KR20200027351A - Natural deep eutectic solvent for room temperature stabilization and storage of protein biologics - Google Patents

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KR20200027351A KR1020180105543A KR20180105543A KR20200027351A KR 20200027351 A KR20200027351 A KR 20200027351A KR 1020180105543 A KR1020180105543 A KR 1020180105543A KR 20180105543 A KR20180105543 A KR 20180105543A KR 20200027351 A KR20200027351 A KR 20200027351A
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Abstract

The present invention relates to a composition for stabilization of protein, which can improve stability of protein in accordance with a temperature and can also dissolve the protein. The present invention also relates to a method for stabilizing protein using the same. When choline chloride or sugar as a natural substance is mixed at a specific ratio, a liquid with a low melting point is produced from a solid via a hydrogen bond, protein drugs are dissolved, and proteins sensitive to temperature changes are stabilized, thereby enabling long-term storage. In addition, a problem of low temperature storage requiring high cost from production of protein drugs to transportation can be solved, thereby being economically feasible. Thus, it is expected to enable distribution of drugs to areas where the distribution of protein drugs is difficult due to problems of a power system.

Description

단백질 상온 안정화 및 저장용 천연공융용매{Natural deep eutectic solvent for room temperature stabilization and storage of protein biologics}Natural deep eutectic solvent for room temperature stabilization and storage of protein biologics

본 발명은 단백질을 용해시키고, 온도에 따른 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있는 단백질 안정화용 조성물 및 이를 이용한 단백질을 안정화하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for stabilizing proteins capable of dissolving proteins and improving the stability of proteins according to temperature, and a method for stabilizing proteins using the same.

단백질 의약품은 재조합 기술, 세포배양 기술, 정제 기술의 발전에 따라 더욱 그 생산량이 증가하고 있다. 그러나 단백질 의약품은 분자량이 크고 그 구조가 복잡한 경우가 많아 물리적 화학적 불안정성으로 인해 적절한 제형이 필요하다.Protein pharmaceuticals are increasing in production with the development of recombinant technology, cell culture technology, and purification technology. However, protein medicines have a high molecular weight and a complicated structure, and therefore, an appropriate formulation is required due to physical and chemical instability.

수용액 상에 용해된 단백질 약물은 탈아미드화(deamidation), 산화(oxidation), 가수분해(hydrolysis) 등과 같은 화학적 분해와 열변성(thermal denaturation), 응집(aggregation)과 같은 물리적 분해에 의해서 비활성화가 일어나며 또한, 수분 제거를 위한 동결 건조 과정에서 단백질의 변성이 일어나 독성을 유발할 수 있다. 한가지 예로서, 물리적 불안정성에 의해 발생하는 대표적인 현상인 응집(aggregation)의 요인은 단백질의 정제, 제형화, 보관 과정에서 다양하게 존재한다. 정제 시에는 최적의 조건이 아닌 pH, 염 종류, 염 농도, 온도, 공기와의 접촉, 교반 속도 등이 영향을 미치며, 제형화 시에는 단백질의 농축 조건이 영향을 미칠 수 있다. 그리고 버퍼 교환 시에는 필터 통과, 교반 등이 영향을 미치며 저장 시에는 온도변화, pH 변화, 공기와의 접촉, 교반 등이 응집 현상에 영향을 미칠 수 있다. 상기와 같은 이유로 응집된 단백질은 대체로 활성이 감소되거나 시간이 지남에 따라 활성을 잃어버린다. 또한, 단백질은 응집되는 경우 인체에 투여하게 되면 응집되지 않은 상태에서는 나타내지 않던 항원성을 갖게 되어 항체(anti-drug antibody, ADA)의 생성을 유발시킬 수 있다.Protein drug dissolved in aqueous solution is deactivated by chemical decomposition such as deamidation, oxidation, hydrolysis, and physical decomposition such as thermal denaturation and aggregation. In addition, the protein may be denatured in the freeze-drying process for removing moisture, causing toxicity. As an example, factors of aggregation, which is a typical phenomenon caused by physical instability, exist variously in the process of purification, formulation, and storage of proteins. In the case of purification, pH, salt type, salt concentration, temperature, contact with air, stirring speed, etc., which are not optimal conditions, may be affected, and when formulated, the protein concentration conditions may be affected. In addition, when the buffer is exchanged, the passage of the filter, agitation, and the like are affected, and when stored, the temperature change, pH change, contact with air, agitation, etc. can affect the agglomeration phenomenon. For this reason, agglomerated proteins generally have reduced activity or lose activity over time. In addition, when the protein is aggregated, when administered to the human body, it has antigenicity, which is not shown in the non-aggregated state, and may cause the production of an antibody (anti-drug antibody, ADA).

한편, 무수유기용매를 사용하는 경우 단백질의 안정성을 향상시킬 수는 있으나, 유기용매의 독성으로 인해 의학적으로 사용이 어려워 보관 용매로는 적합하지 않으며, 단백질 약물의 안정성을 위하여 생산으로부터 운송에 이르기까지 고비용의 저온 저장(Cold chain)이 필요하지만, 전력체계가 잘 갖추어 있지 않은 곳으로의 보급에는 어려움이 있는 실정이다.On the other hand, when anhydrous organic solvents are used, the stability of the protein may be improved, but due to the toxicity of the organic solvent, it is difficult to use medically and thus is not suitable as a storage solvent. From the production to transportation for the stability of protein drugs Although a high-cost cold chain is required, it is difficult to supply it to a place where the power system is not well equipped.

따라서, 단백질 약물을 안정화시켜 장기간 보존이 가능하면서도 고비용의 저온 저장의 문제점과 전력체계의 문제점으로 인한 단백질 약물 공급의 어려움을 해결할 수 있는 연구가 요구되고 있다.Therefore, there is a need for a study that can stabilize protein proteins for long-term preservation while solving the difficulties of supplying protein drugs due to high-temperature cold storage problems and power system problems.

