KR20150011359A - 디지털 pcr을 수행하는 방법 - Google Patents

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KR20150011359A
KR20150011359A KR1020147032455A KR20147032455A KR20150011359A KR 20150011359 A KR20150011359 A KR 20150011359A KR 1020147032455 A KR1020147032455 A KR 1020147032455A KR 20147032455 A KR20147032455 A KR 20147032455A KR 20150011359 A KR20150011359 A KR 20150011359A
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카이푸 첸
케이시 알. 맥팔랜드
주니어 데이빗 엔. 키스
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Abstract

표적 핵산의 검출 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플을 50％ 초과의 분획이 샘플 부피당 1개 이하의 표적 핵산 분자를 함유하는 복수의 샘플 부피로 분획화하고, 복수의 샘플 부피를 증폭을 위한 조건으로 처리하는 것을 포함한다. 상기 방법은 표적 핵산이 존재하는 샘플 부피에서 이온 농도의 변화를 검출하고, 증폭된 표적 핵산을 갖는 분획의 수를 계수하고, 샘플 내 표적 핵산의 양을 결정하는 것을 추가로 포함한다.

Description

디지털 PCR을 수행하는 방법 {METHOD OF PERFORMING DIGITAL PCR}
배경기술
디지털 PCR (dPCR)은 핵산 (DNA, cDNA, 메틸화 DNA, 또는 RNA 포함함)을 직접 정량화하고, 클론적으로 증폭시키는데 사용할 수 있는 종래의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법의 개선이다. dPCR 및 전통적 PCR 사이의 하나의 차이는 핵산 양의 측정 방법에 있다. PCR 및 dPCR 둘 다는 단일 샘플 당 하나의 반응을 수행하며, dPCR은 또한 샘플 내에 단일 반응을 수행하나, 샘플은 다수의 분할 내에 분리되며, 반응은 개별적으로 각각의 분할에서 수행된다. 이 분리는 핵산 양의 민감한 측정을 가능하게 한다. DPCR은 유전자 서열의 변이, 예컨대 카피수 변이 또는 점 돌연변이를 연구하는데 유용한 것으로 입증되었다.
dPCR에서, 샘플은 샘플 내의 개별 핵산 분자가 국부화되고 많은 별개의 영역 내에 농축되도록 분할된다. 샘플은 단순 희석 절차에 의해 각각의 분획이 대략 하나 이하의 DNA 주형의 카피를 함유하도록 분획화된다. 개별 DNA 주형을 격리시킴으로써, 이 절차는 원래의 샘플에서 매우 낮은 수준으로 존재했던 DNA 분자를 효과적으로 풍부화한다. 샘플의 분할은 포아송(Poisson) 통계를 사용한 분자의 계수를 촉진시킨다. 결과적으로, 각각의 분할은 "0개" 또는 "1개"의 분자(들), 또는 음성 또는 양성 반응을 각각 함유할 것이다. 분자의 출발 카피수는 전통적 PCR에서 증폭 주기의 수에 비례하는 반면, dPCR은 최초 샘플 양을 결정하기 위해 증폭 주기의 수에 의존하지 않는다.
dPCR 분석의 현재의 방법은 증폭의 생성물을 식별하기 위해 형광 프로브 및 빛 기반 검출 방법을 이용한다. 이러한 접근법은 검출 가능한 충분한 신호를 생성하기 위해 표적 분자의 충분한 증폭을 요구하나, 추가의 오차 또는 편향(bias)을 야기할 수 있다. 따라서 증가된 정확도 및 정밀도를 가지며, dPCR-기반 접근법과 연관되어 사용될 수 있는 감도를 갖는 대안적 분석 방법을 사용하여 샘플 내의 관심 핵산을 검출하는 개선된 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본원에서 샘플을 50％ 초과의 분획이 샘플 부피당 1개 이하의 표적 핵산 분자를 함유하는 복수의 샘플 부피로 분획화하고; 복수의 샘플 부피를 증폭을 위한 조건으로 처리하고; 표적 핵산이 존재하는 샘플 부피에서 이온 농도의 변화를 검출하고; 증폭된 표적 핵산을 갖는 분획의 수를 계수하고; 샘플에서 표적 핵산의 양을 결정하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 증폭을 위한 프라이머 및 프로브와 결합시키는 것을 추가로 포함한다. 이온 농도의 변화가 이온 농도의 증가일 수 있거나 또는 이온 농도의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 비드와 결합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 하나 이상의 웰을 포함하는 기판에 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 기판은 유리, 금속, 금속 산화물, 규소, 세라믹, 중합체 코팅 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 웰은 고체 또는 액체 예컨대, 덮개 유리, 유리, 플라스틱, 복합 재료, 광학적 투명 물질, 불혼화성 유체, 또는 임의의 다른 적합한 밀봉 구조일 수 있는 밀봉 층으로 밀봉될 수 있거나 또는 밀봉되지 않을 수 있다. 추가로, 웰의 표면은 처리된 표면일 수 있다. 처리된 표면은 친수성 코팅, 항체, 스트렙타비딘, 아비딘, 박막 코팅, 나노섬유, 올리고뉴클레오티드, 그의 임의의 조합 또는 임의의 다른 적합한 표면 처리로의 표면 코팅을 포함하는, 관심의 표적 분자의 결합을 촉진시키기 위한 표면 처리를 포함할 수 있다. 대안으로, 샘플은 매트릭스, 예컨대 세포외 매트릭스, 중합체 매트릭스, 또는 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔, 아가로스 겔, 또는 히드로겔 상에 로딩될 수 있다. 방법은 복수의 샘플의 각각을 복수의 격리된 위치에 배치하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 복수의 격리된 위치는 단일 센서와 화학적 연락 상태에 있거나 또는 각각의 복수의 격리된 위치는 자신 만의 개별 센서와 화학적 연락 상태에 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 이온 농도의 변화는 이온 농도의 증가이거나 또는 이온 농도의 감소이다. 일부 실시양태에서, 이온은 양성 이온, 예컨대 수소 이온일 수 있거나 또는 음성 이온, 예컨대 피로포스페이트 분자일 수 있다. 이온 농도의 변화는 pH의 변화에 의해 나타낼 수 있거나 또는 전기 신호로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 출발 샘플의 표적 핵산의 양을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 표적 핵산의 최초량을 함유하는 샘플을, 하나 이상의 표적 핵산 분자를 함유하는 반응 구역의 백분율이 50％ 초과 및 100％ 미만인 복수의 샘플 부피로 희석하고; 복수의 샘플 부피를 하나 이상의 증폭 사이클로 처리하고; 하나 이상의 증폭 사이클의 결과로서 복수의 샘플 부피 중 하나 이상에서 이온 농도의 변화를 검출하고; 표적 핵산의 최초량을 수량화하는 것을 포함하는, 핵산의 절대 정량법을 수행하기 위한 방법이 추가로 제공된다. 이온 농도의 변화는 이온 농도의 증가, 이온 농도의 감소, pH의 변화일 수 있고, 양성 이온, 예컨대 수소 이온, 음성 이온, 예컨대 피로포스페이트 분자, 또는 양성 및 음성 이온 둘 다의 검출을 수반할 수 있다.
