KR20180115657A

KR20180115657A - 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포

Info

Publication number: KR20180115657A
Application number: KR1020180122818A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 서민수; 박상범
Original assignee: 주식회사 강스템바이오텍
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2018-10-23
Also published as: WO2013085303A1; US9771555B2; US20140322182A1; KR20130063483A; KR20200012991A

Abstract

본 발명은 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포(canine amniotic membrane-derived multipotent stem cells; cAM-MSCs) 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며, 미분화 상태로 20계대 이상 배양되는 능력 및 지방, 골, 신경, 연골 등으로 분화하는 능력을 가지는, 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포에 관한 것이다.

Description

개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포{Canine Amniotic Membrane-Derived Multipotent Stem Cells}

21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.

이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.

줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells; MSCs)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4 내지 5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C. M. Verfaillie, Trends Cell Biol ., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기세포의 공급원이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J. G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3: 778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp . Hematol ., 30: 896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린 된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다.

이러한 다분화능 줄기세포주의 확립이 중요한 이유는 줄기세포주의 증식/동결 연구, 특성화 연구, 약품 시험 및 자가/동종/이종 이식의 목적에 기인한다.

또한 동물모델은 손상된 또는 질환을 가진 조직의 치유 및 기능회복을 위한 재생의학에 있어 그 중요성이 대두되고 있다. 이중에서도 개과동물은 현재 370 여종 이상의 유전질환이 보고되어 있고 대다수가 인간에서 발생하는 질환 및 기능장애와 닮아있다. 따라서 인간의 유전질환의 기전 및 병인 연구 특히 인간에게서 직접 연구가 어려운 X-연관 중증 복합 면역결핍 및 듀시엔형 근이영양증과 같은 복합 유전성 희귀 열성 질환 연구를 위한 동물모델로서 개과동물의 중요성이 증가하고 있다. 이와 같이 개과 동물은 고형장기 이식뿐 아니라 전립선암, 심혈관질환, 골재생, 당뇨병, 백혈병, 척수손상 등의 인간 병리학 기전 연구와 새로운 치료법을 시험하기 위한 유용한 동물모델이다. 더불어 줄기세포 이식 및 유전자 치료와 같은 다양한 치료방법을 연구하기 위한 이상적인 대형동물모델이다.

따라서, 개의 여러 조직에서 줄기세포를 분리하고 특성화하는 것이 줄기세포 연구분야의 주요과제이다. 인간과 쥐 유래의 줄기세포는 여러 방면으로 종래 기술에서 시도되어 왔으나, 개과동물의 경우, 위와 같이 인간 질환 연구를 위한 유용한 대형동물모델임에도 불구하고 아직은 그 연구가 미진한 상황이다. 지방조직, 골수, 제대혈 등으로부터 줄기세포의 분리가 가능하나 그 수득량에 제한이 있고, 지방조직 또는 골수를 개체로부터 획득하는 방법이 침습적이며, 고통을 유발한다는 점에서 한계가 있다.

한편, 줄기세포를 세포 치료제로 사용하기 위해서 현 기술단계에서는 미분화 상태가 유지될 수 있는 배양 조건이 규격화되어야 하며, 이와 더불어, 조직으로부터 분리한 줄기세포는 다종의 세포가 혼합된 상태이기 때문에, 균질의 줄기세포를 다량 배양할 수 있는 기술도 해결해야 할 문제점 중에 하나이다. 특히 조직 또는 혈액으로부터 줄기세포를 분리하는 방법은 통상적으로 다수의 표면항원에 대한 항체를 이용한 Cell sorting을 예로 들 수 있다. 상기 방법은 줄기세포의 표면항원을 파악하고 있어야 한다는 한계가 있으며, 문제는 줄기세포 공통의 표면항원(이하, 마커)이 밝혀지지 않았고, 또한 줄기세포 마커가 다양하게 개발되어 있지 않은 상태이며, 알려진 마커도 분화상태에 따라서 발현 정도가 다르며, 특히 마커의 발현정도에 따라 세포를 분류하는 장비가 고가라는 점에서 활용하는데 제약이 많다.

태반은 태아에 영양과 산소를 공급함으로 태아의 발달과 생존에 중요한 역할을 한다. 일반적으로, 분만 후 태반은 의료 폐기물로 취급되어 버려진다. 그러나 최근의 연구에 따르면 인간에서 양막 조직은 풍부한 줄기세포의 원천으로 이로부터 유래된 줄기세포에 관한 많은 연구가 진행되어 왔다. 임상적용에 있어서, 양막 조직은 창상 치료와 망막 표면 재건에 효과를 갖는다. 양막에는 줄기세포뿐만 아니라, 기타 단핵세포 및 타 줄기세포가 함께 혼합되어 있을 가능성이 있으며, 이러한 혼합된 세포배양 조건에서는 양분(nutrient)의 분배 정도가 달라질 수 있으며, 이로 인하여 세포의 분화상태에 비균질성을 야기할 수 있다. 결국, 균질한 세포군으로 제조할 수 없다는 문제는 치료제로서 사용할 경우 예상하는 효과와 다르게 나타날 수 있다는 치명적인 단점으로 작용하기 때문에, 균질한 성체줄기세포를 다량 얻을 수 있는 효과적인 배양 기술의 개발이 시급한 상황이다.

이에 본 발명자들은 수득이 용이한 새로운 줄기세포 공급원인 암캐의 분만 후 채취하는 양막(canine amniotic membrane)으로부터 최초로 균질성이 향상된 줄기세포(stem cells) 군(population)을 분리하여, 타 줄기세포에 비해 빠르고 지속적인 자기 재생 능력(성장능), 다분화능 줄기세포의 면역특성 및 다른 세포로의 우수한 분화 능력, 특히 골세포로의 분화능이 현저히 뛰어남을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 다양한 조직세포로 분화시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 조직세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개과동물을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 개과동물 양막에서 세포를 분리하는 제1단계; 분리한 줄기세포를 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 제2단계; 및 배양된 세포를 회수하는 제3단계를 포함하여, 다음과 같은 특성을 나타내는 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법을 제공한다. 상기의 방법으로 제조된 줄기세포는 (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고; (c) 미분화 상태로 20계대 이상 배양되는 능력을 가진다.

