KR20110074563A - 바이러스의 정제 방법 - Google Patents

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buffer
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마크 톰슨
재니스 위
아칸크샤 나그팔
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메디뮨 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 부착성 세포(예를 들어, MDCK 또는 Vero 세포)로부터 세포 회합된 바이러스를 정제하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 숙주 세포 DNA(HCD), 숙주 세포 단백질(HCP) 및 비특이적 엔도뉴클레아제(예를 들어, 벤조나아제)의 수준이 규제 기관에서 요구하는 규정사항보다 낮아진, 생 약독화 세포-회합 바이러스(예를 들어, 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 또는 저온 적응성 및/또는 온도 감응성 인플루엔자 바이러스)를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 피험체를 활성적으로 면역화시키거나 또는 수동 면역 및 진단 면역분석을 포함한, 다양한 용도를 위한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

Description

바이러스의 정제 방법{METHODS FOR PURIFICATION OF VIRUSES}
1. 관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008년 9월 24일 출원된 미국 가출원 제61/099,749호; 2008년 10월 13일 출원된 미국 가출원 제61/104,933호; 2008년 12월 15일 출원된 미국 가출원 제61/122,456호; 2009년 6월 17일 출원된 미국 가출원 제61/187,721호, 및 2009년 7월 1일 출원된 미국 가출원 제61/222,131호를 우선권으로 주장하며, 이들 내용의 전체를 참조하여 본원에 포함시킨다.
2. 주정부 지원 연구 및 개발 하에 수행된 본 발명의 권리에 대한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원, 및 보건복지부와의 공동 연구 및 개발 협약의 수행으로 이루어졌다. 미정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
3. 기술 분야
본 발명은 백신 개발을 위해 생물반응기에서 성장시킨 부착성 세포로부터 세포-회합된 바이러스를 정제하기 위한 방법을 제공한다.
4. 배경 기술
백신접종은 바이러스 감염으로 유발되는 질환을 예방하기 위한 가장 중요한 공중 보건 방법이다. 백신의 유용성은, 안정적이며 배양하기 쉬운 공급원으로부터 다량의 백신 물질(예를 들어, 바이러스)을 신속하게 생산할 수 있는지의 여부에 달려있다. 신속한 백신 개발과 백신의 충분한 공급으로 그 이용성을 증대시키는 것이 인간과 동물의 수많은 질환을 퇴치시키는데 있어서 중요하다. 백신 생산의 지연과 그의 양적인 부족 때문에 급증하는 질환을 처리하는데 있어서 문제가 발생할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 세계적으로 유행하는 인플루엔자에 대한 백신을 생산하기 위해 장기간의 소요시간(lead time)이 필요하다는 문제점이 있다고 최근 연구는 시사하고 있다. 예를 들면, 문헌 [Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953]을 참조할 수 있다. 따라서, 최근의 백신 생산은 세포 배양물에서 백신용 바이러스의 증식에 초점을 맞추고 있다.
3.1 인플루엔자 바이러스
특히, 마딘 다비 개과 신장 (MDCK: Madin Darby Canine Kidney) 세포는 다수의 그룹들에 의해 계속 사용되어 왔다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 미국등록특허 제6,455,298호; 미국특허공보 제2005/0118140호; 미국특허공보 제2005/0118698호; 미국등록특허 제6,825,306호; WO 2005/113758 및 문헌 [Radaeva, I.F., et al., Vopr . Virusol. (2005) 50: 43-6]를 참조할 수 있다. 그러나, 기존의 대다수의 MDCK 세포주는 종양유발성(tumorigenicity), 세포 배양물에서 동물 혈청의 요건 및 백신 사용에 적합한 인플루엔자 바이러스의 낮은 수율을 비롯한 하나 이상의 결함을 지니고 있다. 게다가, 이러한 세포주들로부터 백신 물질을 생산하기 위해 개발된 많은 세포 배양 방법은 배지 교환 단계를 비롯한 수많은 조작이 필요하고, 접종을 위해서 다량의 바이러스를 사용해야 되는 경우가 많다. 또한, 다른 인플루엔자 균주들이 거듭하여 출현(혹은 재출현)하기 때문에, 순환하는 인플루엔자 균주들에 기초하여 이들이 유행하는 각 시즌에 새로운 인플루엔자 백신이 만들어진다. 유감스럽게도, 어떤 인플루엔자 백신 균주는 고수율로 증식시키기가 더 어려운 경우가 있다. 세포 배양물에서 유래한 물질의 각 회분(batch)의 수율은 생산 능력을 대변할 뿐 아니라 제품의 비용에도 영향을 주므로, 바이러스 수율(즉, 피크 바이러스 역가)를 개선하는 것이 바람직하다.
최근에는, 백신 균주를 매우 높은 역가로 증식시킬 수 있는 신규한 무혈청 배지 및 비종양유발성 세포주, 그리고 일회용 생물 반응기 내에서 바이러스 물질을 생산하는 방법이 개발되었다(미국특허공보 제2006/0188977호; 및 미국특허출원 제11/855,769호, 2007년 9월 14일 출원됨). 본 발명은 이러한 성과를 더욱 확장하여, 신규한 세포 배양 배지, 생물반응기 내에서 배지 교환 없이 MDCK 세포, 특히 비종양유발성 세포주로부터 다량의 백신 물질을 생산하기 위한 고도의 재현가능성을 보유하며 효율적으로 확장가능한 방법, 그리고 고순도로 정제된 약독화 생백신 생산용의 안정한 다운스트림 정제 과정을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 완벽하여 최소한의 조작만이 필요하며 비용면에서도 효율적이다.
3.2 호흡기 세포융합 바이러스 ( RSV )
인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 유아 및 청소년에 있어서 중증의 하기도 감염 (LRTI)의 주된 요인이며, 상당한 치사율과 사망률의 원인이 된다. 7대 주요 수출국 시장(미국, 일본, 프랑스, 독일, 이태리, 스페인, 영국)에서 해마다 3백만 명의 성인들과 거의 40만 명의 미숙아들을 비롯하여 총 1,800백만 명의 사람들이 감염된다. 미국에서만 한 해에 7만에서 12만 5천 명의 입원 환자들이 RSV LRTI 로 고생하고 있는 것으로 추정된다. 항원과 관련하여 사람에게는 두 가지의 다양한 RSV 하위 집단 A와 B가 존재한다. RSV는 면역 기능이 저하된 성인 및 노인에 있어서 감염의 중요한 병원체로서도 알려져 있다. 자연 감염에 의해 유발되는 RSV 재감염에 대한 불완전한 저항성으로 인해, RSV는 어린 시절 및 일생 동안 여러 번에 걸쳐 사람을 감염시킬 수 있다. RSV 면역예방의 목적은 RSV 감염과 연관될 수 있는 심각한 질병을 예방할 수 있도록 충분한 저항성을 유도해내는 것이다. 최근 RSV 백신 개발의 전략은 주로 정제된 바이러스 항원의 투여 또는 비강 내 투여를 위한 약독화 생균 RSV의 개발을 위주로 하고 있다. 그러나, 현재까지 RSV에 대해 인증을 받은 백신은 없었다.
바이러스 유전체 RNA는 나출(naked) RNA와 같이 전염성은 아니다. RSV의 RNA 유전체는 거대한 뉴클레오캡시드(N) 단백질로 단단하게 싸여 있으며, 인단백질(P)과 거대(L) 폴리머라아제 서브유닛과 결합되어 있다. 이러한 단백질들은 핵단백질 코어를 형성하는데, 이는 전염성의 최소 단위로 알려져 있다(문헌 [Brown et al., 1967, J. Virol. 1:368-373]).
수십 년간의 연구에도 불구하고, RSV 감염과 결부된 심각한 사망률과 치사율을 방지할 수 있는 시판되는 안전하고도 효율적인 RSV 백신은 개발된 바가 없다. 포르말린으로 불활성화된 바이러스 백신은 RSV 감염으로부터 보호하는데 실패하였고, 실제로는 유아에 있어서 야생형 바이러스에 의해 후속 감염이 이루어지는 동안에 증상을 악화시켰다(문헌 [Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405- 21]; [Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 449-63]). 그 이후에는 재조합 방법, 화학적 돌연변이 유발법 및 온도 감응성 돌연변이체를 위한 야생형 RSV의 저온 계대 배양법에 의해 얻어진 약독화 생균 돌연변이체 개발에 초점을 맞추었다(문헌 [Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3: 414-21]; [Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 691-9] 참조). 그러나, 세포 연관 단백질로부터 약독화 생균 바이러스를 정제하는 일은, RSV 감염의 유효한 예방학적 치료를 위한 규제 지침을 충족시켜야 하기 때문에 지금까지 달성하기 힘든 점이 있었다.
인플루엔자 바이러스와 유사하게, RSV는 안정된 세포주 내에서 성장하는데, 여기서 바이러스는 숙주 세포와 밀착 결합되고 있어, 감염성의 최소 단위를 유지하면서 세포 연관 단백질로부터 바이러스를 정제하는 것이 쉽지 않다. 이러한 복잡성에 더하여, RSV는 부서지기 쉽다(예를 들어, 전단 응력 민감성이다). 이렇게 바이러스가 대부분 숙주 세포와 연관이 되어 있고 부서지기 쉽다는 점들 때문에, 약독화 생균 바이러스를 포함하는 임상적으로 허용가능한 면역원성 조성물을 만들면서 숙주 세포 추출물(예를 들어, DNA 및 단백질)로부터 바이러스를 정제하는 것이 어려운 것이다. 이러한 이유들이 왜 RSV에 대해 시판되는 백신이 없는가에 대한 부분적이나마 그에 대한 답이 될 것이다. 따라서, 면역원성 조성물의 제조 및 제형화를 위해 RSV 및 기타 다른 세포 회합 바이러스를 정제하는데 사용될 수 있는 정제 공정의 필요성이 대두되고 있다.
5. 발명의 요약
본 발명은 전체 바이러스 회수율이 5% 이상인, 세포 배양물(예를 들어, Vero 세포 배양물)에서 성장된 부착성 세포로부터 생존 세포-회합된 바이러스(예를 들어, RSV)를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 정제된 바이러스는 바이러스 투여량(4-6 log10 FFU) 당 100 ng 보다 적은 숙주 세포 DNA(HCD), 40 ㎍ 보다 적은 숙주 세포 단백질(HCP), 및 0.1 ng 보다 적은 비특이적 뉴클레아제를 포함한다.
6. 도면의 간단한 설명
도 1은 4×2L 생물반응기 내에서 배양 0일에서 4일까지의 생존 세포 밀도 (VCD)와 세포 생존율 (V%)의 플롯을 나타낸 것이다. 표 6에 상술한 종균 반응기(SR) 공정 조건을 사용하여 생물반응기를 배양하였다. SR 4에 대한 2 dps 데이터는 나타내지 않았다.
도 2는 B2B 트립신화가 이루어지는 동안에 1번, 3번 및 4번 실험에 있어서 3×2L 종균 반응기(SR)의 중간 샘플링 시간인 0분 내지 40분에 찍은 사진(10× 확대)을 나타낸 것이다. 트립신화는 비드간 이동 프로토콜과 같이 생물반응기 내에서 수행하였다.
도 3은 12×2L 최종 생성 반응기 (FPR) 내에서의 생존 세포 밀도 (VCD)와 세포 생존율 (V%)의 플롯을 나타낸 것이다. 3번 실험의 생물반응기들(FPR3.X.X)을 5 dps에 감염시키고(~120 hps), 다른 실험들의 생물반응기들은 4 dps에 감염시켰다. 4번 실험에 대해서는 감염 후 VCD와 세포 생존율 데이터는 나타내지 않았다.
도 4는 모든 실험의 12×2L 최종 생성 반응기에 대하여 4dps에 찍은 사진(100× 확대)을 나타낸 것이다.
도 5는 모든 실험의 9×2L 최종 생성 반응기에 대하여 3dpi에 찍은 사진(100× 확대)을 나타낸 것이다.
도 6은 처음에 4×2L 종균 반응기에서 증식시켜 배양한 후 12×2L 최종 생성 반응기(FPR)에서 감염시킨 세포에 있어서, 시간의 경과에 따른 ca A/우루과이 (A/U), ca A/사우스 다코타 (A/S) 및 ca B/플로리다 (B/F) 바이러스 역가의 플롯을 나타낸 것이다. 주: 각각의 데이터 지점은 세 번의 반복 검정의 평균을 나타낸다. 검출 한계 미만(< 6.4 log10FFU/㎖ 또는 희석된 경우에는 < 2.4 log10FFU/㎖)의 바이러스 역가는 기록하지 않았다.
도 7은 67% 배지 교환 공정 (67% MX)과 배지 무교환 공정 (0% MX)을 사용하여 생성된 균주에 있어서 시간의 경과에 따른 바이러스 생성 프로파일을 나타낸 것이다. 균주 ca A/위스콘신/67/05 및 ca A/우루과이에 대한 플롯을 도 7A에 나타내었으며, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다에 대한 플롯은 도 7B에 나타내었다.
도 8은 ∼30분 이내에 세포를 떼어내기에 유효한 약 0.05X의 최종 농도로 킬레이트제(EDTA) 및 프로테아제 (TrypLE™)를 포함하는 완충된 염 용액(DPBS)을 사용하는 각각의 2 세척 단계를 이용하는 비드간 이동 공정의 순서도를 나타낸다.
도 9는 직류식 여과 1 (Direct Flow Filtration, DFF1) 여과 장치(도 9A, 위)에 사용되는 필터와 배관 장치, GE 헬스케어 유니플럭스(Healthcare Uniflux) 스키드(skid) 배관 장치(도 9A, 아래), GE 헬스케어 악타 프로세스(AKTA process) 스키드 배관 장치(도 9B, 위) 및 직류식 여과 2 (DFF2) 여과 장치 (도 9B, 아래)를 도시한 것이다.
도 10은 초기 정제 공정 1a를 개선된 정제 공정 1b와 나란히 도식화하여 나타낸 것이다. 추가로 변형된 부분들은 도 10B에 도식화하여 상세히 나타냈다. 각 공정에 대한 상세한 설명은 실시예 3과 4에 제공하였다.
도 11은 TFF1 #8 러닝의 유량 추적 곡선을 나타낸 것이다.
도 12는 BPG 100 및 BPG 200 CS 컬럼 압력 유동 특성을 나타낸 것이다.
도 13은 #9 러닝의 CS 컬럼 용리 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 14는 #8 러닝 TFF2 8X DF 공정의 유량 추적 곡선을 나타낸 것이다.
도 15는 10 및 30-L 규모의 상이한 생산 로트에 대한 공정 단계 역가 회수율을 요약해 나타낸 것이다.
도 16은 RSV의 상이한 생산 로트 중에서 5 Log FFU의 RSV 용량(최종 정제 약물 산물) 당 전체 DNA 및 전체 단백질을 요약해 나타낸 것이다.
7. 구체적인 설명
본 발명은 부착성 세포(예를 들어, MDCK 세포, 특히 비종양유발성 세포주 또는 Vero 세포)로부터 생물반응기 내에서 예방, 진단, 면역요법 또는 치료 용도의 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 RSV) 또는 바이러스 항원을 대량으로 생산하기 위한 고도의 재현가능성을 보유하며 효율적으로 확장가능한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 세포융합 바이러스를 배지 교환을 필요로 하지 않으면서도 높은 역가로 생산하는 견고한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)의 배양을 지원하는 배양 배지, 그리고, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스)를 포함하는 바이러스의 복제를 배지 교환 필요없이도 높은 역가로 지원하는 배양 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)로부터 백신 물질(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)을 제조하는 방법, 그리고 MDCK 세포에서 생산된 백신 물질을 이용하여 인플루엔자 감염을 예방하는 방법도 제공한다. 임의의 세포 회합 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 및 RSV)는 본원에 기술된 방법에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함될 수 있다. 본원에서, "세포 회합 바이러스"는 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 기법에 의해 측정시 약 60% 이상의 바이러스 역가가 바이러스-감염된 부착성 세포와 연관되어 발견되는 바이러스를 일컫는다. 본 발명의 방법은 저온 적응성/온도 감수성/약독화성(ca / ts / att) 인플루엔자 균주 (예를 들어, FluMist® 중의 인플루엔자 균주) 및 RSV (예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 생산하는데 특히 유용하다.
비종양유발성 MDCK 세포 및/또는 Vero 세포에서 성장할 수 있는 바이러스로는, 이에 제한되지는 않지만, 인플루엔자, RSV, 1형, 2형 및 3형 파라인플루엔자 바이러스 및 인간 메타뉴모바이러스를 포함하는 (-)스트랜드 RNA 바이러스뿐 아니라, DNA 바이러스, 레트로바이러스, (+)스트랜드 RNA 바이러스, (-)스트랜드 RNA 바이러스, 이중 가닥 RNA 바이러스를 비롯한 기타 바이러스, 예컨대 이에 제한하진 않지만, 파포바바이러스(papovavirus), 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스, 우두(vaccinia) 바이러스, 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 파보바이러스(parvovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 소아마비(poliomyelitis) 바이러스, 홍역 바이러스, 광견병 바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.
7.1 정의
본원에서 사용된 종양유발성(Tumorigenicity)이라는 말은 당업자에게 이 용어가 부여하는 통상적인 의미를 나타낸다. 종양유발성은, 한 실시 양태에서, 성숙한 누드 마우스 모델에서 측정된다(예를 들어, 문헌 [Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36: 1353] 및 하기 실시예 5). 또한, 종양유발성은 다른 분석법, 예를 들면, 닭의 배아 내에 주사하는 방법 및/또는 융모요막에 국소 적용하는 방법(문헌 [Leighton et al., 1970, Cancer, 26: 1024]을 이용한 분석법으로 시험할 수도 있다.
"재조합체(recombinant)"라는 용어는 물질(예를 들어, 핵산 또는 단백질)에 인간이 개입하여 인공적으로 또는 합성적으로(비자연적으로) 변형된 것을 가리킨다. 상기 변형은 자연 환경 또는 자연 상태 범위 내에서 해당 물질에 대해 수행되거나, 이러한 자연 환경 또는 자연 상태 범위로부터 분리된 해당 물질에 대해서 수행될 수 있다. 구체적으로, 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성되는 경우 재조합체이다. 재조합체 바이러스는 유전체 내에 도입된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 또한, 재조합체 바이러스는 하나 이상의 바이러스 모균주로부터 유래한 성분을 포함하는 경우에는 재배열체(reassortant) 바이러스가 될 수도 있다.
바이러스와 관련하여, "재배열체(reassortant)"라는 용어는 바이러스가 하나 이상의 바이러스 모균주 또는 공급원에서 유래한 유전적 성분 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 7:1 재배열체는 제1 모 바이러스로부터 유래된 7개의 바이러스 유전체 분절(또는 유전자 분절)과, 제2 모 바이러스 유래의 단일 상보성 바이러스 유전체 분절(single complementary viral genomic segment), 예컨대 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 뉴라미니다아제(neuraminidase)를 코딩하는 단일 상보성 바이러스 유전체 분절을 포함한다. 6:2 재배열체는 제1 모 바이러스 유래의 가장 흔한 6개의 내부 유전자인 6개의 유전체 분절과, 다른 모 바이러스 유래의 두 상보성 분절, 예컨대, 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제를 포함한다.
본원에서 사용된 "약"이라는 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 이 용어에 의해 변화되는 값이 그 수치의 10%를 초과하거나 10% 미만으로 미달되지 않는 값을 가리킨다. 예를 들어, "약 5 ㎍/kg"이라는 용어는 4.5 ㎍/kg 내지 5.5 ㎍/kg의 범위를 의미한다. 다른 예를 들면, "약 1시간"이라는 것은 54분 내지 66분의 범위를 의미한다.
"온도 감수성(temperature sensitive)", "저온 적응성(cold adapted)" 및 "약독화성(attenuated)"이라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, "온도 감수성" ("ts")이라는 용어는, A형 인플루엔자 균주의 경우, 바이러스가 저온, 예컨대 33℃에 비하여 더 높은 온도, 예컨대 39℃에서 100배 이상의 역가 감소를 나타내고, B형 인플루엔자 균주의 경우, 바이러스가 저온, 예컨대 33℃에 비하여 더 높은 온도, 예컨대 37℃에서 100배 이상의 역가 감소를 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, "저온 적응성" ("ca")이라는 용어는 바이러스가 고온, 예컨대 33℃에서의 증식률보다 더 낮은 온도, 예컨대 25℃에서 100배 이내로 더 높은 증식을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, "약독화성" ("att")이라는 용어는 바이러스가 흰족제비의 상부 기도에서는 복제를 하지만 폐 조직에서는 검출되지 않으며, 동물에서 인플루엔자 유사 질환을 유발하지 않는 것을 의미한다. 중간 표현형을 갖는 바이러스, 즉, 39℃ (A형 균주 바이러스) 또는 37℃ (B형 균주 바이러스)에서 100배 이하의 역가 감소를 나타내고, 33℃에서의 증식에 비해 25℃에서 100배 이상(예를 들어, 200배, 500배, 1000배, 10,000배 이내)의 증식을 나타내는 바이러스, 및/또는 흰족제비의 상부 기도에 비하여 폐에서 감소된 증식률 및/또는 동물에 있어서 주춤하는 인플루엔자 유사 질환을 나타내는 바이러스도 본 발명에 포함되는 유용한 바이러스이다. 증식(growth)은 역가, 플라크 크기 또는 형태, 입자 밀도 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 표시되는 바이러스의 양을 의미한다.
7.2 세포
본원에 기술된 세포 회합 바이러스는 바이러스의 수확, 회수 및 사용이 허용되는 역가까지 바이러스를 성장시킬 수 있는 임의의 부착성 세포 내에서 증식될 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 부착성 세포는 상기 세포 회합 바이러스를 그에 해당하는 야생형 바이러스에 대해 측정된 것과 비슷한 역가까지 성장시킬 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 본원에 기술된 세포 회합 바이러스는 이 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 세포 내에서 증식된다.
한 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 회합 바이러스는 포유동물 세포 내에서 증식된다. 본원에 기술된 세포 회합 바이러스가 증식할 수 있는 대표적인 포유동물 세포로는, 이에 제한되지는 않으나, Vero 세포, CHO 세포, Hep-2 세포, MBCK 세포, MDCK 세포, MRC-5 세포, HeLa 세포 및 LLC-MK2 세포를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 호흡기 세포융합 바이러스를 비롯하여 본원에 기술된 세포 회합 바이러스는 베라 세포 내에서 증식한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 인플루엔자 바이러스를 비롯하여 본원에 기술된 세포 회합 바이러스는 MDCK 세포 내에서 증식한다.
6.2.1 MDCK 세포
MDCK 세포는 예컨대, 이에 제한하지는 않지만, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus) 및 플라보바이러스(flavovirus)를 비롯한 다양한 바이러스의 단리 및 복제를 지원하는 것으로 알려져 있다. 특히, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스 생성에 광범위하게 사용된다. 그러나, 상기에서 언급한 바와 같이, 일부 MDCK 세포주들은 종양유발성이다. 종양유발성이 규제할 대상이라면, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 생성을 위한 비종양유발성 MDCK 세포를 증식시키는 방법 및 그의 용도를 제공한다. 따라서, 한 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 비종양유발성 MDCK 세포를 이용한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 종양유발성과는 상관없이 MDCK 세포를 이용한다.
본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 비종양유발성 MDCK 세포로서는, 이에 제한되지는 않지만, 미국 미생물 보존 센터(버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 2005년 1월 5일 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-6500 및 PTA-6503 (각각 MDCK-S 및 MDCK-SF103으로 지정됨)으로 부여된 세포주; 그리고 2006년 10월 5일에 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-7909와 PTA-7910 (각각 서브클론 1-A 및 1-B로 지정됨)으로 부여된 세포주를 포함한다.
이용될 수 있는 다른 MDCK 세포로서는, 이에 제한되지는 않지만, 미국 미생물 보존 센터에 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-6501 및 PTA-6502 (각각 MDCK-SF101 및 MDCK-SF102로 지정됨)으로 부여된 세포주; ATCC 수탁번호가 CRL-12042 (MDCK.5F1으로 지정됨)로 부여된 세포주; 그리고 ATCC 수탁번호가 ATCC CCL34, CRL-2286 및 CRL-2285로 부여된 세포주를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서 비종양유발성이다(문헌 [Stiles et al.] 참조). 특정 실시 양태에서, 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우 비종양유발성이다(문헌 [Leighton et al., 상기와 동일] 참조). 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서는 비종양유발성이지만, 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우에는 비종양유발성이 아니다. 추가의 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델의 경우, 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우에 비종양유발성이다. 추가의 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 20회 이상 계대 배양 후, 또는 30회 이상 계대 배양 후, 또는 40회 이상 계대 배양 후, 또는 50회 이상 계대 배양 후, 또는 60회 이상 계대 배양 후, 또는 70회 이상 계대 배양 후, 또는 80회 이상 계대 배양 후, 또는 90회 이상 계대 배양 후, 또는 100회 이상 계대 배양 후에도 비종양유발성이다. 추가의 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 본 발명의 무혈청 배지(예를 들어, MediV SFM 105 + TE, MediV SFM 109 및 MediV SFM 110)에서 20회 이상 계대 배양 후, 또는 30회 이상 계대 배양 후, 또는 40회 이상 계대 배양 후, 또는 50회 이상 계대 배양 후, 또는 60회 이상 계대 배양 후, 또는 70회 이상 계대 배양 후, 또는 80회 이상 계대 배양 후, 또는 90회 이상 계대 배양 후, 또는 100회 이상 계대 배양 후에도 비종양유발성이다.
종양유발성은 당업자에게 공지된 여러가지 방법으로 정량될 수 있다. 흔히 사용되는 한 방법은 "TD50" 값을 측정하는 것인데, 이 수치는 실험 동물의 50%에 종양을 유발하기 위해 필요한 세포수로 정의된다(예를 들어, 문헌 [Hill R. The TD50 assay for tumor cells. In: Potten C, Hendry J, editors. Cell clones. London: Churchill Livingstone; 1985. p.223] 참조). 한 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 약 1010 내지 약 101 사이, 또는 약 108 내지 약 103 사이, 또는 약 107 내지 약 104 사이의 TD50 값을 갖는다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 약 1010 이상, 또는 약 109 이상, 또는 약 108 이상, 또는 약 107 이상, 또는 약 106 이상, 또는 약 105 이상, 또는 약 104 이상, 또는 약 103 이상, 또는 약 102 이상, 또는 약 101 이상의 TD50 값을 갖는다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 약 107 이상의 TD50 값을 갖는다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포는 비종양원성(non-oncogenic)이다. 세포가 종양원성인지를 결정하는 방법은 일반적으로 세포 용해물 및/또는 DNA를 신생 설치류 종에 접종하는 단계 및 시간의 경과에 따라 종양이 형성된 상태를 평가하는 단계를 포함한다(예를 들어, 문헌 [Nowinski and Hays, 1978, J. Virol, 27: 13-8]; [Peeper, et al., 2002, Nat Cell Biol., 4: 148-53]; [Code of Federal Regulation (CFR), "Oncogenicity", Title 40, Vol. 8, Chapter 1, section 798.330, pp.160-164]를 참조). 예를 들어, 보통 태어난 지 4일이 채 되지 않은 신생 설치류(예를 들어, 햄스터, 누드 마우스, 랫트)에 107 이상의 세포 당량의 세포 용해물 및/또는 DNA를 주사한 후에 5개월 이상 동안 모니터링한다. 종양원성 분석은 상업적으로 실험을 수행하는 회사[예를 들어, 바이오릴라이언스(BioReliance), 프로토콜 #001031 및 #001030 참조]에 의해 통상적으로 수행된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포의 세포 용해물 및/또는 DNA를 105 이상, 106 이상, 107 이상으로 신생 설치류 종에 주사할 경우 2개월 후, 또는 3개월 후, 또는 4개월 후, 또는 5개월 후, 또는 6개월 후, 또는 이보다 더 시간이 흐른 후에도 종양 형성을 유발하지 않는다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 비종양유발성 MDCK 세포의 DNA를 0.01 mg, 또는 0.02 mg, 또는 0.03 mg, 또는 0.04 mg, 또는 0.05 mg, 또는 0.06 mg, 또는 0.07 mg, 또는 0.08 mg, 또는 0.09 mg, 또는 0.10 mg, 또는 그 이상의 양으로 신생 설치류 종에 주사할 경우 2개월 후, 또는 3개월 후, 또는 4개월 후, 또는 5개월 후, 또는 6개월 후, 또는 이보다 더 시간이 흐른 후에도 종양 형성을 유발하지 않는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는 이에 제한되지는 않지만, 오르소믹소바이러스(A형 및/또는 B형 인플루엔자 균주 포함), 파라믹소바이러스(A형 및/또는 B형 RSV, 인간 메타뉴모바이러스 및 1형, 2형 및/또는 3형 파라인플루엔자 포함), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 포함하는 바이러스의 복제를 지원한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는, 예를 들어, FluMist®에서 발견되는 것과 같은 저온 적응성, 온도 감수성(ca / ts), 약독화성 인플루엔자 바이러스(문헌 [Belshe et al., 1998, N Engl J Med 338:1405]; [Nichol et al., 1999, JAMA 282:137]; [Jackson et al., 1999, Vaccine, 17:1905]), 및/또는 이러한 바이러스의 백본(예를 들어, 잔류하고 있는 유전자 분절)을 포함하거나, 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성과 같은 특징 중 하나 이상의 특징을 갖는 인플루엔자 바이러스의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 분절)을 포함하는 재배열체 바이러스의 복제를 지원한다.
세포가 바이러스의 복제를 지원할 수 있는 능력에 대한 하나의 척도는 감염된 세포 배양물로부터 얻어지는 바이러스 수율이다. 바이러스 수율은 바이러스 감염 및/또는 성장을 측정하도록 고안된 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 수율은 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 분석법, 또는 세포 배양물 단층 내의 감염된 세포 내에 바이러스 항원을 검출하는 형광 포커스 분석법(FFA)에 의해, 시료 중에 존재하는 바이러스의 농도를 측정함으로써 정량될 수 있다(예를 들어, 미국등록특허 제7,262,045호 참조). TCID5O 값은 흔히 log10 TCID50/㎖로 기록되며, FFA 값은 대개 log10 FFL/㎖(형광 포커스 유닛/㎖)로 기록된다. 인플루엔자 바이러스의 생산에 유용한 방법들로서는, 이에 제한되지는 않지만, 특허 공보 WO 08/105931 (특히, 실시예 12 참조)에 개시된 것들을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFL/㎖까지 인플루엔자 바이러스(예를 들어, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포는 약 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFL/㎖까지 인플루엔자 바이러스(예컨대, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포는 비종양유발성이다.
백신 및 관련생물제품 자문위원회(Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)에서는 매년 유행성 인플루엔자에 대한 백신 접종을 위해 백신 균주 제조에 사용되는 야생형 인플루엔자 바이러스를 생물제제 평가 및 연구센터(Centers for Biologics Evaluation and Research, CBER) 또는 세계보건기구(WHO) 및 유럽의약품평가기구(European Medicines Evaluation Agency, EMEA)로 해마다 추천하고, FDA 또는 미국질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서는 이를 제조업자에게 제공한다. 이후, 이러한 균주들은 일반적으로 야생형 바이러스의 NA 및/또는 HA 유전자와, 원하는 특정 성질을 보유하게 될 도너(donor) 바이러스(흔히 마스터 도너 바이러스 또는 MDV로도 지칭됨)로부터 유래한 잔존 유전자 분절이 조합된 재배열체 백신 균주를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV 균주는 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성일 수 있고/있거나, 높은 증식률을 가질 수 있다. 하기에 바로 제시될 실시 양태들은 다른 인플루엔자 균주(예를 들어, 하나 이상의 보건 기구에 의해 추천된 야생형 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형에 관한 것이다. 이러한 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스는 해당 균주의 HA 및 NA 유전자 분절, 그리고 예컨대, FluMist®[ca A/앤 아버(Ann Arbor)/6/60 및 ca B/앤 아버/1/66]에서 발견되는 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 인플루엔자 바이러스와 같이 적절한 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 균주(본원에서 "저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 백본"으로도 지칭됨)의 잔존 유전자 분절을 포함하는 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스를 수득함으로써 제조될 수 있다. 본원에서, 재조합 및/또는 재배열 바이러스는 야생형 인플루엔자 바이러스 균주의 HA 및 NA 유전자 분절과, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성인 인플루엔자 바이러스의 잔존 유전자 분절을 포함한다. 재조합 및/또는 재배열 바이러스는 식별자 "ca", "att", "ts" 중 하나 이상에 의해 선행되는 야생형 균주 지정법에 의해서도 지칭되기도 하는데, 예컨대 A/뉴 칼레도니아/20/99의 HA 및 NA 유전자 분절과, 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 인플루엔자 바이러스(A/앤 아버/6/60)의 잔존 분절을 포함하는 재조합 및/또는 재배열 바이러스는 간단하게 "ca A/뉴 칼레도니아/20/99"로 지정될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는, 이에 제한되지는 않지만, CBER, WHO, EMEA, FDA 및 CDC를 포함하는 하나 이상의 보건 기구에 의해 해마다 추천되고/되거나 제공되는 하나 이상의 인플루엔자 균주(예를 들어, A형 인플루엔자 균주, B형 인플루엔자 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(예를 들면, 재조합체)의 복제를 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖까지 지원한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는, 이에 제한되지는 않지만, CBER, WHO, EMEA, FDA 및 CDC를 포함하는 하나 이상의 보건 기구에 의해 해마다 추천되고/되거나 제공되는 하나 이상의 인플루엔자 균주(예를 들어, A형 인플루엔자 균주, B형 인플루엔자 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(예를 들면, 재배열체)의 복제를 약 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖까지 지원한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포는 비종양유발성이다.
다른 특정의 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는 하나 이상의 A형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 지원한다. A형 인플루엔자 균주는 임의의 아형(예를 들어, H1N1, H3N2, H7N7, H5N1, H9N2, H1N2, H2N2)일 수 있는 점도 고려된다. 현재, A형 인플루엔자 바이러스에서는 16개 이상의 서로 다른 HA 아형과 9개 이상의 서로 다른 NA 아형이 확인되었다. 따라서, A형 인플루엔자 균주는 현재 알려졌거나, 앞으로 확인될 것들 및/또는 재배열될 수 있는 HA 및 NA 아형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포는 비종양유발성이다.
다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)는 하나 이상의 B형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 지원한다. B형 인플루엔자 바이러스는 현재 이들의 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제 단백질에 따라 아형들로 분류되진 않았으며, 그 계통만이 분류되었다. 현재, B형 인플루엔자 바이러스 균주는 다수의 하위 계통을 가진 B/야마가타(Yamagata) 및 B/빅토리아(Victoria) 계통의 두 가지로 분류되어 있다. 따라서, B형 인플루엔자 균주는 임의의 계통 및/또는 현재 알려졌거나 앞으로 확인될 계통 및/또는 재배열될 수 있는 계통들로부터 유도될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포는 비종양유발성이다.
6.3 세포 배양 배지 및 세포 배양 방법
본 발명은 생물반응기, 예컨대 일회용 생물반응기, 재사용가능한 표준 생물반응기(예를 들어, 스테인리스강 및 유리용기 생물반응기) 내에서 다량의 백신 물질을 생산하기 위한 무혈청 세포 배양 배지 및 고도의 재현가능성을 보유하며 효율적으로 확장가능한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스)를 높은 역가, 예를 들어, 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖로 복제하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)의 증식을 높은 세포 밀도까지 지원하고 높은 바이러스 역가를 얻기 위한 배지 교환 단계에 대한 필요성을 배제하는 강화된(enriched) 무혈청 세포 배양 배지를 제공한다. 배지 교환 단계의 제거로 공정 시간과 배지 사용의 단축과 같은 여러 장점들이 제공된다. 게다가, 이는 제조시 필요한 다수의 작업을 줄이게 되어, 결과적으로 오염의 기회를 감소시키게 된다. 다른 측면에서, 본 발명은 비드간 이동 방법을 비롯한 미세담체 상에서 비종양유발성 세포를 증식하는 개선된 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명의 강화된 무혈청 배양 배지는 비종양유발성 MDCK 세포의 비종양유발 특성을 유지한다.
6.3.1 강화된 무혈청 배지
당업자라면 세포를 증식하는데 사용되는 세포 배양 배지가, 이에 제한되지는 않지만, 본원에 기술된 바와 같이 비종양유발성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세포로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 배양시 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 높은 역가까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 등의 특성 중 하나 이상의 세포 특성에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 외래의 병원체(예컨대, 미코플라스마, 바이러스 및 프리온)에 의해 오염되는 위험 가능성을 감소시키기 위해서는, 치료 물질(예를 들어, 백신)의 생산을 위한 조직 배양 적용에서 혈청 또는 동물 추출물의 사용을 최소화하거나 심지어는 제거해야 한다. 또한, 세포 배양 공정 동안 필요한 여러 가지 조작들을 최소화하면 오염의 가능성을 현저히 줄일 수 있다. 따라서, 본 발명은 회분식 배양 방법을 이용해 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)의 증식 및 백신 물질의 생산에 유용한 강화된 무혈청 배양 배지를 제공한다. 특히, 본 발명의 강화된 무혈청 배양 배지(본원에서 "본 발명의 무혈청 배지" 및 "본 발명의 배지"로도 지칭됨)는 배지 교환, 또는 보충을 하지 않는 회분식 배양 방법에서 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 무혈청 배지를 개발하여 사용하게 되면, 백신 물질(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)의 세포 배양 기반 생산에 있어서 맞부딪히게 되는 가장 힘든 작업상 문제들 중의 하나인 배지 교환/보충의 요건을 극복하게 된다.
한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 비종양유발성 MDCK 세포의 증식을 지원하는데, 여기서 이 세포들은 배지 내에서 증식된 후(즉, 계대 배양된 후)에도 비종양유발성을 유지한다. 특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 본 발명의 무혈청 배지 중에서 20회 이상 계대 배양 후, 또는 30회 이상 계대 배양 후, 또는 40회 이상 계대 배양 후, 또는 50회 이상 계대 배양 후, 또는 60회 이상 계대 배양 후, 또는 70회 이상 계대 배양 후, 또는 80회 이상 계대 배양 후, 또는 90회 이상 계대 배양 후, 또는 100회 이상 계대 배양 후에도 비종양유발성이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)가 높은 밀도로 증식하는 것을 지원한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 MDCK 세포가 5×105 세포/㎖ 이상, 6×105 세포/㎖ 이상, 7×105 세포/㎖ 이상, 8×105 세포/㎖ 이상, 9×105 세포/㎖ 이상, 1×106 세포/㎖ 이상, 1.2×106 세포/㎖ 이상, 1.4×106 세포/㎖ 이상, 1.6×106 세포/㎖ 이상, 1.8×106 세포/㎖ 이상, 2.0×106 세포/㎖ 이상, 2.5×106 세포/㎖ 이상, 5×106 세포/㎖ 이상, 7.5×106 세포/㎖ 이상, 1×107 세포/㎖ 이상의 밀도로 증식하도록 지원한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 비종양유발성 MDCK 세포의 증식을 지원한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 세포)를 높은 밀도로 증식시키고 이어서 인플루엔자 바이러스가 배지 교환 단계 필요없이도 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 10.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖로 복제되도록 지원한다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 비종양유발성 MDCK 세포를 높은 밀도로 증식시키고, 이어서 인플루엔자 바이러스(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 상기 기술된 바이러스들)가 복제되도록 지원한다.
