KR20190083724A - Microfluidic chip and pretreatment method for concentration and purification of samples - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 시료의 농축 및 정제를 위한 미세유체 칩 및 전처리 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microfluidic chip and a pretreatment method for concentrating and purifying a sample.
현재 병원에서는 낮은 농도의 병원체를 핵산 증폭과 같은 분자진단 기법으로 검출하기 위해서, 전처리 과정으로 12시간 이상의 시간동안 배양을 진행한다. 그 후 배양을 진행한 시료를 원심분리기를 통해 병원체를 농축하여 사용한다. 이러한 방법은 시간이 오래 걸리며 검출하려고 하는 시료 안에 분자진단 저해요소가 존재하여 분자진단 기법의 민감도에 영향을 미친다. 또한 이러한 전처리 과정은 연구원들의 수작업으로 이루어지며 연구자의 숙련도에 영향을 받게 되며, 고위험성 병원체에 노출로 인한 연구원들의 감염 문제를 발생시킬 수 있다.Currently, in the hospital, culture is carried out for more than 12 hours by pretreatment in order to detect low-level pathogens by molecular diagnostic techniques such as nucleic acid amplification. After that, the cultured specimen is concentrated by using a centrifugal separator. This method takes a long time and affects the sensitivity of molecular diagnostic techniques due to the presence of molecular diagnostic inhibitors in the sample to be detected. This preprocessing process is done manually by the researchers, is influenced by the proficiency of the researchers, and can cause infection problems among the researchers exposed to high-risk pathogens.
병원체 농축기술 경우 최근 자성나노입자의 표면에 항체를 결합시킨 후 특정세균과 반응시키는 방법인 Immunomagnetic separation (IMS) 기법을 이용하여 이를 대체할 수 있으나, 10 mL 의 많은 시료에 적용시킬 경우 영구 자석에 의한 입자의 포집 효율이 떨어지며, 복잡한 실험 과정으로 인해 많은 시간이 소요된다. In case of pathogen enrichment technology, it can be replaced by Immunomagnetic separation (IMS) method which is a method of binding antibody to the surface of magnetic nanoparticles and reacting with specific bacteria. However, when applied to many samples of 10 mL, permanent magnet , The collection efficiency of the particles is decreased, and it takes a lot of time due to the complicated experiment process.
핵산 정제 방법은 일반적으로 원심분리기를 이용한 기술이 있다. 이 과정은 원심분리기를 이용해 세균을 농축하는 과정 및 washing 과정 등의 반복해서 완충용액을 바꾸어 주면서 원심분리를 진행해 주어야하는 단점이 있다. 이를 대체하는 기술로 자성 실리카 입자를 이용한 정제 기술이 있으나, 이 기술 역시 튜브 안에서 반복적으로 완충용액을 바꾸어주면서 진행해야하는 복잡한 방법으로 이루어져 있다.The nucleic acid purification method generally uses a centrifuge technology. This process has the disadvantage that centrifugation should be carried out while changing the buffer solution repeatedly such as a process of concentrating bacteria and a washing process using a centrifugal separator. There is a refinement technique using magnetic silica particles as a substitute technology, but this technique is also a complicated method that must be repeated while changing the buffer solution in the tube.
Qiagen, Cephied, abbott, BD 등의 분자진단 선발주자 기업에서 시료 내 병원체로부터 직접적으로 유전자를 추출하는 상용 kit를 개발해내고 있지만 병원체 농축과 핵산 정제 및 추출이 동시에 가능한 시스템은 제시된 바 없다.A leading molecular diagnostic company, Qiagen, Cephied, abbott, BD, etc., has developed a commercial kit for extracting genes directly from a pathogen in a sample. However, no system has been proposed for simultaneous enrichment of pathogen and nucleic acid purification and extraction.
한편, 마이크로 플루이딕 채널(Microfluidic channel)과 같이 화학물질이나, 혈액 또는 생체분자 등의 액체 시료를 원하는 방향으로 빠르게 전달하려는 연구가 진행됨에 따라(국내 공개특허 제2007-0005153호), 이러한 채널들은 극소량의 샘플 및 시료만을 가지고도 집약적으로 설계된 칩 내에서 화학물질 검출, 반응 검사, 신약 개발, 세포배양, 생체 기관 모사, 또는 실험 등을 수행할 수 있다. 최근에는 분석에 필요한 시료의 양을 극소화시켜 한 방울의 액체만 가지고도 분석이 가능한 개방형 플루이딕 채널(Open fluidic channel)에 대한 연구 또한 진행되고 있다. 상기와 같은 마이크로 플루이딕 채널(Micro fluidic channel)에서는 유체의 흐름을 제어하는 것이 중요하며, 예를 들어 전기나 3차원 구조를 이용하여 유체의 흐름을 제어한다.On the other hand, as researches for rapidly transferring chemical substances, liquid samples such as blood or biomolecules, in a desired direction, such as a microfluidic channel (Korean Patent Publication No. 2007-0005153) It is possible to perform chemical detection, reaction test, new drug development, cell culture, bio-organ simulation, or experiment in an intensively designed chip with only a very small amount of sample and sample. In recent years, studies on an open fluidic channel that can analyze even a drop of liquid have been carried out by minimizing the amount of sample required for analysis. In such a microfluidic channel, it is important to control the flow of the fluid. For example, the flow of the fluid is controlled by using electricity or a three-dimensional structure.