대한민국특허등록공보 10-1704378Republic of Korea Patent Registration Publication 10-1704378

본 발명자들은 천연 물질인 당이나 콜린클로라이드를 특정 비율로 혼합했을 때 수소 결합에 의해 고체로부터 융점이 낮은 액체가 생성이 되어, 단백질 약물을 용해시키고 이때 용해된 단백질 약물은 온도 변화에 관계없이 단백질의 안정성을 높일 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.When the present inventors mix natural substances, sugar or choline chloride, in a specific ratio, hydrogen bonds form a liquid with a low melting point from a solid, dissolving the protein drug and dissolving the protein drug. It was confirmed experimentally that the stability can be improved, and the present invention was completed based on this.

이에, 본 발명의 목적은 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for stabilizing proteins, which contains a natural eutectic solvent containing choline chloride (Chl) and sugar.

본 발명의 다른 목적은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention comprises the step of adding a composition for stabilizing a protein containing a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar to a solution containing the protein. Is to provide

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs from the following description. will be.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜린클로라이드 및 당이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a composition for stabilizing proteins, which contains a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar.

또한, 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드 및 당이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for stabilizing a protein, comprising the step of adding a composition for stabilizing the protein, which contains a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar to a solution containing the protein.

본 발명의 일 구현예로, 상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protein is interferon-2 alpha (interferon-2α), carbonic anhydrase, human immunoglobulin G (IgG, human immunoglobulin G) and human serum albumin (HSA) albumin).

본 발명의 다른 구현예로, 상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In another embodiment of the invention, the sugar is fructose, sucrose, galactose, mannose, glucose, xylose, and maltose It may be selected from the group consisting of.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 당은 프럭토스 일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the sugar may be fructose.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 콜린클로라이드와 프럭토스, 수크로스, 글루코스, 자일로스, 또는 말토스의 몰비(molar ratio)는 1 : 0.5 내지 2.0일 수 있다(1:0.5~2.0).In another embodiment of the present invention, the molar ratio of the choline chloride and fructose, sucrose, glucose, xylose, or maltose may be 1: 0.5 to 2.0 (1: 0.5 to 2.0).

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 콜린클로라이드와 갈락토스 또는 만노스의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0일 수 있다(1:0.2~1.0).In another embodiment of the present invention, the molar ratio of choline chloride and galactose or mannose may be 1: 0.2 to 1.0 (1: 0.2 to 1.0).

본 발명인 단백질 안정화용 조성물은 천연공융용매를 사용하여 단백질 약물을 용해시켜 안정화시킴으로써 온도 변화에 민감한 단백질을 고농도로 녹여 안정화시킬 수 있으므로 장기간 보관이 가능할 뿐만 아니라, 상온에서 보관이 용이하여 단백질 약물 생산으로부터 운송에 이르기까지 고비용이 요구되는 저온 저장 및 운송(cold-chain system)의 문제점을 해결할 수 있어 경제적이며, 인도적 측면에서 전력 체계의 문제점으로 인하여 단백질 약물 보급이 어려운 지역으로 약품 보급도 가능하게 할 것으로 기대된다.The composition for protein stabilization according to the present invention can be stabilized by dissolving and stabilizing a protein drug by using a natural eutectic solvent to dissolve and stabilize a protein sensitive to temperature changes at a high concentration, and also can be stored for a long time, and can be easily stored at room temperature to prevent protein production. It is economical because it can solve the problem of cold storage and transportation (cold-chain system), which requires high cost to transportation, and it will be possible to supply drugs to areas where protein drug supply is difficult due to problems of power system in humanitarian aspects. It is expected.

도 1은 다양한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent; NDES) 와 PBS(phosphate buffered saline)에 용해되어 있는 인터페론-알파2(interferon-α2; IFN-α2)의 활성도를 비교한 결과이다.
도 2a 및 2b는 콜린클로라이드와 프럭토스을 포함하는 천연공융용매(Chl:Fru NDES)와 PBS에 용해된 IFN-α2의 2차구조(도 2a) 및 3차구조(도 2b)를 비교한 결과이다.
도 3은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 온도에 따른 열변성 정도를 비교한 결과이다.
도 4a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2에 대하여 다양한 온도에서 활성도를 비교한 결과이다.
도 4b는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 70℃에서 시간에 따른 활성도 변화를 비교한 결과이다.
도 4c 및 4d는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 70℃에서 2차구조(도 4c) 및 3차구조(도 4d)를 비교한 결과이다.
도 5a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 37℃에서의 시간에 따른 활성도를 비교한 결과이다.
도 5b 및 5c는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 37℃에서의 2차구조(도 5b) 및 3차구조(도 5c)를 비교한 결과이다.
도 6은 다양한 NDES와 PBS에 용해되어 있는 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase; CA)의 활성도를 비교한 결과이다.
도 7은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 2차 구조를 비교한 결과이다.
도 8은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 온도에 따른 열변성 정도를 비교한 결과이다.
도 9a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 다양한 온도에서의 활성도를 비교한 결과이다.
도 9b 및 9c는 Chl:Fru NDES에 용해된 CA의 70℃에서의 시간에 따른 활성도(도 9b) 및 탁도(도 9c) 변화를 비교한 결과이다.
도 10a 및 10b는 Chl:Fru NDES 에 용해된 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G)의 상온에서의 시간에 따른 2차구조(도 10a) 및 3차구조(도 10b)를 비교한 결과이다.
도 11a는 Chl:Fru NDES에 용해된 다양한 농도의 인간혈청알부민(HSA)를 나타낸 것이다.
도 11b는 Chl:Fru NDES에 용해된 다양한 농도의 인간혈청알부민(HSA)를 70℃에서 2시간 동안 가열한 후의 상태를 나타낸 것이다.1 is a result of comparing the activity of various natural eutectic solvents (NDES) and interferon-α2 (IFN-α2) dissolved in phosphate buffered saline (PBS).
2A and 2B are results comparing the secondary structure (FIG. 2A) and tertiary structure (FIG. 2B) of IFN-α2 dissolved in PBS with natural eutectic solvent (Chl: Fru NDES) containing choline chloride and fructose. .
3 is a result of comparing the degree of thermal denaturation according to the temperature of Chl: Fru NDES and IFN-α2 dissolved in PBS.
Figure 4a is a result of comparing the activity at various temperatures for CFN: Fru NDES and IFN-α2 dissolved in PBS.
Figure 4b is a result of comparing the activity change over time at 70 ℃ of CFN: Fru NDES and IFN-α2 dissolved in PBS.
4C and 4D are the results of comparing the secondary structure (FIG. 4C) and the tertiary structure (FIG. 4D) at 70 ° C. of IFN-α2 dissolved in PBS with Chl: Fru NDES.
Figure 5a is a result of comparing the activity over time of Chl: Fru NDES and IFN-α2 dissolved in PBS at 37 ℃.
5B and 5C are the results of comparing the secondary structure (FIG. 5B) and tertiary structure (FIG. 5C) of Chl: Fru NDES and IFN-α2 dissolved in PBS at 37 ° C.
6 is a result of comparing the activity of carbonic anhydrase (CA) dissolved in various NDES and PBS.
7 is a result of comparing the secondary structure of Chl: Fru NDES and CA dissolved in PBS.
8 is a result of comparing the degree of thermal denaturation according to the temperature of Chl: Fru NDES and CA dissolved in PBS.
Figure 9a is a result of comparing the activity at various temperatures of Chl: Fru NDES and CA dissolved in PBS.
9B and 9C are the results of comparing the changes in activity (FIG. 9B) and turbidity (FIG. 9C) over time at 70 ° C of CA dissolved in Chl: Fru NDES.
10A and 10B are results comparing the secondary structure (FIG. 10A) and tertiary structure (FIG. 10B) over time at room temperature of human immunoglobulin G (IgG) dissolved in Chl: Fru NDES. .
11A shows various concentrations of human serum albumin (HSA) dissolved in Chl: Fru NDES.
11B shows the state after heating human serum albumin (HSA) of various concentrations dissolved in Chl: Fru NDES for 2 hours at 70 ° C.

