KR102646948B1 - Method of providing information necessary for diagnosis of acute hypoxic ischemic tissue in small intestine using genetically modified bacteria - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 변형 박테리아를 이용한 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생체발광 분자영상을 통한 생체발광 정도, 분포도 및 살모넬라 티피뮤리움 수의 계수 값에 따라 소장 내 급성 경색의 유무, 범위, 및 그 중증도를 판단에 필요한 정보를 제공할 수 있고, 이를 급성 소장 경색 질환의 정확한 진단, 예후, 치료 효과를 평가할 수 있는 정량적 생체지표로서 활용할 수 있다. 특히, 살모넬라 티피뮤리움을 이용하면 향후 소장 경색의 치료제 또는 다양한 시약을 경색 조직에 선택적으로 운반함으로써 효율적인 약물운반시스템을 구축하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using genetically modified bacteria. Specifically, the present invention can provide information necessary to determine the presence, extent, and severity of acute infarction in the small intestine according to the degree, distribution, and coefficient of Salmonella Typhimurium count through bioluminescence molecular imaging. , this can be used as a quantitative biomarker to evaluate the accurate diagnosis, prognosis, and treatment effect of acute small bowel infarction disease. In particular, it is expected that Salmonella Typhimurium can be used in the future to build an efficient drug delivery system by selectively transporting various reagents or treatments for small intestine infarction to the infarcted tissue.
Description
본 발명은 유전자 조작된 박테리아를 이용한 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using genetically engineered bacteria.
허혈성 장질환은 전 연령대에서 나타날 수 있으며 중장염전, 위장염전, 상장간막동정맥혈전증 등의 질환으로 인해 발생할 수 있으며, 소아에서는 대표적으로 괴사성 장염이 허혈성 장질환에 포함된다. Ischemic bowel disease can occur at all ages and can be caused by diseases such as midgut volvulus, gastrointestinal volvulus, and superior mesenteric sinus vein thrombosis. In children, necrotizing enteritis is typically included in ischemic bowel disease.
이 질환들은 환자의 상태가 악화할 경우 예후가 좋지 못해 사망률이 높은 것으로 보고되고 있고 많은 범위의 장관이 포함될 경우 다량의 장관을 수술적으로 절제해야 하는 위험부담이 크기 때문에 성공적으로 치료를 하더라도 수술 후 단장증후군 (short bowel syndrome)이 합병하여 소장이식을 받아야 하거나 또는 평생 정맥 주사를 맞아야 하는 상태에 이를 수도 있다.These diseases are reported to have a poor prognosis and high mortality when the patient's condition worsens, and when a large area of the intestine is involved, the risk of surgical resection of a large amount of the intestine is high, so even if treated successfully, the Short bowel syndrome may develop into a condition that requires a small intestine transplant or lifelong intravenous injections.
장은 특히 허혈-재관류 손상에 가장 취약한 특성이 있기 때문에 수술을 시행할 때에는 매우 신중한 절제 범위의 결정이 요구된다. 더군다나 허혈성 장질환으로 부분적으로 손상된 장은 혈류가 정상적으로 돌아오더라도 조직 표면의 색깔로 인해 회복이 충분히 되지 않은 것으로 오인할 여지가 높을 수 있다.Because the intestine is particularly vulnerable to ischemia-reperfusion damage, very careful determination of the extent of resection is required when performing surgery. Furthermore, even if blood flow returns to normal in the intestines that are partially damaged due to ischemic bowel disease, there may be a high risk of misconception that recovery is not sufficient due to the color of the tissue surface.
하지만, 현재까지 수술적 재관류 후 혈관내 관류량을 측정하는 방법은 측정치에 대한 객관성과 신뢰도가 높지 않기 때문에 장의 말단 동맥의 맥박 및 장의 색깔에 의해 경험적으로 판단하여 수술을 시행하는 경우가 대부분인 실정이다. However, to date, the method of measuring intravascular perfusion after surgical reperfusion does not have high objectivity and reliability of the measured values, so in most cases, surgery is performed based on empirical judgment based on the pulse of the terminal artery of the intestine and the color of the intestine. .
