KR20090046876A - 핵산의 증폭방법 - Google Patents

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마사후미 토야마
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도요 세이칸 가부시키가이샤
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Abstract

특정 염기배열을 가지는 핵산을 간편하고도 단시간에 효율적으로 증폭시킬 수 있는, 신규 원리에 기초한 핵산의 증폭방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(a)증폭 대상의 염기배열을 포함하는 DNA를 주형으로 하고, 상기 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍을 이용하여 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 행하여, 직쇄상 DNA 단편을 얻는 것; 및 (b)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA를 주형으로 하고, (a)에 의해 얻어진 직쇄상 DNA 단편의 3-말단을 복제 기점으로 하여, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 연쇄적으로 행하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법을 제공한다.
핵산, 증폭, 염기배열, DNA, 프라이머, 폴리머라아제

Description

핵산의 증폭방법{NUCLEIC ACID AMPLIFICATION METHOD}
본 발명은 핵산의 증폭방법, 특히, 특정 프라이머(primer)와 환상 1개 쇄 DNA(circular single-stranded DNA)의 조합을 이용하는 핵산의 증폭방법, 상기 방법을 이용하여 표적 유전자의 존재 유무를 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하는 검출용 키트(kit)에 관한 것이다.
현재 연구기관, 의료기관, 검사기관 그 밖의 여러 현장에서, 표적 유전자의 특이적인 염기배열에 기초한 분석·검출방법이 많이 이용되고 있다. 예를 들면, 인간·동물 등 생체 유래의 시료(체액이나 세포편)나 환경 유래의 시료에 포함되는 병원균, 곰팡이, 진드기 등의 알레르겐(allergen)과 같은 병원성 미생물·미소 동물, 바이러스나 화분(花粉) 등의 존재를 분석·검출하는 경우에도, 그들 검출 대상이 가지는 표적 유전자의 특이적인 염기배열을 검출하는 방법이 이용되고 있다. 이들 핵산(DNA, RNA)을 검출하는 방법은 단백질을 검출하는 방법에 비해, 단시간에 고감도로 행할 수 있다. 또한, 시료 중에 본래 포함되는 핵산의 양이 검출 한계 이하이더라도, 무(無)세포계를 이용하여 비교적 간단하고도 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이 이점들로부터, 핵산을 증폭하는 방법을 이용하거나, 혹은 핵산을 증폭하는 방법과 조합하여, 표적 유전자의 특이적인 염기배열을 검출하는 방법이 많이 개 발되고 있다.
현재, 가장 일반적으로 사용되고 있는 핵산의 증폭수법으로서는, 온도 사이클을 이용하여 주형(鑄型)의 변성, 주형에의 프라이머의 어닐링(annealing), DNA 폴리머라아제(polymerase) 신장 반응의 사이클을 수십회 행하고, 프라이머쌍에 의해 사이에 끼이는 영역의 핵산을 증폭하는 PCR법을 들 수 있다. 그러나 온도 사이클을 이용하여 핵산을 증폭하는 방법에서는, 온도 사이클을 제어하기 위한 기기(써멀 사이클러(thermal cycler) 등)가 고가인 것이나, 핵산의 증폭에 최적인 온도 사이클의 검토·설정 등이 필요하게 된다.
따라서 최근, 온도 사이클을 이용하지 않고 일정 온도 조건하에서 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 진행시키는 핵산 증폭방법이 고안되어 왔다. 그 대표적인 것이 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)법이다(특허문헌 1). LAMP법에서는, 표적 유전자의 6개의 영역에 대하여, 합성되는 DNA 쇄의 3'말단이 항상 루프를 형성하고 다음의 DNA 증폭 반응의 복제 기점이 되는, 4개의 프라이머를 설계하고 이용하여, 표적 유전자의 핵산분자를 증폭시키고 있다.
또한, 특허문헌 2에서는, 표적 유전자 중의 2부위의 불연속적인 인접영역에 상보적인 염기배열을 5'말단 및 3'말단에 가지며 또한 표적 유전자에 상보적이지 않은 링커(linker)영역을 가지는 직쇄 DNA 분자를 프로브(probe)로서 설계하고, 표적 유전자에 대하여 상기 프로브를 루프 형상으로 하이브리다이징(hybridizing)시켜 병치(竝置)하는 5'말단과 3'말단 사이를 리가아제(ligase)로 연결하여 환상화시키고, 상기 링커영역에 상보적인 프라이머를 이용하여, 환상화한 상기 프로브의 염 기배열을 증폭하는 방법에 대하여 기재한다.
그러나 이들 기존의 방법에는 비용, 검출방법의 설계 및 조작, 검출감도 등의 점에 있어서 과제도 남아 있어, 이들 과제를 충분히 만족하는 새로운 핵산 증폭방법 및 검출방법이 필요로 되고 있다.
[특허문헌 1] 국제공개 제2000/28082호 팜플렛
[특허문헌 2] 일본국 공표특허공보 2005-508599호
본 발명의 목적은, 특정 염기배열을 가지는 핵산을 간편하고도 단시간에 효율적으로 증폭시킬 수 있는, 신규 원리에 기초한 핵산의 증폭방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 상기 증폭방법을 이용하여, 시료 중의 표적 유전자의 존재 유무를 신속하고도 명확하게 검출할 수 있는 고감도의 검출방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은, 이들 방법에 유용한 특정 프라이머와 환상 1개 쇄 DNA의 조합을 포함하는 핵산 증폭용 키트 및 검출용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 환상 1개 쇄 DNA를 1개 쇄 DNA 단편으로부터 간편하고도 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 특이적 염기배열을 가지는 주형 핵산분자에 대하여, 상기 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머와, 상기 프라이머와 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA의 조합을 이용하여 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 연쇄적으로 행함으로써, 주기적인 온도 제어의 필요 없이, 간편하고도 단시간의 조작으로 상기 특이적인 염기배열의 핵산을 효율적으로 증폭시킬 수 있음을 발견하였다.
또한 본 발명자는, 상술한 핵산의 증폭방법을 이용하여, 시료 중의 표적 유전자의 유무, 특히, 생체 또는 환경에 유래하는 시료 중의 알레르겐, 바이러스, 병원균 등의 미생물의 존재 유무를 신속하고도 고감도로 검출할 수 있음을 발견하였다.
이들 방법, 및 이들 방법에 유용한 키트는 구체적으로는 다음과 같다.
본 발명의 핵산의 증폭방법은,
(a)증폭 대상의 염기배열을 포함하는 DNA를 주형으로 하고, 상기 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍을 이용하여 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 행하여, 직쇄상 DNA 단편을 얻는 것; 및
(b)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA를 주형으로 하고, (a)에 의해 얻어진 직쇄상 DNA 단편의 3'말단을 복제 기점으로 하여, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 연쇄적으로 행하는 것;을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a)와 (b)는, 사용하는 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 행해지는데, 바람직하게는 (a)와 (b)를 동일 온도 조건하에서 행한다.
또한, 바람직하게는, 증폭 대상의 염기배열을 포함하는 DNA가, RNA를 주형으로 하는 역전사(逆轉寫)에 의해 얻어진 DNA 쇄를 포함하는 것이다.
본 발명의 핵산의 증폭방법에 유용한 키트는,
(ⅰ)증폭 대상의 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍;
(ⅱ)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
(ⅲ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제;
(ⅳ)dNTP;를 포함하는 핵산 증폭용 키트이다.
