KR20210039983A - 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20210039983A
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안드레 로널드 왓슨
크리스티안 포스터
슈아일리앙 린
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리간달 인코포레이티드
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Abstract

다중 페이로드를 갖는 전달 비히클을 사용하는 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 전달 비히클은 (a) 세포의 게놈을 절단하는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 1개 이상의 핵산, (b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA (여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열 (예를 들어, attP 부위)을 생성함); (c) 부위-특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산) (예를 들어, ΦC31, ΦC31 RDF, Cre, FLP) (여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식함); 및 (d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 페이로드를 포함한다.

Description

게놈 편집을 위한 방법 및 조성물
상호-참조
본 출원은 2018년 4월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/661,992 및 2018년 6월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/685,240을 우선권 주장하며, 이들 가출원은 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서론
게놈 편집은 대부분의 상황에서 비효율적인 과정으로 남아있다. 부위 특이적 유전자 편집을 수행하기 위한 많은 기술이 존재하지만, 특히 생체내 전달을 고려할 때 부적절한 전달 기술에 의해 임상 해석이 방해받는다. 따라서, 효율적인 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법은 중요한 미충족 필요로 남아있다.
다중 페이로드를 갖는 전달 비히클을 사용하는 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상 방법은 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 전달 비히클은 (a) 세포의 게놈을 절단하는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TALEN, 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 절단 복합체, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질 - RNA-가이드 CRISPR/Cas 폴리펩티드 - 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1 (Cas12a), Cas13, MAD7 등) 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 [(a)는 본원에서 뉴클레아제 조성물로 지칭됨]; (b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA (여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열 (예를 들어, attP 부위)을 생성함) [(b)는 본원에서 표적 공여자 조성물로 지칭됨]; (c) 부위-특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산) (예를 들어, ΦC31, ΦC31 RDF, Cre, FLP) (여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식함) [(c)는 본원에서 레콤비나제 조성물로 지칭됨]; 및 (d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA [(d)는 본원에서 삽입 공여자 조성물로 지칭됨]를 포함하는 페이로드를 포함한다. (a), (b), (c) 및 (d)를 포함하는 전달 비히클은 부위-특이적 레콤비나제에 대한 1개 이상의 표적 부위의 삽입에 이어서 관심 뉴클레오티드 서열의 레콤비나제-매개 삽입에 의해 게놈 내로 큰 서열의 삽입을 용이하게 한다. 일부 경우에, 삽입된 관심 뉴클레오티드 서열 (삽입 공여자 조성물로부터의 것)은 10 킬로염기 쌍 (kbp) 이상 (예를 들어, 15 kbp 내지 100 kbp, 30 kbp 내지 100 kbp, 또는 50 kbp 내지 100 kbp) 이다.
일부 경우에, 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열 (예를 들어, 2개의 attP 부위의 삽입)을 생성한다. 일부 경우에, 뉴클레아제 조성물은 세포의 게놈을 2개의 위치에서 절단하고, 표적 공여자 조성물은 제1 공여자 DNA 중 2개를 포함하며, 이들 각각은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이에 의해 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열 (예를 들어, 2개의 attP 부위의 삽입)을 생성한다. 일부 경우에, 제2 공여자 DNA는 부위-특이적 레콤비나제에 대한 2개의 표적 서열 (예를 들어, attB 부위)을 포함하며, 여기서 2개의 표적 서열은 세포의 게놈 내로 삽입된 뉴클레오티드 서열에 플랭킹된다.
전달 비히클은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 내로 도입/세포에 전달될 수 있다. 동일한 전달 비히클 (예를 들어, 나노입자)의 일부로서 다중 페이로드를 전달하는 것의 한 이점은 각각의 페이로드의 효율이 희석되지 않는다는 것이다. 예시적인 예로서, 페이로드 A 및 페이로드 B가 2개의 개별 패키지/비히클 (각각 패키지 A 및 패키지 B)로 전달된다면, 효율은 곱셈되며, 예를 들어 패키지 A 및 패키지 B가 각각 1% 형질감염 효율을 갖는다면, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.01% (1% X 1%)이다. 그러나, 페이로드 A 및 페이로드 B가 둘 다 동일한 전달 비히클의 일부로서 전달된다면, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.01%보다 100배 개선된 1%이다.
전달 비히클은 비-바이러스 비히클, 바이러스 비히클, 나노입자 (예를 들어, 표적화 리간드 및/또는 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 나노입자), 리포솜, 미셀, 물-오일-물 에멀젼 입자, 오일-물 에멀젼 미셀 입자, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 펩티드 표적화 리간드) (여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드와 축합되고/거나 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용함), 페이로드에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 펩티드 표적화 리간드) (여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공함) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에 페이로드는 데옥시리보핵단백질 복합체(들) 또는 리보-데옥시리보핵단백질 복합체(들)로서 세포 내로 도입된다.
제공된 조성물 및 방법은 임의의 세포 유형 내의 임의의 유전자좌에서의 게놈 편집을 위해 (예를 들어, T-세포를, 예를 들어 생체내에서 조작하기 위해) 사용될 수 있다. 예를 들어, CD8+ T-세포 집단 또는 CD8+ 및 CD4+ T-세포의 혼합물은 항원 인식을 위한 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 도메인의 적절한 TCRα/TCRβ 쌍을 일시적으로 또는 영구적으로 발현하도록 프로그램화될 수 있다.
본 발명은 첨부 도면과 함께 읽는 경우에 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 통례에 따라, 도면의 다양한 특징부가 비율에 맞지 않는다는 것이 강조된다. 반대로, 다양한 특징부의 치수는 명확성을 위해 임의적으로 확대되거나 축소된다. 하기 도면이 도면에 포함된다.
도 1은 대상 방법의 한 예의 개략적 표현을 도시한다. 이러한 특정한 예에서: 2개의 표적 서열 (예를 들어, attP 부위)은 서열 특이적 뉴클레아제를 사용한 게놈의 절단 후에 게놈 내로 삽입되고 (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA를 사용함); 2개의 표적 서열 (예를 들어, attB 부위)은 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA 상에 존재하고; 2개의 잔류 부위 (예를 들어, attR 부위)는 부위-특이적 레콤비나제 (예를 들어, PhiC31 (ΦC31))를 사용한 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 것)로부터의 서열의 삽입 후에 게놈 내에 존재한다.
도 2는 전달 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 나노입자의 한 유형)의 개략적 표현을 도시한다.
도 3은 전달 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 나노입자의 한 유형)의 개략적 표현을 도시한다. 이 경우에서는, 도시된 나노입자는 다층이며, 코어 (제1 페이로드를 포함함)를 갖고, 이는 제1 유출가능한 층에 의해 둘러싸이고, 이는 중간 층 (추가의 페이로드를 포함함)에 의해 둘러싸이고, 이는 제2 유출가능한 층에 의해 둘러싸이고, 이는 표면 코팅되어 있다 (즉, 외부 쉘을 포함함).
도 4 (패널 A-B)는 대상 나노입자의 표면 코트의 표적화 리간드의 예시적인 구성의 개략적 표현을 도시한다. 도시된 전달 분자는 나노입자의 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용하는 앵커링 도메인에 접합된 표적화 리간드를 포함한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단에서 접합될 수 있지만 (각각의 패널의 좌측), 내부 위치에서도 접합될 수 있음 (각각의 패널의 우측)을 주목한다. 패널 A에서의 분자는 링커를 포함하는 반면 패널 B에서의 분자는 그렇지 않다.
도 5A는 공여자 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 대상 전달 분자의 예시적인 구성)의 개략적 도면을 제공한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단에서 접합될 수 있지만 (도면의 좌측), 내부 위치에서 접합될 수도 있다 (도면의 우측). 이 도면은 페이로드에 접합된 표적화 리간드뿐만 아니라 링커를 포함하는 전달 분자를 보여준다.
도 5B는 공여자 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 대상 전달 분자의 예시적인 구성)의 개략적 도면을 제공한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단에서 접합될 수 있지만 (도면의 좌측), 내부 위치에서 접합될 수도 있다 (도면의 우측). 이 도면은 페이로드에 접합된 표적화 리간드를 갖지만 링커는 갖지 않는 전달 분자를 보여준다.
도 5C는 공여자 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 대상 전달 분자의 예시적인 구성)의 개략적 도면을 제공한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단에서 접합될 수 있지만 (도면의 좌측), 내부 위치에서 접합될 수도 있다 (도면의 우측). 이 도면은 핵산 페이로드와 축합된 (및/또는 단백질 페이로드와, 예를 들어 정전기적으로 상호작용하는) 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드 및 링커를 포함하는 전달 분자를 보여준다.
도 5D는 공여자 비히클의 예시적인 실시양태 (도시된 경우에, 대상 전달 분자의 예시적인 구성)의 개략적 도면을 제공한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단에서 접합될 수 있지만 (도면의 좌측), 내부 위치에서 접합될 수도 있다 (도면의 우측). 이 도면은 핵산 페이로드와 축합된 (및/또는 단백질 페이로드와, 예를 들어 정전기적으로 상호작용하는) 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드를 갖지만 링커는 갖지 않는 전달 분자를 보여준다.
도 6은 사용될 수 있는 핵 국재화 신호 (NLS)의 비제한적 예를 제공한다 (예를 들어, 나노입자의 일부로서, 예를 들어 NLS-함유 펩티드로서; NLS-함유 펩티드, 음이온성 중합체, 양이온성 중합체 및/또는 양이온성 폴리펩티드 등의 일부/그에 접합된 것으로서). 상기 도면은 문헌 [Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]으로부터 적합화된 것이다. (부류 1, 위에서 아래로 (서열식별번호(SEQ ID NO): 201-221); 부류 2, 위에서 아래로 (서열식별번호: 222-224); 부류 4, 위에서 아래로 (서열식별번호: 225-230); 부류 3, 위에서 아래로 (서열식별번호: 231-245); 부류 5, 위에서 아래로 (서열식별번호: 246-264)].
도 7은 마우스 조혈 세포 계통의 개략적 표현, 및 계통 내의 다양한 세포에 대해 확인된 마커를 도시한다.
도 8은 인간 조혈 세포 계통의 개략적 표현, 및 계통 내의 다양한 세포에 대해 확인된 마커를 도시한다.
도 9는 세포 분화 및/또는 증식에 영향을 미치는데 사용될 수 있는 miRNA 인자의 개략적 표현을 도시한다.
도 10은 세포 분화 및/또는 증식에 영향을 미치는데 사용될 수 있는 단백질 인자의 개략적 표현을 도시한다.
도 11은 연구 A의 조성물을 사용한 나노입자의 평균 입자 크기를 도시한다.
도 12는 연구 A의 조성물을 사용한 나노입자의 제타 전위를 도시한다.
도 13은 연구 A의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수를 도시한다.
도 14는 연구 B의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수 및 안정성을 기재하는 차트를 도시한다.
도 15는 연구 B의 조성물을 사용한 나노입자의 평균 입자 크기를 도시한다.
도 16은 연구 B의 조성물을 사용한 나노입자의 제타 전위를 도시한다.
도 17은 연구 B의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수를 도시한다.
도 18은 연구 B의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수 및 안정성을 기재하는 차트를 도시한다.
도 19는 연구 C의 조성물을 사용한 나노입자의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 20은 연구 C의 조성물을 사용한 나노입자의 제타 전위를 도시한다.
도 21은 연구 C의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수를 도시한다.
도 22는 연구 C의 조성물을 사용한 나노입자의 다분산 지수 및 안정성을 도시한다.
도 23은 연구 C의 조성물을 사용한 나노입자의 SYBR 골드 포함 검정에 의해 수득된 형광 값을 도시한다.
도 24는 RNP-H2B (미니 코어) 입자의 특징화를 도시한다.
도 25는 RNP-H2B-PLE20:PDE20 (코어) 입자의 특징화를 도시한다.
도 26은 RNP-H2B-PLE20:PDE20 (코어) 입자의 혈청 안정성을 도시한다.
도 27은 리간드-변형된 입자의 1일 후 다분산도 평가를 도시한다.
도 28은 리간드-변형된 입자의 72시간 또는 7일 후 다분산도 평가를 도시한다.
도 29는 자동화 파이프라인 샘플링에 의해 측정된 세포, 핵 및 나노입자를 도시한다.
도 30은 다양한 처리 후 14.5시간에 걸친 세포 입자 공동국재화의 변화를 도시한다.
도 31은 다양한 처리 후 14.5시간에 걸친 Cas9-eGFP 세포의 백분율을 도시한다.
도 32는 다양한 처리 후 14.5시간에 걸친 핵 입자 통합을 도시한다.
도 33은 다양한 처리 후 14.5시간에 걸친 Cas9-eGFP 세포의 백분율을 도시한다.
도 34A는 비처리 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 34B는 도 34A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 34C는 도 34A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 35A는 코어 입자에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 35B는 도 35A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 35C는 도 35A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 36A는 리간드 폴리(L-아르기닌)으로 처리된 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 36B는 도 36A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 36C는 도 36A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 37A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 37B는 도 37A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 37C는 도 37A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 38A는 리간드 CD8_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 38B는 도 38A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 38C는 도 38A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 39A는 리간드 CD28_mCD80_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 39B는 도 39A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 39C는 도 39A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 40A는 리간드 CD28_mCD86_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 40B는 도 40A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 40C는 도 40A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 41A는 리간드 IL2R_mIL2_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 41B는 도 41A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 41C는 도 41A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 42A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1 및 CD8_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 42B는 도 42A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 42C는 도 42A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 43A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1 및 CD28_mCD80_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 43B는 도 43A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 43C는 도 43A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 44A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1 및 CD28_mCD86_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 44B는 도 44A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 44C는 도 44A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 45A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1 및 IL2R_mIL2_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 45B는 도 45A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 45C는 도 45A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 46A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1 및 폴리(L-아르기닌)n=10을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 46B는 도 46A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 46C는 도 46A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 47A는 리간드 CD2B_mCD80_(4GS)2_9R_N 및 CD28_mCD86_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 47B는 도 47A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 47C는 도 47A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 48A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1, CD2B_mCD86_(4GS)2_9R_N 및 CD8_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 48B는 도 48A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 48C는 도 48A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 49A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1, CD8_4GS_2_9R_N_1 및 IL2R_mIL2_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 49B는 도 49A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 49C는 도 49A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 50A는 리간드 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1, CD2B_mCD80_(4GS)2_9R_N 및 CD8_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 50B는 도 50A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 50C는 도 50A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 51A는 CD3_CD3e_(4GS)2_9R_N_1, CD2B_mCD86_(4GS)2_9R_N 및 CD28_mCD80_(4GS_)2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 51B는 도 51A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 51C는 도 51A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 52A는 리간드 CD8_4GS_2_9R_N_1, CD28_mCD80_(4GS)2_9R_N 및 CD28_mCD86_(4GS)2_9R_N을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 52B는 도 52A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 52C는 도 52A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 53A는 리간드 CD8_4GS_2_9R_N_1, CD28_mCD80_(4GS)2_9R_N 및 IL2R_mIL2_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 53B는 도 53A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 53C는 도 53A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 54A는 리간드 CD8_4GS_2_9R_N_1, CD28_mCD86_(4GS)2_9R_N, IL2R_mIL2_4GS_2_9R_N_1을 갖는 샘플에서의 T-세포 및 PBMC 표적화를 도시한다.
도 54B는 도 54A에 상응하는 인간 1차 범 T-세포 데이터를 도시한다.
도 54C는 도 54A에 상응하는 인간 1차 PBMC 데이터를 도시한다.
도 55는 상이한 리간드를 갖는 샘플의 영상 분석, 범-T 세포 유동 분석 및 PBMC 유동 분석을 도시한다.
도 56은 도 55의 것과 상이한 리간드 세트를 갖는 샘플의 영상 분석, 범-T 세포 유동 분석 및 PBMC 유동 분석을 도시한다.
도 57은 나노입자 합성의 일반적 개략도를 도시한다. 이는 페이로드, 양이온성/음이온성 펩티드 및 리간드의 첨가를 수반하며, 이는 다양한 첨가 순서 및 자유도를 나타낸다. 펩티드, 페이로드 및 리간드 예가 주어지고, 상이한 량체(mer) 길이 및 D/L 이성질체를 포함한다.
도 58A는 단계적으로 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 PLR50, 완충제 및 RNP의 부피를 도시한다.
도 58B는 단계적으로 첨가된 (연속) 각각의 나노입자의 제제에 사용된 PLR50, 완충제 및 RNP의 부피를 도시한다.
도 58C는 단계적으로 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 DNA, PLR50 및 완충제의 부피를 도시한다.
도 58D는 단계적으로 첨가된 (연속) 각각의 나노입자의 제제에 사용된 DNA, PLR50 및 완충제의 부피를 도시한다.
도 58E는 나노입자 웰 ID (그것이 합성되고 크기, 제타 전위 및 SYBR 형광에 대해 측정된 96-웰 플레이트 내의 위치) 및 그의 나노입자 ID로의 전환 (도 61I에서의 96-웰 세포 형질감염 플레이트 참조)을 도시한다.
도 59A는 2C.1.1.1에서 합성된 나노입자의 입자 크기를 도시한다. 입자 크기를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 크기는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 유체역학적 직경 (nm) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 59B는 2C.1.1.1에서 합성된 나노입자의 제타 전위를 도시한다. 입자 제타 전위를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 제타 전위는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 제타 전위 (mV) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 59C는 SYBR 형광 검정을 사용한 2C.1.1.1에서의 각각의 입자의 평균 (밤샘) 축합 지수를 도시한다. 축합 지수는 [(관심 웰 형광 - 유리 DNA 형광) / 유리 DNA 형광] * 100으로서 계산되고, 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 축합 지수 ± 표준 편차로서 보고된다. 보다 축합된 나노입자는 보다 높은 차폐, 보다 적은 형광, 이에 따라 보다 음성인 축합 지수를 가질 것이다.
도 60A는 HEK293-GFP 세포의 2C.1.1.1 형질감염에 대한 플레이트 레이아웃을 도시한다. NP를 이중 플레이트 상에 20uL 및 10uL로 투여하였다. B행 (금색 하이라이트)은 층 1 전하 비를 보여주고, C행 (오렌지색 하이라이트)은 외부 층 전하 비를 보여주고, 녹색 하이라이트는 CRISPRMAX 형질감염 대조군을 보여주고, 회색 하이라이트는 리포펙타민3000 형질감염 대조군을 보여준다. DNA 믹스는 ssODN 및 PhiC31 발현 및 공여자 플라스미드를 포함한다.
도 60B는 GFP 및 알렉사647 (NP) 형광을 모니터링하는, 형질감염 후 제5일에 대한 2C.1.1.1 유동 결과를 도시한다. 생존 세포를 FSC/SSC 산란에 기초하여 게이팅하였으며, %GFP- 및 %NP+가 생존 게이트에 대해 제시되어 있다. 리포펙션 대조군이 강건한 결과를 제공하긴 하지만, NP 웰에 대해 유의한 GFP KD는 관찰되지 않는다. NP의 20uL 용량은 제5일에 유의한 NP 신호를 갖는 반면 10uL 용량은 그렇지 않다. RFP 발현은 태그-RFP 플라스미드를 사용한 리포펙션 대조군에서만 관찰되었다: 생존의 20% RFP+, 웰 C11 (데이터는 제시되지 않음). 형질감염 후 제10일 및 제14일에서의 유동 분석은 NP 군에 대해 NP 알렉사-647 신호 부재, GFP 녹-다운 부재 및 RFP 발현 부재를 나타냈다. RFP 발현은 플라스미드 리포펙션 대조군에서 시간 경과에 따라 감소한 반면 (7% RFP+ 제10일, 2% RFP+ 제14일), CRISPRMAX 대조군 (B10, C10)에서의 GFP 녹-다운은 일정하게 유지되었으며, 이는 유전적 유전자 편집과 일치한다.
도 60C는 생어 서열분석 데이터의 신테고 ICE-KI 분석을 사용한 attP ssODN (6%)의 GFP 유전자좌 (25% KD) 및 HDR (녹-인)의 편집을 보여주는, RNP+DNA 믹스 리포펙션 대조군 (웰 C10)에 대한 2C.1.1.1 형질감염 후 제5일 게놈 분석의 결과를 도시한다.
도 61A는 단계적으로 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 PLR50, 완충제 및 RNP의 부피를 도시한다.
도 61B는 단계적으로 첨가된 (연속) 각각의 나노입자의 제제에 사용된 PLR50, 완충제 및 RNP의 부피를 도시한다.
도 61C는 단계적으로 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 DNA, 리간드 믹스, 알렉사-647 나노입자 표지 및 완충제의 부피를 도시한다.
도 61d는 단계적으로 첨가된 (연속) 각각의 나노입자의 제제에 사용된 PLR50, 완충제 및 RNP의 부피를 도시한다.
도 61E는 나노입자 웰 ID (그것이 합성되고 크기, 제타 전위 및 SYBR 형광에 대해 측정된 96-웰 플레이트 내의 위치) 및 그의 나노입자 ID로의 전환 (도 61I에서의 96-웰 세포 형질감염 플레이트 참조)을 도시한다.
도 61F는 2C.2.1.1에서 합성된 나노입자의 입자 크기를 도시한다. 입자 크기를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 크기는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 유체역학적 직경 (nm) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 61G는 2C.2.1.1에서 합성된 나노입자의 제타 전위를 도시한다. 입자 제타 전위를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 제타 전위는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 제타 전위 (mV) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 61H는 SYBR 형광 검정을 사용한 2C.2.1.1에서의 각각의 입자의 평균 (밤샘) 축합 지수를 도시한다. 축합 지수는 [(관심 웰 형광 - 유리 DNA 형광) / 유리 DNA 형광] * 100으로서 계산되고, 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 축합 지수 ± 표준 편차로서 보고된다. 보다 축합된 나노입자는 보다 높은 차폐, 보다 적은 형광, 이에 따라 보다 음성인 축합 지수를 가질 것이다.
도 61I는 자극된 PBMC의 2C.2.1.1 형질감염에 대한 플레이트 레이아웃을 도시한다. NP를 60,000개의 자극된 PBMC로 이루어진 웰당 10uL로 투여하였다. B행 (금색 하이라이트)은 층 1 전하 비를 보여주고, C행 (오렌지색 하이라이트)은 외부 층 전하 비를 보여준다. 녹색으로 하이라이트된 웰 (B12 - G12 및 G11)은 뉴클레오펙션 대조군이다. NP18, NP39 및 NP25가 유전자 편집 효율 (TCR k/d; 각각 6%, 5% 및 5% 생어 서열분석 효율) 면에서 최고 성능의 나노입자 군이었다. 볼드체 값은 생어 서열분석에 의해 결정된 바와 같은 하이라이트된 샘플에 대해 >1%의 TCR 유전자좌 절단 값을 나타낸다.
도 61J는 유동 세포측정법을 통해 측정된 바와 같은 실험 2C.2.1.1로부터의 형질감염된 세포의 세포 생존율 (%생존)을 도시한다. 밤샘 형질감염으로부터의 나노입자의 PBS 세척 후, 자극된 PBMC를 제1일 유동 분석을 위해 수집하였다. 세포 생존율을 아넥신 V 염색에 의해 검정하였다. 웰 E6은 오류를 가졌다.
도 61K는 유동 세포측정법을 통해 측정된 바와 같은 실험 2C.2.1.1로부터의 형질감염된 세포의 세포 생존율 (%사멸/아폽토시스)을 도시한다. 밤샘 형질감염으로부터의 나노입자의 PBS 세척 후, 자극된 PBMC를 제1일 유동 분석을 위해 수집하였다. 세포 생존율을 아넥신 V 염색에 의해 검정하였다. 웰 E6은 오류를 가졌다. 아폽토시스 및 사멸 세포. 웰 E6은 오류를 가졌다.
도 61L은 2C.2.1.1로부터의 다양한 나노입자 제제의 세포 흡수 (AF647-NP+ 및 EGFP-Cas9+)를 도시한다. 밤샘 형질감염으로부터의 나노입자의 PBS 세척 후, 자극된 PBMC를 제1일 유동 분석을 위해 수집하였다. GFP (Cas9-GFP) 및 알렉사647 (NP) 형광이 제시되어 있고, 생존 게이트 (아넥신 V 음성)에 대해 %GFP+ 및 %NP+가 제시되어 있다. HEK-293 세포와 비교하여 T 세포에서 매우 적은 NP 신호 (알렉사647)가 관찰되며, 이는 AF647-결합된 엔도솜 이탈 펩티드의 신속한 분해가 가장 효율적인 세포하 Cas9 RNP 전달을 유발한다는 것을 시사한다. 거의 모든 미량의 NP+ 수준 (1-2%)은 최고-값 Cas9-GFP 신호와 일치한다. CD3 염색은 세포의 >95%가 CD3+임을 보여주었으며 (제시되지 않음), 이는 CD3/CD28 자극이 T 세포의 선택적 증식을 유발하였음을 나타낸다.
도 61M은 2C.2.1.1에서의 형질감염 후 제4일의 TCR 발현의 유동 분석을 도시한다. RNP +/- ssODN을 갖는 뉴클레오펙션 웰은 강건한 TCR KD를 갖는 반면, 모든 성분 (F12) 및 NP 웰의 뉴클레오펙션은 그렇지 않다. NP 신호 (알렉사647 또는 Cas9-GFP)는 관찰되지 않고, 단지 RFP 플라스미드 뉴클레오펙션 대조군 웰 (G12)만이 생존 세포의 10%에서 RFP 발현을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음).
도 61N은 2C.2.1.1에서의 형질감염 후 제14일의 TCR 발현의 유동 분석을 도시한다. 심지어 플라스미드 뉴클레오펙션 대조군으로부터도 NP 신호 (알렉사647 또는 Cas9-GFP) 또는 RFP 발현이 관찰되지 않는다.
도 61O는 TRAC 유전자좌에 대한 제14일 생어 서열분석 데이터의 ICE 점수를 도시한다. 높은 ICE 점수는 유동에 의한 TCR KD와 유사하게 뉴클레오펙션 샘플에서의 강건한 편집을 나타낸다. 3개의 NP (박스표시)는 신테고의 ICE 플랫폼에 의한 보통의 TCR 편집을 나타냈다. 어떠한 샘플도 attP ssODN에서 HDR (녹-인)을 나타내지 않았다.
도 61P는 코어를 보다 높은 나노입자 흡수 효율 및 세포하 방출 동역학을 생성하도록 추가로 최적화한 2C.1.2.1 전에 수행된 연구인 2C.2.1.1의 생어 서열분석 결과를 도시한다. 2C.1.2.1은 다양한 비의 히스톤 단편, PLR10, PLR50, NLS-변형된 히스톤 및/또는 엔도솜 이탈 - NLS 펩티드와 함께, 다양한 비의 PLE 대 PDE를 추가로 포함하였다. 표적화 리간드에서의 장식 전에, 2C.1.2.1에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 연장된 세포하 방출에 비해 신속한 세포하 방출을 위해 나노입자 코어를 최적화하도록 의도된 스크린의 초기 세트에서 다양한 나노입자 코어를 그의 생물학적 성능 (세포 흡수, 시간 경과에 따른 세포 지속성, 생존율 및 유전자 편집)에 대해 평가하였다.
도 61Q는 코어를 보다 높은 나노입자 흡수 효율 및 세포하 방출 동역학을 생성하도록 추가로 최적화한 2C.1.2.1 전에 수행된 연구인, 형질감염 후 제14일에서의 2C.2.1.1의 생어 서열분석 결과를 도시한다. 표적화 리간드에서의 장식 전에, 연장된 세포하 방출에 비해 신속한 세포하 방출을 위해 나노입자 코어를 최적화하도록 의도된 스크린의 초기 세트에서 다양한 나노입자 코어를 그의 생물학적 성능 (세포 흡수, 시간 경과에 따른 세포 지속성, 생존율 및 유전자 편집)에 대해 평가하였다.
도 62A는 단계 1로서 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 양이온성 펩티드 및 완충제의 부피를 도시한다.
도 62B는 단계 2로서 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 RNP, DNA 또는 DNA+PLE/PDE의 부피를 도시한다. 나노입자를 이 단계에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
도 62C는 단계 3으로서 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 RNP, DNA 또는 DNA+PLE/PDE의 부피를 도시한다. 나노입자를 이 단계에서 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다.
도 62D는 단계 3으로서 첨가된 각각의 나노입자의 제제에 사용된 양이온성 펩티드, 나노입자 알렉사-647 표지 및 완충제의 부피를 도시한다. 나노입자를 이 단계에서 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다.
도 62E는 나노입자 웰 ID (그것이 합성되고 크기, 제타 전위 및 SYBR 형광에 대해 측정된 96-웰 플레이트 내의 위치) 및 그의 나노입자 ID로의 전환 (도 61I에서의 96-웰 세포 형질감염 플레이트 참조)을 도시한다.
도 62F는 전하 비 10을 달성하기 위해 0.1% 원액으로부터 필요한 양이온성 폴리펩티드 부피의 예시적인 계산을 도시한다.
도 62G는 전하 비 4를 달성하기 위해 0.1% 원액으로부터 필요한 양이온성 폴리펩티드 부피의 예시적인 계산을 도시한다.
도 62H는 2C.1.2.1에서 합성된 나노입자의 입자 크기를 도시한다. 입자 크기를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 크기는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 유체역학적 직경 (nm) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 62I는 2C.1.2.1에서 합성된 나노입자의 제타 전위를 도시한다. 입자 제타 전위를 와이어트 모비우스 제타 전위 및 DLS 검출기를 통해 삼중으로 측정하였다. 제타 전위는 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 제타 전위 (mV) ± 표준 편차로서 보고된다.
도 62J는 SYBR 형광 검정을 사용한 2C.1.2.1에서의 각각의 입자의 평균 (밤샘) 축합 지수를 도시한다. 축합 지수는 [(관심 웰 형광 - 유리 DNA 형광) / 유리 DNA 형광] * 100으로서 계산되고, 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 축합 지수 ± 표준 편차로서 보고된다. 보다 축합된 나노입자는 보다 높은 차폐, 보다 적은 형광, 이에 따라 보다 음성인 축합 지수를 가질 것이다.
도 62K는 HEK293-GFP 세포에서의 2C.1.2.1에 대한 나노입자 형질감염 레이아웃을 도시한다. 황색으로 하이라이트된 군은 도 62A-62E에 나타낸 상응하는 나노입자의 단일 (10ul) 용량인 반면, 청색으로 하이라이트된 군은 도 62A-62E에 나타낸 상응하는 나노입자의 두배 (20ul) 용량이다. 녹색 하이라이트는 CRISPRMAX 형질감염 대조군을 나타내고, 회색 하이라이트는 리포펙타민3000 형질감염 대조군을 나타낸다. DNA 믹스는 ssODN 및 PhiC31 발현 및 공여자 플라스미드를 포함한다.
도 62L은 알렉사647 형광 (NP 신호)을 모니터링하는, 형질감염 후 제3일에 대한 2C.1.2.1 유동 결과를 도시한다. 생존 세포를 FSC/SSC 산란에 기초하여 게이팅하였으며, %NP+가 생존 게이트에 대해 제시되어 있다.
도 62M은 GFP 형광을 모니터링하는, 형질감염 후 제3일에 대한 2C.1.2.1 유동 결과를 도시한다. 생존 세포를 FSC/SSC 산란에 기초하여 게이팅하였으며, %GFP-가 생존 게이트에 대해 제시되어 있다. RFP 발현은 태그-RFP 플라스미드를 사용한 리포펙션 대조군에서만 관찰되었다: 생존의 51% RFP+, 웰 B6 (데이터는 제시되지 않음).
도 62N은 도 62F에서 GFP KD를 나타내는 2C.1.2.1로부터의 선택된 NP-형질감염된 샘플 (HEK293-GFP)에 대한 GFP 및 알렉사647 (NP)의 제3일 유동 플롯을 도시한다. 생존 세포 게이트 (FSC/SSC에 기초함)가 제시되어 있다. GFP 발현의 감소는 +/- NP 신호에서 관찰되며, 이는 신속한 NP 펩티드 쉘의 분해 및 RNP 페이로드의 방출을 시사한다.
도 62O는 GFP 형광 알렉사647 형광 (NP 신호)을 모니터링하는, 형질감염 후 제3일에 대한 2C.1.2.1 유동 결과를 도시한다. 생존 세포를 FSC/SSC 산란에 기초하여 게이팅하였으며, 백분율이 생존 게이트에 대해 제시되어 있다. 녹색 하이라이트된 웰은 %GFP-에 대한 상위 히트 (62F에 제시됨)이고, 분홍색 하이라이트된 웰은 %NP+에 대한 상위 히트 (62E에 제시됨)이다.
도 62P는 HEK293-GFP 세포 내로 형질감염되고 2C.1.2.1의 웰 E5에 상응하는 AF647-표지된 나노입자에 적용된 조영-증강 영상 (상단-좌측, 하단-좌측; 이미지J 스크립트 참조) 및 연관된 한계값 지도 (상단-우측, 하단-우측)를 도시한다. 밝은 녹색 영역은 높은 정도의 NP-유도 형광이 있는 GFP- 영역을 나타내는 반면, 적색 영역은 NP-유도 형광이 없는 GFP+ 영역을 나타낸다. NP 형광은 바이오텍 시테이션 5 텍사스 레드 필터 큐브 (부품 번호: 1225102)에 의해 획득되었으며, 이에 의한 공동국재화 연구 및 AF647 (Cy5 채널)을 사용한 유동 세포측정법 결과와의 비교는 NP+ 픽셀이 RFP+ 픽셀과 구별되지 않는다는 것을 입증하였다. 이들 한계값 지도를 사용하여 각각의 웰 위치에 대한 피어슨 계수, M1 & M2 계수 및 중첩 계수를 생성하였다.
도 62Q는 HEK293-GFP 세포 내로 형질감염된 AF647-표지된 나노입자에 적용되고, 형질감염 후 제6일에 생성된 2C.1.2.1의 웰 E5에 상응하며, 도 62P에 상응하는 코스테스 한계값 지도를 도시한다. 밝은 녹색 영역은 높은 정도의 NP-유도 형광이 있는 GFP- 영역을 나타내는 반면, 적색 영역은 NP-유도 형광이 없는 GFP+ 영역을 나타낸다.
도 62R은 형질감염 후 제6일에 생성된 2C.1.2.1의 웰 F5에 대한 분절에 상응하는 대표적인 데이터 및 코스테스 한계값 지도를 도시하고, 영상화 스크립트를 통한 자동 한계값 설정을 나타낸다. 이들 한계값 지도를 사용하여 각각의 웰 위치에 대한 피어슨 계수, M1 & M2 계수 및 중첩 계수를 생성하였다.
도 62S는 2C.1.2.1의 웰 B6 (RFP 플라스미드-단독 양성 대조군)에 대한 한계값 지도의 자동화된 생성에 상응하는 대표적인 데이터를 도시하고, 영상화 스크립트를 통한 자동 한계값 설정을 나타낸다. 이들 한계값 지도를 사용하여 다른 웰에서 각각의 웰 위치에 대한 피어슨 계수, M1 & M2 계수 및 중첩 계수를 생성하였다. Cy5 채널 부재 (NP-) 하의 텍사스 레드 채널 (RFP+)의 확인 및 NP+ 지표로서의 RFP+의 가시성을 다른 웰과 비교할 때 본 실험에서 추가의 한계값 설정에 사용하였다.
도 62T는 RFP 및 DAPI 중첩 영상을 도시한다. 웰 B5는 RFP 삽입의 부재로 인해 텍사스 레드 채널을 나타내지 않았다 (B6 RFP 플라스미드 리포펙타민 대조군에서 관찰된 바와 같음). 웰 E8, E9 및 F9 (나노입자 군)는 가시적으로 높은 정도의 나노입자 흡수를 나타내며, 여기서 특정 웰 (예를 들어 E5)은 만더스 계수 M1=0.01 (NP+와 중첩되는 GFP+의 분율) 대 M2=0.907 (GFP+와 중첩되는 NP+의 분율)을 나타낸다. 이는 입자 흡수와 GFP 발현의 부재 사이의 강한 관계를 나타낸다.
도 62U는 2C.1.2.1의 제3일 NP 흡수 및 GFP 녹다운을 도시하며, 여기서 샘플은 %GFP- (상기 B4에서 E4로 하향하는 값) 및 %NP+ (상기 E7에서 F5로 상승하는 값)에 따라 이중모드로 분류된다. 현저하게, NP+ 생존 세포 비율은 최고-성능의 나노입자-흡수 군에 대해 제3일과 제6일 사이에 유사하게 유지된다. 이는 입자의 다양한 성분이 세포에 효율적으로 진입하지만, 효율적으로 그의 페이로드를 방출하지 않거나 적절한 구획(들)에 도달하지 않는다는 것, 및 이들 나노입자가 지연 방출 동역학을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 제3일에서의 상위-성능의 GFP 녹다운 입자는 제6일까지 상대 녹다운 효율이 감소하였다. 입자 분해는 Δ(제3일NP+% - 제6일NP+%)에 의해 모델링된다. NP+ 편집된 세포의 독성을 나타내는 유전자 편집 효율은 Δ(제6일GFP-% - 제3일GFP-%)에 의해 모델링된다. 이들 2가지 비의 비교는 표적화 리간드에서의 후속 코팅을 위한 최적의 "코어 나노입자"의 확립을 가능하게 하며, 이에 의해 제3일에서의 %NP+ 세포 및 제6일에서의 %GFP- 세포의 균형이 추구된다. 이들 선택 기준에 따르면, NP13, NP15, NP06 및 NP14 (흑색 직사각형)가 추가의 리간드-표적화 층형성 및 세포 표적화 대 세포하 방출 효율의 최적화를 위한 상위 나노입자 후보이다. 도 35A에서, "코어 입자" (동일한 정의에 의하면, 예를 들어 리간드 없이 단지 음이온성 및/또는 양이온성 폴리펩티드만을 포함함)는 2C.1.2.1 및 2C.2.1.1에서의 최저-성능 군과 대등한 흡수 효율을 달성하는 것으로 제시되어 있으며, 이에 의해 다양한 표적화 리간드에서의 장식이 세포 흡수 및 CRISPR-Cas9 RNP 전달을 10x 초과의 효율만큼 증가시킨다 (도 30 - 56).
도 62V는 2C.1.2.1의 제6일 NP 흡수 및 GFP 녹다운을 도시하며, 여기서 샘플은 %GFP- (상기 B4에서 E4로 하향하는 값) 및 %NP+ (상기 E7에서 F5로 상승하는 값)에 따라 이중모드로 분류된다. 현저하게, NP+ 생존 세포 비율은 최고-성능의 나노입자-흡수 군에 대해 제3일과 제6일 사이에 유사하게 유지된다. 이는 입자의 다양한 성분이 세포에 효율적으로 진입하지만, 효율적으로 그의 페이로드를 방출하지 않거나 적절한 구획(들)에 도달하지 않는다는 것, 및 이들 나노입자가 지연 방출 동역학을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 제3일에서의 상위-성능의 GFP 녹다운 입자는 제6일까지 상대 녹다운 효율이 감소하였다. 입자 분해는 Δ(제3일NP+% - 제6일NP+%)에 의해 모델링된다. NP+ 편집된 세포의 독성을 나타내는 유전자 편집 효율은 Δ(제6일GFP-% - 제3일GFP-%)에 의해 모델링된다. 이들 2가지 비의 비교는 표적화 리간드에서의 후속 코팅을 위한 최적의 "코어 나노입자"의 확립을 가능하게 하며, 이에 의해 제3일에서의 %NP+ 세포 및 제6일에서의 %GFP- 세포의 균형이 추구된다. 이들 선택 기준에 따르면, NP13, NP15, NP06 및 NP14 (흑색 직사각형)가 추가의 리간드-표적화 층형성 및 세포 표적화 대 세포하 방출 효율의 최적화를 위한 상위 나노입자 후보이다. 도 35A에서, "코어 입자" (동일한 정의에 의하면, 예를 들어 리간드 없이 단지 음이온성 및/또는 양이온성 폴리펩티드만을 포함함)는 2C.1.2.1 및 2C.2.1.1에서의 최저-성능 군과 대등한 흡수 효율을 달성하는 것으로 제시되어 있으며, 이에 의해 다양한 표적화 리간드에서의 장식이 세포 흡수 및 CRISPR-Cas9 RNP 전달을 10x 초과의 효율만큼 증가시킨다 (도 30 - 56).
