KR20170116456A - Novel Bacillus sonorensis strain capable of producing exopolysaccharide and use of exopolysaccharide - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 다양한 기능성을 가진 세포외다당류(exopolysaccharide)의 생산능이 우수하다. 본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주로부터 생산된 세포외다당류(exopolysaccharide)는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품 또는 식품 분야에서 증점제, 유화 안정화제 또는 프리바이오틱스 등으로 사용될 수 있다.The novel Bacillus sonorensis strain according to the present invention is excellent in the ability to produce extracellular polysaccharides having various functions. The exopolysaccharide produced from the novel Bacillus sonorensis strain according to the present invention has various functionalities such as adhesiveness, emulsion stabilization activity, lactic acid bacterial growth promoting activity or pathogen growth inhibiting activity, A thickener, an emulsion stabilizer or a prebiotics.
Description
본 발명은 세포외다당류를 생산하는 신규 소노렌시스 균주 및 세포외다당류의 다양한 용도에 관한 것이다.The present invention relates to various uses of novel sonolenesis strains and extracellular polysaccharides for producing extracellular polysaccharides.
미생물 유래 다당류는 미생물 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 발효 중에 축적된다. 이 중 미생물의 1차 또는 2차 대사산물을 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)라고 한다(Kim DJ et al., 2001). 미생물로부터 생산되는 다당류는 긴 사슬(long-chain) 및 고분자(high-molecularmass)의 특성을 가진 폴리머로 텍스처라이저(texturizers), 증점제(viscosifiers), 유화제(emulsifiers), 필름 형성능 등의 다양한 기능을 보유하며 식품 공업에서 오래전부터 사용되어 왔으며, 최근 혈당조절 효과, 자외선 차단효과(Bae JT et al., 2005), 항산화 효과(Asker MMS et al., 2009; Wang J et al., 2007), 항균성 및 면역 강화 효과(Kolodzieja H et al., 2007) 등 건강에 유익한 효과의 연구보고에 따라 식품 및 제약산업 등 넓은 범위에서 활용 가능한 기능성 소재로서 그 중요성이 점점 증가하고 있다(Shivakumar S et al,. 2006). 또한 이렇게 미생물이 생산하는 세포외다당류는 배지의 구성성분 및 배양 조건 등을 개선함에 따라 그 생산성을 크게 높일 수 있다고 보고되고 있다(Vijayendra SVN et al., 2008). 그러나, 현재 산업적으로 상용화되어 있는 기능성 다당류의 대부분은 주로 버섯과 같은 곰팡이류(fungi)에서 많이 생산되는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 예로 차가버섯(Inonotus obliquus) 등과 같은 고등균사체 버섯에 의해서 생산되는 베타 글루칸(β-glucan)이 있다. 이러한 베타 글루칸은 최근 여러 연구로부터 항암(Cha JY et al., 2004), 항산화(Cui Y et al., 2005), 항고지혈증 및 혈당조절(Kim MA et al., 2009) 등을 지닌 것으로 알려짐에 따라 큰 주목을 받고 있다. 그러나 버섯과 같은 곰팡이류는 세균 (bacteria)에 비하여 성장속도가 느리고 배양특성상 상대적으로 대량 배양이 어려우며, 또한 세포외다당류의 생산량이 많지 않은 단점을 지니고 있다.The microbial polysaccharide is a part of the cell wall of the microorganism and forms a thin membrane around the cell wall or accumulates as a viscous form outside the cell wall during fermentation. The primary or secondary metabolites of these microorganisms are called exopolysaccharides (EPS) (Kim DJ et al., 2001). Polysaccharides produced from microorganisms are polymers with long-chain and high-molecular mass properties and have various functions such as texturizers, viscosifiers, emulsifiers and film forming ability. (Wang J et al., 2007), antimicrobial activity and antioxidative effects (Bae JT et al., 2005) and antioxidant effect (Asker MMS et al., 2009; The importance of health-promoting effects has been increasing as a functional material that can be used in a wide range of food and pharmaceutical industries (Shivakumar S et al., 2007), including immunosuppressive effects (Kolodzieja H et al., 2007) ). In addition, the extracellular polysaccharides produced by these microorganisms have been reported to be able to significantly increase their productivity as they improve the constituents of the medium and culture conditions (Vijayendra SVN et al., 2008). However, most of the functional polysaccharides currently commercialized in the industry are known to be produced mainly from fungi such as mushrooms. Typical examples include beta-glucan (beta-glucan) produced by higher mycelia such as Inonotus obliquus -glucan). These beta-glucans are known to have anti-cancer (Cha JY et al., 2004), antioxidant (Cui Y et al., 2005), anti-hyperlipemia and blood glucose control (Kim MA et al., 2009) It is receiving great attention. However, fungi such as mushroom have a disadvantage in that they are slower in growth rate than bacteria, are relatively difficult to cultivate in a large amount, and produce less extracellular polysaccharides.
한편, 식품으로부터 분리된 균주로부터 생산된 세포외다당류에 대한 연구는 발효유제품으로부터 분리된 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.) 등과 특히 김치로부터 분리된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weissella sp.) 등과 같은 유산균으로부터 생산된 세포외다당류가 있으나, 그 수가 많지 않으며 또한 각 미생물이 생산하는 세포외다당류의 기능성 입증에 대한 연구 또한 적은 것으로 알려져 있다. 따라서 기능성을 보유한 세포외다당류를 고효율로 생산하는 균주를 발굴하고, 균주 및 균주로부터 생성되는 세포외다당류의 기능성을 입증함으로써 차후 기능성을 보유한 발효 식품을 위해 적용 가능한 균주의 발굴의 필요성이 있다.On the other hand, studies on extracellular polysaccharides produced from strains isolated from foods have been conducted on Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp. There are a number of extracellular polysaccharides produced from lactic acid bacteria such as Leuconostoc sp. And Weissella sp. Separated from kimchi. However, the number of extracellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria is low, and the functional verifiability of extracellular polysaccharides produced by each microorganism Is also known to have little research. Therefore, there is a need to find a strain capable of producing a highly functional extracellular polysaccharide with high efficiency, and to prove the functionality of the extracellular polysaccharide produced from the strain and the strain, and to find an applicable strain for a fermented food having a future function.