참조로의 도입
본 명세서에 언급된 모든 출판물, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 출판물, 특허, 또는 특허 출원이 언급에 의해 구체적으로 및 개별적으로 도입되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 도입된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규 특징은 첨부된 특허청구범위에 세심하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는, 본 발명의 원리가 이용되며 하기 도면이 수반되는 예시적 실시양태를 나타내는 다음 상세한 설명에 대한 참조에 의해 수득될 것이다:
도 1은 PCR의 연장 단계의 예를 나타내고;
도 2는 본원에 기재된 방법에서의 사용을 위한 장치의 한 실시양태를 나타내고;
도 3은 본원에 기재된 방법에서의 사용을 위한 장치의 한 실시양태를 나타내고;
도 4a 및 4b는 본원에 기재된 방법에서의 사용을 위한 장치의 한 실시양태를 나타내고;
도 5a 및 5b는 본원에 기재된 방법에서의 사용을 위한 장치의 한 실시양태를 나타내고;
도 6a 및 6b는 본원에 기재된 방법에서의 장치의 한 실시양태를 나타낸다.
상세한 설명
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 DNA 용융 및 DNA의 효소 복제에 대한 반응의 반복된 가열 및 냉각의 주기로 이루어진 열 주기에 의존한다. 대다수의 PCR 방법은 열 주기, 즉 PCR 샘플을 정의된 일련의 온도 단계로 교대로 가열 및 냉각하는 것을 사용한다. 이들 열 주기 단계는 먼저 DNA 용융이라 부르는 절차에서 고온에서 DNA 이중 나선의 2개 가닥을 물리적으로 분리시키는데 필요하다. 더 낮은 온도에서, 각각의 가닥은 이어서 표적 DNA를 어닐링 단계 및 연장 단계 중 선택적으로 증폭시키기 위해 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성에서의 주형으로서 사용된다. 폴리머라제는 열-안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제를 포함한다. PCR의 선택성은 특정 열 주기 조건하에 증폭을 위해 표적화된 DNA 영역에의 상보적인 프라이머의 사용으로부터 야기된다. DNA 폴리머라제와 함께 표적 영역에 상보적인 서열을 함유하는 프라이머 (짧은 DNA 단편)는 선택적 및 반복된 증폭을 가능하게 하기 위한 주요 성분이다. 도 1은 DNA의 상보적 가닥의 연장을 나타낸다. DNA 복제 중 데옥시리보스-포스페이트 백본이 연장됨으로써, 피로포스페이트 분자는 유리되어 반응을 앞으로 추진시킨다. 추가로, 반응은 또한 단일 수소 이온, H+를 상보적 가닥 상의 히드록시드 기로부터 방출시킨다. 본원에 제공된 방법에서, 화학적 농도의 변화를 검출하는 것은 증폭이 일어나고 있다는 것을 나타낼 수 있으며, 따라서 관심의 주형 DNA가 반응 용기 내에 존재한다는 것을 나타낼 수 있다.
본원에서 샘플을 50％ 초과의 분획이 샘플 부피당 1개 이하의 표적 핵산 분자를 함유하는 복수의 샘플 부피로 분획화하고; 복수의 샘플 부피를 증폭을 위한 조건으로 처리하고; 표적 핵산이 존재하는 샘플 부피에서 이온 농도의 변화를 검출하고; 증폭된 표적 핵산을 갖는 분획의 수를 계수하고; 샘플에서 표적 핵산의 양을 결정하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 증폭을 위한 프라이머 및 프로브와 결합시키는 것을 추가로 포함한다. 이온 농도의 변화가 이온 농도의 증가일 수 있거나 또는 이온 농도의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 비드와 결합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 하나 이상의 웰을 포함하는 기판에 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 기판은 유리, 금속, 금속 산화물, 규소, 세라믹, 중합체 코팅 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 웰은 고체 또는 액체 예컨대, 덮개 유리, 유리, 플라스틱, 복합 재료, 광학적 투명 물질, 불혼화성 유체, 또는 임의의 다른 적합한 밀봉 구조일 수 있는 밀봉 층으로 밀봉될 수 있거나 또는 밀봉되지 않을 수 있다. 추가로, 웰의 표면은 처리된 표면일 수 있다. 처리된 표면은 친수성 코팅, 항체, 스트렙타비딘, 아비딘, 박막 코팅, 나노섬유, 올리고뉴클레오티드, 그의 임의의 조합 또는 임의의 다른 적합한 표면 처리로의 표면 코팅을 포함하는, 관심의 표적 분자의 결합을 촉진시키기 위한 표면 처리를 포함할 수 있다. 대안으로, 샘플은 매트릭스, 예컨대 세포외 매트릭스, 중합체 매트릭스, 또는 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔, 아가로스 겔, 또는 히드로겔 상에 로딩될 수 있다. 방법은 복수의 샘플의 각각을 복수의 격리된 위치에 배치하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 복수의 격리된 위치는 단일 센서와 화학적 연락 상태에 있거나 또는 각각의 복수의 격리된 위치는 자신 만의 개별 센서와 화학적 연락 상태에 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 이온 농도의 변화는 이온 농도의 증가이거나 또는 이온 농도의 감소이다. 일부 실시양태에서, 이온은 양성 이온, 예컨대 수소 이온일 수 있거나 또는 음성 이온, 예컨대 피로포스페이트 분자일 수 있다. 이온 농도의 변화는 pH의 변화에 의해 나타낼 수 있거나 또는 전기 신호로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 출발 샘플의 표적 핵산의 양을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 표적 핵산의 최초량을 함유하는 샘플을, 하나 이상의 표적 핵산 분자를 함유하는 반응 구역의 백분율이 50％ 초과 및 100％ 미만인 복수의 샘플 부피로 희석하고; 복수의 샘플 부피를 하나 이상의 증폭 사이클로 처리하고; 하나 이상의 증폭 사이클의 결과로서 복수의 샘플 부피 중 하나 이상에서 이온 농도의 변화를 검출하고; 표적 핵산의 최초량을 수량화하는 것을 포함하는, 핵산의 절대 정량법을 수행하기 위한 방법이 추가로 제공된다. 이온 농도의 변화는 이온 농도의 증가, 이온 농도의 감소, pH의 변화일 수 있고, 양성 이온, 예컨대 수소 이온, 음성 이온, 예컨대 피로포스페이트 분자, 또는 양성 및 음성 이온 둘 다의 검출을 수반할 수 있다.