본 발명자들은 천연 물질인 당이나 콜린클로라이드를 특정 비율로 혼합했을 때 수소 결합에 의해 고체로부터 융점이 낮은 액체가 생성이 되어, 단백질 약물을 용해시키고 이때 용해된 단백질 약물은 온도 변화에 관계없이 단백질의 안정성을 높일 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.When the present inventors mix natural substances, sugar or choline chloride, in a specific ratio, hydrogen bonds form a liquid with a low melting point from a solid, dissolving the protein drug and dissolving the protein drug. It was confirmed experimentally that the stability can be improved, and the present invention was completed based on this.

본 발명의 일 실시예에서는, IFN-α2의 안정화 매질로서 다양한 조성의 천연공융용매로 실험한 결과 콜린클로라이드와 프럭토스가 조합된 천연공융용매에서 IFN-α2 활성이 가장 뛰어난 상태로 유지되는 것을 확인하였으며(실시예1 참조), 다양한 온도조건에서 IFN-α2 단백질의 활성도, 2차, 및 3차 구조가 유지됨을 확인하였다(실시예2 내지 실시예5 참조).In an embodiment of the present invention, as a result of experimenting with a natural eutectic solvent having various compositions as a stabilizing medium of IFN-α2, it was confirmed that IFN-α2 activity was maintained in the best state in a natural eutectic solvent in which choline chloride and fructose were combined. (See Example 1), it was confirmed that the activity, secondary, and tertiary structure of the IFN-α2 protein is maintained at various temperature conditions (see Examples 2 to 5).

본 발명의 다른 실시예에서는, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase; CA)의 안정화 매질로서 다양한 조성의 천연공융용매로 실험한 결과 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 CA 활성이 높게 유지되는 것을 확인하였으며(실시예6 참조), 다양한 온도에서 열적안정성이 부여되고 단백질의 2차구조도 유지됨을 확인하였다(실시예7 내지 실시예9 참조).In another embodiment of the present invention, as a stabilization medium of carbonic anhydrase (CA), as a result of experiments with natural eutectic solvents of various compositions, in the case of natural eutectic solvents containing choline chloride and saccharides, all CA activities remain high. It was confirmed (see Example 6), it was confirmed that the thermal stability is imparted at various temperatures and the secondary structure of the protein is also maintained (see Examples 7 to 9).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G)의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스를 기반으로 한 천연공융용매를 이용한 결과 상온에서 단백질의 2차 및 3차 구조가 장기간 유지됨을 확인하였다(실시예10 참조).In another embodiment of the present invention, as a stabilizing medium of human immunoglobulin G (IgG, human immunoglobulin G), choline chloride: a secondary and tertiary structure of proteins at room temperature as a result of using a natural eutectic solvent based on fructose It was confirmed that it was maintained for a long time (see Example 10).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간혈청알부민(HSA, Human serum albumin)의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스를 기반으로 한 천연공융용매를 이용한 결과 70℃에서도 인간혈청알부민(HSA, Human serum albumin)이 안정하게 유지됨을 확인하였다(실시예11 참조).In another embodiment of the present invention, as a stabilization medium of human serum albumin (HSA), choline chloride: a result of using a natural eutectic solvent based on fructose, human serum albumin (HSA) at 70 ° C ) Was confirmed to be stable (see Example 11).

상기 실시예 결과에 비추어 본 발명의 천연공융용매는 다양한 단백질을 안정화시켜 보관이 용이하게 하는 효과를 가진다.In view of the results of the above examples, the natural eutectic solvent of the present invention has an effect of stabilizing various proteins to facilitate storage.

이에, 본 발명은 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for stabilizing proteins, which contains a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar.