도 62W는 상위-성능의 제3일 GFP 녹다운 입자 대 상위-성능의 제6일 흡수 입자를 도시한다. 현저하게, NP+ 생존 세포 비율은 최고-성능의 나노입자-흡수 군에 대해 제3일과 제6일 사이에 유사하게 유지되고, GFP- 세포는 외견상 신속한 NP 대사에 의존하는 한편, 낮은 독성 및 높은 흡수 백분율을 나타내는 NP는 낮은 페이로드 활성을 나타낸다. 이는 입자의 다양한 성분이 세포에 효율적으로 진입하지만, 효율적으로 그의 페이로드를 방출하지 않거나 적절한 구획(들)에 도달하지 않는다는 것, 및 이들 나노입자가 제한된 세포 독성 하에 지연 방출 동역학을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 특정 첨가 순서 및 제제는 또한 강한 정전기적 상호작용으로 인해 gRNA-Cas9 활성을 파괴할 수 있다. 제3일에서의 상위-성능의 GFP 녹다운 입자는 제6일까지 상대 녹다운 효율이 감소하였다. 샘플 E7, E4, F7 및 E5 (흑색 직사각형)는 제3일과 제6일 사이에 유전자 편집 효율이 증가하였고, 2C.1.2.1에서 연구된 모든 제제 중 가장 높은 비의 편집된 세포 대 NP+ 세포를 가졌다.
도 62X는 제3일 대 제6일 생존 NP+ 세포 (나노입자를 함유하는 총 생존 세포의 %)의 비교를 도시한다. 다양한 제제가 첨가 순서, PDE/PLE, PLR10, PLR50 및/또는 히스톤-유래 단편의 포함, 및 그와 연관된 4/5-성분 나노입자의 형질감염 효율의 면에서 제시되어 있다. NP17은 G8에서의 NP17의 용량의 50%로 E8에서 보다 높은 형질감염 효율을 달성하는 것으로 관찰되며, 이는 최적화된 세포하 트래픽킹이 NP+ 세포 수를 증가시킬 수 있음을 시사한다. 축합 지수, 제타 전위 및 리간드 코팅의 추가의 최적화는, NP+ 생존 세포 대 GFP- 편집된 생존 세포의 비 (도 62B - 62C) 및 RNP-단독 전달 시스템에 대한 추가의 제제 연구 (도 11 - 56)의 면에서 가장 우수한 성능을 갖는 전체-최대 축합 지수보다 대략 10% 더 낮은 축합 지수를 갖는 제제에 의해 입증된 바와 같이, 세포-특이성 및 세포하 방출 효율에 대한 개선을 가져올 것이다. 도 35A에서, "코어 입자" (예를 들어 리간드 없이 단지 음이온성 및/또는 양이온성 폴리펩티드만을 포함함)는 2C.1.2.1 및 2C.2.1.1에서의 최저-성능 군과 대등한 흡수 효율을 달성하는 것으로 제시되어 있으며, 이에 의해 다양한 표적화 리간드에서의 장식이 세포 흡수 및 CRISPR-Cas9 RNP 전달을 10x 초과의 효율만큼 증가시킨다 (도 30 - 56). 충분히 낮은-전체-최대 축합 지수를 갖고, 임의로 소정 비의 히스톤-유래 서열 및 PLE 및/또는 PDE를 포함하는 나노입자를 생성하는 것은, 세포하 트래픽킹 및 방출 능력과 균형을 이루는 표적화 리간드 및 나노입자 표면 화학의 최적화된 합리적 선택을 가능하게 한다.
도 62Y는 도 62M - 62O에서 흑색 직사각형으로 정의된 바와 같은 제3일 대 제6일 생존 NP+ 세포 (나노입자를 함유하거나 또는 GFP-이거나 또는 둘 다인 총 생존 세포의 %)의 비교를 도시한다. 이들 입자는 2개의 시점을 비교하였을 때 형질감염 후 존재하는 GFP- 생존 세포의 증가를 가졌으며, 이는 나노입자 페이로드의 지연 또는 연장 방출을 시사한다. 추가적으로, GFP- 생존 세포 빈도는 형질감염 효율과 유사하며, 이는 효율적인 세포하 방출, 나노입자 + AF647 형광단의 분해 및 후속 페이로드 활성을 시사한다. 이들 나노입자 코어는 도 30-56에 도시된 바와 같은 표적화 리간드로의 추가의 층형성을 위한 이상적인 주형이다.
상기 요약된 바와 같이, 다중 페이로드를 갖는 전달 비히클을 사용하는 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상 방법은 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 전달 비히클은 (a) 세포의 게놈을 절단하는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TALEN, 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 절단 복합체, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질 - RNA-가이드 CRISPR/Cas 폴리펩티드 - 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1 (Cas12a), Cas13, MAD7 등) 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 [(a)는 본원에서 뉴클레아제 조성물로 지칭됨]; (b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA (여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열 (예를 들어, attP 부위)을 생성함) [(b)는 본원에서 표적 공여자 조성물로 지칭됨]; (c) 부위-특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산) (예를 들어, ΦC31, ΦC31 RDF, Cre, FLP) (여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식함) [(c)는 본원에서 레콤비나제 조성물로 지칭됨]; 및 (d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA [(d)는 본원에서 삽입 공여자 조성물로 지칭됨]를 포함하는 페이로드를 포함한다.
본 방법 및 조성물을 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 특정한 방법 또는 조성물로 제한되지 않으므로, 당연히 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한치와 하한치 사이에서 하한치 단위의 1/10까지의 각각의 중간 값이 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내 임의의 언급된 값 또는 개재 값 내지 그 언급된 범위 내 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포괄된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 범위 내에 포함되거나 배제될 수 있고, 더 작은 범위 내에 이러한 한계치 중 어느 하나 또는 둘 다가 포함되거나 또는 둘 다가 포함되지 않는 각각의 범위는 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 조건으로 하여 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적인 및 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개물은 공개물에서 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 포함된 공개물의 임의의 개시내용을 모순이 존재하는 정도까지 대체하는 것으로 이해된다.
본 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 각각의 개별 실시양태는 본 발명의 범주 또는 취지에서 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 실시양태의 특색과 용이하게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특색을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함함을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "엔도뉴클레아제"에 대한 언급은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 1개 이상의 엔도뉴클레아제 및 그의 등가물에 대한 언급을 포함하는 것 등이다. 추가로, 청구범위는 임의의 요소, 예를 들어 임의의 임의적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 주목한다. 따라서, 이러한 언급은 청구범위 요소의 열거와 관련하여 "단독으로", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행 기준으로서의 역할을 하도록 의도된다.
본원에서 논의된 공개물은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 어떠한 것도 본 발명이 이러한 공개물에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 공개물의 일자는 실제의 공개 일자와 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
방법 및 조성물
효율적인 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상 방법은 (a) [본원에서 뉴클레아제 조성물로 지칭됨] 세포의 게놈을 절단하는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 (또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산), (b) [본원에서 표적 공여자 조성물로 지칭됨] 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA (여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열 (표적 부위, 예를 들어 attP 부위)을 생성함); (c) [본원에서 레콤비나제 조성물로 지칭됨] 부위-특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산) (여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식함); 및 (d) [본원에서 삽입 공여자 조성물로 지칭됨] 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 페이로드를 갖는 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
(a) 부위 특이적 뉴클레아제 (본원에서 서열 특이적 뉴클레아제로도 지칭됨) 또는 (b) 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산은, 예를 들어 전달 비히클의 핵산 페이로드로서 임의의 관심 핵산일 수 있으며, 이는 선형 또는 원형일 수 있고, 플라스미드, 바이러스 게놈, RNA 등일 수 있다. 용어 "핵산"은 변형된 핵산을 포괄한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 모방체일 수 있고, 변형된 당 백본, 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 1개 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오시드간 연결), 1개 이상의 변형된 염기 등을 포함할 수 있다 (핵산이 전사되고/거나 단백질로 번역될 수 있는 한).
I. 뉴클레아제 조성물 (서열 특이적 뉴클레아제)
대상 뉴클레아제 조성물은 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 (본원에서 부위-특이적 뉴클레아제로도 지칭됨) 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함한다. 대상 부위 특이적 뉴클레아제는 게놈 DNA에 절단 (이중 가닥 또는 단일 가닥)을 서열 특이적 방식으로 도입할 수 있는 것이다. 일부 부위 특이적 뉴클레아제는 조작된 단백질 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN))이고, 일부 경우에 이러한 단백질은 닉 (단일 가닥 파괴)을 생성하기 위해 사용되거나 또는 평활 또는 엇갈림 말단을 생성하기 위해 단백질 쌍으로서 사용된다. 일부 경우에, 부위 특이적 뉴클레아제는 평활 이중 가닥 절단을 생성하는 것이다 (예를 들어, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질, 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13 등). 일부 경우에, 부위 특이적 뉴클레아제는 자연적으로는 평활 단일 가닥 절단을 생성하지만 (예를 들어, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질, 예컨대 Cas9) 단백질이 니카제 (DNA의 단지 1개의 가닥만을 절단함)이도록 돌연변이된 것이다. 니카제 단백질, 예컨대 돌연변이된 니카제 Cas9를 사용하여 단일 가닥 파괴를 생성하거나 또는 표적 DNA의 대향 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 RNA를 사용함으로써 엇갈림 말단을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 대상 방법은 2개의 가이드 RNA와 함께 서열 특이적 니카제 (예를 들어, 니카제 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질, 예컨대 니카제 Cas9)를 사용하여 2개의 게놈 위치 중 (적어도) 1개에서 엇갈림 절단을 생성하는 것을 포함한다. 일부 경우에 대상 방법은 4개의 가이드 RNA와 함께 서열 특이적 니카제 (예를 들어, 니카제 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질, 예컨대 니카제 Cas9)를 사용하여 2개의 게놈 위치에서 2개의 엇갈림 절단을 생성하는 것을 포함한다.
임의의 편리한 부위 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, 유전자 편집 단백질, 예컨대 임의의 편리한 프로그램가능한 유전자 편집 단백질)가 사용될 수 있다. 적합한 프로그램가능한 유전자 편집 단백질의 예는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 유형 I 또는 유형 III CRISPR/ Cas 이펙터 단백질, 및 부류 2 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (이펙터), 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 부위 특이적 뉴클레아제의 예는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN); 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN); 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 뉴클레아제; CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (이펙터 단백질), 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등); 메가뉴클레아제 (예를 들어, I-SceI, I-CeuI, I-CreI, I-DmoI, I-ChuI, I-DirI, I-FlmuI, I-FlmuII, I-Anil, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-MleI, PI-MtuI, PI-PspI, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-SceV 등); 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부위 특이적 뉴클레아제는 단백질로서 또는 단백질을 코딩하는 핵산 (RNA 또는 DNA)으로서 세포에 (전달 비히클의 일부로서) 전달될 수 있다.
일부 경우에 전달 비히클은 유전자 편집 도구 (즉, 유전자 편집 시스템, 예를 들어 부위 특이적 절단 시스템, 예컨대 프로그램가능한 유전자 편집 시스템의 성분)를 코딩하는 핵산을 전달하는데 사용된다. 예를 들어, 핵산 페이로드는 (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA, (iii) 프로그램가능한 유전자 편집 단백질, 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP) (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 - ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제에 융합된 것 - TALEN), 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 뉴클레아제, 및/또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등)를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA; (iv) 메가뉴클레아제를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA; (v) 귀소 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA; 및 (iv) 공여자 DNA 분자 (제1 및/또는 제2 대상 공여자 DNA) 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 경우에 대상 전달 비히클은 단백질 페이로드, 예를 들어 단백질, 예컨대 ZFN, TALEN, 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 뉴클레아제, 및/또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등), 메가뉴클레아제, 및 귀소 엔도뉴클레아제, Cas13, MAD7을 전달하는데 사용된다.
시스템의 성질 및 목적하는 결과에 따라, 유전자 편집 시스템 (예를 들어 부위 특이적 유전자 편집 시스템, 예컨대 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 단일 성분 (예를 들어, ZFP, ZFN, TALE, TALEN, 메가뉴클레아제 등)을 포함할 수 있거나 또는 다중 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템은 적어도 2개의 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 (i) 공여자 DNA 분자 핵산; 및 (ii) 유전자 편집 단백질 (예를 들어, 프로그램가능한 유전자 편집 단백질, 예컨대 ZFP, ZFN, TALE, TALEN, DNA-가이드 폴리펩티드, 예컨대 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트(Natronobacterium gregoryi Argonaute) (NgAgo), 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 뉴클레아제, 및/또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등)), 또는 유전자 편집 단백질을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA)를 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 및 (ii) CRISPR/CAS RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등), 또는 RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA)를 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 (i) NgAgo-유사 가이드 DNA; 및 (ii) DNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA)를 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 적어도 3개의 성분: (i) 공여자 DNA 분자; (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 및 (iii) CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY 또는 Cpf1), 또는 RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA)를 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그램가능한 유전자 편집 시스템)은 적어도 3개의 성분: (i) 공여자 DNA 분자; (ii) NgAgo-유사 가이드 DNA, 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA를 코딩하는 DNA; 및 (iii) DNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클의 페이로드는 1개 이상의 유전자 편집 도구를 포함한다. 용어 "유전자 편집 도구"는 유전자 편집 시스템의 1개 이상의 성분을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 따라서, 일부 경우에 페이로드는 유전자 편집 시스템을 포함하고, 일부 경우에 페이로드는 유전자 편집 시스템의 1개 이상의 성분 (즉, 1개 이상의 유전자 편집 도구)을 포함한다. 예를 들어, 표적 세포는 유전자 편집 시스템의 성분 중 1개를 이미 포함할 수 있고, 사용자는 단지 나머지 성분만을 첨가할 필요가 있다. 이러한 경우에 대상 나노입자의 페이로드는 주어진 유전자 편집 시스템의 성분 모두를 반드시 포함하는 것은 아니다. 따라서, 일부 경우에 페이로드는 1개 이상의 유전자 편집 도구를 포함한다.
예시적인 예로서, 표적 세포는 유전자 편집 단백질 (예를 들어, ZFP, TALE, DNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, NgAgo), 유형 I 또는 유형 III CRISPR/Cas 뉴클레아제, 및/또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등)), 및/또는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 이미 포함할 수 있고, 따라서 페이로드는 (i) 공여자 DNA 분자; 및 (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 표적 세포는 CRISPR/Cas 가이드 RNA 및/또는 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA를 이미 포함할 수 있고, 페이로드는 (i) 공여자 DNA 분자; 및 (ii) CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, Cas13, MAD7 등), 또는 RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA); 또는 DNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
프로그램가능한 유전자 편집 도구 (예를 들어, CRISPR/Cas RNA-가이드 단백질, 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1 (Cas12a) 및 Cas13, 아연 핑거 단백질, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제, TALE 단백질, 예컨대 TALEN, CRISPR/Cas 가이드 RNA 등)에 관한 추가의 정보에 대해, 예를 들어 다음 문헌을 참조한다: [Dreier, et al., (2001) J Biol Chem 276:29466-78; Dreier, et al., (2000) J Mol Biol 303:489-502; Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6); Dreier, et al., (2005) J Biol Chem 280:35588-97; Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8; Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Segal, (2002) Methods 26:76-83; Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; Pabo, et al., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40; Wolfe, et al., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212; Segal and Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7; Segal, et al., (2003) Biochemistry 42:2137-48; Beerli and Barbas, (2002) Nat Biotechnol 20:135-41; Carroll, et al., (2006) Nature Protocols 1:1329; Ordiz, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5; Guan, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301; Sanjana et al., Nature Protocols, 7:171-192 (2012); Zetsche et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71; Makarova et al., Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97; Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May;10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43; Qi et al., Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 2013 Oct 31; Chen et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. 2013 Nov;195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013;3:2510; Fujii et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187; Hu et al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188; Larson et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis. 2013 Dec;51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda). 2013 Dec 9;3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 2013 Oct 9; Yang et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9; Briner et al., Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-9; Burstein et al., Nature. 2016 Dec 22 - Epub ahead of print; Gao et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul 34(7):768-73; 및 Shmakov et al., Nat Rev Microbiol. 2017 Mar;15(3):169-182]; 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO2002099084; WO00/42219; WO02/42459; WO2003062455; WO03/080809; WO05/014791; WO05/084190; WO08/021207; WO09/042186; WO09/054985; 및 WO10/065123; 미국 특허 출원 공개 번호 20030059767, 20030108880, 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 20140377868; 20150166983; 및 20160208243; 및 미국 특허 번호 6,140,466; 6,511,808; 6,453,242 8,685,737; 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
II. 표적 공여자 조성물 (제1 공여자 DNA)
대상 표적 공여자 조성물은 제1 공여자 DNA를 포함한다. 제1 공여자 DNA는 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 편리한 포맷 (예를 들어, 플라스미드, 미니서클, 선형 등)으로 존재할 수 있다. 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA는 게놈 내로 삽입된 다음 부위-특이적 레콤비나제에 의해 인식되는 (및 이용되는) 1개 이상의 표적 서열 (표적 부위)을 포함할 수 있다. 일부 경우에 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA는 표적 부위를 포함하지 않지만, 공여자 DNA의 삽입은 이러한 표적 부위가 게놈에 존재하도록 유발한다 (예를 들어, 예컨대 공여자 및 게놈이 점착성 말단을 갖는 일부 경우에, 공여자의 삽입 서열과 게놈의 접합부에서 표적 부위가 생성될 수 있음).
표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
일부 경우에, 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 (총) 10 이상의 염기 쌍 (bp) (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)의 길이를 갖는다. 다시 말해서, 일부 경우에 대상 공여자 DNA는 10 이상의 bp (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)를 갖는다.
일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 염기 쌍 (bp) 내지 150 킬로염기 쌍 (kbp) [단일 가닥인 경우에 'bp' 대신 뉴클레오티드 (nt) 단위] (예를 들어, 10 bp 내지 100 kbp, 70 kbp, 10 bp 내지 50 kbp, 10 bp 내지 40 kbp, 10 bp 내지 25 kbp, 10 bp 내지 15 kbp, 10 bp 내지 10 kbp, 10 bp 내지 1 kbp, 10 bp 내지 750 bp, 10 bp 내지 500 bp, 10 bp 내지 250 bp, 10 bp 내지 150 bp, 10 bp 내지 100 bp, 10 bp 내지 50 bp, 18 bp 내지 150 kbp, 18 bp 내지 100 kbp, 18 bp 내지 70 kbp, 18 bp 내지 50 kbp, 18 bp 내지 40 kbp, 18 bp 내지 25 kbp, 18 bp 내지 15 kbp, 18 bp 내지 10 kbp, 18 bp 내지 1 kbp, 18 bp 내지 750 bp, 18 bp 내지 500 bp, 18 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 150 kbp, 25 bp 내지 100 kbp, 25 bp 내지 70 kbp, 25 bp 내지 50 kbp, 25 bp 내지 40 kbp, 25 bp 내지 25 kbp, 25 bp 내지 15 kbp, 25 bp 내지 10 kbp, 25 bp 내지 1 kbp, 25 bp 내지 750 bp, 25 bp 내지 500 bp, 25 bp 내지 250 bp, 25 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 150 kbp, 50 bp 내지 100 kbp, 50 bp 내지 70 kbp, 50 bp 내지 50 kbp, 50 bp 내지 40 kbp, 50 bp 내지 25 kbp, 50 bp 내지 15 kbp, 50 bp 내지 10 kbp, 50 bp 내지 1 kbp, 50 bp 내지 750 bp, 50 bp 내지 500 bp, 50 bp 내지 250 bp, 50 bp 내지 150 bp, 100 bp 내지 150 kbp, 100 bp 내지 100 kbp, 100 bp 내지 70 kbp, 100 bp 내지 50 kbp, 100 bp 내지 40 kbp, 100 bp 내지 25 kbp, 100 bp 내지 15 kbp, 100 bp 내지 10 kbp, 100 bp 내지 1 kbp, 100 bp 내지 750 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 250 bp, 200 bp 내지 150 kbp, 200 bp 내지 100 kbp, 200 bp 내지 70 kbp, 200 bp 내지 50 kbp, 200 bp 내지 40 kbp, 200 bp 내지 25 kbp, 200 bp 내지 15 kbp, 200 bp 내지 10 kbp, 200 bp 내지 1 kbp, 200 bp 내지 750 bp, 200 bp 내지 500 bp, 10 kbp 내지 150 kbp, 10 kbp 내지 100 kbp, 10 kbp 내지 70 kbp, 10 kbp 내지 50 kbp, 10 kbp 내지 40 kbp, 10 kbp 내지 25 kbp, 50 kbp 내지 150 kbp, 50 kbp 내지 100 kbp, 50 kbp 내지 70 kbp, 70 kbp 내지 150 kbp, 또는 70 kbp 내지 100 kbp)을 갖는다 (이의 길이를 가짐). 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 50 kbp 내지 100 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 1 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 1 kbp를 갖는다.
일부 경우에 공여자 DNA는 모방체, 변형된 당 백본, 비-천연 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 1개 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오시드간 연결), 변형된 염기 등 중 1개 이상을 포함한다.
세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 임의의 편리한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 서열은 (총) 10 이상의 염기 쌍 (bp) (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)의 길이를 갖는다. 다시 말해서, 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 10 이상의 bp (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)를 갖는다.
일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 염기 쌍 (bp) 내지 150 킬로염기 쌍 (kbp) [단일 가닥인 경우에 'bp' 대신 뉴클레오티드 (nt) 단위] (예를 들어, 10 bp 내지 100 kbp, 70 kbp, 10 bp 내지 50 kbp, 10 bp 내지 40 kbp, 10 bp 내지 25 kbp, 10 bp 내지 15 kbp, 10 bp 내지 10 kbp, 10 bp 내지 1 kbp, 10 bp 내지 750 bp, 10 bp 내지 500 bp, 10 bp 내지 250 bp, 10 bp 내지 150 bp, 10 bp 내지 100 bp, 10 bp 내지 50 bp, 18 bp 내지 150 kbp, 18 bp 내지 100 kbp, 18 bp 내지 70 kbp, 18 bp 내지 50 kbp, 18 bp 내지 40 kbp, 18 bp 내지 25 kbp, 18 bp 내지 15 kbp, 18 bp 내지 10 kbp, 18 bp 내지 1 kbp, 18 bp 내지 750 bp, 18 bp 내지 500 bp, 18 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 150 kbp, 25 bp 내지 100 kbp, 25 bp 내지 70 kbp, 25 bp 내지 50 kbp, 25 bp 내지 40 kbp, 25 bp 내지 25 kbp, 25 bp 내지 15 kbp, 25 bp 내지 10 kbp, 25 bp 내지 1 kbp, 25 bp 내지 750 bp, 25 bp 내지 500 bp, 25 bp 내지 250 bp, 25 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 150 kbp, 50 bp 내지 100 kbp, 50 bp 내지 70 kbp, 50 bp 내지 50 kbp, 50 bp 내지 40 kbp, 50 bp 내지 25 kbp, 50 bp 내지 15 kbp, 50 bp 내지 10 kbp, 50 bp 내지 1 kbp, 50 bp 내지 750 bp, 50 bp 내지 500 bp, 50 bp 내지 250 bp, 50 bp 내지 150 bp, 100 bp 내지 150 kbp, 100 bp 내지 100 kbp, 100 bp 내지 70 kbp, 100 bp 내지 50 kbp, 100 bp 내지 40 kbp, 100 bp 내지 25 kbp, 100 bp 내지 15 kbp, 100 bp 내지 10 kbp, 100 bp 내지 1 kbp, 100 bp 내지 750 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 250 bp, 200 bp 내지 150 kbp, 200 bp 내지 100 kbp, 200 bp 내지 70 kbp, 200 bp 내지 50 kbp, 200 bp 내지 40 kbp, 200 bp 내지 25 kbp, 200 bp 내지 15 kbp, 200 bp 내지 10 kbp, 200 bp 내지 1 kbp, 200 bp 내지 750 bp, 200 bp 내지 500 bp, 10 kbp 내지 150 kbp, 10 kbp 내지 100 kbp, 10 kbp 내지 70 kbp, 10 kbp 내지 50 kbp, 10 kbp 내지 40 kbp, 10 kbp 내지 25 kbp, 50 kbp 내지 150 kbp, 50 kbp 내지 100 kbp, 50 kbp 내지 70 kbp, 70 kbp 내지 150 kbp, 또는 70 kbp 내지 100 kbp)을 갖는다 (이의 길이를 가짐). 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 50 kbp 내지 100 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 1 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 표적 공여자 조성물의 공여자 DNA (제1 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 1 kbp를 갖는다.
일부 실시양태에서, 2개의 표적 부위가 게놈 내로 삽입된다 (하기에 보다 상세히 기재된 제2 공여자 DNA - 삽입 공여자 조성물 -로부터의 관심 단일 뉴클레오티드 서열의 삽입을 수용하기 위해). 다시 말해서, 일부 실시양태에서 표적 공여자 조성물의 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하며, 이는 임의의 편리한 접근법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 표적 부위는 동일한 제1 공여자 DNA 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 2개의 표적 부위 각각은 별개의 제1 공여자 DNA 상의 게놈 내로 삽입되고, 따라서 대상 전달 비히클의 페이로드는 일부 경우에 2개의 상이한 제1 공여자 DNA를 포함할 수 있다 (예를 들어, 일부 경우에 이는, 예를 들어 2개의 상이한 부위-특이적 뉴클레아제를 사용하거나 또는 뉴클레아제 조성물의 일부로서 포함될 수 있는 적어도 2개의 상이한 가이드 RNA와 함께 단일 CRISPR/Cas 이펙터 단백질을 사용하여, 2개의 상이한 위치에서의 게놈의 절단을 필요로 할 것임).
2개의 표적 부위가 게놈 내로 생성/삽입되면 (예를 들어, 1개 또는 2개의 제1 공여자 DNA 및 1개 또는 다중 부위 특이적 뉴클레아제 - 또는 CRISPR/Cas 이펙터 단백질과 함께 1개 또는 다중 가이드 RNA를 사용하여), 2개의 표적 부위는 1,000,000 염기 쌍 (bp) 이하 (예를 들어, 500,000 bp 이하, 100,000 bp 이하, 50,000 bp 이하, 10,000 bp 이하, 1,000 bp 이하, 750 bp 이하 또는 500 bp 이하)만큼 이격될 수 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 100,000 bp 이하만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 위치는 50,000 bp 이하만큼 이격되어 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 표적 부위는 5 내지 1,000,000 염기 쌍 (bp)의 범위 (예를 들어, 5 내지 500,000, 5 내지 100,000, 5 내지 50,000, 5 내지 10,000, 5 내지 5,000, 5 내지 1,000, 5 내지 500, 10 내지 1,000,000, 10 내지 500,000, 10 내지 100,000, 10 내지 50,000, 10 내지 10,000, 10 내지 5,000, 10 내지 1,000, 10 내지 500, 50 내지 1,000,000, 50 내지 500,000, 50 내지 100,000, 50 내지 50,000, 50 내지 10,000, 50 내지 5,000, 50 내지 1,000, 50 내지 500, 100 내지 1,000,000, 100 내지 500,000, 100 내지 100,000, 100 내지 50,000, 100 내지 10,000, 100 내지 5,000, 100 내지 1,000, 100 내지 500, 300 내지 1,000,000, 300 내지 500,000, 300 내지 100,000, 300 내지 50,000, 300 내지 10,000, 300 내지 5,000, 300 내지 1,000, 300 내지 500, 500 내지 1,000,000, 500 내지 500,000, 500 내지 100,000, 500 내지 50,000, 500 내지 10,000, 500 내지 5,000, 500 내지 1,000, 1,000 내지 1,000,000, 1,000 내지 500,000, 1,000 내지 100,000, 1,000 내지 50,000, 1,000 내지 10,000, 또는 1,000 내지 5,000 bp)만큼 이격되어 있다.
일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 1,000,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 500,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 150,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 50,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 20,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 15,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 20 내지 10,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다.
일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 1,000,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 500,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 150,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 50,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 20,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 15,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 500 내지 10,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다.
일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 1,000,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 500,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 150,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 50,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 20,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 15,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 1,000 내지 10,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다.
일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 1,000,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 500,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 150,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 50,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 20,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 15,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다. 일부 경우에 2개의 표적 부위는 5,000 내지 10,000 bp의 범위만큼 이격되어 있다.
제1 공여자 DNA가 이중 가닥인 경우에, 공여자 DNA의 각각의 말단은 독립적으로 5' 또는 3' 단일 가닥 오버행을 가질 수 있거나 또는 평활 말단일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 공여자 DNA의 양쪽 말단은 5' 오버행을 갖는다. 일부 경우에 공여자 DNA의 양쪽 말단은 3' 오버행을 갖는다. 일부 경우에 공여자 DNA의 한쪽 말단은 5' 오버행을 갖는 반면 다른 말단은 3' 오버행을 갖는다. 각각의 오버행은 임의의 편리한 길이일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 오버행의 길이는 독립적으로 2-200 뉴클레오티드 (nt) 길이일 수 있다 (예를 들어, 2-150, 2-100, 2-50, 2-25, 2-20, 2-15, 2-12, 2-10, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-150, 3-100, 3-50, 3-25, 3-20, 3-15, 3-12, 3-10, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 4-150, 4-100, 4-50, 4-25, 4-20, 4-15, 4-12, 4-10, 4-8, 4-7, 4-6, 5-150, 5-100, 5-50, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 5-8 또는 5-7 nt 참조). 일부 경우에 각각의 오버행의 길이는 독립적으로 2-20 nt 길이일 수 있다. 일부 경우에 각각의 오버행의 길이는 독립적으로 2-15 nt 길이일 수 있다. 일부 경우에 각각의 오버행의 길이는 독립적으로 2-10 nt 길이일 수 있다. 일부 경우에 각각의 오버행의 길이는 독립적으로 2-7 nt 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서 공여자 DNA는 적어도 1개의 아데닐화된 3' 말단을 갖는다.
임의의 편리한 표적 부위가 사용될 수 있다 (예를 들어, 게놈 내로 삽입되는 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열에 포함될 수 있음). 일부 경우에 표적 부위는 15 이상의 bp (또는 nt) 길이 (예를 들어, 18 이상, 20 이상, 25 이상 또는 30 이상의 bp) 이다. 일부 경우에 표적 부위는 15 내지 50 bp (또는 nt) (예를 들어, 15 내지 45, 15 내지 40, 15 내지 35, 18 내지 50, 18 내지 45, 18 내지 40, 18 내지 35, 20 내지 50, 20 내지 45, 20 내지 40, 20 내지 35, 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 30 내지 50, 30 내지 45, 30 내지 40, 30 내지 35)의 길이를 갖는다. 표적 부위의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: LoxP (Cre에 의해 인식됨), LoxP2722 (Cre에 의해 인식됨), att [예를 들어, attB (ΦC31), attP (ΦC31), attL (ΦC31 RDF), attR (ΦC31 RDF), RS (R에 의해 인식됨), gix (Gin에 의해 인식됨)] (예를 들어 미국 특허 번호 9,902,970; 9,783,822; 9,233,174; 8,546,135; 8,399,254; 8,058,506; 7,670,823; 및 5,888,732 참조 (이들 모두는 표적 부위 및/또는 상응하는 부위-특이적 레콤비나제에 관한 그의 교시내용에 대해 본원에 참조로 포함됨)).
III. 레콤비나제 조성물 (부위-특이적 레콤비나제)
대상 레콤비나제 조성물은 1개 이상의 서열 특이적 레콤비나제 (본원에서 부위-특이적 레콤비나제로도 지칭됨) 또는 1개 이상의 서열 특이적 레콤비나제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함한다. 대상 부위 특이적 레콤비나제는 게놈의 1개 이상의 표적 부위 (상기 참조) (제1 공여자 DNA로부터의 서열의 삽입 후) 및 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)의 1개 이상의 표적 부위를 인식할 수 있고 제2 공여자 DNA로부터의 관심 서열의 게놈 내로의 삽입을 촉매할 수 있는 것이다. 여러 부위 특이적 레콤비나제가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 임의의 편리한 부위 특이적 레콤비나제가 사용될 수 있다. 부위 특이적 레콤비나제의 예는 ΦC31, ΦC31 RDF, Cre 및 FLP를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 대표적인 부위 특이적 레콤비나제는 ΦC31 (PhiC31)의 인테그라제, R4, TP901-1, ΦBT1 (PhiBT1), Bxb1, RV-1, AA118, U153 및 ΦFC1 (PhiFC1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IV. 삽입 공여자 조성물 (제2 공여자 DNA)
대상 삽입 공여자 조성물은 제2 공여자 DNA를 포함한다. 제2 공여자 DNA는 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 편리한 포맷 (예를 들어, 플라스미드, 미니서클, 선형 등)으로 존재할 수 있다. 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA는 부위-특이적 레콤비나제에 의해 게놈 내로 삽입되는 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA는, 부위-특이적 레콤비나제가 제1 공여자 DNA의 (표적 공여자 조성물의) 서열의 삽입 동안 생성된 표적 부위를 사용하여 서열의 삽입을 촉매할 수 있는 한, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 따라서, 제2 공여자 DNA는 통상적으로 관심 서열의 게놈 내로의 삽입을 용이하게 하기 위해 부위 특이적 레콤비나제에 의해 인식되는 1개 이상의 표적 부위 (예를 들어, 제1 공여자 DNA와 관련하여 상기 논의된 표적 부위 참조)를 포함할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 일부 경우에 제2 공여자 DNA의 삽입은 일부 경우에 게놈에 남아있는 잔류 서열을 생성할 수 있다. 예를 들어, attB 및 attP 표적 부위가 사용되는 경우에, attL 및/또는 attR 서열(들)은 삽입이 완료된 후 게놈에 남아있을 수 있다.
일부 경우에, 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 1개의 표적 부위를 포함한다. 일부 경우에 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 1개 이상의 표적 부위 (예를 들어, 2개 이상의 표적 부위)를 포함한다. 일부 경우에 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 2개의 표적 부위를 포함한다. 일부 경우에 관심 뉴클레오티드 서열 (게놈 내로 삽입될 서열)은 2개의 표적 부위에 의해 플랭킹된다 (및 일부 경우에 2개의 표적 부위는 동일하고, 즉, 관심 뉴클레오티드 서열은 일부 경우에 동일한 표적 부위의 2개의 카피에 의해 플랭킹될 수 있음).
일부 경우에, 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 (총) 10 이상의 염기 쌍 (bp) (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)의 길이를 갖는다. 다시 말해서, 일부 경우에 대상 공여자 DNA는 10 이상의 bp (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)를 갖는다.
일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 염기 쌍 (bp) 내지 150 킬로염기 쌍 (kbp) [단일 가닥인 경우에 'bp' 대신 뉴클레오티드 (nt) 단위] (예를 들어, 10 bp 내지 100 kbp, 70 kbp, 10 bp 내지 50 kbp, 10 bp 내지 40 kbp, 10 bp 내지 25 kbp, 10 bp 내지 15 kbp, 10 bp 내지 10 kbp, 10 bp 내지 1 kbp, 10 bp 내지 750 bp, 10 bp 내지 500 bp, 10 bp 내지 250 bp, 10 bp 내지 150 bp, 10 bp 내지 100 bp, 10 bp 내지 50 bp, 18 bp 내지 150 kbp, 18 bp 내지 100 kbp, 18 bp 내지 70 kbp, 18 bp 내지 50 kbp, 18 bp 내지 40 kbp, 18 bp 내지 25 kbp, 18 bp 내지 15 kbp, 18 bp 내지 10 kbp, 18 bp 내지 1 kbp, 18 bp 내지 750 bp, 18 bp 내지 500 bp, 18 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 150 kbp, 25 bp 내지 100 kbp, 25 bp 내지 70 kbp, 25 bp 내지 50 kbp, 25 bp 내지 40 kbp, 25 bp 내지 25 kbp, 25 bp 내지 15 kbp, 25 bp 내지 10 kbp, 25 bp 내지 1 kbp, 25 bp 내지 750 bp, 25 bp 내지 500 bp, 25 bp 내지 250 bp, 25 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 150 kbp, 50 bp 내지 100 kbp, 50 bp 내지 70 kbp, 50 bp 내지 50 kbp, 50 bp 내지 40 kbp, 50 bp 내지 25 kbp, 50 bp 내지 15 kbp, 50 bp 내지 10 kbp, 50 bp 내지 1 kbp, 50 bp 내지 750 bp, 50 bp 내지 500 bp, 50 bp 내지 250 bp, 50 bp 내지 150 bp, 100 bp 내지 150 kbp, 100 bp 내지 100 kbp, 100 bp 내지 70 kbp, 100 bp 내지 50 kbp, 100 bp 내지 40 kbp, 100 bp 내지 25 kbp, 100 bp 내지 15 kbp, 100 bp 내지 10 kbp, 100 bp 내지 1 kbp, 100 bp 내지 750 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 250 bp, 200 bp 내지 150 kbp, 200 bp 내지 100 kbp, 200 bp 내지 70 kbp, 200 bp 내지 50 kbp, 200 bp 내지 40 kbp, 200 bp 내지 25 kbp, 200 bp 내지 15 kbp, 200 bp 내지 10 kbp, 200 bp 내지 1 kbp, 200 bp 내지 750 bp, 200 bp 내지 500 bp, 10 kbp 내지 150 kbp, 10 kbp 내지 100 kbp, 10 kbp 내지 70 kbp, 10 kbp 내지 50 kbp, 10 kbp 내지 40 kbp, 10 kbp 내지 25 kbp, 50 kbp 내지 150 kbp, 50 kbp 내지 100 kbp, 50 kbp 내지 70 kbp, 70 kbp 내지 150 kbp, 또는 70 kbp 내지 100 kbp)을 갖는다 (이의 길이를 가짐). 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 50 kbp 내지 100 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 10 bp 내지 1 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에, 대상 제2 공여자 DNA (삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA)는 총 20 bp 내지 1 kbp를 갖는다.
일부 경우에 공여자 DNA는 모방체, 변형된 당 백본, 비-천연 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 1개 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오시드간 연결), 변형된 염기 등 중 1개 이상을 포함한다.
세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 임의의 편리한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 서열은 (총) 10 이상의 염기 쌍 (bp) (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)의 길이를 갖는다. 다시 말해서, 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 10 이상의 bp (예를 들어, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 5,000 이상, 10,000 이상, 50,000 이상 또는 75,000 이상의 bp)를 갖는다.
일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 염기 쌍 (bp) 내지 150 킬로염기 쌍 (kbp) [단일 가닥인 경우에 'bp' 대신 뉴클레오티드 (nt) 단위] (예를 들어, 10 bp 내지 100 kbp, 70 kbp, 10 bp 내지 50 kbp, 10 bp 내지 40 kbp, 10 bp 내지 25 kbp, 10 bp 내지 15 kbp, 10 bp 내지 10 kbp, 10 bp 내지 1 kbp, 10 bp 내지 750 bp, 10 bp 내지 500 bp, 10 bp 내지 250 bp, 10 bp 내지 150 bp, 10 bp 내지 100 bp, 10 bp 내지 50 bp, 18 bp 내지 150 kbp, 18 bp 내지 100 kbp, 18 bp 내지 70 kbp, 18 bp 내지 50 kbp, 18 bp 내지 40 kbp, 18 bp 내지 25 kbp, 18 bp 내지 15 kbp, 18 bp 내지 10 kbp, 18 bp 내지 1 kbp, 18 bp 내지 750 bp, 18 bp 내지 500 bp, 18 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 150 kbp, 25 bp 내지 100 kbp, 25 bp 내지 70 kbp, 25 bp 내지 50 kbp, 25 bp 내지 40 kbp, 25 bp 내지 25 kbp, 25 bp 내지 15 kbp, 25 bp 내지 10 kbp, 25 bp 내지 1 kbp, 25 bp 내지 750 bp, 25 bp 내지 500 bp, 25 bp 내지 250 bp, 25 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 150 kbp, 50 bp 내지 100 kbp, 50 bp 내지 70 kbp, 50 bp 내지 50 kbp, 50 bp 내지 40 kbp, 50 bp 내지 25 kbp, 50 bp 내지 15 kbp, 50 bp 내지 10 kbp, 50 bp 내지 1 kbp, 50 bp 내지 750 bp, 50 bp 내지 500 bp, 50 bp 내지 250 bp, 50 bp 내지 150 bp, 100 bp 내지 150 kbp, 100 bp 내지 100 kbp, 100 bp 내지 70 kbp, 100 bp 내지 50 kbp, 100 bp 내지 40 kbp, 100 bp 내지 25 kbp, 100 bp 내지 15 kbp, 100 bp 내지 10 kbp, 100 bp 내지 1 kbp, 100 bp 내지 750 bp, 100 bp 내지 500 bp, 100 bp 내지 250 bp, 200 bp 내지 150 kbp, 200 bp 내지 100 kbp, 200 bp 내지 70 kbp, 200 bp 내지 50 kbp, 200 bp 내지 40 kbp, 200 bp 내지 25 kbp, 200 bp 내지 15 kbp, 200 bp 내지 10 kbp, 200 bp 내지 1 kbp, 200 bp 내지 750 bp, 200 bp 내지 500 bp, 10 kbp 내지 150 kbp, 10 kbp 내지 100 kbp, 10 kbp 내지 70 kbp, 10 kbp 내지 50 kbp, 10 kbp 내지 40 kbp, 10 kbp 내지 25 kbp, 50 kbp 내지 150 kbp, 50 kbp 내지 100 kbp, 50 kbp 내지 70 kbp, 70 kbp 내지 150 kbp, 또는 70 kbp 내지 100 kbp)을 갖는다 (이의 길이를 가짐). 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 50 kbp 내지 100 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 10 bp 내지 1 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 50 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 10 kbp를 갖는다. 일부 경우에 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 공여자 DNA (제2 공여자 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 총 20 bp 내지 1 kbp를 갖는다.