더군다나 로봇수술 장비 또는 복강경의 시야에서 장 조직 및 혈관의 관류 상태를 정확히 판단하기가 어려운 경우가 종종 발생하는데 현재까지 장 조직의 관류상태를 정확히 평가할 수 있는 방법은 개발되어 있지 않기 때문에 영상 및 객관적 지표를 통해 증명할 수 있는 임상진단방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.Moreover, it is often difficult to accurately determine the perfusion status of intestinal tissue and blood vessels under the view of a robotic surgical device or laparoscope. To date, no method has been developed to accurately evaluate the perfusion status of intestinal tissue, so images and objective indicators have not been developed. There is an urgent need for a clinical diagnosis method that can be proven through .
전임상 시험 시 주로 이용되는 비침습적 영상법으로 자기공명영상법Microscopic (Magnetic Resonance Imaging; 이하, MRI), 컴퓨터단층촬영 (Computed Tomography; 이하, CT), 양전자 단층촬영 (Positron Emission Tomography; 이하, PET), 초음파 (Ultrasonography) 등이 이용되고 있다. 이러한 비침습적 영상 기술들은 병변 부위의 해부 및 생리학적인 특성 또는 병변의 크기를 영상으로 보여줌으로써, 질병의 악화 정도 또는 치료 효과의 정도를 결정하는데 매우 유용하게 사용되고 있다. Non-invasive imaging methods mainly used in preclinical testing include magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), and positron emission tomography (PET). , Ultrasonography, etc. are used. These non-invasive imaging technologies are very useful in determining the degree of worsening of a disease or the degree of treatment effectiveness by showing the anatomical and physiological characteristics of the lesion site or the size of the lesion through images.
그러나 질병의 발생 및 진행과정에 있어서 가시적으로 나타나는 해부학적 변화의 경우, 질병이 상당히 진행된 시점에서 나타나는 것으로서, 그보다 훨씬 이전 시점에 나타나는 조직내의 변화들을 정성 또는 정량적으로 영상화 할 수 있어야만, 질병의 조기 진단과 치료 효과의 정확한 판정이 가능해진다. However, in the case of anatomical changes that are visible during the development and progression of a disease, they appear when the disease has progressed considerably, and only when qualitative or quantitative imaging of changes in the tissue that appear at a much earlier time point can be made for early diagnosis of the disease. It becomes possible to accurately determine the effectiveness of treatment.
이러한 이유로 기존의 비침습적 영상기법이 분자영상으로 그 영역을 확대하고 있다. 특히, 광학분자영상은 생체에서 발광하는 광학적 특성을 이용하여 영상을 획득하는 방법으로서 다른 분자 영상기법보다 저렴하면서 빠르게 영상을 획득할 수 있다는 장점을 가지고 있어 주목 받고 있는데 이 가운데 루시퍼레이즈 (luciferase)를 이용하여 생체 내에서 발광하는 빛을 관찰하고 분석이 가능한 생체발광 분자영상 (bioluminescent imaging)이 많이 사용되고 있다.For this reason, existing noninvasive imaging techniques are expanding their scope to molecular imaging. In particular, optical molecular imaging is a method of acquiring images using the optical properties of light emission in living organisms, and is attracting attention because it has the advantage of being able to acquire images faster and cheaper than other molecular imaging techniques. Among these, luciferase is used. Bioluminescent molecular imaging, which can observe and analyze light emitted within the living body, is widely used.
이에 본 발명자들은 유전자 조작된 박테리아를 이용한 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 하였으며, 구체적으로는, 생체발광 분자영상기법을 이용하여 급성 소장 경색 모델을 대상으로 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움을 이용하여 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직을 영상화함으로써 선택적으로 허혈성 장 조직을 진단하기 위한 방법을 제공하고자 하였다. Accordingly, the present inventors attempted to provide a method of providing the information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using genetically engineered bacteria. Specifically, the present inventors attempted to provide a method of providing the information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using genetically engineered bacteria. Specifically, the present inventors attempted to provide a method for detecting genes in an acute small intestine infarction model using bioluminescence molecular imaging techniques. We attempted to provide a method for selectively diagnosing ischemic intestinal tissue by imaging acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using engineered Salmonella Typhimurium.