본 발명자들은 핵산 증폭 기법으로 검출되기 어려운 낮은 농도의 병원체 시료를 전처리 농축을 통해 검출 가능한 농도로 만들어 줌과 동시에 시료에 들어있는 분자진단 저해요소들을 제거하며, 농축된 병원체에서 핵산을 정제 후 추출하는 과정이 동시에 가능한 미세유체 칩 및 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 표면에 항체가 결합된 자성나노입자에 병원체를 결합시켜 제조된 시료를, 정제 챔버 하부에 영구자석이 구비된 미세유체 칩을 이용할 경우, 분자진단이 가능한 수준으로 시료가 농축 및 정제된다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made it possible to detect a low concentration of a pathogen sample which is difficult to be detected by the nucleic acid amplification technique at a detectable concentration through the pre-treatment concentration, remove the molecular diagnostic inhibition elements contained in the sample and purify and extract the nucleic acid from the concentrated pathogen The present inventors have conducted intensive studies to develop a pretreatment method for enriching and purifying microfluidic chips and samples capable of simultaneously forming a magnetic nanoparticle and a magnetic nanoparticle, The present inventors have accomplished the present invention by confirming that a sample is concentrated and purified to a level that enables molecular diagnosis.
이에, 본 발명의 목적은 시료의 농축 및 정제를 위한 미세유체 칩 및 상기 미세유체 칩을 사용한 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a microfluidic chip for concentration and purification of a sample, and a pretreatment method for concentrating and purifying a sample using the microfluidic chip.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 시료 출구를 포함하는, 미세유체 칩을 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a semiconductor device comprising: a substrate; A sample injection port formed on the substrate; A channel forming a path of movement of the sample; A purification chamber connected to the channel; An impurity removal outlet through which the impurities removed from the purification chamber escape; An air inlet through which air is injected into the channel; And a purified sample outlet through which the purified sample in the purification chamber escapes.
본 발명의 일구현예로서, 상기 정제 챔버의 양 말단에는 필름밸브가 구비된 것을 특징으로 한다.In an embodiment of the present invention, a film valve is provided at both ends of the purifying chamber.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비된 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, a permanent magnet is provided at a lower portion of the tablet chamber.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 미세유체 칩은 진동모터를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In still another embodiment of the present invention, the microfluidic chip further includes a vibration motor.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 시료는 병원체; 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 포함하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the sample is a pathogen; And a magnetic nanoparticle having an antibody bonded to the surface thereof.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 미세유체 칩을 이용한 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 제공한다:The present invention also provides a pretreatment method for concentrating and purifying a sample using the microfluidic chip comprising the steps of:
병원체 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 혼합하여 시료를 제조하는 단계(S1);(S1) of preparing a sample by mixing magnetic nanoparticles having an antibody bound to a pathogen and a surface thereof;
상기 S1 단계의 시료를 자성 입자가 충진 된 미세유체 칩에 주입구를 통해 주입하여 시료를 농축한 후, 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S2);A step S2 of injecting the sample of the step S1 into the microfluidic chip filled with the magnetic particles through the injection port to concentrate the sample and then removing the remaining fluid through the impurity removal outlet;
상기 S2단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용해 및 결합 완충액을 주입하여 볼텍싱(vortexing)하고, 세척 완충액을 주입하여 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S3);Removing the remaining fluid in step S2, vortexing by injecting a dissolution and binding buffer solution, and removing the remaining fluid through the impurity removal outlet by injecting a washing buffer solution (S3);
상기 S3단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용출 완충액을 주입하고, 챔버를 50 내지 80℃로 가열하며 볼텍싱하는 단계(S4); 및Removing the remaining fluid in step S3, injecting an elution buffer solution, and vortexing the chamber by heating to 50 to 80 DEG C (step S4); And
상기 S4 단계의 볼텍싱이 완료되면, 시료 주입구 및 불순물 제거 출구를 차단하고, 공기 주입구 및 정제 핵산 출구를 개방하여 농축 및 정제된 시료를 추출해내는 단계(S5).When the vortexing in step S4 is completed, the sample inlet and the impurity removal outlet are blocked, and the air inlet and the purified nucleic acid outlet are opened to extract the concentrated and purified sample (S5).
본 발명의 일 구현예로서, 상기 S2 단계의 농축은 영구자석과 시료 안의 자성나노입자의 자성에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the concentration in the step S2 is performed by the magnetism of the permanent magnet and the magnetic nanoparticles in the sample.
본 발명에 따른 미세유체 칩 및 상기 미세유체 칩을 이용한 전처리 방법은, 분자진단 기법에 이용될 순수한 핵산을 분리하기 위한 시료의 전처리 과정(세균 농축, 불순물 분리, 핵산 정제 및 추출)을 1시간 이내 수행할 수 있고, 각각 독립적으로 진행되는 과정을 하나의 미세유체 칩 안에서 연속적으로 수행할 수 있으며, 하나의 반응 공간에서 농축과 핵산 정제가 동시에 이루어지기 때문에 시료 손실이 적어 민감도적으로 우수한 장점이 있다.The microfluidic chip according to the present invention and the pretreatment method using the microfluidic chip are capable of preliminarily processing a sample (bacterial concentration, impurity separation, nucleic acid purification and extraction) for separating pure nucleic acid to be used in a molecular diagnostic technique within 1 hour Can be performed continuously in a single microfluidic chip, and each sample can be subjected to concentration and nucleic acid purification at the same time in a single reaction space, resulting in less loss of the sample, which is advantageous in sensitivity .
도 1은 본 발명의 미세유체 칩의 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 미세유체 칩과 각 구성 요소를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 미세유체 칩의 분해도를 나타낸 도면이다.
도 4a는 본 발명의 미세유체 칩의 상/하부프레임 및 메인기판을 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명의 미세유체 칩의 하부 프레임과 메인기판을 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 4c는 본 발명의 미세유체 칩을 조립한 사진을 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 시료 전처리 자동화 시스템의 구성을 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 미세유체 칩이 시스템의 디바이스 스테이지에 장착되는 것을 보여주는 도면이다.
도 6a는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템을 나타낸 것으로, 상부모듈 및 하부모듈을 포함하는 것을 보여주는 도면이다.