일부 실시양태에서 공여자 DNA는 적어도 1개의 아데닐화된 3' 말단을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 세포의 게놈 내로의 삽입은 삽입된 서열과 내인성 프로모터 (예를 들어, (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; 및 (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터)의 작동가능한 연결을 유발한다. 일부 경우에 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열은 프로모터 (예를 들어, (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; 및 (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터)에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 (제2 공여자 DNA의) 뉴클레오티드 서열은 단백질을 코딩한다. 임의의 편리한 단백질이 코딩될 수 있으며 - 예는 T 세포 수용체 (TCR) 단백질; T 세포 수용체 (TCR) 단백질의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역; 키메라 항원 수용체 (CAR); 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드; 리포터 단백질 (예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 GFP, RFP, CFP, YFP, 및 원적외선, 근적외선에서 형광을 발하는 형광 단백질 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 (제2 공여자 DNA의) 뉴클레오티드 서열은 다가 (예를 들어, 이종다가) 표면 수용체를 코딩한다 (예를 들어, T-세포가 표적 세포인 일부 경우에). 임의의 편리한 다가 수용체가 사용될 수 있고, 비제한적 예는 이중특이적 또는 삼중특이적 CAR 및/또는 TCR, 또는 면역 세포 상의 다른 친화성 태그를 포함한다. 이러한 삽입은 표적화된 세포가 수용체를 발현하도록 할 것이다. 일부 경우에, 다가는 개별 수용체를 삽입함으로써 삽입되며, 삽입된 수용체는 OR 게이트 (하나 또는 다른 것이 활성화를 촉발함)로서 또는 AND 게이트 (수용체 신호전달이 공동-자극성이고 동종가 결합이 세포, 예를 들어 표적화된 T-세포를 활성화/자극시키지 않을 것임)로서 기능한다. 삽입된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 (예를 들어, CAR, TCR, 다가 표면 수용체)은 그가 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 1개 이상의 표적에 결합하도록 (예를 들어, 세포, 예를 들어 T-세포를 이들에 표적화하는 기능을 하도록) 선택될 수 있다.
일부 경우에, 삽입된 뉴클레오티드 서열은 수용체를 코딩하며, 수용체에 의해 표적화 (결합)되는 표적은 개체의 질환 (예를 들어, 암/종양)에 특이적이다. 일부 경우에, 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종다가 수용체를 코딩하며, 이종다가 수용체에 의해 표적화되는 표적의 조합은 개체의 질환 (예를 들어, 암/종양)에 특이적이다. 한 예시적인 예로서, 개체의 암 (예를 들어, 예컨대 생검을 통한 종양)을 서열분석하여 (핵산 서열, 단백질체학, 대사체학 등), 표적일 수 있는 이환 세포의 항원 (예컨대 개체의 대조군 세포에 비해 종양에 의해 과다발현되거나 그에 독특한 항원)을 확인할 수 있고, 이러한 표적 중 1개 이상 (예를 들어, 이러한 표적 중 2개 이상, 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 약 20개)에 결합하는 수용체 (예를 들어, 이종다가 수용체)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, B-세포, T-세포, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 사용함) 내로 삽입하여, 면역 세포가 개체의 이환 세포 (예를 들어, 종양 세포)를 특이적으로 표적화하도록 할 수 있다. 따라서, (제2 공여자 DNA의) 삽입된 뉴클레오티드 서열은 진단상 반응성이도록 설계될 수 있고 - 코딩된 수용체(들) (예를 들어, 이종다가 수용체(들))가 환자의 단백질체학, 게놈학 또는 대사체학과 관련된 독특한 통찰을 (예를 들어, 서열분석 등을 통해) 제공받은 후에 설계될 수 있다는 의미에서 -, 따라서 열렬한 특이적 면역계 반응을 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 면역 세포 (예컨대 NK 세포, B 세포, T 세포 등)는 개체 자신의 질환 (예를 들어, 암)에 대해 효과적이도록 설계된 수용체, 예컨대 CAR 및/또는 TCR 단백질 (예를 들어, 이종다가 버전)을 발현하도록 게놈 편집될 수 있다. 일부 경우에, 조절 T 세포는 진단상-반응성 의약 후 자가면역에 의해 이환된 조직에 대해 유사한 결합력을 제공받을 수 있다.
일부 경우에, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 인트론을 갖지 않는 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 인트론을 갖지 않는 뉴클레오티드 서열은 TCR 단백질의 전부 또는 일부를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 1개 초과의 전달 비히클이 표적 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩한다. 일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩한다.
일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다. TCR 단백질 및 CDR과 관련된 보다 많은 정보에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21; 및 Glanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21]을 참조한다.
일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛을 코딩한다. 일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩한다. 일부 경우에 대상 방법은 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다. TCR 단백질 및 CDR과 관련된 보다 많은 정보에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21; 및 Glanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21]을 참조한다.
전달 비히클 / 페이로드
일부 실시양태에서, 대상 조성물 (뉴클레아제 조성물, 표적 공여자 조성물, 레콤비나제 조성물 및/또는 삽입 공여자 조성물)은 동일한 전달 비히클의 페이로드로서 세포에 전달된다. 예를 들어, 일부 경우에, (i) 대상 제1 공여자 DNA; (ii) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 (예컨대 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, CRISPR/Cas 이펙터 단백질) (1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산); (iii) 부위 특이적 레콤비나제; 및 (iv) 제2 공여자 DNA는 동일한 전달 비히클의 페이로드이다. 일부 이러한 경우에 페이로드는 함께 결합하여 1개 이상의 리보핵단백질 복합체 (예를 들어, 단백질 및 RNA, 예를 들어 CRISPR/Cas 이펙터 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 복합체), 데옥시리보핵단백질 복합체 (예를 들어, DNA 및 단백질을 포함하는 복합체), 및/또는 리보-데옥시리보핵단백질 복합체 (예를 들어, 단백질, DNA 및 RNA를 포함하는 복합체)를 형성한다.
전달 비히클은 비-바이러스 비히클, 바이러스 비히클, 나노입자 (예를 들어, 표적화 리간드 및/또는 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 나노입자), 리포솜, 미셀, 물-오일-물 에멀젼 입자, 오일-물 에멀젼 미셀 입자, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 펩티드 표적화 리간드) (여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드와 축합되고/거나 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용함), 페이로드에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 펩티드 표적화 리간드) (여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공함)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 전달 비히클은 물-오일-물 에멀젼 입자이다. 일부 경우에, 전달 비히클은 오일-물 에멀젼 미셀 입자이다. 일부 경우에, 전달 비히클은 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자이다. 일부 경우에, 전달 비히클은 다층 입자이다. 일부 경우에, 전달 비히클은 DNA 오리가미 나노봇이다. 상기 중 임의의 것에 대해, 페이로드 (핵산 및/또는 단백질)는 공유적으로, 핵산 상보적 쌍으로서, 또는 입자의 수상 내의 것으로, 입자의 내부에 존재할 수 있다. 일부 경우에 전달 비히클은 표적화 리간드, 예를 들어 일부 경우에 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 오일-물 에멀젼 미셀 입자 상에, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 다층 입자 상에 또는 DNA 오리가미 나노봇 상에 코팅된 표적화 리간드 (본원의 다른 곳에 보다 상세히 기재됨)를 포함한다. 일부 경우에 전달 비히클은 금속 입자 코어를 갖고, 페이로드 (예를 들어, 공여자 DNA 및/또는 부위 특이적 뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 핵산)는 금속 코어에 접합 (공유 결합)될 수 있다.
나노입자
본 개시내용의 나노입자는 핵산 및/또는 단백질로 제조될 수 있는 페이로드를 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 나노입자는 핵산 페이로드 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)를 전달하는데 사용된다. 일부 경우에 나노입자의 코어는 페이로드(들)를 포함한다. 일부 이러한 경우에 나노입자 코어는 또한 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함할 수 있다. 일부 경우에 나노입자는 금속성 코어를 갖고, 페이로드는 코어와 회합된다 (일부 경우에, 예를 들어 코어의 외부에 접합됨). 일부 실시양태에서, 페이로드는 나노입자 코어의 일부이다. 따라서, 대상 나노입자의 코어는 핵산, DNA, RNA 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 대상 나노입자는 핵산 (DNA 및/또는 RNA) 및 단백질을 포함한다. 일부 경우에 대상 나노입자 코어는 리보핵단백질 (RNA 및 단백질) 복합체를 포함한다. 일부 경우에 대상 나노입자 코어는 데옥시리보핵단백질 (DNA 및 단백질, 예를 들어 공여자 DNA 및 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 이펙터 단백질) 복합체를 포함한다. 일부 경우에 대상 나노입자 코어는 리보-데옥시리보핵단백질 (RNA 및 DNA 및 단백질, 예를 들어 가이드 RNA, 공여자 DNA 및 CRISPR/Cas 이펙터 단백질) 복합체를 포함한다. 일부 경우에 대상 나노입자 코어는 PNA를 포함한다. 일부 경우에 대상 코어는 PNA 및 DNA를 포함한다.
대상 핵산 페이로드는 모르폴리노 백본 구조를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 핵산 페이로드 (예를 들어, 공여자 DNA 및/또는 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및/또는 레콤비나제를 코딩하는 핵산)는 1개 이상의 잠금 핵산 (LNA)을 가질 수 있다. 적합한 당 치환기는 메톡시 (-O-CH3), 아미노프로폭시 (--O CH2 CH2 CH2NH2), 알릴 (-CH2-CH=CH2), -O-알릴 (--O-- CH2-CH=CH2) 및 플루오로 (F)를 포함한다. 2'-당 치환 기는 아라비노 (상부) 위치 또는 리보 (하부) 위치에 있을 수 있다. 적합한 염기 변형은 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C=C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 변형된 핵염기는 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b) (1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도(3',2':4,5)피롤로(2,3-d)피리미딘-2-온)을 포함한다.
일부 경우에, 핵산 페이로드는 접합체 모이어티 (예를 들어, 핵산 페이로드의 활성, 안정성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 것)를 포함할 수 있다. 이들 모이어티 또는 접합체는 관능기, 예컨대 1급 또는 2급 히드록실 기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 접합체 기는 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약역학적 특성을 증진시키는 기 및 올리고머의 약동학적 특성을 증진시키는 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 접합체 기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 약역학적 특성을 증진시키는 군은 흡수를 개선시키고/거나, 분해에 대한 저항성을 증진시키고/거나, 표적 핵산과의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 군을 포함한다. 약동학적 특성을 증진시키는 기는 대상 핵산의 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기를 포함한다.
임의의 편리한 폴리뉴클레오티드는 공여자 DNA (예를 들어, 부위 특이적 뉴클레아제 및/또는 부위 특이적 레콤비나제를 전달하기 위한)가 아닌 대상 핵산 페이로드로서 사용될 수 있다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: DNA 및 RNA의 종, 예컨대 mRNA, m1A 변형된 mRNA (아데노신의 위치 1에서의 모노메틸화), 모르폴리노 RNA, 펩토이드 및 펩티드 핵산, cDNA, DNA 오리가미, 합성 뉴클레오티드를 갖는 DNA 및 RNA, 미리 규정된 2차 구조를 갖는 DNA 및 RNA, 및 상기 언급된 것의 다량체 및 올리고머.
상기 언급된 바와 같이, 1개 초과의 페이로드가 동일한 패키지 (전달 비히클) (예를 들어, 나노입자)의 일부로서 전달되고, 예를 들어 일부 경우에는 상이한 페이로드가 상이한 코어의 일부이다. 동일한 전달 비히클 (예를 들어, 나노입자)의 일부로서 다중 페이로드를 전달하는 것의 한 이점은 각각의 페이로드의 효율이 희석되지 않는다는 것이다. 예시적인 예로서, 페이로드 A 및 페이로드 B가 2개의 개별 패키지/비히클 (각각 패키지 A 및 패키지 B)로 전달된다면, 효율은 곱셈되며, 예를 들어 패키지 A 및 패키지 B가 각각 1% 형질감염 효율을 갖는다면, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.01% (1% X 1%)이다. 그러나, 페이로드 A 및 페이로드 B가 둘 다 동일한 전달 비히클의 일부로서 전달된다면, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.01%보다 100배 개선된 1%이다.
마찬가지로, 패키지 A 및 패키지 B가 각각 0.1% 형질감염 효율을 갖는 시나리오에서, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.0001% (0.1% X 0.1%)이다. 그러나, 페이로드 A 및 페이로드 B가 둘 다 이 시나리오에서 동일한 패키지의 일부 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부 - 패키지 A)로서 전달된다면, 페이로드 A 및 페이로드 B를 동일한 세포에 전달할 가능성은 0.0001% 초과의 1000배 개선된 0.1%이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음) 및 공여자 DNA는 게놈 편집 효율을 증가시키는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부로서) 전달된다. 일부 경우에, 1개 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음) 및 공여자 DNA는 세포 분열 및/또는 분화를 제어하는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부로서) 전달된다.
상기의 비제한적 예로서, 일부 실시양태에서 1개 이상의 유전자 편집 도구 및 공여자 DNA는 SCF (및/또는 SCF를 코딩하는 DNA 또는 mRNA), HoxB4 (및/또는 HoxB4를 코딩하는 DNA 또는 mRNA), BCL-XL (및/또는 BCL-XL을 코딩하는 DNA 또는 mRNA), SIRT6 (및/또는 SIRT6을 코딩하는 DNA 또는 mRNA), miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 및/또는 LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA) 중 1개 이상과 조합되어 전달될 수 있다.
유전자 편집 도구 (예를 들어, 부위 특이적 뉴클레아제) 및 공여자 DNA와 조합되어 전달될 수 있는 마이크로RNA의 예에 대해서는, 도 9를 참조한다. 예를 들어, 하기 마이크로RNA가 하기 목적을 위해 사용될 수 있다: 만능 줄기 세포의 외배엽 계통으로의 분화를 차단하기 위해: miR-430/427/302 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000738, MI0000772, MI0000773, MI0000774, MI0006417, MI0006418, MI0000402, MI0003716, MI0003717 및 MI0003718 참조); 만능 줄기 세포의 내배엽 계통으로의 분화를 차단하기 위해: miR-109 및/또는 miR-24 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000080, MI0000081, MI0000231 및 MI0000572 참조); 만능 줄기 세포의 내배엽 계통으로의 분화를 유도하기 위해: miR-122 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000442 및 MI0000256 참조) 및/또는 miR-192 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000234 및 MI0000551 참조); 외배엽 전구 세포의 각질세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-203 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000283, MI0017343 및 MI0000246 참조); 신경 능선 줄기 세포의 평활근 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-145 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000461, MI0000169 및 MI0021890 참조); 신경 줄기 세포의 신경교 세포 운명 및/또는 뉴런 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-9 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000466, MI0000467, MI0000468, MI0000157, MI0000720 및 MI0000721 참조) 및/또는 miR-124a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000443, MI0000444, MI0000445, MI0000150, MI0000716 및 MI0000717 참조); 중배엽 전구 세포의 연골세포 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-199a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000242, MI0000281, MI0000241 및 MI0000713 참조); 중배엽 전구 세포의 골모세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-296 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000747 및 MI0000394 참조) 및/또는 miR-2861 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0013006 및 MI0013007 참조); 중배엽 전구 세포의 심장 근육 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-1 (예를 들어, MiR 염기 등록번호번호: MI0000437, MI0000651, MI0000139, MI0000652, MI0006283 참조); 중배엽 전구 세포의 심장 근육 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-133 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000450, MI0000451, MI0000822, MI0000159, MI0000820, MI0000821 및 MI0021863 참조); 중배엽 전구 세포의 골격근 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-214 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000290 및 MI0000698 참조), miR-206 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000490 및 MI0000249 참조), miR-1 및/또는 miR-26a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000083, MI0000750, MI0000573 및 MI0000706 참조); 중배엽 전구 세포의 골격근 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-133 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000450, MI0000451, MI0000822, MI0000159, MI0000820, MI0000821 및 MI0021863 참조), miR-221 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000298 및 MI0000709 참조), 및/또는 miR-222 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000299 및 MI0000710 참조); 분화로의 조혈 전구 세포의 분화를 유도하기 위해: miR-223 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000300 및 MI0000703 참조); 분화로의 조혈 전구 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-128a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000447 및 MI0000155 참조) 및/또는 miR-181a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000269, MI0000289, MI0000223 및 MI0000697 참조); 조혈 전구 세포의 림프 전구 세포로의 분화를 유도하기 위해: miR-181 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000269, MI0000270, MI0000271, MI0000289, MI0000683, MI0003139, MI0000223, MI0000723, MI0000697, MI0000724, MI0000823 및 MI0005450 참조); 조혈 전구 세포의 림프 전구 세포로의 분화를 차단하기 위해: miR-146 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000477, MI0003129, MI0003782, MI0000170 및 MI0004665 참조); 조혈 전구 세포의 골수 전구 세포로의 분화를 차단하기 위해: miR-155, miR-24a, 및/또는 miR-17 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000071 및 MI0000687 참조); 림프 전구 세포의 T 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-150 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000479 및 MI0000172 참조); 골수 전구 세포의 과립구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-223 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000300 및 MI0000703 참조); 골수 전구 세포의 단핵구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-17-5p (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MIMAT0000070 및 MIMAT0000649 참조), miR-20a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000076 및 MI0000568 참조), 및/또는 miR-106a (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000113 및 MI0000406 참조); 골수 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-150 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000479 및 MI0000172 참조), miR-155, miR-221 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000298 및 MI0000709 참조), 및/또는 miR-222 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000299 및 MI0000710 참조); 및 골수 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-451 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0001729, MI0017360, MI0001730 및 MI0021960 참조) 및/또는 miR-16 (예를 들어, MiR 염기 등록번호: MI0000070, MI0000115, MI0000565 및 MI0000566 참조).
유전자 편집 도구, 제1 및 제2 공여자 DNA, 및 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산)와 조합되어 (예를 들어, 단백질로서 또는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA로서) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예에 대해서는, 도 10을 참조한다. 동일한 단백질이, 예를 들어 나노입자를 수용하는 표적 세포에서의 분화를 편향시킬 목적으로, 표적화 리간드와 유사한 방식으로 대상 나노입자의 외부 쉘의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)은 하기 목적을 위해 사용될 수 있다: 조혈 줄기 세포의 공통 림프 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-7 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3574 참조); 조혈 줄기 세포의 공통 골수 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3562 참조), GM-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID 1437 참조), 및/또는 M-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID 1435 참조); 공통 림프 전구 세포의 B-세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, IL-4 (예를 들어, NCBI 유전자 ID: 3565 참조), 및/또는 IL-7; 공통 림프 전구 세포의 자연 킬러 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-15 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3600 참조); 공통 림프 전구 세포의 T-세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-2 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3558 참조), IL-7, 및/또는 Notch (예를 들어, NCBI 유전자 ID 4851, 4853, 4854, 4855 참조); 공통 림프 전구 세포의 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 2323 참조); 공통 골수 전구 세포의 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, 및/또는 TNF-알파 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 7124 참조); 공통 골수 전구 세포의 과립구-대식세포 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF; 공통 골수 전구 세포의 거핵구-적혈구 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, SCF (예를 들어, NCBI 유전자 ID 4254 참조), 및/또는 Tpo (예를 들어, NCBI 유전자 ID 7173 참조); 거핵구-적혈구 전구 세포의 거핵구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, IL-6 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3569 참조), SCF, 및/또는 Tpo; 거핵구-적혈구 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: 에리트로포이에틴 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 2056 참조); 거핵구의 혈소판 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-11 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3589 참조) 및/또는 Tpo; 과립구-대식세포 전구 세포의 단핵구 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF 및/또는 M-CSF; 과립구-대식세포 전구 세포의 골수모세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF; 단핵구의 단핵구-유래된 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, IFN-알파 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3439 참조), 및/또는 IL-4; 단핵구의 대식세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IFN-감마, IL-6, IL-10 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3586 참조), 및/또는 M-CSF; 골수모세포의 호중구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: G-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID 1440 참조), GM-CSF, IL-6, 및/또는 SCF; 골수모세포의 호산구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF, IL-3, 및/또는 IL-5 (예를 들어, NCBI 유전자 ID 3567 참조); 및 골수모세포의 호염기구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: G-CSF, GM-CSF, 및/또는 IL-3.
본원에 기재된 다른 페이로드와 조합되어 (예를 들어, 단백질 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA로서) 전달될 수 있는 단백질의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: SOX17, HEX, OSKM (Oct4/Sox2/Klf4/c-myc) 및/또는 bFGF (예를 들어, 간 줄기 세포 계통으로의 분화를 유도함); HNF4a (예를 들어, 간세포 운명으로의 분화를 유도함); 폴리 (I:C), BMP-4, bFGF 및/또는 8-Br-cAMP (예를 들어, 내피 줄기 세포/전구세포 계통으로의 분화를 유도함); VEGF (예를 들어, 동맥 내피 운명으로의 분화를 유도함); Sox-2, Brn4, Myt1l, Neurod2, Ascl1 (예를 들어, 신경 줄기 세포/전구세포 계통으로의 분화를 유도함); 및 BDNF, FCS, 포르스콜린 및/또는 SHH (예를 들어, 뉴런, 성상세포 및/또는 핍지교세포 운명으로의 분화를 유도함).
본원에 기재된 다른 페이로드와 조합되어 (예를 들어, 단백질 및/또는 핵산, 예컨대 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA로서) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 시토카인 (예를 들어, 예컨대 CD8+ T-세포를 활성화시키기 위한 IL-2 및/또는 IL-15); Notch, Wnt 및/또는 Smad 신호전달 경로 중 1개 이상을 조정하는 리간드 및/또는 신호전달 단백질; SCF; 줄기 세포 분화 인자 (예를 들어 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, c-Myc 등); 및 후속 단리/정제/농축을 위한 일시적 표면 마커 "태그" 및/또는 형광 리포터. 예를 들어, 섬유모세포는 Sox2의 전달을 통해 신경 줄기 세포로 전환될 수 있는 한편 Oct3/4 및 소분자 "후성적 재설정 인자"의 존재 하에서는 심근세포로 전환될 것이다. 헌팅톤병 또는 CXCR4 돌연변이를 갖는 환자에서, 이들 섬유모세포는 뉴런 및 심장 세포와 연관된 이환 표현형 형질을 각각 코딩할 수 있다. 유전자 편집 교정 및 이들 인자를 단일 패키지로 전달함으로써, 도입되는 인자/페이로드 중 1개 이상 (모두는 아님)으로 인한 유해 효과의 위험이 유의하게 감소될 수 있다.
페이로드 방출의 시기 및/또는 위치가 제어될 수 있기 때문에 (본 개시내용의 다른 곳에서 보다 상세히 기재됨), 동일한 패키지 (예를 들어, 동일한 나노입자) 내의 다수의 페이로드의 패키징은 상이한 페이로드에 대한 상이한 방출 시간/속도 및/또는 위치를 달성하는 것을 방해하지 않는다. 예를 들어, 상기 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA의 방출은 동일한 패키지의 일부인 1개 이상의 유전자 편집 도구의 방출과 별개로 제어될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식 및/또는 분화를 제어하는 단백질 및/또는 핵산 (예를 들어, DNA, mRNA, 비-코딩 RNA, miRNA)은 1개 이상의 유전자 편집 도구보다 먼저 방출될 수 있거나 또는 1개 이상의 유전자 편집 도구보다 나중에 방출될 수 있다. 이는, 예를 들어 1개 초과의 유출가능한 층을 사용함으로써 및/또는 1개 초과의 코어를 사용함으로써 (예를 들어, 여기서 1개의 코어는 다른 것과 상이한 방출 프로파일을 갖고, 예를 들어 상이한 D- 대 L-이성질체 비를 사용하고, 상이한 ESP:ENP:EPP 프로파일을 사용하는 것 등) 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 공여자 및 뉴클레아제는 단계적 방식으로 방출될 수 있어 최적의 편집 및 삽입 효율을 가능하게 한다. 마찬가지로, 일부 경우에 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산) 및 제2 공여자 DNA를 방출시키기 전에 제1 공여자 DNA 및 뉴클레아제 (또는 이를 코딩하는 핵산)를 방출시키는 것이 바람직할 수 있다.
나노입자 코어
대상 나노입자의 코어는 음이온성 중합체 조성물 (예를 들어, 폴리(글루탐산)), 양이온성 중합체 조성물 (예를 들어, 폴리(아르기닌), 양이온성 폴리펩티드 조성물 (예를 들어, 히스톤 테일 펩티드), 및 페이로드 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 페이로드, 예를 들어 제1 및 제2 공여자 DNA (예를 들어, 각각 1개 이상), 부위 특이적 뉴클레아제 또는 부위-특이적 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 부위 특이적 레콤비나제 또는 이를 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산 중합체의 존재 하에 (및 일부 경우에 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드의 존재 하에) 양이온성 아미노산 중합체과 페이로드의 축합에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 코어를 구성하는 성분들의 축합은 양이온성 중합체와 페이로드와의 접합체와 비교하여 증가된 형질감염 효율을 매개할 수 있다. 나노입자 코어에 음이온성 중합체를 포함시키는 것은 나노입자의 세포내 체류 및 페이로드의 방출의 지속기간을 연장시킬 수 있다.
코어의 양이온성 및 음이온성 중합체 조성물의 경우, D-이성질체 중합체 대 L-이성질체 중합체의 비는 페이로드의 시한 방출을 제어하도록 제어될 수 있으며, 여기서 D-이성질체 중합체 대 L-이성질체 중합체의 증가된 비는 증가된 안정성 (감소된 페이로드 방출 속도)으로 이어지고, 이는 예를 들어 대상 나노입자에 의해 전달된 페이로드로부터 보다 오래 지속되는 유전자 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에 나노입자 코어 내의 D-대-L 이성질체 폴리펩티드의 비를 조절하는 것은 유전자 발현 프로파일 (예를 들어, 페이로드 분자에 의해 코딩되는 단백질의 발현)이 대략 1-90일 (예를 들어 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15 또는 5-10일)이 되도록 할 수 있다. 페이로드 방출의 제어 (예를 들어, 유전자 편집 도구를 전달하는 경우에)는, 예를 들어 상동성-지정 복구가 요구되는 일부 경우에 게놈 편집을 수행하는데 특히 효과적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 유출가능한 층을 포함하고, 여기서 코어는 (a) 음이온성 중합체 조성물; (b) 양이온성 중합체 조성물; (c) 양이온성 폴리펩티드 조성물; 및 (d) 핵산 및/또는 단백질 페이로드를 포함하고, 여기서 (a) 및 (b) 중 하나는 아미노산의 D-이성질체 중합체를 포함하고, (a) 및 (b) 중 다른 것은 아미노산의 L-이성질체 중합체를 포함하고, 여기서 D-이성질체 중합체 대 L-이성질체 중합체의 비는 10:1 내지 1.5:1 (예를 들어, 8:1 내지 1.5:1, 6:1 내지 1.5:1, 5:1 내지 1.5:1, 4:1 내지 1.5:1, 3:1 내지 1.5:1, 2:1 내지 1.5:1, 10:1 내지 2:1; 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 5:1 내지 2:1, 10:1 내지 3:1; 8:1 내지 3:1, 6:1 내지 3:1, 5:1 내지 3:1, 10:1 내지 4:1; 4:1 내지 2:1, 6:1 내지 4:1, 또는 10:1 내지 5:1), 또는 1:1.5 내지 1:10 (예를 들어 1:1.5 내지 1:8, 1:1.5 내지 1:6, 1:1.5 내지 1:5, 1:1.5 내지 1:4, 1:1.5 내지 1:3, 1:1.5 내지 1:2, 1:2 내지 1:10, 1:2 내지 1:8, 1:2 내지 1:6, 1:2 내지 1:5, 1:2 내지 1:4, 1:2 내지 1:3, 1:3 내지 1:10, 1:3 내지 1:8, 1:3 내지 1:6, 1:3 내지 1:5, 1:4 내지 1:10, 1:4 내지 1:8, 1:4 내지 1:6, 또는 1:5 내지 1:10)의 범위이다. 일부 이러한 경우에, D-이성질체 중합체 대 L-이성질체 중합체의 비는 1:1이 아니다. 일부 이러한 경우에, 음이온성 중합체 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 음이온성 중합체를 포함하며, 여기서 (임의로) 양이온성 중합체 조성물은 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-리신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에 양이온성 중합체 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 중합체를 포함하며, 여기서 (임의로) 음이온성 중합체 조성물은 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 음이온성 중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 유출가능한 층을 포함하고, 여기서 코어는 (i) 음이온성 중합체 조성물; (ii) 양이온성 중합체 조성물; (iii) 양이온성 폴리펩티드 조성물; 및 (iv) 핵산 및/또는 단백질 페이로드를 포함하고, 여기서 (a) 상기 음이온성 중합체 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체를 포함하고/거나; (b) 상기 양이온성 중합체 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체를 포함한다. 일부 이러한 경우에, 음이온성 중합체 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 제1 음이온성 중합체를 포함하고; 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 제2 음이온성 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 중합체 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 제1 양이온성 중합체를 포함하고; 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-리신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 제2 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체는, 상기 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체에 대해, 10:1 내지 1:10 범위의 비로 존재한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체는, 상기 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체에 대해, 10:1 내지 1:10 범위의 비로 존재한다.
나노입자 성분 (시기)
일부 실시양태에서, 페이로드 방출의 시기는 특정한 유형의 단백질을, 예를 들어 코어의 일부 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 일부, 양이온성 중합체 조성물의 일부, 및/또는 음이온성 중합체 조성물의 일부)로서 선택함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 페이로드 방출을 특정한 시간 범위 동안 또는 페이로드가 특정한 세포 위치 (예를 들어, 시토졸, 핵, 리소솜, 엔도솜)에 또는 특정한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH 등) 하에 존재할 때까지 지연시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 특이적 단백질 활성 (예를 들어, 효소적 활성)에 감수성인, 예를 들어 특이적 단백질 활성 (예를 들어, 효소적 활성)에 대한 기질인 단백질이 (예를 들어, 코어의 일부로서) 사용되고, 이는 일반적인 편재성 세포 기구, 예를 들어 일반적인 분해 기구에 감수성인 것과 대조적이다. 특이적 단백질 활성에 감수성인 단백질은 본원에서 '효소적으로 감수성인 단백질' (ESP)로 지칭된다. ESP의 예시적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (i) 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 활성 (세포외 활성의 예)에 대한 기질인 단백질, 예를 들어 MMP에 의해 인식되는 모티프를 포함하는 단백질; (ii) 카텝신 활성 (세포내 엔도솜 활성의 예)에 대한 기질인 단백질, 예를 들어 카텝신에 의해 인식되는 모티프를 포함하는 단백질; 및 (iii) 메틸트랜스퍼라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제 활성 (세포내 핵 활성의 예)에 대한 기질인 단백질, 예컨대 히스톤 테일 펩티드 (HTP), 예를 들어 효소적으로 메틸화/탈-메틸화될 수 있는 모티프 및/또는 효소적으로 아세틸화/탈-아세틸화될 수 있는 모티프를 포함하는 단백질. 예를 들어, 일부 경우에 핵산 페이로드는 아세틸트랜스퍼라제 활성에 대한 기질인 단백질 (예컨대 히스톤 테일 펩티드)과 축합되고, 단백질의 아세틸화는 단백질이 페이로드를 방출하게 하며 - 이에 따라, 아세틸화에 대해 다소 감수성인 단백질을 사용하도록 선택함으로써 페이로드 방출에 대한 제어를 실행할 수 있다.
일부 경우에, 대상 나노입자의 코어는 효소적으로 중성인 폴리펩티드 (ENP)를 포함하며, 이는 폴리펩티드가 특정한 활성을 갖지 않고 중성인 폴리펩티드 단독중합체 (즉, 반복 서열을 갖는 단백질)이다. 예를 들어, 둘 다 특정한 활성을 갖는 NLS 서열 및 HTP와는 달리, ENP는 그렇지 않다.
일부 경우에, 대상 나노입자의 코어는 효소적 활성에 대해 저항성인 단백질인 효소적으로 보호된 폴리펩티드 (EPP)를 포함한다. PP의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (i) 단백질분해적 분해에 저항할 수 있는 D-이성질체 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, D-이성질체 중합체); 및 (ii) 자기-보호 도메인, 예컨대 폴리글루타민 반복 도메인 (예를 들어, QQQQQQQQQQ) (서열식별번호: 170).
대상 나노입자의 일부 (예를 들어, 나노입자 코어의 일부)인 감수성 단백질 (ESP), 중성 단백질 (ENP) 및 보호된 단백질 (EPP)의 상대량을 제어함으로써, 페이로드의 방출을 제어할 수 있다. 예를 들어, 보다 많은 ESP의 사용은 일반적으로 보다 많은 EPP의 사용보다 더 신속한 페이로드 방출을 일으킬 수 있다. 추가로, 보다 많은 ESP의 사용은 일반적으로 특정한 세트의 조건/상황, 예를 들어 ESP가 감수성인 단백질 (예를 들어, 효소)의 활성을 유도하는 조건/상황에 좌우되는 페이로드의 방출을 일으킬 수 있다.
나노입자의 음이온성 중합체 조성물
음이온성 중합체 조성물은 1개 이상의 음이온성 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 음이온성 중합체 조성물은 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA) 및 그의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 주어진 음이온성 아미노산 중합체는 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 믹스를 포함할 수 있다. 각각의 중합체는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 중합체로서 조성물 중에 존재할 수 있으며, 여기서 D-이성질체는 분해되는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 더 안정하다. 따라서, 나노입자 코어에 D-이성질체 폴리(아미노산)을 포함시키는 것은 코어의 분해 및 후속 페이로드 방출을 지연시킨다. 따라서 페이로드 방출 속도는 제어될 수 있고 D-이성질체의 중합체 대 L-이성질체의 중합체의 비에 비례하며, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 보다 높은 비는 페이로드 방출의 지속기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킴). 다시 말해서, D- 및 L-이성질체의 상대량은 나노입자 코어의 시한 방출 동역학 및 분해 및 페이로드 방출에 대한 효소적 감수성을 조정할 수 있다.
일부 경우에, 대상 나노입자의 음이온성 중합체 조성물은 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA) 및 폴리(아스파르트산) (PDA))의 D-이성질체의 중합체 및 L-이성질체의 중합체를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L-이성질체 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 음이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된) D-이성질체의 중합체 인 제1 음이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함하고; (예를 들어, 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된) L-이성질체의 중합체인 제2 음이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함한다. 일부 경우에, 제1 음이온성 중합체 (D-이성질체) 대 제2 음이온성 중합체 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 대상 나노입자의 코어의 음이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 음이온성 중합체의 임의의 상기 예에 추가로 또는 그 대신에) 글리코사미노글리칸, 당단백질, 폴리사카라이드, 폴리(만누론산), 폴리(굴루론산), 헤파린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 케라탄, 케라탄 술페이트, 아그레칸, 폴리(글루코사민), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 음이온성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 코어 내의 음이온성 중합체는 1-200 kDa (예를 들어 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa) 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 음이온성 중합체는 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 폴리(글루탐산)을 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 예를 들어 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 음이온성 중합체 조성물의 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))가 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 핵 국재화 신호 (NLS) (하기에 보다 상세히 기재됨)를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체 조성물의 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 중합체는 대상 나노입자 코어를 생성할 때 양이온성 중합체 전에 첨가된다.
나노입자의 양이온성 중합체 조성물
양이온성 중합체 조성물은 1개 이상의 양이온성 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 양이온성 중합체 조성물은 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린) 및 그의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 주어진 양이온성 아미노산 중합체는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 및 시트룰린 잔기의 믹스 (임의의 편리한 조합)를 포함할 수 있다. 각각의 중합체는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 중합체로서 조성물 중에 존재할 수 있으며, 여기서 D-이성질체는 분해되는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 더 안정하다. 따라서, 나노입자 코어에 D-이성질체 폴리(아미노산)을 포함시키는 것은 코어의 분해 및 후속 페이로드 방출을 지연시킨다. 따라서 페이로드 방출 속도는 제어될 수 있고 D-이성질체의 중합체 대 L-이성질체의 중합체의 비에 비례하며, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 보다 높은 비는 페이로드 방출의 지속기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킴). 다시 말해서, D- 및 L-이성질체의 상대량은 나노입자 코어의 시한 방출 동역학 및 분해 및 페이로드 방출에 대한 효소적 감수성을 조정할 수 있다.
일부 경우에 대상 나노입자의 양이온성 중합체 조성물은 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린))의 D-이성질체의 중합체 및 L-이성질체의 중합체를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L-이성질체 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 양이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된) D-이성질체의 중합체인 제1 양이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함하고; (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-리신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된) L-이성질체의 중합체인 제2 양이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함한다. 일부 경우에, 제1 양이온성 중합체 (D-이성질체) 대 제2 양이온성 중합체 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 대상 나노입자의 코어의 양이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 양이온성 중합체의 임의의 상기 예에 추가로 또는 그 대신에) 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) (PAMAM), 폴리(아스파르트아미드), 폴리펩토이드 (예를 들어, 코어 축합을 위한 "거미줄"-유사 분지를 형성하기 위함), 전하-관능화 폴리에스테르, 양이온성 폴리사카라이드, 아세틸화 아미노 당, 키토산, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 양이온성 중합체 (예를 들어, 선형 또는 분지형 형태)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 코어 내의 양이온성 중합체는 1-200 kDa (예를 들어 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa) 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는, 예를 들어 대략 29 kDa의 분자량을 갖는 폴리(L-아르기닌)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 25 kDa의 분자량을 갖는 선형 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 10 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 70 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 중합체는 PAMAM을 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 예를 들어 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 양이온성 중합체 조성물의 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌) (PDR), 폴리(D-리신) (PDK), 폴리(D-히스티딘) (PDH), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌) (PLR), 폴리(L-리신) (PLK), 폴리(L-히스티딘) (PLH), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린))가 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 핵 국재화 신호 (NLS) (하기에 보다 상세히 기재됨)를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체 조성물의 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌) (PDR), 폴리(D-리신) (PDK), 폴리(D-히스티딘) (PDH), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌) (PLR), 폴리(L-리신) (PLK), 폴리(L-히스티딘) (PLH), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
나노입자의 양이온성 폴리펩티드 조성물
일부 실시양태에서, 나노입자의 양이온성 폴리펩티드 조성물은 안정성, 세포하 구획화 및/또는 페이로드 방출을 매개할 수 있다. 한 예로서, 대상 나노입자 코어 내의, 일반적으로 히스톤 테일 펩티드로 지칭되는 히스톤 단백질의 N-말단의 단편은, 일부 경우에 다양한 히스톤 변형에 의해 탈양성자화될 수 있을 뿐만 아니라 (예컨대 히스톤 아세틸트랜스퍼라제-매개 아세틸화의 경우), 나노입자 코어의 성분 (예를 들어, 페이로드)의 효과적인 핵-특이적 탈패키징을 매개할 수 있다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물은 히스톤 및/또는 히스톤 테일 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 히스톤 및/또는 히스톤 테일 펩티드일 수 있음). 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물은 NLS-함유 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 NLS-함유 펩티드일 수 있음). 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물은 가교를 용이하게 하는 시스테인 잔기에 의해 분리되어 있는 1개 이상의 NLS-함유 펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물은 미토콘드리아 국재화 신호를 포함하는 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 미토콘드리아 국재화 신호를 포함하는 펩티드일 수 있음).
나노입자의 유출가능한 층 (유출가능한 코트)
일부 실시양태에서, 대상 나노입자는 코어를 둘러싸는 (캡슐화하는) 유출가능한 층 (본원에서 "일시적 안정화 층"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 경우에, 대상 유출가능한 층은 초기 세포 흡수 전 및 그 동안 페이로드를 보호할 수 있다. 예를 들어, 유출가능한 층이 없으면, 세포 내재화 동안 다수의 페이로드가 상실될 수 있다. 세포 환경에 있으면, 유출가능한 층은 '유출'되어 (예를 들어, 층은 pH- 및/또는 글루타티온-민감성일 수 있음), 코어의 성분을 노출시킨다.
