KR20180033586A - 전달을 위한 유전적으로 인코딩된 내재적으로 무질서화된 스텔스 중합체 및 이의 이용 방법 - Google Patents

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사마그야 반스코타
패리사 유세프푸어
자얀타 바타차리야
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Abstract

폴리펩타이드 및 하나 이상의 약물 분자를 포함하는 콘주게이트가 본원에서 제공된다. 폴리펩타이드에는 하나 이상의 하전된 모티프가 포함되며, 하나 이상의 하전되지 않는 모티프가 추가로 포함될 수 있다. 콘주게이트는 대상체에 약물 분자를 효과적으로 전달하기 위해 이용될 수 있다.

Description

전달을 위한 유전적으로 인코딩된 내재적으로 무질서화된 스텔스 중합체 및 이의 이용 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2015년 8월 4일에 출원된 U.S. 특허 가출원 번호 62/200,726을 우선권으로 주장하며, 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여되는 연구비 5R01EB000188 R01 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 소정 권리를 갖는다.
기술분야
본 개시는 약물 전달 방법, 보다 구체적으로는 치료제에 콘주게이션된 쯔비터이온성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 콘주게이트는 개선된 생체적합성 및 생분해성을 갖는다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 재조합적으로 발현될 수 있고, 이에 의해 정밀하게 설계되고 유전자 수준에서 조작될 수 있다.
도입
약물 또는 치료제, 예컨대 소분자, 펩타이드, 및 단백질의 원상태 형태로의 전달은 이의 불량한 안정성, 낮은 용해도, 및 짧은 생체내 순환에 의해 제한된다. 약물 전달에서의 이러한 난제는 감소된 치료 유효성 및 표적을 벗어난 독성의 증가된 위험으로 이어진다. 약물에 대한 거대분자 담체의 부착은 이의 용해도, 혈장 반감기, 종양-특이적 섭취, 및 이의 전반적 치료능을 개선할 수 있다. 다양한 물질, 주로 합성 중합체가 약물을 전달하기 위해 이전에 설계되었다. 이러한 합성 중합체의 하나는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG는 약물 주위에 "물 우리(cage)"를 형성하는 친수성 및 흡습성 중합체이며, 이어서 혈액 성분으로부터의 입체 반발을 제공하고 그 옵소닌화 및 효소적 분해를 모두 방지한다. PEG의 이러한 "스텔스" 특성은 약물의 용해도 및 안정성을 개선하고, 대상체로부터 이의 조기 제거를 감소시켜서, PEG화 - PEG에 약물을 부착하는 공정 - 를 약학 산업에서 중요한 방법으로 만든다. 최근 수 년 간, 이의 단량체에 교대 양이온기 및 음이온기를 갖는 중합체인 새로운 클래스의 쯔비터이온성 합성 중합체는 유사한 스텔스 특성을 실증하였다. 그러나, 약물 전달 비히클로서 합성 중합체의 신뢰성을 손상시키는 3가지 주요 단점이 존재한다. 첫 번째로, PEG에 대한 반복된 노출은 유해한 면역 반응을 유발하는 PEG-특이적 항체를 생성할 수 있음이 잘 보고되어 있다. 두 번째로, 합성 중합체는 비-생분해성이며, 약물 전달 후 이의 생체내 효과는 잘 이해되어 있지 않다. 세 번째로, 합성 중합체는 각 배치가 상이한 분자량을 갖는 사슬로 이루어지는 다분산성이다. 합성 중합체에 내재적인 이러한 다분산성은 특히 반감기 및 면역원성에 관해, 상이한 생물학적 특성을 갖는 약물 콘주게이트 집단을 생성할 수 있다. 개선된 생체적합성, 용해도, 안정성 및 반감기와 감소된 독성을 갖는 효율적인 약물 전달에 대한 필요성이 당분야에 존재한다.
하나의 양태에서, (a) 하나 이상의 하전된 모티프를 포함하는 폴리펩타이드로서, 각각의 하전된 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 1(VPX1X2G)로 구성되는 아미노산 서열을 가지며, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산인 폴리펩타이드; 및 (b) 폴리펩타이드에 부착된 하나 이상의 약물 분자를 포함하는 콘주게이트가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 복수의 하전된 모티프가 포함된다. 일부 구현예에서, 복수의 하전된 모티프는 일렬로 반복된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 하나 이상의 하전되지 않은 모티프가 추가로 포함되며, 각각의 하전되지 않은 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 3(VPGXG)으로 구성되는 아미노산 서열을 갖고, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 복수의 하전되지 않은 모티프가 포함된다. 일부 구현예에서, 복수의 하전되지 않은 모티프는 일렬로 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 하전되지 않은 모티프는 폴리펩타이드의 적어도 2개의 인접한 하전된 모티프 사이에 배치된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 2(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 4(VPGXG)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 5(VPX1X2G)n(VPGXG)m의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 6(VPGXG)m(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 SEQ ID NO: 7{(VPX1X2G)(VPGXG)}b의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수인 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, X1은 음으로 하전된 아미노산이고, X2는 양으로 하전된 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1은 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 하전된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전된 아미노산은 독립적으로 글루타메이트산 및 아스파르트산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양으로 하전된 아미노산은 독립적으로 라이신 및 아르기닌으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, X는 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X는 글리신 및 발린으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 링커가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 링커에는 하나 이상의 시스테인이 포함된다. 일부 구현예에서, 링커에는 SEQ ID NO: (GGC), SEQ ID NO: ((GGC)8), SEQ ID NO: ((G4S)3), 및 SEQ ID NO: ((VPGXG)16, 식 중 X는 1:1의 비로 존재하는 발린 또는 시스테인임)으로부터 선택되는 아미노산 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 모두에 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 약물 분자가 링커를 통해 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 링커 내 티올 반응기를 통해 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 약물 분자는 소분자, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 소분자가 포함된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 단백질이 포함된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 암 치료제가 포함된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 항체가 포함된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 파클리탁셀이 포함된다. 일부 구현예에서, 약물 분자에는 Tn3(TRAIL 수퍼작용제)이 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 대상체에 대한 투여를 위해 제조된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트의 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 재조합적으로 발현된다.
또 다른 양태에서, 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 상세히 기재되는 바와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에서 제공된다. 또 다른 양태에서, 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에서 제공된다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에 대한 약물 분자의 전달 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 대상체에 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 대상체에 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 샘플 내 표적의 존재 결정 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 샘플을 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 및 복합체의 존재를 검출하는 단계로서, 복합체의 존재는 샘플 내 표적을 시사하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플이 대상체로부터 수득되며, 방법에는 대상체의 질환을 진단하는 단계, 예진하는 단계 또는 치료 유효성을 평가하는 단계가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 방법에 대상체의 치료 유효성을 평가하는 단계가 추가로 포함되는 경우, 방법에는 유효성을 개선하기 위해 필요에 따라 대상체의 치료를 변경하는 단계가 추가로 포함된다. 또 다른 양태에서, 대상체에서 질환의 진단 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 대상체로부터의 샘플을 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 샘플 내 표적 수준을 결정하는 단계로서, 복합체 수준은 샘플 내 표적 수준을 시사하는 단계; 및 샘플 내 표적 수준을 표적의 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 상이한 표적 수준은 대상체에서 질환을 시사하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 수준은 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 또는 동안의 시점에 대상체에서의 수준에 해당하며, 샘플은 이후 시점에 대상체로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 샘플은 대상체가 치료를 받고 있는 기간 동안의 시점에 대상체로부터 취해지며, 대조군 수준은 무질환 수준 또는 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 시점에서의 수준에 해당한다. 일부 구현예에서, 방법에는 치료가 질환 치료에 비효과적인 것으로 결정되는 경우 대상체에 대한 치료를 변경하는 단계 또는 상이한 치료를 투여하는 단계가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 리포터로 표지된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 대상체에 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 종양내 투여된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 항원성을 갖는다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 대사 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 및 정형외과 장애로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환에는 암이 포함된다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 결장직장암, 결장암, 폐암, 전립선암, 고환암, 뇌암, 피부암, 직장암, 위암, 식도암, 육종, 기관암, 두부경부암, 췌장암, 간암, 난소암, 림프모양 암, 자궁경부암, 외음부암, 흑색종, 중피종, 신장암, 방광암, 갑상선암, 뼈암, 암종, 육종, 및 연조직암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암에는 유방암이 포함된다.
도 1은 ZiPP의 가능한 구조 및 서열을 나타낸다. (A) 단독중합체. (B) 디블록 중합체. (C) 멀티블록 중합체. (D) 하전된 모티프의 가능한 서열.
도 2는 ZiPP의 특성규명을 나타낸다. 이용된 ZiPP 구축물은 펜타펩타이드 쯔비터이온성 모티프의 120개 반복이다. (A) 정제된 ZiPP 구축물의 SDS PAGE 분석. (B) (VPKDG)120 및 (VPRDG)120에 대한 대표적 MALDI 스펙트럼으로 정제된 ZiPP 구축물의 MW를 확인하였다(각각 MW=60.5 kDa, MW=63.8 kDa). (C) 동적 광 산란을 이용해서 측정된 수력학적 반지름은 ELP 대조군에 비해 잘 수화된 ZiPP를 나타내었다. (D) ZiPP의 CD-스펙트럼은 저파장에서 음의 타원율 및 더 높은 파장에서 약간 양의 타원율을 나타내었으며, 이는 ELP와 같은 무질서화 구조에 전형적이다. (E) 원상태 PAGE 겔은 ZiPP가 알부민과 상호작용하지 않음을 나타내었다.
도 3은 정맥내 주사되는 경우, ELP(VPGAG) 및 ZiPP의 혈장 동역학을 나타낸다. (A) 실험 설계. (B) 주사 후 시간의 함수로서의 혈장 농도. (C) 각각의 콘주게이트에 대한 곡선 하 면적(AUC). (D) 각각의 콘주게이트에 대한 제거 반감기.
도 4는 피하 주사되는 경우, ELP(VPGAG) 및 ZiPP의 혈장 동역학을 나타낸다. (A) 실험 설계. (B) 주사 후 시간의 함수로서의 혈장 농도. (C) 각각의 콘주게이트에 대한 AUC.
도 5는 ZiPP-PTX 콘주게이트의 특성규명을 나타낸다. (A) ZiPP 파클리탁셀(PTX) 나노입자의 설계 도식. 파클리탁셀을 pH 감수성 링커를 통해 8개의 C-말단 잔기에 화학적으로 콘주게이션하였다. (B) PTX 콘주게이션 후 동적 및 정적 광 데이터는 ZiPP가 마이셀 당 26의 응집수로 58 ㎚ 반지름의 마이셀로 자가-어셈블리되었음을 나타낸다. 폼 팩터(form factor, ρ)-Rg/Rh로 계산됨-는 0.82였으며, 이는 구형 마이셀의 형성을 표시한다. ZiPP 및 ZiPP+PTX 콘주게이트의 MALDI-MS는 중합체 사슬 당 3.2~4개 약물이 존재함을 나타내었다. (C) 처리 72시간 후 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 세포주에서 ZiPP-PTX, ELP-PTX, 및 자유 PTX에 대한 세포 생활성.
도 6은 Zipp화 단백질을 나타낸다. (A) (Tn3)6을 갖는 ZiPP 융합 단백질에 대한 설계 개요. (B) 대장균에서 재조합적으로 발현된 다양한 길이의 ZiPP를 갖는 (Tn3)6의 친화도 정제 샘플의 SDS-PAGE 분석. (C) Colo205(결장암 세포)에 대한 세포독성 검정 및 계산된 IC50값.
도 7은 ZiPP의 특성규명을 나타낸다. 이용된 ZiPP 구축물은 펜타펩타이드 쯔비터이온성 모티프의 80개 반복이다. (A) 정제 ZiPP 구축물의 SDS PAGE 분석. 50 kD 및 75 kD 래더(ladder)가 참조 분자량으로 표시되지만, SDS-PAGE에서 이용되는 래더는 구형 단백질의 것이므로, 구조화되지 않은 ZIPP와 직접 비교할 수 없다. (B) (VPREG)80 및 (VPKEG)80에 대한 대표적 MALDI 스펙트럼으로 정제 ZIPP 구축물의 분자량을 확인하였다(각각 MW=44.1 kDa, MW=41.8 kDa). (C) ZIPP의 CD-스펙트럼은 저파장에서 음의 타원율 및 더 높은 파장에서 약간 양의 타원율을 나타내었으며, 이는 ELP와 같은 무질서화 구조에 전형적이다.