도 6b는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 내부 구조 사진을 나타낸 도면이다.
도 6c는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 상부모듈 및 하부모듈을 보다 상세하게 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 상면을 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 우측면을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 자동화 시스템의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법의 과정을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 전처리 방법을 거치지 않은 원시료 및 본 발명의 전처리 방법을 거친 시료를 대상으로 PCR(핵산증폭)을 수행한 후 증폭 산물의 젤 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 전처리 방법을 거치지 않은 원시료 및 본 발명의 전처리 방법을 거친 시료를 대상으로 정량적 핵산 증폭 기술(quantitative PCR)을 수행한 후 형광 세기를 확인하여 그 결과를 나타낸 도면이다. 1 shows a view of a microfluidic chip of the present invention.
FIG. 2 is a view showing the microfluidic chip manufactured according to the present invention and the respective components.
3 is an exploded view of a microfluidic chip of the present invention.
4A is a view showing an upper / lower frame and a main substrate of a microfluidic chip of the present invention.
FIG. 4B is a view showing the coupling of the lower frame of the microfluidic chip of the present invention and the main substrate.
4C is a photograph of the microfluidic chip of the present invention assembled.
5A is a diagram showing a configuration of a sample preparation automation system of the present invention.
5B is a view showing that the microfluidic chip of the present invention is mounted on the device stage of the system.
FIG. 6A illustrates a system constructed in accordance with an embodiment of the present invention, including an upper module and a lower module. FIG.
6B is a view showing an internal structure photograph of the system manufactured in the embodiment of the present invention.
6C is a more detailed view of an upper module and a lower module of the system manufactured in the embodiment of the present invention.
7A is a top view of a system manufactured in an embodiment of the present invention.
FIG. 7B is a right side view of the system manufactured in the embodiment of the present invention.
8 is a schematic diagram of a pretreatment automation system for concentrating and purifying a sample of the present invention.
9 is a view showing a process of a pretreatment method for concentration and purification of a sample of the present invention.
10 is a graph showing gel electrophoresis results of amplification products after performing PCR (nucleic acid amplification) on a raw sample not subjected to the pretreatment method of the present invention and a sample subjected to the pretreatment method of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing the results of fluorescence intensity after quantitative PCR performed on raw samples not subjected to the pretreatment method of the present invention and samples subjected to the pretreatment method of the present invention.
본 발명자들은 핵산 증폭 기법으로 검출되기 어려운 낮은 농도의 병원체 시료를 전처리 농축을 통해 검출 가능한 농도로 만들어 줌과 동시에 시료에 들어있는 분자진단 저해요소들을 제거하며, 농축된 병원체에서 핵산을 정제 후 추출하는 과정이 동시에 가능한 미세유체 칩 및 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 개발하고자 연구한 결과, 표면에 항체가 결합된 자성나노입자에 병원체를 결합시켜 제조된 시료를, 정제 챔버 하부에 영구자석이 구비된 미세유체 칩을 이용할 경우, 분자진단이 가능한 수준으로 시료가 농축 및 정제된다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made it possible to detect a low concentration of a pathogen sample which is difficult to be detected by the nucleic acid amplification technique at a detectable concentration through the pre-treatment concentration, remove the molecular diagnostic inhibition elements contained in the sample and purify and extract the nucleic acid from the concentrated pathogen As a result of studying to develop a pretreatment method for concentration and purification of microfluidic chips and samples capable of simultaneous processes, it was found that a sample prepared by binding a pathogen to a magnetic nanoparticle to which an antibody is bound on a surface thereof is immersed in a permanent magnet The present inventors have completed the present invention by confirming that the sample is concentrated and purified to a level that enables molecular diagnosis when the microfluidic chip is used.
이에, 본 발명은, 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 시료 출구를 포함하는, 미세유체 칩을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a semiconductor device comprising: a substrate; A sample injection port formed on the substrate; A channel forming a path of movement of the sample; A purification chamber connected to the channel; An impurity removal outlet through which the impurities removed from the purification chamber escape; An air inlet through which air is injected into the channel; And a purified sample outlet through which the purified sample in the purification chamber escapes.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 미세유체 칩을 이용한 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 제공한다:The present invention also provides a pretreatment method for concentrating and purifying a sample using the microfluidic chip comprising the steps of:
병원체 및 표면에 항원이 결합된 자성나노입자를 혼합하여 시료를 제조하는 단계(S1);(S1) mixing a pathogen and magnetic nanoparticles bound with an antigen on the surface thereof to prepare a sample;
상기 S1 단계의 시료를 자성 입자가 충진 된 미세유체 칩에 주입구를 통해 주입하여 시료를 농축한 후, 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S2);A step S2 of injecting the sample of the step S1 into the microfluidic chip filled with the magnetic particles through the injection port to concentrate the sample and then removing the remaining fluid through the impurity removal outlet;
상기 S2단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용해 및 결합 완충액을 주입하여 볼텍싱(vortexing)하고, 세척 완충액을 주입하여 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S3);Removing the remaining fluid in step S2, vortexing by injecting a dissolution and binding buffer solution, and removing the remaining fluid through the impurity removal outlet by injecting a washing buffer solution (S3);
상기 S3단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용출 완충액을 주입하고, 챔버를 50 내지 80℃로 가열하며 볼텍싱하는 단계(S4); 및Removing the remaining fluid in step S3, injecting an elution buffer solution, and vortexing the chamber by heating to 50 to 80 DEG C (step S4); And
상기 S4 단계의 볼텍싱이 완료되면, 시료 주입구 및 불순물 제거 출구를 차단하고, 공기 주입구 및 정제 핵산 출구를 개방하여 농축 및 정제된 시료를 추출해내는 단계(S5).When the vortexing in step S4 is completed, the sample inlet and the impurity removal outlet are blocked, and the air inlet and the purified nucleic acid outlet are opened to extract the concentrated and purified sample (S5).