한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 식물 가수분해물을 포함한다. 식물 가수분해물은 이에 제한되지는 않지만, 옥수수, 면실, 완두, 대두, 맥아, 감자 및 소맥 중 하나 이상의 가수분해물을 포함한다. 식물 가수분해물은 효소적 가수분해에 의해 생성될 수 있으며, 일반적으로 펩타이드, 유리 아미노산 및 성장 인자의 혼합물을 포함한다. 식물 가수분해물은 예를 들어, 마르코르 디벨럽먼트(Marcor Development), 하이클론(Hyclone) 및 오르가노 테크니(Organo Technie)를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 식물 가수분해물 대신에, 또는 식물 가수분해물과 함께 효모 가수분해물도 사용할 수 있다는 점도 고려된다. 효모 가수분해물은 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), USB 코포레이션(USB Corp), 기브코(Gibco)/BRL 및 기타 공급처를 비롯하여 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 식물 가수분해물 또는 효모 가수분해물을 대신하여, 또는 추가로 합성 가수분해물이 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 약 0.1 g/L 내지 약 5.0 g/L, 또는 약 0.5 g/L 내지 약 4.5 g/L, 또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 또는 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 또는 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 최종 농도로 식물 가수분해물을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 2.5 g/L의 최종 농도로 식물 가수분해물을 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 2.5 g/L의 최종 농도로 소맥 가수분해물을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 지질 보충물을 포함한다. 배양 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있는 지질은, 이에 제한되지는 않지만, 동식물 유래의 화학적으로 규명된 동식물 유래의 지질 보충물 뿐만 아니라, 합성으로 유도된 지질도 포함한다. 지질 보충물 내에 존재할 수 있는 지질은, 이에 제한되지는 않지만, 콜레스테롤, 포화 및/또는 불포화 지방산(예를 들어, 아라키돈산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산, 올레산, 팔미트산 및 스테아르산)을 포함한다. 콜레스테롤은 100X 지질 보충물 저장액 중에 0.10mg/㎖ 내지 0.40mg/㎖ 사이의 농도로 존재할 수 있다. 지방산은 100X 지질 보충물 저장액 중에 1㎍/㎖ 내지 20㎍/㎖ 사이의 농도로 존재할 수 있다. 배지 조성물에 적합한 지질은 예를 들면 하이클론, 기브코/BRL 및 시그마-알드리치를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 화학적으로 규명된 지질 농축물을 약 0.1X 내지 약 2X, 또는 약 0.2X 내지 약 1.8X, 또는 약 0.3X 내지 약 1.7X, 또는 약 0.4X 내지 약 1.6X, 또는 약 0.5X 내지 약 1.5X, 또는 약 0.6X 내지 약 1.4X, 또는 약 0.7X 내지 약 1.3X, 또는 약 0.8X 내지 약 1.2X의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 화학적으로 규명된 지질 농축물(CDCL) 용액을 1X의 최종 농도로 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 화학적으로 규명된 지질 농축물(CDCL) 용액(표 4)을 1X의 최종 농도로 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 미량 원소를 포함한다. 사용가능한 미량 원소로서는, 이에 제한하지는 않지만, CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 아셀렌산염(Selenite)·2Na, 구연산철, MnSO4·H2O, Na2SiO3·9H2O, 몰리브덴산-암모늄염, NH4VO3, NiSO4·6H2O, SnCl2(무수), AlCl3·6H2O, AgNO3, Ba(C2H3O2)2, KBr, CdCl2, CoCl2·6H2O, CrCl3(무수), NaF, GeO2, KI, RbCl, ZrOCl2·8H2O을 포함한다. 미량 원소의 농축 저장액은 예컨대, 셀 그로우(Cell Grow)(카달로그 번호 99-182, 99-175 및 99-176 참조)와 같은 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 미량 원소 용액 A, B 및 C(표 3)를 약 0.1X 내지 약 2X, 또는 약 0.2X 내지 약 1.8X, 또는 약 0.3X 내지 약 1.7X, 또는 약 0.4X 내지 약 1.6X, 또는 약 0.5X 내지 약 1.5X, 또는 약 0.6X 내지 약 1.4X, 또는 약 0.7X 내지 약 1.3X, 또는 약 0.8X 내지 약 1.2X의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 미량 원소 용액 A, B 및 C(표 3)를 1X의 최종 농도로 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 하나 이상의 호르몬, 성장 인자 및/또는 다른 생물학적 분자를 포함한다. 호르몬은 이에 제한되지는 않지만, 트리요오도티로닌, 인슐린 및 하이드로코르티손을 포함한다. 성장 인자는 이에 제한되지는 않지만, 표피 성장 인자(EGF: Epidermal Growth Factor), 인슐린 성장 인자(IGF: Insulin Growth Factor), 형질전환 성장 인자(TGF: Transforming Growth Factor) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF: Fibroblast Growth Factor)를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 표피 성장 인자(EGF)를 포함한다. 다른 생물학적 분자들로서는, 사이토카인[예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)], 인터페론, 인터루킨, TNF, 케모카인[예를 들어, 란테스(Rantes), 에오탁신(eotaxin), 대식세포 염증 단백질(MIP)] 및 프로스타글란딘(예를 들어, 프로스타글란딘 E1 및 E2)을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 성장 인자를 약 0.0001 내지 약 0.05 mg/L, 또는 약 0.0005 내지 약 0.025 mg/L, 또는 약 0.001 내지 약 0.01 mg/L, 또는 약 0.002 내지 약 0.008 mg/L, 또는 약 0.003 mg/L 내지 약 0.006 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 EGF를 0.005 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 트리요오도티로닌을 약 1×10-12 M 내지 약 10×10-12 M, 또는 약 2×10-12 M 내지 약 9×10-12 M, 또는 약 3×10-12 M 내지 약 7×10-12 M, 또는 약 4×10-12 M 내지 약 6×10-12 M의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 트리요오도티로닌을 5×10-12 M의 최종 농도로 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 인슐린을 약 1 mg/L 내지 약 10 mg/L, 또는 약 2.0 내지 약 8.0 mg/L, 또는 약 3 mg/L 내지 약 6 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 인슐린을 5 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 프로스타글란딘을 약 0.001 mg/L 내지 약 0.05 mg/L, 또는 약 0.005 mg/L 내지 약 0.045 mg/L, 또는 약 0.01 mg/L 내지 약 0.04 mg/L, 또는 약 0.015 mg/L 내지 약 0.035 mg/L, 또는 약 0.02 mg/L 내지 약 0.03 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 프로스타글란딘을 0.025 mg/L의 최종 농도로 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 프로스타글란딘 E1을 0.025 mg/L의 최종 농도로 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 푸트레신, 아미노산, 비타민, 지방산 및 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분으로 강화된다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는, 배지 성분의 농도가 세포를 증식하는데 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들어 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/햄의 F12 배지(Ham's F12 mediem)(DMEM/F12)에서 발견되는 농도보다 약 1배, 또는 약 2배, 또는 약 3배, 또는 약 4배, 또는 약 5배 이상이 되도록, 하나 이상의 배지 성분으로 강화된다. DMEM/F12의 표준 조성은 하기 표 1에서 참조로 제공하였다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 푸트레신의 농도가 DMEM/F12에서 통상 발견되는 농도보다 약 5배 이상이 되도록 푸트레신으로 강화된다.
첨가될 수 있는 지방산으로는, 불포화 지방산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 리놀레산 및 α-리놀렌산(필수 지방산으로도 지칭됨)뿐 아니라, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 올레산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 에루크산, 도코사헥사에노산; 포화 지방산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 에이코산산, 도코산산, 테트라코산산 및 리포산과 같은 황함유 지방산을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 상기 기술된 바와 같이 지질 보충물에 의해 제공되는 것과는 별도로 추가의 지방산이 첨가된다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 리놀레산 및 리놀렌산으로 강화된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 리놀레산 및 리놀렌산의 농도가 DMEM/F12에서 통상 발견되는 농도보다 약 5배 이상이 되도록 리놀레산 및 리놀렌산이 첨가된다.
첨가될 수 있는 아미노산으로는 20개의 표준 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)뿐 아니라, 시스틴 및 비표준 아미노산을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 흔히 "필수 아미노산"으로 지칭되는 비종양유발성 MDCK 세포에 의해 합성되지 않는 하나 이상의 아미노산이 첨가된다. 예를 들어, 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 이소루신, 메티오닌, 루신 및 리신의 8개 아미노산이 일반적으로 인간에 있어서 필수적인 것으로 간주된다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 시스틴과 모든 표준 아미노산의 농도가 DMEM/F12에서 통상 발견되는 농도보다 약 5배 이상이 되도록 시스틴과 모든 표준 아미노산(글루타민은 제외; DMEM/F12는 글루타민 없이 조제되는 경우가 많아 별도로 첨가됨)으로 강화된다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 글루타민을 약 146 mg/L 내지 약 1022 mg/L, 또는 약 292 mg/L 내지 약 876 mg/L, 또는 약 438 mg/L 내지 약 730 mg/L의 농도로 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 글루타민을 584 mg/L의 농도로 포함한다.
첨가될 수 있는 비타민으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 아스코르빈산 (비타민 A), d-비오틴 (비타민 B7 및 비타민 H), D-판토텐산칼슘, 콜레칼시페롤 (비타민 D3), 염화콜린, 시아노코발라민 (비타민 B12), 에르고칼시페롤 (비타민 D2), 엽산 (비타민 B9), 메나퀴논 (비타민 K2), 미오-이노시톨, 나이아신아미드 (비타민 B3), p-아미노벤조산, 판토텐산 (비타민 B5), 필로퀴논 (비타민 E), 피리독신 (비타민 B6), 레티놀 (비타민 A), 리보플라빈 (비타민 B2), α-토코페롤 (비타민 E) 및 티아민 (비타민 B1)을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 d-비오틴, D-판토텐산칼슘, 염화콜린, 시아노코발라민, 엽산, 미오-이노시톨, 나이아신아미드, 피리독신, 리보플라빈 및 티아민의 농도가 DMEM/F12에서 통상 발견되는 농도보다 약 5배 이상이 되도록 상기 지적한 비타민으로 강화된다.
첨가될 수 있는 뉴클레오시드로서는, 이에 제한되지는 않지만, 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘, 이노신 및 히포크산틴을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 히포크산틴 및 티미딘의 농도가 DMEM/F12에서 통상 발견되는 농도보다 약 5배 이상이 되도록 히포크산틴 및 티미딘으로 강화된다.
세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 추가의 성분들로서는, 이에 제한되지는 않지만, 중탄산나트륨, 탄소원(예를 들어, 글루코스) 및 철분 결합 물질을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 중탄산나트륨을 약 1200 mg/L 내지 약 7200 mg/L, 또는 약 2400 mg/L 내지 약 6000 mg/㎖, 또는 약 3600 mg/㎖ 내지 약 4800 mg/㎖의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 중탄산나트륨을 4400 mg/㎖의 최종 농도로 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 탄소원으로서 글루코스를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 글루코스를 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 또는 약 2 g/L 내지 약 10 g/L, 또는 약 3 g/L 내지 약 8 g/L, 또는 약 4 g/L 내지 약 6 g/L, 또는 약 4.5 g/L 내지 약 9 g/L의 최종 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 글루코스를 4.5 g/L의 최종 농도로 포함한다. 비종양유발성 MDCK 세포를 높은 밀도로 증식시키고 이어서 인플루엔자를 복제하는데 사용되는 본 발명의 무혈청 배지에 추가의 글루코스를 첨가하여, 탄소원의 고갈을 피할 수 있다는 점도 특히 고려된다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 약 5.5 g/L 내지 약 10 g/L의 글루코스 최종 농도에 대해 추가로 1-5 g/L의 글루코스를 포함한다.
이용할 수 있는 철분 결합 물질로는 트랜스페린과 같은 단백질과 트로폴론과 같은 화학적 화합물(예를 들어, 미국등록특허 제5,045,454호; 제5,118,513호; 제 6,593,140호; 및 PCT 공보 WO 01/16294 참조). 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 트랜스페린 대신에 트로폴론 (2-히드록시-2,4,6-시클로헤파트리엔-1) 및 철분 공급원(예를 들어, 구연산 제2철 암모늄, 황산 제2철 암모늄)을 포함한다. 예를 들어, 트로폴론 또는 트로폴론 유도체는 약 5:1 내지 약 1:1의 몰비로 배지 중에 존재하는 철분에 대해 초과의 몰농도로 존재할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 트로폴론 또는 트로폴론 유도체를 약 5:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1.75:1, 또는 약 1.5:1, 또는 약 1.25:1의 몰비로 배지 중에 존재하는 철분에 대해 초과의 몰농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 최종 농도가 0.25 mg/L인 트로폴론 및 최종 농도가 0.20 mg/L인 구연산 제2철 암모늄(FAC)을 포함한다(예를 들어, 표 2 참조)
배지 조성물에 상기 기술된 것과 같은 성분들을 추가하게 되면 삼투압을 변형시킬 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, DMEM/F12에서 통상 발견되는 하나 이상의 성분들의 양을 감소시켜 원하는 삼투압을 유지시킨다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 내에서 염화나트륨(NaCl)의 농도를 감소시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 중 NaCl의 농도는 DMEM/F12에서 통상 나타나는 농도의 약 10% 내지 약 90%, 또는 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 60%이다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 중 NaCl의 최종 농도는 DMEM/F12에서 통상 나타나는 농도의 약 50%이다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 중 NaCl의 최종 농도는 3500 mg/L이다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 중에 존재하는 동물 유래 성분의 수는 최소화하거나 심지어는 동물 유래의 성분을 제거한다. 예를 들어, 비동물성 원천으로부터 유래된 인슐린 및 트랜스페린과 같은 시판되는 재조합 단백질[예컨대, 각각 바이오로지컬 인더스트리스(Biological Industries)사 제조, Cat. No. 01-818-1 및 밀리포어(Millipore)사 제조, Cat. No. 9701]은 동물성 원천에서 유래한 단백질 대신 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 모든 동물 유래의 성분들은 화학적으로 규명된 지질 혼합물의 성분일 수 있는 콜레스테롤을 제외하고는 비동물성 유래의 제품으로 대체된다. 통상적으로 동물성 유래의 제품과 관련된 위험을 최소화하기 위해서, 콜레스테롤은 외래 인자(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 프리온)가 섞이지 않은 지역에 위치한 양의 털로부터 유래할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 표 2에 열거된 MediV SFM 110 배지의 모든 성분들을 지시된 최종 농도로 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 지시된 최종 농도로 표 2에 열거된 MediV SFM 110 배지의 모든 성분들로 필수적으로 이루어진다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 표 2에 열거된 성분들로 이루어진 MediV SFM 110 배지는 본 발명의 무혈청 배지이다.
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6.3.2 비드간 이동( Bead to Bead Transfer )
한 실시 양태에서, 비종양유발성 MDCK 세포는 이들이 부착되는 표면 상에서 부착성 세포로서 배양된다. 조직 배양 세포가 성장될 수 있는 부착성 표면은, 이에 제한되지는 않지만, 표면 개질된 폴리스티렌 플라스틱, 단백질 코팅된 표면(예를 들어, 피브로넥틴 및/또는 콜라겐 코팅된 유리/플라스틱)뿐 아니라, 시판되는 매우 다양한 미세담체[예를 들어, 도르마셀(Dormacell), 파이퍼&란겐(Pfeifer&Langen)의 DEAE-덱스트란(Dextran) 미세담체 비드; 플로우 래버러토리즈(Flow Laboratories)의 수퍼비드(Superbead); 힐렉스(Hillex), 솔로힐(SoloHill), 앤아버의 스티렌 공중합체-트리메틸아민 비드; GE 헬스케어 라이프 사이언스(GE 헬스케어 Life Science)의 사이토덱스(Cytodex) 1 및 사이토덱스 3]를 포함한다. 미세담체 비드는 세포 배양물의 부피에 대한 부착성 세포의 성장을 위해 큰 표면적을 제공하는 작은 구체이다(직경 100-200 미크론 범위). 예를 들어, 배지 1리터는 2천 만개 이상의 미세담체 비드를 포함하여 8000 ㎠를 초과하는 성장 표면을 제공할 수 있다. 부착성 표면의 선택은 비종양유발성 MDCK 세포 배양에 사용되는 방법에 의해 결정된다.
한 실시 양태에서, 미세담체는 약 1 g/L 내지 약 4 g/L의 농도로 사용된다. 또 다른 실시 양태에서, 미세담체는 약 2 g/L 내지 약 3 g/L의 농도로 사용된다. 특정 실시 양태에서 배양 용기(예컨대, 생물반응기)는 배양될 MDCK 세포를 이용하여 약 0.5 내지 약 2×105 세포/㎖의 접종 농도로 씨딩(접종)된다. 특정 실시 양태에서, 접종 농도는 약 0.7 내지 약 1.8×105 세포/㎖, 또는 약 0.8 내지 약 1.6×105 세포/㎖, 또는 약 0.9 내지 약 1.4×105 세포/㎖, 또는 약 1.0 내지 약 1.2×105 세포/㎖이다. 다르게는, 접종 농도는 미세담체 단위 당에 대하여 계산될 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 배양 용기(예컨대 생물반응기)는 배양될 MDCK 세포를 이용하여 약 10 내지 약 40 세포/미세담체, 또는 약 12 내지 약 38 세포/미세담체, 또는 약 14 내지 약 36 세포/미세담체, 또는 약 16 내지 약 34 세포/미세담체, 또는 약 18 내지 약 32 세포/미세담체, 또는 약 20 내지 약 30 세포/미세담체의 접종 농도로 접종된다.
부착성 세포를 2차 배양하는 공정(즉, 세포를 증식시켜 세포 배양물을 증량시키는 것) 동안에는 세포를 융합성 지지 표면(예컨대, 플라스크 표면, 미세담체 등)에서 새로운 지지 표면으로 이동시켜야 한다. 이러한 세포 이동을 수행하기 위해서는 여러 가지 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 플라스크 또는 미세담체로부터 세포를 제거하기 위해서 트립신, TrypLE 및 콜라게나아제와 같은 프로테아제를 사용할 수 있으며, 이렇게 제거한 세포는 필요하다면 세척을 거쳐서 더 큰 플라스크 또는 증식용 배지를 함유하는 더 큰 부피의 미세담체에 희석시켜 넣는다. 이러한 공정은 흔히 배양물을 "분할(splitting)"한다고 지칭하며, 이는 최종 배양물에 대한 원 배양물의 비율로 정량될 수 있다. 예를 들어, 1:8의 분할 비율은 1부의 원 배양물(예컨대, 10 mL)을 7부의 갓 배양된 배지(예컨대, 70 mL)에 첨가하여 80 mL를 만들어 내는 것을 의미한다. 다르게는, 원 배양물 내에 세포수를 측정하여 원하는 접종 밀도 및 최종 배양물의 부피를 바탕으로 희석도를 계산한다. 이러한 용도를 위해서, TrypLE [인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재]와 같은 비동물성 유래의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 다르게는, 미세담체 배양물에서 세포들을 떼어낸 후에 신선한 배지 및/또는 미세담체 비드를 배양물에 첨가할 수도 있다. 일부 실시 양태에서, 프로테아제로 처리된 배양물은 신선한 배지 및/또는 미세담체의 첨가 전, 첨가 시 또는 첨가 후에 더 큰 배양 용기로 옮긴다.
특정 실시 양태에서, 미세담체 상에서 부착성 세포로서 성장하는 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)의 세포 배양물은 프로테아제(예를 들어, TrypLE)로 처리된다. 상기 프로테아제를 필요에 따라 불활성화한 후[예를 들어, 리마콩(lima bean) 트립신 억제제와 같은 프로테아제 억제제의 첨가에 의한 불활성화], 신선한 배지 및/또는 미세담체 비드를 상기 배양물에 첨가할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 프로테아제로 처리된 배양물은 신선한 배지 및/또는 미세담체의 첨가 전, 첨가 시 또는 첨가 후에 더 큰 배양 용기로 옮긴다.
비드간 이동 방법에서 프로테아제를 사용하면 세포 퍼짐이 불량하고 세포수가 적게 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 필요한 프로테아제의 양을 최소화하거나 심지어 제거하여, 비드간 이동을 촉진시킬 수 있는 비드간 이동 수행법을 제공한다(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 실시예 섹션 8.2에 예시된 방법, 실시예 섹션 8.1에서도 이용됨). 특히, 본 발명자들은 킬레이트제를 이용한 예비처리, 특히 세포의 증식을 위해 사용된 것보다 더 높은 pH에서의 예비처리에 의해서, 미세담체로부터 세포를 분리하는데 필요한 프로테아제의 양을 20배 이상 감소시킬 수 있음을 밝혀냈다.
일부 실시 양태에서, 비드간 이동은 프로테아제(예컨대, TrypLE)를 첨가하기 전에 킬레이트제를 이용해 세포를 예비처리함으로써 촉진된다. 다른 실시 양태에서, 비드간 이동은 킬레이트제(예컨대, EDTA)를 첨가한 후 세포 증식에 이용되는 pH를 초과하는 pH로 배양시킴으로써 촉진될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 미세담체 상에서 부착성 세포로 성장하는 비종양유발성 MDCK 세포의 세포 배양물은 프로테아제를 첨가하기 전 세포를 증식하는 동안 사용되는 pH보다 높은 pH로 킬레이트제(예컨대, EDTA)를 사용하여 처리된다. 특정 실시 양태에서, pH를 모니터링하여 필요에 따라 조절해 미세담체 기질로부터 세포 분리를 촉진시킨다. 세포들이 분리된 후에는, 신선한 배지 및/또는 미세담체 비드를 배양물에 첨가한다. 일부 실시 양태에서, 원래의 미세담체가 존재하는 배양물 또는 원래의 미세담체가 존재하지 않는 배양물은 신선한 배지 및/또는 미세담체를 첨가하기 전에, 첨가와 동시에 또는 첨가 후에 더 큰 배양 용기로 옮긴다.
특정 실시 양태에서, 세포들을 떼어내기 이전에 세척 배지(예컨대, 완충염 용액)를 사용하여 세척한다. 세포를 세척하는데 유용한 배지로는, 이에 제한되지는 않지만, 헤페스 완충 용액(Hepes-Buffered solution), 인산염 완충 식염수(Phosphate-Buffered Saline), 둘베코의 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 행크의 평형 염류액(Hank's Balanced Salt Solution), 얼의 평형 염류액(Earle's Balanced Salt Solution)을 포함한다. 세포를 세척하는 공정은 배지(증식 배지 및/또는 세척 배지)의 일부 또는 모두를 신선한 세척 배지(즉, 완충염 용액)로 대체하는 단계를 수반한다. 상기 공정은 여러 번 반복할 수 있다. 일반적으로, 미세담체 비드를 자리를 잡도록 한참 동안(예를 들어, 10분 내지 40분) 두고 증식 배지를 용기로부터 제거한다. 선택적으로, 세포 배양물로부터 배지를 제거하는 작업은, 낮은 전단력을 갖는 교차 접선 흐름식 장치(alternating low shear tangential flow device)를 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 미국등록특허 제6,544,424호 참조). 특정 실시 양태에서, 세척하는 단계에서 약 50% 내지 약 90%의 배지(성장 배지 및/또는 세척 배지)가 제거된다. 특정 실시 양태에서, 배지는 제거된 배지 부피보다 적거나, 제거된 배지 부피와 동일하거나, 또는 제거된 배지 부피보다 많은 부피의 세척 배지(즉, 완충염 용액)로 대체된다. 한 실시 양태에서, 세척 배지는 생성되는 세포 배양물의 부피가 원래의 세포 배양물의 작업 부피의 약 25% 내지 약 100%가 되도록 첨가된다. 특정 실시 양태에서, 세척 배지는 원래의 세포 배양물의 작업 부피의 약 40% 내지 약 60%로 첨가된다. 다른 특정 실시 양태에서, 세척 배지는 원래의 세포 배양물의 작업 부피의 약 90% 내지 약 100%로 첨가된다. 특정 실시 양태에서, 세포는 2회 이상 세척한다.
특정 실시 양태에서, 세척 배지는 킬레이트제를 포함한다. 사용될 수 있는 킬레이트제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPA), 에틸렌비스(옥시에틸렌-트리니트릴로)테트라아세트산(EGTA)를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 특정 실시 양태에서, 세척 배지는 킬레이트제를 약 0.25 mM 내지 약 0.75 mM의 농도로 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 세척 배지는 킬레이트제를 약 0.4 mM 내지 약 0.6 mM의 농도로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 세척 배지는 킬레이트제를 약 0.5 mM의 농도로 포함한다.
한 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지의 pH는 약 7.6 내지 약 8.4이다. 특정 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지의 pH는 약 7.8 내지 약 8.2이다. 다른 특정 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지의 pH는 약 7.9 내지 약 8.1이다. 킬레이트제를 포함하는 세척 배지를 세포 배양물에 첨가하면 세척 배지 중에 생성되는 세포 배양물의 pH를 변화시킬 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지로 세척되는 세포 배양물의 pH는, 필요하다면, 세포 배양물에 세척 배지를 첨가한 후에 약 7.6 내지 약 8.4로 조절한다. 특정 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지로 세척되는 세포 배양물의 pH는, 필요하다면, 세포 배양물에 세척 배지를 첨가한 후에 약 7.8 내지 약 8.2로 조절한다. 다른 특정 실시 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 세척 배지로 세척되는 세포 배양물의 pH는, 필요하다면, 세포 배양물에 세척 배지를 첨가한 후에 약 7.9 내지 약 8.1로 조절한다.
특정 실시 양태에서, 세포 배양물은 킬레이트제를 포함하는 세척 배지의 첨가 후, 그리고 추가의 세척 단계 및/또는 프로테아제의 첨가 전에 교반된다. 배양물 교반은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 휘젓기, 흔들기, 회전 등을 이용하여 수행될 수 있다. 교반 작업의 속도 및 지속 시간은 배양물의 부피, 세척 배지의 성분 및 세포 배양물 중의 세포 유형에 따라 결정된다. 특정 실시 양태에서, 세포 배양물은 세포의 증식에 사용되는 것과 비슷한 속도로 교반된다. 다른 실시 양태에서, 세포 배양물은 세포의 증식에 사용되는 것보다 빠른 속도로 교반된다. 더 빠른 교반 속도가 이용되는 경우, 그 속도는 약 10% 내지 약 90%, 또는 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 65%로 증가된다. 특정 실시 양태에서, 사용되는 교반 속도는 약 40% 내지 약 65%이다. 특정 실시 양태에서, 세포 배양물은 약 5분 내지 약 60분 동안 교반된다. 특정 실시 양태에서, 세포 배양물은 약 20분 내지 약 40분 동안 교반된다.
특정 실시 양태에서, 프로테아제(예를 들어, 세린 프로테아제)는 세척 중에 세포 배양물에 첨가하나, 한번이라도 교반한 후에 첨가한다. 특정 실시 양태에서, 세포들은 2회 이상 세척하며, 프로테아제는 한번이라도 교반한 후 마지막 세척 단계를 시행하는 동안에 첨가한다. 본 발명의 한 측면에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제, 또는 아스파라긴 프로테아제이다. 특정 실시 양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, TrypLE 등)이다. 다른 실시 양태에서, 미국등록특허출원 제11/455,818호에 기술된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로테아제가 사용된다. 트립신은 동물성 공급원, 또는 보다 바람직하게는, 재조합체 공급원으로부터 유래할 수 있다. 이러한 조건 하에 분리를 수행하기 위해 첨가된 프로테아제의 양은, 세포를 킬레이트제로 예비처리 하지 않은 경우에는 필요한 양보다 적어도 5X 이하로 하며, 배양물의 부피 및 프로테아제의 농도에 의해 결정될 것이다. 예로서, 시판되는 TrypLE™ 익스프레스(Express)(10X 저장액으로 제공됨)는 일반적으로 약 1X의 최종 농도로 사용되어(예를 들어, Invitrogen™ TrypLE 선별 제품 소개 참고) MDCK 세포와 같은 고부착성 세포를 분리하였다. 본원에서 입증된 바와 같이(섹션 8.2 참조), 미세담체로부터 세포를 분리시키는데 필요한 TrypLE™의 최종 농도는 0.05X로서 20배 감소한 수치이다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 세포 배양물에 첨가되는 프로테아제의 최종 농도는 약 0.5X, 또는 약 0.1X, 또는 약 0.09X, 또는 약 0.08X, 또는 약 0.07X, 또는 약 0.06X, 또는 약 0.05X, 또는 약 0.04X, 또는 약 0.02X이며, 여기에서 1X는 동일한 해리 조건 하에서 킬레이트제로 예비처리를 하지 않은 세포를 분리해 내는데 필요한 프로테아제의 최종 농도를 의미한다.
한 실시 양태에서, MDCK 세포는 배양 시스템 내에서 부착성 세포로 배양된다. MDCK 세포를 배양하기 위해 이용될 수 있는 배양 시스템은, 예를 들어, 출발 배지에서 영양분이 고갈되는 경우에 추가의 영양분(예를 들어, 탄소 공급원, 아미노산 등)을 첨가하여 높은 세포 밀도로 증식을 촉진하는 회분식(batch) 배양 시스템 및 유가식 배양(fed bacth culture) 시스템을 포함한다. 다르게는 또는 선택적으로, 관류식 배양 시스템(예를 들어, 원심 분리, 여과, 스핀 여과기 등 세포 체류 시스템 이용)이 배지 교환 및/또는 고갈된 영양분의 보충을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 비종양유발성 MDCK 세포는 본 발명의 무혈청 배지(예컨대, MediV SFM 110)를 사용하여 배지 교환/보충(예를 들어, 주입식 또는 관류식)이 없는 회분식 배양 시스템에서 부착성 세포로서 배양된다. 부착성 세포로서 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)를 배양하는 것과 관련된 추가적인 지침 내용에 대해서는, 예를 들어, 미국공개특허 제2003/0108860호 및 제2005/0118140호 및 PCT 공보 WO 2008/105931에서 찾을 수 있다. MDCK 세포의 배양을 위해 유용하게 흔히 사용되는 배양 시스템은 교반형 용기 생물반응기를 포함한다.
6.3.3 인플루엔자 바이러스 배양 조건
본 발명은 상기 기술된 바와 같이 무혈청 배지 조성물 중에서 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포) 및 다른 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 특히, 추가적인 배양 조건은 MDCK 세포의 특성, 예컨대 비종양유발성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세포로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스)의 증식을 높은 역가(예를 들어 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 9.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖)까지 지원하는 등의 특성을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 이들 배양 조건은, 이에 제한되지는 않지만, 정선된 부착성 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 교반 속도, 배양 방법, 용존 산소량 및 pH를 포함한다.
특히, 배양 조건은 MDCK 세포(예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포)의 성장을 최적화하기 위해 다양한 방법으로 조정할 수 있다. 이러한 조정을 통하여, 예를 들어, 미국공개특허 제2005/0118698호에 기술된 것과 같이 바이러스 물질(예컨대, 바이러스)의 생산량을 증가시킬 수도 있다. 다르게는, 배양 조건을 조정하여 세포 성장과 관계없이 MDCK 세포로부터 백신 물질의 생산을 최적화할 수 있다. 이들 배양 조건은, 이에 제한되지는 않지만, 부착성 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 배양 방법, 용존 산소량 및 pH를 포함한다.
한 실시 양태에서, MDCK 세포(예컨대, 비종양유발성 MDCK 세포)는 1% 이상, 또는 2% 이상, 또는 3% 이상, 또는 4% 이상, 또는 5% 이상, 또는 6% 이상, 또는 7% 이상, 또는 8% 이상, 또는 9% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상의 CO2 농도에서 배양된다.
한 실시 양태에서, 용존 산소량 (DO) 농도(pO2 값)는 MDCK 세포를 배양하는 동안 유리하도록 조절되며, 그 범위는 5% 내지 100% (공기 포화도를 기준으로 함), 또는 10% 내지 60%이다. 특정 실시 양태에서, 용존 산소량 (DO) 농도(pO2 값)는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상이다. 특정 실시 양태에서, DO 농도는 50%로 유지된다. 특정 실시 양태에서, DO는 50%로 낮아진 후에 그 수준에서 유지된다. DO 수준을 유지하는 방법으로는, 예를 들어, 순수한 산소를 살포하는 방법을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 비종양유발성 MDCK 세포의 배양에 사용되는 배양 배지의 pH는 배양하는 동안에 조절되며, pH 6.4 내지 pH 8.0 범위, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.4 범위이다. 특정 실시 양태에서, 배양 배지의 pH는 약 6.4, 또는 약 6.6, 또는 약 6.8, 또는 약 7.0, 또는 약 7.2, 또는 약 7.4, 또는 약 7.6, 또는 약 7.8 이상, 또는 8.0 이상이다. 특정 실시 양태에서, 배양 배지의 pH는 약 7.4이다.
추가의 실시 양태에서, MDCK 세포는 본 발명의 무혈청 배지 내에서 25℃ 내지 39℃의 온도로 배양된다. 특히, 배양 온도는 원하는 공정에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 비종양유발성 MDCK 세포는 세포의 증식을 위해서는 37±2℃에서, 그리고 백신 물질(예컨대, 바이러스)의 생산을 위해서는 이보다 낮은 온도(예컨대, 25℃ 내지 35℃)에서 성장할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃ 이하, 또는 31℃ 이하, 또는 32℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 34℃ 이하의 온도에서 배양된다. 또 다른 실시 양태에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃, 또는 31℃, 또는 32℃, 또는 33℃, 또는 34℃의 온도에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 33±2℃의 온도에서 배양된다.
특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 교반형 용기 생물반응기(예컨대, 일회용 플라스틱, 재사용가능한 유리 또는 스테인리스강 생물반응기) 내의 본 발명의 무혈청 배지 중에서 배양되며, 온도, 교반 속도, pH, 용존 산소량(DO), O2 및 CO2의 유속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 매개변수가 모니터링 및/또는 제어된다. 한 실시 양태에서, 온도는 약 3O℃ 내지 약 42℃, 또는 약 33℃ 내지 약 39℃, 또는 약 35℃ 내지 약 38℃로 유지된다. 특정 실시 양태에서, 온도는 약 36℃ 내지 약 38℃로 유지된다. 한 실시 양태에서, 교반 속도는 약 100 내지 200 rpm으로 유지된다. 구체적인 실시 양태에서, 일회용 생물반응기가 사용되며, 교반 속도는 약 80 내지 약 120 rpm, 또는 약 90 내지 약 100 rpm으로 유지된다. 다른 특정 실시 양태에서, 재사용가능한 생물반응기가 사용되며, 교반 속도는 약 150 내지 약 200 rpm, 또는 약 160 내지 약 180 rpm으로 유지된다. 교반 속도는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 조절된다. 사용되는 생물반응기의 유형 및 크기뿐 아니라 사용되는 교반 날개의 유형과 수에 있어서, 세포 증식을 최대화하고/하거나 세포 손상을 최소화하기 위해 교반 속도 조절이 필요할 수 있다.
다른 실시 양태에서, MDCK 세포 배양물의 pH는 약 6.4 내지 약 8.0으로 유지된다. 구체적인 실시 양태에서, 배양 개시 시점의 pH는 약 6.8 내지 약 7.6이고, 배양 중에는 배양물의 pH가 약 7.0 내지 약 7.5로 유지된다. 개시 pH는 상기 바람직한 범위보다 더 낮거나 높을 수 있으며, 이러한 pH는 바람직한 수준(예를 들어, 7.4)으로 높이거나 낮추어 그 수준에서 유지시키는 것도 가능하다. 특정 실시 양태에서, pH는 약 7.4로 유지된다. pH는 필요하다면 CO2의 살포 및/또는 산의 첨가(예를 들어, HCL) 또는 염기의 첨가(예를 들어, NaOH, NaHCO3, Na2CO3)에 의해 조절될 수 있다.
추가의 또 다른 실시 양태에서, 허용가능한 DO 범위는 약 100% 내지 약 35%이다. 특정 실시 양태에서, MDCK 세포 배양물의 DO는 약 35% 내지 약 50%, 또는 약 50%로 유지된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, DO는 약 35% 미만으로 떨어져서는 안된다. 특정 실시 양태에서, 개시 DO는 100%일 수 있으며, DO는 미리 결정된 수준(예컨대, 50%)로 떨어뜨려 그 수준에서 유지되는 것도 가능하다. DO는 예를 들어 O2를 살포함으로써 유지된다. 특정 실시 양태에서, O2의 유속은 약 2.0 L/분 이하로 유지된다. 특정 실시 양태에서, CO2의 유속은 약 0.4 L/분 이하로 유지된다. 또 다른 실시 양태에서, 일정한 총 유속이 유지되며(예를 들어, 40 mL/분), 유속을 유지하기 위해 N2 기체를 공급한다. 따라서, N2 기체의 공급량은 DO 및 pH를 유지하는데 사용되는 O2 및 CO2로부터 계산될 수 있다.
글루코스, 글루타민, 락테이트, 다른 배지 성분들의 함량뿐 아니라, 배지의 pH와 pO2 값, 그리고 교반 속도와 같은 기타 매개변수는 세포 밀도 및/또는 바이러스 생산이 최적화되도록 비종양유발성 MDCK 세포 배양시 용이하게 조작할 수 있다.
6.3.4 호흡기 세포융합 바이러스 배양 조건
특정 실시 양태에서, 세포는 특정한 총 생존 세포수를 달성하기 위해 본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 감염시키기 전에 배양된다. 예를 들어, Vero 세포는 4 mM의 L-글루타민과 1%의 CDLC로 보충된 VP-SFM 중(약 37℃)에서 배양하여, 총 생존 세포수와 세포 생존율을 측정할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 특정한 평균 생존 세포수가 달성이 되면 세포를 세포 회합 바이러스로 감염시킨다. 예를 들어, RSV와 같은 본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 약 1.5×108 또는 그 이상의 세포/조직 배양 용기의 평균 생존 세포수가 달성될 수 있다. 한 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 약 1×106 내지 또는 약 1×1014 세포/조직 배양 용기의 평균 생존 세포수(예를 들어, Vi-세포 계수기를 이용하여 측정시)가 달성된다. 다른 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 약 1×106 세포/조직 배양 용기, 약 5×106 세포/조직 배양 용기, 약 1×107 세포/조직 배양 용기, 약 5×107 세포/조직 배양 용기의 평균 생존 세포수(예를 들어, Vi-세포 계수기를 이용하여 측정시)가 달성된다. 또 다른 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 약 1×108 세포/조직 배양 용기, 약 5×108 세포/조직 배양 용기, 약 1×109 세포/조직 배양 용기, 약 5×109 세포/조직 배양 용기, 약 1×1010 세포/조직 배양 용기의 평균 생존 세포수(예를 들어, Vi-세포 계수기를 이용해 측정시)가 달성된다.
선택된 세포에 대해 최적의 조건으로 결정된 감염다중도(MOI: multiplicity of infection)를 사용해 세포를 감염시킨다. 특정 실시 양태에서, 약 0.0001 내지 약 1, 또는 약 0.0005 내지 0.005의 MOI를 사용하여 본원에 기술된 세포를 감염시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 약 0.0001, 약 0.0005 또는 약 0.00075의 MOI를 사용하여 본원에 기술된 세포를 감염시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 약 0.001, 약 0.005, 약 0.0075 또는 약 0.01의 MOI를 사용하여 본원에 기술된 세포를 감염시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 약 0.05, 약 0.075, 약 0.1 또는 약 0.5의 MOI를 사용하여 본원에 기술된 세포를 감염시킨다. 특정 실시 양태에서, 약 0.01의 MOI를 갖는 rA2cp248/404/1030ΔSH를 사용하여 Vero 세포를 감염시킨다.