대상체에 약물 분자를 전달하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 조성물 및 방법에는 폴리펩타이드 및 여기에 부착된 약물 분자를 포함하는 콘주게이트가 포함된다. 폴리펩타이드에는 양으로 및 음으로 하전된 아미노산이 모두 포함된다. 본원에 상세히 기재된 조성물 및 방법은 생체적합성, 용해도, 안정성 및 반감기, 면역원성, 및 항원성에 대한 제한을 포함하여, 약물 전달에서의 이전 난제를 극복할 수 있다. 본원에 상세히 기재된 구축물은 콘주게이트 주변에 "물 우리"를 제공하여 콘주게이트를 분해로부터 입체적으로 차폐하기 위해 친수성 원리를 이용할 수 있다. 이에 따라 콘주게이트는 콘주게이션된 치료제의 안정성 및 용해도를 증가시키고 이의 생체내 유효성을 개선한다. 콘주게이트는 질환을 치료하기 위한 약물을 효과적으로 전달함으로써 질환의 치료를 허용할 수 있다. 약물이 표적에 결합하는 일부 구현예에서, 콘주게이트는 또한 표적을 검출하고, 질환을 검출하거나 진단하고, 및/또는 치료 유효성을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 본원에 상세히 기재된 콘주게이트는 또한 유전 조작에 의해 제조됨으로써 정밀도, 더 낮은 독성, 더 우수한 생체적합성, 및 개선된 생분해성을 가지고 이의 설계 및 조작을 촉진할 수 있다.
1. 정의
본원에서 이용되는 "포함한다", "포함된다", "가지는", "가진다", "할 수 있다", 함유한다"는 용어 및 이의 변형은 추가 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는, 개방형 말단의 접속 어구, 용어, 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한, 복수의 참조물이 포함된다. 본 개시는 또한 명시적으로 나타내건 아니건, 본원에 나타낸 구현예 또는 성분을 "포함하는", "이로 구성되는" 및 "이로 본질적으로 구성되는" 다른 구현예를 포괄한다.
본원에서 수치 범위의 열거에 있어서, 동일한 정도의 정밀도로 이들 사이의 각각의 개재 수치가 명시적으로 포괄된다. 예를 들어, 6~9의 범위에 있어서, 6 및 9에 부가하여 수치 7 및 8이 포괄되며, 6.0~7.0의 범위에 있어서, 수치 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명시적으로 포괄된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충 시, 정의를 포함하여 본 문헌이 우선이 될 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 아래에 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 평가에서 이용될 수 있다. 본원에서 인용되는 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이의 전문이 참조로 포함된다. 본원에 개시된 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
하나 이상의 관심 값에 적용되는 본원에서 이용되는 "약"이라는 용어는 언급된 참조값과 유사한 값을 나타낸다. 소정 양태에서, "약"이라는 용어는 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 자명하지 않은 한(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고), 언급된 참조값의 어느 방향으로든(초과이거나 미만으로) 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 나타낸다.
본원에서 이용되는 "아미노산"은 천연 발생 및 비-천연 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 나타낸다. 천연 발생 아미노산은 유전 코드에 의해 인코딩되는 것이다. 아미노산은 이의 일반적으로 공지된 3글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장되는 1글자 기호에 의해 본원에서 나타낼 수 있다. 아미노산에는 측쇄 및 폴리펩타이드 골격 부분이 포함된다.
본원에서 이용되는 "바이오마커"라는 용어는 질환 또는 상태의 확인 및/또는 분류에 유용한 다양한 농도로 대상체에 존재하는 천연 발생 생물학적 분자를 나타낸다. 바이오마커에는 질환에 대한 표시자 또는 마커로 이용되는 유전자, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 핵산, 리보핵산, 폴리펩타이드, 또는 다른 생물학적 분자가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 질환 마커를 포함한다. 예를 들어, 바이오마커는 질환을 갖는 대상체에서 상향조절되거나 하향조절되는 유전자일 수 있다. 또 다른 예로서, 바이오마커는 질환을 갖거나 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에서 그 수준이 증가되거나 감소되는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 폴리펩타이드를 포함한다.
"대조군", "참조 수준" 및 "참조"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 참조 수준은 소정 값 또는 범위일 수 있으며, 이는 측정된 결과를 평가하기 위한 벤치마크로 채택된다. 본원에서 이용되는 "대조군 그룹"은 대조군 대상체 그룹을 나타낸다. 소정 수준은 대조군 그룹으로부터의 컷오프값일 수 있다. 소정 수준은 대조군 그룹으로부터의 평균일 수 있다. 컷오프값(또는 소정 컷오프값)은 AIM(채택 지수 모델, Adaptive Index Model) 방법에 의해 결정될 수 있다. 컷오프값(또는 소정 컷오프값)은 환자 그룹의 생물학적 샘플로부터의 ROC(수신자 작동 곡선, receiver operating curve) 분석에 의해 결정될 수 있다. 생물학 분야에서 일반적으로 공지된 바와 같은 ROC 분석은 하나의 상태를 다른 상태와 구별하는, 예컨대 CRC를 갖는 환자의 확인에서 각 마커의 성능을 결정하는 평가 능력의 결정이다. ROC 분석의 설명은 문헌[P.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)]에 제공되며, 그 개시는 전문이 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 컷오프값은 환자 그룹의 생물학적 샘플의 사분위 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 컷오프값은 25백분위수~75백분위수 범위의 임의의 값에 해당하는 값, 바람직하게는 25백분위수, 50백분위수 또는 75백분위수, 보다 바람직하게는 75백분위수에 해당하는 값을 선택함으로써 결정될 수 있다. 이러한 통계 분석은 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용해서 수행될 수 있고, 임의의 수의 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지(예컨대, Analyse-it Software Ltd., Leeds, UK; StataCorp LP, College Station, TX; SAS Institute Inc., Cary, NC.)를 통해 구현될 수 있다. 표적에 대한 또는 단백질 활성에 대한 건강한 또는 정상 수준 또는 범위는 표준 관례에 따라 정의될 수 있다. 대조군은 그 질환 상태가 알려져 있는 대상체, 또는 이로부터의 샘플일 수 있다. 대상체, 또는 이로부터의 샘플은 건강하거나, 질환이 있거나, 치료 전에 질환이 있거나, 치료 동안 질환이 있거나, 치료 후에 질환이 있거나, 이의 조합일 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 삽입되거나 도입될 수 있는, 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 또 다른 매체를 시사한다.
"숙주 세포"라는 용어는 핵산 구축물 또는 발현 벡터를 이용한 형질전환, 전달감염, 형질도입, 콘주게이션 등에 감수성인 세포이다. 숙주 세포는 식물, 박테리아, 효모, 진균, 곤충, 동물 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에는 대장균(Escherichia coli)이 포함된다.
"단분산성" 또는 "단분산"은 각각이 거의 동일한 분자량을 가지는, 복수의 콘주게이트, 또는 이의 폴리펩타이드의 특성을 나타낸다. 콘주게이트의 유전적으로 인코딩된 합성은 분자량의 정밀한 제어를 촉진할 수 있다. 분자량은 분자의 생체내 순환 시간, 또는 그 반감기에 영향을 미치는 요인이다.
"옵소닌화"는 분자, 미생물, 또는 아폽토시스 세포가 포식세포 및 자연 살해(NK) 세포 상의 세포 표면 수용체와 더 강한 상호작용을 갖기 위해 화학적으로 변경되는 분자 기전을 나타낸다. 분자, 미생물, 또는 아폽토시스 세포 상의 항원이 옵소닌에서 코팅된다. 옵소닌은 면역 세포, 예컨대 대식구 및 호중구에 대한 결합을 증강시킨다. 옵소닌화는 또한 세포 표면 수용체로부터의 신호 캐스케이드를 통해 포식작용을 매개한다.
"합성 중합체"는 화학적 공정에 의해 적어도 하나의 단량체로부터 제조되는 중합체를 나타낸다. 합성 중합체는 살아있는 유기체에 의해 직접 제조되지 않는다. 합성 중합체에는 단독중합체, 헤테로중합체, 블록 중합체, 공중합체, 삼원중합체 등, 및 이의 배합물, 조합물 및 혼합물이 포함된다. 합성 중합체의 예에는 비제한적으로 작용화된 중합체, 예컨대 5-비닐테트라졸 단량체 단위를 포함하며 2.0 미만의 분자량 분포를 갖는 중합체가 포함된다. 합성 중합체는 성상 블록 공중합체, 선형 중합체, 분기형 중합체, 과분기형 중합체, 수지상 중합체, 빗살형 중합체, 그래프트 중합체, 브러시 중합체, 보틀-브러시 공중합체 및 가교 구조, 예컨대 5-비닐테트라졸 단량체 단위 블록을 포함하는 블록 공중합체 중 하나 이상이거나 이를 함유할 수 있다. 합성 중합체에는 비제한적으로 폴리에스테르, 폴리(메트)아크릴아마이드, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리에테르, 폴리스티렌, 폴리노보넨 및 불포화 결합을 갖는 단량체가 포함된다. 예를 들어, 양친매성 빗살형 중합체는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2007/0087114 및 U.S. 특허 번호 6,207,749(Mayes et al.)에 기재되며, 그 각각의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 양친매성 빗살-유형 중합체는 소수성, 수불용성 중합체로 형성된 골격 및 짧은, 친수성 비-세포 결합 중합체로 형성된 측쇄를 함유하는 공중합체 형태로 존재할 수 있다. 다른 합성 중합체의 예에는 비제한적으로 폴리알킬렌, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리클로로프렌; 폴리비닐 에테르; 예컨대 폴리(비닐 아세테이트); 폴리비닐 할라이드, 예컨대 폴리(비닐 클로라이드); 폴리실록산; 폴리스티렌; 폴리우레탄; 폴리아크릴레이트; 예컨대 폴리(메틸 (메트)아크릴레이트), 폴리(에틸 (메트)아크릴레이트), 폴리(n-부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸 (메트)아크릴레이트), 폴리(tert-부틸 (메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실 (메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴 (메트)아크릴레이트), 폴리(페닐 (메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트); 폴리아크릴아마이드, 예컨대 폴리(아크릴아마이드), 폴리(메타크릴아마이드), 폴리(에틸 아크릴아마이드), 폴리(에틸 메타크릴아마이드), 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드), 폴리(n, 이소, 및 tert-부틸 아크릴아마이드); 및 이의 공중합체 및 혼합물이 포함된다. 이러한 합성 중합체에는 치환, 화학적 기, 예를 들어, 알킬기, 알킬렌기의 부가, 하이드록실화, 산화, 및 당업자에 의해 일상적으로 수행되는 다른 변경을 갖는 합성 중합체를 포함하는 유용한 유도체가 포함될 수 있다. 합성 중합체에는 쯔비터이온성 중합체, 예를 들어, 폴리포스포리콜린, 폴리카복시베타인, 및 폴리설포베타인이 포함될 수 있다. 합성 중합체는 베타인, 카복시베타인, 설포베타인, 올리고에틸렌 글리콜(OEG), 사르코신 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 측쇄를 가질 수 있다.