이에, 본 발명의 목적은 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, the purpose of the present invention is to provide a method for providing the information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine.
본 발명은 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공에 관한 것이다.The present invention relates to providing a method for providing information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine.
구체적으로, 본 발명은 생체발광 분자영상을 통한 생체발광 정도, 분포도 및 살모넬라 티피뮤리움 수의 계수 값에 따라 소장 내 급성 경색의 유무, 범위, 및 그 중증도를 판단에 필요한 정보를 제공할 수 있고, 이를 급성 소장 경색 질환의 정확한 진단, 예후, 치료 효과를 평가할 수 있는 정량적 생체지표로서 활용할 수 있다.Specifically, the present invention can provide information necessary to determine the presence, extent, and severity of acute infarction in the small intestine according to the degree, distribution, and coefficient of Salmonella Typhimurium count through bioluminescence molecular imaging. , this can be used as a quantitative biomarker to evaluate the accurate diagnosis, prognosis, and treatment effect of acute small bowel infarction disease.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 예는 다음 단계를 포함하는 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:One example of the present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine comprising the following steps:
급성 저산소성 허혈성 조직 시료에서 정량적 분석 지표를 획득하는 획득 단계; 및An acquisition step of acquiring quantitative analysis indicators from an acute hypoxic ischemic tissue sample; and
획득된 정량적 분석 지표를 분석하는 분석 단계.Analysis step to analyze the obtained quantitative analysis indicators.
본 발명에 있어서 정량적 분석 지표는 생체발광신호인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the quantitative analysis indicator may be a bioluminescence signal, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 정량적 분석 지표는 경색 질환의 진행 정도 및 분포도로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the quantitative analysis index may be one or more selected from the group consisting of the degree of progression and distribution of infarct disease, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 생체발광신호는 생체발광신호 영상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the bioluminescence signal may be a bioluminescence signal image, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 획득 단계는 생체발광 분자영상을 CCD 카메라를 이용하여 저산소성 허혈성 조직을 영상화하는 영상화 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the acquisition step may include, but is not limited to, an imaging step of imaging hypoxic ischemic tissue using a CCD camera to obtain bioluminescent molecular images.
본 발명에 있어서 영상화 단계는 30 내지 300 초, 30 내지 270 초, 30 내지 240 초, 30 내지 210 초, 30 내지 180 초, 30 내지 150 초, 30 내지 120 초, 30 내지 900 초, 30 내지 60 초 동안 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 30 초 동안 수행하는 것일 수 있다. CCD (charged coupled device = 전자결합소자)는 광원으로부터 방사된 광자들이 광전효과에 의해 광전자를 생성함으로써 신호를 획득하는데 CCD 카메라를 상기 시간 동안 노출하였을 때가 전자결합소자에 도달하는 광자의 수가 최적화된다.In the present invention, the imaging step is 30 to 300 seconds, 30 to 270 seconds, 30 to 240 seconds, 30 to 210 seconds, 30 to 180 seconds, 30 to 150 seconds, 30 to 120 seconds, 30 to 900 seconds, and 30 to 60 seconds. It may be performed for seconds, for example, 30 seconds. CCD (charged coupled device = electronically coupled device) acquires signals by generating photoelectrons through the photoelectric effect of photons emitted from a light source. When the CCD camera is exposed for the above time, the number of photons reaching the electronically coupled device is optimized.
본 발명에 있어서 분석 단계는 생체발광신호를 정량적으로 계산하는 계산 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the analysis step may include, but is not limited to, a calculation step of quantitatively calculating the bioluminescence signal.
본 발명에 있어서 계산 단계는 생체발광신호를 정량적으로 계산함으로써 정량적 진단 생체지표를 제공할 수 있다.In the present invention, the calculation step can provide a quantitative diagnostic biomarker by quantitatively calculating the bioluminescence signal.