상기 제1단계는, 줄기세포의 풍부한 원천이지만 의료 폐기물로 취급되어 버려지고 있는, 개과동물의 양막으로부터 세포를 분리하는 단계이다. 세포 분리는 약간의 변형을 가해 이전에 기술된 방법으로 실시하였으며[Diaz-Prado, S. et al., Tissue Eng . Part C Methods, 2010; Mihu C. M. et al., Rom . J. Morpho . Embryol, 50: 73-77, 2009], 모든 태반 시료는 개과동물로부터 제왕절개 분만을 통해 수거하였다.

상기 제1단계는 상기 양막을 효소로 분해시켜 양막 상피 세포층을 제거하는 제1세부단계; 상기 상피세포층을 제거한 양막을 화학적 방법으로 중배엽성 단일세포를 분리하는 제2세부단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 제1세부단계의 효소는 트립신-EDTA일 수 있고, 제2세부단계의 화학적 방법은 콜라겐 분해효소를 처리하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 제1세부단계의 효소는 0.25% 트립신-EDTA가 사용될 수 있고, 제2세부단계의 효소로는 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type I)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "개과동물"이란, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼, 승냥이 등의 잡식성 동물이며, 모두 발가락으로 걷는 지행동물이다. 상기 개과동물은 크게 개족과 여우족으로 나뉜다. 개족은 갈기늑대, 가로무늬자칼, 검은등자칼, 개, 딩고, 붉은늑대, 에티오피아늑대, 인도늑대, 코요태, 황금자칼, 게잡이여우속, 들개속, 승냥이, 아프리카들개, 작은귀개, 포클랜드늑대, 안데스여우, 다윈여우, 아르헨티나회색여우, 팜파스여우, 페루사막여우, 흰여우 등을 포함하고, 여우족은 북극여우, 붉은여우, 스위프트여우, 키트여우, 코사크여우, 케이프여우, 검은꼬리모래여우, 벵골여우, 티베트모래여우, 블랜포드여우, 흰꼬리모래여우, 페넥여우, 회색여우, 섬여우, 코즈멜여우 등을 포함하며, 기타 큰귀여우, 너구리 등이 있다.

본 발명의 용어 "양막"이란, 융모막, 탈락막과 함께 삼중층의 구조로 태반을 구성하는 하나의 층으로, 상피 단층과 기질막의 이중층 구조를 갖는 얇은 무혈관 막으로 태아에 결합하여 환경을 구성하는 주머니이다. 임상연구에 의하면 양막 조직은 창상 치료 및 망막 표면 재건에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

상기 제2단계는 분리된 세포를 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 단계로서 균질성이 향상된 줄기세포군을 분리하여 증식시키는 단계이다. 상기 제2단계의 배양은 세포가 배양접시에 부착배양하는 것이 바람직하다. 또한 상기 제2단계의 저농도 글루코스 DMEM 중 글루코스의 농도는 바람직하게는 800 내지 1200 mg/L이며, 보다 바람직하게는 1000 mg/L이다. 더불어 저농도 글루코스 DMEM 배지에 소태아혈청을 첨가하여 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포로 인정되기 위해서는 첫째, 미분화상태로 계속 복제되어야하며, 둘째, 특정 배양조건에서 특정 세포로 분화가 가능해야 한다. 상기 기술된 줄기세포는 분화능력과 자가복제능력 때문에 최근 세포 치료제 조성물 후보로 주목받고 많은 연구가 진행되고 있다. 본 발명의 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포는 20계대까지 증식 가능함을 확인하였다(도 1C).

본 발명의 용어 "다분화능 줄기세포"란, 줄기세포가 도입되는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포는 배양조건에 따라 각각 지방, 골, 신경, 연골세포로 분화하는 능력을 가짐을 확인하였다(실시예 7 내지 10; 도 3 내지 6).

상기 제1단계 및 제2단계에 의해 제조된 본 발명의 줄기세포는 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이때, 본 발명의 줄기세포가 양성 발현을 나타내는, 사람 마커인 CD90은 Thy-1이라고도 불리는 여러 종류(피부유래 줄기세포, 내피유래 줄기세포, 중간엽 줄기세포)의 줄기세포 마커이고[Masson N. M. et al., Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 290(1): G45-65, 2006], 사람 마커인 CD105는 엔도글린(endoglin)이라고도 알려져 있는, MSCs 마커이다[Dominici M. et al., Cytotherapy, 8(4): 315-7, 2006]. 한편, 본 발명의 줄기세포는 면역세포 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD38, 및 CD62L, 혈구세포 마커인 CD34, 및 CD45와 혈소판 마커인 CD41a에 대해서는 발현하지 않는다. 이는 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 다분화능 줄기세포임을 제시하는 것이다.

본 발명의 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 배양 조건에 따라 지방, 골, 신경 또는 연골세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었고, 미분화상태로 20계대까지 증식할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이 또한 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 다분화능 줄기세포임을 제시하는 것이다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 양막으로부터 분리된 세포로부터 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내는 다분화능 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 균질의 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법을 제공한다: (a) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지며; (b) 미분화 상태로 20계대 이상 배양되는 능력을 가짐.

