KR20040081798A - 연골세포 이식을 위한 방법, 기구 및 물질 - Google Patents

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KR20040081798A
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KR
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cartilage
support matrix
chondrocytes
collagen
implantable article
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KR10-2004-7012696A
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브루노 기아네티
페터 베렌스
샤무엘 아스쿨라이
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페리겐 트란스플란타치온 서비스 인터나치오날 (파우테에스이) 아게
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Abstract

본 발명은 흡수가능한 지지 매트릭스에 보유되어 있는 연골세포를 포함하여 이식가능한 물품의 이식에 의해 동물의 관절 표면 연골을 효과적으로 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 동물의 연골 치료를 위한 이식가능한 물품(이식가능한 물품에는 흡수성 지지 매트릭스상에 보유되어 있는 연골세포가 포함된다) 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 일반적으로 흡수성의 연성 지지 매트릭스에 부착되어 성장된 생세포를 위한 상기 매트릭스를 포함하고 있는 물품을 포함한다.

Description

연골세포 이식을 위한 방법, 기구 및 물질{METHODS, INSTRUMENTS AND MATERIALS FOR CHONDROCYTE CELL TRANSPLANTATION}
본 발명은 연골세포 이식, 골이식술 및 연골 이식술, 치유, 관절 복구 및 관절염 병리의 예방 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 연골세포 이식 및 연골 재생을 위한 신규한 방법 및 기구에 관한 것이다.
미국에서 매년 500,000건 이상의 관절성형술 및 전체 관절 대체술이 행해지고 있다. 대략적으로 동일한 수의 유사 시술이 유럽에서 행해지고 있다. 유럽에서의 시술 건수에는 약 90,000건의 전체 무릎 대체술 및 약 50,000건의 무릎의 결함을 복구하기 위한 시술이 포함되어 있다. 상기 수는 본질적으로 미국에서와 동일하다(참조 : Praemer A., Furner S., Rice, D. P., Musculoskeletal conditions in the United States, American Academy of Orthopaedic Surgeous, Park Ridge, Ill., 1992, 125).
연골을 재생 치료하는 방법은 관절 손상의 초기 단계에서 가장 유용하며 이 단계에서 수행됨으로써 인공 관절 대체 수술을 필요로 하는 환자들의 수를 감소시킬 수 있다. 이러한 예방적인 치료 방법에 의해서, 골관절염이 발병하는 환자의 수가 또한 감소할 것이다.
관절에서 연골부 구조를 재피복시키기 위해 사용되는 기술들은 질병에 걸린 연골 및 연골하골을 절제하여 맥관화된 해면골을 노출시키는 연골하골 드릴링, 연마 및 다른 방법들을 사용하여 연골의 복구를 유도시키기 위해 주로 시도되어 왔다(참조 : Insall, J., Clin. Orthop. 1974, 101, 61; Ficat R. P. et al., Clin Orthop. 1979, 144, 74; Johnson L. L., inOperative Arthroscopy, McGinty J. B., Ed., Raven Press, New York, 1991, 341).
쿤(Coon)과 칸(Cahn)(참조 : Science 1966, 153, 1116)은 병아리 배(胚) 체절로부터 연골 합성 세포를 배양하는 기술을 설명하였다. 후에, 칸과 래셔(Lasher)(참조 : PNAS USA 1967, 58, 1131)는 연골 분화를 위한 전제조건으로서 DNA 합성의 관련성을 분석하기 위해 상기 시스템을 사용하였다. 연골세포는 성장시까지 EFG 및 FGF 둘 모두에 반응하지만(참조 : Gospodarowicz and Mescher, J. Cell Physiology, 1977, 93, 117), 궁극적으로는 이들의 분화능은 상실된다(참조 : Benya et al., Cell, 1978, 15, 1313). 연골세포를 성장시키는 방법은 브리트베르그, 엠.(Brittberg, M.) 등(참조 : new Engl., J. Med. 1994, 331, 889)에 의해 기술되었으며 주로 이를 약간 조정하여 사용되고 있다. 상기 방법을 사용하여 성장된 세포들은 환자의 무릎 관절내로의 자가이식물로서 사용된다. 또한 콜레타스(Kolettas) 등(참조 : J. Cell Science 1995, 108, 1991)은 장기간의 세포 배양하에서 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 연골 특이적인 분자들의 발현을 조사하였다. 이들은 단층 배양액중의 배양 동안 형태학적 변화에도 불구하고(참조 : Aulthouse, A. et al., In vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659, Archer, C. et al., J. Cell Sci. 1990, 97, 361; Hanselmann, H. et al., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97), 아가로스 겔상에서 성장된 현탁 배양물과 비교할 때, 여러 과학자들에 의해 시험된 알기네이트 비드 또는 스피너 배양물(둥근 모양의 세포 형태를 유지시킴)은 연골세포를 변화시키지 않았는데, 즉, 타입 II 및 IX 콜라겐 및 거대 집합체 프로테오글리칸, 아그레칸, 베르시칸 및 링크 단백질과 같은 발현 마커가 변화하지 않았음을 밝혀내었다 (참조 : Kolettas, E. et al., J. Cell Science 1995, 108, 1991).
와키타니(Wakitani) 등[참조 : Tissue Engineering 4(4), 429 (1989)]은 연골 결함을 복구시키기 위한 동물 실험에서의 콜라겐 타입 I 겔의 용도를 기술하였다. 모든 예에서, 주요한 문제점은 기능적인 조직 복구를 위해 필요한 생체역학적 성질의 결여였다.
관절성 연골세포는 연골에서만 발견되는 특수한 중간엽 유도 세포이다. 연골은 연골세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스에 의존하는 물리적 성질을 가진 무혈관성 조직이다. 연골내 뼈발생동안, 연골세포는 타입 X 콜라겐의 발현의 개시에 의해 특징화되는 세포 비대증을 야기시키는 성숙을 겪게 된다[참조 : Upholt, W. B. and Olsen, R. R., In: CartilageMolecular Aspects(Hall, B. & Newman, S., Eds.) CRC Boca Raton 1991, 43; Reichenberger, E. et al., Dev. Biol. 1991, 148, 562; Kirsch, T. et al., Differentiation, 1992, 52, 89; Stephens, M. et al., J. Cell Sci., 1993, 103, 1111].