본 발명에서 사용하는 용어 “당(sugar)”란 당, 당질, 설탕(雪糖), 당[류](糖[類]), 사탕(砂糖), 자당(蔗糖). 동물 및 식물 기원의 단맛이 있는 여러 종류의 탄수화물로서, 다가(多價)알코올의 알데하이드 또는 키톤 유도체이다. 당질의 주요한 2군(群)은 C12H22O11의 구조식을 가진 이당류와 C6H12O6의 단당류이며, 이들은 모두 백색의 결정성 고형이며, 물과 희석알코올에 녹는다. 이당류에는 대표적으로 수크로스(sucrose), 말토스(maltose), 락토스(lactose) 등이 있으며 단당류에는 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose) 등이 포함된다. 이들 이외에 많은 인공당 및 그 외의 당이 화학적으로 알려져 있다.The term “sugar” used in the present invention is sugar, sugar, sugar (雪 糖), sugar [class] (糖 [類]), candy (砂 糖), sucrose (蔗糖). A variety of sweet carbohydrates of animal and plant origin, aldehyde or chitone derivatives of polyhydric alcohols. The main two groups of carbohydrates are disaccharides having a structural formula of C 12 H 22 O 11 and monosaccharides of C 6 H 12 O 6 , all of which are white crystalline solids, soluble in water and diluted alcohol. Disaccharides typically include sucrose, maltose, and lactose. Monosaccharides include glucose, fructose, mannose, and galactose. In addition to these, many artificial sugars and other sugars are chemically known.

본 발명에서 사용하는 용어 “공융용매(deep eutectic solvent)”란 공융점을 갖는 용매로 공융점이란 두성분계의 고체상(固體相)-액체상(液體相) 곡선에서, 두 성분이 고용체(固溶體)를 만들지 않고 액체 상태에서 완전히 녹아 섞이는 점 또는 냉각시에는 일정 조성의 용액에서 성분수에 따른 종류의 결정이 동시에 정출하는 점을 의미한다.The term “deep eutectic solvent” used in the present invention is a solvent having a eutectic point. In the solid phase-liquid phase curve of a two-component system called eutectic point, two components are solid solutions. It means that the mixture is completely dissolved in a liquid state without making), or that the crystals of the type according to the number of components are simultaneously crystallized from the solution of a certain composition when cooled.

본 발명에서 상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 특정 항체를 안정화 시키는 용도로 사용될 수도 있다.In the present invention, the protein may be interferon-2 alpha (interferon-2α), carbonic anhydrase, human immunoglobulin G (IgG) and human serum albumin (HSA). It is not limited thereto, and may be used for stabilizing a specific antibody.

본 발명에서 상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 당은 프럭토스 이다.In the present invention, the sugar is selected from the group consisting of fructose, sucrose, galactose, mannose, glucose, xylose, and maltose. It can be, but is not limited to, preferably, the sugar is fructose.

본 발명에서 상기 콜린클로라이드와 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 또는 말토스(maltose)의 몰비(molar ratio)는 1 : 0.5 내지 2.0 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the molar ratio of choline chloride and fructose, sucrose, glucose, xylose, or maltose may be 1: 0.5 to 2.0. However, it is not limited thereto.

본 발명에서 상기 콜린클로라이드와 갈락토스(galactose) 또는 만노스(mannose)의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the molar ratio of choline chloride and galactose or mannose may be 1: 0.2 to 1.0, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention comprises the step of adding a composition for stabilizing a protein containing a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar to a solution containing the protein. It provides a way to stabilize.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments are provided to help understanding of the present invention. However, the following examples are only provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1.  One. IFNIFN -- α2α2 안정화 매질로서  As a stabilizing medium 천연공융용매의Natural eutectic 선별 Selection

IFN-α2의 안정화 매질로서 다양한 몰비로 조성된 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) : 당(sugar)과 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) : 카복시산 그룹(carboxylic acid group)을 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent; NDES)에 PBS에 녹인 IFN-α2(최종 농도 = 40 μM)를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, IFN-α2가 용해된 천연공융용매를 제조하였다. IFN-α2 / NDES 제제를 사용하기 전에 원하는 농도로 희석(최종 농도 = 5 nM) 시킨 후, IFN-α2의 활성도를 측정하여 용해 전과 후에 단백질 활성을 유지시키는 천연공융용매를 선별하였다 (Chl:Choline chloride, Fru:Fructose, Suc:Sucrose, Gal:Galactose, Man:Mannose, Glu:glucose, Xyl:Xylose, Mat:Maltose, Cit:Citric acid, Mal:Malic acid, Lev:levulinic acid, Tar:Tartaric acid, Oxa:Oxalic acid). IFN-α2의 활성은 인터페론-센시티브 리스폰스 엘리먼트(Interferon-sensitive response element; ISRE) 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자(firefly luciferase gene)를 리포터 유전자(reporter gene)로 형질전환한 인간 자궁경부암세포(HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 웰 플레이트에 배양하여 24시간 후, IFN-α2(최종 농도 =5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 측정하였다.As a stabilizing medium of IFN-α2, choline chloride (Chl) composed of various molar ratios: sugar and choline chloride (Chl): natural eutectic solvent based on carboxylic acid group IFN-α2 (final concentration = 40 μM) dissolved in PBS was added to (natural deep eutectic solvent; NDES), and water was removed through freeze drying to prepare a natural eutectic solvent in which IFN-α2 was dissolved. After using the IFN-α2 / NDES preparation, diluted to the desired concentration (final concentration = 5 nM), the activity of IFN-α2 was measured to select a natural eutectic solvent that maintains protein activity before and after dissolution (Chl: Choline chloride, Fru: Fructose, Suc: Sucrose, Gal: Galactose, Man: Mannose, Glu: glucose, Xyl: Xylose, Mat: Maltose, Cit: Citric acid, Mal: Malic acid, Lev: levulinic acid, Tar: Tartaric acid, Oxa: Oxalic acid). The activity of IFN-α2 is a human cervical cancer cell that transforms the firefly luciferase gene, which is regulated by the expression of the interferon-sensitive response element (ISRE) promoter, into a reporter gene. (HeLa). To measure ISRE-luciferase activity, HeLa cells (200,000 cells / well) were cultured in a 24-well plate, and after 24 hours, IFN-α2 (final concentration = 5 nM) was treated and luciferase activity was measured after 18 hours.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 루시페라아제 활성이 뛰어난 것으로 나타났으며 특히 콜린클로라이드와 프럭토스의 몰비가 1:1인 경우 가장 활성이 높은 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 1, in the case of natural eutectic solvents containing choline chloride and saccharides, both showed excellent luciferase activity, especially when the molar ratio of choline chloride and fructose was 1: 1, the highest activity. .