상기 면역학적 분리는 상기 사람 마커에 대해 상이한 종(species)간에도 교차반응하는 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 현재까지 개과동물에 특이적인 항체는 다양하게 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서, 본 발명은 개과동물의 양막으로부터 분리한 다분화능의 면역학적 표현형을 사람 특이적 항체를 이용하여 특성화하였다는데 그 특징이 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고, (c) 미분화 상태로 20계대 이상 배양되는 능력을 가지는 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 제공한다. 바람직하게 상기 다분화능 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 덱사메타손, 인도메타신, 3-이소부틸-1-메틸-크산틴 및 인슐린을 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 60 μM 인도메타신(indomethacin), 500 μM 3-이소부틸-1-메틸-크산틴(3-isobutyl-1-metyl-xanthine; IBMX) 및 5 μg/ml 인슐린을 포함하는 지방세포화 분화 배지에 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "지방세포"란 지방의 형태로 에너지를 저장하는 지방 조직을 구성하는 주된 세포이다. 이는 세포질 층으로 둘러싸인 커다란 지방 방울을 포함하는 백색지방세포와 지방 방울이 고루 흩어져있는 상당량의 세포질을 포함하는 다각형의 갈색지방세포의 두가지 형태로 존재한다. 백색지방세포는 레지스틴, 아디포넥틴 및 렙틴과 같은 아디포카인(adipokine)으로 작용하는 단백질을 분비한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 2-인산 아스코르브산, 덱사메타손, 및 베타-글리세로포스페이트를 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 저농도 글루코스 DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM)에 50 μM 2-인산 아스코르브산(ascorbic acid 2-phosphate), 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 10% 소태아혈청을 포함하는 골형성 분화 배지를 사용하여 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "골세포"란 촘촘한 골조직에 가장 풍부한 별모양의 세포로 핵과 세포질의 얇은 고리를 포함한다. 골모세포가 스스로 분비한 기질에 갇혀 골세포를 형성한다. 골세포는 간극결합을 통해 영양분과 폐기물을 교환하는데 사용되는 소관계라 불리는 작은 관을 채우는 긴 세포질 신장을 통해 서로 연결된다. 한편, 골세포는 합성 능력이 감소되어 유사분열하지 않으며 중간엽에서 생성되고, 수산화인회석, 탄산칼슘, 및 인산칼슘이 세포 주위에 축적된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 베타-머캅토에탄올로 24시간 인큐베이션 후 도코사헥사에노익, B27 보충제 및 디메틸술폭시드를 포함한 유도 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 베타-머캅토에탄올(1 mM; beta-mercaptoethanol; BME)과 5% FBS와 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 100 μM 도코사헥사에노익(docosahexaenoic; DHA), B27 보충제 및 1.5% 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 포함한 무혈청 유도 배지로 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "신경세포"란 전기적 그리고 화학적 신호전달에 의해 정보를 처리하고 전달하는 전기적으로 활성화시킬 수 있는 세포이다. 화학적 신호전달은 다른 세포와의 분화된 연결인 시냅스를 통해 이루어진다. 신경세포는 망을 형성하여 서로 연결되어있다. 신경세포는 뇌, 척수 및 말초 신경절을 포함하는 신경계의 핵심요소이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 연골발생 분화 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 폴리프로필렌 튜브에 세포를 시딩하고 원심분리하여 펠렛으로 만들어 1 ml의 연골발생 분화 배지에서 배양할 수 있다. 상기 연골발생 분화 배지는 TGF-β3, 덱사메타손, 아스코르브산염 등을 첨가한 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상용화된 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 용어 "연골세포"란 연골에서 발견되는 유일한 세포이다. 연골세포는 주로 콜라겐과 프로테오글리칸으로 구성되는 연골기질을 생산하고 유지한다. 연골 내에서 연골세포의 구성은 연골의 형태 및 조직의 위치에 따라 달라진다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 방법으로 개과동물의 양막으로부터 분리된 다분화능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 용어 "세포치료제"란, 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

상기 본 발명의 세포치료 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물인 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1×10³ 내지 5×10⁶ 세포/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 세포치료제는 개과동물의 근골격계 질환 또는 신경계 질환의 치료에 사용될 수 있다. 보다 바람직하게 개과동물의 골관절염 치료용, 개과동물의 골 결실 질환 치료용, 개과동물의 지방 조직 형성용, 개과동물의 힘줄 조직 형성용, 개과동물의 근육 조직 형성용, 개과동물의 신경 조직 형성용, 개과동물의 신경계질환인 척수손상 치료용, 개과동물의 안과질환인 각막 또는 망막질환 치료용, 개과동물의 장관질환 치료용, 개과동물의 아토피 피부질환 치료용 또는 개과동물의 자가면역질환인 루프스 치료용인 세포 치료제일 수 있다.