이하, 도면을 참고하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[미세유체 칩][Microfluidic chip]
본 발명의 미세유체 칩은 상술한 것과 같이 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 시료 출구를 포함하는 것으로, 시료의 농축 및 정제 용도로 이용되는 미세유체 칩이다. 본 발명의 미세유체 칩의 도면은 도 1에 나타내었다.The microfluidic chip of the present invention comprises a substrate as described above; A sample injection port formed on the substrate; A channel forming a path of movement of the sample; A purification chamber connected to the channel; An impurity removal outlet through which the impurities removed from the purification chamber escape; An air inlet through which air is injected into the channel; And a purified sample outlet through which the purified sample in the purification chamber escapes. The microfluid chip is used for concentration and purification of a sample. A diagram of the microfluidic chip of the present invention is shown in Fig.
도 2 하단에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명은 기판에 고정을 위한 Align홀, 진동모터 접촉을 위한 홈이 형성될 수 있으며, 상기 기판을 포함한 미세유체 칩은 플라스틱 필름 소재가 이용되는 것으로, 도 3에 나타낸 것과 같이 Polyethylene terephthalate (PET), Polyvinyl chloride (PVC), Polyimide (PI)의 얇은 플라스틱 필름을 이용하여 필요한 형상을 cutting하여 적층구조로 제작되는 것이다.2, an Align hole for fixing the substrate to the substrate and a groove for contacting the vibration motor may be formed on the substrate. The microfluid chip including the substrate may be formed of a plastic film material. 3, a thin plastic film of polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl chloride (PVC), and polyimide (PI) is used to cut the necessary shapes to produce a laminated structure.
상기 기판은 아크릴 재질의 상, 하판 케이스를 조립하여 완성될 수 있는 것으로. 본 발명의 미세유체 칩은 4개의 미세채널, 1개의 병원체 농축-핵산 정제 챔버, 4개의 주입구와 2개의 채널 밸브 그리고 시스템 스테이지 고정을 위한 6개의 hole 부분과 믹서 및 세균 용해를 위한 진동을 전달하기 위한 진동모터와의 접촉부분인 1개 hole 구조 그리고 케이스 조립을 위한 8개의 작은 hole로 구성되어있다. 2개의 입구와 2개의 출구는 각각 시료주입구, 공기주입구, 불순물출구, 정제 핵산 출구로 이루어지고, 각 미세 채널은 폭 0.5 내지 3 mm, 높이 50 내지 200 μm일 수 있으며, 농축-핵산 정제 챔버는 중앙의 큰 직사각형(높이 500 내지 1000 μm, 길이, 5 내지 20 mm, 폭 1 내지 10 mm)과 양 옆에 사다리꼴 형태(높이 500 내지 1000 μm, 짧은 길이 0.1 내지 2 mm, 큰 길이 2.5 내지 5 mm, 두 변 사이 길이 1 내지 3 mm)와 직사각형이 합쳐진 형상일 수 있으며 총 허용 가능한 시료의 용량은 20 내지 100 μL의 부피일 수 있다.The substrate may be completed by assembling upper and lower case made of acrylic material. The microfluidic chip of the present invention comprises four microchannels, one pathogen enrichment-nucleic acid purification chamber, four inlet and two channel valves, six hole portions for system stage fixation, and a mixer and vibrator for dissolving bacteria A single hole structure which is a contact part with the vibration motor and eight small holes for assembling the case. Each of the microchannels may have a width of 0.5 to 3 mm and a height of 50 to 200 占 퐉 and the concentration-nucleic acid purification chamber may be a (Height 500 to 1000 占 퐉, length 5 to 20 mm,
상기 정제 챔버의 양 말단에는 필름 밸브가 구비된다. 상기 필름 밸브는 챔버에 들어온 시료가 채널을 통해 새로운 시료가 인입되거나 밖으로 배출되는 것을 조절할 수 있도록 구비된 것으로, 상기 필름 밸브는 챔버에 들어온 시료가 농축되고 정제되는 과정에서 잠겨질 수 있는 것이다.Film valves are provided at both ends of the purifying chamber. The film valve is provided so as to be able to control a sample introduced into the chamber through a channel to allow a new sample to be introduced into or out of the chamber. The film valve can be immersed in the process of concentration and purification of the sample introduced into the chamber.
상기 정제 챔버의 하부에는 영구자석이 구비되는 것으로, 상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비됨으로써, 자성 나노입자의 항체에 결합된 병원체를 포함하는 시료를 농축할 때 상기 자성 나노입자와 영구자석 사이의 자성으로 인해 효율적인 농축을 수행할 수 있는 것이다.Wherein a permanent magnet is provided at a lower portion of the purification chamber and a permanent magnet is provided at a lower portion of the purification chamber so that when a sample including a pathogen bound to an antibody of magnetic nanoparticles is concentrated, It is possible to perform efficient enrichment.
상기 미세유체 칩은 시료의 주입 전에, 주입구를 통해 자성 실리카 입자가 충진될 수 있고, 진동모터를 구비하여 시료의 혼합을 도울 수 있다.The microfluidic chip may be filled with magnetic silica particles through an injection port before injection of a sample, and a vibration motor may be provided to assist mixing of the sample.
[시료][sample]
본 발명에서 사용하는 시료는, 병원체 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 포함하는 것으로, 자성 나노입자의 표면에 항체를 결합시켜 면역자성나노입자를 합성한 후, 병원체를 혼합하여, 병원체가 면역자성나노입자의 항체와 결합하도록 하는 것이다.The sample used in the present invention includes a pathogen and magnetic nanoparticles to which an antibody is bound on the surface thereof. After binding the antibody to the surface of the magnetic nanoparticles to synthesize the immunomagnetic nanoparticles, the pathogen is mixed, And to bind to the antibody of the immunomagnetic nanoparticle.