본 발명의 2개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법은,
(a)표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를, 검출 대상의 시료에 첨가하고, 상기 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 효소 반응시키는 것;
(b)효소 반응시킨 시료 중에서, 핵산이 증폭되었는지 여부를 확인하는 것; 및
(c)핵산이 증폭되었을 경우에, 검출 대상의 시료 중에 2개 쇄의 표적 핵산분자가 존재한다고 결정하는 것;을 포함한다.
본 발명의 1개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법은,
(a)표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머, 표적 핵산분자의 상기 표적 염기배열의 영역과 다른 영역의 표적 염기배열을 가지는 프라이머, 이들 프라이머의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA, 역전사 효소, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를, 검출 대상의 시료에 첨가하고, 상기 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 효소 반응시키는 것;
(b)효소 반응시킨 시료 중에서, 핵산이 증폭되었는지 여부를 확인하는 것; 및
(d)핵산이 증폭되었을 경우에, 검출 대상의 시료 중에 1개 쇄의 표적 핵산분자가 존재한다고 결정하는 것;을 포함한다.
본 발명의 2개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법에 유용한 키트는,
(ⅰ)2개 쇄의 표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍;
(ⅱ)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
(ⅲ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제; 및
(ⅳ)dNTP;를 포함하는, 2개 쇄의 표적 핵산분자의 검출용 키트이다.
본 발명의 1개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법에 유용한 키트는,
(ⅰ)1개 쇄의 표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머;
(ⅱ)표적 핵산분자의 상기 표적 염기배열의 영역과 다른 영역의 표적 염기배열을 가지는 프라이머;
(ⅲ)(ⅰ) 및 (ⅱ)의 프라이머 중 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
(ⅳ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제; 및
(ⅴ)dNTP;를 포함하는, 1개 쇄의 표적 핵산분자의 검출용 키트이다.
바람직하게는, (vi)역전사 효소를 더 포함하는 상기 검출용 키트이다.
본 발명은 또한, 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법으로서,
a)직쇄상 1개 쇄 DNA와, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단영역 및 3'말단영역의 상보배열을 인접하여 가지는 어댑터 폴리뉴클레오티드(adapter polynucleotide)와, 내열성 리가아제를 포함하는 반응 혼합물을 조제하는 공정,
b)직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 상보배열을 결합시킴으로써, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 인접시키는 공정,
c)상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 연결하는 공정,
d)환상화된 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드를 해리시키는 공정,
을 포함하는, 상기 제조방법을 제공한다.
<발명의 효과>
본 발명은 신규이며 효율적인 핵산 증폭방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 핵산 증폭방법을 이용하여 표적 유전자의 유무를 검출하는, 간이적이면서 신속한 검출방법을 제공한다. 이 검출방법을 이용함으로써, 병원성 미생물이나 바이러스 그 밖의 특이적인 표적 유전자를 간이적인 조작으로 신속하고도 명확하게 검출할 수 있다.
또한 본 발명은, 이들 방법에 유용한, 프라이머와 환상 1개 쇄 DNA의 조합을 제공한다.
또한 본 발명은, 내열성 DNA 리가아제를 사용하여 환상 1개 쇄 DNA를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 동일 효소 반응 혼합물 내에서 반복하여 라이게이션(ligation) 반응을 행함으로써, 직쇄상 1개 쇄 DNA로부터 환상 1개 쇄 DNA를 고수율로 합성하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 핵산 증폭방법의 원리(제1단계)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 핵산 증폭방법의 원리(제2단계)를 나타낸다.
도 3은 표 3의 실험 결과(실험 1∼실험 3)를 나타낸다.
도 4는 표 3의 실험 결과(실험 4∼실험 6)를 나타낸다.
도 5는 표 3의 실험 1∼실험 3의 샘플의 전기영동(電氣泳動;electrophoresis)의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법에 의한 환상화 1개 쇄 DNA의 제조의 개략을 나타낸다.
도 7은 SYBR GreenI를 이용하여 환상 1개 쇄를 검출한 사진을 나타낸다. A는 프라이머를 첨가하지 않고 폴리머라아제 반응을 행한 대조 샘플이고, B는 통상의 합성 반응을 행한 샘플을 나타낸다.
도 8은 전기영동에 의해 환상 1개 쇄를 검출한 겔 사진을 나타낸다.
도 9는 라이게이션 반응을 1회, 및 25회 반복하여 행했을 경우의, 환상 1개 쇄 합성의 농도를 비교한 그래프를 나타낸다.
본 발명의 핵산 증폭방법에 있어서는, DNA 폴리머라아제 신장 반응에 의해, 증폭 대상으로 하는 염기배열을 1회 또는 복수회 반복하여 포함하는 다양한 쇄길이(chain-length)의 증폭 산물이 얻어지고, 이들 증폭 산물이 주형 또는 복제 기점으로서 역할을 수행하는 한층 더한 DNA 폴리머라아제 신장 반응이 연쇄적으로 진행하여, 증폭 대상으로 하는 염기배열을 효율적으로 증폭할 수 있다.
본 발명의 증폭 대상의 염기배열(본 명세서 중에서는 '표적 염기배열'이라고도 함)을 포함하는 주형 DNA는 1개 쇄 또는 2개 쇄의 직쇄상 또는 환상의 DNA이며, 이 주형 DNA 중에 포함되는 증폭 대상의 염기배열은, 주형 DNA 중에 있어서 특이적인 영역의 염기배열이다. 또한 본 발명의 방법은, 역전사 효소를 이용하여 RNA 분자에 상보적인 염기배열을 합성한 cDNA를 주형 DNA로서 행할 수도 있다. 이 경우에는, 본 발명의 증폭 대상의 염기배열은 RNA 분자 중 우라실(uracil)(U)이었던 염기가 티민(thymine)(T)으로 치환된 염기배열이다.
본 발명의 증폭방법에서 이용하는 프라이머쌍은, 주형 DNA 중의 증폭 대상의 표적 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 것으로서, 주형 DNA에 기초하여, 프라이머쌍에 끼인 영역(프라이머쌍의 염기배열을 포함함)을 직쇄상 DNA 단편으로서 얻을 수 있는 것이면 된다. 따라서, 주형 DNA가 2개 쇄의 DNA일 경우에는, 프라이머쌍의 각 프라이머는, 각각의 쇄상(鎖上)의 표적 염기배열을 가진다. 주형 DNA가 1개 쇄의 DNA일 경우에는, 프라이머쌍 중 한쪽의 프라이머는, 주형 DNA 쇄상에 존재하는 증폭 대상의 염기배열과는 다른 영역의 표적 염기배열을 가진다.
본 발명의 방법은, 적어도 1개의 프라이머쌍을 이용하여 행할 수 있고, 복수 의 프라이머쌍을 이용할 경우, 그 수에 상한은 없지만, 예를 들면 중첩해 설계하여 이용할 수도 있다. 예를 들면 1∼5쌍, 바람직하게는 1∼3쌍, 보다 바람직하게는 2∼3쌍, 특히 바람직하게는 2쌍이다.
각 프라이머는, 쌍을 이루는 프라이머나 다른 프라이머쌍의 프라이머와 동일한 배열이나 상보적인 배열을 가지고 있지 않는 쪽이 바람직하다.
쌍을 이루는 프라이머가 결합하는 영역간의 상대거리(염기수)는, 본 발명의 반응이 진행하는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 가장 내측의 프라이머쌍의 프라이머가 결합하는 영역간의 상대거리는 보다 적은 쪽이 바람직하고, 그 외측의 프라이머쌍과 인접하는 내측의 프라이머쌍이 결합하는 영역간의 상대거리도 보다 적은 쪽이 바람직하다. 상기 상대거리(염기수)는 바람직하게는 0b∼1kb이고, 보다 바람직하게는 0∼100b이다.