세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 선택된 세포주에 대해 적절한 배지 및 조건(예컨대, 온도 CO2 조건 및 pH) 하에 일정 시간 동안 배양되어 최적의 바이러스 역가 수율을 나타낼 수 있다. 예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH와 같은 RSV로 감염된 Vero 세포는 4 mM의 L-글루타민으로 보충된 SF4MegaVir 배지(인비트로겐 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 중에서 배양하고, 바이러스를 수거하기 전에 CO2 없이 30℃에서 약 10일간 배양한다. 일부 실시 양태에서, RSV로 감염된 세포(예컨대, RSV로 감염된 Vero 세포)는 바이러스를 수거하기 전에 약 8일 내지 14일간 배양한다. 특정 실시 양태에서, RSV로 감염된 세포는 바이러스를 수거하기 전에 약 8일간, 바람직하게는 약 9일간, 약 10일간, 약 11일간, 또는 약 12일간 배양한다.
본원에 기술된 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 당업자에게 공지된 임의의 조직 배양 용기 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 T-75 플라스크 또는 T-225 플라스크 중에서 배양된다. 다른 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 1리터, 2리터, 3리터, 4리터, 또는 5리터의 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 40 500㎖ 이상의 작업 부피를 갖는 롤러병(roller bottle) 중에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 롤러병과 같은 4리터의 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 다른 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 10리터, 15리터, 20리터, 또는 25리터의 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 다른 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 50리터, 75리터, 또는 100리터의 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 다른 실시 양태에서, 세포 회합 바이러스로 감염된 세포는 250리터, 500리터, 또는 1000리터의 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 사용될 수 있는 조직 배양 용기로는, 플라스크, 롤러병, 생물반응기 및 당업자에게 공지된 임의의 기타 조직 배양 용기들을 포함한다.
6.4 백신 물질의 제조
본 발명은 MDCK 세포(예컨대, 비종양유발성 MDCK 세포)가 바이러스 제조를 위해 사용되는 세포 배양물 중에서 바이러스를 생산하는 확실한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 배지 교환 또는 보충 없이 인플루엔자 바이러스를 높은 역가로 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시 양태에서, 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 약 100 내지 200 rpm의 교반 속도, 약 6.0 내지 약 7.8의 pH, 약 33℃ 내지 약 42℃의 온도 및 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배양 조건을 유지하면서, 무혈청 배양 배지 중에서 MDCK 세포를 증식시키는 단계;
(b) 배양 배지의 교환 없이 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; 및
(c) 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 배양시키는 단계.
본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 인플루엔자 바이러스는 본원에 기술되어 있으며(예를 들어, 섹션 7.2 및 6.7), 이에 제한되지는 않지만, 약독화성, 온도 감수성, 저온 적응성(ca/ts/att)을 갖는 마스터 도너(master donor) 바이러스와 관련하여 선택된 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다아제 항원을 혼입시킨 재배열 바이러스를 포함한다. 바이러스는 예를 들어, 온도 감수성(ts), 저온 적응성(ca), 또는 약독화성(att)의 특성 중의 하나 이상의 특성을 갖는 마스터 도너 바이러스(예를 들어, A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, PR8, B/레닌그라드/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/레닌그라드/179/86, B/레닌그라드/14/55, B/잉글랜드/2608/76 등)의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 단편)을 포함할 수 있다. 난세포(egg) 또는 세포주에서 재배열 인플루엔자 백신 균주를 생산하는 방법으로는, 예를 들어, 문헌 [Kilbourne, E.D. in Vaccines(2nd Edition), ed. Plotkin and Mortimer, WB Saunders Co.(1988)]에 개시된 방법들, PCT 특허공보 WO 05/062820와 WO 03/091401, 그리고 미국등록특허 제6,951,754호, 제6,887,699호, 제6,649,372호, 제6,544,785호, 제6,001,634호, 제5,854,037호, 제5,824,536호, 제5,840,520호, 제5,820,871호, 제5,786,199호 및 제5,166,057호와, 미국공개특허 제20060019350호, 제20050158342호, 제20050037487호, 제20050266026호, 제20050186563호, 제20050221489호, 제20050032043호, 제20040142003호, 제20030035814호 및 제20020164770호에 개시된 방법들을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 다른 인플루엔자 바이러스로서는 이종성 유전자 산물을 발현할 수 있는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다(예를 들어, 미국공개특허 제2004/0241139호 및 제2004/0253273호 참조). 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 인플루엔자 바이러스는 약 8.0 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖ 이상의 피크 바이러스 역가로 제조된다. 다른 실시 양태에서, 인플루엔자 바이러스는 약 8.1 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.3 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.5 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.7 이상, 또는 8.8 이상, 또는 8.9 이상, 또는 9.0 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/㎖ 이상의 피크 바이러스 역가로 제조된다.
특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 부착성 세포로서 증식된다. 특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 비종양유발성 세포이며, 부착성 세포로서 증식된다. 다른 특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 ATCC 수탁번호 PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502, PTA-6503, PTA-7909 및 PTA-7910으로 이루어진 군으로부터 선택되어, 부착성 세포로서 증식된다. 부착성 세포를 증식하는데 유용한 생물반응기 및 방법은 상기에 기술하였다(섹션 0 및 0 참조). 다른 실시 양태에서, MDCK 세포는 비부착성 세포로서 증식된다. 비부착성 MDCK 세포를 증식하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국등록특허 제6,455,298호를 참조한다. 추가의 배양 조건, 예컨대 온도, 교반 속도, pH, pO2, CO2 농도 및 세포 접종 농도에 대해서는 상기에 상술하였다(섹션 0 및 0 참조).
특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 교반형 용기 생물반응기 중에서 부착성 세포로서 증식된다. 본 발명의 특정 실시 양태에서, 세포를 배양하기 위한 온도, 교반 속도, pH, pO2, CO2 농도 및 다른 매개변수들은 상기 기술된 바와 같이 배양하는 동안에 조절된다(섹션 0 및 0 참조). 특정 실시 양태에서, MDCK 세포는 약 5×105 내지 약 3×106의 세포 밀도로 증식된다. 다르게는, 또는 선택적으로 MDCK 세포는 지정된 시간 동안 증식된다. 개시 접종 밀도, 배가 시간 및 원하는 최종 세포 밀도가 증식 시간을 결정할 것이다. 이러한 실시 양태에서, 세포는 예를 들어, 1일 내지 10일간, 또는 2일 내지 8일간, 또는 3일 내지 7일간 증식될 수 있다. 일부 실시 양태에서, MDCK 세포는 약 3일 내지 약 5일간 증식된다.
특정 실시 양태에서, 무혈청 배지는 본원에 기술된 바와 같이 강화된 무혈청 배지이다(섹션 0 참조). 한 실시 양태에서, 무혈청 배지는 식물 가수분해물, 지질 보충물, 미량 원소를 포함하며, 푸트레신, 아미노산, 비타민, 지방산 및 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분으로 강화된다. 또 다른 실시 양태에서, 무혈청 배지는 표 2에 열거된 MediV SFM110 배지의 모든 성분들을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 무혈청 배지는 표 2에 열거된 MediV SFM110 배지의 모든 성분들로 필수적으로 이루어진다. 다른 특정 실시 양태에서, 무혈청 배지는 지시된 최종 농도로 표 2에 열거된 MediV SFM 110 배지의 성분들로 이루어진다. 특정 실시 양태에서, 무혈청 배지는 약 4.5 g/L의 최종 농도로 글루코스를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 무혈청 배지는 약 9.0 g/L의 최종 농도로 글루코스를 포함한다.
세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 인플루엔자 바이러스로는, 이에 제한되지는 않지만, 본원에 기술한 것들을 포함한다(예컨대, 섹션 7.2 및 참조 소스 확인되지 않음). 세포를 감염시키기 위해 첨가될 바이러스의 양(본원에선 "바이러스 투입량"으로도 지칭됨)은 세포당 첨가되는 바이러스의 수(흔히 감염다중도, 즉 MOI로서도 지칭됨)로서 측정된다. 일부 실시 양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 약 0.00001 FFU/세포 내지 약 10 FFU/세포, 또는 약 0.00001 FFU/세포 내지 약 1 FFU/세포, 또는 약 0.00001 FFU/세포 내지 약 0.1 FFU/세포, 또는 약 0.00001 FFU/세포 내지 약 0.001 FFU/세포의 바이러스 투입량을 이용하여 수행된다. 한 실시 양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 약 0.00001 FFU/세포 내지 약 0.0001 FFU/세포, 또는 약 0.00002 FFU/세포 내지 약 0.0002 FFU/세포의 바이러스 투입량을 이용하여 수행된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 0.00001 FFU/세포 내지 0.00005 FFU/세포의 바이러스 투입량을 이용하여 수행된다. 다른 특정 실시 양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 0.0001 FFU/세포 내지 0.0005 FFU/세포의 바이러스 투입량을 이용하여 수행된다. 첨가될 바이러스의 양을 결정하는데 하기의 식을 이용할 수 있다: 바이러스의 양(μL) = 총 세포 × 바이러스 투입량(FFU/세포)/10바이러스 FFA 역가(FFU/㎖) × 1000
다르게는, 세포를 감염시키는데 사용되는 바이러스의 양(즉, 바이러스 투입량)은 배양물 중 바이러스의 최종 농도에 의해 결정된다. 예를 들어, 바이러스는 약 1×103 FFU/㎖ 내지 약 0.001×103 FFU/㎖, 또는 약 0.1×103 FFU/㎖ 내지 약 0.01×103 FFU/㎖의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 첨가되는 바이러스의 양을 결정하는데 하기의 식을 이용할 수 있다: 바이러스의 양(μL) = 배양물의 부피(mL) × 최종 농도(FFU/㎖)/10바이러스 FFA 역가(FFU/㎖) × 1000
선택적으로, 헤마글루티닌의 전구체 단백질[HA0]을 분해시켜서 세포 상에 바이러스를 흡착시킬 수 있는 프로테아제를 첨가할 수 있다. 프로테아제의 첨가는 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키기 직전에, 그와 동시에, 또는 그 직후에 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 감염과 동시에 첨가하는 경우, 프로테아제는 감염시키려는 세포 배양물에 직접 첨가할 수 있거나, 또는 예를 들어, 바이러스 접종물과 함께 농축물로서 첨가할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제, 또는 아스파라긴 프로테아제이다. 한 실시 양태에서, 트립신이 사용된다. 특정 실시 양태에서, TPCK-처리된 트립신이 사용된다. 한 실시 양태에서, 트립신은 1 내지 5000 mU/㎖, 또는 5 내지 1000 mU/㎖, 또는 100 내지 500 mU/㎖의 최종 농도로 세포 배양물에 첨가된다. 대안적인 실시 양태에서, 트립신은 배양 배지 중에 1 내지 200 ㎍/㎖, 또는 5 내지 50 ㎍/㎖, 또는 5 내지 30 ㎍/㎖의 최종 농도로 세포 배양물에 첨가된다.
프로테아제는 동물성 공급원, 또는 보다 바람직하게는, 재조합체 공급원으로부터 유래할 수 있다. 사용하기에 적절한 재조합 프로테아제는 여러 가지 상업적 공급원, 예를 들어 인비트로겐 (TrypLE™) 및 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (TrypZean™)로부터 저장액(예컨대, 1X-100X)으로 쉽게 얻을 수 있다. 특정 실시 양태에서, 재조합 프로테아제는 약 0.01X 내지 약 1X, 또는 약 0.02X 내지 약 0.8X, 또는 약 0.03X 내지 약 0.7X, 또는 약 0.04X 내지 약 0.6X, 또는 약 0.05X 내지 약 0.5X, 또는 약 0.06X 내지 약 0.4X, 또는 약 0.07X 내지 약 0.3X, 또는 약 0.8X 내지 약 0.2X의 최종 농도로 사용된다. 특정 실시 양태에서, 재조합 프로테아제는 약 0.02X 내지 약 0.06X의 최종 농도로 사용된다. 또 다른 실시 양태에서, 프로테아제는 재조합 트립신 유사 프로테아제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, TrypLE™ (인비트로겐)이다. 또 다른 실시 양태에서, 프로테아제는 미국특허출원 제11/455,818호에 기술된 것과 같은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 유래한다.
감염 후, 상기 감염된 세포 배양물은 특히 최대 세포 변성 효과, 또는 바이러스 혹은 바이러스 항원의 최대량이 검출될 수 있을 만큼의 바이러스를 복제시키기 위해 추가로 배양된다. 한 실시 양태에서, 세포는 감염 후 30℃ 내지 37℃의 온도에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 세포는 바이러스로 감염된 후 39℃ 이하, 또는 38℃ 이하, 또는 37℃ 이하, 또는 36℃ 이하, 또는 35℃ 이하, 또는 34℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 32℃ 이하, 또는 31℃ 이하, 또는 30℃ 이하의 온도에서 배양된다. 33℃ 미만의 온도, 그 중에서도 상기 지정된 온도 범위에서 상기 감염된 세포를 배양할 경우, 특정 인플루엔자 바이러스, 예컨대, B형 균주(예를 들어, 미국공개특허 제2006/0153872호 참조)를 보다 높은 수율로 생산할 수 있다. 추가로, 온도 감수성, 저온 적응성(ts/ca) 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해서는 35℃ 미만의 온도에서 감염된 세포를 배양할 수 있다는 점도 고려된다. ts/ca 바이러스는 약독화성(att)일 수도 있음도 고려된다. 다른 실시 양태에서, 세포는 ts/ca 인플루엔자 균주를 생산하기 위해 30℃ 이하, 또는 31℃ 이하 또는 32℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 34℃ 이하의 온도에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 세포는 B형 인플루엔자 바이러스 균주를 생산하기 위해 31℃의 온도에서 배양된다. 또 다른 실시 양태에서, 세포는 감염 후 31±2℃의 온도에서 배양된다.
특정 실시 양태에서, 세포의 배양(단계 (c))은 적절한 바이러스 수율을 내기에 충분한 시간 동안, 예컨대 감염 후 2일 내지 10일간, 또는 선택적으로 3일 내지 7일간 수행된다. 본 발명의 방법의 한 실시 양태에서, 세포의 배양(단계 (c))은 감염 후 2일간, 또는 3일간, 또는 4일간, 또는 5일간, 또는 6일간, 또는 7일간 수행된다. 다른 실시 양태에서, 세포의 배양(단계 (c))은 감염 후 40시간 내지 96시간 동안 수행된다. 특정 실시 양태에서, 세포의 배양(단계 (c))은 감염 후 약 48시간 내지 약 72시간 동안 수행된다.
본 발명의 방법의 특정 실시 양태에서, 세포는, 예를 들어, 교반 속도, pH, pO2 값, CO2 농도 및 다른 매개변수들이 상기 기술된 바와 같이 유지되도록, 바이러스를 이용하여 감염시키는 단계(단계 (b)) 후에 배양시킬 수 있다(섹션 0 및 0 참조).
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에, 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지(즉, 감염된 세포들이 성장한 배양 배지)를 수거하는 단계를 더 포함한다. 상기 수거한 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지는 본원에서 "바이러스 수확물"로도 지칭된다.
한 실시 양태에서, MDCK 세포의 증식에 사용되는 임의의 미세담체는 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지를 수거하기 전에 자리를 잡도록 해준다. 선택적으로, 또는 다르게는, 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지는 낮은 전단력을 갖는 교차 접선 흐름(ATF) 장치를 이용하여 수거할 수 있다(예를 들어, 미국등록특허 제6,544,424호 참조). ATF 장치를 사용하면 수거 단계 이전에 미세담체가 자리를 잡는데 필요한 시간을 감소시키거나, 또는 심지어는 그러한 시간이 필요치 않게 된다. 또 다른 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 적절한 버퍼를 사용하여 안정화된다.
특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 농축 버퍼, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 안정화된 바이러스 수확물 중에 약 218 mM의 최종 농도를 갖는 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)일 수 있는 수크로스 인산염(SP) 버퍼를 첨가하여 안정화된다.
다른 특정 실시 양태에서, 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지를 수거하는 단계는 복제된 바이러스를 정제하는 단계와 커플링된다. 예를 들어, 교차 접선 흐름(ATF)을 사용하여 복제된 바이러스를 포함하는 배양 배지를 수거할 수 있으며, 상기 수거된 물질에 대해 하기 상술된 하나 이상의 정제 단계를 직접 수행할 수 있다.
6.5 백신 물질의 정제
본 발명은 바이러스, 특히 세포 배양물에서 복제된 임상용 생균 바이러스를 정제하는 확실한 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 방법은 포유동물 세포, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 인간 복상 폐 섬유아세포 세포주(예컨대, MRC-5 및 WI-38), 인간 망막아종 세포주, 인간 신장 세포주(예컨대, PER.C6 및 293), 붉은털원숭이 태아 폐 세포주(예컨대, FRhL2), 아프리카 녹색 원숭이 세포주(예컨대, Vero) 및 개의 신장 세포주(예컨대, MDCK)의 배양물에서 바이러스를 정제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 정제 방법은 바이러스, 특히 생균 바이러스에 전반적으로 높은 회수율을 제공하며, 숙주 세포 DNA (HCD), 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 비특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대 벤조나아제)의 수준을 규제 당국에서 요구하는 규정 사양 미만으로 할 수 있다.
바이러스 조제물로부터 HCD의 양을 감소시키는 일은 동물(인간 포함)에서 임상용으로 이용하려는 바이러스에 있어서는 특히 중요하다. 게다가, 잔류할 수 있는 HCD의 크기는 종양유발 잠재력을 감소시키기 위해 종양유전자의 평균 크기(1,925 염기쌍)보다 작아야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 잔류할 수 있는 HCD의 양과 크기를 주사용 백신으로서 허용가능한 수준 미만(WHO 권고 사항은 비경구 투여되는 백신에 있어서는 투여량 당 10 ng임; 문헌 [Griffiths, 1999, Dev Biol Stand. Basel, Karger, vol 98, pp 153-157] 참조)으로 감소시키는 인플루엔자 바이러스 또는 RSV의 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서, 흡입된 바이러스의 정제를 위한 방법은 임의의 잔류 HCD의 양 및 크기가 투여량 당 150 ng 이하 수준으로 감소된다.
특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 10 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 9 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 8 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 7 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 6 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 5 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 4 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 3 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 2 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 1 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.8 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.6 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.4 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.2 ng HCD/투여량 이하를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 1 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.8 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.6 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.4 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 0.2 ng HCD/투여량 이하를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 200 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 190 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 180 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 170 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 160 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 150 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 140 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 130 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 120 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 110 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 100 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 90 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 80 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 70 ng HCD/투여량 이하를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 120 ng HCD/투여량 이하 또는 약 105 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 100 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 90 ng HCD/투여량 이하, 또는 약 75 ng HCD/투여량 이하를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 인플루엔자 바이러스이며, 약 10 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 9 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 8 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 7 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 6 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 5 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 4 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 3 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 2 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 1 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.8 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.6 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.4 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.2 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 1 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.8 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.6 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.4 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.2 ng HCD/7.0±0.5 log10FFU 이하를 포함한다.
한 실시 양태에서, HCD의 양은 피코그린 분석법(PicoGreen Assay)을 이용하여 측정된다. 또 다른 실시 양태에서, HCD의 양은 실시간 중합효소 연쇄 반응(rtPCR)을 이용하여 측정된다. 이러한 분석법들은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 중에 존재하는 HCD의 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상은 그 길이가 약 1000 염기쌍(bp) 이하이다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 중에 존재하는 HCD의 약 80% 이상은 그 길이가 약 1000 bp 이하이다. 다른 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 중에 존재하는 HCD의 약 90% 이상은 그 길이가 약 1000 bp 이하이다. 다른 실시 양태에서, 정제된 바이러스 중에 존재하는 HCD의 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상은 그 길이가 약 500 bp 이하이다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 중에 존재하는 HCD의 약 60% 이상은 그 길이가 약 500 bp 이하이다.
일부 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 100 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 90 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 80 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 70 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 60 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 50 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 40 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 30 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 20 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 10 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 9 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 8 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 7 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 6 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 5 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 4 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 3 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 2 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 1 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.8 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.6 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.4 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.2 ㎍ HCP/투여량 이하를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 1 ng HCP/투여량 이하, 또는 약 0.8 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.6 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.4 ㎍ HCP/투여량 이하, 또는 약 0.2 ㎍ HCP/투여량 이하를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 인플루엔자 바이러스이며, 약 10 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 9 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 8 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 7 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 6 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 5 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 4 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 3 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 2 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 1 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.8 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.6 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.4 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.2 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 약 1 ng HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.8 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.6 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.4 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하, 또는 약 0.2 ㎍ HCP/7.0±0.5 log10FFU 이하로 포함한다.
한 실시 양태에서, HCP의 양은 검출을 위해 HCP에 대한 항체를 이용하는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 측정된다. 이러한 분석법은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
백신 조성물용 불활성/붕괴된 바이러스 입자의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있어 지난 40년간 이용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법들은 일반적으로 온전한 바이러스 입자, 특히 생균 약독화성 바이러스를 제조하는데에는 사용될 수 없는 세정제 또는 포름알데히드를 이용한 처리와 같은, 위험한 단계들을 포함하고 있다. 따라서, 본 발명은 바이러스 수확물에서 HCD와 HCP를 적절히 분리하기 위한 막과 조건들을 이용하여 온전한 생균 바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스 또는 RSV)를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 전반적으로 높은 생균 바이러스의 회수율을 제공한다. 한 실시 양태에서, 정제된 바이러스의 전체 회수율은 3% 이상, 또는 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 25% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상이다. 정제된 바이러스의 회수율을 모니터링하는 방법으로는, 바이러스 감염 및/또는 증식을 측정하도록 고안된 분석법들을 포함한다. 예를 들어, 형광 포커스 분석법(Focal Fluorescent assay, FFA) 및 평균 조직 배양 감염 용량(Median Tissue Culture Infectious Dose, TCID50) 분석법을 사용하여 정제된 생균 인플루엔자 바이러스의 회수율을 모니터링할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 바이러스 정제 방법은 30% 이상의 전반적으로 높은 바이러스 회수율을 제공하는데, 여기에서 정제된 바이러스는 0.1 ng 이하의 HCD, 0.3 ㎍ 이하의 HCP 및 7.0±0.5 log10FFU의 바이러스 당 0.0050 ng의 비특이적 뉴클레아제를 포함한다.
바이러스 수확물의 정제는 다수의 단계를 포함하는데, 이들 단계는 바이러스 및 정제 조건에 따라 최적화될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 정제 공정은 하기의 단계들 중 임의의 단계를 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다: a) 바이러스 수확물의 세정; b) 농축 및/또는 버퍼 교환; c) 크로마토그래피에 의한 정제 및 d) 멸균 여과. 이러한 단계들은 비특이적 엔도뉴클레아제를 이용한 처리 및 바이러스 수확물 또는 바이러스 로딩물의 안정화와 같은 추가의 단계들을 포함할 수 있다. 이러한 단계들은 상기 기술된 바와 같이 HCP와 HCD를 적절히 제거하면서 바이러스 회수율을 최대화하는 순서로 정제 공정 중에 여러 번 수행될 수 있다.
바이러스 수확물을 정화하는데 유용한 방법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 원심분리, 투석 및 막 여과를 포함하며, 막 여과로는 이에 제한되지는 않으나, 단류(single pass) 여과, 전량(dead-end) 여과, 직류식 여과(direct flow filtration, DFF)(액체가 여과 매질을 통해 직접 흐름), 횡류(crossflow) 또는 접선(tangential flow) 흐름식 여과(TFF)[액체가 막 표면에(을 따라) 접선 방향으로 흐름]를 포함한다. TFF 시스템은 일정한 여과물 유속(Filtrate Flux rate)[흔히 간단하게 "플럭스(Flux, 유속)"로서도 지칭되며, 이는 시간당 막(㎡)에 투과되는 용량(ℓ)(LMH)으로서 측정될 수 있음]를 유지하기 위해, 또는 일정한 경막압(transmembrane pressure)["TMP"로 약칭되며, 이는 평방 인치당 파운드(psi)로서 측정될 수 있음)을 유지하기 위해 실행될 수 있다. 그러나, 막 오염을 방지하기 위해서는 일정한 유속 및 TMP도 조절될 수 있다. 여과용으로 사용하기 위한 막은 상업적 공급처로부터 이용가능하다.
당업계에서는, 운반 액체로부터 제거되는 물질의 크기에 의해 규정되어 통상적으로 허용되는 4가지 종류의 막이 있다. 이들은 역삼투막, 나노여과막, 한외여과막 및 정밀여과막으로, 최소 공극 크기로부터 최대 공극 크기를 갖는 것까지 여러 종류가 있다. 상기 언급한 막을 이용한 여과는 특정한 공극 크기를 갖는 막을 사용함으로써 그 분자량에 따라 분자들을 분리하게 된다. 예를 들어, 0.01 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 역삼투막을 이용한 분리는 200 Da 이하의 분자량을 갖는 분자를 분리하는데 사용된다. 0.001-0.008 ㎛(경계값 포함)의 공극 크기를 갖는 나노여과막을 이용한 여과는 200 Da 내지 15 kDa(경계값 포함)의 분자량을 갖는 분자를 분리하는데 사용된다. 0.005-0.1 ㎛(경계값 포함)의 공극 크기를 갖는 한외여과막을 이용한 여과는 5 kDa 내지 300 kDa(경계값 포함)의 분자량을 갖는 분자를 분리하는데 사용된다. 0.05-3.0 ㎛(경계값 포함)의 공극 크기를 갖는 정밀여과막을 이용한 여과는 100 kDa 내지 3000 kDa(경계값 포함)의 분자량 및 이보다 더 큰 분자량을 갖는 분자를 분리하는데 사용된다. 따라서, 막 여과는 막의 공극 크기에 의해 결정된 특정 분획 분자량(Molecular Weight Cut-Off, MWCO)을 가지는 막을 사용하여 해당 분자(예컨대, 바이러스)를 다른 세포 성분들로부터 분리할 수 있다. 이론상 한계 분자량(Nominal Molecular Weight Limit, NMWL) 또는 이론상 분획 분자량(Nominal Molecular Weight Cut-Off, NMWCO)으로도 지칭되는 MWCO는 막에 의해 여과될 수 있는 kDa 크기의 종착점을 나타낸 것이다. MWCO는 막에 의해 90%가 그대로 보유되는 분자의 분자량으로 정의된다. 예를 들어, 동일한 분자량을 갖는 분자는 현저하게 다른 형태를 가질 수 있기 때문에, MWCO는 정확한 측정의 기준이 되는 건 아니지만, 그렇다 하더라도 유용한 측정의 기준은 될 수 있어서 필터 제조업자에 의해 흔히 사용된다. 막은 평판 시트 또는 나선형으로 감긴 형태로 사용될 수 있다. 여과 방법의 유형에 따라 중공사(hollow fiber)가 사용될 수도 있다. 막으로서 사용가능한 여러 가지 재료들이 사용될 수 있는데, 그 예로서 이에 제한되지는 않지만, 재생 셀룰로오스, 폴리에테르 설폰(고유의 소수성 특징을 변화시키도록 변형되거나 그렇지 않을 수도 있음), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 그리고 세라믹 및 금속 산화물 응집체뿐 아니라, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 PTFE(TEFLON®)를 포함한다. 여과 방법과 막 유형의 조합은 구분되어 사용될 수 있으며, 분리막을 포함하는 필터, 컬럼 등의 용량은 처리될 물질의 부피 및/또는 농도에 따라 조절될 수 있다.
농축 및/또는 버퍼 교환에 유용한 방법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 투석, 한외여과(UF) 및 정용여과(DF: diafiltration)를 포함한다. TFF는 농축하는데 사용될 수 있는 UF와, 버퍼를 교환하는데 사용될 수 있는 DF를 모두 포함할 수 있다. 또한, UF 및/또는 DF의 사용은 오염원일 수 있는 더 작은 분자들을 막을 통해 씻어내고 잔류 여과물 내에 더 큰 해당 분자들을 남기는 분획화 공정에 의해 결과적으로 추가로 정제를 한 셈이 될 수도 있다. 따라서, UF 및/또는 DF를 포함하는 TFF는 농축 및/또는 버퍼 교환 및/또는 정제하는데 사용될 수 있다. 여과용으로 사용하기 위한 막의 선택에 대해서는 상기 기술하였다. 본 발명에 따르면, DF는 불연속적 또는 연속적인 DF일 수 있다. 불연속적인 DF에서는 용액이 농축되며, 줄어든 부피는 새로운 버퍼에 의해 대체된다. 연속적인 DF에서는 기존의 버퍼 용액이 제거되면서 새로운 버퍼 용액이 유입됨으로 인해 용액 부피가 유지된다.
특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 약 2X, 또는 약 3X, 또는 약 4X, 또는 약 5X, 또는 약 6X, 또는 약 7X, 또는 약 8X, 또는 약 9X, 또는 약 10X, 또는 그 이상으로 농축되며, 여기에서 "X"는 작업/최종 잔류 여과물 부피에 첨가된 총 개시 부피와 같다. 특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 약 3X 내지 약 5X로 농축된다. 다른 특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 약 4X로 농축되며, 여기에서 "X"는 작업/최종 잔류 여과물 부피에 첨가된 총 개시 부피와 같다. 특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 모든 후속 정제 단계의 로딩물을 증가시키기 위해 약 1OX 이상으로 농축된다. 특정 실시 양태에서, 하기의 농도, 약 1 투석부피(diavolume), 또는 약 2 투석부피, 또는 약 3 투석부피, 또는 약 4 투석부피, 또는 약 5 투석부피, 또는 약 6 투석부피, 또는 약 7 투석부피, 또는 약 8 투석부피, 또는 약 9 투석부피, 또는 약 10 투석부피, 또는 그 이상의 투석부피의 버퍼가 DF에 의해 교환되는데, 여기에서 투석부피(diavolume)란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다. 특정 실시 양태에서, 약 4 투석부피 내지 약 6 투석부피의 버퍼가 교환되는데, 여기에서 투석부피란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다. 다른 특정 실시 양태에서, 약 5 투석부피의 버퍼가 교환되는데, 여기에서 투석부피란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다.
특정 실시 양태에서, 바이러스(예컨대, 인플루엔자, RSV)를 포함하는 잔류 여과물은 원하는 부피의 버퍼가 교환된 후에 수거한다. 잔류 여과물을 수거한 후에도, 일부 바이러스가 막에 약하게 결합된 상태로 잔류할 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 수거된 잔류 여과물에 첨가되는 추가의 교환 버퍼로 막을 헹구어 준다. 수거된 잔류 여과물은 "컨디셔닝된 바이러스 로딩물" 또는 "#XUF #XDF"로 지칭되기도 하는데, 여기에서 "#"는 각각 UF 및 DF 공정에 있어서 교환된 버퍼의 농축 배수 또는 투석부피의 수를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, 농축 및 버퍼 교환을 위해 500 kDa MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일부 실시 양태에서, 막은 공정 후 세척하여 재사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 각각 한 회분의 정화된 바이러스에 대해 새로운 막이 사용된다. 다른 특정 실시 양태에서, 정화된 수확물은 섹션 8.3 및 8.4에 제공된 실시예에 예시된 것과 같이 농축되고 버퍼 교환된다.
바이러스(예컨대, 인플루엔자 또는 RSV)의 정제에 유용한 크로마토그래피의 유형으로는, 이에 제한되지는 않지만, 친화성 크로마토그래피뿐 아니라, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피가 사용된다. 한 실시 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피가 사용된다. 다른 실시 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 높은 pH에서 수행된다. 한 실시 양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 사용된다. 특정 실시 양태에서, 강성 4급 암모늄(Q) 음이온 교환기가 사용된다(예를 들어, Capto™ Q, GE 헬스케어). 다른 실시 양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 낮은 pH에서 수행된다. 이온 교환 크로마토그래피에 유용한 음이온 매질로는, 이에 제한되지는 않지만, 음이온막 흡착제(예를 들어, Sartobind® Q15, D15) 및 양이온막 흡착제(예를 들어, Sartobind® S15 및 C15)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 네가티브 크로마토그래피는 불순물이 음이온 또는 양이온 교환 매질에 의해 결합된 후, 숙주 세포 단백질 및/또는 핵산과 같은 이러한 불순물로부터 바이러스가 분리 또는 정제되는 경우에 사용된다. 크로마토그래피는 회분식 공정으로 또는 다르게는 컬럼 공정을 이용하여 수행될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
오염물질인 HCD를 효율적으로 제거하는데 유용한 방법으로는, 정제 공정의 다른 단계들과 더불어, 비특이적 엔도뉴클레아제(예컨대, 벤조나아제®)를 이용한 처리 방법을 포함한다. 그러나, 동물(인간을 포함함) 임상용으로 사용하고자 하는 바이러스에 있어서는, 최종적으로 정제된 바이러스 중에 비특이적 뉴클레아제의 양이 최소한이 되어야 하는 것이 바람직하다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본원의 방법에서 사용되어 잔류할 수 있는 비특이적 엔도뉴클레아제의 양을 주사용 백신에 허용가능한 수준 미만으로 감소시키는 바이러스의 정제 방법을 제공한다.
한 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 투여량 당 약 0.0060 ng 이하, 또는 약 0.0055 ng 이하, 또는 약 0.0050 ng 이하, 또는 약 0.0045 ng 이하, 또는 약 0.0040 ng 이하, 또는 약 0.0035 ng 이하, 또는 약 0.0030 ng 이하, 또는 약 0.0025 ng 이하, 또는 약 0.0020 ng 이하, 또는 약 0.0015 ng 이하, 또는 약 0.0010 ng, 또는 그 이하의 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 투여량 당 약 0.0040 ng 이하, 또는 약 0.0035 ng 이하, 또는 약 0.0030 ng 이하, 또는 약 0.0025 ng 이하의 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 RSV이고, 7.0±0.5 log10FFU 당 약 0.0060 ng 이하, 또는 약 0.0055 ng 이하, 또는 약 0.0050 ng 이하, 또는 약 0.0045 ng 이하, 또는 약 0.0040 ng 이하, 또는 약 0.0035 ng 이하, 또는 약 0.0030 ng 이하, 또는 약 0.0025 ng 이하, 또는 약 0.0020 ng 이하, 또는 약 0.0015 ng 이하, 또는 약 0.0010 ng 이하, 또는 그 이하의 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 RSV이고, 7.0±0.5 log10FFU 당 약 0.0040 ng 이하, 또는 약 0.0035 ng 이하, 또는 약 0.0030 ng 이하, 또는 약 0.0025 ng 이하의 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스는 RSV이며, 5.0±0.5 log10FFU 당 약 0.009 ng 이하, 또는 약 0.01 ng 이하, 또는 검출 수준(ELISA로 0.1 ng/mL) 이하로 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 벤조나아제®이다.
멸균 작업은 동물(인간을 포함함)의 임상용으로 사용하려는 바이러스 및/또는 바이러스 성분에 있어서 특히 중요하다. 따라서, 본 발명의 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 또는 RSV) 정제 방법은 멸균화 단계를 포함하는데, 이는 최종 여과 단계로서(예컨대, RSV의 경우), 또는 공지된 멸균화 방법을 이용하여(예컨대, 인플루엔자 바이러스의 경우) 수행될 수 있다. 백신 성분들(예컨대, 바이러스, 전달 장치)의 멸균화 작업에 유용한 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, 방사선, 여과, 화학적 처리 및 기타 적절한 절차를 포함한다. 한 실시 양태에서, 제조된 바이러스 벌크물은 여과에 의해 멸균된다. 멸균화 작업에 유용한 여과 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, 상기 기술한 바와 같은 단류 여과, 전량 여과, 직류식 여과(DFF) 및 접선 흐름식 여과(TFF)를 포함한다. 그러나, RSV의 약한 특성 때문에, 바이러스는 멸균 등급 필터를 사용하여 멸균할 수는 없다.
아래에 백신 조제물용 인플루엔자 바이러스 및 RSV를 정제하는 구체적인 방법들을 제공한다.
6.5.1 인플루엔자 바이러스의 정제
특정 실시 양태에서, 정제할 바이러스는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화 인플루엔자 바이러스)이다.
한 실시 양태에서, 세포 배양물로부터 바이러스를 정제하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 바이러스 수확물을 정화하는 단계;
(b) 단계 (a) 수행 후에 농축 및/또는 버퍼 교환하는 단계;
(c) 단계 (b) 수행 후에 크로마토그래피로 정제하는 단계;
(d) 단계 (c) 수행 후에 농축 및/또는 버퍼 교환하는 단계; 및
(e) 단계 (d) 수행 후에 멸균하는 단계.
한 실시 양태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 특정 실시 양태에서, 인플루엔자 바이러스는 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스이다.
특정 실시 양태에서, 단계 (a), (b), (d) 및 (e)는 막 여과에 의해 수행된다. 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (b) 및 (d)는 접선 흐름식 여과에 의해 수행된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (a) 및 (e)는 직류식 여과에 의해 수행된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (b)는 한외여과에 의한 농축 및 정용여과에 의한 버퍼 교환 작업을 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (d)는 농축 작업만을 포함한다. 바이러스를 정제하는 방법에 대한 추가의 실시 양태들은 하기에 상세히 기술한다.
한 특정 실시 양태에서, 단계 (c)는 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행된다. 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (c)는 비특이적 뉴클레아제를 이용한 처리 작업을 더 포함한다.
상기 기술된 바와 같이, 세포 배양물로부터 얻어진 바이러스는 수거 후에 안정화(예를 들어, 수크로스 인산염(SP)의 첨가에 의한 안정화)될 수 있다. 따라서, 본 발명의 정제 방법은 안정화된 바이러스 수확물을 정화하는 단계를 포함한다. 다르게는, 수거 단계와 세정 단계를 짝지을 수도 있다. 예를 들어, 세포 배양으로 복제된 바이러스를 수거하여 이 바이러스 수확물을 바이러스의 세정 작업을 위해 사용되는 매질 및/또는 장치로 직접 주입하는데 ATF가 사용될 수 있다.
예를 들어, 감염된 배양물의 원래의 배지는 먼저 세포의 잔해물 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예컨대 10분 내지 30분 동안, 예컨대 1000-2000×g에서 원심분리에 의해 정제될 수 있다. 다르게는, 배지는 손상되지 않고 온전한 세포와 다른 거대 과립 물질을 유지하면서, 바이러스가 통과하기에 충분히 크게 규정된 범위의 공극 크기를 갖는 반투과막을 통해 여과된다.
한 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 바이러스를 통과시키기에는 충분히 크지만 온전한 세포와 세포의 잔해물을 보유하기에는 충분히 작은 공극 크기를 갖는 MF 막을 이용하는 DFF 및/또는 TFF에 의해 정화된다. 한 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 약 1.2 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통한 DFF 및/또는 TFF에 의해 정화된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 약 1.2 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통한 DFF에 의해 정화된다. 다른 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 1.2 ㎛의 공극 크기를 갖는 제1막과 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 제2막을 통한 DFF에 의해 정화된다. 특정 실시 양태에서, 폴리프로필렌 및/또는 PVDF 막이 사용된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 것과 같은 DFF에 의해 정화된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 세포 배양물에서 복제된 바이러스의 수거 단계는 DFF 단계와 커플링된다. 예를 들어, 세포 배양물에서 복제된 바이러스는 수거되어 DFF에서 사용되는 매질과 장치에 직접 적용된다. 수거 단계와 정화 단계를 커플링하면, 조작 단계의 수를 감소시킬 수 있고, 수확물 탱크의 필요성을 없앨 수 있으며, 전체적인 가공 처리 시간을 줄일 수 있다.