또한 관절의 관절성 표면의 외층에서의 타입 II 콜라겐의 과잉 분해는 골관절염에 의해 유발된다. 따라서 콜라겐 네트워크가 약화되고 이어서 세동(細動)을 일으킴으로써 프로테오글리칸과 같은 매트릭스 물질이 소실되고 결국 전부 대체된다. 약화된 골관절염 연골의 이러한 세동은 석회화 연골 및 연골하골내까지 도달할 수 있다[참조 : Kempson, G. E. et al., Biochem. Biophys. Acta 1976, 428, 741; Roth, V., and Mow, V. C., J. Bone Joint Surgery, 1980, 62A, 1102; Woo, S. L.-Y. et al., in Handbook of Bioengineering(R. Skalak and S. Chien Eds), McGraw-Hill, New York, 1987, pp. 4.1-4.44].
뼈, 연골 및 기타 결합 조직의 기본 발생, 조직학적 및 현미경적 해부학에 대한 설명들은 예를 들어, 위터(Wheater), 버킷(Burkitt) 및 다니엘(Daniels)의 문헌[Functional Histology, 2nd Edition (Churchill Livingstone, London 1987, Chp. 4)]을 참조할 수 있다. 뼈, 연골 및 기타 결합 조직의 결함에 대한 기본적인 조직학적 해부학에 대한 설명도 예를 들어, 위터, 버킷, 스티븐(Stevens) 및 로베(Lowe)의 문헌[참조 : Basic Histopathology, (Churchill Livingstone, London, 1985, Chp. 21)]을 참조할 수 있다.
연골세포 이식을 위한 필요성이 상기 언급된 참고문헌에 적어도 충분히 기술되어 있긴 하지만, 이식 또는 다른 방법에 의한 연골 복구를 위한 만족할 만한 효과적인 방법에 대한 필요성이 남아있다.
도 1A는 연골 캡과 함께 관절 표면을 가진 무릎 관절에서 뼈의 전형적인 관절 말단을 보여준다.
도 1B는 뼈의 관절 말단의 연골 캡에 대한 연골 결함 또는 손상을 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 이식가능한 물품의 하나의 양태를 보여준다.
도 3은 도 2의 이식가능한 활모양의 물품이 도 4에 제시되는 바와 같은 관절경 도입기내에 이식을 위해 배치될 수 있음을 보여준다.
도 4는 본 발명에 따른, 이식 부위에 이식가능한 물품 이식하기 위한 관절경 도입기를 보여준다.
도 5는 관절경 기구를 수용할 수 있는 두개의 액세스(access) 채널을 사용하여 연골 캡의 결함 또는 손상 부위에 도 3의 이식가능한 물품을 배치시키는 것을 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 연골하층내로 연장되지 않은 결함 또는 손상을 가진 연골 및 결함 또는 손상 부위에 접착제에 의해 고정되어 있는 본 발명에 따른 이식가능한 물품의 개략적인 단면도이다.
도 7은 연골하층내로 연장되지 않은 결함 또는 손상을 가진 연골 및 기계적인 고정장치에 의해 결함 또는 손상 부위에 고정된 이식가능한 물품의 개략적인 단면도이다.
도 8은 결함 또는 손상 부위에 이식가능한 물품을 고정시키기 위해 사용된 기계적인 고정장치에 대한 하나의 양태를 도시한 것이다.
도 9는 연골하층내로 연장된 결함 또는 손상을 가진 연골 및 결함 또는 손상 부위에 접착제에 의해 고정되어 있는 본 발명에 따른 이식가능한 물품의 개략적인 단면도이다.
도 10은 연골하층내로 연장된 결함 또는 손상을 가진 연골 및 기계적인 고정장치에 의해 결함 또는 손상 부위에 고정되어 있는 이식가능한 물품의 개략적인 단면도이다.
도 11A는 지지 매트릭스상에서의 연골세포 성장 초기의 고체 지지 매트릭스의 조직학적 표본의 컬러 마이크로사진의 흑백 복사본이다.
도 11AA는 도 11A의 컬러 마이크로사진이다.
도 11B는 지지 매트릭스상에서 연골세포가 성장한지 3주 후의 연골세포가 로딩된 도 11A의 지지 매트릭스를 보여주는 컬러 마이크로사진의 흑백 복사본이다.
도 11BB는 도 11B의 컬러 마이크로사진이다.
도 11C는 면역조직화학적 염색에 의해 보여지는 지지 매트릭스상에서 성장된 연골세포를 가진 콜라겐으로 형성된 지지 매트릭스를 보여주는 사진이다.
도 11D는 면역조직화학적 염색에 의해 보여지는 생물 반응기 시스템에서 지지 매트릭스상에서 성장된 연골세포를 가진 콜라겐으로 형성된 지지 매트릭스를 보여주는 사진이다.
본 발명은 세포의 성장 및 부착을 지지할 수 있는 지지 매트릭스를 포함하는 이식가능한 물품 및 상기 물품을 이식시켜 이식 위치에서 세포를 재생시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 흡수성 지지 매트릭스상에 보유되어 있는 연골세포를 포함하는 이식가능한 물품의 이식에 의해 동물의 관절 표면 연골을 효과적으로 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 지지 매트릭스는 타입 I 또는 타입 II 콜라겐과 같은 콜라겐으로부터 제조되며, 연골세포는 자기 유래성 또는 동종 유래성이다. 바람직하게는 이식가능한 물품은 접착제 또는 기계적인 유지 수단에 의해 이식 부위에 고정된다. 또한 본 발명은 이식 부위에 이식가능한 물품을 위치시키고 조작하기 위한 기구 및 이식 부위에 이식가능한 물품을 고정시키기 위한 유지 장치에 관한 것이다.
또한 본 발명은 동물의 연골 복구를 위한 이식가능한 물품(이식가능한 물품에는 흡수성 지지 매트릭스에 보유된 연골세포가 포함됨) 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 연골 손상 및 결함이 종종 발생하는 인체중 하나의 관절은 무릎이다. 도 1A는 인간 무릎 관절(10)에서 뼈의 전형적인 관절 말단을 보여준다. 무릎 관절(10)은 대퇴골(12)과 경골(14)의 접합에 의해 형성되며, 건강한 연골(16)이 대퇴골(12)의 관절 말단을 덮고 있다. 도 1B는 연골(16)에서의 결함 및 손상(18)의 원형 영역(하기에 때때로 결함(18)으로 표기)을 보여준다.
