KR20170036105A

KR20170036105A - 치료학적 용도의 줄기 세포 조성물 및 줄기 세포의 제조 방법

Info

Publication number: KR20170036105A
Application number: KR1020177006885A
Authority: KR
Inventors: 이리나 컬키스; 사비나 글로츠만
Original assignee: 아비타 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2017-03-31
Also published as: RU2017107114A; IL250495A0; US20230092739A1; IL250495B; US20200224170A1; CN107002035A; BR112017001696A2; RU2017107114A3; RU2714236C2; EP3180423A1; CA2995429A1; EP3936609A1; JP6909154B2; WO2016024256A1; JP2017529068A; US20190127702A1

Abstract

본 발명의 방법은 공여 샘플로부터 수득되는 줄기 세포의 생산을 증대 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 바람직하게는, 수득되는 줄기 세포의 수적 증가를 위해 여러번의 회수 사이클을 이용해 최소적으로 조작된 조직으로부터 세포를 회수하는 단계를 포함한다.

Description

치료학적 용도의 줄기 세포 조성물 및 줄기 세포의 제조 방법 {STEM CELL COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCING STEM CELLS FOR THERAPEUTIC APPLICATIONS}

본 발명은 치료학적 용도의 줄기 세포 조성물 및 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

줄기 세포는 치료학적 용도, 의학 연구, 약제 검사 등을 위한 매력적인 세포 소스이다. 공교롭게도, 이들 세포를 동종이계 이식체로서 사용하는 것에는 문제가 있다. 줄기 세포의 대량 증식이 세포 테라피에 전제 조건이지만, 성체 MSC는 증식력이 제한적이다. 골수 (BM) 분리물로부터 MSC를 생산하기 위해 적용되는 기본 원리는 전 골수 (whole bone marrow)가 플라스틱 배양 디쉬에 놓였을 때 플라스틱에 부착하는 부착력으로서, 4시간 후 비-부착 세포들을 세척 제거하는 것은, 당해 기술 분야의 상식이다. 이 프로토콜은, 또한, 점성과 삼투성이 낮은 고밀도 용액 (예, Ficoll, Percoll) 중에 BM을 밀도 구배로 원심분리하여, MSC가 함유된 BM의 단핵구 분획을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로, 뼈와 같은 고형 조직으로부터 유래되는 MSC는 작은 뼈 조각을 플라스크에 넣고, 이 뼈 외식편으로부터 세포를 생장시켜 분리할 수 있다. 다른 예로, 콜라게나제에 의한 분해 공정도 이용될 수 있다. 그러나, 세포가 조혈 줄기 세포와 같은 다른 타입의 세포들로 오염되면, MSC 샘플의 순도를 떨어뜨리는 혼성 집단이 형성될 가능성이 높다. 이 문제를 해결하기 위해, 2가지 유사 기법, 즉 자기 비드 분류법 (magnetic bead sorting)과 형광-활성화된 세포 분류법 (FACS: fluorescence-activated cell sorting)이 개발되었다. 다른 경우에는, 형광-활성화된 세포 분류법 (FACS)이 MSC를 분리하기 위한 방법이다. 생체외 증식은 MSC를 분리한 다음에 진행되는 필수 단계로서, 이는 치료학적으로 유의한 세포 수를 생산하는 것을 목표로 MSC의 자유로운 생체외 자가 회복을 허용하며, 공여자 (나이, 성별, 외상 여부 및 전신 질환 여부) 및 방법 등의 몇가지 인자들에 따라 결정된다.

MSC는 빠른 증식으로 인해 비교적 단시간내에 엄청나게 많아질 수 있지만, 효소적 처리를 이용해 세포를 플라스크에서 플라스크로 여러번 옮기는 대규모의 시험관내 배양없이 MSC를 치료학적으로 적절한 수로 생산할 수 있는 방법은 당해 기술 분야에 존재하지 않는다. 상기한 조건에서 MSC를 증식시키면, MSC의 최대 분화 잠재력은 점차 줄어드는 것으로 확인되었다. 대규모 서브-배양은 세포 기능을 손상시켜, 생장 정지 및 세포자살과 연관된 세포 노화를 야기한다. 한편, 장기 배양이 자발적인 형질전환을 발생시켜 발암 잠재력을 가지게 될 수 있음을 시사하는 데이타도 있다. 또한, 배양하는 동안에 MSC의 특수성이 없어지는 경우도 나타났다. MSC의 심장보호 효과는 제5 계대 이후부터 제10 계대의 세포에서, 그 이하 세대의 세포와 비교해 떨어진다. 이는 혈관 내피 성장인자의 방출 가능성 저하로 설명될 수 있다 (Crisostomo et al., 2006; Digirolamo et al., 1999; Muraglia et al.,2000; Rubio et al., 2005; Stenderup et al., 2003). 따라서, 당해 기술 분야의 모든 방법들은 증식시키는 세포의 수와 품질 사이에서 절충이 필요하며, 그래서 세포 테라피에서의 이의 이용은 제한적이다.

본원에 기술된 방법 및 세포 조성물은 복수의 세포 계대 배양, 세포 노화, 분화 약화 및 성장인자의 생산 감소, 냉동보존되는 세포 수 제한 등과 같은 전술한 문제들을 해소시킨다. 종래 기술과 대조적으로, 본 발명에서는 세포의 계대 배양 횟수 단축, 시험관내 세포 조작 감소 및 그에 따른 분화력과 성장인자의 생산 강화, 안정적인 핵형, 냉동보존된 세포의 사실상 수적 무제한을 제시하였다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공개공보들은 모든 목적으로 그 전체가 본 명세서에 원용에 의해 포함된다.

Chen VC et al. (2012) "Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells" Stem Cell Res.　2012 May;8(3):388-402. Schirmaier et al: Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Eng. Life Sci. 2014, 14, 292-303, Vallee et al: Adipose-tissue engineering: taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathol Biol (Paris). 2009 Jun;57(4):309-17 Nekanti et al: Optimization and scale-up of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Stem Cell Research (2010) 5, 244-254. Brooke G, Rossetti T, Pelekanos R, et al: Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Br J Haematol. 144:571-579. 2008. Govindasamy et al: Human platelet lysate permits scale-up of dental pulp stromal cells for clinical applications. Cytotherapy, 2011; Early Online, 1-13 Hanley et al: Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System ;Cytotherapy, 2014-08-01, Volume 16, Issue 8, 1048-1058 Lizier NF, Kerkis A, Gomes CM, Hebling J, Oliveira CF, Caplan AI, Kerkis I. Scaling-up of dental pulp stem cells isolated from multiple niches. PLoS One. 2012;7(6):e39885; Kerkis I, Caplan AI. Stem cells in dental pulp of deciduous teeth. Tissue Eng Part B Rev. 2012 Apr;18(2):129-38. Maher Al-Atari Abou-Asi Nuria Casals Farre Lluis Giner Tarrida Lluis Giner Tarrida Eduardo Ferres Padro Patent application title: PLURIPOTENT STEM CELLS OBTAINED FROM DENTAL PULP http://www.faqs.org/patents/app/20110236356 Cordeiro MM, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, Smith AJ, Nor JE. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J Endod. 2008 34(8):962-9. Arora V, Arora P, Munshi AK. Banking Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth (SHED): Saving for the Future J Clin Pediatr Dent 33(4): 289-294, 2009 Sukoyan MA, Kerkis AY, Mello MR, Kerkis IE, Visintin JA, Pereira LV. Establishment of new murine embryonic stem cell lines for the generation of mouse models of human genetic diseases. Braz J Med Biol Res. 2002 May;35(5):535-42. Carta L, Pereira L, Arteaga-Solis E, Lee-Arteaga SY, Lenart B, Starcher B, Merkel CA, Sukoyan M, Kerkis A, Hazeki N, Keene DR, Sakai LY, Ramirez F.Fibrillins 1 and 2 perform partially overlapping functions during aortic development. J Biol Chem. 2006 Mar 24;281(12):8016-23 Kerkis A, Fonseca SA, Serafim RC, Lavagnolli TM, Abdelmassih S, Abdelmassih R, Kerkis I. In vitro differentiation of male mouse embryonic stem cells into both presumptive sperm cells and oocytes. Cloning Stem Cells. 2007 Winter;9(4):535-48. Lavagnolli TM, Fonseca SA, Serafim RC, Pereira VS, Santos EJ, Abdelmassih S, Kerkis A, Kerkis I. Presumptive germ cells derived from mouse pluripotent somatic cell hybrids. Differentiation. 2009 Sep-Oct;78(2-3):124-30 Hayashi MA, Guerreiro JR, Cassola AC, Lizier NF, Kerkis A, Camargo AC, Kerkis I. Long-term culture of mouse embryonic stem cell-derived adherent neurospheres and functional neurons. Tissue Eng Part C Methods. 2010 Dec;16(6):1493-502. Lima BL, Santos EJ, Fernandes GR, Merkel C, Mello MR, Gomes JP, Soukoyan M, Kerkis A, Massironi SM, Visintin JA, Pereira LV A new mouse model for marfan syndrome presents phenotypic variability associated with the genetic background and overall levels of Fbn1 expression. PLoS One. 2010 Nov 30;5(11):e14136. Beltrao-Braga PC, Pignatari GC, Maiorka PC, Oliveira NA, Lizier NF, Wenceslau CV, Miglino MA, Muotri AR, Kerkis I. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 2011;20(11-12):1707-19. Deepa Ponnaiyan -- Do dental stem cells depict distinct characteristics? - Establishing their "phenotypic fingerprint" Dent Res J (Isfahan). 2014 Mar-Apr; 11(2): 16-172 Brito et al., Imbalance of p75NTR/TrkB protein expression in Huntington's disease: implication for neuroprotective therapies. Cell Death and Disease (2013) 4, e595; doi:10.138/cddis.2013.116 Crisostomo PR, Wang M, Wairiuko GM, et al. High passage number of stem cells adversely affects stem cell activation and myocardial protection. Shock. 2006;26:575-80. Digirolamo CM, Stokes D, Colter D, et al. Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br J Haematol. 1999;107:275-81. Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 2000;113:1161-6. Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005;65:3035-9. Stenderup K, Justesen J, Clausen C, Kassem M. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells. Bone. 2003;33:919-26.