실시예2Example 2 . . Chl:FruChl: Fru NDES와With NDES PBS에 용해되어 있는  Dissolved in PBS IFNIFN -- α2α2 단백질의 2차 및 3차 구조 비교 Comparing secondary and tertiary structures of proteins

상기 실시예 1을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)가 IFN-α2의 구조와 활성도에 영향을 주지 않는 것을 확인하기 위해 Chl:Fru와 PBS에 용해되어 있는 IFN-α2 단백질의 2차 및 3차 구조를 비교하였다. To confirm that the natural eutectic solvent (Chl: Fru) selected through Example 1 does not affect the structure and activity of IFN-α2, secondary and IFN-α2 proteins dissolved in Chl: Fru and PBS The tertiary structure was compared.

IFN-α2 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate). Secondary structural changes of IFN-α2 protein were analyzed by using IFN-α2 diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) using a spectropolarimeter equipped with a constant temperature unit (1.0 mm quartz cell, far UV CD 190 nm). -250 nm at 50 nm / min scanning rate).

IFN-α2 단백질 3차 구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했으며 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).The tertiary structural change of IFN-α2 protein was observed through measurement of extrinsic fluorescence using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt (ANS) and PBS Fluorescence changes at room temperature using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland) by adding 20 μL of ANS (40 μM) to 200 μL of IFN-α2 (final concentration = 1.5 μM) diluted in It was observed (370 nm excitation / 400-600 nm emission).

그 결과 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이 NDES와 PBS에서 유사한 결과값을 가지는 것으로 나타나 천연공융용매가 단백질의 2차 및 3차구조에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 2A and 2B, it was found that NDES and PBS had similar results, and it was confirmed that the natural eutectic solvent did not significantly affect the secondary and tertiary structures of proteins.

실시예Example 3.  3. Chl:FruChl: Fru NDES에서From NDES IFNIFN -- α2의α2 열적안정성Thermal stability 평가 evaluation

상기 실시예 1을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)와 PBS에 용해된 IFN-α2의 용융점(Melting temperature; Tm)을 비교하기 위해 분광 광도계(Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 단백질 샘플의 온도를 1 ℃/분의 속도로 연속적으로 증가시킴으로써 PBS 또는 Chl:Fru에 용해 된 IFN-α2의 용융 거동을 관찰 하였다. 최종 단백질 농도는 5.0 μM이었으며 용융 곡선 및 Tm은 온도에 따른 280 nm에서의 흡광도의 변화에 기초하여 결정되었다. 열 변성은 온도와 흡광증가성(hyperchromicity)의 일차 도함수(dH / dT)를 사용하여 나타내었다.Spectrophotometer (Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) to compare the melting point (Tm) of IFN-α2 dissolved in PBS with the natural eutectic solvent (Chl: Fru) selected through Example 1 above The melting behavior of IFN-α2 dissolved in PBS or Chl: Fru was observed by continuously increasing the temperature of the protein sample at a rate of 1 ° C / min. The final protein concentration was 5.0 μM and the melting curve and Tm were determined based on the change in absorbance at 280 nm with temperature. Thermal denaturation is represented using the first derivative (dH / dT) of temperature and hyperchromicity.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, PBS의 경우 60℃ 근방부터 급격히 단백질 변성이 일어나는 것으로 관찰되는 반면 Chl:Fru는 변화가 거의 없는 것으로 나타나 Chl:Fru NDES가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 3, in the case of PBS, it was observed that protein denaturation occurred rapidly from around 60 ° C. Chl: Fru showed little change, indicating that Chl: Fru NDES can improve the thermal stability of the protein. Confirmed.

실시예Example 4.  4. Chl:FruChl: Fru NDES에NDES 용해된  Dissolved IFNIFN -- α2의α2 다양한 온도 조건에서 활성도 측정 및 70℃에서 단백질의 2차 및 3차 구조비교 Measurement of activity under various temperature conditions and comparison of secondary and tertiary structure of protein at 70 ℃

IFN-α2의 활성은 ISRE 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 형질전환한 인간 자궁경부암세포 (HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 웰 플레이트에 배양하여 24시간 후, IFN-α2(최종 농도 = 5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 특정했다. IFN-α2 단백질 2차구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate) The activity of IFN-α2 was measured using human cervical cancer cells (HeLa) transformed with a reporter gene by the firefly luciferase gene, which is regulated by the expression of the ISRE promoter. To measure ISRE-luciferase activity, HeLa cells (200,000 cells / well) were cultured in a 24-well plate, after 24 hours, IFN-α2 (final concentration = 5 nM) was treated, and after 18 hours, luciferase activity was specified. The secondary structure change of IFN-α2 protein was analyzed by IFN-α2 diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) using a spectropolarimeter equipped with a constant temperature unit (1.0 mm quartz cell, far UV CD 190 nm) -250 nm at 50 nm / min scanning rate)

IFN-α2 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission)The tertiary structure change of the IFN-α2 protein was observed through measurement of extrinsic fluorescence using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt (ANS). Fluorescence changes at room temperature using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland) by adding 20 μL of ANS (40 μM) to 200 μL of IFN-α2 diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) Was observed (370 nm excitation / 400-600 nm emission)