본원에서 이용되는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수도 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 모두인 부분을 함유할 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드는 핵산, 천연 또는 합성, DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, 또는 폴리뉴클레오타이드가 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합을 함유할 수 있는 하이브리드, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신, 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
"펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산의 연결된 서열이다. 폴리펩타이드는 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변경 또는 조합일 수 있다. 펩타이드 및 폴리펩타이드에는 단백질, 예컨대 결합 단백질, 수용체, 및 항체가 포함된다. "폴리펩타이드", "단백질", 및 "펩타이드"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. "일차 구조"는 특정 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다. "이차 구조"는 폴리펩타이드 내의 국소적으로 질서화된, 3차원 구조를 나타낸다. 이러한 구조는 일반적으로 도메인, 예컨대 효소 도메인, 세포외 도메인, 막통과 도메인, 포어 도메인, 및 세포질 꼬리 도메인으로 알려져 있다. 도메인은 폴리펩타이드의 조밀한 단위를 형성하며, 전형적으로 15 내지 350개 아미노산 길이인 폴리펩타이드 부분이다. 예시적인 도메인에는 효소 활성 또는 리간드 결합 활성을 갖는 도메인이 포함된다. 전형적인 도메인은 더 적은 조직화 섹션, 예컨대 베타-시트 연신물 및 알파-나선으로 만들어진다. "삼차 구조"는 폴리펩타이드 단량체의 완전한 3차원 구조를 나타낸다. "사차 구조"는 독립적인 삼차 단위의 비공유 연합에 의해 형성되는 3차원 구조를 나타낸다. "모티프"는 폴리펩타이드 서열 부분이며 적어도 2개의 아미노산이 포함된다. 모티프는 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 모티프에는 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 순차적 아미노산이 포함된다.
본원에서 이용되는 "약동학"은 체내에서 약물의 순환 및 그 생체이용률, 분포, 및 배출을 나타낸다.
예컨대, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 이용되는 경우 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 원상태 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 변경되었음을, 또는 세포가 이렇게 변경된 세포로부터 유래되었음을 시사한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 원상태(비-재조합) 형태 내에서 확인되지 않는 유전자를 발현하거나 다른 경우 비정상적으로 발현되거나, 하향 발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않는 원상태 유전자를 발현한다.
"리포터", "리포터 그룹", "표지", 및 "검출 가능한 표지"는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 리포터는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 표지는 시각적 또는 기구적 수단에 의해 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 리포터 그룹의 신호 전달의 물리적 성질(예컨대, 형광, 전기화학, 핵 자기 공명(NMR), 및 전자 상자성 공명(EPR)) 및 화학적 성질이 상이한 다양한 리포터 그룹이 이용될 수 있다. 다양한 리포터에는 신호-생성 물질, 예컨대 색원체, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 방사활성 화합물 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 리포터는 방사선 표지를 포함한다. 리포터에는 빛을 생성하는 모이어티, 예컨대 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 모이어티, 예컨대 플루오레신이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터로부터의 신호는 형광 신호이다. 리포터는 형광단을 포함할 수 있다. 형광단의 예에는 비제한적으로 아크릴로단(6-아크릴로이 1-2-디메틸아미노나프탈렌), 바단(6-브로모-아세틸-2-디메틸아미노-나프탈렌), 로다민, 나프탈렌, 단질 아지리딘, 4-[N-[(2-요오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 에스테르(IANBDE), 4-[N-[(2-요오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(IANBDA), 플루오레신, 디피로메텐보론 디플루오라이드(BODIPY), 4-니트로벤조[c][1,2,5]옥사디아졸(NBD), Alexa 형광 염료, 및 이의 유도체가 포함된다. 형광 유도체에는, 예를 들어 5-플루오레신, 6-카복시플루오레신, 3'6-카복시플루오레신, 5(6)-카복시플루오레신, 6-헥사클로로플루오레신, 6-테트라클로로플루오레신, 플루오레신, 및 이소티오시아네이트가 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 "샘플" 또는 "평가 샘플"은 표적의 존재 및/또는 수준이 검출되거나 결정될 임의의 샘플을 의미할 수 있다. 샘플에는 액체, 용액, 에멀젼, 또는 현탁액이 포함될 수 있다. 샘플에는 의학 샘플이 포함될 수 있다. 샘플에는 임의의 생물학적 유체 또는 조직, 예컨대 혈액, 전혈, 혈액의 분획, 예컨대 혈장 및 혈청, 근육, 장액, 땀, 타액, 소변, 눈물, 윤활액, 골수, 뇌척수액, 코 분비물, 가래, 양수, 기관지폐포 세척액, 위 세척액, 구토, 대변 물질, 폐 조직, 말초혈 단핵 세포, 전체 백혈구, 림프절 세포, 비장 세포, 편도 세포, 암 세포, 종양 세포, 담즙, 소화액, 피부, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 분취물을 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 생물학적 유체를 포함한다. 샘플은 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 샘플은 환자로부터 수득된 대로 직접 이용될 수도 있고, 또는 예컨대 여과, 증류, 추출, 농축, 원심분리, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 사전-처리되어 본원에서 논의된 바와 같은 일부 방식으로 또는 당분야에 공지된 바와 같은 다른 방식으로 샘플의 특징을 변경할 수 있다.
본원에서 이용되는 "감수성"이라는 용어는 진양성의 수 + 위음성의 수로 나눈 진양성의 수를 나타내며, 여기서 감수성("sens")은 0<sens<1의 범위 내일 수 있다. 이상적으로, 본원에서의 방법 구현예는 0과 같거나 0에 가까운 위음성의 수를 가져서, 대상체는 이들이 실제로 질환을 갖는 경우 질환을 갖지 않는 것으로 잘못 확인되지 않는다. 반대로, 평가는 종종 감수성에 대한 상보적 측정인, 정확히 음성을 분류하는 예측 알고리즘의 능력으로 수행된다.
본원에서 이용되는 "특이성"이라는 용어는 진음성의 수 + 위양성의 수로 나눈 진음성의 수를 나타내며, 여기서 특이성("spec")은 0<spec<1의 범위 내일 수 있다. 이상적으로, 본원에 기재된 방법은 0과 같거나 0에 가까운 위양성의 수를 가져서, 대상체는 이들이 실제로 질환을 갖지 않는 경우 질환을 갖는 것으로 잘못 확인되지 않는다. 따라서, 감수성 및 특이성이 모두 1, 또는 100%인 방법이 바람직하다.
"특이적으로 결합하는"이란, 일반적으로 폴리펩타이드가 무작위, 미관련 표적에 결합할 것보다 더 쉽게 해당 표적에 결합하는 경우, 이것이 표적에 결합함을 의미한다.
"스텔스" 또는 "스텔스 중합체"는 연장된 시기 동안 혈류에서 면역 세포에 의해 검출되지 않고 유지될 수 있는, 콘주게이트, 또는 이의 폴리펩타이드를 나타낸다. 스텔스 중합체는 면역계에서 외래 입자를 인식하기 위해 이용되는 일반적인 방법인, 프로테아제, 및 옵소닌화에 의한 것과 같은 콘주게이트, 또는 이의 폴리펩타이드의 효소적 분해에 적어도 부분적으로 내성이다. 따라서, 스텔스 중합체는 다른 중합체, 콘주게이트, 비-스텔스 중합체, 및/또는 비-스텔스 콘주게이트에 비해 감소된 항원성, 감소된 면역원성, 증가된 안정성, 증가된 반감기, 및 증가된 생체이용률 중 하나 이상을 가질 수 있다. 신체로부터 콘주게이트(또는 폴리펩타이드 또는 이의 약물 분자)의 옵소닌화, 면역계에 의한 인식, 또는 제거를 지연하거나, 감소시키거나, 방지하는 능력이 본원에서 스텔스 특성으로 언급될 수 있다.
본원에서 이용되는 "대상체"는 본원에 기재된 콘주게이트 또는 융합 단백질을 원하거나 필요로 하는 포유류를 의미할 수 있다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 대상체는 포유류일 수 있다. 포유류는 영장류 또는 비-영장류일 수 있다. 포유류는 영장류, 예컨대 인간; 비-영장류, 예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 마우스, 래트, 낙타, 라마, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 및 기니아픽; 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 및 긴팔원숭이일 수 있다. 대상체는 임의의 연령 또는 발달 단계, 예컨대, 성인기, 사춘기, 또는 유아기일 수 있다.
본원에서 이용되는 "표적"은 약물 분자가 결합하는 대상을 나타낼 수 있다. 표적에는, 예를 들어, 소분자, 단백질, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다.
"전이" 또는 "상 전이"는 열 반응성 폴리펩타이드의 응집을 나타낸다. 상 전이는 하한 임계 용액 온도(LCST) 또는 역 전이 온도(Tt)로 불리는 특정 온도에서 급격하게 그리고 가역적으로 일어난다. 전이 온도 미만에서, 열 반응성 폴리펩타이드(또는 열 반응성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드)는 매우 가용성이다. 전이 온도를 지나며 가열 시, 열 반응성 폴리펩타이드는 소수성으로 붕괴되고 응집하여, 별도의 겔-유사 상을 형성한다. "역 전이 사이클링"은 열 반응성 폴리펩타이드(또는 열 반응성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드)에 대한 단백질 정제 방법을 나타낸다. 단백질 정제 방법에는 가용상 및 불용상을 통해 용액을 사이클링하기 위해 열 반응성 폴리펩타이드의 가역적 상 전이 거동을 이용함으로써 오염물질을 제거하는 단계가 관여될 수 있다.
"치료" 또는 "치료하는"이란 질환으로부터 대상체의 보호를 나타내는 경우, 질환의 에방, 억제, 억압, 완화, 또는 완전 제거를 의미한다. 질환의 예방에는 질환의 개시 전에 대상체에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계가 관여된다. 질환의 억제에는 질환의 유도 후에 그러나 그 임상적 출현 전에 대상체에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계가 관여된다. 질환의 억압 또는 완화에는 질환의 임상적 출현 후에 대상체에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계가 관여된다.
"실질적으로 동일한"은 첫 번째 및 두 번째 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 아미노산 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%임을 나타낸다.
폴리뉴클레오타이드에 대해 본원에서 이용되는 "변이체"는 (i) 참조되는 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조되는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 참조되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iv) 참조되는 폴리뉴클레오타이드, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 대해 엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 추가 정의될 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적 예에는 특정 항체 또는 폴리펩타이드에 의해 결합되거나 면역 반응을 촉진하는 능력이 포함된다. 변이체는 실질적으로 동일한 서열을 의미할 수 있다. 변이체는 이의 기능적 단편을 의미할 수 있다. 변이체는 또한 여러 카피의 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 여러 카피는 일렬로 있거나 링커에 의해 분리될 수 있다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조되는 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예컨대, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 갖는 상이한 아미노산으로 아미노산의 대체는 당분야에서 전형적으로 소소한 변화가 관여되는 것으로 인식된다. 이러한 소소한 변화는 부분적으로, 아미노산의 수치(hydropathic) 지수를 고려하여 확인될 수 있다. 문헌[Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132]를 참고한다. 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. 하나의 양태에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 소수성도 생물학적 기능을 보유하는 폴리펩타이드를 생성할 치환을 드러내기 위해 이용될 수 있다. 폴리펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려는 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 4,554,101에 논의된 바와 같이, 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 조치인, 해당 폴리펩타이드의 최대 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다. 유사한 친수성값을 갖는 아미노산의 치환은 당분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성값은 모두 해당 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 드러나는, 아미노산의 상대적 유사성, 특히 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
"물 우리"는 분자를 둘러싸고 분자와 이온적으로 상호작용하는 물 분자를 나타낸다. 분자는, 예를 들어, 폴리펩타이드, ZiPP, 약물 분자, 또는 콘주게이트일 수 있다. 분자가, 예를 들어, 용액 중에 있는 경우, 분자는 물 우리가 그 주위에 형성되도록 주변 물 분자와 이온성 상호작용을 형성한다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 양으로 및 음으로 하전된 아미노산은 용액 중 그 주위의 물 분자와 이온성 상호작용을 형성할 수 있다. 용액에는, 예를 들어, 대상체의 혈장 또는 혈액 또는 다른 체액이 포함될 수 있다. 이온성 상호작용은 수소 결합 또는 다른 분자간 인력보다 강하며, 교란되기 위해서는 더 많은 에너지가 필요하다. 일부 구현예에서, 물 우리는 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, ZiPP, 약물 분자, 또는 콘주게이트)를 분해 또는 옵소닌화로부터 차폐할 수 있다. 물 우리는 분자에 스텔스 특성을 부여할 수 있다.
"쯔비터이온성" 또는 "쯔비터이온"은 전체 0의 전하를, 그러나 분자 내의 독립적인 개별 원자 상에 음전하 및 양전하를 포함하는 분자를 나타낸다. 하전된 원자는 하나 이상의 공유 결합에 의해 연결된다. 폴리펩타이드는 쯔비터이온성일 수 있다.