본 발명에 사용하는 프라이머로서는, 주형 DNA와 상보적인 2중쇄를 형성할 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 8∼40mer의 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 16∼25mer의 것이다. 또한, 주형 DNA(표적 염기배열) 또는 프라이머의 GC함량, 이차구조를 취하는 것의 용이함 등, 그 밖에 프라이머 설계에 있어서 일반적으로 고려되는 성질에 대해서도 당업자의 기술상식의 범위 내의 것이다. 이러한 프라이머의 설계 및 합성은 본 기술분야에서 통상 이용되고 있는 설계 프로그램 등의 수법을 이용하여 행할 수 있다.
역전사 효소를 이용하여 RNA 분자 중의 염기배열을 합성한 cDNA를 주형 DNA로서 이용할 경우에도, 마찬가지로, 상기 RNA 분자가 2개 쇄인지 1개 쇄인지에 따 라, 상술한 것과 같이 프라이머쌍을 설계할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 환상 1개 쇄 DNA는, 프라이머쌍의 적어도 한쪽의 프라이머와 동일한 염기배열을 적어도 1개 포함하는 것이며, 그 적어도 한쪽의 프라이머와 동일한 염기배열이란, 증폭 대상의 염기배열과 상보적인 염기배열을 가지는 것이다.
환상 1개 쇄 DNA는, 1개의 프라이머와 동일한 염기배열이 일정한 간격으로 반복하여 복수개 포함되도록 설계되어도 되고, 또한 다른 복수의 프라이머와 동일한 염기배열이 1회 또는 복수회 반복하여 포함되어 있어도 된다. 복수의 프라이머쌍을 이용할 경우, 환상 1개 쇄 DNA에 포함되는 염기배열은, 가장 내측에 이용한 프라이머쌍의 염기배열의 적어도 한쪽과 동일한 것이 바람직하다.
환상 1개 쇄 DNA 중, 프라이머와 동일한 염기배열 이외의 영역의 염기배열은, 본 발명이 특이적으로 반응하는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 적은 쪽이 바람직하다. 또한, 3'→5' 엑소뉴클레아제(Exonuclease) 활성을 가지지 않는 쇄치환형 DNA 폴리머라아제를 사용할 경우, 프라이머와 동일한 염기배열의 5'측에 티민(T)을 1염기 부가하는 것이 바람직하다.
환상 1개 쇄 DNA의 쇄길이는, 본 발명이 특이적으로 반응하는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 16b∼10kb의 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼100b이다. 이러한 환상 1개 쇄 DNA의 설계 및 합성은 본 기술분야에서 통상 이용되고 있는 설계 프로그램 등의 수법을 이용하여 행할 수 있다. 또한, 환상 1개 쇄 DNA는 후술하는 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 DNA 폴리머라아제는 쇄치환형 5'-3'DNA 폴리머라아제 활성을 가지는 것으로서, 염기쌍의 상보쇄를 정확하게 합성하는 것이 바람직하다. 또한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성은 가지고 있어도 되지만, 가지고 있지 않는 것이 바람직하고, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 가지지 않는 것이 바람직하다. DNA 폴리머라아제의 최적 온도는 50∼90℃인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60∼72℃이다. 이러한 DNA 폴리머라아제로서는, 예를 들면 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 Bst DNA Polymerase large fragment, 파이로코커스(Pyrococcus)속 세균 유래의 Deep VentR (R)(exo-) DNA polymerase(뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이션 제조), Herculase(R)Ⅱ Fusion DNA polymerase(스트라테이진(STRATAGENE)사 제조), 써모코커스(Thermococcus)속 유래의 VentR (R)(exo-) DNA polymerase, TherminatorTM DNA Polymerase, TherminatorTM Ⅱ DNA Polymerase(뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이션 제조), KOD Dash DNA polymerase(토요보사 제조) 등의 것을 단독으로, 혹은 키트의 형태로 입수할 수 있다. 서로의 효소 활성을 방해하지 않는 한은 2종류 이상의 DNA 폴리머라아제를 병용할 수도 있다.
DNA 폴리머라아제에 의한 신장 반응은, 일반적인 핵산 증폭에 사용되는 버퍼(Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgSO4 등의 염류를 포함함), 예를 들면 사용하는 DNA폴리머라아제에 부속된 최적화된 조성의 것을 이용해도 된다.
상술한 것과 같은 적절한 버퍼에, 주형 DNA, 본 발명의 프라이머쌍, 본 발명의 환상 1개 쇄 DNA, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 기질이 되는 4종의 디옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside) 3인산(dNTP:dATP, dCTP, dGTP, dTTP)을 첨가하고, 이 반응 용액을 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 상기 효소 활성을 가지는 온도, 예를 들면 50∼90℃, 바람직하게는 60∼72℃로 유지함으로써, 온도 사이클 제어 없이 동일 용기 내에서 1회의 조작으로 핵산을 효율적으로 증폭할 수 있다. 또한, 복수의 프라이머쌍을 이용할 경우는 본 발명의 반응 온도 조건을 더욱 낮은 조건, 예를 들면 30∼50℃로 설정할 수 있다. DNA 폴리머라아제 신장 반응의 온도 조건은 이용하는 쇄치환형 DNA 폴리머라아제의 활성을 가지는 온도에 의존한다. 사용하는 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 상기 효소 활성을 가지는 온도의 범위 내이면, 반드시 증폭 반응 전체를 통해 동일 온도(등온)를 유지하지 않아도 되지만, 증폭 반응 전체를 통해 동일 온도(등온)로 유지하는 것(동일 온도 조건하)이 바람직하다.
핵산의 증폭은, DNA 폴리머라아제 신장 반응으로 핵산이 증폭될 때에 반응 용액 중에서 생성되는 피로인산 마그네슘의 침전에 의해 확인할 수 있다(국제공개 제2001/083817호 팜플렛). 또한, 본 기술분야에서 통상 사용되는 핵산염색 형광색소 등, 예를 들면 에티디움브로마이드(ethidium bromide)나 SYBR Green I(캠브렉스사 제조) 등을 통상의 방법에 따라 이용하여, 형광의 유무나 강도에 의해 핵산의 증폭을 확인할 수도 있다.
다음으로 도면을 이용하여, 본 발명의 핵산의 증폭방법의 양태를 구체적으로 설명한다.
우선 제1단계에서, 증폭 대상의 특이적인 염기배열을 포함하는 주형 DNA와 프라이머쌍의 DNA 폴리머라아제 신장 반응에 의해 직쇄상 DNA 단편이 얻어진다(도 1).
2개 쇄의 주형 DNA 중의 2개의 특이적인 염기배열의 영역 A, B를 증폭 대상으로 삼을 경우, 각 영역의 한쪽의 쇄상의 배열을 A1 및 B1, 다른쪽의 쇄상의 배열을 A2 및 B2로 규정한다. 프라이머쌍 중, 한쪽의 프라이머는 A1과 상보적인 염기배열, 즉 A2의 염기배열을 가지도록 설계하고, 다른쪽의 프라이머는 B2와 상보적인 염기배열, 즉 B1을 가지도록 설계한다(도 1, (ⅰ)).