따라서, 본 발명의 상기 세포 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개과동물을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 개과동물의 질환 예컨대, 근육, 연골, 신경 또는 지방조직의 손상 또는 결핍에 의해 유도되는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따르면, 개과동물의 양막이 개과동물 다분화능 줄기세포의 공급원이 될 수 있음을 확인하였고, 본 발명에 따라 제조된 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포는 우수한 증식능 및 분화능을 나타내는 바, 줄기세포가 대량으로 요구되는 개과동물의 수의 재생 의학 및 인간 질병 치료의 세포치료의 대형동물모델을 위한 세포 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포(canine amniotic membrane-derived multipotent stem cells; cAM-MSCs)의 초대 배양과 누적 집단 배가 수준(cumulative population doubling level; CPDL) 및 계대 의존적 줄기세포 특이적 마커의 발현을 나타낸 도이다. (A)는 수득한 개과동물 양막 조직, (B)는 cAM-MSCs의 위상차 이미지를 나타낸다. (C)는 cAM-MSCs의 세포성장곡선을 나타내며 (D 내지 G)는 계대에 따른 줄기세포 특이적 마커 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4의 발현량을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSC의 FACS 분석 결과이다. 분석은 계대 5에서 수행되었다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs의 지방생성 분화에 관한 도이다. (A 내지 D)는 지방생성 유도 3주 후 오일 레드 O 염색결과를 나타낸다. (A, B)는 기본 배양 배지에서 성장한 대조 세포로 오일 레드 O에 의해 염색되지 않았다. (C, D)는 지방생성 분화를 위해 지방생성 유도 배지로 처리한 세포이다. 분화된 세포에서 지방 방울이 오일 레드 O에 의해 염색되었다. 검은 화살표가 염색된 붉은 지방 방울을 나타낸다. (E) 정량을 위해 염료를 100% 이소프로판올로 용출시키고 500 nm에서 0.5초간 분광광도법으로 흡광도를 측정하였다. 분화된 세포에서 대조군 세포보다 5배 더 높은 값을 보였다. (F, G)는 지방생성 특이적 마커, FABP4, LEPTIN 및 LPL의 RT-PCR(F) 및 정량적 RT-PCR(G)에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다. mRNA 정량을 위해 GAPDH가 기준으로 사용되었다. 모든 분석은 3회씩 반복하였고 평균±표준오차로 표기하였다(**p＜0.01, ***p＜0.001).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs의 골형성 분화에 관한 도이다. (A 내지 D)는 배양 3주 후 골형성 분화를 확인하기 위해 알리자린 레드 S로 염색하였다. (A, B)는 기본 배양 배지에서 배양한 대조 세포로, 알리자린 레드 S에 의한 염색이 관찰되지 않았다. (C, D)는 골형성 유도 배지에서 성장시킨 세포로 대조세포와 비교하여 알라자린 레드 S에 의해 강하게 염색되었다. (E)는 정량을 위해 100 mM 염화 세틸피리디니움으로 용출시켜 570 nm에서 0.5초간 분광광도법으로 흡광도를 측정하였다. 모든 분석은 3회 반복 시행되었다. (F, G)는 골형성 특이적 마커, MSX2, SPARC, COL1A1 및 BGLAP의 RT-PCR(F) 및 정량적 RT-PCR(G)에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다. mRNA 정량을 위해 GAPDH가 기준으로 사용되었다. 모든 분석은 3회씩 반복하였고 평균±표준오차로 표기하였다(***p＜0.001).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs의 신경 분화에 관한 도이다. (A, B)는 기본 배양 배지로 성장시킨 대조 세포이다. 대조 세포는 GFAP에 대해 양성이지만 베터 III 튜불린에 대해서는 아니다. (C, D) 신경 발생 후 세포를 GFAP와 베타 III 튜불린으로 염색하였다. (E 내지 G) 음성 대조군은 알렉사 488(녹색, F), 알렉사 594(적색, G) 및 핵 검출을 위한 Hoechst 염색(청색,E)만을 이용하여 수행되었다. (H, I)는 신경 특이적 마커, MAP2 및 GFAP의 RT-PCR(H) 및 정량적 RT-PCR(I)에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다. mRNA 정량을 위해 GAPDH가 기준으로 사용되었다. 모든 분석은 3회씩 반복하였고 평균±표준오차로 표기하였다(***p＜0.001).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs의 연골발생 분화에 관한 도이다. 연골발생 유도 3주 후 펠렛 형성이 관찰되었다. (A)는 타원형의 연골형성 펠렛의 이미지이다. 펠렛은 15 ml 폴리프로필렌 튜브의 바닥에 형성되었다. 검은 화살표가 펠렛을 가리킨다. (B)는 연골발생 펠렛의 톨루이딘 블루 염색 결과이다. 펠렛을 파라핀에 함몰시키고 3 μm 절편으로 잘라 슬라이드에 올렸다. 슬라이드를 톨루이딘 블루로 염색하였다. 염색된 조직은 일반적으로 연골 조직 표현형을 나타내었다. (C, D)는 연골발생 특이적 마커, AGGRECAN 및 COL2A의 RT-PCR(C) 및 정량적 RT-PCR(D)에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다. mRNA 정량을 위해 GAPDH가 기준으로 사용되었다. 모든 분석은 3회씩 반복하였고 평균±표준오차로 표기하였다(***p＜0.001).
도 7은 재현성을 확인하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs 세포주 2 및 3의 초대 배양과 누적 집단 배가 수준(cumulative population doubling level; CPDL)을 나타낸 도이다. (A) 및 (B)는 세포주 2 및 3을 제조하기 위해 수득한 개과동물 양막 조직, (C) 및 (D)는 세포주 2 및 3의 cAM-MSC 위상차 이미지를 나타낸다. (E)는 세포주 2(실선) 및 3(점선)의 세포성장곡선을 나타낸다.
도 8은 재현성을 확인하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs 세포주 2 및 3의 지방생성 분화에 관한 도이다. (A 내지 D)는 지방생성 유도 3주 후 오일 레드 O 염색결과를 나타낸다. (A, C)는 기본 배양 배지에서 성장한 대조 세포로 오일 레드 O에 의해 염색되지 않았다. (B, D)는 지방생성 분화를 위해 지방생성 유도 배지로 처리한 세포이다. 분화된 세포에서 지방 방울이 오일 레드 O에 의해 염색되었다. 스케일 바=50 μm. (E, F)는 정량을 위해 염료를 100% 이소프로판올로 용출시키고 500 nm에서 0.5초간 분광광도법으로 흡광도를 측정한 결과이다. 상기 모든 분석은 3회 수행하여 평균±표준편차로 나타내었다(***; p＜0.001). (G, H)는 지방생성 특이적 마커, FABP4, LEPTIN 및 LPL의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 9는 재현성을 확인하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs 세포주 2 및 3의 골형성 분화에 관한 도이다. (A 내지 D)는 배양 3주 후 골형성 분화를 확인하기 위해 알리자린 레드 S로 염색하였다. (A, C)는 기본 배양 배지에서 배양한 대조 세포로, 알리자린 레드 S에 의한 염색이 관찰되지 않았다. (B, D)는 골형성 유도 배지에서 성장시킨 세포로 대조세포와 비교하여 알라자린 레드 S에 의해 강하게 염색되었다. 스케일 바=50 μm. (E, F)는 정량을 위해 100 mM 염화 세틸피리디니움으로 용출시켜 570 nm에서 0.5초간 분광광도법으로 흡광도를 측정한 결과이다. 모든 분석은 3회 반복 시행되었다. 상기 모든 분석은 3회 수행하여 평균±표준편차로 나타내었다(***; p＜0.001). (G, H)는 골형성 특이적 마커, MSX2, SPARC, COL1A1 및 BGLAP의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 10은 재현성을 확인하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs 세포주 2 및 3의 신경 분화에 관한 도이다. (A, B)는 신경 특이적 마커, MAP2 및 GFAP의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 11은 재현성을 확인하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 cAM-MSCs 세포주 2 및 3의 연골발생 분화에 관한 도이다. (A, D)는 타원형의 연골형성 펠렛의 이미지이다. 펠렛은 15 ml 폴리프로필렌 튜브의 바닥에 형성되었다. (B, E)는 연골발생 펠렛의 톨루이딘 블루 염색 결과이다. 스케일 바=100 μm. (C, F)는 연골발생 특이적 마커, AGGRECAN 및 COL2A의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 수준을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아닌 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명은 서울대학교의 "실험동물의 보호 및 사용에 관한 가이드"의 지침을 따라 수행되었으며 동물의 윤리적 사용과 관련된 적용가능한 기관 및 정부의 정책과 규제를 준수하였다.