본 발명은 외식편 조직으로부터 분리된 줄기 세포 집단을 시험관내에서 수득 및/또는 증식시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 바람직하게는 1회 이상의 회수 사이클 동안에 조직을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 회수 사이클은 일반적으로 조직을 배양 배지에서 유지하여, 세미-컨플루언트 줄기 세포 배양을 달성하기에 충분한 기간 동안 세포를 증식시키는 단계, 및 이들 세포를 최종 줄기 세포 집단으로 수집하는 단계를 포함한다. 조직은 바람직하게는 각각의 회수 사이클 전에 최소한으로 조작된다.

구체적인 구현예에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포 (primary derived stem cell)의 증식 집단을 수득하는 시험관내 방법에 관한 것이다:

a. 외식편 조직을 세척하고, 최소한으로 조작하는 단계;

b. 외식편 조직을 제1 배양 표면에서 배양 배지를 이용해 시험관내에서 배양하여, 일차 유도 줄기 세포의 배양을 확립하는 단계;

c. 배양 배지로부터 일차 유도 줄기 세포를 수집하는 단계; 및

d. 외식편 조직을 배양 배지와 함께 제2 배양 표면으로 이동시키는 단계;

e. 외식편 조직을 이용해 단계 b, c 및 d를 1회 이상 반복 실시하여, 외식편 조직으로부터 일차 유도된 증식 집단을 수득하는 단계.

이들 방법은, 바람직하게는, 외식편 조직을 세척하고 최소한으로 조작하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 외식편 조직은 각각의 회수 사이클 수행 전에는 효소적으로 또는 화학적으로 처리되지 않거나, 또는 해부되지 않는다. 외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포의 증식 집단을 수득하는 방법은, 바람직하게는, 생장 배지에서 일차 유도 줄기 세포를 계대 배양하고 생장 배지에서 줄기 세포를 수집하는 단계를 또한 포함한다. 계대 배양은 각각의 회수 사이클을 수행한 이후에 여러번 또는 마지막에 수행될 수 있다.

본 방법은 외식된 세포를 계대 배양하고, 계대 배양된 세포를 생장 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 1회 이상의 회수 사이클에서 조직을 배양 배지에서 배양하는 단계를 조직을 혈청 함량이 5% 미만인 배양 배지에서 배양한 다음 혈청 함량이 15%인 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 조직을 혈청 함량이 5% 미만인 배양 배지에서 배양하는 기간은 3일이다. 조직을 혈청 함량이 15%인 배양 배지에서 배양하는 기간은 7일이다. 일부 구현예에서, 배양 배지와 생장 배지는 DMEM이며, 예를 들어, 배양 배지는 DMEM-F12이거나, 및/또는 생장 배지는 DMEM-로우 글루코스 (DMEM-low glucose)이다. 일부 측면에서, 생장 배지는 비-필수 아미노산으로 보충되지 않는다. 일부 구현예들에서, 외식된 세포 및/또는 계대 배양된 세포는 안정적인 핵형을 가진다.

또한, 본 발명은 적어도 1차 회수 사이클로부터 수득되는 외식된 세포를 포함하는 치료학적 줄기 세포 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 초기 3회, 초기 65회 또는 초기 100회의 회수 사이클로부터 수득되는 외식된 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 본 조성물은 적어도 제1 계대 (P1), P1에서 P3, 또는 P1에서 P50으로부터 수득되는 계대 배양된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 냉동된 상태로 보관될 수 있으며, 해동되었을 때 줄기 세포 마커의 발현에 변화를 나타내지 않는다.

본 발명에 따른 방법 및 조성물에 대한 일부 구현예들에서, 줄기 세포는 신경 능선 (neuronal crest) 또는 말초 신경계 오리진의 줄기 세포이다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 성체 또는 신생아 줄기 세포, 즉, 비-배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 조직은 치수 (dental pulp) 또는 산후 조직 (postpartum tissue)이며, 예를 들어, 탯줄 및 태반이다.

도 1은 탯줄 (UC)에서 줄기 세포를 분리하는 과정을 간략하게 도시한 것이다. 패널 A는 5 cm의 UC 조각을 나타낸 것이다. 패널 B는 UC 조직의 세척을 나타낸 것이고; 패널 C는 작은 절편으로 절단된 UC 조직을 나타낸 것이다. 패널 D는 기계적으로 기본 배지로 옮겨져 플라스틱 배양 플레이트에서 배양되는 UC 조직의 소형 절편들을 나타낸 것이다. 패널 E는 배양 표면 상에 CD105 양성인 줄기 세포의 부착을 나타낸 것이다. 패널 F는 간엽 줄기 세포의 배양물을 나타낸 것이다.
도 2는 산업적인 규모의 줄기 세포 배양 방법을 도시한 것이다.
도 3은 생물공학, 의학, 약학, 미용학, 영양 섭취 등에 있어 줄기 세포의 비-효소적인 분리 및 기계적 전달 방법의 활용도를 도시한 것이다.
도 4는 여러가지 공여체 절편들의 분리와 하나의 플라스크에서의 이들 절편들의 공동-배양을 도시한 것이다. HLA-매칭, 부분 매칭 및/또는 비-매칭되는 여러 공여체로부터 수득한 절편들은, 임의의 면역 반응 신호가 발생되지 않는 한, MSC 생산을 위해 동일 플라스크에서 배양할 수 있다.
도 5는 "원 타임 (one time)" 줄기 세포 분리를 위한 기존의 조직-소스 냉동보존법 (a)과 본 발명에 따른 조직-소스 냉동보존 방법 (b)을 도시한 것이다.
도 6은 정상 MSC와 EP 또는 iPS 세포들 간의 기본 차이를 도시한 것이다.
도 7은 2가지 타입의 배양 배지에서 hIDPSC의 증식율을 도시한 것이다.
도 8은 Mtb 및 M. bovis 균주로 감염된 C57Bl/6 마우스의 폐 세포에서의 사이토카인 생산에 대한 복막내 IDPSC 접종 (inoculation) 효과를 도시한 것이다.
도 9는 형광 현미경을 통해 가시화된 각막 이식용 IDPSC에서의 변연 줄기 세포 마커의 면역염색 결과를 도시한 것이다. 스케일 바는 50 ㎛ 길이를 표시한다. 패널 A는 IDPSC에서 p63 핵 위치를 나타낸 것이다. 패널 B는 패널 A 이미지를 DAPI 핵 염색과 겹친 것이다. 패널 C는 인테그린 β1의 막 국지성을 보여주는 것이다. 패널 D는 비멘틴 (vimentin), 중간 섬유의 검출 결과이다. 패널 E는 세포 막 단백질인 코넥신 43 (connexin 43)의 검출 결과이다. 패널 F는 원형질막 단백질 ABCG2의 검출 결과이다. 패널 G는 K3/12에 대한 약한 파지티브 면역염색 결과를 도시한 것이다. 패널 H는 음성 대조군이다.
도 10은 IDPSC에서 변연 줄기 세포 마커 (ABCG2, connexin 43 및 K12)의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 도시한 것이다. 레인 1은 100 bp 래더 (ladder)이다. 레인 2는 인간 각막 조직 샘플이다. 레인 3은 인간 변연 조직 샘플이다. 레인 4는 IDPSC 샘플이다.
도 11은 치수에서 줄기 세포 니치 (niche)를 도시한 것이다. 패널 A는 치관부와 치근부로 구성된 치아 사진이다. 패널 B는 치수에서 혈관주위 니치 (perivascular niche) (a)와 신경얼기 (nerve plexus) (b)의 위치를 나타낸 것이다. 패널 C는 혈관주위 니치 (a) 및 신경얼기 (b)에서의 네스틴 면역염색 결과를 나타낸 것이다. 패널 D는 상아질모세포밑 니치 (subodontoblastic niche) (c)와 세포-결핍 및 세포-풍부 영역 (d)의 위치를 나타낸 것이다. 패널 E와 F는 상아질모세포밑 니치 (c) 및 세포-결핍 및 세포-풍부 영역 (d) 각각에서의 네스틴 면역염색 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 탯줄에서 추정의 신경 줄기 세포 니치를 도시한 것이다. 패널 A는 양막하 상피에서 신경미세섬유 (NF)의 발현을 나타낸 것이다. 패널 B는 정맥에서 저 친화성 신경 성장인자 (p75 또는 CD271)의 발현을 나타낸 것이다. 패널 C는 추정의 신경 줄기 세포 니치로부터 분리된 줄기 세포에서 베타-III 투불린에 대한 양성 면역염색 결과를 나타낸 것이다. 패널 D는 추정의 신경 줄기 세포 니치로부터 분리된 줄기 세포에서 GFAP의 양성 면역염색 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 탯줄 조직내 여러가지 줄기 세포 니치에서의 Oct 3/4, nanog 및 Sox2 등의 전사 인자의 발현을 나타낸 것이다. 백색 화살표는 이들 전사 인자들을 발현하는 세포를 표시하며, 흑색 화살표는 이들 전사 인자를 발현하지 않는 세포를 표시한다.

미국 특허 출원 공개번호 제 2004/0136967호는 탯줄의 외식편으로부터 세포를 분리하거나, 또는 효소에 의해, 예를 들어 콜라게나제 또는 트립신의 처리에 의해 세포를 분리하는 단계를 포함하는 탯줄 매트릭스로부터 줄기 세포를 수득하는 방법을 기술하고 있다. 조직 단편을 이후 또 다른 유리 슬라이드로 덮고, 완전 배지에서 배양한다. 즉, 선행 기술에는 외식편 배양물의 반복 사용이 언급되어 있지 않다.

본 발명은, 줄기 세포 집단들을 늘리는 선행 기술의 방법과는 다르게, 배양된 줄기 세포의 집단의 규모를 확장하기 위해 복수의 회수 사이클을 사용한다. 또한, 선행 기술의 방법과는 달리, 오리진 조직을 버리지 않고, 반복적인 회수 사이클을 위해 자르거나 또는 분쇄한다. 조직은 최소한으로 조작되어야 한다. 회수 사이클은, 예를 들어, 새로운 배양 표면으로 조직을 이동시켜 줄기 세포의 새로운 외식편 배양을 확립하는 사이클을 의미한다. 본 발명에서, 회수 (줄기 세포 공급원을 공급하기 위한 이동) 사이클은 다중 사이클 (multiple cycles)을 통해, 예를 들어 1-100회의 이동을 통해 반복될 수 있다. 다중 회수 사이클은 복수의 일차 배양을 확립하여, 고유한 특징을 가진 줄기 세포를 대규모로 제공해준다. 다시 말해, 본 발명은, 동일 조직에 대한 반복적인 회수 사이클을 통해, 최소 조작된 조직 소스로부터 회수된 줄기 세포를 반복적인 일차 배양을 수행함으로써 줄기 세포를 대규모로 왕성하게 배양하는 방법을 제공한다. 예상치 못하게도, 회수 사이클의 반복은 각 사이클에서 수득되는 부착 세포의 수를 증가시킨다. 아울러, 본 발명자들은, 항생제/항진균제 및 첨가제가 첨가된 배양 생장 배지에 노출된 최소 조작된 조직 단편들을 비-효소적 회수를 통해 외식편을 반복 배양함으로써, 여러번 0 계대 (P0) 환경을 개시할 수 있으며, 그래서 반복적인 회수 사이클을 통해 충분한 수의 줄기 세포를 제공하는 동안에 낮은 계대에서의 핵형 안정성으로 인해 안전성이 개선됨을 놀랍게도 알게 되었다.