본 발명은 연골 복구용 이식물 및 이식 방법 및 이러한 이식물을 위한 기구를 포함한다. 이식물에는 지지 매트릭스 및 지지 매트릭스상에 보유되어 있는 자기유래성 또는 동종유래성 연골세포가 포함된다.
일반적으로, 지지 매트릭스는 연골세포 성장을 지지하는 물질이며, 시간이 지나면 이식물을 수용한 환자의 체내로 흡수된다. 이식 방법은 관절경을 이용한 최소한 침입성 또는 개방 외과술에 의한 것일 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 연골 결함의 회복을 위해 적합한 동종 및 이종의 연골세포를 사용하는 것을 고려한다.
도 2는 이러한 이식물을 보여준다. 더욱 상세하게는, 이식가능한 물품(20)에는 연골세포(24)가 보유되어 있는 지지 매트릭스(22)가 포함된다. 적합한 지지 매트릭스(22)는 이식 전후에 이 위에서 연골세포가 성장하도록 하는 시간 동안 안정한 형태로 유지될 수 있고, 연골세포의 천연 환경과 유사한 시스템을 제공하여 연골세포 성장 분화를 최적화시킬 수 있음을 특징으로 하는 고체 또는 겔-유사 골격일 것이다.
지지 매트릭스(22)는 완전한 연골 복구를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 안정적일 것이며 따라서 시간이 지나면, 예컨대, 2 내지 3 개월 내에 어떤 현저한 흔적도 남기거나 독성 분해 생성물 형성시키지 않고 신체에 의해 흡수된다. 용어 "흡수"는 지지 매트릭스가 천연 생물학적 작용에 의해 분해되고, 분해된 지지 매트릭스 및 이들의 분해 생성물이 예컨대, 림프관 또는 혈관을 통해 처리되는 것을 의미한다. 따라서, 바람직하게는 지지 매트릭스(22)는 생리학적으로 흡수될 수 있는 비-항원성 막-유사 물질이다. 또한, 지지 매트릭스(22)는 바람직하게는 하나의 비교적 매끄러운 면(21) 및 하나의 비교적 거친 면(23)을 가진 시트 유사 형태로 존재한다. 예를 들어, 거친 면(23)은 섬유성이며, 전형적으로 연골 결함(18)을 향하고 있고 연골세포 내측성장을 촉진시키는 반면, 매끄러운 면(21)은 전형적으로 연골 결함(18)과 다른 방향을 향하고 있고 조직 내측성장을 방해한다.
하나의 양태에서, 지지 매트릭스(22)는 폴리펩티드 또는 단백질로 형성되어있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 공급원, 예컨대, 포유류로부터 수득된다. 그러나, 천연 공급원으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질과 비슷한 물리적 및 화학적 성질을 가진 인공 물질을 사용하여 지지 매트릭스(22)를 형성시킬 수도 있다. 또한 지지 매트릭스는 가역적으로 변형가능한 것이 바람직한데, 이는 유저(user)에 의해 취급되는 경우 이식가능한 물품(20)이 본 발명의 일면 동안에 조작된 후, 이것의 원래 모양으로 되돌릴 수 있기 때문이다.
지지 매트릭스(22)를 형성시킬 수 있는 바람직한 물질은 말, 돼지, 소, 양 및 닭으로부터 수득된 것과 같은 콜라겐이다. 지지 매트릭스(22)를 형성시킬 수 있는 적합한 물질에는 콘트로-셀(Chondro-Cell)®(시판되는 타입 II 콜라겐 매트릭스 패드, Ed. Geistlich Shne, Switzerland), 및 콘드로-지드(Chondro-Gide)®(시판되는 타입 I 콜라겐 매트릭스 패드, Ed. Geistlich Shne, Switzerland)가 있다. 콜라겐 타입 II 매트릭스도 사용될 수 있지만, 콜라겐 타입 I으로부터 형성된 지지 매트릭스(22)는 콜라겐 타입 II로부터 형성된 지지 매트릭스보다 약간 빳빳하다.
상기 기술된 바와 같이 이식가능한 물품은 예컨대, 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 지지 매트릭스상에 연골세포를 배양시킴으로써 제조될 수 있다.
자가 이식물에 있어서, 연골 생검물을 우선 환자의 관절의 체중이 실리지 않는 영역으로부터 관절경 기술에 의해 수집하고, 20% 우태아 혈청을 함유하고 있는 성장 배지중에 담아 실험실로 옮겼다. 그런 다음, 연골 생검물을 단백질 가수분해 효소이자 결합제인 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 효소를 사용하여 처리함으로써 연골부 연골세포를 단리하고 추출하였다. 그런 다음 추출된 연골세포를 초기 세포 계수치 약 50,000에서부터 연골세포 최종 계수치 약 2 천만 이상까지 성장 배지중에서 배양시켰다.
재이식 3일 전에, 성장 배지를 10% 자가 혈청(즉, 하기 기술하는 바와 같이 환자의 혈액으로부터 추출한 혈청)을 함유하고 있는 이식 배지로 교환하였다. 그런 다음, 상기 이식 배지에서 배양된 연골세포를 지지 매트릭스(22)내로 침지시켜서 지지 매트릭스에 침투시키고, 계속 증대시킴으로써 이식가능한 물품(22)을 형성시켰다. 그런 다음 이식가능한 물품(22)을 환자의 연골 결함 부위(18)에 이식하였다.
결함 또는 손상(18)을 직접 처리하거나 체내이식 전에 조금 확대시키거나 외과술에 의해 조각함으로써 이식가능한 물품(20)이 수용되도록 할 수 있는 것으로 이해되고 있다. 배양 방법 뿐만 아니라 성장 및 이식 배지를 수집된 연골부 생검물을 처리하고 본 발명에 따른 연골세포를 배양하기 위해 사용되는 실험 방법에 대한 설명으로 시작하여 하기 실시예를 통해 상세하게 설명하였다.
