KR20170024827A - The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same - Google Patents

The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same Download PDF

Info

Publication number
KR20170024827A
KR20170024827A KR1020150120349A KR20150120349A KR20170024827A KR 20170024827 A KR20170024827 A KR 20170024827A KR 1020150120349 A KR1020150120349 A KR 1020150120349A KR 20150120349 A KR20150120349 A KR 20150120349A KR 20170024827 A KR20170024827 A KR 20170024827A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
qpcr
nucleic acid
reaction
cartridge
film
Prior art date
Application number
KR1020150120349A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
박한오
박한이
이양원
송구영
김종갑
Original Assignee
(주)바이오니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)바이오니아 filed Critical (주)바이오니아
Priority to KR1020150120349A priority Critical patent/KR20170024827A/en
Publication of KR20170024827A publication Critical patent/KR20170024827A/en

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Abstract

The present invention relates to a quantitative PCR (qPCR) cartridge with a microchannel film reactor, a nucleic acid extraction module and a qPCR reaction composition module, and a high-speed qPCR system using the same and, more specifically, to a cartridge (100) for nucleic acid extraction and a qPCR capable of qualitatively and quantitatively analyzing nucleic acids, antibodies, and antigens which are target materials with high sensitivity through qPCR, reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR), realtime nested PCR (rt-nPCR), realtime nested RT-PCR (rt-nRT-PCR), digital PCR (dPCR), digital RT-PCR (dRT-PCR) or immuno-qPCR, (I-qPCR), and to a high-speed qPCR system integrally comprising: a qPCR reaction unit (150) performing qPCR reaction using the cartridge; a cartridge driving unit (200); an optical unit (300); and a control unit (400).

Description

미세유로 필름 반응기, 핵산 추출 모듈 및 qPCR 반응조성물 모듈이 구비된 qPCR 카트리지 및 이를 이용한 고속 qPCR 시스템{The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0002] The present invention relates to a qPCR cartridge including a micro-channel film reactor, a nucleic acid extraction module, and a qPCR reaction composition module, and a high-speed qPCR system using the same. the Same}

본 발명은 미세유로 필름 반응기, 핵산 추출 모듈 및 qPCR 반응조성물 모듈이 구비된 qPCR 카트리지 및 이를 이용한 고속 qPCR 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표적 물질인 핵산, 항체, 항원들을 정량 PCR(quantitative PCR, qPCR), 역전사-정량 PCR(Reverse Transcription-quantitative PCR, RT-qPCR), 실시간 네스티드 PCR(realtime nested PCR, rt-nPCR), 실시간 네스티드 역전사-PCR(realtime nested RT-PCR, rt-nRT-PCR), 디지털 PCR(digital PCR, dPCR), 디지털 역전사-PCR(digital RT-PCR, dRT-PCR) 또는 면역-정량 PCR(Immuno-qPCR, I-qPCR)를 통해 고민감도로 정량ㆍ정성 분석할 수 있는 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100)와 상기 카트리지를 이용하여 qPCR 반응을 수행하는 qPCR 반응부(150), 카트리지 구동부(200), 광학부(300) 및 제어부(400)가 일체형으로 구비된 고속 qPCR 시스템에 관한 것이다.
The present invention relates to a qPCR cartridge equipped with a microfiltration membrane reactor, a nucleic acid extraction module and a qPCR reaction composition module, and a high-speed qPCR system using the same. More particularly, the present invention relates to a qPCR cartridge, qPCR), reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR), real-time nested PCR (rt-nPCR), real-time nested RT- Quantitative and qualitative analysis with high sensitivity through PCR, digital PCR, dPCR, digital RT-PCR, dRT-PCR or immuno-qPCR A cartridge driving unit 200, an optical unit 300, and a controller (not shown) for performing a qPCR reaction using the cartridge and a cartridge 100 for a nucleic acid extraction and a qPCR (quantitative polymerase chain reaction) 400 are integrally provided.

체외진단검사(in vitro diagnostic testing: IVD testing)는 질병의 원인을 정확하게 판정할 목적으로 혈액, 뇨(urine), 객담, 타액(saliva), 체액 등 인체에서 유래하는 시료를 검체로 하여 특정 지표 물질을 검출하거나 정량 분석하는 검사이다. In order to accurately determine the cause of the disease, in vitro diagnostic testing (IVD testing) is performed by using a sample derived from human body such as blood, urine, sputum, saliva, Is detected or quantitatively analyzed.

분자진단검사(Molecular diagnostic testing)는 분자 표적을 대상으로 하는 진단이고, 핵산진단검사(NAT; nucleic acid testing)는 표적 핵산을 대상으로 하는 진단검사로서, 공지된 인간 유전체와 각종 병원체들의 핵산 염기서열을 대상으로 PCR 방법에 의한 표적의 증폭이 가능하므로 정확한 진단이 가능하여 체외진단검사 시장 중 가장 빠른 속도로 성장하는 분야이다. Molecular diagnostic testing is a molecular diagnostic test, and nucleic acid testing (NAT) is a diagnostic test that targets target nucleic acids. It uses known human genomes and nucleic acid sequences of various pathogens , It is possible to amplify the target by the PCR method. Therefore, it is the fastest growing field among the in vitro diagnostic tests market because accurate diagnosis is possible.

분자진단검사는 바이러스, 세균 등의 감염질환에 대한 정성ㆍ정량검사가 주종을 이루고 있고, 감염질환의 감염여부를 확인하거나 바이러스의 혈액 내 농도를 측정하는 데 사용되고 있고, 항생제 내성변이주를 확인하기 위한 검사 등이 이루어지고 있다. Molecular diagnostic tests are mainly used for qualitative and quantitative tests for infectious diseases such as viruses and bacteria. They are used for checking infectious diseases or measuring the concentration of virus in blood, and for checking antibiotic resistant mutants Inspection and so on.

종양의 조기진단, 치료법의 효능증가를 위한 진단검사도 빠른 속도로 증가하고 있고, 개인의 유전적 소인(genetic predisposition)에 따른 질병과 관련된 이상 유전자를 검출하거나 치료법의 결정과 약물 선택 및 약효 평가를 위한 개인맞춤형 의학(personalized medicine)의 분야에서 다양하게 응용되고 있다. Early diagnosis of tumors and diagnostic tests for increasing the efficacy of therapies are also increasing rapidly. In addition, detection of abnormal genes related to diseases according to genetic predisposition of individuals, determination of treatment methods, drug selection and drug efficacy evaluation And in the field of personalized medicine.

표적 핵산을 실시간으로 정량분석할 수 있는 qPCR 기술은 극미량의 병원체들도 정확하게 정성ㆍ정량적으로 진단할 수 있어 분자진단의 핵심기술로서 상기 분자진단 응용분야의 많은 진단키트들이 개발되어 있다. QPCR technology capable of quantitatively analyzing target nucleic acid in real time can accurately and qualitatively diagnose even a very small amount of pathogens, and many diagnostic kits of the molecular diagnostic application field have been developed as a core technology of molecular diagnostics.

현재 qPCR을 자동화한 시스템들이 개발되어 핵산 추출과 qPCR, RT-qPCR 등의 반복적이고 복잡한 조작을 자동화한 시스템들이 대형병원과 임상검사 전문기관을 중심으로 사용되어 검사가 이루어지고 있다. 현재 이용되고 있는 분자진단검사의 자동화 시스템은 핵산의 추출, 증폭 및 확인의 전 과정을 자동화시키는 방향으로 발전되어 왔다. 그중 한 예로 Gen-Probe의 티그리스 다이렉트 튜브 샘플링(TIGRIS Direct Tube Sampling, TIGRIS(TM) DTS) 시스템은 미국 식약청의 승인을 받은 최초의 자동화 시스템으로 표적 핵산의 포획, 증폭, 확인 및 검사결과 출력 과정이 자동화되어 있고, 대표적인 성병 중 하나인 임질의 원인균인 임질균(Neisseria gonorrhoeae)과 성감염질환 원인균인 클라미디아 드라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 감염 여부를 검사할 수 있다. 다른 예로 로슈 분자 시스템(Roche Molecular Systems)의 COBAS(TM) 시스템(Ampliprep, Taqman analyzer), Abbott의 m2000 시스템(m2000sp, m2000rt)과 같이 많은 시료들을 처리할 수 있는 시스템들이 개발되어 출시되었다. 상기 자동화 시스템은 동시에 많은 검체를 처리할 수 있지만 시스템이 고가이고 검사의 처리시간이 3~5시간 걸리는 단점이 있어서 대형 검사센타들을 대상으로 운영되고 있다. Currently, qPCR automated systems have been developed, and systems that automate repetitive and complex manipulations such as nucleic acid extraction, qPCR, and RT-qPCR have been used in large hospitals and clinics. Currently, the automated system for molecular diagnostic tests has been developed to automate the entire process of nucleic acid extraction, amplification and identification. One example of this is Gen-Probe's TIGRIS Direct Tube Sampling (TIGRIS (TM) DTS) system, the first automated system approved by the US Food and Drug Administration to capture, amplify, Neisseria gonorrhoeae , a causative organism of gonorrhea, one of the representative sexually transmitted diseases, and Chlamydia trachomatis , a sexually transmitted disease causative organism, can be examined. Other systems have been developed and released that can process many samples, such as the Roche Molecular Systems COBAS (TM) system (Ampliprep, Taqman analyzer) and Abbott's m2000 system (m2000sp, m2000rt). The automation system can handle many samples at the same time, but it has a disadvantage that the system is expensive and the processing time is 3 ~ 5 hours.

소규모 1차 의료기관에서도 쉽게 사용할 수 있는 분자진단 시스템으로 Cepheid의 GeneXpert(TM) 시스템, IQuum Inc의 Liat(Lab-in-a-tube) analyzer 등이 실시간 중합효소 연쇄반응 기반의 자동화 시스템으로 개발되어 시장에 출시되어 있다. 상기 시스템들은 1개의 임상시료를 처리하여 시스템 가격은 저렴하고 사용도 간편할 뿐만 아니라 1회용 카트리지를 사용하고 있어 교차오염에 대한 우려가 없는 장점이 있다. 그러나 검사시간이 1시간 이상 걸리므로 의료현장에서 바로 결과를 보고 처방을 내리기까지 오랜 시간을 기다려야 하는 문제점이 있다. 또한, 상기 자동화 시스템은 한번에 많은 종류의 병원균 검사를 수행할 수 없기 때문에 감염균이 검출될 때까지 각각의 감염균 검사키트를 이용하여 여러 종류의 검사들을 수행해야 하는 문제점이 있다. The Cepheid GeneXpert (TM) system and IQuum Inc's Liat (Lab-in-a-tube) analyzer have been developed as real-time polymerase chain reaction based automation systems and can be easily used in small primary medical institutions. . These systems process one clinical sample and are cheap and easy to use as well as having a disposable cartridge, which is advantageous in that there is no fear of cross contamination. However, since the examination takes more than an hour, there is a problem in that it takes a long time to wait for the results and the prescriptions to be immediately obtained at the medical field. In addition, since the automation system can not perform many types of pathogen testing at one time, there is a problem in that various types of tests must be performed using each of the infectious disease test kits until the infecting bacteria are detected.

상기 문제점을 해결하기 위해 한 종류의 시료를 가지고 많은 수의 표적을 한번에 표적을 다중 검사할 수 있는 제품으로 Biofire사에서 FilmArray　제품이 개발되었다. 현재 출시된 제품으로는 27개의 혈액감염균을 혈액배양확인 패널, 17개의 호흡기 감염바이러스들과 3종의 폐렴균을 검출할 수 있는 호흡기 패널, 22종의 소화기 감염바이러스, 세균, 기생충을 동시에 검사할 수 있는 소화기 감염 패널이 개발되어 있다. 필름 사이에 형성된 구획과 유로를 통해 핵산 추출 후 원형의 PCR 반응기에서 1차 PCR을 수행한 후 상기 PCR 용액을 수십 개의 원형반응기 배열에 주입하여 2차로 nested qPCR을 수행하면서 여기에서 발생하는 형광을 검출해 각각의 표적을 측정하는 방식으로 민감도가 높고 다중의 표적을 검출할 수 있는 장점이 있다. 그러나 상기 시스템도 1시간 정도 시간이 걸려서 현장에서 검사를 하고 처방을 하기 위해서는 환자가 기다려야 하거나 다시 병원을 방문해야 하는 문제점이 있다. 또한, 1차로 다중의 표적을 대상으로 하는 multiplex PCR에서 정량적인 증폭이 어려워 2차 PCR을 통해 민감도는 높일 수 있지만 정량적인 검출을 하는 데 있어서는 한계가 있어 모두 정성검사 패널을 출시하고 있다. 또한, Filmarrary에 사용되는 카트리지는 용액을 가해서 건조시약을 녹이는 과정을 작업자가 해주어야만 한다. 카트리지에 용액을 담아 놓으면 장기 보존시에 누액으로 인해 제품이 손상될 수 있어 건조된 시약을 용액으로 다시 녹이는 과정으로 해결하고 있다. 그러나 이 과정은 작업자가 불편할 뿐만 아니라 용액을 가해주는 과정에서 오염이 발생할 가능성도 있다. In order to solve the above problem, it is possible to test multiple targets with one kind of sample at one time. 　 The product was developed. Currently, 27 blood-borne infectious disease bacteria can be tested simultaneously on the blood culture confirmation panel, a respiratory panel capable of detecting 17 respiratory infections and 3 pneumococci, and 22 parasites, bacteria and parasites A panel of digestive tract infections has been developed. After the nucleic acid is extracted through the compartments and the channels formed between the films, the first PCR is performed in a circular PCR reactor, and then the PCR solution is injected into dozens of circular reactor arrays to perform the second nested qPCR, The method of measuring each target of the sun has the advantage of being able to detect multiple targets with high sensitivity. However, the above system also takes about one hour, so there is a problem that the patient has to wait or visit the hospital again in order to perform the examination at the site and prescribe. In addition, it is difficult to perform quantitative amplification in a multiplex PCR which targets a plurality of targets, so sensitivity can be increased through a second PCR. However, there are limitations in quantitative detection, and thus all qualitative test panels are being released. In addition, cartridges used in filmarrays must be handled by the operator to dissolve the drying reagent by adding the solution. If the solution is stored in the cartridge, the product may be damaged due to leakage during long-term storage, and the drying reagent is dissolved again in the solution. This process, however, is not only inconvenient for the operator, but also may cause contamination in the course of applying the solution.

한편, 극미량의 표적을 검출하기 위해 개발된 디지털 PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)은 표적이 많은 다른 핵산들에 들어 있을 때 비특이적인 반응에 의한 표적 이외에 많은 유사 표적이 증폭되어 정량검출이 불가능한 문제를 해결한 기술이나(Quantstudio 3D, Life technology), 핵산의 추출, 반응, 검출 등이 분리되어 있어 불편하고 많은 표적이 들어 있는 경우 검출이 불가능하여 시료를 희석해서 사용해야 하는 문제점이 있어 분자진단에 활발하게 사용되지 못하고 있다. 그러나 극미량의 표적 핵산을 정확하게 검출하기 위해서는 dPCR이 가지고 있는 장점이 있으므로 이를 분자진단에 활용하기 위해서는 극소수의 표적부터 많은 수의 표적까지 검출하고 전자동으로 시료 처리가 가능한 새로운 개념의 장비가 필요하다. On the other hand, the digital polymerase chain reaction (dPCR), which was developed to detect a trace of a target, has a number of similar targets amplified in addition to non-specific targets when they are contained in other target nucleic acids, (Quantstudio 3D, Life technology), nucleic acid extraction, reaction, and detection are separated. If there are inconvenient and many targets, it is impossible to detect them. It is not used to. However, in order to accurately detect a trace amount of target nucleic acid, dPCR has a merit. Therefore, in order to utilize it in molecular diagnosis, a new concept device capable of detecting a small number of targets to a large number of targets and fully automatic sample processing is needed.

한편, 표지 항체에 프로브 핵산을 부착한 후 상기 프로브 핵산을 정량 PCR법을 이용하여 정량함으로써 표적 항원이나 항체를 고감도로 측정할 수 있는 immuno-qPCR(I-qPCR)은 qPCR이 가지는 단일 표적을 증폭할 수 있어 높은 민감도를 가지고 있고, 1~109의 광범위한 표적들을 정확하게 측정할 수 있고, 5개 이상의 다중의 표적을 하나의 반응기에서 증폭할 수 있어 여러 개의 표적을 검출할 수 있어서 화학발광법을 대체할 수 있는 차세대 면역진단 방법이다. 다만, 상기 진단방법은 조작이 복잡하여 시간이 오래 걸리고 자동화가 되지 않아 아직 실용화되지 못하고 있다. 그러므로 이러한 복잡한 I-qPCR의 단계들을 자동화하여 여러 개의 표적들을 빠르게 검출할 수 있고, 전자동으로 시료처리가 가능한 새로운 개념의 시스템이 필요하다. On the other hand, immuno-qPCR (I-qPCR) capable of measuring the target antigen or antibody with a high sensitivity by attaching the probe nucleic acid to the labeled antibody and then quantifying the probe nucleic acid using the quantitative PCR method can amplify a single target having qPCR It is highly sensitive and can accurately measure a wide range of targets from 1 to 10 9 and can amplify more than 5 multiple targets in one reactor to detect multiple targets, It is a next-generation immunodiagnostic method that can be replaced. However, the above-described diagnostic method is complicated in operation, takes a long time, and can not be automated. Therefore, there is a need for a new conceptual system that can automatically detect multiple targets and automate the processing of these complex I-qPCR steps.

일반적으로 생물체로부터 핵산을 정제하는 과정은 다양한 시약을 이용하여 수작업으로 추출하거나 전자동 유전자 추출 장비를 통하여 추출할 수 있다. 하지만, 상기와 같은 종전 방법은 세포로부터 핵산을 추출하여 정제하는 단계까지 유해한 시약, 또는 바이러스와 세균과 같은 감염원으로부터 연구자는 자유로울 수 없어 안전하게 핵산을 추출하는데 많은 어려움이 있었다.Generally, the process of purifying nucleic acid from an organism can be manually extracted using various reagents or extracted using an automatic gene extraction apparatus. However, the conventional method has difficulty in extracting the nucleic acid safely because the researchers are not free from harmful reagents or infection sources such as viruses and bacteria until the step of extracting nucleic acids from the cells and purifying them.

대한민국특허공개 제10-2008-0058900호(전기장에 의하여 핵산을 농축하기 위한 핵산 농축 장치 및 그를 이용하여 핵산을 농축하는 방법)에서는 전극의 표면에 10 내지 60℃에서 고체상태인 이온성 액체 물질을 포함하는 전극의 전기장에 의하여 핵산을 농축하는 방법을 게시하고 있고, 대한민국특허공개 제10-2005-0088867호(이온투과성 폴리머로 코팅된 전극을 이용한 핵산 정제 방법 및 그 장치)와 미국특허번호 제0073049호(Method and Apparatus for Nucleic Purification Using Ion-permeable Polymer-Coated Electrode)에서는 이온투과성 폴리머가 코팅된 전극을 직접적으로 이용하여 핵산이 포함된 시료로부터 핵산을 정제하는 방법이 개시되어 있다. Korean Patent Laid-Open No. 10-2008-0058900 (Nucleic Acid Concentrating Apparatus for Enriching Nucleic Acid by Electric Field and Method for Concentrating Nucleic Acid Using the Nucleic Acid Concentrating Apparatus by Electric Field) discloses that an ionic liquid substance, which is solid at 10 to 60 ° C, Discloses a method of concentrating nucleic acids by an electric field of an electrode including a nucleic acid, and Korean Patent Laid-open Publication No. 10-2005-0088867 (a nucleic acid purification method and apparatus using an electrode coated with an ion permeable polymer) and United States Patent No. 0073049 Discloses a method for purifying a nucleic acid from a sample containing a nucleic acid by directly using an ion-permeable polymer-coated electrode in a method and apparatus for ion-permeable polymer-coated electrode.

한편, 종래 기술에 따르면, 다양한 형태의 연속형 중합효소 연쇄반응 실시간 모니터링 기술이 제시되고 있으며, 일례로는 모세관을 이용한 중합효소 연쇄반응 장치인 미국등록특허 6,033,880호가 개시된 바 있다. 상기 장치에서 열전달 블록은 4개의 다른 항온 블록으로 구성되어 있으며, 모세관에 용액공급 장치를 이용하여 시료 및 시약을 공급하거나 제거하도록 되어 있다. 상기 장치를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행하기 위해서는 열전달 블록을 회전시키면서 모세관에 전달되는 온도를 변화시킴으로써 중합효소 연쇄반응을 수행하게 된다. 이러한 형태의 구성을 갖는 기술들의 일반적인 문제점은 중합효소 연쇄반응을 위해 열전달 블록을 회전시켜야 하고, 회전시 각 모세관이 열전달 블록과의 접촉정도에 따라 중합효소 연쇄반응 정도의 차이가 발생할 수 있어서 연쇄 반응의 재현성이 부족하게 된다는 점이다.Meanwhile, according to the prior art, various types of continuous polymerase chain reaction real-time monitoring techniques have been proposed. For example, U.S. Patent No. 6,033,880 discloses a polymerase chain reaction device using a capillary. In this apparatus, the heat transfer block is composed of four different thermostatic blocks, and the capillary is designed to supply or remove the sample and reagent using a solution supply device. In order to proceed with the polymerase chain reaction using the above apparatus, the polymerase chain reaction is performed by changing the temperature to be transferred to the capillary while rotating the heat transfer block. A common problem with these types of techniques is that the heat transfer block must be rotated for polymerase chain reaction and the degree of polymerase chain reaction may vary depending on the degree of contact between each capillary and the heat transfer block during rotation, The reproducibility of the image is insufficient.

또한, 이러한 형태의 장치를 사용하는 경우, 시간 간격을 두고 연속적으로 중합효소 연쇄반응을 진행시키는 것은 불가능하며, 중합효소 연쇄반응이 완료된 후에만 반응의 진행 정도를 측정할 수 있는 장치로 구성되어 있기 때문에 반응이 완료되기 전에는 진행 정도를 알 수 없다는 문제점이 있다.Further, in the case of using this type of apparatus, it is impossible to continuously carry out the polymerase chain reaction at intervals of time, and it is composed of a device capable of measuring the progress of the reaction only after the completion of the polymerase chain reaction Therefore, there is a problem that the degree of progress can not be known until the reaction is completed.

이러한 문제점을 개선하는 새로운 방식의 중합효소 연쇄반응 실시간 모니터링 장치로 대한민국 특허등록 제593263호(발명의 명칭: 연속 흐름상 반응 장치)에 모세관과 원형의 가열 블록으로 이루어진 연속식 흐름식 중합효소 연쇄반응용 온도순환 장치가 개시된 바 있다.A new type of polymerase chain reaction real time monitoring device which improves these problems is a continuous flow type polymerase chain reaction (PCR) comprising a capillary tube and a circular heating block in Korean Patent Registration No. 593263 Temperature cycling device for a refrigerator.

상기 장치는 변성(melting), 어닐링(annealing), 연장(extension) 온도 구역으로 나누어진 직경 30mm의 구리 블록에 길이 3.5m의 모세관을 33회 감아서 제작되었다. 모세관 내부로 흐르는 PCR 반응 혼합물은 구리로 이루어진 가열 블록을 한번씩 회전함으로써 PCR 반응의 각 사이클이 수행된다. 이 방법에서는, 중합효소 연쇄반응 시료가 흐르는 모세관을 가열 블록에 감고, 스캐너에 장착된 광 조사 장치를 사용하여 가열 블록에 감긴 모세관에 광선을 조사하며 모세관에서 발생하는 형광량을 측정하기 위한 수단으로서 형광 검출기가 장착된 스캔 장치를 사용하여 모세관을 스캐닝하게 된다.The device was fabricated by winding a capillary tube of 3.5 m in length 33 times onto a 30 mm diameter copper block divided by a melting, annealing and extension temperature zone. The PCR reaction mixture flowing into the capillary is cycled each cycle of the PCR reaction by rotating the heating block consisting of copper once. In this method, a capillary through which a polymerase chain reaction sample flows is wrapped around a heating block, a light irradiating capillary wrapped around the heating block using a light irradiating device mounted on the scanner, and a means for measuring the amount of fluorescence generated in the capillary The capillary is scanned using a scanning device equipped with a fluorescence detector.

이 방법에서는 가열 블록에 감긴 모세관에 광을 조사하기 위한 광 조사장치와 모세관에서 발생하는 형광을 측정하기 위한 센서를 이동장치(moving stage)에 장착하여 스캐너를 선형으로 구동시켜 스캐너의 이동에 따라 모세관에 광을 순차적으로 조사하고, 또한 모세관에서 발생하는 형광을 스캐너의 이동에 따라 순차적으로 측정하게 된다.In this method, a light irradiating device for irradiating light to a capillary wound on a heating block and a sensor for measuring fluorescence emitted from a capillary are mounted on a moving stage to linearly drive the scanner, And the fluorescence generated in the capillary tube is sequentially measured in accordance with the movement of the scanner.

상기 특허에서는, 특정 파장의 광선을 발생시키는 조사광원부와 형광 검출 센서가 모세관이 감겨 있는 가열 블록 위를 일정 속도로 이동하면서 스캐닝하는 장비를 기재하고 있다. 이러한 조사광원부와 형광 검출 센서들이 스캐너에 장착된 채 모세관이 감긴 가열 블록의 중심축과 평행하는 축 방향 또는 이를 가로지르는 축 방향을 따라 이동하면서 모세관에 광을 조사하거나 형광을 측정하는데, 상기 장치는 스캐닝할 때마다 한번씩 중합효소 연쇄반응의 모니터링이 이루어지며, 스캐닝할 때마다 다수의 모세관을 스캐닝하게 된다. 또한, 이렇게 조사광원부, 형광측정부를 이동식 장치에 장착하고 일정 속도로 이동시키며, 모세관내 시료에서 발생하는 형광을 스캐닝하여 연속적으로 검출하기 위해서는 필연적으로 모터, 선형 이송 수단과 같이 이들을 이송하는 이송장치, 이송 가이드 장치, 이송장치에 동력을 제공하는 구동수단 등이 구비되어야 한다. 그러나, 다수의 광학 렌즈로 구성되는 조사광원부는 대물렌즈와 같은 고가의 렌즈를 사용하고, 광 경로의 정확한 컨트롤을 위하여 조사광원부 및 형광측정부의 정교한 배치를 필요로 하기 때문에 중합효소 연쇄반응 장치의 제작비용이 크게 증가된다는 문제점을 야기한다. 더불어, 다수의 렌즈, 이송 장치, 동력 전달 수단, 구동수단 등은 상기 장치의 크기를 크게 할 뿐만 아니라 빈번한 고장과 오작동의 원인이 될 수 있다.In this patent, an irradiation light source unit for generating a light beam having a specific wavelength and an apparatus for scanning the fluorescent light sensor with a moving speed of a heating block on which a capillary tube is wound are moved at a constant speed. The irradiation light unit and the fluorescence detection sensors irradiate light or fluorescence to the capillary while moving along the axial direction parallel to the center axis of the heating block mounted on the scanner while the capillary is wound around the scanner, Polymerase chain reaction (PCR) is monitored once every scanning, and multiple capillaries are scanned each time it is scanned. In order to continuously detect the fluorescent light generated in the sample in the capillary tube by continuously attaching the irradiation light source unit and the fluorescence measurement unit to the mobile device and moving it at a constant speed, A conveying guide device, a driving means for supplying power to the conveying device, and the like. However, since the irradiation light source unit composed of a plurality of optical lenses uses expensive lenses such as an objective lens and precisely arranges the irradiation light source unit and the fluorescence measurement unit for accurate control of the optical path, Which causes a problem that the cost is greatly increased. In addition, a large number of lenses, a transfer device, a power transmission means, a driving means, etc., not only increase the size of the apparatus but also cause frequent malfunctions and malfunctions.