2. 콘주게이트
콘주게이트에는 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드에 부착된 하나 이상의 약물 분자가 포함된다. 콘주게이트에는 적어도 하나의 링커가 추가로 포함될 수 있다. 콘주게이트는 약물 전달을 위해 고려되는 스텔스 중합체이다.
a. 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 하나 이상의 하전된 모티프를 포함한다. 하전된 모티프에는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 및 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산이 포함되며, 여기서 양으로 하전된 아미노산 및 음으로 하전된 아미노산은 1:1의 비로 존재한다. 일부 구현예에서, 모티프의 전체 전하는 중성이다. 일부 구현예에서, 하전된 모티프는 쯔비터이온성 모티프이다. 하나의 모티프 내의 양으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 모티프 내의 음으로 하전된 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다. 본원에서 이용되는 아미노산의 (양 및/또는 음)전하는 아미노산 측쇄의 전하를 나타낸다. 하전된 아미노산은 중성 pH, 생리적 pH, 또는 단백질 폴딩 내의 국소 pH, 또는 이의 조합에서 양으로 및/또는 음으로 하전된다. 하전된 모티프에는 하나 이상의 하전되지 않은 아미노산이 추가로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 모티프는 VPX1X2G(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산인 서열을 갖는다. 하나 이상의 하전된 모티프를 포함하는 폴리펩타이드는 쯔비터이온성 폴리펩타이드(ZiPP)일 수 있다. ZiPP는 음전하를 갖는 아미노산 및 양전하를 갖는 아미노산이 모두 포함되는 전체 중성 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 복수의 하전된 모티프를 포함한다. 복수의 하전된 모티프는 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 (VPX1X2G)n(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이며, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함한다. X1은 인접 모티프 간에 동일하거나 상이할 수 있다. X2는 인접 모티프 간에 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, n은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열 (VPX1X2G)n(SEQ ID NO: 2)로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이며, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 단독중합체로 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 하나 이상의 하전된 모티프에 부가하여 하나 이상의 하전되지 않은 모티프가 포함된다. 하전되지 않은 모티프에는 하전되지 않은 아미노산이 포함된다. 일부 구현예에서, 하전되지 않은 모티프에는 임의의 하전된 아미노산이 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 하전되지 않은 모티프는 VPGXG(SEQ ID NO: 3)로 구성되는 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 서열을 갖는다.
복수의 하전되지 않은 모티프는 일렬로 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 하전된 모티프에 부가하여 (VPGXG)n(SEQ ID NO: 4)의 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, n은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 하전된 모티프에 부가하여 (VPGXG)n(SEQ ID NO: 4)로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 하전되지 않은 모티프를 포함하는 폴리펩타이드로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이며, n은 1 이상의 정수인 폴리펩타이드는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP)로 언급된다.
폴리펩타이드의 모티프는 임의의 수의 가능한 방식으로 배열될 수 있다. 가능한 배열 및 구조의 예를 도 1에 나타낸다. 도 1에서, 회색 블록은 양으로 하전된 아미노산을 표시하는 반면, 검은색 블록은 음으로 하전된 아미노산을 표시한다. 도 1a는 단독중합체의 일례를 나타내며, 여기서 각각의 단위는 펜타펩타이드 서열 VPX1X2G(SEQ ID NO: 1), 또는 하전된 모티프의 반복이다. 도 1d는 VPX1X2G(SEQ ID NO: 1)의 가능한 서열을 나타낸다. 도 1b는 디블록 중합체의 일례를 나타낸다. 디블록 구조에서, 중합체의 하나의 블록은 반복하는 하전된 모티프로 제조되는 반면, 다른 부분에는 반복하는 하전되지 않은 모티프가 포함된다. 도 1c는 멀티블록 중합체의 일례를 나타내며, 여기서 하전된 모티프 및 하전되지 않은 모티프는 상이한 부위에 배치되어 중합체의 다양성을 증가시킨다. 특정 수, 정체, 및 배열의 모티프가 최적 용매화 수준을 달성하고, 물 우리를 생성하고, 및/또는 자체 주위에 층을 생성하여 치료제 또는 약물 분자의 약동학 개선을 도울 수 있는 콘주게이트를 생성하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 또는 콘주게이트에 스텔스 특성을 부여하도록 배열된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 하전되지 않은 모티프는 폴리펩타이드의 적어도 2개의 인접한 하전된 모티프 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드에는 복수의 일렬로 반복된 하전된 모티프 및 복수의 일렬로 반복된 하전되지 않은 모티프가 포함된다. 일부 구현예에서, 복수의 일렬로 반복된 하전된 모티프는 복수의 일렬로 반복된 하전되지 않은 모티프에 C-말단에 배치된다. 일부 구현예에서, 복수의 일렬로 반복된 하전된 모티프는 복수의 일렬로 반복된 하전되지 않은 모티프에 N-말단에 배치된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 (VPX1X2G)n(VPGXG)m(SEQ ID NO: 5)의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, n은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, (VPX1X2G)n(VPGXG)m(SEQ ID NO: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 폴리펩타이드는 디블록 중합체로 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 (VPGXG)m(VPX1X2G)n(SEQ ID NO: 6)의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, n은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 10 내지 약 500, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, m은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500의 정수이다. 일부 구현예에서, (VPGXG)m(VPX1X2G)n(SEQ ID NO: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이며, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 폴리펩타이드는 디블록 중합체로 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 {(VPX1X2G)(VPGXG)}b(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이며, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, b는 약 100, 200, 또는 300 이하의 정수이다. 일부 구현예에서, b는 약 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 이상의 정수이다. 일부 구현예에서, b는 약 10 내지 약 300, 약 10 내지 약 200, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 1 내지 약 300, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구현예에서, b는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 또는 300의 정수이다. 일부 구현예에서, {(VPX1X2G)(VPGXG)}b(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이며, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수인 폴리펩타이드는 멀티블록 중합체로 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, X1은 음으로 하전된 아미노산이고, X2는 양으로 하전된 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1은 양으로 하전된 아미노산이고, X2는 음으로 하전된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 음으로 하전된 아미노산은 독립적으로 글루타메이트산 및 아스파르트산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양으로 하전된 아미노산은 독립적으로 라이신 및 아르기닌으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X는 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X는 글리신 및 발린으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 온도-감수성이며, 이는 또한 열 반응성으로 언급될 수 있다. 열 반응성 폴리펩타이드는 상 전이를 가질 수 있다. 열 반응성 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 및/또는 콘주게이트에 상 전이 특징을 부여할 수 있다. 상 전이는 하한 임계 용액 온도(LCST) 또는 역 전이 온도(Tt)로 불리는 특정 온도에서 급격하게 그리고 가역적으로 일어난다. "상 전이" 또는 "전이"는 또한 열 반응성 폴리펩타이드의 응집을 나타낼 수 있다. 전이 온도(LCST 또는 Tt) 미만에서, 열 반응성 폴리펩타이드(또는 열 반응성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드)는 매우 가용성일 수 있다. 전이 온도를 초과하며 가열 시, 열 반응성 폴리펩타이드는 소수성으로 붕괴되고 응집하여, 별도의 겔-유사 상 또는 불용성 소수성 응집물을 형성할 수 있다. 폴리펩타이드의 열 반응성 특성은 "역 전이 사이클링으로 불리는 방법에 따라 폴리펩타이드 및/또는 콘주게이트의 정제에서 이용될 수 있다. 상 전이는 또한 예를 들어, 암모늄 설페이트와 같은 코스모트로픽(kosmotropic) 염을 이용해서 유발될 수 있다. 예를 들어, 나트륨 클로라이드가 코스모트로픽 염과 함께 이용될 수 있다. 코스모트로픽 염은 폴리펩타이드 및/또는 콘주게이트를 포함하는 용액에 첨가될 수 있고, 코스모트로픽 염은 폴리펩타이드 및/또는 콘주게이트가 응집물을 형성하거나 용액에서 침전되어 나올 때까지 첨가된다. 응집물은 원심분리에 의해 펠렛화되고 제2 용액 또는 완충액 중에 재현탁될 수 있다. 폴리펩타이드 및/또는 콘주게이트의 응집물은 이의 Tt 미만으로 냉각되면 또는 코스모트로픽 염이 용액으로부터 제거되면 용액 내로 재용해될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 임의의 크로마토그래피 정제 없이 정제된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 재조합적으로 생성되고 박테리아 배양, 예컨대 대장균으로부터 정제된다.
b. 약물 분자
콘주게이트에는 하나 이상의 약물 분자가 포함될 수 있다. 약물 분자는 치료제일 수 있다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 소분자, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 탄수화물, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 암 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 Tn3(TRAIL 수퍼작용제)을 포함한다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 콘주게이트의 폴리펩타이드의 시스테인에 부착된다.
콘주게이트에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 약물 분자가 포함될 수 있다. 콘주게이트에는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 약 3개의 약물 분자가 포함될 수 있다. 콘주게이트에는 약 10개 미만, 약 8개 미만, 또는 약 5개 미만의 약물 분자가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트에는 1개의 약물 분자가 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트에는 콘주게이트의 폴리펩타이드 당 1개의 약물 분자가 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트에는 1~10개의 약물 분자가 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트에는 2~5개의 약물 분자가 포함된다.
c. 링커
일부 구현예에서, 콘주게이트에는 적어도 하나의 링커가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트에는 하나를 초과하는 링커가 포함된다. 이러한 구현예에서, 링커는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 콘주게이트에는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 링커가 포함될 수 있다. 콘주게이트에는 20개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만의 링커가 포함될 수 있다. 콘주게이트에는 1 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 1 내지 5개 링커가 포함될 수 있다. 링커는 폴리펩타이드의 C-말단, 폴리펩타이드의 N-말단, 또는 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 모두에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드 서열 내의 임의의 위치에 배치될 수 있다. 여러 링커가 서로 인접해서 배치될 수 있다.
링커는 임의의 아미노산 서열 및 길이의 폴리펩타이드일 수 있다. 링커는 스페이서 펩타이드로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 하전되지 않은 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성이다. 일부 구현예에서, 링커는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 SEQ ID NO: 8(GGC), SEQ ID NO: 9((GGC)8), SEQ ID NO: 10((G4S)3), 및 SEQ ID NO: 11((VPGXG)16, 식 중 X는 1:1의 비로 존재하는 발린 또는 시스테인임)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
링커는 폴리펩타이드에 대한 약물 분자를 위한 부착 부위로서 작용할 수 있다. 약물 분자는 당분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 링커에 부착될 수 있다. 약물 분자는 티올 반응성 연결기를 통해 링커에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 약물 분자는 링커를 통해 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 링커 내 티올 반응기를 통해 폴리펩타이드에 부착된다.
3. 폴리뉴클레오타이드
본원에 상세히 기재된 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 제공된다. 벡터에는 본원에 상세히 기재된 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 수득하기 위해, 전사를 지시하는 프로모터, 전사/번역 종결자, 그리고 단백질을 인코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 함유하는 발현 벡터 내로 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 서브클로닝할 수 있다. 벡터의 일례는 pet24이다. 적합한 박테리아 프로모터는 당분야에 널리 공지되어 있다. 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환되거나 전달감염된 숙주 세포가 추가로 제공된다. 단백질을 발현하기 위한 박테리아 발현 시스템은, 예컨대 대장균(E. coli), 고초균(Bacillus sp .), 및 살모넬라(Salmonella)에서 이용 가능하다(Paiva et al., Gene 1983, 22, 229-235; Mosbach et al., Nature 1983, 302, 543-545). 이러한 발현 시스템을 위한 키트가 상업적으로 이용 가능하다. 포유류 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵생물 발현 시스템이 당분야에 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 이용 가능하다. 레트로바이러스 발현 시스템이 본 발명에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 SEQ ID NO: 13의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 포함한다.
콘주게이트는 당업자에 따라 숙주 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 콘주게이트는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 콘주게이트는 크로마토그래피, 예컨대 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 친화도 크로마토그래피, 또는 이의 조합을 이용해서 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 크로마토그래피 없이 정제된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 역 전이 사이클링을 이용해서 정제된다.