한 실시 양태에서, 정화된 수확물은 농축되고/되거나 버퍼가 교환된다. 한 실시 양태에서, 농축 및/또는 버퍼 교환은 UF 및 DF에 의해 수행된다. 다른 실시 양태에서, TFF는 UF 및 DF 양자 모두를 위해 사용된다. 또 다른 실시 양태에서, 세포 배양물에서 복제된 바이러스의 수거 단계는 TFF 단계와 커플링된 DFF 단계와 짝지을 수 있다. 수거, 정화 및 농축/버퍼 교환 단계들의 커플링은 조작 단계의 수를 줄이고, 전체적인 가공 처리 시간을 줄일 수 있다. 특정 실시 양태에서, TFF는 일정한 여과물 유속을 유지하기 위해 실행된다. 다른 실시 양태에서, TFF는 일정한 TMP를 유지하기 위해 실행된다. 특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 먼저 UF에 의해 농축된 후, DF에 의해 버퍼 교환된다. 교환 버퍼는 바이러스 수확물 내에 존재하는 것과 동일하거나 상이할 수 있다는 점도 고려된다. 한 실시 양태에서, 교환 버퍼는 중성 pH의 SP 버퍼이다. 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)를 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 다른 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)로 이루어진다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 특정 실시 양태에서, 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)를 포함하는 잔류 여과물은 원하는 부피의 버퍼가 교환된 후에 수집된다. 잔류 여과물을 수집한 후에도, 일부 바이러스들은 막에 약하게 결합된 상태로 잔류할 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 수거된 잔류 여과물에 첨가되는 추가의 교환 버퍼로 막을 헹구어 준다. 수거된 잔류 여과물은 "컨디셔닝된 바이러스 로딩물" 또는 "#XUF #XDF"로 지칭되기도 하는데, 여기에서 "#"는 각각 UF 및 DF 공정에 있어서 교환된 버퍼의 농축 배수 또는 투석부피의 수를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, 농축 및 버퍼 교환을 위해 500 kDa MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일부 실시 양태에서, 막은 공정 후 세척하여 재사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 각각 한 회분의 정화된 바이러스에 대해 새로운 막이 사용된다. 다른 특정 실시 양태에서, 정화된 수확물은 섹션 8.3 및 8.4에 제공된 실시예에 예시된 것과 같이 농축되고 버퍼 교환된다.
특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 크로마토그래피로 정제된다. 일부 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 친화성 크로마토그래피로 정제된다. 유사한 분리 특성을 갖는 다양한 친화성 크로마토그래피 매질을 이용할 수 있는데, 예를 들어, 여러 가지 바이러스와 바이러스성 단백질의 농축 및 정제를 위하여 다양한 친화성 크로마토그래피 매질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, N(p-아미노페닐)옥삼산 아가로스, 셀루파인(Cellufine™) 설페이트(Sulfate)[키쏘 코포레이션(Chisso Corp.)사 제조]을 이용할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 셀루파인 설페이트(키쏘 코포레이션) 친화성 매질이 친화성 크로마토그래피에 이용된다. 다른 실시 양태에서, 플루셀렉트(FluSelect™)(GE 헬쓰케어)가 친화성 크로마토그래피에 이용된다. 특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 친화성 매질 상에 직접 로딩된다. 특정 실시 양태에서, 결합되지 않은 물질은 친화성 매질을 통과해 추가의 바이러스 결합을 촉진할 수 있다.
한 실시 양태에서, 친화성 매질 1 ㎖ 당 약 109.0 내지 약 1010, 또는 약 109.2 내지 약 109.8, 또는 약 109.4 내지 약 109.6 바이러스 입자들이 로딩된다. 다른 실시 양태에서, 친화성 매질 1 ㎖ 당 약 109.0 이상, 또는 약 109.1 이상, 또는 약 109.2 이상, 또는 약 109.3 이상, 또는 약 109.4 이상, 또는 약 109.5 이상, 또는 약 109.6 이상, 또는 약 109.7 이상, 또는 약 109.9 이상, 또는 약 109.9 바이러스 입자들이 로딩된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 입자들은 생균 바이러스이다. 시료 내의 생균 바이러스의 수를 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다.
다른 실시 양태에서, 친화성 매질 1 ㎖ 당 약 9.0 log10 FFU 내지 약 10 log10 FFU, 또는 약 9.2 log10 FFU 내지 약 9.8 log10 FFU, 또는 약 9.4 log10 FFU 내지 약 9.6 log10 FFU의 바이러스가 로딩된다. 다른 실시 양태에서, 친화성 매질 1 ㎖ 당 약 9.0 log10 FFU 이상, 또는 약 9.1 log10 FFU 이상, 또는 약 9.2 log10 FFU 이상, 또는 약 9.3 log10 FFU 이상, 또는 약 9.4 log10 FFU 이상, 또는 약 9.5 log10 FFU 이상, 또는 약 9.6 log10 FFU 이상, 또는 약 9.7 log10 FFU 이상, 또는 약 9.8 log10 FFU 이상, 또는 약 9.9 log10 FFU 이상의 바이러스가 로딩된다. 특정 실시 양태에서, 셀루파인 설페이트(키쏘 코포레이션)의 친화성 매질이 사용되며, 셀루파인 설페이트 1 ㎖ 당 9.2 log10 FFU 내지 9.8 log10 FFU의 바이러스가 로딩된다. 다른 특정 실시 양태에서, 셀루파인 설페이트(키쏘 코포레이션)의 친화성 매질이 사용되며, 셀루파인 설페이트 1 ㎖ 당 9.4 log10 FFU 내지 9.6 log10 FFU의 바이러스가 로딩된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 셀루파인 설페이트(키쏘 코포레이션)의 친화성 매질이 사용되며, 셀루파인 설페이트 1 ㎖ 당 약 9.4 log10 FFU 이상, 또는 약 9.5 log10 FFU 이상, 또는 약 9.6 log10 FFU 이상, 또는 약 9.7 log10 FFU의 바이러스가 로딩된다.
한 실시 양태에서, 친화성 매질을 충분한 부피의 버퍼(예를 들어, SP 버퍼)(바이러스는 친화성 매질에 결합하여 잔류하려 함)로 세척하여, 이 친화성 매질에 결합되지 않은 오염물질 및 약하게 결합하고 있는 오염물질들을 제거한다. 특정 실시 양태에서, 세척 버퍼는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)를 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 다른 특정 실시 양태에서, 세척 버퍼는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)로 이루어진다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 특정 실시 양태에서, 바이러스를 세척 후에 충분한 부피의 버퍼(바이러스는 친화성 수지에 결합하지 않을 것임)를 이용하여 컬럼에 결합되어 있을 수 있는 오염물질들을 분리시키지 않으면서 바이러스를 용리시켜 수집한다. 특정 실시 양태에서, 용리 버퍼는 염을 포함한다. 친화성 컬럼으로부터 바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스)를 용리하는데 유용한 염으로는, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함한다. 일반적으로, 용리 버퍼는 0 내지 1.0 M의 농도 범위의 구배 또는 단계로서 수지에 적용된다. 용리 버퍼에서 염으로 사용된 양이온 및 음이온의 유효성은 호프마이스터 계열(Hofmeister series)과 상관 관계가 있다(흔히 사용되는 양이온이 배출되어 나오는 순서는 Ca2 + > Mg2 + > Na+ > K+ >NH4 + 이고, 흔히 사용되는 음이온의 효과적인 배출 순서는 PO4 3 - > SO4 2- > COO- > Cl- 임). 한 실시 양태에서, 용리 버퍼는 최종 농도가 1M인 염화나트륨을 포함한다(10% 이내에서 변동 가능). 다른 실시 양태에서, 용리 버퍼는 1M의 염화나트륨, 218 mM의 수크로스 및 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)를 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 수집된 용리 바이러스는 본원에서 "정제된 바이러스 용출액"으로도 지칭된다. 바이러스의 용리는 자외선(UV) 흡광도, 특히 280 nm의 흡광도를 모니터링하여 관찰할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 컬럼 크로마토그래피로 정제되는데, 여기에서 바이러스의 용리를 모니터링하여 바이러스를 포함하는 특정 분획물을 수집하게 된다. 이러한 접근 방법은 용리된 바이러스의 부피를 최소화하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 다른 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 것과 같이 크로마토그래피에 의해 정제된다.
특정 실시 양태에서, 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)를 정제하는 방법은 비특이적 엔도뉴클레아제(예컨대, 벤조나아제®)를 이용한 처리 작업을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제 처리는 바이러스의 정제 초기에 행한다. 한 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제 처리는 단계 (a) 이후 단계 (b) 전에 행한다. 다른 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제 처리는 단계 (b) 이후 단계 (c) 전에 행한다. 다르게는, 바이러스는 단계 (c) 동안 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리된다. 이러한 접근 방법의 장점은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시되어 있다. 특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 친화성 매질에 결합된 후, 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 버퍼에 노출된다. 일부 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 약 10 U/㎖ 내지 약 100 U/㎖ 농도로 버퍼 중에 존재한다. 다른 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 약 40 U/㎖ 내지 약 60 U/㎖ 농도로 버퍼 중에 존재한다. 한 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 수크로스를 포함하는 버퍼 중에 존재한다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)를 포함하는 버퍼 중에 존재한다. 다른 특정 실시 양태에서, 특이적 엔도뉴클레아제는 218 mM의 수크로스, 11 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)로 이루어진 버퍼(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능) 중에 약 40 U/㎖ 내지 약 60 U/㎖의 농도로 존재한다. 특정 실시 양태에서, 로딩 및 세척 조건은 결합된 바이러스가 약 10분 내지 약 120분 동안 비특이적 엔도뉴클레아제에 노출되도록 하기 위해 조절된다. 한 실시 양태에서, 로딩 및 세척 조건은 결합된 바이러스가 약 40분 내지 약 80분 동안 비특이적 엔도뉴클레아제에 노출되도록 하기 위해 조절된다. 다른 실시 양태에서, 로딩 및 세척 조건은 결합된 바이러스가 10분 이상, 또는 20분 이상, 또는 30분 이상, 또는 40분 이상, 또는 50분 이상, 또는 60분 이상, 또는 70분 이상, 또는 80분 이상, 또는 90분 이상, 또는 100분 이상, 또는 110분 이상, 또는 120분 이상 동안 비특이적 엔도뉴클레아제에 노출되도록 하기 위해 조절된다. 본 발명의 한 측면에서, 비특이적 엔도뉴클레아제에 노출되는 시간, 비특이적 엔도뉴클레아제의 농도 및 버퍼를 포함하는 비특이적 엔도뉴클레아제의 부피는 조절될 수 있다. 예를 들어, DNA 오염물질을 분해하는데 필요한 시간을 최소화하기 위해, 비특이적 엔도뉴클레아제의 농도를 증가시킬 수 있으며; 다르게는, 사용되는 비특이적 엔도뉴클레아제의 양을 최소화하기 위해 노출 시간을 증가시킬 수 있다. 비특이적 엔도뉴클레아제를 이용하여 처리한 후, 임의의 소화된 DNA 잔기 오염물을 제거하기 위해 충분한 부피의 버퍼(예컨대, SP 버퍼)(바이러스는 친화성 매질에 결합하여 잔류할 것임)로 친화성 매질을 세척하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 친화성 수지는 비특이적 엔도뉴클레아제를 이용한 처리 전 및/또는 처리 후에 상기 기술된 바와 같이 세척된다. 다른 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 벤조나아제®이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 바와 같이 친화성 크로마토그래피에 의한 정제와 동시에 벤조나아제®로 처리된다.
본 발명의 특정 측면에서, 크로마토그래피로 정제 후, 정제된 바이러스 용출물은 농축되고/되거나 버퍼가 교환된다. 농축 및/또는 버퍼 교환에 유용한 방법은 상기 기술하였다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 용출물의 버퍼는 DF를 사용하여 교환된다. 한 실시 양태에서, 약 5 투석부피 이상의 버퍼가 DF에 의해 교환되는데, 여기에서 투석부피란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다. 약 5 투석부피 이상을 교환하는 것에 대한 장점은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 상술되어 있다. 다른 실시 양태에서, 약 6 투석부피, 또는 약 7 투석부피, 또는 약 8 투석부피, 또는 약 9 투석부피, 또는 약 10 투석부피, 또는 그 이상의 투석부피를 갖는 버퍼가 DF에 의해 교환되는데, 여기에서 투석부피란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다. 특정 실시 양태에서, 약 8 투석부피 이상의 버퍼가 DF에 의해 교환되는데, 여기에서 투석부피란 DF 동안에 작업에 도입된 총 버퍼 부피/잔류 여과물 부피이다. 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 200 mM의 수크로스, 100 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)를 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 다른 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 200 mM의 수크로스, 100 mM의 인산염 버퍼(pH 7.0-7.4)로 이루어진다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 특정 실시 양태에서, 바이러스를 포함하는 잔류 여과물은 원하는 부피의 버퍼가 교환된 후에 수집된다. 잔류 여과물을 수집한 후에도, 일부 바이러스들은 막에 약하게 결합된 상태로 잔류할 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 수거된 잔류 여과물에 첨가되는 추가의 교환 버퍼로 막을 헹구어 준다. 수거된 잔류 여과물은 "제조된 바이러스 벌크" 또는 "#XDF"로 지칭되기도 하는데, 여기에서 "#"는 DF 공정에 있어서 교환된 버퍼의 투석부피의 수를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, 농축 및/또는 버퍼 교환을 위해 500 kDa MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일부 실시 양태에서, 막은 공정 후 세척하여 재사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 각각 한 회분의 정화된 바이러스 용출물에 대해 새로운 막이 사용된다. 다른 특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스 용출물의 버퍼는 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 것과 같이 교환된다. 또 다른 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 상기 기술된 바와 같이 UF에 의해 농축되고, 버퍼는 DF에 의해 교환된다. UF 단계를 도입함으로써 제조된 바이러스 벌크물의 생성 부피를 감소시킬 것이다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 용출물은 약 2X, 또는 약 3X, 또는 약 4X, 또는 약 5X, 또는 그 이상으로 농축되는데, 여기에서 "X"는 작업에서 첨가된 총 개시 부피/최종 잔류 여과물 부피와 같다. 다른 실시 양태에서, 바이러스 용출물은 약 2X 내지 약 4X로 농축된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 용출물은 약 2X로 농축된 후, 상기 기술된 바와 같이 DF에 의해 버퍼 교환된다. 특정 실시 양태에서, 정제된 바이러스 용출물의 버퍼는 섹션 8.4에 제공된 실시에에 예시된 바와 같이 농축되고 버퍼 교환된다.
한 실시 양태에서, 조제된 바이러스 벌크물은 DFF 및/또는 TFF에 의해 멸균된다. 다른 실시 양태에서, 제조된 바이러스 벌크물은 바이러스를 통과시키기에는 충분히 크지만 다른 오염물질들을 보유하기에는 충분히 작은 공극 크기를 갖는 MF 막을 이용하여 멸균된다. 한 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 약 0.45 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통한 DFF 및/또는 TFF에 의해 멸균된다. 특정 실시 양태에서, 폴리프로필렌 및/또는 PVDF 막이 사용된다. 한 실시 양태에서, 멸균 작업 전에 추가의 성분들이 상기 제조된 바이러스 벌크물에 첨가된다. 특정 실시 양태에서, 아미노산 부형제(예를 들어, 글루탐산, 아르기닌), 단백질 가수분해물(예를 들어, 콜라겐, 젤라틴), 킬레이트제(예를 들어, EDTA) 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 멸균 작업 전에 상기 제조된 바이러스 벌크물에 첨가된다. 특정 실시 양태에서, 글루탐산, 아르기닌 및 젤라틴이 멸균 작업 전에 상기 조제된 바이러스 벌크물에 첨가된다. 다른 특정 실시 양태에서, cGAG (200 mM 수크로스, 100 mM 인산염, 12.1% w/v 아르기닌, 10% 젤라틴, 그리고 54 mM 또는 0.9% 글루탐산)가 1:9 v/v의 비율로 정제된 바이러스 벌크에 첨가된다. 다른 특정 실시 양태에서, 글루탐산 나트륨, 아르기닌 및 젤라틴은 멸균 작업 전에 각각 5.4 mM 또는 0.09%, 1.21% w/v 및 1.0% w/v의 최종 농도로 조제된 바이러스 벌크물에 첨가된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 조제된 바이러스 벌크물은 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시된 것과 같은 DFF에 의해 멸균된다.
특정 실시 양태에서, 세포 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 약 1.2 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 이용하는 직류식 여과(DFF)로 바이러스 수확물을 정화하는 단계;
(b) 단계 (a) 후에 500 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 막을 이용하여, 접선 흐름식 한외여과(UF)로 농축하고 정용여과(DF)로 버퍼를 교환하는 단계;
(c) 단계 (b) 이후에 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계;
(d) 단계 (c) 후에 500 kDa의 분획분자량(MWCO)을 갖는 막을 이용하여, DF로 버퍼를 교환하는 단계; 및
(e) 단계 (d) 후에 약 0.45 ㎛ 내지 약 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 이용하는 DFF로 멸균하는 단계,
상기에서, 정제된 바이러스의 전체적인 회수율은 30% 이상이고, 상기 정제된 바이러스는 7.0±0.5 log10FFU의 바이러스 당 0.1 ng 이하의 HCD, 0.3 ㎍ 이하의 HCP를 포함한다.
세포 배양물로부터 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 정제하는 방법에 도입될 수 있는 추가의 매개변수들은 하기 섹션 8.3에 제공된 실시예에 예시되어 있다.
6.5.2 RSV 의 정제
특정 실시 양태에서, 정제할 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) (예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)이다.
한 실시 양태에서 세포 배양물로부터 바이러스를 정제하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 바이러스 수확물을 정화하는 단계;
(b) 단계 (a) 수행 후에 멸균 및/또는 버퍼 교환하는 단계;
(c) 단계 (b) 수행 후에 농축 및/또는 버퍼 교환하는 단계;
(d) 단계 (c) 수행 후에 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및
(e) 단계 (d) 수행 후에 최종적으로 여과하는 단계.
특정 실시 양태에서, 단계 (a)는 다수의 여과 단계를 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (a)는 비특이적 엔도뉴클레아제를 이용한 처리 단계를 더 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (a) 및 (c)는 직류식 여과에 의해 수행된다. 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (c)는 접선 흐름식 여과에 의해 수행된다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 단계 (c)는 접선 흐름식 여과에 의한 농축 단계 및 정용여과에 의한 버퍼 교환 단계를 모두 포함한다. 한 특정 실시 양태에서, 단계 (d)는 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환)에 의해 수행된다. 또 다른 실시 양태에서, 단계 (c)는 농축 단계만을 포함한다. 바이러스(예를 들어, RSV)를 정제하는 방법의 추가의 실시 양태들은 하기에 상술된다.
본 발명의 정제 방법은 바이러스 수확물의 정화(단계 (a))를 포함한다. 예를 들어, 감염된 배양물의 원래의 배지는 먼저 세포의 잔해물 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예컨대 10분 내지 30분 동안, 예컨대 1000-2000×g에서 원심분리에 의해 정화될 수 있다. 다르게는, 바이러스를 포함하는 상청액은, 세포와 다른 거대 과립 물질을 온전하게 유지하면서, 바이러스가 통과하기에 충분히 크게 규정된 범위의 공극 크기를 갖는 반투과막 계열을 통해 여과된다. 정제 공정 중의 이러한 정화 단계는 숙주 세포 DNA를 분해하기 위해 비특이적 엔도뉴클레아제 (예를 들어 벤조나아제®)를 이용한 처리 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 바이러스 수확물은 i) 직류식 여과(DFF)로 여과되고; ii) 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리되며; iii) DFF로 다시 여과된다.
한 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 바이러스를 통과시키기에는 충분히 크지만 온전한 세포와 세포의 잔해물을 보유하기에는 충분히 작은 공극 크기를 갖는 MF 막을 이용하는 DFF 및/또는 TFF에 의해 정화된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 비특이적 엔도뉴클레아제의 처리 작업이 함께 조합된 DFF에 의해 정화된다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 약 10 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통해 여과하고 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리한 후, 약 3.0 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통해 다시 여과한다. 특정 실시 양태에서, 정화 공정에서 제1 여과 단계는 약 5.0 ㎛ 내지 약 1.0 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통해 행해진다. 특정 실시 양태에서, 정화 공정에서 제2 여과 단계는 약 3.0 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통해 행해진다. 특정 실시 양태에서, 제1 여과 단계 또는 제2 여과 단계는, 단독으로 혹은 조합되어, 서로 다른 크기의 두 필터가 적층되어 더 작은 공극 크기를 갖는 필터의 막힘을 방지하는 이중막 필터를 사용한다. 한 실시 양태에서, 이 이중 필터의 크기는 약 3/0.8 ㎛인데, 여기서 3 ㎛의 필터가 예비필터로서 작용하여 더 큰 세포 잔해물을 제거하게 된다. 다른 특정 실시 양태에서, 바이러스 수확물은 약 3.0 ㎛의 공극 크기를 갖는 제1막 및 약 3/0.8 또는 약 0.65 ㎛의 공극 크기를 갖는 제2막을 이용하는 DFF에 의해 정화된다.
특정 실시 양태에서, 바이러스(예를 들어, RSV)를 정제하는 방법은 숙주 세포 DNA(HCD)를 분해하기 위해 비특이적 엔도뉴클레아제(예를 들어, 벤조나아제®)를 이용한 처리 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제 처리는 바이러스의 정제 초기 단계에 행한다. 한 실시 양태에서, 바이러스는 단계 (a) 동안 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리된다. 특정 실시 양태에서, 여과된 바이러스 수확물은 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 버퍼와 혼합된다. 일부 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 버퍼 중에 약 5 U/㎖ 내지 약 100 U/㎖의 농도로 존재한다. 다른 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 버퍼 중에 약 5 U/㎖ 내지 약 60 U/㎖의 농도로 존재한다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 약 50 U/㎖로 존재한다. 다른 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 약 10 U/㎖로 존재한다. 한 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 약 1.O mM 내지 약 1O mM의 MgCl2을 포함하는 버퍼 중에 존재한다. 특정 실시 양태에서, 버퍼는 50 U/㎖의 비특이적 엔도뉴클레아제 및 5 mM의 MgCl2을 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, MgCl2은 2 mM로 존재한다. 또다른 특정 구체예에서, 버퍼는 10 U/㎖의 비특이적 엔도뉴클레아제 및 5 mM의 MgCl2를 포함한다.
정화 공정에서 제1 여과 단계 후, 비특이적 엔도뉴클레아제는 여과된 바이러스 수확물을 이용하여 약 1시간 내지 약 4시간 동안 약 32 ± 3℃에서 배양된다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 여과된 바이러스 수확물을 이용하여 약 3시간 동안 32℃에서 배양된다. 또 다른 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는, 바이러스가 비특이적 엔도뉴클레아제에 10분 이상, 또는 20분 이상, 또는 30분 이상, 또는 40분 이상, 또는 50분 이상, 또는 60분 이상, 또는 70분 이상, 또는 80분 이상, 또는 90분 이상, 또는 100분 이상, 또는 110분 이상, 또는 120분 이상, 또는 150분 이상, 또는 180분 이상, 또는 210분 이상, 또는 240분 이상 노출되도록 하기 위해 조절된 조건 하에 배양된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비특이적 엔도뉴클레아제에 대한 노출 시간, 비특이적 엔도뉴클레아제의 농도 및 비특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 버퍼의 부피는 조절될 수 있다. 예를 들어, DNA 오염물질을 분해하는데 필요한 시간을 최소화하기 위해, 비특이적 엔도뉴클레아제의 농도를 증가시킬 수 있으며; 다르게는, 사용되는 비특이적 엔도뉴클레아제의 양을 최소화하기 위해 노출 시간을 증가시킬 수 있다. 특정 실시 양태에서, 비특이적 엔도뉴클레아제는 벤조나아제®이다. 비특이적 엔도뉴클레아제를 이용하여 처리한 후, 이 처리된 바이러스 여과 수확물은 임의의 소화된 DNA 잔기 오염물 및 잔류하는 숙주 세포 잔해물을 제거하기 위해 다시 여과된다.
특정 실시 양태에서, 벤조나아제로 처리한 정화된 바이러스 수확물은 수크로스 인산염 (SP), 트리스 수크로스 (TS) 또는 수크로스 인산염 글루탐산 (SPG) 버퍼를 첨가하여 안정화된다. 이러한 버퍼들은 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은 염을 더 포함할 수 있다. 일정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 SP 버퍼이고, 이 버퍼는 수크로스, 인산칼륨(1염기성 및 2염기성의 조합) 및 염화칼륨을 포함한다. 특정 실시 양태에서, SP 버퍼는 약 250 mM 내지 약 200 mM 수크로스, 100 mM 인산칼륨 및 약 150 mM 염화 칼륨, pH 7.2를 포함한다. 특정 실시 양태에서, SP는 214 mM 수크로스를 포함한다. 일정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 TS 버퍼이고, 이 버퍼는 약 2.5 mM 내지 약 75 mM의 TrisCl(pH 7.2) 및 약 25O mM 내지 약 15O mM의 수크로스를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 5O mM의 TrisCl(pH 7.2) 및 218 mM의 수크로스를 포함한다. TS 버퍼는 단독으로 혹은 조합하여, NaCl, KCl, KH2PO4 또는 K2HPO4를 더 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, NaCl 또는 KCl의 농도는 약 125 mM 내지 약 175 mM이다. 특정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 5 mM의 TrisCl(pH 7.2), 175 mM의 수크로스 및 15O mM의 NaCl 또는 15O mM의 KCl을 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 36 mM의 TrisCl(pH 7.2), 214 mM의 수크로스 및 15O mM의 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 한 실시 양태에서, KH2PO4 또는 K2HPO4가 약 1O mM 내지 약 2.5 mM로 존재한다. 특정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 5 mM의 TrisCl(pH 7.2), 175 mM의 수크로스, 15O mM의 NaCl 및 5 mM의 KH2PO4를 포함한다. 일정 실시 양태에서, 안정화 버퍼는 SPG이며, 이 버퍼는 218 mM의 수크로스, 3.8 mM의 KH2PO4, 7.2 mM의 K2HPO4 및 5 mM의 글루탐산 나트륨을 포함한다. 당업자라면, 가장 높은 수율로 안정화된 바이러스 수확물을 수득하기 위해서는, 안정화 버퍼의 농도가 바이러스, 바이러스 수확물 및 정제 조건에 따라 변화될 수 있다는 사실을 알 것이다.
특정 실시 양태에서, 정화된 수확물은 농축되고/되거나 버퍼가 교환된다.한 실시 양태에서, 농축 및/또는 버퍼 교환은 UF 및 DF에 의해 수행된다. 다른 실시 양태에서, TFF는 UF와 DF 양자 모두에 이용된다. 특정 실시 양태에서, TFF는 일정한 여과물 유속을 유지하기 위해 실행된다. 다른 실시 양태에서, TFF는 일정한 TMP를 유지하기 위해 실행된다. 특정 실시 양태에서, UF 단계는 50O kDa의 중공사 카트리지(GE 헬스케어)를 이용하여 수행되며, 여기서 바이러스 수확물은 15 psi의 작업 TMP 및 12000 sec-1의 전단 속도를 이용하여 5배로 농축된다. 이러한 매개변수들은 최종 백신 조성물의 최대 바이러스 수율을 극대화하기 위해 바이러스 및 정제 조건에 따라 변화될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 정화된 바이러스는 먼저 UF로 농축된 후, 버퍼 교환은 1 또는 2 DF 버퍼에 의해 실시된다. 단지 예로서, 정화된 수확물은 우선 UF 에 의해 농축되고 이후, 수크로스 및 염의 농도가 다른 교환 버퍼를 이용한 2 DF 단계가 실시된다. 따라서, 교환 버퍼는 바이러스 수확물에 존재하는 버퍼와 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 교환 버퍼는 추가의 버퍼 교환 단계에 따라 최종 조성물 버퍼와 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시 양태에서, 교환 버퍼는 중성 pH의 SP, TS 또는 수크로스 시트르산 버퍼이다. 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 약 7-25% w/v의 수크로스를 포함하기 때문에, 약 10O mM 내지 약 80O mM의 수크로스를 저용량 내지 고용량 범위로 제공한다. 한 실시 양태에서, 교환 버퍼는 약 1 mM 내지 약 15O mM의 농도로 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 교환 버퍼는 약 2.5 mM 내지 약 5O mM의 농도로 TrisCl을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 교환 버퍼는 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨을 약 5.O mM 내지 약 5O mM의 농도로 포함한다. 한 실시 양태에서, 교환 버퍼는 인산칼륨을 약 2O mM 내지 약 15O mM의 농도로 포함한다. 일정 실시 양태에서, 인산칼륨의 농도는 대체로 고농도 또는 저농도의 수크로스와 상응하는 저농도 또는 고농도의 제1인산칼륨 및 제2인산칼륨의 조합 농도이다. 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 5 mM 내지 약 30 mM의 제1인산칼륨을 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 약 10 mM 내지 약 80 mM의 제2인산칼륨을 포함한다. 교환 버퍼의 구체적인 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 5 mM의 TrisCl; 7-25% w/v의 수크로스; 1 mM 내지 15O mM의 NaCl; 2O mM의 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨, 7-25% w/v의 수크로스, 15O mM의 NaCl 또는 KCl; 및 10O mM의 인산칼륨, 7-25% w/v의 수크로스, 15O mM의 KCl을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 25% w/v의 수크로스, 약 10O mM의 인산칼륨 버퍼 및 약 15O mM의 KCl을 포함한다(pH 7.2). 추가 실시 양태에서, 이러한 교환 버퍼에서 인산칼륨의 농도는 제1인산칼륨과 제2인산칼륨의 조합농도로서, 예를 들어, 28.5 mM 제1인산칼륨 및 71.2 mM 제2인산칼륨이다. 다른 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 25% w/v의 수크로스, 약 5 mM의 TrisCl 및 약 15O mM의 NaCl(pH 7.2)을 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 교환 버퍼는 10% w/v 수크로스, 약 20 mM 인산칼륨 버퍼 및 약 100 mM KCl, pH 7.0을 포함한다. 추가 실시 양태에서, 이러한 교환 버퍼 내 인산칼륨의 농도는 제1인산칼륨과 제2인산칼륨의 조합농도로서, 예를 들어, 7.7 mM 제1인산칼륨 및 12.3 mM 제2인산칼륨이다. 교환 버퍼 성분들은 최종 조제물과 상용성인 버퍼에 정제된 바이러스를 두고, 또한 크로마토그래피 단계 및 최종 여과 단계의 바이러스 수율을 최대화하기 위해 바이러스 및 정제 조건에 따라 변화될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 안정화된 바이러스 수확물은 상기 기술된 바와 같이 크로마토그래피로 추가로 정제된다. 일부 실시 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피가 사용된다(예를 들어, 음이온 또는 양이온). 특정 실시 양태에서, UF에 의해 부피를 감소시키고 처리된 정화 바이러스 수확물의 정용여과에 의한 버퍼 교환 후, 바이러스는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 이러한 크로마토그래피 단계, 또는 폴리싱(polishing) 단계는, 한 실시 양태에서 네가티브 크로마토그래피를 이용하여 수행된다. 이러한 실시 양태에서, 표면(예를 들어, 중합성 비드)은 바이러스 입자들과의 결합을 배제하여 바이러스가 표면을 그냥 통과하도록 하면서 HCD 또는 HCP와는 결합하도록 유도체화된다. 이러한 개념은 바이러스 입자를 포함하는 버퍼가 상기 유도체화된 표면을 지나치거나 통과하도록 해야하는 다른 표면들에도 적용될 수 있다. 완전한 크로마토그래피 공정은 첨가제가 없고 백신 조성물용 바이러스의 대규모 생산용으로 쉽게 확장가능하다. 크로마토그래피는 회분식 공정으로 또는 다르게는 컬럼 공정을 이용하여 수행될 수 있다는 점도 고려된다. 특정 실시 양태에서, 컨디셔닝된 바이러스 로딩물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
크로마토그래피 단계(수행되는 경우) 또는 버퍼 교환 후, 농축된 바이러스 수확물은 멸균 단계를 거치게 된다. 한 실시 양태에서, 멸균 단계는 최종 여과 단계이다. 한 실시 양태에서, 최종 여과는 3 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 막을 통한 DFF이다. 특정 실시 양태에서, 필터는 3/0.8 ㎛의 이중막이다. 다른 특정 실시 양태에서, 필터는 약 1 mM 이하이다. 한 측면에서, 필터는 0.8, 0.65 또는 0.45 ㎛이다.
특정 실시 양태에서, 바이러스로 감염된 세포로부터 호흡기 세포융합 바이러스를 정제하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) i) 약 10 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 정화 필터를 통한 직류식 여과(DFF)에 의해 바이러스 수확물을 여과하는 단계;
ii) 상기 바이러스 수확물을 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계;
iii) 약 3 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 바이러스 수확물을 여과하는 단계
를 포함하는 바이러스 수확물의 정화 단계;
(b) 염(NaCl 또는 KCl)을 보유하는 수크로스, 인산염 또는 트리스(Tris) 버퍼로 상기 정화된 바이러스 수확물을 안정화하는 단계;
(c) 분획분자량(MWCO) 500 kDa - 0.1 ㎛인 중공사 카트리지를 이용하여 상기 안정화된 바이러스 수확물을 접선 흐름식 여과(TFF)에 의해 농축하고, 정용여과(DF)에 의해 버퍼 교환을 수행하는 단계;
d) 약 0.8 ㎛ 내지 약 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 상기 농축된 바이러스 수확물을 여과하는 단계.
여기에서, 호흡기 세포융합 바이러스는 바이러스 감염된 세포로부터 정제되며, 5.7 log10FFU/㎖ 이상의 최종 바이러스 감염도 역가를 가진다.
다른 특정 실시 양태에서, 정제 방법은 바이러스 수확물의 농축 및 버퍼 교환 후, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다.
또 다른 특정 실시 양태에서, 바이러스 감염된 세포로부터 호흡기 세포융합 바이러스를 정제하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a. i. 공극 크기가 약 3 ㎛∼8 ㎛인 1 이상의 정화 필터를 통한 직류식 여과(DFF)에 의해 바이러스 수확물을 여과하고;
ii. 바이러스 수확물을 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하며;
iii. 공극 크기가 약 0.65 ㎛인 1 이상의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 바이러스 수확물을 여과하는 것을 포함하는 바이러스 수확물을 정화하는 단계;
b. 정화된 바이러스 수확물을 염(NaCl 또는 KCl)을 포함한 수크로스, 인산염 또는 Tris 버퍼로 안정화시키는 단계;
c. 분획분자량(MWCO) 500 kD - 0.1 ㎛인 중공사 카트리지를 이용하여 접선흐름식 여과(TFF)에 의해 안정화된 바이러스 수확물을 농축하고 정용여과(DF)에 의해 2 버퍼 교환을 수행하는 단계;
d. 공극 크기가 약 3/0.8 ㎛인 1 이상의 이중 정화 필터를 통한 DFF에 의해 농축된 바이러스 수확물을 여과하는 단계.
추가 실시 양태에서, 단계 c에서 2 버퍼 교환은 동일한 교환 버퍼로 수행한다. 다르게, 2 버퍼 교환은 상이한 교환 버퍼로 수행한다. 특정 실시 양태에서, DF는 약 25% w/v 수크로스, 약 100 mM 인산칼륨 버퍼 및 약 150 mM KCl, pH 7.2를 포함하는 제1 교환 버퍼로 수행한다. 추가 특정 실시 양태에서, DF는 약 10% w/v 수크로스, 약 20 mM 인산칼륨 버퍼 및 약 100 mM KCl, pH 7.0을 포함하는 제2 교환 버퍼로 수행한다.
6.6 백신 조성물 및 사용법
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이러스(예컨대, 인플루엔자 또는 RSV)에 관한 것이다. 이러한 바이러스는 인간 또는 동물에 투여하기 위한 백신을 제공하기 위해 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 바이러스는 손상되지 않고 온전한 바이러스 입자(예를 들어, 생균 약독화성 바이러스)로서, 또는 불활성/붕괴(disintegrated) 바이러스(예를 들어, 포름알데히드 세정제로 처리된 것)로서 존재할 수 있다. 선택적으로, 규명된 바이러스 성분(예를 들어, 단백질)은 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 바이러스로부터 분리되어 백신 제조에 사용될 수 있다. 백신 조성물용 불활성/붕괴 바이러스 입자의 생산 방법 및 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있어 지난 40년간 이용되어 왔다.
6.6.1 인플루엔자 바이러스 백신
온전한 바이러스 입자(예를 들어, 생균 약독화성 바이러스)의 조성물은 버퍼, 아미노산 부형제(예를 들어, 글루탐산, 아르기닌), 단백질 가수분해물(예를 들어, 콜라겐, 젤라틴), 킬레이트제(예를 들어, EDTA) 및 보존제를 포함한다. 이러한 조성물에 유용한 버퍼는 20O mM의 수크로스 및 pH 7.0-7.4의 인산염 버퍼 또는 히스티딘 버퍼를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 온전한 바이러스 입자의 조성물은 글루탐산 및 아르기닌과 같은 아미노산 부형제를 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 온전한 바이러스 입자의 조성물은 콜라겐 또는 젤라틴(예컨대, 돼지, 어류, 조류 젤라틴)과 같은 안정화 단백질 가수분해물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 온전한 바이러스 입자의 조성물은 인플루엔자 백신 접종 시즌(예를 들어, 북반구에서 보통 대략 9월경부터 3월까지) 동안 "접종 현장"(예를 들어, 2-8℃, 4℃, 5℃ 등에서 냉장시켜 판매 및 상품화하는 현장)에서 저장하기에 충분한 시간 동안 액상 형태로 안정한 생균 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 바이러스/백신 조성물은 저장 기간 동안 그 효능을 유지하거나, 그 효능이 저하되더라도 허용가능한 정도만 퇴색될 것이 요구된다. 다른 실시 양태에서, 이러한 용액/백신은 약 2℃ 내지 약 8℃, 예를 들어, 냉장 온도에서 액상 형태로 안정하다. 예를 들어, 냉장 온도에서 안정적인 약독화성 인플루엔자 백신을 제조하는 방법 및 조성물은 PCT 특허공보 WO 2006/041819에 기술되어 있으며, PCT 공보 WO 2005/014862도 참조할 수 있다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본 발명은 1-5% 아르기닌; 1-4% 젤라틴; 5-10% 수크로스(인산염 버퍼 중에 존재할 수 있음); 0.01-0.1% 글루탐산(일나트륨, 일수화물); 10-150 mM 인산칼륨 및 80-150 mM 히스티딘 중의 하나 이상(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능)을 최종 조성물 중에 포함하는 냉장 온도에서 안정한 백신 조성물을 제공한다.
한 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 1-2% 아르기닌; 2% 젤라틴; 7-10% 수크로스(인산염 버퍼 중에 존재할 수 있음); 및 100 mM 히스티딘 중의 하나 이상을 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 0.01-0.1% 글루탐산(일나트륨, 일수화물); 1-2% 아르기닌; 1% 젤라틴; 및 7-10% 수크로스 중의 하나 이상을 인산염 버퍼 중에 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능).
다른 특정 실시 양태에서, 본 발명은 수크로스 6-8% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1-2% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.05-0.1% w/v; A형 돼지(또는 어류 또는 조류와 같은 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 0.5-2% w/v; 제2인산칼륨 1-2%; 및 제1인산칼륨 0.25-1% w/v 중의 하나 이상을 최종 조성물 중에 포함하는 냉장 온도에서 안정한 백신 조성물을 제공한다.
한 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094 w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v 중의 하나 이상을 포함한다. 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다.
다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 이러한 실시 양태들에서, 조성물은 버퍼[예를 들어, 인산칼륨 버퍼(pH 7.0-7.2)] 중에 존재한다. 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 20% 이내에서 변동 가능).
추가의 또 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 30% 이내에서 변동 가능). 추가의 또 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 40% 이내에서 변동 가능).