일부 경우에, 대상 유출가능한 층은 실리카를 포함한다. 일부 경우에, 대상 나노입자가 (예를 들어, 실리카의) 유출가능한 층을 포함하는 경우에, 감소된 세포 흡수 확률에도 불구하고 보다 큰 세포내 전달 효율이 관찰될 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 나노입자 코어를 유출가능한 층으로 코팅하는 것 (예를 들어, 실리카 코팅)은 코어를 밀봉하여, 이를 층의 유출시까지 안정화시킬 수 있으며, 이러한 유출은 (예를 들어, 의도된 세포하 구획에서의 프로세싱시) 페이로드의 방출을 일으킨다. 수용체-매개 세포내이입을 통한 세포 진입 후, 나노입자는 그의 최외각 층을 유출시키고, 유출가능한 층은 엔도솜의 산성화 환경 또는 시토졸의 환원성 환경에서 분해되어 코어를 노출시키고, 이는 일부 경우에 국재화 신호, 예컨대 핵 국재화 신호 (NLS) 및/또는 미토콘드리아 국재화 신호를 노출시킨다. 더욱이, 유출가능한 층에 의해 캡슐화된 나노입자 코어는 혈청에서 안정할 수 있고, 생체내 투여에 적합할 수 있다.
임의의 목적하는 유출가능한 층이 사용될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표적 세포에서 (예를 들어, 어떠한 조건 하에, 예컨대 낮은 pH 하에) 페이로드가 방출되기를 원하는 곳 (예를 들어, 엔도솜, 시토졸, 핵, 리소솜 등)을 고려할 수 있다. 상이한 유출가능한 층은 유출가능한 코트가 유출되기에 (및 따라서 페이로드를 방출하기에) 바람직한 시간, 곳 및/또는 조건에 따라 보다 바람직할 수 있다. 예를 들어, 유출가능한 층은 산 불안정성일 수 있다. 일부 경우에, 유출가능한 층은 음이온성 유출가능한 층 (음이온성 코트)이다. 일부 경우에, 유출가능한 층은 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 및/또는 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹)을 포함한다. 일부 경우에, 유출가능한 층은 칼슘, 망가니즈, 마그네슘, 철 (예를 들어, 유출가능한 층은 자기성일 수 있음, 예를 들어 Fe3MnO2) 및 리튬 중 1개 이상을 포함한다. 이들 각각은 포스페이트 또는 술페이트를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 유출가능한 층은 인산칼슘, 황산칼슘, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 인산철, 황산철, 인산리튬 및 황산리튬 중 1개 이상을 포함하며; 이들 각각은 유출가능한 층이 '유출'될 방법 및/또는 조건에 대해 특정한 효과를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에 유출가능한 층은 다음 중 1개 이상을 포함한다: 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹), 칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 산화칼슘, 히드록시아파타이트, 망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 산화망가니즈, 마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘, 철, 인산철, 황산철, 산화철, 리튬, 인산리튬 및 황산리튬 (그의 임의의 조합) (예를 들어, 유출가능한 층은 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹), 인산칼슘, 황산칼슘, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 인산철, 황산철, 인산리튬, 황산리튬 또는 그의 조합의 코팅일 수 있음). 일부 경우에, 유출가능한 층은 실리카를 포함한다 (예를 들어, 유출가능한 층은 실리카 코트일 수 있음). 일부 경우에, 유출가능한 층은 알기네이트 겔을 포함한다.
일부 경우에 상이한 페이로드에 대한 상이한 방출 시간이 바람직하다. 예를 들어, 일부 경우에 페이로드를 초기에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 0.5 - 7일 내에) 방출하는 것이 바람직하고, 일부 경우에 페이로드를 나중에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 6일 - 30일 내에) 방출하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 경우에, 표적 세포와의 접촉 0.5-7일 내에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일 또는 1-3일 내에) 페이로드 (예를 들어, 제1 공여자 DNA 및 유전자 편집 도구, 예컨대 CRISPR/Cas 가이드 RNA, 상기 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드, 및/또는 상기 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자)를 방출하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포와의 접촉 6-40일 내에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20 또는 9-15일 내에) 페이로드 (예를 들어, 제2 공여자 DNA 분자 및 레콤비나제 또는 이를 코딩하는 핵산)를 방출하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에 방출 시간은 상이한 페이로드를 갖는 나노입자를 상이한 시간에 전달함으로써 제어될 수 있다. 일부 경우에 방출 시간은 나노입자를 동시에 (상이한 제제의 일부로서 또는 동일한 제제의 일부로서) 전달함으로써 제어될 수 있으며, 여기서 나노입자의 성분은 목적하는 방출 시간을 달성하도록 설계된다. 예를 들어, 보다 빠르게 또는 보다 느리게 분해되는 유출가능한 층, 분해에 대해 보다 더 또는 보다 덜 저항성인 코어 성분, 탈축합에 대해 보다 더 또는 보다 덜 감수성인 코어 성분 등을 사용할 수 있고, 임의의 또는 모든 성분은 목적하는 시기를 달성하기 위해 임의의 편리한 조합으로 선택될 수 있다.
일부 경우에 페이로드는 상이한 시간에 방출되는 것이 바람직하다. 이는 다수의 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 1개 초과의 코어를 가질 수 있으며, 여기서 한 코어는 페이로드 (예를 들어, 제1 공여자 DNA, 및/또는 게놈 편집 도구, 예컨대 ZFP 또는 ZFP를 코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 등)를 초기에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 0.5-7일 내에, 예를 들어 표적 세포와의 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일 또는 1-3일 내에) 방출할 수 있는 성분으로 제조되고, 다른 것은 페이로드 (예를 들어, 제2 공여자 DNA 분자 및/또는 레콤비나제 또는 이를 코딩하는 핵산)를 나중에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 6-40일 내에, 예를 들어 표적 세포와의 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20 또는 9-15일 내에) 방출할 수 있는 성분으로 제조된다.
또 다른 예로서, 나노입자는 1개 초과의 유출가능한 층을 포함할 수 있으며, 여기서 외부 유출가능한 층이 유출되고 (페이로드를 방출함), 이후에 내부 유출가능한 층이 유출된다 (또 다른 페이로드를 방출함). 일부 경우에, 내부 페이로드는 제1 공여자 DNA 분자 및 1개 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, ZFN 또는 ZFN을 코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 등)이고, 외부 페이로드는 제2 공여자 DNA 및 서열 특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산)이다. 내부 및 외부 페이로드는 임의의 목적하는 페이로드일 수 있고, 어느 하나 또는 둘 다는, 예를 들어 1개 이상의 siRNA 및/또는 1개 이상의 mRNA를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 나노입자는 1개 초과의 유출가능한 층을 가질 수 있고, 한 페이로드 (예를 들어, 제1 공여자 DNA 및/또는 게놈 편집 도구, 예컨대 ZFP 또는 ZFP를 코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 또는 CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 등)를 초기에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 0.5-7일 내에, 예를 들어 표적 세포와의 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일 또는 1-3일 내에) 방출하도록 설계될 수 있고, 또 다른 페이로드 (예를 들어, 제2 공여자 DNA 분자 및/또는 레콤비나제)를 나중에 (예를 들어, 표적 세포와의 접촉 6-40일 내에, 예를 들어 표적 세포와의 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20 또는 9-15일 내에) 방출하도록 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 상기 기재된 실시양태에서), 변경된 유전자 발현의 시간은 페이로드 방출의 시간에 대한 대용물로서 사용될 수 있다. 예시적인 예로서, 페이로드가 제12일까지 방출되었는지를 결정하고자 하는 경우에, 제12일에 나노입자 전달의 목적하는 결과를 검정할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 결과가, 예를 들어 관심 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 삽입함으로써 관심 단백질을 발현하는 것이라면, 관심 단백질의 발현을 검정/모니터링하여 페이로드가 방출되었는지를 결정할 수 있다. 또 다른 예로서, 목적하는 결과가, 예를 들어 게놈 DNA를 절단하고/거나 공여자 DNA 분자의 서열을 삽입함으로써 표적 세포의 게놈을 변경시키는 것이라면, 표적화된 유전자좌로부터의 발현 및/또는 게놈 변경의 존재를 검정/모니터링하여 페이로드가 방출되었는지를 결정할 수 있다.
따라서, 일부 경우에 유출가능한 층은 나노입자 성분의 단계적 방출을 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 나노입자는 1개 초과 (예를 들어, 2, 3 또는 4개)의 유출가능한 층을 갖는다. 예를 들어, 2개의 유출가능한 층을 갖는 나노입자의 경우, 이러한 나노입자는, 최내각에서 최외각으로, 예를 들어 제1 페이로드를 갖는 코어; 제1 유출가능한 층, 예를 들어 제2 페이로드를 갖는 중간 층; 및 중간 층을 둘러싸는 제2 유출가능한 층을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 3 참조). 이러한 구성 (다수의 유출가능한 층)은 다양한 목적하는 페이로드의 단계적 방출을 용이하게 한다. 추가의 예시적인 예로서, 2개의 유출가능한 층을 갖는 나노입자 (상기 기재된 바와 같음)는 코어에 공여자 DNA 및/또는 1개 이상의 목적하는 유전자 편집 도구 (예를 들어, 공여자 DNA 분자, CRISPR/Cas 가이드 RNA, CRISPR/Cas 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 등 중 1개 이상)를, 중간 층에 또 다른 목적하는 유전자 편집 도구 (예를 들어, 제2 공여자 DNA 및 레콤비나제 또는 이를 코딩하는 핵산)를 - 임의의 목적하는 조합으로 포함할 수 있다.
대안적 패키징 (예를 들어, 지질 제제)
일부 실시양태에서, 대상 코어 (예를 들어, 상기 기재된 성분 및/또는 구성의 임의의 조합을 포함함)는 지질-기반 전달 시스템, 예를 들어 양이온성 지질 전달 시스템의 일부이다 (예를 들어, 문헌 [Chesnoy and Huang, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2000, 29:27-47; Hirko et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1185-93; 및 Liu et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1307-15] 참조). 일부 경우에, 대상 코어 (예를 들어, 상기 기재된 성분 및/또는 구성의 임의의 조합을 포함함)는 유출가능한 층에 의해 둘러싸이지 않는다. 상기 언급된 바와 같이, 코어는 음이온성 중합체 조성물 (예를 들어, 폴리(글루탐산)), 양이온성 중합체 조성물 (예를 들어, 폴리(아르기닌), 양이온성 폴리펩티드 조성물 (예를 들어, 히스톤 테일 펩티드), 및 페이로드 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 페이로드)를 포함할 수 있다.
코어가 지질-기반 전달 시스템의 일부인 일부 경우에, 코어는 시한 및/또는 위치 (예를 들어, 환경-특이적) 방출을 염두에 두고 설계된다. 예를 들어, 일부 경우에 코어는 ESP, ENP 및/또는 EPP를 포함하고, 일부 이러한 경우에 이들 성분은 목적하는 조건 (예를 들어, 세포 위치, 세포 조건, 예컨대 pH, 특정한 효소의 존재 등)이 코어 (예를 들어, 상기 기재됨)에 의해 마주쳐질 때까지 페이로드 방출이 지연되도록 하는 비로 존재한다. 일부 이러한 실시양태에서 코어는 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L-이성질체의 중합체는 서로에 대해 특정한 범위 내의 비 (예를 들어, 상기 기재됨)로 존재한다. 일부 경우에 코어는 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L-이성질체의 중합체는 서로에 대해 특정한 범위 내의 비 (예를 들어, 상기 기재됨)로 존재한다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L-이성질체의 중합체는 서로에 대해 특정한 범위 내의 비 (예를 들어, 상기 기재됨)로 존재한다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 중합체 및 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 중합체를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L-이성질체의 중합체는 서로에 대해 특정한 범위 내의 비 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재됨)로 존재한다. 일부 경우에 코어는 NLS (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재됨)를 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 경우에 코어는 HTP (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재됨)를 포함한다.
양이온성 지질은, 유전자 전달에 사용될 수 있고 플라스미드 DNA와 축합하는 능력을 갖는 비바이러스 벡터이다. 리포펙션을 위한 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드의 합성 후, 헤드 기, 링커 및 소수성 도메인 변형을 포함한 양이온성 지질의 분자 구조를 개선시키는 것이 활발한 분야였다. 변형은 증진된 표면 전하 밀도를 통해 DNA 결합 및 전달을 개선시킬 수 있는 다가 폴리아민의 사용 및 독성을 제한할 수 있는 스테롤계 소수성 기, 예컨대 3B-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일] 콜레스테롤의 사용을 포함하였다. 헬퍼 지질, 예컨대 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)은 엔도솜 이탈을 용이하게 하기 위해 증진된 리포솜 소수성 및 육각형 역상 전이를 통해 트랜스진 발현을 개선시키는데 사용될 수 있다. 일부 경우에 지질 제제는 DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, 98N12-5, C12-200, 콜레스테롤, PEG-지질, 리피도폴리아민, 덱사메타손-스페르민 (DS) 및 이치환된 스페르민 (D2S) (예를 들어, 덱사메타손을 폴리아민 스페르민에 접합시킴으로써 생성됨) 중 1개 이상을 포함한다. DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 및 DLin-MC3-DMA는 관련 기술분야에 약술된 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Heyes et al., J. Control Release, 2005, 107, 276-287; Semple et al., Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176; Akinc et al., Nature Biotechnology, 2008, 26, 561-569; Love et al., PNAS, 2010, 107, 1864-1869]; 국제 특허 출원 공개 WO2010054401 참조; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
다양한 지질-기반 전달 시스템의 예는 하기 공개물: 국제 특허 공개 번호 WO2016081029; 미국 특허 출원 공개 번호 US20160263047 및 US20160237455; 및 미국 특허 번호 9,533,047; 9,504,747; 9,504,651; 9,486,538; 9,393,200; 9,326,940; 9,315,828; 및 9,308,267에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 일부 경우에 대상 코어는 지질 (예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 리포펙타민 형질감염 시약)에 의해 둘러싸인다. 일부 경우에 대상 코어는 지질 제제 (예를 들어, 지질 나노입자 제제) 내에 존재한다. 지질 제제는 리포솜 및/또는 리포플렉스를 포함할 수 있다. 지질 제제는 에탄올 희석 (SNALP) 리포솜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및/또는 프로타민으로 코팅될 수 있는 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온성 지질을 포함하는 것)에 의한 자발적 소포 형성을 포함할 수 있다.
지질 제제는 리피도이드-기반 제제일 수 있다. 리피도이드의 합성은 광범위하게 기재되었고, 이들 화합물을 함유하는 제제는 대상 지질 제제에 포함될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869; 및 Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:12996-3001] 참조; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 경우에, 대상 지질 제제는 다음 중 1개 이상을 (임의의 목적하는 조합으로) 포함할 수 있다: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (DOPE); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); 1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 디옥타데실아미도글리실스페르민 (DOGS); N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1 (GAP-DLRIE); 프로판아미늄 브로마이드; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB); 6-라우록시헥실 오르니티네이트 (LHON); 1-(2,3-디올레오일옥시프로필)-2,4,6-트리메틸피리디늄 (2Oc); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도-에틸]-N,N-디메틸-1 (DOSPA); 프로판아미늄 트리플루오로아세테이트; 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOPA); N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1 (MDRIE); 프로판아미늄 브로마이드; 디미리스토옥시프로필 디메틸 히드록시에틸 암모늄브로마이드 (DMRI); 3.베타.-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 DC-Chol; 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤 (BGTC); 1,3-디오데옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드 (DOSPER); 디메틸옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB); 디옥타데실아미도글리실스페르미딘 (DSL); rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-히드록시에틸)]-디메틸암모늄 (CLIP-1); 클로라이드 rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필 (CLIP-6); 옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모늄 브로마이드; 에틸디미리스토일포스파티딜콜린 (EDMPC); 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DSDMA); 1,2-디미리스토일-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP); O,O'-디미리스틸-N-리실 아스파르테이트 (DMKE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DSEPC); N-팔미토일 D-에리트로-스핑고실 카르바모일-스페르민 (CCS); N-t-부틸-N0-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘; 디C14-아미딘; 옥타데세노일옥시[에틸-2-헵타데세닐-3 히드록시에틸] 이미다졸리늄 (DOTIM); 클로라이드 N1-콜레스테릴옥시카르보닐-3,7-디아자노난-1,9-디아민 (CDAN); 2-[3-[비스(3-아미노프로필)아미노]프로필아미노]-N-[2-[디(테트라데실)아미노]-2-옥소에틸]아세트아미드 (RPR209120); 디테트라데실카르바모일메-에틸-아세트아미드; 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLinDMA); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란; DLin-KC2-DMA; 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트; DLin-MC3-DMA; DLin-K-DMA; 98N12-5; C12-200; 콜레스테롤; PEG-지질; 리피오폴리아민; 덱사메타손-스페르민 (DS); 및 이치환된 스페르민 (D2S).
나노입자의 표면 코트 (외부 쉘)
일부 경우에, 유출가능한 층 (코트)은 그 자체가 본원에서 "외부 쉘", "외부 코트" 또는 "표면 코트"로 지칭되는 추가의 층에 의해 코팅된다. 표면 코트는 다수의 상이한 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 표면 코트는 전달 효율을 증가시킬 수 있고/거나 대상 나노입자를 특정한 세포 유형으로 표적화할 수 있다. 표면 코트는 펩티드, 중합체 또는 리간드-중합체 접합체를 포함할 수 있다. 표면 코트는 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 표적화 리간드의 수용액 (링커 도메인 존재 또는 부재)을 코팅된 나노입자 현탁액 (유출가능한 층으로 코팅된 나노입자의 현탁액)에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 (앵커링 도메인의) 양성자화된 앵커링 잔기의 최종 농도는 25 내지 300 μM이다. 일부 경우에, 표면 코트를 첨가하는 방법은 50 내지 150 nm의 평균 입자 크기 및 0 내지 -10 mV의 제타 전위를 갖는 입자의 단분산 현탁액을 생성한다.
일부 경우에, 표면 코트는 최외각 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용한다. 예를 들어, 일부 경우에, 나노입자는 2개의 유출가능한 층 (예를 들어, 최내각에서 최외각으로; 예를 들어 제1 페이로드를 갖는 코어; 제1 유출가능한 층, 예를 들어 제2 페이로드를 갖는 중간 층; 및 중간 층을 둘러싸는 제2 유출가능한 층)을 갖고, 외부 쉘 (표면 코트)은 제2 유출가능한 층과 (예를 들어, 정전기적으로) 상호작용할 수 있다. 일부 경우에, 나노입자는 단지 1개의 유출가능한 층 (예를 들어, 음이온성 실리카 층)을 갖고, 외부 쉘은 일부 경우에 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용할 수 있다.
따라서, 유출가능한 층 (예를 들어, 최외각 유출가능한 층)이 음이온성인 경우 (예를 들어, 유출가능한 층이 실리카 코트인 일부 경우), 표면 코트가 양이온성 성분을 포함하는 경우, 표면 코트는 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 표면 코트는 표적화 리간드가 양이온성 앵커링 도메인에 접합된 전달 분자를 포함한다. 양이온성 앵커링 도메인은 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용하고 전달 분자를 나노입자에 고정시킨다. 마찬가지로, 유출가능한 층 (예를 들어, 최외각 유출가능한 층)이 양이온성인 경우, 표면 코트가 음이온성 성분을 포함하는 경우에 표면 코트는 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면 코트는 세포 관통 펩티드 (CPP)를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 중합체는 CPP ('단백질 전달 도메인' - PTD로도 지칭됨)로서 기능할 수 있고, 이는 지질 이중층, 미셀, 세포막, 소기관 막 또는 소포 막 횡단을 용이하게 하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물 또는 유기 또는 무기 화합물을 지칭하는데 사용되는 용어이다. 작은 극성 분자에서부터 큰 거대분자 및/또는 나노입자까지의 범위일 수 있는 또 다른 분자 (예를 들어, 대상 나노입자의 유출가능한 층 내에 포매되고/거나 그와 상호작용함)에 부착된 PTD는 분자가 막을 횡단하는 것, 예를 들어 세포외 공간에서부터 세포내 공간으로 진행하는 것 또는 시토졸에서 소기관 (예를 들어, 핵) 내로 진행하는 것을 용이하게 한다.
CPP의 예는 최소 운데카펩티드 단백질 전달 도메인 (YGRKKRRQRRR (서열식별번호: 160)을 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응함); 세포 내로의 진입을 지시하기에 충분한 수의 아르기닌을 포함하는 폴리아르기닌 서열 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10-50개의 아르기닌); VP22 도메인 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 드로소필라 안텐나페디아 단백질 전달 도메인 (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 말단절단된 인간 칼시토닌 펩티드 (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); 폴리리신 (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (서열식별번호: 161); 트랜스포르탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열식별번호: 162); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열식별번호: 163); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열식별번호: 164)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CPP의 예는 YGRKKRRQRRR (서열식별번호: 160), RKKRRQRRR (서열식별번호: 165), 3개의 아르기닌 잔기 내지 50개의 아르기닌 잔기의 아르기닌 단독중합체, RKKRRQRR (서열식별번호: 166), YARAAARQARA (서열식별번호: 167), THRLPRRRRRR (서열식별번호: 168) 및 GGRRARRRRRR (서열식별번호: 169)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, CPP는 활성화가능한 CPP (ACPP)이다 (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). ACPP는 절단가능한 링커를 통해 매칭 다가음이온 (예를 들어, Glu9 또는 "E9")에 연결된 다가양이온성 CPP (예를 들어, Arg9 또는 "R9")를 포함하며, 이는 순 전하를 거의 0으로 감소시키고, 이에 의해 세포 내로의 부착 및 흡수를 억제한다. 링커의 절단시에, 다가음이온이 방출되어, 폴리아르기닌 및 그의 고유의 부착성을 국부적으로 드러내고, 이에 따라 ACPP가 막을 횡단하도록 "활성화"시킨다.
일부 경우에, 코팅된 코어 (유출가능한 층에 의해 둘러싸인 코어)를 CPP를 포함하는 조성물 (예를 들어, 용액)과 접촉시킴으로써 CPP를 나노입자에 첨가할 수 있다. 이어서, CPP는 유출가능한 층과 (예를 들어, 정전기적으로) 상호작용할 수 있다.
일부 경우에, 표면 코트는 양이온성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌), 예컨대 폴리(L-아르기닌) 및/또는 폴리(D-아르기닌), 폴리(리신), 예컨대 폴리(L-리신) 및/또는 폴리(D-리신), 폴리(히스티딘), 예컨대 폴리(L-히스티딘) 및/또는 폴리(D-히스티딘), 폴리(오르니틴), 예컨대 폴리(L-오르니틴) 및/또는 폴리(D-오르니틴), 폴리(시트룰린), 예컨대 폴리(L-시트룰린) 및/또는 폴리(D-시트룰린) 등)를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 표면 코트는 폴리(아르기닌), 예를 들어 폴리(L-아르기닌)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표면 코트는 헵타펩티드, 예컨대 셀랭크 (TKPRPGP - 서열식별번호: 147) (예를 들어, N-아세틸 셀랭크) 및/또는 세맥스 (MEHFPGP - 서열식별번호: 148) (예를 들어, N-아세틸 세맥스)를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 표면 코트는 셀랭크 (예를 들어, N-아세틸 셀랭크)를 포함한다. 일부 경우에, 표면 코트는 세맥스 (예를 들어, N-아세틸 세맥스)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표면 코트는 전달 분자를 포함한다. 전달 분자는 표적화 리간드를 포함하고, 일부 경우에 표적화 리간드는 앵커링 도메인 (예를 들어 양이온성 앵커링 도메인 또는 음이온성 앵커링 도메인)에 접합된다. 일부 경우에 표적화 리간드는 개재 링커를 통해 앵커링 도메인 (예를 들어 양이온성 앵커링 도메인 또는 음이온성 앵커링 도메인)에 접합된다.
다가 표면 코트
일부 경우에, 표면 코트는 다음 중 어느 1개 이상을 (임의의 목적하는 조합으로) 포함한다: (i) 상기 기재된 중합체 중 1개 이상, (ii) 1개 이상의 표적화 리간드, 1개 이상의 CPP 및 1개 이상의 헵타펩티드. 예를 들어, 일부 경우에 표면 코트는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상)의 표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 또한 상기 기재된 양이온성 중합체 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표면 코트는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상)의 표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 또한 1개 이상의 CPP를 포함할 수 있다. 추가로, 표면 코트는 스텔스 기능성을 촉진하기 위한, 즉 혈청 단백질 흡착 및 보체 활성을 방지하기 위한 당펩티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이는 아지드-알킨 클릭 화학을 통해, 프로파르길 변형된 잔기를 함유하는 펩티드를 시알산, 뉴라민산 등의 유도체를 함유하는 아지드에 커플링시켜 달성될 수 있다.
일부 경우에, 표면 코트는 CD34 및 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드의 조합을 포함한다. 예를 들어, 폴리(L-아르기닌)은 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표면 코트의 일부로서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에 나노입자를 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌))로 표면 코팅한 후에, 코팅된 나노입자를 히알루론산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 쯔비터이온성 및 다가 표면을 형성한다.
일부 실시양태에서, 표면 코트는 다가이다. 다가 표면 코트는 2개 이상의 표적화 리간드 (예를 들어, 상이한 리간드를 포함하는 2개 이상의 전달 분자)를 포함하는 것이다. 다량체 (이 경우에 삼량체) 표면 코트 (외부 쉘)의 예는 표적화 리간드 줄기 세포 인자 (SCF) (CD117로도 공지된 c-Kit 수용체를 표적화함), CD70 (CD27을 표적화함), 및 SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A) (CD150을 표적화함)를 포함하는 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 조혈 줄기 세포 (HSC) [KLS (c-Kit+ Lin- Sca-1+) 및 CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34-]를 표적화하기 위해, 대상 나노입자는 각각 c-Kit, CD27 및 CD150을 표적화하는 표적화 리간드 SCF, CD70 및 SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A)의 조합을 포함하는 표면 코트를 포함한다 (예를 들어, 표 1 참조). 일부 경우에, 이러한 표면 코트는 다른 림프 및 골수 전구세포에 비해 HSPC 및 장기 HSC (c-Kit+/Lin-/Sca-1+/CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34-)를 선택적으로 표적화할 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, 모든 3개의 표적화 리간드 (SCF, CD70 및 SH2D1A)는 양이온성 앵커링 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘, 예컨대 6H, 폴리-아르기닌, 예컨대 9R 등)에 대한 융합을 통해 나노입자에 앵커링된다. 예를 들어, (1) 표적화 폴리펩티드 SCF (c-Kit 수용체를 표적화함)는
Figure pct00001
를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 양이온성 앵커링 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘, 예컨대 6H, 폴리-아르기닌, 예컨대 9R 등)이고, 예를 들어 이는 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단 단부에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩티드 서열 내에 포매될 수 있고; (2) 표적화 폴리펩티드 CD70 (CD27을 표적화함)은
Figure pct00002
를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 양이온성 앵커링 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘, 예컨대 6H, 폴리-아르기닌, 예컨대 9R 등)이고, 예를 들어 이는 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단 단부에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩티드 서열 내에 포매될 수 있고; (3) 표적화 폴리펩티드 SH2D1A (CD150을 표적화함)는
Figure pct00003
를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 양이온성 앵커링 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘, 예컨대 6H, 폴리-아르기닌, 예컨대 9R 등)이고, 예를 들어 이는 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단 단부에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩티드 서열 내에 포매될 수 있다 (예를 들어, 예컨대
Figure pct00004
상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 나노입자는 목적하는 세포 유형을 표적화하기 위해 또는 세포 유형의 목적하는 조합을 표적화하기 위해 다중 표적화 리간드 (표면 코트의 일부로서)를 포함할 수 있다. 마우스 및 인간 조혈 세포 계통 내의 관심 세포의 예가 도 7-8에, 이러한 세포에 대해 확인된 마커와 함께 도시되어 있다. 예를 들어, 관심 세포 표면 마커의 다양한 조합은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: [마우스] (i) CD150; (ii) Sca1, cKit, CD150; (iii) CD150 및 CD49b; (iv) Sca1, cKit, CD150, 및 CD49b; (v) CD150 및 Flt3; (vi) Sca1, cKit, CD150, 및 Flt3; (vii) Flt3 및 CD34; (viii) Flt3, CD34, Sca1, 및 cKit; (ix) Flt3 및 CD127; (x) Sca1, cKit, Flt3, 및 CD127; (xi) CD34; (xii) cKit 및 CD34; (xiii) CD16/32 및 CD34; (xiv) cKit, CD16/32, 및 CD34; 및 (xv) cKit; 및 [인간] (i) CD90 및 CD49f; (ii) CD34, CD90, 및 CD49f ; (iii) CD34; (iv) CD45RA 및 CD10; (v) CD34, CD45RA, 및 CD10; (vi) CD45RA 및 CD135; (vii) CD34, CD38, CD45RA, 및 CD135; (viii) CD135; (ix) CD34, CD38, 및 CD135; 및 (x) CD34 및 CD38. 따라서, 일부 경우에 표면 코트는 다음으로부터 선택된 표면 단백질 또는 표면 단백질의 조합에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함한다: [마우스] (i) CD150; (ii) Sca1, cKit, CD150; (iii) CD150 및 CD49b; (iv) Sca1, cKit, CD150, 및 CD49b; (v) CD150 및 Flt3; (vi) Sca1, cKit, CD150, 및 Flt3; (vii) Flt3 및 CD34; (viii) Flt3, CD34, Sca1, 및 cKit; (ix) Flt3 및 CD127; (x) Sca1, cKit, Flt3, 및 CD127; (xi) CD34; (xii) cKit 및 CD34; (xiii) CD16/32 및 CD34; (xiv) cKit, CD16/32, 및 CD34; 및 (xv) cKit; 및 [인간] (i) CD90 및 CD49f; (ii) CD34, CD90, 및 CD49f ; (iii) CD34; (iv) CD45RA 및 CD10; (v) CD34, CD45RA, 및 CD10; (vi) CD45RA 및 CD135; (vii) CD34, CD38, CD45RA, 및 CD135; (viii) CD135; (ix) CD34, CD38, 및 CD135; 및 (x) CD34 및 CD38. 대상 나노입자는 1개 초과의 표적화 리간드를 포함할 수 있고, 일부 세포는 중첩 마커를 포함하기 때문에, 다수의 상이한 세포 유형이 표면 코트의 조합을 사용하여 표적화될 수 있고, 예를 들어 일부 경우에 표면 코트는 1개의 특이적 세포 유형을 표적화할 수 있는 반면 다른 경우에 표면 코트는 1개 초과의 특이적 세포 유형 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상의 세포 유형)을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 조혈 계통 내의 세포의 임의의 조합이 표적화될 수 있다. 예시적인 예로서, CD34를 표적화하는 것 (CD34에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드를 사용함)은 조혈 계통 내의 여러 상이한 세포로의 페이로드의 나노입자 전달을 유도할 수 있다 (예를 들어, 도 7-8 참조).
전달 분자
(i) 단백질 또는 핵산 페이로드 또는 (ii) 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드 (펩티드)를 포함하는 전달 분자가 제공된다. 표적화 리간드는 (i) 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합 및 일부 경우에 (ii) 긴 엔도솜 재순환 경로의 결속을 제공한다. 표적화 리간드가 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합되는 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드 및/또는 단백질 페이로드와 상호작용한다 (예를 들어, 그와 축합됨). 일부 경우에 표적화 리간드는 개재 링커를 통해 접합된다. 상이한 가능한 접합 전략 (즉, 대상 전달 분자의 성분들의 상이한 가능한 배열)의 예에 대해 도 5A-D를 참조한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하지만, 반드시 긴 엔도솜 재순환 경로의 결속을 제공하는 것은 아니다. 따라서, 단백질 또는 핵산 페이로드에 접합되거나 또는 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 펩티드 표적화 리간드)를 포함하며, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 (그러나 반드시 긴 엔도솜 재순환 경로의 결속을 제공하는 것은 아닌) 것인 전달 분자가 또한 제공된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 전달 분자는 핵산 또는 단백질 페이로드가 그의 세포외 표적에 도달하고 (예를 들어, 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공함으로써) 우선적으로 리소솜 내에서 파괴되거나 '짧은' 엔도솜 재순환 엔도솜 내로 격리되지 않도록 설계된다. 대신에, 본 개시내용의 전달 분자는 '긴' (간접적/느린) 엔도솜 재순환 경로의 결속을 제공할 수 있으며, 이는 엔도솜 이탈 및/또는 소기관과의 엔도솜 융합을 가능하게 할 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에, β-아레스틴은 (예를 들어, 세포내이입 동안) 액틴 세포골격으로부터의 7-막횡단 GPCR (McGovern et al., Handb Exp Pharmacol. 2014;219:341-59; Goodman et al., Nature. 1996 Oct 3;383(6599):447-50; Zhang et al., J Biol Chem. 1997 Oct 24;272(43):27005-14) 및/또는 단일-막횡단 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 절단을 매개하여, 목적하는 엔도솜 분류 경로를 촉발시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 전달 분자의 표적화 리간드는 (예를 들어, 신호전달 편향을 제공하고, 오르토스테릭 결합 후 세포내이입을 통한 내재화를 촉진하기 위해) 세포 표면 단백질에 대한 결합시 β-아레스틴의 결속을 제공한다.
하전된 중합체 폴리펩티드 도메인
일부 경우에 표적화 리간드 (예를 들어, 대상 전달 분자의 것)는 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (앵커링 도메인, 예컨대 양이온성 앵커링 도메인 또는 음이온성 앵커링 도메인)에 접합된다 (예를 들어, 도 4 및 도 5A-D 참조). 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 반복 잔기 (예를 들어, 양이온성 잔기, 예컨대 아르기닌, 리신, 히스티딘)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (앵커링 도메인)은 3 내지 30개 아미노산 (예를 들어, 3-28, 3-25, 3-24, 3-20, 4-30, 4-28, 4-25, 4-24 또는 4-20개 아미노산; 또는 예를 들어, 4-15, 4-12, 5-30, 5-28, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12개 아미노산) 범위의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (앵커링 도메인)은 4 내지 24개 아미노산 범위의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (앵커링 도메인)은 5 내지 10개 아미노산 범위의 길이를 갖는다. 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인의 적합한 예는 RRRRRRRRR (9R) (서열식별번호: 15) 및 HHHHHH (6H) (서열식별번호: 16)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (양이온성 앵커링 도메인, 음이온성 앵커링 도메인)은 임의의 편리한 하전된 도메인 (예를 들어, 양이온성 하전된 도메인)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 도메인은 히스톤 테일 펩티드 (HTP)일 수 있다 (본원의 다른 곳에서 보다 상세히 기재됨). 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 히스톤 및/또는 히스톤 테일 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 히스톤 및/또는 히스톤 테일 펩티드일 수 있음). 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 NLS-함유 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 NLS-함유 펩티드일 수 있음). 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 미토콘드리아 국재화 신호를 포함하는 펩티드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드는 미토콘드리아 국재화 신호를 포함하는 펩티드일 수 있음).
일부 경우에, 대상 전달 분자의 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 전달 분자가 페이로드 (예를 들어, 핵산 페이로드 및/또는 단백질 페이로드)와 상호작용하는 (예를 들어, 예컨대 축합을 위해 정전기적으로 상호작용하는) 방식으로서 사용된다.
일부 경우에, 대상 전달 분자의 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어 표적화 리간드가 나노입자를 목적하는 세포/세포 표면 단백질로 표적화하는데 사용되도록, 나노입자의 표면을 전달 분자로 코팅하기 위한 앵커로서 사용된다 (예를 들어, 도 4 참조). 따라서, 일부 경우에 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 나노입자의 하전된 안정화 층과 정전기적으로 상호작용한다. 예를 들어, 일부 경우에 나노입자는 안정화 층 (예를 들어, 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인 또는 인산칼슘 코팅)에 의해 둘러싸인 코어 (예를 들어, 핵산, 단백질 및/또는 리보핵단백질 복합체 페이로드를 포함함)을 포함한다. 일부 경우에, 안정화 층은 음전하를 갖고, 따라서 양으로 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 안정화 층과 상호작용하여, 전달 분자를 나노입자에 효과적으로 앵커링시키고, 나노입자 표면을 대상 표적화 리간드로 코팅할 수 있다 (예를 들어, 도 4 참조). 일부 경우에, 안정화 층은 양전하를 갖고, 따라서 음으로 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 안정화 층과 상호작용하여, 전달 분자를 나노입자에 효과적으로 앵커링시키고, 나노입자 표면을 대상 표적화 리간드로 코팅할 수 있다. 접합은 임의의 편리한 기술에 의해 달성될 수 있고, 많은 상이한 접합 화학은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 일부 경우에, 접합은 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합)을 통한 것이다. 일부 경우에 접합은 아민-반응성 화학을 사용하여 달성된다. 일부 경우에, 표적화 리간드 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 동일한 폴리펩티드의 일부에 의해 접합된다.
일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인 (양이온성)은 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린) 및 그의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 주어진 양이온성 아미노산 중합체는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 및 시트룰린 잔기의 믹스 (임의의 편리한 조합)를 포함할 수 있다. 중합체는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 중합체로서 존재할 수 있으며, 여기서 D-이성질체는 분해되는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 더 안정하다. 따라서, D-이성질체 폴리(아미노산)의 포함은 분해 (및 후속 페이로드 방출)를 지연시킨다. 따라서 페이로드 방출 속도는 제어될 수 있고 D-이성질체의 중합체 대 L-이성질체의 중합체의 비에 비례하며, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 보다 높은 비는 페이로드 방출의 지속기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킴). 다시 말해서, D- 및 L-이성질체의 상대량은 방출 동역학 및 분해 및 페이로드 방출에 대한 효소적 감수성을 조정할 수 있다.
일부 경우에, 양이온성 중합체는 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린))의 D-이성질체 및 L-이성질체를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L-이성질체 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 D-이성질체의 중합체 (예를 들어, 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택됨)인 제1 양이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함하고; L-이성질체의 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-리신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택됨)인 제2 양이온성중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함한다. 일부 경우에, 제1 양이온성 중합체 (D-이성질체) 대 제2 양이온성 중합체 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 (예를 들어, 양이온성 중합체의 임의의 상기 예에 추가로 또는 그 대신에) 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) (PAMAM), 폴리(아스파르트아미드), 폴리펩토이드 (예를 들어, 코어 축합을 위한 "거미줄"-유사 분지를 형성하기 위함), 전하-관능화 폴리에스테르, 양이온성 폴리사카라이드, 아세틸화 아미노 당, 키토산, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 양이온성 중합체 (예를 들어, 선형 또는 분지형 형태)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 중합체는 1-200 kDa (예를 들어, 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa) 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는, 예를 들어 대략 29 kDa의 분자량을 갖는 폴리(L-아르기닌)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 25 kDa의 분자량을 갖는 선형 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 10 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 중합체는 대략 70 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 중합체는 PAMAM을 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 예를 들어 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 양이온성 중합체 조성물의 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌) (PDR), 폴리(D-리신) (PDK), 폴리(D-히스티딘) (PDH), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌) (PLR), 폴리(L-리신) (PLK), 폴리(L-히스티딘) (PLH), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린))가 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 핵 국재화 신호 (NLS) (하기에 보다 상세히 기재됨)를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌) (PDR), 폴리(D-리신) (PDK), 폴리(D-히스티딘) (PDH), 폴리(D-오르니틴) 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌) (PLR), 폴리(L-리신) (PLK), 폴리(L-히스티딘) (PLH), 폴리(L-오르니틴) 및 폴리(L-시트룰린))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드 및/또는 단백질 페이로드와 축합된다 (예를 들어, 도 5A-D 참조). 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용한다. 일부 경우에, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 실리카, 염 및/또는 음이온성 중합체와 공-축합되어, 부가된 엔도솜 완충 용량, 안정성 및 예를 들어 임의적인 시한 방출을 제공한다. 일부 경우에, 대상 전달 분자의 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어 일부 4-25개 아미노산 길이 또는 4-15개 아미노산 길이의 반복 양이온성 잔기 (예컨대 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘)의 스트레치이다. 이러한 도메인은 전달 분자가 음이온성 유출가능한 매트릭스 (예를 들어, 공-축합된 음이온성 중합체)와 정전기적으로 상호작용하게 할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 대상 전달 분자의 대상 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 음이온성 유출가능한 매트릭스 및 핵산 및/또는 단백질 페이로드와 (예를 들어, 정전기적으로) 상호작용하는 반복 양이온성 잔기의 스트레치이다. 따라서, 일부 경우에 대상 전달 분자는 페이로드 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질)와 상호작용하고, 음이온성 중합체와 함께 조성물의 일부로서 존재한다 (예를 들어, 페이로드 및 음이온성 중합체와 공-축합됨).
음이온성 유출가능한 매트릭스의 음이온성 중합체 (즉, 대상 전달 분자의 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체)는 임의의 편리한 음이온성 중합체/중합체 조성물일 수 있다. 예는 폴리(글루탐산) (예를 들어, 폴리(D-글루탐산) (PDE), 폴리(L-글루탐산) (PLE), 다양한 목적하는 비의 PDE 및 PLE 둘 다 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, PDE는 음이온성 유출가능한 매트릭스로서 사용된다. 일부 경우에, PLE는 음이온성 유출가능한 매트릭스 (음이온성 중합체)로서 사용된다. 일부 경우에, PDE는 음이온성 유출가능한 매트릭스 (음이온성 중합체)로서 사용된다. 일부 경우에, PLE 및 PDE는 둘 다 음이온성 유출가능한 매트릭스 (음이온성 중합체)로서, 예를 들어 1:1 비 (50% PDE, 50% PLE)로 사용된다.