본 발명자들은 이러한 기술적 배경 하에서, 극미량의 물질로부터 핵산 또는 단백질을 추출하고, 상기 추출된 핵산 또는 단백질을 고민감도로 정량ㆍ정성 분석할 수 있는 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100), qPCR 반응부(150), 열전달 블록(220), 밀착수단(226, 227, 228), 광학부(300), 카트리지 구동부(200) 및 제어부(400)가 일체형으로 구비된 고속 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 시스템을 개발하고자 예의 노력한 결과, 고속 qPCR 시스템의 카트리지(100)에서 시료로부터 표적 핵산을 추출하고, 각종 qPCR 반응액과 혼합하여 qPCR 반응물을 준비한 다음, 상기 qPCR 반응물을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입하고, 열전달 블록(220)에 적절한 온도를 가하여 다양한 qPCR 반응 검사가 수행될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have found that, under these technical backgrounds, the present invention provides a cartridge for nucleic acid extraction and qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) capable of extracting a nucleic acid or protein from a trace amount of substance and quantitatively and qualitatively analyzing the extracted nucleic acid or protein with a sensitive sensitivity A high-speed qPCR (100) in which a controller 100, a qPCR reaction unit 150, a heat transfer block 220, contact units 226, 227 and 228, an optical unit 300, a cartridge driving unit 200, As a result, the target nucleic acid is extracted from the sample in the cartridge 100 of the high-speed qPCR system and mixed with various qPCR reaction solutions to prepare a qPCR reagent. Then, the qPCR reagent is introduced into the microfluidic channel qPCR film reactor 153, and the temperature of the heat transfer block 220 is appropriately applied thereto. Thus, the present inventors have completed the present invention.

본 발명의 목적은 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지를 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a cartridge for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction).

본 발명의 다른 목적은 정량 중합효소 연쇄반응(qPCR) 반응부 및 열전달 블록을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) reaction unit and a heat transfer block.

본 발명의 또 다른 목적은 정량 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 측정하는 광학부를 제공하는 데 있다.It is yet another object of the present invention to provide an optical unit for measuring quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

본 발명의 또 다른 목적은 핵산 추출 및 중합효소 연쇄반응을 연달아 실행하면서, 표적 핵산, 표적 항원, 표적 항체 등의 증폭을 실시간으로 스캐닝할 수 있는 다목적 고속 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 시스템으로, 정량 PCR(quantitative PCR, qPCR), 역전사-정량 PCR(Reverse Transcription-quantitative PCR, RT-qPCR), 실시간 네스티드 PCR(realtime nested PCR, rt-nPCR), 실시간 네스티드 역전사-PCR(realtime nested RT-PCR, rt-nRT-PCR), 디지털 PCR(digital PCR, dPCR), 디지털 역전사-PCR(digital RT-PCR, dRT-PCR), 면역-정량 PCR(Immuno-qPCR, I-qPCR) 등을 통해 고민감도로 극미량의 표적 핵산 또는 표적 단백질을 정량ㆍ정성 분석을 수행할 수 있는 시스템을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a multipurpose high-speed qPCR (quantitative polymerase chain reaction) system capable of real-time scanning of amplification of a target nucleic acid, a target antigen, and a target antibody while sequentially performing nucleic acid extraction and a polymerase chain reaction, Real-time nested RT-PCR (quantitative PCR, qPCR), reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR), real-time nested PCR PCR and rt-nRT-PCR), digital PCR (dPCR), digital reverse-PCR (dRT-PCR) and immuno-qPCR And to provide a system capable of performing quantitative and qualitative analysis of a trace amount of target nucleic acid or target protein with sensitivity.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산 추출부(120)에서 시료의 핵산을 자동으로 추출하고, 추출된 핵산을 이동 채널(130)을 통해 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응, Quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응 준비부(140)로 이동시킨 다음, qPCR 반응 준비부(140)에서 상기 추출된 핵산에 각기 다른 qPCR 조성물을 자동으로 혼합하여 qPCR 반응물을 준비하고, qPCR 반응부(150)에서 상기 qPCR 반응물을 각기 다른 온도가 전달되는 부채꼴형의 열전달 블록(220)에 밀착되어진 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 필름 사이에 형성된 미세유로(153-1)로 이동시키는 핵산 추출 및 정량 중합효소 연쇄반응용 카트리지를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a nucleic acid extracting unit 120 for automatically extracting a nucleic acid of a sample, and extracting the extracted nucleic acid through a transport channel 130 using qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) The reagent is transferred to the reaction preparation unit 140 and then qPCR reagent is prepared by automatically mixing the different qPCR compositions with the extracted nucleic acid in the qPCR reagent preparation unit 140. The qPCR reagent The fine channel qPCR film 153 adhered to the fan-shaped heat transfer block 220 to which different temperatures are transferred is moved to the fine channel 153-1 formed between the films of the reactor 153 A cartridge for nucleic acid extraction and quantitative polymerase chain reaction is provided.

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100)에서 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 qPCR 반응물을 주입하는 qPCR 반응물 주입구(151); qPCR 반응물이 흘러가면서 qPCR 반응이 일어나는 미세유로(153-1); qPCR 반응 후 생성된 qPCR 반응생성물을 상기 카트리지(100)의 배출액 수집구획(154)으로 배출하는 qPCR 반응생성물 배출구(152)가 구비된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)로 구성되는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부를 제공한다.The present invention also provides a kit comprising: a qPCR reagent inlet 151 for injecting a qPCR reagent mixed with nucleic acid extracted from the cartridge 100 and a PCR drying composition; a microfluidic channel 153-1 in which the qPCR reaction occurs while the qPCR reactant flows; and a qPCR reaction product outlet (152) for discharging the qPCR reaction product generated after the qPCR reaction to the waste liquid collection zone (154) of the cartridge (100). qPCR reaction unit.

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100)로부터 유래된 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물이 유출입되고, 중합효소 연쇄반응 사이클이 반복 수행되도록 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 열전달 블록을 제공한다.The present invention also relates to Wherein the micro channel qPCR film reactor 153 is coupled such that the qPCR reactant and the qPCR reaction product derived from the cartridge 100 flow in and the polymerase chain reaction cycle is repeated.

본 발명은 또한, 상기 열전달 블록(220)의 동심 원주면의 중심축에서 조사되는 다른 파장대의 레이저광원(311, 312, 313); 상기 qPCR 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에 레이저광을 집광하고 발생되는 형광을 수집하기 위해 동심 원주면의 중심축 상에서 회전하는 회전광학부(350); 상기 레이저광과 형광을 편광 특성을 이용해서 분리하는 광분할부(360); 및 분리된 형광을 각 파장대 별로 측정하는 광센서부(370)로 구성되는 것을 특징으로 하는 광학부를 제공한다.The present invention may further include: laser light sources 311, 312, and 313 of different wavelength ranges irradiated from the central axis of the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220; The micro channel 153-1 of the micro channel qPCR film reactor 153 of the qPCR reaction unit 150 is provided with a rotation optical unit (not shown) for condensing laser light and rotating on the central axis of the concentric circle 350); A light splitting unit 360 for splitting the laser light and the fluorescence by using polarization characteristics; And an optical sensor unit 370 for measuring the separated fluorescence by each wavelength band.

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 제공한다.The present invention also relates to the cartridge (100); remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the micro channel qPCR film reactor (153) by irradiating laser light, and detecting the fluorescence And an optical unit (300).

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산 디지털 정량분석 시스템을 제공한다.The present invention also relates to A cartridge 100; And a micro channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the optical unit 300 for irradiating the micro channel qPCR film reactor 153 with a laser beam and detecting fluorescence. The present invention also provides a target nucleic acid digital quantitative analysis system using the target nucleic acid qPCR quantitative analysis system.

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산의 농도에 따라 정량 PCR 방식 및 디지털 PCR 방식이 자동 전환 가능한 표적 핵산 정량분석 시스템을 제공한다.The present invention also relates to A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the optical part (300) for irradiating the micro channel qPCR film reactor (153) with laser light and detecting fluorescence, according to the concentration of the target nucleic acid using the target nucleic acid qPCR quantitation analysis system. The present invention provides a target nucleic acid quantitative analysis system capable of automatic switching.

본 발명은 또한, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300); 및 상기 카트리지(100), qPCR 반응부(150), 열전달 블록(220), 밀착수단(226, 227, 228) 및 광학부(300)의 각 부분들을 카트리지 구동부(200)로 구동하고 제어부(400)로 제어하는 회로로 구성되는 전자동 핵산 추출 및 표적 핵산 정량분석 시스템을 제공한다.
The present invention also relates to A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; The fine channel qPCR film reactor 153 is irradiated with laser light, An optical unit 300; And the cartridge 100, the qPCR reaction unit 150, the heat transfer block 220, the contact units 226, 227, and 228, and the optical unit 300 And a circuit for driving the respective parts by the cartridge driving part 200 and controlling the control part 400. The present invention also provides an automated nucleic acid extraction and target nucleic acid quantitative analysis system.

본 발명은 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지와 이를 포함하는 고속 qPCR 시스템을 이용하여 시료로부터 추출된 핵산의 정량 분석값을 신속하게 얻을 수 있는 시스템을 제공함으로써, 정량 PCR(quantitative PCR, qPCR), 역전사-정량 PCR(Reverse Transcription-quantitative PCR, RT-qPCR), 실시간 네스티드 PCR(realtime nested PCR, rt-nPCR), 실시간 네스티드 역전사-PCR(realtime nested RT-PCR, rt-nRT-PCR), 디지털 PCR(digital PCR, dPCR), 디지털 역전사-PCR(digital RT-PCR, dRT-PCR), 면역-정량 PCR(Immuno-qPCR, I-qPCR) 등을 통해 다수의 표적 핵산의 정량ㆍ정성 분석, 극소량의 표적 핵산의 정량분석, 또는 다수의 항원, 항체의 정량ㆍ정성 분석 등을 수행할 수 있다. The present invention provides a system for quickly obtaining a quantitative analysis value of a nucleic acid extracted from a sample using a cartridge for nucleic acid extraction and a qPCR (quantitative polymerase chain reaction) cartridge and a high-speed qPCR system including the same, (RT-PCR), real-time nested PCR (RT-nPCR), real-time nested RT-PCR (rt-PCR) and reverse transcription-quantitative PCR (e. g., nRT-PCR), digital PCR (dPCR), digital reverse-PCR (dRT-PCR) and immuno-qPCR Quantitative / qualitative analysis, quantitative analysis of a very small amount of target nucleic acid, or quantitative / qualitative analysis of a large number of antigens and antibodies.

특히 하나의 카트리지 및 이에 결합된 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응부의 밀폐공간에서 모든 핵산의 증폭과 분석을 수행할 수 있어서 표적 물질의 오염과 증폭 반응생산물의 오염에 의한 위양성을 방지할 수 있고, 경제적이고 안정적인 결과를 낼 수 있는 카트리지, 정확한 온도조절이 가능한 열전달 블록과 형광검출용 광학부가 구비된 고속 qPCR 시스템을 제공함으로써 경제적이고 정확한 표적 물질의 정량 검출이 가능하다. In particular, amplification and analysis of all nucleic acids can be carried out in a confined space of one cartridge and a qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) coupled thereto, thereby preventing contamination of the target material and contamination due to contamination of amplification products , A cartridge capable of producing economical and stable results, a heat transfer block capable of precise temperature control, and a high-speed qPCR system equipped with an optical part for fluorescence detection, thereby enabling economical and accurate quantitative detection of a target substance.

도 1은 핵산 추출부(120), qPCR 반응 준비부(140) 및 qPCR 반응부(150)가 포함된 카트리지의 조립 구성도이다.
도 2는 카트리지 본체에 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 qPCR 시스템에 장착된 상태를 나타낸 상태도이다.
도 3은 카트리지 본체 및 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 출고되어 qPCR 시스템에 장착되기 전까지의 상태를 나타낸 상태도이다.
도 4는 카트리지 본체 하부의 핵산 추출부(120) 및 qPCR 반응준비부(140)가 포함된 내부구조의 단면도이다.
도 5는 qPCR 반응부(150)를 나타낸 것으로, (A)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 외관상 구조 및 (B)는 열전달 블록(220)과 밀착된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 형상을 나타낸 것이다. 또한, (C)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 구조와 정량 중합효소 연쇄반응(qPCR)에 따른 시료를 포함하는 반응물 및 반응생산물의 흐름 방향을 점선 화살표로 나타낸 것이며, (D)~(F)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1) 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 회전선택밸브들, 피스톤펌프들과 이동채널부(130)를 이용하여 핵산 추출과 용액을 이동시켜 qPCR 반응액을 준비시키는 원리와 내부구조를 나타내는 단면도이다.
도 7은 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 내부의 전체 구조를 나타낸 사시도이다.
도 8은 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 자동문의 정면사시도(A)와 후면 사시도(B)이다.
도 9는 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 카트리지 구동부 중 피스톤펌프 구동부의 사시도이다.
도 10은 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 카트리지 구동부 중 피스톤펌프 구동부의 측면도이다.
도 11은 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 카트리지 구동부 중 회전식 선택밸브 구동부의 사시도(A) 및 단면도(B)를 나타낸 것이다.
도 12는 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 qPCR 반응부(150)와 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)이 열전달 블록(변성 블록 및 반응 블록)(220)이 결합된 사시도, 평면도 및 정면도이다.
도 13은 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 광학계 모식도를 나타낸 것이다. 1 is an assembly diagram of a cartridge including a nucleic acid extractor 120, a qPCR reaction preparation unit 140, and a qPCR reaction unit 150.
2 is a state view showing a state in which the fine flow path qPCR film reactor 153 is mounted on the cartridge main body in the qPCR system.
3 is a state diagram showing the state before the cartridge body and the fine channel qPCR film reactor 153 are shipped and mounted in the qPCR system.
4 is a cross-sectional view of an internal structure including a nucleic acid extracting unit 120 and a qPCR reaction preparation unit 140 in a lower portion of the main cartridge body unit.
5A and 5B show the qPCR reaction unit 150. Fig. 5A shows the appearance of the microchannel qPCR film reactor 153 and Fig. 5B shows the microchannel qPCR film reactor 153 closely attached to the heat transfer block 220. Fig. Fig. (C) is a dotted arrow showing flow directions of reactants and reaction products including the sample according to the structure of the microchannel qPCR film reactor 153 and quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and F shows the structure of the fine flow path 153-1 of the fine flow path qPCR film reactor 153. Fig.
6 is a cross-sectional view illustrating the principle and internal structure for preparing a qPCR reaction solution by using nucleic acid extraction and transferring solutions using rotary select valves, piston pumps, and a movement channel unit 130. FIG.
FIG. 7 is a perspective view showing the entire structure of a nucleic acid extracting integrated high-speed qPCR system.
FIG. 8 is a front perspective view (A) and a rear perspective view (B) of an automatic door of a nucleic acid extraction integrated high speed qPCR system.
9 is a perspective view of a piston pump driving part of a cartridge driving part of a high-speed qPCR system with nucleic acid extraction.
10 is a side view of a piston pump driving unit of a cartridge driving unit of a high-speed qPCR system with a nucleic acid extracting unit.
11 is a perspective view (A) and a cross-sectional view (B) of a rotary selector valve driving unit in a cartridge driving unit of a nucleic acid extracting integral high-speed qPCR system.
12 is a perspective view, a plan view, and a front view, respectively, of a qPCR reaction unit 150 and a microchannel qPCR film reactor 153 of a nucleic acid extraction integrated high-speed qPCR system combined with a heat transfer block (denaturing block and reaction block)
13 is a schematic diagram of an optical system of a high-speed qPCR system with nucleic acid extraction.

본 발명은 다목적 고속 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction, 정량 중합효소 연쇄반응) 시스템에 관한 것으로, 표적 물질인 핵산, 항체, 항원들을 qPCR, RT-qPCR, rt-nPCR, rt-nRT-PCR, dPCR, dRT-PCR 또는 I-qPCR를 통해 고민감도로 정량ㆍ정성 분석할 수 있는 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100), qPCR 반응부(150), 열전달 블록(220), 밀착수단(226, 227, 228), 광학부(300), 카트리지 구동부(200) 및 제어부(400)가 일체형으로 구비된 고속 qPCR 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a multi-purpose high-speed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) system, wherein the target nucleic acid, antibody, and antigens are selected from the group consisting of qPCR, RT-qPCR, rt-nPCR, rt- a cartridge 100 for a nucleic acid extraction and a qPCR (quantitative polymerase chain reaction), a qPCR reaction unit 150, a heat transfer block 220, The present invention relates to a high-speed qPCR system in which a plurality of means 226, 227, and 228, an optical unit 300, a cartridge driving unit 200, and a control unit 400 are integrally provided.

본 발명은 다목적 고속 qPCR 시스템에 작업자가 카트리지(100)를 장착하고, 장착된 카트리지(100)에 시료만 투입하고, 고속 qPCR 시스템을 작동시키면 10분~20분 사이에 시료의 핵산 추출부터 정량분석까지 모든 반응을 자동으로 수행하여 다수의 표적을 대상으로 정량 검출이 가능하다. 특히, 상기 카트리지(100)는 시료의 핵산 추출부터 정량분석까지 필요한 모든 시약들을 포함하고, 상기 핵산 추출 작업은 전자동으로 수행될 수 있고, 장기간 보관해도 용액의 누수 없이 항상 품질을 유지할 수 있다.The present invention is characterized in that when the operator mounts the cartridge 100 on the multi-purpose high-speed qPCR system, puts only the sample into the mounted cartridge 100, and operates the high-speed qPCR system, Can be automatically detected and quantitative detection of a large number of targets is possible. In particular, the cartridge 100 includes all reagents necessary for nucleic acid extraction and quantitative analysis of the sample. The nucleic acid extraction operation can be performed automatically, and quality can be maintained without leakage of the solution even after storage for a long period of time.

본 발명은 또한, 현장에서 10~20분 사이에 표적 항원 및/또는 표적 항체의 정성ㆍ정량적인 검사 결과를 도출할 수 있도록 항원-항체 반응과 정량 중합효소 연쇄반응이 한 개의 카트리지(100)에 일체화되어 5~10분 내에 항원-항체 반응을 수행할 수 있고, 5분 내에 표지용 핵산(예컨대, DNA)을 이용하여 정량 증폭반응을 수행하여 표적 항원 및 표적 항체를 정량적으로 검출할 수 있는 시스템이다.The present invention also relates to a method for producing an antigen-antibody reaction and a quantitative polymerase chain reaction in one cartridge 100 so that qualitative and quantitative test results of a target antigen and / or a target antibody can be obtained in 10 to 20 minutes in the field A system capable of quantitatively detecting a target antigen and a target antibody by performing an antigen-antibody reaction within 5 to 10 minutes and performing quantitative amplification reaction using a labeled nucleic acid (for example, DNA) within 5 minutes to be.

본 발명의 분자진단 검사용 카트리지와 고속 qPCR 시스템을 사용하면 극미량의 각종 병원균을 검출할 수 있어 감염 여부를 초기에 탐지할 수 있다. 또한, 급성심근경색 등을 20분 이내에 신속하게 진단할 수 있다. By using the cartridge for molecular diagnostic test and the high-speed qPCR system of the present invention, it is possible to detect a very small amount of various pathogens, so that the infection can be detected at an early stage. In addition, acute myocardial infarction can be diagnosed quickly within 20 minutes.

따라서, 1차 의료기관에서 본 발명의 고속 qPCR 시스템을 사용하면 한 대의 장비로 임상증상에 따라 각각 필요한 카트리지를 사용하여 빠르게 진단할 수 있어, 결과를 기다리는 시간이나 재방문 없이 바로 처방이 이루어져 각종 감염 질병에 신속하게 대처할 수 있고, 급성 질환에 신속하게 대응함으로써 감염병 확산을 막고, 귀중한 생명을 살리며 의료비용을 대폭적으로 줄일 수 있다. 또한, 수술 전 고위험군 병원체 검사, 패혈증검사도 빠르게 수행하여 환자들의 응급수술과 처방에 큰 도움이 줄 수 있을 것이다. 특히, 본 시스템은 작고 가벼워 이동이 용이하고, 조작이 간단하므로, 에볼라, 메르스, 신종플루 등 각종 신종전염병이 발생한 현장에서 바로 전염성 병원체를 고민감도로 신속하게 진단할 수 있어 감염자의 조기진단을 통한 초기 감염환자의 격리 및 치료를 즉각적으로 수행하여 질병확산을 근본적으로 막을 수 있다. Therefore, when the high-speed qPCR system of the present invention is used in the primary medical institution, it is possible to quickly diagnose the clinical symptoms by using the necessary cartridges and to prescribe them without waiting for a result or returning, And respond quickly to acute illnesses, thereby preventing the spread of infectious diseases, saving precious lives, and greatly reducing medical costs. In addition, pre-operative high-risk pathogen test and sepsis test can be performed rapidly, which will greatly assist patients in emergency surgery and prescription. Especially, this system is small and light, easy to move and easy to operate. Therefore, it is possible to quickly diagnose infectious pathogens with high sensitivity at the site where various new infectious diseases such as Ebola, The initial infection can be isolated and treated promptly to prevent the spread of the disease.

또한, 본 발명의 고속 qPCR 시스템을 사용하면 조류독감, 구제역과 같은 가축전염병의 조기진단이 현장에서 가능하여 감염된 가축들을 신속하게 처리하여 가축 전염병의 확산을 방지할 수 있다. In addition, by using the high-speed qPCR system of the present invention, early detection of livestock infectious diseases such as avian influenza and foot-and-mouth disease can be performed in the field, and infected livestock can be rapidly treated to prevent the spread of infectious diseases.

또한, 본 발명의 고속 qPCR 시스템을 사용하면 I-qPCR을 통해 항체나 특정 단백질을 고감도로 신속하게 진단할 수 있어, 트로포닌(Troponin), CK-MB 같은 급성 심근경색 마커들을 1차 의료기관에서 고민감도로 정량분석하여 심장질환자들의 생명을 구할 수 있다. In addition, using the high-speed qPCR system of the present invention, it is possible to quickly diagnose antibodies or specific proteins with high sensitivity through I-qPCR, and to diagnose acute myocardial infarction markers such as troponin and CK-MB in the first medical institution Quantitative analysis with sensitivity can save lives of heart disease patients.

아울러, 본 발명의 고속 qPCR 시스템을 사용하면 PSA, CEA, CA125, CA-99, AFP 등과 같은 암단백질 마커들을 다중으로 동시에 고민감도로 진단할 수 있어, 암의 조기진단과 암환자 예후를 모니터링하는 용도로 사용할 수 있어 1차 의료기관의 필수적인 시스템으로 사용될 수 있다.
In addition, by using the high-speed qPCR system of the present invention, multiple cancer markers such as PSA, CEA, CA125, CA-99, and AFP can be diagnosed with multiple sensitivity at the same time, It can be used as an essential system of primary medical institution.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 핵산 추출부(120)에서 시료의 핵산을 자동으로 추출하고, 추출된 핵산을 이동 채널(130)을 통해 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응, Quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응 준비부(140)로 이동시킨 다음, qPCR 반응 준비부(140)에서 상기 추출된 핵산에 각기 다른 qPCR 조성물을 자동으로 혼합하여 qPCR 반응물을 준비하고, qPCR 반응부(150)에서 상기 qPCR 반응물을 각기 다른 온도가 전달되는 부채꼴형의 열전달 블록(220)에 밀착되어진 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 필름 사이에 형성된 미세유로(153-1)로 이동시키는 핵산 추출 및 정량 중합효소 연쇄반응용 카트리지(100)에 관한 것이다.Therefore, in one aspect of the present invention, nucleic acid extracting unit 120 automatically extracts a nucleic acid of a sample, and the extracted nucleic acid is subjected to qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) And the qPCR reagent is prepared by preparing a qPCR reagent by automatically mixing different qPCR compositions with the extracted nucleic acid in the qPCR reagent preparing unit 140. The qPCR reagent is then supplied to the qPCR reaction unit 150, The fine channel qPCR film closely adhered to the fan-shaped heat transfer block 220 to which another temperature is transferred is moved to the fine channel 153-1 formed between the films of the reactor 153 And a cartridge 100 for nucleic acid extraction and quantitative polymerase chain reaction.

본 발명에 있어서, 상기 카트리지(100)는 시료가 투입되는 카트리지 상부(110)의 시료 투입구(111), 시료 투입구(111)에 삽입되는 마개(114), 상기 시료로부터 핵산의 자동추출에 필요한 핵산 추출용 시약들을 저장하는 복수의 용액저장통(112), 상기 시약들의 복수의 핵산 추출부 구획(122), 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123), 핵산 추출부 피스톤펌프(121) 및 표적부착 고정상(124)이 구비된 핵산 추출부(120); 상기 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산을 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(140)로 이동시키는 이동 채널(130); qPCR 반응 준비부(140)로 이동된 핵산과 혼합가능한 PCR 건조 조성물을 포함하는 복수의 qPCR 조성물 통(142), qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 구비된 qPCR 반응 준비부(140); 상기 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 용액을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입하는 qPCR 반응물 주입구(151); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에서 중합효소 연쇄반응 후 생성된 반응생성물을 배출하는 qPCR 반응생성물 배출구(152); 및 상기 핵산 추출부(120)에서 사용된 용액 및 상기 PCR 반응생성물을 수집하는 배출액 수집구획(154)이 구비된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the cartridge 100 includes a sample inlet 111 of the cartridge upper portion 110 into which a sample is injected, a stopper 114 inserted into the sample inlet 111, a nucleic acid A plurality of nucleic acid extracting sections 122 of the reagents, a nucleic acid extracting rotary select valve 123, a nucleic acid extracting section piston pump 121 and a target attaching stationary phase A nucleic acid extracting unit 120 provided with the nucleic acid extracting unit 120; A movement channel 130 for moving the nucleic acid extracted from the nucleic acid extraction unit 120 to the qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation unit 140; a plurality of qPCR composition cylinders 142, a qPCR reaction part rotary select valve 143 and a qPCR reaction part piston pump 141 including a PCR drying composition capable of mixing with the nucleic acid transferred to the qPCR reaction preparation part 140 a qPCR reaction preparation unit 140; A qPCR reagent inlet 151 for injecting a solution mixed with the extracted nucleic acid and PCR drying composition into a microchannel qPCR film reactor 153; A qPCR reaction product outlet 152 for discharging the reaction product generated after the polymerase chain reaction in the micro channel qPCR film reactor 153; And a waste liquid collecting section 154 for collecting the solution used in the nucleic acid extracting section 120 and the PCR reaction product.

본 발명에 있어서, 상기 시료 투입구(111)에 삽입되는 마개(114)의 바닥면은 시료용액의 면 이하의 깊이로 삽입되고, 마개(114)의 내부 공간에 시료를 균질화하기 위한 초음파 프로브(sonicator)(202)의 팁이 추가로 삽입될 수 있어, 마개(114)의 바닥면을 통해 시료용액에 초음파를 전달할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.The bottom surface of the stopper 114 inserted into the sample inlet 111 is inserted at a depth less than the surface of the sample solution and an ultrasonic probe for homogenizing the sample in the inner space of the stopper 114 ) 202 can be further inserted so that ultrasonic waves can be transmitted to the sample solution through the bottom surface of the stopper 114. [

본 발명에 있어서, 상기 시료는 세포, 체액, 또는 표적 물질이 포함된 혼합물인 것을 특징으로 하는 할 수 있다.In the present invention, the sample may be a cell, a body fluid, or a mixture containing a target substance.

본 발명에 있어서, 상기 카트리지 상부(110)에 위치한 복수의 용액저장통(112)은 각기 다른 핵산 추출용 시약을 포함하며, 천공가능한 필름(113)으로 밀봉되어 있으며, 카트리지 본체의 복수의 핵산 추출부 구획(122)에 삽입되어 있고, 카트리지 상부(110)를 카트리지 본체에 압착하여 밀어 넣으면 상기 용액저장통(112)의 천공가능한 필름(113)은 핵산 추출부 구획(122)의 바닥에 형성된 천공용 펀치(126)에 의해 천공되어 핵산 추출부 구획(122)에 핵산 추출용 시약이 채워질 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the plurality of solution reservoirs 112 located in the cartridge upper part 110 include different reagents for nucleic acid extraction, are sealed with a perforable film 113, The puncturable film 113 of the solution reservoir 112 is inserted into the partition wall 122 of the nucleic acid extracting compartment 122. When the cartridge upper part 110 is pushed into the cartridge body, And the nucleic acid extracting compartment 122 may be filled with the nucleic acid extracting reagent.

본 발명에 있어서, 카트리지 본체에는 복수의 핵산 추출부 구획(122), 상기 핵산 추출부 구획(122)의 바닥에 형성된 천공용 펀치(126), 상기 핵산 추출부 구획(122) 바닥에 구비된 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123) 및 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 연결하는 통구(122-1); 상기 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산을 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(140)로 이동시키는 이동 채널(130); 각각의 핵산 추출부 구획(122)의 통구(122-1)와 핵산 추출부 피스톤펌프(121)와 선택적으로 연결되는 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123) 및 핵산 추출부 피스톤펌프(121)가 구비된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the cartridge main body includes a plurality of nucleic acid extracting compartments 122, a punching punch 126 formed at the bottom of the nucleic acid extracting compartment 122, (122-1) for connecting the extraction rotary select valve (123) and the nucleic acid extracting section piston pump (121); A movement channel 130 for moving the nucleic acid extracted from the nucleic acid extraction unit 120 to the qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation unit 140; A nucleic acid extracting unit rotary select valve 123 and a nucleic acid extracting unit piston pump 121 selectively connected to the nucleic acid extracting unit piston pump 121 and the tube 122-1 of each nucleic acid extracting unit 122 are provided .