본 발명에 있어서 정보를 제공하는 방법은 시료의 박테리아 수를 계수하는 재검증 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the method of providing information may additionally include a re-verification step of counting the number of bacteria in the sample, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 계수 단계의 시료는 소장 내 경색부위인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the sample in the counting step may be an infarcted area within the small intestine, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 시료는 박테리아를 주입한 후 12시간 내지 24시간 후의 시료인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the sample may be a sample 12 to 24 hours after injection of bacteria, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 박테리아는 절대적 혐기성 또는 조건적 혐기성 박테리아인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the bacteria may be obligate anaerobic or facultative anaerobic bacteria, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서 박테리아는 살모넬라인 것일 수 있으며, 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the bacteria may be Salmonella, for example, Salmonella Typhimurium, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 박테리아는 유전자 조작된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the bacteria may be genetically engineered, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서 유전자 조작된 박테리아는 ppGpp (Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphospate) 합성능이 결여된 박테리아인 것일 수 있으며, 예를 들어, ppGpp 씬세타아제를 코딩하는 불활성화된 (inactivated) relA 유전자 또는 spoT 유전자를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the genetically engineered bacteria may be bacteria lacking the ability to synthesize ppGpp (Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphospate), for example, an inactivated relA gene encoding ppGpp cinsetase. Alternatively, it may contain the spoT gene.
본 발명에 있어서 유전자 조작된 박테리아는 도 1의 계열지도를 가진 플라스미드가 도입된 박테리아인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the genetically engineered bacteria may be bacteria into which a plasmid with the family map of Figure 1 has been introduced, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서 유전자 조작된 박테리아는 생체발광 리포터 유전자가 도입된 것일 수 있으며, 예를 들어, 루시퍼라아제 유전자 (lux)가 도입된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the genetically engineered bacteria may be those into which a bioluminescence reporter gene has been introduced, for example, a luciferase gene (lux) may be introduced, but are not limited thereto.
본 발명은 유전자 변형 박테리아를 이용한 소장 내 급성 저산소성 허혈성 조직 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생체발광 분자영상을 통한 생체발광 정도, 분포도 및 살모넬라 티피뮤리움 수의 계수 값에 따라 소장 내 급성 경색의 유무, 범위, 및 그 중증도를 판단에 필요한 정보를 제공할 수 있고, 이를 급성 소장 경색 질환의 정확한 진단, 예후, 치료 효과를 평가할 수 있는 정량적 생체지표로서 활용할 수 있다. 특히, 살모넬라 티피뮤리움을 이용하면 향후 소장 경색의 치료제 또는 다양한 시약을 경색 조직에 선택적으로 운반함으로써 효율적인 약물운반시스템을 구축하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine using genetically modified bacteria. Specifically, the present invention can provide information necessary to determine the presence, extent, and severity of acute infarction in the small intestine according to the degree, distribution, and coefficient of Salmonella Typhimurium count through bioluminescence molecular imaging. , this can be used as a quantitative biomarker to evaluate the accurate diagnosis, prognosis, and treatment effect of acute small bowel infarction disease. In particular, it is expected that Salmonella Typhimurium can be used in the future to build an efficient drug delivery system by selectively transporting various reagents or treatments for small intestine infarction to the infarcted tissue.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Renilla 루시퍼라아제의 특정 변이체인 Rluc8을 포함하는 박테리아 발현 플라스미드의 구조도이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 백서의 소장 내 허혈을 2, 3 및 4시간 유도하여 관찰한 사진이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 소장 부위 별로 2, 3 및 4 시간 허혈을 유도한 후 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움을 주입과 동시에 12시간 재관류 후 급성 저산소성 허혈성 조직을 이미징하여 생체발광 분포도를 나타낸 사진이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따라 소장 부위 별로 2, 3 및 4 시간 허혈을 유도한 후 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움을 주입과 동시에 24시간 재관류 후 급성 저산소성 허혈성 조직을 이미징하여 생체발광 분포도를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 sham 모델 및 급성 소장경색 모델을 대상으로 생체발광신호(p/s/cm2/sr)의 세기를 허혈 유도 시간별 및 재관류 시간별로 각각 측정하여 통계적으로 분석 평가한 결과 그래프이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 sham 모델 및 급성 소장경색 모델을 대상으로 박테리아 수(CFU/g)를 허혈 유도 시간별 및 재관류 시간별로 각각 측정하여 통계적으로 분석 평가한 결과 그래프이다.Figure 1 is a structural diagram of a bacterial expression plasmid containing Rluc8, a specific variant of Renilla luciferase, according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a photograph observed by inducing ischemia in the small intestine of a white paper for 2, 3, and 4 hours according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows bioluminescence by injecting genetically engineered Salmonella Typhimurium and simultaneously imaging acute hypoxic ischemic tissue after 12 hours of reperfusion after inducing ischemia for 2, 3, and 4 hours in each small intestine area according to an embodiment of the present invention. This is a photo showing the distribution.