상기 병원체의 종류는 바이러스, 세균, 진균 등일 수 있고, 본 발명의 실시예와 같이 대장균일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The pathogen may be virus, bacterium, fungus, or the like, and may be, but not limited to, Escherichia coli as in the embodiment of the present invention.
[시료 전처리 자동화 시스템][Sample preparation automation system]
본 발명의 미세유체 칩은 시료 전처리 자동화 시스템에 장착되어, 시료의 농축 및 정제를 수행할 수 있는 것으로, 본 발명의 시스템은 시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함할 수 있다. The microfluidic chip of the present invention can be mounted on a sample preparation automation system to perform concentration and purification of a sample. The system of the present invention includes a sample storage cartridge; A pinch-solenoid valve system connected to the sample storage cartridge; A lower module connected to the valve system; An upper module positioned above the lower module; A microfluidic chip mounted on the lower module; And a tubing peristaltic pump connected to the microfluidic chip.
- 시료 저장 카트리지- Sample storage cartridge
본 발명의 시료 저장 카트리지는, 시료(Sample), 용해 완충액(lysis buffer), 용출 완충액(elution buffer), 세척 완충액(washing buffer) 등이 저장될 수 있는 카트리지 형태의 시료 저장 부분으로, 시스템 기구물에 탈 부착 가능한 형태이다.The sample storage cartridge of the present invention is a cartridge-type sample storage part in which a sample, a lysis buffer, an elution buffer, a washing buffer and the like can be stored. It is a removable form.
상기 시료 저장 카트리지는 핀치-솔레노이드 밸브 시스템에 연결된다.The sample storage cartridge is connected to a pinch-solenoid valve system.
- 핀치-솔레노이드 밸브시스템- Pinch - Solenoid valve system
상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브 시스템은 솔레노이드 플런지 압박에 의해 유체 시료의 흐름을 제어할 수 있는 것으로, 미세유체 칩이 장착되는 하부모듈과 연결될 수 있다.The pinch-solenoid valve system connected to the sample storage cartridge is capable of controlling the flow of the fluid sample by the solenoid plunge compression, and can be connected to the lower module on which the microfluidic chip is mounted.
- 하부모듈- Lower module
상기 하부모듈은 상기 밸브시스템과 연결된 것으로, 영구자석 및 전동모터가 구비되어, 미세유체 칩을 시스템에 고정하는 역할과, 미세유체 칩 내 챔버의 시료를 농축하고 mixing하는 역할을 수행할 수 있다.The lower module is connected to the valve system and includes a permanent magnet and an electric motor to fix the microfluidic chip to the system and to concentrate and mix the chamber of the chamber in the microfluidic chip.
상기 영구자석의 1축 구동을 통해 농축 및 정제기술을 자동화할 수 있다.The one-axis drive of the permanent magnet can automate the concentration and purification techniques.
-상부모듈- upper module
상기 상부 모듈은 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 것으로, 하부모듈에 장착된 미세유체 칩에 주입된 자성 실리카 입자에서 핵산이 잘 분리될 수 있도록 히터가 구비된다. 상기 히터의 양 말단에는 필름 밸브의 개폐를 조절할 수 있는 필름 밸브 액츄에이터가 구비된다.The upper module is located at the upper portion of the lower module, and a heater is provided so that the nucleic acid can be well separated from the magnetic silica particles injected into the microfluidic chip mounted on the lower module. At both ends of the heater, a film valve actuator capable of controlling the opening and closing of the film valve is provided.
- 튜빙연동펌프- Tubing peristaltic pump
본 발명에서 하부 모델에 장착된 미세유체 칩에는 튜빙연동펌프가 설치되는 것이며, 상기 펌프에 의해 유체 시료 및 완충액 등의 자동 수송을 가능하게 할 수 있다. 상기 튜빙연동펌프는 0.1 내지 2.5 mL/min으로 유체의 흐름을 제어 가능하다.In the present invention, the microfluidic chip mounted on the lower model is provided with a tubing peristaltic pump, and the fluid sample and the buffer solution can be automatically transported by the pump. The tubing peristaltic pump is capable of controlling the flow of fluid at 0.1 to 2.5 mL / min.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
[실시예 1. 농축-정제용 미세유체 칩의 제조][Example 1: preparation of microfluidic chip for concentration-purification]
농축-정제용 미세유체 칩을 도 3에 따라 제조하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 폴리에틸렌 소재의 하판 및 상판 사이에 폴리이미드 소재의 채널형성용 기판을 적층해준 후, PVC 소재의 주입구 부분과 출구 부분을 형성하였고, 그 위에 챔버의 양말단에 필름밸브(챔버-밸브)를 형성하고 챔버 덮개를 적층하여 메인 디바이스 부분을 제조하였다. 이후 메인 디바이스를 상부프레임 및 하부프레임으로 하우징해주었다.A microfluidic chip for concentration-purification was prepared according to Fig. As shown in FIG. 3, a polyimide substrate for channel formation was laminated between a bottom plate and a top plate of a polyethylene material, and then an inlet portion and an outlet portion of a PVC material were formed. On both ends of the chamber, Chamber-valve) and the chamber lid was laminated to produce the main device portion. Then, the main device was housed as an upper frame and a lower frame.