음이온성 중합체
음이온성 중합체는 1개 이상의 음이온성 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 음이온성 중합체 조성물은 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA) 및 그의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 주어진 음이온성 아미노산 중합체는 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 믹스를 포함할 수 있다. 각각의 중합체는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 중합체로서 조성물 중에 존재할 수 있으며, 여기서 D-이성질체는 분해되는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 더 안정하다. 따라서, D-이성질체 폴리(아미노산)의 포함은 분해 및 후속 페이로드 방출을 지연시킬 수 있다. 따라서 페이로드 방출 속도는 제어될 수 있고 D-이성질체의 중합체 대 L-이성질체의 중합체의 비에 비례하며, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 보다 높은 비는 페이로드 방출의 지속기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킴). 다시 말해서, D- 및 L-이성질체의 상대량은 나노입자 코어의 시한 방출 동역학 및 분해 및 페이로드 방출에 대한 효소적 감수성을 조정할 수 있다.
일부 경우에 음이온성 중합체 조성물은 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA) 및 폴리(아스파르트산) (PDA))의 D-이성질체의 중합체 및 L-이성질체의 중합체를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L-이성질체 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 음이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된) D-이성질체의 중합체 인 제1 음이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함하고; (예를 들어, 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된) L-이성질체의 중합체인 제2 음이온성 중합체 (예를 들어, 아미노산 중합체)를 포함한다. 일부 경우에, 제1 음이온성 중합체 (D-이성질체) 대 제2 음이온성 중합체 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 음이온성 중합체 조성물은 (예를 들어, 음이온성 중합체의 임의의 상기 예에 추가로 또는 그 대신에) 글리코사미노글리칸, 당단백질, 폴리사카라이드, 폴리(만누론산), 폴리(굴루론산), 헤파린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 케라탄, 케라탄 술페이트, 아그레칸, 폴리(글루코사민), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 음이온성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 1-200 kDa (예를 들어, 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa) 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 음이온성 중합체는 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 폴리(글루탐산)을 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 예를 들어 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 음이온성 중합체 조성물의 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))가 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 핵 국재화 신호 (NLS) (하기에 보다 상세히 기재됨)를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체 조성물의 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 중합체는 표적화 리간드에 접합된다.
링커
일부 실시양태에서 표적화 리간드는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인, 음이온성 앵커링 도메인)에 또는 페이로드에 개재 링커를 통해 접합된다. 링커는 단백질 링커 또는 비-단백질 링커일 수 있다. 링커는 일부 경우에 안정성을 보조하고/거나, 보체 활성화를 방지하고/거나, 앵커링 도메인에 비해 리간드에 가요성을 제공할 수 있다.
링커에 대한 표적화 리간드의 접합 또는 앵커링 도메인에 대한 링커의 접합은 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 일부 경우에, 접합은 술프히드릴 화학 (예를 들어, 예컨대 2개의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합)을 통한 것이다. 일부 경우에 접합은 아민-반응성 화학을 사용하여 달성된다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 시스테인 잔기를 포함하고, 시스테인 잔기를 통해 링커에 접합되고/거나; 앵커링 도메인은 시스테인 잔기를 포함하고, 시스테인 잔기를 통해 링커에 접합된다. 일부 경우에, 링커는 펩티드 링커이고, 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드 및 펩티드 링커는 동일한 폴리펩티드의 일부가 되어 접합되고/거나; 앵커링 도메인 및 펩티드 링커는 동일한 폴리펩티드의 일부가 되어 접합된다.
일부 경우에, 대상 링커는 폴리펩티드이고, 폴리펩티드 링커로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드 링커가 고려되지만, 비-폴리펩티드 링커 (화학적 링커)가 일부 경우에 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커이다. 적합한 단백질 링커는 4개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이 (예를 들어, 4-50, 4-40, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 4-10, 6-60, 6-50, 6-40, 6-30, 6-25, 6-20, 6-15, 6-10, 8-60, 8-50, 8-40, 8-30, 8-25, 8-20, 또는 8-15개 아미노산 길이)의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상 링커는 강성이다 (예를 들어, 1개 이상의 프롤린 잔기를 포함하는 링커). 강성 링커의 하나의 비제한적 예는 GAPGAPGAP (서열식별번호: 17)이다. 일부 경우에, 폴리펩티드 링커는 N- 또는 C-말단 단부에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 강성 링커는 GAPGAPGAPC (서열식별번호: 18) 및 CGAPGAPGAP (서열식별번호: 19)로부터 선택된다.
소정의 정도의 가요성을 갖는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에 대상 링커는 가요성이다. 연결 펩티드는 가요성 링커가 일반적으로 가요성 펩티드를 생성하는 서열을 가질 것임을 염두에 두고 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 작은 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌의 사용은 가요성 펩티드를 생성하는데 사용하기 위한 것이다. 이러한 서열의 생성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용적이다. 다양한 상이한 링커가 상업적으로 입수가능하고, 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 링커 폴리펩티드의 예는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, GSGGSn (서열식별번호: 20), GGSGGSn (서열식별번호: 21) 및 GGGSn (서열식별번호: 22) (여기서, n은 적어도 1의 정수임) 포함), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체를 포함한다. 링커의 예는 GGSG (서열식별번호: 23), GGSGG (서열식별번호: 24), GSGSG (서열식별번호: 25), GSGGG (서열식별번호: 26), GGGSG (서열식별번호: 27), GSSSG (서열식별번호: 28) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 상기 기재된 임의의 요소에 접합된 펩티드의 설계가 전체적으로 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있으므로, 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 1개 이상의 부분을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 가요성 링커의 추가의 예는 GGGGGSGGGGG (서열식별번호: 29) 및 GGGGGSGGGGS (서열식별번호: 30)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 폴리펩티드 링커는 N- 또는 C-말단 단부에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 가요성 링커는 GGGGGSGGGGGC (서열식별번호: 31), CGGGGGSGGGGG (서열식별번호: 32), GGGGGSGGGGSC (서열식별번호: 33) 및 CGGGGGSGGGGS (서열식별번호: 34)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 대상 폴리펩티드 링커는 엔도솜용해성이다. 엔도솜용해성 폴리펩티드 링커는 KALA (서열식별번호: 35) 및 GALA (서열식별번호: 36)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 폴리펩티드 링커는 N- 또는 C-말단 단부에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 대상 링커는 CKALA (서열식별번호: 37), KALAC (서열식별번호: 38), CGALA (서열식별번호: 39) 및 GALAC (서열식별번호: 40)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
술프히드릴 커플링 반응의 예시적인 예
(예를 들어, 예컨대 시스테인 잔기를 사용하는 술프히드릴 화학을 통한 접합을 위한 것)
(예를 들어, 표적화 리간드 또는 당펩티드를 링커에 접합시키거나, 표적화 리간드 또는 당펩티드를 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 접합시키거나, 링커를 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 접합시키기 위한 것 등).
디술피드 결합
유리 술프히드릴 기를 함유하는 환원 상태의 시스테인 잔기는 전형적인 디술피드 교환 반응에서 보호된 티올과 디술피드 결합을 용이하게 형성한다.
Figure pct00005
티오에테르/티오에스테르 결합
시스테인의 술프히드릴 기는 말레이미드 및 아실 할라이드 기와 반응하여, 각각 안정한 티오에테르 및 티오에스테르 결합을 형성한다.
Figure pct00006
아지드 - 알킨 고리화첨가
이러한 접합은 알킨 결합을 함유하는 시스테인 잔기의 화학적 변형에 의해 또는 합성 펩티드 제조 (예를 들어, 고체 상 합성)에서 L-프로파르길 아미노산 유도체 (예를 들어, L-프로파르길 시스테인 - 하기에 도시됨)의 사용에 의해 용이해진다. 이어서, 커플링은 Cu 촉진된 클릭 화학에 의해 달성된다.
Figure pct00007
표적화 리간드의 예
표적화 리간드의 예는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
SCF (c-Kit 수용체를 표적화하거나/그에 결합함)
Figure pct00008
CD70 (CD27을 표적화하거나/그에 결합함)
Figure pct00009
SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A) (CD150을 표적화하거나/그에 결합함)
Figure pct00010
따라서, 표적화 리간드 (단독으로 또는 다른 표적화 리간드와 조합되어 사용될 수 있음)의 비제한적 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00011
전달 분자 및 성분의 예시적인 예
(0a) 시스테인 접합 앵커 1 (CCA1)
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 시스테인]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP C (서열식별번호: 41)
(0b) 시스테인 접합 앵커 2 (CCA2)
[시스테인 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
C GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 42)
(1a) α5β1 리간드
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP RRETAWA (서열식별번호: 45)
(1b) α5β1 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
RRETAWA GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 46)
(1c) α5β1 리간드 - Cys 좌측
CGAPGAPGAP (서열식별번호: 19)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(1d) α5β1 리간드 - Cys 우측
GAPGAPGAPC (서열식별번호: 18)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA2 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(2a) RGD α5β1 리간드
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP RGD (서열식별번호: 47)
(2b) RGD a5b1 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
RGD GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 48)
(2c) RGD 리간드 - Cys 좌측
CRGD (서열식별번호: 49)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(2d) RGD 리간드 - Cys 우측
RGDC (서열식별번호: 50)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA2 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(3a) 트랜스페린 리간드
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP THRPPMWSPVWP (서열식별번호: 51)
(3b) 트랜스페린 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
THRPPMWSPVWP GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 52)
(3c) 트랜스페린 리간드 - Cys 좌측
CTHRPPMWSPVWP (서열식별번호: 53)
CPTHRPPMWSPVWP (서열식별번호: 54)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(3d) 트랜스페린 리간드 - Cys 우측
THRPPMWSPVWPC (서열식별번호: 55)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA2 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(4a) E-셀렉틴 리간드 [1-21]
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP MIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열식별번호: 56)
(4b) E-셀렉틴 리간드 [1-21]
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
MIASQFLSALTLVLLIKESGA GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 57)
(4c) E-셀렉틴 리간드 [1-21] - Cys 좌측
CMIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열식별번호: 58)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(4d) E-셀렉틴 리간드 [1-21] - Cys 우측
MIASQFLSALTLVLLIKESGAC (서열식별번호: 59)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA2 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(5a) FGF 단편 [26-47]
[앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열식별번호: 60)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(5b) FGF 단편 [26-47]
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)]
KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열식별번호: 61)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(5c) FGF 단편 [25-47] - 좌측의 Cys 천연
CKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열식별번호: 43)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(5d) FGF 단편 [26-47] - Cys 우측
KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSC (SEQ ID NO: 44)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA2 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
(6a) 엑센딘 (S11C) [1-39]
HGEGTFTSDLCKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 2)
주: 이는 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 아민-반응성 화학을 통해 CCA1 (상기 참조)에 접합될 수 있다.
표적화 리간드
다양한 표적화 리간드 (예를 들어, 대상 전달 분자의 일부로서, 예를 들어 나노입자의 일부로서)가 사용될 수 있고, 수많은 상이한 표적화 리간드가 고려된다. 일부 실시양태에서 표적화 리간드는 야생형 단백질의 단편 (예를 들어, 결합 도메인)이다. 예를 들어, 일부 경우에 대상 전달 분자의 펩티드 표적화 리간드는 4-50개 아미노산 (예를 들어, 4-40, 4-35, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 5-50, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 7-50, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-15, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20 또는 8-15개 아미노산)의 길이를 가질 수 있다. 표적화 리간드는 야생형 단백질의 단편일 수 있지만, 일부 경우에 야생형 아미노산 서열에 비해 돌연변이 (예를 들어, 삽입, 결실, 치환) (즉, 상응하는 야생형 단백질 서열에 비해 돌연변이)를 갖는다. 예를 들어, 표적화 리간드는 표적 세포 표면 단백질과의 결합 친화도를 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 경우에 표적화 리간드는 항체의 항원-결합 영역 (F(ab))이다. 일부 경우에 표적화 리간드는 ScFv이다. "Fv"는 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비-공유 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. scFv의 검토에 대해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
일부 경우에 표적화 리간드는 바이러스 당단백질을 포함하고, 이는 일부 경우에 편재성 표면 마커, 예컨대 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하고, 막 러플링 연관 과정을 통해 일부 세포 집단에서 미세음세포작용 (및/또는 거대음세포작용)을 유도할 수 있다. 폴리(L-아르기닌)은 표면 마커, 예컨대 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 결합에 또한 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 표적화 리간드이다.
일부 경우에 표적화 리간드는 입자 표면 (예를 들어, 나노입자 표면) 상에 정전기적으로 또는 입자 표면에 대한 공유 변형 또는 입자 표면 상의 1개 이상의 중합체를 이용하여 코팅된다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 링커 및/또는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있는 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스테인은 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 내부 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 시스테인 잔기를 포함하기 위해, 표적화 리간드는, 예를 들어 상응하는 야생형 서열에 비해 돌연변이된다 (예를 들어, 삽입 또는 치환). 따라서, 본원에 기재된 임의의 표적화 리간드는 시스테인 잔기에의 삽입 및/또는 치환 (예를 들어, 시스테인 잔기의 내부, N-말단, C-말단 삽입 또는 그로의 치환)에 의해 변형될 수 있다.
"상응하는" 야생형 서열은 대상 서열이 유래되었거나 유래될 수 있는 야생형 서열 (예를 들어, 관심 서열과 높은 서열 동일성을 갖는 야생형 단백질 서열)을 의미한다. 일부 경우에, "상응하는" 야생형 서열은 관심 아미노산 스트레치에 걸쳐 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 것이다. 예를 들어, 1개 이상의 돌연변이 (예를 들어, 치환, 삽입)를 갖지만 그 외에는 야생형 서열과 고도로 유사한 표적화 리간드의 경우, 가장 유사한 아미노산 서열이 상응하는 야생형 아미노산 서열인 것으로 간주될 수 있다.
상응하는 야생형 단백질/서열은 (변형된 위치(들)의 외부에서) 100% 동일할 필요는 없지만 (예를 들어, 85% 이상 동일, 90% 이상 동일, 95% 이상 동일, 98% 이상 동일, 99% 이상 동일한 것 등일 수 있음), 표적화 리간드 및 상응하는 야생형 단백질 (예를 들어, 야생 단백질의 단편)은 의도된 세포 표면 단백질에 결합할 수 있고 (변형된 영역의 외부에서) 충분한 서열 동일성을 보유하여 이들이 상동인 것으로 간주될 수 있다. "상응하는" 야생형 단백질 서열의 아미노산 서열은 임의의 편리한 방법을 사용하여 (예를 들어, 임의의 편리한 서열 비교/정렬 소프트웨어, 예컨대 BLAST, MUSCLE, T-COFFEE 등을 사용하여) 확인/평가될 수 있다.
표면 코트의 일부로서 (예를 들어, 표면 코트의 전달 분자의 일부로서) 사용될 수 있는 표적화 리간드의 예는 표 1에 열거된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대상 전달 분자의 일부로서 사용될 수 있는 표적화 리간드의 예는 표 3에 열거된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (표 3에 열거된 서열 중 다수는 링커 (예를 들어, GGGGSGGGGS)를 통해 양이온성 폴리펩티드 도메인, 예를 들어 9R, 6R 등에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 2열의 SNRWLDVK)를 포함함). 표적화 리간드에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예는 NPKLTRMLTFKFY (서열식별번호: xx) (IL2), TSVGKYPNTGYYGD (서열식별번호: xx) (CD3), SNRWLDVK (Siglec), EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF); EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF), EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF), SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열식별번호: xx) (cKit), 및 Ac-SNYSAibADKAibANAibADDAibAEAibAKENS (서열식별번호: xx) (cKit)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 일부 경우에 표적화 리간드는 NPKLTRMLTFKFY (서열식별번호: xx) (IL2), TSVGKYPNTGYYGD (서열식별번호: xx) (CD3), SNRWLDVK (Siglec), EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF); EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF), EKFILKVRPAFKAV (서열식별번호: xx) (SCF), 또는 SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열식별번호: xx) (cKit)와 85% 이상 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
표 1. 표적화 리간드의 예
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표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 및 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 및 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12 및 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12, 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12, 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 아미노산 서열 RGD 및/또는 서열식별번호: 1-12, 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 서열식별번호: 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열식별번호: 181-187 및 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 서열식별번호: 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열식별번호: 181-187 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드 (예를 들어, 전달 분자의 것)는 서열식별번호: 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열식별번호: 271-277 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
용어 "표적" 및 "표적화된 결합"은 특이적 결합을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다" 등은 용액 또는 반응 혼합물 내의 다른 분자 또는 모이어티에 비해 한 분자에 대한 비-공유 또는 공유 우선적 결합을 지칭한다 (예를 들어, 항체는 다른 이용가능한 폴리펩티드에 비해 특정한 폴리펩티드 또는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 리간드는 다른 이용가능한 수용체에 비해 특정한 수용체에 특이적으로 결합함). 일부 실시양태에서, 한 분자가 특이적으로 결합하는 또 다른 분자에 대한 그의 친화도는 10-5 M 이하 (예를 들어, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하, 10-15 M 이하, 또는 10-16 M 이하)의 Kd (해리 상수)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합 강도를 지칭하고, 증가된 결합 친화도는 보다 낮은 Kd와 상관관계가 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 패밀리 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나제 (RTK), 세포 표면 당단백질 및 세포-세포 부착 분자로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 수용체 도킹시 리간드의 공간 배열의 고찰을 사용하여 목적하는 기능적 선택성 및 엔도솜 분류 편향을 달성할 수 있으므로, 예를 들어 리간드와 표적 사이의 구조 기능 관계는 페이로드 또는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 대한 표적화 리간드의 접합으로 인해 파괴되지 않는다. 예를 들어, 핵산, 단백질, 리보핵단백질 또는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 대한 접합은 잠재적으로 결합 간극(들)를 방해할 수 있다.
따라서, 일부 경우에 리간드에 결합된 목적하는 표적 (세포 표면 단백질)의 결정 구조가 이용가능한 경우 (또는 이러한 구조가 관련 단백질에 이용가능한 경우), 3D 구조 모델링 및 서열 스레딩을 사용하여 리간드와 표적 사이의 상호작용 부위를 시각화할 수 있다. 이는, 예를 들어 치환 및/또는 삽입 (예를 들어, 시스테인 잔기)의 배치를 위한 내부 부위의 선택을 용이하게 할 수 있다.
예로서, 일부 경우에, 표적화 리간드는 패밀리 B G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR) ('세크레틴-패밀리'로도 공지됨)에 대한 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 각각 표적화된 결합 및 긴 엔도솜 재순환 경로의 결속을 제공하는 패밀리 B GPCR의 알로스테릭-친화도 도메인 및 오르토스테릭 도메인 둘 다에 대한 결합을 제공한다.
G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR)는 이들이 G 단백질 (이종삼량체 GTPase)과 상호작용하여 세포내 제2 메신저, 예컨대 시클릭 AMP, 이노시톨 포스페이트, 디아실글리세롤 및 칼슘 이온의 합성을 조절한다는 점에서 공통 분자 아키텍처 (7개의 추정 막횡단 절편을 가짐) 및 공통 신호전달 메카니즘을 공유한다. GPCR의 패밀리 B (세크레틴-수용체 패밀리 또는 '패밀리 2')는 원형질 막에서의 세포간 상호작용을 매개하는 것으로 생각되는 분자 및 폴리펩티드 호르몬에 대한 수용체를 포함하는 작지만 구조적으로 및 기능적으로 다양한 단백질 군이다 (예를 들어, 문헌 [Harmar et al., Genome Biol. 2001;2(12):REVIEWS3013] 참조). 결합된 리간드를 갖거나 갖지 않는 N-말단의 여러 결정 구조의 공개를 포함한, 세크레틴-수용체 패밀리의 구성원에 관한 구조 생물학에서의 중요한 진보가 존재하였으며, 이러한 연구는 리간드 결합의 이해를 확장시키고 구조-기반 리간드 설계를 위한 유용한 플랫폼을 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Poyner et al., Br J Pharmacol. 2012 May;166(1):1-3] 참조).
예를 들어, 엑센딘-4 리간드 또는 그의 유도체 (예를 들어, 시스테인 치환된 엑센딘-4 표적화 리간드, 예컨대 서열식별번호: 2로서 제시된 것)를 사용하여 췌장 세포 표면 단백질 GLP1R을 표적화하는데 (예를 들어, β-섬을 표적화하는데) 대상 전달 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. GLP1R은 뇌 및 췌장 내에서 풍부하기 때문에, GLP1R에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드는 뇌 및 췌장을 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, GLP1R을 표적화하는 것은 헌팅톤병 (CAG 반복 확장 돌연변이), 파킨슨병 (LRRK2 돌연변이), ALS (SOD1 돌연변이) 및 다른 CNS 질환과 같은 질환의 치료 (예를 들어, 1개 이상의 유전자 편집 도구의 전달을 통함)에 초점을 맞춘 방법 (예를 들어, 치료 방법)을 용이하게 한다. GLP1R을 표적화하는 것은 또한 당뇨병 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병 및 췌장암과 같은 질환의 치료 (예를 들어, 1개 이상의 유전자 편집 도구의 전달을 통함)를 위해 췌장 β-섬에 페이로드를 전달하는 것에 초점을 맞춘 방법 (예를 들어, 치료 방법)을 용이하게 한다.
엑센딘-4의 변형된 버전을 사용하여 GLP1R을 표적화하는 경우에, 시스테인 치환 및/또는 삽입을 위한 (예를 들어, 핵산 페이로드에의 접합을 위한) 아미노산은 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 1)인 엑센딘-4 아미노산 서열을, 가교된 복합체가 2개의 결합 간극을 파괴하지 않도록 대면해야 하는 방향을 예상하기 위해 3D 공간에서 회전할 수 있는 PDB 3차원 렌더링을 사용하여 글루카곤-GCGR (4ERS) 및 GLP1-GLP1R-ECD 복합체 (PDB: 3IOL)의 결정 구조에 정렬시킴으로써 확인될 수 있다. 표적화 리간드 (패밀리 B GPCR을 표적화함)의 바람직한 가교 부위 (예를 들어, 시스테인 잔기의 치환/삽입을 위한 부위)가 상응하는 수용체의 2개의 결합 간극에 대해 충분히 직교인 경우에, 고친화도 결합뿐만 아니라 수반되는 긴 엔도솜 재순환 경로 격리 (예를 들어, 최적의 페이로드 방출을 위함)가 발생할 수 있다. 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 10, 11 및/또는 12에서의 시스테인 치환은 G-편향 신호전달 캐스케이드의 이중모드 결합 및 특이적 개시, 베타 아레스틴의 결속 및 액틴 세포골격으로부터의 수용체 해리를 부여한다. 일부 경우에, 이러한 표적화 리간드는 수반되는 오르토스테릭 부위 결속 없이 GPCR의 N-말단 도메인에 대한 단순한 결합을 통해 결속되지 않는 메카니즘인 수용체-매개 세포내이입을 통해 나노입자의 내재화를 촉발한다 (친화성 가닥인 엑센딘-4 [31-39]의 단순한 결합에서와 같음).
일부 경우에, 대상 표적화 리간드는 엑센딘-4 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)에 대해 85% 이상 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 L10, S11 및 K12에 상응하는 위치 중 1개 이상에서의 시스테인 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 S11에 상응하는 위치에서의 시스테인 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 경우에, 대상 표적화 리간드는 엑센딘-4 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인)에 (링커와 함께 또는 링커 없이) 접합된다.
또 다른 예로서, 일부 경우에 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 수용체 티로신 키나제 (RTK), 예컨대 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체 (FGFR)에 대한 결합을 제공한다. 따라서, 일부 경우에 표적화 리간드는 FGF의 단편이다 (즉, FGF의 아미노산 서열을 포함함). 일부 경우에, 표적화 리간드는 오르토스테릭 결합 동안 점유된 RTK의 절편에 결합한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참조). 일부 경우에, 표적화 리간드는 RTK의 헤파린-친화성 도메인에 결합한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 아미노산 서열 KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열식별번호: 4)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 서열식별번호: 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, RTK의 오르토스테릭 부위를 점유하는 소형 도메인 (예를 들어, 5-40개 아미노산 길이)은 천연 성장 인자 리간드에 고유할 수 있는 세포-증식성 및 원-종양원성 신호전달 캐스케이드의 결속 없이 RTK (예를 들어, FGFR)의 핵 분류와 관련된 세포내이입 경로를 결속시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 말단절단된 bFGF (tbFGF) 펩티드 (a.a.30-115)는 bFGF 수용체 결합 부위 및 헤파린-결합 부위의 일부를 함유하고, 이 펩티드는 세포 증식을 자극하지 않으면서 세포 표면 상의 FGFR에 효과적으로 결합할 수 있다. tbFGF의 서열은 KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY (서열식별번호: 13)이다 (예를 들어, 문헌 [Cai et al., Int J Pharm. 2011 Apr 15;408(1-2):173-82] 참조).
일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 아미노산 서열 HFKDPK (서열식별번호: 5)를 포함한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참조). 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 아미노산 서열 LESNNYNT (서열식별번호: 6)를 포함한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참조).
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 세포 표면 당단백질에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 세포-세포 부착 분자에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 표적화 리간드는 세포-세포 부착 인자로서 기능하는 세포 표면 당단백질이고 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 골수의 것) 상에서 발견되는 단백질인 CD34에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 셀렉틴, 예컨대 E-셀렉틴, L-셀렉틴 또는 P-셀렉틴의 단편 (예를 들어, 셀렉틴의 처음 40개의 아미노산에서 발견되는 신호 펩티드)이다. 일부 경우에 대상 표적화 리간드는 셀렉틴 (예를 들어, E-셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴)의 스시 도메인을 포함한다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열식별번호: 7)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 7로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MVFPWRCEGTYWGSRNILKLWVWTLLCCDFLIHHGTHC (서열식별번호: 8)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 8로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIFPWKCQSTQRDLWNIFKLWGWTMLCCDFLAHHGTDC (서열식별번호: 9)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 9로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIFPWKCQSTQRDLWNIFKLWGWTMLCC (서열식별번호: 10)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 10으로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
대상 표적화 리간드로서 사용될 수 있는 셀렉틴의 단편 (예를 들어, 셀렉틴의 처음 40개의 아미노산에서 발견되는 신호 펩티드)은 일부 경우에 특이적으로 변형된 시알로뮤신에 대한 강한 결합을 달성할 수 있으며, 예를 들어 세포외 CD34의 다양한 시알릴 루이스x 변형 / O-시알릴화는 P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대한 골수, 림프, 비장 및 편도 구획에 대한 차등 친화도를 유도할 수 있다. 반대로, 일부 경우에 표적화 리간드는 CD34의 세포외 부분일 수 있다. 일부 이러한 경우에, 리간드의 시알릴화의 변형을 이용하여 표적화 리간드를 다양한 셀렉틴에 차등적으로 표적화할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 대한 표적화된 결합을 제공한다. E-셀렉틴은 내피 세포에 대한 종양 세포의 부착을 매개할 수 있고, E-셀렉틴에 대한 리간드는 암 전이에서 소정의 역할을 할 수 있다. 예로서, P-셀렉틴 당단백질-1 (PSGL-1) (예를 들어, 인간 호중구로부터 유래됨)은 E-셀렉틴 (예를 들어, 내피에 의해 발현됨)에 대한 고효율 리간드로서 기능할 수 있고, 따라서 대상 표적화 리간드는 일부 경우에 PSGL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, E-셀렉틴 리간드-1 (ESL-1)은 E-셀렉틴에 결합할 수 있고, 따라서 대상 표적화 리간드는 일부 경우에 ESL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, PSGL-1 및/또는 ESL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 갖는 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 결합하기 위해 1개 이상의 시알릴 루이스 변형을 보유한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2 및 Mac2-BP는 E-셀렉틴에 결합할 수 있고, 따라서 대상 표적화 리간드는 일부 경우에 CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2 및 Mac2-BP 중 어느 하나의 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 P-셀렉틴에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에 PSGL-1은 이러한 표적화된 결합을 제공할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 대상 표적화 리간드는 일부 경우에 PSGL-1 아미노산 서열 (또는 P-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, PSGL-1 아미노산 서열 (또는 P-셀렉틴에 결합하는 그의 단편)을 갖는 표적화 리간드는 P-셀렉틴에 결합하기 위해 1개 이상의 시알릴 루이스 변형을 보유한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD47, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 트랜스페린 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 THRPPMWSPVWP (서열식별번호: 11)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 11로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린 (예를 들어, α5β1 인테그린)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RRETAWA (서열식별번호: 12)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 12로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGDGW (서열식별번호: 181)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 181로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGD를 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 GCGYGRGDSPG (서열식별번호: 182)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 182로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 이러한 표적화 리간드는 N-말단에서 아세틸화되고/거나 C-말단에서 아미드화 (NH2)된다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린 (예를 들어, α5β3 인테그린)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 DGARYCRGDCFDG (서열식별번호: 187)와 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 187로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 뇌를 표적화하는데 사용되는 표적화 리간드는 광견병 바이러스 당단백질 (RVG)로부터의 아미노산 서열 (예를 들어, YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGG (서열식별번호: 183))을 포함한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 183으로서 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 표적화 리간드 (본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 것)의 경우, RVG는 앵커링 도메인 (예를 들어, 9R 펩티드 서열)에 접합 및/또는 융합될 수 있다. 예를 들어, 대상 나노입자의 표면 코트의 일부로서 사용되는 대상 전달 분자는 서열 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGRRRRRRRRR (서열식별번호: 180)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 c-Kit 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 184로서 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 184로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 CD27에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 185로서 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 185로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 CD150에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 186으로서 제시된 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열식별번호: 186으로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 KLS CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34- 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 유전자 편집 도구(들) (본원의 다른 곳에 기재됨)가 BCL11a 전사 인자의 발현을 파괴하고 결과적으로 태아 헤모글로빈을 생성하기 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, 베타-글로빈 (HBB) 유전자는 변경된 E7V 치환을 상응하는 상동성-지정 복구 공여자 DNA 분자로 교정하기 위해 직접적으로 표적화될 수 있다. 한 예시적인 예로서, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 그가 HBB 유전자 내의 유전자좌에 결합하고 게놈 내에 이중-가닥 또는 단일-가닥 파괴를 생성하여 게놈 복구를 개시하도록 적절한 가이드 RNA와 함께 전달될 수 있다. 일부 경우에, 공여자 DNA 분자 (단일 가닥 또는 이중 가닥)는 (페이로드의 일부로서) 도입되고, 14-30일 동안 방출되는 한편, 가이드 RNA/CRISPR/Cas 단백질 복합체 (리보핵단백질 복합체)는 1-7일의 과정에 걸쳐 방출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 T-세포 수용체를 변형시키기 위해 CD4+ 또는 CD8+ T-세포, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 유전자 편집 도구(들) (본원의 다른 곳에 기재됨)가 T-세포 수용체를 변형시키기 위해 도입될 수 있다. T-세포 수용체는 직접적으로 표적화되고, 신규 T-세포 수용체에 대한 상응하는 상동성-지정 복구 공여자 DNA 분자로 치환될 수 있다. 한 예로서, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 적절한 가이드 RNA와 함께 전달되어, 그가 TCR 유전자 내의 유전자좌에 결합하고 게놈 내에 이중-가닥 또는 단일-가닥 파괴를 생성하여 제1 공여자 DNA (서열 특이적 레콤비나제에 대한 1개 이상의 표적 서열을 가짐)의 삽입을 개시하도록 할 수 있을 것이고, 관심 뉴클레오티드 서열은 제1 공여자 DNA에 의해 삽입된 표적 서열(들)을 인식하는 레콤비나제에 의해 제2 공여자 DNA로부터 삽입된다. 일부 경우에, 공여자 DNA 분자 (단일 가닥 또는 이중 가닥)가 도입된다 (페이로드의 일부로서). 베타-글로빈, CCR5, T-세포 수용체 또는 임의의 다른 관심 유전자를 표적화하는 다른 CRISPR 가이드 RNA 및 공여자 서열, 및/또는 다른 발현 벡터가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 핵산 압타머이다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 펩토이드이다.
표적화 리간드를 함께 구성하는 2개의 상이한 펩티드 서열을 갖는 전달 분자가 또한 제공된다. 예를 들어, 일부 경우에 표적화 리간드는 2가 (예를 들어, 이종2가)이다. 일부 경우에, 세포-관통 펩티드 및/또는 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 결합 리간드는 본 개시내용의 임의의 표적화 리간드와 함께 이종2가 세포내이입 촉발제로서 사용된다. 이종2가 표적화 리간드는 표적화 리간드 중 하나로부터의 친화성 서열 및 상이한 표적화 리간드로부터의 오르토스테릭 결합 서열 (예를 들어, 목적하는 세포내이입 트래피킹 경로를 결속시키는 것으로 공지된 것)을 포함할 수 있다.
앵커링 도메인
일부 실시양태에서, 전달 분자는 앵커링 도메인 (예를 들어, 양이온성 앵커링 도메인, 음이온성 앵커링 도메인)에 접합된 표적화 리간드를 포함한다. 일부 경우에 대상 전달 비히클은 앵커링 도메인과 축합되고/거나 앵커링 도메인과 정전기적으로 상호작용하는 페이로드를 포함한다 (예를 들어, 전달 분자는 페이로드를 전달하기 위해 사용되는 전달 비히클일 수 있음). 일부 경우에 나노입자의 표면 코트는 앵커링 도메인을 갖는 이러한 전달 분자를 포함하고, 일부 이러한 경우에 페이로드는 이러한 나노입자의 코어에 존재한다 (코어와 상호작용함). 앵커링 도메인과 관련된 추가의 세부사항에 대해서는 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인을 기재하는 상기 섹션을 참조한다.
히스톤 테일 펩티드 (HTP)
일부 실시양태에서 대상 나노입자의 양이온성 폴리펩티드 조성물은 히스톤 펩티드 또는 히스톤 펩티드의 단편, 예컨대 N-말단 히스톤 테일 (예를 들어, H1, H2 (예를 들어, H2A, H2AX, H2B), H3 또는 H4 히스톤 단백질의 히스톤 테일)을 포함한다. 히스톤 단백질의 테일 단편은 본원에서 히스톤 테일 펩티드 (HTP)로 지칭된다. 이러한 단백질 (히스톤 및/또는 HTP)은 대상 나노입자의 코어의 일부로서 핵산 페이로드와 축합될 수 있기 때문에, 1개 이상의 히스톤 또는 HTP (예를 들어, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 일부로서)를 포함하는 코어는 본원에서 때때로 뉴클레오솜-모방 코어로 지칭된다. 히스톤 및/또는 HTP는 단량체로서 포함될 수 있고, 일부 경우에 핵산 페이로드를 나노입자 코어 내로 축합할 때 이량체, 삼량체, 사량체 및/또는 팔량체를 형성한다. 일부 경우에, HTP는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제-매개 아세틸화의 경우에서와 같이 다양한 히스톤 변형에 의해 탈양성자화될 수 있을 뿐만 아니라, 코어의 성분의 효과적인 핵-특이적 언패키징 (예를 들어, 페이로드의 방출)을 매개할 수 있다. 히스톤 및/또는 HTP를 포함하는 코어의 트래픽킹은 골지 및 내형질 세망을 통한 역행성 수송을 이용하는 대안적 세포내이입 경로에 의존할 수 있다. 추가로, 일부 히스톤은 선천성 핵 국재화 서열을 포함하고, 코어 내 NLS의 포함은 코어 (페이로드 포함)를 표적 세포의 핵으로 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물은 H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물은 히스톤 단백질의 N-말단 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 단편 (HTP)은 히스톤 단백질의 처음 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 N-말단 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 HTP는 히스톤 단백질의 N-말단 영역으로부터의 5-50개 아미노산 (예를 들어, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 8-50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35 또는 10-30개 아미노산)을 포함한다. 일부 경우에, 대상 양이온성 폴리펩티드는 5-150개 아미노산 (예를 들어, 5-100, 5-50, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 8-150, 8-100, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 10-150, 10-100, 10-50, 10-40, 10-35 또는 10-30개 아미노산)을 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 번역후 변형 (예를 들어, 일부 경우에 1개 이상의 히스티딘, 리신, 아르기닌 또는 다른 상보적 잔기 상에)을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 양이온성 폴리펩티드는 메틸화되거나 (및/또는 메틸화 / 탈메틸화에 감수성이거나), 아세틸화되거나 (및/또는 아세틸화 / 탈아세틸화에 감수성이거나), 크로토닐화되거나 (및/또는 크로토닐화 / 탈크로토닐화에 감수성이거나), 유비퀴티닐화되거나 (및/또는 유비퀴티닐화 / 탈유비퀴티닐화에 감수성이거나), 인산화되거나 (및/또는 인산화 / 탈인산화에 감수성이거나), SUMO화되거나 (및/또는 SUMO화 / 탈SUMO화에 감수성이거나), 파르네실화되거나 (및/또는 파르네실화 / 탈파르네실화에 감수성이거나), 황산화되거나 (및/또는 황산화 / 탈황산화에 감수성이거나) 또는 달리 번역후 변형된다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 p300/CBP 기질 (예를 들어, 하기 HTP, 예를 들어 서열식별번호: 129-130 참조)이다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 (예를 들어, 티오술페이트 술퍼트랜스퍼라제 기질로서) 황산화되거나 황산화에 감수성인 1개 이상의 티올 잔기를 포함한다 (예를 들어, 시스테인 및/또는 메티오닌 잔기를 포함할 수 있음). 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 C-말단에서 아미드화된다. 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 (및/또는 HTP)는 임의의 그의 리신에서 모노메틸화, 디메틸화 또는 트리메틸화되어 전사 활성을 촉진하거나 억제하고 핵-특이적 방출 동역학을 변경시킬 수 있다.
양이온성 폴리펩티드는 목적하는 변형을 갖도록 합성될 수 있거나 또는 시험관내 반응에서 변형될 수 있다. 대안적으로, 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)는 세포 집단에서 발현될 수 있고, 목적하는 변형된 단백질이 단리/정제될 수 있다. 일부 경우에 대상 나노입자의 양이온성 폴리펩티드 조성물은 메틸화 HTP를 포함하고, 예를 들어 H3K4(Me3)의 HTP 서열을 포함하며 - 서열식별번호: 75 또는 88로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 C-말단 아미드를 포함한다.
히스톤 및 HTP의 예
예는 하기 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
따라서, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 62-139 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 62-139 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 62-139 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 양이온성 폴리펩티드는 임의의 편리한 변형을 포함할 수 있고, 다수의 이러한 고려되는 변형, 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 크로토닐화, 유비퀴티닐화, 인산화, SUMO화, 파르네실화, 황산화 등이 상기에 논의되어 있다.
일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 94에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 94에 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 서열식별번호: 94에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 인간 히스톤 3 단백질의 처음 25개의 아미노산을 포함하고 리신 4에서 트리-메틸화된 (예를 들어, 일부 경우에 C-말단에서 아미드화된) H3K4(Me3) (서열식별번호: 95)로 나타내어지는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 양이온성 (또는 일부 경우에 음이온성) 아미노산 중합체, 링커, NLS 및/또는 다른 양이온성 폴리펩티드에 대한 접합을 용이하게 할 수 있는 (예를 들어, 일부 경우에 분지형 히스톤 구조를 형성함) 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 내부 잔기이다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 N-말단 및/또는 C-말단에 위치한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이 (예를 들어, 삽입 또는 치환)를 포함한다. 시스테인을 포함하는 HTP의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00020
일부 실시양태에서, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 대상 나노입자의 코어의 양이온성 (및/또는 음이온성) 아미노산 중합체에 접합된다. 예로서, 히스톤 또는 HTP는 시스테인 잔기를 통해 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(리신)을 포함하는 것)에 접합될 수 있으며, 예를 들어 여기서 중합체의 리신(들)의 피리딜 디술피드 기(들)가 히스톤 또는 HTP의 시스테인에 대한 디술피드 결합으로 치환된다.
변형된 / 분지화 구조
일부 실시양태에서, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 선형 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는다.
예를 들어, 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(L-리신), 폴리(D-리신))의 말단에 (예를 들어, 그의 C-말단에서) 접합되어, 이에 따라 연장된 선형 폴리펩티드를 형성한다. 일부 경우에, 1개 이상 (2개 이상, 3개 이상 등)의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(L-리신), 폴리(D-리신))의 말단(들)에 (예를 들어, 그의 C-말단에서) 접합되어, 이에 따라 연장된 선형 폴리펩티드를 형성한다. 일부 경우에, 양이온성 중합체는 4,500 - 150,000 Da 범위의 분자량을 갖는다.