세포외다당류를 생산하는 균주와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1420355호에는 막걸리로부터 분리되고, 췌장 베타 세포의 증식 및 췌장세포의 사멸억제 활성을 갖는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) M76균주(기탁번호: KACC91683P)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0481678호에는 세포외 다당류를 분비하는 자이로디니움 임푸디쿰(Gyrodinium impudicum) KG03 균주(KCTC 10325BP)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0808956호에는 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지고, 위 및 장에서 생존 가능하며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 김치아이 GJ2 균주(Leuconostoc kimchii GJ2)(KCTC 10921BP). 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1569043호에는 수탁번호 KCCM11308P의 바실러스 서브틸리스 J-92 (Bacillus subtilis J-92) 균주로서, 글루코오스 대신에 수크로오스(Sucrose), 프럭토오스(Fructose) 또는 라피노오스(Raffinose)를 2%(w/w) 함유하는 MRS 배지에서 30℃로 24시간 동안 배양시 각각 98.05 mg/ml, 53.15 mg/ml 또는 70.41 mg/ml의 세포외다당류 (exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 된장 유래의 균주가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1523205호에는 김치에서 분리되고, 세포외다당류(EPS) 생산능을 가진 기탁번호 KCCM11309P의 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18(Pediococcus pentosaceus KFT-18) 균주로서, 기질 당으로 람노오스 또는 수크로오스를 포함한 고체배지에서만 세포외다당류를 생성하는 콜로니를 형성하는 균주가 개시되어 있다.Extracellular in relation to the strains producing the polysaccharide Republic of Korea Patent No. 10-1420355 discloses separated from rice wine, when the CD rakti Phedi O Rhodococcus having a pancreatic beta cell proliferation, and apoptosis inhibitory activity of the pancreatic cells of (Pediococcus acidilactici ) M76 strain (Accession No .: KACC91683P). Korean Patent Registration No. 10-0481678 discloses Gyrodinium impudicum KG03 strain (KCTC 10325BP) which secretes an extracellular polysaccharide. Also, Korean Patent Registration No. 10-0808956 discloses a method for producing an exopolysaccharide which is isolated from kimchi, has resistance to artificial gastric juice and artificial bile, is viable in the stomach and intestines, A child GJ2 strain ( Leuconostoc kimchii GJ2) (KCTC 10921BP). Korean Patent Registration No. 10-1569043 also discloses that Bacillus subtilis J-92 strain No. KCCM 11308P is used as a strain instead of glucose in the presence of sucrose, fructose or raffinose When cultured in MRS medium containing 2% (w / w) of Raffinose at 30 ° C for 24 hours, exopolysaccharide (EPS) of 98.05 mg / ml, 53.15 mg / ml or 70.41 mg / A strain derived from soybean is produced. Korean Patent Publication No. 10-1523205 discloses that Pediococcus KFT-18 of Accession No. KCCM 11309P, which is isolated from kimchi and has the ability to produce extracellular polysaccharide (EPS) pentosaceus KFT-18), a strain that forms a colony that produces extracellular polysaccharide only in a solid medium containing rhamnose or sucrose per substrate.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산능이 우수한 신규 균주를 제공하는데에 있다.The present invention has been made under the background of the prior art, and an object of the present invention is to provide a novel strain excellent in the ability to produce an extracellular polysaccharide having various functions.
또한, 본 발명의 일 목적은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류 및 이를 높은 수준으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데에 있다.It is also an object of the present invention to provide an extracellular polysaccharide having various functions and a method for producing the extracellular polysaccharide at a high level.
또한, 본 발명의 일 목적은 세포외다당류의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.It is also an object of the present invention to provide various uses of extracellular polysaccharides.
본 발명의 발명자들은 간장으로부터 다양한 바실러스속 균주들을 스크링하였고, 소정의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주가 다양한 기능성을 가진 세포외다당류를 높은 수준으로 생산한다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The present inventors scribed various strains of Bacillus sp. From the liver and confirmed that a predetermined strain of Bacillus sonorensis produces a high level of extracellular polysaccharide having various functions and completed the present invention Respectively.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 세포외다당류 생산능을 가진 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, an example of the present invention provides a Bacillus sonorensis strain having the ability to produce an extracellular polysaccharide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as 16S rDNA.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 제공한다.In order to achieve the above object, there is provided an extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned Bacillus sonorensis strain of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함하는 세포외다당류의 생산방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a Bacillus subtilis strain, comprising the steps of: inoculating and culturing the aforementioned Bacillus sonorensis strain on a culture medium to obtain a culture; And separating the extracellular polysaccharide from the culture. The present invention also provides a method for producing an extracellular polysaccharide.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 증점제를 제공한다.In order to achieve the above object, an example of the present invention provides a thickener comprising an extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned Bacillus sonorensis strain.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 유화 안정화제를 제공한다.In order to achieve the above object, an example of the present invention provides an emulsion stabilizer comprising an extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned strain of Bacillus sonorensis .
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 프리바이오틱스를 제공한다.In order to achieve the above object, an example of the present invention provides a prebiotics comprising an extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned Bacillus sonorensis strain.
본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 다양한 기능성을 가진 세포외다당류(exopolysaccharide)의 생산능이 우수하다. 본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주로부터 생산된 세포외다당류(exopolysaccharide)는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품, 식품 또는 화장품 분야에서 증점제, 유화 안정화제 또는 프리바이오틱스 등으로 사용될 수 있다.The novel Bacillus sonorensis strain according to the present invention is excellent in the ability to produce extracellular polysaccharides having various functions. The exopolysaccharide produced from the novel Bacillus sonorensis strain according to the present invention has various functions such as adhesiveness, emulsion stabilization activity, lactic acid bacterial growth promoting activity or pathogen growth inhibiting activity, In the field of cosmetics, thickeners, emulsion stabilizers or prebiotics.
도 1은 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 점착성 외관을 나타낸 사진이다.
도 2는 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 3은 TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 배양된 MJM60135 균주의 형태를 나타낸 것이고, 도 4는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양된 MJM60135 균주의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 5는 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 산 가수분해물을 TLC 방법으로 분석한 결과이다.
도 7은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS을 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 분석한 결과물이다.
도 8은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 톨루엔 및 자일렌 내에서의 유화 활성을 측정한 결과이다.
도 9는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 유산균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 10은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 병원균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.Fig. 1 is a photograph showing the sticky appearance of candidate strains derived from liver and producing extracellular polysaccharide (exopolysaccharide).
Figure 2 shows the exopolysaccharide productivity of candidate strains derived from liver and producing extracellular polysaccharides.
FIG. 3 shows the morphology of MJM60135 strain cultured on TSA (tryptic soy agar) medium, and FIG. 4 shows the exopolysaccharide productivity of MJM60135 strain cultured in TSB (tryptic soy broth) medium.
Figure 5 shows the phylogenetic tree of the strain MJM60135.
FIG. 6 is a result of TAC analysis of acid hydrolyzate of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135.
FIG. 7 is a result of analysis of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 by FT-IR spectroscopy.
8 shows the results of measuring the emulsifying activity of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 in toluene and xylene.
9 is a Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) and the EPS produced from MJM60135 strain is a graph showing the effect on the growth of lactic acid bacteria, Figure 10 is the growth of the EPS the pathogen produced from Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 strain On the other hand.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산능이 우수한 신규 균주에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a novel strain having excellent ability to produce an extracellular polysaccharide having various functions.