4. 투여
조성물은 콘주게이트를 포함할 수 있다. 상기에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트는 약학 분야의 당업자에게 널리 공지된 표준 기법에 따라 조성물로 제형화될 수 있다. 조성물은 대상체에 대한 투여를 위해 제조될 수 있다. 콘주게이트를 포함하는 이러한 조성물은 특정 대상체의 연령, 성별, 체중 및 상태, 그리고 투여 경로와 같은 요인을 고려하여 의학 분야의 당업자에게 널리 공지된 투여량으로 및 기법에 의해 투여될 수 있다.
콘주게이트는 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 콘주게이트는 반응을 유도하기 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 콘주게이트는 치료 효과를 야기하기 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다. 이를 달성하기 적절한 양이 "치료적 유효 용량"으로 정의된다. 상기 이용을 위해 효과적인 양은, 예컨대, 투여되는 콘주게이트 요법의 특정 조성물, 투여 방식, 질환의 단계 및 중증도, 환자의 일반 건강 상태, 및 처방의의 판단에 의존할 것이다.
콘주게이트는 문헌[Donnelly 등(Ann. Rev. Immunol . 1997, 15, 617-648); Felgner 등(U.S. 특허 번호 5,580,859, 1996년 12월 3일에 허여됨); Felgner(U.S. 특허 번호 5,703,055, 1997년 12월 30일에 허여됨); 및 Carson 등(U.S. 특허 번호 5,679,647, 1997년 10월 21일에 허여됨)에 기재된 바와 같이 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 투여될 수 있으며, 그 전체 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 콘주게이트는, 예를 들어, 백신 건을 이용해서, 개체에 투여될 수 있는 입자 또는 비드에 복합화될 수 있다. 당업자는 생리적으로 허용 가능한 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체의 선택이, 예를 들어, 투여 경로에 의존함을 인지할 것이다.
콘주게이트는 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로에는 비경구 투여, 예컨대, 피내, 근육내 또는 피하 전달이 포함된다. 다른 경로에는 경구 투여, 비강내, 질내, 경피, 정맥내, 동맥내, 종양내, 복강내, 및 표피 경로가 포함된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 대상체에 정맥내, 동맥내, 또는 복강내 투여된다.
콘주게이트는 액체 조제물, 예컨대 현탁액, 시럽, 또는 엘릭서일 수 있다. 콘주게이트는 리포좀, 마이크로스피어, 또는 다른 중합체 매트릭스 내에 포함될 수 있다(예컨대, 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Felgner et al., U.S. 특허 번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. I to III (2nd ed. 1993)]에 기재된 방법에 의해). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있으며, 제조하고 투여하기가 비교적 단순한 무독성의, 생리적으로 허용 가능하고 대사 가능한 담체일 수 있다.
콘주게이트는 백신으로 이용될 수 있다. 백신은 전기천공을 통해, 예컨대 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 7,664,545에 기재된 방법에 의해 투여될 수 있다. 전기천공은 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 기재된 방법 및/또는 장치에 의할 수 있다. 전기천공은 최소 침습적 장치를 통해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 콘주게이트는 제어 방출 제형으로 투여된다. 콘주게이트는, 예를 들어, 순환 또는 종양 내로 방출될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 1주, 적어도 약 1.5주, 적어도 약 2주, 적어도 약 2.5주, 적어도 약 3.5주, 적어도 약 4주, 또는 적어도 약 1개월의 기간에 걸쳐 방출될 수 있다.
5. 검출
본원에서 이용되는 "검출하다" 또는 "존재를 결정하다"라는 용어는 표적에 결합된 하나 이상의 콘주게이트의 검출 불가능한, 낮은, 정상, 또는 높은 농도의 정성적 측정을 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적은 바이오마커일 수 있다. 검출에는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 검출이 포함될 수 있다. 검출에는 하나 이상의 콘주게이트 또는 표적의 부재 대비 하나 이상의 콘주게이트 또는 표적 존재의 검출이 포함될 수 있다. 검출에는 또한 하나 이상의 콘주게이트 또는 표적 수준 정량이 포함될 수 있다. "정량하다" 또는 "정량"이라는 용어는 상호 교환적으로 이용될 수 있고, 상대적이건 절대적이건, 물질(예컨대, 콘주게이트 또는 표적)의 양 또는 풍부도의 결정 방법을 나타낼 수 있다. 임의의 적합한 검출 방법이 본 개시의 일반 범위 내에 속한다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 검출을 위해 이에 부착된 리포터를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 리포터로 표지된다. 일부 구현예에서, 표적에 결합된 콘주게이트의 검출은 비제한적으로 웨스턴 블롯 상의 밴드 세기, 유세포 측정, 방사선 표지 조영, 세포 결합 검정, 활성 검정, SPR, 면역검정, 또는 당분야에 공지된 다양한 다른 방법을 포함하는 방법에 의해 결정될 수 있다.
콘주게이트가 표적 결합 및/또는 검출을 위한 항체를 포함하는 경우를 포함하는 일부 구현예에서, 임의의 면역검정이 이용될 수 있다. 면역검정은, 예를 들어, 효소-연관 면역검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 경쟁적 억제 검정, 예컨대 전방 또는 후방 경쟁적 억제 검정, 형광 분극 검정, 또는 경쟁적 결합 검정일 수 있다. ELISA는 샌드위치 ELISA일 수 있다. 표적에 대한 콘주게이트의 특이적인 면역학적 결합은 콘주게이트에 부착된 직접적 표지를 통해 또는 간접적 표지, 예컨대 알칼리성 포스파타제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제를 통해 검출될 수 있다. 고정화된 콘주게이트의 이용이 면역검정 내로 포함될 수 있다. 콘주게이트는 다양한 지지체, 예컨대 자기 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 검정 플레이트(예컨대 마이크로타이터 웰)의 표면, 고체 기재 물질의 절편 등 상에 고정화될 수 있다. 검정 스트립은 고체 지지체 상에 어레이로 콘주게이트 또는 복수의 콘주게이트를 코팅하여 제조될 수 있다. 이어서 상기 스트립은 평가 생물학적 샘플 내로 딥핑된 후 세척 및 검출 단계를 통해 신속히 처리되어 측정 가능한 신호, 예컨대 유색 스팟을 생성할 수 있다.
6. 방법
a. 약물 분자의 전달 방법
본 발명은 대상체에 대한 약물 분자의 전달 방법에 대한 것이다. 방법에는 대상체에 본원에 기재된 바와 같은 콘주게이트를 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 약물 분자 단독 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 개선된 특성을 가지며, 개선된 특성은, 예를 들어, 스텔스, 생체적합성, 용해도, 안정성, 반감기, 혈장 중 체류, 항원성, 면역원성, 단분산, 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 용이하게 합성된다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 용이하게 정제된다. 일부 구현예에서, 용이한 합성 및/또는 정제는 콘주게이트의 개선된 비용-효율성으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트, 또는 이의 폴리펩타이드는 유전적으로 인코딩되며, 이에 의해 정확한 분자량을 갖는 콘주게이트의 설계를 촉진한다. 일부 구현예에서, 콘주게이트의 분자량은 그 생체내 반감기를 결정하고/하거나 영향을 미친다. 콘주게이트의 분자량을 용이하고 정확하게 제어할 수 있는 것은 콘주게이트의 생체내 반감기 제어를 촉진할 수 있다. 대비되어, 합성 중합체, 예컨대 PEG의 분자량은 제어하기가 용이하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 항원성을 갖는다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는다.
b. 질환의 치료 방법
본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법에 대한 것이다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 콘주게이트의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 질환은, 예를 들어, 암, 대사 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 또는 정형외과 장애일 수 있다.
대사 질환은 체내의 비정상적 화학 반응이 정상 대사 과정을 변형시키는 경우 일어날 수 있다. 대사 질환에는, 예를 들어, 인슐린 내성, 비-알코올성 지방간 질환, 2형 당뇨병, 인슐린 내성 질환, 심혈관 질환, 죽상경화, 지질-관련 대사 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고지혈증, 및 글루코스 대사 장애가 포함될 수 있다.
자가면역 질환은 체내에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 비정상적 면역 반응으로부터 생긴다. 자가면역 질환에는, 비제한적으로, 루푸스, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 그레이브스병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 급성 류마티스열, 연쇄구균 감염 후 사구체신염, 결절다발 동맥염, 심근염, 건선, 셀리악병, 크론병, 궤양성 장염, 및 섬유근통이 포함될 수 있다.
심혈관 질환은 심장 또는 혈관이 관여되는 질환 클래스이다. 심혈관 질환에는, 예를 들어, 관상 동맥 질환(CAD), 예컨대 협심증 및 심근경색(심장 마비), 뇌졸중, 고혈압성 심장병, 류마티스성 심장병, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장병, 판막성 심장병, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 및 정맥 혈전증이 포함될 수 있다.
정형외과 장애 또는 근골격 장애는 신체 관절, 인대, 근육, 신경, 힘줄, 및 사지, 목, 및 등을 지지하는 구조에서의 부상 또는 통증이다. 정형외과 장애에는 통증을 유발하고 정상 활동을 손상시키는 변성 질환 및 염증성 상태가 포함될 수 있다. 정형외과 장애에는, 예를 들어, 손목 터널 증후군, 위관절융기염, 및 힘줄염이 포함될 수 있다.
암에는 비제한적으로 유방암, 결장직장암, 결장암, 폐암, 전립선암, 고환암, 뇌암, 피부암, 직장암, 위암, 식도암, 육종, 기관암, 두부경부암, 췌장암, 간암, 난소암, 림프모양 암, 자궁경부암, 외음부암, 흑색종, 중피종, 신장암, 방광암, 갑상선암, 뼈암, 암종, 육종, 및 연조직암이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 유방암이다.
c. 질환의 진단 방법
질환의 진단 방법이 본원에서 제공된다. 방법에는 본원에 기재된 바와 같은 콘주게이트를 대상체에 투여하는 단계, 및 표적에 대한 콘주게이트의 결합을 검출하여 대상체에서 표적의 존재를 결정하는 단계가 포함될 수 있다. 표적의 존재 또는 부재는 대상체에서 질환을 시사할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법에는 대상체로부터의 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 콘주게이트와 접촉시키는 단계, 샘플 내 표적 수준을 결정하는 단계, 및 샘플 내 표적 수준을 표적의 대조군 수준과 비교하는 단계가 포함될 수 있고, 대조군 수준과 상이한 표적 수준은 대상체에서 질환을 시사한다. 일부 구현예에서, 대조군 미만인 표적의 검출된 수준은 질환을 시사할 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 초과인 표적의 검출된 수준은 질환을 시사할 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 상기에 상세히 기재된 바와 같이 암, 대사 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 및 정형외과 장애로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적은 질환 마커 또는 바이오마커를 포함한다.
d. 표적 존재의 결정 방법
샘플 내 표적 존재의 결정 방법이 본원에서 제공된다. 방법에는 콘주게이트 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 콘주게이트와 접촉시키는 단계, 및 복합체의 존재를 검출하는 단계가 포함될 수 있다. 복합체의 존재는 샘플 내 표적을 시사할 수 있다. 표적은, 예를 들어, 단백질 또는 핵산일 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 수용체 또는 항원일 수 있다. 항원은, 예를 들어, 질환과 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘주게이트는 검출을 위한 리포터로 표지된다.
일부 구현예에서, 샘플은 대상체로부터 수득되며, 방법에는 대상체의 치료 유효성을 진단하는 단계, 예진하는 단계, 또는 평가하는 단계가 추가로 포함된다. 방법에 대상체의 치료 유효성을 평가하는 단계가 포함되는 경우, 방법에는 유효성을 개선하기 위해 필요에 따라 대상체의 치료를 변경하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
e. 치료 효과의 결정 방법
이를 필요로 하는 대상체에서 질환에 대한 치료 효과의 결정 방법이 본원에서 제공된다. 방법에는 콘주게이트 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 대상체로부터의 샘플을 본원에 상세히 기재된 바와 같은 콘주게이트와 접촉시키는 단계, 샘플 내 복합체 수준을 결정하는 단계로서, 복합체 수준은 샘플 내 표적 수준을 시사하는 단계, 및 샘플 내 표적 수준을 표적의 대조군 수준과 비교하는 단계가 포함될 수 있고, 표적 수준이 대조군 수준과 상이한 경우, 치료는 질환 치료에서 효과적이거나 비효과적인 것으로 결정된다.
