KR20060109595A

KR20060109595A - 개선된 측면 이동 면역분석법과 이를 위한 디바이스

Info

Publication number: KR20060109595A
Application number: KR1020050031755A
Authority: KR
Inventors: 유승범; 손미진; 오재훈; 김은경
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2005-04-18
Publication date: 2006-10-23
Also published as: KR101157042B1

Abstract

본 발명은 고형상에 항원이나 항체 등의 포획분자를 고정시키고 이러한 고형상에서 용액을 측면 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 면역분석법에 있어서, 고형상에 고정된 포획분자와 검체 중의 분석물질의 반응을 우선적으로 유도하고, 고형상의 포획분자에 결합된 분석물질과 표지 접합체와의 반응이 나중에 유도되도록 함으로써, 용액을 측면 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 간접 면역분석법의 민감도를 크게 향상시키고 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과를 개선할 수 있는 방법과, 그러한 방법을 효과적으로 수행할 수 있는 신규한 면역 크로마토그래피 디바이스를 제공한다.

Description

개선된 측면 이동 면역분석법과 이를 위한 디바이스 {Improved Lateral Flow Immunoassay And Device Therefor}

도 1은 면역 크로마토그래피 스트립과 하우징으로 이루어진 종래의 면역 크로마토그래피 디바이스의 분해 모식도이다;

도 2는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 면역 크로마토그래피 디바이스의 분해 모식도이다;

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 면역 크로마토그래피 디바이스의 분해 모식도이다;

도4는 본 발명의 또다른 실시예에 따른 면역 크로마토그래피 디바이스의 분해 모식도이다;

도 5는 종래의 면역 크로마토그래피법으로 검출 되지 않는 C형 간염 바이러스 항체 양성 검체를 실시예 2에서 시험한 결과이다;

도6은 도 2의 디바이스를 사용한 실험(실시예 3)에서 C형 간염 바이러스 항체 양성 50 검체에 대해 검사한 결과이다;

도7은 도 2의 디바이스를 사용한 실험(실시예 4)에서 C형 간염 바이러스 항체 음성 50 검체에 대해 검사한 결과이다.

본 발명은 개선된 측면 이동 면역분석법과 이를 위한 면역 크로마토그래피(Immunochromatography) 디바이스에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 고형상에 항원이나 항체 등의 포획분자를 고정시키고 이러한 고형상에서 용액을 측면 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 면역분석법에 있어서, 고형상에 고정된 포획분자와 검체 중의 분석물질의 반응을 우선적으로 유도하고, 적절한 방법으로 고형상에 결합하지 않는 분석물질을 제거한 후, 고형상의 포획분자에 결합된 분석물질과 표지 접합체와의 반응이 나중에 유도되도록 함으로써, 용액을 측면 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 간접 면역분석법(Indirect Immunoassay)의 민감도를 크게 향상시키고 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과(hook effect)를 개선할 수 있는 방법, 및 그것을 효과적으로 수행할 수 있는 면역 크로마토그래피 디바이스에 관한 것이다.

면역분석법(Immunoassay)이란 항원 또는 항체를 검출하거나 그것의 농도를 측정하는 분석 방법을 말하며, 이러한 면역분석법에는 용액상(Solution Phase)에서만 반응이 진행되는 동종 면역분석법(Homogeneous Immunoassay)과 고형상(Solid Phase)으로 분석물질이나 표지물질의 분리가 필요한 이종 면역분석법(Heterogeneous Immunoassay)이 있다.

가장 보편적으로 사용되고 있는 방식으로는 폴리스티렌(Polystyrene) 재질의 96웰 플레이트(96 Well Plate)를 고형상으로 사용하고 효소 표지체(Enzyme Label)를 표지 접합체(Conjugate)로 사용하는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법이 있다. ELISA법을 사용함에 있어서, 고형상으로는 상기 96웰 플레이트 이외에도 플라스틱 튜브, 플레이트, 여러 가지 재질의 미세입자(Microparticle), 비드(Bead), 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose Membrane), 유리 슬라이드(Glass Slide) 등을 사용할 수 있고, 표지체로는 상기한 효소 이외에도 형광 물질, 발광 물질, 골드 콜로이드, 실버 콜로이드 또는 라텍스 등을 사용할 수 있다.

한편, 별도의 기기나 장비없이 의료 현장에서 환자의 상태를 즉시 검사할 수 있는 진단 방법을 현장검사(POCT, Point-of-care test) 또는 래피드 검사(Rapid test)라고 한다. 면역학적 래피드 검사는 주로 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)와 같은 막(membrane)을 고형상으로 사용하고 표지체로 골드 콜로이드를 사용하며 비교적 저렴한 비용으로 빠르게 검사할 수 있는 특징이 있다.

일반적으로 니트로셀룰로오스 막을 이용하는 래피드 검사(Rapid test)는 크게 통과 검사법(Flow Through method)과 용액을 통과시키지 않고 다공성의 니트로셀룰로오스 막을 이용하여 측면 이동(Lateral Flow) 시키는 면역 크로마토그래피법(Immunochromatography)으로 나눌 수 있다.