본 발명에 있어서, 상기 용액저장통(112)에 포함된 핵산 추출용 시약은 세포 용해용액(lysis buffer), 부착용액(binding buffer), 세척용액(washing buffer) 또는 용출용액(elution buffer)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the reagent for nucleic acid extraction contained in the solution reservoir 112 is a cell lysis buffer, a binding buffer, a washing buffer, or an elution buffer. .

본 발명에 있어서, 상기 핵산 추출부(120)에 구비된 표적부착 고정상(124)은 실리카막(silica membrane), 폴리올리고분자막 또는 양이온성막인 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 항원 및/또는 항체 검출을 위한 면역 정량 PCR(immuno-qPCR)을 수행하는 경우, 상기 표적부착 고정상(124)은 추가적으로 항원 또는 항체가 고정화(바람직하게는, 막에 고정화)되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the target fixing stationary phase 124 provided in the nucleic acid extractor 120 may be a silica membrane, a polyol polymer membrane, or a cationic membrane. Here, when performing immuno-qPCR for the detection of an antigen and / or an antibody, the target immobilization phase 124 is further characterized in that the antigen or antibody is immobilized (preferably immobilized on the membrane) .

본 발명에 있어서, 상기 qPCR 조성물 통(142)에 포함된 qPCR 건조 조성물은 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 중합효소활성저해 항체, 프라이머, 프로브, 완충용액, RNA 가수분해효소 저해제, 안정화제 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 최적화된 표적 핵산 증폭용 용액으로 건조시킨 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the qPCR drying composition contained in the qPCR composition bottle 142 may be a DNA polymerase, an RNA polymerase, a polymerase inhibitor antibody, a primer, a probe, a buffer solution, an RNA hydrolase inhibitor, But it is not limited thereto, and may be characterized in that it is dried with an optimized target nucleic acid amplification solution.

본 발명에 있어서, 상기 qPCR 조성물 통(142)은 면역 qPCR에 필요한 표적 항원 또는 표적 항체에 대한 검출 항체들을 포함하고, 상기 검출 항체들은 각각의 특이한 염기서열을 가지는 핵산들로 표지된 다음, 건조시켜 안정화된 상태인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the qPCR composition bottle 142 contains detection antibodies for the target antigen or the target antibody required for immunological qPCR, the detection antibodies are labeled with nucleic acids having the respective unique base sequences, And is in a stabilized state.

본 발명에 있어서, qPCR 반응 준비부(140)는 상기 핵산 추출부(120)와 qPCR 반응 준비부(140)와 공통으로 연결되는 이동 채널(130); 복수의 qPCR 조성물 통(142); qPCR 반응물 주입구(151), 반응유 통(145), 배출액 수집구획(154)과 선택적으로 연결되는 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 구비된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the qPCR reaction preparation unit 140 includes a movement channel 130 commonly connected to the nucleic acid extraction unit 120 and the qPCR reaction preparation unit 140; A plurality of qPCR composition cylinders 142; a qPCR reaction part rotary select valve 143 and a qPCR reaction part piston pump 141 selectively connected to the qPCR reaction material inlet 151, the reaction fluid passage 145 and the discharge liquid collection section 154 are provided can do.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 구동시켜 핵산 추출부 구획(122)을 순차적으로 선택한 후, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 구동부에 의해 상하로 이동시켜 시료와 각각의 용액들을 흡입, 토출하여 핵산 추출과정을 진행시켜 시료로부터 핵산을 추출하고, 상기 추출된 핵산을 이동 채널(130)을 통해 qPCR 반응 준비부(140)로 이동시켜 반응 준비부 선택밸브(143)를 구동시켜 qPCR 조성물 통(142)을 선택한 후, qPCR 반응부 피스톤펌프(11)를 구동부에 의해 상하로 이동시켜 시료와 각각의 용액들을 흡입, 토출하여 qPCR 조성물 통(142)에 포함된 PCR 건조 조성물과 혼합한 다음, qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 구동시켜 상기 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 qPCR 반응물을 qPCR 반응물 주입구(151)를 통해 qPCR 반응부(150)로 이동시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the nucleic acid extracting section rotary selector valve 123 is driven to sequentially select the nucleic acid extracting section 122, and then the nucleic acid extracting section piston pump 121 is moved up and down by the driving section, And the nucleic acid is extracted from the sample. The nucleic acid extracted from the sample is transferred to the qPCR reaction preparation unit 140 through the movement channel 130, The qPCR reaction unit piston pump 11 is moved up and down by the driving unit to suck and discharge the sample and each of the solutions so as to perform PCR drying contained in the qPCR composition bottle 142 And then the qPCR reaction rotary selector valve 143 is driven to move the qPCR reagent mixed with the extracted nucleic acid and the PCR drying composition to the qPCR reactor 150 through the qPCR reagent inlet 151 .

본 발명에 있어서, 상기 배출액 수집구획(154)은 증폭된 PCR 산물을 모아서 다시 qPCR 반응에 사용될 수 있게 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)로 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)와 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the effluent collecting section 154 collects the amplified PCR products and is connected to the qPCR reaction part piston pump 141 by the qPCR reaction part selection valve 143 so that it can be used for the qPCR reaction. .

본 발명은 다른 관점에서, 상기 카트리지(100)에서 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 qPCR 반응물을 주입하는 qPCR 반응물 주입구(151); qPCR 반응물이 흘러가면서 qPCR 반응이 일어나는 미세유로(153-1); qPCR 반응 후 생성된 qPCR 반응생성물을 상기 카트리지(100)의 배출액 수집구획(154)으로 배출하는 qPCR 반응생성물 배출구(152)가 구비된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)로 구성되는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부(150)에 관한 것이다. In another aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: a qPCR reagent inlet (151) for injecting a qPCR reagent mixed with nucleic acid extracted from the cartridge (100) and a PCR drying composition; a microfluidic channel 153-1 in which the qPCR reaction occurs while the qPCR reactant flows; and a qPCR reaction product outlet (152) for discharging the qPCR reaction product generated after the qPCR reaction to the waste liquid collection zone (154) of the cartridge (100). and a qPCR reaction unit 150.

본 발명에 있어서, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 광학 측정면이 투명한 고분자 접합필름의 필름 사이에 qPCR 반응물 주입구(151)로부터 qPCR 반응생성물 배출구(152)까지 일정 간격으로 연결 및 배열되어 있는 연속된 미세유로(153-1)가 형성되어 온도가 각기 다른 2개 이상의 동심 원주면을 구비한 열전달 블록(220)을 30회 이상 순차적으로 통과하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the microchannel qPCR film reactor 153 is connected and arranged at regular intervals from the qPCR reaction product inlet 151 to the qPCR reaction product outlet 152 between the films of the polymeric junction film having optical measurement surfaces transparent And the heat transfer block 220 having two or more concentric circumferential surfaces with different temperatures are successively passed through at least 30 times with continuous fine flow paths 153-1.

본 발명에 있어서, 상기 미세유로(153-1)는 바닥이 둥근 미세유로 단면을 가지는 홈으로서 상부에 투명필름이 부착되어 형성되며, 상기 미세유로 단면의 규격은 가로 0.05mm∼0.3mm 및 세로 0.05mm∼0.3mm인 것을 특징으로 할 수 있다(도 5F 참조).In the present invention, the micro-channel 153-1 is a groove having a micro-channel cross-section with a rounded bottom, and a transparent film is adhered on the top of the micro-channel 153-1. The size of the micro channel cross-section is 0.05 mm to 0.3 mm mm to 0.3 mm (see Fig. 5F).

본 발명에 있어서, 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 PCR 구역과 예열 구역으로 나누어져 있고, 상기 PCR 구역과 예열 구역에 포함된 qPCR 반응물 주입구(151)로부터 50~75℃의 저온으로 유지되는 저온 구역(155); 90~98℃의 고온으로 유지되는 고온 구역(157); 및 저온 구역(155)과 고온 구역(157) 사이에 광학측정 구역(156)을 반복적으로 지나가면서 온도순환에 따른 qPCR 반응물의 qPCR 반응이 일어나는 것을 특징으로 할 수 있다(도 5 (C) 참조).In the present invention, the microchannel qPCR film reactor 153 is divided into a PCR zone and a preheating zone, and a low temperature (low temperature) maintained at a low temperature of 50 to 75 ° C from the qPCR reagent inlet 151 included in the PCR zone and the preheating zone Zone 155; A high temperature zone 157 maintained at a high temperature of 90 to 98 占 폚; And the qPCR reaction of the qPCR reaction due to the temperature cycling occurs repeatedly through the optical measurement zone 156 between the low temperature zone 155 and the high temperature zone 157 (see Fig. 5 (C)). .

본 발명에 있어서, 상기 예열 구역 중 저온 구역(155)에서는 역전사(Reverse Transcription, RT)가 이루어지고, 상기 PCR 구역의 고온 구역(157)에서는 qPCR 반응물에 포함된 핵산을 변성시키고, 중합효소를 억제하는 항체를 변성시켜 qPCR이 가능하도록 상기 중합효소를 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 5의 (C) 참조). In the present invention, reverse transcription (RT) is performed in the low temperature zone 155 of the preheating zone, denaturation of the nucleic acid contained in the qPCR reagent in the high temperature zone 157 of the PCR zone, (See Fig. 5 (C)). In this case, the antibody is denatured to activate the polymerase to enable qPCR.

본 발명에 있어서, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228)에 의해 동심을 가지는 부채꼴형(바람직하게는, 110°~180°휘어진 형태)의 열전달 블록(220)에 밀착될 수 있는 형태로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다(도 12 참조).
In the present invention, the micro channel qPCR film reactor 153 is formed by a reactor-attaching film 226, an adhering film-fixing station 227, and an adhering film-fixing station moving unit 228, (See FIG. 12) in a form that can be brought into close contact with the heat-conducting block 220 in the form of a bent shape of 110 ° to 180 °.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 카트리지(100)로부터 유래된 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물이 유출입되고, 중합효소 연쇄반응 사이클이 반복 수행되도록 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 열전달 블록(220)에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is characterized in that a micro channel qPCR film reactor 153 is coupled such that a qPCR reactant and a qPCR reaction product derived from the cartridge 100 flow in and the polymerase chain reaction cycle is repeated Gt; 220 < / RTI >

본 발명에 있어서, 상기 열전달 블록(220)은 qPCR 반응물에 각기 다른 온도를 제공하기 위해 변성 블록(221) 및 반응 블록(223)을 포함하는 온도가 각기 다른 2개 이상의 동심 원주면을 구비하고, 부채꼴형인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the heat transfer block 220 has two or more concentric circles having different temperatures, including a denaturing block 221 and a reaction block 223, to provide different temperatures to the qPCR reactant, And can be characterized by a fan shape.

본 발명에 있어서, 상기 qPCR 반응물은 상기 변성 블록(221) 및 반응 블록(223)을 1회 이동할 때마다 한 사이클의 중합효소 연쇄반응이 일어나고, 총 1∼45 사이클의 중합효소 연쇄반응이 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the qPCR reactant is subjected to one cycle of a polymerase chain reaction every time the denaturing block 221 and the reaction block 223 are moved, and a total of 1 to 45 cycles of a polymerase chain reaction .

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 열전달 블록(220)의 동심 원주면의 중심축에서 조사되는 다른 파장대의 레이저광원(311, 312, 313); 상기 qPCR 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에 레이저광을 집광하고 발생되는 형광을 수집하기 위해 동심 원주면의 중심축 상에서 회전하는 회전광학부(350); 상기 레이저광과 형광을 편광 특성을 이용해서 분리하는 광분할부(360); 및 분리된 형광을 각 파장대 별로 측정하는 광센서부(370)로 구성되는 것을 특징으로 하는 광학부(300)에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, the laser light sources 311, 312, and 313 of different wavelength ranges irradiated from the central axis of the concentric circular surface of the heat transfer block 220; remind q Microchannel of the PCR Reaction Unit 150 A rotating optical unit (not shown) for condensing the laser light to the fine flow path 153-1 of the reactor 153 and collecting fluorescence generated on the microchannel 153-1 350); A light splitting unit 360 for splitting the laser light and the fluorescence by using polarization characteristics; And an optical sensor unit 370 for measuring the separated fluorescence by each wavelength band.

본 발명에 있어서, 상기 광학부(300)는 레이저광을 발생시키는 레이저광원(311, 312, 313); 상기 레이저광원(311, 312, 313)으로부터 조사된 레이저광에서 특정파장영역의 레이저광을 통과시키는 이색성 쇼트패스필터1(331) 및 이색성 쇼트패스필터2(332); 상기 레이저광을 평행광으로 만드는 콜리메이팅 렌즈(321, 322, 323); 상기 레이저광을 편광시키는 편광자1(334); 상기 레이저광을 편광 특성을 이용하여 반사시키며, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 통과시키는 광분할부(360)의 편광 빔 분리기(361); 상기 레이저광원(311, 312, 313)에서 조사되는 레이저광을 90°로 반사할 수 있게 광축에 대해 45°방향으로 고정된 거울인 광분할부(360)의 미러1(362); 위치 제어가 가능한 거울 회전 모터1(353)과 결합되어 회전되며, 상기 편광 빔 분리기(361)로부터 반사된 레이저광을 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 상기 편광 빔 분리기(361)로 반사시키는 회전광학부(350)의 회전 거울인 미러2(351); 상기 미러2(351)에 의해 반사된 레이저광을 집광하여 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 수집하여 상기 미러2(351)에 전달하는 회전광학부(350)의 렌즈4(352); 상기 미러2(351)에 의해 반사되어 상기 편광 빔 분리기(361)를 통과한 형광을 검출하는 광센서부(370)의 광센서(372);를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the optical unit 300 includes laser light sources 311, 312, and 313 that generate laser light; A dichroic short path filter 1 (331) and a dichroic short path filter 2 (332) for passing laser light in a specific wavelength range from laser light emitted from the laser light sources 311, 312, and 313; Collimating lenses (321, 322, 323) for making the laser light into parallel light; A polarizer 1 334 for polarizing the laser light; A polarizing beam splitter 361 of the light splitting unit 360 that reflects the laser light using the polarization characteristic and transmits the fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the micro channel qPCR film reactor 153; A mirror 1 362 of a light splitting unit 360, which is a mirror fixed in a 45 ° direction with respect to an optical axis so as to reflect laser light emitted from the laser light sources 311, 312, and 313 at 90 °; The laser beam reflected from the polarizing beam splitter 361 is transmitted to the micro channel qPCR film reactor 153. The micro channel qPCR film reactor 153 is rotated by being coupled with the mirror rotation motor 1 353, A mirror 2 (351) which is a rotating mirror of a rotating optical unit 350 that reflects the fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the polarizing beam splitter 361 to the polarizing beam splitter 361; The laser light reflected by the mirror 2 351 is condensed and transferred to the micro channel qPCR film reactor 153 to collect fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the micro channel qPCR film reactor 153, A lens 4 (352) of a rotating optical part (350) which transmits the light to the lens (351); And an optical sensor 372 of the optical sensor unit 370 for detecting fluorescence reflected by the mirror 2 351 and passed through the polarized beam splitter 361.

본 발명에 있어서, 상기 광센서부(370)는 상기 편광 빔 분리기(361)를 통과한 형광을 특정파장영역의 형광만을 통과시키는 밴드패스필터(342~346)가 구비되는 필터휠(340); 밴드패스필터를 통과한 형광을 집광시키는 렌즈5(371); 상기 필터휠(340)을 회전시키는 위치 제어가 가능한 필터 회전 모터인 모터2(373); 및 상기 밴드패스필터(342~346)를 통과한 특정파장영역의 형광을 검출하는 광센서(372);를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the optical sensor unit 370 includes a filter wheel 340 having band-pass filters 342 to 346 for passing fluorescence having passed through the polarized beam splitter 361 only through fluorescence of a specific wavelength range. A lens 5 (371) for condensing the fluorescence that has passed through the band-pass filter; A motor 2 373 which is a filter rotation motor capable of position control for rotating the filter wheel 340; And an optical sensor 372 for detecting fluorescence of a specific wavelength region that has passed through the band-pass filters 342 to 346.

본 발명에 있어서, 상기 미세유로(153-1)는 원형으로 배치되어 있고, 중심에서 반사거울인 미러2(351)를 계속 회전하면서 상기 미세유로(153-1)에서 발생하는 형광값을 빠르게 회전광학부(350)를 통해 스캔하여 일정 형광값 이상이 나오는 미세유로(153-1)를 결정함으로써 초기 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the micro flow path 153-1 is arranged in a circular shape, and the fluorescence value generated in the micro flow path 153-1 is rotated rapidly while the mirror 2 (351) And the concentration of the initial target nucleic acid is measured by determining the fine flow path 153-1 which is scanned through the optical unit 350 and has a constant fluorescence value or more.

본 발명에 있어서, 상기 모터1(353) 또는 모터2(373)는 일정 각도와 속도로 회전되는 스테핑 모터인 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the motor 1 (353) or the motor 2 (373) may be a stepping motor rotated at a predetermined angle and speed.

본 발명의 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템은 표적 물질(예컨대, 핵산)이 포함된 것으로 추정되는 시료의 정제(핵산 추출) 여부와 상관없이 상기 시스템에 투입(첨가)하면 표적 핵산의 검출ㆍ정량이 가능하다. 즉, 시료만 투입(첨가)하면 표적 핵산의 분석 결과를 전자동으로 볼 수 있는 핵산 추출과 증폭검출이 가능한 표적 핵산 정량분석 시스템이다.The target nucleic acid qPCR quantitative analysis system of the present invention can detect and quantify a target nucleic acid by adding (adding) to the above system regardless of purification (nucleic acid extraction) of a sample suspected of containing a target substance (for example, nucleic acid) Do. In other words, it is a target nucleic acid quantitative analysis system capable of extracting nucleic acid and detecting amplification, which can automatically analyze the result of the target nucleic acid when the sample is added (added).

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템에 관한 것이다.Accordingly, the present invention provides, in another aspect, A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the micro channel qPCR film reactor (153) by irradiating laser light, and detecting the fluorescence And an optical unit (300).

본 발명에 있어서, 상기 카트리지(100)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)는 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 사이로 형성된 미세유로(153-1)로 qPCR용 반응물을 연속적으로 주입하여 qPCR 반응을 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the qPCR reaction rotary selector valve 143 and the qPCR reaction piston pump 141 of the cartridge 100 are connected to the fine flow channel 153-1 formed between the fine flow channel qPCR film reactors 153, The reaction product is continuously injected to perform the qPCR reaction.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산 디지털 정량분석 시스템에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the micro channel qPCR film reactor (153) by irradiating laser light, and detecting the fluorescence And an optical unit (300). The present invention relates to a target nucleic acid digital quantitative analysis system using a target nucleic acid qPCR quantitative analysis system.

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산이 단일 핵산분자의 증폭에 의해 발생되는 형광을 검출할 수 있는 사이클에 해당되는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1) 위치에서 검출되지 않을 경우, 상기 미세유로(153-1) 위치보다 2 사이클 이상의 미세유로(153-1) 위치에서 정지하여 초점을 맞추고 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물에 포함된 표적 핵산의 형광발생 회수를 계수함으로써 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, when the target nucleic acid is not detected at the position of the micro channel 153-1 of the micro channel qPCR film reactor 153 corresponding to the cycle capable of detecting fluorescence generated by the amplification of the single nucleic acid molecule , And stops and focuses at the position of the microchannel 153-1 at least two cycles longer than the position of the microchannel 153-1. The qPCR reactant passing through the microchannel 153-1 and the target nucleic acid contained in the qPCR reaction product And the concentration of the target nucleic acid is measured by counting the number of times of fluorescence generation.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산의 농도에 따라 정량 PCR 방식 및 디지털 PCR 방식이 자동 전환 가능한 표적 핵산 정량분석 시스템에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And the micro channel qPCR film reactor (153) by irradiating laser light, and detecting the fluorescence The present invention relates to a target nucleic acid quantitative analysis system capable of automatically switching between a quantitative PCR method and a digital PCR method according to the concentration of a target nucleic acid using a target nucleic acid qPCR quantitative analysis system composed of a DNA fragment

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산의 농도가 높을 경우 정량 PCR 방식으로, 상기 표적의 핵산의 농도가 낮을 경우, 디지털 PCR 방식으로 자동으로 표적 핵산 정량분석 시스템이 전환되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, when the concentration of the target nucleic acid is high, the target nucleic acid quantitative analysis system is automatically switched by the quantitative PCR method and when the concentration of the target nucleic acid is low, by the digital PCR method.

본 발명에 있어서, 상기 회전광학부(350)가 동작하면서 각각의 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물에 포함된 표적 핵산을 연속적으로 측정하여 임계형광이 검출되는 미세유로(153-1)를 검출하여 정량 PCR을 수행하고, 상기 표적 핵산이 단일 핵산분자의 증폭에 의해 발생되는 형광을 검출할 수 있는 사이클에 해당되는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1) 위치에서 검출되지 않을 경우, 디지털 PCR 방식으로 자동 전환되어 상기 미세유로(153-1) 위치보다 2 사이클 이상의 미세유로(153-1) 위치에서 정지하여 초점을 맞추고 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물에 포함된 표적 핵산의 형광발생 회수를 계수함으로써 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, when the rotating optical unit 350 is operated, the target nucleic acid contained in the qPCR reaction product and the qPCR reaction product passing through the respective micro flow channels 153-1 is continuously measured, (153-1) to perform quantitative PCR, and the microchannel of the micro channel qPCR film reactor 153 corresponding to the cycle in which the target nucleic acid can detect the fluorescence generated by the amplification of the single nucleic acid molecule. -1) position, it is automatically switched by the digital PCR method to stop and focus at the position of the micro channel 153-1 at least two cycles from the position of the micro channel 153-1, and the micro channel 153-1 The number of times of fluorescence generation of the target nucleic acid contained in the qPCR reactant passing through the target nucleic acid is counted to determine the concentration of the target nucleic acid.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 상기 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 상기 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 상기 광학부(300); 및 상기 카트리지(100), qPCR 반응부(150), 열전달 블록(220), 밀착수단(226, 227, 228) 및 광학부(300)의 각 부분들을 카트리지 구동부(200)로 구동하고 제어부(400)로 제어하는 회로로 구성되는 전자동 핵산 추출 및 표적 핵산 정량분석 시스템에 관한 것이다.
In another aspect of the present invention, A cartridge 100; remind The micro-channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100) a qPCR reaction unit 150; The micro channel qPCR film reactor (153) A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; The fine channel qPCR film reactor 153 is irradiated with laser light, An optical unit 300; And the cartridge 100, the qPCR reaction unit 150, the heat transfer block 220, the contact units 226, 227, and 228, and the optical unit 300 And a circuit for driving the respective parts by the cartridge driving part 200 and controlling the control part 400. The present invention relates to an automatic nucleic acid extraction and a target nucleic acid quantitative analysis system.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 미세유로 필름 반응기, 핵산 추출 모듈 및 qPCR 반응조성물 모듈이 구비된 qPCR 카트리지 및 이를 이용한 고속 qPCR 시스템(핵산 추출 일체형 고속형 qPCR 시스템)을 자세히 설명한다. Hereinafter, a detailed description will be given of a qPCR cartridge having a microfiltration film reactor, a nucleic acid extraction module, and a qPCR reaction composition module of the present invention and a high-speed qPCR system (nucleic acid extraction integrated type high-speed qPCR system) using the same.

도 1은 핵산 추출부(120), qPCR 반응 준비부(140) 및 qPCR 반응부(150)가 포함된 카트리지의 조립 구성도를 나타낸 것이며, 도 2는 카트리지 본체와 qPCR 필름 반응기(153)가 시스템에 장착되는 상태를 나타낸 상태도로서 카트리지 상부(110)가 카트리지 본체와 밀착되어 용액저장통(112)을 밀봉하고 있는 실링필름(113)이 카트리지 본체 바닥에 구비된 천공용 펀치(126)에 찢어져 용액들이 핵산 추출부 구획(122)에 담겨진 상태를 나타내고, 도 3은 카트리지 본체 및 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 생산되어 qPCR 시스템에 장착되기 전까지의 상태로서 용액저장통(112)을 밀봉하고 있는 실링필름(113)이 천공용 펀치(126)보다 위에 있는 상태를 나타낸 상태도이고, 도 4는 카트리지 본체 하부의 핵산 추출부(120) 및 qPCR 반응준비부(140)가 포함된 내부구조의 단면도를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a view showing an assembled structure of a cartridge including a nucleic acid extractor 120, a qPCR reaction preparation unit 140 and a qPCR reaction unit 150, A sealing film 113 sealing the solution reservoir 112 is torn by the piercing punch 126 provided at the bottom of the main body of the cartridge, 3 shows a state in which the cartridge main body and the micro channel qPCR film reactor 153 are produced and mounted in the qPCR system and which are sealed in the solution reservoir 112, 4 is a sectional view of the internal structure including the nucleic acid extracting unit 120 and the qPCR reaction preparation unit 140 in the lower part of the main body of the cartridge .

본 발명의 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100)는 카트리지 상부(110), 핵산 추출부(120), 이동 채널(130), qPCR 반응 준비부(140) 및 qPCR 반응부(150)로 구성되어 있다. The cartridge 100 for nucleic acid extraction and qPCR of the present invention includes a cartridge upper part 110, a nucleic acid extracting part 120, a movement channel 130, a qPCR reaction preparation part 140, (150).

카트리지 상부(110)에는 검출대상 시료가 투입되는 시료 투입구(111); 핵산 추출 및 항원, 항체반응 등에 필요로 하는 각각의 용액들을 담고 있는 용액저장통(112), 상기 용액저장통(112)을 밀봉하는 실링필름(113)으로 밀봉하여 제조된다. The cartridge upper part 110 is provided with a sample inlet 111 into which a sample to be detected is injected; A solution reservoir 112 containing the respective solutions required for nucleic acid extraction, antigen, and antibody reaction, and a sealing film 113 sealing the solution reservoir 112.

상기 용액저장통(112)에 주입되는 용액은 세포 용해용액(lysis buffer), 부착용액(binding buffer), 세척용액(washing buffer) 또는 용출용액(elution buffer) 등에서 필요로 하는 것을 선택하여 사용될 수 있다. The solution to be injected into the solution reservoir 112 may be selected from a lysis buffer, a binding buffer, a washing buffer, and an elution buffer.

상기 시료 투입구(111)에는 검출대상 시료가 투입되는 통구로서 상기 시료는 세포, 체액, 또는 표적 핵산, 표적 항원, 표적 항체 등의 표적 물질이 포함된 혼합물일 수 있다. The sample inlet 111 may be a mixture of a target material such as a cell, a body fluid, or a target nucleic acid, a target antigen, or a target antibody.

본 카트리지의 사용시에는 상기 시료 투입구(111)에 시료를 투입한 다음, 마개(114)로 밀봉하며, 상기 마개(114)는 초음파 파쇄기를 이용해 세포 파쇄나 균질화를 가속하기 위해, 초음파 팁이 삽입될 수 있게 형성되어 시료 용액 면에 삽입될 수 있는 충분한 길이를 가진 모양으로 이루어져 있다. 카트리지의 각각의 용액저장통(112)에는 용액의 원활한 흐름을 위해 0.5mm 내외의 통기구(115)가 형성되어 있고, 보관 시 통기구(115)를 통한 증발이나 누액을 막기 위한 통기구 실링필름(미도시)으로 밀봉되어 있다가 사용시에 제거하고 사용된다.When the cartridge is used, a sample is injected into the sample inlet 111 and then sealed with a stopper 114. The stopper 114 is inserted into the sample inlet 111 to accelerate cell disruption or homogenization using an ultrasonic crusher. So that it can be inserted into the surface of the sample solution. Each solution reservoir 112 of the cartridge is provided with a ventilation hole 115 of about 0.5 mm for smooth solution flow and a ventilation sealing film (not shown) for preventing evaporation or leakage through the ventilation hole 115 during storage, Which is then used to remove it during use.

카트리지 본체에는 핵산 추출부(120)와 이동 채널(130), qPCR 반응 준비부(140)가 구비되어 있고, 여기에 필름 형태의 qPCR 반응부(반응기)(150)가 부착되어 있다. The cartridge body is provided with a nucleic acid extracting unit 120, a moving channel 130 and a qPCR reaction preparation unit 140, and a qPCR reaction unit (reactor) 150 in the form of a film is attached thereto.