조직의 최소 조작 방법은 선행 기술에서 비-치료적 이용에서, 주로 진단 목적에서 일부 알려져 있다. 구체적으로, 이러한 목적은 독성, 발암성, 치료 물질, 생물 제제의 효과 판단 또는 감수성 검사를 위한 조직 (예, 각막) 및 조직 외식편의 배양을 포함한다. 최근, 본 발명자들은 치수 줄기 세포를 분리하는데 이 기법의 적용을 개시한 바 있다. 이 기법의 주 목적은 배양된 조직 아키텍처 (architecture)를 유지하는 것이며, 예를 들어, 실질 및 기질 (stroma)이 그 구조와 기능 측면에서 보존되게 하는 것이다. 그래서, 시험관내 장기는 배양 중에 생체내 장기 기능을 모방한다. 아울러, 본 발명자들은 기존에 당해 기술 분야에서 진단, 스크리닝 방법에 사용되었던, 장기의 절편으로부터 세포를 분리하기 위해 사용되는 외식편 배양 방법을 활용하였다: 적출된 조직을 무균 하에 분리, 최소 처리하고, 작은 조각으로 자른 다음 배양 배지가 들어있는 세포 배양 디쉬에 둔다.

외식편 배양은, 세포가 자신의 세포외 매트릭스에 둘러싸여 있고, 니치에서 외부 환경으로의 생체내 줄기 세포/전구체의 이동을 보다 정확하게 모방하는, 배양으로서, 전구 세포는 조직 밖으로 이동해 배양 디쉬의 표면에 붙게 된다. 상기한 2가지 방법들은 환경과 줄기 세포 니치를 보존하므로, 유사성을 가진다. 줄기 세포의 증식에 이 방법을 적용하는 것은, 조직이 배양 중에 저산소 환경에 놓이기 때문에 유리하다. 그렇지만, 배양 배지가 최소한으로 조작된 조직의 외식 세포와 조직내 세포가 생활성인 상태로 유지되도록 지원하기 위해 충분한 영양분 공급을 제공해준다. 이런 이점은 선행 기술의 내용과 비교해 예상치 못한 것이며, 줄기 세포를 미분화된 상태로 유지시킨다는 점에서 매우 유익하다. 따라서, 치수, 즉 소형 장기 및 외식편의 기계적 이동은, 분리 후 원시적인 특징을 변화없이 유지하기 위해, 줄기 세포를 연속적으로 분리하기 위한 전략이다. 치수는 느슨한 결합 조직으로, 이 장기는 무게가 여러가지일 수 있다. DP는 가벼운 것으로, 부착 및 세포 생장 (cell outgrowth)없이 부유하는 경향을 보인다. 치수 조직이 기판에 부착되는 것을 촉진하기 위해, 무균 커버슬립을 사용해 심지어 더욱 강력한 저산소 환경을 적용할 수 있다. 커버슬립의 사용은 복수의 회수 사이클에서 조직 줄기 세포 니치에 저산소 환경을 유도하기 위한 또 다른 예이다.

일 구현예에서, 본 발명은 1회 이상의 회수 사이클을 통해 최소 조작된 조직으로부터 일차 유도 및 계대 배양된 줄기 세포의 증식 집단을 시험관내 증식시키는 방법에 관한 것이다. 각각의 회수 사이클 중에, 외식편 세포의 수는 고전적인 효소 처리에 의해 유도되는 줄기 세포 증식으로 분리된 세포에 적어도 2배가 된다. 회수 사이클의 횟수는 적어도 3회 (H1-H3), 적어도 65회 (H1-H65) 또는 최대 100회 (H1-H100)일 수 있다. 각 회수 사이클은 최소 조작된 조직 절편 (예, 효소적으로 또는 화학적으로 처리되지 않고, 해부되지 않음)을 항생제 첨가된 배양 배지에서 유지하여 세미-컨플루언트 줄기 세포 배양물을 수득하기에 충분한 기간 동안 세포를 증식시키고, 그 세포를 최종 줄기 세포 집단으로 수집하는 단계를 포함한다. 이러한 배양된 세포의 생성은 회수 사이클의 초대 계대 (primary passage, PO)이다.

본 방법은, 최소 조작된 조직을 세척하는 단계 및 조직을 1회 이상의 회수를 통해 시험관내에서 유지하여 다양한 유형의 간엽 다능성 및 만능성 줄기 세포 등의 줄기 세포를 배양 표면 또는 비드에 부착시키는 단계를 포함한다. 회수 사이클로부터 수득되는 각 외식편 배양물은 P0이며, 이후의-순차적인 계대배양 또는 생물반응조 시스템의 소스로 공급된다. 외식편 배양물은 최대 50회까지 계대배양될 수 있다. 세포는 효소적으로 또는 비-효소적으로 계대 배양될 수 있다. 반복적인 회수 사이클 동안에, 조직과 세포는 성장인자 및/또는 항미생물제가 첨가된 DMEM 생장 배지에서 유지될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법을 이용해 조직의 단편으로부터 수득되는 줄기 세포의 전체 수는, 고전적인 효소 처리에 의해 유도되는 줄기 세포 증식을 통해 수득할 수 있는 줄기 세포의 수에 적어도 3배이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 통해 수득되는 줄기 세포의 전체 수는 고전적인 효소적 처리에 의해 유도되는 줄기 세포 증식을 통해 수득되는 줄기 세포의 수에 적어도 3배 내지 적어도 65배이다. 즉, 본 방법은 단일 또는 혼성 공여 조직/유체 소스로부터 수득되는 줄기 세포의 수를 동일한 조직 소스에 대한 고전적인 방법과 비교해 증가시키는 방법에 관한 것이다.

조직은 외식편 배양을 확립하기 전에 냉동보존될 수 있다. 외식편 배양과 후속적인 계대배양으로부터 수득된 부착 세포 역시 냉동보존될 수 있다. 냉동 후 세포 생존성은 50-90% 보다 높아, 산업적인 용도와 치료학적인 용도에 적합하다. 본 방법의 일부 측면에서, 치료학적 조성물은 언급된 방법에 따라 복수의 회수 사이클 동안에 수득되는 냉동-해동된 간엽 줄기 세포를 혼합한 배치 (batch)로부터 수득된다. 배치는 회수 사이클들의 혼합물 또는 동일 회수 사이클로부터 수득되는 계대가 혼성된 세포를 포함할 수 있다. 연구 및 임상적인 용도의 세포 배치는 여러가지 회수 사이클들에서 수득된 P0 세포들을 포함하는 조성물일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 분리된 배치를 인간 또는 동물에 치료가 필요한 위치에 주사 및/또는 이식하는 단계를 포함하는 세포 테라피 방법에 관한 것이다. 세포 배치는 여러 회수 사이클 및 직접 냉동 원액으로부터 계대배양으로 수득된 혼성 세포일 수 있다. 세포 배치는 또한 인간 또는 동물에게 투여하기 전에 냉동 원액으로부터 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배치는 타겟 요법에 필수적인 기능성 파라미터에 대한 검사, 예를 들어 관련 인자 방출 및/또는 관련 바이오마커 검사로 평가된다. 본 방법의 방법에 따라 분리된 최종 줄기 세포 집단은 간엽 마커들을 발현한다. 최종 줄기 세포 집단은 또한 만능성 마커, 신경외배엽 마커 및/또는 혈관 주위 세포 마커들도 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 줄기 세포 집단은 바람직하게는 간엽 마커와 일부 만능성 마커, 특히 신경외배엽, 상피 마커 및/또는 혈관 주위 세포 마커를 발현한다. 일부 구현예들에서, 줄기 세포는 바람직하게는 HLA II (HLA-DR) 발현과 같은 MHC 클래스 II의 발현이 결여되어 있다. 신경학적으로 이용하기 위해서는, 바람직한 CSN 인자, 마커, 예를 들어 베타 투불린, SOX2; 또는 SOX10; 또는 신경 성장인자 및 펩타이드, 예를 들어 GDNF, NGF 및 BDNF가 테스트된다. 세포 배치는 테스트된 분화 능력을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은, 또한, pH가 산성이 아니고 세포에 유해하지 않는, 세포 테라피용 완충화된 치료 조성물 (buffered therapeutic composition)에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 일 구현예는 최소 조작된 조직으로부터 시험관내에서 증식시킨 배양물에서 일차 줄기 세포를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 그 조직은 화학제 또는 효소에 의해 처리되거나 또는 완전히 분해 처리되지 않는다. 이러한 방법은, 연속하여, 주기적으로 또는 간헐적으로 항-미생물제 용액을 포함하는 보충된 생장 배지에서 유지되는 세포 배양 챔버내 조직으로부터 부착성 줄기 세포를 회수하고; 제1 회수로부터 수득된 배양된 세포를 계대 배양하여 단계를 반복하는 과정을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 회수 단계는 반복되며, 계대 배양 단계는 각각의 회수 단계에서 1회, 2회 또는 3회 반복된다. 복수의 회수 사이클이 수행된 후 수득되는 배양물의 줄기 세포는 혼합되며, 관련 바이오마커의 품질관리 (quality control)를 통해 기능성에 대해 평가가 수행될 수 있다. 이들 세포는 치료학적으로 사용하기 전에 냉동될 수 있다.

표 1은 본 발명의 방법과 선행 기술의 방법으로 수득되는 세포의 수를 비교한 것이다.