통과 검사법(Flow Through method)은 니트로셀룰로오스와 같은 다공성 막을 이용하며 다공성 막 아래에 보통 셀룰로오스 재질의 필터 종이를 대고 용액을 떨어뜨려 검사하는 방식이다. 통과 검사법의 경우 세척 과정이 포함된 여러 단계로 이루어져 있어 진행방법이 복잡하고, 또한 아주 짧은 시간 내에 항원/항체 반응이 일 어나야 하는 래피드 검사(Rapid test)에서는 이러한 방법을 통해 검출되는 민감도가 면역 크로마토그래피법 보다는 좋지 않다는 단점을 가지고 있다. 그러나 항원-항체 반응의 순서가 ELISA와 동일한 순서, 즉 고형상에 있는 포획 분자(Capture Molecule)와 분석물질이 먼저 반응하고 이들과 표지 접합체와의 반응이 그 후에 이루어지므로 다음과 같은 유리한 점이 있다.

첫째, 특이적인 항체 검출을 위한 비경쟁적 분석법(Noncompetitive Assays for Specific Antibodies)에 있어서, 면역 크로마토그래피법은 포획 분자나 표지 접합체의 양이 매우 많이 필요함에 반하여, 면역 통과법은 훨씬 적은 양으로도 반응이 가능할 뿐만 아니라 이들을 효율적으로 사용하는 것이 가능하다. 둘째, 고농도의 분석물질을 사용하는 경우에 있어서, 면역 크로마토그래피법을 이용하면 표지 접합체가 분석물질의 모든 결합 부위를 차지하는 경우가 있어서 고형상에 표지 접합체가 결합하지 않는 훅 효과(Hook Effect)가 발생하기도 하지만, 면역 통과법을 이용하면 이러한 문제를 극복할 수 있다는 장점이 있다.

이와 관련하여, 면역 크로마토그래피법은 항원-항체의 특이적 면역반응과 크로마토그래피법의 진행성을 결합한 검사방법이라고 할 수 있다. 이 방법은, 항원-항체의 특이적 결합, 측면 이동성 막(Lateral Flow Membrane) 상에서의 반응물질의 이동, 항원 또는 항체가 결합된 골드 콜로이드(Gold Colloid)의 이동성, 응집에 의한 발색 등을 이용한 검사방법으로서, 이 방법을 이용할 경우에는 별도의 세척 단계가 없는 1 ~ 2 번의 과정만으로 검사를 수행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 검체와 포획분자 또는 표지 접합체의 반응 및 세척 과정은 별도의 분리된 과정이 아닌 크로마토그래피 방법 자체에 의해 이루어진다. 각 항원-항체 반응은 일차적으로 크로마토그래피의 속도에 의해 조절이 가능하며, 또한 표지 접합체나 니트로셀룰로오스 막에 고정되는 항원이나 항체와 같은 포획 분자의 양에 따라서도 조절될 수 있다.

이러한 장점에도 불구하고 면역 크로마토그래피법은 항원-항체 반응이 ELISA의 순서와 다르게 행해지는 특성으로 인해, 분석물질이 고형상에 있는 포획 분자와 먼저 반응하지 않고 표지 접합체와 먼저 반응하게 되며, 크로마토그래피에 의해 고형상의 포획분자에 결합된 분석물질이나 표지 접합체를 다른 성분들과 분리해야 한다. 이종 면역분석법에서 고형상을 사용하여 분석물질이나 표지 접합체를 용액상에서 분리하는 과정에서 크로마토그래피를 이용하는 경우, ELISA에서와 같은 효율적인 세척이나 분리가 어렵다. 따라서, 특이적인 항체 검출을 위한 비경쟁적 분석법(Noncompetitive Assays for Specific Antibodies)에 있어서 민감도가 좋지 않고, 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과(Hook Effect)에 쉽게 노출된다는 단점이 있다. 그러나, 이러한 단점에도 불구하고 현장 검사법으로서는 통과 검사법에 비해 사용이 간편하고 보다 민감도가 높은 면역 크로마토그래피법이 더 선호되고 있다.

이러한 면역 크로마토그래피법을 수행하는 디바이스는 일반적으로 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있다. 상기 크로마토그래피 스트립은, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 접촉되도록 접합체 패드와 검체 패드가 순차적으로 적층되어 있다. 고형상의 대향 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중 간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있다. 상기 상부 하우징은 상기 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부와 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고, 상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있다.

그러한 구성의 면역 크로마토그래피 디바이스의 대표적인 예가 도 1에 개시되어 있다. 도 1을 참조하면, 크로마토그래피 스트립(110)은 검체 패드(Sample pad: 101), 접합체 패드(Conjugate pad: 102), 고형상으로서의 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane: 103), 흡수 패드(Absorbent pad: 106), 지지체로서의 접착성 라미네이트 카드(Laminate card: 107) 등을 포함하고 있다.

검체 패드(101)는 검체가 부가되는 부위로서, 일정한 속도와 분포로 검체가 크로마토그래피 되도록 하며, 여기에 블로킹 단백질, 용제(detergent), 완충용액 성분, 염, 점도 증가 물질 등을 처리함으로써 검체의 이동 속도 조절, 표지 접합체의 용해도 조절, 비특이 반응의 차단 등의 역할을 수행할 수도 있다.