실시예 1: 개과동물 양막의 수거

분만을 위한 제왕절개에 의해 분리된 후 정상적으로 버려지는 양막을 사용하였다(서울대학교 수의과 병원). 이는 연구의 목적으로 비용없이 제공되었다. 이렇게 분리된 막은 오로지 조직으로부터의 줄기세포의 분리와 특성화에만 사용되었다. 본 발명에는 건강한 성체 잡종견(healthy adult mixed-breed dogs; n=6; 4.5±0.4 kg)이 사용되었다. 제왕절개 분만에 앞서, 아세프로마진 말레인산염(acepromazine maleate; 0.1 mg; Sedaject, Samwoo medical, Yesan, Korea)로 처리하였고, 이후 마취 유도를 위해 티오펜탈 나트륨염(thiopental sodium; 15 mg; Pentotal, Joongwei pharmaceutical, Seoul, Korea)를 정맥내주사하였다. 마취상태를 유지하기 위해 이소푸루란(isoflurane; AErrane, Baxter, Mississauga, ON, Canade)을 사용하였다. 모든 과정은 멸균조건하에서 수행되었다.

실시예 2: 줄기세포 분리 및 배양

세포 분리는 약간의 변형을 가해 이전에 기술된 방법으로 실시하였다[Diaz-Prado, S. et al., Tissue Eng . Part C Methods, 2010; Mihu C. M. et al., Rom . J. Morpho . Embryol, 50: 73-77, 2009]. 모든 태반 시료는 실시예 1의 방법으로 개과동물로부터 제왕절개 분만을 통해 수거하였다. 전체 태반으로부터 양막을 분리하기 위하여, 양막을 융모막으로부터 물리적으로 벗겨냈다. 멸균조건하에서, 수거된 양막을 생리 식염수(0.9%)로 서너번 씻어냈다. 상피세포들을 제거하기 위해, 수거된 양막에 트립신-EDTA(0.25%)를 37℃에서 30분간 처리하고, 생리 식염수로 서너번 세척하였다. 이어서, 상피세포를 제거한 양막을 수술용 칼로 작게 자른 후 37℃에서 약 3 내지 4시간 동안 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type I; 2 mg/ml; Worthington biochemical, Freehold, NJ)로 분해하여 중배엽성 단일세포로 분리시켰다. 이어서, 인산 완충 염용액(PBS; Cellgro, USA)으로 350 g로 5분간 원심분리하여 세척하였다. 상등액을 제거한 후, 세포 펠렛은 기본 배양 배지인 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 저농도 글루코스 DMEM(LG-DMEM; Gibco BRL, USA)으로 재현탁하였다. 세포를 75T 폴리스티렌 배양 플라스크(Nunc, USA)에 시딩하고 5% 이산화탄소의 습식 배양기에서 인큐베이션하였다. 기본 배양 배지는 일주일에 3회 교환하였고 80 내지 90% 컨플루언시에 이르렀을 때 계대배양하였다.

도 1A는 개과동물의 태반조직으로부터 분리된 양막이다. 이로부터 분리된 cAM-MSCs는 MSCs의 전형적인 방추형태를 나타내었고 플라스틱 배양접시에 부착되었다(도 1B).

실시예 3: 누적 집단 배가 수준 분석(cumulative population doubling level analysis)

다분화능 줄기세포를 비롯한 줄기세포는 자기 재생 능력이 있으며, 이는 계속적이고 꾸준한 증식율과 관련되어 있다[Reya T. et al., Nature, 414(6859): 105-11, 2001]. 따라서 상기 실시예 2에서 수득된 cAM-MSCs의 증식과 성장 효율을 총 누적 집단 배가 수준에 의해 결정하였다. 이것은 공식 CPDL=ln(Nf/Ni)ln2를 사용하였고, 여기서 Ni는 초기 시딩 세포 수이고, Nf는 최종 수거 세포 수 및 ln은 자연로그이다. 세포(5×10⁴)를 6-웰 배양 접시(Nunc) 3개 웰에 분주하고 5 내지 7일 후 계대배양하였다. 최종 세포 수를 계수하였고 5×10⁴ 세포를 재분주하였다. 누적 배가 수준을 얻기 위해, 각 계대에 대한 집단 배가를 계산하였고 이전 계대의 집단 배가 수준에 더하였다. 상기 과정은 증식률의 감소가 관찰될 때까지, 계대 3으로부터 20까지, 반복되었다. 그 결과는 도 1C에 나타내었다.