이 프라이머쌍과 상기 주형 DNA의 DNA 폴리머라아제 신장 반응에 의해, 5'말단에 A2와 동일한 염기배열을 가지며 3'말단에 B2와 동일한 염기배열을 가지는 직쇄상 DNA 단편과, 5'말단에 B1과 동일한 염기배열을 가지며 3'말단에 A1과 동일한 염기배열을 가지는 직쇄상 DNA 단편의 조합이 얻어진다. 이 얻어진 직쇄상 DNA 단편이 제2단계가 개시될 때의 복제 기점이 된다(도 1, (ⅱ)).
제2단계에서 주형이 되는 환상 1개 쇄 DNA는, 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열(A2 및/또는 B1)을 포함하도록 설계한다(도 2, (ⅰ)). 도 2에서는, A2 및 B1의 각각과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA를 나타내고 있다. 상술한 바와 같이, 얻어지는 직쇄상 DNA 단편은 각각 3'말단에 프라이머쌍과 상보적인 염기배열(A1 또는 B2)을 가지기 때문에, 그 직쇄상 DNA 단편의 3'말단영역(A1, B2)이, 환상 1개 쇄 DNA 중의 프라이머쌍과 동일한 염기배열(A2, B1)영역에 대하여 어닐링하여 복제 기점이 되고, 환상 1개 쇄 DNA를 주형으로 하여 DNA 폴리 머라아제 신장 반응이 일어난다(도 2, (ⅰ)). 합성된 DNA 쇄는, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제에 의해 벗겨지면서 롤링 서클(rolling circle) 모양으로 신장한다(도 2, (ⅱ)). 그 벗겨져서 신장하는 DNA 쇄에 대하여, 반응 용액 중에 존재하는 프라이머가 어닐링하여 복제 기점이 되어 DNA 폴리머라아제 신장 반응이 일어나고(도 2, (ⅲ)), 상기 프라이머를 복제 기점으로 하여 합성하여 벗겨진 DNA 쇄는, 반응 용액 중에 존재하는 프라이머 또는 환상 1개 쇄 DNA에 대하여 어닐링하여 DNA 폴리머라아제 신장 반응이 일어난다(도 2, (ⅳ)).
위에서 설명하는 제1단계의 과정과 제2단계의 과정은, 일단, 제2단계를 개시하는 발단이 되는 직쇄상 DNA 단편이 합성된 후에는 병렬하여 동시 진행한다. 또한, 이와 같이 연쇄적인 증폭 반응이 진행하여, 결과적으로, 증폭 대상의 특이적인 염기배열을 1회 또는 복수회 반복하여 포함하는 다양한 쇄길이의 DNA 쇄가 합성된다.
본 발명의 다른 양태는, 상술한 핵산 증폭방법의 원리를 이용하는 표적 유전자의 검출방법이다. 본 검출방법은 검출 목적, 검출 대상 시료의 유래, 표적 유전자 등에 따라, 다양한 산업에 있어서 여러 장면에서 행할 수 있다.
표적 유전자가 검출되는 시료로서는, 예를 들면, 인간 그 외에 동물 유래의 체액이나 조직편으로부터 조제한 것이어도 되고, 환경 유래의 토양이나 해수, 식물로부터 조제한 것이어도 되며, 공장에서 제조·가공된 음료나 식료품, 의약품 등이어도 된다. 이들은 직접, 혹은 필요에 따라서, 적당한 조작을 이용하여 핵산(DNA, RNA) 추출액으로서 조제하여, 검출 대상의 시료로서 본 발명의 검출방법에 이용할 수 있다. 이러한 시료의 조제는 일반적인 핵산 검출방법에 사용되는 통상의 수법에 따라 행할 수 있다.
표적 유전자는 미생물(세균, 곰팡이 등), 알레르겐(예를 들면 진드기, 화분 등), 바이러스에 특이적인 것이어도 되고, 또한 인간과 그 외 동물의 게놈 중의 야생형 또는 변이형 유전자이어도 된다.
본 검출방법은, 상술한 핵산 증폭방법의 '주형 DNA' 및 '증폭 대상의 염기배열'을, 각각 본 검출방법의 '표적 핵산분자(즉 표적 유전자)' 및 '표적 유전자 중의 표적 염기배열'로 치환하고, 시료 중에 표적 핵산분자(즉 표적 유전자)가 존재할 경우에는, 상술한 핵산 증폭방법과 동일한 원리에 의해, 표적 유전자 중의 표적 염기배열의 핵산이 증폭되는 것을 이용한 것이다.
2개 쇄의 표적 핵산분자를 검출할 경우에는,
(a)표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를, 검출 대상의 시료에 첨가하고, 상기 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 효소 반응시키는 것;
(b)효소 반응시킨 시료 중에서, 핵산이 증폭되었는지 여부를 확인하는 것; 및
(c)핵산이 증폭되었을 경우에, 검출 대상의 시료 중에 2개 쇄의 표적 핵산분자가 존재한다고 결정하는 것;에 의해, 표적 핵산분자를 검출할 수 있다.
1개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 경우에는, 2개 쇄의 표적 핵산분자를 검 출하는 경우에 있어서의 '표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍' 및 '상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA'는, 각각 '표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머와, 표적 핵산분자의 상기 표적 염기배열의 영역과 다른 영역의 표적 염기배열을 가지는 프라이머의 조합' 및 '이들 프라이머의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA'로 치환하고, 표적 핵산분자가 2개 쇄인 경우와 동일한 조작에 의해 1개 쇄의 표적 핵산분자를 검출할 수 있다.
표적 핵산분자가 RNA인 경우에는, 상기 (a)의 효소 반응의 공정에 있어서, 또한 역전사 효소(RNA 의존성 DNA 폴리머라아제)를 시료에 첨가하여 효소 반응시킴으로써, 상술한 핵산 증폭방법과 마찬가지로, 시료 중의 RNA 분자에 대하여 합성되는 cDNA 쇄를 주형으로 하여 핵산이 증폭되는지 여부를 확인하고, 핵산이 증폭되었을 경우에는 표적 RNA 분자가 존재한다고 결정함으로써 표적 RNA 분자의 존재를 검출할 수 있다.
핵산의 증폭은, 상술과 같이, 피로인산 마그네슘의 침전이나, 본 기술분야에서 통상 사용되는 핵산염색 형광색소 등을 이용하여, 침전이나 형광의 유무를 지표로 하여 확인할 수 있다. 또한, 피로인산 마그네슘의 생성량이나 형광의 강도를 지표로 하여, 검출 대상의 시료 중에 존재하는 표적 유전자의 핵산량의 다소에 대하여 비교할 수 있다.
이렇게 하여, 본 검출방법을 이용함으로써, 시료 중에 존재하는 표적 유전자 의 핵산이 극히 미량이더라도, 동일한 반응용기 내에서 1회의 조작으로 표적 유전자 중의 특이적 염기배열을 효율적으로 증폭하여 검출할 수 있다. 본 검출방법은 예를 들면 마이크로 튜브(micro tube), 마이크로웰 플레이트(microwell plate), 마이크로칩(microchip) 등의 반응용기 내에서 행해도 되고, 또한 HTS(High-Throughput Screening) 등의 기술을 이용해도 된다.
본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에서는, 공정 a)에 있어서, 직쇄상 1개 쇄 DNA 및 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA와 상보적인 배열을 가지는 어댑터 폴리뉴클레오티드 및 내열성 리가아제를 포함하는 반응 혼합물이 조제된다.
환상화에 이용되는 직쇄상 1개 쇄 DNA의 염기의 종류나 수에는 특별히 제한은 없으며, 실제의 세포로부터 단리된 게놈 배열이어도 되고, 인공적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 배열이어도 되고, 일반적으로 환상화기에 충분한 수의 염기가 있으면 되며, 예를 들면 적어도 20염기 이상, 바람직하게는 20∼200염기, 보다 바람직하게는 30∼80염기이다.