Figure 4 shows bioluminescence by inducing ischemia for each small intestine area for 2, 3, and 4 hours according to an embodiment of the present invention, followed by injection of genetically engineered Salmonella Typhimurium and imaging acute hypoxic ischemic tissue after 24 hours of reperfusion. This is a photo showing the distribution.
Figure 5 shows statistical analysis by measuring the intensity of the bioluminescence signal (p/s/cm 2 /sr) for each ischemia induction time and reperfusion time for the sham model and the acute small bowel infarction model according to an embodiment of the present invention. This is a graph of the evaluation results.
Figure 6 is a graph showing the results of statistical analysis by measuring the number of bacteria (CFU/g) for each ischemia induction time and reperfusion time for the sham model and the acute small bowel infarction model according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움Example 1. Genetically Engineered Salmonella Typhimurium
1-1. 플라스미드1-1. plasmid
pBAD-pelB-RLuc8 플라스미드는 다음과 같이 제작되었다. Renilla 루시퍼라아제의 특정 변이체인 Rluc8을 8개의 선호적 변이 (favorable mutations)들의 조합으로 제조한 후, pBAD/Myc-His A 플라스미드에 삽입시켰다. pelB (pectate lyase) 리더 서열을 루시퍼라이제 유전자의 N-말단에 첨가하였다. 플라스미드 구조도를 도 1 에 나타내었다. The pBAD-pelB-RLuc8 plasmid was constructed as follows. Rluc8, a specific variant of Renilla luciferase, was prepared by combining eight favorable mutations and then inserted into pBAD/Myc-His A plasmid. The pelB (pectate lyase) leader sequence was added to the N-terminus of the luciferase gene. The plasmid structure diagram is shown in Figure 1.
1-2. 박테리아 균주1-2. bacterial strain
경색 부위 타겟팅하기 위해 유전자 조작된 S. typhimurium 박테리아(△ppGpp, SHJ2037(relA::cat, spot::kn))는 ppGpp (Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphospate) 합성능이 결여된 변이체이다. ppGpp 합성에 관여하는 가장 중요한 단백질은 ppGpp 씬세타아제 (synthetase)로서, 이를 코딩하는 유전자는 relA 유전자 및 spoT 유전자를 포함한다. ppGpp 합성능이 결여된 변이체는 ppGpp 합성을 위한 ppGpp 씬세타아제를 코딩하는 불활성화된 (inactivated) relA 유전자 또는 spoT 유전자를 포함한다. ppGpp 합성 결여는 본 발명의 박테리아가 경색 부위로 타겟팅 하는 데에 있어서 결정적인 기여를 한다. 50 ㎍/mL 카나마이신(Sigma)이 포함된 LB배지 (Luria-Bertani broth)의 37℃에서 살모넬라를 성장시켰고, 생체발광이미징을 위하여 상기 △ppGpp 박테리아를 생체발광 리포터 유전자로 형질전환시켰다. S. typhimurimu-Xen26 (Xenogen-Caliper)의 박테리아 루시퍼라아제 유전자(lux)를 P22HT int transduction 방법에 의해 SHJ2037 균주에 도입시켰다. 상기 균주를 50 ㎍/mL 카나마이신(Sigma)이 포함된 LB배지 에서 배양하였다. pBAD-pelB-RLuc8 플라스미드를 SHJ2037 균주에 전기 충격법 (electroporation method)을 이용하여 형질전환시켰다. 20 ㎍/mL 암피실린이 포함된 LB배지 상에서 성장하는 콜로니를 선별하였다. The S. typhimurium bacterium (△ppGpp, SHJ2037(relA::cat, spot::kn)), which was genetically engineered to target the infarct area, is a mutant lacking the ability to synthesize ppGpp (Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphospate). The most important protein involved in ppGpp synthesis is ppGpp synthetase, and the genes encoding it include the relA gene and the spoT gene. Mutants lacking ppGpp synthesis ability include an inactivated relA gene or spoT gene, which encodes ppGpp cinsetase for ppGpp synthesis. The lack of ppGpp synthesis contributes critically to the targeting of the bacteria of the present invention to the infarct site. Salmonella was grown at 37°C in LB medium (Luria-Bertani