또한 줄기세포 특이적 마커의 유전자 발현 수준을 측정하기 위하여, 계대 의존적 방식으로 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 구체적인 실험방법은 하기 실시예 5에 나타내었다. 본 발명에서는 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4와 같은 줄기세포 특이적 마커들을 사용하였다. 그 결과, 도 1D 내지 G에 나타낸 바와 같이 상기 줄기세포 마커들은 계대가 증가함에 따라 감소하는 발현 패턴을 보였다.

실시예 4: RT- PCR

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 분리하여 배양한 cAM-MSCs를 다양한 조직세포로 분화시킨 후 각각의 조직의 분화 관련 마커들의 유전자 발현 수준을 RT-PCR로 확인하였다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같고, 그 결과는 각각의 분화 실험결과에 함께 나타내었다. 이지-스핀 토탈 RNA 추출 키트(Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 배양한 세포로부터 토탈 RNA를 추출하였다. 분광광도계로 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 결정하였다. 수퍼스크립트 II 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 올리고 (dT) 프라이머(Invitrogen)를 사용하여 역전사를 위한 1 μg의 토탈 RNA로 cDNA를 제조하였다. 플래티넘 Taq(Invitrogen, Carsbad, CA)을 이용한 PCR로 cDNA를 증폭시켰다. PCR 프라이머는 표 2에 나타내었다. PCR 생성물은 1.5% 아가로즈 젤로 분리하여 브롬산 에티디움(ethidium bromide)로 가시화하였다.

실시예 5: 정량적 RT- PCR

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 분리하여 배양한 cAM-MSCs의 줄기세포 특이적 마커와 이를 다양한 조직세포로 분화시킨 후 각각의 조직의 분화 관련 마커들의 유전자 발현 수준을 정량적 RT-PCR로 확인하였다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같고, 그 결과는 각각의 분화 실험결과에 함께 나타내었다. 프라이머와 cDNA 혼합 및 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량적 RT-PCR을 수해하였다. ABI 7500 Realtime-PCR 시스템과 제공된 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라 정량적 RT-PCR을 수행하였다. RNA 발현 수준은 표준화 후 내인 글리세르알데히드-3-인 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)와 비교하였다. 본 발명에 사용된 프라이머 서열은 표 1과 2에 열거하였다.

실시예 6: 유세포 분석에 의한 cAM- MSCs 의 면역표현형 특성 확인

일반적으로, 사람의 MSCs는 구별되는 특이적 표면항원마커를 가진다. 세포치료국제협회(International Society of Cellular Therapy)에 따르면, 일반적으로 사람 MSCs는 사람 마커인 CD73, CD44, CD90 및 CD105에 양성발현을 보이며, 사람마커인 CD11b, CD14, CD18, CD79a, CD34, CD45 및 HLA-DR에 음성발현을 나타낸다[Dominici M. et al., Cytotherapy, 8(4): 315-7, 2006]. 따라서, cAM-MSCs의 면역표현형을 결정하기 위하여, 10종의 CD 마커에 대하여 하기의 방법으로 실험하였다.

먼저, 제조업자(BD Biosciences, USA)가 제공한 프로토콜에 따라 FACS 분석을 위한 특이적 항체로 세포를 염색하였다. 간략히, cAM-MSCs를 트립신처리하고 인산 완충 염용액으로 서너번 세척하였다. 부유시킨 세포를 특이적 항체 염색을 위해 일정부분 분할(약 1×10⁶ 세포)하였다. 세포를 하기의 항체들로 면역염색하였다: 마우스 항-인간 CD3, 마우스 항-인간 CD11c, 마우스 항-인간 CD28, 마우스 항-인간 CD34, 마우스 항-인간 CD38, 마우스 항-인간 CD41a, 마우스 항-인간 CD45, 마우스 항-인간 CD62L, 마우스 항-인간 CD90(BD Biosciences) 및 마우스 항-인간 CD105(Serotec, USA). 항체는 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC) 또는 피코에리트린(phycoerythrin; PE)과 결합되었다. FACS Calibur^TM(BD Biosciences) 및 Cell Quest Pro^TM(BD Biosciences) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

그 결과, cAM-MSCs는 MSCs의 면역표현형과 일치하는 발현 패턴을 가짐을 확인하였다(도 2). cAM-MSCs는 잘 알려진 전형적인 MSCs 마커인 CD90 및 CD105에 양성 발현을 보였다. CD90은 Thy-1이라 불리며, 자궁내막 줄기세포, 간 줄기세포, 각질 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포와 같은 다양한 형태의 줄기세포에 대한 마커이다. CD105 또한 SH2라 불리는 잘 알려진 MSC 마커이다. 그러나, 본 발명의 줄기세포는 다른 면역 세포 마커(CD3, CD11c, CD28, CD38 및 CD62L), 조혈세포(CD34, 및 CD45) 및 혈소판 마커(CD41a)의 발현에 대해서는 음성이었다. 상기 결과는 cAM-MSCs의 면역표현형이 다른 특성화된 MSCs의 것과 일치함을 보여주었다.