시점에는 질환의 개시 전, 치료법의 투여 전, 치료법 투여 동안의 다양한 시점, 및 치료법이 종결된 후, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 대상체에 대한 콘주게이트의 투여 시, 콘주게이트는 표적에 결합할 수 있고, 표적의 존재 또는 부재는 다양한 시점에 대상체에서 질환의 존재를 시사한다. 일부 구현예에서, 표적은 질환 마커 또는 바이오마커를 포함한다. 다양한 시점에 표적에 대한 콘주게이트의 결합 비교는 질환이 진행했는지, 질환 단계가 진행했는지, 치료법이 질환을 치료하거나 예방하기 위해 작용하고 있는지, 또는 이의 조합을 시사할 수 있다.
일부 구현예에서, 대조군 수준은 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 또는 동안의 시점에 대상체에서의 수준에 해당하며, 샘플은 이후 시점에 대상체로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 샘플은 대상체가 치료를 받고 있는 기간 동안의 시점에 대상체로부터 취해지며, 대조군 수준은 무질환 수준 또는 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 시점에서의 수준에 해당한다. 일부 구현예에서, 방법에는 치료가 질환 치료에 비효과적인 것으로 결정되는 경우 대상체에 대한 치료를 변경하는 단계 또는 상이한 치료를 투여하는 단계가 추가로 포함된다.
7. 실시예
실시예 1
물질 및 방법
클로닝 . ZiPP에 대한 합성 유전자를 화학적으로 합성된 올리고머로부터 어셈블리하였다(IDT Inc.; Coralville, IA). 올리고머를 플라스미드 재구성 재귀적 방향성 결찰(Pre-RDL) 기법(McDaniel, J.R., et al. Biomacromolecules, 2010, 11, 944-952)을 이용하여 대장균에서 pET 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
역 전이 사이클링(ITC)에 의한 ZiPP의 발현 및 정제. ZiPP를 대장균에서 pET 발현 벡터로부터 발현시켰다. 수용액 중의 모든 ZiPP는 가역적인 역상 전이를 나타낸다. 이들은 이의 전이 온도(Tt)를 초과하여 가열되는 경우, 가용성 단백질에서 불용성 소수성 응집물로 진행한다. 동일한 현상(상 분리)이 또한 코스모트로픽 염을 이용하여 유발될 수 있다. ZiPP의 응집물은 이의 Tt 미만으로 냉각되면 또는 염이 용액으로부터 제거되는 경우 용액 내로 재용해시킬 수 있다. ZiPP의 이러한 열 반응성 특성은 단백질 정제를 위해 단순한 비-크로마토그래피 방법을 가능케 한다. 상기 정제 방법은 "역 전이 사이클링"(ITC)으로 불린다(Meyer, D.E. and A. Chilkoti. Nat. Biotech. 1999, 17, 1112-1115; MacEwan, S.R., et al. J. Vis . Exp. 2014, 88, e51583).
ITC에 의한 ZiPP의 전형적 정제에서, 1 L 배양물로부터의 대장균 세포를 원심분리에 의해 회수하고 저온 PBS 중에 재현탁한다. 이어서 세포를 4℃에서 초음파 분쇄에 의해 용해시킨다. 그 뒤 대장균 용해물을 15,000xg에서 원심분리하여 세포벽 및 다른 세포 파편을 제거한다. ZiPP는 세포 용해물의 가용성 분획(상청액)에 존재하는 가용성 단백질이다. 폴리에틸렌이민을 세포 용해물의 상청액에 첨가하고, 14,000xg에서 원심분리하여 DNA 및 임의의 잔여 박테리아 세포벽을 펠렛화한다. 이어서 ZiPP를 암모늄 설페이트 및 나트륨 클로라이드를 이용한 상 분리의 유발에 이어 4℃에서 15분 동안 15,000xg에서의 원심분리에 의해 상청액으로부터 정제한다. 이어서 펠렛을 저온 PBS 중에 재현탁하고, 임의의 불용성 물질을 10분 동안 4℃에서 원심분리 단계에 의해 제거한다. 이러한 단계를 균질해질 때까지 반복하고, 이는 SDS-PAGE 겔에서의 단일 밴드의 출현에 의해 확인한다. 분자량(MW)을 또한 Voyager DE-Pro MALDI-TOF(Applied Biosystems; Foster City, CA) 기기로 확인하였다. ZiPP의 구조화되지 않은 성질을 원형 이색성 기기(Aviv 202)로 확인하였다. 동물 실험을 위해, Detoxi-Gel(Thermo Scientific; Waltham, MA)을 이용하여 내독소를 제거한다.
생체내 약동학(PK) 연구. 상기 연구에서, ZiPP를 하전되지 않은 중합체 (VPGAG)120 및 (VPGAG)160와 비교하였다. 중합체를 N-말단에서 Alexa 488로 형광 표지하고, 꼬리 정맥 주사를 이용해서 Balb/c 마우스 내로 주사하였다. 유사한 성질을 갖지만 임의의 전하가 없는 생체중합체, VPGAG를 대조군으로 이용하여 나타난 약동학 파라미터에서의 임의의 변화가 VPX1X2G 모티프에 포함된 전하의 결과임을 나타낸다. 각각의 마우스는 i.v 또는 피하 주사된 단회 용량의 ZiPP 또는 대조군(150 mg/kg BW)을 수여받았다. 꼬리 정맥으로부터 주사 후 40초, 15분, 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 및 72시간에 혈액 샘플을 수집하였다(100 ㎕의 헤파린을 포함하는 튜브 내에 10 ㎕ 수집). 혈중 형광 표지된 중합체의 농도를 Alexa 488의 표준 곡선을 이용해서 계산하였다. 혈중 농도 시간-경과 데이터를 i.v. pk 데이터에 대해 표준 2구획 PK 모델로 분석하여 약동학 파라미터를 확인하였다.
파클리탁셀 ( PTX ) 콘주게이션 . 8개의 주기적으로 이격된 시스테인 잔기가 (VPGXG)16에 배열되고, x가 V 또는 C 1:1인 모티프를 ZiPP의 C-말단에 클로닝하였다. 약물 콘주게이션 절편은 여러 카피의 PTX가 콘주게이션되는 8개의 시스테인을 함유하였다. PTX의 첫 번째 2'OH를 레불린산으로 변경하였다(Etrych, T.S., et al. Molecular Pharmaceutics 2010, 7, 1015-1026). 상기 변경은 PTX의 세포독성을 보유한다. 이어서 활성화된 PTX를 ZiPP 상의 티올기와 반응하는 말단 말레이미드를 갖는 산-불안정형 하이드라지드 링커(N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH) 링커)를 이용해서 자유 티올에 콘주게이션하여 안정한 탄소-황 결합을 형성하였다(Andrew MacKay, J., et al. Nat. Mater. 2009, 8, 993-999).
ZiPP - PTX 약물 콘주게이션의 특성규명. 약물 콘주게이션의 순도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해서 평가하였다. HPLC 데이터를 PTX의 흡광도에 해당하는 228 ㎚의 흡광도에서의 피크 하 적분 면적을 이용해서 정량하였다. 약물 대 ZiPP의 콘주게이션 비를 질소 레이저(337 nm)가 장착된 Voyager DE-Pro MALDI-MS(Applied Biosystems; Foster City, CA) 기기의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행-시간 질량 분광측정(MALDI-TOF-MS)에 의해 결정하였다. 동적 광 산란(DLS) 기법을 수행하여 Dynapro 플레이트 판독기(Wyatt Technology; Santa Barbara, CA)를 이용해서 25℃ 및 25 μM 농도에서 ZiPP-PTX 나노입자의 수력학적 반지름(Rh)을 결정하였다. 데이터를 자동연관 함수의 정규 피팅으로 분석하고, 백분율 세기를 레일리(Raleigh) 구체 모델을 이용해서 질량 세기로 전환하였다. 이어서 정규 피팅을 이용해서 랜덤 코일에 대한 질량 백분율로 칭량되는 수력학적 반지름을 결정하였다. 회전 반지름을 PTX 콘주게이션 후 정적 광 산란(SLS)을 이용해서 계산하였다. 폼 팩터(ρ)를 Rg/Rh로 계산하였다.
ZiPP - PTX 콘주게이트의 시험관내 세포독성. 시험관내 세포독성을 MDA-MB-231 인간 삼중 음성 유방암 세포 상에서 수행하였다. Falcon™ 96-웰 세포 배양 플레이트(BD; Franklin Lakes, NJ)에서 배지 100 ㎕ 당 3x103 세포를 접종하였다. 세포가 16~18시간 동안 부착하도록 둔 후, 나노몰-미만 내지 높은-마이크로몰 범위 농도로 자유 PTX 및 ZiPP-PTX로 처리하였다. 72시간 약물 처리 후, 20 ㎕의 3-(4,5,-디메틸2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 시약(CellTiter 96 AQueous™ Promega; Madison, WI)을 각각의 웰에 첨가하고 추가 2시간 동안 인큐베이션하였다. 자유 약물 및 ZiPP-약물 콘주게이트에 대한 용량-반응 곡선을 Victor3 마이크로플레이트 판독기(Perkin Elmer; Waltham, MA)로 490 ㎚에서 각각의 웰의 흡광도를 측정하여 구축하였다. 50% 억제 농도, IC50을 다음 공식(Andrew MacKay, J., et al. Nat. Mater. 2009, 8, 993-999)에 대해 데이터를 피팅하여 결정하였다:
Figure pct00001
식 중, V는 세포의 생활성이고, Ctreatment는 약물 농도이고, p는 용량 반응 곡선의 기울기이다. 상기 IC50값을 이용해서 콘주게이트의 효능을 평가한다.
실시예 2
ZiPP의 발현 및 정제
ZiPP의 열 반응성 특성은 ITC를 이용한 단순한 비-크로마토그래피 정제를 가능케 하였다. 구리 염색된 SDS-PAGE 겔에서 단일 밴드의 출현은 산물의 순도를 확인시켜 주었다(도 2a). 2개의 상이한 ZiPP, (VPKEG)80(MW=44 kDa) 및 (VPREG)80(MW=42 kDa)을 도 7a에서 정제된 산물의 대표로 나타낸다. 50 kDa 래더를 겔에서 참조 MW로 표시하지만, SDS 겔에서 이용된 래더는 구형 단백질의 것이며, 따라서 구조화되지 않은 ZiPP와 직접 비교할 수 없다. 순도 및 MW를 확인하기 위해, MALDI-TOF에 의해 정제된 산물을 분석하였다. MALDI 스펙트럼은 (VPKEG)80에 대해 21 kDa 및 42 kDa(피크 1 및 2)의 m/z값 및 (VPREG)80에 대해 22 kDa 및 44 kDa(피크 3 및 4)의 m/z값에서 이온의 존재를 나타내었다(도 7b). MALDI 스펙트럼은 (VPKDG)120에 대해 20 kDa, 30 kDa, 및 60.5 kDa의 m/z값 및 (VPRDG)120에 대해 21 kDa 및 32 kDa 및 63.8 kDa의 m/z값에서 이온의 존재를 나타내어(도 2b), 정제된 ZiPP 구축물의 분자량을 확인시켜 주었다(각각 MW=60.5 kDa, MW=63.8 kDa). 본 발명자들은 또한 CD-스펙트럼에 의해 ZiPP의 내재적인 무질서화 성질을 확인하였다. 도 2d 및 도 7c 의 CD-스펙트럼은 낮은 파장에서 음의 타원율을 그리고 더 높은 파장에서 약간 양의 타원율을 나타내었으며, 이는 랜덤-코일의 특징으로, ELP와 같은 무질서화 구조에 전형적이며, 중합체의 구조화되지 않은 성질을 확인시켜 주었다. 수력학적 반지름을 동적 광 산란을 이용해서 측정하였고 ELP 대조군에 비해 잘 수화된 ZiPP를 나타내었다(도 2c). 원상태 PAGE 겔은 ZIPP가 알부민과 상호작용하지 않음을 나타내었다(도 2e).