배양 과정동안 연골 생검물을 처리하고 연골부 연골세포를 성장시키기 위해 사용되는 성장 배지(이하, "성장 배지")를 2.5 ml 겐토마이신 설페이트(농도 70 마이크로몰/리터), 4.0 ml 암포테리신(농도 2.2 마이크로몰/리터; 상표명 Fungizone®, 스퀴브(Squibb)로부터 이용가능한 항진균제), 15 ml 1-아스코르브산(300 마이크로몰/리터), 100 ml 우태아 혈청(최종 농도 20%) 및 나머지는 DMEM/F12 배지를 서로 혼합함으로써 제조하여 성장 배지 약 400 ml을 생성하였다(또한 동일한 성장 배지를 사용하여 병원으로부터 실험실로 연골부 생검물을 옮겼으며 실험실에서 연골세포를 추출하고 증대시켰다.).
환자로부터 수득된 혈액을 약 3,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 다른 혈액 구성성분으로부터 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 보관하였고 배양 과정 및 이식법의 나중 단계에서 사용하였다.
자가 이식을 위해 환자로부터 앞서 수집된 연골 생검물을 상기 기술된 성장 배지중에 담아 이를 배양시킬 실험실로 옮겼다. 성장 배지를 기울여 따름으로써 연골 생검물을 분리시키고, 실험실에 도착하자 마자 폐기하였다. 그런 다음 연골 생검물을 단순 DMEM/F12중에서 3회 이상 세척함으로써 연골 생검물상의 우태아 혈청의 막을 제거하였다.
그런 다음 연골 생검물을 상기 기술된 성장 배지를 함유하는 조성물중에서 세척하고, 28 ml 트립신 EDTA(농도 0.055)를 첨가하였다. 상기 조성물에서, 5% CO2및 37℃에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션시켰다. 배양 후에, 연골 생검물을 성장 배지중에서 2 내지 3회 세척함으로써 생검물에 어떠한 트립신 효소도 없도록 깨끗이 하였다. 그런 다음 연골을 칭량하였다. 전형적으로, 연골부 연골세포를 성장시키기 위해 필요한 연골의 최소량은 약 80 - 100 mg이다. 200 내지 300 mg과 같이 조금 더 큰 양이 바람직하다. 칭량한 후에, 연골을 약 50 ml 단순 DMEM/F12 배지중의 2 ml 콜라게나제(농도 5,000 효소 유닛; 분해성 효소)의 혼합물중에 위치시키고, 세분화시킴으로써 상기 효소가 연골을 부분적으로 분해시키도록 하였다. 세분화시킨 후에, 세분화된 연골을 깔대기를 사용하여 보틀(bottle)에 넣고, 콜라게나제 및 단순 DMEM/F12 혼합물 약 50 ml을 보틀에 첨가하였다. 그런 다음 세분화된 연골을 5% CO2및 37℃에서 17 내지 21시간 동안 인큐베이션시켰다.
그런 다음 하나의 양태에서, 인큐베이션된 세분화된 연골을 40 μm 메쉬(mesh)를 사용하여 걸러내고, 10분 동안 원심분리(1054 rpm 또는 200 배 중력으로)시키고, 성장 배지를 사용하여 2회 세척하였다. 그런 다음 연골세포를 5% CO2및 37℃에서 2주 이상(이 시간은 성장 배지를 3 내지 4회 교환하는 동안의 시간이다) 성장 배지중에서 인큐베이션시킨 후에 연골세포를 계수함으로써 이들의 생존능력을 결정하였다.
환자에게 재이식하기 적어도 3일 전에, 연골세포를 트립신처리 및 원심분리에 의해 성장 배지로부터 제거하고, 1.25 ml 겐토마이신 설페이트(농도 70 마이크로몰/리터), 2.0 ml 암포테리신(농도 2.2 마이크로몰/리터; 상표명 Fungizone®스퀴브로부터 이용가능한 항균제), 7.5 ml 1-아스코르브산(300 마이크로몰/리터), 25 ml 자가 혈청(최종 농도 10%) 및 나머지는 DMEM/F12 배지를 함유하고 있는 이식 배지로 옮김으로써 약 300 ml의 이식 배지를 생성시켰다.
그런 다음 지지 매트릭스(22)를 NUNCLONTM세포 배양 트레이의 웰의 바닥내에 들어맞는 적절한 크기로 절단한 다음, 무균 조건하에서 1 - 2 ml 이식 배지와함께 웰의 바닥에 위치시켰다. 그런 다음 이식 배지 약 5 - 10 ml중의 충분한 양(예컨대, 3백만 개 내지 천만 개의 연골세포)의 배양된 연골부 연골세포를 지지 매트릭스(22)내로 침지시키고, 5% CO2및 37℃에서 약 72시간 동안 인큐베이션시킴으로써 연골세포가 계속해서 성장하도록 하였다. 이 인큐베이션 동안, 연골세포는 군집을 형성하며 지지 매트릭스(22)에 부착한다. 상기 방법을 사용하여, 지지 매트릭스(22)의 생체역학적 성질의 현저한 손실없이, 지지 매트릭스(22)가 이식가능한 물품(20)을 형성하기에 충분한 수로 지지 매트릭스 상에서의 연골세포의 성장 및 유지를 지지한다는 것이 밝혀졌다. 또한 지지 매트릭스(22)는 연골 결함 부위에 이식가능한 물품의 이식 후에 연골세포의 지속적인 성장을 지지하는 환경을 제공한다.
또 다른 양태에서, 17 내지 21 시간 인큐베이션 기간에 이어서 상기 논의된 바와 같이 세포 계수치 및 생존능력을 결정한 후에, 연골 세포를 이식 배지로 옮긴 다음 2주 이상 지지 매트릭스(22)상에서 직접 성장시켰다.
이식가능한 물품(20)은 일시적으로 지지 매트릭스(22)에 부착되어 있는 연골세포의 기계적인 파괴 또는 손실없이 변형될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 변형은 하기 기술되는 바와 같이 이식가능한 물품(20)이 관절내로 도입되거나 치료하려는 표면상에 위치되는 경우에 완전히 가역적이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 연골세포가 충분한 수로 성장되거나 로딩되는 지지 매트릭스(22)는 일시적으로 이의 연골세포 로드의 기계적인 파괴 또는 손실없이 관절경을 지닌 작업 장치내로 이의 도입을 가능하도록 하는 방식으로 변형될 수 있다.