도 2a는 표적 핵산의 단일 분자가 검출될 수 있는 장치의 한 실시양태를 나타낸다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 대표적인 장치 (200)는 하나 이상의 웰 (204)을 포함하는 에칭된 기판 (202)를 포함할 수 있으며, 여기서 웰 (204)은 소정 부피의 샘플을 함유하고, 국한하도록 설정될 수 있다. 이온 감지 층 (206)은 웰 (204)과 화학적 연락 상태에 있을 수 있으며, 센서 (208)와 전기적 연락 상태에 있다. 일부 실시양태에서, 웰 (204), 또는 하나 초과의 웰이 있는 실시양태에서의 웰은 단일 센서와 화학적 연락 상태에 있거나, 또는 각 웰 (204)은 도 2a에 나타낸 바와 같이 자신 만의 개별 센서와 화학적 연락 상태에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 화학적 필드-효과 트랜지스터 (chemFET) 센서, 이온-감지 필드 효과 트랜지스터 (ISFET), 또는 임의의 다른 적합한 바이오센서일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 이온 농도, pH, 열, 효소 활성, 또는 웰에서 발생하는 반응에 대한 반응에서 방출된 임의의 다른 형태의 에너지에 대한 변화를 검출한다. 일부 실시양태에서, 센서는 반응 중 단일 수소 이온의 방출을 검출하도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 주형 가닥이 복제됨으로써, 각각의 뉴클레오티드 결합이 발생하고 시스템은 이온 농도의 변화를 검출하고, 이러한 변화를 스파이크로서 보고할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드 (207)는 도 2a에 도시한 바와 같이, DNA 가닥을 결합하는데 사용될 수 있다. 적합한 장치의 다른 실시양태는 공개된 미국 특허 공개 번호 2010/0301398에 더 자세히 기재되었으며, 상기 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
사용하는 동안, 증폭이 발생하고 뉴클레오티드의 혼입이 발생하기 때문에, 수소 이온이 방출되고 웰에서 pH를 효과적으로 떨어뜨린다. 그 후, 이온 감지 층이 전하의 상승으로서 pH 변화를 검출한다. 충분한 전하가 형성되면, 센서는 이 변화를 감지 플레이트 전역에 형성된 전압에서 읽어낸다. 일부 실시양태에서, PCR을 수행하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용하여 샘플의 PCR을 실행할 수 있다. 이러한 방법은 열 순환기(thermal cycler)의 사용 또는 등온 증폭, 예컨대 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 절단 효소 증폭 반응 (NEAR), 헬리카제-의존 증폭, 레콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 또는 검출가능한 반응 부산물을 포함하는 반응을 수행하는 임의의 다른 적합한 방법을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 열 대류, 예컨대 미세규모 열 대류 또는 적외선-매개 온도 제어가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가열 소자 (220)는 도 2b에 도시된 바와 같이 기판 (202)으로 가공될 수 있다. 가열 소자는 기판 내에 위치하거나 감지 층 아래, 또는 장치 상의 임의의 다른 적합한 장소에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가열 소자는, 웰에 열을 제공하는데 기여하고 웰을 적어도 부분적으로 밀봉할 수 있거나 밀봉하지 않을 수 있는 웰의 개구 상에 배치되는 커버 또는 뚜껑에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가열 소자는 예를 들어 텅스텐 램프, 방사선 (스펙트럼의 적색 부분)과 같은 적외선 열 공급원이다. 이러한 실시양태에서, 방열을 사용하거나 압축 공기에 의해 냉각을 성취한다.
일부 실시양태에서, 활성 가열/감지 소자는 독립적인 PCR 반응 (장치/칩의 외부 장비의 사용을 요구하지 않는 반응)을 수행하기 위한 장치 또는 칩에 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도체 및 반도체 물질이 열 및/또는 다른 형태의 전자기 방사선을 생생시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백금, 피착된(doped) 폴리규소, 또는 임의의 다른 적합한 물질의 침적을 통해 온도 감지 및 가열을 성취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에너지 공급원이 장치에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치가 펠티에 또는 다른 열적 공급원, 예컨대 열적 블록, 열 패드, 또는 임의의 다른 적합한 가열 공급원에 연결될 수 있다.
PCR 관찰을 위해 통합된 작동기 (가열기)를 사용한 규소에서의 하나 또는 다수의 웰의 가공이 예를 들어 미국 공개번호 20100301398 및 [Iordanov et al., Sensorised Nanoliter Reactor Chamber for DNA Multiplication, IEEE (2004) 229-232]에 기재되었고, 둘 다 그 전체가 참조문헌으로 포함된다. 그렇게 가공된 웰 또는 챔버가 각각 핵산 증폭의 관찰을 위한 통합된 ISFET를 갖는 것으로 제공될 수 있다. 이오르다노브 등에 의해 그들의 상기 언급된 논문에서 언급된 바와 같이, 미처리 규소 및 표준 규소-관련 물질은 Taq 폴리머라제의 억제제이다. 따라서, 규소 또는 규소-관련 물질, 예를 들어 규소 게르마늄 또는 인장 규소 (모든 이러한 물질을 이하 규소 기판으로서 지칭함)가 핵산 증폭을 위한 마이크로칩 챔버 또는 채널의 가공에 이용되는 경우에, 이는 통상적으로 예를 들어 SU8, 폴리메틸-메타크릴레이트 (PMMA), 퍼스펙스 (Perspex)™ 또는 유리와 같은 규소에 의한 폴리머라제 효율의 감소를 방지하기 위한 물질로 덮일 것이다.