표 1. 여러가지 소스로부터 수득되는 성체 간엽 줄기 세포에 대한 비교:

MSC 소스	세포 수	참조 문헌
지방세포 조직	3 x 10⁷/100 mL 1 x 10¹⁰/1 L	Schirmaier et al. , 2009
지방세포 조직	(1-3) x 10⁸	Vallee et al., 2009
탯줄의 바르톤 젤리	1 x 10⁸개 (단일 탯줄에서 15일 배양)	Nekanti et al., 2010
태반	제2 계대시 (7.6-11.6) x 10⁸ (태반의 약 절반으로부터 유도됨; 세포는 제5 계대 동안에 0.6-0.8/일의 배가 속도를 유지함)	Brooke et al., 2008
사랑니 ( 효소적 )	(25.29 ± 1.85) x10⁶	Govindasamy et al., 2011
골수	4 x 10⁷개 (골수 10 ml로부터)	최신 기술 (미공개)
골수	플라스크: 평균 수율 세포 2 x 10⁸개 생물반응조: 평균 수율 세포 2 x 10⁸개	Hanley et al., 2014
유치 치수	3.5 x 10⁸ (35회의 회수 사이클에서 제3 계대)	Cellavita
유치 치수	0.9 x 10⁹ (3차 회수 사이클의 제1 계대, 2차 회수 사이클의 제2 계대 및 1차 회수 사이클의 제3 계대)	Lizier et al., 2012
탯줄 조직	3.6 x 10⁷ (단일 탯줄 조직으로부터 첫 회수 사이클 후 5-7일 배양)	Cellavita

일 구현예에서, 본 발명의 방법은 조직으로부터 과도한 혈액을 세척하는 단계 및 수집된 조직을 항생제 및 완충액으로 소독하는 단계를 포함한다. 또한, 조직은 기계적으로 조직 절편으로 절단되며, 조직은 현미경 없이 육안으로 볼 수 있는 크기의 조각으로 절단된다. 예를 들어, 조직 절편은 1 mm 보다 커야 한다. 조직 절편은 보충된 배양 배지에 노출된다. 바람직한 구현예에서, 보충된 배양 배지는 DMEM, 더 바람직하게는 DMEM F12를 기본으로 한다. 일부 배양 후, 부착된 세포가 세미-컨플루언스에 도달하면, 조직 절편을 또 다른 회수 사이클을 위해 새로운 플레이트로 이동시킨다.

일부 구현예들에서, 각 회수 사이클 (PO) 이후의 줄기 세포는 여러 번의 계대 배양되며, 배양시 줄기 세포의 수는 증가된다. 줄기 세포는 정상적인 핵형을 유지하면서 제3, 제15 또는 제50 계대 동안 계대 배양할 수 있다. 일부 구현예들에서, 각 반복 사이클에서, 줄기 세포는 반복 사이클의 선행 사이클에서 사용된 수종의 공여체로부터 유래된 혼합 조직 조각들로서 수득되거나 또는 동일한 공여체에서 수득된 수종의 샘플들 (예, 외과적 시술을 통한 동일 공여체의 여러 조직 샘플링으로 수득되는 탈락성 치수)로부터 수득된다. 공급원 조직은 신선하게 수득하거나, 또는 세포 은행에서 냉동보존 후 해동할 수 있다.

이식편 회수 후, 미분화된 또는 분화된 세포에 대한 효소적 스플리팅 (splitting)/계대배양은 당해 기술 분야에 공지된 고전적인 세포 배양 조건에서 또는 생물반응조 조건 하에 무균 플라스틱 플라스크, 유리 제품, 무균 백, 마이크로-캐리어, 마이크로파이버 반응조 등에서 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 줄기 세포의 증식 방법은 기계적 이동, 영양분 고갈 및 저산소 상태에 의해 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:

(i) 신생아 (postnatal), 어린 또는 성체 간엽 세포 및 전구체 줄기 세포를 최소 조작된 조직으로부터 수득하는 단계 (바람직하게는, 신경외배엽에서 기원한 줄기 세포 니치의 세포와 혈관 주위 세포를 함유한 조직, 및/또는 상피 소스, 즉 치아 조직, 태반, 양막, 탯줄 등의 산후 조직 (post-delivery tissue); 모낭 및 외배엽 기원의 지방 세포 조직 (adipose tissue of under-ectodermal source) 등);

(ii) 상기 조직은 생활성을 기본적으로 검사하고, 항생제를 첨가하여, 항균 조건 하에 유지시키고, 혈액을 실질적으로 제거하고, 기계적으로 작은 조각들로 자른다 (바람직하게는, 보충 배지에 노출시키기 위해 약 0.5 - 5 mm).

(iii) 최소 조작된 조직으로부터 상기 줄기 세포 콜로니 형성은 비-효소적/기계적 방법 하에 수행된다.

(iv) 상기 콜로니 형성은 기본적으로 기계적 조작과 배지 노출 및 플라스틱 제품, 비드 또는 부착 표면에의 세포 부착에 의해 유도되며, 상기 콜로니 형성 개시는 5% 이하의 저 혈청 배지에서 저산소성/고갈 스트레스 조건 하에 약 3일 후 또는 정상 배양 증식 조건에서는 그 이후에 시작된다.

(v) 반복적인 여러 번의 회수는 많은 수의 세포를 적은 계대 수로 이용가능하게 하며, 각각의 회수에서 새로운 일차 배양이 개시되고, 첫 회수 후 조직은 크기가 줄어들고, 스트레스 상황에 놓이게 되며, 후속적인 회수에서 세포를 회수하는 기간은 처음 일차 회수 배양시 보다 약 2배 빨라진다.

(vi) 이러한 최소 조작된 조직으로부터 수득된 세포는 생체내 조건을 모방하는 복수의 줄기 세포 니치로부터 기원한 동일 마커들을 생체내 및 시험관내에서 발현한다.

(vii) 상기 콜로니 형성 기간은, 화학적 스트레스, 예를 들어 저산소, 기계적 스트레스, 예를 들어, 커버슬립 압력 하; 및/또는 보충물 고갈, 바람직하게는 혈청 5% 이하 (하기 실시예 MS2 참조)에 의해 유도될 수 있는, 스트레스-저산소 조건 하에서 유도되며, 적어도 2배 수준에서 실질적으로 가속화될 수 있다.

(viii) 콜로니 형성 후 여러 번의 반복적인 회수로부터 수득되는 줄기 세포의 일차 회수 유닛 (unit)은 세포 증식에 적합한 환경에, 바람직한 예에서, 혈청 보충이 약 15% 보충되거나 또는 성장 인자 및 추가적인 보충이 수행된, 세포 증식에 적합한 환경에 노출되어 효소적으로 또는 비-효소적으로 계대 배양된다. 증식은, 저산소/스트레스 환경을 가속화하는 것으로 당해 기술 분야에 널리 공지된 글루코스 함량이 낮은 DMEM을 사용하는 경우에, 현저하게 가속화될 수 있다 (하기 실시예 MS3 참조).

세포 테라피를 위한 이식은, 부가적인 활성 첨가제 또는 상승 작용하는 약학적 또는 생물학적 성분 등이 첨가 또는 무첨가된, 완충화된 약학적 조성물, 하이드로겔, 이식 스캐폴드 (implantation scaffold)로 수행될 수 있다.

수득된 세포는 전신 및/또는 국소 투여 경로를 통해 1회, 바람직하게는 아래 실시예에서 다발성 경화증에 대한 개 치료 - 최적의 결과는 증상을 개선하기 위해 세포를 2 - 3회, 바람직하게는 >2, 3, 또는 4회로 반복 주사함으로써 달성됨 -에 나타낸 바와 같이 다중 투여 방식으로 세포를 투여함으로써 다양한 세포 테라피 용도로 사용될 수 있다. 보다 바람직한 접근 방법으로서, 프로세스의 가역성이 세포 테라피에 의해 조절될 수 있는 경우, 세포는 질환의 상대적인 초기 단계에 투여되어야 한다.

전술한 이점들은 복수의 소비자의 효용으로 전환될 것이다:

● 잘 규명되고 특성화된 줄기 세포를 강력하고 재현가능한 산업적인 규모로 생산가능할 것으로 예상된다.

● 향후 생물 반응조 증식을 위한 초기 계대로부터 더 많은 출발 물질이 수득된다.

● Cellavita 세포의 독특한 단백질 발현 패턴은 쉽고 표준화된 특징 파악을 가능하게 한다.

비-효소적인 줄기 세포 분리 및 절편의 기계적 이동 방법의 가능한 적용 분야는 도 3에 나타낸다. 세포 또는 분리된 절편은 동결건조, 침전, 추출 및 정제하거나 또는 추가로 생활성 분자를 분리하기 위한 공정을 진행할 수 있다. 이들 분자는 미학적 (회생) 외용 및 내용 용도의 "칵테일" 또는 치료학적 크림을 제조하기 위해 새로운 미공지 분자를 서열분석하고 합성하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 한편, MSC는 다양한 질병, 손상 및 외상의 치료에 줄기 세포 테라피로서 사용될 수 있다. 이들 세포는 추가적으로 암 치료에 다양한 전달성 치료학적 분자 또는 자살 분자에 대한 비히클로서 활용될 수 있다. 이들 세포는 또한 유전자 및 조직의 조작, 지지체 (또는 스캐폴드)를 이용한 또는 이용없이 장기의 프린팅, 및 복수의 질환들에서 다른 타입의 세포 및/또는 줄기 세포와의 조합에 이용될 수 있다.

그러나, 본 발명자들은, 분리된 줄기 세포의 최종 집단이 동시에 유사성을 나타낼 수 있지만, 줄기 세포 니치에 따라 표 2에 나타낸 바와 같이, 줄기 세포 특성에 영향을 줄 수 있는 뚜렷한 특성들을 나타낼 수 있다는 것을 발견하였다.