동시에 상기 매트릭스가 천연 연골 매트릭스 물질의 재생 및 연골세포의 추가적인 인 시튜(in situ) 분화를 손상시키지 않고 연골 결함 영역에 접착제 또는 기계적인 유지 수단에 의해 고정될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 일면은 이식 부위에 이식가능한 물품(20)을 위치시키기 위한 기구 및 이식 부위에 이식가능한 물품(20)을 지탱시키기 위한 기계적 유지 장치를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 이식 방법은 관절경 기술에 의해 수행된다. 도 3은 이식가능한 물품(20)이 관절경 도입기(28)의 작업 채널(26)을 통해 이식 부위로 전달될 수 있도록 하기 위해 어떻게 이식가능한 물품(20)이 이의 지름으로 말림으로써 이식 원통형인 나선형을 형성하는지를 보여준다. 적합한 관절경 도입기를 도 4에 묘사하였다.
도 4에서, 관절경 도입기(30)는 관심있는 관절에 유입하여 원하는 치수의 이식가능한 물품(20)을 전달시키기에 적합한 직경 및 길이를 가진 작업 채널(32)을 포함하고 있다. 예를 들어, 대부분의 방법에 있어서, 작업 채널(32)의 직경은 약 8 내지 20 mm이고, 길이는 약 30 내지 60 cm이다. 작업 채널(32)내에서 그리고 작업 채널에 대해 장방향으로 이동하는 주입 채널(34)은 되돌아올 수 있으면서 제거가능한 니들(36)을 수용하고 있다. 주입 채널(34)은 작업 채널(32)내로 적어도 부분적으로 텔레스코픽(telescopic)하게 하강할 수 있는 핸들(38)에 부착되어 있다. 니들(36)은 주입 채널(34)의 길이를 연장시켜서 유체가 이식 부위를 통과하도록 해준다. 주입 채널(34)은 이식 부위를 향해 또는 이와 반대 방향으로 텔레스코픽하게 이동하는 핸들(38)에 의해 작업 채널(32)내에서 이동된다.
또한 도입기(30)는 고무 또는 다른 적절한 물질로 제조된 캡(40)을 포함하고 있으며, 캡은 도입기(30)상에 활주식으로 결합되어 있다. 사용시에, 캡(40)은 연골 결함 부위를 둘러싸고 있으며, 혈액 및 다른 천연 유체와 같은 유체가 연골 결함 부위내로 흐르는 것을 차단한다. 또한 도입기(30)는 이식가능한 물품을 고정시켜서 이를 이식 부위에 도입시키고 위치시키기 위해 핸들(38)에 부착된, 바깥쪽으로 편향된 그립핑(gripping) 엘리먼트(42)를 2개 이상 가지고 있다. 사용시에, 핸들(38)은 유저(user)를 향해 그리고 반대 방향으로 텔레스코픽하게 이동되므로, 그립핑 엘리먼트(42)는 작업 채널(32)의 내부와 결합되어 있으며 그립핑 방식으로 서로 향하도록 이동되고(핸들(38)이 유저를 향해 이동되는 경우), 그립을 해제시키기 위해 서로 반대방향으로 이동된다(핸들(38)이 유저로부터 반대방향으로 이동되는 경우). 이러한 텔레스코픽 이동은 주입 채널(34) 및 그립핑 엘리먼트(42)가 작업 채널(42)내에서 슬라이딩가능하게 전진하고 되돌아오도록 하는 핸들(38)내에 배치되어 있는 편향 엘리먼트(도시하지 않음)에 의해 제어될 수 있다.
도 5 내지 7은 무릎 관절(10)과 같은 이식 부위에 이식가능한 물품(22)을 이식하기 위한 전형적인 관절경 방법을 보여준다. 결함 연골(18)은 결함 부위로부터, 바람직하게는 웰(46)이 남도록 연골하층(44) 위의 깊이까지 제거된다(도 6 내지 7 참조). 연골 결함(18)이 제거된 후에 결함 부위는 이식가능한 물품(22)을 수용하기 위해 준비된다. 연골하층이 출혈이 이식 부위에서 일어날 정도로 방해되는 경우,상기 부위는 우선 지혈성 배리어로서 작용하는 임의의 흡수성 물질을 사용하여 덮어질 수 있다.
다른 방법으로는, 부위 준비는 니들(36)을 통해 웰(46)내로 생체적합성 아교를 주입시키는 것을 포함할 수 있다. 도 6에서 접착제(48)로서 제시된 이러한 생체적합성 아교는 유기 피브린 아교(예컨대, Tisseel®, 피브린 기재 접착제(Baxter, Austria) 또는 자가 혈액 샘플을 사용하여 외과적으로 제조된 피브린 아교)를 포함할 수 있다.
그런 다음 원하는 치수로 미리 절단하고 도 5에 제시된 바와 같은 나선형 원통 모양으로 말려진 이식가능한 물품(20)을 그립핑 엘리먼트(42)에 의해 그립핑하고 관절경 도입기(30)의 말단내에 고정시켰다. 그런 다음 말단에서 이식가능한 물품(20)을 고정하고 있는 관절경 도입기(30)를 액세스 채널(33)을 통해 이식 부위로 전진시키고, 그립핑 엘리먼트(42)로부터 해제시키고, 그립핑 엘리먼트(42)를 사용하여 펴거나 이것이 작업 채널(32)을 빠져나갈 때 펴지도록 하였다. 액세스 채널(33)은 도입기(30) 및 가시화 기구와 같은 기구들이 이식 부위에 액세스하도록 해주는 하나 이상의 채널들을 포함하고 있다. 그립핑 엘리먼트(42)를 사용하여, 이식가능한 물품(20)의 거친 면(23)이 웰(46)을 향하도록 이식가능한 물품(20)을 조작하고 웰(46)내에 부드럽게 고정되도록 함으로써 접착제(48)가 경화되어 웰(46)내에 이식가능한 물품(20)과 결합하도록 하였다.