카트리지 본체의 핵산 추출부(120)는 시료로부터 핵산, 항원, 항체 등의 표적을 부착시키기 위한 표적부착 고체상(124), 상기 표적부착 고체상(124)을 고정시키기 위한 고체상 고정판(125), 상기 표적부착 고체상(124)을 세척하고 부착된 표적을 수득하는 다른 조성으로 구성된 표적추출용 용액을 포함하는 복수의 핵산 추출부 구획(122)이 구비되어 있고, 각각의 핵산 추출부 구획(122)에는 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)와 상기 선택밸브(123)의 누수를 막기 위한 핵산 추출부 회전식 선택밸브 실(127) 및 핵산 추출부 피스톤펌프(121)가 구비되어 있다. The nucleic acid extracting unit 120 of the cartridge main body includes a target mounting solid phase 124 for attaching a target such as a nucleic acid, an antigen, and an antibody from a sample, a solid phase fixing plate 125 for fixing the target mounting solid phase 124, There is provided a plurality of nucleic acid extracting compartments 122 including a solution for target extraction composed of different compositions for washing the adhered solid phase 124 and obtaining an attached target. In each nucleic acid extracting compartment 122, A nucleic acid extracting unit rotary select valve chamber 127 and a nucleic acid extracting unit piston pump 121 for preventing leakage of the extracting unit rotary select valve 123 and the selection valve 123 are provided.

상기 표적부착 고체상(125)은 DNA 또는 RNA 추출용 필터, 또는 항원, 항체가 고정화되어 있는 필터인 실리카멤브레인, 폴리올리고분자막 또는 양이온성막인 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 핵산, 항원 또는 항체들을 선택적으로 흡착시킬 수 있는 고체상의 입자 등을 포함할 수 있다. The target attachment solid phase 125 may be a filter for extracting DNA or RNA or a silica membrane, a polyol polymer membrane, or a cationic membrane, which is a filter on which an antigen, an antibody is immobilized, but is not limited thereto. Solid particles that can be selectively adsorbed, and the like.

본 카트리지의 본체의 qPCR 반응준비부(140)에는 다른 조성으로 구성된 qPCR 조성물을 포함하는 복수의 qPCR 조성물 통(142), qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143), 상기 선택밸브(143)의 누수를 막기 위한 qPCR 반응부 선택밸브 실(144) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 구비되어 있다. 상기의 각각의 회전식 선택밸브(123, 143)는 회전식 선택밸브 밀착판(128)에 의해 각각의 회전식 선택밸브(123, 143)를 압착하여 각각의 실이 밀착되어 누수를 방지한다. The qPCR reaction preparation unit 140 of the main body of the present cartridge includes a plurality of qPCR composition cylinders 142 including a qPCR composition composed of different compositions, a qPCR reaction part rotation selection valve 143, And a qPCR reaction part selection valve chamber 144 for preventing the reaction part 141 and a qPCR reaction part piston pump 141 are provided. Each of the rotary select valves 123 and 143 compresses the rotary select valves 123 and 143 by the rotary select valve close plate 128 so that the respective chambers are closely contacted to prevent leakage.

상기 카트리지 본체에는 상기 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산을 qPCR 반응 준비부(혼합부)(140)로 이동시키는 이동 채널(130)이 구비되어 있어서 추출된 핵산 용액을 qPCR 반응 준비부(140)로 이동시켜 qPCR 반응물을 제조할 수 있다. The cartridge body is provided with a movement channel 130 for moving the nucleic acid extracted from the nucleic acid extracting unit 120 to the qPCR reaction preparation unit (mixing unit) 140. The extracted nucleic acid solution is supplied to the qPCR reaction preparation unit 140 ) ≪ / RTI > to produce a qPCR reagent.

상기 카트리지 본체에 부착되는 qPCR 반응부(반응기)(150)는 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산 용액을 이용하여 qPCR 반응 준비부(150)에서 PCR 건조 조성물과 혼합된 qPCR 반응물을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입시켜 qPCR 반응을 수행한다. 이를 위해 qPCR 반응부(150)는 qPCR 반응물 주입구(151); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 통과한 qPCR 반응생성물을 배출시키는 qPCR 반응생성물 배출구(152); 및 상기 qPCR 반응생성물을 수집하는 배출액 수집구획(154)을 포함하여 구성된다. The qPCR reaction unit (reactor) 150 attached to the main body of the cartridge is configured to mix the qPCR reagent mixed with the PCR drying composition in the qPCR reaction preparation unit 150 using the nucleic acid solution extracted from the nucleic acid extraction unit 120, And injected into a film reactor 153 to perform a qPCR reaction. For this, the qPCR reaction unit 150 includes a qPCR reagent inlet 151; A qPCR reaction product outlet 152 for discharging the qPCR reaction product passed through the microchannel qPCR film reactor 153; And an effluent solution collection section (154) for collecting the qPCR reaction product.

카트리지의 상부(110)는, 도 1에 나타난 바와 같이, 카트리지 본체와 결합되어 사용된다. 도 2는 카트리지 본체와 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 시스템에 장착되는 상태를 나타낸 상태도로서 카트리지의 상부(100)가 카트리지 본체에 밀착된 상태를 나타낸 것이다. 이때 카트리지 상부(110)가 카트리지 본체와 밀착되면 용액저장통(112)을 밀봉하고 있는 실링필름(113)이 카트리지 본체 바닥에 구비된 천공용 펀치(126)에 찢어져 용액들이 핵산 추출부 구획(122)에 담겨진 상태를 나타내고, 도 3은 카트리지 본체 및 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 생산되어 qPCR 시스템에 장착되기 전까지의 상태로서 용액저장통(112)을 밀봉하고 있는 실링필름(113)이 천공용 펀치(126) 보다 위에 있는 상태를 나타낸 것이다. The upper portion 110 of the cartridge is used in combination with the cartridge body, as shown in Fig. 2 is a state view showing a state in which the cartridge body and the fine channel qPCR film reactor 153 are mounted on the system, and shows the state in which the upper portion 100 of the cartridge is in close contact with the cartridge body. At this time, when the cartridge upper part 110 comes into close contact with the main body of the cartridge, the sealing film 113 sealing the solution reservoir 112 is torn by the perforation punch 126 provided at the bottom of the main body of the cartridge, 3 shows a state in which the cartridge main body and the fine channel qPCR film reactor 153 are produced and mounted in the qPCR system. The sealing film 113 sealing the solution reservoir 112 is a punching punch (126). ≪ / RTI >

사용 전의 카트리지는 카트리지 상부(110)의 멈춤돌기(117)가 카트리지 본체의 중간에 있는 멈춤홈(161)에 걸려 있어 덜 삽입된 상태이고, 카트리지를 qPCR 시스템에 장착하여 사용할 때는 카트리지 상부(110)가 완전히 본체에 삽입되어 상기 멈춤돌기(117)가 카트리지 본체의 하부에 있는 밀착홈(162)에 걸린 상태이다. The cartridge before use is in a state in which the stopping protrusion 117 of the cartridge upper part 110 is caught in the stop groove 161 in the middle of the cartridge body and is in a state of being less inserted. When the cartridge is mounted on the qPCR system, Is completely inserted into the main body so that the detent protrusion 117 is caught in the close contact groove 162 in the lower portion of the main cartridge body unit.

카트리지 상부(110)를 압착하여(눌러서) 카트리지 상부(110)의 멈춤돌기(117)가 카트리지 본체의 밀착홈(162)에 안착되게 카트리지 상부(110)와 본체를 밀착시키면 용액저장통(112)을 밀봉하는 실링필름(113)이 각각의 구획에 구비되어 있는 천공용 펀치(126)에 의해 천공하여 밀봉되어 있는 핵산 추출용 용액들이 각각의 핵산 추출부 구획(122)으로 흘러나와 담기도록 한 후 사용된다. 이때 카트리지의 각 구획의 용액들이 구획에서 유출될 때 진공이 걸려서 안 흘러내리는 것을 방지하기 위해 통기구(116)가 구비되어 있다. 또한 카트리지 상부(110)와 본체가 밀착되는 부위에 통기용 필터(115)가 구비되어 있다.When the cartridge upper part 110 and the main body are brought into close contact with each other so that the detent protrusion 117 of the cartridge upper part 110 is seated in the close contact groove 162 of the cartridge main body by pressing the cartridge upper part 110 The sealed sealing film 113 is pierced by the punching punch 126 provided in each of the compartments and the sealed nucleic acid extracting solution is allowed to flow into the respective nucleic acid extracting compartments 122, do. At this time, the vents 116 are provided to prevent the solutions of the respective compartments of the cartridge from being vacuumed when the liquid is discharged from the compartments. And a ventilation filter 115 is provided at a portion where the cartridge upper part 110 and the main body are in close contact with each other.

상기와 같이 카트리지 상부(110)를 밀착시킨 후 시료(검출대상 생체시료)를 시료 투입구(111)에 투입한 후 마개(114)를 닫고 본 발명의 고속 qPCR 시스템에 투입을 하면 간편하게 1분 이내에 검사를 시작할 수 있다. 시스템의 카트리지 구동부(200)에서 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 회전시켜 세포 용해용액(lysis buffer)이 들어있는 핵산 추출부 구획(122)으로 연결한 다음, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 이용하여 시료 처리에 필요한 부피의 세포 용해용액(lysis buffer)을 흡입한다. After the cartridge upper part 110 is closely contacted as described above, a sample (detection target biological sample) is put into the sample input port 111 and then the cap 114 is closed and put into the high-speed qPCR system of the present invention. ≪ / RTI > The nucleic acid extracting part rotary selector valve 123 is rotated in the cartridge driving part 200 of the system to connect the nucleic acid extracting part 123 to the nucleic acid extracting part 122 containing the lysis buffer, , A lysis buffer of a necessary volume for sample processing is sucked.

핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 회전시켜 시료가 투입된 핵산 추출부 구획(122)으로 연결한 다음, 직전에 흡입한 세포 용해용액(lysis buffer)을 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 가동하여 시료에 인가한다. 이때 초음파 파쇄기 팁이 삽입되어 있는 마개(114)에 초음파를 인가하여 초음파가 용액에 전달되어 빠르게 세포 파쇄가 일어나면서 세포 용해용액(lysis buffer)이 시료와 잘 혼합되게 할 수 있다. 세포 용해용액(lysis buffer)으로 처리된 시료는 핵산 추출부 피스톤펌프(121)로 흡입하여 표적부착 고체상(124)에 가해주어 시료 내 표적들을 부착시킨 다음, 여액을 직전 시료처리를 수행하였던 구획으로 배출하여 제거한다. 이어서 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 이용하여 부착용액(binding buffer), 세척용액(washing buffer)등이 담겨있는 핵산 추출부 구획(122)으로 순차적으로 연결한 다음, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 이용하여 표적부착 고체상(124)에 해당 용액들을 순차적으로 인가해주고 여액을 제거하여 시료로부터 표적 핵산 추출과정을 수행한다. The nucleic acid extracting rotary selector valve 123 is rotated to connect the nucleic acid extracting compartment 122 into which the sample has been introduced and then the cell lysis buffer sucked just before is moved to the nucleic acid extracting section piston pump 121 Apply to the sample. At this time, ultrasonic waves are applied to the cap 114 having the ultrasonic disposer tip inserted therein, so that the ultrasonic waves are transferred to the solution, and cell lysis is rapidly performed, so that the lysis buffer can be mixed well with the sample. The sample treated with the cell lysis buffer was sucked into the nucleic acid extracting section piston pump 121 and applied to the target attached solid phase 124 to attach the targets in the sample and then the filtrate was used as the compartment Discharge and remove. Then, the nucleic acid extracting unit is sequentially connected to a nucleic acid extracting compartment 122 containing a binding buffer, a washing buffer, and the like using a nucleic acid extracting rotary selector valve 123. Then, 121) to sequentially apply the solutions to the target attached solid phase (124) and remove the filtrate to perform the target nucleic acid extraction process from the sample.

상기 과정을 거쳐서 표적부착 고체상(124)에 부착된 표적 핵산은 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 용출용액(elution buffer)이 담긴 핵산 추출부 구획(122)으로 연결시킨 다음, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 이용하여 흡입한 후, 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 이용하여 이동 채널(130)로 이동시킨다. 이때 이동 채널(130)은 qPCR 반응 준비부(140)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 통해 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)와 연결이 가능한 구조로 제작된 구획이다. The target nucleic acid attached to the target adhering solid phase 124 through the above process is connected to the nucleic acid extracting section compartment 122 containing the elution buffer by the nucleic acid extracting rotary select valve 123, Is sucked by the pump 121, and then is moved to the movement channel 130 by using the nucleic acid extracting unit rotary select valve 123. At this time, the movement channel 130 is a compartment made to be connectable to the qPCR reaction part piston pump 141 through the qPCR reaction part rotary selection valve 143 of the qPCR reaction preparation part 140.

도 6은 카트리지(100)에서 핵산을 추출하는 과정(도 6의 A, B)과 핵산 용액을 핵산 중합효소가 포함된 qPCR 조성물과 혼합하는 과정(도 6의 C와 D)을 이동 채널부(130)를 포함하는 내부구조 단면도로 나타낸 것이다.6 is a flowchart illustrating a process (A and B in FIG. 6) for extracting nucleic acid from the cartridge 100 and a process (C and D in FIG. 6) for mixing the nucleic acid solution with a nucleic acid polymerase- 130). ≪ / RTI >

상기 검출대상 생체시료로부터 표적 핵산을 추출과정 중에는 부착용액(binding buffer), 세척용액(washing buffer), 용출용액(elution buffer) 등 다양한 용액들이 담긴 핵산 추출부 구획(122)으로 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 연결하고, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)로 이동 작업을 수행하게 되는데 핵산 추출부 회전식 선택밸브 실(127)과 회전식 선택밸브 밀착판(128)을 설치하여 핵산 추출 과정 중 용액의 누출방지와 원활한 핵산 추출부 회전식 선택밸브(127)의 회전작동을 가능하게 한다.During the extraction of the target nucleic acid from the biological sample to be detected, the nucleic acid extracting section 122 containing the various solutions such as a binding buffer, a washing buffer, and an elution buffer, The valve 123 is connected to the nucleic acid extracting unit 121 and the nucleic acid extracting unit 121 is moved to the nucleic acid extracting unit rotary select valve chamber 127 and the rotary select valve adhering plate 128, And the rotation operation of the smooth nucleic acid extracting rotary select valve 127 is enabled.

상기에서 추출(정제)된 표적 핵산은 qPCR 반응 준비부(140)에서 핵산 중합효소와 표적들에 대한 프라이머 프로브 등이 포함된 핵산 증폭용 시약과 혼합되어 qPCR 반응을 위해 준비된다. 이동 채널(130)과 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 연결되게 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)로 연결한 다음, qPCR 반응에 필요한 부피의 추출된 표적 핵산을 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)로 흡입한 후 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 목적하는 qPCR 조성물 통(142)으로 연결하고, qPCR 반응부 피스톤펌프(141)로 흡입 및 토출 작동을 반복하여 qPCR 조성물 통(142)에 건조된 형태로 담지해둔 핵산 중합효소, 프라이머, 프로브가 포함된 핵산 증폭용 시약과 핵산 용액을 혼합하여 qPCR 조성물을 제조한다. The target nucleic acid extracted (purified) from the above is mixed with a nucleic acid amplification reagent containing a nucleic acid polymerase and a primer probe for the target in the qPCR reaction preparation unit 140 and prepared for qPCR reaction. The volume of the extracted target nucleic acid required for the qPCR reaction is connected to the qPCR reaction part piston pump 141 through the qPCR reaction part rotary valve 143 so that the movement channel 130 and the qPCR reaction part piston pump 141 are connected, And then the qPCR reaction rotary selector valve 143 is connected to the desired qPCR composition cylinder 142 and the suction and discharge operations are repeated with the qPCR reaction part piston pump 141 to dry the qPCR composition cylinder 142 The nucleic acid amplification reagent containing the nucleic acid polymerase, the primer and the probe carried in the form of a nucleic acid amplification reagent and a nucleic acid solution are mixed to prepare a qPCR composition.

제조된 조성물은 qPCR 반응에 필요한 양만큼 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)로 흡입한 다음, qPCR 반응부 선택밸브(143)로 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 qPCR 반응물 주입구(151)로 연결한 후 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)를 이용하여 미세유로(153-1) 내부로 일정한 속도로 qPCR 조성물 용액을 주입한다. 주입된 qPCR 조성물 용액은 미세유로(153-1)를 통과하면서 예열 구역의 저온 구역(155)을 통과하면서 역전사반응이 일어나고, 상기 예열 구역의 고온 구역(157)을 통과하여 핫스타트에 필요한 항체와 DNA 이중나선을 변성시키고 PCR 구역으로 흐르게 된다. PCR 구역의 저온 구역(155)에서는 프라이머가 표적에 선택적으로 붙고 이어서 중합효소에 의해 표적 특이적 핵산 중합반응이 일어나고, 광학(형광)측정 구역(156)에서 qPCR 반응에 의해 발생된 특이 파장의 형광량을 측정하여 증폭량을 확인한 후 고온 구역(157)을 통과하면서 차후 qPCR 반응을 위한 핵산의 변성(DNA 이중나선 풀림) 과정이 연속적으로 일어나게 된다.The prepared composition was sucked into the qPCR reaction part piston pump 141 by an amount necessary for the qPCR reaction and then connected to the qPCR reaction part selection inlet 143 of the micro flow path qPCR film reactor 153 to the qPCR reaction part injection port 151 Then, the qPCR composition solution is injected into the microchannel 153-1 at a constant rate by using the qPCR reaction part piston pump 141. The injected qPCR composition solution passes through the micro channel 153-1 while passing through the low temperature zone 155 of the preheating zone and undergoes a reverse reaction and passes through the high temperature zone 157 of the preheating zone, DNA double helix is denatured and flowed into the PCR region. In the low temperature zone 155 of the PCR zone, the primer selectively attaches to the target, followed by the target specific nucleic acid polymerization reaction by the polymerase, and the specific wavelength type generated by the qPCR reaction in the optical (fluorescence) After measuring the amount of light and confirming the amount of amplification, the denaturation of the nucleic acid for subsequent qPCR reaction (DNA double helix annealing) is continuously performed while passing through the high temperature zone 157.

한 쌍 이상으로 구비된 서로 다른 프라이머 및/또는 프로브로 구성된 qPCR 조성물을 포함하는 qPCR 조성물 통(142)으로부터 qPCR 반응물을 제조하여 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입함으로써 연속하여 다양한 종류의 qPCR 반응들을 동시에 수행할 수 있다. 이때 qPCR 반응물 주입 간에 미네랄오일을 주입함으로써 각각의 qPCR 반응물을 구획(분리)하는 것이 가능하다. 1차 qPCR 반응 완료 후 qPCR 반응생성물 배출구(152)로 배출되는 qPCR 반응생성물은 배출액 수집구획(154)에 모아두었다가 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)와 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)를 이용하여 증류수나 완충용액으로 희석하여 2차 qPCR 반응의 주형 시료 용액으로 사용할 수 있다. 배출액 수집구획(154)에 모인 1차 qPCR 반응생성물은 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)와 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)에 의해 qPCR 조성물 통(142)으로 다시 이송 및 혼합한 후 순차적으로 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입하여 2차 nested qPCR 반응을 수행한다.A qPCR reagent is prepared from a qPCR composition bottle (142) containing a qPCR composition composed of more than one pair of primers and / or probes and injected into the microchannel qPCR film reactor (153) Can be performed simultaneously. At this time, it is possible to separate (isolate) each qPCR reactant by injecting mineral oil between the qPCR reactant injections. After completion of the primary qPCR reaction, the qPCR reaction product discharged to the qPCR reaction product outlet 152 is collected in the waste liquid collecting compartment 154, and the qPCR reaction product rotary valve 143 and the qPCR reaction product piston pump 141 are used Diluted with distilled water or buffer solution and used as a template sample solution for the secondary qPCR reaction. The primary qPCR reaction products collected in the effluent collecting compartment 154 are transported and mixed back to the qPCR composition bottle 142 by the qPCR reaction part rotary selector valve 143 and the qPCR reaction part piston pump 141, And then injected into the microchannel qPCR film reactor 153 to perform a second nested qPCR reaction.

qPCR 반응 준비부(140)로 추출된 핵산의 이동, qPCR 조성물과의 혼합, 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)로의 qPCR 반응물의 주입 등은 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)에 의해 선택되게 되는데 핵산 추출부 구획(122)에서와 같이 qPCR 반응부 선택밸브 실(144)과 회전식 선택밸브 밀착판(128)을 설치하여 시료 누출방지와 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)의 회전동작을 원활하게 한다. The movement of the nucleic acid extracted into the qPCR reaction preparation unit 140, mixing with the qPCR composition, and injection of the qPCR reagent into the microchannel qPCR film reactor 153 are selected by the qPCR reaction rotary selector valve 143, The qPCR reaction part selection valve chamber 144 and the rotary type valve closing plate 128 are provided as in the extraction section 122 to facilitate the rotation of the sample leakage prevention and the qPCR reaction part rotary select valve 143 .

각각의 피스톤펌프(121, 141)는 빠르고 정확한 용액의 이동을 위해 다른 크기를 가진다. 핵산 추출부 피스톤펌프(121)는 이동시키는 용액의 부피가 크므로 직경이 커서 핵산 추출부 피스톤펌프(141)의 용량은 2mL~10mL일 수 있다. 반면, 정밀도를 요구하는 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)는 1mL 이하의 용량을 가진다. 상기 피스톤펌프(121, 141)는 피스톤 대신에 진공펌프 또는 연동펌프와 연결되어 있는 구조로 대체되어 흡입, 토출 기능을 대신할 수도 있지만 정확한 용액전달을 위해서는 상기 피스톤펌프를 사용하는 것이 바람직하다.Each of the piston pumps 121 and 141 has different sizes for fast and accurate solution movement. The nucleic acid extracting part piston pump 121 has a large diameter because the volume of the solution to be moved is large, and the capacity of the nucleic acid extracting part piston pump 141 may be 2 mL to 10 mL. On the other hand, the qPCR reaction piston pump 141, which requires precision, has a capacity of 1 mL or less. The piston pumps 121 and 141 may be replaced with a vacuum pump or a peristaltic pump instead of a piston to replace the suction and discharge functions. However, it is preferable to use the piston pump for accurate solution delivery.

본 발명에 있어서, 상기 qPCR 조성물은 핵산 중합효소가 포함된 핵산 증폭용 시약인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 핵산 추출부 구획(122)은 구획 밑면의 약 0.5mm 직경을 가지는 통구(122-1)를 통해서 핵산 추출용 용액의 이동이 이루어질 수 있으며, 상기 qPCR 조성물 통(142)는 통 밑면의 약 0.5mm 직경을 가지는 통구를 통해서 qPCR 용액의 이동이 이루어질 수 있고, 상기 추출된 핵산과 혼합된 qPCR 용액은 중합효소 연쇄반응 반응부의 열전달 블록(220)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)로 이동시킬 수 있다.In the present invention, the qPCR composition may be a nucleic acid amplification reagent containing a nucleic acid polymerase. The nucleic acid extracting compartment 122 may include a cap 122-1 having a diameter of about 0.5 mm at the bottom of the compartment, The qPCR composition bottle 142 can be moved through the passage having a diameter of about 0.5 mm on the bottom surface of the bottle and the qPCR solution can be moved The qPCR solution can be transferred to the microchannel qPCR film reactor 153 coupled to the heat transfer block 220 of the polymerase chain reaction unit.

본 발명에 있어서, 상기 카트리지 상부(110), 핵산 추출부(120) 및 qPCR 반응 준비부(140)를 포함하는 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100)는 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 아크릴로부타디엔스티렌(ABS), PMMA(poly methyl methacrylate), COC(cyclic olefin copolymer), PDMS(polydimethylsiloxane), 실리콘(silicone) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 재료로 제조될 수 있고, 회전식 선택밸브 실(127, 144)은 각종 고무 탄성체로 제조될 수 있다. 상기 카트리지(100)는 일회용 플라스틱 제품으로 사용되므로, 시료의 원천적인 오염을 차단할 수 있다. 도 4는 카트리지 본체의 한면이 절개된 사시도를 나타낸 것이다. In the present invention, the cartridge 100 for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction) including the cartridge upper part 110, the nucleic acid extracting part 120, and the qPCR reaction preparation part 140 is made of polycarbonate, poly (ABS), poly methyl methacrylate (PMMA), cyclic olefin copolymer (COC), polydimethylsiloxane (PDMS), silicone, and combinations thereof. And the rotary select valve chambers 127 and 144 can be made of various rubber elastic bodies. Since the cartridge 100 is used as a disposable plastic product, it is possible to prevent original contamination of the sample. 4 is a perspective view showing one side of the cartridge body.

도 2는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)와 카트리지(100)가 결합된 외관상 구조의 사시도를 나타낸 것이다. 상기 카트리지(100)는 qPCR 반응물이 유출입되고, qPCR 사이클이 반복 수행되도록 상기 열전달 블록(220)에 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)와 결합되어 있고, 각기 다른 온도가 전달되는 열전달 블록(220)과 밀착되어 있다.2 shows a perspective view of an apparent structure in which the micro channel qPCR film reactor 153 and the cartridge 100 are combined. The cartridge 100 is connected to the heat transfer block 220 through a microchannel qPCR film reactor 153 so that the qPCR reactant flows in and the qPCR cycle is repeatedly performed. Respectively.

도 5는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 나타낸 것으로, A는 외관상 구조를 나타내고 있으며, B는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 부착된 상태로 카트리지가 시스템에 투입되는 형태를 나타내고 있으며, C는 qPCR에 따른 핵산을 포함하는 반응물 및 반응생산물의 흐름 방향을 점선 화살표로 나타낸 것이며, D 및 E는 상기 필름의 미세유로(153-1) 구조를 나타낸 것이고, F는 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 필름의 단면 구조를 나타낸 것이다.
5 shows a micro channel qPCR film reactor 153 in which A shows an apparent structure and B shows a state in which a cartridge is put into a system with a fine channel qPCR film reactor 153 attached thereto, D and E represent the microfluidic channel 153-1 structure of the film, F represents the microfluorescent substance in the microchannel qPCR film reactor 153) shows the cross-sectional structure of the film.

일반적인 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)은 94℃의 변성(denaturation), 45~67℃의 결합(annealing) 및 72℃의 복제(polymerization, extension)의 세 단계로 이루어지나, 복제단계를 생략하더라도 50℃~70℃ 정도로 맞추어주면 중합효소 연쇄반응이 잘 일어나므로 실시간 qPCR(real-time qPCR)을 빠르게 수행할 수 있다. The general quantitative polymerase chain reaction (qPCR) consists of three steps: denaturation at 94 ° C, annealing at 45 ° C to 67 ° C, and polymerization and extension at 72 ° C. It is possible to rapidly perform real-time qPCR (real-time qPCR) since the polymerase chain reaction occurs well if the temperature is adjusted to about 50 ° C to 70 ° C.

도 12에 나타난 바와 같이, 열전달 블록(220)은 각기 다른 온도를 제공하도록 변성 블록(denaturing block)(221)과 반응 블록(annealing block)(223)이 구분되어 있는 2 구획의 열전달 블록을 도시하였으나, 더 추가하여도 무방하다. 이때, 상기 광학측정 구역(222) 공간에 의해 상기 열전달 블록의 구획(221, 223) 간의 온도 간섭을 억제하여 온도조절이 보다 용이하게 된다. 상기 광학측정부 구역(222)은 회전 광학부(350)가 자유롭게 회전할 수 있게 최소한의 공간으로 구비된다. As shown in FIG. 12, the heat transfer block 220 has a two-compartment heat transfer block in which a denaturing block 221 and an annealing block 223 are separated to provide different temperatures , It may be added. At this time, temperature control is facilitated by suppressing the temperature interference between the spaces 221 and 223 of the heat transfer block by the space of the optical measurement area 222. [ The optical measuring sub-section 222 is provided with a minimum space so that the rotating optical section 350 can freely rotate.

도 12에는 열전달 블록(220)의 형상이 2개의 밴드(band) 또는 파이 형상으로 예시되어 있으나, 중심축에서 같은 반지름을 가지는 블록으로서 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 밀착될 수 있는 원형 등 다양한 형상으로 제조될 수 있다. 12, the shape of the heat transfer block 220 is illustrated in two bands or pie shapes. However, the heat transfer block 220 may be a block having the same radius on the center axis, Shape.