PCR을 위해 미세가공된 규소-유리 칩의 표면 패시베이션(passivation)이 쇼프너 등에 의해 [Nucleic Acid Res. (1996) 24, 375-379]에 또한 기재된다. 그들의 연구에서, 규소 칩을 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 가공하고 115 ㎛의 깊이로 에칭하였다. 파이렉스™ 유리 커버를 각 규소 칩의 상부에 위치시키고 규소 및 유리를 애노드 접합하였다. 제공된 챔버에서 열순환으로 PCR 증폭 효율을 개선할 목적으로 여러 유형의 표면 패시베이션이 조사되었다. 산화된 규소 표면 (SiO2)이 통상의 PCR 튜브에서 수행된 반응에 비해 일관된 증폭을 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 표면은 또한 본 발명에 따라 ISFET pH 감지로 핵산 증폭을 실행하기 위한 마이크로유체 장치를 가공하는데 적합할 수 있다. PCR 마이크로유체 장치 가공에서의 표면 패시베이션의 추가적인 논의를 위해 [Zhang et al., PCR microfluidic devices for DNA amplification, Biotechnology Advances (2006) 24, 243-284]를 참조할 수 있다. 상기 종설 논문에 기재된 바와 같이, 기판 코팅에 의한 정적 표면 패시베이션의 대안으로서, 샘플에 안정화 작용제를 포함시키는 것 (동적 패시베이션)이 가능할 수 있다.
정상 샘플에서 PCR 관찰을 실행하기 위한 상기 기재된 바와 같은 저 반응 부피 챔버의 대안으로서, PCR 관찰을 위한 샘플이 마이크로유체 장치의 챔버 또는 채널을 통해 흐르도록 할 수 있고, 흐르면서 PCR을 위한 열순환이 성취되는 상이한 온도로 연속적으로 처리된다. 따라서, 예를 들어 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 연장의 PCR 단계에 적합한 상이한 온도 구역을 연속적으로 통과하는 채널 또는 챔버, 예컨대, 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 연장의 PCR 단계의 채널을 따른 연속적인 반복에 적합한 베이스에서 제공되는 상이한 온도 구역을 연이어 통과하는, 예를 들어 규소 칩 장치와 같은 마이크로유체 장치 중의 채널을 통해 샘플을 흐르도록 할 수 있다. 칩 상의 연속 흐름 핵산 증폭을 수행하기 위한 상기 마이크로유체 구조가 예를 들어, [Auroux et al., Minaturised Nucleic Acid Analysis Lab Chip (2004) 4, 534-546]에 기재되고, 증폭의 ISFET 관찰과 조합될 수 있다. 이 유형의 구조가, 예를 들어 포토리소그래피를 사용하여 유체 망을 정의한 후 에칭 또는 침적 단계를 사용하여 예컨대 PMMA, 아크릴, 퍼스펙스™ 또는 유리 기판에서 요구되는 하나 또는 여러 개의 채널을 생성하는 표준 미세가공 기술의 사용을 통해 가공될 수 있다. 유리 또는 PMMA 또는 다른 물질 중의 커버 플레이트가 채널을 덮도록 덮히거나 덮히지 않을 수 있다. 하나 또는 여러 개의 채널의 베이스가, 가열 또는 열 펌프 (펠티에) 소자뿐만 아니라 통합된 ISFET 및 온도 센서를 갖는 규소 칩에 결합되는 기판에 의해 형성되어, 반응 혼합물이 이러한 센서 및 작동기와 직접적으로 접촉하도록 할 수 있고, 온도 제어를 위한 회로를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 다르게는, ISFET 및 온도 센서가 반응 혼합물과 직접적으로 접촉하도록 이들을 하우징하는 인쇄 회로 기판 (PCB)에 의해 채널(들)의 베이스가 형성될 수 있다. PCB는 또한 가열 또는 열 펌프 소자, 센서 인터페이스 및 온도 제어 회로를 하우징할 수 있다. 마이크로유체 채널 또는 챔버 내에 존재하는 시약은 완충된 증폭 반응 혼합물의 시약일 수 있고, 이는 선택된 서열의 증폭에 적합한 부위에서 표적과 혼성화하는 능력을 위해 선택된 프라이머, 증폭을 위해 요구되는 하나 또는 여러 개의 효소 및 과량의 4개의 dNTP 모두를 포함할 수 있다.
비례-적분-미분 (PID) 제어기에 의해 온도를 제어할 수 있고, 이는 가장 흔한 폐쇄-루프 피드백 제어 시스템 중 하나이다. 이어서, 측정 온도 및 표적 온도 사이의 오차를 사용하여 요구되는 가열 수준을 계산할 수 있다. 이 출력 수준의 계산이 현재 오차에 직접적으로 (비례) 기반하여, 오차의 이력 (적분)에 기반하여, 및 오차의 변화율 (미분)을 바탕으로 예측된 미래 오차에 기반하여 수행될 수 있다. 유사하게, 이오르다노브 등의 상기 동일 문헌 (2004)에 기재된 바와 같이 PI 제어기가 오차의 현재 및 이력 값에 기반하여 온도를 안정시킬 수 있다. 다르게는, 펄스폭 변조 또는 듀티 순환과 같은 기술이 시행될 수 있다.