또 다른 양태에서(도 7), 흡수성 핀, 앵커, 나사 또는 봉합실과 같은 기계적인 유지 수단들을 사용하여 웰(46)에 이식가능한 물품을 고정시켰다. 적절한 핀(50)에는 Ortho-PinTM(시판되는 락티드 공중합체 핀; Ed. Geistlich Shne, Switzerland)이 포함된다. 도 8은 흡수성 핀(50)의 하나의 양태를 보여준다. 이 양태에서, 핀(50)은 헤드(52), 샤프트(Shaft)(56)내의 인트라메듈라(intramedullar) 채널(54) 및 하나 이상의 유지 링(58)을 포함하고 있다. 핀(50)의 치수는 특정 용도에 따라 다양할 테지만, 전형적으로, 핀(50)은 길이가 약 10 - 15 mm이고, 헤드(52)는 직경이 약 4 mm이고, 인트라메듈라 채널(54)은 직경이 약 1.2 mm이고, 샤프트(56)는 직경이 약 2 mm이고, 유지 링(58)은 직경이 약 2.5 mm이다. 유지 링(58)은 연골 결함을 둘러싸고 있는 건강한 연골내로 핀(50)을 앵커링(anchoring)시키는 역할을 한다. 핀(50)은 신체에 유해하지 않으면서 시간이 지난 후에 신체에 의해 흡수되거나 아니면 분해될 수 있는 임의의 물질로부터 형성된다. 예를 들어, 핀(50)은 폴리락티드로부터 제조될 수 있다.
또한 웰(46)에 이식가능한 물품(20)을 고정시키기 위해 접착체(48) 및 핀(50)과 같은 기계적인 유지 수단을 조합하여 사용하는 것을 본 발명의 범위내에 포함시키고자 한다.
도 6에 제시된 바와 같이, 하나 이상의 채널을 가지는 제 2 액세스 채널을 사용하여 이식 부위에 기구가 액세스하도록 함으로써 이식가능한 물품, 접착제 및/또는 기계적인 유지 수단이 위치되도록 도울수 있거나 기구가 이식 부위에 액세스하거나 가시화되도록 해줄 수 있다. 또한 이러한 개별적인 액세스 채널을 사용함으로써 관절경 도입기(30) 또는 다른 관절경 기구에 대하여 기술된 하나 이상의 기능들을 수행할 수 있다.
상기 지적한 바와 같이, 도 9 및 10에서 제시된 바와 같이, 연골 결함(18)은 연골하층(44) 내로 또는 그 아래로 확장되어 있거나 연골하층 내 또는 그 아래의 연골을 제거할 필요가 있는 경우에는, 상기 방법은 이식가능한 물품(20)의 배치 이전에 웰(46)내에 지혈성 배리어(62)를 위치시키는 것을 포함하도록 변형된다. 지혈성 배리어(62)는 발생중인 연골부내로의 도관 조직, 골세포, 피브로플라스트(fibroplast) 등의 성장 또는 침입을 억제시킨다. 이것은 유리질 연골이 이식 부위에서 성장하도록 해준다고 믿어진다. 적합한 지혈성 배리어는 발생중인 연골내로의 도관형성 및 세포 침입을 억제시킴으로써 연골의 형성을 최적화시키고 결함 부위에서 연골이 완전한 두께로 성장하도록 해줄 것이다. 바람직하게는, 지혈성 배리어는 장기간 동안 안정적이어서 완전하게 연골을 복구시킨 다음, 시간이 지나면 인체에 의해 흡수되거나 아니면 분해될 것이다. 적합한 지혈 배리어는 산화된 재생 멸균 셀룰로오스로 형성된 흡수성 지혈제인 Surgicel®W1912(Ethicon, Ltd., United Kingdom)이다.
상기 기술된 외과용 기구들은 일회용 또는 다용도 재사용가능한 외과용 기구를 제조하기에 적합한 금속 및/또는 플라스틱 또는 실리콘과 같은 임의의 물질로부터 제조된다.
본 발명의 특정한 일면은 다양한 지지 매트릭스와 접촉한 경우의 연골세포의거동을 연구하기 위해 시험관내 시스템을 사용함으로써 예시된다. 이 시험관내 시험은 관절경 방법을 기계적으로 견뎌내기 위한 특정 물질의 능력을 예보해주며, 연골세포 성장 거동에 관한 정보를 또한 제공해준다.
상기 일면 및 본 발명의 다른 일면은 하기 실시예로부터 더욱 잘 이해될 수 있으며, 이는 예시일 뿐 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
연골세포를 CO2인큐베이터내 37℃에서 상기 기술된 성장 배지중에서 3주 동안 성장시키고 베리겐 이식 서비스(Verigen Transplantation Service) ApS(Copenhagen, DK or at University of Lbeck, Lbeck, Germany)의 클래스 100 실험실에서 다루었다. [성장 배지의 다른 조성물들도 연골세포를 배양시키기 위해 사용될 수 있음에 주의하라] 세포를 트립신 EDTA를 사용하여 5 내지 10분 동안 트립신처리하고 Brker-Trk 챔버에서 트립판 블루 생존성 염색을 사용하여 계수하였다. 세포 계수치를 밀리리터당 7.5 x 105연골세포로 조정하였다. 클래스 100 실험실에서 하나의 NUNCLONTM플레이트의 덮개를 열었다.
지지 매트릭스 물질, 상세하게는 Chondro-Gide®콜라겐 막을 NUNCLONTM세포 배양 트레이내의 웰의 바닥에 들어맞는 적절한 크기로 절단하였다. 이 경우에 있어서 약 4 cm 크기의 원판을 무균 조건하에서 웰의 바닥에 위치시켰다.
3주 후에, 연골세포를 성장 배지로부터 상기 기술된 이식 배지로 옮기고, 5ml 이식 배지중의 약 5 x 106연골세포를 지지 매트릭스의 상부에 직접 위치시켜 이의 표면에 걸쳐 분산시켰다. 상기 플레이트를 CO2인큐베이터내 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 이 기간 후, 연골세포는 군집을 형성하였고 지지 매트릭스상에서 성장하기 시작하였으며, 배지를 사용한 세정 또는 매트릭스상에 온화한 압력을 기계적으로 가할 때 조차도 지지 매트릭스로부터 제거시킬 수 없었다.
인큐베이션 기간의 종료시에, 이식 배지를 기울여 따르고 지지 매트릭스상에서 성장한 연골세포를 유지하고 있는 지지 매트릭스를 고정액으로서 첨가된 디메틸아르신산의 0.1M 나트륨 염을 함유하는 2.5% 글루타르알데히드중에서 냉각시켰다. 지지 매트릭스를 조직학적 평가를 위해 사프라닌 O를 사용하여 염색하였다. 이것의 컬러 마이크로사진의 흑백 복사본을 도 11A에 제시하였다. 또한 상기 마이크로사진의 특성을 더욱 잘 예시하기 위해 마이크로사진의 컬러판을 도 11AA로서 제시하였다.