본 발명의 일 예에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 세포외다당류 생산능을 가진다. 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 바람직하게는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P)이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 바람직하게는 간장에서 유래한다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 pH는 4.5~9, 바람직하게는 5.5~8이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 온도는 15~50℃, 바람직하게는 30~40℃ 이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 배지로는 TSA(Tryptic soy agar) 배지, NA(Nutrient agar) 배지, MRS 한천(MRS agar) 배지, LB 한천(Luria-Bertani agar) 배지 또는 최소 영양 배지(효모 추출물, 펩톤 및 무기염류로 이루어짐)가 있다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 그람 양성 균주이고, 막대(rod) 형상을 가진다.The novel Bacillus sonorensis strain according to an embodiment of the present invention is a 16S rDNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having extracellular polysaccharide production ability. The Bacillus sonorensis strain is preferably Bacillus sonorensis MJM60135 (accession number: KACC 92109P). In addition, the Bacillus sonorensis strain is preferably derived from liver. In addition, the pH suitable for the growth of the Bacillus sonorensis strain is 4.5 to 9, preferably 5.5 to 8. The temperature suitable for the growth of the Bacillus sonorensis strain is 15 to 50 ° C, preferably 30 to 40 ° C. As a medium suitable for the growth of the Bacillus sonorensis strain, TSA (Tryptic soy agar) medium, NA (nutrient agar) medium, MRS agar medium, Luria-Bertani agar medium, Medium or minimal nutrient medium (consisting of yeast extract, peptone and inorganic salts). In addition, the Bacillus sonorensis strain is a gram-positive strain and has a rod shape.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 세포외다당류는 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된다. 상기 세포외다당류는 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 글루코스(glucose) 또는 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하고, 바람직하게는 만노스(mannose), 글루코스(glucose) 및 갈락토스(galactose)를 포함한다. 또한, 상기 세포외다당류는 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함한다.One aspect of the invention relates to extracellular polysaccharides having various functionalities. The extracellular polysaccharide according to an example of the present invention is produced by the above-mentioned novel Bacillus sonorensis strain. The extracellular polysaccharide is composed of mannose and glucose or mannose and galactose as constituent monosaccharides and preferably includes mannose, glucose and galactose. do. In addition, the extracellular polysaccharide includes a carboxyl group and a hydroxyl group as a functional group.
상기 세포외다당류는 비독성 및 비항원성을 가지기 때문에 의약품 분야, 식품 첨가제 분야 등에서 안정하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 세포외다당류는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성 등과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품 분야, 식품 분야 또는 화장품 분야에서 유용한 소재로 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 유산균 성장 또는 병원균 성장은 유산균 증식 또는 병원균 증식과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 세포외다당류에 의해 성장이 촉진되는 유산균의 종류로는 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토바실러스 퍼텐툼(Lactobacillus fermentum) 등이 있으며, 여기에 반드시 한정되지 않는다. 또한, 상기 세포외다당류에 의해 성장이 억제되는 병원균의 종류로는 대장균 K99(E. coli K99), 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨(Salmonella enterica serovar . typhimurium) 등이 있으며, 여기에 반드시 한정되지 않는다.Since the extracellular polysaccharide has non-toxic and non-toxic properties, it can be used stably in the fields of medicine and food additives. In addition, the extracellular polysaccharide can be used as a useful material in the field of medicine, food, or cosmetics because it has various functionalities such as tackiness, emulsion stabilization activity, lactic acid bacterial growth promoting activity, or pathogen growth inhibiting activity. In the present invention, the lactic acid bacteria growth or pathogen growth can be mixed with lactic acid bacteria growth or pathogen growth. Examples of the type of lactic acid bacteria in which growth is promoted by the extracellular polysaccharide include Lactobacillus plantarum subsp . Plantarum , Lactobacillus plantarum , Enterococcus mutansus, durans), and the like Kasei Lactobacillus (Lactobacillus casei), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) or Lactobacillus buffer tentum (Lactobacillus fermentum), not necessarily limited to it. Examples of the pathogenic microorganisms whose growth is inhibited by the extracellular polysaccharide include Escherichia coli K99 ( E. coli K99), salmonella enterica serovar variant typhimurium ( Salmonella enterica serovar . typhimurium , and the like, but are not necessarily limited thereto.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 세포외다당류의 생산방법은 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 배지는 TSB(tryptic soy broth) 배지, MRS 배지 또는 LB(Luria-Bertani) 배지 등에서 선택될 수 있고, 세포외다당류의 생산성을 고려할 때 TSB(tryptic soy broth) 배지인 것이 바람직하다. 또한, 상기 배양 온도는 30~40℃인 것이 바람직하고, 세포외다당류의 생산성 및 경제성을 고려할 때 35~40℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 배양 시간은 24~72 hr인 것이 바람직하고, 세포외다당류의 생산성 및 경제성을 고려할 때 36~60 hr인 것이 더 바람직하다.One aspect of the invention relates to a method of producing an extracellular polysaccharide having various functionalities. The method for producing an extracellular polysaccharide according to an embodiment of the present invention comprises the steps of: inoculating and culturing the above-mentioned strain of Bacillus sonorensis in a culture medium to obtain a culture; And separating the extracellular polysaccharide from the culture. The medium may be selected from TSB (tryptic soy broth) medium, MRS medium or LB (Luria-Bertani) medium, and TSB (tryptic soy broth) medium in consideration of productivity of extracellular polysaccharide. In addition, the incubation temperature is preferably 30 to 40 DEG C, and more preferably 35 to 40 DEG C in view of the productivity and economical efficiency of the extracellular polysaccharide. In addition, the incubation time is preferably 24 to 72 hr, and more preferably 36 to 60 hr in view of productivity and economical efficiency of the extracellular polysaccharide.