실시예 3
생체내 약동학 연구
ZiPP의 약동학 파라미터를 결정하기 위해, 혈장 농도를 꼬리 정맥 주사 또는 피하 주사를 통해 마우스에서의 전신 투여 후 72시간의 기간에 걸쳐 추적하였다. 매칭되는 아미노산 길이를 갖는 하전되지 않은 중합체를 대조군으로 이용하였다. 실험 설계를 도 3a 및 도 4a에 나타낸다. 중합체를 Alexa488로 형광 표지하고 마우스 내로 주사하였다. 혈액 샘플을 최대 72시간까지의 다양한 시점에 수집하였다. ELP120(VPGAG)120을 길이 대조군으로 이용한 반면, ELP160(VPGAG)160을 분자량 대조군으로 이용하였다. 도 3b 및 도 4b는 주사 후 시간의 함수로서의 혈장 중합체 농도를 나타내며, 이는 쯔비터이온성 모티프(구체적으로 각각 X1 및 X2에 있어서 K, D, 및 E 포함)의 도입이 스텔스 특성을 부여하며, 이는 다시 하전되지 않은 ELP에 비해 중합체의 순환 시간을 증가시킴을 나타내었다. 주사 후 시간의 함수로서의 혈장 농도는 ZIPP가 ELP보다 우수하게 작용함을 나타내었다. 이들 중합체는 2구획 모델을 따랐으며, 이에 따라 상기 모델을 이용하여 반감기 및 곡선 하 면적을 계산하였다. 2구획 모델을 혈장 중합체 농도에 피팅시켰고, 이는 약동학적 파라미터인 곡선 하 면적(AUC)(도 3c 및 도 4c) 및 제거 반감기(도 3d)를 산출하였다. AUC를 실험의 시간 경과에 걸쳐 총 중합체 노출의 척도로서 계산하였다. AUC는 VPKEG 및 VPKDG가 하전되지 않은 ELP 길이 대조군뿐만 아니라 분자량 대조군에 비해 유의미하게 더 우수하게 작용함을 나타내었다. 데이터는 도 3c에 대해 평균±SE, n=5를 나타내며, 데이터는 도 4c에 대해 평균±SE, n=3~4를 나타낸다. ZiPP의 최종 반감기는 VPGAG 구축물의 반감기에 비해 6시간 증가하였다(도 3d). 또한, 가장 서술적인 약동학적 파라미터인, ZiPP에 대해 혈장 농도 곡선 하 면적(AUC)에 의해 측정된 중합체의 총 누적 혈액 노출은 하전되지 않은 폴리펩타이드인 동일 사슬 길이의 VPGAG의 노출에 비해 약 3배 더 높았다(도 3c). 결과는 펩타이드 중합체 내로의 쯔비터이온성 모티프 및 보다 구체적으로 하전된 잔기의 도입이 중합체의 약동학 개선에서 중요한 역할을 담당함을 나타내었다.
실시예 4
파클리탁셀 - ZiPP 콘주게이트의 특성규명
파클리탁셀(PTX)을 VPKEG 펜타펩타이드 단위의 120개 반복의 C-말단 트레일러에서 1:1의 비로 X-V 또는 C를 갖는 (VPGXG)16에 화학적으로 콘주게이션하였다. 파클리탁셀을 pH 감수성 링커를 통해 8개의 C-말단 잔기에 화학적으로 콘주게이션하였다. 설계를 도 5a에 나타낸다. 중합체 약물 콘주게이트를 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(MWCO: 10kDa; Millipore; Billerica, MA)을 이용하여 정제하고, 정제된 산물을 HPLC 상에 걸어 미반응 자유 약물의 부재를 확인하였다. HPLC 크로마토그램은 무시할 만한 양의 자유 약물을 포함하는 중합체-약물 콘주게이트의 순도를 확인시켜 주었다. 정제된 ZiPP-PTX 콘주게이트는 MALDI-TOF 스펙트럼을 이용해서 모체 ZiPP 중합체 사슬 및 ZiPP-PTX 콘주게이트 간에 계산된 MW 차이로 확인된 바와 같이 중합체 사슬 당 3.2~4개의 약물을 가졌다(도 5b). 또한, 동적 광 산란 측정은 PTX 콘주게이션 후, ZiPP가 실제로 58 ㎚의 수력학적 반지름(Rh)의 나노입자로 자발적으로 자가-어셈블리함을 시사하였다. 이들은 마이셀 당 26의 응집수로 58 ㎚ 반지름의 마이셀로 자가-어셈블리되었다. 폼 팩터(form factor, ρ)-Rg/Rh로 계산됨-는 0.82였으며, 이는 구형 마이셀의 형성을 표시한다.
실시예 5
ZiPP - PTX 콘주게이트의 시험관내 항-종양 유효성
Zipp-PTX의 시험관내 세포독성을 시간의 함수로서 농도 범위에 걸쳐 세포 생활성을 확인함으로써 측정하였다. MDA-MB-231, 인간 삼중 음성 유방암 세포주를 모델로 이용하였다. 약물 처리 72시간 후, MDA-MB-231 세포의 증식이 대조군(약물 없음)에 비해 억제되었다(도 5c). 또한, 억제는 자유 약물의 억제와 필적하였다. 자유 약물에 대한 IC50값은 2 nM 근처였던 반면, ZiPP-PTX에 대한 값은 12.4 nM였다(약물 측면의 농도). ZiPP-PTX에 대한 IC50값은 자유 약물에 대한 값보다 6배 높았으나, 이러한 결과는 자유 약물이 약물 수송체를 통해 세포 안팎으로 쉽게 확산할 수 있는 반면, 약물-중합체 콘주게이트로부터의 PTX는 이것이 엔도솜 내부에 있는 경우에만 방출되는 시험관내 환경에서 예상된다. 나노입자는 세포내이입을 통해 섭취되고 약물은 pH가 낮은 후기 엔도솜으로 나노입자가 이동한 후 방출되므로, 상기 과정은 느리다. 이러한 낮은 pH는 ZiPP로부터 PTX의 방출을 유발한다. 이러한 결과는 PTX-중합체 콘주게이트가 생체내 플랫폼으로 취하기에 충분히 안정하고 강력함을 이들이 시사하므로 고무적이다. IC50값은 세포 생활성을 50% 감소시킨 약물의 농도를 나타내었다.
실시예 6
ZiPP - Tn3 콘주게이트
다가 스캐폴드 단백질(Tn3)은 TNF-관련 아폽토시스-포함 리간드 수용체 2(TRAIL2)의 수퍼작용제이며, ZiPP에 부착될 단백질로 선정되었다. 융합 단백질의 설계 개요를 도 6a에 나타낸다. TRAIL2의 수퍼작용제는 TRAILR2의 활성화가 다양한 인간 암에서 아폽토시스를 유도할 수 있고, 이에 따라 암 치료제를 위한 잠재력을 가지므로 선택되었다. (Tn3)6은 단량체 Tn3 단위의 6개 일렬로 반복을 나타내며, 이는 MedImmune에 의해 높은 친화도로 TRAIL2에 결합하도록 조작되었다. 다양한 길이의 ZiPP를 갖는 (Tn3)6을 대장균에서 재조합적으로 발현시켰다. 친화도 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석을 도 6b에 나타낸다. Colo205(결장암 세포)에 대한 세포독성 검정은 융합 단백질이 고도로 세포독성이며, 이의 효능이 도 6c에 나타낸 바와 같이, 자유 단백질(ZIPP가 부착되지 않은 (Tn3)6)에 필적함을 나타내었다. IC50값은 세포 생활성을 50% 감소시킨 약물의 농도를 나타내었다.
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특정 양태의 상기 설명은 다른 이들이 당분야의 지식을 적용함으로써, 본 개시의 일반 개념에서 벗어나지 않고, 과도한 실험 없이, 이러한 구체 양태의 다양한 적용을 위해 쉽게 변경하고/하거나 적응할 수 있도록 본 발명의 일반 성질을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 변경은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기반하여, 개시된 양태의 의미 및 균등 범위 내인 것으로 의도된다. 본원에서의 어법 또는 용법은 본 명세서의 용법 또는 어법이 교시 및 지침의 견지에서 당업자에 의해 해석되도록 하는 설명의 목적을 위한 것이며 제한을 위한 것이 아님이 이해되어야 한다.
본 개시의 폭 및 범위는 임의의 상술된 예시적 양태에 의해 제한되어서는 안되며, 첨부되는 청구범위 및 이의 균등부에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원, 및/또는 다른 문헌은 각각의 개별 공보, 특허, 특허 출원, 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위한 참조로 포함됨을 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 포함된다.
완전성의 이유로, 본 발명의 다양한 양태를 다음의 번호를 매긴 항으로 나타낸다:
항 1. (a) 하나 이상의 하전된 모티프를 포함하는 폴리펩타이드로서, 각각의 하전된 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 1(VPX1X2G)로 구성되는 아미노산 서열을 가지며, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산인 폴리펩타이드; 및 (b) 폴리펩타이드에 부착된 하나 이상의 약물 분자를 포함하는 콘주게이트.
항 2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 복수의 하전된 모티프를 포함하는 콘주게이트.
항 3. 제2항에 있어서, 복수의 하전된 모티프가 일렬로 반복되는 콘주게이트.
항 4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 하나 이상의 하전되지 않은 모티프를 추가로 포함하며, 각각의 하전되지 않은 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 3(VPGXG)으로 구성되고, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 아미노산 서열을 갖는 콘주게이트.
항 5. 제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 복수의 하전되지 않은 모티프를 포함하는 콘주게이트.
항 6. 제5항에 있어서, 복수의 하전되지 않은 모티프가 일렬로 반복되는 콘주게이트.
항 7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 하전되지 않은 모티프가 폴리펩타이드의 적어도 2개의 인접한 하전된 모티프 사이에 배치되는 콘주게이트.
항 8. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 9. 제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 4(VPGXG)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 10. 제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 5(VPX1X2G)n(VPGXG)m의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 11. 제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 6(VPGXG)m(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 12. 제4항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 7{(VPX1X2G)(VPGXG)}b의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 음으로 하전된 아미노산이고, X2가 양으로 하전된 아미노산인 콘주게이트.
항 14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 양으로 하전된 아미노산이고, X2가 음으로 하전된 아미노산인 콘주게이트.
항 15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 음으로 하전된 아미노산이 글루타메이트산 및 아스파르트산으로부터 독립적으로 선택되는 콘주게이트.
항 16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 양으로 하전된 아미노산이 라이신 및 아르기닌으로부터 독립적으로 선택되는 콘주게이트.
항 17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 콘주게이트.
항 18. 제17항에 있어서, X가 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로부터 선택되는 콘주게이트.
항 19. 제18항에 있어서, X가 글리신 및 발린으로부터 선택되는 콘주게이트.
항 20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 링커를 추가로 포함하는 콘주게이트.
항 21. 제20항에 있어서, 링커가 하나 이상의 시스테인을 포함하는 콘주게이트.
항 22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 링커가 SEQ ID NO: (GGC), SEQ ID NO: ((GGC)8), SEQ ID NO: ((G4S)3), 및 SEQ ID NO: ((VPGXG)16, 식 중 X는 1:1의 비로 존재하는 발린 또는 시스테인임)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 콘주게이트.
항 23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 폴리펩타이드 의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 모두에 배치되는 콘주게이트.
항 24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약물 분자가 링커를 통해 폴리펩타이드에 부착되는 콘주게이트.
항 25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 링커 내의 티올 반응기를 통해 폴리펩타이드에 부착되는 콘주게이트.
항 26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약물 분자가 소분자, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 및 이의 조합으로부터 선택되는 콘주게이트.
항 27. 제26항에 있어서, 약물 분자가 소분자를 포함하는 콘주게이트.
항 28. 제26항에 있어서, 약물 분자가 단백질을 포함하는 콘주게이트.
항 29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 암 치료제를 포함하는 콘주게이트.
항 30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 항체를 포함하는 콘주게이트.