실시예 7: 지방세포로의 분화 가능 여부

상기 실시예 2에서 제조된 cAM-MSCs가 지방세포로 분화할 수 있는지 결정하기 위해 세포를 덱사메타손(dexamethasone; 1 μM), 인도메타신(indomethacin; 60 μM), 3-이소부틸-1-메틸-크산틴(3-isobutyl-1-metyl-xanthine; IBMX; 500 μM) 및 인슐린(5 μg/ml)(Sigma-Aldrich, USA)을 포함하는 지방세포화 분화 배지로 3주간 처리하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지를 사용하였다. 80 내지 90% 컨플루언시에 도달하였을 때 세포를 3주간 지방세포화 분화 배지로 처리하였다. 3주 후, 오일 레드 O 염색을 수행하여 지방 방울을 확인하였다. 세포를 10% 포르말린으로 적어도 한시간 동안 고정하였고 새롭게 희석한 오일 레드 O에서 10분간 인큐베이션하기에 앞서 60% 이소프로판올로 세척하였다. 염료는 100% 이소프로판올에 용해시켰고, 분광광도계를 사용하여 500 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명자들은 분화 조건하에서 형성된 지방 방울을 검출할 수 있었고 대조 조건하에서는 그렇지 않음을 확인하였다(도 3A 내지 D). 세포의 분화 상태를 정량하기 위하여 오일 레드 O를 용출시켜 흡광도를 측정한 결과는 도 3E에 나타내었다. 분화된 세포는 대조군 세포보다 5배 높은 흡광도 값을 나타내었다. 이와 더불어 본 발명자들은 FABP4, 렙틴 및 LPL과 같은 지방형성 관련 마커들의 유전자 발현수준을 RT-PCR(도 3F) 및 정량적 RT-PCR(도 3G)을 통해 측정하였다. 분화 후, 지방생성-관련 마커들의 발현은 대조군에 비해 분화배지로 처리한 세포에서 증가하였다.

실시예 8: 골세포로의 분화 가능 여부

상기 실시예 2에서 제조된 cAM-MSCs의 골형성 분화 능력을 결정하기 위해 저농도 글루코스 DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM)에 2-인산 아스코르브산(50 μM), 덱사메타손(100 nM), β-글리세로포스페이트(10 mM)(Sigma-Aldrich, USA) 및 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 포함하는 골형성 분화 배지를 사용하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지가 사용되었다. 세포가 80 내지 90%의 컨플루언시에 도달하였을 때, 배지를 골형성 분화 배지로 교환하였고 이후 3주간 세포를 항온 배양하였다. 3주 후 칼슘 침착에 양성적으로 반응하는 알리자린 레드 S로 염색하여 칼슘 침착을 확인하였다. 세포를 인산 완충 염용액으로 세척하고, 빙냉의 에탄올(70%)로 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 이후 세포를 증류수로 서너번 세척하였다. 세포를 알리자린 레드 S(40 mM; pH 4.2; Sigma-Aldrich, USA)로 실온에서 10분간 염색하였다. 증류수로 세포를 5회 세척하여 비특이적으로 결합된 염료를 세척하였다. 알리자린 레드 S 염료는 염화 세틸피리디늄(100 mM; Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 1시간 동안 가용화시켰다. 분광광도계를 사용하여 가용화된 알리자린 레드 S의 흡광도를 570 nm에서 측정하였다.

그 결과, 분화 조건하에서 강한 양성의 알리자린 레드 S 염색이 확인되었고, 대조 조건하에서는 음성 염색이 관찰되었다(도 4A 내지 D). 분화상태를 정량하기 위하여, 염화 세틸피리디늄으로 염료를 용출시켜 흡광도를 측정한 결과, 분화된 세포는 대조군 세포에 비해 약 15배 높은 흡광도 값을 나타내었다(도 4E). 추가적으로 MSX2, SPARC, COL1A1 및 BGLAP와 같은 골형성 관련 마커들의 유전자 발현 수준을 RT-PCR(도 4F) 및 정량적 RT-PCR(도 4G)을 통해 측정하였다. 분화 후, 골형성 관련 마커들의 발현은 대조군에 비해 증가하였다.

실시예 9: 신경세포로의 분화 가능 여부

상기 실시예 2에서 제조된 cAM-MSCs에 신경 분화 배지를 사용하여 신경발생을 유도하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지가 사용되었다. 세포를 기본 배양 배지에 시딩하고 컨플루언시에 도달하도록 두었다. 분화를 유도하기 위해, 유도에 앞서 세포를 베타-머캅토에탄올(1 mM; beta-mercaptoethanol; BME)과 5% FBS와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 도코사헥사에노익(100 M; docosahexaenoic; DHA, Sigma-Aldrich, USA), B27 보충제(Gibco BRL, USA) 및 1.5% 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 무혈청 유도 배지로 2일간 처리하였다. 면역염색 및 RT-PCR을 수행하여 분화를 확인하였다. 면역염색 방법은 하기 실시예 11에 구체적으로 나타내었다.

그 결과, 신경 마커 GFAP 및 베타 III 튜불린이 분화 조건하에서 양성적으로 발현됨을 보였다(도 5C 및 D). 그러나, 기본 배양 조건하에서, cAM-MSCs는 GFAP를 발현하였으나 베타 III 튜불린은 발현시키지 않았다(도 5A 및 B). 음성 대조군은 이차 항체 알렉사 488 & 594와 인큐베이션하였으나 어떠한 바탕신호도 보이지 않았다(도 5E 및 F). RT-PCR(도 5H) 및 정량적 RT-PCR(도 5I)을 통해 신경-관련 유전자의 발현 수준을 측정하여 GFAP가 대조군 및 신경 분화 조건 모두에서 발현됨을 확인하였다. 분화 조건하에서 MAP2 발현은 대조 조건에 비해 양성이었다(도 5H 및 I).

실시예 10: 연골세포로의 분화 가능 여부

상기 실시예 2에서 제조된 cAM-MSCs의 연골세포로의 분화를 촉진시키기 위하여, 연골발생 분화 배지를 사용하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지가 사용되었다. 15 ml 폴리프로필렌 튜브에 세포(5×10⁵)를 시딩하고 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 세포 펠렛을 1 ml의 연골발생 분화 배지(Lonza)에서 인큐베이션하며 3주간 배양하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였다. 분화 후, 펠렛을 파라핀에 함몰시켜 3 μm 절편으로 잘랐다. 연골형성을 확인하기 위하여, 표준화된 프로토콜에 따라 절편을 톨루이딘 블루로 염색하였다.