이용하는 내열성 DNA 리가아제에 의존하지만, 환상화에 이용되는 직쇄상 1개 쇄 DNA가 인공적으로 합성된 폴리뉴클레오티드의 경우, 5'말단을 인산화하고 있는 쪽이 바람직하지만, 인산화하지 않아도 된다. 또한, 그 밖의 수식은 하지 않는 쪽이 바람직하다.
또한, 어댑터 폴리뉴클레오티드는, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단영역 및 3'말단영역의 상보배열을 가지며, 구체적으로는, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단영역 및 3'말단영역의 각 상보배열을 인접하여 가진다. 본 발명에 있어서, "5'말단 영역", "3'말단영역"이란, 각각 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단, 3'말단의 최말단염기를 포함하는 영역을 의미하고, 그 영역의 길이는 일반적으로 폴리뉴클레오티드의 어닐링을 행하기 위해 필요한 값으로 당업자가 설정할 수 있다. 예를 들면 5∼20염기가 적당하고, 어댑터 폴리뉴클레오티드의 합성을 고려하면, 5'말단영역과 3'말단영역의 합계로 15∼30염기 정도인 것이 바람직하다.
본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에 있어서, '(5'말단영역 및 3'말단영역의) 상보배열'은, 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단 및 3'말단의 각 영역의 배열과 완전히 상보적인 배열인 것이 바람직하지만, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA와의 어닐링이 가능한 한에서 미스 매치의 염기쌍을 가지고 있어도 된다. 그러한 염기쌍의 수는 반응 조건이나 전체 영역의 길이에 의존하는데, 예를 들면 각 영역에 1개, 2개, 3개 등, 또는 각 영역의 전체 염기의 1%∼50% 정도일 수 있다. 단, 당업자에게 이해되는 바와 같이, 라이게이션을 효율적으로 행하기 위해서는, 환상화시에 실제로 리가아제에 의한 연결 반응이 행해지는 5'말단과 3'말단의 염기는 각각 어댑터의 염기와 염기쌍을 형성하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 어댑터 폴리뉴클레오티드는, 위에서 설명한 5'말단영역에 상보적인 배열과 3'말단영역에 상보적인 배열을 인접하여 가진다. 여기서, '인접한다'는 것은, 5'측으로부터 상기 5'말단 상보배열, 이어서 3'말단 상보배열이, 사이에 염기가 끼이지 않고 연속하고 있는 것을 의미한다. 이러한 어댑터 폴리뉴클레오티드는 도 6에 나타내는 바와 같이, 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어닐링함으로써 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA를 환상으로 배치시키는 것이 가능해진다.
본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에 있어서는, 직쇄상 1개 쇄 DNA를 환상화하기 위한 라이게이션 반응에 내열성 DNA 리가아제가 사용된다. 내열성 DNA 리가아제란, 인접한 DNA 쇄의 5'말단과 3'말단을 포스포디에스테르 결합으로 연결하는 효소로서, 2개 쇄 DNA를 1개 쇄 DNA로 해리시키는 고온(DNA 해리 온도), 예를 들면 80∼100℃, 바람직하게는 90∼95℃에서도 실질적으로 활성을 잃지 않는 효소를 의미한다. 예를 들면, 일반적으로 해리 온도로서 사용되는 95∼100℃에 30분∼1시간 정도 노출되더라도 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 효소 활성을 유지하는 리가아제를 들 수 있고, 일반적으로 LCR 반응에의 사용에 적합한 것으로서 시판되는 리가아제라면 '내열성 DNA 리가아제'에 포함된다고 이해된다. 내열성 DNA 리가아제는, 일반적으로 고온 환경에 생식하는 파이로코커스·퓨리어서스(Pyrococcus furiosus)나 아에로파이럼·퍼닉스(Aeropyrum pemix), 써모코커스속(Thermococcus sp.) 등의 초호열성 균이나 써머스·아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 등의 고도 호열성 균으로부터 단리되는데, 내열성을 더욱 높이기 위해 재조합이 행해져 있는 것도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 구체적으로는, (스트라테이진사 제조의 Pfu DNA 리가아제나 에피센트리(Epicentre)사 제조의 앰플리가아제(Ampligase) DNA 리가아제, 와코쥰야쿠고교사 제조 내열성 DNA 리가아제, 뉴잉글랜드 바이오랩스사 제조의 9°Nth DNA 리가아제, Taq DNA 리가아제) 등을 들 수 있다.
본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에 있어서, 공정 a)에서 조제되는 반응 혼합물은, 상기의 직쇄상 1개 쇄 DNA, 어댑터 폴리뉴클레오티드, 내열성 DNA 리 가아제를 포함한다. 이들의 농도, 존재 비율은 해당 분야의 기술상식에 기초하여 적절히 결정할 수 있다. 직쇄상 1개 쇄 DNA의 농도는 예를 들면 1∼100μmol/l, 바람직하게는 20∼80μmol/l, 보다 바람직하게는 40∼60μmol/l이며, 어댑터 폴리뉴클레오티드의 농도는 예를 들면 0.05∼50μmol/l, 바람직하게는 1∼40μmol/l, 보다 바람직하게는 3∼12μmol/l 등이지만, 이들 범위에 한정되는 것은 아니다. 또한, 바람직한 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 몰비는 후술하는 라이게이션 반응의 반복 횟수 등에 의해 변동되는데, 예를 들면 100:1∼1:5, 바람직하게는 50:1∼1:1, 보다 바람직하게는 20:1∼4:1이다.
한편, 본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에서는, 후술하는 바와 같이 어댑터 폴리뉴클레오티드는 환상화한 1개 쇄 DNA로부터 해리하여 재이용할 수 있기 때문에, 당초의 반응 혼합물 중에 어댑터 폴리뉴클레오티드가 직쇄상 1개 쇄 DNA보다도 낮은 비율(예를 들면 위에 나타낸 것과 같은 몰비 20:1 등)로밖에 존재하지 않는 경우이더라도 효율적으로 환상 1개 쇄 DNA를 제조할 수 있다.
내열성 DNA 리가아제의 첨가량은, 예를 들면 시판된 것을 사용할 경우는, 반응 혼합물 중의 DNA의 농도나 양에 기초하여 제조자의 지시에 따라 바람직한 값을 결정할 수 있다.
또한, 공정 a)에서 조제되는 반응 혼합물은 또한, 라이게이션 반응에 필요한 다양한 물질을 포함해도 된다. 일반적으로, 사용하는 리가아제의 종류에 따라서 반응 버퍼의 조성이 결정되는데, 예를 들면 Tris-HCl(pH 7.5), KCl, MgCl2, ATP, NAD(P), DTT 등을 적절한 농도로 포함할 수 있다. 실제로는, 시판된 리가아제에 첨부되는 반응 버퍼를 제조자의 지시에 따라 사용하면 충분하다.
상기 공정 a)에서 직쇄상 1개 쇄 DNA, 어댑터 폴리뉴클레오티드 및 내열성 DNA 리가아제를 포함하는 반응 혼합물을 조제한 후, 공정 b)부터 d)에서, 각각 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 결합(어닐링), 라이게이션 반응에 의한 환상화, 열변성에 의한 환상화 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 분리를 행함으로써, 환상 1개 쇄 DNA가 제조된다(도 6 참조).