broth) containing 50 μg/mL kanamycin (Sigma), and for bioluminescence imaging, the △ppGpp bacteria were transformed with a bioluminescence reporter gene. The bacterial luciferase gene (lux) from S. typhimurimu-Xen26 (Xenogen-Caliper) was introduced into strain SHJ2037 by the P22HT int transduction method. The strain was cultured in LB medium containing 50 μg/mL kanamycin (Sigma). The pBAD-pelB-RLuc8 plasmid was transformed into SHJ2037 strain using the electroporation method. Colonies growing on LB medium containing 20 μg/mL ampicillin were selected.
실시예 2. 동물 모델의 제조Example 2. Preparation of animal model
2-1. 대조군 모델 제조2-1. Control model preparation
대조군 모델로서 백서 (Sprague-Dawley, 체중 331 내지 340 g)를 마취한 후 복벽에 약 2cm 정도의 incision을 통해 소장을 밖으로 노출시킨 후 상장간동맥 (superior mesenteric artery)을 혈관 겸자 (vascular clamps)로 결찰하지 않은 상태를 유지하였다. As a control model, a white paper (Sprague-Dawley, body weight 331 to 340 g) was anesthetized, the small intestine was exposed through an incision of approximately 2 cm in the abdominal wall, and the superior mesenteric artery was ligated using vascular clamps. It was maintained as not.
2-2. 급성 소장 경색 모델 제조2-2. Acute small bowel infarction model fabrication
백서 (Sprague-Dawley, 체중 331 내지 340 g)를 마취한 후 복벽에 약 2cm 정도의 절개 (incision)를 통해 소장을 밖으로 노출시킨 후, 일정 간격으로 세 부위별 서로 다른 경색의 정도를 유도하기 위해 상장간동맥 (superior mesenteric artery)을 혈관 겸자로 2, 3 및 4 시간 동안 각각 결찰하여 장간막 혈관으로부터의 혈류 공급을 차단하였다. 이후 결찰된 혈관 겸자를 제거하고 재관류 12 및 24 시간 동안 소장에 재관류를 시킨 후 허혈성-재관류 손상 정도를 평가하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.After anesthetizing a white paper (Sprague-Dawley, body weight 331 to 340 g), the small intestine was exposed through an incision of approximately 2 cm in the abdominal wall, and then the small intestine was exposed at regular intervals to induce different degrees of infarction in each of the three areas. The superior mesenteric artery was ligated with vascular forceps for 2, 3, and 4 hours, respectively, to block the blood supply from the mesenteric vessels. Afterwards, the ligated blood vessel forceps were removed and the small intestine was reperfused for 12 and 24 hours. The degree of ischemic-reperfusion damage was evaluated, and the results are shown in Figure 2.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 2시간 혈관 결찰 후 허혈성-재관류 손상 부위에서는 focal loss of surface epithelium 및 mucosal infarction이 관찰되었고, 3시간 혈관 결찰 후 조직 손상 부위에서는 submucosal infarction과 mural infarction이 주로 관찰되었다. 4시간 혈관 결찰 후에는 손상된 조직에서 transmural infarction이 주로 관찰되었으므로, 이러한 조직병리학적 검사 결과를 통해 본 발명의 목적에 적합한 급성 소장 내 중증도별 경색 모델이 제작되었음을 확인하였다. As can be seen in Figure 2, focal loss of surface epithelium and mucosal infarction were observed in the ischemia-reperfusion injury area after 2 hours of vessel ligation, and submucosal infarction and mural infarction were mainly observed in the tissue damage area after 3 hours of vessel ligation. Since transmural infarction was mainly observed in the damaged tissue after 4 hours of vascular ligation, it was confirmed through the results of these histopathological examinations that a severity-specific acute small intestine infarction model suitable for the purpose of the present invention was created.