그 결과 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이 PBS에서는 70℃에서 IFN-α2의 활성도가 급격히 저하되었으나 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2는 다양한 온도 조건에서 높은 활성도를 유지하였고 70℃에서도 장시간 활성도를 유지하고 있음을 확인하였다. 또한, 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이 NDES에서는 70℃에서 단백질의 2차 및 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 4A and 4B, the activity of IFN-α2 rapidly decreased at 70 ° C in PBS, but the IFN-α2 dissolved in Chl: Fru NDES maintained high activity at various temperature conditions and maintained long-term activity at 70 ° C. It was confirmed that it was maintained. In addition, as shown in Figures 4c and 4d, it was confirmed that the secondary and tertiary structures of the protein remained stable at 70 ° C in NDES.

실시예Example 5.  5. Chl:FruChl: Fru NDES와With NDES PBS에 용해된  Dissolved in PBS IFNIFN -- α2의α2 상온에서 시간에 따른 활성도 비교 Comparison of activity over time at room temperature

IFN-α2의 활성은 ISRE 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 형질전환한 인간 자궁경부암세포(HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 well plate에 배양하여 24시간 후, 37˚C에서 지정된 기간동안 인큐베이션 후 샘플링한 IFN-α2(최종 농도 = 5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 측정하였다. The activity of IFN-α2 was measured using human cervical cancer cells (HeLa) transformed with a reporter gene by the firefly luciferase gene, which is regulated by the expression of the ISRE promoter. To measure ISRE-luciferase activity, HeLa cells (200,000 cells / well) were cultured in a 24 well plate, and after 24 hours, incubated at 37 ° C for a specified period and then sampled IFN-α2 (final concentration = 5 nM). After 18 hours, luciferase activity was measured.

IFN-α2 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다(1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate). The secondary structure change of IFN-α2 protein was analyzed by using IFN-α2 diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) using a spectropolarimeter equipped with a constant temperature unit (1.0 mm quartz cell, far UV CD 190 nm). -250 nm at 50 nm / min scanning rate).

IFN-α2 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).The tertiary structure change of the IFN-α2 protein was observed through measurement of extrinsic fluorescence using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt (ANS). Fluorescence changes at room temperature using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland) by adding 20 μL of ANS (40 μM) to 200 μL of IFN-α2 diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) Was observed (370 nm excitation / 400-600 nm emission).

그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, PBS에 용해된 IFN-α2은 37˚C에서 20일경부터 급격히 활성도가 떨어진 반면에 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2는 90일 이후까지도 활성도가 유지되는 것을 확인할 수 있었고, 도 5b 및 5c에 나타난 바와 같이 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2의 2차와 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 5a, IFN-α2 dissolved in PBS rapidly decreased activity from day 20 at 37˚C, while IFN-α2 dissolved in Chl: Fru NDES was maintained even after 90 days 5B and 5C, it was confirmed that the secondary and tertiary structures of IFN-α2 dissolved in Chl: Fru NDES remain stable.

실시예Example 6.  6. 탄산무수화효소Carbonic anhydrase (carbonic (carbonic anhydraseanhydrase ) 안정화 매질로서 ) As a stabilizing medium 천연공융용매의Natural eutectic 선별 Selection

탄산무수화효소(carbonic anhydrase; CA)의 안정화 매질로서 다양한 몰비로 조성된 콜린클로라이드 : 당과 콜린클로라이드 : 카복시산 그룹을 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 CA(최종 농도 = 67 μM)를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, CA가 용해된 천연공융용매를 제조하였다. CA / NDES 제제를 사용하기 전에 원하는 농도로 희석(최종 농도 = 33 nM) 시킨 후, CA의 활성도를 측정하여 용해 전과 후에 단백질 활성을 유지시키는 천연공융용매를 선별하였다 (Chl:Choline chloride, Fru:Fructose, Suc:Sucrose, Gal:Galactose, Man:Mannose, Glu:glucose, Xyl:Xylose, Mat:Maltose, Cit:Citric acid, Mal:Malic acid, Lev:levulinic acid, Tar:Tartaric acid, Oxa:Oxalic acid). CA의 활성은 CA에 의한 4-니트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate; PNPA)의 가수 분해에 의해 생성되는 발색 물질인 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광도 변화를 통하여 측정하였다. CA (최종 농도 = 33 nM) 100 μl와 PNPA (최종농도 = 5 μM) 100 μl를 96 웰 플레이트에서 혼합한 뒤에 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 5분 동안 30초 간격으로 400 nm에서의 흡광도 변화를 통해 CA의 활성도를 측정하였다.CA dissolved in PBS in a natural deep eutectic solvent (NDES) based on a group of choline chloride: sugar and choline chloride: carboxylic acid composed of various molar ratios as a stabilizing medium for carbonic anhydrase (CA) (Final concentration = 67 μM) was added, and water was removed through freeze drying to prepare a natural eutectic solvent in which CA was dissolved. After using the CA / NDES preparation, diluted to the desired concentration (final concentration = 33 nM), the activity of CA was measured to select a natural eutectic solvent that maintains protein activity before and after dissolution (Chl: Choline chloride, Fru: Fructose, Suc: Sucrose, Gal: Galactose, Man: Mannose, Glu: glucose, Xyl: Xylose, Mat: Maltose, Cit: Citric acid, Mal: Malic acid, Lev: levulinic acid, Tar: Tartaric acid, Oxa: Oxalic acid ). The activity of CA was measured by changing the absorbance of p-nitrophenol, a color-producing substance produced by hydrolysis of 4-nitrophenyl acetate (PNPA) by CA. After mixing 100 μl of CA (final concentration = 33 nM) and 100 μl of PNPA (final concentration = 5 μM) in a 96 well plate, 5 at room temperature using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland). The activity of CA was measured by changing the absorbance at 400 nm at 30 second intervals for minutes.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 콜린클로라이드와 카복시산 그룹을 포함하는 천연공융용매의 경우 CA 활성이 낮았으나 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 CA 활성이 높게 유지되는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 6, CA activity was low in the case of natural eutectic solvents containing choline chloride and carboxylic acid groups, but CA activity was high in all natural eutectic solvents containing choline chloride and saccharides.