보다 상세하게는, 공정 b)에서는, 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 상보배열을 결합시킴으로써, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 인접시킨다. 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 결합(어닐링)은, 반응 혼합물을 적당한 온도에 둠으로써 행해지며, 그 온도는 예를 들면 55∼65℃, 바람직하게는 60℃이지만, 당업자가 이해하는 바와 같이 어댑터 폴리뉴클레오티드의 길이나 Tm값에 의해 적절한 값은 변동하기 때문에, 적절히 조정하는 것이 가능하다. 반응 시간도 마찬가지로 폴리뉴클레오티드의 길이나 반응 온도와의 관계로 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면 1초에서 3분까지, 바람직하게는 5초에서 1분까지, 보다 바람직하게는 10초이지만, 반응 혼합물이 실질적으로 설정 온도에 도달해 있으면 충분하며, 보다 긴 시간 설정으로 하는 것도 가능하다.
이 공정 b)에 있어서 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 상보배열이 결합할 때에 직쇄상 1개 쇄 DNA가 구부러져 5'말단과 3'말단이 인접·접근 한 구조가 되기 때문에, 다음 공정 c)에 있어서 환상화(라이게이션 반응)를 효율적으로 행하는 것이 가능해진다.
공정 c)에서는, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 연결시킨다. 즉, 반응 혼합물을 적절한 온도에 일정 시간 둠으로써, 반응 혼합물 중에 포함되는 DNA 리가아제가 작용하여 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 연결시킨다. 반응 온도는 사용하는 내열성 DNA 리가아제의 최적 온도로 설정하는 것이 바람직한데, 상기 리가아제가 활성을 가지는 온도의 범위 내에서 자유롭게 설정할 수 있다. 예를 들면 와코준야쿠고교사 제조 내열성 DNA 리가아제를 사용할 경우, 60∼90℃, 바람직하게는 70℃로 설정된다. 적절한 반응 시간은 리가아제의 종류나 효소량 등에 의존하며, 예를 들면 5∼30분, 바람직하게는 10분이다.
공정 d)에서는, 환상화된 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드를 해리시킨다. 즉, 반응 혼합물의 DNA의 해리 온도(고온)에 둠으로써, 공정 c)가 종료한 시점에서 결합하고 있는 환상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드를 해리시킨다. 반응 온도는 일반적으로 사용되는 DNA 해리 온도이면 되며, 예를 들면 90∼100℃, 바람직하게는 93∼98℃, 예를 들면 95℃로 설정된다. 또한, 반응 시간은 예를 들면 1초∼1분, 바람직하게는 5∼30초, 보다 바람직하게는 10초로 설정할 수 있다. 이 공정에 의해 어댑터 폴리뉴클레오티드가 당초의 1개 쇄의 상태로 되돌아가기 때문에, 후술하는 바와 같이 다시 공정 b)로 되돌아오고, 환상화되지 않고 남아있는 1개 쇄 DNA와의 결합에 재이용하는 것이 가능해진다.
바람직하게는, 본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법에 있어서는 공정 b)에 서 d)의 일련의 조작(이하, 사이클이라고도 표현함)이 반복하여 행해진다. 공정 b)에서 d)의 사이클을 반복하여, 어댑터 폴리뉴클레오티드를 반복하여 이용하면서 직쇄상 1개 쇄 DNA를 연달아 환상화시킴으로써, 고수율로 환상화 1개 쇄 DNA를 제조하는 것이 가능해진다.
반복 횟수는 예를 들면 적어도 2회, 바람직하게는 10회 이상, 보다 바람직하게는 25회 이상이며, 직쇄상 1개 쇄 DNA의 고갈, 리가아제 활성의 저하, 필요로 하는 환상화 1개 쇄 DNA의 수량 등을 고려하여 당업자가 적당한 횟수를 결정할 수 있다.
한편, 본 발명의 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법은, 해당 기술분야의 기술상식에 기초하여 다양하게 변경, 개량된 방법도 포함한다. 예를 들면, 공정 b)에서 d)를 반복하여 행할 경우, 최초와 최후를 제외한 도중의 각 사이클이 공정 b), c), d)를 포함하고, 또한 이 순서로 실시되면 되고, 특히 최초와 최후의 사이클에서는, 환상 1개 쇄 DNA를 적절하게 제조하기 위한 수단을 취할 수 있는 것을 당업자는 용이하게 이해한다.
예를 들면, 일반적으로 반응을 개시한 직후는 반응 혼합물을 해리 온도로 올려 비특이적인 어닐링을 방지하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는, 예를 들면 95℃에서 2분간 처리된다. 또한, 최후의 사이클에서는 공정 c)에서 반응 혼합물을 라이게이션 온도에 둔 후에, 반응 혼합물을 그때까지와는 다른 해리 조건으로 처리하여(예를 들면 98℃에서 2분간) 환상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드를 해리시켜도 된다. 또한, 그 후 4℃로 급랭하여 반응을 종료시켜도 된다.
그 밖에, 사이클마다 온도나 시간의 설정 변경이나, 공정 b)와 c)를 동일 조건으로 일괄적으로 행하는 것 등의 변경도 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.
<실시예>
약품명 뒤에 회사명을 기재하지 않은 것은 와코쥰야쿠고교사 제품이다. 또한, 특별히 기재하지 않는 한, 용매는 물이다.
(TE 버퍼 조성)
4mmol/l Tris-HCl(트리스-하이드록시메틸-아미노메탄)염산
1mmol/l 에틸렌디아민 4아세트산 2나트륨 2수화물(EDTA)
pH 8.0으로 조정
(1.2% TAE 전기영동용 겔)
1.2% 아가로오스(agarose)
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 아세트산
(2.0% TAE 전기영동용 겔)
2.0% 아가로오스
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 아세트산
예 1
[표적의 조제방법]
하기에 나타내는 효소 제품, 키트 제품은 특별히 기재하지 않는 한 취급설명서에 따랐다.
pUC19(다카라바이오사)를 제한 효소 DraI(다카라바이오사) 처리 후, 1.2% TAE 전기영동용 겔을 사용하고, 전기영동 챔버인 Mupid-ex(어드밴스사)를 이용하여 전기영동(100V, 50분)을 행하였다.
그 후, 핵산염색시약 SYBR GreenI(캠브렉스사 제조)로 염색, 겔로부터의 목적 DNA 단편(약 2kb)의 절취, DNA 추출 키트 NucleoSpin Extract Kit(MACHEREY-NAGEL사)를 이용하여 회수하고, 표적 조제액(10mmol/l)으로 하였다.
[환상 1개 쇄 DNA의 합성]
환상 1개 쇄 DNA의 합성에 이용한 프라이머를 표 1에 기재한다. 43C는 5'말단에 인산화 수식하고, Bind는 카트리지 정제를 행하고 있다(인비트로젠사 제조).
환상 1개 쇄 DNA의 합성에 이용한 프라이머 배열
이름 배열(5'-3')
43C ACAGCTATGACTCGACGTTGTAAAACGACGGCTCACACAGGAA
Bind GTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
표 1의 프라이머 2개(43C:75nmol/l, Bind:1.6nmol/l)와 내열성의 DNA 연결 효소(내열성 리가아제)를 혼합하여, 하기에 나타낸 온도로 효소 반응을 행하였다.
95℃, 2분간 -공정 1
95℃, 10초간 -공정 2
60℃, 10초간 -공정 3 공정 2~4를 25사이클
70℃, 10분간 -공정 4
98℃, 2분간 -공정 5
4℃, ∞ -공정 6
반응 종료 후, Gen 토루쿤(다카라바이오사)을 첨가하여, 에탄올 침전을 행하였다. 그 후, 얻어진 DNA의 펠렛을 75% 에탄올로 2회, 99.5% 에탄올로 1회 세정하고, 65℃에서 건조시킨 후에 정제수로 30μl에 용해하였다.