상기 미세유로(153-1)는 qPCR 반응물 주입구(151)를 통해 시료가 유입되고 qPCR 반응생성물 배출구(152)를 통해 배출되게 된다. 상기 열전달 블록(220)에 의해 각기 다른 온도가 전달되어 반응 사이클이 반복적으로 수행되도록 광학부(300)를 향해 부채꼴 모양으로 중심각이 110°~180°(바람직하게는, 120°) 휘어진 형태로 광학부(300)를 감싸는 형상으로 열전달 블록(220)에 결합될 수 있으며, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 일정 간격으로 배열되어 연결되는 미세유로(153-1)로 구성되어 있을 수 있다. 이에 따라 상기 미세유로(153-1)가 각기 다른 온도로 조절되는 열전달 블록(220)을 순차적 및 반복적으로 접촉함으로써 중합효소 연쇄반응을 수행하게 되어 시료 내 핵산의 증폭이 이뤄지게 된다. 상기 미세유로(153-1)가 일정 간격으로 배열되어 있는 이유는 중합효소 연쇄반응을 일정하게 유지하고, 광학 측정 시 형광이 발생하는 간격을 일정하게 유지하여 정확하게 형광량을 측정하기 위함이다. The sample flows into the micro channel 153-1 through the qPCR reagent inlet 151 and is discharged through the qPCR reaction product outlet 152. [ The heat transfer block 220 conveys a different temperature to the optical part 300 so as to repeatedly perform the reaction cycle so that the central angle is deflected in the form of a 110 to 180 ° (preferably 120) And the micro channel qPCR film reactor 153 may be composed of micro channels 153-1 arranged at regular intervals and connected to each other. Accordingly, the micro channel 153-1 is sequentially and repeatedly brought into contact with the heat transfer block 220, the temperature of which is adjusted to a different temperature, so that the polymerase chain reaction is performed, thereby amplifying the nucleic acid in the sample. The reason why the micro channels 153-1 are arranged at regular intervals is to keep the polymerase chain reaction constant and to measure the fluorescence amount accurately by keeping constant the intervals where fluorescence occurs during optical measurement.

상기 열전달 블록(220)은 각기 다른 온도를 제공하도록 광학측정부 구역(222)으로 변성 블록(denaturing block)(221)과 반응 블록(annealing block)(223)이 분리될 수 있으며, 상기 열전달 블록(220)는 각기 다른 온도를 유지하도록 발열소자와 온도센서가 구비되어 제어부에 의해 일정온도를 유지할 수 있다. The heat transfer block 220 may be separated from the denaturing block 221 and the annealing block 223 in the optical measuring section 222 to provide different temperatures, 220 are provided with a heating element and a temperature sensor so as to maintain different temperatures so that a predetermined temperature can be maintained by the control unit.

상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 한번 통과하여 증폭되어 배출액 수집구획(154)에 모아진 PCR 반응생성물은 다양한 염기서열을 포함하고 있는 표적 DNA의 혼합물인 경우, 각각의 표적들의 염기서열에 해당하는 프라이머 프로브를 사용하여 2차 qPCR 을 통해 각각의 표적들을 정성ㆍ정량분석 할 수 있다. 상기 검출대상 핵산은 상기 변성 블록(denaturing block)(221)과 반응 블록(annealing block)(223)을 1회 이동할 때마다 한 사이클의 중합효소 연쇄반응이 일어나고, 총 1~45 사이클의 중합효소 연쇄반응이 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.The PCR reaction product amplified by passing through the micro channel qPCR film reactor 153 and collected in the effluent collecting zone 154 is a mixture of target DNAs containing various base sequences and corresponds to the base sequence of each target , The targets can be qualitatively and quantitatively analyzed through the secondary qPCR using primer probes. The nucleic acid to be detected is subjected to one cycle of a polymerase chain reaction every time the denaturing block 221 and the annealing block 223 are moved, and a total of 1 to 45 cycles of the polymerase chain reaction And the reaction proceeds.

상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 상기 광학부(300)의 회전하는 거울인 미러2(351)의 중심을 향해 부채꼴 모양으로 중심각이 약 110°~180°(바람직하게는 120°)로 휘어진 형태로 열전달 블록(220)에 결합될 수 있으며, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 일정 간격으로 배열되어 있는 연속적인 미세유로(153-1)로 구성되어 있을 수 있으며, 상기 미세유로(153-1)는 바닥이 둥근 단면을 가지는 것이 바람직하며, 상기 단면의 규격은 가로 0.1~0.3mm 및 세로 0.1~0.3mm일 수 있고, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 표적 핵산이 포함된 qPCR 반응물이 주입되는 qPCR 반응물 주입구(151)와 qPCR 반응생성물이 배출되는 qPCR 반응생성물 배출구(152)를 포함한다. The microchannel qPCR film reactor 153 has a central angle of about 110 ° to 180 ° (preferably 120 °) in a fan shape toward the center of the mirror 2 (351) which is the rotating mirror of the optical unit 300 And the micro channel qPCR film reactor 153 may be composed of a continuous micro channel 153-1 arranged at regular intervals and the micro channel 153 -1) may have a rounded bottom surface, the cross-sectional size may be 0.1 to 0.3 mm and 0.1 to 0.3 mm in length, and the micro channel qPCR film reactor 153 may include a qPCR And a qPCR reaction product inlet 151 through which the reaction product is injected and a qPCR reaction product outlet 152 through which the qPCR reaction product is discharged.

상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 cDNA를 합성하는 역전사 반응과 qPCR 반응을 수행할 수 있는 예열 구역이 구비되어 있어 RT-PCR과 PCR을 동시에 수행할 수 있다. 역전사(Reverse Transcription, RT) 반응은 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 주입구(151)에서 바로 연결되는 저온 구역(155)에서 역전사반응을 수행할 수 있고, 이어지는 고온 구역(157)에서 변형을 거친 후 핵산을 증폭하는 중합효소 연쇄반응이 온도순환 구역(구간)에서 진행될 수 있다.
The micro channel qPCR film reactor 153 is provided with a preheating zone capable of performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA and a qPCR reaction, so that RT-PCR and PCR can be simultaneously performed. The reverse transcription (RT) reaction can perform a reverse transcription reaction in the low temperature zone 155, which is directly connected to the injection port 151 of the micro channel qPCR film reactor 153, and in the subsequent high temperature zone 157, Polymerase chain reaction amplifying the nucleic acid can proceed in the temperature circulation zone (section).

상기와 같은 구성으로 고안된 본 발명의 핵산 추출 및 qPCR 카트리지(100)를 이용하여 각종 표적 물질을 검출 및 정량할 수 있는 실시간 모니터링 시스템인 고속 qPCR 시스템을 개발하였다. 도 7은 고속 qPCR 시스템의 케이스가 제거된 상태의 사시도를 나타낸 것으로서 A는 카트리지가 장착된 상태를 나타내고, B는 카트리지를 장착할 때 자동문(201)이 열린 상태를 나타내고 있다. 도 8은 고속 qPCR 시스템의 자동문의 정면사시도(A)와 후면사시도(B)를 나타낸 것이다. A high-speed qPCR system, which is a real-time monitoring system capable of detecting and quantifying various target substances using the nucleic acid extraction and qPCR cartridge 100 of the present invention, which is designed as described above, has been developed. FIG. 7 is a perspective view of the high-speed qPCR system with the case removed; FIG. 7A shows a state in which the cartridge is mounted, and FIG. 7B shows a state in which the automatic door 201 is opened when the cartridge is mounted. 8 shows a front perspective view (A) and a rear perspective view (B) of an automatic door of a high speed qPCR system.

이하 본 발명의 카트리지(100)를 사용하는 고속 qPCR 시스템에 대한 상세한 기술을 하겠다. Hereinafter, a detailed description of a high-speed qPCR system using the cartridge 100 of the present invention will be given.

본 발명의 카트리지(100)를 구동하여 원하는 표적 물질의 정확한 농도를 측정하기 위해서는 세포 파쇄 및 핵산 추출과 표적 핵산, 항원, 항체를 검출하는 표식 DNA 물질을 대상으로 신속하고, 정확하게 qPCR 반응을 수행해야 한다. 이를 위해 필요로 하는 물리적, 화학적 반응들을 연속적으로 빠르게 수행하여야 한다. 이러한 역할을 수행하는 카트리지 구동부(150)가 본 시스템에 구비되어 있어 이하 구동부에 대한 설명을 하겠다. In order to drive the cartridge 100 of the present invention to measure an accurate concentration of a desired target substance, the qPCR reaction must be quickly and accurately performed on the labeled DNA material that detects cell crushing and nucleic acid extraction and target nucleic acid, antigen, and antibody do. The required physical and chemical reactions must be performed continuously and rapidly. The cartridge driving unit 150 that performs this role is provided in the present system.

세포 파쇄와 단백질에 부착되어 있는 핵산들을 빠르게 분리시키기 위해서 본 시스템에는 카트리지(100)의 생체시료가 투입되는 시료 투입구(111)를 밀봉하는 마개(114)를 원통형으로 고안하였다. 시료투입구(111)로 시료를 투입하고, 마개(114)로 밀봉한 후 본 발명의 시스템에 장착하면 시스템의 상하로 개폐되는 자동문(201)에 장착되어 있는 초음파 파쇄기의 초음파 프로브(202)가 카트리지 마개(114)의 원통에 삽입 밀착되어 여기에 세포 용해용액을 가해주어 시료를 포함하고 있는 용액이 마개(114)의 바닥이 잠기게 한 다음, 여기에 초음파를 가해주면 마개(114)의 하부 면을 통해 시료 용액에 초음파가 전달되어 빠른 시간에 세포를 파쇄하고, 단백질 등에 부착되어 있는 핵산을 용액으로 용출시킬 수 있다. 자동문(201)은 모터에 의해 자동으로 개폐되고 자동문(201)의 상부에는 초음파 프로브(202)와 더불어 카트리지를 눌러서 고정시키는 카트리지 고정봉(203)이 장착되어 있다. 상기 초음파 프로브(202)와 카트리지 고정봉(203)에는 상하이동 유격이 있고 프로브 압축 스프링(204)에 의해 눌려지는 구조로 되어 있어 카트리지(100)를 항상 일정하게 눌러주고, 초음파 프로브(202)를 일정한 압력으로 마개(114)의 바닥을 눌려주어 효율적으로 초음파가 시료용액에 전달될 수 있다. In order to rapidly separate the cell crushing and the nucleic acids attached to the protein, the present system is designed to have a cap 114 for sealing the sample input port 111 into which the biological sample of the cartridge 100 is injected. When the sample is introduced into the sample input port 111 and sealed with the stopper 114 and then mounted on the system of the present invention, the ultrasonic probe 202 of the ultrasonic wave shredder mounted on the automatic door 201, The solution containing the sample is immersed in the bottom of the stopper 114 and the ultrasonic wave is applied to the bottom of the stopper 114. Thereafter, The ultrasound is transmitted to the sample solution through the microfluidic channel, and the nucleic acid attached to the protein can be eluted into the solution. The automatic door 201 is automatically opened and closed by a motor, and an upper portion of the automatic door 201 is equipped with an ultrasonic probe 202 and a cartridge fixing rod 203 for pressing and fixing the cartridge. The ultrasonic probe 202 and the cartridge fixing rods 203 have a vertical movement gap and are pressed by the probe compression spring 204 so that the cartridge 100 is always pressed constantly and the ultrasonic probe 202 The bottom of the stopper 114 is pressed at a constant pressure, so that the ultrasonic wave can be efficiently transferred to the sample solution.

본 발명의 시스템에서 카트리지(100)의 피스톤펌프를 구동하는 피스톤펌프 구동부의 사시도를 도 9에 도시하였다. 도 10은 피스톤펌프 구동부의 측면도를 도시하였다. 도 11은 회전식 선택밸브 구동부의 피스톤펌프 구동부의 사시도(A) 및 단면도(B)를 도시한 것이다.FIG. 9 is a perspective view of the piston pump driving unit for driving the piston pump of the cartridge 100 in the system of the present invention. 10 is a side view of the piston pump driving unit. 11 is a perspective view (A) and a sectional view (B) of a piston pump driving portion of the rotary select valve driving portion.

카트리지(100)를 2개의 피스톤펌프를 각각 정밀하게 구동하기 위해서는 피스톤 집게(211)를 통해 카트리지의 각각의 피스톤을 상하로 작동시키는 상하이동 스크류(212)와 구동시키는 각각의 모터(213-A, 213-B)를 이용하였다. 카트리지(100) 장착시에 피스톤 집게(211)가 걸리는 문제를 해결하기 위해 상기 피스톤펌프 상하구동부를 전후로 이동할 수 있게 전후 직선운동이 가능한 전후 운동부 위에 설치하고, 전후 이동 모터(215)와 전후 이동 랙피니온(214)을 이용하여 전후 이동이 가능하게 하였다. 카트리지(100) 장착 시에 피스톤펌프 구동부(210)가 후진되어 있다가 카트리지(100) 장착 후 자동문(201)을 닫아서 카트리지(100)를 고정하면 피스톤펌프 구동부(210)가 전방으로 이동하여 각각의 피스톤 집게(211)가 카트리지 피스톤펌프의 연결부(121-A, 141-A)에 끼워지도록 하였다. In order to precisely drive the two pistons of the cartridge 100, each of the motors 213-A, 213-A, and 213-A, which drives the pistons of the cartridges up and down by the pistons 211, 213-B) was used. In order to solve the problem of the piston tongue 211 being caught when the cartridge 100 is mounted, the piston pump upper and lower drive unit is installed on the front and rear moving parts capable of linear movement back and forth so as to move back and forth, The pinion 214 can be used to move back and forth. The piston pump driving unit 210 is moved backward when the cartridge 100 is mounted and then the automatic door 201 is closed after the cartridge 100 is mounted to fix the cartridge 100. Then, So that the piston pin 211 is inserted into the connecting portions 121-A and 141-A of the cartridge piston pump.

상기 카트리지(100)의 피스톤펌프를 구동하여 각각의 용액들을 원하는 곳에 전달해 주기 위해서는 카트리지(100)의 회전식 선택밸브(123, 143)를 구동시켜야 한다. 도 11은 본 발명의 시스템의 회전식 선택밸브(123, 143)를 구동시키는 구동부의 사시도(A)와 단면도(B)를 나타낸 것이다. 회전식 선택밸브 연결부(216)는 카트리지 회전식 선택밸브 돌기(129)가 밀착되어 삽입될 수 있는 홈을 구비하여 카트리지 회전식 선택밸브가 안착될 수 있는 홈을 가지고 것을 특징으로 하며 회전식 베어링에 의해 지지되고, 선택밸브모터(218)와 커플링(217)에 의해 연결되는 특징을 가지고 있어 구동모터에 의해 360°회전하면서 피스톤펌프와 각각의 구획을 연결시켜 주어 용액을 원하는 곳으로 옮겨주는 역할을 수행한다. The rotary select valves 123 and 143 of the cartridge 100 must be driven in order to drive the piston pump of the cartridge 100 and deliver the respective solutions to a desired position. Fig. 11 shows a perspective view (A) and a sectional view (B) of a driving unit for driving rotary select valves 123 and 143 of the system of the present invention. The rotary select valve connection portion (216) is provided with a groove into which the cartridge rotary select valve projection (129) can be closely inserted and into which the cartridge rotary select valve is seated, and supported by a rotary bearing, The selector valve motor 218 and the coupling 217 are connected to each other by a driving motor to rotate the piston 360 ° with respect to the piston pump and transfer the solution to a desired position.

이하, 온도순환반응을 수행하는 고속 qPCR 시스템의 qPCR 반응부(150)에 대해 설명을 하겠다. 도 12는 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 반응부의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)와 열전달 블록(변성 블록 및 반응 블록)(220)이 결합된 사시도, 평면도 및 정면도이다. 도 12의 B와 D는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 열전달 블록(220)과 삽입되어 반응기 밀착용필름(226)에 의해 밀착되기 전의 상태를 평면도와 사시도로 나타낸 것이며, 도 12의 A와 C는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 열전달 블록(220)과 삽입되어 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228)에 의해 반응기 밀착용 필름(226)이 후진하여 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 열전달 블록(220)에 완전 밀착된 상태를 평면도와 사시도로 나타낸 것이고, E는 열전달 블록(220)의 정면도이다.Hereinafter, the qPCR reaction unit 150 of the high-speed qPCR system for performing the temperature cycling reaction will be described. 12 is a perspective view, a plan view, and a front view of the micro channel qPCR film reactor 153 and the heat transfer block (denaturing block and reaction block) 220 of the reaction part of the nucleic acid extraction integrated high speed qPCR system. 12B and 12D are a plan view and a perspective view, respectively, of the state before the fine channel qPCR film reactor 153 is inserted into the heat transfer block 220 and adhered to the reactor adhesion film 226, The fine channel qPCR film reactor 153 is inserted into the heat transfer block 220 and the reactor film 158 is moved backward by the moving film fixed frame moving means 228 so that the fine channel qPCR film reactor 153 is heated And E is a front view of the heat transfer block 220. As shown in FIG.

본 발명의 핵산 추출 일체형 고속 qPCR 시스템의 qPCR 반응부(150)는 열전달 블록(220)과 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)에 밀착시키는 수단으로 구성되어 있고, 열전달 블록(220)의 부채꼴 곡면의 중심에는 하기 기술된 회전광학부(350)가 위치하게 되어 있다. The qPCR reaction unit 150 of the nucleic acid extraction integrated type high speed qPCR system of the present invention comprises means for closely contacting the heat transfer block 220 and the microchannel qPCR film reactor 153 to the heat transfer block 220, The rotational optical part 350 described below is located at the center of the fan-shaped curved surface.

열전달 블록(220)은 고온의 변성 블록(221)과 저온의 반응 블록(223)으로 구성되어 있는데 회전하는 광학부(300)가 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에서 발생하는 형광을 측정하는 광학측정부 구역(222)의 간격을 띠우고(도 12 E) 있고, 평면도(도 12 A, B)에 나타내었듯이 부채꼴형으로 배치되어 있다. 변성 블록(221)과 반응 블록(223)은 각각의 양끝단에 히터(225)와 온도센서(224)가 설치되어 있어 4개의 지점을 원하는 온도로 일정하게 유지시켜 줄 수 있다. 따라서, 변성 블록(221)과 반응 블록(223)은 원주면을 따라 양끝단에 같은 온도를 유지하여 일정한 온도를 유지할 수도 있고, 또한 양끝단에 다른 온도를 주어서 열전달 블록(220)의 원주면을 따라서 온도 구배를 줄 수 있는 특징을 가지고 있다. 이러한 온도 구배를 형성시킨 열전달 블록(220)을 이용하여 증폭된 핵산(DNA)의 고정밀 변성온도 분석(high resolution melting analysis)을 수행할 수 있다. The heat transfer block 220 is composed of a high-temperature denaturing block 221 and a low-temperature reaction block 223. The rotating optical unit 300 is an optical measuring device for measuring fluorescence generated in the micro channel qPCR film reactor 153 (FIG. 12E), and are arranged in a fan shape as shown in a plan view (FIGS. 12A and B). The denaturing block 221 and the reaction block 223 are provided at both ends with a heater 225 and a temperature sensor 224 so that the four points can be kept constant at a desired temperature. Therefore, the denaturing block 221 and the reaction block 223 can maintain the same temperature at both ends along the circumferential surface to maintain a constant temperature, and at the same time, different temperatures are applied to the circumferential surfaces of the heat transfer block 220 Therefore, it has a feature of giving a temperature gradient. A high-resolution melting analysis of amplified nucleic acid (DNA) can be performed using the heat transfer block 220 having the temperature gradient formed therein.

미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)에 밀착시키는 수단은 열전달 블록(220)에 완벽하게 밀착되어야만 목표성능을 달성할 수 있다. 왜냐하면, 완벽한 밀착이 되어야만 빠르고 균일하게 열전달 블록(220)의 온도를 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달해 줄 수 있고, 정확한 미세유로(153-1)의 형광을 측정을 위해 열전달 블록(220)의 원주면에 정밀하게 초점이 맞추어진 회전광학부(350)에 의해 정확한 형광을 측정할 수 있기 때문이다. 또한, 열전단 블록(220)의 열이 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에만 전달이 되고, 열손실이 최소한으로 하기 위해서는 가능한 한 비열이 적은 형태의 밀착수단을 사용하여야 한다. The target performance can be achieved only when the means for bringing the fine channel qPCR film reactor 153 into close contact with the heat transfer block 220 is completely in close contact with the heat transfer block 220. This is because the temperature of the heat transfer block 220 can be transferred quickly and uniformly to the microchannel qPCR film reactor 153 only when the microchannels are completely adhered to each other and the heat transfer block 220 is required to measure the fluorescence of the microchannel 153-1 accurately. Because the accurate fluorescence can be measured by the rotating optical part 350 which is precisely focused on the circumferential surface of the light source. In addition, heat of the thermal block 220 is transferred only to the microchannel qPCR film reactor 153, and in order to minimize the heat loss, a contact means of a form with a low specific heat should be used.

본 발명에서는 밀착수단으로 반응기 밀착용 필름(226)을 사용하였다. 반응기 밀착용 필름(226)의 양끝단을 밀착용 필름 고정틀(227)에 고정시키고, 고정틀의 한쪽은 고정시키고 다른 한쪽은 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228)을 이용하여 열전달 블록(220)의 전후로 이동시킬 수 있게 하여, 이동용수단(228)을 전진시켜 열전달 블록(220)과 반응기 밀착용 필름(226) 사이의 틈을 만들고 여기에 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 삽입시켜 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 저온 구역(156)과 고온 구역(157)이 각각 반응 블록(223)과 변성 블록(221)에 위치하게 한 후에 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228)을 후진시켜 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 밀착시킨다. 이때 완전히 밀착될 수 있게 이동하는 밀착용 필름 고정틀(227)은 압축 스프링(229)을 구비하여 일정한 압력으로 눌려줄 수 있게 하였다. In the present invention, the film 226 for adhering the reactor was used as the adhesion means. The both ends of the film 226 for fixing the reaction film are fixed to the film fixing frame 227 for fixing and one side of the fixing frame is fixed and the other is fixed to the front and rear of the heat transfer block 220 The moving means 228 is advanced so as to make a gap between the heat transfer block 220 and the film for adhesion to the reactor 226 and the microchannel qPCR film reactor 153 is inserted into the microchannel qPCR film reactor 153, Temperature zone 156 and the high-temperature zone 157 of the micro-channel qPCR film reactor 153 are positioned in the reaction block 223 and the denaturing block 221, respectively, (153). At this time, the tightly fitting film fixing frame 227 which moves so as to be in close contact can be pressed with a certain pressure by the compression spring 229.

상기와 같은 구조를 고안하여 간편하고 정확하게 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 온도순환을 하면서 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에서 발생하는 형광량을 정확하게 측정할 수 있는 경제적인 시스템을 제공하였다. The above-described structure is devised so that the amount of fluorescence generated in the micro channel 153-1 of the micro channel qPCR film reactor 153 can be accurately measured while the temperature circulation of the micro channel qPCR film reactor 153 is simple and accurate Thus providing an economical system.

이하 핵산 추출용 일체형 고속 qPCR 시스템의 광학부(300)를 자세히 설명하겠다. 광학부(300)는 구조가 복잡하므로 이해하기 쉽게 모식도로 설명을 하겠다. 광학 분야의 통상의 지식을 가진 사람은 모식도로 본 발명의 원리를 충분히 이해할 수 있도록 기술을 하였다. Hereinafter, the optical unit 300 of the integrated high-speed qPCR system for nucleic acid extraction will be described in detail. The optical part 300 has a complicated structure and will be explained with a schematic view for easy understanding. Those skilled in the art will appreciate that the principles of the present invention can be fully understood by those skilled in the art.

본 발명의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에서 발생하는 형광을 측정하기 위해서는 광원부(330), 광분할부(360), 센서부(370), 스캔부(349)로 나뉜다.In order to measure the fluorescence generated in the micro channel 153-1 of the micro channel qPCR film reactor 153 of the present invention, the light source unit 330, the light splitting unit 360, the sensor unit 370, and the scan unit 349 It is divided.

광원부(330)의 광원으로는 넓은 범위의 다양한 형광을 측정하기 위해 적색-, 녹색- 및 청색-레이저를 사용하였다. 상기 레이저는 필요에 따라 다양한 파장의 것을 선택할 수 있으며, 사용되는 개수도 선택할 수 있다. Red, green, and blue lasers were used as the light source of the light source 330 to measure a wide range of various fluorescence. The laser can be selected from various wavelengths as needed, and the number to be used can also be selected.

청색 레이저광원(311)은 이색성 쇼트패스필터1(dichroic short pass filter1)(331)로 일정 파장 이하의 짧은 파장은 통과시키고, 그것보다 긴 파장은 반사하는 특성을 가진 필터로 광축에 대해 45°로 기울어져 위치한다. 이런 특성 때문에 청색 레이저광원(311) 빔은 통과하고, 녹색 레이저광원(312) 빔은 반사하는 것이다. 마찬가지로 또 다른 파장 특성을 갖는 이색성 쇼트패스필터2(dichroic short pass filter2)(332)는 상대적으로 파장이 짧은 녹색, 청색 레이저광원 빔은 통과시키고, 적색 레이저광원(313) 빔은 반사하여 출구로 나가게 된다. 여기서 레이저 빔을 콜리메이팅(collimating)하기 위해서 렌즈1(321), 렌즈2(322), 렌즈3(323)이 사용된다. The blue laser light source 311 is a filter having a dichroic short pass filter 1 (331) for passing a short wavelength shorter than a certain wavelength and reflecting longer wavelengths, As shown in FIG. Because of this characteristic, the blue laser light source 311 beam passes through and the green laser light source 312 beam is reflected. Similarly, the dichroic short pass filter 2 (332) having another wavelength characteristic allows the green and blue laser light source beams having relatively short wavelengths to pass therethrough, and the red laser light source 313 reflects the beams to the exit Out. Here, lens 1 (321), lens 2 (322), and lens 3 (323) are used for collimating the laser beam.

본 발명에서는 검출 민감도를 높이기 위해서, 강한 빛을 조사할 수 있는 레이저 여기광원(이하, 레이저광원)과 이로부터 발생하는 약한 형광 빛에 대해 여기광(레이저광)의 간섭을 최소화하면서 효과적으로 형광을 검출하기 분리하기 위해 편광을 이용하였다. In the present invention, in order to increase detection sensitivity, a laser excitation light source (hereinafter referred to as a laser light source) capable of irradiating strong light and a fluorescent light generated therefrom are effectively detected while minimizing the interference of excitation light (laser light) Polarization was used for the following separation.

본 발명의 한 예로 광원은 S파를 사용하고 형광은 P파를 사용할 수 있다. 편광자1(Polarizer1)(334)은 레이저 빛을 편광시키기 위한 소자로 S파는 통과시키고 P파는 반사하는 소자이다. ND(neutral density) 필터(333)는 광량을 감소시키기 위한 필터로 레이저의 출력을 조절하기 위해 사용된다.As an example of the present invention, an S wave can be used as a light source and a P wave can be used as a fluorescence. Polarizer 1 (Polarizer 1) 334 is a device for polarizing laser light, which passes an S wave and reflects P wave. A neutral density (ND) filter 333 is used to adjust the output of the laser as a filter for reducing the amount of light.

광분할부(360)는 편광 빔 분리기(Polarizing Beam Splitter)(이하 PBS, 361), 편광자2(polarizer2)(363) 그리고 미러1(362)로 구성된다. 광분할부(360)는 여기광원과 형광을 분리하는 기능을 수행한다. 더 자세하게는 PBS는 S파(광원)은 반사를 하고 시료에서 나오는 형광 중 P파는 통과시키도록 제작되어 있다. 따라서, 광원을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 쪽으로 향하도록 광로를 형성하여 주며 형광은 광센서부(370)로 향하도록 광로를 변경하는 역할을 한다. 편광자2(Polarizer2)(363)는 PBS에 의해 완전히 분리가 되지 않은 여기광원을 좀 더 제거하기 위한 목적으로 사용된다. 미러1(362)는 광로를 변경하기 위해 사용되었다. The light splitting unit 360 includes a polarizing beam splitter (PBS) 361, a polarizer 2 363, and a mirror 1 362. The light splitting unit 360 separates the excitation light source from the fluorescence. More specifically, PBS is designed to reflect S waves (light sources) and to pass P waves of fluorescence from the sample. Therefore, the optical path is formed to direct the light source toward the fine channel qPCR film reactor 153, and the fluorescence serves to change the optical path to the optical sensor unit 370. Polarizer 2 (Polarizer 2) 363 is used for the purpose of further removing the excitation light source which is not completely separated by PBS. Mirror 1 362 was used to change the optical path.