상기 상부프레임 및 하부프레임의 형태는 도 4a에 나타낸 것 같이, 상부프레임에는 시료저장 카트리지의 튜빙 펌프와 연결되는 튜빙 연결부가 형성되었고, 하부프레임에는 정제 챔버 부분이 고정될 수 있도록 오목하게 홈을 형성하였고, 상부프레임 및 하부프레임에 핵산정제 시스템에 고정될 수 있는 Align홀과 진동모터 연결구멍을 형성해주었다.As shown in FIG. 4A, the upper frame and the lower frame are formed with a tubing connection portion connected to the tubing pump of the sample storage cartridge, and the lower frame has a recessed groove formed therein for fixing the tablet chamber portion. Align holes and vibration motor connection holes were formed in the upper frame and the lower frame to be fixed to the nucleic acid purification system.
이후 도 4b에 나타낸 것과 같이 하부프레임에 메인 디바이스를 적층한 후 상부 프레임을 적층하여 조립해주었다. 상기 조립된 미세유체 칩은 도 4c에 나타낸 것과 같다.Then, as shown in FIG. 4B, the main device is laminated on the lower frame, and then the upper frame is laminated and assembled. The assembled microfluidic chip is as shown in FIG.
본 실시예 1에서는 Polyethylene terephthalate (PET), Polyvinyl chloride (PVC), Polyimide (PI)의 얇은 플라스틱 필름을 이용하여 필요한 형상을 cutting하여 적층구조로 제작하였고, 아크릴 재질의 상, 하판 케이스를 조립한 것을 이용하였다. 상기 미세 유체 칩은 4개의 미세채널, 1개의 병원체 농축-핵산 정제 챔버, 4개의 주입구와 2개의 채널 밸브, 시스템 스테이지 고정을 위한 6개의 hole 부분, 믹서 및 세균 용해를 위한 진동을 전달하기 위한 진동모터와의 접촉부분인 1개 hole 구조 그리고 케이스 조립을 위한 8개의 작은 hole로 구성되어있다. 2개의 입구와 2개의 출구는 각각 시료주입구, 공기주입구, 불순물출구, 정제 핵산 출구로 이루어지며, 각 미세 채널은 폭 1 mm, 높이 100 μm이며, 농축-핵산 정제 챔버는 중앙의 큰 직사각형(높이 800 μm, 길이, 13.3 mm, 폭 3 mm)과 양 옆에 사다리꼴 형태(높이 800 μm, 짧은 길이 1 mm, 큰 길이 3 mm, 두 변 사이 길이 2 mm)와 직사각형이 합쳐진 형상이며 40 μL의 부피로 설계하여 제작된 것이다.In Example 1, a thin plastic film of polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl chloride (PVC), and polyimide (PI) was used to cut a necessary shape to form a laminated structure. An acrylic upper and lower case Respectively. The microfluidic chip comprises four microchannels, one pathogen enrichment-nucleic acid purification chamber, four inlet and two channel valves, six hole portions for system stage fixation, a mixer and a vibrator for delivering vibrations for bacterial dissolution One hole structure for contact with the motor, and eight small holes for case assembly. Each of the microchannels has a width of 1 mm and a height of 100 占 퐉, and the concentration-nucleic acid purification chamber has a large rectangular shape at the center (height (800 μm in height, 1 mm in short length, 3 mm in length, 2 mm in length between two sides) and a rectangular shape on both sides of a trapezoidal shape (800 μm in length, 13.3 mm in width and 3 mm in width) As shown in Fig.
[실시예 2. 시료 전처리 자동화 시스템의 구성][Embodiment 2] Construction of Automated Sample Preparation Process System [
본 실시예에서는 실시예 1에서 제작한 미세유체 칩이 연결되는 시료 전처리 자동화 시스템을 제작하였다. 본 발명에서 사용하는 시스템의 구성은 도 5에 나타내었는데, 도 5a에 나타낸 것과 같이 크게 시료가 저장되는 시료 저장 카트리지, 핀치-솔레노이드 밸브시스템, 디바이스 스테이지 및 히터, 튜빙연동펌프로 이루어지는 것이다. 도 5b에 나타낸 것과 같이 미세유체 칩을 디바이스 스테이지 부분에 올려 고정해주었다. 상기 시스템을 케이싱한 외부 사진을 도 6a에 나타내었다. 도 6a에 나타낸 것과 같이 상부모듈과 하부모듈을 포함하고 있으며 상기 상부 모듈은 디바이스 스테이지 및 히터를 포함하고, 하부모듈은 진동모터와 영구자석을 포함하도록 제작하였다, 시스템의 내부 구조는 도 6b에 나타낸 것과 같이, 상부모듈 및 하부모듈이 형성된 케이스의 안쪽에 핀치-솔레노이드 밸브와 상기 밸브와 연결되는 시스템 파워서플라이를 포함하도록 하였고, 샘플의 이송 및 유체를 제어할 수 있는 튜빙펌프를 구비하였으며, 상기 시스템의 구동 시 발생하는 열을 식힐 수 있도록 했다. 상기 상부모듈과 하부모듈은 도 6c에 더 상세하게 나타내었다.In this embodiment, a sample pretreatment automation system to which the microfluid chip fabricated in Example 1 is connected was manufactured. The structure of the system used in the present invention is shown in FIG. 5, which comprises a sample storage cartridge, a pinch-solenoid valve system, a device stage, a heater, and a tubing peristaltic pump, as shown in FIG. As shown in FIG. 5B, the microfluidic chip was fixed on the device stage portion. An external photograph of the system casing is shown in Fig. 6A. 6A, the upper module includes a device stage and a heater, and the lower module includes a vibration motor and a permanent magnet. The internal structure of the system is the same as that shown in FIG. 6B A pinch solenoid valve and a system power supply connected to the valve in the inside of the case formed with the upper module and the lower module and has a tubing pump capable of transferring and controlling the fluid of the sample, So that the heat generated during the operation of the apparatus can be cooled. The upper module and the lower module are shown in more detail in Figure 6c.