접합체 패드(102)에는 골드 표지 접합체와 같은 검출물질이 포함되어 있으며, 검체가 검체 패드(101)를 통과한 후 접합체 패드(102)에 도달하면, 양성의 경우 검체가 검출물질과 결합하여 니트로셀룰로오스 막(103)으로 이동한다.

니트로셀룰로오스 막(103)은 다공성 막으로서 그 상단면 일측의 검사선(104) 및 대조선(105)에 항원이나 항체가 고정되어 있다. 표지 접합체와 검체가 니트로셀룰로오스 막을 따라 측면 이동(Lateral Flow) 방식으로 이동하여 검사선(104)에 도달하면, 양성인 경우에는 검사선(104)에 있는 항원 또는 항체와 결합하게 되고, 음성인 경우에는 검사선(104)을 그대로 지나치게 된다.

흡수패드(106)는 크로마토그래피된 물질들을 흡수하여 계속적으로 용액이 이동할 수 있도록 해준다.

접착성의 라미네이트 카드(107)는 상기 구성요소들에 대한 지지체의 역할을 한다.

이러한 스트립(100)은 스트립 자체를 시험관 등에 넣어서 사용하기도 하지만 하우징에 넣고 조립하여 사용하기도 한다. 상부 하우징(110)에는 검체 첨가부(111), 결과를 판독할 수 있는 결과 확인창(112), 하부 하우징에 결합할 수 있는 핀(114) 구조물 등으로 이루어져 있다. 이러한 하우징에는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐 등 여러 가지 재질이 사용될 수 있으며, 투명한 재질의 플라스틱을 사용할 경우에는 결과 확인창(112)이 도면에서와 같이 천공될 필요가 없다.

하부 하우징(120)은 스트립(100)을 고정시켜 주는 고정부(121), 상부 하우징(110)과 결합할 수 있는 핀홀(122) 등으로 구성되어 있다.

면역 크로마토그래피법을 이용한 면역 검사 방법 중 특이적인 항체 검출을 위한 비경쟁적 분석법에 있어서 표지 항체 접합체와 검체가 먼저 반응을 하기 때문에 매우 많은 양의 표지 항체 접합체가 요구되지만 현실적으로 이것을 만족시키기 용이하지 않다. 예를 들어, 프로테인 A(Protein A)와 같은 물질을 골드 콜로이드와 같은 표지체에 접합시켜 사용하는 경우, 표지 접합체가 검체 내의 IgG를 모두 결합시키지 못하면 표지 접합체와 결합하지 않은 특이 IgG가 검사선에 결합하고 모든 종류의 IgG 분자가 대조선에 결합할 수 있게 된다. 이로 인해 표지 접합체-IgG 복합체가 대조선이나 검사선에 결합하는 것이 경쟁적으로 저해된다. 보통 혈액 내의 IgG 농도는 10 mg/ml 이상으로 알려져 있으며 보다 효과적으로 면역 크로마토그래피를 하기 위해서는 매우 많은 양의 표지 접합체나 포획분자를 사용해야 한다. 그러나, 니트로셀룰로오스 막의 단백질 결합 용량은 한정되어 있고 표지 접합체의 경우도 패드나 고형상에 고정시킬 때 그 양이 한정되어 있으며, 또한 과량 사용에 의한 비특이 반응 유발 등의 문제가 발생할 가능성이 있어 현실적으로는 필요한 양의 표지 접합체나 포획분자를 사용할 수가 없다. 따라서, 민감도가 다른 검사법에 비해 좋지 못하다. ELISA와 같은 면역검사법에서는 항체와 고형상에 고정된 항원을 먼저 반응시키고 반응하지 않은 항체를 세척에 의해 제거하므로 이러한 문제가 발생하지 않는다. 그러나, 기존에 사용되고 있는 방식의 면역 크로마토그래피법은 검체와 표지 접합체를 먼저 반응시키므로 이 반응에서 결합되지 않은 많은 수의 IgG 양성 분자가 검사선의 항원과 결합하여 표지 접합체의 결합을 경쟁적으로 방해하게 된다. 대조선의 경우도 표지 접합체에 결합하지 않은 IgG 분자가 결합하여 표지 접합체의 결합을 방해하게 된다.

따라서, 특이 항체 검출을 위한 간접 면역 분석법으로는 면역 크로마토그래피법 보다는 면역 통과법이 더 적합한 방법이라 할 수 있다. 또한, Biosite 사의USP 6767510에 언급된 방법과 같이 미세 플라스틱 구조물의 모세관 현상을 이용하여 항원-항체 반응을 유도하는 방식의 면역분석법에서도 형광 표지 접합체와 분석물질의 반응이 먼저 유도되므로 특이 항체 검출을 위한 간접 면역분석법에서 민감도가 저하될 수 밖에 없다.