다르게는, 마이크로챔버에서 열순환을 위해 요구되는 온도 구역 사이에서 증폭 혼합물을 앞뒤로 움직이게 하는 왕복동(reciprocating) 시스템을 갖도록 선택될 수 있다. 이러한 칩 상 샘플-전환 PCR (상기 언급된 오루 등의 종설 논문에 기재됨)에 기인하는 핵산 증폭이 마이크로유체 챔버의 벽, 또는 pH를 측정하기에 적합한 임의의 장소에 ISFET를 제공함으로써 관찰될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따라 ISFET 감지를 위해 수정될 수 있는 PCR을 위한 마이크로유체 장치의 자세한 사항은 [Zhang et al. (2006) Biotech. Adv. 24, 243-284]를 다시 참조할 수 있다. 상기 종설 논문에서 논의된 바와 같이, 이러한 장치가 바람직하게는 규소 칩의 형태를 취할 수 있는 반면에, 칩 기판을 위한 다른 물질, 예컨대 유리, 다양한 중합체 및 세라믹이 이용될 수 있다. 열순환을 위한 접촉 가열의 대안으로서, 동일한 종설 논문에서 또한 논의된 바와 같이 다양한 비접촉 가열 방법이 이용될 수 있고, 예를 들어 열기 매개 가열, 적외선 활용, 레이저-매개 가열, 유도 가열 및 마이크로웨이브 조사를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 장치가 DPCR을 수행하는데 사용될 수 있다. 도 3이 DPCR용 장치의 한 실시양태를 도시한다. 장치 (300)는 웰 (304), 일부 실시양태에서 1개 이상의 웰, 100개 이상의 웰, 1000개 이상의 웰, 10,000개 이상의 웰, 30,000개 이상의 웰을 갖는 기판 (302)으로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기판 (302)이 50,000개 미만의 웰, 40,000개 미만의 웰, 30,000개 미만의 웰, 20,000개 미만의 웰, 5,000개 미만의 웰, 1000개 미만의 웰, 500개 미만의 웰, 100개 미만의 웰, 10개 미만의 웰을 가질 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의 웰 (304)이 하나 이상의 센서 (308)와 전기적 연락 상태에 있는 감지 층 (306)과 화학적 연락 상태에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 웰이 그들 자신의 각 센서 (308)와 화학적 및 전기적 연락 상태에 있다. 예를 들어 증폭을 위한 샘플, PCR 프라이머 및 시약, 완충제, 또는 임의의 다른 적합한 시약을 포함할 수 있는 샘플 (312)이 칩 상에 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 불혼화성 유체 층, 플라스틱 층, 유리 층, 또는 임의의 다른 적합한 밀봉 층과 같은 밀봉 층 (310)이, 웰 상에 위치하여 각각의 개별 웰에서 반응 혼합물을 격리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 웰 표면의 적어도 일부가 친수성 코팅 또는 물질로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 웰 표면의 적어도 일부가 소수성 코팅 또는 물질로 코팅될 수 있다. 추가로, 반응 혼합물을 이어서 PCR을 수행하는데 필요한 조건으로 처리할 수 있다. 앞서 기재된 바와 같이, PCR이 발생하는 경우, 앰플리콘이 연장/복제될 때마다 수소 이온이 방출되어 웰에서 반응 혼합물의 pH를 변화시킬 것이다. 그 후, 반응 혼합물의 pH에서의 이러한 변화를 웰과 화학적 연락 상태에 있는 센서에 의해 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 앞서 기재된 바와 같이 증폭 전에 칩 상에 샘플이 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 칩의 외부에서 증폭되거나 풍부화될 수 있고, 그 후 증폭된 주형을 갖는 샘플이 칩 상에 로딩될 수 있다. 칩 상에 로딩되면, 샘플은 검출가능한 부산물을 방출하기에 적합한 임의의 반응을 겪을 수 있다. 일부 실시양태에서, 적은 반응 부피는 불혼화성 유체를 사용하여 샘플을 더 적은 반응 부피 내로 전단시킴으로써 형성되고 이는 이어서 칩 상에 로딩된다.
도 4a가 본원에서 제공되는 장치의 대안적 실시양태를 도시한다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 본원에서 제공되는 장치 및 방법의 일부 실시양태에서, 샘플을 기판 내 웰 중으로 분배하는 대신에, DNA 같은 샘플 (412)은 DNA의 개별 분자가 서로 격리된 매트릭스 (414) 내에 함유 및 국한될 수 있다. 매트릭스는 세포외 매트릭스, 중합체 매트릭스, 또는 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 매트릭스일 수 있다. 매트릭스는 DNA 단편, 콜로니, 클러스터, 폴로니 사이의 신호 간섭을 감소시키기에 충분한 물질이어야 한다. 일부 실시양태에서 도 4a에 도시된 바와 같이 매트릭스는 감지 층 (406)의 표면 상에 펼쳐진 연속 층일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 2개의 유리 슬라이드 사이에 끼일 수 있고 감지 플레이트 상에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지지체 (416)가 매트릭스와 구조적으로 연결될 수 있다. 장치 (400)의 대안적 실시양태에서, 도 4b에 도시된 바와 같이 매트릭스 (412)가 하나 이상의 웰 (404)을 함유하는 기판 (402)과 함께 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 웰 (404)이 샘플 클러스터 사이에서 개별 클러스터로부터 신호를 검출하는 센서의 숫자를 감소시키는 신호 소음을 추가적으로 감소시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 앰플리콘이 연장 및/또는 복제될 때마다 수소 분자가 방출되기 때문에 개별 콜로니, 클러스터, 폴로니, 단편 밑의 센서가 증폭을 갖는 구역 또는 웰에 대한 pH의 변화를 검출할 수 있다. 검출은 센서에 대한 샘플의 근접성에 따라 다를 수 있거나 다르게는 전체 표면적에 걸쳐 증폭된 폴로니의 숫자를 확인하기 위한 시간 기반 검출일 수 있다. 시간 기반 접근을 사용하는 정량법은 이어서 구역 또는 부피 당 콜로니의 숫자를 계산하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치가 에멀젼 dPCR을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 도 5a 및 5b가 에멀젼을 갖는 장치를 사용하는 한 실시양태를 묘사한다. 이러한 실시양태에서, 에멀젼 액적이 관심 있는 샘플을 함유하는 에멀젼이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에멀젼이 PCR에 필요한 샘플, 프라이머, 프로브, 시약, 완충제, 또는 임의의 다른 적합한 성분을 함유하는 용액으로부터 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 에멀젼이 샘플로부터 생성될 수 있다. PCR을 위한 시약, 프로브, 프라이머, 완충제, 또는 임의의 다른 적합한 성분, 예컨대 5' 뉴클레아제 또는 택맨 (TaqMan)을 함유하는 제2 에멀젼이 생성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 열, 빛, 전류, 화학적 성질, 전하, 또는 액적을 합치기 위한 임의의 다른 적합한 형태를 포함하는 임의의 적합한 형태의 에너지를 사용하여 증폭 전의 일정 시점에서 샘플 에멀젼으로부터의 액적 및 시약 에멀젼으로부터의 액적이 합쳐질 수 있다. 일부 실시양태에서, 에멀젼 액적이 진탕, 교반(stirring, agitating), 음파처리(sonicating), 또는 에멀젼을 형성하기 위한 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 (512)을 함유하는 비증폭된 에멀젼 액적이 하나 이상의 웰 (504)을 함유하는 기판 (502) 상에 로딩될 수 있다. 도 5a는 웰 (504) 내로 로딩된 샘플 (512)을 도시하는 기판의 상면도이고, 여기서 샘플 (512)이 표적 핵산의 단일 카피를 함유하도록 희석되었다. 이러한 실시양태에서, 일부 웰이 표적 핵산의 주형을 하나 이상 함유할 수 있고 일부 웰이 표적 핵산의 주형을 하나도 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 웰의 표면이 예를 들어 친수성 표면 코팅과 같은 표면 코팅, DNA 결합제 또는 DNA 분자를 보유하기 위한 임의의 다른 적합한 처리로 처리될 수 있다. 기판 상에 샘플이 로딩되면 불혼화성 유체 층 또는 밀봉 층 (510) (도 5b에 도시된 바와 같음)이 웰 상에 위치되어 개별 반응 부피를 격리할 수 있고 또한 오버레이로서 역할을 할 수 있다. 도 5b가 측면에서 본 장치 (500)를 도시한다. 일부 실시양태에서, 도 5b에 도시된 바와 같이, 밀봉 층 (510)이 샘플로 채워지지 않은 임의의 빈 웰 (504)을 또한 채울 수 있다. 샘플이 기판 (502) 상에 로딩되면, 그 후 샘플을 PCR 증폭에 필요한 조건으로 처리할 수 있다. 이어서, 증폭된 샘플을 함유하는 웰, 또는 양성 샘플 웰 (516)이 표적 DNA를 갖지 않는 웰, 또는 음성 샘플 웰 (518)과 구분될 수 있다. 추가로, 비(non) 샘플 웰 (520)이 양성 샘플 웰 (516) 및 음성 샘플 웰 (518)과 구별될 수 있는데, 이는 밀봉 층으로 인해 비 샘플 웰 (520)이 상이한 전기적 특성을 가질 것이기 때문이다.