구동되는 시스템의 상면을 도 7a에 나타내었으며, 도 7a와 같이 시료 저장부를 시스템 좌측에 위치시켜 시료가 담긴 시린지를 거치할 수 있도록 하였고, 핀치-솔레노이드 밸브를 통해 채널에서 유체의 흐름을 조절할 수 있도록 하였다. 상기 튜빙펌프에는 유체 이송 공기 주입 튜브를 연결시켜 유체 시료를 미세유체 칩에 전달하거나 버퍼 용액 등을 자동 수송할 수 있도록 하였다. 또한 시스템의 우측면을 도 7b에 나타내었고, 제작된 시스템의 모식도는 도 8에 나타내었다.The upper surface of the driven system is shown in FIG. 7A. As shown in FIG. 7A, the sample storage unit is positioned on the left side of the system so that the syringe containing the sample can be mounted. The flow of the fluid through the channel can be controlled through the pinch- Respectively. The tubing pump is connected to a fluid transfer air injection tube to transfer the fluid sample to the microfluidic chip or to automatically transport the buffer solution. The right side of the system is shown in FIG. 7B, and a schematic diagram of the manufactured system is shown in FIG.
[실시예 3. 시료 전처리][Example 3: Pretreatment of sample]
실시예 1에서 제작된 미세유체 칩을 실시예 2의 시스템에 고정하여 챔버 부분 하단에 영구자석이 위치하도록 하였다. 상기 미세유체 칩은 z-section 방향으로 1축 제어로 이동이 가능하다. 칩의 주입구는 튜빙과 연결되며 모든 시료는 튜빙 펌프와, 핀치-솔레노이드 밸브, 필름 밸브에 의해 제어해주었다. 핵산 정제에 필요한 65℃의 온도유지를 위해서 챔버 상단부에 위치한 히터를 작동시켜 주었고, 시스템 하우징 부분과 탈부착이 가능한 4개의 부분으로 구성되는 시료저장 카트리지에는 병원체-면역자성나노입자 혼합시료, lysis-binding buffer, washing buffer, elution buffer를 채워주었다.The microfluidic chip fabricated in Example 1 was fixed to the system of Example 2 so that a permanent magnet was positioned at the bottom of the chamber portion. The microfluidic chip can move in a single-axis control in the z-section direction. The injection port of the chip is connected to the tubing and all the samples are controlled by the tubing pump, the pinch solenoid valve and the film valve. A heater located at the upper end of the chamber was operated to maintain the temperature of 65 ° C required for nucleic acid purification. A sample storage cartridge composed of four parts for detachable attachment to the system housing part contained a pathogen-immune magnetic nanoparticle mixed sample, lysis- buffer, washing buffer, and elution buffer.
시료 전처리 과정은 도 9에 나타내었다. 병원체 농축, 불순물 제거를 위한 washing, 핵산 정제 및 추출 과정으로 진행되는 것으로, 먼저 자성나노입자의 표면에 항체를 결합시킨 면역자성나노입자를 합성 후 병원체가 들어있는 시료와 혼합하였고, 이 때 시료의 병원체는 자성나노입자 표면의 항체와 결합하는 것이다. 본 실시예에서 병원체는 대장균 O157:H7 균주를 사용하였다.The sample pretreatment process is shown in Fig. In the course of this process, the immune magnetic nanoparticles bound to the surface of the magnetic nanoparticles are mixed with the sample containing the pathogen after synthesis. At this time, Pathogens bind to antibodies on the surface of magnetic nanoparticles. In this example, Escherichia coli O157: H7 strain was used as the pathogen.
이 후 챔버에 핵산과 결합이 가능한 자성실리카 비드를 충진 시킨 후 병원체 농축 과정을 진행하였다. 상기 병원체-면역자성나노입자가 들어있는 시료를 시료저장 카트리지에서 튜빙 펌프를 이용하여 2 mL/분의 유량으로 주입시켰고, 영구자석의 자기장에 의해 농축과정을 진행해주었다. 최종적으로 20 μL 시료 내에 병원체-면역자성나노입자가 존재하도록 하였다.After that, the chamber was filled with magnetic silica beads capable of bonding with nucleic acid, and the pathogen enrichment process was performed. The sample containing the pathogen-immune magnetic nanoparticles was injected into the sample storage cartridge at a flow rate of 2 mL / min using a tubing pump, and the concentration process was performed by the magnetic field of the permanent magnet. Finally, pathogen-immunomagnetic nanoparticles were present in the 20 μL sample.
다음으로 50 μL의 lysis-binding buffer를 챔버로 주입한 후 필름 밸브로 막아주었고, 5분 동안 진동모터를 이용하여 병원체로부터 핵산 추출이 원활하게 되도록 하였다. 핵산은 추출됨과 동시에 lysis-binding buffer의 cation bridge로 인해 챔버 내 충진 된 자성실리카입자와 결합되었고, washing을 통해 챔버 내 lysis-binding buffer를 모두 제거한 후, 40 μL의 RNase free water (elution buffer)를 주입하였다. Next, 50 μL of lysis-binding buffer was injected into the chamber and blocked with a film valve, and the nucleic acid was extracted smoothly from the pathogen using a vibration motor for 5 minutes. The nucleic acid was extracted and combined with the magnetic silica particles packed in the chamber due to the cation bridge of the lysis-binding buffer. After removing all of the lysis-binding buffer in the chamber through washing, 40 μL of RNase free water (elution buffer) Respectively.
이 후 히터로 65℃로 10분 동안 챔버를 가열해준 후, 핵산을 자성실리카입자에서 분리시켜주었다. 이후 40 μL 내의 농축된 병원체의 핵산 샘플을 수득하였다.Thereafter, the chamber was heated with a heater at 65 DEG C for 10 minutes, and the nucleic acid was separated from the magnetic silica particles. A nucleic acid sample of the enriched pathogen within 40 [mu] L was then obtained.