다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 1% 이내에서 변동 가능). 또 다른 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루탐산, 일나트륨 일수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 3% 이내에서 변동 가능). 특정 실시 양태에서, 백신 조성물은, 버퍼로서 예를 들어, 인산칼륨(예를 들어, 50 mM 이상, 또는 100 mM 이상, 또는 200 mM 이상, 또는 250 mM 이상)을 또는 대안으로, 히스티딘(예를 들어, 50 mM 이상, 또는 100 mM 이상, 또는 200 mM 이상, 또는 250 mM 이상)을 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 조성물의 액상 공급물이 건조 가열된 기체 스트림 하에서 미세한 액적으로 분사되는 것인 분무 건조, 급속 건조 공정이 백신 조성물의 저장 기간을 연장하기 위해 사용될 수 있다. 미세한 액적의 증발을 통해서, 용해되었던 용질로 구성된 건조 분말이 수득된다(예를 들어, 미국공개특허 제2004/0042972호 참조).
일반적으로, 바이러스 또는 바이러스 성분은 하나 이상의 바이러스 균주에 특이적인 면역 반응을 자극하기 위하여 적절한 담체 또는 부형제의 형태로 예방차원에서 투여될 수 있다. 보통, 담체 또는 부형제는 예컨대, 멸균수, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 수용액, 글리세롤 수용액, 에탄올, 또는 이들의 혼합물과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제이다. 멸균성, pH, 등장성 및 안정성을 확보한 이러한 용액의 제조는 당업계에 확립된 프로토콜에 따라 수행된다. 일반적으로, 담체 또는 부형제는 알레르기 반응 및 다른 부작용을 최소화하면서, 예컨대 피하, 근육내, 비강내 등과 같은 특정 투여 경로에 맞도록 선택된다.
선택적으로, 바이러스, 또는 그의 성분들의 예방학적 투여를 위한 조성물은 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 하나 이상의 아주번트도 함유한다. 적합한 아주번트로는 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대, 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온(polyanion), 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 바실 칼메테-구에린(BCG: Bacille Calmette-Guerin), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 및 합성 아주번트 QS-21과 MF59를 포함한다.
일반적으로, 백신 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 특이적인 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 바이러스의 투여는 보호성 면역 반응을 유도한다. 하나 이상의 바이러스 균주에 대해 보호성 면역 반응을 유발하기 위한 투여량과 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 불활성화된 인플루엔자 바이러스는 약 1-1000 HID50(인간 감염 용량, human infectious dose)의 범위, 즉 투여량 당 약 105-108 pfu(플라크 형성 단위, plaque forming units)로 제공된다. 다르게는, 약 10-50 ㎍, 예를 들면, 약 15 ㎍의 HA가 아주번트없이 투여되며, 이보다 적은 투여량은 아주번트와 함께 투여된다. 일반적으로, 투여량은 예를 들면, 나이, 신체 상태, 체중, 성별, 식이 요법, 투여 시간 및 다른 임상적 요인을 기초로 하여 상기 범위 내에서 조절될 것이다. 예방 백신 조성물은 예를 들면, 주사 바늘과 주사기를 이용하여, 또는 주사 바늘이 없는 주사 장치를 이용하여 피하 또는 근육내 주사함으로써 전신 투여된다. 다르게는, 백신 조성물은 액적, 거대 입자 에어로졸(약 10 미크론 초과)에 의해, 또는 상부 기도 내로 분무하여 비강내 투여된다. 상기 전달 경로 중에서 어느 것이든 보호성 전신 면역 반응을 유도하지만, 비강내 투여는 인플루엔자 바이러스의 도입 부위에서 점막 면역성을 유발하는 추가적인 이점을 제공한다. 비강내 투여의 경우, 약독화성 생균 바이러스 백신, 예를 들어, 약독화성, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성인 재조합 또는 재배열 인플루엔자 바이러스가 대개 바람직하다. 1회의 투여로 보호성 면역 반응을 자극시키는 것이 바람직하지만, 원하는 예방 효과를 달성하기 위해서는 추가의 용량을 동일하거나 다른 경로에 의해 투여할 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 오르소믹소바이러스(A형 및 B형 인플루엔자 균주 포함), 파라믹소바이러스(RSV, 인간 메타뉴모바이러스 및 파라인플루엔자 포함), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 비롯한 임의의 바이러스에 대해서도 적용될 수 있다.
6.6.2 RSV 백신
한 실시 양태에서, 정제된 생균 약독화성 바이러스(예를 들어, RSV)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상에서 면역 방법을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 약독화성 바이러스는 키메라 바이러스이다.
특정 실시 양태에서, 약독화성 RSV를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물(예를 들어, 인간)에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다.
정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상의 능동 면역법(active immunization)에서 사용될 수 있다. 한 실시 양태에서, 정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물, 즉 백신의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 생균 약독화성 바이러스는 키메라 바이러스이다.
특정 실시 양태에서, 정제된 생균 약독화성 RSV를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물, 즉 백신의 유효량을 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV 감염을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다.
생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 바이러스는 바이러스 감염을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시 양태에서, 정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 약독화성 바이러스는 키메라 바이러스이다. 특정 실시 양태에서, 정제된 생균 약독화성 RSV를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV 감염을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다.
정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대상에서 바이러스 역가를 감소시키는 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 한 실시 양태에서, 약독화성 생균 세포 회합 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 바이러스 역가를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 약독화성 바이러스는 키메라이다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 생균 RSV를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV 역가를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량은 미처리된 대상에 비해, 바이러스로 면역 반응이 유도된 대상에서 바이러스 역가를 약 2배, 바람직하게는 약 5배 이상, 약 10배 이상, 또는 약 20배 이상 감소시킨다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량은 미처리된 대상에 비해, 세포 회합 바이러스로 후속 감염된 대상에서 세포 회합 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 지속 시간 및/또는 중증도를 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량은 미처리된 대상에 비해 정제된 바이러스로 후속 감염된 대상의 생존율을 증가시킨다.
정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 순수한(naive) 대상, 즉 해당 바이러스에 감염되지 않았거나 현재 감염되지 않은 대상에게 투여될 수 있다. 한 실시 양태에서, 생균 약독화성 세포 회합 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 바이러스 감염이 생길 위험이 있는 순수한 대상에게 투여될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 RSV 감염이 생길 위험이 있는 순수한 대상에게 투여될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다.
정제된 생균 약독화성 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 해당 바이러스의 다른 집단, 다른 하위 집단 또는 다른 균주로 이미 감염된 대상에게 투여될 수 있다. 한 실시 양태에서, 면역원성 조성물은 해당 바이러스와는 다른 집단, 다른 하위 집단 또는 다른 균주의 바이러스로 이미 감염되고, 해당 바이러스로 인한 감염이 생길 위험이 있는 대상에게 투여된다.
한 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 유아 또는 조산아에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 낭포성 섬유증, 기관지폐형성 장애, 선천성 심장질환, 선천성 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증이 있는 사람에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 걸음마를 배우는 나이의 아이에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 소아 아동에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 취학 아동에게 투여된다.
특정 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 1개월 내지 24개월 된 인간에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 1개월 내지 3개월 된 인간에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 6개월 내지 24개월 된 인간에게 투여된다.
다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 골수 이식을 받은 인간에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 노인에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 양로원에 있는 사람들에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 생균 약독화성 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 대가족인 가정(즉, 15명 이상의 인간이 사는 집)에 사는 사람에게 투여된다.
특정 실시 양태에서, 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물은 보통 북반구의 11월에서 4월까지의 기간인 RSV 시즌 이전에 인간 대상(특정 실시 양태에서, 인간 대상은 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이임)에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물은 보통 북반구의 11월에서 4월까지의 기간인 RSV 시즌 동안에 인간 대상(특정 실시 양태에서, 인간 대상은 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이임)에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물은 보통 북반구의 11월에서 4월까지의 기간인 RSV 시즌 이전에, 그리고 그 시즌 동안에 인간 대상(특정 실시 양태에서, 인간 대상은 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이임)에게 투여된다.
특정 실시 양태에서, 정제된 약독화성 생균 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은, 바이러스로 면역 반응을 유도했을 경우, 미처리된 대상에 비해 바이러스 감염에 대해 완전하게 보호를 할 수는 없지만 더 낮은 바이러스 역가를 유도할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 정제된 약독화성 생균 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 투여는, 바이러스로 면역 반응을 유도했을 경우, 미처리된 대상에 비해 바이러스 역가를 0.5배, 1배, 2배, 4배, 6배, 8배, 15배, 25배, 50배 또는 그 이상으로 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 약독화성 생균 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물의 투여는, 바이러스로 면역 반응을 유도했을 경우, 미처리된 대상에 비해 바이러스 역가를 10%, 바람직하게는 25%, 50%, 75% 또는 그 이상으로 감소시킨다. 바이러스 역가가 감소됨으로 해서 나타나는 이점으로는, 이에 제한되지는 않지만, 바이러스 감염의 중증 증상의 완화, 바이러스 감염의 증상 감소, 바이러스 감염의 지속 시간의 감소를 포함한다.
약독화성 생균 키메라 세포 회합 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 비바이러스성 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 약독화성 생균 키메라 세포 회합 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 질병을 예방 및/또는 치료하기 위하여 대상에게 해당 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 전달하는데 사용될 수 있다.
면역원성 조성물, 예를 들어, 본원에 기술된 백신 조성물을 도입하는데 여러 가지 방법들이 사용될 수 있는데, 이러한 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, 비강내, 기관내, 경구, 폐, 피내, 복강내 및 비경구(예를 들어, 근육내, 정맥내 및 피하) 경로를 이용하는 방법을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 생균 약독화성 세포 회합 바이러스를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 바이러스 감염의 본래의 경로를 통해 투여된다. 특정 실시 양태에서, 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물은 비강내로 투여된다.
예방 주사(면역 유도) 절차에 있어서, 사용될 면역원성 조성물의 양 및 예방 주사의 일정은 당업계의 숙련된 의사에 의해 결정될 것이며, 대상의 면역 반응과 항원 역가를 참고로 하여 투여될 것이다. 특정 실시 양태에서, 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이는, 1회 분 용량의 면역원성 조성물이 약 125 내지 200 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 1회 분이 투여된다. 다른 실시 양태에서, 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이는, 1회 분 용량의 면역원성 조성물이 약 125 FFU, 약 150 FFU, 약 175 FFU, 또는 약 200 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 1회 분 용량이 투여된다.
일부 실시 양태에서, 약 125 내지 200 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 2-6 회분 용량이 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이에게 투여된다. 일부 실시 양태에서, 면역원성 조성물의 용량은 1개월 내지 6개월 간격 또는 2개월 내지 12개월 간격으로 투여된다. 특정 실시 양태에서, 약 125 내지 200 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 3회분의 용량이 유아, 조산아 또는 걸음마를 배우는 아이에게 2개월 간격으로 투여된다. 예를 들어, 150 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 제1회분의 용량을 유아가 1개월 미만일 때 투여한 후, 150 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 제2회분의 용량을 유아가 약 2개월이 되었을 때 투여하고, 150 FFU의 약독화성 생균 RSV(예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH)를 포함하는 면역원성 조성물 제3회분의 용량을 유아가 약 4개월이 되었을 때 투여하는 것이다.
7.7 바이러스
세포 회합 바이러스는 자연적으로 발생된 바이러스, 돌연변이화된 바이러스(예를 들어, UV 방사선, 돌연변이원 및/또는 계대 배양에 대한 노출로 돌연변이화된 바이러스), 재배열체(분절화된 유전체를 갖는 세포 회합 바이러스에 대한 재배열체) 및/또는 유전자 조작된 바이러스일 수 있다. 세포 연관 RNA 바이러스의 비제한적인 예로서는, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 거품형성(foamy) 바이러스, 레트로바이러스, 예컨대 HTLV, 렌티바이러스, 예컨대 HIV 및 SIV, 그리고 레오바이러스를 포함한다. 다르게는, 세포 회합 바이러스는 헤르페스 바이러스와 같은 DNA 바이러스이다. 세포 연관 DNA 바이러스의 비제한적인 예로서는, 헤르페스 바이러스, EBV, CMV 및 마렉병 바이러스(Marek's disease virus)를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물에 포함된 세포 회합 바이러스는 복제가 불가하다. 특정 실시 양태에서, 상기 복제가 불가한 세포 회합 바이러스는 바이러스 유전체 복제 및/또는 합성에 필수적인 하나 이상의 기능에 결함이 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 복제가 불가한 세포 회합 바이러스는 바이러스 입자의 조립에 필수적인 하나 이상의 기능에 결함이 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 복제가 불가한 세포 회합 바이러스는 바이러스 유전체의 복제 또는 합성 및 바이러스 입자의 조립에 필수적인 하나 이상의 기능에 결함이 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물에 포함된 세포 회합 바이러스는 약독화성 생균 바이러스이다. 약독화성 세포 회합 바이러스는, 야생형 세포 회합 바이러스에 비해, 예를 들어, 바이러스 유전체를 복제하는 능력, 대상으로 삼은 숙주 세포에서 복제하는 능력, 감염성 바이러스 입자들을 조립하는 능력 및/또는 숙주 세포를 감염시키는 능력이 감소될 수 있다. 세포 회합 바이러스의 약독화 시험은 당업계에 공지된 어느 방법으로도 수행할 수 있다. 예를 들어, 미국특허출원 제10/831,780호(2004년 4월 23일 출원되고, 2005년 1월 27일에 미국공개특허 제2005/0019891호로 공포됨), 특히 상기 특허에서 "재조합 바이러스의 약독화(Attenuation of Recombinant Viruses)"라는 제목의 섹션 5.7을 참조할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약독화성 바이러스는 잘 알려진 돌연변이 유발, 예컨대 바이러스의 저온 계대 배양 또는 UV 방사선 및/또는 돌연변이원에 대한 노출로 제조된다. 다른 실시 양태에서, 약독화성 바이러스는 유전적으로 조작된다.
세포 회합 바이러스는 키메라 바이러스일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 키메라 바이러스는 복제가 불가한 바이러스이다. 특정 실시 양태에서, 키메라 바이러스는 약독화성 바이러스이다.
6.7.1 인플루엔자 바이러스
본원의 배양 배지, 방법, 공정 및 조성물은 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조 및 정제에 특히 유용하다. 인플루엔자 바이러스는 분절된 단일 가닥 RNA 유전체를 함유한 내부 리보핵산 단백질 코어와, 매트릭스 단백질에 의해 정렬된 외부 지질단백질 외피로 이루어진다. A형 인플루엔자 바이러스 및 B형 인플루엔자 바이러스 각각은 단일 가닥의 (-) 센스 RNA의 분절 8개를 함유한다. A형 인플루엔자 유전체는 11개의 폴리펩타이드를 코딩한다. 분절 1-3은 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제를 구성하는 3개의 폴리펩타이드를 코딩한다. 분절 1은 폴리머라아제 복합체 단백질 PB2를 코딩한다. 나머지 폴리머라아제 단백질 PB1과 PA는 분절 2와 3에 의해 각각 코딩된다. 또한, 일부 인플루엔자 균주의 분절 1은, PB1 코딩 영역 내의 다른 리딩 프레임으로부터 생산되는 작은 단백질인 PB1-F2를 코딩한다. 분절 4는 감염시 세포 부착과 진입에 관여하는 헤마글루티닌(HA) 표면 당단백질을 코딩한다. 분절 5는 바이러스 RNA와 함께 주요 구조 성분인 뉴클레오캡시드 핵산단백질(NP) 폴리펩타이드를 코딩한다. 분절 6은 뉴라미니다아제(NA) 외피 당단백질을 코딩한다. 분절 7은 서로 다르게 스플라이싱된 mRNA들로부터 해독되는, M1과 M2로 명명되는 두 매트릭스 단백질을 코딩한다. 분절 8은 대체하여 스플라이싱된 mRNA 변이체들로부터 해독되는 두 비구조성 단백질인 NS1 과 NS2를 코딩한다.
B형 인플루엔자의 8개의 유전체 분절은 11개의 단백질을 코딩한다. 세 개의 가장 큰 유전자들이 RNA 폴리머라아제의 성분인 PB1, PB2 및 PA를 코딩한다. 분절 4는 HA 단백질을 코딩한다. 분절 5는 NP를 코딩한다. 분절 6은 NA 단백질과 NB 단백질을 코딩한다. NB와 NA 두 단백질 모두 비스시스트로닉(biscistronic) mRNA의 중복된 리딩 프레임으로부터 해독된다. B형 인플루엔자의 분절 7은 M1과 M2의 두 단백질도 코딩한다. 가장 작은 분절은 전장 RNA로부터 해독되는 NS1과, 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 해독되는 NS2의 두 생성물을 코딩한다.
재조합 바이러스는 마스터 도너 바이러스(MDV)로도 명명되는 승인된 마스터 균주와 관련하여 선택된 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제 항원을 도입하기 위하여 제조된다. FluMist®는 승인된 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성 MDV 균주(예로서, A/앤 아버/6/60 및 B/앤 아버/1/66)를 사용한다. 마스터 도너 바이러스로서 사용될 수 있는 다른 균주로서는, 이에 제한되지는 않지만, ca A/앤 아버/6/60, ca B/앤 아버/1/66, ca A/레닌그라드/134/17/57, A/푸에르토리코/8/34 (PR8), ca B/앤 아버/1/94, B/레닌그라드/14/17/55, B/USSR/60/69 및 B/레닌그라드/179/86을 포함한다.
난세포를 기재로 하는(egg-based) 방법 및 보다 최근에 개발된 세포 배양 방법(예로서, PCT 공보 WO 03/091401; WO 05/062820과, 미국등록특허 제6,544,785호; 제6,649,372호; 제6,951,754호 및 미국특허출원 제11/455,818호, 제11/455,734호 및 제11/501,067호 참조)을 비롯한 다수의 방법이 재배열 바이러스의 제조에 유용하다. 본 발명의 배지 및 방법은, 이에 제한하지는 않지만, 본원에 개시된 인플루엔자 균주를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 생산과, 마스터 도너 바이러스의 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스(A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, PR8)의 생산을 위해 유용하다는 점도 고려된다. 추가로, 본 발명의 배지 및 방법은 온도 감수성, 저온 적응성 및 약독화성 표현형 중 하나 이상의 표현형을 갖는 재배열 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 유용하다는 점도 고려된다. 통상적인 재조합 기법, 예를 들면, 동시 감염(co-infection) 방법에 의해, 또는 선택적으로 플라스미드 레스큐(rescue) 기법에 의해 재조합체를 생성시킬 수 있다(예로서, PCT 공보 WO 03/091401; WO 05/062820와, 미국등록특허 제6,544,785호; 제6,649,372호; 제6,951,754호; 제6,887,699호, 제6,001,634호, 제5,854,037호, 제5,824,536호, 제5,840,520호, 제5,820,871호, 제5,786,199호, 및 제5,166,057호; 미국공개특허 제20060019350호, 제20050158342호, 제20050037487호, 제20050266026호, 제20050186563호, 제20050221489호, 제20050032043호, 제20040142003호, 제 20030035814호 및 제20020164770호; 및 문헌 [Neumann et al., (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs, Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350]; [Fodor et al ., (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA, J. Virol 73:9679-9682]; [Hoffmann et al ., (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113]; WO 01/83794; [Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81:2843-2847]; 및 [Hoffmann et al ., (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17):11411-11416]를 참조할 수 있다). 최근에는, MDCK 세포 내에서 플라스미드 레스큐를 이용해 재조합체를 생성하였다(예를 들어, PCT 공보 WO 2007/124327; 문헌 [Wang and Duke; 2007 Oct 23, J. Virol, 4:102] 참조).
6.7.2 호흡기 세포융합 바이러스
본원의 방법, 공정 및 조성물은 백신용 RSV의 제조 및 정제에 특히 유용하다. RSV의 임의의 집단, 하위 집단 또는 균주 (예를 들어, A 집단 또는 B 집단)는 본원에 기술된 공정에 의해 정제될 수 있고/있거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, RSV의 임의의 집단과 하위 집단에 대한 논고는 문헌 [Sato et al., 2005, Journal of Clinical Microbiology 43:36-40]을 참조할 수 있다. 한 실시 양태에서, RSV는 A 집단에 속한다. 다른 실시 양태에서, RSV는 B 집단에 속한다.
본원에 기술된 공정에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함되는 RSV는 자연적으로 발생된 RSV 균주, 돌연변이화된 RSV (예를 들어, UV 방사선 노출, 돌연변이원 및/또는 계대 배양에 의해 돌연변이 유발된 바이러스) 및/또는 유전적으로 조작된 RSV일 수 있다. 한 실시 양태에서, RSV 유전체는 F, G, NS1, NS2, M1 (오픈 리딩 프레임("ORF") 1), M2(ORF2), SH2, N, P, 또는 L 유전자와 같은 하나 이상의 바이러스 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, RSV 유전체 내에 치환, 결실 및/또는 삽입을 조합한 것이 도입된다. 일부 실시 양태에서, RSV 유전체는 F, G, NS1, NS2, M1(ORF1), M2(ORF2), SH2, N, P, 또는 L 유전자와 같은 하나 이상의 바이러스 유전자에서 하나 이상의 미스센스(missense) 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, RSV 유전체는 F, G, NS1, NS2, M1(ORF1), M2(ORF2), SH2, N, P, 또는 L 유전자와 같은 하나 이상의 바이러스 유전자 모두 혹은 일부에 있어서 하나 이상의 결실을 포함한다.
한 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함되는 RSV는 복제가 불가하다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제되고/되거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함되는 RSV는 약독화된다. 바이러스를 약독화시키기 위해 RSV 유전체 내에 도입될 수 있는 비제한적인 돌연변이의 예들은, 예를 들어, 2004년 4월 23일에 출원된 미국특허출원 제10/831,780호 (2005년 1월 27일에 미국공개특허 제2005/0019891호로 공포됨) 및 2006년 3월 24일에 출원된 미국특허출원 제11/389,618호 (2006년 1월 20일에 미국공개특허 제2006/0160130호 공포됨)를 참조할 수 있다. 약독화성 RSV로는, 이에 제한되지는 않지만, 저온 계대 배양된(cp) 돌연변이체 (예를 들어, 본원에 그 내용 전체가 참조로 포함되는 문헌 [Kim et al., 1971, Pediatrics 48:745-755]에 기술되어 있는 cpRSV), 온도 감수성(ts) 돌연변이체 (예를 들어, 문헌 [Crowe et al., 1993, Vaccine 11:1395-1404]; [Crowe et al., 1995, Vaccine 13:847-855]; [Mills et al., 1971, J Immunol. 107:123-130]; 및 [Pringle et al., Vaccine 1993, 11:473-478]에 기술되어 있는 RSV ts-1, RSV ts-2, ts-1A, ts19A 및 ts1C), 저온 계대 배양된 온도 감수성(cpts) 돌연변이체 (예를 들어, cpts248/404, cpts248/255, cpts 248/955 및 cpts 530/1009; 예를 들어, 문헌 [Karron et al., 1997, J Infect Dis. 176:1428-1436] 참조) 및 유전적으로 조작된 돌연변이체 (예를 들어, 문헌 [Karron et al., J. of Infect. Diseases 191:1093-1140]; [Whitehead et al., 1999, J. Virol. 73:3438-3442]; 및 [Collins et al., 2005, Proc. Am. Thorac. Soc. 2: 166-173]에 기술되어 있는 rA2cp248/404ΔSH, rA2cp248/404/1030ΔSH, rΔNS1, rΔM2-2 및 r248ΔNS2)를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제될 수 있고/있거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함될 수 있는 RSV는 rA2cp248/404/1030ΔSH이다. 이러한 약독화성 RSV는 그 온도 감수성 및 약독화 특성의 원인이 되는 하기를 비롯한 다수의 약독화 유전적 요소들을 포함한다: (i) 저온 계대 배양된 RSV를 약독화하는 N, F 및 L 단백질의 5세트의 미스센스 돌연변이; (ii) 제한 온도를 더 낮추어 온도 감수성 표현형을 제공해 바이러스를 약독화시키는 L 단백질 내에 미스센스 돌연변이를 분리하는 248번 및 1030번의 변형; (iii) M2 유전자의 유전자 개시 전사 신호에 있어서 뉴클레오타이드 치환과, 추가적인 온도 감수성을 함께 부여하는 L 단백질의 미스센스 돌연변이와의 조합인 404번 변형; 및 (iv) 약독화 표현형을 제공하는 SH 유전자 전체가 결실된 것인 ΔSH. RSV 유전체 내로 도입된 아미노산 치환의 위치에 대해서는 하기 표 1를 참조한다.
[표 1]
Figure pct00002
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 공정에 의해 정제될 수 있고/있거나 본원에 기술된 면역원성 조성물 내에 포함될 수 있는 RSV는 하나 이상의 이종성 서열을 발현하도록 조작된다(즉, RSV는 키메라 바이러스임). 이종성 서열은 예를 들어, F, G, NS1, NS2, M1 (ORF1), M2(ORF2), N, P, SH2 및/또는 L 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. RSV에 조작될 수 있는 이종성 서열의 비제한적인 예로서는, 항원 [예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 항원(문헌 [Robbins and Kawakawi, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636]에 기술된 것과 같은 항원), 진균 항원 및 기생충 항원], 마커 또는 태그 (예를 들어, 플래그 태그 및 His 태그), 키메라 단백질 (예를 들어, 두 개의 서로 다른 RSV 균주에서 유래한 RSV G 단백질의 하이브리드) 및 원하는 생물학적 특성 또는 활성을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 (예를 들어, 인터페론 (IFN)-α IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-22와 같은 사이토카인)를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 키메라 RSV는 약독화된다. 키메라 RSV의 비제한적인 예로서는, 예를 들어, 2004년 4월 23일에 출원된 미국특허출원 제10/831,780호 (2005년 1월 27일에 미국공개특허 제2005/0019891호로 공포됨) 및 2006년 3월 24일에 출원된 미국특허출원 제11/389,618호 (2006년 1월 20일에 미국공개특허 제2006/0160130호 공포됨)를 참조할 수 있다.
한 실시 양태에서, RSV는 RSV 벡터 이외에 RSV의 다른 집단, 하위 집단 또는 균주에 속하는 바이러스에서 유래된 하나 이상의 바이러스 항원을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, RSV 벡터는 B 집단 RSV로부터 유래될 수 있으며, 이종성 서열은 A 집단 RSV로부터 유래될 수 있다.
다른 실시 양태에서, RSV는 RSV 이외의 바이러스로부터 수득되거나 그로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 항원을 발현하도록 조작된다. 바이러스 항원의 비제한적인 예로서는, 아데노바이러스과(科)(adenoviridae)(예를 들어, 포유동물아데노바이러스 및 조류아데노바이러스), 헤르페스바이러스과(herpesviridae)(예를 들어, 단순헤르페스바이러스(herpes simplex virus) 1, 단순헤르페스바이러스 2, 단순헤르페스바이러스 5, 단순헤르페스바이러스 6, 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus), HHV6-HHV8 및 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 레비바이러스과(leviviridae)(예를 들어, 레비바이러스, 엔테로박테리아 파지 MS2, 알로레바이러스), 폭스바이러스과(poxviridae)(예를 들어, 초르도폭스바이러스(chordopoxvifinae), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 조류폭스바이러스(apipoxvirus), 염소두종바이러스(capripoxivirus), 레포리폭스바이러스(leporiripoxivirus), 수이폭스바이러스(suipoxivirus), 멀루시폭스바이러스(molluscipoxvirus) 및 엔토모폭스바이러스(entomopoxivirus)), 파포바바이러스과(papovaviridae)(예를 들어, 폴리오마바이러스(polyomavirus) 및 유두종바이러스(papillomavirus)), 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae) [예를 들어, 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 1, 모빌리바이러스(mobillivirus)(예를 들어, 홍역 바이러스(measles virus)), 루불라바이러스(rubulavirus)(예를 들어, 귀밑샘염 바이러스(mumps virus)), 뉴모노바이러스(pneumonovirinae)(예를 들어, 뉴모바이러스(pneumovirus), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(human respiratory synctial virus)) 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)(예를 들어, 조류뉴모바이러스 및 인간 메타뉴모바이러스)], 피코르나바이러스과(picornaviridae)[예를 들어, 장내 바이러스(enterovirus), 코감기 바이러스(rhinovirus), 헤파토바이러스(hepatovirus)(예를 들어, 인간 A형 간염 바이러스), 카디오바이러스(cardiovirus) 및 압토바이러스(dqthovirus)], 레오바이러스과(reoviridae)(예를 들어, 오르소레오바이러스(orthoreovirus), 오르비바이러스(orbivirus), 로타바이러스(rotavirus), 사이포바이러스(cypovirus), 피지바이러스(fijivirus), 피토레오바이러스(phytoreovirus) 및 오리자바이러스(oryzavirus)), 레트로바이러스과(retroviridae)[예를 들어, 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스(lentivirus){예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) 1 및 인간 면역결핍 바이러스 2(예를 들어, HIV gp160), 스푸마바이러스(spumavirus)}], 플라비바이러스과(flaviviridae)(예를 들어, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스(dengue virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)), 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae)(예를 들어, B형 간염 바이러스), 토가바이러스과(togaviridae)[예를 들어, 알파바이러스 (예를 들어, 신드비스 바이러스(sindvis virus)) 및 루비바이러스(rubivirus)(예를 들어, 풍진 바이러스(rubella virus)], 랍도바이러스과(rhabdoviridae)(예를 들어, 베시쿨로바이러스(vesiculovirus), 리싸바이러스(lyssavirus), 에페메로 바이러스(ephemerovirus), 시토랍도바이러스(cytorhabdovirus) 및 네클레오랍도바이러스(necleorhabdovirus)), 아레나바이러스과(arenaviridae)(예를 들어, 아레나바이러스(arenavirus), 림프구성 맥락수막염바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 입피바이러스(Ippy virus) 및 라싸바이러스(lassa virus)) 및 코로나바이러스과(coronaviridae)(예를 들어, 코로나바이러스 및 토로바이러스)의 항원을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 항원은 호흡기 질병을 유발하는 바이러스로부터 유래할 수 있으며, 예컨대 인플루엔자 항원 (예를 들어, 헤마글루티닌 H5 및 H7), 메타뉴모바이러스 항원, 파라인플루엔자 항원, 뉴캐슬병바이러스 항원, 센다이바이러스 항원 및 전염성 후두기관지염 바이러스 항원(ILV)을 들 수 있다. 특정 실시 양태에서, 바이러스 항원은 제1형 인간 파라인플루엔자 바이러스, 제2형 인간 파라인플루엔자 바이러스, 제3형 인간 파라인플루엔자 바이러스, 또는 센다이바이러스로부터 유래한다. 다른 실시 양태에서, 바이러스 항원은 HIV gp120, HIV nef, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, HTLV tax, 단순헤르페스바이러스 당단백질 (예를 들어, gB, gC, gD 및 gE) 또는 B형 간염 표면 항원, C형 간염 E 단백질 또는 코로나바이러스 돌기 단백질이다.
다른 실시 양태에서, RSV는 하나 이상의 박테리아 항원 (예를 들어, 박테리아 피복 단백질 또는 박테리아와 결합된 보호성 항원)을 발현하도록 조작된다. 박테리아 항원의 비제한적인 예로서는, 아쿠아스피릴룸(Aquaspirillum)과(科), 아조스피릴룸(Azospirillum)과, 아조박테라시애(Azotobacteraceae)과, 박테로이다시애(Bacteroidaceae)과, 바르토넬라(Bartonella)종(種), 브델로비브리오(Bdellovibrio)과(), 캄필로박터(Campylobacter)종, 클라미디아(Chlamydia)종(예컨대, 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)), 엔테로박테리아시애과(Enterobacteriaceae)(예컨대, 시트로박터(Citrobacter )종, 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터 에어로진(Enterobacter aerogenes), 어위니아종(Erwinia), 대장균(Escherichia coli), 하프니아(Hafnia)종, 클렙시엘라(Klebsiella)종, 모르가넬라(Morganella)종, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella)종, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 가르디넬라(Gardinella)과, 해 모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 할로박테리아시애(Halobacteriaceae)과, 헬리코박터(Helicobacter)과, 레지오날라시애(Legionallaceae)과, 리스테리아(Listeria)종, 메틸로코카시애(Methylococcaceae)과, 미코박테리아(mycobacteria)(예컨대, 미코박테리움 튜버컬로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 네이세리아시애(Neisseriaceae)과, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum)과, 파스퇴렐라시애(Pasteurellaceae)과, 뉴모코커스(Pneumococcus)종, 슈도모나스(Pseudomonas)종, 리조비아시애(Rhizobiaceae)과, 스피릴룸(Spirillum)과, 스피로소마시애(Spirosomaceae)과, 스타필로코커스(Staphylococcus)(예컨대, 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 파이로진(Staphylococcus pyrogenes)), 스트렙토코커스(Streptococcus)(예컨대, 스트렙토 코커스 엔테리티디스(Streptococcus enteritidis), 스트렙토코커스 파스시애(Streptococcus fasciae) 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)), 뱀피로비브르 헬리코박터(Vampirovibr Helicobacter)과, 에르시니아(Yersinia)과, 바 실러스 안트라시스(Bacillus antracis) 및 뱀피로비브리오(Vampirovibrio)과의 박테리아로부터 유래된 항원을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 박테리아 항원은 뉴모코커스(Pneumococcus)종, 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)와 같은 호흡기 질병을 유발하거나 이러한 질병과 관련된 박테리아로부터 유래된다.
다른 실시 양태에서, RSV는 병원성 진균으로부터 수득되거나 유래한 하나 이상의 진균성 항원을 발현하도록 조작된다. 진균성 항원의 비제한적인 예로서는, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans); 블라스토마이세스 더마 티티디스(Blastomyces dermatitidis); 아이엘로마이세스 더마티티디스(Aiellomyces dermatitidis); 히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum); 코시디오데스 이미티스(Coccidioides immitis); 칸디다(Candida)종(예컨 대, 칸디다 알비칸스(C. albicans), 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 칸디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 칸디다 구일리에르몬디(C. guilliermondii) 및 칸디다 크루세이(C. krusei)); 아스퍼길러스(Aspergillus)종(예컨 대, 아스퍼길러스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스퍼길러스 플라부스(A. flavus) 및 아스퍼길러스 니거(A. niger)); 리조푸스(Rhizopus)종 ; 리조무코르(Rhizomucor)종 ; 쿠닝하멜라(Cunninghammella)종 ; 아포피소마이세스(Apophysomyces)종(예컨 대, 아포피소마이세스 삭세나에아(A. saksenaea), 아포피소마이세스 무코르(A. mucor) 및 아포피소마이세스 압시디아(A. absidia)); 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenckii), 파라코시디오이데스 브라실리 엔시스(Paracoccidioides brasiliensis); 슈달레쉐리아 보이디(Pseudallescheria boydii); 토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata); 트리코파이톤(Trichophyton)종 ; 미크로스포룸(Microsporum)종 및 더마토파이레스(Dermatophyres)종으로부터 유래된 항원을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 진균성 항원은 호흡기 질병을 유발하거나 이러한 질병과 관련된 병원성 진균으로부터 유래된다.
다른 실시 양태에서, RSV는 하나 이상의 기생충 항원을 발현하도록 조작된다. 기생충 항원의 비제한적인 예로서는, 아피콤플렉사(Apicomplexa)문(門)의 구성원, 예컨대 바베시아(Babesia), 톡소플라스마(Toxoplasma), 플라스모디움(Plasmodium), 에이 메리아(Eimeria), 이소스 포라(Isospora), 아톡소플라스마(Atoxoplasma), 시스토이소스포라(Cystoisospora), 함몬디아(Hammondia), 베 스니오티아(Besniotia), 사르코시스티스(Sarcocystis), 프렌켈리아(Frenkelia), 해모프로테우스(Haemoproteus), 류코사이토준(Leucocytozoon), 테일레리아(Theileria), 페르킨수스(Perkinsus) 및 그레가리나(Gregarina) 종; 뉴모사이스티 스 카리니(Pneumocystis carinii); 미크로스포(Microspora)라문의 구성원, 예컨대 노세마(Nosema), 엔테로사이토준(Enterocytozoon), 엔세팔리토준(Encephalitozoon), 셉타타(Septata), 므라제키아(Mrazekia), 암블료스포라(Amblyospora), 아메손(Ameson), 글루게아(Glugea), 플레이스토포라(Pleistophora) 및 미크로스포리디 움(Microsporidium) 종; 및 아세토스포라(Ascetospora)문의 구성원, 예컨대 하플로스포리디움(Haplosporidium) 종뿐 아니라, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 비박스(P. vivax), 플라스모디움 오발레(P. ovale), 플라스모디움 말라리아(P. malaria); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii); 레이쉬마니아 멕시카나(Leishmania mexicana), 레이쉬마니아 트로피카(L. tropica), 레이쉬마니아 마조르(L. major), 레이쉬마 니아 애티오피카(L. aethiopica), 레이쉬마니아 도노바니(L. donovani); 트리파노소 마 크루 지(Trypanosoma cruzi), 트리파노소 마 브루세이(T. brucei); 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움(S. haematobium), 쉬스토소마 자포니움(S. japonium); 트리키넬라 스 피랄리스(Trichinella spiralis); 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti); 브루키아 말라릴리(Brugia malayli); 엔타모에바 히스토리티 카(Entamoeba histolytica); 엔테로 비우스 베르미쿨로아루 스(Enterobius vermiculoarus); 태 니아 솔리움(Taenia solium), 태니아 사기나타(T. saginata); 트리초모나스 바기나티스(Trichomonas vaginatis), 트리초모 나스 호미니스(T. hominis), 트리초모나스 테낙스(T. tenax); 기아르디아 람블리아(Giardia lamblia); 크립토스포 리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum); 뉴모시티스 카리니(Pneumocytis carinii); 바베시 아 보비스(Babesia bovis), 바베 시아 디베르겐스(B. divergens), 바베시아 미크로티(B. microti); 이소스포라 벨리(Isospora belli); L 호미니스(L hominis); 디엔타모에바 프라길리스(Dientamoeba fragilis); 온초세르카 볼부루스(Onchocerca volvulus); 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides); 네카토르 아메리카니스(Necator americanis); 안사일로스토마 듀오데날레(Ancylostoma duodenale); 스트론글리오이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis); 카필라리아 필립피넨시스(Capillaria philippinensis); 안지오스트론길루스 칸토넨시스(Angiostrongylus cantonensis); 히메노레피스 나나(Hymenolepis nana); 디필로보트리움 라툼(Diphyllobothrium latum); 에키노코커스 그라눌로수 스(Echinococcus granulosus), 에키노코커스 물티로쿨라리스(E. multilocularis); 파라고니무스 웨스터마니(Paragonimus westermani), 파라고니무스 칼리엔시스(P. caliensis); 클로노키스 시넨시스(Chlonorchis sinensis); 오피스 토르키스 펠리네아 스(Opisthorchis felineas), G. 비베리니(G. Viverini), 파스시올라 헵파티카(Fasciola hepatica); 사르콥테스 스카비에이(Sarcoptes scabiei); 페디 쿨루스 휴마 누스(Pediculus humanus); 프티르루스 푸비스(Phthirlus pubis) 및 더마토비아 호미니스(Dermatobia hominis)를 비롯한 종으로부터 유래된 항원을 포함한다.
8. 실시예
이제 본 발명을 하기 실시예를 참고로 기술한다. 이들 실시예는 예시의 목적으로 제시되는 것일 뿐, 본 발명이 어떤 경우라도 이러한 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안될 것이며, 오히려 본원에 제공되는 교시의 결과로 비추어 보아서 명백해지는 사실이 되는 그 어떤 변형이라도 모두 본원에 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 물론, 사용되는 특정 장비와 시약, 크기, 제조업자 등에 대한 구체적인 목록 또는 설명은 그에 대해 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명에 기재된 내용으로 제한되는 것으로 생각해서는 안 된다. 또한, 유사하게 수행되는 다른 장비 및 시약들로 용이하게 대체될 수 있다.