그 용해액에 엑소뉴클레아제 I(다카라바이오사)를 첨가하고, 37℃, 60분 반응시킨 후, 에탄올 침전을 행하였다. 얻어진 DNA의 펠렛을 75% 에탄올로 2회, 99.5% 에탄올로 1회 세정하고, 65℃에서 건조시킨 후에 TE 버퍼로 30μl에 용해하여, 환상 1개 쇄 DNA 조제액으로 하였다.
[특이적 유전자 증폭]
유전자 검출에 이용한 프라이머를 표 2에 기재한다. 모두 HPLC 정제를 행하고 있다(인비트로젠사 제조).
유전자 검출에 이용한 프라이머 배열
이름 배열(5'-3')
Forward-in CGACGTTGTAAAACGACGGC
Reverse-in CACACAGGAAACAGCTATGAC
유전자 검출 반응에는 하기를 사용하였다.
효소: Bst DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이션 제조) 4U/25μl
표적: 표적 조제액 0.5μl/25μl
λ 게놈: λ 게놈(다카라바이오사) 0.5ng/μl
(반응 버퍼 조성)
1/10량 Bst DNA 폴리머라아제 부속의 버퍼
1μmol/l 표 2의 프라이머(Forward-in, Reverse-in)
0.5mmol/l each dNTP
O.02μg/ml 환상 1개 쇄 DNA 조제액
각 시약을 표 3의 조건으로 혼합하고, 95℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 4℃로 급랭하고, 효소를 첨가한 후, 63℃에서 60분간 인큐베이션하였다.
[DNA 증폭의 확인방법]
핵산염색시약 SYBR GreenI를 1/10로 희석하고, 샘플 25μl에 대하여 1μl를 혼합하여, 302nm의 파장을 맞춰 고감도 필터로 관찰하였다. 결과를 표 3과 도 1에 나타낸다.
DNA의 증폭 결과
효소 표적 λ 게놈 반응 버퍼 핵산의 증폭
실험 1 × ○ × ○ -
실험 2 ○ × × ○ -
실험 3 ○ ○ × ○ +
실험 4 × ○ ○ ○ -
실험 5 ○ × ○ ○ -
실험 6 ○ ○ ○ ○ +
이상의 실험 1∼6의 결과로부터, 효소 + 표적을 포함하는 것(실험 3 및 실험 6)에서는 신속한 핵산의 증폭이 확인되었다. 한편 효소는 존재하지만 표적을 포함하지 않는 것(실험 2 및 실험 5)에서는 핵산의 증폭은 확인되지 않았다. 또한, 표적 배열 이외의 DNA를 포함하고 있어도 핵산의 증폭이 확인되지 않은 것으로 보아(실험 5), 배열을 특이적으로 인식하고 있는 것이 확인되었다. 한편, 효소를 포함하고 있지 않은 것(실험 1 및 실험 4)에 대해서는 핵산의 증폭은 행하고 있지 않다.
예 2
[특이적 유전자 증폭]
예 1과 동일하게 조제한 환상 1개 쇄 DNA 조제액을 이용하여 특이적 유전자 증폭을 행하였다.
유전자 검출에 이용한 프라이머를 표 4에 기재한다. 모두 HPLC 정제를 행하고 있다(인비트로젠사 제조).
유전자 검출에 이용한 프라이머 배열
이름 배열(5'-3')
Forward-in CGACGTTGTAAAACGACGGC
Forward-out ACGCCAGGGTTTTCCCAGTC
Reverse-in CACACAGGAAACAGCTATGAC
Reverse-out TGGAATTGTGAGCGGATAAC
유전자 검출 반응에는 하기를 사용하였다.
효소: Bst DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이션 제조) 4U/25μl
표적: 표적 조제액 0.5μl/25μl
λ 게놈: λ 게놈(다카라바이오사) 0.5ng/μl
(반응 버퍼 조성)
1/10량 Bst DNA 폴리머라아제 부속의 버퍼
1μmol/l 표 4의 프라이머(Forward-in, Reverse-in)
0.2μmol/l 표 4의 프라이머(Forward-Out, Reverse-Out)
0.5mmol/l each dNTP
1μmol/l 환상 1개 쇄 DNA 조제액
5% 디메틸술폭시드
각 시약을 표 5의 조건으로 혼합하고, 95℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 4℃로 급랭하고, 효소를 첨가한 후, 63℃에서 60분간 인큐베이션하였다.
[DNA 증폭의 확인방법]
핵산염색시약 SYBR GreenI를 1/10로 희석하고, 샘플 25μl에 대하여 1μl를 혼합하여, 302nm의 파장을 맞춰 고감도 필터로 관찰하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.
DNA의 증폭 결과
효소 표적 λ 게놈 반응 버퍼 형광의 유무
실험 7 × ○ × ○ -
실험 8 ○ × × ○ -
실험 9 ○ ○ × ○ +
실험 10 × ○ ○ ○ -
실험 11 ○ × ○ ○ -
실험 12 ○ ○ ○ ○ +
이상의 실험 7∼12의 결과로부터, 효소 + 표적을 포함하는 것(실험 9 및 실험 12)에서는 신속한 핵산의 증폭이 확인되었다. 한편 효소는 존재하지만 표적은 포함하지 않는 것(실험 8 및 실험 11)에서는 핵산의 증폭은 확인되지 않았다. 또한, 표적 배열 이외의 DNA를 포함하고 있어도 핵산의 증폭이 확인되지 않은 것으로 보아(실험 11), 배열을 특이적으로 인식하고 있는 것이 확인되었다. 한편, 효소를 포함하고 있지 않은 것(실험 7 및 실험 10)에 대해서는 핵산의 증폭은 행하고 있지 않다.
상기 실시예와 같이, 본 발명에 의해 핵산배열을 특이적으로 인식하고, 또한 신속한 핵산 증폭이 가능한 것이 나타났다.
예 3
[환상 1개 쇄 DNA의 합성]
표 1의 2종류의 폴리뉴클레오티드(43C:60μmol/l, Bind:3μmol/l)와 와코쥰야쿠고교사 제조 내열성 DNA 리가아제 재조합체(1.25ul)를 합계 25ul로 혼합하고, 하기에 나타낸 조건으로 반응을 행하였다. 그 밖에, 상기 내열성 DNA 리가아제에 첨부된 반응 버퍼를 사용하였다. 혼합액 중에 있어서의 최종적인 조성은, 내열성 리가아제(1.25ul/25ul) 첨부 버퍼(2.5ul/25ul), 표 1의 2종류의 폴리뉴클레오티드(43C:60μmol/l, Bind:3μmol/l)이다.
이 혼합물을 예 1의 [환상 1개 쇄 DNA의 합성]과 동일한 온도 조건으로 효소 반응을 행하고, 마찬가지로 에탄올 침전을 행하여, TE 버퍼로 30μl에 용해한 환상 1개 쇄 DNA 조제액을 얻었다.
[환상 1개 쇄 DNA의 합성의 확인]
환상 1개 쇄 DNA의 합성을 폴리머라아제 반응에 의해 확인하였다.
반응 혼합물 조성
0.02μg/ml 환상 1개 쇄 DNA 조제액
1.6nmol/l 표 2의 프라이머(Forward-in과 Reverse-in)
4U/25μl Bst DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이션)
1.6nmol/l 표 1의 프라이머(Bind)
(반응 버퍼는, Bst DNA 폴리머라아제의 제조자의 지시에 따랐다.)