상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 (a) 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고 제1 상등액을 얻는 단계; (b) 상기 제1 상등액을 저급 알코올(탄소 수가 1~5임) 또는 함수 저급 알코올(탄소 수가 1~5임)과 혼합하여 침전물을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 침전물이 형성된 제1 상등액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계로 구성될 수 있다. 상기 저급 알코올로는 바람직하게는 에탄올, 부탄올 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 바람직하게는 상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에 상기 제1 상등액을 탈색 및/또는 탈단백질화 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 바람직하게는 상기 (a) 단계, (b) 단계 및 (c) 단계 외에 (d) 상기 침전물을 물에 용해시키고 원심분리하여 제2 상등액을 수득하는 단계; 및 (e) 제2 상등액을 농축하고 고형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 상등액의 농축 방법으로는 멤브레인 여과, 투석 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 농축된 제2 상등액의 고형화 방법으로는 스프레이 드라이, 동결건조 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.Separating the extracellular polysaccharide from the culture comprises: (a) centrifuging the culture to remove cells and obtaining a first supernatant; (b) mixing the first supernatant with a lower alcohol (having 1 to 5 carbon atoms) or a lower alcohol (having 1 to 5 carbon atoms) to form a precipitate; And (c) centrifuging the first supernatant liquid on which the precipitate is formed to obtain a precipitate. As the lower alcohol, ethanol, butanol, etc. may be preferably used. In addition, the step of separating the extracellular polysaccharide from the culture may further include a step of decolorizing and / or deprotecting the first supernatant between steps (a) and (b). In addition, the step of separating the extracellular polysaccharide from the culture is preferably carried out by dissolving the precipitate in water and centrifuging to obtain a second supernatant liquid in addition to the steps (a), (b) and (c) ; And (e) concentrating and solidifying the second supernatant. As the method of concentrating the second supernatant, membrane filtration, dialysis, etc. may be used, but the present invention is not limited thereto. In addition, as the method of solidifying the concentrated second supernatant, spray drying, freeze drying, etc. may be used, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일 측면은 세포외다당류의 다양한 용도이다. 예를 들어, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 점착성을 가지기 때문에 증점제(thickening agent)로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 세포외다당류는 치약, 크림, 연고, 로션 등과 같이 의약품, 화장품, 식품 분야에서 증점제로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 증점제는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 카르복시메틸셀룰로스와 같은 다른 공지의 증점 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.One aspect of the invention is the diverse uses of extracellular polysaccharides. For example, the extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned novel strain of Bacillus sonorensis can be used as a thickening agent because it has stickiness. Specifically, the extracellular polysaccharide of the present invention can be used as a thickening agent in medicine, cosmetics, and food such as toothpaste, cream, ointment, lotion and the like. The thickener according to an exemplary embodiment of the present invention may be provided in the form of a composition containing other known thickening substances such as carboxymethyl cellulose in addition to extracellular polysaccharides produced by Bacillus sonorensis strain.
또한, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 유화 안정화 활성을 가지기 때문에 유화 안정화제로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 세포외다당류는 에멀젼 형태의 의약품 제형, 연구 분야에서 사용되는 피콜(ficoll)의 대용품, 에멀젼 형태의 화장품 제형 등과 같이 의약품, 화장품, 식품 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유화 안정화제는 유제와 물이 공존하는 계에서 유화 형성에 도움을 주거나 형성된 유화의 안정화에 도움을 주는 성분을 말한다. 상기 유제로는 톨루엔, 자일렌과 같은 탄화수소 등이 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 예에 따른 유화 안정화제는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 왁스, 지방산 알코올 등과 같은 다른 공지의 유화 안정화 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.In addition, the extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned novel strain of Bacillus sonorensis can be used as an emulsion stabilizer since it has an emulsion stabilizing activity. Specifically, the extracellular polysaccharide of the present invention can be used in medicines, cosmetics, foodstuffs such as pharmaceutical formulations in emulsion form, substitute for ficoll used in the field of research, cosmetic formulations in emulsion form, and the like. In the present invention, the emulsion stabilizer refers to a component that helps stabilize emulsification or stabilizes the formed emulsion in a system in which emulsion and water coexist. The emulsions include, but are not necessarily limited to, hydrocarbons such as toluene and xylene. The emulsion stabilizer according to an exemplary embodiment of the present invention may be provided in the form of a composition including an extracellular polysaccharide produced by a strain of Bacillus sonorensis as well as other known emulsion stabilizing substances such as wax, .
또한, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성을 가지기 때문에 프리바이오틱스(Prebiotics)로 사용될 수 있다. 상기 프리바이오틱스는 장내 유익한 박테리아(예를 들어 유산균)의 생장을 돕는 난소화성 성분으로서 프로바이오틱스(probiotics)의 영양원이 되어 장내 환경을 개선하는데 도움을 주는 물질을 말한다. 식품 성분이 프리바이오틱스의 조건을 갖추려면 위장관의 상부에서 소화 또는 흡수되지 않아야 하고 대장 내 미생물 중 비피도박테리아와 같은 유용 세균을 선택적으로 활성화시키고 병원균 등의 유해균은 억제할 수 있어야 한다. 본 발명의 일 예에 따른 프리바이오틱스는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 라피노오스, 대두올리고당, 프럭토올리고당, 갈락토올리고당 등의 올리고당류와 기타 락툴로오스(lactulose), 락티톨(lac- titol), 자일리톨(xylitol) 등과 같은 공지의 프리바이오틱 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.In addition, the extracellular polysaccharide produced by the above-mentioned Bacillus sonorensis strain can be used as prebiotics because it has lactic acid bacteria growth promoting activity or pathogen growth inhibiting activity. The prebiotics are substances that are an indigestible ingredient that helps grow bacteria (for example, lactic acid bacteria) beneficial in the intestines and serve as nutrients for probiotics to help improve the intestinal environment. In order for the food composition to have the conditions of prebiotics, it should not be digested or absorbed from the upper part of the gastrointestinal tract, and it should selectively activate useful bacteria such as bifidobacteria in the intestinal microorganisms and inhibit harmful bacteria such as pathogens. In addition to the extracellular polysaccharide produced by the Bacillus sonorensis strain, the prebiotics according to an exemplary embodiment of the present invention may include oligosaccharides such as raffinose, soy oligosaccharide, fructooligosaccharide, and galactooligosaccharide, May also be provided in the form of a composition comprising a known prebiotic substance such as lactulose, lac-titol, xylitol and the like.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following examples are intended to clearly illustrate the technical features of the present invention and do not limit the scope of protection of the present invention.
1. 세포외다당류(1. Extracellular polysaccharides ( exopolysaccharideexopolysaccharide )를 생산하는 균주의 분리 및 동정Isolation and Identification of Strain Producing
(1) 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 후보 균주의 분리(1) Isolation of candidate strains producing exopolysaccharide (EPS)
간장 샘플을 순차적으로 희석하고, 희석된 간장 현탁액을 TSA(tryptic soy agar) 배지에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 구별되는 형태를 보이는 콜로니들을 선택하고, TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 계대배양 하였다. 점착성 외관과 배양물의 끈적끈적함을 육안으로 판단하고 총 37개의 후보 균주를 분리하였다. 이중 점착성 외관을 보이는 총 9개의 후보 균주를 선별하고 추가적인 연구를 진행하였다.Soy samples were sequentially diluted and the diluted soy sauce suspension was plated on TSA (tryptic soy agar) medium and cultured at 37 ° C for 2 days. Colonies showing distinctive shapes were selected and subcultured on TSA (tryptic soy agar) medium. The viscous appearance and the stickiness of the culture were judged visually and a total of 37 candidate strains were isolated. A total of 9 candidate strains showing double sticky appearance were selected and further studies were conducted.