실시예 2
연골세포를 CO2인큐베이터내에서 37℃에서 상기 기술된 성장 배지중에서 3주 동안 성장시키고 베리겐 이식 서비스(Verigen Transplantation Service) ApS(Copenhagen, DK or at University of Lbeck, Lbeck, Germany)의 클래스 100 실험실에서 다루었다. 세포를 트립신 EDTA를 사용하여 5 내지 10분 동안 트립신처리하고 Brker-Trk 챔버에서 트립판 블루 생존성 염색을 사용하여 계수하였다.연골세포 계수치를 밀리리터당 5 x 105연골세포로 조정하였다. 클래스 100 실험실에서 하나의 NUNCLONTM플레이트의 덮개를 열었다.
실시예 1에서와 같이, Chondro-Gide®지지 매트릭스를 NUNCLONTM세포 배양 트레이의 웰의 바닥에 들어맞는 적절한 크기로 절단하였다. 이 경우에 있어서 약 4 cm 직경의 원판을 웰의 바닥위에 무균적 조건하에서 위치시켰다.
3주 후에, 연골세포를 성장 배지로부터 상기 기술된 이식 배지로 옮기고, 5 ml 이식 배지중의 약 5 x 105세포를 지지 매트릭스 상부에 직접 위치시켜 지지 매트릭스의 표면 상에 분산시켰다. 상기 플레이트를 CO2인큐베이터내에서 37℃에서 3주 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 기간의 종료시에, 이식 배지를 기울여 따르고, 지지 매트릭스상에 연골세포를 유지하고 있는 지지 매트릭스를 고정액으로서 첨가된 디메틸아르신산의 0.1M 나트륨 염을 함유하는 2.5% 글루타르알데히드중에서 냉각시켰다. 지지 매트릭스를 조직학적 평가를 위해 사프라닌 O를 사용하여 염색하였다. 면역조직화학에 있어서, 콜라겐 막을 메탄올-아세톤중에서 고정시키고 토끼 항-인간 타입 II 콜라겐 및 마우스 항-인간 아그레칸을 사용하여 아그레칸 및 타입 II 콜라겐에 대해 염색하였다. 1차 항체를 형광 2차 항체를 사용하여 가시화시켰다. 연골세포(24)를 보여주는 이것의 컬러 마이크로사진의 흑백 복사본을 도 11B에 도시하였다. 또한 컬러판을 상기 마이크로사진의 특성을 더욱 잘 예시하기 위해 도 11BB로서 제시하였다.
Chondro-Gide®지지 매트릭스상에서의 3주 배양 기간 동안, 연골세포가 지지 매트릭스상에서 성장하고 증대되어 캐리어의 중앙에 군집을 형성하고 표면을 따라 라이닝(lining)되는 것을 관찰하였다.
실시예 3
연골세포를 CO2인큐베이터내에서 37℃에서 상기 기술된 성장 배지중에서 3주 동안 성장시키고 베리겐 이식 서비스(Verigen Transplantation Service) ApS(Copenhagen, DK or at University of Lbeck, Lbeck, Germany)의 클래스 100 실험실에서 다루었다. 연골세포를 트립신 EDTA를 사용하여 5 내지 10분 동안 트립신처리하고 Brker-Trk 챔버에서 트립판 블루 생존성 염색을 사용하여 계수하였다. 연골세포 계수치를 밀리리터당 5 x 105연골세포로 조정하였다. 클래스 100 실험실에서 하나의 NUNCLONTM플레이트의 덮개를 열었다.
실시예 1에서와 같이, Chondro-Gide®지지 매트릭스를 NUNCLONTM세포 배양 트레이의 웰의 바닥에 들어맞는 적절한 크기로 절단하였다. 이 경우에 있어서 약 4 cm 직경의 원판을 웰의 바닥위에 무균적 조건하에서 위치시켰다.
3주 후에, 연골세포를 성장 배지로부터 상기 기술된 이식 배지로 옮기고, 5 ml 이식 배지중의 약 5 x 106세포를 지지 매트릭스의 상부에 직접 위치시켜 지지 매트릭스의 표면상에 분산시켰다. 상기 플레이트를 CO2인큐베이터내에서 37℃에서 3주 동안 인큐베이션시켰다.
그런 다음 성장된 연골세포를 유지하고 있는 지지 매트릭스를 콜라게나제와 함께 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 연골세포를 유지하고 있는 지지 매트릭스를 원심분리하였다. 세포를 NUNCLONTM플레이트상에 시딩(seeding)하고 일부를 Brker-Trk 챔버에서 트립판 블루 생존성 염색을 사용하여 계수하였다. 이것의 마이크로사진을 도 11C에 제시하였다. 전체 계산된 세포수는 6 x 106이고 생존능력은 95% 이상인 것으로 밝혀졌다.
실시예 4
동물 연구를 독일의 뤼벡 대학교의 시설에서 수행하였다.
4개의 7 mm 직경의 둥근 연골 결함을 양 2마리의 무릎의 연골에서 유발시켰다. 모든 개입을 정맥내주사를 통한 케타니스트/롬푼(Ketanest/Rompun) 전신 마취하에서 수행하였다. 결함을 중앙 대퇴골 과상돌기의 체중 지지 영역의 연골내에 2개의 구멍 및 대퇴부슬개골 관절과 경골대퇴부 관절의 지역에 2개의 구멍을 드릴링함으로써 유입시켰다. 결함의 두 영역에 있어서, 2개의 구멍들중 각각 하나는 뼈위의 연골 및 연골하층의 최고지점을 통해 연장되지만, 각 지역의 나머지 구멍은 연골 및 연골하층의 최고지점을 통해 연장되지 않는다.
동시에 연골의 조각을 양(羊) 무릎의 체중을 지지하지 않는 영역으로부터 수집하였다.
상기 연골로부터 생성된 연골세포를 실시예 3에 따른 지지 매트릭스상에서 6주 동안 성장시켰다.
그런 다음 Chondro-Gide®지지 매트릭스상에 로딩된 연골세포를 관절경 외과술에 의해 이식시켰다. 하나의 양에게서 매트릭스를 피브린 아교를 사용하여 처리된 영역에 접착시킴으로써 고정시키고 다른 양에서는 매트릭스를 본 발명에 따라 상기 기술된 바와 같이 폴리락티드 핀을 사용하여 고정시켰다.