실시예7Example 7 . . Chl:Fru와With Chl: Fru PBS에 용해되어 있는 CA 단백질의 2차 구조 비교 Secondary structure comparison of CA protein dissolved in PBS

실시예 6을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)가 CA의 구조와 활성도에 영향을 주지 않는 것을 확인하기 위해 Chl:Fru와 PBS에 용해되어 있는 CA 단백질의 2차 구조를 비교하였다. To confirm that the natural eutectic solvent (Chl: Fru) selected through Example 6 did not affect the structure and activity of CA, the secondary structure of CA proteins dissolved in Chl: Fru and PBS was compared.

CA 단백질 2차구조 변화는 PBS에 희석한 CA (최종 농도 = 3.3 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate).CA protein secondary structure changes were analyzed by diluting the CA diluted in PBS (final concentration = 3.3 μM) using a spectropolarimeter equipped with a constant temperature unit (1.0 mm quartz cell, far UV CD 190 nm-250 nm at 50 nm / min scanning rate).

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 네이티브 CA와 NDES가 첨가된 CA모두 비슷한 결과값을 나타내고 있어 천연공융용매가 단백질의 구조에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 7, both native CA and NDES-added CA showed similar results, confirming that the natural eutectic solvent did not significantly affect the structure of the protein.

실시예Example 8.  8. Chl:FruChl: Fru NDES에서From NDES CA의  CA's 열적안정성Thermal stability 평가 evaluation

실시예 6을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)와 PBS에 용해된 CA의 용융점(Melting temperature; Tm)를 비교하여, Chl:Fru가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하기 위해 분광 광도계 (Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 단백질 샘플의 온도를 1 ℃ / 분의 속도로 연속적으로 증가시킴으로써 PBS 또는 Chl:Fru에 용해 된 CA의 용융 거동을 관찰하였다. 최종 단백질 농도는 5.0 μM이었으며 용융 곡선 및 Tm은 온도에 따른 280 nm에서의 흡광도의 변화에 기초하여 결정되었다. 열변성과 관련하여 온도와 흡광증가성(hyperchromicity)은 일차 도함수(dH / dT)를 사용하여 나타내었다.To compare the natural eutectic solvent (Chl: Fru) selected in Example 6 with the melting point (Tm) of CA dissolved in PBS, to confirm that Chl: Fru can improve the thermal stability of proteins The melting behavior of CA dissolved in PBS or Chl: Fru was observed by continuously increasing the temperature of the protein sample at a rate of 1 ° C / min using a spectrophotometer (Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The final protein concentration was 5.0 μM and the melting curve and Tm were determined based on the change in absorbance at 280 nm with temperature. In relation to thermal denaturation, temperature and hyperchromicity were expressed using a first derivative (dH / dT).

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, PBS의 경우 60℃ 근방부터 급격히 단백질 변성이 일어나는 것으로 관찰되는 반면 Chl:Fru는 변화가 거의 없는 것으로 나타나 Chl:Fru가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 8, in the case of PBS, it was observed that protein denaturation occurred rapidly from around 60 ° C. Chl: Fru was found to have little change, confirming that Chl: Fru can improve the thermal stability of the protein. Could.

실시예Example 9.  9. Chl:FruChl: Fru NDES에NDES 용해된 CA의 다양한 온도 조건에서 활성도 및 70℃에서 CA의 활성도 및 탁도 비교 Comparison of activity at various temperature conditions of dissolved CA and activity and turbidity of CA at 70 ° C

CA의 활성은 CA에 의한 4-니트로페닐아세테이트(4-nitrophenyl acetate; PNPA)의 가수 분해에 의해 생성되는 발색 물질인 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광도 변화를 통하여 측정하였다. CA (최종 농도 = 33 nM) 100 μl와 PNPA (최종농도=5 μM) 100 μl를 96 웰 플레이트에서 혼합한 뒤에 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 5분 동안 30초 간격으로 400 nm에서의 흡광도 변화를 통해 CA의 활성도를 측정하였다. 70℃에서 시간에 따른 CA의 탁도 변화는 CA가 용해된 Chl:Fru NDES (최종농도 = 5.0 μM)와 PBS(최종농도 = 5.0 μM)를 415 nm 에서의 흡광도 변화를 통해서 측정하였다.The activity of CA was measured by changing the absorbance of p-nitrophenol, a color-producing substance produced by hydrolysis of 4-nitrophenyl acetate (PNPA) by CA. 100 μl of CA (final concentration = 33 nM) and 100 μl of PNPA (final concentration = 5 μM) were mixed in a 96 well plate, followed by 5 at room temperature using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland). The activity of CA was measured by changing the absorbance at 400 nm at 30 second intervals for minutes. The change in the turbidity of CA over time at 70 ° C was measured by changing the absorbance at 415 nm of CA dissolved Chl: Fru NDES (final concentration = 5.0 μM) and PBS (final concentration = 5.0 μM).

그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, PBS에서는 65℃부터 효소의 활성도가 급격히 떨어졌으나 NDES에서는 상대적으로 높은 활성도를 유지하고 있었으며 또한, 도 9b 및 9c에 나타난 바와 같이, 70℃에서 시간에 따른 CA의 활성도 및 탁도 관찰에서도 NDES가 PBS군보다 완만하게 값이 변화함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 9A, the activity of the enzyme rapidly decreased from 65 ° C in PBS, but maintained a relatively high activity in NDES. Also, as shown in FIGS. 9B and 9C, CA over time at 70 ° C Also in the activity and turbidity observations, it was confirmed that the value of NDES was changed more slowly than the PBS group.