상기 수득된 샘플에 대하여, 대장균 O157:H7 균주의 농축 전의 원시료와 병원체 농축 및 핵산 정제 후 미세유체 칩에서 얻어진 시료(농축-핵산 정제액)를 핵산 증폭 기법 (PCR) 을 거쳐 젤 전기영동을 통해 비교하여 도 10에 나타내었다(M : DNA 100 bp marker, 103-1 : 103-1 CFU/mL 농도의 대장균 O157:H7 시료).The obtained sample was subjected to gel electrophoresis through nucleic acid amplification (PCR) using a sample obtained before concentration of E. coli strain O157: H7 and a sample obtained from a microfluidic chip (concentration-nucleic acid purification solution) after pathogen concentration and nucleic acid purification. (M: DNA 100 bp marker, E. coli O157: H7 sample at a concentration of 10 3 -1: 10 3 -1 CFU / mL).
그 결과 도 10에서 확인할 수 있는 것과 같이, 핵산 증폭 기술을 이용해 검출이 불가능한 102-1 CFU/mL 농도에서 온칩 세균 농축 및 핵산 정제 후 검출되는 것을 확인할 수 있다.As a result, as shown in FIG. 10, it can be confirmed that the nucleic acid amplification technology is used to detect undissociated 10 2 -1 CFU / mL concentration after on-chip bacterial enrichment and nucleic acid purification.
또한, 대장균 O157:H7 균주의 농축 전의 원시료와 병원체 농축 및 핵산 정제 시스템에서 얻어진 시료(농축-정제액)를 정량적 핵산 증폭 기술(quantitative PCR)을 이용하여 농축 및 정제 효과를 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 확인할 수 있는 것과 같이, 농축-정제 과정을 거친 시료에서 더 높은 형광세기가 관찰되어, 농축-정제 과정을 통해 병원체의 농축이 효율적으로 이루어진 것을 알 수 있었다.The concentration and purification effect of a sample of the E. coli strain O157: H7 before enrichment and the concentration of the pathogen and the sample (concentrated-purified solution) obtained in the nucleic acid purification system were confirmed by quantitative PCR, Respectively. As can be seen from FIG. 11, higher fluorescence intensity was observed in the sample subjected to the concentration-purification process, and it was found that the concentration of the pathogen was efficiently performed through the concentration-purification process.
또한 상기 원시료 및 상기 농축-정제를 거친 시료의 핵산 증폭 시작점(Cq value)을 분석한 결과, 하기 표 1에 나타낸 것과 같이 원시료에 비하여 현저히 낮은 수준의 Cq value를 보여, 본 발명의 농축 및 정제 방법이 우수한 핵산정제 효과를 보인다는 것을 확인하였다.As a result of analyzing the starting point (Cq value) of nucleic acid amplification of the raw sample and the concentrated-purified sample, Cq value was significantly lower than that of the original sample as shown in Table 1 below. It was confirmed that the purification method showed excellent nucleic acid purification effect.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (7)
Board; A sample injection port formed on the substrate; A channel forming a path of movement of the sample; A purification chamber connected to the channel; An impurity removal outlet through which the impurities removed from the purification chamber escape; An air inlet through which air is injected into the channel; And a purified sample outlet through which the purified sample exits the purification chamber.
상기 정제 챔버의 양말단에는 필름밸브가 구비된 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
The method according to claim 1,
Characterized in that a film valve is provided at both ends of the purification chamber.
상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비된 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
The method according to claim 1,
And a permanent magnet is provided at a lower portion of the purification chamber.
상기 미세유체 칩은 진동모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
The method according to claim 1,
Wherein the microfluidic chip further comprises a vibration motor.
상기 시료는 병원체; 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
The method according to claim 1,
Wherein the sample is a pathogen; And a magnetic nanoparticle having an antibody bonded to the surface thereof.
병원체 및 표면에 항원이 결합된 자성나노입자를 혼합하여 시료를 제조하는 단계(S1);
상기 S1 단계의 시료를 자성 입자가 충진된 미세유체 칩에 주입구를 통해 주입하여 시료를 농축한 후, 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S2);
상기 S2단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용해 및 결합 완충액을 주입하여 볼텍싱(vortexing)하고, 세척 완충액을 주입하여 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S3);
상기 S3단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용출 완충액을 주입하고, 챔버를 50 내지 80℃로 가열하며 볼텍싱하는 단계(S4); 및
상기 S4 단계의 볼텍싱이 완료되면, 시료 주입구 및 불순물 제거 출구를 차단하고, 공기 주입구 및 정제 핵산 출구를 개방하여 농축 및 정제된 시료를 추출해내는 단계(S5).
A pretreatment method for concentrating and purifying a sample using the microfluidic chip according to claim 1, comprising the steps of:
(S1) mixing a pathogen and magnetic nanoparticles bound with an antigen on the surface thereof to prepare a sample;
A step S2 of injecting the sample of the step S1 into the microfluidic chip filled with the magnetic particles through the injection port to concentrate the sample and then removing the remaining fluid through the impurity removal outlet;
Removing the remaining fluid in step S2, vortexing by injecting a dissolution and binding buffer solution, and removing the remaining fluid through the impurity removal outlet by injecting a washing buffer solution (S3);
Removing the remaining fluid in step S3, injecting an elution buffer solution, and vortexing the chamber by heating to 50 to 80 DEG C (step S4); And
When the vortexing in step S4 is completed, the sample inlet and the impurity removal outlet are blocked, and the air inlet and the purified nucleic acid outlet are opened to extract the concentrated and purified sample (S5).
상기 S2 단계의 농축은 영구자석과 시료 안의 자성나노입자의 자성에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법.The method according to claim 6,
Wherein the step S2 is performed by magnetization of the permanent magnet and the magnetic nanoparticles in the sample.
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