표 2. UC 및 DP 조직에서의 여러가지 줄기 세포 니치

탯줄 (UC) 조직에서의 줄기 세포 니치 배외 중배엽 (extra-embryonic mesoderm) 유래			치수 (DP) 조직에서의 줄기 세포 니치 배아 외배엽 유래
UC에 없음			신경얼기내 신경망
바르톤 젤리 무코폴리사카라이드 (히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트)로 구성된 젤라틴성 물질 섬유모세포 및 대식세포 일부 함유			DP에 없음
UC에 없음			치수 연질 결합조직, 모세관, 림프 및 신경 인자 섬유모세포 및 미-분화된 간엽 세포 함유 콜라겐 섬유 I형 및 II형 함유
UC에 없음			소형 모세관
정맥 및 동맥			DP에 없음
내부 긴 평활근	외부 원형	혈관 내피 세포	DP에 없음
	평활근
UC에 없음			상아질모세포밑 영역 (Subodontoblast region) 줄기 세포 - 상아질모세포 함유
양막 상피 기저층			DP에 없음
양막 상피 하 (sub-amniotic epithelium)			DP에 없음

표 2는 2종의 조직을 예로 들고 있지만, 그 내용은 이들 조직으로 한정되지 않으며, 임의 타입의 조직을 포함할 수 있다:

a. 배아 외배엽 및 신경능선 (neural crest) 유래 (설하 및 악하 (submandibular) 조직, 침샘 및 눈물샘, 치아유도, 치아판, 헤르트비히 상피근초 (Hertwig's epithelial root sheath), 치아소포, 치주 인대, 피부, 출생 모반 (birthmark) 등);

b. 배외 중배엽 유래 (난황낭 (yolk sac) 및 양막, 탯줄, 태반 및 태막); 및

c. 배아 중배엽 유래 (지방세포 조직 및 골수).

이들 조직들 모두 도 1 및 2에 따라 처리되어 도 3 및 4에 따라 이용될 수 있는 절편의 소스로서 이용될 수 있다.

a, b 및 c에 언급된 여러가지 조직 소스들로부터 수득되는 각각의 줄기 세포 타입들은 다양한 목적과 여러가지 증상에 대한 세포 테라피 및 재생 의학에 이용될 수 있다. 동시에, 이들 줄기 세포가 서로 다른 배아 오리진의 것이라면, 치료학적 치료에 증강된 또는 상승적인 또는 보완적인 효과 (complementary effect)를 제공하기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 조직 소스의 예로는, 탯줄, 치아/치주 조직, 하악 조직, 점막 조직, 위-장 조직, 태반, 양수 또는 양막낭 (amniotic sac), 신경 조직 (예, 신경 또는 신경교 세포-함유 조직), 신경 능선 유래 조직 또는 말초 신경계 오리진, 근육, 뼈, 피부 (진피, 표피, 각질 형성 세포-함유 또는 멜라노사이트-함유 조직, 포피, 성형 수술 또는 생검-유래 피부), 지방세포/지방 조직, 혈액 및 기타 체액, 유선 조직, 내피 조직, 고환 조직, 난소, 심장 조직, 간, 뼈 조직, 폐 조직, 침샘 조직, 췌장 조직, 심장 및 비장 등이 있다.

비-효소적인 줄기 세포 분리 및 기계적 이동 방법은 또한 탯줄 (도 1)과 같은 다른 조직에 대해서도 최소한으로 변형시켜 확대할 수 있다. 예를 들어, 탯줄 (UC)로부터 수득한 5 cm 조각을 분리하고 (도 1a), 과도한 혈액을 제거하기 위해 식염수와 같은 무균 용액으로 세척한다. 최초 UC 조직 조각을 배양하기 위해 보다 더 작은 조직 절편으로 자르고 (패널 C), 기본 배지로 기계적으로 옮긴다 (도 1D). 기본 배지는 각 줄기 세포 타입에 특이적일 수 잇으며, 이의 구체적인 제형은 조직 오리진에 따라 결정될 수 있다. CD105에 양성인 줄기 세포는 조직에서 이동하여 배양 표면에 부착된다 (도 1E). 도 1F에서, 작은 UC 조직 절편으로부터 기원한 간엽 줄기 세포 (MSC)의 배양을 관찰할 수 있다.

이 방법은 도 2에 나타낸 바와 같이 산업적인 규모의 배양으로 쉽게 변환할 수 있다. 여러 개의 절편들을 UC로부터 분리하여, MSC 생산을 위해 다양한 배양 플라스크에 넣는다. 효소적 처리를 이용한 시험관내 증식 후, 이들 세포는 세포 테라피 및 기타 목적으로 사용될 수 있다. 여러 번의 기계적인 UC 절편 전달은 생활성 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있는 MSC를 상당량으로 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 본 방법에 따라 분리된 줄기 세포가 사용되는 환자 치료 용법에 관한 것이다. 이 용법은 환자의 면역 및 염증 상태를 방어적으로 조절하기 위해 줄기 세포의 전신 투여로 시작된다. 항-염증성 면역조절 효과가 사이토카인 및 면역글로빈, 그리고 기타 면역조절 인자를 환자에서 측정 (예, 혈액 검사)함으로써 확인되면, 재생 세포 테라피를 위해 줄기 세포의 국소 이식을 적용할 수 있다.

기능성 분석은, 병원 감염과, 당뇨병성 궤양과 같은 상처 치유, 수술 상처 등과 같은 감염 위험성이 있을 수 있는 질환에 대해, 예를 들어 항-염증성, 항미생물성 및 재생성 등의 상승작용 인자들의 규명 (characterization)을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 세포 테라피 치료를 이용한 cellavita 기술은 환자가 시술 중인 다른 허용되는 의학적 및 지지 치료와 함께 보조적으로 행해져야 하지만, 보조 약물요법의 시험관내 적합성 (compatibility)을 세포 면역-조절 및 재생 잠재성을 저해하지 않는지 평가하여야 한다. 예를 들어, 항생제, 스테로이드, 항-증식제 및 면역-억제제는 유해하거나 또는 세포 활성을 저해할 수 있어, 따라서 그 용법은 적절한 테라피 용법으로 조정되어야 한다.

본원의 내용, 측면 및 구현예들은 본원에 기술된 특정 물질 유형, 성분, 방법 또는 기타 예들로 한정되지 않는다. 당해 기술 분야에 공지된 수많은 부가적인 물질 타입, 구성 성분, 방법 및 공정들은 본원에 대한 구체적인 구현예와 함께 사용될 것으로 예견된다. 즉, 예를 들어, 구체적인 구현예들이 기술되어 있지만, 이러한 구현예 및 구현 구성성분들은, 의도한 조작에 부합되는, 상기한 시스템 및 구현 구성성분들에 대해 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 임의의 구성성분, 모델, 타입, 물질, 세포, 버전 및/또는 양 등을 포함할 수 있다.

용어 "예시적인", "예" 또는 이의 다양한 형태들은 본원에서 예, 경우 또는 예시를 제공하는 의미로 사용된다. "예시" 또는 "예"로서 본원에 언급된 임의의 측면 또는 디자인이 반드시 다른 측면 또는 디자인을 능가하는 바람직하거나 또는 유익한 것으로서 해석되는 것은 아니다. 아울러, 예는 명확하게 하고 이해를 돕기 위해 제공된 것일 뿐 어떤 방식으로도 본원의 언급된 내용 또는 관련 부분으로 한정 또는 제한하고자 하는 의미는 아니다. 가변적인 범위에 대한 수많은 부가적인 또는 대안적인 예들이 존재할 수 있지만, 간결하게 하기 위해 생략된 것으로 이해된다.

본원은 수많은 여러 형태의 구현예들을 포함하고 있으며, 이는 도면에 도시되며, 본원에 상세한 구체적인 구현예들로 기술될 것이며, 본 발명의 내용이 언급된 방법 및 시스템의 원리에 대한 예시로서 간주되고, 예시된 구현예들에 대한 언급된 개념에 대한 넓은 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 치수의 생활성

Maher Al-Atari Abou-Asi et al. (2011)은, 5세 내지 7세의 환자는 치수가 없고 향후 여러가지 부위: 에나멜, 치수 (pulp), 치은 (gum), 백악질, 뼈, 혈관 및 신경의 치아를 형성하게 될 미분화된 세포 응집물인 치배 (dental germ)로 오히려 언급되기 때문에, Kerkis et al., 2006의 간행물에 따라 치수 (DP)로부터 추출된 만능성 세포의 오리진은 치수일 수 없다고 주장하였다. 그러나, Cordeiro et al. (2008)은, 인간의 탈락된 젖니로부터 유래된 줄기 세포가 DP-유사 조직을 생체내에서 생성한다는 것을 밝혀내었다. 저자들은 인간 치아 슬라이스내에서 제조된 생분해성 스캐폴드에 SHED를 접종하여 이를 면역결핍 마우스에 이식하였다. 이들은, 상기한 세포에 의해 형성된 조직이 생리학적 DP와 매우 유사한 아키텍처와 세포성 (cellularity)을 가짐을 관찰하였다. 투과 전자 형미경과 면역조직화학법을 이용한 상아질 시알로단백질 (dentin sialoprotein)에 대한 초미세구조 분석에서, SHED가 상아질모세포-유사 세포로 생체내에서 분화됨이 시사되었다. 특히, SHED는, LacZ로 안정적으로 형질전이된 SHED를 가진 조작된 조직에서 혈액-함유 혈관의 벽부에 라이닝된 세포에 대한 β-갈락토시다제 염색을 통해 입증된 바와 같이, 내피세포-유사 세포로도 분화되었다. 이 연구는, 탈락된 젖니가 DP 조직의 조작에 실현가능한 줄기 세포 소스임을 시사해준다.

본 발명자들은 추출 시점에 치수의 색을 토대로 세포 배양 전에 생육가능한 치수를 스크리닝하였다. 탈락된 치아는 세포 생활성의 표시로서 적색의 치수를 가져야 한다. 적색은 제거될 때까지 치수에 혈액이 공급되었음을 의미한다. 치수의 색이 회색인 경우, 이는 치수로의 혈액 공급이 약화되었을 가능성을 의미한다. 즉, 줄기 세포는 괴사 상태일 수 있으며, 회수시 더 이상 생존할 수 없다 (Arora et al., 2009).

치수 추출 및 배양에 대한 실시예는 윤리 위원회로부터 허가받은 고지된 동의를 구한 후 건강한 개체들로부터 수득한 신선한 탈락 유치로 수행하였으며 (Helsinki in Europe, IBR, USA), 50% pen/strep 용액 (100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ml 스트렙토마이신)과 50% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함하는 멸균 용액에서 반복하여 헹군 다음, 신선하게 추출된 치수를 다시 세척하고, 3-20% 소 태아 혈청 (FBS), 100 unit/ml 페니실린, 100 units/ mL 스트렙토마이신이 첨가된 DP 조직 유지 배지에서 치수의 생활성 검사를 수행하였다. 콜로니 형성이 최소 조작된 치수로부터 시작되고 세포가 플라스틱 세포 배양 표면에 부착되면, 안전성 검사 (무균성 검사 및 마이코플라스마 검사)를 수행한 다음 회수 사이클 및/또는 계대배양을 통한 세포 증식 및/또는 조직 또는 세포의 냉동보존을 반복하여 수행하였다.