일부 실시양태에서, 장치는 도 6a 및 6b에 도시한 바와 같이 비드를 이용한 에멀젼 dPCR과 함께 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 에멀젼은 에멀젼 액적이 하나 이상의 관심 샘플 주형 및 필요한 PCR 혼합물 및/또는 시약, 프로브, 프라이머 및 비드 (607)를 함유하도록 생성될 수 있고, 여기서 비드 (607)는 DNA 또는 임의의 다른 관심 표적 핵산을 결합하기 위한 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에멀젼 액적은 진탕, 교반(stirring, agitating), 음파처리, 또는 에멀젼을 형성하기 위한 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 형성될 수 있다. DNA가 존재하는 임의의 비드 (607)는 비드, 또는 주형 양성 비드 (622)로부터 연장된 DNA를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 주형 양성 비드가 풍부화될 수 있다. 그 후, 샘플 (612) 및 비드 (607)를 함유하는 증폭된 에멀젼 액적은 도 6a에 도시한 바와 같이 하나 이상의 웰 (604)을 함유하는 기판 (602)상에 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 웰의 표면이 예를 들어 친수성 표면 코팅과 같은 표면 코팅, DNA 결합제 또는 DNA 분자를 보유하기 위한 임의의 다른 적합한 처리로 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 기판 상에 로딩되면, 불혼화성 유체 층 또는 밀봉 층이 웰 상에 위치되어 개별 반응 부피를 격리할 수 있고, 또한 오버레이로서 역할을 할 수 있다. 도 6b는 측면에서 본 장치 (600)를 도시한다. 샘플 및/또는 비드가 웰 (604) 내에 로딩되면, 그 후 샘플을 PCR 증폭에 필요한 조건으로 처리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신규 프라이머 및/또는 프로브가 관심 검정에 대해 조사하기 위하여 사용될 수 있다. 빈 웰 (628)과는 대조적으로, 관심 검정에 상응하는 서열을 갖는 비드를 함유하는 웰, 또는 양성 웰 (624)은 신호를 줄 것이고, 그렇지 않다면 웰은 음성 웰 (628)일 것이다.
일부 실시양태에서, 에멀젼은 필요한 시약, 프라이머, 프로브, 및 프라이머 부위를 갖는 비드와 함께 생성될 수 있다. 그 후, PCR은 에멀젼에서 수행되어서 DNA가 존재하는 비드가 주형 양성 비드를 형성하기 위한 비드로부터 연장된 DNA를 가질 수 있을 것이다. 그 후, 에멀젼은 분리(broken)될 수 있다. 이어서, 양성 비드가 식별될 수 있고, 양성 비드는 풍부화되거나 또는 풍부화되지 않을 수 있다. 그 후, 비드는 웰을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 칩 상에 로딩될 수 있다. 이어서, PCR이 칩 상에서 수행될 수 있고, 신규 프라이머로 로딩되어 관심 검정에 대해 조사할 수 있다. 그 후, 관심 검정에 상응하는 서열을 갖는 비드를 갖는 웰은 신호를 줄 수 있다. 그 후, 관심 검정에 상응하는 비드를 갖지 않는 웰은 음성일 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 실제로 서열분석하지 않고 수소 이온의 검출을 수행할 수 있다. 비-서열분석 수소 이온 검출 방법은 2종의 표적 특이적 PCR 프라이머로 앰플리콘을 생성하고, 앰플리콘을 비드에 결합시키고, 표적 특이적 검출 프라이머를 혼성화시키고, 비드를 웰 내에 로딩하고, 칩 상에서 비드 검출을 수행하여 비드를 함유하는 웰을 식별하고, 폴리머라제 및 모든 4종의 dNTP를 함유하는 반응 혼합물을 공급하고, 수소 이온을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 시스템은 몇 개의 비드가 앰플리콘을 갖고 검출 프라이머와 매칭되는지의 카운트를 제공할 수 있지만, 반드시 임의의 서열 정보를 제공하지는 않을 것이다. 이때, 수소 이온 급증은 DNA 가닥의 중합이 일어났음을 나타낼 것이다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 표적 분자를 부분적으로 서열분석하여, 예를 들어 비드 결합된 앰플리콘의 서열을 확인 (그러나 이는 전통적인 염기의 1:1 판독을 요구하지는 않을 것임)함으로써 수소 이온의 검출을 수행할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 각각 4종의 염기 중 1종이 결핍된 dNTP 풀들을 사용하여 서열분석을 실행할 수 있다. 이는 특정한 표적 분자를 양성인 것으로 식별하는데 사용될 수 있는 서열 패턴을 제공할 것이며, 또한 서열분석 주기마다 더 많은 수소 이온을 제공하여 피크 높이의 예측가능한 변동을 제공할 것이다.