8.1 배지 및 세포 배양 과정
MDCK 세포, 특히 비종양유발성 MDCK 세포를 고농도로 증식시키는데 유용한 무혈청 배지 조성물(예컨대, MediV SFM 107, MediV SFM 105)은 이미 기술하였다(예컨대, FL410US 및 G-FL414US 참조). 그러나, 이러한 무혈청 배지 조성물을 무혈청 배지에 적응된 비종양유발성 MDCK 세포(예컨대, ATCC 접근 번호 PTA-7909 또는 PTA-7910)와 함께 사용하는 작업은, 배지를 교환하지 않고도 재조합 인플루엔자 바이러스의 피크 바이러스 역가(일반적으로 log10FFU/㎖로 측정됨)를 양호하게 수득할 수는 있지만, 배지를 교환 [증식 배지의 일부 (예컨대, ~67%)를 제거하여 세포를 증식시킨 후 감염 전(또는 감염과 동시에)에 감염 배지로 대체하는 배지 교환] 하면서 얻은 것에 비해 피크 역가에 있어서는 여전히 더 낮은 것으로 나타났다. 게다가, 이러한 피크 역가를 얻으려면 추가의 프로테아제(TrypLE)가 필요했다. 배지 교환의 필요성 및/또는 추가의 프로테아제 필요성을 극복하기 위해, 강화된 배지인 MediV SFM 110이 개발되었다. MediV SFM 110은 비타민, 리놀레산, 리포산, 뉴클레오시드, 푸트레신 및 상기 기술된 배지 내에 존재하는 거의 모든 아미노산을 5X 농도로 포함한다(표 2 참조). MediV SFM 110의 사용으로는 MediV SFM 105 + TE를 사용하여 얻은 것에 비해 세포 밀도가 개선되지는 않았다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 0% 및 67%의 배지 교환을 수행한 MediV SFM 110은 유사한 바이러스 역가를 나타냈다.
무 배지 교환(MX) 공정 및 4개의 종균 반응기에서 비드간 이동(하기 섹션 8.2에 제공된 실시예 참조)으로 제조되어 MediV SFM 110 배지에서 증식된 세포를 이용한 12회 러닝의 성능에 대해서는 하기에 기술하였다. 야생형 균주인 A/우루과이/716/2007, A/사우스 다코타/6/2007 및 B/플로리다/4/2006 (식별자 "ca"를 앞에 기재하는 야생형 균주 명명법에 의해 지칭됨)의 HA 및 NA를 포함하는 세 개의 저온 적응성 (ca), 온도 감수성 (ts), 약독화성 (att) 재조합 바이러스 균주를 2L 규모에서 제조하여, 3개의 균주 모두 8.4 log10FFU/㎖ 이상의 역가로 바이러스를 생산하였다. 종균 반응기에서의 세포 분리 및 최종 생산 반응기(FPR)에서의 세포 분리가 적절히 이루어졌는지에 대해서는, 1X DPBS 세척을 이용하는 비드간 이동과 pH 8.0에서 TrypLE 셀렉트(select) 및 EDTA를 이용하는 트립신화 과정 후에 이를 관찰하였다. 감염시, 이러한 세포들의 샘플을 정기적으로 채취하여 최적의 수거 시간을 결정하였다. 피크 바이러스 역가는 모든 바이러스 유형에 대해 감염후 3일째(dpi) 되는 날에 관찰되는 것으로 밝혀졌다. 결과의 재현가능성을 검증하기 위해 이들 균주 각각에 대해 4회의 러닝을 수행하고 데이터를 서로에 대해 연관시켜 비교하였다. ca A/우루과이/716/2007은 감염 후 3일째(dpi)에 8.7±0.05 log10FFU/㎖의 가장 높은 역가를 나타냈던 반면에, ca A/사우스 다코타/6/2007 및 ca B/플로리다/4/2006에 대한 피크 역가는 각각 3dpi에 8.8±0.0 log10FFU/㎖와 8.45±0.25 log10FFU/㎖를 나타내었다.
상기 러닝 데이터의 재현가능성은 무 배지 교환 공정이 확실한 방법임을 알려주고 있다. 따라서, 상기 강화된 배지는 배지 또는 성분들의 교환이나 첨가 없이 생산성을 유지하게 된 것이다. 결과적으로, 강화된 배지를 개발하여 사용하였더니, 세포 배양 기반의 인플루엔자 백신 생산에 있어서 가장 난관에 부딪혔던 작업 문제 중의 하나인 배지 교환/보충의 필요성을 극복할 수 있게 되었다.
8.1.1 재료 및 방법
재료, 시약 및 장비 : 유사하게 수행되는 다른 장비 및 시약들로 용이하게 대체될 수 있다.
1. 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) / Ham F12 [미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코(Gibco)사 제조, Cat No. ME080012]
2. 정제수(MilliQ) 또는 주사용수(WFI Water)
3. MediV SFM 110 베이스 분말 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코사 제조, Cat No. ME080045)
4. 글루코스 [미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)사 제조, Cat No. 15023-021]
5. 아셀렌산염나트륨 [미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)사 제조, Cat No. 6607-31]
6. L-글루타민 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코사 제조, Cat No. 25030-081)
7. CD 지질 (100X) (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코사 제조, Cat No. 11905-031)
8. 밀 펩톤 [프랑스 라 꾸흐뇌브 SAS 소재의 오르가노테크니(Organotechnie)사 제조, Cat No. 19559]
9. 인슐린 [미국 조지아주 노르크로스 소재의 세롤로지컬(Serological)사 제조, Cat No. 4506]
10. T3 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사 제조, Cat No. T5516)
11. 히드로코르티손 [미국 뉴욕주 필립스버그 소재의 말린크로트(Mallinckrodt)사 제조, Cat No. 8830(-05)]
12. 프로스타글란딘 El (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사 제조, Cat No. P7527)
13. EGF (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사 제조, Cat No. E9644)
14. 구연산 제2철 암모늄 [미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 J.T. 베이커(Baker)사 제조, Cat No. 1980-01]
15. 트로폴론 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사 제조, Cat No. T89702-5G)
16. 미량 원소 A [미국 버지니아주 머내서스 소재의 셀그로우/미디어테크(Cellgro/Mediatech)사 제조, Cat No. 99-182-cl]
17. 미량 원소 B [미국 버지니아주 머내서스 소재의 셀그로우/미디어테크사 제조, Cat No. 99-175-cl]
18. 미량 원소 C [미국 버지니아주 머내서스 소재의 셀그로우/미디어테크사 제조, Cat No. 99-176-cl]
19. 중탄산나트륨 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐사 제조, Cat. No. 91425/87-5067)
20. 둘베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS) pH-7.4 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐사 제조, Cat No. 14190-367)
21. EDTA - DPBS 용액 봉지 (기브코사, Cat No. 14190-367)
22. 0.5 M의 EDTA pH-8 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코사 제조, Cat No. 15575-038)
23. 0.2 ㎛ 스테리컵(stericup) 필터 [미국 메사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore)사 제조, Cat No. SCGPU05RE]
24. TrypLE 셀렉트 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코사 제조, Cat No. 12563)
25. 리마콩 억제제 [미국 뉴저지주 레이크우드 소재의 워딩턴(Worthington)사 제조, Cat No. LS002829]
26. 사이토덱스(Cytodex) 3 [미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 애머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)사 제조, Cat No. 17-0485-03]
27. 수크로스 인산염 [미국 유타주 로간 소재의 하이클론(Hyclone)사 제조, Cat No. SH3A1578-01]
28. 10-20L 멸균 봉지 [미국 캔자스주 레넥사 소재의 SAFC 바이오사이언스(Biosciences) JRH 사 제조, Cat No. 1329B]
29. 롤러병 [미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝(Corning)사 제조, Cat No. 3907]
30. NaOH 1M 용액 (독일 다름슈타트 소재의 EMD사 제조, Cat No. 1071)
31. 0.2 ㎛의 멸균 필터 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝사 제조, Cat No. 430320, 430767)
32. 1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL 피펫 (미국 캘리포니아주 브리즈번 소재의 VWR사 제조, Cat. Nos. 53284-700, 53283-704, 708, 710, 각각 순서대로)
33. 5 mL 흡입 피펫 (미국 캘리포니아주 브리즈번 소재의 VWR사 제조, Cat No. 53392-044)
34. 1.8 mL 에펜도르프 시험관(Eppendorf tube) (미국 플로리다주 오켈러 소재의 USA 사이언티픽, Cat No. 1415-5510)
35. 마이크로피펫 팁 [미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 아트 몰레큘러 바이오프로덕츠(Art Molecular Bioproducts)사 제조, Cat No. 2OE, 200E 및 1000E]
36. 수크로스 인산염, 10X (미국 유타주 로간 소재의 하이클론사 제조, Cat# SH3A1578-01)
37. 애플리콘 콘트롤러 유닛(Applikon Controller Unit) [미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 애플리콘 바이오테크놀로지(Applikon Biotechnology)사 제조, 모델: ADI 1010, ADI 1025]
38. 3L 유리 용기 및 헤드플레이트 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 애플리콘 바이오테크놀로지사 제조)
39. 2.5″A310 교반 날개 [미국 뉴욕주 로체스터 소재의 라이트닌(Lightnin)사 제조]
40. 60 mm 해수용 교반 날개 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 애플리콘 바이오테크놀로지사 제조).
41. 45 mm 해수용 교반 날개 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 애플리콘 바이오테크놀로지사 제조).
42. 연동 펌프 [미국 메사추세츠주 윌밍턴 소재의 와트슨 말로우 브레델 펌프(Watson Marlow Bredel Pump)사 제조, 모델 520S/R]
43. 무균작업대(Biosafety cabinet) [미국 메인주 산포드 소재의 더 베이커 컴퍼니(The Baker Company)사 제조, SG-600]
44. 롤러병 인큐베이터 [미국 뉴저지주 바인랜드 소재의 벨코 바이오테크놀로지(Bellco Biotechnology)사 제조, 모델 7630-80589]
45. 수조 [미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 보켈 그랜트(Boekel Grant)사 제조, PB-1400]
46. 뉴클레오카운터(Nucleocounter) [미국 뉴저지주 에디슨 소재의 뉴 브런스윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific)사 제조, M1293-0000]
47. 바이로프로파일(Bioprofile) 400 [미국 메사추세츠주 월섬 소재의 노바 바이오메디컬(Nova Biomedical)사 제조, Bioprofile 400]
48. 현미경 [미국 뉴욕주 손우드 소재의 자이스(Zeiss)사 제조, Axiovert 25]
49. 디지털 카메라 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 니콘사 제조, 모델 E5400)
50. 마이크로피펫 [미국 메사추세츠주 보스턴 소재의 랩시스템(Labsystem)사 제조, 모델 No. P2-20, P1OO, P200, P1OOO]
51. 피펫 보조장치 [미국 펜실베니아주 브루몰 소재의 드럼몬드(Drummond)사 제조, Cat. No. 4-000-100]
52. CO2 흔들 플라스크 인큐베이터 [미국 메릴랜드주 로렐 소재의 ATR 바이오테크(Biotech)사 제조, 모델 AJ118]
세포 공급원 : 프로세스 디벨럽먼트 뱅크(Process Development Bank, PDB)에서 입수한 무혈청 MDCK 클론 ID 9B9-1E4 세포를 미량 원소 A, B 및 C를 첨가한 MediV SFM 105를 이용하여, 또는 MediV SFM 1094를 이용하여 롤러병에서 배양하였다. 미량 원소 A, B 및 C를 첨가한 MediV SFM 105의 조성은, MediV SFM 105가 액상으로 제조되고, MediV SFM 109는 분말로 제조된다는 점을 제외하고는 MediV SFM 109 배지와 유사하였다. 세포를 접종 후 3일-4일 간격으로 SOP D02005에 따라 통상적인 계대 배양을 실시(단, 2X DPBS 세척은 수행하지 않음)하였다.
바이러스 접종 : 이 공정은 2008/2009 FluMist® 시즌 균주인 A/우루과이/716/2007(Lot # nb3903pg94, 141900675A), A/사우스 다코타/6/2007(Lot # 141900666) 및 B/플로리다/4/2006 (141900641A)를 이용하여 개발되었다. 이들 모든 종자들은 난세포에서 생산되었다. 플라스미드 레스큐 방법을 이용하여 세포 배양물에서 생산된 종자 바이러스에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다(예를 들어, 문헌 [Wang and Duke, 2007 Oct 23, J. Virol, 4:102]; [Hoffmann, et al., 2000, PNAS, 97(11):6108-13]; 및 [Hoffmann, et al., 2002, PNAS, 99(17):11411-6] 참조).
배양 배지 : 롤러병 및 종균 반응기(SR)의 이들 러닝의 모든 통상적인 세포 계대 배양에 있어서, 미량 원소 A, B 및 C와 총 4.5 g/L의 D-글루코스를 첨가한 MediV SFM 105, 또는 총 4.5 혹은 9.0 g/L의 D-글루코스를 첨가한 MediV SFM 109를 각기 사용하였다. 최종 생산 반응기(FPR)에 대해서는 총 9.0 g/L의 D-글루코스를 첨가한 MediV SFM 110을 사용하였다. 접종 조건에 따라 D-글루코스의 예상 농도는 약 4.5 내지 9.0 g/L 사이로 조절될 수 있다. 각 배양 배지의 조성에 대해서는 표 2에 상술하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
생물반응기 조건 및 방법 : 모든 실험에 있어서, FPR은 종균 반응기(SR)의 1:8 분할 내용물을 이용하여 접종해, 2008/2009 시즌 바이러스인 ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다의 재조합체로 감염시켰다. 공정의 일관성 및 변동성 포착을 확실하게 하기 위해 동일한 조건 하에 여러 개의 FPR을 가동시켰다. 배지 교환(MX)과 무 배지 교환(No-MX) 공정을 나란히 비교하기 위해 각 실험에 2008/2009 바이러스 중 하나를 사용하여 첫 3개의 실험을 수행하였다. 첫 3개의 실험의 각 실험에 대해, 2×2L FPR을 동일한 조건에서 반복하여 러닝하였는데, 여기서는 감염시 무 배지 교환을 수행하였으며, 공정의 변동성을 포착하기 위해 동일한 바이러스 균주로 반응기들을 감염시켰다. 따라서, 총 6×2L의 생물반응기들을 SR의 1:8 세포 배양물의 내용물로 접종시키고, 무 배지 교환 공정으로 3개의 2008/2009 시즌 바이러스 균주 모두를 사용하여 감염시켰다.
08/09 균주에 대한 무 배지 교환 공정의 성능의 데이터를 더 만들기 위해 마지막 2개의 실험을 수행하였다. 4번째 실험에서, 1×2L의 SR로부터 3×2L의 FPR을 접종시키고, 3개의 시즌 바이러스 재조합체 유형을 모두 사용해 감염시켰다. 5번째 실험은 동일한 조건을 사용하여 4번째 실험을 반복 검증하였다. 무 배지 교환 공정의 성능을 평가하기 위해서, 그리고 공정의 변동성을 포착하기 위해 실험을 반복 수행하였다.
각 실험에 있어서 감염에 사용된 바이러스 균주와 FPR을 접종하는데 사용된 세포의 공급원은 표 5에 상술되어 있다.
Figure pct00008
종균 반응기( SR ) : 모든 실험에 있어서, 미량 원소 A, B 및 C를 포함하는 MediV SFM 105 (MediV SFM 105 + TE) 또는 MediV SFM 109 배지 중에서 2 g/L의 사이토덱스 3 미세담체를 이용하여, 2L 또는 5L 규모의 종균 생물반응기에서 세포를 증식시켰다. 미량 원소 A, B 및 C를 첨가한 MediV SFM 105의 조성은, MediV SFM 105가 액상으로 제조되고, MediV SFM 109는 분말로 제조되며 아셀렌산나트륨을 덜 포함한다는 점을 제외하고는 MediV SFM 109 배지와 거의 동일하다. 글루코스와 글루타민의 농도는 각각 9.0 g/L와 4 mM이었다. 실험 1 내지 3에 대해서는 1.35×1O5 개의 세포/㎖로 용기들을 접종하고, 실험 4와 5에 대해서는 1.8×1O5 개의 세포/㎖로 용기들을 접종하였다. SR 내의 용존 산소량(D.O.)은 0.02 vvm의 일정한 총 흐름의 순수한 산소와 N2를 조합한 기체를 이용하여 50%로 유지하였다. pH는 모든 SR에 대해서 CO2와 1N NaOH를 이용해 두 가지 측면으로 조절하였다. 실험 1과 2에 대한 SR의 작업 부피는 각각 2L와 5L로 하였다. 이들은 모두 한 개의 해수용 교반 날개를 구비하여, 175 rpm으로 교반하였다. 실험 3과 4에 대한 SR의 작업 부피는 2L로 하였다. 이들은 모두 2개의 라이트닌 교반 날개를 갖추어 175 rpm으로 교반하였다. 세포 증식과 물질대사에 대한 교반 날개와 작업 부피의 영향은 본 연구의 범위에서는 간과해도 무방하다. 첫 3개의 실험에 있어서, SR을 22.5개의 세포/MC로 접종하였다. 보다 양호한 세포 증식을 달성하기 위해서, 실험 4와 5의 SR을 30 세포/MC로 접종하였다. 각 FPR과 그에 대한 SR을 편성한 실험 고안에 대한 내용을 표 5에 나타내었고, 각 SR에 대한 공정 조건을 표 6에 기술하였다. 접종한 지 4일이 지난 후에, SR의 교반기, 기체 흐름과 D.O. 그리고 온도 조절을 중지하여 미세담체가 자리 잡도록 하였고, 세포는 하기 섹션 8.2에 제공된 실시예에 상술된 바와 기본적으로 동일하게 10×TrypLE를 첨가하고 pH 8로 맞춘 생물반응기의 작업 부피의 절반을 이용하여 세척하고 트립신화하였다. SR의 내용물은 표 7에 명시된 바와 같이 B2B 이동 프로토콜을 이용하여 트립신화하였다.
최종 생산 반응기( FPR ) : 다음으로, 종균 반응기의 내용물을 공급용 병에 주입하고 125 mL의 세포 접종원을 사용하여 1:8의 분할로 FPR을 접종하였다. FPR 내의 세포들을 9.0 g/L 농도의 글루코스를 포함하는 MediV SFM 110 중에서 증식시켰다. 2L의 FPR 유리 용기에 2개의 라이트닌 교반 날개를 구비시켜 175 rpm으로 교반하였다. D.O.는 0.02 vvm의 일정한 총 흐름 전략으로 제어된 50% 공기 포화도로 조절하였고, 이때 40 mL/분의 일정한 총 흐름을 유지하였으며, N2 기체의 공급량은 O2와 CO2 기체로부터 산출하였다(N2=40-O2-CO2). pH는 모든 FPR에 대해 CO2와 1N NaOH를 이용하여 증식기와 감염기 동안의 온도는 각각 37℃와 33℃로 조절하였다. FPR에 사용한 바이러스 균주는 표 5에 열거하였고, FPR에 있어서 증식기 및 감염기 동안의 공정 조건은 표 8에 열거하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
분석 절차 : 용기에서 매일 샘플 채취를 수행하였다. 세포를 뉴클레오카운터를 사용하여 계수하고, 10X 확대한 현미경 사진을 찍어 세포 형태를 관찰하였다. 노바 바이오프로파일 400 분석기를 이용하여 pH, pO2, pCO2 및 글루코스, 락테이트, 글루타민 및 암모늄의 농도를 매일 모니터링하였다. 생물반응기의 pH 재보정은 온라인과 오프라인 값의 차이가 0.03 pH 단위보다 높은 경우에 수행하였다. 감염된 샘플을 1O× 수크로스 인산염(SP)으로 안정화시키고 분석할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. 바이러스 복제의 진행 상태에 대해서는, 하기 기술된 것과 같은 형광 포커스 분석법(FFA)에 의해 바이러스 감염도를 측정함으로써 분석하였다.
형광 포커스 분석법 ( FFA ) : MDCK 세포를 MEM/EBSS + 1X 비필수아미노산 + 2mM 글루타민 + PEN/Strep (VGM) 중의 96 웰 플레이트에서 포화될 때까지 증식시켰다(36±1℃, 5±2% CO2, ~4일). 다음으로, VGM을 제거하고 세포를 신선한 VGM으로 세척한 후, VGM 중에서 연속 희석(예컨대 , 10-1, 10-2 ... 10-7)된 100 μL의 바이러스 접종원(예컨대, ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다)으로 감염시켜서 33±1℃, 5±2% CO2에서 약 19-20시간 동안 배양하였다. 각 바이러스 희석물을 3번 반복하여 세포에 접종하였다. 33±1℃, 5±2% CO2에서 약 19-20시간 동안 세포를 배양한 후, 이들 세포를 항인플루엔자 항체를 사용해 면역염색하여 하기 절차에 따라 샘플의 바이러스 역가를 측정하였다. 바이러스를 포함하는 세포 배양 배지를 각 플레이트에서 제거하고 상기 플레이트를 200 ㎕/웰의 DPBS로 세척한 후, 실온에서 100 μL의 차가운 4%의 파라포름알데히드로 15±3분 동안 고정화하였다. 다음으로, 상기 플레이트를 250 ㎕/웰의 1X 인산염 완충 식염수 + 0.05% Tween 20 (TPBS)로 2회 세척한 후, A 균주 또는 B 균주에 특이적인 1차 항체로 세포를 배양하였다. 상기 1차 항체를 1X PBS(SBSA) 중의 0.1% 사포닌, 1% BSA 및 0.1% 아지드나트륨에서 바람직한 희석도로 희석하였다. 37±1℃에서 60±5분 동안 배양한 후, 1차 항체를 제거하여 세포를 250 ㎕의 TPBS로 3회 세척하며, SBSA 중에서 바람직한 희석도로 제조된 형광 염료[예컨대, FITC로 표지된 래빗의 항양(rabbit anti sheep) 2차 항체]에 접합된 2차 항체를 웰에 첨가하였다. 37±1℃에서 60±5분 동안 배양한 후, 상기 2차 항체를 제거하여 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 2회 세척하고 나노수(nano water)로 2회 세척한 후, 페이퍼 타월로 물기를 찍어내면서 건조(blot drying)시켰다. 다음으로, 상기 플레이트를 실온의 암실에서 뚜껑을 열어 10분 이상 통풍 건조시켰다. 도립(inverted) 형광 현미경을 이용(총 100X로 확대)하여 형광 신호들을 도시화하였다. SPOT 프로그램과 같은 영상 소프트웨어를 이용하여 이미지들을 촬영하였다. 일반적으로 각 웰의 가운데 밴드를 관찰하여 모든 초점들을 계수하고 8개 내지 120개 계수의 초점을 가진 웰들 만을 계수하였다. log10FFU/㎖은 계수된 각 웰에 대해 산출하였고, 3개의 웰의 평균 및 표준 편차를 계산하였다.
8.1.2 결과 및 고찰
처음 3개의 실험과 마지막 2개의 실험에 있어서, 각각의 종균 생물반응기에 대해 세포를 22.5개 및 30개의 세포/미세담체(MC)로 접종하였다. 도 1은 모든 실험의 SR들에 대해 생존 세포 밀도(VCD)와 세포 생존율(V%)을 플롯팅한 것이다. 4 dps에 종균 반응기의 세포 밀도는 0.94 내지 1.14 백만 개의 세포/㎖ 범위였다. 세포 밀도의 차이는 22.5개 및 30개의 세포/MC라는 접종 세포 농도에서의 차이에 상당 부분 기인하였다. 22.5개 및 30개의 세포/MC로 접종된 SR에서 접종 후 4일째(dps)되는 날의 세포 밀도는 0.95±0.01 백만 개 및 1.12±0.024 백만 개의 세포/㎖이었다. 모든 생물반응기의 세포 생존율은 90% 이상이었다. 4일간의 배양 후, 종균 반응기 내에서 1x 0.5 mM EDTA - DPBS 세척액 및 10x TrypLE 셀렉트를 이용한 비드간 이동을 수행하여 세포를 트립신화하였다. 트립신화는 간헐적으로 샘플을 채취하여 현미경으로 세포 분리를 관찰하면서 30±10분간 지속하였다. 약 30분 내지 40분의 트립신화 후에, 약 90%의 세포들이 MC로부터 분리되었으며, 이는 도 2에서처럼 단일 세포로 나타났다. 모든 실험에 있어서, 트립신화된 세포들을 1:8의 분할 비율로 최종 생물반응기를 접종하는데 사용하였다. 모든 FPR의 세포 증식을 도 3에 플롯팅하였다. 실험 2에서 모든 FPR에 대한 VCD가 4 dps에서 0.6×1O6 개의 세포/㎖ 이하였고, 이들 FPR의 세포 배양물 유도기가 더 길었기 때문에, 이들 세포들에게 4 dps가 아닌 5 dps에 감염시켰다. 또한, 감염 후 VCD 데이터는 실험 4의 FPR에 대해서는 나타내지 않았다. 마지막으로, 0.5×1O6 개의 세포/㎖ 이하의 낮은 VCD에도 불구하고, 실험 5에서는 4 dps에 FPR을 감염시켰다. 세포 증식기 동안 FPR에 있어서 생존율은 90% 이상이었다.
모든 FPR에 있어서 감염시의 세포 밀도는 표 9에 기록하였다. 생존 세포 밀도에 있어서 큰 변화가 관찰되었다. 이는 0.44 내지 1.12×1O6 개의 세포/㎖ 범위였다. 이러한 차이는 세포 계수 오차와 관련이 있었다. SR과 FPR 모두에 대한 평균 VCD는 표 10에 기록하였다. 4 dps에 SR과 FPR에 대한 평균 VCD는 각각 약 1.12×1O6 개의 세포/㎖ 및 0.73×1O6 개의 세포/㎖이었다.
Figure pct00012
Figure pct00013
트립신화 후, 0 dps에 FPR 내의 세포를 미세담체 비드에 부착시키고, 이후 미세담체 비드 표면에서의 증식을 시작하였다. 대부분의 미세담체들이 세포로 덮였으며, 일부 비드들만이 4 dps까지 그대로 잔존하였다(어떤 세포도 비드를 덮지 않음). 세포 형태는 모든 실험에 있어서 유사하였다. 3 dps 및 4 dpi에서 전형적인 세포 형태를 보여주는 사진을 도 4와 5에 각각 나타내었다.
4 또는 5 dps에, 실험 1, 2 및 3의 FPR을 ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다로 각각 감염시켰다. 감염 전에 0.03x의 10x TrpLE 셀렉트를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 실험 4와 5에서, 3개의 시즌 균주인 ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다 중 하나를 선택해 20 FFU/㎖의 양으로 각각의 FPR을 감염시켰다. 도 6은 감염 후 68시간 내지 74시간(hpi) 사이에 피크 바이러스 역가가 달성되었음을 보여준다. 또한, 바이러스 역가는 92 hpi까지 계속 높게 유지되었다.
각 바이러스 균주 유형에 대한 평균 바이러스 역가는 표 11에 개괄되어 있다. ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다 각각에 대한 평균 바이러스 역가는 8.7, 8.8 및 8.45 log10FFU/㎖이었다. 이는 67% 배지 교환이 이루어졌을 경우에 이러한 균주들에서 관찰되었던 수준 또는 그 이상에 해당되는 것이다.
67% 배지 교환 공정(기본적으로는 국제 특허 공보 WO 08/105931에 기술된 것과 같이 수행하며, 실시예 12를 참조함)을 이용하여 생산된 4개의 균주(ca A/위스콘신/67/05, ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다)의 바이러스 역가를 무 배지 교환 공정(기본적으로 상기 기술된 것과 같이 수행함)과 비교하기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 각 공정과 균주에 대해 2회 이상의 러닝을 수행하였다. 도 7을 보면, 67% 배지 교환 공정과 무 배지 교환 공정에 있어서 각 균주에 대한 피크 바이러스 역가가 비슷한 것을 알 수 있다.
Figure pct00014
배지 교환은 현재 세포 배양 기재의 인플루엔자 백신 제조 공정에서 주요한 작업 단계이다. 감염시키기 전에 배지 교환 단계를 제거하기 위해 많은 시도가 있어 왔는데, 이는 배지 교환 단계가 없다면 미생물 오염의 가능성이 감소할 것이고 보다 운용하기에 편한 공정이 수행될 수 있기 때문이다. 배지 교환을 하지 않는 12개의 생물반응기 러닝을 연속적 수행을 통해, 공정 수행 데이터, 보다 구체적으로는, 세포 분리/부착, 세포 증식 및 바이러스 역가 정보를 수집하여 새로운 백신 제조 공정의 변동성을 평가하고, 새로운 비드간 이동 절차를 이용하는 SR에서 세포를 직접 취하여 FPR의 접종을 실행할 수 있는지에 평가하였다. 세 바이러스 균주, 즉 ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다를 감염 전에 배지 교환 없이 각각 4번 생산하였다. SR에 있어서 4 dps에 VCD가 1×1O6 개 세포/㎖까지 달성될 수 있었고, 1x DPBS, TrypLE 셀렉트 및 EDTA를 이용한 B2B 이동은 30분 내지 40분의 트립신화 후 종균 반응기에서의 효과적인 세포 분리(>90%)로 인해 성공적으로 달성될 수 있었음이 확인되었다. FPR 내의 세포들은 미세담체 비드 상에서 증식하여 감염 시에는 약 0.73×1O6 개 세포/㎖의 평균 VCD에 도달하였다. MX 공정이 없는 모든 FPR 러닝에 있어서 ca A/우루과이, ca A/사우스 다코타 및 ca B/플로리다의 피크 바이러스 역가는 3 dpi에 각각 8.7±0.05, 8.8±0.0 및 8.45±0.25 log10FFU/㎖이었다. 이 수치는 67% 배지 교환이 이루어진 바이러스 균주에 대해 일반적으로 관찰된 수치보다 양호하거나 그 수준에 해당되는 수치이다(도 8 참조). 모든 바이러스 유형에 있어서 피크 바이러스 역가는 8.4 log10FFU/㎖ 이상이었다. 이러한 결과들은 여기에 기술한 B2B 이동과 무 MX 공정이 매우 확실한 방법임을 명백히 증명하고 있는 것이다. 이러한 방법들은 고가의 배지 시약을 사용을 최소화하여 오염의 가능성을 감소시킬 수 있다.
8.2 저농도의 프로테아제를 이용한 신속한 비드간 이동 공정
본 실시예는 스피너 플라스크, 흔들 플라스크 또는 교반형 탱크 생물반응기 내에서 DPBS/0.5 mM EDTA(pH 8) 세척 용액 및 저농도의 프로테아제(예컨대, 0.05X TrypLE)를 이용하는 MDCK 세포의 신속하고도 효율적인 비드간 이동을 위한 공정 및 매개변수들을 기술하고 있다. 공정 순서의 개요는 도 8에 제공하였다. 본 공정에서 사용될 수 있는 예시적인 장비 및 시약들은 표 12, 표 13 및 표 14에 상술하였다. 물론, 이들은 유사하게 수행하는 다른 장비와 시약들로도 대체될 수 있으며, 여기서 장비나 시약에 대해 특정 상표 또는 유형을 구체적으로 언급하지만, 특별히 그렇게 하는 것으로 지적하지 않는 한 그것으로 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 공정을 상기 기술한 12개의 러닝에서 이용하였다. 위에서 지적한 바와 같이, EDTA를 이용한 1X DPBS 세척 단계와 pH 8에서 TrypLE 셀렉트를 이용한 트립신화 단계를 포함하는 비드간 이동 프로토콜을 사용했더니, 종균 반응기에서 적절한 세포 분리와 FPR에서의 적절한 세포 부착이 관찰되었다. 따라서, 비드간 이동 공정은 신속하고, 효율적이며 확실한 방법이다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
10X DPBS 분말을 이용한 1X 액체 배지 DPBS 의 제조 : 분말화 배지를 실온의 물에서 가볍게 저어 가며 첨가한다(물을 가열하지 말 것). 용기 내부를 헹구어 남아있는 모든 분말의 흔적을 제거한다. 물을 이용하여 소정의 부피로 희석한다. 용해될 때까지 저어 준다(너무 완전하게 혼합하지 말 것). 배지의 pH를 7.8 ± 0.1로 조절한다(최종 작업 pH는 8.0임). pH 단위는 여과시 통상 0.1-0.3 상승하곤 한다. pH가 조절된 후, 배지가 여과될 때까지 용기를 닫은 채로 둔다. 0.1 미크론의 막을 이용하여 즉시 멸균한다.
O.5 M 저장액 EDTA 의 제조 : 186.1 g의 EDTA (이나트륨, 이수화물)를 800 mL의 탈이온수에 첨가한다. 교반하면서 약 2O g의 NaOH 펠렛 또는 10N NaOH를 첨가하여 pH를 8.0으로 한다. 주의 : pH가 갑자기 상승하는 것을 피하기 위해서 마지막 몇 그램은 천천히 첨가한다. EDTA는 pH가 8 부근이 될 때까지는 용해되지 않을 것이다. 탈이온수를 이용하여 부피를 1L로 조절한다. 0.1 미크론 필터를 사용하여 여과한다. 이를 분취하여 더 작은 부피(각각 20O mL의 병)에 넣어 실온에 저장한다.
DPBS / O.5 M 저장액 EDTA 의 제조 : DPBS 1L 마다 1 mL의 0.5 M 저장액 EDTA(pH 8)를 첨가한다. 배지의 pH를 7.8 ± 0.1로 조절하였다(최종 작업 pH는 8.0임). 주의 : pH 단위는 여과시 통상 0.1-0.3 상승하곤 한다. 0.1 미크론 필터를 사용하여 여과한다.
1X DPBS / 0.5 mM EDTA - pH 8.0 세척 절차 : 해당되는 교반, pH, DO, 온도 콘트롤을 중지한다. 미세담체 비드를 15 ± 5분간 자리를 잡게 한다. 사용한 증식 배지의 80 ± 10%를 배출구 포트를 통해 제거한다. 표 15를 참조한다. 주의 : 이 절차는 교차 접선 흐름(ATF)를 이용해 실행될 수 있다. 동일한 부피의 1X DPBS/0.5 mM EDTA - pH 8.0 세척 용액으로 대체하여 이를 배양 용기에 첨가한다. 표 15를 참조한다. 교반을 원래의 설정대로 개시하고 세포를 25 ± 5분간 세척한다. 교반을 중지하고 미세담체 비드를 15 ± 5분간 자리를 잡게 한다. 세척 용액의 80 ± 10%를 배출구 포트를 통해 제거한다. 표 16을 참조한다. 주의 : 이 절차는 ATF를 이용해 실행될 수 있다. 1X DPBS/0.5 mM EDTA - pH 8.0 세척 용액을 50%의 작업 배양 부피까지 용기에 첨가한다. 표 15를 참조한다. 교반기 속도를 소정의 rpm으로 설정한다. 표 16을 참조한다. 교반기, pH, DO 및 온도 콘트롤을 개시한다. pH 설정을 8.0으로 조절한다. 표 16을 참조한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
세포 분리 절차 : 배양물의 pH가 8 ± 0.1에 도달한 경우, 계산된 부피의 1OX TrypLE를 주입 포트를 통해 또는 배지 포트를 통해서 0.05X의 최종 농도까지 첨가한다. 표 17을 참조한다. 주의 : 소정의 작업 부피에 대하여 1OX TrypLE를 1:200 희석도로 수행할 수도 있다. 샘플링 포트를 통해서 샘플이 완전히 다 분리될 때까지 15 ± 2분 마다 분취한다. 주의 : 세포 분리는 <60분 이내에 완료되어야 한다. 배양 용기 원래의 작업 부피까지 기초 배지를 첨가한다. 교반기와 pH 콘트롤을 제외한 모든 콘트롤 루프를 중지시킨다.
비드간 절차 : 소정 부피의 분리된 세포를 최종 생산 반응기로 옮긴다. 표 18을 참조한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
8.3 실시예 3. 세포 배양으로 생산된 인플루엔자의 정제 공정
세포 배양물에서 제조된 인플루엔자를 위한 견고한 대규모 정제 공정의 개발은 광범위한 부문의 개발이 요구된다. 초기 단계의 공정은 바이러스 수확물(VH)(감염 후 60-65시간)을 봉지로 주입하고, 바이러스 안정성을 위해 1/10 (v/v)의 희석도로 1OX 수크로스 인산염 (SP) 버퍼를 첨가하는 것으로 개발되었다. 상기 안정화된 바이러스 수확물(SVH)은 먼저 2 mM의 MgCl2와 함께 50 유닛/㎖의 벤조나아제로 32℃에서 3시간 동안 처리하여 MDCK 숙주 세포 DNA (HCD)를 제거하고, 5 mM의 EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 벤조나아제는 마그네슘 이온의 존재 하에 DNA를 올리고뉴클레오타이드로 분해하는 조작된 재조합 엔도뉴클레아제이다. 이후, 벤조나아제로 처리된 바이러스 수확물은 1.2 ㎛의 폴리프로필렌(PP)과 0.45 ㎛의 PVDF 캡슐 필터에 의해 정화된다. 정화된 VH는 500 kDa의 분획분자량을 갖는 중공사 카트리지에 대한 SP 버퍼를 이용한 5배(5X)의 한외여과 및 5배의 정용여과로 컨디셔닝하였다. 바이러스 입자는 중공사의 잔류 여과물 쪽에 보유되는 반면, 숙주 세포 단백질 (HCP), 숙주 세포 DNA (HCD) 및 벤조나아제는 중공사의 투과된 여과물 쪽으로 정용여과된다. 농축 및 정용여과된 바이러스를 셀루파인 설페이트 (CS) 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 추가로 HCD, HCP 및 벤조나아제 불순물들을 제거하였다. CS는 컬럼에 바이러스를 결합시키는 친화성 수지이며, 여기서 결합된 바이러스는 SP 고농도의 염 버퍼를 사용하여 용리된다. 컬럼 용출물로부터 정제된 바이러스는 500 kDa의 분획분자량을 갖는 중공사 카트리지에 대한 5 투석부피의 SP100 (200 mM 수크로스 및 100 mM 인산칼륨, pH 7.2) 버퍼로 정용여과되어서 고농도의 염 용리 버퍼가 제거되므로 정제된 바이러스를 제조하게 되는 것이다. 이후, 상기 정용여과된 바이러스 산물을 1/9 (v/v) 희석도의 cGAG를 첨가하여 안정화하고, 0.22 ㎛의 필터를 사용하여 멸균 여과하여 최종 벌크 산물을 만들게 된다.