세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주는 콜로니의 점착성 외관에 기초하여 선별하였다. 점착성 외관을 보이는 총 9개의 후보 균주 콜로니들를 선택하고, TSA(tryptic soy agar) 배지 상에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 계대배양 하였다. 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 총 9개의 후보 균주를 EPS 생산 바실러스속 균주 1 내지 EPS 생산 바실러스속 균주 9로 명명하고, 이를 EPSB1 내지 EBSB9로 약칭하였다. 도 1은 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 점착성 외관을 나타낸 사진이다. 도 1에서 "A"는 EPSB1 후보 균주의 외관이고 "B"는 EPSB2 후보 균주의 외관이고 "C"는 EPSB3 후보 균주의 외관이고 "D"는 EPSB4 후보 균주의 외관이고 "E"는 EPSB5 후보 균주의 외관이고 "F"는 EPSB6 후보 균주의 외관이고 "G"는 EPSB7 후보 균주의 외관이고 "H"는 EPSB8 후보 균주의 외관이고 "I"는 EPSB9 후보 균주의 외관이다.Candidate strains producing extracellular polysaccharides were screened based on the sticky appearance of the colonies. A total of nine candidate strain colonies showing viscous appearance were selected, plated on TSA (tryptic soy agar) medium, and subcultured for 2 days at 37 ° C. Nine candidate strains producing exopolysaccharide were named EPS-producing Bacillus sp. 1 to EPS-producing Bacillus sp. 9, abbreviated EPSB1 to EBSB9. Fig. 1 is a photograph showing the sticky appearance of candidate strains derived from liver and producing extracellular polysaccharide (exopolysaccharide). In Figure 1, "A" is the appearance of the EPSB1 candidate strain, "B" is the appearance of the EPSB2 candidate strain, "C" is the appearance of the EPSB3 candidate strain, "D" is the appearance of the EPSB4 candidate strain, "E" is the EPSB5 candidate strain "F" is the appearance of the EPSB6 candidate strain, "G" is the appearance of the EPSB7 candidate strain, "H" is the appearance of the EPSB8 candidate strain, and "I" is the appearance of the EPSB9 candidate strain.
(2) 최종 균주의 선별(2) Selection of the final strain
선별한 바실러스속 후보 균주들을 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종하고 37℃에서 2일 동안 진탕배양 하였다. 이후 배양액을 5000×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 이후, 상등액을 10분 동안 끓여 효소를 실활시켰다. 이후 상등액을 40℃의 수조 안에서 활성탄으로 30분 동안 처리하여 탈색시키고, [Wang, Yuan, Wang, Zhang, Yang & Xu, 2007]의 방법에 의거하여 탈단백질화 시켰다. 이후, 탈단백질화된 상등액을 5000×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 4배 부피의 95% 에탄올 수용액과 혼합한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이후, 혼합물을 8000×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 펠렛을 수거하고, 수거한 펠렛을 멸균 증류수에 용해시켰다. 이후, 펠렛 용액을 3000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 24 hr 동안 투석하여 세포외다당류(exopolysaccharide, 이하 'EPS'라 함) 농축액을 수득하였다. 이후, EPS 농축액을 동결건조하여 고형의 EPS를 수득하고 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. 바실러스속 후보 균주들의 배양액 내 EPS 함량을 글루코스를 표준품으로 사용한 페놀-황산 방법(phenol-sulfuric acid method; Masuko, Minami, Iwasaki, Majima, Nishimura & Lee, 2005)으로 측정하였다.The selected Bacillus subtilis strains were inoculated into TSB (tryptic soy broth) medium and cultured at 37 ° C for 2 days with shaking. Then, the culture was centrifuged at 5000 xg for 10 minutes to remove the cells. The supernatant was then boiled for 10 minutes to inactivate the enzyme. The supernatant was decolorized by treatment with activated charcoal in a water bath at 40 ° C for 30 minutes, and deproteinized according to the method of Wang, Yuan, Wang, Zhang, Yang & Xu, 2007. The deproteinized supernatant was then centrifuged at 5000 xg for 10 minutes to remove precipitates, mixed with 4 volumes of 95% ethanol solution, and left overnight at 4 ° C. The mixture was then centrifuged at 8000 x g for 10 minutes to collect the precipitated pellet, and the collected pellet was dissolved in sterile distilled water. Thereafter, the pellet solution was centrifuged at 3000 x g for 10 minutes, and the supernatant was dialyzed for 24 hours to obtain an extracellular polysaccharide (EPS) concentrate. The EPS concentrate was then lyophilized to obtain solid EPS, which was stored at 4 < 0 > C until use. The EPS content of cultured Bacillus subtilis strains was measured by the phenol-sulfuric acid method (Masuko, Minami, Iwasaki, Majima, Nishimura & Lee, 2005) using glucose as a standard.
도 2는 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 EPSB6 균주는 가장 높은 EPS 생산성(8.4±0.8 g/L)을 보였고, EPSB9 균주의 경우 7.0±0.76 g/L, EPSB5 균주의 경우 5.6±0.4 g/L, EPSB1의 경우 4.0±1.1 g/L의 EPS 생산성을 보였다. 한편, EPSB8 균주 및 EPSB4 균주의 경우 낮은 EPS 생산성(2.3±0.34 g/L)을 보였다. 가장 높은 EPS 생산성을 보인 EPSB6 균주를 ECUM(the Extract collection of useful microorganisms) library에 "MJM60135"로 기탁하였다. 이후, EPSB6 균주는 MJM60135 균주로 언급한다. 도 3은 TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 배양된 MJM60135 균주의 형태를 나타낸 것이고, 도 4는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양된 MJM60135 균주의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the exopolysaccharide productivity of candidate strains derived from liver and producing extracellular polysaccharides. As shown in FIG. 2, the EPSB6 strain showed the highest EPS productivity (8.4 ± 0.8 g / L), 7.0 ± 0.76 g / L for EPSB9 strain, 5.6 ± 0.4 g / L for EPSB5 strain, 4.0 And an EPS productivity of ± 1.1 g / L. On the other hand, EPSB8 strain and EPSB4 strain showed low EPS productivity (2.3 ± 0.34 g / L). EPSB6 strain, which showed the highest EPS productivity, was deposited as "MJM60135" in the ECUM (Extract collection of useful microorganisms) library. Hereinafter, the EPSB6 strain is referred to as MJM60135 strain. FIG. 3 shows the morphology of MJM60135 strain cultured on TSA (tryptic soy agar) medium, and FIG. 4 shows the exopolysaccharide productivity of MJM60135 strain cultured in TSB (tryptic soy broth) medium.