비드 또는 웰 없이 이온 검출을 수행하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 이러한 실시양태에서는, 단일 앰플리콘을 수소 이온 검출기 주변 둘레에 위치한 히드로겔 필름의 개별 영역에 결합시킬 것이다. 이어서, 반응을 실행하여 고리를 포화시킬 수 있고, 이어서 서열분석을 수행 (이때 수소 이온 검출기에 의해 검출될 수소 이온을 방출함)할 수 있다.
디지털 캐스트PCR(castPCR), PAP 또는 TPAP 연장 검정을 수행하는 방법이 본원에 제공된다. 경쟁적 대립유전자-특이적 택맨® PCR (캐스트PCR)은 다량의 정상적인 야생형 게놈 DNA (gDNA)를 함유하는 샘플에서 희귀 돌연변이를 검출하고 수량화하는 방법이다. 캐스트PCR™ 기술은 야생형 대립유전자로부터의 비-특이적 증폭을 억제하기 위해 대립유전자-특이적 택맨® qPCR을 대립유전자-특이적 MGB 차단제와 조합하여 전통적인 대립유전자-특이적 PCR보다 우수한 특이성을 생성하며, 동시계류중인 출원 미국 일련 번호 13/350,764 [Methods, Compositions, and Kits for Detecting Rare Cells] (이 출원은 그 전문이 참조로 포함됨)에 추가로 논의되어 있다. 인산화 활성화 중합 (PAP)은 표적 또는 주형 핵산과 혼성화되었을 때의 가피로인산분해-매개 프라이머-탈차단에 이어지는 활성화된 프라이머의 연장을 포함하는 과정이다. PAP에 사용되는 프라이머는 전형적으로 3'에 종결인자 뉴클레오티드, 예컨대 디데옥시뉴클레오티드 (ddNMP)를 포함한다. TPAP는 트리포스페이트의 존재 하에서의 연장가능하지 않은 프라이머의 중합을 지칭한다. 통상적으로, 프라이머의 3' 말단에 있는 연장가능하지 않은 뉴클레오티드는 중합이 일어날 수 있게 되기 전에 첫 번째로 제거되어 연장가능한 프라이머를 생성한다. 디지털 캐스트PCR, PAP 또는 TPAP 연장 검정은 또한 웰당 수천 개의 수소의 검출 감도가 요구될 수 있는 희귀 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 희귀 돌연변이 대립유전자를 포함하는 전단된 gDNA (각각 ~100 kb)의 범용 부착부를 비드에 결합시킬 수 있다. 캐스트PCR 또는 TPAP를 이용한 대립유전자 특이적 연장 동안, 희귀 돌연변이 대립유전자의 연장이 일어나서 수소 이온이 방출될 수 있다. 이때, 방출되는 수소 이온을 이온 감지 검출 시스템에 의해 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가폴리인산분해에 의한 활성화 (APP)를 이용하여 핵산을 증폭시킬 수 있다. APP는 (a) 가폴리인산분해에 의해 제거가능한 (즉, 활성화가능한) 연장가능하지 않은 3' 말단 ("P*")을 갖는 제1 올리고뉴클레오티드를 핵산에 어닐링시키는 단계; (b) 가폴리인산분해제 및 가폴리인산분해 활성을 갖는 생촉매 (즉, DNA 폴리머라제)를 사용하여 3' 연장가능하지 않은 말단을 제거함으로써 비차단된 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계; 및 (c) 비차단된 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 목적 핵산 가닥을 생성하는 단계를 이용하여 수행할 수 있다. APP 방법은 또한, 예를 들어 하기 추가 단계: (d) 주형 가닥으로부터 단계 (c)의 목적 핵산 가닥을 분리하는 단계, 및 (e) 목적 핵산 가닥의 목적 증폭 수준이 달성될 때까지 단계 (a)-(d)를 반복하는 단계를 추가함으로써 목적 핵산 가닥을 증폭시키는데 이용될 수 있다. APP의 단계 (a) 내지 (c)는 열순환기 상에서 2개 이상의 온도 단계로 순차적으로 수행할 수도 있고, 이들은 열순환기 상에서 하나의 온도 단계로 수행할 수도 있다.
이온 감지 검출 시스템을 사용하여 멀티플렉스 디지털 돌연변이 검출 검정을 수행하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 이러한 실시양태에서, 대립유전자 특이적 프라이머를 비드에 부착시킬 수 있다. 각각의 비드는 100-500종의 돌연변이를 분석할 수 있다. 이어서, 비드당 0-1개의 분자의 존재 하에 멀티플렉스 에멀젼 TPAP PCR을 수행할 수 있다. 이때, 비드 및 결합된 대립유전자를 증폭을 위한 조건에 적용시킨다. 이어서, 돌연변이의 존재 또는 부재를 계수할 수 있고, 이어서 이들 100-500종의 희귀 돌연변이의 빈도를 결정할 수 있다. TPAP 또는 APP의 다른 실시예는 동시계류중인 출원 미국 일련 번호 13/324,676 [Polymerization of Nucleic Acids Using Activation by Polyphosphorolysis (APP) Reactions] (이는 그 전문이 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
다르게는, 대립유전자 특이적 프라이머의 혼합물을 비드에 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 대립유전자 특이적 프라이머를 부착시킬 수 있고, 3종 이상, 50종 이상, 100종 이상, 500종 이상, 1000종 이상의 대립유전자 특이적 프라이머를 부착시킬 수 있다. 이어서, 비드를 샘플 및 PCR 시약과 혼합할 수 있다.