치수 추출과 배양을 아래와 같이 수행하였다:

● 건강한 개체로부터 수득한 신선한 탈락 유치를 50% pen/strep 용액 (100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ml 스트렙토마이신)과 50% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함하는 멸균 용액에서 반복하여 세척한다.

● 멸균 바늘을 사용해 치아로부터 DP를 분리시킨다. 막 분리한 치수를 3% pen/strep 용액이 포함된 용액에서 세척한다. 치수에 대한 생활성 검사를 15% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone), 100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 2 mM 비-필수 아미노산이 첨가된 DP 조직 유지 배지에서 수행한다.

● 치수가 플라스틱 세포 배양 표면에 부착되기 시작하면, 콜로니 형성은 5일 내지 2주간 관찰될 것이다.

● 안전성 검사는 무균성 검사와 마이코플라스마 검사로 수행한다.

실시예 2: 치수 외식편 유래 줄기 세포

치아 오리진 유래의 줄기 세포에 대한 최근 리뷰 (Deepa Ponnaiyan 2014)에서 상세히 기술된 치아 조직에 대한 여러가지 예들은 치수 줄기 세포, 치주 인대 줄기 세포, 인간의 탈락 유치 유래의 줄기 세포, 치근단유두로부터 유래된 치낭 전구세포, 구강의 골막 줄기 세포 및 최근에는 치은 결합 조직 유래의 줄기 세포의 차별적인 바이오마커 특징을 나타낸다. 특히, 대부분의 마커들은 여러가지 치아 줄기 세포들에서 유사하지만, Notch와 CD29 마커는 다양한 치아 소스로부터 유래된 줄기 세포들 간에 발현이 차별적이다. 본원의 방법에 의해 수득된 세포에서의 시험관내 및 생체내 마커 발현은 동일하다.

실시예 3: 초기 계대에서 반복 회수로부터 인간 IDPSC 기형종의 형성

기형종 형성은 배아 줄기 세포 (ES) 세포 또는 유도 만능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등의 세포의 만능성을 측정하는데 필요한 툴이다. 최근 Gropp et al. (2012)에 의해 발표된 프로토콜과 유사한, 세포의 기형종 형성력 평가 프로토콜을 본 실험에 적용하였다. 본 방법은, 마우스 ES 세포와 인간 iPS 세포 10⁶개를 마트리겔 (Matrigel)과 함께 면역결핍 마우스에 피하 이식하였을 때, 상당히 재현가능하며 효과적인 것으로 확인되었다. 사례의 100%에서, 다수 동물들에서 기형종 형성이 관찰되었고, 심지어 이식 후 최대 6개월 간의 추적 검사에서도 관찰되었다. 본 발명자들은 이 방법을 다른 성체 간엽 줄기 세포 (MSC), 예를 들어 유치의 치수, 탯줄, 지방세포 조직 등으로부터 유래된 세포 등에 대한 생물-안전성 분석으로 사용하였다. 본원에 언급된 실험 시스템 외에도, 이 방법을 또한 부분적으로 만능성 마커를 발현하는 골수, 간, 난황낭, 요막 및 양수로부터 유래된 개의 태아 MSC를 이용해 검증하였다.

기형종 분석 방법:

종양의 발생을 4달간 (~16주) 모니터링하였다. 만능성 세포의 경우, 기형종에 대한 조직학적 기준들은 모두 3개의 배엽층으로부터 유래된 조직의 발생이었다. 이 분석은 병리학자에 의해 수행되었다. 성체/간엽 줄기 세포의 경우, 세포 주입부에서의 정상적인 조직 온전성에 대한 모든 변화 또는 임의 유형들을 살펴보았다.

결과

실험 시스템:

a. 마우스 배아 줄기 세포

b. 마우스 3T3 섬유모세포

c. 불멸성 (permanent) 마우스 세포주 Balbc 3T3 세포주, 클론 A31

d. 인간 iPS-IDPSC

e. 인간 ES 세포

f. 인간 IDPSC

본 발명자들은 다양한 실험들에 전술한 방법을 이용해, 본 발명자들이 확립한 여러가지 마우스 ES 세포주의 만능성을 규명하고, 아울러 마우스 ES 세포주로부터 수득한 서브-클론들의 특징 규명 및 제25 계대 이상에서의 ES 세포의 만능성을 검증하였다 (Sukoyan et al., 2002; Carta et al., 2006; Kerkis et al., 2007; Lavagnolli et al., 2007; Hayshi et al., 2010). 또한, 최근 본 발명자가 속한 그룹에서 발표한 최근 문헌 (Beltrao-Braga et al., 2011)에서는, 본 방법을 이용해, 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC: immature dental pulp stem cell)로부터 유래된 iPS 세포의 만능성을 규명하였다. 이 문헌에서, 인간 IDPSC는 iPS-IDPSC에 대한 대조군으로 사용되었다. 본 발명자들은, iPS-IDPSC가 모두 3개의 배엽층으로부터 기원한 조직으로 기형종을 형성하지만, IDPSC는 어떤 타입의 기형종 또는 임의의 다른 타입의 신생물을 형성할 수 없다는 것을 밝혀내었다.

실험 시스템:

a. 초기 계대 (n=10) 및 후기 계대 (n=10)의 IDPSC 일차 배양물 3종

b. 인간 일차 섬유모세포

본 발명자들은, 기존에, 배아 줄기 세포 마커들, 즉 Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 몇가지 간엽 줄기 세포 마커를, 적어도 처음 25회 계대배양 동안에 발현하면서, 정상적인 핵형과 줄기 세포의 특징적인 증식 속도를 유지하는, IDPSC 집단의 분리를 발표하였었다. 아울러, 이들 세포는 화학적으로 제한된 배양 조건 하에서 평활근과 골격근, 뉴런, 연골 및 뼈로의 획일적인 분화를 이행하도록 시험관내에서 유도할 수 있다. IDPSC는 크기가 작고 세포질내 세포 기관이 부족하지만, 이 세포는 전형적인 간엽/섬유모세포-유사 형태를 나타내는 나이브 (naive) 만능 세포와는 차이가 있다 (Lizier et al., 2012). IDPSC는 ES 및 iPS 세포와는 대조적으로 간엽성, 상피이다 (도 5). MSC 세포와 ES 세포 (또는 iPS 세포) 간의 기본적인 차이는, MSC는 이동성, 플라스틱 및 부착성이라는 것이다. MSC 세포는 세포외 기질을 합성하며, 세포 정션이 없는 세포 (cell junction free cell)이다.

종양 형성은 전술한 ES 및 iPS 세포와 관련있지만, 정상적인 MSC와는 무관하다. IDPSC는 MSC 집단으로 구성되며 만능성 마커를 발현하는 줄기 세포의 수는 가변적이다 (세포의 1-25%) (Kerkis et al., 2006; Lizier et al., 2012). 이 프로토콜은 IDPSC의 집단, 특히, 사용되는 세포의 수에 맞게 조절되었으며, IDPSC 중 20%가 만능성 마커를 발현하는 경우를 기준으로 계산되었다. IDPSC의 최기성 (teratogenicity)은 세포 10⁶개가 아닌 5 x 10⁶개로 분석하였다. IDPSC DNA의 존재가 실험한 모든 장기들에서 발견되었지만, 종양 형성 또는 임의의 형태병리학적 변화는 관찰되지 않았다 (Lizier et al.)

실시예 4: 줄기 세포의 기본 마커들의 발현 패턴은 치수 (DP)의 냉동보존에 의해 영향을 받지 않는다

탯줄, 양막낭, 태반으로부터 유래된 신생 세포 (newborn cell)와 치수 유래의 어린 줄기 세포의 미성숙 특성으로 인해, 이들 세포는 이의 성체 세포 (골수 및 지방세포 조직)와 비교해 더 높은 증식력과 증식율을 나타낸다. 그래서, 탯줄, 양막낭, 태반 및 치수로부터 유래된 세포는 동종이계 테라피 (allogenic therapy)로서 향후 사용하기 위해 먼저 냉동장치 (약 -80℃)에서 냉동시킨 다음 액체 질소 (약 -196℃)에서 냉동보존할 수 있다.

본 발명자들은, 외식편의 냉동보존 및 해동 전 또는 해동 후 회수된 세포가 동일한 인자 발현 패턴을 유지함을 확인하였다. 본 발명자들은, 냉동보존 전 및 이후의 치수 및 탯줄로부터 장기간의 배양을 통한 반복 회수 하에 최소 조작된 이식편으로부터 유래된 세포는, 간엽 마커 (즉, CD 73, CD 105, CD90)를 발현하며, 조혈 마커 (즉, CD34, CD45)를 발현하지 않으며, 하나 이상의 조직접합성 마커 - HLA-DR을 발현하지 않으며, 핵형 안정성을 유지하고, 다능성 (레티노익산, BMP- TNF, NGF 등과 같은 유도 인자와 함께 배양한 경우에 뉴런 등의 서로 다른 계통으로의 분화)을 유지한다는 것을, 확인하였다.

예를 들어, 유치로부터 수득한 치수를 냉동보존한 다음 IDPSC를 분리하기 위해 해동하였다. IDPSC를, 회수 0/ 계대 3 (HOP3)까지 배양하여, FACS 분석에 의해 신선한 DP로부터 입수된 동일 계대의 hIDPSC와 비교하였다. 이들 2종의 세포의 발현 패턴은 유사한 것으로 확인되었다 (표 3). 이들 2가지 타입의 IDPSC는 간엽 마커 (CD105, CD73, CD90) 발현은 양성이고, 조혈 마커 CD45 및 조직적합성 마커 HLA-DR의 발현은 음성이었다.

표 3. 치수 냉동보존이 hIDPSC의 특징적인 표현형에 미치는 영향

	형광 %
마커	냉동보존 전	냉동보존 후
CD105	99.51	99.57
CD73	83.11	96.01
CD90	99.03	98.63
CD45	5.79	7.09
HLA-DR*	0.2	0.3

실시예 5: 생장 배지가 hIDPSC의 증식율에 미치는 영향

hIDPSC를 배양하기 위한 최적의 증식 조건을 평가하기 위해, 동 수의 세포를 접종하여, 2가지 유형의 생장 배지 (표 4)에서 5일간 배양하였다. 세포 증식율은 타입 2 생장 배지에서 더 (2배) 높은 것으로 확인되었으며, 즉 DMEM-로우 글루코스로 구성되며 15% FBS가 첨가된 생장 배지가 세포 배양에 보다 최적이다.