(3) MJM60135 균주의 동정(3) Identification of strain MJM60135
최종 선별된 MJM60135 균주에 대해 계통학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 먼저, 유전체 DNA 분리 키트(genomic DNA isolation kit; GeneALL, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 제조자의 사용설명서에 따라 균주의 유전체 DNA를 분리하였다. 이후, 균주의 16S rDNA을 증폭시키기 위해 순방향 프라이머인 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머인 1492R(5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 솔젠트사(SolGent sequencing company, Republic of Korea)에 의뢰하여 균주의 전장에 가까운 부분 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 이때, 프라이머로 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')를 사용하였다. 그 결과, MJM60135 균주의 16S rDNA는 서열번호 1의 연속 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 이후, MJM60135 균주의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GeneBank nucleotide database와 비교하고, MEGA 6 소프트웨어(Tamura et al. 2013)를 이용하여 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 완성하였다.Phylogenetic analysis was performed on the finally selected MJM60135 strain. First, the genomic DNA of the strain was isolated according to the manufacturer's instructions using a genomic DNA isolation kit (GeneALL, Seoul, Republic of Korea). PCR was then performed using forward primer 27F ((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') and reverse primer 1492R (5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3') to amplify 16S rDNA of the strain. (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') and 785F (5'-GGATTAGATACCCTGGTA (SEQ ID NO: 2)) as a primer were analyzed by using SolGent sequencing company (Republic of Korea) The 16S rDNA sequence of the MJM60135 strain was compared with the GeneBank nucleotide database using the BLAST program, and the 16S rDNA sequence of the MJM60135 strain was compared with the GeneBank nucleotide database using the BLAST program , And
도 5는 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 MJM60135 균주의 염기서열은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) NBRC 101234T의 16S rDNA와 99% 이상의 상동성을 보였다. 이를 통해 MJM60135 균주의 종을 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis)로 확정하였다.Figure 5 shows the phylogenetic tree of the strain MJM60135. As shown in FIG. 5, the nucleotide sequence of MJM60135 showed 99% or more homology with 16S rDNA of Bacillus sonorensis NBRC 101234T. The species of MJM60135 strain was identified as Bacillus sonorensis .
(4) 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주의 수탁 정보(4) Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) Depositary information of MJM60135 strain
본 발명의 발명자들은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주를 2015년 12월 1일에 공인기탁기관인 국립농업과학원 농업미생물은행(주소 : 대한민국 전라북도 전주시 완산구 농생명로 370 )에 특허기탁 신청하여 수탁번호 KACC 92109를 부여받았다.The inventors of the present invention applied Bacillus sonorensis strain MJM60135 on December 1, 2015 to the National Institute of Agricultural Science and Technology (National Institute of Agricultural Science and Technology, Agricultural Biotechnology Bank, Jeonju, Korea) KACC 92109 was awarded.
2. 2. 바실러스Bacillus 소노렌시스( Sonorenisis ( Bacillus Bacillus sonorensissonorensis ) ) MJM60135MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 특성 분석 Characterization of EPS produced from strain
(1) EPS의 구성 성분 분석(1) Analysis of constituents of EPS
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS 분말 10㎎을 6M 농도의 TFA(trifluoroacetic acid) 용액과 100℃에서 6hr 동안 반응시켜 가수분해하였다. 이후, 회전식 감압 증발기를 이용하여 가수분해 용액에 존재하는 TFA(trifluoroacetic acid)를 제거하고 15M 농도의 암모니아 용액 0.32㎖를 첨가하여 중화시켰다. 또한, 단당류 표준품에 대해서도 위에서와 같이 6M 농도의 TFA(trifluoroacetic acid) 용액으로 처리하고 암모니아 용액으로 중화시켰다. 이후, EPS 가수분해물을 TLC(thin layer chromatography)로 분석하여 EPS를 구성하는 단당류를 결정하였다. 구체적으로 EPS 가수분해물을 실리카겔 60 TLC 플레이트(Merck) 상에서 에틸아세테이트:n-프로판올:아세트산:물의 부피비가 4:2:2:1인 이동상으로 전개하여 분리하였다. 분리된 당들을 오르시놀-황산 분무 시약으로 가시화하였다.10 mg of the EPS powder produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 was hydrolyzed by reacting with 6M TFA (trifluoroacetic acid) solution at 100 ° C for 6 hours. Then, TFA (trifluoroacetic acid) present in the hydrolysis solution was removed using a rotary vacuum evaporator, and 0.32 ml of a 15M ammonia solution was added to neutralize the solution. Also, the monosaccharide standard product was treated with a 6M TFA (trifluoroacetic acid) solution and neutralized with an ammonia solution as described above. The EPS hydrolyzate was analyzed by thin layer chromatography (TLC) to determine the monosaccharide constituting EPS. Specifically, the EPS hydrolyzate was developed on a
도 6은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 산 가수분해물을 TLC 방법으로 분석한 결과이다. 도 6에서 "GM"은 갈락토만난(Galactomannan)을 나타내고, "EPS"는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS를 나타낸다. 도 6에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 구성 단당류로 만노스 및 글루코스 또는 만노스 및 갈락토스 또는 만노스, 글루코스 및 갈락토스가 검출되었다.FIG. 6 is a result of TAC analysis of acid hydrolyzate of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135. In Fig. 6, "GM" represents galactomannan and "EPS " represents EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135. As shown in FIG. 6, mannose and glucose or mannose and galactose or mannose, glucose and galactose were detected as constituent monosaccharides of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135.
(2) EPS에 존재하는 관능기 분석(2) Analysis of functional groups present in EPS
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS에 존재하는 관능기를 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 결정하였다. 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS 분말을 분광분석법 등급의 KBr과 혼합하고 1㎫의 압력으로 처리하여 펠렛 형태의 시편을 제조하였다. 이후, 펠렛 시편은 직경이 약 10㎜ 이고 두께가 약 1㎜ 이었다. 구체적으로 Varian 2000 FTIR spectrometer (Varian, Inc., USA)를 사용하여 4000~400 ㎝-1 파장수 범위에서 FT-IR 분광분석 데이터를 기록하였다. Functional groups present in EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 were determined by FT-IR spectroscopy. A pellet-shaped specimen was prepared by mixing EPS powder produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 with KBr spectroscopic grade and treating it at a pressure of 1 MPa. Thereafter, the pellet specimen had a diameter of about 10 mm and a thickness of about 1 mm. Specifically, FT-IR spectroscopic data were recorded using a
도 7은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS을 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 분석한 결과물이다. 도 7의 FT-IR 스펙트럼에서 3420 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 OH stretch에 해당하고 2920 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 CH stretch에 해당한다. 1000~1200 ㎝-1 사이에 위치하는 C-O-C 및 C-O의 넓은 stretch는 탄수화물에 해당한다. 1366 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 COO-의 C=O strecth 및 COO-의 C-O 결합에 할당될 수 있다(Wang, Ahmed, Feng, Li & Song, 2008). 도 7에서 보이는 EPS의 FT-IR 스펙트럼으로부터 EPS에 2가 양이온의 결합 부위로 작용할 수 있는 카르복실기가 존재한다는 것을 알 수 있다. 또한, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS에는 카르복실기 및 하이드록실기가 존재하는데, 상기 관능기들은 고분자 전해질(polyelectrolyte)에서 관찰되는 과정과 유사한 응집 과정을 위해 선호되는 관능기이다(Wang, Ahmed, Feng, Li & Song, 2008).FIG. 7 is a result of analysis of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 by FT-IR spectroscopy. The peak located at 3420 cm -1 wavelength corresponds to OH stretch and the peak located at 2920 cm -1 wavelength corresponds to CH stretch in the FT-IR spectrum of FIG. 7. The broad stretch of COC and CO located between 1000 and 1200 cm -1 corresponds to carbohydrates. The peak located at 1366 cm -1 wavelength can be assigned to C = O strecth of COO- and CO bonds of COO- (Wang, Ahmed, Feng, Li & Song, 2008). From the FT-IR spectrum of the EPS as shown in FIG. 7, it can be seen that there is a carboxyl group that can act as a binding site for divalent cations in the EPS. In addition, EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 has a carboxyl group and a hydroxyl group, which are preferred functional groups for flocculation processes similar to those observed in polyelectrolyte (Wang , Ahmed, Feng, Li & Song, 2008).