양을 격리시키고 무릎을 고정 붕대로 1주일 동안 유지시켰다.
이후 양을 풀어주어 자유롭게 이동하도록 하였다. 관절에 대한 평가는 결함의 치유, 연골 결함 부위에 세포-지지 매트릭스 이식물의 부착 및 연골 결함 부위에서 연골의 재생을 보여주었다.
상기 논의는 부분적으로 NUNCLONTM플레이트과 같은 유리제품내에서 지지 매트릭스상에 연골세포를 성장시키고 적절한 세포 배양을 위해 필요한 만큼의 성장 배지 또는 이식 배지를 교환해주는 방법에 관한 것이지만, 본 발명은 생물반응기 모델 번호 1302[미누셀 게엠베하 리미티드로부터 이용가능함(MinuCells GMBH Ltd., D-93077 Bad Abbach, Germany)]와 같은 생물반응기내에서 지지 매트릭스상에서 연골세포를 성장시키는 방법도 포함하고 있다. 생물반응기를 사용하여, 일정 유량의 성장 배지 또는 이식 배지가 지지 매트릭스에 의해 통과되며, 연골세포는 예컨대, NUNCLONTM플레이트를 사용할 때 요구되는 것과 같이 매 24 내지 96시간마다 성장 배지 또는 이식 배지를 교체시킬 필요없이 더 빠른 속도로 지지 매트릭스상에서 성장될 수 있다. 이러한 생물반응기를 사용함으로써 생물반응기를 통한 성장 배지 또는 이식 배지의 흐름에 기인하여 연골세포의 각형 성장이 초래된다고 이해되고 있다. 생물반응기내에서 지지 매트릭스상에서 성장된 연골세포의 마이크로사진을 도 11D에 제시하였다.
유리제품 또는 지지 매트릭스상에서 배양되든 간에, 연골세포의 배양은 전체 세포 배양 방법을 위해 성장 배지에서 또는 전체 세포 배양 방법을 위해 이식 배지에서 일어날 수 있다. 즉, 성장 배지로부터 이식 배지로의 연골세포의 이동은 필요치 않다. 연골세포는 연골세포의 특정 조건, 연골세포의 성장 단계 및/또는 환자의 상태에 의존하여 배양 방법중 어떤 시점에서 성장 배지로부터 이식 배지로 옮겨질 수 있으며, 반대의 경우에도 마찬가지이다. 성장 배지 또는 이식 배지에서든 간에, 지지 매트릭스에 충분한 수의 연골세포가 부착하도록 하기 위해 이식 이전에 연골세포를 약 2 내지 3시간 동안 지지 매트릭스내로 침지시켜야 할 필요가 있다.
생물반응기가 사용되지 않는 경우에는, 성장 배지 또는 이식 배지(배양 과정의 특정 단계에서 어느 것이 사용되든 간에)를 예컨대, 세포의 수 및 생존능력에 따라 예컨대 약 24 내지 96시간 마다 교체해야 한다.
본 발명이 본 발명의 특정 양태에 대해 기술하고 있지만, 이에 한정되는 것이 아니다. 대부분의 일반적인 인식에 있어서, 본 발명은 필수적으로 바람직하게는 가용성이고 바람직하게는 생체내에 흡수될 수 있는 지지 매트릭스를 포함하는 어떠한 물품(및 이의 용도)를 포함하며, 지지 매트릭스는 생세포를 위한 지지물로서 역할하고, 생세포는 전형적으로 얼마간의 최소 기간 동안 지지 매트릭스상에서성장되어 부착된다. 이러한 부착은 매트릭스의 표면을 파고드는 세포 성장때문일 수 있다. 바람직하게는, 지지 매트릭스는 생체내로 이식시키기 위해 필요한 조작법과 같은 조작을 용이하도록 하기 위해 이식가능한 물품에 대해 충분한 물리적 일체성을 제공한다.
그러므로 추가되어 있는 청구항들을 상기 기술된 본 발명의 양태들을 포함할 뿐만 아니라 본 발명과 관련되어 당업자에 의해 제조될수 있는 바와 같이 본 발명의 이러한 모든 양태, 변형물 및 등가물을 포함하여 해석하고자 한 것이며, 양태, 변형물 및 등가물은 본 발명의 본질적인 사상 및 범위내에 존재한다.
본 발명에 의해 세포의 성장 및 부착을 지지할 수 있는 지지 매트릭스를 포함하는 이식가능한 물품 및 상기 물품을 이식시켜 이식 위치에서 세포를 재생시키는 방법이 제공된다.

Claims (17)

  1. (a) 동물에 의해 흡수가능한 지지 매트릭스상에 보유되어 있는 연골세포를 포함하고 있는 이식가능한 물품을 제공하는 단계; 및 (b) 연골부 결함 부위에 이식가능한 물품을 고정시키는 단계를 포함하여, 연골 결함 부위에 이식가능한 물품을 이식함으로써 동물의 연골 결함 부위를 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (b) 이전에, 연골 결함 부위로부터 결함 연골을 제거하되, 연골로부터의 출혈을 방지하기에 충분한 연골 물질을 연골 결함 부위에 남겨 두는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 (b) 이전에, 결함 부위 근처에 지혈성 배리어를 위치시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 지지 매트릭스가 연골세포의 성장을 지지할 수 있고, 이식가능한 물품에 물리적 일체성을 제공하여 이의 조작이 용이해지도록 할 수 있는 시트형 부재임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 지지 매트릭스가 폴리펩티드 또는 단백질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 지지 매트릭스가 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 콜라겐이 필수적으로 말, 돼지, 소, 양 및 닭 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 콜라겐이 돼지 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 콜라겐이 콜라겐 타입 I임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 6항에 있어서, 콜라겐이 콜라겐 타입 II임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 지지 매트릭스가 고체 부재임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 지지 매트릭스가 겔-유사물임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 단계 (b)에서 이식가능한 물품이 접착제에 의해 결함 부위에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 접착제가 피브린 아교임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 단계 (b)에서 이식가능한 물품이 흡수성의 기계적 유지 수단에 의해 결함 부위에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 기계적 유지 수단이 핀(pin)임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
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