표 4. 사용된 다양한 배지의 조성

조직 유지 배지	배지 1 (생장 & 조직 유지)	배지 2 (생장)
DMEM-F12	DMEM-F12	DMEM-Low 글루코스
FBS <5%	FBS >10% (예,15%)	FBS >10% (예,15%)
100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ml 스트렙토마이신	100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ml 스트렙토마이신	100 unit/ml 페니실린, 100 unit/ml 스트렙토마이신
2 mM L-글루타민	2 mM L-글루타민	2 mM L-글루타민
	2 mM 비-필수 아미노산	--

실시예 6: 치수 (DP)로부터 세포의 발육 (sprouting) 개시

2개의 동일한 DP 절편을 조직 배양으로 유지하였다. 이중 하나는 15% FBS 존재 하에 배양하고, 다른 절편은 혈청 고갈 스트레스 조건 (4.8% FBS) 하에 배양하였다. DP에서 세포의 생장 개시는 4.8% FBS 존재 조건에서는 3일째였고, 15% FBS 조건에서는 7일째였다. 즉, 혈청 고갈은 치수 전달에 필요한 시간을 단축할 수 있다. 따라서, 치수로부터 세포 생장 개시는 혈청 고갈 배지에서 더 빨랐다.

실시예 7: hIDPSC 후기 집단 (LP)의 파라크린 작용 ( paracrine effect)은 항-염증, 면역조절 및 항미생물 특성을 포함한다

MSC는 재생 환경을 파라크린 기전을 통해 보조하며, 항-염증성 기전과 면역조절 기전을 통해 조절한다.

병독성이 서로 다른 미코박테리아 투베르쿨로시스 (Mycobacteria tuberculosis)(Mtb) 및 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) 균주로 정맥내 감염된 C57Bl/6 마우스의 폐 세포에 의한 사이토카인 생산에 대한 IDPSC의 복막내 접종 효과 (도 8). BIOPLEX 테스트 데이타에 나타낸 바와 같이, IDPSC 접종은 감염된 폐 세포에 의한 사이토카인의 생산을 감소시킨다 (도 8). 전-염증성 사이토카인 (TNF-a, IL-1b, MIP-2, IL-17)과 항-염증성 사이토카인 (IL-10)의 현저한 감소는 고 병독성 Mtb 균주로 감염된 폐에서 관찰되었다. IFN-g 및 KC의 생산 감소는 현저하지 않았다. IDPCS를 접종받은 마우스에서만 IL-4 생산 유도가 관찰되었다.

종양 괴사 인자 (TNF, 카케신 (cachexin) 또는 카케틴 (cachectin) 및 종래에는 종양 괴사 인자 α 또는 TNFα)는 전신성 염증에 관여하는 아디포카인 (adipokine)이다. TNF의 주된 역할은 면역 세포의 조절이다. 내인성 발열성 물질인 TNF는 열, 세포자살성 세포 사멸, 악액질, 염증을 유도할 수 있으며, 종양형성 및 바이러스 복제를 저해하고, IL1 & IL6 생산 세포를 통해 패혈증에 반응할 수 있다. TNF 생산에 대한 조절 이상은 알츠하이머 질환 등의 다양한 인간 질환과 연루되어 있다.

인터페론 gamma (IFNγ 또는 IFN-g)는, 바이러스 및 세포내 박테리아 감염에 대한 선천적인 및 후천적인 면역과 종양 방제에 중요한 면역 인터페론 사이토카인으로서 알려져 있는, 클래스 II 타입의 인터페론에 속하는 이량성 가용성 사이토카인이다. IFNγ는 대식 세포의 중요한 활성인자이다. 비정상적인 IFNγ 발현은 다수의 염증성 질환과 자가면역 질환과 연관되어 있다. 면역계에서 IFNγ의 중요성은 바이러스 복제를 직접 저해하는 IFNγ의 능력에 일부 기인하며, 가장 주요하게는 IFNγ의 면역자극 및 면역조절 작용에서 일부 기인한다.

인터루킨 17은, IFNγ와 유사하게, 염증 부위로 단핵구와 호중구를 동원하기 위해 다양한 조직들에서 케모카인 생산을 증가시킴으로써 지연-타입의 반응에 강력한 매개인자로서 작용하는, 사이토카인이다. 인터루킨 17은 세포외 병원체에 의한 면역계 침입에 반응하여, 병원체의 세포 매트릭스에 대한 파괴를 유도하는, 전염증성 사이토카인이다.

인터루킨-1 beta (IL- 1β)는, 또한 카타볼린 (catabolin)이라고도 하며, 염증 반응의 중요한 매개인자인 사이토카인 단백질이다. 이것은 세포 증식, 분화 및 세포자살 등의 다양한 세포 활동에 관여한다. 가장 주목할만한 IL-17 역할은 전염증성 반응 유도 및 매개에 참여하는 것이다. IL-17은 일반적으로 알레르기 반응과 관련있다.

인터루킨-10 (IL-10)은, 인간 사이토카인 합성 저해 인자 (CSIF)로도 알려져 있는, 항-염증성 사이토카인이다. IL-10은 면역조절 및 염증에 다면발현 효과 (pleiotropic effect)를 가진 사이토카인이다.

케모카인 리간드 2 (CXCL2)는, 대식세포 염증성 단백질 2 (MIP-2)로도 지칭되며, 호중구의 염증 반응을 조절하는데 주된 역할을 담당하며, 패혈증 발생의 매개인자이다. KC 및 대식세포-염증성 단백질-2 (MIP-2)는 수술 상처로 인해 피부에서 구분되는 일시적인 발현 패턴을 나타내는 C-X-C 모티프를 가진 케모카인이다. KC 및 MIP-2는 호중구의 주화성 물질이다. 이들 2종의 케모카인들은 광범위한 급성 및 만성 염증 스펙트럼에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 뒤이은 염증 반응의 성질과 정도를 결정짓는 중요한 결정인자로 간주된다.

실시예 8: 최소 조작된 조직에 대한 복수의 회수 (LP)에 의해 수득되는 hIDPSC의 강력한 면역조절력

IDPSC는, 공동-배양시 단핵구-유래 수지상 세포로부터 유래되는, 면역-조절 작용을 나타낸다. 공동-배양시, Lin T 증식력은 저하되고 (50% 이상), Lin T CD4⁺/FoxP3⁺/IL10⁺ 및 Lin T CD4⁺/FoxP3⁺/IFN-γ⁺ 세포의 비율을 현저하게 높이는 방향으로 Lin T 분화가 유도된다. IDPSC에서 HLA-DR 발현 효과는 관찰되지 않았다.

본 발명자들은, 최소 조작된 조직을 반복 회수 (Cellavita 방법)하여 수득된 줄기 세포가 대부분의 만능성 마커를 발현하지만, 이들 줄기 세포를 마우스에 주사하였을 때 기형종이 형성되지 않는다는 것을 입증하였다.

표 5. 신선 배양 유래 세포 및 냉동보존한 치수 및 세포 유래의 세포를 이용한 모델인 다양한 포유류 종들 간의 hIDPSC 치료 비교

개체	상해 또는 질환의 유형	무게	투여	이식 횟수	이식되는 세포의 수	효능 점수: 0-5
냉동보존된 치수로부터 유래된 hIDPSC 세포와 계대 수가 낮은 (3-4계대) 세포를 이용한 새로운 세포 테라피 치료
개 (n = 30)	Dempster (인간 다발성 경화증)	a. 3-5 kg b. 5-20 kg c. > 20 kg	내인성 (EV)	a. 1-2 b. 2-3 c. 4	a. 4 x 10⁶ b. 6 x 10⁶ c. 4 x 10⁶	2-5^* * 모든 개체들 역기능없이 생존함: - 40% 치유됨 (3-4) - 50% 유의한 기능 회복 (4-5) - 10% 기능 회복 불충분, 시간에 따라 개선됨 (2-3)
인간 (n = 5)	뼈 재생, 치아 임플란트 (dental implant)	평균 70 kg	국소 (스캐폴드와 함께)	1	2 x 10⁶	5 뼈 재생, 성숙화 및 신생혈관형성
신선한 세포를 이용한 치료 (종래 2006-2011에 발표)
마우스 (n = 16)	척추 손상	25-30 g	병변 부위	1	8 x 10⁵	4 백색질 재생 및 일부 기능 회복
랫 (n = 8)	5 mm x 8 mm 머리뼈 결함	320-420 g	국소 (스캐폴드와 함께)	1	1 x 10⁶	5 뼈 재구축
토끼 (n = 15)	각막 결함 직경 6.0-10.0 mm	-	국소 (스캐폴드와 함께)	1	1 x 10⁶	3-4 각막 재건 동물들 중 50%에서 기능 회복 (점수는 상처의 중증도에 따라 결정됨)
양 (n = 4)	대퇴골 괴사	35 kg	국소	1	1 x 10⁶	5 뼈 재생, 기능 회복

실시예 9: 치수에서 새로운 신경얼기 및 서브상아질모세포의 줄기 세포 발굴

초기 뉴런 마커인 네스틴에 대한 면역염색시, 신경얼기, 혈관주위 니치 (perivascular niche) 및 상아질모세포밑 니치에서 발현 차이가 확인되었다. 신경얼기에서 세포는 네스틴에 양성인 (도 11C, b)인 반면, 혈관주위 니치의 세포는 네스틴 음성 (도 11C, a)이었다. 세포-비존재 및 세포-풍부 구역의 니치에서는 네스틴 음성이었지만 (도 11D, d 및 11F, d), 서브-상아질모세포 니치에서의 세포 역시 네스틴 양성이었다 (도 11D, c 및 11E, c).