또 다른 예로서, 일부 경우에, 1개 이상 (2개 이상, 3개 이상 등)의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(L-리신), 폴리(D-리신))의 측쇄에 (예를 들어, 그의 C-말단에서) 접합되어, 이에 따라 분지형 구조 (분지형 폴리펩티드)를 형성한다. 나노입자 코어의 성분 (예를 들어, 대상 양이온성 폴리펩티드 조성물의 성분)에 의한 분지형 구조의 형성은 일부 경우에, 달성될 수 있는 코어 축합 (예를 들어, 핵산 페이로드의 축합)의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 경우에 분지형 구조를 형성하는 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 다양한 유형의 분지 구조가 관심 대상이고, (예를 들어, 대상 양이온성 폴리펩티드, 예컨대 HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP; 펩토이드, 폴리아미드 등을 사용하여) 생성될 수 있는 분지 구조의 예는 브러시 중합체, 웹 (예를 들어, 거미줄), 그라프트 중합체, 별형 중합체, 빗살형 중합체, 중합체 네트워크, 덴드리머 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 분지형 구조는 2-30개의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, HTP) (예를 들어, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15 또는 4-10개의 양이온성 폴리펩티드)를 포함하며, 여기서 각각은 분지형 구조의 다른 양이온성 폴리펩티드와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 경우에, 양이온성 중합체는 4,500 - 150,000 Da 범위의 분자량을 갖는다. 일부 경우에, 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(L-리신), 폴리(D-리신))의 측쇄의 5% 이상 (예를 들어, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상)이 대상 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어 HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP)에 접합된다. 일부 경우에, 양이온성 중합체 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-리신), 폴리(L-리신), 폴리(D-리신))의 측쇄의 50% 이하 (예를 들어, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하)가 대상 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어 HTP, 예를 들어 시스테인 잔기를 갖는 HTP)에 접합된다. 따라서, HTP는 중합체, 예컨대 양이온성 아미노산 중합체의 백본으로부터 분지될 수 있다.
일부 경우에, 분지형 구조의 형성은 펩토이드 (폴리펩토이드), 폴리아미드, 덴드리머 등과 같은 성분을 사용하여 용이해질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 펩토이드 (예를 들어, 폴리펩토이드)는, 예를 들어 일부 경우에 나노입자 코어의 축합을 용이하게 할 수 있는 웹 (예를 들어, 거미줄) 구조를 생성하기 위해 나노입자 코어의 성분으로서 사용된다.
본원의 천연 또는 변형된 폴리펩티드 서열 중 1개 이상은 말단 또는 간헐적 아르기닌, 리신 또는 히스티딘 서열로 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드는 나노입자 코어 내에 동일한 아민 몰농도로 포함된다. 이러한 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 C-말단은 5R (5개의 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 C-말단은 9R (9개의 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 N-말단은 5R (5개의 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 N-말단은 9R (9개의 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 경우에, H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP)은 각각 FKFL 카텝신 B 단백질분해적 절단 도메인 또는 RGFFP 카텝신 D 단백질분해적 절단 도메인과 연속으로 가교된다. 일부 경우에, H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP)은 5R (5개의 아르기닌), 9R (9개의 아르기닌), 5K (5개의 리신), 9K (9개의 리신), 5H (5개의 히스티딘) 또는 9H (9개의 히스티딘) 양이온성 스페이서 도메인에 의해 연속으로 가교될 수 있다. 일부 경우에, 1개 이상의 H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP)은 그의 N-말단에서 프로타민에 디술피드-결합된다.
분지형 히스톤 구조를 생성시키는 방법을 예시하기 위해, 예시적인 제조 방법이 제공된다. 이러한 방법의 한 예는 하기를 포함한다: 등몰비의 히스톤 H2AX [134-143], 히스톤 H3 [1-21 Cys], 히스톤 H3 [23-34 Cys], 히스톤 H4 [8-25 WC] 및 SV40 T-Ag-유래된 NLS의 공유 변형을 10% 피리딜 디술피드 변형된 폴리(L-리신) [MW = 5400, 18000 또는 45000 Da; n = 30, 100 또는 250]과의 반응에서 수행할 수 있다. 전형적인 반응에서, 700 μM Cys-변형된 히스톤/NLS (20 nmol)의 29 μL 수용액을 57 μL의 0.2 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)에 첨가할 수 있다. 둘째로, 14 μL의 100 μM 피리딜 디술피드 보호된 폴리(리신) 용액을 이어서 히스톤 용액에 첨가하여 1:2 비의 피리딜 디술피드 기 대 시스테인 잔기를 갖는 100 μL로 최종 부피를 만들 수 있다. 이 반응을 실온에서 3시간 동안 수행할 수 있다. 반응을 4회 반복할 수 있고, 343nm에서 피리딘-2-티온의 흡광도를 통해 접합 정도를 결정할 수 있다.
또 다른 예로서, 0:1, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:0 몰비의 히스톤 H3 [1-21 Cys] 펩티드 및 히스톤 H3 [23-34 Cys] 펩티드의 공유 변형을 10% 피리딜 디술피드 변형된 폴리(L-리신) 또는 폴리(L-아르기닌) [MW = 5400, 18000 또는 45000 Da; n = 30, 100 또는 250]과의 반응에서 수행할 수 있다. 전형적인 반응에서, 700 μM Cys-변형된 히스톤 (20 nmol)의 29 μL 수용액을 57 μL의 0.2 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)에 첨가할 수 있다. 둘째로, 14 μL의 100 μM 피리딜 디술피드 보호된 폴리(리신) 용액을 이어서 히스톤 용액에 첨가하여 1:2 비의 피리딜 디술피드 기 대 시스테인 잔기를 갖는 100 μL로 최종 부피를 만들 수 있다. 이 반응을 실온에서 3시간 동안 수행할 수 있다. 반응을 4회 반복할 수 있고, 343nm에서 피리딘-2-티온의 흡광도를 통해 접합 정도를 결정할 수 있다.
일부 경우에, 음이온성 중합체는 표적화 리간드에 접합된다.
핵 국재화 서열 (NLS)
일부 실시양태에서, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4)는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 핵 국재화 서열 (NLS)을 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 따라서, 일부 경우에 대상 나노입자의 양이온성 폴리펩티드 조성물은 NLS를 포함하는 펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 대상 나노입자의 히스톤 단백질 (또는 HTP)은 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상)의 천연 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다. 일부 경우에, 대상 나노입자의 히스톤 단백질 (또는 HTP)은 히스톤 단백질에 대해 이종인 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상)의 NLS (즉, 히스톤/HTP의 일부로서 자연 발생하지 않는 NLS, 예를 들어 인간에 의해 부가될 수 있는 NLS)를 포함한다. 일부 경우에, HTP는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 중합체 조성물의 양이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(아르기닌) (PR), 폴리(리신) (PK), 폴리(히스티딘) (PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌) (PDR), 폴리(D-리신) (PDK), 폴리(D-히스티딘) (PDH), 폴리(D-오르니틴), 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌) (PLR), 폴리(L-리신) (PLK), 폴리(L-히스티딘) (PLH), 폴리(L-오르니틴) 또는 폴리(L-시트룰린))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
일부 실시양태에서, 음이온성 중합체 조성물의 음이온성 아미노산 중합체 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 또는 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 N- 및/또는 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산 중합체는 내부 NLS를 포함한다.
임의의 편리한 NLS (예를 들어, 히스톤, HTP, 양이온성 아미노산 중합체, 음이온성 아미노산 중합체 등에 접합된 것)가 사용될 수 있다. 예는 부류 1 및 부류 2 '단일부분 NLS', 뿐만 아니라 부류 3-5의 NLS를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]로부터 적합화된 도 6 참조). 일부 경우에, NLS는 다음 식을 갖는다: (K/R) (K/R) X10-12(K/R)3-5. 일부 경우에, NLS는 다음 식을 갖는다: K(K/R)X(K/R).
일부 실시양태에서, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 NLS를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드는 히스톤 단백질 또는 히스톤 단편이 아니다 (예를 들어, HTP가 아님). 따라서, 일부 경우에 양이온성 폴리펩티드 조성물의 양이온성 폴리펩티드는 NLS-함유 펩티드이다.
일부 경우에, NLS-함유 펩티드는 양이온성 (또는 일부 경우에 음이온성) 아미노산 중합체, 링커, HTP에 대한 히스톤 단백질 및/또는 다른 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 일부 경우에 분지형 히스톤 구조의 일부로서)에 대한 접합을 용이하게 할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 술프히드릴 화학 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학을 통한 가교 (접합)에 사용될 수 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 내부 잔기이다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 N-말단 및/또는 C-말단에 위치한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드 조성물의 NLS-함유 펩티드는 (예를 들어, 야생형 아미노산 서열에 비해) 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이 (예를 들어, 삽입 또는 치환)를 포함한다.
NLS-함유 펩티드로서 사용될 수 있는 (또는 임의의 편리한 양이온성 폴리펩티드, 예컨대 HTP 또는 양이온성 중합체 또는 양이온성 아미노산 중합체 또는 음이온성 아미노산 중합체에 접합된) NLS의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (이들 중 일부는 시스테인 잔기를 포함함):
Figure pct00021
사용될 수 있는 NLS의 비제한적 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]을 참조하며, 예를 들어 본 개시내용의 도 6을 참조한다.
미토콘드리아 국재화 신호
일부 실시양태에서, 대상 나노입자의 양이온성 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어 H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3 또는 H4), 음이온성 중합체 및/또는 양이온성 중합체는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상)의 미토콘드리아 국재화 서열을 포함한다 (및/또는 그에 접합됨). 임의의 편리한 미토콘드리아 국재화 서열이 사용될 수 있다. 미토콘드리아 국재화 서열의 예는 PEDEIWLPEPESVDVPAKPISTSSMMMP (서열식별번호: 149), SDHB의 미토콘드리아 국재화 서열, 모노/디/트리페닐포스포늄 또는 다른 포스포늄, VAMP 1A, VAMP 1B, DGAT2의 67개 N-말단 아미노산 및 Bax의 20개 N-말단 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
전달
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 대상 방법은 전달 비히클 (예를 들어, 나노입자, 전달 분자 등)을 표적 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 이는 일부 경우에 표적 세포를 전달 비히클과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 표적 세포가 생체내 세포인 경우, 도입은 개체에게 전달 비히클을 투여함으로써 달성될 수 있다. 대상 전달 비히클 (예를 들어, 나노입자, 전달 분자 등)은 임의의 목적하는 표적 세포, 예를 들어 임의의 목적하는 진핵 세포로 전달될 수 있다.
일부 경우에, 표적 세포는 시험관내 세포이며 (예를 들어, 세포는 배양물 중에 존재함), 예를 들어 세포는 확립된 조직 배양 세포주의 세포일 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 생체외 세포이다 (예를 들어, 세포는 개체, 예를 들어 환자로부터 단리된 1차 세포 (또는 최근의 후손)임). 일부 경우에, 표적 세포는 생체내 세포이고, 따라서 유기체의 내부에 존재한다 (그의 일부임).
예를 들어 전달 비히클의 페이로드로서 본원에 기재된 성분은 임의의 편리한 경로를 통해 대상체에게 도입될 수 있다 (즉, 개체에게 투여될 수 있음) - 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 전신, 국부, 비경구, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 두개내 (i.c.), 척수내, 안내, 피내 (i.d.), 근육내 (i.m.), 림프내 (i.l.) 또는 척수액내. 성분/전달 비히클은 주사 (예를 들어, 전신 주사, 직접적 국부 주사, 종양 및/또는 종양 절제 부위 내로 또는 그 근처로의 국부 주사 등), 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 국부 전달 (예를 들어, 종양 및/또는 암 부위로의 전달)을 위한 방법의 예는, 예를 들어 볼루스 주사에 의해, 예를 들어 시린지에 의해, 예를 들어 관절, 종양 또는 기관 내로 또는 관절, 종양 또는 기관 근처로; 예를 들어 연속 주입에 의해, 예를 들어 캐뉼라삽입에 의해, 예를 들어 대류를 사용하는 것을 포함한다 (예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 출원 번호 20070254842 참조).
대상체에 대한 치료 투여 횟수는 달라질 수 있다. 전달 비히클을 개체 내로 도입하는 것은 1회 사건일 수 있지만; 특정 상황에서, 이러한 치료는 제한된 기간 동안 개선을 도출할 수 있고 진행중인 일련의 반복 치료를 필요로 할 수 있다. 다른 상황에서, 효과가 관찰되기 전에 전달 비히클의 다중 투여가 필요할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 정확한 프로토콜은 질환 또는 상태, 질환의 병기 및 치료될 개체의 파라미터에 좌우된다.
"치료 유효 용량" 또는 "치료 용량"은 목적하는 임상 결과를 달성하기에 (즉, 치료 효능을 달성하기에) 충분한 양이다. 치료 유효 용량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 목적상, 전달 비히클의 치료 유효 용량은 개체에게 투여될 때 질환 상태/질병의 진행을 완화, 호전, 안정화, 역전, 예방, 저속화 또는 지연시키기에 충분한 양이다.
예시적인 치료적 개입은 숙주 게놈 내로 통합된 임의의 레트로바이러스 DNA를 제거하는 것에 추가로 HIV 감염에 대한 저항성을 생성하는 것이다. T-세포는 HIV에 의해 직접적으로 영향을 받고, 따라서 CD34+ 및 CD45+ 세포에 대한 하이브리드 혈액 표적화 전략이 탐구될 수 있다. 예를 들어, 효과적인 치료적 개입은 HSC 및 T-세포를 동시에 표적화하고, 다수의 가이드 뉴클레아제 (예를 들어, 단일 입자 내)를 통해 CCR5-Δ32 및 gag/rev/pol 유전자에 절제 (및 대체 서열)를 전달하는 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표적 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 유제류 세포, 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 낙타 세포, 토끼 세포, 개과 (개) 세포, 고양이과 (고양이) 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 인간 세포)이다. 임의의 세포 유형이 표적화될 수 있고, 일부 경우에 특정한 세포의 특이적 표적화는 표적화 리간드의 존재에 좌우되며 (예를 들어, 나노입자의 표면 코트의 일부로서, 전달 분자의 일부로서 등), 여기서 표적화 리간드는 특정한 세포 유형에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 표적화될 수 있는 세포는 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 장기 HSC, 단기 HSC, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프성 전구 세포, T-세포, B-세포 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 표적화를 통해), NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포 (예를 들어, SIRPα-모방 펩티드를 통한 CD47 표적화를 통해), 적혈구 전구 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다양한 적용 (예를 들어, 뉴런, 췌장 세포, 조혈 줄기 세포 및 다능 전구세포 등을 표적화하기 위한 것)의 예는, 예를 들어 표적화 리간드와 관련하여 상기에 논의되어 있다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 및 다능 전구세포는 생체내 유전자 편집 (예를 들어, 삽입)을 위해 표적화될 수 있다. 심지어 생체내 골수 세포의 1% (대략 1백5십억개 세포) 편집은 생체외 요법 (대략 1백억개 세포)보다 더 많은 세포를 표적화할 것이다. 또 다른 예로서, 췌장 세포 (예를 들어, β 도세포)는, 예를 들어 췌장암 치료, 당뇨병 치료 등을 위해 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, 뉴런과 같은 뇌 내의 체세포는 표적화될 수 있다 (예를 들어, 헌팅톤병, 파킨슨병 (예를 들어, LRRK2 돌연변이) 및 ALS (예를 들어, SOD1 돌연변이)와 같은 적응증 치료를 위해). 일부 경우에, 이는 직접적 두개내 주사를 통해 달성될 수 있다.
또 다른 예로서, 내피 세포 및 조혈계 세포 (예를 들어, 거핵구 및/또는 거핵구의 상류의 임의의 전구 세포, 예컨대 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC) - 예를 들어, 도 7-8 참조)는 폰 빌레브란트병 치료를 위해 대상 나노입자 (또는 대상 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)에 의해 표적화될 수 있다. 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 코딩하는 유전자 내에 돌연변이를 보유하는 세포 (예를 들어, 내피 세포, 거핵구 및/또는 거핵구의 상류의 임의의 전구 세포, 예컨대 MEP, CMP, MPP, HSC, 예컨대 ST-HSC, IT-HSC 및/또는 LT-HSC)는 돌연변이된 유전자를, 예를 들어 대체 서열을 도입함으로써 (예를 들어, 공여자 DNA의 전달을 통해) 편집 (및 교정)하기 위해 표적화될 수 있다 (시험관내, 생체외, 생체내). 상기 경우 중 일부에서 (예를 들어, 폰 빌레브란트병의 치료와 관련된 경우, VWF를 코딩하는 유전자 내 돌연변이를 보유하는 세포를 표적화하는 것과 관련된 경우), 대상 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 대한 표적화된 결합을 제공한다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 공지된 원인 돌연변이, 예를 들어 게놈 내의 돌연변이와 연관된 임의의 질환을 포함한 임의의 수의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 겸상 적혈구 질환, β 지중해빈혈, HIV, 골수이형성 증후군, JAK2-매개 진성 다혈구혈증, JAK2-매개 원발성 골수섬유증, JAK2-매개 백혈병 및 다양한 혈액 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 추가의 비제한적 예로서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 또한 B-세포 항체 생성, 면역요법 (예를 들어, 체크포인트 차단 시약의 전달), 및 줄기 세포 분화 적용에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 KLS CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34- 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 베타-글로빈 (HBB) 유전자는 변경된 E7V 치환을 (삽입 공여자 조성물의) 적절한 공여자 DNA 분자로 교정하기 위해 직접적으로 표적화될 수 있다. 한 예시적인 예로서, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 적절한 가이드 RNA(들)와 함께 전달되어, 그가 HBB 유전자 내의 유전자좌에 결합하고 게놈에 절단을 생성하여 도입된 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물)로부터의 서열의 삽입을 개시하도록 할 수 있다. 상기 삽입에 의해 생성된 표적 부위(들)는 제2 공여자 DNA로부터의 관심 뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉매하는 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적을 제공한다. 일부 경우에, 공여자 DNA 분자 (단일 가닥 또는 이중 가닥)는 (페이로드의 일부로서) 도입되고, 14-30일 동안 방출되는 한편, 가이드 RNA/CRISPR/Cas 단백질 복합체 (리보핵단백질 복합체)는 1-7일의 과정에 걸쳐 방출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 T-세포 수용체를 변형시키기 위해 CD4+ 또는 CD8+ T-세포, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 유전자 편집 도구(들) (본원의 다른 곳에 기재됨)가 T-세포 수용체를 변형시키기 위해 도입될 수 있다. T-세포 수용체는 직접적으로 표적화되고, 신규 T-세포 수용체에 대한 상응하는 상동성-지정 복구 공여자 DNA 분자로 치환될 수 있다. 한 예로서, CRISPR/Cas RNA-가이드 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 적절한 가이드 RNA(들)와 함께 전달되어, 그가 HBB 유전자 내의 유전자좌에 결합하고 게놈에 절단을 생성하여 도입된 제1 공여자 DNA (표적 공여자 조성물)로부터의 서열의 삽입을 개시하도록 할 수 있다. 상기 삽입에 의해 생성된 표적 부위(들)는 제2 공여자 DNA로부터의 관심 뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉매하는 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적을 제공한다. 베타-글로빈, CCR5, T-세포 수용체 또는 임의의 다른 관심 유전자를 표적화하는 다른 CRISPR 가이드 RNA 및 공여자 서열, 및/또는 다른 발현 벡터가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 경우에, 대상 방법은, 일부 경우에 거의 100개 도메인 및 많게는 1,000,000 염기 쌍을 갖고 불변 영역이 V(D)J 영역으로부터 ~100,000 염기 쌍 또는 그 초과만큼 이격되어 있는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 유전자좌를 표적화하는데 사용된다. 일부 경우에, 공여자 DNA의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 이러한 경우에, 게놈 내로 삽입되는 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열은 TCR 단백질의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역의 아미노산을 코딩한다. 예를 들어, 문헌 [Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21; 및 Glanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21]을 참조한다.
일부 경우에 대상 방법은 게놈 조작에 대한 안전 장치로서 특이적 인핸서의 제어 하에 (그와 작동가능하게 연결되도록) 두면서 유전자를 삽입하는데 사용된다. 삽입이 실패하면, 인핸서는 파괴되어 후속 유전자 및 임의의 가능한 삽입결실(indel)이 발현될 가능성이 없도록 한다. 유전자 삽입이 성공하면, 새로운 유전자가 그의 말단에서의 정지 코돈과 함께 삽입될 수 있으며, 이는 다중-부분 유전자, 예컨대 TCR 유전자좌에 특히 유용하다. 일부 경우에, 대상 방법을 사용하여 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 다른 구축물을 T-세포 내로 삽입하거나 또는 B-세포가 특이적 항체 또는 항체 대체물 (예컨대 나노바디, 상어 항체 등)을 생성하도록 할 수 있다.
일부 경우에 게놈 내로 삽입되는 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩한다. 일부 이러한 경우에, 공여자 DNA의 삽입은 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 내인성 T-세포 프로모터에 대한 작동가능한 연결을 유발한다 (즉, CAR의 발현은 내인성 프로모터의 제어 하에 있을 것임). 일부 경우에 게놈 내로 삽입되는 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 - 따라서 삽입된 CAR은 공여자 DNA 상에 존재하는 프로모터의 제어 하에 있을 것이다.
일부 경우에 게놈 내로 삽입되는 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열은 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상기 공여자 DNA의 삽입은 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 내인성 프로모터에 대한 작동가능한 연결을 유발한다. 일부 경우에 게놈 내로 삽입되는 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열은 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며 - 따라서, 서열의 삽입 후에, 막 결합된 표적화 리간드의 발현은 공여자 DNA 상에 존재하는 프로모터의 제어 하에 있을 것이다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 델타 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다. 일부 경우에, 대상 방법 및/또는 조성물은 2개의 공여자 DNA를 포함한다. 일부 이러한 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 한 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생하고, (삽입 공여자 조성물의) 다른 공여자 DNA의 서열의 삽입은 T 세포 수용체 (TCR) 베타 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에서 발생한다.
일부 실시양태에서, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 서열의 삽입은 삽입된 서열과 T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 내인성 프로모터의 작동가능한 연결을 유발한다. 일부 경우에, 삽입된 서열은 TCR 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 삽입 후에 단백질-코딩 서열이 공여자 DNA에 존재하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 채로 (그의 제어 하에) 유지되도록 한다. 일부 경우에, 상기 서열의 삽입은 삽입된 서열 (예를 들어, 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 예컨대 CAR, TCR-알파, TCR-베타, TCR-감마 또는 TCR-델타 서열)과 CD3 또는 CD28 프로모터의 작동가능한 연결을 유발한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 삽입된 서열은 프로모터 (예를 들어, T-세포 특이적 프로모터)에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 삽입된 서열은 삽입된 서열과 내인성 프로모터 (예를 들어, 줄기 세포 특이적 또는 체세포 특이적 내인성 프로모터)의 작동가능한 연결을 유발한다. 일부 경우에 (삽입 공여자 조성물의) 공여자 DNA의 삽입된 서열은 리포터 단백질 (예를 들어, 유전자 편집 효율을 평가하기 위한, 예를 들어 형광 단백질, 예컨대 GFP, RFP, YFP, CFP, 근적외선 및/또는 원적외선 리포터 단백질 등)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에 삽입된 서열은 인트론을 갖지 않는 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, TCR 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 것)을 포함한다.
일부 경우에, 대상 방법 (및/또는 대상 조성물)은 적용을 위한 서열의 삽입, 예컨대 형광 리포터 (예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)/적색 형광 단백질 (RFP)/근적외선/원적외선 등)의, 예를 들어 막횡단 단백질과 같은 임의의 코딩되는 관심 단백질의 C- 및/또는 N-말단 내로의 삽입을 위해 사용될 수 있다.
공동-전달 (반드시 본 개시내용의 나노입자는 아님)
상기 언급된 바와 같이, 동일한 패키지 (전달 비히클)의 일부로서 다중 페이로드를 전달하는 하나의 이점은 각각의 페이로드의 효율이 희석되지 않는다는 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 DNA, 1개 이상의 부위 특이적 뉴클레아제 (또는 이를 코딩하는 1개 이상의 핵산), 제2 공여자 DNA, 및 부위 특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산)는 동일한 전달 비히클의 페이로드이다. 일부 실시양태에서, 공여자 DNA 및/또는 1개 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)는 게놈 편집 효율을 증가시키는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 유전자 편집 도구는 세포 분열 및/또는 분화를 제어하는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달된다. 예를 들어, 일부 경우에 1개 이상의 유전자 편집 도구는 세포 분열을 제어하는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달된다. 일부 경우에, 1개 이상의 유전자 편집 도구는 분화를 제어하는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달된다. 일부 경우에, 1개 이상의 유전자 편집 도구는 세포 DNA 복구 기구를 편향시키는 단백질 (및/또는 이를 코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA와 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달된다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없다. 예를 들어, 일부 경우에 전달 비히클은 바이러스이고, 일부 경우에 전달 비히클은 비-바이러스이다. 비-바이러스 전달 시스템의 예는 다중 핵산 페이로드 또는 단백질 및 핵산 페이로드의 조합을 공-축합시키는데 사용될 수 있는 물질을 포함한다. 예는 (1) 지질 기재 입자, 예컨대 쯔비터이온성 또는 양이온성 지질, 및 엑소솜 또는 엑소솜-유래 소포; (2) 무기/하이브리드 복합 입자, 예컨대 핵산 및/또는 단백질 페이로드와 공-축합된 이온성 복합체, 및 양이온성 이온 상태의 Ca, Mg, Si, Fe 및 생리학적 음이온, 예컨대 O2-, OH, PO4 3-, SO4 2-로부터 축합될 수 있는 복합체를 포함하는 것; (3) 탄수화물 전달 비히클, 예컨대 시클로덱스트린 및/또는 알기네이트; (4) 중합체 및/또는 공-중합체 복합체, 예컨대 폴리(아미노산) 기재 정전기적 복합체, 폴리(아미도-아민), 및 양이온성 폴리(B-아미노 에스테르); 및 (5) 바이러스 유사 입자 (예를 들어, 단백질 및 핵산 기재)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 전달 시스템의 예는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공동-전달을 위한 페이로드의 예
일부 실시양태에서 본원에 기재된 페이로드 성분은 SCF (및/또는 SCF를 코딩하는 DNA 또는 mRNA), HoxB4 (및/또는 HoxB4를 코딩하는 DNA 또는 mRNA), BCL-XL (및/또는 BCL-XL을 코딩하는 DNA 또는 mRNA), SIRT6 (및/또는 SIRT6을 코딩하는 DNA 또는 mRNA), miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 및/또는 LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA) 중 1개 이상과 조합되어 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 전달 비히클이 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 전달될 수 있다.
함께 전달될 수 있는 마이크로RNA (RNA로서 또는 RNA를 코딩하는 DNA로서 전달됨)의 예에 대해서는, 도 9를 참조한다. 예를 들어, 하기 마이크로RNA가 하기 목적을 위해 사용될 수 있다: 만능 줄기 세포의 외배엽 계통으로의 분화를 차단하기 위해: miR-430/427/302; 만능 줄기 세포의 내배엽 계통으로의 분화를 차단하기 위해: miR-109 및/또는 miR-24; 만능 줄기 세포의 내배엽 계통으로의 분화를 유도하기 위해: miR-122 및/또는 miR-192; 외배엽 전구 세포의 각질세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-203; 신경 능선 줄기 세포의 평활근 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-145; 신경 줄기 세포의 신경교 세포 운명 및/또는 뉴런 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-9 및/또는 miR-124a; 중배엽 전구 세포의 연골세포 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-199a; 중배엽 전구 세포의 골모세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-296 및/또는 miR-2861; 중배엽 전구 세포의 심장 근육 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-1; 중배엽 전구 세포의 심장 근육 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-133; 중배엽 전구 세포의 골격근 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-214, miR-206, miR-1 및/또는 miR-26a; 중배엽 전구 세포의 골격근 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-133, miR-221 및/또는 miR-222; 분화로의 조혈 전구 세포의 분화를 유도하기 위해: miR-223; 분화로의 조혈 전구 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-128a 및/또는 miR-181a; 조혈 전구 세포의 림프 전구 세포로의 분화를 유도하기 위해: miR-181; 조혈 전구 세포의 림프 전구 세포로의 분화를 차단하기 위해: miR-146; 조혈 전구 세포의 골수 전구 세포로의 분화를 차단하기 위해: miR-155, miR-24a 및/또는 miR-17; 림프 전구 세포의 T 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-150; 골수 전구 세포의 과립구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-223; 골수 전구 세포의 단핵구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-17-5p, miR-20a 및/또는 miR-106a; 골수 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 차단하기 위해: miR-150, miR-155, miR-221 및/또는 miR-222; 및 골수 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: miR-451 및/또는 miR-16.
본원에 기재된 성분 (예를 들어, 제1 및 제2 공여자 DNA, 1개 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음), 및 서열 특이적 레콤비나제 - 또는 이를 코딩하는 핵산)과 함께 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예에 대해서는, 도 10을 참조한다. 예를 들어, 하기 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질) (예를 들어, 단백질로서 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA로서 전달됨)은 하기 목적을 위해 사용될 수 있다: 조혈 줄기 세포의 공통 림프 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-7; 조혈 줄기 세포의 공통 골수 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, GM-CSF 및/또는 M-CSF; 공통 림프 전구 세포의 B-세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, IL-4 및/또는 IL-7; 공통 림프 전구 세포의 자연 킬러 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-15; 공통 림프 전구 세포의 T-세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-2, IL-7 및/또는 Notch; 공통 림프 전구 세포의 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드; 공통 골수 전구 세포의 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF 및/또는 TNF-알파; 공통 골수 전구 세포의 과립구-대식세포 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF; 공통 골수 전구 세포의 거핵구-적혈구 전구 세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, SCF 및/또는 Tpo; 거핵구-적혈구 전구 세포의 거핵구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-3, IL-6, SCF 및/또는 Tpo; 거핵구-적혈구 전구 세포의 적혈구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: 에리트로포이에틴; 거핵구의 혈소판 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IL-11 및/또는 Tpo; 과립구-대식세포 전구 세포의 단핵구 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF 및/또는 M-CSF; 과립구-대식세포 전구 세포의 골수모세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF; 단핵구의 단핵구-유래 수지상 세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, IFN-알파 및/또는 IL-4; 단핵구의 대식세포 운명으로의 분화를 유도하기 위해: IFN-감마, IL-6, IL-10 및/또는 M-CSF; 골수모세포의 호중구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: G-CSF, GM-CSF, IL-6 및/또는 SCF; 골수모세포의 호산구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: GM-CSF, IL-3 및/또는 IL-5; 및 골수모세포의 호염기구 운명으로의 분화를 유도하기 위해: G-CSF, GM-CSF 및/또는 IL-3.
본원에 기재된 성분과 함께 (예를 들어, 단백질 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA로서) 전달될 수 있는 단백질의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: SOX17, HEX, OSKM (Oct4/Sox2/Klf4/c-myc) 및/또는 bFGF (예를 들어, 간 줄기 세포 계통으로의 분화를 유도함); HNF4a (예를 들어, 간세포 운명으로의 분화를 유도함); 폴리 (I:C), BMP-4, bFGF 및/또는 8-Br-cAMP (예를 들어, 내피 줄기 세포/전구세포 계통으로의 분화를 유도함); VEGF (예를 들어, 동맥 내피 운명으로의 분화를 유도함); Sox-2, Brn4, Myt1l, Neurod2, Ascl1 (예를 들어, 신경 줄기 세포/전구세포 계통으로의 분화를 유도함); 및 BDNF, FCS, 포르스콜린 및/또는 SHH (예를 들어, 뉴런, 성상세포 및/또는 핍지교세포 운명으로의 분화를 유도함).
본원에 기재된 성분과 함께 (예를 들어, 단백질 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA로서) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 시토카인 (예를 들어, 예컨대 CD8+ T-세포를 활성화시키기 위한 IL-2 및/또는 IL-15); Notch, Wnt 및/또는 Smad 신호전달 경로 중 1개 이상을 조정하는 리간드 및/또는 신호전달 단백질; SCF; 줄기 세포 프로그램화 인자 (예를 들어 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, c-Myc 등); 및 후속 단리/정제/농축을 위한 일시적 표면 마커 "태그" 및/또는 형광 리포터. 예를 들어, 섬유모세포는 Sox2의 전달을 통해 신경 줄기 세포로 전환될 수 있는 한편 Oct3/4 및 소분자 "후성적 재설정 인자"의 존재 하에서는 심근세포로 전환될 것이다. 헌팅톤병 또는 CXCR4 돌연변이를 갖는 환자에서, 이들 섬유모세포는 뉴런 및 심장 세포와 연관된 이환 표현형 형질을 각각 코딩할 수 있다. 유전자 편집 교정 및 이들 인자를 단일 패키지로 전달함으로써, 도입되는 인자/페이로드 중 1개 이상 (모두는 아님)으로 인한 유해 효과의 위험이 유의하게 감소될 수 있다.
적용은 생체내 접근법을 포함하며, 여기서 세포 사멸 단서는 유전자 편집이 성공적이지 않을 때 조건부일 수 있고, 세포 분화/증식/활성화는 조직/기관-특이적 프로모터 및/또는 외인성 인자와 관련된다. 유전자 편집을 받은 이환 세포는 활성화 및 증식할 수 있지만, 또 다른 프로모터-구동된 발현 카세트 (예를 들어 종양 억제자, 예컨대 p21 또는 p53의 부재와 관련된 것)의 존재로 인해, 이들 세포는 후속적으로 제거될 것이다. 다른 한편으로는, 목적하는 특징을 발현하는 세포는 목적하는 하류 계통으로 추가로 분화되도록 촉발될 수 있다.
키트
키트가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 대상 키트는 다음 중 1개 이상을 (임의의 조합으로) 포함할 수 있다: (i) 제1 공여자 DNA (본원의 다른 곳에 기재됨); (ii) 1개 이상의 부위 특이적 뉴클레아제 (또는 이를 코딩하는 1개 이상의 핵산), 예컨대 ZFN 쌍, TALEN 쌍, 니카제 Ca9, Cpf1 등; (iii) 제2 공여자 DNA (본원의 다른 곳에 기재됨); (iv) 서열 특이적 레콤비나제 (또는 이를 코딩하는 핵산); (v) 표적화 리간드, (vi) 링커, (vii) 링커에 접합된 표적화 리간드, (viii) 앵커링 도메인에 (예를 들어, 링커와 함께 또는 링커 없이) 접합된 표적화 리간드, (ix) 유출가능한 층으로서 사용하기 위한 작용제 (예를 들어, 실리카), (x) 추가의 페이로드, 예를 들어 siRNA, 또는 siRNA 또는 shRNA에 대한 전사 주형; 유전자 편집 도구 등, (xi) 양이온성 중합체로서 사용될 수 있는 중합체, (xii) 음이온성 중합체로서 사용될 수 있는 중합체, (xiii) 양이온성 폴리펩티드로서 사용될 수 있는 폴리펩티드, 예를 들어 1개 이상의 HTP, 및 (xiv) 대상 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클. 일부 경우에, 대상 키트는 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 표시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물, 예를 들어 컴퓨터-판독가능 매체를 포함한다.
나노입자 합성의 제1 예시적인 실시예
멸균 무분진 환경 (BSL-II 후드) 내에서 절차를 수행하였다. 기밀 시린지를 70% 에탄올로 멸균한 후 여과된 뉴클레아제 무함유 물로 3회 헹구고, 사용 전 4℃에서 저장하였다. 표면을 사용 전 RNAse 억제제로 처리하였다.
나노입자 코어
적절한 양의 페이로드 (이 경우에 플라스미드 DNA (EGFP-N1 플라스미드))를 폴리(D-글루탐산) 및 폴리(L-글루탐산)의 수성 혼합물 ('음이온성 중합체 조성물')과 합함으로써 제1 용액 (음이온성 용액)을 제조하였다. 이 용액을 pH 8.5의 10mM 트리스-HCl에 의해 적절한 부피로 희석하였다. 적절한 양의 축합제를 함유하는 농축된 용액을 pH 5.5의 60mM HEPES에 의해 적절한 부피로 희석함으로써 '양이온성 중합체 조성물' 및 '양이온성 폴리펩티드 조성물'의 조합인 제2 용액 (양이온성 용액)을 제조하였다. 이 경우에서는, '양이온성 중합체 조성물'은 폴리(L-아르기닌)이고, '양이온성 폴리펩티드 조성물'은 16 μg의 H3K4(me3) (히스톤 H3의 테일, K4 상의 트리 메틸화)였다.
유리 바이알 또는 저 단백질 결합 원심분리 튜브 내 페이로드 용액에 축합 용액을 적가한 후 이어서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 200 μl 미만의 배치에서 나노입자 코어의 침전을 수행할 수 있다. 200 μl 초과의 배치의 경우에는, 2가지 용액을 마이크로유체 포맷으로 (예를 들어, 표준 혼합 칩 (예를 들어 돌로마이트 마이크로믹서) 또는 유체역학적 유동 포커싱 칩을 사용하여) 합할 수 있다. 생성된 나노입자 코어의 현탁액이 100nm 미만의 평균 입자 크기를 나타내면서 단분산되도록 최적의 투입 유량을 결정할 수 있다.
이 경우에서는, 상기로부터의 2가지 동일한 부피의 용액 (양이온성 축합제 중 하나 및 음이온성 축합제 중 하나)을 혼합하기 위해 제조하였다. 양이온성 축합제의 용액의 경우, 중합체/펩티드 용액을 1개의 단백질 저 결합 튜브 (에펜도르프)에 첨가한 다음, 60mM HEPES (pH 5.5)에 의해 총 부피 100 μl로 희석하였다 (상기 언급된 바와 같음). 이 용액을 음이온성 용액의 제조 동안 실온에서 유지하였다. 음이온성 축합제의 용액의 경우, 음이온성 용액을 최소 광 노출 하에 얼음 상에서 냉각시켰다. 수용액 중 10μg의 핵산 (대략 1 μg/μl) 및 7μg의 수성 폴리(D-글루탐산) [.1%]을 10mM 트리스-HCl (pH 8.5)에 의해 총 부피 100 μl로 희석하였다 (상기 언급된 바와 같음).
2가지 용액 각각을 .2 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 여과하고, 그 자체의 해밀턴 1ml 기밀 시린지 (유리, 삽입 제품 번호)로 옮겼다. 각각의 시린지를 하버드 펌프 11 엘리트 듀얼 시린지 펌프 상에 배치하였다. 시린지를 튜빙을 사용하여 돌로마이트 마이크로 믹서 칩의 적절한 유입구에 연결하고, 시린지 펌프를 100 μl 총 부피에 대해 120 μl/분으로 실행시켰다. 생성된 용액은 코어 조성물 (이제 핵산 페이로드, 음이온성 성분 및 양이온성 성분을 포함함)을 포함하였다.
코어 안정화 (유출가능한 층의 첨가)
코어를 유출가능한 층으로 코팅하기 위해, 생성된 나노입자 코어 현탁액을 이어서 10mM 트리스 HCl (pH8.5, 10 - 500mM) 중 규산나트륨 또는 10mM PBS (pH 8.5, 10 - 500mM) 중 염화칼슘의 희석 용액과 합하고, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 이 경우에서는, 코어 조성물을 희석된 규산나트륨 용액에 첨가하여 코어를 중합체 실리카 (유출가능한 층의 예)의 산 불안정성 코팅으로 코팅하였다. 그렇게 하기 위해, 10 μl의 원액 규산나트륨 (시그마(Sigma))을 먼저 1.99 ml의 트리스 완충제 (10mM 트리스 pH = 8.5, 1:200 희석) 중에 용해시키고, 철저히 혼합하였다. 실리케이트 용액을 멸균 0.1 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 여과하고, 시린지 펌프 상에 탑재된 멸균 해밀턴 기밀 시린지로 옮겼다. 상기로부터의 코어 조성물을 또한, 시린지 펌프 상에 또한 탑재된 멸균 해밀턴 기밀 시린지로 옮겼다. 시린지를 PTFE 튜빙을 사용하여 돌로마이트 마이크로 믹서 칩의 적절한 유입구에 연결하고, 시린지 펌프를 120 μl/분으로 실행시켰다.
안정화된 (코팅된) 코어는 표준 원심 여과 장치 (100 kDa 아미콘 울트라, 밀리포어(Millipore)) 또는 고분자량 컷오프 막을 사용하는 30mM HEPES (pH 7.4) 중에서의 투석을 사용하여 정제할 수 있다. 이 경우에서는, 안정화된 (코팅된) 코어를 원심 여과 장치를 사용하여 정제하였다. 수집된 코팅된 나노입자 (나노입자 용액)를 희석 PBS (1:800) 또는 HEPES로 세척하고, 다시 여과하였다 (용액을 저장을 위해 500 μl 멸균 분산 완충제 또는 뉴클레아제 무함유 물 중에 재현탁시킬 수 있음). 효과적인 실리카 코팅이 입증되었다. 안정화된 코어는 110.6 nm의 크기 및 -42.1 mV (95%)의 제타 전위를 가졌다.