(3) EPS의 유화 활성 분석(3) Analysis of emulsifying activity of EPS
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 유화 활성을 분석하기 위해 [Fusconi, Maria Nascimento Assuncao, de Moura Guimaraes, Rodrigues Filho & Eduardo da Hora Machado, 2010)에 의거하여 유화 시험(Emulsification assay)을 수행하였다. 구체적으로 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주를 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종하고 37℃에서 1일 동안 진탕배양 하였다. 이후 배양액을 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 이후, 테스트 튜브 안에서 상등액 3㎖ 및 이와 동일 부피의 탄화수소 화합물(톨루엔 또는 o-자일렌)을 혼합하였다. 이후 테스트 튜브를 2분 동안 볼텍스(vortex) 한 후 24℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 배양 완료 후 24 hr가 경과되었을 때 유화 활성을 검사하고, 유화 지수(emulsification index, E24)는 다음과 같은 식으로 계산하였다.In order to analyze the emulsifying activity of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 , an emulsification assay was conducted according to Fusconi, Maria Nascimento Assuncao, de Moura Guimaraes, Rodrigues Filho and Eduardo da Hora Machado, ) Were performed. Inoculated in particular Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) the strain MJM60135 TSB (tryptic soy broth) medium and cultured with shaking for 1 day at 37 ℃. The culture was then centrifuged and the supernatant was collected. Then, 3 ml of the supernatant and the same volume of hydrocarbon compound (toluene or o-xylene) were mixed in the test tube. The test tube was then vortexed for 2 minutes and then incubated at 24 < 0 > C for 24 hours. The emulsification index (E 24 ) was calculated by the following equation.
한편 양성 대조군으로 EPS 대신 Triton X-100(10% in TSB)을 사용하고 동일한 방법으로 유화 활성을 검사하였다. 또한, 대조군(Control)으로 EPS 대신 증류수를 사용하고 동일한 방법으로 유화 활성을 검사하였다.On the other hand, Triton X-100 (10% in TSB) was used instead of EPS as a positive control, and emulsification activity was examined by the same method. In addition, emulsion activity was examined by the same method using distilled water instead of EPS as a control (control).
도 8은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 톨루엔 및 자일렌 내에서의 유화 활성을 측정한 결과이다. 도 8에서 "Control"은 대조군을 나타내고, "TX-100"은 양성 대조군을 나타낸다. 도 8에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 유화 지수는 톨루엔 내에서 60%에 가까웠다. 따라서, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 천연 유화 안정화제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.8 shows the results of measuring the emulsifying activity of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 in toluene and xylene. In Fig. 8, "Control" represents a control group and "TX-100" represents a positive control group. Emulsifying index of the EPS production from Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 strains as shown in Figure 8 was close to 60% in toluene. Therefore, EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 is expected to be used as a natural emulsion stabilizer.
(4) EPS의 프리바이오틱스 특성 분석(4) Analysis of prebiotics characteristics of EPS
락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 퍼텐툼(Lactobacillus fermentum)과 같은 유산균들의 성장에 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 미치는 영향을 평가하였다. 구체적으로 글루코스가 1% 함유된 MRS 액체 배지 또는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 MRS 액체 배지에 유산균을 접종하고 37℃에서 배양하면서 배양 시간에 따른 배양액의 흡광도로 측정하여 유산균의 성장 수준을 평가하였다. Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum subsp . of lactic acid bacteria, such as plantarum), Lactobacillus Planta Room (Lactobacillus plantarum), Enterococcus two Lance (Enterococcus durans), Lactobacillus Kasei (Lactobacillus casei), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) and Lactobacillus spread tentum (Lactobacillus fermentum) The effect of EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 on growth was evaluated. While particular glucose is inoculated with the lactic acid bacteria in 1% of the contained MRS broth or Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) the EPS produced from MJM60135 strain containing 1% MRS broth and incubated at 37 ℃ of culture medium according to the culture time And the growth level of the lactic acid bacteria was evaluated by measuring the absorbance.
또한, 대장균 K99(E. coli K99) 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨(Salmonella enterica serovar . typhimurium)과 같은 병원균들의 성장에 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 미치는 영향을 평가하였다. 구체적으로 글루코스가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지 또는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에 병원균을 접종하고 37℃에서 배양하면서 배양 시간에 따른 배양액의 흡광도로 측정하여 병원균의 성장 수준을 평가하였다.In addition, Escherichia coli K99 ( E. coli K99) and salmonella enterica serovar variant typhimurium ( Salmonella enterica serovar . typhimurium), and to evaluate its effects on the EPS produced from Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 strain on the growth of pathogens such. Specifically,
도 9는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 유산균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 10은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 병원균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 9의 (a)는 글루코스가 1% 함유된 MRS 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이고, 도 9의 (b)는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 MRS 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이다. 또한, 도 10의 (c)는 글루코스가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이고, 도 10의 (d)는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이다. 도 9 및 도 10에서 그래프의 X 좌표는 배양 시간(hr)이고, 그래프의 Y 좌표는 600㎚ 파장에서의 흡광도 값이다. 도 9 및 도 10에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 유산균의 성장을 지지하는 반면 병원균의 성장을 억제하였다. 따라서, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 프리바이오틱 소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.9 is a Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) and the EPS produced from MJM60135 strain is a graph showing the effect on the growth of lactic acid bacteria, Figure 10 is the growth of the EPS the pathogen produced from Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 strain On the other hand. Of Figure 9 (a) is a the EPS containing 1% glucose (b) of 1 and the results at the time when using the MRS liquid medium containing%, 9 is produced from Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 strain This is the result when MRS liquid medium is used. 10 (c) shows the results when LB (Luria-Bertani) liquid medium containing 1% glucose was used, and FIG. 10 (d) shows the results obtained from the strain Bacillus sonorensis MJM60135 (Luria-Bertani) liquid medium containing 1% of EPS. 9 and 10, the X-coordinate of the graph is the incubation time (hr), and the Y-coordinate of the graph is the absorbance value at a wavelength of 600 nm. 9 and Bacillus Sono alkylene System, EPS produced from (Bacillus sonorensis) MJM60135 strains as shown in Figure 10 inhibited the growth of pathogens, while supporting the growth of lactic acid bacteria. Therefore, EPS produced from Bacillus sonorensis strain MJM60135 is expected to be used as a prebiotic material.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. Therefore, the scope of the present invention should be construed as including all embodiments falling within the scope of the appended claims.