증폭전 분할 및 이중-단계 에멀젼 PCR을 이용한 멀티플렉스 디지털 PCR을 단일 단계 또는 단일 증폭 반응으로 수행하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 분할 및 증폭을 단일 단계로 수행하는 것은 정확한 정량화를 방해할 수 있는 무작위 노이즈 또는 오차 및 편향을 제거한다. 일부 실시양태에서, 샘플의 분할, 또는 주형 분자 또는 핵산의 분할은 샘플의 임의의 프로세싱을 수행하기 전에 수행한다. 프로세싱은, 예를 들어 꼬리첨가, 표적화, 증폭, 비드-로딩, 또는 임의의 다른 적합한 프로세싱을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 단일 증폭 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 각각이 서열 특이적 3' 말단 및 범용 5' 말단을 함유하는 표적화 올리고의 멀티플렉스를 갖는 샘플을 분할하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 표적화 올리고는 반응 부피 중에서 임의 표적의 수 라운드의 증폭을 수행하여 표적의 꼬리첨가된 앰플리콘을 생성할 수 있음을 확실히 하기에 충분한 농도로 존재한다. 추가로, 모든 표적화 올리고 상에 존재하는 꼬리와 동일한 범용 올리고가 반응 부피에 첨가될 수 있고, 여기서 범용 올리고는 임의의 꼬리첨가된 앰플리콘의 증폭을 제1 라운드를 지나 계속하기에 충분한 농도로 존재한다. 추가로, 예를 들어 서열분석 비드와 같은 비드가 반응 부피 중에 존재할 수도 있고, 존재하지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 반응 부피는 단분산 액적, 다분산 액적 및/또는 에멀젼일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에멀젼 중에서의 1단계 RT-PCR이 가능할 수 있고, RNA의 디지털 분석을 허용할 수 있다.
실시예
증폭전 분할 및 이중-단계 에멀젼 PCR 을 이용한 멀티플렉스 디지털 PCR
물질: 각각 동일한 범용 서열로 꼬리첨가된 표적 특이적 올리고의 멀티플렉스 풀을 샘플 및 PCR 마스터믹스(MasterMix)와 저농도로 조합한다. 예를 들어: 목적하는 수의 표적을 갖는 대립유전자 특이적 정방향 프라이머, 목적하는 수의 표적을 갖는 대립유전자 특이적 역방향 프라이머, 범용 정방향 프라이머 또는 꼬리, 범용 역방향 프라이머 또는 꼬리를 샘플 및 PCR 마스터믹스와 조합할 수 있다. 추가로, 범용 정방향 프라이머/꼬리로 사전로딩된 비드, 뿐만 아니라 고농도의 매칭 범용 정방향 프라이머 또는 꼬리 및 매칭 범용 역방향 프라이머 또는 꼬리를 첨가할 수 있다. 범용 역방향 프라이머 또는 꼬리의 양은 비드 로딩을 유발하기 위해 범용 정방향 프라이머 또는 꼬리보다 약간 더 고농도일 수 있다.
방법: 멀티플렉스 풀, 샘플 및 PCR 마스터믹스가 조합되면, 이어서 반응 혼합물을 에멀젼화에 의해 수천 개 또는 수백만 개의 액적으로 분할할 수 있다. 각각의 액적은 이에 따라 모든 표적의 증폭을 개시하기에 충분한 표적화 프라이머를 함유할 것이다. 이어서, 특정한 액적에서 주형과 매칭되는 어느 대립유전자 특이적 프라이머에 의해서든지 증폭이 시작될 수 있다. 모든 다른 대립유전자 특이적 프라이머는 비생산적이다. 증폭의 제1 단계 후, 표적에 대한 대립유전자 특이적 프라이머는 완전히 소모될 수 있다. 이어서, 증폭은 모든 반응 또는 액적에서 동일한 범용 프라이머에 의해 계속될 수 있다. 비드 상의 범용 정방향 프라이머도 또한 연장되어 서열분석 주형을 생성할 수 있다.
분석: 액적의 정량화는 디지털 방식이다 (증폭에 대해 양성 또는 증폭에 대해 음성).
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시 및 기재되어 있지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 당업자는 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화 및 치환을 수행할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안은 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범주를 규정하는 것으로 의도되며, 이들 특허청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물은 그에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (23)

  1. 샘플을 50％ 초과의 분획이 샘플 부피당 1개 이하의 표적 핵산 분자를 함유하는 복수의 샘플 부피로 분획화하고;
    복수의 샘플 부피를 증폭을 위한 조건으로 처리하고;
    표적 핵산이 존재하는 샘플 부피에서 이온 농도의 변화를 검출하고;
    증폭된 표적 핵산을 갖는 분획의 수를 계수하고;
    샘플에서 표적 핵산의 양을 결정하는 것
    을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플을 증폭을 위한 프라이머 및 프로브와 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 이온 농도의 변화가 이온 농도의 증가인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 샘플을 비드와 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 샘플을 하나 이상의 웰을 포함하는 기판에 로딩하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 웰을 불혼화성 유체 층으로 밀봉하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 하나 이상의 웰이 코팅을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 코팅이 친수성 코팅인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 복수의 샘플의 각각을 복수의 격리된 위치에 배치하는 것을 추가로 포함하며, 복수의 격리된 위치의 각각은 센서와 화학적 연락 상태에 있는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 이온 농도의 변화가 수소 이온의 증가인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 이온 농도의 변화가 pH의 변화인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 표적 핵산의 양을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 표적 핵산의 최초량을 함유하는 샘플을, 하나 이상의 표적 핵산 분자를 함유하는 반응 구역의 백분율이 50％ 초과 및 100％ 미만인 복수의 샘플 부피로 희석하고;
    복수의 샘플 부피를 하나 이상의 증폭 사이클로 처리하고;
    하나 이상의 증폭 사이클의 결과로서 복수의 샘플 부피 중 하나 이상에서 이온 농도의 변화를 검출하고;
    표적 핵산의 최초량을 수량화하는 것
    을 포함하는, 핵산의 절대 정량법을 수행하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서, 이온 농도의 변화가 증가인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 이온이 양성 이온인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 양성 이온이 수소 이온인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 이온이 음성 이온인 방법.
  18. 샘플을 50％ 초과의 분획이 샘플 부피당 1개 이하의 표적 핵산 분자를 함유하는 복수의 샘플 부피로 분획화하도록 구성되고, 추가로 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더;
    샘플 보유 장치와 화학적 연락 상태에 있는 감지 층; 및
    감지 층과 전기적 연락 상태에 있는 하나 이상의 센서
    를 포함하는, PCR을 수행하기 위한 장치.
  19. 제18항에 있어서, 샘플 보유 장치가 매트릭스인 장치.
  20. 제19항에 있어서, 매트릭스가 세포외 매트릭스인 장치.
  21. 제18항에 있어서, 샘플 보유 장치가 겔인 장치.
  22. 제21항에 있어서, 겔이 히드로겔인 장치.
  23. 제18항에 있어서, 샘플 보유 장치가 센서의 주변부의 적어도 일부 주위에 위치된 것인 장치.
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