한편, 면역분석법에서 고농도의 분석물질이 검체 중에 존재하는 경우, 검체와 표지 접합체를 고형상의 항원이나 항체와 동시에 반응시키면, 표지 접합체가 결합할 수 있는 모든 위치에 분석물질이 결합하는 훅 효과(Hook Effect)가 발생한다. 이것을 피하기 위하여, ELISA와 같은 면역분석법에서는 분석물질과 고형상의 항원이나 항체를 먼저 반응시키고 세척에 의해 여분의 분석물질을 제거한 후 표지 접합체를 반응시키는 방법을 사용한다. 그러나, 막을 이용하는 종래의 면역 크로마토그래피법이나 Biosite 사의 USP 6,767,510에 개시되어 있는 미세 플라스틱 구조물의 모세관 현상을 이용한 면역분석법에서는 훅 효과(High-Dose Hook Effect)를 효과적으로 극복할 수 있는 방법이 존재하지 않는다. 따라서, 특이적인 항체 검출을 위한 비경쟁적 분석법이 가지고 있는 종래의 문제점을 해결하고 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과(High-Dose Hook Effect)가 일어나지 않는 면역분석법에 대한 필요성이 높은 실정이다.

본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 기존의 크로마토그래피나 모세관 현상 등을 이용하여 용액을 측면 이동시키며 면역 반응을 유도하는 방법에서 검체를 표지 접합체에 먼저 반응시키는 방식이, 이미 설명한 바와 같이, 매우 많은 양의 표지 접합체가 요구되는 문제점과, 검체 내에 고농도의 분석물질이 존재하는 경우 표지 접합체가 결합할 수 있는 모든 위치에 분석물질이 결합하게 되어 고형상에 표지 접합체가 결합하지 못하게 되는 훅 효과가 발생할 가능성이 높다는 문제점이 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 이에 대한 개선책을 개발하기 위한 심도있는 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 검체 중의 분석물질을 먼저 고형상의 포획분자와 반응시킨 후 표지 접합체를 반응시키는 면역반응을 유도하는 것이 특이 항체 검출을 위한 간접 면역분석법에 효과적이고 고농도 분석물질에 의한 훅 효과를 막을 수 있는 효과가 있음을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 완성되었다.

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 면역분석법은, 고형상에 항원이나 항체 등의 포획분자를 고정시키고 이러한 고형상에서 검체를 포함한 용액을 측면 이동시키면서 항원-항체 반응을 유도하는 면역분석법에 있어서, 고형상에 고정된 포획분자와 검체 중의 분석물질 간의 반응을 우선적으로 유도하고, 고형상의 포획분자에 결합된 분석물질(포획분자-분석물질 복합체)과 표지 접합체와의 반응을 나중에 유도하는 것으로 구성되어 있다.

상기 용어 "면역분석법"이란, 용액을 측면으로 이동시키면서 항원-항체 반응을 유도하는 간접 면역분석법으로서, 2차 항체나 항체 특이적인 단백질을 이용하여 IgA, IgG, IgM, IgD 등과 같은 특이 항체를 검출하기 위한 비경쟁적 분석법을 포함한다.

상기 면역분석법에서 검체 등을 포함한 용액의 이동을 유도하는 방식으로는, 크로마토그래피, 모세관 현상, 전기이동, 펌프(Pump), 원심분리, 자기장 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 특징은, 앞서 설명한 바와 같이, 이러한 면역분석법에서 포획분자와 분석물질의 반응을 우선 유도하고 포획분자-분석물질 복합체와 표지 접합체의 반응을 나중에 유도하는 구성으로 이루어져 있다는 점이다. 이러한 구성상의 특징으로 인해, 용액을 측면으로 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 간접 면역분석법에서 민감도를 크게 향상시키고 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과를 개선하는 효과를 발휘한다.

상기 고형상은 검체 중의 분석물질과 결합하는 항원이나 항체 등의 포획분자들을 고정시키고 용액을 측면 이동시킬 수 있는 역할을 하는 매개체로서, 예를 들어, 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), PVDF(Polyvinylidene Fluoride), 나일론(Nylon) 등과 같은 흡수성 물질, 다공성 플라스틱, 미세구조물이 디자인된 판상 부재 등이 사용될 수 있다.

상기 표지 접합체 중의 표지체로는 골드, 실버 등과 같은 금속 표지물, 과산화효소 등과 같은 발색 효소, 형광물질, 발광물질, 염색체(Dye) 등을 사용할 수 있다.

분석물질과 포획분자의 결합 반응 후 포획분자-분석물질 복합체와 표지 접합체의 반응을 유도하는 방식은 다양한 구성에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 분석물질을 포함하고 있는(또는 포함하고 있을 가능성이 있는) 검체를 직접 또는 간접적으로 포획분자에 접촉시켜 반응을 유도하고, 이러한 반응을 통해 얻어진 포획 분자-분석물질 접합체에 경시적(經時的)으로 표지 접합체를 측면 이동을 통해 접촉시켜 포획분자-분석물질 접합체와 표지 접합체의 반응을 유도하는 방식을 들 수 있다.

이러한 경시적인 연속 반응은 도 1에 개시되어 있는 바와 같은 종래의 면역 크로마토그래피 디바이스를 통해서도 구현될 수 있다.