실시예Example 10.  10. Chl:FruChl: Fru NDES에NDES 용해된  Dissolved 인간면역글로불린GHuman Immunoglobulin G (( IgGIgG , human immunoglobulin G)의 상온에서 시간에 따른 안정성 분석, human immunoglobulin G) stability analysis over time at room temperature

IgG 항체 단백질의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스 (molar stoichiometry = 1:1)를 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 IgG를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, IgG가 용해된 천연공융용매(최종농도 = 15 μM)를 제조하였다. Choline chloride as a stabilization medium for IgG antibody protein: IgG dissolved in PBS is added to a natural deep eutectic solvent (NDES) based on fructose (molar stoichiometry = 1: 1), and water is lyophilized. By removal, IgG was dissolved in a natural eutectic solvent (final concentration = 15 μM) to prepare.

IgG 항체 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IgG(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다(1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate). The secondary structure change of IgG antibody protein was analyzed using IgG (final concentration = 1.5 μM) diluted in PBS using a spectropolarimeter equipped with a constant temperature unit (1.0 mm quartz cell, far UV CD 190 nm-250 nm). at 50 nm / min scanning rate).

IgG 항체 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IgG(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).The change in the tertiary structure of the IgG antibody protein was observed through measurement of extrinsic fluorescence using 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt (ANS). Fluorescence changes at room temperature were observed using a microplate reader (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland) by adding 20 μL of ANS (40 μM) to 200 μL of IgG diluted in PBS (final concentration = 1.5 μM) (370 nm excitation / 400-600 nm emission).

그 결과 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, Chl:Fru NDES에 용해된 IgG는 상온에서 8주 이후까지도 IgG의 2차 및 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIGS. 10A and 10B, it was confirmed that the IgG dissolved in Chl: Fru NDES maintains the secondary and tertiary structures of IgG stably even after 8 weeks at room temperature.

실시예Example 11.  11. 천연공융용매(Chl:Fru)에Natural eutectic solvent (Chl: Fru) 다양한 농도로 용해된  Dissolved in various concentrations 인간혈청알부민Human serum albumin (HSA, Human serum albumin)의  (HSA, Human serum albumin) 열적안정성Thermal stability 분석 analysis

HSA의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스 (molar stoichiometry = 1:1)를 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 다양한 농도의 HSA를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, HSA가 용해된 천연공융용매(최종농도 = 15 μM ~ 2.25 mM)를 제조하였다(도 10a). 70℃에서 2시간 동안 가열한 후 가열전과 비교한 결과 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이 HSA의 상태변화를 육안으로 관찰할 수 없었다. As a stabilizing medium of HSA, choline chloride: natural deep eutectic solvent (NDES) based on fructose (molar stoichiometry = 1: 1) is added with various concentrations of HSA dissolved in PBS, and water is freeze-dried. By removing the, HSA dissolved natural eutectic solvent (final concentration = 15 μM ~ 2.25 mM) was prepared (FIG. 10A). After heating at 70 ° C. for 2 hours, as compared with the results before heating, the state change of HSA could not be observed with the naked eye as shown in FIGS. 11A and 11B.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The above description of the present invention is for illustration only, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (12)

콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물.
A composition for stabilizing proteins, containing a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
According to claim 1,
The protein is selected from the group consisting of interferon-2 alpha (interferon-2α), carbonic anhydrase, human immunoglobulin G (IgG) and human serum albumin (HSA). Characterized in that the protein, protein stabilizing composition.
제1항에 있어서,
상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
According to claim 1,
The sugar is selected from the group consisting of fructose, sucrose, galactose, mannose, glucose, xylose, and maltose The composition for protein stabilization.
제3항에 있어서,
상기 당은 프럭토스인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
The method of claim 3,
The sugar is characterized in that the fructose, protein stabilizing composition.
제3항에 있어서,
상기 콜린클로라이드와 프럭토스, 수크로스, 글루코스, 자일로스, 또는 말토스의 몰비는 1 : 0.5 내지 2.0인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
The method of claim 3,
The molar ratio of choline chloride and fructose, sucrose, glucose, xylose, or maltose is 1: 0.5 to 2.0, protein stabilization composition.
제3항에 있어서,
상기 콜린클로라이드와 갈락토스 또는 만노스의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
The method of claim 3,
The molar ratio of choline chloride and galactose or mannose is 1: 0.2 to 1.0, characterized in that, protein stabilizing composition.
단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법.
A method of stabilizing a protein, comprising adding a composition for stabilizing the protein containing a natural eutectic solvent containing choline chloride and sugar to a solution containing the protein.
제7항에 있어서,
상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
The method of claim 7,
The protein is selected from the group consisting of interferon-2 alpha, carbonic anhydrase, human immunoglobulin G (IgG) and human serum albumin (HSA). A method for stabilizing a protein, characterized in that it is a protein.
제7항에 있어서,
상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
The method of claim 7,
The sugar is selected from the group consisting of fructose, sucrose, galactose, mannose, glucose, xylose, and maltose How to stabilize the protein.
제9항에 있어서,
상기 당은 프럭토스인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
The method of claim 9,
The sugar is characterized in that the fructose, a method for stabilizing the protein.
제9항에 있어서,
상기 콜린클로라이드와 프럭토스, 수크로스, 글루코스, 자일로스, 또는 말토스의 몰비는 1 : 0.5 내지 2.0인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
The method of claim 9,
Method for stabilizing a protein, characterized in that the molar ratio of choline chloride and fructose, sucrose, glucose, xylose, or maltose is 1: 0.5 to 2.0.
제9항에 있어서,
상기 콜린클로라이드와 갈락토스 또는 만노스의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.The method of claim 9,
Method for stabilizing a protein, characterized in that the molar ratio of the choline chloride and galactose or mannose is 1: 0.2 to 1.0.
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