형광 데이터를 획득하는 스캔부(349)는 미러2(351)와 렌즈4(352)로 구성되는 회전부(350) 그리고 모터1(353)로 구성되어 있다. 렌즈4(352)는 레이저를 집광하여 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고 또한 시료에서 발생되는 형광을 수집하여 센서로 전달하기 위해 평행광으로 만들어 준다. 모터1(353)에 체결된 회전광학부(350)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에 초점을 맞추어 회전하며 형광 데이터를 수집한다. 모터1(353)은 위치 제어가 가능한 모터로, 예를 들어 스테핑 모터를 사용한다.The scan unit 349 for acquiring fluorescence data is constituted by a rotation unit 350 including a mirror 2 351 and a lens 4 352 and a motor 1 353. The lens 4 (352) collects the laser beam, transfers the laser beam to the fine channel qPCR film reactor 153, and collects the fluorescence emitted from the sample to produce parallel light for transmission to the sensor. The rotating optical unit 350 fastened to the motor 1 353 rotates focusing on the fine flow path 153-1 of the fine flow path qPCR film reactor 153 and collects fluorescence data. The motor 1 353 is a position controllable motor, for example, a stepping motor.

광센서부(370)은 다종의 밴드패스필터(342~346)이 설치된 필터휠(340)과 렌즈5(371), 광센서(372) 및 모터2(373)로 구성된다. 밴드패스필터는 시료에 사용된 형광의 파장에 맞게 구성하면 된다. 본 발명에서는 5개의 밴드패스필터(342~346)와 한 개의 더미(dummy)(341)로 구성된 필터휠(340)의 예를 보여준다. 더미는 광센서(372)로 아무 빛도 입사하지 않게 빛을 차단하는 역할만을 한다. 렌즈5(371)는 형광을 광센서(372)로 안정되게 전달하기 위해 사용된다. 광센서(372)는 형광을 측정하기 위해 사용되며, photodiode, 광증폭관(PMT) 등이 사용될 수 있다. 고민감도 검출을 위한 디지털 PCR 적용을 위해서는 PMT를 사용하는 것이 바람직하다. The optical sensor unit 370 is composed of a filter wheel 340 and a lens 5 371, an optical sensor 372 and a motor 2 373 provided with various kinds of band-pass filters 342 to 346. The bandpass filter can be configured to match the wavelength of the fluorescence used in the sample. The present invention shows an example of the filter wheel 340 composed of five bandpass filters 342 to 346 and one dummy 341. [ The dummy serves only to block the light from entering the light sensor 372 without any light. The lens 5 371 is used to stably transmit the fluorescence to the optical sensor 372. The light sensor 372 is used for measuring fluorescence, and a photodiode, an optical amplification tube (PMT), or the like can be used. It is desirable to use PMT for digital PCR application for detection of sensitivity.

광원부(330)의 3개의 레이저는 선택적으로 on/off가 가능하며 qPCR 반응에 사용된 형광물질에 적합한 여기광을 조사하는 레이저를 선택하여 해당 레이저를 켜고 형광을 측정하게 된다. 예를 들어 Fluorescein의 형광을 측정할 경우 레이저는 블루레이저를 켠다. 센서부(370)의 모터2(373)를 작동시켜 필터휠(340)을 회전시켜 해당 형광을 볼 수 있는 밴드패스필터(342~346)의 위치를 선택한다. 회전광학부(350)를 한 바퀴 회전시켜 데이터를 획득한다. 다른 형광을 측정하기 위해서 다시 레이저를 세팅한 후 반복하면 된다.
The three lasers of the light source 330 can be selectively turned on and off, and a laser that emits excitation light suitable for the fluorescent material used in the qPCR reaction is selected, and the corresponding laser is turned on to measure fluorescence. For example, when measuring the fluorescence of a fluorescein, the laser turns on a blue laser. The motor 2 373 of the sensor unit 370 is operated to rotate the filter wheel 340 to select the positions of the bandpass filters 342 to 346 capable of viewing the fluorescence. The rotation optical unit 350 is rotated one turn to acquire data. To measure another fluorescence, set the laser again and repeat.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 핵산 추출용 qPCR 카트리지를 이용한 혈청에 포함된 핵산의 추출Example 1: Extraction of nucleic acid contained in serum using qPCR cartridge for nucleic acid extraction

핵산 추출용 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 카트리지(100)는 시료(세포, 체액 또는 핵산이 포함된 혼합물)로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출부(120)와 상기 추출된 핵산에 핵산 중합효소가 포함된 핵산 증폭용 시약을 혼합하여 qPCR 반응부(150)로 이동시키는 qPCR 반응 준비부(혼합부)로 구성되어 있다. The qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) cartridge 100 for nucleic acid extraction comprises a nucleic acid extracting unit 120 for extracting a nucleic acid from a sample (a mixture containing a cell, a body fluid, or a nucleic acid), and a nucleic acid polymerase And a qPCR reaction preparation unit (mixing unit) for mixing the nucleic acid amplification reagents to the qPCR reaction unit 150.

본 실시예에서는 상기 카트리지(100)를 사용하여 혈청에서 RNA을 추출하였다. 상기 카트리지 상부(110)에는 혈청에서 RNA 추출에 필요한 용액들이 핵산 추출부 구획(122)별로 실링필름(113)으로 밀봉되어 조립되어 있어 핵산 추출부 구획(122)이 포함된 카트리지 하단부의 중간 위치에 결합 미완 상태로 보관되어 있으므로, 사용 시에 먼저 카트리지 상부(110)를 눌러서 본체와 완전 결합상태가 되면, 핵산 추출부 구획(122)별로 바닥에 구비되어 있는 천공용 펀치(126)가 실링필름(113)을 천공하여서, 각각의 구획(122)에 상기 핵산 추출용 용액들이 채워지도록 하였다. In this embodiment, RNA was extracted from the serum using the cartridge 100. In the cartridge upper part 110, solutions necessary for RNA extraction from serum are packed and sealed with a sealing film 113 for each of the nucleic acid extracting compartments 122, so that the nucleic acid extracting compartments 122 are disposed at intermediate positions The punching punch 126 provided at the bottom of each nucleic acid extracting compartment 122 is separated from the ceiling punch 126 by a sealing film (not shown) 113 were pierced so that each of the compartments 122 was filled with the nucleic acid extracting solutions.

카트리지 상부(110)에 위치한 시료 투입구(111)에 혈청 800μL를 주입하고 마개(114)를 닫고, 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 고속 qPCR 시스템의 필름 반응기 홈에 삽입되게 본 발명의 고속 qPCR 시스템에 장착하였다. 고속 qPCR 시스템의 뚜껑이 닫히면서 카트리지(100)가 고정이 되면서, 초음파 프로브(202)가 마개(114) 안으로 삽입되어 마개(114)의 바닥을 눌러주게 된다. 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)가 세포 용해용액이 담겨져 있는 핵산 추출부 구획(122)으로 회전하여 핵산 추출부 피스톤펌프(121)로 용액을 흡입하여 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)가 시료 용액 구역으로 회전한 후 핵산 추출부 피스톤펌프(121)로 세포 용해용액(4M 염화 구아니딘) 1.2mL를 가해주면 상기용액에 초음파 프로브(202)를 통해 초음파를 약 1분간 가하여 세포를 완전히 용해시키고, 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 흡입하여 균질화된 세포용액을 2mL 흡입하였다. 이때 핵산 추출용 피스톤펌프(121)의 바닥에 구비되어 있는 핵산 부착용 표적부착 고체상(binding Filter; DNA 또는 RNA 추출용 실리카 재질의 필터)에 세포 용액에 존재하는 DNA 또는 RNA가 부착된다. 피스톤펌프(121)에 빨아들인 여액을 다시 천천히 토출하여 여액을 시료용액구획으로 보내고, 회전선택밸브로 세척용액들을 순차적으로 선택하여 피스톤펌프(121)로 흡입한 다음, 토출하여 상기 표적부착 고체상(124)을 세척하고, 남아 있는 세척용액의 에탄올을 제거하기 위해 용액이 담겨져 있는 구획으로 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)를 선택한 후 공기를 흡입하고, 토출하는 과정을 5회 반복하여 표적부착 고체상(124)에 남아 있는 에탄올을 제거하였다. 마지막 단계로 부착된 핵산을 수득하는 과정은 핵산 용출용액(elution buffer)을 포함하는 구획으로 회전식 선택밸브(123)를 회전시켜 핵산 용출용액을 흡입하여 여기에 표적부착 고체상(124)에 부착된 핵산을 탈착한 후 회전식 선택밸브(123)를 이동 채널(130)로 회전시킨 후 피스톤펌프(121)로 토출하여 핵산이 포함된 핵산 용출용액이 이동 채널(130)에 담기게 한다. 800 占 퐇 of serum was injected into the sample inlet 111 located at the cartridge upper part 110 and the stopper 114 was closed and the micro channel qPCR film reactor 153 was inserted into the film reactor groove of the high speed qPCR system, . The ultrasonic probe 202 is inserted into the stopper 114 and the bottom of the stopper 114 is pressed while the cartridge 100 is fixed with the lid of the high speed qPCR system closed. The nucleic acid extracting unit rotary select valve 123 rotates to the nucleic acid extracting compartment 122 containing the cell lysing solution and sucks the solution into the nucleic acid extracting unit piston pump 121 so that the nucleic acid extracting rotary select valve 123 rotates the sample And then 1.2 mL of a cell lysis solution (4 M guanidine chloride) is added to the nucleic acid extracting section piston pump 121. Ultrasonic waves are applied to the above solution through the ultrasonic probe 202 for about 1 minute to completely dissolve the cells, The nucleic acid extracting section piston pump 121 was inhaled and 2 mL of the homogenized cell solution was inhaled. At this time, DNA or RNA existing in the cell solution adheres to a binding filter (filter made of silica for DNA or RNA extraction) attached to the nucleic acid, which is provided on the bottom of the nucleic acid extracting piston pump 121. The filtrate sucked into the piston pump 121 is slowly discharged again, the filtrate is sent to the sample solution compartment, the cleaning solutions are successively selected with the rotary selector valve, sucked into the piston pump 121, 124), and the nucleic acid extracting rotary select valve 123 was selected as a compartment containing the solution to remove the remaining ethanol from the washing solution. Then, the process of sucking in air and discharging the air was repeated five times, The remaining ethanol in the flask 124 was removed. As a final step, the step of obtaining the attached nucleic acid is carried out by rotating the rotary select valve 123 with a compartment containing a nucleic acid elution buffer to suck the nucleic acid eluting solution, The rotary select valve 123 is rotated by the movement channel 130 and is discharged to the piston pump 121 so that the nucleic acid eluting solution containing the nucleic acid is contained in the movement channel 130.

상기 핵산 용출용액(핵산 추출용액)을 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(혼합부)(140)에서 PCR 건조 조성물과 혼합한 다음, 정량중합효소 연쇄반응(qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에서 증폭되어 광학부(300)를 통해 분석한다.
The nucleic acid eluting solution (nucleic acid extract solution) is mixed with a PCR drying composition in a qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation part (mixing part) 140, and then a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) The micro channel qPCR film in the reaction part 150 is amplified in the reactor 153 and analyzed through the optical part 300.

실시예 2: 정량중합효소 연쇄반응(qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응부Example 2: Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)

본 발명은 기존의 qPCR 시스템을 이용한 저용량 핵산 중합반응 증폭에 비해, 다중의 표적을 동시에 분석할 수 있는 미세유로를 기반으로 하는 고속형 중합효소 연쇄반응(qPCR) 방법을 이용한 시스템이다. The present invention is a system using a high-throughput polymerase chain reaction (qPCR) method based on a microfluidic channel capable of simultaneously analyzing multiple targets, as compared with a low-dose nucleic acid polymerization amplification using a conventional qPCR system.

실시예 1의 핵산 용출용액(핵산 추출용액)이 핵산 추출용 qPCR 카트리지(100)의 이동 채널(130)에 이동이 되게 되면 qPCR 반응 준비부(140)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 회전시켜 이동 채널(130)에 위치한 후 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)로 추출된 핵산 용액 40μL를 흡입한 후, qPCR 반응 준비부(140)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 회전시켜 qPCR 조성물 통(142)으로 연결한 후 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)로 추출된 핵산 용액을 가하고 흡입하는 과정을 3회 반복하여 qPCR 반응물을 준비한다. 준비된 qPCR 반응물을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 통과시키면서 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행시켰다. When the nucleic acid eluting solution (nucleic acid extracting solution) of Example 1 is transferred to the movement channel 130 of the nucleic acid extracting qPCR cartridge 100, the qPCR reaction part selection valve 143 of the qPCR reaction preparation unit 140 And then placed in the movement channel 130. After the 40 μL of the nucleic acid solution extracted by the qPCR reaction unit piston pump 141 is sucked, the qPCR reaction part selection valve 143 of the qPCR reaction preparation unit 140 is rotated to rotate the qPCR And the nucleic acid solution extracted by the qPCR reaction part piston pump 141 is added and the inhaled process is repeated three times to prepare a qPCR reaction product. The prepared qPCR reaction was passed through a microchannel qPCR film reactor 153 to perform a real-time PCR.

상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 준비된 qPCR 반응용액이 주입되기 전에, 광학부(300)를 향해 부채꼴 모양으로 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 의해, qPCR 반응 온도로 조절되는 열전달 블록(220)에 밀착되어 있다. 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 통과하여 중합효소 연쇄반응이 일어나 생성된 qPCR 반응생성물은 qPCR 반응생성물 배출구(152)를 통해 모아지도록 구비되어 있다.The microchannel qPCR film reactor 153 is equipped with a heat transfer block 220 which is controlled by the microchannel qPCR film reactor 153 in a fan shape toward the optical part 300 by the qPCR reaction temperature before the prepared qPCR reaction solution is injected. As shown in Fig. The qPCR reaction product generated through polymerization reaction through the micro channel qPCR film reactor 153 is collected through the qPCR reaction product outlet 152.

상기 중합효소 연쇄반응은 열전달 블록(220)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내에서 일어난다(도 5). 여기서, 상기 열전달 블록(220)은 변성 블록(denaturing block)(221)과 반응 블록(annealing block)(223)으로 구성되어 있어 중합효소 연쇄반응에 적합한 온도를 제공하였다. 상기 추출된 핵산은 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)는 qPCR 반응물 주입구(151)에서 일정 부분은 온도가 55℃로 유지되는 반응 블록(223) 구역에서만 미세유로(153-1)가 형성되어 있어 여기에서 역전사(Reverse Transcription, RT)가 이루어지고, 이어지는 미세유로(153-1)는 약 95℃의 변성 블록(221) 구역에서만 형성되어 DNA의 변성과 중합효소의 항체를 동시에 변성시켜 중합연쇄반응에 쓰이는 효소를 활성화시킬 수 있었다. 이어지는 미세유로(153-1)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 필름의 qPCR 구역(구간)으로서 변성 블록(221)과 반응 블록(223)을 교대로 연속적으로 지나면서 정량 중합효소연쇄반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)이 진행될 수 있게 형성되었다. 상기 추출된 핵산은 변성 블록(221)과 반응 블록(223)을 1회 이동할 때마다 한 사이클의 중합효소 연쇄반응이 일어나고, 총 1~45 사이클의 중합효소 연쇄반응을 진행시켰다. 중합효소 연쇄반응이 진행되면서, 실시예 3에 나타난 바와 같이, 광학부(300)를 통해 핵산 qPCR 유래 형광이 검출하여 임계 형광값(threshold florescence)이 나오는 반응 사이클을 측정하여 초기 핵산을 정량할 수 있게 구비되어 있다.
The polymerase chain reaction occurs in a microchannel qPCR film reactor 153 coupled to a heat transfer block 220 (Fig. 5). Here, the heat transfer block 220 is composed of a denaturing block 221 and an annealing block 223 to provide a temperature suitable for the polymerase chain reaction. The microcirculation channel 153-1 of the microchannel qPCR film reactor 153 is connected to the microchannel 153 at a portion of the reaction block 223 where the temperature of the microchannel 153-1 of the microchannel qPCR film reactor 153 is maintained at 55 [ -1) is formed. Reverse transcription (RT) is performed here. The subsequent micro channel 153-1 is formed only in the denaturation block 221 region at about 95 ° C, and the denaturation of the DNA and the polymerase Were simultaneously denatured to activate the enzymes used in the polymerization chain reaction. The subsequent fine channel 153-1 is passed through the denaturation block 221 and the reaction block 223 alternately and continuously as a qPCR zone (section) of the film of the fine channel qPCR film reactor 153, Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). The extracted nucleic acid underwent one cycle of polymerase chain reaction each time the denatured block 221 and the reaction block 223 were moved, and the PCR reaction was performed for 1 to 45 cycles in total. As the polymerase chain reaction proceeds, as shown in Example 3, the initial nucleic acid can be quantified by measuring a reaction cycle in which fluorescence derived from the qPCR nucleic acid is detected through the optical unit 300 and threshold fluorescence is generated .

실시예 3: 핵산 추출 일체형 정량 중합효소 연쇄반응 시스템(고속 qPCR 시스템)Example 3: Nucleic acid extraction integral-type quantitative polymerase chain reaction system (high-speed qPCR system)

핵산 추출 일체형 정량 중합효소 연쇄반응 시스템(고속 qPCR 시스템)의 개략적인 전체 구성은 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100), 핵산 추출 카트리지 구동부(200), 중합효소 연쇄반응 반응부(미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 및 열전달 블록(220) 포함), 광학부(300) 및 제어부(400)로 되어 있다(도 1. 도 5, 도 7, 도 13).The overall schematic structure of the nucleic acid-extracted integral-type quantitative polymerase chain reaction system (high-speed qPCR system) includes a cartridge 100 for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction), a nucleic acid extracting cartridge driving unit 200, (Including the microchannel qPCR film reactor 153 and the heat transfer block 220), the optical section 300 and the control section 400 (Figs. 1, 5, 7, and 13).

상기 고속 qPCR 시스템의 각부 구성을 살펴보면, 핵산 추출 카트리지(100)는 추출된 핵산을 qPCR 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입하며(도 5), 상기 주입된 핵산은 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)와 결합된 열전달 블록(220)에 의해 중합효소 연쇄반응이 일어난다. 상기 qPCR 반응부(150)와 인접하게 위치하는 광학부(광원, 밴드패스필터, 형광검출기 등)(300)(도 13)는 qPCR 반응생성물로부터 유래한 형광을 검출한다. 여기서, 상기 핵산은 체액(body fluid), 세포 또는 핵산이 함유된 혼합물로 검체 또는 면봉으로 수집된 시료로부터 추출된 핵산을 말한다.
The nucleic acid extraction cartridge 100 injects the extracted nucleic acid into the micro channel qPCR film reactor 153 of the qPCR reaction unit 150 (FIG. 5) Polymerase chain reaction occurs by the heat transfer block 220 coupled with the microchannel qPCR film reactor 153. An optical unit (light source, bandpass filter, fluorescence detector, etc.) 300 (FIG. 13) positioned adjacent to the qPCR reaction unit 150 detects fluorescence derived from the qPCR reaction product. Here, the nucleic acid refers to a nucleic acid extracted from a sample collected by a sample or a swab with a mixture containing a body fluid, a cell or a nucleic acid.

실시예 4: 형광측정용 광학부Example 4: Optical part for fluorescence measurement

도 13은 본 발명의 광학부(300)의 모식도를 나타낸 것이다.13 is a schematic view of an optical unit 300 of the present invention.

qPCR 반응생성물로부터 발생하는 형광을 측정하기 위해서는 크게 광원부(330), 광분할부(360), 스캔부(349), 센서부(370)로 나뉜다.The fluorescence generated from the qPCR reaction product is divided into a light source 330, a light splitting unit 360, a scanning unit 349, and a sensor unit 370.

본 발명에서는 광원으로 특별하게 적색, 녹색, 청색으로 세 종류의 레이저를 사용하였으며 형광과 광원을 파장에 상관없이 효과적으로 분리하기 위해 편광을 이용하였다. 일 실시예로 광원은 S파를 사용하고 형광을 P파를 사용하는 것에 대한 설명하겠다.In the present invention, three types of lasers, specifically red, green, and blue, were used as light sources. Polarization was used to effectively separate fluorescence and light sources regardless of wavelength. In one embodiment, the light source uses an S wave and uses fluorescence as a P wave.

도 13의 광원부(300)은 레이저로 구성되어 있다. 레이저는 필요에 따라 다양한 파장의 것을 선택할 수 있으며, 사용되는 개수도 한정되지 않는다. 본 실시 예에서는 적색, 녹색, 청색으로 세 종류의 레이저 광원인 청색 레이저광원(311), 녹색 레이저광원(312), 적색 레이저광원(313)을 채용한 광원을 사용한다. The light source unit 300 of FIG. 13 is composed of a laser. The laser can be selected from various wavelengths as needed, and the number used is not limited. In this embodiment, a light source employing a blue laser light source 311, a green laser light source 312, and a red laser light source 313, which are three types of laser light sources in red, green, and blue,

이색성 쇼트패스필터1(dichroic short pass filter1)(331)은 일정 파장 이하의 짧은 파장을 통과시키고, 그것보다 긴 파장은 반사하는 특성을 가진 필터로 광축에 대해 45°로 기울어져 위치한다. 이런 특성 때문에 청색 레이저광원(311) 빔은 통과하고 녹색 레이저광원(312) 빔은 반사하는 것이다. A dichroic short pass filter 1 (331) is a filter having a characteristic of passing a short wavelength shorter than a certain wavelength and reflecting a wavelength longer than that, and is positioned at an angle of 45 ° with respect to the optical axis. Because of this characteristic, the blue laser light source 311 beam is transmitted and the green laser light source 312 beam is reflected.

마찬가지로 또 다른 파장 특성을 갖는 이색성 쇼트패스필터2(dichroic short pass filter2)(332)는 상대적으로 파장이 짧은 녹색, 청색 레이저 빔은 통과시키고 적색 레이저 빔은 반사하여 출구로 나가게 된다. 여기서 레이저 빔을 콜리메이팅(collimating)하기 위해서 렌즈1(321), 렌즈2(322), 렌즈3(323)이 사용된다. 편광자(polarizer1)(334)는 빛을 편광시키기 위한 소자로 본 실시예에서는 S파는 통과시키고 P파는 반사하게 제작되었다. ND(neutral density) 필터(333)는 광량을 감소시키기 위한 필터로 레이저의 출력을 조절하기 위해 사용된다.Similarly, a dichroic short pass filter 2 (332) having another wavelength characteristic passes green and blue laser beams having relatively short wavelengths, reflects the red laser beam, and exits to the exit. Here, lens 1 (321), lens 2 (322), and lens 3 (323) are used for collimating the laser beam. A polarizer 1 (polarizer 1) 334 is an element for polarizing light. In this embodiment, S wave is passed through and P wave is reflected. A neutral density (ND) filter 333 is used to adjust the output of the laser as a filter for reducing the amount of light.

광분할부(360)는 편광 빔 분리기(Polarizing Beam Splitter, 이하 PBS)(361), 편광자2(polarizer2)(363) 그리고 미러1(362)로 구성된다. 광분할부(360)는 여기광원과 형광을 분리하는 기능을 수행한다. 더 자세하게는 PBS는 S파(광원)는 반사를 하고 시료에서 나오는 형광 중 P파는 통과시키도록 제작되어 있다. 따라서 PBS는 레이저광원을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 쪽으로 향하도록 광로를 형성하여 주며 형광은 센서부(370)로 향하도록 광로를 변경하는 역할을 한다. 편광자2(polarizer2)(363)은 PBS에 의해 완전히 분리가 되지 않은 여기광원을 좀 더 제거하기 위한 목적으로 사용된다. 미러1(362)는 광로를 변경하기 위해 사용되었다. The light splitting unit 360 includes a polarizing beam splitter (PBS) 361, a polarizer 2 363, and a mirror 1 362. The light splitting unit 360 separates the excitation light source from the fluorescence. More specifically, the PBS is designed to reflect the S wave (light source) and to pass the P wave out of the fluorescence emitted from the sample. Therefore, the PBS forms an optical path to direct the laser light source toward the fine channel qPCR film reactor 153, and the fluorescence serves to change the optical path to the sensor unit 370. Polarizer 2 (363) is used for the purpose of further removing the excitation light source which is not completely separated by PBS. Mirror 1 362 was used to change the optical path.

형광 데이터를 획득하는 스캔부(349)는 미러2(351)와 렌즈4(352)로 구성되는 회전광학부(350) 및 모터1(353)로 구성되어 있다. 렌즈4(352)는 레이저를 집광하여 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고, 또한 qPCR 반응물에서 발생되는 형광을 수집하여 센서로 전달하기 위해 평행광으로 만들어 준다. 모터1(353)에 체결된 회전광학부(350)는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 위를 회전하며 형광 데이터를 수집한다. 모터1(353)은 위치제어가 가능한 모터, 예를 들어 스테핑모터를 사용한다.The scanning section 349 for acquiring fluorescence data is constituted by a rotating optical section 350 and a motor 1 353 constituted by a mirror 2 351 and a lens 4 352. Lens 4 352 condenses the laser and transmits it to the microchannel qPCR film reactor 153 and collimates the fluorescence generated from the qPCR reactant to transmit it to the sensor. The rotating optical unit 350 fastened to the motor 1 353 rotates on the fine channel qPCR film reactor 153 and collects fluorescence data. The motor 1 353 uses a motor capable of position control, for example, a stepping motor.

광센서부(370)는 다종의 밴드패스필터(band pass filter)(342~346)이 설치된 필터휠(340)과 렌즈5(371)과 광센서(372) 및 모터2(373)로 구성된다. 밴드패스필터는 qPCR 반응생성물에 사용된 형광의 파장에 맞게 구성하면 된다. 본 실시 예에서는 5개의 밴드패스필터(342~346)와 한 개의 더미(dummy)(341)로 구성된 필터휠(340)의 예를 보여준다. 더미(341)는 센서로 아무 빛도 입사하지 않게 빛을 차단하는 역할만을 한다. 렌즈5(371)는 형광을 센서로 안정되게 전달하기 위해 사용된다. 광센서(372)은 형광을 측정하기 위해 사용되며, photodiode, PMT 등이 사용될 수 있다.The optical sensor unit 370 is composed of a filter wheel 340, a lens 5 371, an optical sensor 372 and a motor 2 373 provided with various kinds of band pass filters 342 to 346 . The bandpass filter can be configured to match the wavelength of the fluorescence used in the qPCR reaction product. The present embodiment shows an example of a filter wheel 340 composed of five bandpass filters 342 to 346 and one dummy 341. The dummy 341 serves only to shield the light from entering the sensor with no light. The lens 5 (371) is used to stably transmit the fluorescence to the sensor. The optical sensor 372 is used for measuring fluorescence, and photodiodes, PMTs, and the like can be used.

광원부(330)의 3개의 레이저는 선택적으로 on/off가 가능하여 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 사용된 형광에 적합한 레이저를 선택하여 켜면 된다. 예를 들어 Fluorescein의 형광을 측정할 경우 레이저는 블루레이저를 켠다. 광센서부(370)의 모터2(373)를 작동시켜 필터휠(340)을 회전시켜 해당 형광을 볼 수 있는 밴드패스필터(342~346) 위치를 선택한다. 회전광학부(350)를 한 바퀴 회전시켜 데이터를 획득한다. 다른 형광을 측정하기 위해서 다시 레이저를 세팅한 후 반복하면 된다.
The three lasers of the light source unit 330 can be selectively turned on and off, and a laser suitable for the fluorescence used in the microchannel qPCR film reactor 153 can be selected and turned on. For example, when measuring the fluorescence of a fluorescein, the laser turns on a blue laser. The motor 2 373 of the optical sensor unit 370 is operated to rotate the filter wheel 340 to select the positions of the bandpass filters 342 to 346 capable of viewing the fluorescence. The rotation optical unit 350 is rotated one turn to acquire data. To measure another fluorescence, set the laser again and repeat.