예를 들어, 검체를 결과 확인창(112)에 첨가한 후에 검체 첨가부(111)에 완충액을 첨가하는 방식에 의해 상기와 같은 경시적인 연속 반응이 가능할 수 있다. 구체적으로, 먼저 첨가된 검체 중의 분석물질이 포획분자와 반응한 후에 완충액을 첨가하게 되면, 접합체 패드(102)의 표지 접합체가 완충액과 이동하며 검체를 흡수패드(106) 쪽으로 밀어올리게 되고, 따라서 표지 접합체가 검체와 반응하지 않고 고형상(103)에 결합되어 있는 포획분자-분석물질 복합체와 반응하게 된다.

도 1과 같은 종래의 면역 크로마토그래피 디바이스를 사용하는 상기방법이 본 발명의 범주에 당연히 포함됨에 반하여, 상기와 같은 디바이스를 사용하면 검체 성분 중 불용성 물질이 포함되어 있는 경우 고형상에서의 용액의 이동이 방해될 수 있는 단점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명은 상기한 경시적 연속 반응을 보다 효율적으로 수행할 수 있는 다양한 면역 크로마토그래피 디바이스들을 제공한다.

그러한 면역 크로마토그래피 디바이스의 첫번째 바람직한 예는, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 접촉되도록 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있으며, 고형상의 대향 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 흡수 패드와 대조선 사이의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

상기 상부 하우징은 상기 완충액 패드가 노출되도록 천공된 완충액 첨가부, 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부, 및 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고;

상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있다.

하나의 바람직한 실시예에서, 상기 흡수 패드와 고형상 사이에는 일정시간 용액의 이동을 억제하는 간섭부재가 더 포함될 수 있다.

상기 크로마토그래피 디바이스의 하나의 바람직한 예가 도 2에 개시되어 있다.

도 2를 참조하여 설명하면, 상부 하우징(210)에는 검체 첨가부(213)과 완충액 첨가부(211)가 서로 분리하여 설치되어 있고, 스트립(200)에 부착되는 검체 패드(208)를 대조선(205)과 흡수패드(206) 사이에 위치시킨 다음, 스트립(200)과 상부 및 하부 하우징(210, 220)을 조립하여 디바이스를 완성할 수 있다.

도 2의 디바이스를 사용하여 본 발명에 따른 경시적 연속 반응을 수행 방법을 설명하면 다음과 같다. 디바이스의 검체 첨가부(213)에 검체를 부가하면 검체 가 접합체 패드(202)와 반응하기 전에 포획분자가 고정되어 있는 고형상(203)의 대조선(205)과 검사선(204)에 먼저 반응하여 검체 중의 분석물질과 포획분자 사이의 결합 반응이 먼저 일어나게 된다. 그 후 완충액을 완충액 첨가부(201)에 가하면 완충액이 완충액 패드(201)를 통해 접합체 패드(202)에 건조되어 있는 표지 접합체를 녹여서 고형상(203) 쪽으로 이동시키게 되고, 완충액과 표지 접합체가 고형상(203)으로 이동하여 어느 정도 시간이 경과하게 되면 검체와 만나서 검체를 흡수 패드(206) 쪽으로 이동시킨다. 이때 처음에 방출되는 표지 접합체는 어느 정도 검체와 접촉을 하지만, 측면 이동을 하면서 검체를 계속 흡수 패드(206) 쪽으로 밀어내므로 어느 정도 시간이 경과하면 표지 접합체가 검체와 반응하지 않고 고형상(203)에 결합된 포획분자-분석물질 복합체와 반응하게 된다. 즉, 방출된 표지 접합체는 포획분자와 분석물질이 결합되어 있는 검사선(204)과 대조선(205)에 반응하여 복합체를 이루게 되며 골드와 같은 검출물질을 사용하는 경우 적색이나 보라색 띠가 형성된다.

검체 패드(208)는 여러 가지 접착성 물질이나 접착성 테이프로 고형상(203)에 결합시킬 수 있다. 또한, 이때 첨가되는 검체의 양은 검체 패드(208)의 크기 등을 고려하여 적절량을 사용해야 하는데, 예를 들어, 고형상(203)의 크기가 4 mm x 25 mm이고 검체 패드(208)가 4 mm x 5 ~ 10 mm인 경우 검체의 양은 10 ~ 50 ㎕ 정도가 바람직하다. 검체의 양이 50 ㎕를 초과할 경우에는 완충액이 첨가되기 전에 검체가 고형상(203)을 따라 접합체 패드(202) 쪽으로 이동하게 되고, 10 ㎕ 미만일 경우에는 검체가 검사선(204)까지 이동하지 않을 수 있다. 그리고, 완충액을 이용하여 상기의 이동을 효과적으로 하기 위해서는 완충액의 양이 검체 양보다 많은 것이 바람직하다.

경우에 따라서는, 흡수패드(206) 쪽으로의 검체의 이동을 막고 고형상(203)의 검사선(204)과 대조선(205) 쪽으로 용액을 이동시키기 위해 흡수패드(206)와 고형상(203) 사이에 간섭부재를 개재하여, 검체의 흐름을 고형상(203) 쪽으로 유도시킬 수도 있다. 이러한 간섭부재의 바람직한 예로는 폴리비닐 알코올(Polyvinyl Alcohol) 등으로 이루어진 수용성 필름, 소수성의 막 또는 유리섬유 등이 사용될 수 있다. 또한, 검체의 이동을 촉진시키기 위해 검체 패드(208)에 소량의 완충액을 첨가할 수도 있다.