<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Novel Bacillus sonorensis strain capable of producing exopolysaccharide and use of exopolysaccharide <130> DP-16-213 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1475 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Bacillus sonorensis MJM60135 <400> 1 gctatacatg cagtcgagcg aaccgacggg agcttgctcc cttaggttag cggcggacgg 60 gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120 ataccggatg cttgattgaa ccgcatggtt caattataaa aggtggcttt tagctaccac 180 ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240 atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtaccg 420 ttcgaacagg gcggtgcctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480 gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540 gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600 aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660 tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720 gcgcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780 gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc 840 cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900 cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960 tctgacaccc ctagagatag ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020 tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080 cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140 ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200 gggcagaaca aagggcagcg aagccgcgag gctaagccaa tcccacaaat ctgctctcag 1260 ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320 gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380 ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca gccgccgaag gtgggacaga 1440 tgattggggt gaagtcgtaa aaggtaaacc cgtaa 1475 <110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Novel Bacillus sonorensis strain capable of producing exopolysaccharide and use of exopolysaccharide <130> DP-16-213 <160> 1 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1475 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Bacillus sonorensis MJM60135 <400> 1 gctatacatg cagtcgagcg aaccgacggg agcttgctcc cttaggttag cggcggacgg 60 gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120 ataccggatg cttgattgaa ccgcatggtt caattataaa aggtggcttt tagctaccac 180 ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240 atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtaccg 420 ttcgaacagg gcggtgcctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480 gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540 gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600 aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660 tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720 gcgcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780 gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc 840 cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900 cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960 tctgacaccc ctagagatag ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020 tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080 cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140 ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200 gggcagaaca aagggcagcg aagccgcgag gctaagccaa tcccacaaat ctgctctcag 1260 ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320 gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380 ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca gccgccgaag gtgggacaga 1440 tgattggggt gaagtcgtaa aaggtaaacc cgtaa 1475
Claims (20)
세포외다당류 생산능을 가진 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주.
16S rDNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1,
Bacillus sonorensis strain having extracellular polysaccharide production ability.
The method of claim 1, wherein the Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) strain Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) MJM60135 (accession number: KACC 92109P), Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) strain, characterized in that.
The method of claim 1, wherein the Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) strain Bacillus Sono alkylene sheath (Bacillus sonorensis) strain, characterized in that derived from the liver.
[Claim 2] The method according to claim 1, wherein the extracellular polysaccharide is a constituent monosaccharide, which comprises mannose, glucose or mannose and galactose, and includes a carboxyl group and a hydroxyl group as a functional group Bacillus sonorensis strain.
The Bacillus sonorensis strain according to claim 1, wherein the extracellular polysaccharide has a stickiness, an emulsion stabilization activity, a lactic acid bacteria growth promoting activity or a pathogen growth inhibiting activity.
An extracellular polysaccharide produced by the Bacillus sonorensis strain of any one of claims 1 to 5.
The extracellular polysaccharide according to claim 6, wherein the extracellular polysaccharide comprises mannose and glucose or mannose and galactose as constituent monosaccharides.
7. The extracellular polysaccharide according to claim 6, wherein the extracellular polysaccharide comprises a carboxyl group and a hydroxyl group as a functional group.
상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함하는 세포외다당류의 생산방법.
A method for producing a Bacillus sonorensis strain, comprising the steps of: inoculating and culturing the Bacillus sonorensis strain of any one of claims 1 to 5 in a culture medium to obtain a culture; And
And separating the extracellular polysaccharide from the culture.
10. The method for producing an extracellular polysaccharide according to claim 9, wherein the medium is selected from TSB (tryptic soy broth) medium, MRS medium or LB (Luria-Bertani) medium.
10. The method of claim 9, wherein the culturing temperature is 30 to 40 DEG C and the culturing time is 24 to 72 hr.
(a) 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고 제1 상등액을 얻는 단계;
(b) 상기 제1 상등액을 저급 알코올(탄소 수가 1~5임) 또는 함수 저급 알코올(탄소 수가 1~5임)과 혼합하여 침전물을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 침전물이 형성된 제1 상등액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계.
10. The method of claim 9, wherein separating the extracellular polysaccharide from the culture comprises the steps of:
(a) centrifuging the culture to remove cells and obtaining a first supernatant;
(b) mixing the first supernatant with a lower alcohol (having 1 to 5 carbon atoms) or a lower alcohol (having 1 to 5 carbon atoms) to form a precipitate; And
(c) centrifuging the first supernatant liquid on which the precipitate is formed to obtain a precipitate.
13. The method for producing an extracellular polysaccharide according to claim 12, further comprising a step of decolorizing or deproteinizing the first supernatant between steps (a) and (b)
(d) 상기 침전물을 물에 용해시키고 원심분리하여 제2 상등액을 수득하는 단계; 및
(e) 제2 상등액을 농축하고 고형화하는 단계.
13. The method of producing an extracellular polysaccharide according to claim 12, further comprising the steps of:
(d) dissolving the precipitate in water and centrifuging to obtain a second supernatant; And
(e) concentrating and solidifying the second supernatant.
A thickener comprising an extracellular polysaccharide produced by the strain of Bacillus sonorensis according to any one of claims 1 to 5.
16. The method of claim 15, wherein the extracellular polysaccharide is a constituent monosaccharide and comprises mannose, glucose, mannose, and galactose, and includes a carboxyl group and a hydroxyl group as a functional group Thickening agent.
An emulsion stabilizer comprising an extracellular polysaccharide produced by the Bacillus sonorensis strain of any one of claims 1 to 5.
18. The method of claim 17, wherein the extracellular polysaccharide is a constituent monosaccharide and includes mannose, glucose or mannose and galactose, and includes a carboxyl group and a hydroxyl group as a functional group An emulsifying stabilizer.
A prebiotics comprising an extracellular polysaccharide produced by the Bacillus sonorensis strain of any one of claims 1 to 5.
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