초기 공정에 대하여 공정의 확장가능성, 효율 및 최종 산물의 품질을 개선시키는 실질적인 변화를 수행하였다. 공정에 있어서 이러한 변화들은 불순물(HCD, HCP 및 벤조나아제)의 회수율 및 수준을 평가한 것을 기초로 수행하였으며, 원래 수립된 공정에서 이행하였다. 확장가능성을 염두에 두거나 공정의 효율성 및 최종 산물의 품질을 개선하기 위해 모두 5번의 공정 단계를 수행하였다. 제1 단계로, 바이러스 수확물을 2000 FFU/㎖의 바이러스 투입량을 이용하여 감염시킨 세포에 대해 감염 후 48시간으로 변화시켰는데, 이 시간은 피크 바이러스 역가에 해당된다. 제2 단계로, HCD 제거 단계를 회분식 벤조나아제 처리에서 컬럼상 벤조나아제 처리로 변화시켰다. 상기 두 단계는 모두 출발 물질과 최종 벌크 산물의 HCD 수준을 현저히 저하시킴으로써 최종 생성물의 품질을 개선한다. 제3 단계로, CS 수지의 로딩 농도를 9.0 log10FFU/㎖에서 9.5 log10FFU/㎖로 증가시켰더니, 생산 컬럼 크기가 4L에서 1.4L로 감소되었고, 공정 효율성이 개선되었다. 제4 단계로, 제2 버퍼 교환 부피를 5 투석부피에서 8 투석부피로 증가시켜 벤조나아제 제거율을 향상시켰다. 제5 단계로, 최종 여과 흐름을 그 절반인 평균 25 L/m2로 감소시켜 CTM 러닝에 있어서 최종 여과시에 생길 수 있는 막힘을 피할 수 있었다. 상기 마지막 방법(하기에서 상술함)은 0.72 ng/투여량 (피코그린으로 측정) 및 0.1 ng/투여량 (PCR로 측정)의 HCD, 0.21 ㎍/투여량의 HCP 및 0.0035 ng/투여량의 벤조나아제 수준(상기 수치 모두 규제 당국에서 요구하는 규정 사양 미만임)와 함께, 평균 43.4%의 전체적인 회수율이 얻어지는 공정을 제공한다. 도 10은 초기 정제 공정 및 개선된 정제 공정의 개요를 제공한 것이다.
8.3.1 재료 및 방법
재료, 시약 및 장비 : 유사하게 수행되는 다른 장비 및 시약들로 용이하게 대체될 수 있다.
1. 1.2 ㎛ 폴리가드(Polygard) CN 옵티캡(Opticap) XL5 필터 (미국 메사추세츠주 빌러리카 소재의 밀리포어 코포레이션사 제조, Cat. No. KN12A05HH1)
2. 0.45 ㎛ 듀라포어 옵티캡(Durapore Opticap) XL4 필터 (미국 메사추세츠주 빌러리카 소재의 밀리포어 코포레이션사 제조, Cat. No. KPHLA04HH3)
3. 50L 봉지 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH30712.04)
4. 10L 봉지 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH30712.12)
5. 중공사, 500KD, 4,800 cm2 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. UFP-500-C-6A)
6. 중공사, 500KD, 290 cm2 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. UFP- 500-C-3X2MA)
7. 셀루파인 설페이트 수지 (일본 도쿄 소재의 키쏘 코포레이션사 제조, Cat. No. 19847)
8. 플랜지 O-링 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-8494-01)
9. 어댑터 O-링 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-8475-01)
10. 층 지지체(Bed support), 23 ㎛, 선단 부품 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-9252-01)
11. 층 지지체, 23 ㎛, 어댑터 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-1103-08)
12. 개스킷 25 mm 내경 6 mm, EPDM (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-0019-27)
13. 4-포트-2-웨이 밸브 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-5757-01)
14. 사토포어(Sartopore) 2 300 필터 캡슐, 0.45 ㎛/0.22 ㎛, 300 cm2 [미국 메사추세츠주 소재의 사토리우스(Satorius)사 제조, Cat. No. 5441307H5-00-B]
15. 사토포어 2 150 필터 캡슐, 0.45 ㎛/0.22 ㎛, 150 cm2 [미국 메사추세츠주 소재의 사토리우스사 제조, Cat. No. 5441307H4--00--B]
16. 1L PETG 병 [미국 로체스터 뉴욕대학교 소재의 날진(Nalgene)사 제조, Cat. No. 2019-1000]
17. 2L PETG 병 (미국 로체스터 뉴욕대학교 소재의 날진사 제조, Cat. No. 2019-2000)
18. 마스터플렉스(MasterFlex) 플래티넘 경화 실리콘 배관(platinum-cured silicone tubing) L/S 크기 24 (미국 일리노이주 버넌 힐스 소재의 콜 파머사 제조, Cat. No. 96410-24)
19. 마스터플렉스 플래티넘 경화 실리콘 배관 L/S 크기 36 (미국 일리노이주 버넌 힐스 소재의 콜 파머사 제조, Cat. No. 96410-36)
20. 1X 수크로스 인산염 버퍼 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH3A1577) - 218 mM 수크로스 및 11 mM 인산칼륨, pH 7 버퍼
21. 1X SP/1M NaCl 버퍼 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH3A2034)
22. SP1OO 버퍼 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH3A1796) - 200 mM 수크로스 및 100 mM 인산칼륨, pH 7.2 버퍼
23. cGAG 버퍼 (미국 유타주 로간 소재의 하이클론 리미티드사 제조, Cat. No. SH3A1795)
24. 벤조나아제 (독일 다름슈타트 소재의 EMD사 제조, Cat. No. 1.01697.0002)
25. 1M MgCl2 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사 제조, Cat. No. M1028, 로트 # 085K8920)
26. Quant-iT 피코그린 dsDNA 키트 (미국 오리건주 유진 소재의 인비트로겐사 제조, Cat. No. P11496, 로트 # 22987)
27. 0.5N NaOH (10N NaOH로부터 희석됨) (미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 VWR사 제조, Cat. No. VW3247-7)
28. 연동 펌프 (미국 메사추세츠주 윌밍턴 소재의 와트슨 말로우 인코포레이티드사 제조, 모델 520U, 520S 및 520Di)
29. 웨이브믹서(WaveMixer) (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. Mixer20/50EH)
30. 악타(AKTA)프로세스 크로마토그래피 스키드(Skid) (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 28409334)
31. 유니플럭스 10 (Uniflux 1O) 여과 스키드 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 28920799)
32. BPG 100 크로마토그래피 컬럼 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-1103-01)
33. BPG 200 크로마토그래피 컬럼 (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 18-1103-11)
34. 플렉스스탠드(Flexstand) (스웨덴 웁살라 소재의 GE 헬스케어사 제조, Cat. No. 56-4107-54)
Figure pct00022
세포 배양 바이러스 수확물( VH ) : MDCK 세포 증식과 바이러스 생산에 대한 자세한 사항들은 국제 특허 공보 WO 08/105931 (특히, 실시예 12 참조)에 기술되어 있다. 모든 바이러스 생산 러닝은 67% 배지 교환 공정이 있는 일회용 생물반응기(SUB)에서 수행하였으며, 세포는 2000 FFU/㎖의 바이러스 투입량으로 감염시켰다. MDCK 세포를 감염시킨 후 약 60-65시간 (러닝 1-7) 또는 48시간 (러닝 8-9)이 되는 시점에 바이러스를 수거하였다. SUB 내의 미세담체를 바이러스를 수거(VH)하기 전 45분 정도 자리를 잡게 하였다. 약 18 L의 바이러스를 약 0.2 L/분으로 50 L의 봉지에 주입하였고, 바이러스 수확물의 안정화(SVH)를 위해 2L의 1OX SP 버퍼를 동일한 봉지 내에 주입하였다. 혼합 후, SVH 단계에서 샘플을 채취하여 FFA, HCD 및 HCP 분석법으로 감염도에 대해 시험하였다.
직류식 여과 1 ( DFF1 ) : 여과 장치를 준비하고 바이러스 수거 하루 전에 오토클레이브하였다. 1.2 ㎛ 폴리가드 CN 폴리프로필렌 필터 캡슐과 0.45 ㎛ 듀라포어 PVDF 필터 캡슐을 보여주는 여과 장치 그림이 도 9A 상부 패널에 나타나 있다. 약 20 L의 SVH를 분당 1.5 리터로(LPM) 폐쇄된 장치 어셈블리를 통해 주입하고, SVH가 이들을 통과할 때 필터를 준비하였다. 막의 총 표면적은 1.2 ㎛ 폴리가드 CN 폴리프로필렌 필터 캡슐은 1800 cm2이었고, 0.45 ㎛ 듀라포어 PVDF 필터 캡슐은 1900 cm2이었다. 1.5 LPM의 여과 유속에서, 1.2 ㎛와 0.45 ㎛ 필터에 대한 흐름은 각각 500 L/m2/시간 (시간당 면적에 투과되는 용량, LMH) 및 474 LMH이었다. 1.2 ㎛와 0.45 ㎛ 필터에 있어서 실제 로딩량은 각각 111 및 105 L/m2이었다. DFF1에서 정화된 여과물은 20 L의 봉지에 수거하였다. DFF1 여과물을 샘플링하여 FFA로 감염도를 시험하였고, 잔류 HCD와 HCP에 대해서도 시험하였다.
접선 흐름식 여과 1, 5X 한외여과 ( UF ) / 5X 정용여과 ( DF ) ( TFF1 ) : 유니플럭스 스키드 배관 장치를 준비하고 바이러스 수거 하루 전에 오토클레이브하였다. 모든 배관 장치에 대한 그림은 도 9A의 하부 패널에 나타나 있다. 하기의 작동 매개변수를 이용하는 TFF1 단계를 수행하기 위해 유니플럭스(Uniflux™) 스키드를 사용하였다. 유니플럭스 스키드는 중공사 카트리지를 작동하도록 환경이 설정된 자동화 막 분리 여과 시스템이다. 0.5 mm의 내강 크기, 4,800 cm2의 막의 총 표면적 및 60 cm의 경로 길이를 갖는 500 kDa의 분획분자량(MWCO)의 중공사를 사용하였다. 이 공정은 41.7 L/m2 막 표면적의 DFF1 최종 로딩량을 제공하는데, 이는 TFF1 공정에 대해 이전에 평가된 것과 같은 최적 범위 40-150 L/m2 이내에 속한다. 러닝 1-6에 있어서, 동일한 중공사 카트리지를 공정 후에 세정하여 재사용하였다. 러닝 7-9에 있어서는, 새로운 중공사를 준비하여 각 러닝에 사용하였다. 새로운 중공사 카트리지는 각 러닝을 수행하기 전에 탈이온(DI) 수로 90분간 헹궈 글리세롤 보존제를 제거하고, 0.5N NaOH로 1시간 동안 살균 처리하며, pH가 7.0이 될 때까지 1X SP 버퍼로 평형화시켜 준비하였다. 전체 5XUF/5XDF 공정은 16000 s-1의 일정한 전단 속도와 20 psi의 일정한 TMP로 프로그래밍된 유니플럭스 스키드를 사용하여 가동하였다.
DFF1의 전체 부피는 유니플럭스 스키드를 통해 처리하였다. 약 5L의 DFF1을 먼저 유니플럭스 공정 탱크 내로 주입하였다. 투과된 여과물 라인을 먼저 폐쇄하여 8.6 L/분의 재순환(투과된 잔류여과물) 유속(16000 s-1의 전단 속도에 해당됨)을 정립하였다. 5분의 재순환 후, 5XUF 공정을 개시하였다. 투과된 여과물 라인을 개방하여 HCP와 DNA와 같은 500 kDa보다 작은 불순물이 막을 통과하도록 하는 반면, 잔류 여과물 콘트롤 밸브를 점진적으로 폐쇄하여 1.4 bar(20.3 psi)의 경막압 설정점을 달성하였다. 잔류하고 있는 DFF1 여과물을 계속적으로 공정 탱크 내로 주입하여 DFF1의 전체 부피가 탱크 내로 주입될 때까지 5 ± 0.1 L의 일정한 탱크 부피 수준을 유지하였다. DFF1의 모든 물질들이 공급된 후, 공급 펌프를 중지시키고 최종 잔류 여과물 부피가 4 L에 이를 때까지 또는 16 L의 투과된 여과물이 수거될 때까지 잔류 여과물을 계속하여 농축시켰다. 4 L의 잔류 여과물(5XUF)을 5X 투석부피의 1X SP 버퍼(20 L)를 이용한 버퍼 교환으로 정용여과하고, 공정을 상기 기술한 바와 같이 동일한 전단 속도 및 TMP로 가동하였다. 정용여과 버퍼 라인을 개방하고 공급 펌프를 다시 개시하여 1X SP 버퍼를 주입하였다. 정용여과시 투과된 20 L의 여과물을 수거한 후에 5XDF 공정을 종료하였다. 5XDF 종료시에, 잔류 여과물 콘트롤 밸브를 완전히 개방하고 투과된 여과물 라인을 다시 폐쇄해 시스템이 재순환하여 공정이 진행되는 동안 중공사막의 표면에 약하게 결합되어 있는 회수가능한 바이러스들을 털어내도록 하였다. 농축되고 정용여과된 바이러스 생성물을 함유하고 있는 잔류 여과물을 배출시켜 10 L의 생성물 봉지에 수거하였다. 마지막 두 정제 러닝(8과 9)에서, 잔류 여과물 수거 후에 추가의 버퍼 헹굼 단계를 도입하였다. 약 1.5 L의 1X SP를 공정 탱크로 주입하여 투과된 여과물 라인을 폐쇄하고 추가로 5분간 재순환시켰다. 이러한 버퍼 헹굼물도 동일한 10 L의 생성물 봉지에 수거하고 이 봉지를 5XUF 5XDF TFF1 생성물로 표기하였는데, 총 부피는 약 5.5 L였다. TFF1 생성물을 샘플링하여 FFA로 감염도에 대해 시험하였으며, HCD와 HCP에 대해서도 시험하였다. 중공사 카트리지 및 유니플럭스 시스템은 각 공정의 러닝 후에 8.6 L/분의 재순환 유속을 사용하여 0.5N NaOH로 1시간 동안 세정하였다.
BPG 100/200 셀루파인 설페이트 ( CS ) 컬럼의 패킹 및 컬럼 평가 : CS 수지를 약 50% 슬러리 상태로 20%의 에탄올 중에 저장하였다. BPG 100 또는 BPG 200 컬럼을 패킹하는데 필요하는데 수지의 양은 1.1의 압축비를 이용하여 계산하였다. 계산된 수지의 양은 1X SP 버퍼를 이용하여 2회의 버퍼 교환을 수행한 후, 1X SP/1M NaCl 버퍼를 이용해 1회의 버퍼를 수행하여 준비하였다.
BPG 100 및 BPG 200 컬럼은 제조업자의 교시에 따라 조립하였다. 빈 컬럼을 준비하여 사용 전에 0.5N NaOH로 살균 처리하고, DI수로 헹궈 주었다. 1X SP 버퍼를 사용하여 CS 수지를 500 cm/hr로 BPG 100 컬럼 내에 플로우-패킹하고, 악타프로세스(AKTAprocess™) 스키드를 이용하여 컬럼층 높이를 15-20 cm (표적 17.5 cm)로 만들었다. AKTA 프로세스는 자동화 액체 크로마토그래피 시스템이다.
1X SP/1M NaCl 버퍼 중에 제조된 수지 슬러리를 빈 컬럼의 측벽을 따라 붓고, 벽에 남아있을 수 있는 잔류 수지를 물 분사기를 이용하여 물로 헹구어 떨어냈다. 수지를 액체 수준보다 아래로 적어도 10 cm 정도 높이의 수지층으로 자리 잡도록 하였다. 수지를 건드리지 말고 상부 어댑터를 컬럼 내에 삽입한 후 고정 나사/너트로 고정하였다. 4-포트-2-웨이 밸브 (4-2 밸브)를 컬럼 주입구에 설치하였다. 4개의 서로 다른 포트들을 하기와 같이 연결하였다:
1 - AKTA 프로세스 시스템 컬럼 주입구
2 - 컬럼 수동 퍼징(purge) 장치 (폐기물 또는 순환 라인에 연결됨)
3 - 스파이크(Spike) 시험 커넥터 [HETP 시험을 위한 고농도의 염 용액을 주입하는데 사용되는 암 루어 잠금 장치(female lure lock)]
4 - BPG 100/200 컬럼 주입구
다음으로, BPG 1OO 컬럼의 하부 배출구를 AKTA 시스템 컬럼 배출구에 연결하였다. 컬럼 어댑터를 내리기 전에, 4-2 밸브, 포트 3과 4에 대한 연결을 체크하였다. 상부 어댑터를 천천히 수지층 내로 내리고 소량 부피의 버퍼를 4-2 밸브의 포트 3에서 퍼징하였다. 이러한 작업으로 상부 어댑터의 주입구가 버퍼로 퍼징되었음을 확인할 수 있다.
다음으로, 4-2 밸브를 포트 1과 2과 연결하도록 변경하였다. 1X SP 버퍼를 AKTA 시스템과 연결하여 먼저 500 cm/hr로 흐르도록 하고, 이 지점의 컬럼을 우회하여 컬럼 퍼징 포트(4-2 밸브의 포트 2)를 통해 가도록 하였다. 유속이 유속계 상에 500 cm/hr에 달했을 때, 4-2 밸브를 포트 1과 4와 연결되도록 신속하게 조정하였다. 수지층이 표적층 높이에 도달한 경우, 어댑터 폐색기를 수지층으로 내렸다. 이러한 단계들은 수지층 높이에 아무런 변화가 없고 어댑터가 수지층에 도달할 때까지 반복하였다. 어댑터를 1-3 mm 더 내려서 수지층을 가압하여 어댑터와 수지층 사이에 존재할 수 있는 공간을 없애도록 하였다.
패킹에 대해 평가를 하기 전에, CS 컬럼을 1X SP로 평형화시켜 안정된 전도성 기준을 수립하였다. 스파이크 시험 커넥터를 이용하여 2%의 컬럼 부피(CV)로 1X SP/1M NaCl을 주입(4-2 밸브의 포트 3 내지 4)하여 컬럼 패킹을 평가하였다. 50 cm/hr 유속의 1X SP를 이용(4-2 밸브의 포트 1 내지 4)하여 컬럼을 평형화하였다. 전도성 피크는 약 ½ CV에서 나타났다. 유니콘(Unicorn) 소프트웨어 상에서 나타난 전도성 피크를 사용하여 컬럼 플레이트 높이(HETP)와 피크의 비대칭성에 대해 평가하였다. 일단 바람직한 컬럼 HETP가 달성되면, 컬럼을 살균 처리하여 사용 전에 0.5N NaOH 중에 저장하였다.
셀루파인 설페이트 ( CS ) 크로마토그래피 : AKTA 프로세스 스키드용 배관 장치를 준비하여 바이러스 수거 하루 전에 오토클레이브하였다. 모든 배관 장치에 대한 그림은 도 9B의 상부 패널에 나타나 있다. 크로마토그래피 전 공정을 프로그래밍된 방법으로 자동화하였다.
AKTA 프로세스 스키드의 모든 흐름 경로는 각 러닝을 가동하기 전에 1X SP를 이용하여 수동으로 평형화하였다. 공정의 시작에 있어서, 먼저 컬럼을 3 컬럼 부피(CV)의 1X SP를 사용하여 150 cm/hr의 선형 유속으로 평형화하였다. 다음으로, 5XUF 5XDF TFF1의 전체 부피를 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 그냥 통과해 흐른 결합되지 않은 물질은 수거하였다. 로딩 후, 컬럼을 1 CV의 1X SP를 150 cm/hr로 사용하여 세척한 후, 컬럼 상 벤조나아제 처리를 위해서 50 U/㎖ 벤조나아제 및 2 mM의 MgCl2를 포함하는 2.5 CV의 1X SP(1X SPB)를 150 cm/hr로 이용하였다. 감소된 선형 유속 및 계획적인 1X SPB 세척 부피로 인해 칼럼 수지는 벤조나아제와 50분간 접촉할 수 있게 되었다. 이후, 컬럼을 50 cm/hr에서 1 CV의 1X SP로 세척하여, 마지막 CV의 1X SPB, 컬럼상 벤조나아제 처리 및 별도의 1 CV의 1X SP(150 cm/hr)를 대체하였다. 결합된 바이러스는 3 CV의 1X SP/1M NaCl 버퍼를 이용해 컬럼으로부터 용리하였다. CS 용출물을 10 L의 봉지에 수거하고, 용리 피크는 UV 흡광도를 기초로 수집하였다[5 mm의 경로 길이를 갖는 UV 유세포를 이용하여 50 mAU 내지 50 mAU (0.1 O.D. 내지 0.1 O.D.)로부터 A280을 판독]. BPG 100 컬럼의 CS 용리 부피는 약 0.6 내지 0.9 L이다. 컬럼과 AKTA 프로세스 시스템은 각 공정의 러닝 후에 0.5N의 NaOH로 살균 처리하였다. 컬럼 로딩물, 유동물(flow-through), 세척물 및 용출물을 샘플 채취하여 FFA에 의한 감염도, 벤조나아제, HCD 및 HCP에 대해 시험하였다.
접선 흐름식 여과 2, 8 XDF ( TFF2 ) : 플렉스스탠드(Flexstand)의 설치와 사용은 제조업자의 교시에 따라 수행하였다. 0.5 mm의 내강 크기, 60 cm의 경로 길이 및 290 cm2의 막의 총 표면적을 갖는 500 kDa의 MWCO의 중공사를 사용하였다. 이러한 크기의 막 표면적과 상기 기술된 CS 용출물의 부피 때문에, 최종 로딩물은 20-50 L/m2의 막 표면적의 범위였는데, 이는 이전에 평가된 것과 같이 TFF2에 대해 최적인 범위 내에 속하는 것이다. 플렉스스탠드 상에 새로운 중공사의 설치는 바이러스 수거 하루 전에 수행하였다. 중공사를 DI수로 90분간 헹궈 글리세롤 보존제를 제거하고, 0.5N NaOH로 1시간 동안 살균 처리하며, pH가 7.2가 될 때까지 SP 100 버퍼로 평형화시켰다.
CS 용출물의 전체 부피는 플렉스스탠드 시스템을 통해 처리하였다. 투과된 여과물 라인을 먼저 폐쇄하여 CS 용출물이 0.5 L/분의 공급 유속으로 재순환하도록 하여, 16000 s-1의 전단 속도를 발생시켰다. 5분의 재순환 후, 투과된 여과물 라인을 개방하여 정용여과를 개시하였다. 이와 동시에, SP 100 버퍼를 정용여과 라인을 통해 주입하고, 잔류 여과물 콘트롤 밸브를 점진적으로 폐쇄하여 20-21 psi의 경막압을 수득하였다. 잔류 여과물 저장소의 부피는, SP 100 정용여과 라인의 주입 유속을 조절하여 전체 공정에 대한 CS 용출물 부피(0.4-0.8 L)와 동일한 부피로 일정하게 유지하였다. 러닝 8 이전에, CS 용출물을 5X 투석부피의 SP 100 버퍼로 정용여과하였다. CS 용출물은 정제 러닝 8-9를 위한 8X 투석부피의 SP 100 버퍼로 버퍼 교환하였다. 정용여과 종료시에, 잔류 여과물 밸브를 완전히 개방하고 투과된 여과물 라인을 다시 폐쇄해 생성물 회수 전에 시스템이 5분간 재순환하도록 하였다. 정용여과된 생성물을 10 L의 생성물 봉지에 배출시켰다. 정용여과된 생성물을 샘플링하여 FFA로 감염도에 대해 시험하였으며, 벤조나아제, HCD와 HCP에 대해서도 시험하였다. 중공사 카트리지 및 시스템은 0.5 L/분의 재순환 유속을 사용하여 0.5N NaOH로 1시간 동안 세정하였다.
직류식 여과 2 ( DFF2 ) : 여과 장치를 준비하여 바이러스 수거 하루 전에 오토클레이브하였다. 여과 장치의 그림은 도 9B의 하부 패널에 나타나 있다. 사용된 0.22 ㎛의 폴리에테르 설폰 막 캡슐은 그 총 표면적이 러닝 1-5에 있어서는 150 cm2였고, 러닝 6-9에 있어서는 300 cm2였다. 최종적인 멸균 여과 DFF2 단계는 무균작업대에서 수행하였다.
농축 글루탐산 아르기닌 젤라틴 (cGAG)을 8XDF 생성물에 1:9 (v/v) 희석도로 첨가하여 정제된 바이러스의 최종 조제물을 만들었다. 조제된 바이러스를 300 cm2 캡슐에 대해 약 0.38 LPM으로 폐쇄된 장치 어셈블리를 통해 주입하고, 최종 생성물을 사용하여 필터를 준비하였다. 여과물을 최종 벌크 생성물로서 멸균된 2L의 병에 수집하였다. 0.38 LPM의 여과 유속에서, 300 cm2 필터에 대한 흐름은 760 LMH이었다. 막 표면적에 대한 조제된 벌크의 로딩은 20-150 L/m2 범위였다. 0.22 ㎛로 여과된 최종 벌크 생성물을 샘플링하여 FFA에 의한 감염도를 시험하였고, 벤조나아제, HCD 및 HCP 수준에 대해서도 시험하였다. 최종 벌크 생성물을 분취하여 1, 10 및 100 mL의 부분 표본으로 만들어 급속 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
샘플 분석 및 계산 : 분석을 위해 보낸 모든 샘플들은 급속 냉동하여 -80℃에서 저장하였다. 기본적으로 하기 기술된 바와 같이 HCP 분석을 수행하였다. HCD 분석은 기본적으로는 하기 기술된 것과 같이 피코그린 및 PCR 방법을 사용하여 수행하였다. HCD 치수는 소랄렌-비오틴 블롯의 직접 표지법 및 아가로스 겔의 직접 염색법에 의해 분석하였다. 벤조나아제 정량 분석은 기본적으로 하기 기술된 바와 같이 수행하였다. 계산된 ng/투여량 또는 ㎍/투여량의 모든 수치는 7 log10FFU/투여량의 역가를 기초로 하였다(1 투여량은 흔히 107 FFU로도 지칭함).
숙주 세포 DNA 의 잔류량 측정 : 잔류 MDCK 숙주 세포 DNA의 양은 마이크로웰 포맷의 실시간 PCR 방법을 사용하여 정량한다. 분석의 표적은 개의 시토크롬 옥시다아제 서브유닛 I (Cox I) 유전자 내의 독특한 서열이다. 최적화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 한 세트를 이용하여, 주형으로부터 MDCK Cox I 특이적 PCR 생성물을 만들어 이를 SYBR® 녹색 염료에 의해 검출하였다. 마이크로웰 포맷은 광범위한 역학 범위(1000 내지 0.1 ng/㎖)에 걸쳐 DNA 캘리브레이터(calibrator)를 수용한다. 각 분석에는 적절한 양성 및 음성 대조군들이 포함되어 있다. 시험 샘플 DNA는 DNA 추출 키트를 이용하여 얻었다. 0.1 ng/㎖의 정량 한계 저점 이상의 샘플 DNA 양이 표준 곡선으로부터 계산될 것이다. 정확도는 스파이크 대조군의 회수율을 기준으로 75 내지 125% 이내일 것이다. 보고된 결과들은 50 내지 150%의 스파이크 회수율 수치를 내는 샘플 추출 복제물의 평균 DNA 양일 것이다.
숙주 세포 단백질의 잔류량 측정 : 잔류 숙주 세포 (MDCK) 단백질 (HCP)의 양은 HCP에 대해 생성된 1차 비오틴화 래빗 항체(감염되지 않은 MDCK 배양물에서 유래) 및 스트렙타비딘-고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO) 접합체를 이용하는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정하였다. MDCK 세포 용해물에 대한 항체는 폴리스티렌 마이크로플레이트 상에 흡착된다. 소 혈청 알부민을 함유하는 차단 용액을 첨가해 초과 결합 부위를 포화시킨다. 시험물의 샘플을 희석하여 코팅된 플레이트에 첨가한 경우, MDCK HCP가 존재한다면 상기 코팅된 항체에 결합할 것이다. 래빗에서 키운 MDCK 용해물에 대한 1차 항체(비오틴으로 표지됨)를 플레이트에 첨가한 후, 고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)로 표지된 스트렙타비딘 접합체를 첨가하였다. 마지막으로, HRPO 기질을 첨가하고 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 최종 형성된 생성물(착색됨)의 세기를 측정하였다. 현상된 색상의 세기는 시험물 내에 존재하는 MDCK HCP의 양에 비례한다. 표준 곡선은 공지된 단백질 농도의 MDCK 세포 용해물 캘리브레이터로부터 생성하였다. 표준 곡선으로부터 MDCK 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하였다.
벤조나아제의 잔류량 측정 : 벤조나아제 활성은 청어의 정자 DNA를 분해하는 역량에 의해 측정하였다. 시험물은 두 쌍으로 하여 벤조나아제 표준 곡선에 대해 비교하였는데, 여기서 판독은 260 nm에서 분광 광도계를 이용하여 수행하였다. % 스파이크 회수율(벤조나아제 활성)을 계산하여 순수한 벤조나아제 양(U/㎖)을 측정하였다. 스파이크된 기준 표준물의 순수한 벤조나아제 활성은 1.1 내지 1.9 U/㎖ 이어야하며, 연관성 계수는 ≥0.995 이어야 하고, 스파이크되지 않은 샘플 희석물에서의 활성은 정량가능한 활성에 있어서 ≥0.7 U/㎖ 이어야 하며, % 스파이크 회수율은 80 내지 120% 이어야 한다.
8.3.2 결과 및 고찰
모든 SUB 러닝은 8.0 내지 8.6 log10FFU/㎖ 수거 역가 범위를 나타내었다. 각 정제 러닝의 효율을 평가하는데 사용되는 회수율, HCD 및 HCP 결과는 표 20, 표 21 및 표 22에 요약하였다. 하기 섹션에서는 공정 효율성 및 최종 생성물의 품질을 개선하기 위해 수행한 변화에 대해 개략적으로 이야기하고 이에 대해 논할 것이다. 초기 및 최종 정제 계획에 대한 공정 전개 절차에 대해서는, 초기 정제 러닝에서부터 마지막 정제 러닝에 이르기까지의 주된 변화들을 보여주는 도 10에 요약 설명하였다.
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SVH - SVH 의 벤조나아제 처리에서 컬럼상의 벤조나아제 처리로의 변화 : 초기 공정에서, SVH 단계에서 벤조나아제 처리 작업을 수행하여 숙주 세포 DNA를 제거하였다. 이 공정 단계는 DFF1 단계를 수행하기 전에 32℃에서 20 L의 SVH와 50 U/㎖ 벤조나아제를 3시간 동안 혼합하는 단계를 수반한다. 정제 러닝 1 내지 4에서, 벤조나아제를 SVH 단계에서 첨가하는 반면, 정제 러닝 5 내지 9에서는 SVH 단계에서 벤조나아제 처리 작업을 생략하고, 50 U/㎖의 벤조나아제를 포함하는 크로마토그래피 버퍼와 50분간의 수지 접촉 시간을 이용하는 CS 크로마토그래피 공정을 수행하는 동안에 컬럼상 벤조나아제 처리를 수행하였다. 표 21에 나타난 바와 같이, 정제 러닝 2 내지 4에서는, SVH와 DFF1 간에 ng/투여량으로 보면 HCD 수준이 눈에 띄게 감소하지는 않았지만, 정제 러닝 5 내지 9에서는, 컬럼상 벤조나아제 CS 크로마토그래피 단계 후에 HCD 수준이 현저히 감소하였다. PCR과 피코그린 모두로 분석한 최종 벌크 생성물의 HCD 수준은, 정제 러닝 1 내지 4 (3.25 - 40.49 ng/투여량)에 비해 정제 러닝 5 내지 9 (0.84 -1.42 ng/투여량)에 있어서 훨씬 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 이러한 변화는 최종 벌크 HCD를 1 ng/투여량 이하의 수준으로 저하시킴으로써 최종 생성물의 품질을 개선하였을 뿐 아니라, 벤조나아제 처리 시간과 요구되는 벤조나아제의 총량을 감소시킴으로써 공정 효율성을 증대시켰다. 컬럼상 벤조나아제 처리의 영향에 대해서는 CS 크로마토그래피 섹션에서 추가로 거론할 것이다.
DFF1 : 표 20에 나타난 바와 같이, DFF1 단계는 러닝 4(52.7%)를 제외하고는 양호한 회수율(78.3-154.6%)을 나타냈다. DFF1 단계는 세포와 세포 잔해물을 제거하여 보통 역가에 있어서는 손실을 나타내지는 않았다. 또한, 이 단계는 HCD (표 21)를 어느 정도 제거하였으나, HCP (표 22)는 제거하지 못하였다. 20 L의 SVH를 여과하는데 사용된 양 필터(1.2 및 0.45 ㎛)의 막 면적은 양 필터의 용량에 기초하였고, 이는 미리 각각 2.6과 1.5의 안전계수를 이용하는 규모축소 Vmax/Pmax 연구로부터 측정하였다. 1.5 LPM의 여과 유속에 있어서는, 1.2 ㎛와 0.45 ㎛ 필터에 대한 흐름은 각각 500 LMH와 474 LMH이었다. 1.2 ㎛와 0.45 ㎛ 필터에 대한 실제 SVH 로딩량은 각각 111과 105 L/m2이었다.
TFF1 - TFF1 의 회수 단계를 개선하기 위한 설정 및 회수 방법에서의 변화 : 첫 여섯 번의 정제 러닝은 107.2%에서 30.3%로 각 러닝에 있어서 TFF1 단계의 회수능에서 점진적인 감소를 나타냈다(표 20). 정제 러닝 1 내지 6에서는, TFF1 중공사 카트리지는 공정 후에 0.5N NaOH로 세정하여 재사용하였다. 중공사 카트리지의 세정 성능이 각 러닝 후에 겔층을 완전히 제거하기에 충분한가에 대해서는 알려진 바 없지만, 이 공정 단계 후에 바이러스 회수율의 감소를 초래할 수도 있다. 보다 일관된 단계 회수율을 만들어 내기 위해서, 정제 러닝 7과 함께 시작하는 기존의 프로토콜에 3가지의 주된 변화를 이행하였다. 첫째, 각 러닝에 새로운 중공사를 사용하여 중공사의 불충분한 세정 가능성을 제거하였다. 둘째, TFF1 생성물을 수집하기 전에, 잔류 여과물 밸브를 개방하고 투과된 여과물 밸브를 폐쇄하면서 농축된 잔류 여과물을 중공사 카트리지 내에서 5분간 재순환시켰다. 이렇게 하였더니, 농축 및 정용여과 공정을 행하는 동안에 막의 표면에 형성될 수 있는 임의의 겔층을 제거하여 회수할 수 있게 되었다. 셋째, 동일한 재순환 유속과 시간(5분)으로 추가의 버퍼 헹굼 단계를 수행하여, 중공사 카트리지 내에 잔류하는 바이러스를 회수하고 버퍼 헹굼물을 생성물과 함께 수지하였다. 이러한 변화들을 행한 후, TFF1의 단계 회수율은 정제 러닝 7 내지 9에 있어서 약 75-80%로서 일관되게 높게 유지되었다(표 20). 도 11은 16000 s-1의 전단 속도와 20 psi의 일정한 TMP로 수행된 TFF1 공정(정제 러닝 8)에 대한 전형적인 흐름 곡선을 보여준다. 흐름은 바이러스 용액이 더 농축됨에 따라 감소하였으며(5XUF), 정용여과 단계가 개시될 때까지 계속 감소하다가 정용여과 단계가 마무리되면서 서서히 증가하였다(5XDF). 모든 정제 러닝에 있어서 흐름은 70-100 LMH 범위였는데, 이는 바이러스 역가 및 DFF1 여과물의 혼탁도와 관계가 있는 것으로 보인다. 정용여과 단계 종료시에 그 흐름이 약간 증가한 것은 아마도 5XDF의 마지막에 HCP 및 HCD 불순물이 추가로 제거되었기 때문일 것이다. 표 22에 나타난 바와 같이, 대부분(80-90%)의 HCP 불순물은 첫 번째 TFF (TFF1) 단계에서 제거되었는데, 이는 500 kDa보다 작은 HCP는 투과된 여과물 내에서는 제거되어야 하기 때문이다. 바이러스 수확물에서 1X SP로의 버퍼 교환이 완료되었다는 것은 5XDF 공정 말미에 전도율 자취가 12.5 mS/cm에서 1 mS/cm로 감소한 것으로 나타났다(도 11).
HCD 제거율을 증대시키기 위한 CS 컬럼상 벤조나아제 처리 : 초기의 실험은 10 cm의 층 높이 및 수지 1 mL 당 약 9.0 log10FFU의 바이러스 로딩 농도를 갖는 소규모 CS 컬럼을 이용하는 것으로 고안되었다. 공정이 개선됨에 따라, 수지 1 mL 당 바이러스 로딩 농도, 선형 유속 및 컬럼층 높이는 선형적으로 변경되었다. 9.0 log10FFU/㎖ 수지의 로딩 역가에서는, 8.3 log10FFU/㎖의 수확물 역가를 갖는 20 L의 안정화된 바이러스 수확물을 처리하는데 4 L 층 부피의 CS가 요구된다. 개선된 러닝 1 내지 5에서는, 4 L의 CS 수지를 BPG 200 컬럼 (20 cm 내경(i.d.)) 내로 패킹하여 최종 층 높이를 12.5 cm로 하였다. 200 cm/hr로 BPG 200 컬럼을 패킹하는 동안에, 배압은 권고 패킹 압력인 2.5 bar를 초과하였다(도 12). 역학적 결합능 연구를 수행한 결과, CS 수지는 실제로 상기 기술된 패킹 조건 하에 약 9.7 log10FFU/㎖ 수지까지 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 이와 같이, 9.5 log10FFU/㎖ 수지의 바이러스 로딩에서는, 8.3 log10FFU/㎖의 수확물 역가를 갖는 20 L의 안정화된 바이러스 수확물을 처리하는데 1.3 L만의 CS 수지가 요구될 뿐이다.
1.3 L의 CS 수지로 패킹된 A BPG 200 컬럼은 결과적으로 4.5 cm의 최종 컬럼 층 높이를 가진다. 컬럼 층 높이의 현격한 감소는 15-20 cm의 층 높이로 패킹된 컬럼(보통 대규모 공정에 이용됨)과 비교했을 때 더 낮은 분해능을 제공한다. 정제 러닝 6에서 시작해서, BPG 100 컬럼을 17.5 cm +/- 2.5 cm의 표적 층 높이로 패킹하여 1.4 L의 CS 컬럼 부피를 제공하였다. BPG 100 컬럼에 있어서는, 500 cm/hr의 패킹 유속을 사용하였으며, 그에 따른 패킹 압력은 BPG 200 컬럼에 대한 패킹 압력과는 상이한 수지의 권고 패킹 압력 한계를 초과하지는 않았다(도 12).
정제 러닝 6 내지 9 (BPG 100)와 정제 러닝 2 내지 5 (BPG 200)를 비교해 보면, 실제 로딩이 8.4-8.9 log10FFU/㎖ 수지 (BPG 200 컬럼)에서 9-9.3 log10FFU/㎖ 수지 (BPG 100 컬럼)로 증가되었을 경우, 평균 54% 내지 59%로 유사한 CS 용출물 단계의 회수율을 나타냈다(표 20). 컬럼상 벤조나아제 처리를 사용하여 정제를 수행했을 경우 HCD 제거에 대한 컬럼 성능에 있어서, 정제 러닝 6 내지 9 (BPG 100)는 정제 러닝 5 (BPG 200)에서 CS 용출물 HCD 수준(1.2 ng/투여량)과 유사한 CS 용출물 HCD 수준(0.3-1.5 ng/투여량)을 나타냈다(표 21). 컬럼 성능은 유사하지만, 컬럼 크기 감소로 CS 용출물의 부피 및 버퍼 준비량을 줄일 수 있어 공정 효율을 개선하였고, 이는 대규모 제조 과정으로 변형하여 적용할 때에도 요긴할 것이다. 도 13은 CS BPG 100 컬럼으로부터 용리된 단일 바이러스 피크에 대한 전형적인 크로마토그램을 보여주고 있다(러닝 9).