표면 코트 (외부 쉘)
안정화된 (이 경우에 실리카 코팅된) 나노입자의 음으로 하전된 표면에 리간드 종 (이 경우에 양이온성 앵커링 도메인으로서의 9-Arg 펩티드 서열에 융합된 광견병 바이러스 당단백질 - 'RVG9R')을 정전기적으로 그라프팅함으로써 때때로 "표면 관능화"로 지칭되는 표면 코트 (또한 외부 쉘로 지칭됨)의 첨가를 달성하였다. 여과하고 분산 완충제 또는 물 중에 재현탁시킨 실리카 코팅된 나노입자로 시작하여, 양성자화된 아민 기의 최종 농도가 적어도 75 uM이 되도록 첨가할 중합체 또는 펩티드의 목적하는 양을 결정하는 것과 같이, 각각의 나노입자 분산액의 최종 부피를 결정하였다. 목적하는 표면 구성성분을 첨가하고, 용액을 20-30초 동안 초음파처리한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 원심 여과를 300 kDa에서 수행하고 (최종 생성물은 아미콘 울트라 밀리포어로부터의 표준 원심 여과 장치, 예를 들어 300-500kDa 또는 고분자량 컷오프 막을 사용하는, 예를 들어 30mM HEPES (pH 7.4) 중에서의 투석을 사용하여 정제할 수 있음), 최종 재현탁은 세포 배양 배지 또는 분산 완충제 중에서 이루어졌다. 일부 경우에, 최적의 외부 쉘 첨가는 50 내지 150 nm의 평균 입자 크기 및 0 내지 -10 mV의 제타 전위를 갖는 입자의 단분산 현탁액을 생성한다. 이 경우에서는, 외부 쉘을 갖는 나노입자가 115.8 nm의 크기 및 -3.1 mV (100%)의 제타 전위를 가졌다.
나노입자 합성의 제2 예시적인 실시예
나노입자를 실온, 37℃ 또는 양이온성 성분과 음이온성 성분 사이에 37℃ 및 실온의 차이에서 합성하였다. 양이온성 및 음이온성 성분의 혼합 동안 천연 정전기적 상호작용을 이용하여 수성 완충제 중에서 용액을 제조하였다. 시작시에, 음이온성 성분을 트리스 완충제 (30mM - 60mM; pH = 7.4 - 9) 또는 HEPES 완충제 (30mM, pH = 5.5) 중에 용해시킨 한편 양이온성 성분을 HEPES 완충제 (30mM - 60mM, pH = 5 - 6.5) 중에 용해시켰다.
구체적으로, 페이로드 (예를 들어, 유전자 물질 (RNA 또는 DNA), 유전자 물질-단백질-핵 국재화 신호 폴리펩티드 복합체 (리보핵단백질), 또는 폴리펩티드)를 염기성, 중성 또는 산성 완충제에서 재구성하였다. 분석 목적을 위해, 페이로드를 형광단으로 공유 태그부착되도록 또는 형광단을 유전자 코딩하도록 제조하였다. pDNA 페이로드를 사용하여, AGAGAG 탠덤 반복부에 특이적인 Cy5-태그부착된 펩티드 핵산 (PNA)을 사용하여 형광 리포터 벡터 및 형광 리포터-치료 유전자 벡터에 형광 태그부착시켰다. 음으로 하전된 축합 종으로서 또한 작용할 수 있는 시한-방출 성분 (예를 들어, 폴리(글루탐산))을 염기성, 중성 또는 산성 완충제에서 재구성하였다. 링커-앵커 서열에 접합된 야생형 유래 또는 야생형 돌연변이된 표적화 펩티드를 갖는 표적화 리간드를 산성 완충제에서 재구성하였다. 추가의 축합 종 또는 핵 국재화 신호 펩티드를 나노입자에 포함시키는 경우에, 이들을 또한 양이온성 종에 대해 0.03% w/v 작업 용액 및 음이온성 종에 대해 0.015% w/v로 완충제에서 재구성하였다. 양이온성 종에 대해 0.1% w/v 작업 용액 및 음이온성 종에 대해 0.1% w/v로 실험을 또한 수행하였다. 유전자 물질과 복합체화된 것을 제외한 모든 폴리펩티드를 10분 동안 초음파처리하여 가용화를 개선시켰다.
본 개시내용의 예시적인 비제한적 측면
상기 기재된 본 발명 대상의 실시양태를 포함한 측면은 단독으로 또는 1개 이상의 다른 측면 또는 실시양태와 조합으로 유익할 수 있다. 상기 기재를 제한하지 않으면서, 본 개시내용의 특정 비제한적 측면이 하기 세트 A 및 세트 B에서 제공된다. 본 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 바와 같이, 개별적으로 넘버링된 측면 각각은 상기 또는 하기 개별적으로 넘버링된 측면 중 임의의 것과 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 이는 이러한 측면의 모든 조합에 대한 지지를 제공하도록 의도되며, 하기에 명시적으로 제공된 측면의 조합에 제한되지는 않는다. 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
세트 A
1. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제는 세포의 게놈을 절단하는 것인 뉴클레아제 조성물;
(b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 생성하는 것인 표적 공여자 조성물;
(c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
(d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
을 포함하는 페이로드를 갖는 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 공여자 서열을 세포의 게놈 내로 삽입하는 방법.
2. 항목 1에 있어서, 표적 공여자 조성물의 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 삽입이 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
3. 항목 1에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 세포의 게놈을 2개의 위치에서 절단하고, 표적 공여자 조성물이 상기 제1 공여자 DNA 중 2개를 포함하며, 이들 각각은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이에 의해 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
4. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 1,000,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
5. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 100,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
6. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 10 염기 쌍 (bp) 내지 100 킬로염기 쌍 (kbp)의 길이를 갖는 것인 방법.
7. 항목 1-6 중 어느 하나에 있어서, 제2 공여자 DNA가 부위-특이적 레콤비나제에 대한 2개의 표적 서열을 포함하며, 여기서 2개의 표적 서열은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열에 플랭킹되는 것인 방법.
8. 항목 1-7 중 어느 하나에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열이 attB 부위, attP 부위, attL 부위, attR 부위, loxP 부위 및 FRT 부위로부터 선택되는 것인 방법.
9. 항목 1-8 중 어느 하나에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제가 ΦC31, ΦC31 RDF, Cre 및 FLP로부터 선택되는 것인 방법.
10. 항목 1-9 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터 선택되는 것인 방법.
11. 항목 1-9 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질인 방법.
12. 항목 11에 있어서, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질이 Cas9 및 cpf1로부터 선택되는 것인 방법.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 1개 이상의 CRISPR/Cas 가이드 핵산 또는 CRISPR/Cas 가이드 핵산을 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 방법.
14. 항목 1-13 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 방법.
15. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 방법.
16. 항목 15에 있어서, 나노입자가 페이로드에 추가로, 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 방법.
17. 항목 16에 있어서, 상기 음이온성 중합체 조성물이 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택된 음이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
18. 항목 16 또는 17에 있어서, 상기 양이온성 중합체 조성물이 폴리(아르기닌), 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
19. 항목 16-18 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 코어를 캡슐화하는 유출가능한 층을 추가로 포함하는 것인 방법.
20. 항목 19에 있어서, 유출가능한 층이 음이온성 코트 또는 양이온성 코트인 방법.
21. 항목 19 또는 20에 있어서, 유출가능한 층이 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 칼슘, 산화칼슘, 히드록시아파타이트, 인산칼슘, 황산칼슘, 망가니즈, 산화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 마그네슘, 산화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 철, 산화철, 인산철 및 황산철 중 1개 이상을 포함하는 것인 방법.
22. 항목 19-21 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 유출가능한 층을 둘러싸는 표면 코트를 추가로 포함하는 것인 방법.
23. 항목 22에 있어서, 표면 코트가 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 또는 음이온성 앵커링 도메인을 포함하는 것인 방법.
24. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
25. 항목 24에 있어서, 1개 이상의 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드로부터 선택되는 것인 방법.
26. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
27. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
28. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포, 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 간 세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로부터 선택된 표적 세포에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
29. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
30. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드와 축합되고/거나 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용하는 것인 방법.
31. 항목 29 또는 30에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
32. 항목 30에 있어서, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인이 3 내지 30개 아미노산 범위의 길이를 갖는 것인 방법.
33. 항목 30-32 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 방법.
34. 항목 33에 있어서, 음이온성 중합체가 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택되는 것인 방법.
35. 항목 29-34 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 5-50개 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
36. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 패밀리 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나제 (RTK), 세포 표면 당단백질 및 세포-세포 부착 분자로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
37. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
38. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
39. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 장기 HSC, 단기 HSC, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형에 대한 결합을 제공하는 것인 방법.
40. 항목 1-39 중 어느 하나에 있어서, 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 세포 게놈 내로의 삽입이 삽입된 서열과 내인성 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
41. 항목 40에 있어서, 내인성 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; 및 (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
42. 항목 1-39 중 어느 하나에 있어서, 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
43. 항목 42에 있어서, 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; 및 (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 T 세포 수용체 (TCR) 단백질을 코딩하는 것인 방법.
45. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 T 세포 수용체 (TCR) 단백질의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역을 코딩하는 것인 방법.
46. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 것인 방법.
47. 항목 46에 있어서, CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입이 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 내인성 T-세포 특이적 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
48. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 다가 표면 수용체를 코딩하는 것인 방법.
49. 항목 48에 있어서, 세포가 T-세포인 방법.
50. 항목 48 또는 49에 있어서, 다가 표면 수용체가 이중특이적 또는 삼중특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)인 방법.
51. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 것인 방법.
52. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 리포터 단백질을 코딩하는 것인 방법.
53. 항목 52에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인 방법.
54. 항목 52 또는 53에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
55. 항목 52 또는 53에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
56. 항목 1-55 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 인트론을 갖지 않는 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
57. 항목 56에 있어서, 인트론을 갖지 않는 뉴클레오티드 서열이 TCR 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 것인 방법.
58. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하고,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩하는 것인 방법.
59. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하고,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 것인 방법.
60. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며,
여기서 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고,
여기서 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인 방법.
61. 항목 1-60 중 어느 하나에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
62. 항목 1-61 중 어느 하나에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
63. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 뉴클레아제 조성물;
(b) 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하는 표적 공여자 조성물;
(c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
(d) 표적 세포의 게놈 내로의 삽입을 위한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
을 포함하며, 여기서 (a), (b), (c) 및 (d)는 동일한 전달 비히클의 일부로서의 페이로드인 조성물.
64. 항목 63에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 조성물.
65. 항목 64에 있어서, 나노입자가 (a), (b), 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 조성물.
66. 항목 64 또는 65에 있어서, 나노입자가 나노입자를 세포 표면 단백질로 표적화하는 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
67. 항목 63-66 중 어느 하나에 있어서, 페이로드가 1개 이상의 데옥시리보핵단백질 복합체 또는 1개 이상의 리보-데옥시리보핵단백질 복합체를 형성하는 것인 조성물.
68. 항목 63-67 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 페이로드 중 1개 이상과 정전기적으로 상호작용하는 것인 조성물.
69. 항목 68에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
70. 항목 63-67 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 조성물.
71. 항목 63-67 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 오일-물 에멀젼 미셀 입자 상에, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 다층 입자 상에 또는 DNA 오리가미 나노봇 상에 코팅된 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
72. 항목 66-71 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F (ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
73. 항목 63-67 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 조성물.
세트 B
1. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제는 세포의 게놈을 절단하는 것인 뉴클레아제 조성물;
(b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 생성하는 것인 표적 공여자 조성물;
(c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
(d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
을 포함하는 페이로드를 갖는 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 공여자 서열을 세포의 게놈 내로 삽입하는 방법.
2. 항목 1에 있어서, 표적 공여자 조성물의 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 삽입이 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
3. 항목 1에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 세포의 게놈을 2개의 위치에서 절단하고, 표적 공여자 조성물이 상기 제1 공여자 DNA 중 2개를 포함하며, 이들 각각은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이에 의해 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
4. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 1,000,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
5. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 100,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
6. 항목 2 또는 3에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 10 염기 쌍 (bp) 내지 100 킬로염기 쌍 (kbp)의 길이를 갖는 것인 방법.
7. 항목 1-6 중 어느 하나에 있어서, 제2 공여자 DNA가 부위-특이적 레콤비나제에 대한 2개의 표적 서열을 포함하며, 여기서 2개의 표적 서열은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열에 플랭킹되는 것인 방법.
8. 항목 1-7 중 어느 하나에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열이 attB 부위, attP 부위, attL 부위, attR 부위, loxP 부위 및 FRT 부위로부터 선택되는 것인 방법.
9. 항목 1-8 중 어느 하나에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제가 ΦC31, ΦC31 RDF, Cre 및 FLP로부터 선택되는 것인 방법.
10. 항목 1-9 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터 선택되는 것인 방법.
11. 항목 1-9 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질인 방법.
12. 항목 11에 있어서, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질이 Cas9 및 cpf1로부터 선택되는 것인 방법.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 1개 이상의 CRISPR/Cas 가이드 핵산 또는 CRISPR/Cas 가이드 핵산을 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 방법.
14. 항목 1-13 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 방법.
15. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 방법.
16. 항목 15에 있어서, 나노입자가 페이로드에 추가로, 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 방법.
17. 항목 16에 있어서, 상기 음이온성 중합체 조성물이 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택된 음이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
18. 항목 16 또는 17에 있어서, 상기 양이온성 중합체 조성물이 폴리(아르기닌), 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
19. 항목 16-18 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 코어를 캡슐화하는 유출가능한 층을 추가로 포함하는 것인 방법.
20. 항목 19에 있어서, 유출가능한 층이 음이온성 코트 또는 양이온성 코트인 방법.
21. 항목 19 또는 20에 있어서, 유출가능한 층이 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 칼슘, 산화칼슘, 히드록시아파타이트, 인산칼슘, 황산칼슘, 망가니즈, 산화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 마그네슘, 산화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 철, 산화철, 인산철 및 황산철 중 1개 이상을 포함하는 것인 방법.
22. 항목 19-21 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 유출가능한 층을 둘러싸는 표면 코트를 추가로 포함하는 것인 방법.
23. 항목 22에 있어서, 표면 코트가 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 또는 음이온성 앵커링 도메인을 포함하는 것인 방법.
24. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
25. 항목 24에 있어서, 1개 이상의 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드로부터 선택되는 것인 방법.
26. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, IL2, CD80, CD86, CD8 엡실론, 펩티드-HLA-A*2402, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
27. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 CD3, CD8, CD4, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD47, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL2R, IL7R, IL10R, IL12R, IL15R, IL18R, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
28. 항목 22 또는 23에 있어서, 표면 코트가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포, 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 간 세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로부터 선택된 표적 세포에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
29. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
30. 항목 1-14 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드와 축합되고/거나 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용하는 것인 방법.
31. 항목 29 또는 30에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
32. 항목 30에 있어서, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인이 3 내지 30개 아미노산 범위의 길이를 갖는 것인 방법.
33. 항목 30-32 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 방법.
34. 항목 33에 있어서, 음이온성 중합체가 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택되는 것인 방법.
35. 항목 29-34 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 5-50개 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
36. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 패밀리 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나제 (RTK), 세포 표면 당단백질 및 세포-세포 부착 분자로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
37. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘, 엑센딘-S11C, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, α5β1 리간드, IL2, Cde3-엡실론, 펩티드-HLA-A*2402, CD80, CD86, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
38. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD47, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
39. 항목 29-35 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 장기 HSC, 단기 HSC, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형에 대한 결합을 제공하는 것인 방법.
40. 항목 1-39 중 어느 하나에 있어서, 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 세포 게놈 내로의 삽입이 삽입된 서열과 내인성 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
41. 항목 40에 있어서, 내인성 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터; (v) B-세포 특이적 프로모터; (vi) CD19 프로모터; (vii) CD20 프로모터; (viii) CD22 프로모터; (ix) B29 프로모터; 및 (x) T-세포 또는 B-세포 V(D)J-특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
42. 항목 1-39 중 어느 하나에 있어서, 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
43. 항목 42에 있어서, 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터; (v) B-세포 특이적 프로모터; (vi) CD19 프로모터; (vii) CD20 프로모터; (viii) CD22 프로모터; (ix) B29 프로모터; 및 (x) T-세포 또는 B-세포 V(D)J-특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 (i) T 세포 수용체 (TCR) 단백질; (ii) IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질; 또는 (iii) IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 또는 λ 쇄를 코딩하는 것인 방법.
45. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 T 세포 수용체 (TCR) 단백질의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역을 코딩하는 것인 방법.
46. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 것인 방법.
47. 항목 46에 있어서, CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입이 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 내인성 T-세포 특이적 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
48. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 다가 표면 수용체를 코딩하는 것인 방법.
49. 항목 48에 있어서, 세포가 T-세포인 방법.
50. 항목 48 또는 49에 있어서, 다가 표면 수용체가 이중특이적 또는 삼중특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)인 방법.
51. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 것인 방법.
52. 항목 1-43 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 리포터 단백질을 코딩하는 것인 방법.
53. 항목 52에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인 방법.
54. 항목 52 또는 53에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
55. 항목 52 또는 53에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
56. 항목 1-55 중 어느 하나에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 인트론을 갖지 않는 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
57. 항목 56에 있어서, 인트론을 갖지 않는 뉴클레오티드 서열이 TCR 단백질 또는 이뮤노글로불린의 전부 또는 일부를 코딩하는 것인 방법.
58. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서
(1) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩하거나; 또는
(2) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛을 코딩하거나; 또는
(3) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 쇄를 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 λ 쇄를 코딩하는 것인 방법.
59. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하고,
여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 것인 방법.
60. 항목 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서
(1) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나; 또는
(2) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나; 또는
(3) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 쇄에 대한 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 λ 쇄에 대한 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인 방법.
61. 항목 1-60 중 어느 하나에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
62. 항목 1-61 중 어느 하나에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
63. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 뉴클레아제 조성물;
(b) 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하는 표적 공여자 조성물;
(c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
(d) 표적 세포의 게놈 내로의 삽입을 위한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
을 포함하며, 여기서 (a), (b), (c) 및 (d)는 동일한 전달 비히클의 일부로서의 페이로드인 조성물.
64. 항목 63에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 조성물.
65. 항목 64에 있어서, 나노입자가 (a), (b), 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 조성물.
66. 항목 64 또는 65에 있어서, 나노입자가 나노입자를 세포 표면 단백질로 표적화하는 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
67. 항목 66에 있어서, 세포 표면 단백질이 CD47인 조성물.
68. 항목 67에 있어서, 표적화 리간드가 SIRPα 단백질 모방체 (이는 대식세포 흡수를 방지함) (예를 들어, SIRPα의 외부 단편)인 조성물.
69. 항목 68에 있어서, 나노입자가 세포내이입-촉발 리간드를 추가로 포함하는 것인 조성물.
70. 항목 63-69 중 어느 하나에 있어서, 페이로드가 1개 이상의 데옥시리보핵단백질 복합체 또는 1개 이상의 리보-데옥시리보핵단백질 복합체를 형성하는 것인 조성물.
71. 항목 63-70 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 페이로드 중 1개 이상과 정전기적으로 상호작용하는 것인 조성물.
72. 항목 71에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
73. 항목 63-70 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 조성물.
74. 항목 63-70 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 오일-물 에멀젼 미셀 입자 상에, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 다층 입자 상에 또는 DNA 오리가미 나노봇 상에 코팅된 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
75. 항목 66-71 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F (ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
76. 항목 63-70 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 조성물.
실험
하기의 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완전한 개시 및 기재를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제공하도록 제시되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지도 않고 하기 실험이 수행된 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지도 않는다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력이 이루어졌으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처 압력이다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개물 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타내어진 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 발명의 실시에 바람직한 모드를 포함하도록 밝혀진 또는 제안된 특정한 실시양태에 관하여 기재되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용에 비추어 본 발명의 의도된 범주를 벗어나지 않으면서 예시된 특정한 실시양태에 수많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 코돈 중복성으로 인해, 단백질 서열에 영향을 미치지 않으면서 기저 DNA 서열에 변화가 이루어질 수 있다. 더욱이, 생물학적 기능 동등성 고려사항 때문에, 생물학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에 변화가 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 1
세포 흡수 및 표현형을 유동 세포측정법 및 고함량 스크리닝에 의해 특징화하여, 다양한 세포 하위집단에 걸친 전달 효율 및 유전자 편집을 정량화하였다.
이들 실험에서, 비자극 인간 1차 범-T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T-세포의 혼합물) 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 급속 형질감염시키고 (나노입자와 함께 30분 인큐베이션), 10ug/ml 헤파란 술페이트를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 24시간 후에 아튠 NxT 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 세포를 CD4 및 CD8에 특이적인 항체로 염색하고, 각각의 하위집단에서 EGFP-태그부착된 Cas9의 형질도입을 정량화하였다.
본 실시예로부터 수집된 예시적인 데이터가 도 34A - 54C에 제시되어 있다.
실시예 2: 다중모드 데이터세트
세포 흡수 및 표현형을 유동 세포측정법 및 고함량 스크리닝에 의해 특징화하여, 다양한 세포 하위집단에 걸친 전달 효율 및 유전자 편집을 정량화하였다.
이들 실험에서, 비자극 인간 1차 범-T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물) 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 급속 형질감염시키고 (나노입자와 함께 30분 인큐베이션), 10ug/ml 헤파란 술페이트를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 24시간 후에 아튠 NxT 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 세포를 CD4 및 CD8에 특이적인 항체로 염색하고, 각각의 하위집단에서 EGFP-태그부착된 Cas9의 형질도입을 정량화하였다. 하기 표는 형질감염 1시간 후에 40x 대물렌즈가 구비된 바이오텍 시테이션 5 영상화 판독기를 이용하여 수행된 영상화 대 24시간에 수집된 유동 세포측정법 데이터의 비교를 제시한다. 본 발명자들은 ≥24시간 시점은 세포 내재화를 결정하는 반면 초기 시점은 세포 친화도를 결정하는 것으로 생각한다. 영상으로부터 1시간 시점에서의 세포 친화도를 결정하기 위해 비감독 학습을 이용하였으며, 유동 세포측정법을 통해 평가된 24시간 시점에서의 세포 흡수와 영상화 데이터를 비교하였다.
본 실시예로부터 수집된 예시적인 데이터가 도 55-56에 제시되어 있다.
실시예 3: 4/5-성분 전달을 위한 나노입자 코어의 최적화
하기 실험에서, 3회 라운드의 스크리닝을 수행하여, GFP 또는 TCR 유전자좌를 표적화하는 CRISPR-Cas9 RNP, attP 랜딩 부위를 삽입하기 위한 ssDNA, 레콤비나제를 코딩하는 플라스미드, 및 attP 표적 유전자좌 내로의 RFP 삽입을 위해 attB 부위를 보유하는 플라스미드의 공동 전달을 위한 코어 제제의 최적 세트를 결정하였다. 이들 실험은 별개의 사용-사례 (CRISPR-EGFP RNP 전달 단독)에서 실시예 2에 상술된 바와 같은 표적화 리간드 밀도의 후속 최적화 전에 수행된다.
본 실시예로부터 수집된 예시적인 데이터가 도 57-62Y에 제시되어 있다.
물리화학적 연구, 즉 SYBR 검정에 의해 페이로드 축합 지수를 결정하고, 후속적으로 다양한 공동-전달 제제 합성에 따라 나노입자로 축합되는 유전자 물질의 상대 백분율을 이해할 수 있다. 추가적으로, 다양한 입자 실시양태는 그의 정전기적 쇄 전반에 걸친 그의 시스테인 변형으로 인해 가교 펩티드로서의 역할을 하는 것 이외에도, 히스톤-변형 효소 및 아세틸 CoA에 대한 "전사상 활성" 기질인 역할을 할 수 있는 히스톤-유래 및 NLS-장식된 서열을 포함한다. 많은 경우에, 가장 유리한 페이로드 축합 지수는 입자 크기 <200nm 및 안정한 제타 전위, 뿐만 아니라 높은 정도의 입자 흡수 및/또는 유전자 편집과 밀접한 상관관계가 있다.
이들 예시적인 실시예에서, 3회 반복 사이클 (도 58A - 62Y)을 수행하여, 표적화 리간드를 갖지 않는 다양한 정전기적 펩티드의 스크리닝이 나노입자 "코어"의 최적화를 가능하게 하여 기능적 유전자 편집, 나노입자 내로의 모든 관련 페이로드의 로딩 (CRISPR-Cas9 RNP, ssDNA ODN 및 2개의 플라스미드를 갖는 5-성분 나노입자의 효율적인 SYBR 축합 지수), 및 58.9% 이하의 형질감염 효율 (CRISPR RNP로부터의 3.52% GFP k/d에 상응함) 및 19.8% 및 19.6% 효율적인 GFP k/d 효율 (각각 18.6% 입자 흡수 및 14.6% 입자 흡수에 상응함)을 달성한다는 것을 입증하였다. 이들 연구에서의 입자는 과도하게 안정하고, 핵산 운반물을 효율적으로 차폐하며, 가변적 세포하 방출 및 기능적 편집 효율을 갖는 효율적인 세포 표적화로 이어진다. 제3일과 제6일 (2개의 영상화 시점) 사이에 나노입자+ 세포인 %생존 세포에서의 가변성이 또한 명백하며, 여기서 가변적 비의 히스톤 단편 (H2A 및 H2B 뿐만 아니라 NLS-변형된 히스톤 단편) 및 엔도솜용해성 AF647-표지된 기능적 펩티드와 함께 가변적 비의 폴리(L-글루탐산) 대 폴리(D-글루탐산)을 포함시키는 것은 세포 환경 내에서 나노입자의 다양한 정도의 1) 세포하 방출 효율 (NP+ 세포 대 편집된 세포) 및/또는 2) 연장 대 "신속-방출" (6d+) 체류를 생성하는 역할을 한다 (도 62U - 62Y).
도 60I로부터 알 수 있는 바와 같이, 많은 세포는 나노입자 형질감염을 갖는 GFP-이고, 대표적인 군에서의 GFP- 세포의 백분율 (유동 플롯의 하단 절반: y-축은 GFP 강도를 나타내고, x-축은 NP-알렉사647 강도를 나타냄)은 GFP+NP+ 세포 대 GFP+NP- 세포의 면에서 상당히 다양하며, 이는 아마도 a) 주어진 정전기적 중합체의 축합 효율을 변화시키고/거나, b) 정전기적 중합체의 세포하 트래픽킹 효율을 변화시키고/거나, c) 정전기적 중합체-결합된 페이로드의 구획-특이적 핵 방출을 변화시키고/거나, d) 주어진 "층"과 연관된 시한 방출 프로파일을 변화시켜 주어진 제제의 기능적 게놈 편집 잠재력의 가변성을 유도하는 것 때문일 것이다.
1. 나노입자 합성
펩티드를 표준 Fmoc-기반 고체-상 펩티드 합성 (SPPS)을 사용하여 합성하였다. C-에서 N-방향으로 서열을 합성하였다. 제1 Fmoc-보호된 아미노산을 디메틸 포름아미드 (DMF) 중 N-메틸 모르폴린 (NMM)과 함께 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU)를 사용하여 노바펙 링크(NovaPeg Rink) 아미드 수지 (밀리포어 시그마) 상에 커플링시켰다. DMF 중 20% 4-메틸 피페리딘 (4PIP)을 사용하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 펩티드 중합체 내의 각각의 아미노산에 대해 후속 커플링 및 탈보호를 수행하였다. 완성된 펩티드를 5 mL의 절단 칵테일 (4.5 mL 트리플루오로아세트산: 250 uL 물: 250 uL 트리이소프로필 실란)을 사용하여 수지로부터 절단하고 전반적으로 탈보호시키고, 90분 동안 혼합하였다. 수지 및 칵테일 용액을 프릿이 장착된 일회용 칼럼에 통과시킴으로써 절단된 펩티드를 수집하였다. 차가운 디에틸 에테르 (4℃) 50mL를 사용하여 TFA 용액으로부터 펩티드를 침전시켰다. 디에틸 에테르를 제거하고, 조 펩티드를 추가의 차가운 에테르 (2x50 mL)로 세척하고, 질소 기체의 스트림 하에 건조시켰다. 조 펩티드를 물 (~5 mL) 중 20% 아세토니트릴 (ACN) 중에 용해시키고, 역상 크로마토그래피에 의해 분획화하였다. 정제된 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 정제된 펩티드를 분말로서 수득하였다.
하기 물질을 구입하였다:
NLS-Cas9-GFP (젠스크립트 Z03393)
NLS-Cas9-NLS (알데브론 9212)
LL285 (신테고) - 가이드 서열: CTCGTGACCACCCTGACCTA (ref. Glaser et al. 2016)
LL295 IDT -
Figure pct00022
LL224 (신테고) 가이드 서열: AGAGTCTCTCAGCTGGTACA (ref. Roth et al. 2018)
LL294 IDT -
Figure pct00023
pLL312 시스템 바이오사이언시스 FC200-PA1
pLL313 시스템 바이오사이언시스 FC550A-1
pTagRFP-N 에브로겐 FP142
표 1. 나노입자 제제 기호설명
Figure pct00024
Figure pct00025
펩티드 서열:
Figure pct00026
리간드 (cll11, cll25)는 9x 아르기닌 앵커를 포함한다. 히스톤 단편 (cpp10, cpp12, cpp13)은 시스테인 기로 변형되어 가교된 메쉬의 형성을 돕는다. Cpp13은 또한 핵 국재화 신호로 변형된다.
개관:
본 실험을 3개의 하위파트에서 반복적으로 수행하였다. 2개의 하위파트 (표제 2C.1.1.1 및 2C.1.2.1)는 HEK293-GFP 안정한 세포의 4 성분 페이로드 나노입자 형질감염을 수반한다. 페이로드는 GFP 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 갖는 NLS-Cas9-NLS 리보핵단백질, 비대칭 상동성 아암을 갖는 attP를 코딩하는 ssODN, PhiC31 인테그라제 발현 플라스미드, 및 EF1a 프로모터 하에 RFP-T2A-퓨로마이신R을 코딩하는 attB 공여자 플라스미드로 구성된다. 또 다른 하위파트 (표제 2C.2.1.1)는 CD3/CD28 비드 자극된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 4/5-성분 페이로드 나노입자 형질감염을 수반한다. 페이로드는 TRAC 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 갖는 GFP-Cas9-NLS 리보핵단백질, 비대칭 상동성 아암을 갖는 attP를 코딩하는 ssODN, PhiC31 인테그라제 발현 플라스미드, 및 EF1a 프로모터 하에 RFP-T2A-퓨로마이신R을 코딩하는 attB 공여자 플라스미드로 구성된다.
2C.1.1.1:
Cas9 리보핵단백질 (RNP)을 1.2:1 sgRNA:Cas9 비를 사용하여 구성하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LL285 및 LL295를 초순수 물 (밀리-큐 물)에 의해 동결건조 상태에서 0.1% w/v로 수화시켰다. pLL312 및 pLL313을 물로 0.05% w/v로 희석하고, 스톡 1:50 pLL313:pLL312를 플라스미드 스톡으로서 생성하였다. 펩티드를 0.1M 비스-트리스 pH 8.5를 사용하여 0.1% w/v로 희석하였다. 하기 첨가 순서로 50-량체 폴리-L-아르기닌 (PLR50) (분자당 +50 총 전하)과 RNP (분자당 -151 총 전하) 사이의 전하 비 (분자 A 대 분자 B의 총 전하의 비)를 변화시키기 위해 다양한 양의 PLR50을 사용하여 단계적 방식으로 100ul의 최종 부피로 48개의 독특한 나노입자를 형성하였다:
1. PLR50
2. RNP
3. DNA 믹스 (ssDNA + 플라스미드 스톡)
4. PLR50
5. 완충제
층 1 및 2를 합하고, 10분 동안 인큐베이션한 다음, 층 3을 층 1 및 2에 첨가하고, 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 층 4를 첨가하고, 이전 층과 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 완충제를 각각의 제제에 첨가하여 총 부피를 100 uL로 만들었다. 층 1 (PLR50:RNP)의 전하 비는 6-35의 범위였고, 층 4 (PLR50:RNP)의 전하 비는 4-40의 범위였다.
각각의 독특한 제제는 2500 ng ssDNA 및 800 ng pDNA를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 250ng ssDNA 및 80ng pDNA를 전달하였다는 것을 암시한다. 각각의 독특한 제제는 10pmol의 Cas9를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 1pmol의 Cas9를 전달하였다는 것을 암시한다. 이 실험을 위해, 40K HEK293-GFP의 2개 플레이트를 형질감염시키고, 웰당 10uL 및 20uL NP로 투여하였다.
2C.1.2.1:
Cas9 RNP를 1.2:1 sgRNA:Cas9 비를 사용하여 구성하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LL285 및 LL295를 초순수 물 (밀리-큐 물)에 의해 동결건조 상태에서 0.1% w/v로 수화시켰다. pLL312 및 pLL313을 물로 0.05% w/v로 희석하고, 스톡 1:50 pLL313:pLL312를 플라스미드 스톡으로서 생성하였다. 펩티드를 0.1M 비스-트리스 pH 8.5를 사용하여 0.1% w/v로 희석하였다. 하기 성분 및 순서를 사용하여 다양한 첨가 순서로 100ul의 최종 부피로 20개의 독특한 나노입자를 형성하였다:
Figure pct00027
각각의 층을 10분 동안 인큐베이션한 후, 다음 층을 첨가하였다. 각각의 독특한 제제는 2500ng ssDNA 및 800ng pDNA를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 250ng ssDNA 및 80ng pDNA를 전달하였다는 것을 암시한다. 각각의 독특한 제제는 15pmol의 Cas9를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 1.5pmol의 Cas9를 전달하였다는 것을 암시한다. 양이온성 펩티드:RNP의 초기 층과 최종 층 사이의 전하 비는 각각 10 및 4의 비로 일정하였다. 상세한 개관은 도 61F 및 61G에 포함된다:
형성 후, 나노입자를 옵티-멤 혈청 감소된 배지 (10ul NP + 90ul 배지 또는 20ul NP + 80ul 배지)에 의해 2개의 농도로 희석하였다. 20k의 밀도로 시딩된 세포를 100ul의 희석된 NP 용액으로 처리하고, 밤새 방치하였다.
2C.2.1.1:
Cas9 RNP를 1.2:1 sgRNA:Cas9 비를 사용하여 구성하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LL224 및 LL294를 초순수 물 (밀리-큐 물)에 의해 동결건조 상태에서 0.1% w/v로 수화시켰다. pLL312 및 pLL313을 물로 0.05% w/v로 희석하고, 스톡 1:50 pLL313:pLL312를 플라스미드 스톡으로서 생성하였다. 펩티드를 0.1M 비스-트리스 pH 8.5를 사용하여 0.1% w/v로 희석하였다. 하기 첨가 순서로 50-량체 폴리-L-아르기닌 (PLR50) (분자당 +50 총 전하) 대 RNP (분자당 -151 총 전하)와 리간드 믹스 (분자당 +9.5 총 전하) 대 RNP 사이의 전하 비 (분자 A 대 분자 B의 총 전하의 비)를 변화시키기 위해 다양한 양의 PLR50 및 리간드 믹스를 사용하여 단계적 방식으로 100ul의 최종 부피로 48개의 독특한 나노입자를 형성하였다:
1. PLR50
2. RNP
3. DNA 믹스 (ssDNA + 플라스미드 스톡)
4. 리간드 믹스 (CD3, CD4)
5. 완충제
층 1 및 2를 합하고, 10분 동안 인큐베이션한 다음, 층 3을 층 1 및 2에 첨가하고, 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 리간드 믹스를 이전 층에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로 완충제를 각각의 제제에 첨가하여 총 부피를 100 uL로 만들었다. 층 1 PLR50:RNP의 전하 비는 2.6-16의 범위이고, 층 3 리간드 믹스:RNP의 전하 비는 2-10의 범위였다. 각각의 독특한 제제는 2500ng ssDNA 및 800ng pDNA를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 250ng ssDNA 및 80ng pDNA를 전달하였다는 것을 암시한다. 각각의 독특한 제제는 15pmol의 Cas9를 가졌으며, 이는 모든 용량 (10ul)이 1.5pmol의 Cas9를 전달하였다는 것을 암시한다.
형성 후, 나노입자를 옵티-멤 혈청 감소된 배지 (10ul NP + 90ul 배지)에 의해 희석하였다. 자극 길이에 기초하여 2개의 플레이트 상에 시딩된 세포를 100 ul의 희석된 NP 용액으로 처리하고, 밤새 방치하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하였다.
2. SYBR 포함 검정
상승작용 H1 하이브리드 다중-모드 플레이트 판독기를 사용하여 SYBR 포함 검정에 대한 형광 측정을 수행하였다. SYBR® 골드 핵산 형광 염색 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))은 DNA 및 RNA 분자에 매우 강하게 결합하고, 결합시 1000배 초과의 신호 증강이 일어난다. SYBR 골드 염료를 나노입자 중 핵산 페이로드의 축합에 대한 지표로서 및 비캡슐화/유리 페이로드의 양에 대한 추정치로서 사용하였다. 그렇게 함으로써, 페이로드 (낮은 SYBR 형광에 의해 나타남)를 캡슐화하는데 있어서 다른 것 (더 높은 형광에 의해 나타남)과 비교하여 더 유망한 나노입자 후보를 스크리닝하였다. 각각의 나노입자 샘플 (N=1)에 대해 밤새 동역학적 측정을 기록하여 시간 경과에 따른 나노입자 패키징의 안정성에 대해 추정하였다. 20 uL의 최종 나노입자 생성물을 SYBR 골드 작업 용액 (TE 완충제 pH 7.8 - 8.0 중 10,00X 희석된 SYBR)과 혼합하여 측정을 위한 100 uL의 총 부피를 만들었다. 네이키드/유리 DNA 및 RNA 페이로드를 대조군 (N=3)으로서 사용하여 기준선 형광을 확립하였다. SYBR 작업 용액 중 제제 완충제의 형광을 측정함으로써 배경 차감을 수행하였다. 여기 485/ 방출 528에서 모든 측정을 기록하였다. 출력은 축합 지수가 [(관심 웰 형광 - 유리 DNA 형광) / 유리 DNA 형광] *100으로서 계산되고, 나노입자 96-웰 ID와 상관된 열지도에서 평균 축합 지수 ± 표준 편차로서 보고되는 것으로 나타내어진다. 보다 축합된 나노입자는 보다 높은 차폐, 보다 적은 형광, 이에 따라 보다 음성인 축합 지수를 가질 것이다.
3. 입자 크기 및 제타 전위 결정 - 와이어트 테크놀로지의 모비우스를 사용하여 동적 광 산란 및 전기영동 이동성에 의해 나노입자의 유체역학적 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 샘플당 총 3개의 측정을 하기 파라미터를 사용하여 획득하였다: 2초 획득 시간, 측정당 20회 획득, 2V 전압 진폭, 10Hz 전기장 및 15초 PALS 수집 기간.
4. 세포 배양 - HEK293/EGFP-AAVS1 안정한 세포주 (SL573, 진코포에이아, 인크.(GeneCopoeia, Inc.), 메릴랜드주 록빌)를 10% FBS 및 0.5ug/mL 퓨로마이신 (깁코(Gibco) A1113802)이 보충된 DMEM에서 배양하고, 0.25% 트립신-EDTA (시그마 59428C)로 제조업체의 지침에 따라 계대배양하였다. 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies) (70025.2)로부터의 동결보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 10% FBS, 50 I.U./mL rIL-2 (페프로테크(PeproTech) 200-02)이 보충된 RPMI에서 해동시켰다. 해동 1일 후에, 세포를 10% FBS, rIL-2 50 I.U./mL, rIL-7 (깁코 PHC0075) 5ng/mL, rIL-15 (깁코 PHC9154) 5ng/mL가 보충된 RPMI 중 CD3/CD28 디나비즈 (써모피셔 11131D)에 의해 1x10e6개 세포/mL로 자극하였다. 자극 2일 후에, 디나비즈를 자기적으로 제거하고, 자극된 T 세포를 RPMI 10% FBS 125 I.U./mL rIL-2에서 배양하였다. 디나비드 제거 후 적어도 1일에 형질감염을 수행하였다. 모든 세포를 100U/mL Pen/Strep (써모피셔 15-140-122)에서 유지하였다.