본 발명에 따른 면역 크로마토그래피 디바이스의 두번째 바람직한 예는, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 접촉되도록 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있으며, 고형상의 대향 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 접합체 패드와 검사선 사이의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

하나의 바람직한 실시예에서, 상기 접합체 패드와 고형상 사이에는 일정시간 용액의 이동을 억제하는 간섭부재가 더 포함될 수 있다.

상기 크로마토그래피 디바이스의 하나의 바람직한 예가 도 3에 개시되어 있다.

도 3을 참조하면, 도 2의 디바이스와 비교하여, 스트립(300)에 부착되는 검체 패드(308)가 접합체 패드(302)와 검사선(304) 사이에 위치하고, 접합체 패드(302)와 고형상(303) 사이에 간섭부재(309)가 개재되어 있어서 검체와 완충액의 진행이 한 방향으로 유도된다는 점에 차이가 있다.

도 3의 디바이스를 사용하여 본 발명에 따른 경시적 연속 반응을 수행 방법을 설명하면 다음과 같다. 검체 첨가부(313)를 통해 검체를 검체 패드(308)에 첨가하면 검체가 검사선(304)과 대조선(305)을 지나 흡수패드(306) 쪽으로 이동하게 된다. 이 때 접합체 패드(302)와 고형상(303) 사이에 간섭부재(309)가 개재되어 있어서 검체가 표지 접합체와 반응하는 것을 막을 수 있다. 이러한 간섭부재의 바람직한 예로는 수용성 필름 등을 들 수 있다. 즉, 검체가 수용성 필름을 녹이는데 시간이 걸리므로 검체는 표지 접합체와 일정 시간 내에는 직접 접촉하지 않고 검체의 대부분이 고형상(303)을 따라 이동하게 된다. 검체 첨가 후 어느 정도 시간 간격을 두고 완충액을 완충액 첨가부(311)에 첨가하면 완충액이 완충액 패드(301)를 통해 흡수되면서 접합체 패드(302)의 표지 접합체를 방출시키고, 이어서 수용성 필 름(309)을 녹여내어 고형상(303)으로 이동하며 일부 남아있는 검체를 흡수 패드(306) 쪽으로 밀어내며 이동한다. 따라서, 어느 정도 시간이 경과하면 표지 접합체가 검체와 반응하지 않고 고형상(303)에 결합된 포획분자-분석물질 복합체와 반응하게 된다.

상기 간섭부재(309)로는 수용성 필름 외에도 PVDF(polyvinylidene fluoride)와 같은 소수성 성질을 띠는 막이나 유리 섬유 등이 사용될 수 있음은 물론이다. 이러한 성분의 물질은 소수성 성질 때문에 검체가 표지 접합체와 접촉하지 못하지만 용제(detergent)와 같은 성분을 완충액에 사용하면 용액이 막이나 유리 섬유를 통과하여 이동할 수 있다. 따라서, 이와 같은 간섭물질의 구멍이나 격자 등의 크기는 단백질이 충분히 통과할 수 있어야 한다.

경우에 따라서는, 검체의 흐름이나 고형상(303)에 결합된 검체 성분의 세척을 위해 검체 첨가부(308)에 완충액을 첨가할 수도 있다.

본 발명에 따른 면역 크로마토그래피 디바이스의 세번째 바람직한 예는, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 검사선을 중심으로 상기 흡수 패드에 대한 대향 측의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

상기 상부 하우징은 완충액 패드가 노출되도록 천공된 완충액 첨가부, 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부, 및 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고, 상기 완충액 첨가부는 하우징의 본체로부터 분리되어 있으며;

상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있고, 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있는 스트립의 일부가 스트립의 대향 측 하부 하우징에 힌지 결합되어 있고 그것의 반대편은 상기 고형상 측에 이격된 상태로 가설 지지체에 의해 지지되어 있다.

상기 크로마토그래피 디바이스의 하나의 바람직한 예가 도 4에 개시되어 있다.

도 4를 참조하면, 접합체 패드(402)와 완충액 패드(401)가 힌지(hinge) 지지체(409) 위에 고정된 상태로 하부 하우징(420)에 연결되어 있다. 또한, 힌지 지지체(409)의 반대편은 가설 지지체로서의 Y자형 고정핀(423)에 의해 지지되어 있다. 고정핀(423)은 물리적인 힘에 쉽게 부서질 수 있는, 예를 들어, 연질의 플라스틱으로 이루어져 있다. 스트립(400)은 검체 패드(408)가 검사선(404) 아래쪽에 위치하도록 구성되어 있고, 접합체 패드(402)가 직접 연결되지 않은 상태로 되어 있으며, 그에 따라 상부 하우징(410)에서 완충액 첨가부(411)가 검체 첨가부(414)로부터 분리되어 있다.

하우징(410, 420)과 스트립(400)을 조립한 후 검체를 검체 첨가부(414)에 가하고 어느 정도 이동할 시간이 경과한 후에 완충액을 완충액 첨가부(411)에 가한 다음 힌지 반대 쪽을 눌러주면 고정핀(423)이 부서지면서 접합체 패드(402)가 고형 상(403)에 접촉하게 되고 완충액과 표지 접합체가 고형상(403) 쪽으로 이동하게 된다. 이러한 방법은 도 3의 디바이스에서 간섭부재를 사용하는 것과 같은 효과를 기대할 수 있다.