상기의 반응 혼합물을 조제한 후, 63℃·60분 인큐베이션하였다. 또한, Bind의 프라이머를 포함하지 않는 대조 혼합물을 조제하고, 마찬가지로 인큐베이션하였다.
이 반응은, 환상 1개 쇄 DNA에 대하여 어닐링한 Bind 폴리뉴클레오티드가 프라이머가 되어 3'방향으로 DNA를 복제하고, 그 복제된 DNA를 또한 주형으로 하여 F와 R의 프라이머에 의해 DNA를 증폭하는 것이다.
[검출]
핵산염색시약 SYBR GreenI(다카라바이오사)를 1/10로 희석하고, 샘플 25μl에 대하여 1μl를 혼합하여, 302nm의 파장을 맞춰 고감도 필터로 관찰하였다.
또한, 2.0% TAE 전기영동용 겔을 사용하고, 전기영동 챔버인 Mupid-ex(어드밴스사)를 이용하여 전기영동(100V, 60분)을 행하고, 그 후, 핵산염색시약 SYBR GreenI로 염색하여 254nm의 파장을 맞춰 고감도 필터로 관찰하였다.
결과를 표 6, 및 도 7, 도 8에 나타낸다.
환상 1개 쇄 합성 확인의 결과
프라이머(Bind) 반응 버퍼 핵산의 증폭
A - ○ ×
B + ○ ○
도 7, 도 8로부터 장쇄(長鎖)의 DNA가 합성되어 있는 것이 확인되었으므로, 환상 1개 쇄 DNA가 합성되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 엑소뉴클레아제 I의 처리로 환상 1개 쇄 이외의 것을 분해할 수 있는 것도 동시에 확인할 수 있었다.
[라이게이션 반응의 반복 반응에 의한 환상 1개 쇄 DNA의 농도 비교]
상기 [환상 1개 쇄 DNA의 합성]에 나타낸 것과 동일한 방법으로, 라이게이션 반응을 반복하여 행하고, 제작된 환상 1개 쇄 DNA의 농도를 비교하였다.
반응 혼합물에 첨가하는 직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 농도는, 43C가 60μmol/l, Bind가 3μmol/l가 되도록 조제하였다.
C: 리가아제 없음
D: (2)∼(4)의 사이클 1회
E: (2)∼(4)의 사이클 25회
반응 후, Gen 토루쿤(다카라바이오사)을 첨가하고, 에탄올 침전을 행하였다. 그 후, 75% 에탄올로 2회, 99.5% 에탄올로 1회 세정하고, 65℃에서 건조시킨 후에 정제수로 30μl에 용해하였다.
용해 후, 엑소뉴클레아제 I(다카라바이오사)를 첨가하고, 37℃, 60분 반응시킨 후, Gen 토루쿤을 첨가하고, 에탄올 침전을 행하였다. 그 후, 75% 에탄올로 2회, 99.5% 에탄올로 1회 세정하고, 65℃로 건조시킨 후에 TE 버퍼로 25μl에 용해하여, 각 농도를 흡광도(260nm)에 의해 검출하였다(도 9). 리가아제를 첨가하지 않고 행한 C를 제로점으로 하였다.
도 9로부터, 본 발명의 방법을 이용하여 라이게이션의 사이클을 반복하여 행함으로써 환상 1개 쇄 DNA가 고수율로 제조되고 있음을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. (a)증폭 대상의 염기배열을 포함하는 주형(鑄型) DNA와, 상기 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍을 이용하여 DNA 폴리머라아제(polymerase) 신장 반응을 행하여, 직쇄상 DNA 단편을 얻는 것; 및
    (b)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA를 주형으로 하고, (a)에 의해 얻어진 직쇄상 DNA 단편의 3'말단을 복제 기점으로 하여, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 신장 반응을 행하는 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a)와 (b)를 동일 온도 조건하에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증폭 대상의 염기배열을 포함하는 주형 DNA가, RNA를 주형으로 하는 역전사(逆轉寫)에 의해 얻어진 DNA 쇄를 포함하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. (ⅰ)증폭 대상의 염기배열에 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍;
    (ⅱ)상기 프라이머쌍과 동일한 염기배열을 동일 분자상에 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
    (ⅲ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제;
    (ⅳ)dNTP;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 키트.
  5. 2개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법으로서,
    (a)표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를 검출 대상의 시료에 첨가하고, 상기 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 효소 반응시키는 것;
    (b)효소 반응시킨 시료 중에서, 핵산이 증폭되었는지 여부를 확인하는 것; 및
    (c)핵산이 증폭되었을 경우에, 검출 대상의 시료 중에 2개 쇄의 표적 핵산분자가 존재한다고 결정하는 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  6. 1개 쇄의 표적 핵산분자를 검출하는 방법으로서,
    (a)표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머, 표적 핵산분자의 상기 표적 염기배열의 영역과 다른 영역의 표적 염기배열을 가지는 프라이머, 이들 프라이머의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA, 쇄치환형 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를 검출 대상의 시료에 첨가하고, 상기 쇄치환형 DNA 폴리머라아제가 활성을 가지는 온도에서 효소 반응시키는 것;
    (b)효소 반응시킨 시료 중에서, 핵산이 증폭되었는지 여부를 확인하는 것; 및
    (d)핵산이 증폭되었을 경우에, 검출 대상의 시료 중에 1개 쇄의 표적 핵산분자가 존재한다고 결정하는 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  7. (ⅰ)2개 쇄의 표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머쌍;
    (ⅱ)상기 프라이머쌍의 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
    (ⅲ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제; 및
    (ⅳ)dNTP;를 포함하는 것을 특징으로 하는 2개 쇄의 표적 핵산분자의 검출용 키트.
  8. (ⅰ)1개 쇄의 표적 핵산분자의 표적 염기배열에 대하여 상보적인 염기배열을 가지는 프라이머;
    (ⅱ)표적 핵산분자의 상기 표적 염기배열의 영역과 다른 영역의 표적 염기배열을 가지는 프라이머;
    (ⅲ)(ⅰ) 및 (ⅱ)의 프라이머 중 적어도 한쪽과 동일한 염기배열을 포함하는 환상 1개 쇄 DNA;
    (ⅳ)쇄치환형 DNA 폴리머라아제; 및
    (ⅴ)dNTP;를 포함하는 것을 특징으로 하는 1개 쇄의 표적 핵산분자의 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    (vi)역전사 효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출용 키트.
  10. 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법으로서,
    a)직쇄상 1개 쇄 DNA와, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단영역 및 3'말단영역의 상보배열을 인접하여 가지는 어댑터 폴리뉴클레오티드(adapter polynucleotide)와, 내열성 리가아제(ligase)를 포함하는 반응 혼합물을 조제하는 공정,
    b)직쇄상 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드의 상보배열을 결합시킴으로써, 상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 인접시키는 공정,
    c)상기 직쇄상 1개 쇄 DNA의 5'말단과 3'말단을 연결하는 공정,
    d)환상화된 1개 쇄 DNA와 어댑터 폴리뉴클레오티드를 해리시키는 공정,
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    공정 b)에서 d)의 일련의 조작을 적어도 2회 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    공정 a)에서 조제한 반응 혼합물 중에서의, 직쇄상 1개 쇄 DNA에 대한 어댑터 폴리뉴클레오티드의 몰비가 1 미만인 것을 특징으로 하는 환상 1개 쇄 DNA의 제조방법.
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