5. 세포 형질감염 - 나노입자를 웰당 10uL 또는 20uL의 NP 믹스 (총 100uL)의 용량을 위해 무혈청 옵티-멤 (써모피셔 11058021) 중에 1:10 또는 2:10으로 희석하였다. HEK293-GFP를 20-40,000개 세포/웰로 플레이팅하고, 자극된 T 세포를 60,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 NP에서 밤새 인큐베이션한 다음, PBS 중에서 세척하고, 통상적으로 배양하였다. DNA의 경우 리포펙타민3000 (써모피셔 L3000008) 및 RNP +/- DNA의 경우 CRISPRMAX (써모피셔 CMAX00008)에 의한 HEK293-GFP의 리포펙션을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 자극된 T 세포의 뉴클레오펙션을 론자 4D-뉴클레오펙터 및 P3 1차 세포 키트에 의해 수행하였다. 20uL 큐벳 내의 1x10e6개 세포를 나노입자 형질감염으로서 등가 용량 (규모조정됨)의 RNP 및 DNA로 전기천공하였다. 펄스 EH-115는 RNP에 대해서만 사용하고, 반면 펄스 EO-115는 DNA를 함유하는 페이로드에 사용하였다.
6. 현미경검사 - 세포를 리신-코팅된 플레이트 상에 시딩하고, 훽스트 33342 (써모피셔 H3570)로 표지하고, 바이오텍 시테이션 5 상에서 매일 영상을 수집하여 세포 생존율, 나노입자 (알렉사647), 및 GFP 및 RFP 발현을 관찰하였다. 피지 (이미지J)에서 하기 스크립트를 통해 각각의 샘플에 대해 영상 분석을 수행하여 피어슨 계수, 중첩 계수를 결정하고, 하기 스크립트 및 연관된 출력을 통해 채널 사이의 공동국재화의 코스테스 지도를 생성하였다. 예시적인 한계값 설정, 코스테스 마스크 및 공동국재화 스크립트 출력이 60K - 60N에 제시되어 있다. NP 흡수는 상위-성능 나노입자 군 내의 GFP- 픽셀에 고도로 상응하는 것으로 확인된다.
호출, 조영 증강 및 후속 마스킹에 대한 스크립트는 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
생성된 출력:
영상 A: E5_1_GFP_8-bit-enhanced_001.tif
영상 B: E5_1_Texas Red_8-bit-enhanced_001.tif
피어슨 계수:
r=-0.086
중첩 계수:
r=0.587
r^2=k1xk2:
k1=0.844
k2=0.409
한계값 사용 (thrA=28 및 thrB=196)
중첩 계수:
r=0.915
r^2=k1xk2:
k1=1.504
k2=0.556
만더스 계수 (원래):
M1=0.997 (B와 중첩되는 A의 분율)
M2=0.998 (A와 중첩되는 B의 분율)
만더스 계수 (영상A의 경우 28 및 영상B의 경우 196의 한계값 사용):
M1=0.01 (B와 중첩되는 A의 분율)
M2=0.907 (A와 중첩되는 B의 분율)
영상A에 대해 255 & 영상B에 대해 255로 설정된 코스테스 자동 한계값.
피어슨 계수:
r=0.0 (한계값 1.0 미만)
M1=0.0 & M2=0.0
7. 유동 세포측정법 - 유동 세포측정법을 아튠 NxT (써모피셔 A24858) 상에서 수행하고, 데이터를 플로우조로 분석하였다. 직접적 형광을 GFP, RFP 및 알렉사647 (나노입자 표지)에 대해 모니터링하였다. 세포 생존율 검정은 좀비 NIR 고정 생존율 키트 (바이오레전드(Biolegend) 423106), 아넥신 V 퍼시픽 블루 (써모피셔 A35122)를 포함하였다. PBMC에 대해, 하기 항체를 사용하였다: TCRα/β-PE-Cy7 (IP26) 1:100 (써모피셔 25-9986-42), CD8a-슈퍼 브라이트 600 (RPA-T8) 1:33 (써모피셔 63-0088-42), CD4-PE (RPA-T4) 1:100 (써모피셔 12-0049-42), CD4-APC-e플루오르780 (RPA-T4) 1:200 (써모피셔 47-0049-42), CD3-APC-e플루오르780 (OKT3) 1:100 (써모피셔 47-0037-41).
8. PCR - 세포를 PBS로 세척하고, 게놈 DNA를 퀵 익스트랙트 (루시젠(Lucigen), QE09050)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수거하였다. ssODN 상동성 아암 외부의 sgRNA 절단 서열에 플랭킹된 다음 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다: GFP 정방향 - 5'-atggtgagcaagggcgagg; GFP 역방향 - 5'-cacgaactccagcaggaccatg; TRAC 정방향 - 5'-CCAGCCTAAGTTGGGGAGAC; TRAC 역방향 - 5'-GTGACTGCGTGAGACTGACT.
서열분석 - PCR 생성물을 E-겔 (써모 피셔 사이언티픽, G401001)에 의해 검증하고, 진와이즈(Genewiz)로 보내 sgRNA 표적 서열의 상류의 다음 프라이머를 사용하는 생어 서열분석을 수행하였다: GFP 5'-gagctgttcaccggggtggt; TRAC 5'-CTGAGTCCCAGTCCATCACGA. 신테고의 CRISPR 편집 추론 (ICE) 및 ICE 녹-인 프로그램을 사용하여 생어 서열분석 크로마토그램을 분석하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Ligandal, Inc. Watson, Andre R Foster, Christian Lin, Shuailiang <120> Methods and Compositions for Genome Editing <130> LGDL-005WO <140> PCT/US2019/029000 <141> 2019-04-24 <150> US 62/685,240 <151> 2018-06-14 <150> US 62/661,992 <151> 2018-04-24 <160> 325 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Cys Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro 1 5 10 15 Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys 20 25 30 Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val 35 40 45 Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala 50 55 60 Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr 85 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 4 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Lys Ser 20 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 5 His Phe Lys Asp Pro Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 6 Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr 1 5 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 7 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala 20 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 8 Met Val Phe Pro Trp Arg Cys Glu Gly Thr Tyr Trp Gly Ser Arg Asn 1 5 10 15 Ile Leu Lys Leu Trp Val Trp Thr Leu Leu Cys Cys Asp Phe Leu Ile 20 25 30 His His Gly Thr His Cys 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 9 Met Ile Phe Pro Trp Lys Cys Gln Ser Thr Gln Arg Asp Leu Trp Asn 1 5 10 15 Ile Phe Lys Leu Trp Gly Trp Thr Met Leu Cys Cys Asp Phe Leu Ala 20 25 30 His His Gly Thr Asp Cys 35 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 10 Met Ile Phe Pro Trp Lys Cys Gln Ser Thr Gln Arg Asp Leu Trp Asn 1 5 10 15 Ile Phe Lys Leu Trp Gly Trp Thr Met Leu Cys Cys 20 25 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 11 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 12 Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala 1 5 <210> 13 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 13 Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro 1 5 10 15 Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys 20 25 30 Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val 35 40 45 Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala 50 55 60 Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr 85 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 14 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 16 His His His His His His 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 17 Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 18 Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 19 Cys Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The amino acids from positions 1 to 5 may be repeated n times. <400> 20 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> The amino acids at positions 1 to 6 may be repeated n times. <400> 21 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> The amino acids at positions 1 to 4 may be repeated n times. <400> 22 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 23 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 24 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 25 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 26 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 27 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 28 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 29 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 30 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 31 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 32 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 33 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 34 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 35 Lys Ala Leu Ala 1 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 36 Gly Ala Leu Ala 1 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 37 Cys Lys Ala Leu Ala 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 38 Lys Ala Leu Ala Cys 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 39 Cys Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 40 Gly Ala Leu Ala Cys 1 5 <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 41 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Cys <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 42 Cys Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 43 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 1 5 10 15 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 20 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 44 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Lys Ser Cys 20 <210> 45 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 45 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala 20 25 <210> 46 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 46 Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 47 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Arg Gly Asp 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 48 Arg Gly Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 49 Cys Arg Gly Asp 1 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 50 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 51 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 20 25 30 <210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 52 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Ala Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 53 Cys Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 54 Cys Pro Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 55 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 56 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu 20 25 30 Leu Ile Lys Glu Ser Gly Ala 35 <210> 57 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 57 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 58 Cys Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Lys Glu Ser Gly Ala 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 59 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala Cys 20 <210> 60 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 60 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 20 25 30 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 <210> 61 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 61 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Lys Ser Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 62 Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg 20 <210> 63 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 63 Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg 20 25 30 Leu Leu Arg Lys Gly Gly Gly 35 <210> 64 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 64 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 20 25 30 Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu 50 55 60 Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Lys 130 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 65 Cys Lys Ala Thr Gln Ala Ser Gln Glu Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 66 Lys Lys Thr Ser Ala Thr Val Gly Pro Lys Ala Pro Ser Gly Gly Lys 1 5 10 15 Lys Ala Thr Gln Ala Ser Gln Glu Tyr 20 25 <210> 67 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 67 Met Ser Gly Arg Gly Lys Thr Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 20 25 30 Arg Leu Leu Arg Lys Gly His Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu 50 55 60 Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly Gly Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Ser Ala Thr Val Gly Pro Lys 115 120 125 Ala Pro Ser Gly Gly Lys Lys Ala Thr Gln Ala Ser Gln Glu Tyr 130 135 140 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is crotonylated. <400> 68 Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 69 Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 70 Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu 1 5 10 15 <210> 71 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 71 Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg 20 25 30 Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 35 40 45 Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn 50 55 60 Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg 65 70 75 80 Leu Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln 85 90 95 Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val 100 105 110 Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys 115 120 125 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 72 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to one methyl group. <400> 73 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to two methyl groups. <400> 74 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to three methyl groups. <400> 75 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> The amino acid at position 10 is phosphorylated. <400> 76 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 77 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Trp Cys 20 <210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> The amino acid at position 14 is attached to an acyl group. <400> 78 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 79 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu 20 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to an acyl group. <400> 80 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu 20 <210> 81 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 81 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 82 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to an acyl group. <400> 82 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to two methyl groups. <400> 83 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to two methyl groups. <400> 84 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 85 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to two methyl groups. <400> 85 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 86 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to a methyl group. <400> 86 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 87 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to two methyl groups. <400> 87 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 88 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at position 4 is attached to three methyl groups. <400> 88 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 89 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> The amino acid at position 10 is phosphorylated. <400> 89 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 90 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at positoin 4 is attached to three methyl groups. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> The amino acid at position 10 is phosphorylated. <400> 90 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 91 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Cys 20 <210> 92 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to an acyl group. <400> 92 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala 20 <210> 93 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The amino acid at position 9 is attached to three methyl groups. <400> 93 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala 20 <210> 94 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 94 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala 20 25 <210> 95 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid at positoin 4 is attached to three methyl groups. <400> 95 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala 20 25 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> The amino acid at position 7 is attached to a methyl group. <400> 96 Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> The amino acid at position 7 is attached to two methyl groups. <400> 97 Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> The amino aid at position 7 is attached to three methyl groups. <400> 98 Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg 1 5 10 15 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> The amino acid at position 6 is attached to an acyl group. <400> 99 Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg Lys Gln 1 5 10 <210> 100 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 100 Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg Lys Gln Leu 1 5 10 15 Ala Ser Lys <210> 101 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 101 Ala Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His 20 25 <210> 102 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 102 Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly 20 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 103 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala 1 5 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 104 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 105 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 106 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is attached to an acyl group. <400> 106 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 107 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is attached to a methyl group. <400> 107 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 108 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is attached to two methyl groups. <400> 108 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 109 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at positoin 5 is attached to three methyl groups. <400> 109 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 110 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> The amino acid at position 3 is attached to an acyl group. <400> 110 Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ser Thr Gly Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly 20 <210> 111 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> The amino acid at position 8 is phosphorylated. <400> 111 Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly 20 <210> 112 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 112 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr 20 25 30 Gly Gly Val 35 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> The amino acid at position 6 is attached to a methyl group. <400> 113 Ser Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr 1 5 10 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> The amino acid at positoin 6 is attached to two methyl groups. <400> 114 Ser Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr 1 5 10 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> The amino acid at position 6 is attached to three methyl groups. <400> 115 Ser Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> The amino acid at position 13 is attached to an acyl group. <400> 116 Gly Thr Val Ala Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu 1 5 10 15 Leu Leu Ile Arg 20 <210> 117 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 117 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr 20 25 30 Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu 35 40 45 Arg Glu 50 <210> 118 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> The amino acid at position 22 is attached to a methyl group. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 118 Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ala Gln Asp Phe Lys Xaa Thr Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ala Ala 20 25 30 Ile <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 119 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg 1 5 10 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> The amino acid at position 7 is attached to an acyl group. <400> 120 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg 1 5 10 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> The amino acid at position 7 is attached to three methyl groups. <400> 121 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg 1 5 10 <210> 122 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 122 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> A methyl group is present between the amino acids at positions 11 and 12. <400> 123 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 124 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> Two methyl groups are present between the amino acids at positions 11 and 12. <400> 124 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 125 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> Three methyl groups are positioned between the amino acids at positions 11 and 12. <400> 125 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 126 Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg Arg Ile 1 5 10 15 Arg Gly Glu Arg Ala 20 <210> 127 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 127 Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Val Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala 35 40 45 Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Met Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys 65 70 75 80 Thr Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala 85 90 95 Cys Glu Ser Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Val 100 105 110 Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 130 135 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 128 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly 1 5 <210> 129 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 129 Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Ala 1 5 10 <210> 130 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 130 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Val 20 <210> 131 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 131 Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg 1 5 10 15 Asp Asn Trp Cys 20 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> The amino acid at position 8 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> The amino acid at position 12 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> The amino acid at position 16 is attached to an acyl group. <400> 132 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Gly Ser Gly Ser Lys 20 25 30 <210> 133 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 133 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 134 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid at position 5 is attached to an acyl group. <400> 134 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> The amino acid at position 8 is attached to an acyl group. <400> 135 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> The amino acid at position 12 is attached to an acyl group. <400> 136 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 137 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> The amino acid at position 16 is attached to an acyl group. <400> 137 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 138 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 138 Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg 1 5 10 15 Asp Asn Trp Cys 20 <210> 139 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 139 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala 1 5 10 15 Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys 20 25 30 Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu 50 55 60 Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys 65 70 75 80 Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg 85 90 95 Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly 100 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 140 Cys Lys Ala Thr Gln Ala Ser Gln Glu Tyr 1 5 10 <210> 141 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 141 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Cys 20 <210> 142 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 142 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Trp Cys 20 <210> 143 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 143 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 144 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 144 Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg 1 5 10 15 Asp Asn Trp Cys 20 <210> 145 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 145 Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Val Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala 35 40 45 Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Met Arg Glu Ile Ala Gln 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can be any naturally occurring amino acid <400> 173 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 174 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 176 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 177 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 178 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 179 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 180 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 180 Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 181 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 181 Arg Gly Asp Gly Trp 1 5 <210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 182 Gly Cys Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 183 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 183 Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 184 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 184 Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr 1 5 10 15 Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr 20 25 30 Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met 35 40 45 Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 65 70 75 80 Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys 85 90 95 Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro 100 105 110 Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp 115 120 125 Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu 130 135 140 Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser 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sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 188 Gly Cys Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 189 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 189 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn 1 5 10 15 Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu 20 25 30 Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val 35 40 45 Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp 50 55 60 Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu 85 90 95 Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe 100 105 110 Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile 115 120 125 Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu 130 135 140 Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser 145 150 155 160 Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val 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anchoring domain. <400> 194 Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val 1 5 10 15 Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys 20 25 30 Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu 35 40 45 Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe 50 55 60 Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu 65 70 75 80 Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser 85 90 95 Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr 100 105 110 Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys 115 120 125 Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr 130 135 140 Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met 145 150 155 160 Leu Pro Pro Val Ala 165 <210> 195 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The amino acid at position 1 may be attached to a cationic anchoring domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (195)..(195) <223> The amino acid at position 195 may be attached to a cationic anchoring domain <400> 195 Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly Cys 1 5 10 15 Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Cys 20 25 30 Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr 50 55 60 Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu 65 70 75 80 Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg 85 90 95 Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala 100 105 110 Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala 115 120 125 Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu 145 150 155 160 Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro 165 170 175 Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro 180 185 190 <210> 196 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The amino acid at position 1 may be attached to a cationic anchoring domain. <400> 196 Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Asp Ala Val Ala Val 1 5 10 15 Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu Lys Leu Leu Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Leu Asp Gly Ser Tyr Leu Leu Arg Asp Ser Glu Ser Val Pro 35 40 45 Gly Val Tyr Cys Leu Cys Val Leu Tyr His Gly Tyr Ile Tyr Thr Tyr 50 55 60 Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr Gly Ser Trp Ser Ala Glu Thr Ala Pro 65 70 75 80 Gly Val His Lys Arg Tyr Phe Arg Lys Ile Lys Asn Leu Ile Ser Ala 85 90 95 Phe Gln Lys Pro Asp Gln Gly Ile Val Ile Pro Leu Gln Tyr Pro Val 100 105 110 Glu Lys Lys Ser Ser Ala Arg Ser Thr Gln Gly Thr Thr Gly Ile Arg 115 120 125 Glu Asp Pro Asp Val Cys Leu Lys Ala Pro 130 135 <210> 197 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> A cationic anchoring domain may be present between the amino acids at positions 4 and 5. <400> 197 Met Gly Ser Ser Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Asp 1 5 10 15 Ala Val Ala Val Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu Lys 20 25 30 Leu Leu Leu Ala Thr Gly Leu Asp Gly Ser Tyr Leu Leu Arg Asp Ser 35 40 45 Glu Ser Val Pro Gly Val Tyr Cys Leu Cys Val Leu Tyr His Gly Tyr 50 55 60 Ile Tyr Thr Tyr Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr Gly Ser Trp Ser Ala 65 70 75 80 Glu Thr Ala Pro Gly Val His Lys Arg Tyr Phe Arg Lys Ile Lys Asn 85 90 95 Leu Ile Ser Ala Phe Gln Lys Pro Asp Gln Gly Ile Val Ile Pro Leu 100 105 110 Gln Tyr Pro Val Glu Lys Lys Ser Ser Ala Arg Ser Thr Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Gly Ile Arg Glu Asp Pro Asp Val Cys Leu Lys Ala Pro 130 135 140 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 198 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 199 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 200 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 201 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 201 Leu Pro Lys Lys Arg Lys Phe Ser Glu Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 202 Lys Arg Lys Arg Trp Glu Asn Asp Ile Pro 1 5 10 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 203 Lys Arg Lys Arg Trp Glu Asn Asn Ile Pro 1 5 10 <210> 204 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 204 Thr Gly Gly Val Met Lys Arg Lys Arg Gly Ser Val 1 5 10 <210> 205 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 205 Pro Ile Leu Pro Leu Lys Arg Arg Arg Gly Ser Pro 1 5 10 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 206 Thr Tyr Ser Gly Val Lys Arg Lys Arg Asn Val Val 1 5 10 <210> 207 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 207 Thr His Ile Gly Tyr Lys Arg Lys Arg Asp Ser Val 1 5 10 <210> 208 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 208 Leu Ser Gly Thr Lys Arg Lys Arg Ala Tyr Phe Ile 1 5 10 <210> 209 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 209 Gln Arg Arg Leu Leu Lys Arg Lys Arg Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 210 Gln Ile Gly Lys Lys Arg Lys Arg Asp Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 211 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 211 Lys Arg Gly Lys Arg Lys Arg Leu Val Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 212 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 212 Lys Lys Gly Lys Arg Lys Arg Leu Val Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 213 Pro Ser Arg Lys Arg Lys Arg Glu Ser Asp His Ile 1 5 10 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 214 Pro Ser Arg Lys Arg Lys Arg Asp His Tyr Ala Val 1 5 10 <210> 215 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 215 Ile Ser Arg Lys Arg Lys Arg Asp Leu Glu Phe Val 1 5 10 <210> 216 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 216 Ile Thr Arg Lys Arg Lys Arg Asp Leu Val Phe Thr 1 5 10 <210> 217 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 217 Glu Pro Asn Pro Arg Lys Arg Lys Arg Ser Glu Leu 1 5 10 <210> 218 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 218 Thr Ser Pro Ser Arg Lys Arg Lys Trp Asp Gln Val 1 5 10 <210> 219 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 219 Thr Leu Glu Arg Lys Arg Lys Leu Ala Val Leu Tyr 1 5 10 <210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 220 Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg Glu Trp Glu Asp Phe 1 5 10 <210> 221 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 221 His Arg Tyr Cys Gly Lys Arg Arg Arg Arg Thr Arg 1 5 10 <210> 222 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 222 Ser Val Leu Gly Lys Arg Ser Arg Thr Trp Glu 1 5 10 <210> 223 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 223 Tyr Gly Arg Val Ser Lys Arg Pro Arg Tyr Gln Phe 1 5 10 <210> 224 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 224 Arg Lys Arg Gly Arg Lys Arg Phe Arg Ser Val 1 5 10 <210> 225 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 225 Lys Arg Lys Tyr Ala Val Phe Leu Glu Ser Gln Asn 1 5 10 <210> 226 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 226 Lys Arg Lys Tyr Ser Ile Tyr Leu Gly Ser Gln Ser 1 5 10 <210> 227 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 227 Lys Arg Lys Trp Met Ala Phe Val Met Gly Asp Pro 1 5 10 <210> 228 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 228 Lys Arg Lys Cys Ala Val Phe Leu Glu Gly Gln Asn 1 5 10 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 229 Ile Pro Arg Lys Arg Ser Phe Ala Glu Leu Tyr Asp 1 5 10 <210> 230 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 230 Arg Leu Thr Pro Arg Lys Arg Ala Phe Ser Glu Val 1 5 10 <210> 231 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 231 Lys Arg Ser Trp Ser Met Ala Phe Cys 1 5 <210> 232 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 232 Lys Arg Thr Lys Ala Gln Ala Phe Thr Glu 1 5 10 <210> 233 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 233 Lys Arg Pro Tyr Ser Ile Ala Phe Pro Leu Gly Gln 1 5 10 <210> 234 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 234 Arg Arg Arg Ser Val Leu Lys Arg Ser Trp Ser Val Ala Phe 1 5 10 <210> 235 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 235 Lys Arg Arg Tyr Ser Asp Ala Phe Arg Leu Pro Val 1 5 10 <210> 236 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 236 Lys Arg Lys Tyr Ser Asp Ala Phe Gly Leu Pro Val 1 5 10 <210> 237 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 237 Ile Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Ser Val Ala Phe Gly 1 5 10 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 238 Ile Gly Arg Lys Arg Val Trp Ala Val Ala Phe Tyr 1 5 10 <210> 239 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 239 Trp Ala Gly Arg Lys Arg Thr Trp Arg Asp Ala Phe 1 5 10 <210> 240 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 240 Ser Ser His Arg Lys Arg Lys Phe Ser Asp Ala Phe 1 5 10 <210> 241 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 241 Pro Ser His Arg Lys Arg Ile 1 5 <210> 242 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 242 Thr Ala His Arg Lys Arg Lys Phe Ser Asp Ala Phe 1 5 10 <210> 243 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 243 Arg Val Gln Arg Lys Arg Lys Trp Ser Glu Ala Phe 1 5 10 <210> 244 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 244 Arg Leu Thr Arg Lys Arg Cys Tyr Asp Cys Ala Phe 1 5 10 <210> 245 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 245 Leu Val Asn Arg Lys Arg Arg Tyr Trp Glu Ala Phe 1 5 10 <210> 246 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 246 Leu Gly Lys Arg Tyr Asp Arg Asp Trp Asp Tyr Lys 1 5 10 <210> 247 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 247 Arg Ser Ser Gly Ile Leu Gly Lys Arg Lys Phe Glu 1 5 10 <210> 248 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 248 Val His Lys Thr Val Leu Gly Lys Arg Lys Tyr Trp 1 5 10 <210> 249 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 249 Ser Ile Leu Gly Lys Arg Lys Asn Arg Asp Pro Ser 1 5 10 <210> 250 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 250 Gln Ser Val Leu Gly Xaa Arg Lys Ser Arg Pro Phe 1 5 10 <210> 251 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 251 Thr Val His Leu Gly Lys Arg Arg Leu Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 252 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 252 Arg Val Leu Gly Lys Arg Lys Thr Gly Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 253 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 253 Val Leu Gly Lys Arg Lys Arg Asp Asp Cys Trp 1 5 10 <210> 254 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 254 His Gly Arg Gln Val Leu Gly Ile Lys Arg Lys Arg 1 5 10 <210> 255 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 255 Ser Val Leu Gly Ile 1 5 <210> 256 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 256 Ser Val Leu Gly Lys Arg Lys Arg His His Leu Asp 1 5 10 <210> 257 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 257 Pro Val Leu Gly Lys Arg Lys Arg Ser Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 258 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 258 Arg Val Leu Gly Lys Arg Lys Arg Glu Asp Arg Pro 1 5 10 <210> 259 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 259 Ile Leu Gly Lys Arg Lys Arg Ser His His Pro Tyr 1 5 10 <210> 260 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 260 Pro Ile Leu Gly Lys Arg Lys Arg His Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 261 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 261 Leu Leu Gly Lys Arg Lys Arg Pro Ser Ile Glu His 1 5 10 <210> 262 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 262 Ser Met Leu Gly Lys Arg Lys Arg Cys Ile Ile Ser 1 5 10 <210> 263 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 263 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Arg Ile Ser Cys Val Thr 1 5 10 <210> 264 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 264 Asp Thr Arg Leu Gly Lys Arg Lys Arg Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 265 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 265 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 266 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 266 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 267 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 267 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 268 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 268 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 269 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 270 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 271 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 271 Met Ala Val Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Asp Lys Met Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn 20 25 30 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 35 40 45 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 50 55 60 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 65 70 75 80 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 85 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300 Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser 305 310 315 320 Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys 325 330 335 Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val 340 345 350 Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr 355 360 365 Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu 370 375 380 Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu 385 390 395 400 Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg 405 410 415 Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro 420 425 <210> 272 <211> 1203 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 272 Met Ala Ala Cys Gly Arg Val Arg Arg Met Phe Arg Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Phe Ala Ala Gly Ala Glu Lys Leu Pro Gly 20 25 30 Gln Gly Val His Ser Gln Gly Gln Gly Pro Gly Ala Asn Phe Val Ser 35 40 45 Phe Val Gly Gln Ala Gly Gly Gly Gly Pro Ala Gly Gln Gln Leu Pro 50 55 60 Gln Leu 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Leu Leu Lys Ala Val Asp Thr Trp Ser Trp Gly Glu Arg Ala Ser His 325 330 335 Glu Glu Val Glu Gly Leu Val Glu Lys Ile Arg Phe Pro Met Met Leu 340 345 350 Pro Glu Glu Leu Phe Glu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Leu Tyr Trp Ser 355 360 365 His Glu Ala Leu Phe Gln Lys Lys Thr Leu Gln Ala Leu Glu Phe His 370 375 380 Thr Val Pro Phe Gln Leu Leu Ala Arg Tyr Lys Gly Leu Asn Leu Thr 385 390 395 400 Glu Asp Thr Tyr Lys Pro Arg Ile Tyr Thr Ser Pro Thr Trp Ser Ala 405 410 415 Phe Val Thr Asp Ser Ser Trp Ser Ala Arg Lys Ser Gln Leu Val Tyr 420 425 430 Gln Ser Arg Arg Gly Pro Leu Val Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Phe Gln 435 440 445 Ala Pro Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Pro Tyr Gln Ser Phe Gln Thr Pro 450 455 460 Gln His Pro Ser Phe Leu Phe Gln Asp Lys Arg Val Ser Trp Ser Leu 465 470 475 480 Val Tyr Leu Pro Thr Ile Gln Ser Cys Trp Asn Tyr Gly Phe Ser Cys 485 490 495 Ser Ser Asp Glu Leu Pro Val Leu Gly Leu Thr Lys Ser Gly Gly Ser 500 505 510 Asp Arg Thr Ile Ala Tyr Glu Asn Lys Ala Leu Met Leu Cys Glu Gly 515 520 525 Leu Phe Val Ala Asp Val Thr Asp Phe Glu Gly Trp Lys Ala Ala Ile 530 535 540 Pro Ser Ala Leu Asp Thr Asn Ser Ser Lys Ser Thr Ser Ser Phe Pro 545 550 555 560 Cys Pro Ala Gly His Phe Asn Gly Phe Arg Thr Val Ile Arg Pro Phe 565 570 575 Tyr Leu Thr Asn Ser Ser Gly Val Asp 580 585 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 278 ctcgtgacca ccctgaccta 20 <210> 279 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 279 gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg 60 tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cccccaactg gggtaacctt tgagttctct 120 cagttggggg ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgacca 166 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 280 agagtctctc agctggtaca 20 <210> 281 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 281 gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtcccc aactggggta acctttgagt 60 tctctcagtt gggggaccag ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat 120 tcaccgattt tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattc 166 <210> 282 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 282 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 283 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 283 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Arg Arg 50 <210> 284 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 284 Cys Glu Val Ser Ser Lys Gly Ala Thr Ile Cys Lys Lys Gly Phe Lys 1 5 10 15 Lys Ala Val Val Lys Cys Ala 20 <210> 285 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 285 Cys Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Cys Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ser Arg Cys Ala 20 <210> 286 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 286 Lys Lys Lys Arg Lys Ser Cys Arg Gly Lys Gln Gly Cys Lys Ala Arg 1 5 10 15 Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser Arg Cys Ala Lys Lys Lys Arg Lys 20 25 30 <210> 287 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 287 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Glu 20 <210> 288 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 288 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 289 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 289 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala 20 25 <210> 290 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(17) <223> Alexa647 is present beween the amino acids at positions 16 and 17. <400> 290 Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Cys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Phe Lys Phe Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Ser Phe 35 <210> 291 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 291 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile 20 25 <210> 292 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 292 ccagcctaag ttggggagac 20 <210> 293 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 293 gtgactgcgt gagactgact 20 <210> 294 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 294 gagctgttca ccggggtggt 20 <210> 295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 295 ctgagtccca gtccatcacg a 21 <210> 296 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 296 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 297 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 297 Thr Ser Val Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Gly Tyr Tyr Gly Asp 1 5 10 <210> 298 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 298 Ser Asn Arg Trp Leu Asp Val Lys 1 5 <210> 299 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 299 Glu Lys Phe Ile Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe Lys Ala Val 1 5 10 <210> 300 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 300 Glu Lys Phe Ile Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe Lys Ala Val 1 5 10 <210> 301 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 301 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 302 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 302 Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu 1 5 10 15 Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser 20 <210> 303 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The amino acid at position 1 is attached to an acyl group. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is aminoisobutyric acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is aminoisobutyric acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is aminoisobutyric acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is aminoisobutyric acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is aminoisobutyric acid. <400> 303 Ser Asn Tyr Ser Xaa Ala Asp Lys Xaa Ala Asn Xaa Ala Asp Asp Xaa 1 5 10 15 Ala Glu Xaa Ala Lys Glu Asn Ser 20 <210> 304 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 304 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 60 acatgaagca g 71 <210> 305 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 305 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacnctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 60 cacatgaagc agcac 75 <210> 306 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 306 ggcccaccct cgtgaccacc ctgaccccca actggggtaa cctttgagtt ctctcagttg 60 ggggctacgg cgtgc 75 <210> 307 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 307 ggcccaccct cgtgaccacc ctgactacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 60 catgaagcag cacg 74 <210> 308 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 308 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 60 gaagcagcac g 71 <210> 309 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 309 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacnncta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga 60 ccacatgaag cagca 75 <210> 310 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 310 ggcccaccct cgtgaccacc ctgaccagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 60 gcacg 65 <210> 311 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 311 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacgcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 60 aagcagcacg 70 <210> 312 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 312 ggcccaccct cgtgaccacc cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacg 55 <210> 313 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 313 ggcccaccct cgtgaccacc ctgagcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 60 gcacg 65 <210> 314 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 314 ggcccaccct cgtgacgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cg 52 <210> 315 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 315 ggcccaccct cgtgaccacc ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 60 agcacg 66 <210> 316 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 316 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacgcagt gcttcagccg cacccgacca catgaagcag 60 cacg 64 <210> 317 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (26)..(40) <223> n is a, c, g, or t <400> 317 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacnnnnn nnnnnnnnnn ctacggcgtg cagtgcttca 60 gccgctaccc cgacc 75 <210> 318 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 318 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 60 atgaagcagc acg 73 <210> 319 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (26)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 319 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacnnnnn nnnctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 60 ccccgaccac atgaa 75 <210> 320 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 320 Asn Phe Tyr Leu Tyr Arg Ala 1 5 <210> 321 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 321 Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe 1 5 10 <210> 322 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 322 Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 1 5 10 <210> 323 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 323 Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu 1 5 <210> 324 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 324 atggtgagca agggcgagg 19 <210> 325 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 325 cacgaactcc agcaggacca tg 22

Claims (76)

  1. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제는 세포의 게놈을 절단하는 것인 뉴클레아제 조성물;
    (b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 삽입은 세포의 게놈 내의 삽입 부위에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 생성하는 것인 표적 공여자 조성물;
    (c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
    (d) 부위-특이적 레콤비나제에 의한 상기 표적 서열의 인식의 결과로서 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
    을 포함하는 페이로드를 갖는 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 공여자 서열을 세포의 게놈 내로 삽입하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 공여자 조성물의 제1 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 삽입이 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 세포의 게놈을 2개의 위치에서 절단하고, 표적 공여자 조성물이 상기 제1 공여자 DNA 중 2개를 포함하며, 이들 각각은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이에 의해 세포의 게놈 내의 제1 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 및 세포의 게놈 내의 제2 위치에서 부위-특이적 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열을 생성하는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 1,000,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 게놈 내의 제1 및 제2 위치가 100,000 염기 쌍 이하만큼 이격되어 있는 것인 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 10 염기 쌍 (bp) 내지 100 킬로염기 쌍 (kbp)의 길이를 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공여자 DNA가 부위-특이적 레콤비나제에 대한 2개의 표적 서열을 포함하며, 여기서 2개의 표적 서열은 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열에 플랭킹되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열이 attB 부위, attP 부위, attL 부위, attR 부위, loxP 부위 및 FRT 부위로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제가 ΦC31, ΦC31 RDF, Cre 및 FLP로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 메가뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 중 적어도 1개가 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 부류 2 CRISPR/Cas 이펙터 단백질이 Cas9 및 cpf1로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 뉴클레아제 조성물이 1개 이상의 CRISPR/Cas 가이드 핵산 또는 CRISPR/Cas 가이드 핵산을 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 나노입자가 페이로드에 추가로, 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 음이온성 중합체 조성물이 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택된 음이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 양이온성 중합체 조성물이 폴리(아르기닌), 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(오르니틴) 및 폴리(시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 코어를 캡슐화하는 유출가능한 층을 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 유출가능한 층이 음이온성 코트 또는 양이온성 코트인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 유출가능한 층이 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 칼슘, 산화칼슘, 히드록시아파타이트, 인산칼슘, 황산칼슘, 망가니즈, 산화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 마그네슘, 산화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 철, 산화철, 인산철 및 황산철 중 1개 이상을 포함하는 것인 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 유출가능한 층을 둘러싸는 표면 코트를 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표면 코트가 유출가능한 층과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 또는 음이온성 앵커링 도메인을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 코트가 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 1개 이상의 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 코트가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, IL2, CD80, CD86, CD8 엡실론, 펩티드-HLA-A*2402, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 코트가 CD3, CD8, CD4, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD47, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL2R, IL7R, IL10R, IL12R, IL15R, IL18R, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
  28. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 코트가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포, 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 간 세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로부터 선택된 표적 세포에 대한 표적화된 결합을 제공하는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 페이로드에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 핵산 페이로드와 축합되고/거나 단백질 페이로드와 정전기적으로 상호작용하는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인이 3 내지 30개 아미노산 범위의 길이를 갖는 것인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 음이온성 중합체가 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 5-50개 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 패밀리 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나제 (RTK), 세포 표면 당단백질 및 세포-세포 부착 분자로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
  37. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 시알릴화 펩티드, 폴리시알릴화 O-연결된 펩티드, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘, 엑센딘-S11C, GLP1, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, α5β1 리간드, IL2, Cde3-엡실론, 펩티드-HLA-A*2402, CD80, CD86, 숙신산, 비스포스포네이트, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  38. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD47, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타; TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마 및/또는 TCR 델타 불변 영역; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β 및 α5β1로부터 선택된 표적에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 방법.
  39. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 장기 HSC, 단기 HSC, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 대식세포, 적혈구 전구 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 전구 세포 (MEP), 공통 골수 전구 세포 (CMP), 다능 전구 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 성상세포, 췌장 세포, 췌장 β-도세포, 근육 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 간 세포, 지방 세포, 장 세포, 결장 세포 및 위 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형에 대한 결합을 제공하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열의 세포 게놈 내로의 삽입이 삽입된 서열과 내인성 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 내인성 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터; (v) B-세포 특이적 프로모터; (vi) CD19 프로모터; (vii) CD20 프로모터; (viii) CD22 프로모터; (ix) B29 프로모터; 및 (x) T-세포 또는 B-세포 V(D)J-특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입되는 삽입 공여자 조성물의 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 프로모터가 (i) T-세포 특이적 프로모터; (ii) CD3 프로모터; (iii) CD28 프로모터; (iv) 줄기 세포 특이적 프로모터; (v) 체세포 특이적 프로모터; (vi) T 세포 수용체 (TCR) 알파, 베타, 감마 또는 델타 프로모터; (v) B-세포 특이적 프로모터; (vi) CD19 프로모터; (vii) CD20 프로모터; (viii) CD22 프로모터; (ix) B29 프로모터; 및 (x) T-세포 또는 B-세포 V(D)J-특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 (i) T 세포 수용체 (TCR) 단백질; (ii) IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질; 또는 (iii) IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 또는 λ 쇄를 코딩하는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 T 세포 수용체 (TCR) 단백질의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역을 코딩하는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입이 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 내인성 T-세포 특이적 프로모터의 작동가능한 연결을 유발하는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 다가 표면 수용체를 코딩하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 세포가 T-세포인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 다가 표면 수용체가 이중특이적 또는 삼중특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)인 방법.
  51. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 막 결합되고 세포외로 제시되는 세포-특이적 표적화 리간드를 코딩하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 리포터 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열이 인트론을 갖지 않는 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 인트론을 갖지 않는 뉴클레오티드 서열이 TCR 단백질 또는 이뮤노글로불린의 전부 또는 일부를 코딩하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서
    (1) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛을 코딩하거나; 또는
    (2) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛을 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛을 코딩하거나; 또는
    (3) 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 쇄를 코딩하고, 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 λ 쇄를 코딩하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며,
    여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 불변 영역을 코딩하고,
    여기서 세포의 게놈 내로 삽입되는 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 불변 영역을 코딩하는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클 중 제1 및 제2 전달 비히클을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서
    (1) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나; 또는
    (2) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 알파 또는 감마 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 TCR 베타 또는 델타 서브유닛 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나; 또는
    (3) 제1 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 κ 쇄에 대한 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되고, 제2 전달 비히클의 제2 공여자 DNA의 뉴클레오티드 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 단백질의 λ 쇄에 대한 프로모터로서 기능하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  63. (a) 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제 또는 1개 이상의 서열 특이적 뉴클레아제를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 뉴클레아제 조성물;
    (b) 부위-특이적 레콤비나제에 대한 표적 서열을 포함하는 제1 공여자 DNA를 포함하는 표적 공여자 조성물;
    (c) 부위-특이적 레콤비나제 또는 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 부위-특이적 레콤비나제는 상기 표적 서열을 인식하는 것인 레콤비나제 조성물; 및
    (d) 표적 세포의 게놈 내로의 삽입을 위한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 공여자 DNA를 포함하는 삽입 공여자 조성물
    을 포함하며, 여기서 (a), (b), (c) 및 (d)는 동일한 전달 비히클의 일부로서의 페이로드인 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 전달 비히클이 나노입자인 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 나노입자가 (a), (b), 음이온성 중합체 조성물, 양이온성 중합체 조성물 및 양이온성 폴리펩티드 조성물을 포함하는 코어를 포함하는 것인 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 나노입자가 나노입자를 세포 표면 단백질로 표적화하는 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 세포 표면 단백질이 CD47인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 표적화 리간드가 SIRPα 단백질 모방체인 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 나노입자가 세포내이입-촉발 리간드를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 1개 이상의 데옥시리보핵단백질 복합체 또는 1개 이상의 리보-데옥시리보핵단백질 복합체를 형성하는 것인 조성물.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하고, 여기서 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인은 페이로드 중 1개 이상과 정전기적으로 상호작용하는 것인 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상 및 하전된 중합체 폴리펩티드 도메인과 상호작용하는 음이온성 중합체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  73. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 페이로드 중 1개 이상에 접합된 표적화 리간드이고, 여기서 표적화 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 것인 조성물.
  74. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 오일-물 에멀젼 미셀 입자 상에, 다층상 물-오일-물 에멀젼 입자 상에, 다층 입자 상에 또는 DNA 오리가미 나노봇 상에 코팅된 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  75. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, ScFv, F(ab), 핵산 압타머 또는 펩토이드인 방법.
  76. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클이 비-바이러스인 조성물.
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