이상에서, 본 발명의 방법을 수행할 수 있는 바람직한 디바이스의 구조들을 예시적으로 설명하였지만, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 다양한 변형의 디바이스들을 구상할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상술하지만, 본 발명의 범주가 그것으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: C형 간염 바이러스 항체 검사용 면역크로마토그래피 스트립 제조

니트로셀룰로오스 막(Millipore사의 SRHF Nitrocellulose Membrane)을 준비하여 오염 물질이 없는지 검사하고, 25 mm x 20 cm의 크기로 절단하였다. 용액 분주기(Biodot 3000)는 항원/항체 분주 전에 정제수로 충분히 세척하여 이물질이 없는 상태로 준비하였다. 니트로셀룰로오스 막을 분주기에 위치시킨 후 검사선에는 유전자 재조합 C형 간염 바이러스 항원 혼합액(Core 항원, NS3 항원, NS4 항원, NS5 항원, 1.0 mg/ml)을 1.0 ㎕/cm로 분주하였다. 대조선에는 산양 항 사람 면역 글로불린(1.0 mg/ml)을 1.0 ㎕/cm로 분주하였다. 그런 다음, 항원이 흡착된 니트로셀룰로오스 막을 분주된 용액이 마르도록 건조시키고 건조가 끝나면 라미네이트 카드에 부착시켰다.

골드 콜로이드 표지 접합체는 프로테인 A-골드 표지 접합체를 사용하였으며 Academic Press에서 발행한 Bioconjugate Techniques(저자: Greg T. Hermanson), 593 ~ 602 쪽을 참고하여 제조하였다. 프로테인 A-골드 표지 접합체는 Millipore 사의 유리섬유에 흡착시켜 용액을 건조시킨 다음 5 mm길이로 절단하였다.

흡수 패드는 Millipore사의 셀룰로오스 패드를 사용하며 20 mm 길이로 절단하였다. 검체 패드는 Millipore 사의 셀룰로오스 패드를 사용하며 5 mm 길이로 절단하였다. 그 밖에 완충액 패드를 사용하는 경우에는 Millipore 사의 셀룰로오스 패드를 1.6 mm 크기로 절단하여 사용하였다.

각각의 요소들을, 도 1, 도 2 및 도 3에서와 같이, 라미네이트 카드에 부착시킨 후 절단기로 4 mm의 크기로 절단하여 면역 크로마토그래피 스트립을 완성하였다. 각 스트립은 백색의 하우징 또는 투명 하우징에 조립하여 검사에 사용하였다.

실시예 2: C형 간염 바이러스 항체 검사

C형 간염 바이러스 항체 검사용 면역 크로마토그래피 스트립을 실시예 1과 같이 제조한 후 하우징에 결합한 후 C형 간염 바이러스 항체 양성 검체를 정상인의 혈청으로 희석하여 20 ㎕를 검체 첨가부에 가한 후 완충액(인산염 완충액, 1.0 % 소혈청 알부민) 100 ㎕를 가하여 전개시켰다. 사용한 검체는 실시예 1과 같은 조건으로 기존의 면역 크로마토그래피법으로 음성이 나오며 대조선에서도 어떤 반응이 이루어지지 않는 양성 검체를 사용하였다.

도 1 구조의 면역 크로마토그래피 디바이스에서 111(도 1) 부위에 검체를 첨가한 경우와, 도 2 구조의 면역 크로마토그래피 디바이스에서 211 부위(도 2)에 검체를 첨가하고 완충액을 같은 부위에 첨가하는 경우에는 검사선이나 대조선에 반응이 일어나지 않았다(도 5의 501, 509). 그러나, 도 2 구조의 면역 크로마토그래피 디바이스에서 검체를 213 부위에 가한 후 완충액을 211 부위에 각각 첨가하였을 때 강한 양성 반응이 일어났고, 이 검체를 정상인의 혈청으로 1/10 ~ 1/640(도 5의 502 ~ 508) 까지 1/2씩 연속하여 희석하였을 때 1/320 희석비까지 양성으로 인지하였다(도 5의 507). 따라서, 용액을 고형상에서 이동시키며 검사하는 면역분석법 중 특이 항체를 검사하는 간접 면역분석법의 경우 분석물질을 고형상에 고정된 포획분자와 먼저 반응을 시키면 항원이나 항체의 농도나 표지 접합체의 농도를 크게 증가시키지 않아도 민감도를 크게 개선시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: C형 간염 바이러스 항체 음성 및 양성 검체에 대한 시험

본 발명에 따른 방법이 실제로 임상 검사에 이용될 수 있는지 알아보기 위해 C형 간염 바이러스 항체 음성 및 양성 검체에 대해 검사를 수행하였다. 실시예 1에서 제조한 스트립 디바이스 중 도 2구조의 C형 간염 바이러스 항체 검사 디바이스를 사용하였다. 하우징은 투명한 폴리스티렌 재질을 사용하였으며 검사 방법은 실시예 2와 같은 방법을 사용하였다. 양성 50 검체, 음성 50 검체에 대한 검사 결과, 양성 50 검체는 모두 양성으로 음성 50 검체는 모두 음성으로 판정되었으며, 이러한 결과를 도 6 및 도 7에 도시하였다.