표 23에 나타난 바와 같이, 컬럼상 벤조나아제 처리에 있어 전반적인 HCD 클리어랜스 (러닝 5 내지 9)는 회분식 벤조나아제 처리(러닝 2 내지 4)에 비해 더 양호하였다. 벤조나아제 처리로 바이러스를 정제한 후에 잔류하는 HCD의 백분율이 0.15 - 3.4% (러닝 2 내지 4) 범위였던 반면에, 컬럼상 벤조나아제 처리로 바이러스를 정제한 후에 잔류하는 HCD의 백분율은 0.02 - 0.15% (러닝 5 내지 9) 범위였다. CS 단계에서의 컬럼상 벤조나아제 처리가 SVH 단계에서의 회분식 벤조나아제 처리 작업에 비해 전반적으로 더 높은 HCD 제거율을 보유하는 것으로 나타나, 결과적으로 최종 벌크에서 더 낮은 DNA 수준을 유도하였다.
회분식 벤조나아제 처리에 비해 컬럼상 벤조나아제 처리를 이용하는 것은 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 두 공정 단계를 하나의 단계로 통합하고, SVH 단계에서는 3시간이 소요되었던 벤조나아제 처리 작업을 CS 컬럼상 단계에서 1시간의 벤조나아제 처리 작업으로 대체함으로써 공정 효율성이 증대된다. 둘째, 정제 공정에 요구되는 벤조나아제의 총량을 줄일 수 있다. 회분식 벤조나아제 처리는 20 L의 바이러스 수확물에 대해 백만 단위의 벤조나아제가 요구되는 반면에, 컬럼상 벤조나아제 처리는 고작 수백, 수천 단위의 벤조나아제를 필요로 하기 때문이다. 따라서, 컬럼상 벤조나아제 처리는 필요한 벤조나아제의 총량을 5배까지 감소시키게 된다.
TFF2 - 벤조나아제 클리어랜스를 증기시키기 위한 TFF2 상에서 정용여과 부피 증가시키기 : 표 20에 나타난 바와 같이, 9개의 모든 정제 러닝에 있어서 TFF2의 단계 회수율은 일관되게 64% 이상이었다(64 - 150.8%). 러닝 3에서, CS 용리 부피는 3.2 L이었다. 290 cm2의 중공사를 이용하였더니, 중공사막 상에 로딩되는 CS 용출물은 110 L/m2로 증가하였고, 총 공정 시간은 6시간이었다. 다음 두 번의 연속하는 러닝에서는, 1400 cm2의 중공사막을 사용해 긴 공정 시간을 피하고 소규모 연구에서 정립된 약 20 - 50 L/m2의 로딩 농도를 유지하였다. 그러나, 러닝 6에서부터, 컬럼 크기는 4 L에서 1.4 L로 변화하였고, 용리 부피도 0.9 L 이하로 감소하기 시작하였다. 이러한 용출물 부피의 감소는 컬럼 크기에 정비례하였다. 6 내지 9에서는, 290 cm2의 중공사 카트리지를 사용해 CS 용출물 로딩 농도를 20 - 50 L/m2로 유지하였다. 도 14는 16000 s-1의 전단 속도와 21 psi의 일정한 TMP로 수행된 정제 러닝 8의 TFF1 공정(정제 러닝 8)에 대한 전형적인 흐름 곡선을 보여준다. TFF2 흐름은 정용여과 공정 전반에 걸쳐서 상당히 안정적인데, 이는 작업 조건이 오염물로 인한 손실을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 모든 정제 러닝에서 흐름은 80-110 LMH 범위였다.
벤조나아제의 클리어랜스를 향상시키기 위해 TFF2 버퍼 교환 부피도 5 투석부피에서 8 투석부피로 증가시켰다. 표 24에 나타난 바와 같이, 공정이 컬럼상 벤조나아제 처리 단계로 바뀌게 되면(러닝 5), CS 용출물의 벤조나아제 수준은 > 75 ng/㎖가 되었는데, 이는 벤조나아제가 CS 컬럼과 결합하여 바이러스 생성물과 함께 용리되었다는 것을 의미한다. CS 컬럼에 결합한 벤조나아제도 1X SPB 후에 1 CV 내지 4 CV의 유동 샘플을 평가함으로써 확인하였다. 유동 샘플은 낮은 벤조나아제 수준을 보유하는 것으로 나타났다(표 24). 따라서, 검출 한계(LOD) 미만의 수준으로 벤조나아제 클리어랜스를 증가시키기 위해, TFF2 버퍼 교환 부피를 정제 러닝 8 및 9에서는 5 투석부피에서 8 투석부피로 증가시켰다. 결과적으로, 정용여과를 5XDF에서 8XDF로 증가시킴으로써 벤조나아제 수준은 추가로 4-5배 감소하였다. 이러한 변화로 최종 벌크 내의 벤조나아제 수준은 LOD 미만, 즉 0.1 ng/투여량까지 감소하였다(표 24).
DFF2 - 최종 벌크의 최종 멸균 여과를 위한 필터 크기 증가시키기 : 표 20에 나타난 바와 같이, 150 cm2와 300 cm2의 0.22 ㎛ 최종 필터를 이용한 평균 단계 회수율은 각각 88.3-111.1%와 65.8-108%이었다. CTM 캠페인 러닝에서 최종 멸균 여과를 수행하는 동안 공급 스트림에 생길 수 있는 막힘을 피하기 위해서, 최종 필터의 크기로 300 cm2 필터를 선택하였다. 0.6 - 1 L의 최종 벌크를 여과하는데 사용되는 막 면적은, 로딩 범위를 20-150 L/m2로 이미 정립한 소규모 연구를 바탕으로 하였다. 여과 유속은 300 cm2 필터에 있어서 0.38 LPM이었고, 이 필터에 대한 흐름은 760 LMH이었다. 필터에 대한 실제 로딩량은 20-33 L/m2이었는데, 이는 소규모 연구에서 측정된 범위 내에 해당하는 것이다.
업스트림 ( SUB ) 공정 수거 시간 변화(3 dpi → 2 dpi ) : 정제 러닝 8에서부터, 바이러스 수거 시간을 3 dpi (60 - 65 hr 수거)에서 2 dpi (48 hr 수거)로 변경하였다. 바이러스 투입량을 0.001 내지 0.003 FFU/세포로 사용하였을 경우, 피크 바이러스 역가는 48시간 dpi에서 관찰되었다. 수거 시간의 변화는 정제 러닝 8과 9 (표 21 및 표 22)의 SVH 단계에서 나타난 바와 같이 개시 HCD 및 HCP 수준의 감소를 유도하였다. 또한, 이러한 변화는 최종 벌크 생성물 내에서 더 낮은 불순물 수준의 HCD 및 HCP를 유도하여(표 21 및 표 22), 결과적으로 최종 생성물의 품질을 개선하게 되었다.
상기 시행된 정제 공정은 우수한 바이러스 수율과 순도를 나타냈다 : 완전하게 시행된 공정은 정제 러닝 8과 9에서 입증되었다. 이들 두 러닝의 전체적인 역가 회수율의 평균은 43.4%이었고, 평균 HCD 불순물 수준은 0.72 ng/투여량 (피코그린에 의해 측정시) 및 0.1 ng/투여량 (PCR에 의해 측정시)이었으며, HCP 불순물 수준은 0.21 ㎍/투여량이었고, 벤조나아제 불순물 수준은 0.0035 ng/투여량이었는데, 이들 모든 수치는 정제된 벌크가 규정하는 사항 이내에 해당되는 것이다.
요약하자면, 공정 효율과 최종 생성물 품질을 개선하기 위해 초창기 정제 공정에 하기를 비롯한 몇 개의 변화를 가한 것이었다: 1) 바이러스 수거 시간을 3 dpi에서 2 dpi로 변경하여 SVH에서 더 낮은 HCD 및 HCP 불순물 수준을 유도하였고, 2) HCD 처리 단계를 SVH에서의 회분식 벤조나아제 처리에서 CS 컬럼상 벤조나아제 처리로 변경하여 전체적인 HCD 분해 및 제거 작업을 개선하였으며, 3) CS 수지의 표적 로딩 농도를 9.0 log10FFA/㎖에서 9.5 log10FFA/㎖로 증가시켜, 컬럼 크기를 4 L에서 1.4 L로 감소시켰고, 4) TFF2에 대한 최종 조제물의 버퍼 교환 부피를 5 투석부피에서 8 투석부피로 증가시켜 벤조나아제 제거 작업을 개선하였으며, 5) 최종 멸균 여과 로딩량을 절반인 평균 25 L/m2로 감소시켜 CTM 러닝에서 최종적으로 여과를 수행하는 동안에 생길 수 있는 막힘을 피하였다.
최종 정제 공정은 도 10에 나타나 있으며, 모든 정제 러닝에 대한 데이터는 표 25에 요약되어 있다. 개선된 정제 공정에 있어 그 역가에 기초한 전체적인 바이러스 회수율의 평균은 43.4%이었고, 벤조나아제에 대한 평균 불순물 수준은 0.0035 ng/투여량이었으며, HCD에 대한 평균 불순물 수준은 0.72 ng/투여량 (피코그린에 의해 측정시) 및 0.1 ng/투여량 (PCR에 의해 측정시)이었고, HCP에 대한 평균 불순물 수준은 0.19 ㎍/투여량이었다. 이러한 불순물 수준은 규정된 사항 이내에 속하는 것이다. 정제 러닝 6 내지 9의 최종 벌크를 직접 표지법 (소랄렌-비오틴) 블롯과 직접 염색 방법 (아가로스 겔)을 이용한 DNA 크기 분석에 의해 분석하였다. 이들 분석에 두드러진 신호는 ≤ 500 bp의 DNA 크기 분포를 나타내었다(데이터는 나타내지 않음).
8.4 실시예 4. 세포 배양으로 생산된 인플루엔자를 위해 변형된 정제 공정
섹션 8.3에 기술된 견고한 대규모 정제 공정에 가할 수 있는 추가의 변형은 도 10b에 개괄하고, 이를 하기에서 상술한다. 특히, 수거, 정화 및 TFF1 단계들은 서로 짝지워져서, 수거 탱크에 대한 필요성을 제거할 수 있고, 조작 단계의 수를 줄일 수 있으며, 전체적인 공정 처리 시간을 개선할 수 있다. 보다 원만한 커플링 작업을 위해, TFF1 작업은 일정한 TMP에서 일정한 흐름으로 그 설정을 변경할 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 더 낮은 TMP가 이용된다(20 psi보다 더 낮은 TMP, 예를 들어 약 10 psi (12,000 s-1) 내지 약 14.5 psi (16,000 s-1). 벌크 부피를 감소시키기 위해 TFF2 단계에 2X UF 단계를 첨가할 수 있다. 선택적으로, TFF1에 10X UF를 사용하여 차후의 모든 정제 단계의 로딩량을 두 배로 할 수 있다.
표 26은 수 개의 정제 러닝에 있어서 매개변수 변화, 회수율 및 HCD에 대해 요약하고 있다. 이들 러닝은 기본적으로 상기 기술된 바와 같이 배지 교환을 하지 않으면서 MediV SFM 110에서 생산된 바이러스를 이용하였다(섹션 8.1에 제공된 실시예 참조). 모든 정제 러닝은 하기 언급한 것을 제외하고는 기본적으로는 1b 공정에 기술된 대로 수행하였다(섹션 8.3에 제공된 실시예 참조). 러닝 #25, #27 및 #30은 수거, DFF 및 TFF1 단계를 커플링하여 수행하였다. 이들 러닝에서, TFF1은 일정한 유속(50 LMH, 12,000 s-1의 전단 속도)로 가동하였다. 러닝 #24, #26 및 #31은 수거, DFF 및 TFF1 단계를 커플링하지 않고 수행하였다. 이들 러닝에서, TFF1은 더 낮은 TMP (10 psi, 16,000 s-1의 전단 속도)에서 가동하였다. 컨디셔닝된 바이러스 로딩량은 CS 단계에서 나누어서 2 mM의 MgCl2 또는 10 mM의 MgCl2로 처리하였다. DNA 분석을 통해 MgCl2 농도 증가로 인해 DNA 크기가 감소하지는 않았음을 알 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 어떤 경우에는 수율이 감소하였다(표 26).
표 27은 배지 교환을 하지 않으면서 MediV SFM 105에서 생산된 바이러스를 이용한 정제 러닝에 있어서 매개변수 변화, 회수율 및 HCD에 대해 요약하고 있다. 이들 러닝은 기본적으로 국제 특허 공보 WO 08/105931 (특히, 실시예 12)에 기술된 바와 같이 생산된 바이러스를 이용하였다. 모든 정제 러닝은 하기 언급한 것을 제외하고는 기본적으로는 1b 공정에 기술된 대로 수행하였다(섹션 8.3에 제공된 실시예 참조). 러닝 #40, #41 및 #42은 수거, DFF 및 TFF1 단계를 커플링하여 수행하였다. 이들 러닝에서, TFF1은 일정한 유속(35 LMH, 12,000 s-1의 전단 속도) 또는 일정한 TMP (10 psi, 12,000 s-1의 전단 속도)에서 가동하였다. 일정한 유속을 이용한 러닝은 소규모로 수행하였으며, CS 단계에 대해서만 공정을 가동하였다. 러닝 #43은 수거, DFF 및 TFF1 단계를 커플링하지 않고 수행하였다.
이러한 연구들은 모두 MediV SFM 110 (MX 수행 안함) 및 MediV SFM 105 (MX 수행함) 공정의 재료들이 유사한 유속/TMP 특성을 나타내고 있음을 시사하고 있다. 더 낮은 전단 속도 (12,000 s-1), 더 낮은 TMP (10 psi) 및 더 낮은 유속 (35 LMH)를 사용하여 TFF 공정 단계에 소요되는 시간이 더 길어졌지만, 수거, DFF 및TFF 단계를 커플링하여 실행한 경우 전체적인 공정 시간은 더 단축될 수 있었다. 이들 정제 러닝에서 HCD의 최종 농도는 0.01-0.6 ng/투여량인 것으로 나타났는데, 이는 상기 기술된 1b 공정에 얻어진 것과 유사한 것이다. 전체적인 수율은 일반적으로 30%를 초과한 수준이었다.
Figure pct00029
Figure pct00030
8.5 실시예 5: RSV 를 생산하기 위한 하류 제조 공정
세포 기반 RSV 백신에 대한 강건한 규모가변적인 제조 공정의 개발은 상이한 공정 변수의 스크리닝 및 최적화를 필요로 한다. 초기 하류 공정 개발은 10-L 규모에서 수행되고 제조 공정은 30-L로 규모 확대하였다. 바이러스 수확물(VH)는 생물반응기에서 생성하였고 감염 이후 7일(dpi) 후 수확하였다. VH는 HyQtainer로 펌핑하고 3-㎛ 직류식 여과를 이용해 정화하였다. 초기 여과는 세포 찌꺼기, 미세담체, 숙주 세포 DNA의 40-70%, 및 VH에 존재하는 다른 미립자들을 제거한다. 이 단계 이후에 10 U/mL-바이러스 수확물로 비특이적 엔도뉴클레아제, 벤조나아제로 나머지 숙주 세포 DNA를 효소 분해가 후속된다. 반응은 5 mM EDTA로 중지시켰다. 벤조나아제 처리 후, VH 는 0.65-㎛ 여과로 정화하고, 안정화 버퍼(안정화 버퍼의 조성은 재료 섹션을 참조함)로 1/6(v/v) 희석하여 안정화시켰다. 안정화된 VH는 12-16시간 동안 실온(21±2℃)에 저장할 수 있다. 접선흐름식 여과(TFF)를 다음날 안정화된 VH 재료에 대해, 경로 길이가 60 cm이고 섬유 내경이 1 mm인 500 kDa 중공사 카트리지를 이용해 수행하였다. TFF 단계는 안정화된 VH를 농축시키고 외생성 엔도뉴클레아제, 오염물 예컨대 숙주 세포 DNA, 및 숙주 세포 단백질을 제거한다. TGG 단계는 또한 농축된 VH를 선택한 제형 버퍼로 교환하는데 사용된다. TFF 단계는 안정화된 VH의 5배 농축, 및 SPP2 버퍼로 7배 버퍼 교환(버퍼 조성은, 재료 섹션 참조)을 포함하였다. SPP2 버퍼로 7X 정용여과후, 4X 정용여과를 SPP3 버퍼(버퍼 조성은 재료 섹션 참조).로 수행하였다. 투석유물을 이후 터미널 Sartorius Sartoclean 셀룰로스 아세테이트 3/0.8-㎛ 필터를 이용해 정화하였다. 3회 10-L 및 2회 30-L 생물반응기 러닝 동안 정제된 RSV 약물 물질의 역가 및 불순물 프로파일 및 정제 공정의 역가 회수율을 이하 실시예에서와 같이 기술한다.
8.5.1 재료 및 방법
재료, 시약 및 장비 : 유사하게 수행하는 다른 재료, 장비 및 시약으로 용이하게 대체할 수 있다.
1) 10X SPG; 2180 mM 수크로스, 1100 mM 인산칼륨, 및 540 mM 글루탐산모노나트륨, pH 7.3(HyClone, Ltd., Logan, UT, Catalog# SH3A2025.01)
2) SPP1; 1498 mM 수크로스, 200 mM 제1인산칼륨, 500 mM 제2인산칼륨, 1050 mM KCl, pH 7.2(HyClone, Ltd., Logan, UT, Catalog# SH3A2559.01)
3) SPP2; 730 mM 수크로스, 28.5 mM 제1인산칼륨, 71.2 mM 제2인산칼륨, 150 mM KCl, pH 7.2(HyClone, Ltd., Logan, UT, Catalog# SH3A2560.03)
4) SPP3; 292 mM 수크로스, 7.7 mM 제1인산칼륨, 12.3 mM 제2인산칼륨, 100 mM KCl, pH 7.0(HyClone, Ltd., Logan, UT, Catalog# SH3A2561.03)
5) 주사용 수(WFI), 10 L/bag(HyClone, Ltd., Logan, UT, Catalog# SH30221.24)
6) 일반 실험실 용도로 적합한 물(VWR, West Chester, PA, Catalog# BDH1168-4LP)
7) 벤조나아제 엔도뉴클레아제, 순도 등급 I(EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, Catalog# 1.01697.00021, Lot# K38894897)
8) 1 M 염화마그네슘(Sigma, St Louis, MO, Catalog# M-1028)
9) 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2나트륨 염 용액(Sigma, St Louis, MO, Catalog# E-7889)
10) 10 N 수산화나트륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# VW3247-7)
11) 0.5 N 수산화나트륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# VW3221-4)
12) 8 N 수산화칼륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# 200056-170)
13) 에틸알콜, 무수물(VWR, West Chester, PA, Catalog# BJAH090-4)
14) 수크로스(VWR, West Chester, PA, Catalog# EM 1.07653.9028)
15) 제1인산칼륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# JT3248-7)
16) 제2인산칼륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# JT3250-7)
17) 염화칼륨(VWR, West Chester, PA, Catalog# EM-PX1405-5)
18) Sartopure PP2, 3-㎛, 2000-㎠ 필터(Sartorius, Edgewood, NY, Catalog# 5595302P9-00-A)
19) Sartopure PP2, 0.65-㎛, 1000-㎠ 필터(Sartorius, Edgewood, NY, Catalog# 5595305P8-00-A)
20) Sartopure PP2, 0.65-㎛, 500-㎠ 필터(Sartorius, Edgewood, NY, Catalog# 5595305P7-00-A)
21) Sartoclean CA, 3.0 + 0.8 ㎛, 500-㎠ 필터(Sartorius, Edgewood, NY, Catalog# 5625304E7-00-A)
22) Acro50 0.2-㎛ PTFE vent 필터(Pall Corporation, East Hills, NH, Catalog# 4251)
23) 500 kDa 중공사 카트리지(막면적: 850-㎠, 내강 ID: 1 mm)(GE 헬스케어, Piscataway, NJ, Catalog# UFP-500-E-4X2MA)
24) 500 kDa 중공사 카트리지(막면적: 2800-㎠, 내강 ID: 1 mm)(GE 헬스케어, Piscataway, NJ, Catalog# UFP-500-E-6A)
25) 3/8" 폴리설폰 인라인 hose barb(VWR, West Chester, PA, Catalog# 16001-592)
26) 3/8 폴리설폰 실리콘 씰(VWR, West Chester, PA, Catalog# 16001-600)
27) 마스터플렉스 백금-경화 실리콘 도관, L/S 36(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Catalog# EW-96410-36)
28) 마스터플렉스 백금-경화 실리콘 도관, L/S 24(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Catalog# EW-96410-24)
29) 마스터플렉스 프리시젼 PharMed 도관, L/S 16(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Catalog# 06485-16)
30) 백금-경화 실리콘 도관, 1/2"ID x 3/4" OD(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Catalog# EW-95802-23)
31) Dow Corning Pharma 강화 도관, 1/2" ID(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Catalog# EW-96108-10)
32) Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트(Invitrogen, Eugene, 또는, Catalog# P11496)
33) 쿠마시 플러스- The Better Bradford Assay 키트(Thermo Scientific, Rockf또는d, IL, Catalog# 23236)
34) 벤조나아제 ELISA 키트 II(EMD Chemicals, Inc, Gibbstown, NJ, Catalog# 1.01681.0002)
35) 1 M MgCl2(Sigma, St. Louis, Missouri, Cat. No. M1028, lot # 085K8920)
36)
37) 96-웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-one, New York, NY, Catalog# 655090)
38) 125-mL 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜-개질(PETG) 사각 배지 용기(VWR, West Chester, PA, Catalog# 16159-130)
39) 1-L PETG 사각 배지 용기(VWR, West Chester, PA, Catalog# 16159-136)
40) 2-L PETG 사각 배지 용기(VWR, West Chester, PA, Catalog# 16159-138)
41) 10-L 플렉스보이 어셈블리(Sartorius Stedim Biosystem, Edgewood, NY, Catalog# SH30712.02)
42) 20-L 플렉스보이 어셈블리(Sartorius Stedim Biosystem, Edgewood, NY, Catalog# SH30712.03)
43) 50-L 플렉스보이 어셈블리(Sartorius Stedim Biosystem, Edgewood, NY, Catalog# SH30712.04)
44) 10-L 폴리프로필렌 카르보이(VWR, West Chester, PA, Catalog# 36494-090)
45) 20-L 폴리프로필렌 카르보이(VWR, West Chester, PA, Catalog# 36494-092)
46) 2-mL 극저온 폴리프로필렌 바이알, 멸균(VWR, West Chester, PA, Catalog# 66008-728)
47) 검사지 pH 4-9 이중 분배기(VWR, West Chester, PA, Catalog# 60777-049)
장비
1) 펌프, 520S(Watson Marlow, Wilmington, MA, Catalog# 050.7131.10A)
2) 펌프, 620Di N/R(Watson Marlow, Wilmington, MA, Catalog# 060.417N.02A)
3) 펌프, 720SN/RE(Watson Marlow, Wilmington, MA, Catalog# 070.413N.E0A)
4) 위생 설비가 구비된 12-mm Sta-Pure 620 LoadSure 성분(Watson Marlow, Wilmington, MA, Catalog# 960.0120.PFT)
5) 위생 설비가 구비된 19-mm Sta-Pure 720 LoadSure 성분(Watson Marlow, Wilmington, MA, Catalog# 960.0190.PFT)
6) 생물학적 안전 캐비넷, Purifier Class II(Labconco, San Ramon, CA, Model# 96212042726)
7) 웨이브 믹서(Wavebiotech, LLC, Somerset, NJ,　Part# MIXER20/50EH)
8) 저울, Max: 3100 g(Sartorius Mechatronics, Catalog# BL3100)
9) 저울, Max: 60 kg(Sartorius Mechatronics, Catalog# EB60EDE-I)
10) 저울, Max: 150 kg(Sartorius Mechatronics, Catalog# E150EDE-I)
11) 압력 게이지가 구비된 스탠다드 플렉스스탠드(FlexStand)(GE 헬스케어, Piscataway, NJ, Catalog# FS-01S-30)
12) 압력 게이지가 구비된 저공극 용적 플렉스스탠드(GE 헬스케어, Piscataway, NJ, Catalog# FS-03LVS-30)
13) SciPres 압력 유동 셀(Scilog, Middleton, WI, Part# 080-699PS-5)
14) 분자 동력학 SpectraMax GEMINI 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Part# EM)
15) SoftMax Pro 프로그램, 버젼 4.8(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Part# SMP53-GXP-SITE)
16) 윈웨지, 스탠다드 에디션(TAL Technologies, Philadelphia, PA, Part# Winwedge Std)
10-L 생물반응기 수확물로부터 RSV 정제
10-L 생물반응기 작업으로 얻은 RSV VH(∼8 L)를 0.41 mL/분/㎠의 유량으로 3.0-㎛ 필터(Sartopure PP2, 2000 ㎠)를 이용해 정화하였다. 얻어진 여과물을 바이러스 수확물 1 mL 당 벤조나아제 10 U 및 5 mM MgCl2와 웨이브 믹서 상에서 3시간 동안 32±3℃에 10-L HyQtainer 어셈블리에서 항온반응하여 숙주 세포 DNA를 분해하였다. 반응은 최종 농도 5 mM로 EDTA를 부가하여 중지시켰다. 벤조나아제 처리된 수확물은 3.0 mL/분/㎠의 유량으로 0.65-㎛ 필터(Sartopure PP2, 500 ㎠)를 이용해 정화시켯다. 여과물을 이후 SPP1 버퍼의 7X 농축된 용액을 이용하여 최종 1X SPP로 안정화시키고 실온(21±2℃)에서 밤새(12-16시간) 저장하였다. 안정화된 바이러스 수확물을 5배로 농축하고 SPP2 버퍼로 7배 정용여과시킨 후 SPP3 버퍼로 4배 정용여과하였다. TFF 공정은 850 ㎠ 중공사 카트리지를 이용하여 수행하였다. 로딩 비율(막 면적 당 바이러스 공급물의 중량), 전단력, 경막압(TMP)은 각각 10 g 공급물/㎠, 12,000 s-1 및 15 psi이었다(TFF 매개변수에 대해 표 1 참조). 정용여과물은 3.8 mL/분/㎠의 유량으로 3/0.8-㎛ 필터(Sartoclean CA, 500 ㎠)를 이용해 정화하였다. 이 필터를 이후 정용여과물 부피의 1/3인 SPP3 부피로 세척하였다. 최종 여과물을 배합하고, 125 mL PETG 용기 내 100-mL 분취물로서 급속 냉동하거나 또는 속도 제어 동결시키고, -80℃에 저장하였다. 샘플(1 또는 10 mL)을 또한 분석을 위해 각 정제 단계 이후 회수하였다. 이들을 급속 동결하고 -80℃에 저장하였다.
30-L 생물반응기 수확물로부터 MEDI -559의 정제
30-L 생물반응기 작업으로 얻은 RSV 바이러스 수확물(∼25 L)을 0.41 mL/분/㎠의 유량으로 평행하게 배열된 2개의 3.0-㎛ 필터(Sartopure PP2, 2000 ㎠)를 이용해 정화하였다. 얻어진 여과물은 바이러스 수확물 1 mL 당 10 U의 벤조나아제 및 5 mM MgCl2와 웨이브 믹서 상에서 3시간 동안 32℃에 50-L HyQtainer 어셈블리에서 항온반응시켜 숙주 세포 DNA를 분해하였다. 반응은 최종 농도 5 mM로 EDTA를 부가하여 중지시켰다. 벤조나아제 처리된 수확물은 유량 3.0 mL/분/㎠의 유량으로 0.65-㎛ 필터(Sartopure PP2, 1000 ㎠)를 이용하여 정화하였다. 다음으로 여과물은 SPP1 버퍼의 7X 농축액을 이용해 1X SPP의 최종 농도로 안정화시키고 실온(21±2℃)에서 밤새(12-16시간) 저장하였다. TFF 공정은 2800 ㎠ 중공사 카트리지를 이용해 수행하였다. 로딩 비율(막면적 당 바이러스 공급물의 중량), 전단율, 및 경막압(TMP)은 각각 10 g 공급물/㎠, 12,000 s-1 및 15 psi였다(TFF 변수에 대해서는 표 28 참조). 정용여과물은 3.8 mL/분/㎠의 유량으로 3/0.8-㎛ 필터(Sartoclean CA, 500 또는 1000 ㎠)를 이용해 정화하였다. 이 필터를 이후 정용여과물 부피의 1/3인 SPP3의 부피로 세척하였다. 최종 여과물을 배합하고, 125 mL PETG 용기에 100 mL 분취물로서 급속 냉동 또는 속도 조절 냉동시키고, -80℃에 저장하였다. 샘플(1 또는 10 mL)을 또한 분석을 위해 각 정제 단계 이후에 회수하였다. 이들을 급속 냉동시켜 -80℃에 저장하였다.
Figure pct00031
Figure pct00032
형광 포커스 분석에 의한 감염성 결정
샘플의 바이러스 역가는 VAS(Vaccine Analytical Science) 그룹에 의해 결정하였다. 이 분석법은 테스트 샘플 내 바이러스를 정량하기 위해 F 단백질 특이적 단일클론 항체를 사용한다.
Quant - iT PicoGreen dsDNA 분석법에 의한 총 DNA 정량
샘플의 전체 DNA 농도는 제조사 설명서에 따라 Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트를 이용해 측정하였다. 샘플의 4 연속 희석물(1:2)을 이중으로 준비하였다. 1.95 내지 1000 ng/mL 범위의 표준물을 삼중으로 준비하였다. 모든 희석은 1X SPG 버퍼를 이용하여 96-웰 마이크로플레이트에서 수행하였다. 형광 강도 방출량을 표준 DNA 농도에 대해 그래프화하였다. 샘플의 전체 DNA 농도는 표준 곡선의 선형 회귀 적합도로부터 외삽한 후, 적절한 희석 배수로 조정하여 결정하였다. 적합화된 선의 y-절편을 (0, 0)로 설정하여 낮은 DNA 농도에 대한 외삽값의 정확성을 증가시켰다. 각 샘플에 대해 보고된 전체 DNA 농도는 연속 희석으로 결정된 농도의 평균이다.
실시간 PCR 에 의한 잔류 Vero 숙주 세포 DNA 정량화
샘플 내 Vero 숙주 세포 DNA의 농도는 VAS 그룹으로 측정하였다. 이 분석법은 백신 바이러스를 포함하는 세포 물질을 함유하는 샘플 중에서, 실시간 PCR을 통해 아프리카 녹색 원숭이(Vero 세포 유래됨) 특이적 DNA를 검출한다.
브래드포드 단백질 분석법에 의한 전체 단백질 정량화
샘플의 전체 단ㄷ백질 농도는 SOP Q0169에 따른 표준물로서 소 혈청 알부민(BSA)를 사용하고 쿠마시 플러스(브래드포드) 분석 키트를 이용해 측정하였다. 2.5∼25 ㎍/mL 범위의 표준물을 삼중으로 준비하였다. 각 샘플의 10배 희석을 초기에 실시하였다. 각 희석된 샘플의 3 연속 희석물(1:2)를 이후 삼중으로 준비하였다. 모든 희석은 1X SPG 버퍼를 이용해 96-웰 마이크로플레이트에서 수행하였다. 595 nm에서의 흡광도를 표준 BSA 농도에 대해 그래프화하였다. 샘플의 전체 단백질 농도는 적절한 희석 배수에 의해 결정하였다. 각 샘플에 대해 보고된 전체 단백질 농도는 연속 희석에 대해 계산된 농도의 평균이다.
ELISA 에 의한 잔류 Vero 숙주 세포 단백질 정량화
샘플 내 잔류 Vero 숙주 세포 단백질의 농도는 VAS 그룹으로 결정하였다. 이 분석법은 아프리카 녹색 원숭이(Vero 세포 유래됨) 특이적 단백질을 정량하기 위해 효소 연결된 면역흡착 분석법을 이용한다. 사용된 항체는 염소에서 Vero 세포 용해물에 대해 발생시킨 정제된 다클론 항체이다.
ELISA 에 의한 벤조나아제 정량화
샘플의 벤조나아제 농도는 벤조나아제 엔도뉴클레아제 ELISA 키트를 이용해 측정하였다. 이 분석은 벤조나아제를 정량하기 위해 효소 연결된 면역흡착 분석법을 이용한다. 1차 항체가 벤조나아제에 결합하고 2차 항체가 벤조나아제와 1차 항체 복합체에 결합하며 450 nm에서 비색 검출하였다. 표준 그래프는 벤조나아제 스톡을 이용해 생성시켰다.
RSV -F 단백질 발현의 측정
RSV-F 단백질의 존재에 대한 동정 실험은 웨스턴 블랏으로 결정하였다. 이 분석에서, 샘플을 마커, 양성 및 음성 대조군과 함께 SDS-PAGE 상에서 러닝한다. 단백질 밴드를 이동 장치 및 이동 버퍼를 이용해 SDS-PAGE에서 나일론막으로 이동시킨다. 나일론막은 이후에 2차 항체의 결합으로 검출되는 RSV F 단일클론 항체와 함께 항온반응시킨다.
모세관 전기영동에 의한 DNA 크기화
DNA 크기화는 VAS(Vaccine Analytical Science) 그룹에 의해 수행하였다. 샘플을 모세관 전기영동기 상에 로딩하여 DNA를 분리하였다. 다양한 크기의 DAN 단편은 상대 형광발광 단위를 판독하여 정량화하였다.
삼투몰농도 측정
샘플의 삼투몰은 Advanced Instruments의 삼투몰측정기를 이용해 측정하였다. 먼저 표준물을 삼투몰측정기 상에서 러닝시킨 후 샘플을 샘플 튜브에 로딩하면 삼투몰 판독값이 표시된다.
8.5.2 결과 및 고찰
30-L 규모(SUB 092529 및 SUB 09-005)에서의 RSV 제조 공정 효율은 10-L 규모(BR09-068, BR09-069, 및 BR09-73)에서의 효율에 필적하였다. 전체 회수율은 6∼14%였고 5회 작업에서 일관적이었다(표 29). 바이러스 수확물의 감염성은 6.5∼7.0 log10 FFU/mL 범위였고, 정제된 약물 물질의 감염성은 6.0∼6.7 log10 FFU/mL 범위였다(표 30). SUB 090529의 바이러스 수확물에 대한 역가가 특히 낮았는데, 이 배양물은 V559-2b 대신 V559-1b 바이러스 종균으로 감염되었기 때문이다. 결과적으로, 최종 정제된 벌크의 역가도 5 로트 중에서 가장 낮았다. V559-1b는 세포-스크래핑에 의해 T-플라스크에서 생성되었기 때문에, 이종성 정도가 높게 나타났고, 이의 사용은, 롤러 용기에서 생성시키고 유리 비드를 이용하여 부착된 세포를 제거시켜 준비한, V559-2b의 사용보다 역가 가변성은 보다 높고 감염성은 보다 낮아질 수 있다. SUB09-005 VH의 역가 및 최종 벌크도 역시 낮은데 감염시점에 세포 밀도가 낮았기 때문이다.
정제된 벌크의 잔류 벤조나아제, 숙주 세포 DNA, 및 숙주 세포 단백질 농도는 모두 RSV 약물 물질에 대해 제안된 상세항목을 만족하였다(표 31). < 300 bp인 잔류 DNA 단편의 비율은 80% 보다 높았고, > 1000 bp 단편의 비율은 5% 이하였다(표 32). RSV-F 단백질의 발현은 정제된 벌크의 모든 5 로트에서 검출되어, RSV의 존재가 검증되었다(표 31).
결론
생물반응기-유래 수확물로부터 RSV에 대해 개발된 정제 공정을 10-L 및 30-L 규모에서 평가하여 공정의 강건성 및 최종 약물 물질의 품질을 평가하였다. 양쪽 규모에서의 바이러스 수확물의 감염성, 정제된 벌크의 감염성, 및 전체 역가 회수율은 각각, 6.5-7.0 log10 FFU/mL, 6.0-6.7 log10 FFU/mL, 및 6-14% 범위였다. 정제된 벌크의 잔류 벤조나아제, 숙주 세포 단백질, 및 숙주 세포 DNA 농도는 모두 RSV 약물 물질에 대해 제안된 상세항목을 충족시켰다. 또한, 잔류 DNA 단편의 80% 이상은 그 크기가 < 300 bp였다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
전술한 발명을 명확함과 이해의 목적으로 일부 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 진정한 범주를 벗어나지 않고 그 형태 및 항목에 다양한 변화를 가할 수 있다는 것은 본 출원 내용을 통해 당업자의 숙련가에게는 자명하다. 예를 들어, 상기 기술된 모든 기술 및 장치를 다양하게 조합하여 사용할 수 있다. 본 출원에서 인용한 모든 출판물, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문헌들은 각각의 개별 출판물, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문헌들을 모든 목적으로 위해 참조하여 포함시킨다고 개별적으로 언급한 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그것들을 참조하여 포함시킨다. 또한, 하기 미국 가출원: 제60/845,121호(2006년 9월 16일 출원); 제60/871,721호(2006년 12월 22일 출원); 제60/917,008호(2007년 5월 9일 출원); 제60/951,813호(2007년 7월 25일 출원); 제61/099,749호(2008년 9월 24일 출원); 및 2007년 9월 14일 출원된 미국 특허 출원 제11//855,769호를 전체로 참조하여 포함시킨다.

Claims (9)

  1. 바이러스 감염된 세포로부터 호흡기 세포융합 바이러스를 정제하는 방법으로서,
    a) i. 공극 크기가 약 3 ㎛∼약 10 ㎛인 1 이상의 정화 필터를 통한 직류식 여과(DFF)에 의해 바이러스 수확물을 여과시키고;
    ii. 바이러스 수확물을 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리하며;
    iii. 공극 크기가 약 0.45 ㎛∼약 3 ㎛인 1 이상의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 바이러스 수확물을 여과시키는 것을 포함하는, 바이러스 수확물을 정화하여(clarifying) 정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;
    b) 정화된 바이러스 수확물을 염(NaCl 또는 KCl)과 수크로스, 인산염 또는 Tris를 포함하는 안정화 버퍼로 안정화시켜 안정화된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;
    c) 분획분자량(MWCO) 500 kDa - 0.1 ㎛인 중공사 카트리지를 이용하여 접선흐름식 여과(TFF)를 통해 안정화된 바이러스 수확물을 농축하고 정용여과(DF)로 버퍼 교환을 수행하여 농축된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;
    d) 공극 크기가 약 0.8 ㎛∼약 0.45 ㎛인 1 이상의 정화 필터를 통한 DFF에 의해 농축된 바이러스 수확물을 여과하여 멸균된 바이러스 수확물을 형성하는 단계;
    를 포함하고, 이를 통해 호흡기 세포융합 바이러스는 바이러스 감염된 세포로부터 정제되며, 최종 바이러스 감염 역가가 5.7 log10 FFU/mL 이상인, 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제 단계를 더 포함하는 것인 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (c)의 교환 버퍼는 약 10∼25% w/v 수크로스, 약 150 mM∼10 mM 인산칼륨, 및 약 175 mM∼50 mM KCl, pH 7.0-7.4을 포함하는 것인 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 호흡기 세포융합 바이러스는 (rA2cp248/404/1030ΔSH)인 정제 방법.
  5. 제1항에 있어서, 바이러스 수확물은 약 150 mM∼50 mM 인산칼륨, 약 250 mM∼175 mM 수크로스, 및 약 175 mM∼125 mM NaCl 또는 KCl, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 안정화되는 것인 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (c)는 5X 농축이 되게하고 5 투석부피(diavolume) 이상의 버퍼가 교환되는 것인 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 바이러스 수확물은 약 120분 내지 210분 동안 비특이적 뉴클레아제에 노출되는 것인 정제 방법.
  8. 제1항에 따른 정제 방법으로 생성된 호흡기 세포융합 바이러스.
  9. 제1항에 따른 정제 방법에 의해 생성된 호흡기 세포융합 바이러스의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
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