항 31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 파클리탁셀을 포함하는 콘주게이트.
항 32. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 Tn3(TRAIL 수퍼작용제)을 포함하는 콘주게이트.
항 33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트가 대상체에 대한 투여를 위해 제조되는 콘주게이트.
항 34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트의 폴리펩타이드가 재조합적으로 발현되는 콘주게이트.
항 35. 제28항에 있어서, 콘주게이트가 재조합적으로 발현되는 콘주게이트.
항 36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 포함하는 조성물.
항 37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
항 38. 제28항의 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
항 39. 제37항 또는 제38항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
항 40. 대상체에 대한 약물 분자의 전달 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
항 41. 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
항 42. 샘플 내 표적 존재의 결정 방법으로서, 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 샘플을 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 및 복합체의 존재를 검출하는 단계로서, 복합체의 존재는 샘플 내 표적을 시사하는 단계를 포함하는 방법.
항 43. 제42항에 있어서, 샘플이 대상체로부터 수득되며, 방법이 대상체의 질환을 진단하는 단계, 예진하는 단계, 또는 치료 유효성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
항 44. 제43항에 있어서, 방법이 대상체의 치료 유효성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 경우, 방법이 유효성을 개선하기 위해 필요에 따라 대상체의 치료를 변경하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
항 45. 대상체에서 질환의 진단 방법으로서, 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 샘플 내 표적 수준을 결정하는 단계로서, 복합체 수준은 샘플 내 표적 수준을 시사하는 단계; 및 샘플 내 표적 수준을 표적의 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 상이한 표적 수준은 대상체에서 질환을 시사하는 단계를 포함하는 방법.
항 46. 제45항에 있어서, 대조군 수준은 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 또는 동안의 시점에 대상체에서의 수준에 해당하며, 샘플은 이후 시점에 대상체로부터 취해지는 방법.
항 47. 제45항에 있어서, 샘플은 대상체가 치료를 받고 있는 기간 동안의 시점에 대상체로부터 취해지며, 대조군 수준은 무질환 수준 또는 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 시점에서의 수준에 해당하는 방법.
항 48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 치료가 질환 치료에서 비효과적인 것으로 결정되는 경우, 대상체에 대한 치료를 변경하는 단계 또는 상이한 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
항 49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트가 리포터로 표지되는 방법.
항 50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트가 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 종양내로 대상체에 투여되는 방법.
항 51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 항원성을 갖는 방법.
항 52. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 콘주게이트가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는 방법.
항 53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암, 대사 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 및 정형외과 장애로부터 선택되는 방법.
항 54. 제53항에 있어서, 질환이 암을 포함하는 방법.
항 55. 제54항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 결장암, 폐암, 전립선암, 고환암, 뇌암, 피부암, 직장암, 위암, 식도암, 육종, 기관암, 두부경부암, 췌장암, 간암, 난소암, 림프모양 암, 자궁경부암, 외음부암, 흑색종, 중피종, 신장암, 방광암, 갑상선암, 뼈암, 암종, 육종, 및 연조직암으로부터 선택되는 방법.
항 56. 제55항에 있어서, 암이 유방암을 포함하는 방법.
서열
SEQ ID NO: 1
VPX1X2G, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이다.
SEQ ID NO: 2
(VPX1X2G)n, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, n은 1 이상의 정수이다.
SEQ ID NO: 3
VPGXG, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다.
SEQ ID NO: 4
(VPGXG)n, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n은 1 이상의 정수이다.
SEQ ID NO: 5
(VPX1X2G)n(VPGXG)m, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수이다.
SEQ ID NO: 6
(VPGXG)m(VPX1X2G)n, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수이다.
SEQ ID NO: 7
{(VPX1X2G)(VPGXG)}b, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수이다.
SEQ ID NO: 8
GGC
SEQ ID NO: 9
(GGC)8
SEQ ID NO: 10
(G4S)3
SEQ ID NO: 11
((VPGXG)16, 식 중 X는 1:1의 비로 존재하는 발린 또는 시스테인이다.
SEQ ID NO: 12
예시적 폴리펩타이드
V P K D G V P K D G V P K D G V P K D G V P K D G
SEQ ID NO: 13
예시적 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
GTC CCG aaa gac GGT GTT CCG aag gac GGC GTG CCT aaa gat GGT GTT CCG aag gac GGG GTG CCA aaa gat GGG
SEQUENCE LISTING <110> DUKE UNIVERSITY <120> GENETICALLY ENCODED INTRINSICALLY DISORDERED STEALTH POLYMERS FOR DELIVERY AND METHODS OF USING SAME <130> 028193-9241-WO00 <140> PCT/US2016/045655 <141> 2016-08-04 <150> 62/200,726 <151> 2015-08-04 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> other negatively or positively charged amino acid <400> 1 Val Pro Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> other negatively or positively charged amino acid <400> 2 Val Pro Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> any amino acid except proline <400> 3 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> any amino acid except proline <400> 4 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> other negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> any amino acid except proline <400> 5 Val Pro Xaa Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> any amino acid except proline <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> other negatively or positively charged amino acid <400> 6 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Xaa Xaa Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> other negatively or positively charged amino acid <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> any amino acid except proline <400> 7 Val Pro Xaa Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Gly Gly Cys 1 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> valine or cysteine present in a ratio of 1:1 <400> 11 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Val Pro Lys Asp Gly Val Pro Lys Asp Gly Val Pro Lys Asp Gly Val 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gly Val Pro Lys Asp Gly 20 25 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 gtcccgaaag acggtgttcc gaaggacggc gtgcctaaag atggtgttcc gaaggacggg 60 gtgccaaaag atggg 75

Claims (56)

  1. (a) 하나 이상의 하전된 모티프를 포함하는 폴리펩타이드로서, 각각의 하전된 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 1(VPX1X2G)로 구성되는 아미노산 서열을 갖고, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산인 폴리펩타이드; 및
    (b) 리펩타이드에 부착된 하나 이상의 약물 분자를 포함하는 콘주게이트.
  2. 제1항에 있어서,
    폴리펩타이드가 복수의 하전된 모티프를 포함하는 콘주게이트.
  3. 제2항에 있어서,
    복수의 하전된 모티프가 일렬로 반복되는 콘주게이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩타이드가 하나 이상의 하전되지 않은 모티프를 추가로 포함하며, 각각의 하전되지 않은 모티프는 독립적으로 SEQ ID NO: 3(VPGXG)으로 구성되는 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 서열을 갖는 콘주게이트.
  5. 제4항에 있어서,
    폴리펩타이드가 복수의 하전되지 않은 모티프를 포함하는 콘주게이트.
  6. 제5항에 있어서,
    복수의 하전되지 않은 모티프가 일렬로 반복되는 콘주게이트.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 하전되지 않은 모티프가 폴리펩타이드의 적어도 2개의 인접한 하전된 모티프 사이에 배치되는 콘주게이트.
  8. 제1항에 있어서,
    폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
  9. 제4항에 있어서,
    폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 4(VPGXG)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n은 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
  10. 제4항에 있어서,
    폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 5(VPX1X2G)n(VPGXG)m의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
  11. 제4항에 있어서,
    폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 6(VPGXG)m(VPX1X2G)n의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, n 및 m은 독립적으로 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
  12. 제4항에 있어서,
    폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 7{(VPX1X2G)(VPGXG)}b의 아미노산 서열로서, 식 중 X1은 음으로 또는 양으로 하전된 아미노산이며, X2는 음으로 또는 양으로 하전된 다른 아미노산이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, b는 1 이상의 정수인 서열을 포함하는 콘주게이트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1이 음으로 하전된 아미노산이고, X2가 양으로 하전된 아미노산인 콘주게이트.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1이 양으로 하전된 아미노산이고, X2가 음으로 하전된 아미노산인 콘주게이트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    음으로 하전된 아미노산이 독립적으로 글루타메이트산 및 아스파르트산으로부터 선택되는 콘주게이트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    양으로 하전된 아미노산이 독립적으로 라이신 및 아르기닌으로부터 선택되는 콘주게이트.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 콘주게이트.
  18. 제17항에 있어서,
    X가 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로부터 선택되는 콘주게이트.
  19. 제18항에 있어서,
    X가 글리신 및 발린으로부터 선택되는 콘주게이트.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩타이드가 링커를 추가로 포함하는 콘주게이트.
  21. 제20항에 있어서,
    링커가 하나 이상의 시스테인을 포함하는 콘주게이트.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    링커가 SEQ ID NO: (GGC), SEQ ID NO: ((GGC)8), SEQ ID NO: ((G4S)3), 및 SEQ ID NO: ((VPGXG)16, 식 중 X는 1:1의 비로 존재하는 발린 또는 시스테인임)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 콘주게이트.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커가 폴리펩타이드의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 모두에 배치되는 콘주게이트.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 약물 분자가 링커를 통해 폴리펩타이드에 부착되는 콘주게이트.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분자가 링커 내의 티올 반응기를 통해 폴리펩타이드에 부착되는 콘주게이트.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 약물 분자가 소분자, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 및 이의 조합으로부터 선택되는 콘주게이트.
  27. 제26항에 있어서,
    약물 분자가 소분자를 포함하는 콘주게이트.
  28. 제26항에 있어서,
    약물 분자가 단백질을 포함하는 콘주게이트.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분자가 암 치료제를 포함하는 콘주게이트.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분자가 항체를 포함하는 콘주게이트.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분자가 파클리탁셀을 포함하는 콘주게이트.
  32. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분자가 Tn3(TRAIL 수퍼작용제)을 포함하는 콘주게이트.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트가 대상체에 대한 투여를 위해 제조되는 콘주게이트.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트의 폴리펩타이드가 재조합적으로 발현되는 콘주게이트.
  35. 제28항에 있어서,
    콘주게이트가 재조합적으로 발현되는 콘주게이트.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 포함하는 조성물.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  38. 제28항의 콘주게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  39. 제37항 또는 제38항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  40. 대상체에 대한 약물 분자의 전달 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 샘플 내 표적 존재의 결정 방법으로서, 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 샘플을 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 및 복합체의 존재를 검출하는 단계로서, 복합체의 존재는 샘플 내 표적을 시사하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    샘플이 대상체로부터 수득되며, 방법이 대상체의 질환을 진단하는 단계, 예진하는 단계 또는 치료 유효성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    방법이 대상체의 치료 유효성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 경우, 방법이 유효성을 개선하기 위해 필요에 따라 대상체의 치료를 변경하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 대상체에서 질환의 진단 방법으로서, 약물 분자 및 샘플 내 표적 간에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건 하에 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 콘주게이트와 접촉시키는 단계; 샘플 내 표적 수준을 결정하는 단계로서, 복합체 수준은 샘플 내 표적 수준을 시사하는 단계; 및 샘플 내 표적 수준을 표적의 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 상이한 표적 수준은 대상체에서 질환을 시사하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    대조군 수준은 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 또는 동안의 시점에 대상체에서의 수준에 해당하며, 샘플은 이후 시점에 대상체로부터 취해지는 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    샘플은 대상체가 치료를 받고 있는 기간 동안의 시점에 대상체로부터 취해지며, 대조군 수준은 무질환 수준 또는 대상체가 치료를 시작한 기간 이전 시점에서의 수준에 해당하는 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 질환 치료에서 비효과적인 것으로 결정되는 경우, 방법이 대상체에 대한 치료를 변경하는 단계 또는 상이한 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트가 리포터로 표지되는 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트가 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 종양내로 대상체에 투여되는 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 항원성을 갖는 방법.
  52. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘주게이트가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘주게이션된 약물 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는 방법.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환이 암, 대사 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 및 정형외과 장애로부터 선택되는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    질환이 암을 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    암이 유방암, 결장직장암, 결장암, 폐암, 전립선암, 고환암, 뇌암, 피부암, 직장암, 위암, 식도암, 육종, 기관암, 두부경부암, 췌장암, 간암, 난소암, 림프모양 암, 자궁경부암, 외음부암, 흑색종, 중피종, 신장암, 방광암, 갑상선암, 뼈암, 암종, 육종, 및 연조직암으로부터 선택되는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    암이 유방암을 포함하는 방법.
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