이들 도면에서 보는 바와 같이, 각각 소망하는 결과가 얻어졌다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 포획분자와 분석물질의 반응을 우선 유도하고 포획분자-분석물질 복합체와 표지 접합체의 반응을 나중에 유도함으로써, 용액을 측면으로 이동시키며 항원-항체 반응을 유도하는 간접 면역분석법에서 민감도를 크게 향상시키고 고농도의 분석물질에 의한 훅 효과를 개선하는 효과를 발휘한다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims

고형상에 항원이나 항체 등의 포획분자를 고정시키고 이러한 고형상에서 검체를 포함한 용액을 측면 이동시키면서 항원-항체 반응을 유도하는 면역분석법에 있어서, 고형상에 고정된 포획분자와 검체 중의 분석물질 간의 반응을 우선적으로 유도하고, 고형상의 포획분자에 결합된 분석물질(포획분자-분석물질 복합체)과 표지 접합체와의 반응을 나중에 유도하는 것으로 구성되어 있는 면역분석법.
제 1 항에 있어서, 상기 면역분석법은 2차 항체나 항체 특이적인 단백질을 이용하여 특이 항체를 검출하기 위한 비경쟁적 분석법인 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 1 항에 있어서, 상기 용액의 이동을 유도하는 방식으로 크로마토그래피, 모세관 현상, 전기이동, 펌프(Pump), 원심분리 또는 자기장을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 3 항에 있어서, 상기 방식은 크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 1 항에 있어서, 상기 고형상은 흡수성 물질, 다공성 플라스틱, 또는 미세 구조물이 디자인된 판상 부재인 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 5 항에 있어서, 상기 고형상은 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), PVDF(Polyvinylidene Fluoride) 또는 나일론(Nylon)으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 1 항에 있어서, 상기 표지 접합체 중의 표지체는 금속 표지물, 발색 효소, 형광물질, 발광물질, 또는 염색체(Dye) 인 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 1 항에 따른 면역분석법을 수행하기 위한 면역 크로마토그래피 디바이스로서, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 접촉되도록 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있으며, 고형상의 대향 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 흡수 패드와 대조선 사이의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

상기 상부 하우징은 상기 완충액 패드가 노출되도록 천공된 완충액 첨가부, 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부, 및 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고;

상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있는 면역 크로마토그래피 디바이스.
제 8 항에 있어서, 상기 흡수 패드와 고형상 사이에는 일정시간 용액의 이동을 억제하는 간섭부재가 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 디바이스
제 8 항에 있어서, 상기 간섭부재는 수용성 필름, 소수성의 막 또는 유리섬유로 되어 있는 것을 특징으로 하는 디바이스.
제 1 항에 따른 면역분석법을 수행하기 위한 면역 크로마토그래피 디바이스로서, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 접촉되도록 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있으며, 고형상의 대향 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 접합체 패드와 검사선 사이의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

상기 상부 하우징은 상기 완충액 패드가 노출되도록 천공된 완충액 첨가부, 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부, 및 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고;

상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있는 면역 크로마토그래피 디바이스.
제 11 항에 있어서, 상기 접합체 패드와 고형상 사이에는 일정시간 용액의 이동을 억제하는 간섭부재가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 디바이스
제 11 항에 있어서, 상기 간섭부재는 수용성 필름, 소수성의 막 또는 유리섬유로 되어 있는 것을 특징으로 하는 디바이스
제 1 항에 따른 면역분석법을 수행하기 위한 면역 크로마토그래피 디바이스로서, 크로마토그래피 스트립을 한쌍의 하우징으로 감싼 구조로 이루어져 있고,

상기 크로마토그래피 스트립에는, 판상의 지지체 상에 용액의 이동을 위한 고형상이 실장되어 있고, 상기 고형상의 일측에 흡수 패드가 접촉되도록 적층되어 있고, 고형상의 중간 부위에 포획분자가 부착된 검사선과 대조선이 위치되어 있으며, 상기 검사선을 중심으로 상기 흡수 패드에 대한 대향 측의 고형상에 검체 패드가 적층되어 있고;

상기 상부 하우징은 완충액 패드가 노출되도록 천공된 완충액 첨가부, 검체 패드가 노출되도록 천공된 검체 첨가부, 및 상기 검사선 및 대조선이 노출되는 확인창을 포함하고 있고, 상기 완충액 첨가부는 하우징의 본체로부터 분리되어 있으며;

상기 하부 하우징은 상기 스트립을 정위치시키기 위한 고정부를 포함하고 있고, 접합체 패드와 완충액 패드가 순차적으로 적층되어 있는 스트립의 일부가 스트립의 대향 측 하부 하우징에 힌지 결합되어 있고 그것의 반대편은 상기 고형상 측에 이격된 상태로 가설 지지체에 의해 지지되어 있는 면역 크로마토그래피 디바이스.