실시예 5: 제어 및 신호처리부Embodiment 5: Control and signal processing section

qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응부(150)에 포함되는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 평면형태가 아닌 광학부(300)를 향해 부채꼴 모양으로 중심각이 약 120°휘어진 형태로 광학부(300)를 감싸게 형성되어 있어, 광학 측정시 동일한 측정거리를 유지하도록 하였다. qPCR 시 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 120°영역에 위치하고, 광의 검출은 22.5°~135°(1번 영역)에서 이루어지며, 나머지 영역은 qPCR이 진행되는 동안 온도를 제어하고 분석 S/W(software) 프로그램으로 스캔된 데이터를 전송한다. 각도의 정확성 및 재현성울 유지하기 위해서 Open-loop 방식으로 위치 제어가 확실히 되는 스테핑 모터를 사용하였으며, 이를 마이크로 구동법으로 제어하여 1회전당 1600 등분으로 나누어 구동하였다. 따라서 위치 정밀도는 360°/1600 = 0.225°이다. The micro channel qPCR film reactor 153 included in the qPCR (Quantum Polymerase Chain Reaction) reaction unit 150 is formed in a shape of a fan shape and a central angle of about 120 ° toward the optical unit 300, 300) so as to maintain the same measurement distance in optical measurement. The fine channel qPCR film reactor 153 in the qPCR is located in the 120 ° region, the light is detected in the range of 22.5 ° to 135 ° (1 region), and the remaining region is controlled in temperature during qPCR, and transmits the scanned data to a software program. In order to maintain the accuracy and reproducibility of the angle, a stepping motor is used which is positively controlled by an open-loop method. The stepping motor is controlled by a micro drive method and divided into 1600 parts per one revolution. Therefore, the positional accuracy is 360 ° / 1600 = 0.225 °.

표 1에 나타난 바와 같이, 시료 모니터링 시 데이터 처리 시간(측정한 데이터를 분석 S/W 프로그램에 전달하는 시간)은 200/(n(rps)*1600)으로 계산되며, 여기서 n(rps)는 초당 회전수(revolution per second), N은(0~1599)의 수치를 나타낸다. 여기서 n(rps)이 6이 된다면 20.8mSec이고, 57Kbyte/Sec 이상의 전송속도를 가지는 통신방법이라면 충분히 PC로 분석데이터를 전송할 수 있으며, 나머지 166.4mSec 동안 전송된 자료를 분석하면 되므로, 현재의 PC의 연산 속도에 비하면 큰 부담이 되지 않는다. 따라서, TCP/IP 형태의 전송방식을 채택하고 고성능의 PC를 사용한다면, 하나의 PC로 여러 대의 시스템을 병렬 운전하여도 무리 없이 작동시킬 수 있다. 뿐만 아니라 상기 166.4mSec 동안 시스템 측에서는 원하는 여기 광원을 준비하고, 형광에 맞는 필터를 준비할 수 있다.
As shown in Table 1, the data processing time (time to transmit the measured data to the analysis software program) during sample monitoring is calculated as 200 / (n (rps) * 1600), where n (rps) Revolution per second, and N is a numerical value of (0 to 1599). If n (rps) is 6, it is 20.8mSec. If the communication method has a transmission speed of 57Kbyte / sec or more, it is enough to transfer analysis data to PC and analyze the data transmitted for the remaining 166.4mSec. It does not become a large burden as compared with the computation speed. Therefore, if a high-performance PC is adopted by adopting a transmission method of TCP / IP type, even if a plurality of systems are operated in parallel by one PC, it can be operated without difficulty. In addition, a desired excitation light source can be prepared on the system side for 166.4 msec, and a filter suitable for fluorescence can be prepared.

Figure pat00001
Figure pat00001

실시예 6: 정량 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR, qPCR)과 역전사-정량 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-qPCR, RT-PCR) Example 6 Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) and Reverse Transcription-qPCR (RT-PCR)

정량 중합효소 연쇄반응과 역전사-정량 중합효소 연쇄반응은 당업자에게 자명한 공지된 방법을 사용하여 핵산을 포함하는 시료(예컨대, 세포, 혈액 등)를 준비하고, 본 발명의 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지를 이용하여 상기 시료로부터 핵산을 추출하고, 추출된 핵산을 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템에 투입(첨가)하여 정량 중합효소 연쇄반응과 역전사-정량 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있다.
(For example, cells, blood, etc.) containing nucleic acids are prepared using the known methods known to those skilled in the art, and the nucleic acid extraction and qPCR of the present invention The nucleic acid is extracted from the sample using a cartridge for a PCR reaction, and the extracted nucleic acid is added (added) to a target nucleic acid qPCR quantitative analysis system to perform a quantitative PCR reaction and a reverse-transcription polymerase chain reaction .

실시예 7: 실시간 네스티드 중합효소 연쇄반응(realtime nested PCR)과 실시간 네스티드 역전사-정량 중합효소 연쇄반응(realtime nested RT-PCR)Example 7 Real-time nested PCR and real-time nested RT-PCR in real-time nested RT-

본 발명의 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지의 배출액 수집구획(154)은 1차로 증폭된 PCR 반응생성물을 모으는 공간으로, PCR 반응생성물에 추가적으로 증류수를 10~50배 가해 희석한 다음, 2차로 qPCR를 수행할 수 있다. 1차 PCR이 끝난 후 핵산 추출부(120)의 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)와 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 이용하여 핵산 용출용액을 이동 채널(130)로 옮긴 후, qPCR 반응부(140)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)와 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)를 이용하여 이동 채널(130)의 핵산 용출용액을 희석하는 양만큼 가해 주어 qPCR 반응물과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 이용하여 2차 nested PCR에 사용할 qPCR 조성물이 담겨진 qPCR 조성물 통(142)에 가해주어 2차 qPCR 반응용액을 준비한 후 이것을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 가해주어 nested qPCR을 수행한다. 여기서, 상기 핵산의 모든 추출 과정은 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지(100) 내부에서 수행되고, 상기 카트리지(100)는 일회용 플라스틱 제품을 사용할 수 있으므로, 시료의 원천적인 오염을 차단할 수 있다.
The discharged liquid collection section 154 of the cartridge for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction) according to the present invention is a space for collecting PCR reaction products amplified first, and diluted water is added 10 to 50 times to the PCR reaction product, And then qPCR can be performed secondarily. After the first PCR is completed, the nucleic acid eluting solution is transferred to the movement channel 130 using the nucleic acid extracting unit rotary selector valve 123 and the nucleic acid extracting unit piston pump 121 of the nucleic acid extracting unit 120, The amount of the nucleic acid eluting solution in the moving channel 130 is diluted with the qPCR reaction rotary selector valve 143 and the qPCR reaction piston pump 141 in the reaction chamber 140 to mix with the qPCR reactant, To the qPCR composition column 142 containing the qPCR composition to be used for the second nested PCR to prepare a secondary qPCR reaction solution, which is then subjected to nested qPCR by applying it to the microchannel qPCR film reactor 153. Here, all extraction of the nucleic acid is performed inside the cartridge 100 for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction), and since the cartridge 100 can use the disposable plastic product, the original contamination of the sample Can be blocked.

실시예 8: 디지털 중합효소 연쇄반응(digital PCR)과 디지털 역전사-정량 중합효소 연쇄반응(digital RT-PCR)Example 8: Digital PCR (digital PCR) and digital reverse-transcription-polymerase chain reaction (digital RT-PCR)

실시예 6 및 실시예 7에 있어서, 극미량의 물질을 검출할 때 디지털 PCR 또는 디지털 RT-PCR 방식을 본 발명에 적용할 수 있다.In Examples 6 and 7, a digital PCR or a digital RT-PCR method can be applied to the present invention when detecting a trace amount of substance.

본 발명의 큰 장점은 넓은 범위의 핵산 정량이 가능한 qPCR과 극소량의 핵산을 정확하게 측정할 수 있는 디지털 PCR을 동시에 수행할 수 있다는 것이다. A major advantage of the present invention is that qPCR capable of quantifying a wide range of nucleic acids and digital PCR capable of accurately measuring a very small amount of nucleic acid can be simultaneously performed.

미세유로(153-1)의 단면적을 S, 미세유로 통과시에 1개의 DNA가 증폭되어 확산되는 구역(구간)을 d, 전체 반응용액의 양을 V라 하면 미세유로를 지나가는 길이(L)는 V/S가 된다. 그러므로 확산 구역(구간)으로 나눈 V/dS는 일정한 사이클 이상이 되면 연속적으로 검출되는 용액에 들어 있는 최소한의 DNA 숫자를 의미한다. 단면적이 0.04 mm2인 미세유로를 40μL의 용액의 확산이 1mm가 되는 용액이 지나가게 되면 1,000개 이상의 표적 DNA가 용액에 존재하면 일정 사이클 이상에서 연속적으로 형광이 검출되고 1,000 이하의 용액에 존재하면 특정 구역(구간)에서만 형광이 검출될 것이다. 이런 미세유로의 특성에 따른 검출 한계 농도를 디지털 전환점이라 한다. 상기 디지털 한계치는 실제로 검출 시스템에 따라 결정이 된다. 단일분자가 증폭되는 것은 이론적으로 2n 사이클로 증폭이 되는데 센서의 민감도와 여기광의 강도에 의해 형광의 검출 한계가 결정되는 데 30에서 42 싸이클에서 보통 검출이 된다. 또한, 사이클이 적을수록 확산 구역(구간) d가 줄어들고 디지털 전환점이 늘어나게 된다. 그러므로 본 발명의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 포함된 시스템에서는 지속적으로 회전하면 디지털 전환점 이전 사이클에서 형광을 검출하고 이 점이 넘어서 형광이 검출이 되지 않으면 디지털 전환점보다 5 사이클 이상으로 이동하여 고정점에서 용액이 흘러감에 따라 발생되는 형광값을 디지털로 검출하여 디지털 PCR을 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러므로 고농도의 표적이 존재할 때에서는 qPCR 방식으로 검출하고, 매우 적은 수의 표적이 존재할 때는 디지털 PCR로 검출하는 새로운 방식의 DNA 검출수단을 제공한다.
Let S be the cross-sectional area of the micro channel 153-1, denote the area (section) where one DNA is amplified and diffused during the passage of the micro channel, and let V denote the total amount of the reaction solution. V / S. Therefore, V / dS divided by the diffusion zone (section) means the minimum number of DNA contained in the solution continuously detected when it exceeds a certain cycle. When a solution having a 1-mm diffusion of 40 μL of a micro-channel having a cross-sectional area of 0.04 mm 2 is passed, if more than 1,000 target DNAs are present in the solution, fluorescence is continuously detected over a certain cycle, Fluorescence will only be detected in a certain section (section). The detection limit concentration according to the characteristics of the microchannel is called a digital switching point. The digital limit is actually determined by the detection system. The amplification of a single molecule is theoretically amplified by 2 n cycles. The detection limit of fluorescence is determined by the sensitivity of the sensor and the intensity of the excitation light, which is usually detected in 30 to 42 cycles. In addition, the smaller the cycle, the smaller the diffusion zone (section) d and the digital switching point. Therefore, in the system including the micro channel qPCR film reactor 153 of the present invention, the fluorescent light is detected in the cycle prior to the digital switching point when continuously rotating, and if the fluorescent light is not detected beyond this point, It is advantageous to perform digital PCR by digitally detecting the fluorescence value generated as the solution flows. Therefore, a qPCR method is used when a high-concentration target is present, and a new method of detecting DNA when a very small number of targets are present is detected by digital PCR.

실시예 9: 면역-정량 중합효소 연쇄반응(Immuno-qPCR)Example 9 Immuno-Quantitative Polymerase Chain Reaction (Immuno-qPCR)

실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에 있어서, 극미량의 물질이 항원 또는 항체와 같은 단백질일 경우 본 실시예에 적용할 수 있다. 본 발명은 카트리지(100)의 표적부착 고체상(124)에서 전자동으로 핵산을 정밀하게 추출하는 방식을 선택하고 있을 뿐만 아니라 표적부착 고체상(124)에서의 항원-항체 반응을 이용한 immuno qPCR을 이용하여 고정밀로 단백질, 항체 등을 정량할 수 있는 다목적 신속 진단 시스템으로 사용될 수 있는 장점이 있다. 항체나 항원을 검출하는 표적부착 고체상(124)으로 실리카 멤브레인을 에폭시기로 활성화시킨 후 여기에 항체나 항원과 같은 단백질을 고정시켰다. 여기에 투입된 혈액, 또는 혈청 시료를 통과시켜 표적 항체나 항원 단백질을 부착시킨 후 세척액으로 세척한 후 표적부착 고체상(124) 부착된 항체 또는 항원에 대한 표식 DNA가 공유결합된 2차 항체를 부착시키고 세척을 하였다. 부착된 항체는 pH가 11인 완충용액을 이용하여 용출을 하고 여기에 중화 용액을 가해 중화를 시켜 표식 DNA가 포함된 용액을 얻을 수 있다. In Example 6, Example 7 and Example 8, the present invention can be applied to a case where a trace amount of substance is a protein such as an antigen or an antibody. The present invention not only selects the method of precisely extracting the nucleic acid precisely at the target attachment solid phase 124 of the cartridge 100 but also uses the immuno qPCR using the antigen-antibody reaction at the target attachment solid phase 124, It can be used as a multi-purpose rapid diagnosis system which can quantify proteins and antibodies. After the silica membrane was activated with an epoxy group with a target-attached solid phase (124) for detecting an antibody or an antigen, a protein such as an antibody or an antigen was immobilized thereon. After the target antibody or antigen protein is adhered to the blood or the serum sample, the antibody is washed with a washing solution, and then a secondary antibody having a labeled covalent bond to the target-attached solid phase (124) Lt; / RTI > The attached antibody may be eluted using a buffer solution having a pH of 11 and neutralized by adding a neutralizing solution thereto to obtain a solution containing the labeled DNA.

상기 표식 DNA가 포함된 용액은 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(혼합부)(140)에서 PCR 건조 조성물과 혼합한 다음, 정량중합효소 연쇄반응(qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에서 증폭되어 광학부(300)를 통해 분석한다.
The labeled DNA-containing solution is mixed with a PCR drying composition in a qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation unit (mixing unit) 140, and then the quantitative polymerase chain reaction (qPCR) And is amplified in the fine channel qPCR film reactor 153 of the light source 150 and analyzed through the optical unit 300.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

100: 핵산 추출 및 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응)용 카트리지
110: 카트리지 상부
111: 시료 투입구;
112: 용액저장통;
113: 실링필름;
114: 마개;
115: 통기용 필터;
116: 통기구;
117: 멈춤돌기;
120: 핵산 추출부
121: 핵산 추출부 피스톤펌프;
121-A:핵산 추출부 피스톤 연결부; 121-B:핵산 추출부 피스톤 접액부
122: 핵산 추출부 구획; 122-1:통구;
123: 핵산 추출부 회전식 선택밸브;
124: 표적부착 고체상;
125: 고체상 고정판
126: 천공용 펀치;
127: 핵산 추출부 회전식 선택밸브 실;
128: 회전식 선택밸브 밀착판;
129: 회전식 선택밸브 돌기;

130: 이동 채널
140: qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(혼합부)
141: qPCR 반응부 피스톤펌프;
141-A: 반응부 피스톤 연결부; 141-B: 반응부 피스톤 접액부
142: qPCR 조성물 통;
143: qPCR 반응부 회전식 선택밸브;
144: qPCR 반응부 선택밸브 실;
145: 반응유 통;
146: 반응유 구획
150: qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응부(반응기)
151: qPCR 반응물 주입구;
152: qPCR 반응생성물 배출구;
153: 미세유로 qPCR 필름 반응기; 153-1: 미세유로
154: 배출액 수집구획;
155: 저온 구역;
156: 광학측정 구역;
157: 고온 구역;
161: 멈춤홈;
162: 밀착홈;
200: 카트리지 구동부;
201: 자동문;
202: 초음파 프로브;
203: 카트리지 고정봉:
204: 프로브 압축 스프링;
210: 피스톤펌프 구동부;
211: 피스톤 집게;
212; 상하이동 스크류;
213-A: 핵산 추출부 모터; 213-B: 반응부 모터;
214: 전후 이동 랙피니온;
215: 전후 이동 모터;
216: 회전식 선택밸브 연결부;
217: 커블링;
218-A: 핵산 추출부 회전식 선택밸브모터; 218-B: 반응부 회전식 선택밸브모터;
220: 열전달 블록
221: 변성 블록;
222: 광학측정부 구역;
223: 반응 블록;
224: 온도센서;
225: 히터;
226: 반응기 밀착용 필름
227: 밀착용 필름 고정틀
228: 밀착용 필름 고정틀 이동용수단
229: 압축 스프링
300: 광학부;
330: 광원부;
311: 청색 레이저광원; 312: 녹색 레이저광원; 313: 적색 레이저광원;
321: 렌즈1; 322: 렌즈2; 323: 렌즈3;
331: 이색성 쇼트패스필터1; 332: 이색성 쇼트패스필터2;
333: ND(neutral density) 필터;
334: 편광자1; 340: 필터휠;
349: 스캔부;
350: 회전광학부;
351: 미러2; 352: 렌즈4;
353: 모터1;
360: 광분할부;
361: 편광 빔 분리기(분할기); 363: 편광자2; 362: 미러1;
370: 광센서부;
340: 필터휠; 341: 더미; 342~346: 밴드패스필터 1~5
371: 렌즈5; 372: 광센서; 373: 모터2
400: 제어부100: Cartridge for nucleic acid extraction and qPCR (quantitative polymerase chain reaction)
110: cartridge top
111: sample inlet;
112: solution reservoir;
113: sealing film;
114: plug;
115: aeration filter;
116: vent;
117: detent projection;
120: nucleic acid extracting unit
121: nucleic acid extracting section piston pump;
121-A: a nucleic acid extracting section piston connecting section; 121-B: nucleic acid extracting section piston wetting section
122: nucleic acid extracting section; 122-1: through;
123: nucleic acid extraction rotary select valve;
124: Targeted adhered solid phase;
125: solid plate
126: perforated punches;
127: nucleic acid extracting rotary select valve chamber;
128: rotary select valve close plate;
129: Rotary selection valve protrusion;

130: mobile channel
140: qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) Reaction preparation part (mixing part)
141: qPCR reaction part piston pump;
141-A: Reaction part piston connection part; 141-B: reaction part piston wetting part
142: qPCR composition bottle;
143: qPCR reaction part rotary select valve;
144: qPCR reaction part selection valve chamber;
145: reaction flow;
146: reaction oil compartment
150: qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) Reactor (Reactor)
151: qPCR reagent inlet;
152: qPCR reaction product outlet;
153: microchannel qPCR film reactor; 153-1:
154: effluent collection compartment;
155: low temperature zone;
156: Optical measurement area;
157: high temperature zone;
161: stop groove;
162: contact groove;
200: a cartridge driving part;
201: Automatic door;
202: ultrasonic probe;
203: Cartridge fixing rod:
204: probe compression spring;
210: a piston pump driving unit;
211: Piston forceps;
212; Up and down screw;
213-A: nucleic acid extractor motor; 213-B: Reactor motor;
214: front and rear moving rack pinion;
215: forward / backward moving motor;
216: rotary select valve connection;
217: curling;
218-A: Nucleic acid extraction rotary select valve motor; 218-B: Reaction part rotary select valve motor;
220: Heat transfer block
221: denaturation block;
222: optical measurement subarea;
223: reaction block;
224: temperature sensor;
225: heater;
226: Film for adhesion to reactor
227: Adhesive Film Fixture
228: Adhesive film moving device
229: Compression spring
300: optical part;
330: light source;
311: blue laser light source; 312: green laser light source; 313: a red laser light source;
321: lens 1; 322: lens 2; 323: lens 3;
331: Dichroic short path filter 1; 332: Dichroic short path filter 2;
333: neutral density (ND) filter;
334: Polarizer 1; 340: filter wheel;
349: scan unit;
350: rotating optical part;
351: mirror 2; 352: lens 4;
353: motor 1;
360: light divider;
361: polarizing beam splitter (splitter); 363: Polarizer 2; 362: mirror 1;
370: optical sensor unit;
340: filter wheel; 341: a dummy; 342 to 346: Bandpass filter 1 to 5
371: lens 5; 372: Optical sensor; 373: Motor 2
400:

Claims (35)