실시예 10: 탯줄에서 추정의 줄기 세포 니치 발견

신경미세섬유 (NF) 및 저-친화성 신경 성장인자 수용체 (p75 또는 CD271)를 검출함으로써 탯줄에서 추정의 줄기 세포 니치를 확인하였다. NF는 뉴런에서 발견되는 10 nm 필라멘트 또는 중간 섬유이다. CD271은 뉴로트로핀 (neurotrophin)에 대한 2종의 수용체들 중 하나로서, 뉴런 세포의 생존 및 분화를 자극하는 단백질 성장인자 패밀리이다. NF와 CD271은 둘다 탯줄 조직에서 발견되었다. NF는 주로 양막하 상피 영역에서 발현되는데 (도 12A) 반해, CD271의 발현은 주로 정맥과 동맥에서 발현된다 (도 12B). 이들 니치로부터 분리된 줄기 세포는 뉴런 분화를 시험관내에서 이행하여 베타-III 투불린과 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP)를 발현할 수 있었다 (도 12C 및 12D).

실시예 11: 탯줄에서 만능성 줄기 세포 또는 미성숙 전구체 니치의 발굴

Oct 3/4, nanog 및 Sox2 등의 전사 인자의 발현을 검출하였다. Oct 3/4 단백질 발현은 WJ, 정맥 (VE), 동맥 (AR)과, 양막 상피 (AEP)의 기저층 (BL)에 위치된 세포에서 핵에 위치하는 것으로 적절하게 검출되었다 (도 13). 만능성 줄기 세포와 유사하게, 핵내 이들 3종의 마커들을 모두 발현하는 세포가 소량 검출되었다. 즉, 본 발명자들은 VE 또는 AR로부터 "진성 (genuine)" 만능성 줄기 세포가 소량, 그리고 탯줄의 AEP로부터 소량 분리됨을 예상할 수 있다. 이들 세포는 태반 및 배아외 중배엽으로부터 유래된 조직 등의 다른 관련 조직들에서도 발견될 수 있다.

실시예 12: 안전성 분석 - 수회 기계적 이동 후 줄기 세포 니치의 시험관내 배양

인체의 특정 해부학적 부위에 위치된 줄기 세포들이 줄기 세포 니치 (SCN)로 지칭된다는 것은 공지의 사실이다. 각 조직은 자신의 SCN을 가지는데, 주변 미세환경으로부터 수신된 신호에 반응하여 줄기 세포의 운명이 결정된다. 그러나, 줄기 세포의 천연적인 니치내에서의 인 시추 생물학적 특징과 MSC를 시험관내 배양하는 동안 이러한 특징이 어떻게 바뀔 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 예를 들어, 세포는 일부 단백질 발현을 중단시키거나 또는 새로운 단백질 발현의 개시를 유도할 수 있다. 이 문제는, 임상 실험에 광범위하게 연루될 수 있고 재생 의학에서 줄기 세포의 성공 및/또는 실패를 설명할 수 있기 때문에, 매우 중요하다. 시험관내 배양된 세포는 조직 아키텍처 뿐만 아니라 조직에 기반한 모든 작용 (세포 간의 상호작용, 특정 인자의 분비 등)이 결여되어 있다. 이것이, 세포주가 조직-특이 기능을 상실할 수 있고, SCN내 세포와 상당히 다른 분자 표현형을 획득할 수 있는, 이유이다. SCN내에서 줄기 세포 마커의 발현 패턴 평가는 줄기 세포의 안전성 평가를 위해, 특히 인간에서의 사용을 위해 필수적이다.

표 6에서, 본 발명자들은, 수회 기계적 이동을 이용해 배양한 시험관내 세포 샘플을 분리 및 유세포 측정한 후, 생체내 조직 샘플의 세포에 대한 면역조직화학적 분석을 통해 수득한 데이타를 요약 개시하였다. 표 6에 따르면, 줄기 세포에 의해 생체내 및 시험관내에서 특히 치수에 의해 발현되는 대부분의 마커들은 기계적 이동 후 수득된 분리된 세포에서 마커 결핍을 나타내지 않았다. 탯줄 조직을 기계적으로 이동시킨 후 수득된 세포에서는, c-kit 및 비멘틴을 발현하는 세포의 수에 차이가 약간 있었다. 이러한 결과는 치수 및 탯줄 조직으로부터 분리된 줄기 세포의 결과이지만, 다른 소스 유래의 줄기 세포, 심지어 액상 세포로 상기한 안전성 분석을 적용할 수 있다.

표 6. 치수 및 탯줄 조직 유래의 줄기 세포에서 생체내 및 시험관내 기본 줄기 세포 마커의 발현 패턴. +++는 세포 수 많음, ++는 세포 수 중간 수준, +는 세포 주 적음을 나타낸다.

마커	치수		탯줄
마커	생체내	시험관내	생체내	시험관내
Oct 3/4	+++	+++	+++	+++
Nanog	+	+	+	+
Sox2	++	++	+	+
Nestin	+++	+++	+	+
CD271 (p75)	+++	+++	+	+
NF	++	++	+	+
PCK	++	++	+	+
SDC 3	++	++	+	+
CD29	+++	+++	+++	+++
CD140b	+	+	+	+
CD146	++	++	+++	+++
HLA-ABC	+	+	++	++
C-kit (CD117)	++	++	+++	+
Fibronectin	+++	++	+++	+
CD105 (SH-2)	+++	+++	+++	+++
CD90 (Thy-1)	+++	+++	+++	+++
SDC 1	+++	+++	+	+
Vimentin	+++	+++	+++	+
STRO-1	+	+	n/a	n/a
CD44	++	++	+++	+++
CD166	++	++	++	++
CD73	+++	+++	++	++

달리 정의되지 않은 한, 본원의 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 또는 등가인 모든 방법 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 물질이 본원에 언급된다. 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 공개공보는 다양한 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본원에 논의된 공개문헌들은 본 출원의 출원일 이전의 내용만을 제공한다. 본 발명이 선행 발명이라는 이유로 상기한 공개문헌 보다 앞설 자격이 없다는 용인으로서 해석되어서는 안된다.

기술된 본 발명은 언급된 구체적인 방법, 프로토콜 및 물질들이 바뀔 수 있으므로, 이들로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 구체적인 예를 단지 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구항으로만 제한되는 것으로 이해된다.

당해 기술 분야의 당업자라면 일상적인 수준을 넘어선 실험없이도 본원에 기술된 본 발명에 대한 구체적인 예들에 대한 등가의 내용을 인지하거나 또는 알 수 있을 것이다. 이러한 등가의 내용은 아래 청구항에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포 집단 (primary derived stem cell population)을 시험관내에서 증식 (expanding)시키는 방법으로서,
상기 방법은, 외식편 조직을 배양 배지에서 2회 이상의 회수 사이클 (harvest cycle)로 배양하는 단계를 포함하며,
상기 회수 사이클은 세미-컨플루언트 (semi-confluent) 줄기 세포 배양물을 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 조직을 배양 배지에서 유지하는 단계 및 상기 세미-컨플루언트 줄기 세포를 최종 줄기 세포 집단으로 수집하는 단계를 포함하며,
상기 외식편 조직은 각각의 회수 사이클 수행 전에 최소한으로 조작되는, 시험관내 증식 방법.
외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포들의 증식 집단을 시험관내에서 수득하는 방법으로서,
상기 방법은,
a. 상기 외식편 조직을 세척하고, 최소한으로 조작하는 단계;
b. 상기 외식편 조직을 제1 배양 표면에서 배양 배지를 이용해 시험관내에서 배양하여, 일차 유도 줄기 세포의 배양을 확립하는 단계;
c. 상기 배양 배지로부터 일차 유도 줄기 세포를 수집하는 단계;
d. 상기 외식편 조직을 배양 배지와 함께 제2 배양 표면으로 이동시키는 단계;
e. 상기 외식편 조직으로 단계 b, c 및 d를 1회 이상 반복 실시하여, 외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포들의 증식 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 외식편 조직으로부터 일차 유도 줄기 세포들의 증식 집단을 시험관내에서 수득하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 일차 유도 줄기 세포를 생장 배지 (growth medium)에서 계대 배양하고, 상기 생장 배지로부터 줄기 세포를 수집하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
1회 이상의 회수 사이클 동안 배양 배지에서의 상기 조직의 배양은 상기 조직을 혈청이 5% 미만으로 포함된 배양 배지에서 일차로 배양한 다음 혈청이 15% 함유된 배양 배지에서 배양하는 것인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 조직을 혈청이 5% 미만으로 포함된 배양 배지에서 배양하는 기간이 3일인, 방법.
제5항에 있어서,
상기 조직을 혈청이 15% 함유된 배양 배지에서 배양하는 기간이 7일인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
상기 배양 배지 및 상기 생장 배지가 DMEM인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 배양 배지가 DMEM-F12인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 생장 배지가 DMEM-로우 글루코스 (DMEM-low glucose)인, 방법.
제9항에 있어서,
상기 생장 배지는 비-필수 아미노산으로 보충되지 않은, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서,
외식된 세포 및/또는 계대 배양된 세포가 안정적인 핵형을 가지는, 방법.
제1항 또는 제2항의 방법으로부터 수득되는 줄기 세포를 포함하는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물이 초기 3회의 회수 사이클들로부터 수득되는 외식된 세포를 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물이 초기 65회의 회수 사이클들로부터 수득되는 외식된 세포를 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물이 초기 100회의 회수 사이클들로부터 수득되는 외식된 세포를 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
적어도 제1 계대 (P1)로부터 수득되는 계대 배양된 세포를 더 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조성물이 P1 내지 P3에서 수득되는 계대 배양된 세포를 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조성물이 P1 내지 P50에서 수득되는 계대 배양된 세포를 포함하는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조성물은 냉동 상태로 보관될 수 있으며, 조성물의 해동 후 줄기 세포의 마커 발현에는 변화가 없는, 치료학적 줄기 세포 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서,
상기 줄기 세포가 신경 능선 (neuronal crest) 또는 말초 신경계 오리진의 줄기 세포인, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조직이 치수 (dental pulp)인, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서,
상기 줄기 세포가 성체 또는 신생아 줄기 세포, 비-배아 줄기 세포인, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조직이 산후 조직 (postpartum tissue)인, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서,
상기 산후 조직이 탯줄 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제3항에 있어서,
일차 유도 및 계대 배양된 줄기 세포들을 혼합하여, 하나의 외식편 조직으로부터 일차 유도 및 계대 배양된 줄기 세포의 배치 (batch)를 제조하는, 방법 또는 치료학적 줄기 세포 조성물.
제2항에 있어서,
단계 e가 30회 이상 반복되는, 방법.
제1항 내지 11항 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서,
상기 외식편 조직이 각 회수 사이클 수행 전에는 효소적으로 또는 화학적으로 처리되지 않거나 또는 해부되지 않는, 방법.