 제1 쌍의 경쇄 및 중쇄;
    2) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함하되; 제1 쌍은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비푸코실화되거나 푸코오스-결핍인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제제에 접합되는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제36항에 있어서, 제제는 튜불린 중합 억제제, DNA 손상제, 또는 DNA 합성 억제제인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제36항에 있어서, 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 칼리키마이신, 듀오카미신, 인도-리노벤조디아제핀 이량체, 또는 엑사테칸 유도체 Dxd인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  39. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산.
  40. 제39항의 핵산을 포함하는 벡터.
  41. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제39항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  42. 제41항에 있어서, 숙주 세포는 비푸코실화되거나 푸코오스 결핍인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산할 수 있는, 숙주 세포.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 숙주 세포는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라아제(Fut8) 넉아웃을 갖는, 숙주 세포.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스퍼라아제 III(GnT-III)을 과발현하는, 숙주 세포.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 골지 μ-만노시다아제 I(ManII)을 과발현하는, 숙주 세포.
  46. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 비푸코실화되었거나 푸코오스 결핍 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 조건 하에서 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  50. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 조성물.
  51. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  52. 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  53. 대상체에서 신생물 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물의 용도.
  54. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
  55. 대상체에서 신생물 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제49항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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