핵산 추출부(120)에서 시료의 핵산을 자동으로 추출하고, 추출된 핵산을 이동 채널(130)을 통해 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응, Quantitative Polymerase Chain Reaction) 반응 준비부(140)로 이동시킨 다음, qPCR 반응 준비부(140)에서 상기 추출된 핵산에 각기 다른 qPCR 조성물을 자동으로 혼합하여 qPCR 반응물을 준비하고, qPCR 반응부(150)에서 상기 qPCR 반응물을 각기 다른 온도가 전달되는 부채꼴형의 열전달 블록(220)에 밀착되어진 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 필름 사이에 형성된 미세유로(153-1)로 이동시키는 핵산 추출 및 정량 중합효소 연쇄반응용 카트리지.
The extracted nucleic acid is automatically extracted from the nucleic acid extracting unit 120 and the extracted nucleic acid is transferred to the qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) preparation unit 140 through the movement channel 130 the qPCR reaction unit 150 automatically mixes the different qPCR compositions with the extracted nucleic acid in the qPCR reaction preparation unit 140 to prepare a qPCR reaction unit. The qPCR reaction unit 150 converts the qPCR reaction product into a fan-shaped heat transfer The fine channel qPCR film closely adhered to the block 220 is moved to the fine channel 153-1 formed between the films of the reactor 153 Cartridges for nucleic acid extraction and quantitative polymerase chain reaction.
제1항에 있어서, 시료가 투입되는 카트리지 상부(110)의 시료 투입구(111), 시료 투입구(111)에 삽입되는 마개(114), 상기 시료로부터 핵산의 자동추출에 필요한 핵산 추출용 시약들을 저장하는 복수의 용액저장통(112), 상기 시약들의 복수의 핵산 추출부 구획(122), 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123), 핵산 추출부 피스톤펌프(121) 및 표적부착 고정상(124)이 구비된 핵산 추출부(120); 상기 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산을 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(140)로 이동시키는 이동 채널(130); qPCR 반응 준비부(140)로 이동된 핵산과 혼합가능한 PCR 건조 조성물을 포함하는 복수의 qPCR 조성물 통(142), qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 구비된 qPCR 반응 준비부(140); 상기 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 용액을 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 주입하는 qPCR 반응물 주입구(151); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에서 중합효소 연쇄반응 후 생성된 반응생성물을 배출하는 qPCR 반응생성물 배출구(152); 및 상기 핵산 추출부(120)에서 사용된 용액 및 상기 PCR 반응생성물을 수집하는 배출액 수집구획(154)이 구비된 카트리지.
The apparatus of claim 1, further comprising a sample inlet (111) of the cartridge top (110) into which the sample is introduced, a stopper (114) inserted into the sample inlet (111), reagents for nucleic acid extraction A plurality of nucleic acid extracting sections 122 of the reagents, a nucleic acid extracting rotary select valve 123, a nucleic acid extracting section piston pump 121 and a target attaching stationary phase 124 A nucleic acid extracting unit 120; A movement channel 130 for moving the nucleic acid extracted from the nucleic acid extraction unit 120 to the qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation unit 140; a plurality of qPCR composition cylinders 142, a qPCR reaction part rotary select valve 143 and a qPCR reaction part piston pump 141 including a PCR drying composition capable of mixing with the nucleic acid transferred to the qPCR reaction preparation part 140 a qPCR reaction preparation unit 140; A qPCR reagent inlet 151 for injecting a solution mixed with the extracted nucleic acid and PCR drying composition into a microchannel qPCR film reactor 153; A qPCR reaction product outlet 152 for discharging the reaction product generated after the polymerase chain reaction in the micro channel qPCR film reactor 153; And a waste liquid collecting section (154) for collecting the solution used in the nucleic acid extracting section (120) and the PCR reaction product.
제2항에 있어서, 상기 시료 투입구(111)에 삽입되는 마개(114)의 바닥면은 시료용액의 면 이하의 깊이로 삽입되고, 마개(114)의 내부 공간에 시료를 균질화하기 위한 초음파 프로브(sonicator)(202)의 팁이 추가로 삽입될 수 있어, 마개(114)의 바닥면을 통해 시료용액에 초음파를 전달할 수 있는 것을 특징으로 하는 카트리지.
3. The apparatus according to claim 2, wherein the bottom surface of the plug (114) inserted into the sample inlet (111) is inserted at a depth less than the surface of the sample solution and an ultrasonic probe for homogenizing the sample a tip of a sonicator 202 can be further inserted to transmit ultrasound to the sample solution through the bottom surface of the stopper 114. [
제1항 또는 2항에 있어서, 상기 시료는 세포, 체액, 또는 표적 물질이 포함된 혼합물인 것을 특징으로 하는 카트리지.
The cartridge according to any one of claims 1 to 3, wherein the sample is a mixture containing a cell, a body fluid, or a target substance.
제2항에 있어서, 상기 카트리지 상부(110)에 위치한 복수의 용액저장통(112)은 각기 다른 핵산 추출용 시약을 포함하며, 천공가능한 필름(113)으로 밀봉되어 있으며, 카트리지 본체의 복수의 핵산 추출부 구획(122)에 삽입되어 있고, 카트리지 상부(110)를 카트리지 본체에 압착하여 밀어 넣으면 상기 용액저장통(112)의 천공가능한 필름(113)은 핵산 추출부 구획(122)의 바닥에 형성된 천공용 펀치(126)에 의해 천공되어 핵산 추출부 구획(122)에 핵산 추출용 시약이 채워질 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 하는 카트리지.
The method of claim 2, wherein the plurality of solution reservoirs (112) located in the cartridge top (110) comprise different nucleic acid extraction reagents and are sealed with a perforable film (113) The perforable film 113 of the solution reservoir 112 is inserted into the partition 121 of the nucleic acid extracting compartment 122 by pressing and pushing the cartridge upper part 110 to the cartridge body, Is punched by the punch (126) so that the nucleic acid extracting section (122) can be filled with the nucleic acid extracting reagent.
제2항에 있어서, 카트리지 본체에는 복수의 핵산 추출부 구획(122), 상기 핵산 추출부 구획(122)의 바닥에 형성된 천공용 펀치(126), 상기 핵산 추출부 구획(122) 바닥에 구비된 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123) 및 핵산 추출부 피스톤펌프(121)를 연결하는 통구(122-1); 상기 핵산 추출부(120)에서 추출된 핵산을 qPCR(정량 중합효소 연쇄반응) 반응 준비부(140)로 이동시키는 이동 채널(130); 각각의 핵산 추출부 구획(122)의 통구(122-1)와 핵산 추출부 피스톤펌프(121)와 선택적으로 연결되는 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123) 및 핵산 추출부 피스톤펌프(121)가 구비된 것을 특징으로 하는 카트리지.
The nucleic acid extracting apparatus according to claim 2, wherein the cartridge main body includes a plurality of nucleic acid extracting compartments (122), a punch (126) formed at the bottom of the nucleic acid extracting compartment (122) (122-1) connecting the nucleic acid extracting rotary select valve (123) and the nucleic acid extracting piston pump (121); A movement channel 130 for moving the nucleic acid extracted from the nucleic acid extraction unit 120 to the qPCR (quantitative polymerase chain reaction) reaction preparation unit 140; A nucleic acid extracting unit rotary select valve 123 and a nucleic acid extracting unit piston pump 121 selectively connected to the nucleic acid extracting unit piston pump 121 and the tube 122-1 of each nucleic acid extracting unit 122 are provided Lt; / RTI > cartridge.
제2항에 있어서, 상기 용액저장통(112)에 포함된 핵산 추출용 시약은 세포 용해용액(lysis buffer), 부착용액(binding buffer), 세척용액(washing buffer) 또는 용출용액(elution buffer)인 것을 특징으로 하는 카트리지.
The reagent for nucleic acid extraction according to claim 2, wherein the reagent for nucleic acid extraction contained in the solution reservoir (112) is a cell lysis buffer, a binding buffer, a washing buffer, or an elution buffer Cartridges featured.
제2항에 있어서, 상기 핵산 추출부(120)에 구비된 표적부착 고정상(124)은 실리카멤브레인, 폴리올리고분자막 또는 양이온성막인 것을 특징으로 하는 카트리지.
The cartridge according to claim 2, wherein the target fixing stationary phase (124) provided in the nucleic acid extractor (120) is a silica membrane, a polyol polymer membrane, or a cationic membrane.
제2항에 있어서, 상기 핵산 추출부(120)에 구비된 표적부착 고정상(124)은 항원 또는 항체가 한 종류 이상 고정화되는 것을 특징으로 하는 카트리지.
The cartridge according to claim 2, wherein the target fixing stationary phase (124) provided in the nucleic acid extracting unit (120) is immobilized with one or more kinds of antigens or antibodies.
제2항 있어서, 상기 qPCR 조성물 통(142)에 포함된 qPCR 건조 조성물은 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 중합효소활성저해 항체, 프라이머, 프로브, 완충용액, RNA 가수분해효소 저해제, 안정화제 및 이들의 조합을 포함하는 최적화된 표적 핵산 증폭용 용액을 건조시킨 것을 특징으로 하는 카트리지.
4. The qPCR composition of claim 2, wherein the qPCR composition comprises a DNA polymerase, an RNA polymerase, a polymerase inhibitor antibody, a primer, a probe, a buffer solution, an RNA hydrolase inhibitor, Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI > wherein the optimized solution for target nucleic acid amplification is dried.
제2항에 있어서, 상기 qPCR 조성물 통(142)은 면역 qPCR에 필요한 표적 항원 또는 표적 항체에 대한 검출 항체들을 포함하고, 상기 검출 항체들은 각각의 특이한 염기서열을 가지는 핵산들로 표지한 다음, 건조시켜 안정화된 상태인 것을 특징으로 하는 카트리지.
The kit according to claim 2, wherein said qPCR composition bottle (142) comprises detection antibodies for the target antigen or target antibody required for immunological qPCR, said detection antibodies are labeled with nucleic acids having respective specific base sequences, And the cartridge is in a stabilized state.
제2항에 있어서, qPCR 반응 준비부(140)는 상기 핵산 추출부(120)와 qPCR 반응 준비부(140)와 공통으로 연결되는 이동 채널(130); 복수의 qPCR 조성물 통(142); qPCR 반응물 주입구(151), 반응유 통(145), 배출액 수집구획(154)과 선택적으로 연결되는 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)가 구비된 것을 특징으로 하는 카트리지.
The method according to claim 2, wherein the qPCR reaction preparation unit (140) comprises: a movement channel (130) commonly connected to the nucleic acid extraction unit (120) and the qPCR reaction preparation unit (140); A plurality of qPCR composition cylinders 142; a qPCR reaction part rotary select valve 143 and a qPCR reaction part piston pump 141 selectively connected to the qPCR reaction material inlet 151, the reaction fluid passage 145 and the discharge liquid collection section 154 are provided The cartridge.
제6항 또는 제12항에 있어서, 상기 핵산 추출부 피스톤펌프(121)는 피스톤 상하 이송 구동부에 의해 구동되고 핵산 추출부 회전식 선택밸브(123)는 회전모터를 구동시켜 핵산 추출부 구획(122) 간 순차적 이동에 따라 핵산 추출과정을 진행시켜 시료로부터 핵산을 추출하고, 상기 추출된 핵산을 이동 채널(130)을 통해 qPCR 반응 준비부(140)로 이동시켜 qPCR 조성물 통(142)에 포함된 PCR 건조 조성물과 혼합한 다음, qPCR 반응부 피스톤펌프(141)와 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)를 구동시켜 상기 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 qPCR 반응물을 qPCR 반응물 주입구(151)를 통해 qPCR 반응부(150)로 이동시키는 것을 특징으로 하는 카트리지.
The nucleic acid extracting apparatus according to claim 6 or 12, wherein the nucleic acid extracting section piston pump (121) is driven by a piston vertical transfer driving section, the nucleic acid extracting section rotary select valve (123) The nucleic acid extracted from the sample is transferred to the qPCR reaction preparation unit 140 through the movement channel 130 and the PCR contained in the qPCR composition column 142 And then the qPCR reaction part piston pump 141 and the qPCR reaction part rotary selection valve 143 are driven to mix the extracted nucleic acid and the PCR drying composition into the qPCR reaction material through the qPCR reaction material inlet 151 to the qPCR reaction unit (150).
제2항에 있어서, 상기 배출액 수집구획(154)은 증폭된 PCR 산물을 모아서 다시 qPCR 반응에 사용될 수 있게 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143)로 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)와 연결되는 것을 특징으로 하는 카트리지.
3. The method of claim 2, wherein the effluent collection compartment (154) collects amplified PCR products and is coupled to the qPCR reaction sub-piston pump (141) by a qPCR reaction sub-turn selector valve (143) Cartridges featured.
제1항의 카트리지(100)에서 추출된 핵산 및 PCR 건조 조성물이 혼합된 qPCR 반응물을 주입하는 qPCR 반응물 주입구(151); qPCR 반응물이 흘러가면서 qPCR 반응이 일어나는 미세유로(153-1); qPCR 반응 후 생성된 qPCR 반응생성물을 상기 카트리지(100)의 배출액 수집구획(154)으로 배출하는 qPCR 반응생성물 배출구(152)가 구비된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)로 구성되는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
A qPCR reagent inlet (151) for injecting a qPCR reagent mixed with the nucleic acid extracted from the cartridge (100) of claim 1 and a PCR drying composition; a microfluidic channel 153-1 in which the qPCR reaction occurs while the qPCR reactant flows; and a qPCR reaction product outlet (152) for discharging the qPCR reaction product generated after the qPCR reaction to the waste liquid collection zone (154) of the cartridge (100). qPCR reaction unit.
제15항에 있어서, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 광학 측정면이 투명한 고분자 접합필름의 필름 사이에 qPCR 반응물 주입구(151)로부터 qPCR 반응생성물 배출구(152)까지 일정 간격으로 연결 및 배열되어 있는 연속된 미세유로(153-1)가 형성되어 온도가 각기 다른 2개 이상의 동심 원주면을 구비한 열전달 블록(220)을 30회 이상 순차적으로 통과하는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
16. The method of claim 15, wherein the micro channel qPCR film reactor (153) is connected and arranged at regular intervals from the qPCR reaction product inlet (151) to the qPCR reaction product outlet (152) between the films of the polymeric junction film , And the heat transfer block (220) having two or more concentric circles having different temperatures is sequentially passed through the heat transfer block (30) more than 30 times.
제15항에 있어서, 상기 미세유로(153-1)는 바닥이 둥근 미세유로 단면을 가지는 홈으로서 상부에 투명필름이 부착되어 형성되며, 상기 미세유로 단면의 규격은 가로 0.05mm∼0.3mm 및 세로 0.05mm∼0.3mm인 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
[16] The method of claim 15, wherein the micro channel (153-1) is a groove having a round bottom micro channel cross section and a transparent film is adhered on the top, 0.05 to 0.3 mm.
제15항에 있어서, 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 PCR 구역과 예열 구역으로 나누어져 있고, 상기 PCR 구역과 예열 구역에 포함된 qPCR 반응물 주입구(151)로부터 50~75℃의 저온으로 유지되는 저온 구역(155); 90~98℃의 고온으로 유지되는 고온 구역(157); 및 저온 구역(155)과 고온 구역(157) 사이에 광학측정 구역(156)을 반복적으로 지나가면서 온도순환에 따른 qPCR 반응물의 qPCR 반응이 일어나는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
16. The method of claim 15, wherein the microchannel qPCR film reactor (153) is divided into a PCR zone and a preheating zone and maintained at a low temperature of 50-75 DEG C from the qPCR reagent inlet (151) Low temperature zone 155; A high temperature zone 157 maintained at a high temperature of 90 to 98 占 폚; And a qPCR reaction of the qPCR reactant occurs through the temperature cycling while repeatedly passing the optical measurement zone (156) between the low temperature zone (155) and the high temperature zone (157).
제18항에 있어서, 상기 예열 구역 중 저온 구역(155)에서는 역전사(Reverse Transcription, RT)가 이루어지고, 상기 PCR 구역의 고온 구역(157)에서는 qPCR 반응물에 포함된 핵산을 변성시키고, 중합효소 활성을 억제하는 항체를 변성시켜 qPCR이 가능하도록 상기 중합효소를 활성화하는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
19. The method of claim 18, wherein reverse transcription (RT) is performed in the low temperature zone (155) of the preheating zone, denaturing the nucleic acid contained in the qPCR reagent in the high temperature zone (157) Is denatured to activate the polymerase to enable qPCR.
제15항에 있어서, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228)에 의해 동심을 가지는 부채꼴형의 열전달 블록(220)에 밀착될 수 있는 형태로 구성되는 것을 특징으로 하는 qPCR 반응부.
The micro channel qPCR film reactor (153) according to claim 15, characterized in that the micro channel qPCR film reactor (153) is constituted by a reactor film (226) for adhesion, a film fastening film (227) Block (220). ≪ RTI ID = 0.0 > A < / RTI >
제1항의 카트리지(100)로부터 유래된 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물이 유출입되고, 중합효소 연쇄반응 사이클이 반복 수행되도록 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 열전달 블록.
Characterized in that the microchannel qPCR film reactor (153) is coupled such that the qPCR reactant and the qPCR reaction product from the cartridge (100) of claim 1 are flown in and the polymerase chain reaction cycle is repeated.
제21항에 있어서, 상기 qPCR 반응물에 각기 다른 온도를 제공하기 위해 변성 블록(221) 및 반응 블록(223)을 포함하는 온도가 각기 다른 2개 이상의 동심 원주면을 구비하고, 부채꼴형인 것을 특징으로 하는 열전달 블록.
22. The method of claim 21, further comprising two or more concentric circumferential surfaces having different temperatures, each including a denaturing block (221) and a reaction block (223) to provide different temperatures to the qPCR reactant, Heat transfer block.
제22항에 있어서, 상기 qPCR 반응물은 상기 변성 블록(221) 및 반응 블록(223)을 1회 이동할 때마다 한 사이클의 중합효소 연쇄반응이 일어나고, 총 1∼45 사이클의 중합효소 연쇄반응이 이루어지는 것을 특징으로 하는 열전달 블록.
The method according to claim 22, wherein the qPCR reagent is subjected to one cycle of polymerase chain reaction each time the denaturing block (221) and the reaction block (223) are moved, and a total of 1 to 45 cycles of polymerase chain reaction Wherein the heat transfer block is a heat transfer block.
제21항의 열전달 블록(220)의 동심 원주면의 중심축에서 조사되는 다른 파장대의 레이저광원(311, 312, 313); 제15항의 qPCR 반응부(150)의 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1)에 레이저광을 집광하고 발생되는 형광을 수집하기 위해 동심 원주면의 중심축 상에서 회전하는 회전광학부(350); 상기 레이저광과 형광을 편광 특성을 이용해서 분리하는 광분할부(360); 및 분리된 형광을 각 파장대 별로 측정하는 광센서부(370)로 구성되는 것을 특징으로 하는 광학부.
Item 21 Laser light sources 311, 312, and 313 of different wavelength ranges irradiated from the central axis of the concentric circular surface of the heat transfer block 220; The micro channel 153 of the qPCR reaction unit 150 of the fifteenth aspect of the present invention is characterized in that laser light is condensed on the fine channel 153-1 of the qPCR film reactor 153, A portion 350; A light splitting unit 360 for splitting the laser light and the fluorescence by using polarization characteristics; And an optical sensor unit (370) for measuring the separated fluorescence by each wavelength band.
제24항에 있어서, 레이저광을 발생시키는 레이저광원(311, 312, 313); 상기 레이저광원(311, 312, 313)으로부터 조사된 레이저광에서 특정파장영역의 레이저광을 통과시키는 이색성 쇼트패스필터1(331) 및 이색성 쇼트패스필터2(332); 상기 레이저광을 평행광으로 만드는 콜리메이팅 렌즈(321, 322, 323); 상기 레이저광을 편광시키는 편광자1(334); 상기 레이저광을 편광 특성을 이용하여 반사시키며, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 통과시키는 광분할부(360)의 편광 빔 분리기(361); 상기 레이저광원(311, 312, 313)에서 조사되는 레이저광을 90°로 반사할 수 있게 광축에 대해 45°방향으로 고정된 거울인 광분할부(360)의 미러1(362); 위치 제어가 가능한 거울 회전 모터1(353)과 결합되어 회전되며, 상기 편광 빔 분리기(361)로부터 반사된 레이저광을 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고, 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 상기 편광 빔 분리기(361)로 반사시키는 회전광학부(350)의 회전 거울인 미러2(351); 상기 미러2(351)에 의해 반사된 레이저광을 집광하여 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 전달하고 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 내의 qPCR 반응생성물로부터 발산된 형광을 수집하여 상기 미러2(351)에 전달하는 회전광학부(350)의 렌즈4(352); 상기 미러2(351)에 의해 반사되어 상기 편광 빔 분리기(361)를 통과한 형광을 검출하는 광센서부(370)의 광센서(372);를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 광학부.
27. The laser processing apparatus according to claim 24, further comprising: laser light sources (311, 312, 313) for generating laser light; A dichroic short path filter 1 (331) and a dichroic short path filter 2 (332) for passing laser light in a specific wavelength range from laser light emitted from the laser light sources 311, 312, and 313; Collimating lenses (321, 322, 323) for making the laser light into parallel light; A polarizer 1 334 for polarizing the laser light; A polarizing beam splitter 361 of the light splitting unit 360 that reflects the laser light using the polarization characteristic and transmits the fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the micro channel qPCR film reactor 153; A mirror 1 362 of a light splitting unit 360, which is a mirror fixed in a 45 ° direction with respect to an optical axis so as to reflect laser light emitted from the laser light sources 311, 312, and 313 at 90 °; The laser beam reflected from the polarizing beam splitter 361 is transmitted to the micro channel qPCR film reactor 153. The micro channel qPCR film reactor 153 is rotated by being coupled with the mirror rotation motor 1 353, A mirror 2 (351) which is a rotating mirror of a rotating optical unit 350 that reflects the fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the polarizing beam splitter 361 to the polarizing beam splitter 361; The laser light reflected by the mirror 2 351 is condensed and transferred to the micro channel qPCR film reactor 153 to collect fluorescence emitted from the qPCR reaction product in the micro channel qPCR film reactor 153, A lens 4 (352) of a rotating optical part (350) which transmits the light to the lens (351); And an optical sensor (372) of the optical sensor unit (370) for detecting fluorescence reflected by the mirror (2) (351) and passed through the polarized beam splitter (361).
제24항에 있어서, 상기 광센서부(370)는 상기 편광 빔 분리기(361)를 통과한 형광을 특정파장영역의 형광만을 통과시키는 밴드패스필터(342~346)가 구비되는 필터휠(340); 밴드패스필터를 통과한 형광을 집광시키는 렌즈5(371); 상기 필터휠(340)을 회전시키는 위치 제어가 가능한 필터 회전 모터인 모터2(373); 및 상기 밴드패스필터(342~346)를 통과한 특정파장영역의 형광을 검출하는 광센서(372);를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 광학부.
The optical sensor unit (370) according to claim 24, wherein the optical sensor unit (370) comprises a filter wheel (340) having bandpass filters (342 to 346) for passing only fluorescence of a specific wavelength region through the polarized beam splitter (361) ; A lens 5 (371) for condensing the fluorescence that has passed through the band-pass filter; A motor 2 373 which is a filter rotation motor capable of position control for rotating the filter wheel 340; And an optical sensor (372) for detecting fluorescence of a specific wavelength range passed through the band-pass filters (342 to 346).
제25항에 있어서, 상기 미세유로(153-1)는 원형으로 배치되어 있고, 중심에서 반사거울인 미러2(351)를 계속 회전하면서 상기 미세유로(153-1)에서 발생하는 형광값을 빠르게 회전광학부(350)를 통해 스캔하여 일정 형광값 이상이 나오는 미세유로(153-1)를 결정함으로써 초기 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 광학부.
26. The method according to claim 25, wherein the fine flow path (153-1) is arranged in a circular shape and the fluorescence value generated in the fine flow path (153-1) is rapidly increased while the mirror (2) Characterized in that the concentration of the initial target nucleic acid is measured by determining the fine flow path (153-1) which is scanned through the rotation optical unit (350) and which has a constant fluorescence value or more.
제1항의 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 제15항의 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 제21항의 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 제24항의 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템.
The cartridge (100) of claim 1; The qPCR reaction unit (150) of claim 15, comprising a micro channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100). A heat transfer block 220 of claim 21 coupled to the microchannel qPCR film reactor 153; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And an optical part (300) according to claim 24 for irradiating laser light to the micro channel qPCR film reactor (153) and detecting fluorescence.
제28항에 있어서, 상기 카트리지(100)의 qPCR 반응부 회전식 선택밸브(143) 및 qPCR 반응부 피스톤펌프(141)는 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153) 사이로 형성된 미세유로(153-1)로 qPCR용 반응물을 연속적으로 주입하여 qPCR 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 시스템.
The cartridge of claim 28, wherein the qPCR reaction rotary selector valve (143) and the qPCR reaction piston pump (141) of the cartridge (100) are connected to the micro flow channel (153-1) formed between the micro flow channel qPCR film reactors wherein the reactants for qPCR are continuously injected to effect a qPCR reaction.
제1항의 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 제15항의 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 제21항의 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 제24항의 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산 디지털 정량분석 시스템.
The cartridge (100) of claim 1; remind The qPCR reaction unit (150) of claim 15, comprising a micro channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100). The fine channel qPCR film reactor 153, A heat transfer block 220; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And an optical part (300) according to claim 24 for irradiating a laser light to the micro channel qPCR film reactor (153) and detecting fluorescence; and a target nucleic acid digital quantitative analysis system using a target nucleic acid qPCR quantitative analysis system.
제30항에 있어서, 상기 표적 핵산이 단일 핵산분자의 증폭에 의해 발생되는 형광을 검출할 수 있는 사이클에 해당되는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1) 위치에서 검출되지 않을 경우, 상기 미세유로(153-1) 위치보다 2 사이클 이상의 미세유로(153-1) 위치에서 정지하여 초점을 맞추고 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물에 포함된 표적 핵산의 형광발생 회수를 계수함으로써 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 시스템.
31. The method according to claim 30, wherein the target nucleic acid is not detected at the micro channel (153-1) of the micro channel qPCR film reactor (153) corresponding to a cycle capable of detecting fluorescence generated by amplification of a single nucleic acid molecule , The qPCR reagent that stops and focuses at the position of the microchannel 153-1 at least two cycles longer than the position of the microchannel 153-1 and passes through the microchannel 153-1 and the target nucleic acid contained in the qPCR reaction product Wherein the concentration of the target nucleic acid is measured by counting the number of times of fluorescence generation of the target nucleic acid.
제1항의 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 제15항의 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 제21항의 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 및 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 제24항의 광학부(300);로 구성된 표적 핵산 qPCR 정량분석 시스템을 이용하는 표적 핵산의 농도에 따라 정량 PCR 방식 및 디지털 PCR 방식이 자동 전환 가능한 표적 핵산 정량분석 시스템.
The cartridge (100) of claim 1; The qPCR reaction unit (150) of claim 15, comprising a micro channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100). A heat transfer block 220 of claim 21 coupled to the microchannel qPCR film reactor 153; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; And an optical part (300) according to claim 24 for irradiating the micro channel qPCR film reactor (153) with a laser beam and detecting fluorescence, according to the concentration of the target nucleic acid using the target nucleic acid qPCR quantitative analysis system. Target nucleic acid quantitative analysis system capable of automatic conversion of digital PCR method.
제32항에 있어서, 상기 표적 핵산의 농도가 높을 경우 정량 PCR 방식으로, 상기 표적의 핵산의 농도가 낮을 경우, 디지털 PCR 방식으로 자동으로 표적 핵산 정량분석 시스템이 전환되는 것을 특징으로 하는 시스템.
33. The system of claim 32, wherein when the concentration of the target nucleic acid is high, the target nucleic acid quantitative analysis system is automatically switched by the quantitative PCR method and when the concentration of the target nucleic acid is low, by the digital PCR method.
제32항에 있어서, 상기 회전광학부(350)가 동작하면서 각각의 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물 및 qPCR 반응생성물에 포함된 표적 핵산을 연속적으로 측정하여 임계형광이 검출되는 미세유로(153-1)를 검출하여 정량 PCR을 수행하고, 상기 표적 핵산이 단일 핵산분자의 증폭에 의해 발생되는 형광을 검출할 수 있는 사이클에 해당되는 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)의 미세유로(153-1) 위치에서 검출되지 않을 경우, 디지털 PCR 방식으로 자동 전환되어 상기 미세유로(153-1) 위치보다 2 사이클 이상의 미세유로(153-1) 위치에서 정지하여 초점을 맞추고 미세유로(153-1)를 통과하는 qPCR 반응물에 포함된 표적 핵산의 형광발생 회수를 계수함으로써 표적 핵산의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 시스템.
36. The method of claim 32, wherein the rotating optical unit (350) is operated to continuously measure the target nucleic acid contained in the qPCR reaction product and the qPCR reactant passing through each micro flow channel (153-1) The flow path 153-1 is detected and quantitative PCR is performed. The microchannel of the microchannel qPCR film reactor 153 corresponding to the cycle in which the target nucleic acid can detect the fluorescence generated by the amplification of the single nucleic acid molecule. 153-1), the micro-channel 153-1 is automatically switched to a digital PCR system to stop at a position of the micro-channel 153-1 at least two cycles longer than the position of the micro-channel 153-1, Wherein the concentration of the target nucleic acid is measured by counting the number of fluorescence incidences of the target nucleic acid contained in the qPCR reagent passing through the target nucleic acid.
제1항의 카트리지(100); 상기 카트리지(100)에 결합된 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 포함하는 제15항의 qPCR 반응부(150); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 결합된 제21항의 열전달 블록(220); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)를 열전달 블록(220)의 동심 원주면에 밀착시키는 반응기 밀착용 필름(226), 밀착용 필름 고정틀(227) 및 밀착용 필름 고정틀 이동용수단(228); 상기 미세유로 qPCR 필름 반응기(153)에 레이저광을 조사하고, 형광을 검출하는 제24항의 광학부(300); 및 상기 카트리지(100), qPCR 반응부(150), 열전달 블록(220), 밀착수단(226, 227, 228) 및 광학부(300)의 각 부분들을 카트리지 구동부(200)로 구동하고 제어부(400)로 제어하는 회로로 구성되는 전자동 핵산 추출 및 표적 핵산 정량분석 시스템. The cartridge (100) of claim 1; The qPCR reaction unit (150) of claim 15, comprising a micro channel qPCR film reactor (153) coupled to the cartridge (100). A heat transfer block 220 of claim 21 coupled to the microchannel qPCR film reactor 153; A film tightening film 226 for tightly adhering the micro channel qPCR film reactor 153 to the concentric circumferential surface of the heat transfer block 220, an adhesion film fixing frame 227 and a film fixing frame moving means for adhesion 228; An optical part (300) according to claim 24 for irradiating laser light to the micro channel qPCR film reactor (153) and detecting fluorescence; And the cartridge 100, the qPCR reaction unit 150, the heat transfer block 220, the contact units 226, 227, and 228, and the optical unit 300 And driving the respective parts by the cartridge driving part (200) and controlling them by the control part (400).
KR1020150120349A 2015-08-26 2015-08-26 The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same KR20170024827A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150120349A KR20170024827A (en) 2015-08-26 2015-08-26 The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150120349A KR20170024827A (en) 2015-08-26 2015-08-26 The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170024827A true KR20170024827A (en) 2017-03-08

Family

ID=58404694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150120349A KR20170024827A (en) 2015-08-26 2015-08-26 The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20170024827A (en)

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190014449A (en) * 2017-07-28 2019-02-12 (주)옵토레인 Immunodiagnostic device
WO2019022299A3 (en) * 2017-07-24 2019-03-21 한국과학기술원 Fully-automatic gene-reading integrated chip
WO2019132404A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 에스디 바이오센서 주식회사 Piston of nucleic acid extracting cartridge
CN110257245A (en) * 2019-07-16 2019-09-20 东莞博识生物科技有限公司 Nucleic acid detection reagent card
WO2019203552A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 (주)로고스바이오시스템스 Device for detecting nucleic acid amplification reaction products in real time
KR20190124134A (en) 2018-04-25 2019-11-04 (주)옵토레인 Catridge for digital real-time pcr
KR20200120068A (en) * 2019-04-11 2020-10-21 (주)바이오니아 Polymerase Chain Reaction System
KR20200139332A (en) 2019-06-04 2020-12-14 (주)옵토레인 Well array for pcr
CN112844505A (en) * 2021-03-05 2021-05-28 江苏汇先医药技术有限公司 Vertical micro-fluidic chip and method for extracting and amplifying nucleic acid
KR20210094385A (en) 2020-01-21 2021-07-29 (주)옵토레인 Push type cartridge for pcr
KR20210126445A (en) 2020-04-10 2021-10-20 (주)옵토레인 Diagnostic chip and diagnostic cartridge having the same
CN113652346A (en) * 2021-08-30 2021-11-16 成都微康生物科技有限公司 Rotary valve driving device of full-automatic PCR analysis system
WO2022124672A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 (주)오상헬스케어 Molecular diagnostic cartridge and molecular diagnostic device using same
KR20220097838A (en) 2021-01-01 2022-07-08 (주)옵토레인 Well array for a hybrid pcr cartridge and pcr analysis method using the same
KR20230030090A (en) 2021-08-24 2023-03-06 (주)옵토레인 Molecular diagnostic cartridge
WO2023128300A1 (en) * 2021-12-29 2023-07-06 연세대학교 산학협력단 Cartridge-type biomarker molecular diagnostic device

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022299A3 (en) * 2017-07-24 2019-03-21 한국과학기술원 Fully-automatic gene-reading integrated chip
KR20190014449A (en) * 2017-07-28 2019-02-12 (주)옵토레인 Immunodiagnostic device
WO2019132404A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 에스디 바이오센서 주식회사 Piston of nucleic acid extracting cartridge
WO2019203552A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 (주)로고스바이오시스템스 Device for detecting nucleic acid amplification reaction products in real time
KR20190120947A (en) * 2018-04-17 2019-10-25 (주)로고스바이오시스템스 A device for real-time detecting nucleic acids amplification products
KR20190124134A (en) 2018-04-25 2019-11-04 (주)옵토레인 Catridge for digital real-time pcr
KR20200120068A (en) * 2019-04-11 2020-10-21 (주)바이오니아 Polymerase Chain Reaction System
KR20200139332A (en) 2019-06-04 2020-12-14 (주)옵토레인 Well array for pcr
CN110257245A (en) * 2019-07-16 2019-09-20 东莞博识生物科技有限公司 Nucleic acid detection reagent card
KR20210094385A (en) 2020-01-21 2021-07-29 (주)옵토레인 Push type cartridge for pcr
KR20210094436A (en) 2020-01-21 2021-07-29 (주)옵토레인 Push type cartridge for pcr
KR20210126445A (en) 2020-04-10 2021-10-20 (주)옵토레인 Diagnostic chip and diagnostic cartridge having the same
KR20220046536A (en) 2020-04-10 2022-04-14 (주)옵토레인 Diagnostic cartridge
WO2022124672A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 (주)오상헬스케어 Molecular diagnostic cartridge and molecular diagnostic device using same
KR20220097838A (en) 2021-01-01 2022-07-08 (주)옵토레인 Well array for a hybrid pcr cartridge and pcr analysis method using the same
CN112844505A (en) * 2021-03-05 2021-05-28 江苏汇先医药技术有限公司 Vertical micro-fluidic chip and method for extracting and amplifying nucleic acid
CN112844505B (en) * 2021-03-05 2024-03-08 江苏汇先医药技术有限公司 Vertical microfluidic chip and method for nucleic acid extraction and amplification
KR20230030090A (en) 2021-08-24 2023-03-06 (주)옵토레인 Molecular diagnostic cartridge
CN113652346A (en) * 2021-08-30 2021-11-16 成都微康生物科技有限公司 Rotary valve driving device of full-automatic PCR analysis system
CN113652346B (en) * 2021-08-30 2023-08-29 成都微康生物科技有限公司 Full-automatic PCR analysis system
WO2023128300A1 (en) * 2021-12-29 2023-07-06 연세대학교 산학협력단 Cartridge-type biomarker molecular diagnostic device

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20170024827A (en) The Quantitative PCR Cartridge with Microchannel-Film Reactor, Nucleic Acid Extraction Module and qPCR Reagents Module, and The Rapid qPCR System Using the Same
JP6838127B2 (en) Test cartridge with integrated transfer module
US10532352B2 (en) Sample analysis system
CN107805597B (en) Gene detection system and method based on micro-fluidic chip
US7799521B2 (en) Thermal cycling
CN102618439B (en) Deoxyribonucleic acid (DNA) fragment amplification and quantitative detection system based on closed reactors
KR102089633B1 (en) Diagnostic cartridge for microfluidic control and Molecular diagnostics system for point-of-care including the same
EP2457099A1 (en) Apparatus for bio-automation
EP3954458A1 (en) Polymerase chain reaction system
US20230001407A1 (en) Microporous substrate for use in a disposable bioassay cartridge
JP5567526B2 (en) Analysis apparatus and analysis method
JP5444632B2 (en) Nucleic acid amplification method and container used therefor
JPWO2020132279A5 (en)
WO2000077253A1 (en) Apparatus and method for gene examination
WO2019222217A1 (en) Portable microfludic system for biological and analytical testing
RU2800583C2 (en) Polymerase chain reaction system
CN115895867A (en) Intelligent nucleic acid detection device and pathogenic bacteria death and free nucleic acid distinguishing method
JPWO2007122819A1 (en) Equipment for liquid-based reactions

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application