그 결과, 폴리프로필렌 튜브의 바닥에 형성된 펠렛이 타원형의 불투명한 바디를 가짐을 확인하였고(도 6A), 톨루이딘 블루 염색을 수행하여 연골형성을 확인하였다. 분화 후, 펠렛은 양성의 톨루이딘 블루 염색을 보였다(도 6B). 또한 본 발명자들은 Aggrecam 및 COL2A1과 같은 연골발생 마커와 관련된 유전자의 발현 패턴을 RT-PCR(도 6C) 및 정량적 RT-PCR(도 6D)을 통해 측정하였다. 연골발생 마커들은 대조 조건과 비교하여 분화 조건하에서 증가되었다(도 6C 및 D).

실시예 11: 면역염색

면역염색을 위하여 마우스 항-신경 특이적 베타 III 튜불린(Abcam, UK)과 래빗 항-신경교원섬유산단백(Glial Fibrillary Acidic Protein; GFAP, Millipore, USA) 항체를 사용하였다. 세포를 4% 포름알데히드로 20분간 고정시키고, 0.5% 트리톤-X 100에 실온에서 10분간 투과되도록 하였다. 인산 완충 염용액으로 서너번 세척한 후 세포를 10% 정상 산양 혈청(normal goat serum; NGS)으로 4℃에서 밤새 차단시켰다. 일차 항체를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인산 완충 염용액으로 세척 후, 세포를 이차 항체 알렉사 488 & 594(1:1000, Molecular Prove, Inc., Eugene, OR, USA)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 핵 염색을 위하여, 인산 완충 염용액에 1:100으로 희석시킨 Hoechst 33238(1 mg/ml)와 함께 시료를 15분간 인큐베이션하였다. 영상은 공초점 현미경(Eclipse TE2000; Nikon, Japan)을 이용하여 포착하였다.

실시예 12: 재현성 확인

본 발명의 줄기세포 분리 및 배양방법의 재현성을 확인하기 위하여, 실시예 1과 2에 기재된 방법으로 6종의 다른 개과동물 양막 시료로부터 세포를 분리하고 배양하였다(성공률 100%). 상기 6종의 시료로부터 분리된 모든 세포는 매우 유사한 세포형태 및 계대배양 능력을 보였다. 이중 임의로 3종의 세포주를 선택하여 단일 세포주를 임의로 선택하여 실시예 3 내지 11에 기재된 방법으로 상기 개별적으로 분리 배양된 줄기세포의 특성을 확인하였다. 선택된 세포주에 한하여 상기의 실험들을 3회 반복하여 수행하였다. 그 추가적인 세포주 2 및 3에 대한 특성화 실험 결과를 도 7 내지 11과 하기 표 3에 나타내었다. 상기 결과를 도 1 내지 6에 나타낸 세포주 1에 대한 세포형태, CPDL(cumulative population doubling level), 지방, 골, 연골 및 신경세포로의 분화 및 면역표현형 특성과 유사한 패턴을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 방법으로 분리 배양한 개과동물 양막 유래 줄기세포는 다분화능 줄기세포로 중간엽줄기세포의 면역표현형 특성을 나타내며 다양한 조직세포로 분화가능한 세포임을 확인하였다.

<110> KANG STEM HOLDINGS CO., LTD <120> Canine Amniotic Membrane-Derived Multipotent Stem Cells <130> PA121092-KR-D1 <150> KR 10-2011-0129818 <151> 2011-12-06 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 forward <400> 1 tcgtgaagcc ggacaaggag aag 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 reverse <400> 2 aggaacatgt tctccaggtt gcct 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 forward <400> 3 aaccccaaga tgcacaactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 reverse <400> 4 cggggccggt atttataatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG forward <400> 5 cctgcatcct tgccaatgtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG reverse <400> 6 tccgggctgt cctgagtaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 forward <400> 7 ccatgggcca aactacccac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 reverse <400> 8 tggggtcaac accattccgt 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL forward <400> 9 acacattcac aagagggtca c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL reverse <400> 10 ctctgcaatc acacggatg 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEPTIN forward <400> 11 ctatctgtcc tgtgttgaag ctg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEPTIN reverse <400> 12 tgtgtgaaat gtcattgatc ctg 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 forward <400> 13 atcagtgtaa acggggatgt g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 reverse <400> 14 gacttttctg tcatccgcag ta 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPARC forward <400> 15 tgagaaggta tgcagcaacg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPARC reverse <400> 16 agtccaggtg gagtttgtgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSX2 forward <400> 17 tccgccagaa acaatacctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSX2 reverse <400> 18 aagggtagga cgctccgtat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 forward <400> 19 cacctcagga gaaggctcac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 reverse <400> 20 atgttctcga tctgctggct 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGLAP forward <400> 21 gtggtgcaac cttcgtgtc 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGLAP reverse <400> 22 gctcgcatac ttccctcttg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP forward <400> 23 tccgaggggg caaaagcacc 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP reverse <400> 24 ggcaggctgc taaccgagag c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2 forward <400> 25 cagcgacaag gccgacacgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2 reverse <400> 26 gggccaaact cgacacccgg 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 forward <400> 27 gaaactctgc caccctgaat g 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 reverse <400> 28 gctccaccag ttcttcttgg 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGGRECAN forward <400> 29 atcaacagtg cttaccaaga ca 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGGRECAN reverse <400> 30 ataacctcac agcgatagat cc 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 31 aacatcatcc ctgcttccac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 32 tccttggagg ccatgtagac 20

Claims

개과동물 양막에서 세포를 분리하는 제1단계;
분리한 세포를 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 제2단계; 및
배양된 세포를 회수하는 제3단계를 포함하여,
다음과 같은 특성을 나타내는 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법:
(a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
(b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
(c) 미분화 상태로 20계대 이상 배양되는 능력을 가짐.