실시예 3. 생체발광 분자영상 획득Example 3. Acquisition of bioluminescent molecular images
허혈 유도 후 재관류 시작과 동시에 동물 모델의 꼬리정맥에 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움 (2 X 104 CFU)을 주입한 후 재관류 12 및 24 시간 시점에서 박테리아의 생체발광을 영상화하기 위하여 CCD (charged couple detector) 카메라가 장착된 IVIS (Berthold Technologies, Germany)의 빛 차단 챔버에 마취된 살아있는 동물을 놓았다. 루시퍼라아제-발현 박테리아로부터 방출되는 광자를 수집하고 1분에 걸쳐 통합하였다. Living Image software (XenogenCaliper, Hopkinton, MA)를 이용하여 광자 카운트를 나타내는 슈도컬러 이미지를 마우스의 사진 상에 겹치도록 하였다. 목적한 부위 (ROI)를 시그널 세기 상에서 선별하였다. ROI 부위를 일정하게 유지하고 ROI에서의 최대값(p/s/cm2/sr)으로 세기를 기록하여, 그 결과를 도 3 내지 도 4에 나타내었다. Genetically engineered Salmonella Typhimurium ( 2 Anesthetized live animals were placed in a light-blocking chamber of IVIS (Berthold Technologies, Germany) equipped with a detector camera. Photons emitted from luciferase-expressing bacteria were collected and integrated over 1 minute. A pseudocolor image representing photon counts was superimposed on the photograph of the mouse using Living Image software (XenogenCaliper, Hopkinton, MA). The region of interest (ROI) was selected on signal intensity. The ROI area was kept constant and the intensity was recorded at the maximum value (p/s/cm 2 /sr) in the ROI, and the results are shown in Figures 3 and 4.
도 3 내지 도 4에서 확인할 수 있듯이, 생체발광신호 세기가 허혈 4 시간 유도 및 재관류 24시간에서 급격하게 증가한 양상을 보여 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움이 저산소성 허혈성 조직을 선택적으로 타겟팅하여 군집을 형성하고 성장한 것을 확인할 수 있었고, 이는 급성 소장 경색의 증상이 심각한 것으로 판단할 수 있었다. As can be seen in Figures 3 and 4, the bioluminescence signal intensity rapidly increased at 4 hours of ischemia and 24 hours of reperfusion, showing that the genetically engineered Salmonella Typhimurium selectively targets hypoxic ischemic tissues to form colonies. It was confirmed that the patient had grown and that the symptoms of acute small bowel infarction were severe.
실시예 4. 소장 내 경색 부위에 대한 정량적 분석 지표 Example 4. Quantitative analysis index for infarction area in the small intestine
4-1. 생체발광신호 측정4-1. Bioluminescence signal measurement
소장 내 세 부위에서 2, 3 및 4 시간 동안 각각 허혈을 유도 후 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움을 주입과 동시에 12 및 24 시간 재관류 후 허혈성-재관류 손상의 정도를 진행 단계별로 생체발광 정도의 세기를 측정하고 박테리아 수를 계수함으로써 급성 저산소성 허혈성 조직에 대한 정량적 생체지표를 제공할 수 있었다. 먼저, 2, 3 및 4 시간 동안 허혈을 유도한 후 재관류 12 및 24 시간 후에 생체발광신호(p/s/cm2/sr)를 측정하여, 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타내었다.After inducing ischemia in three areas of the small intestine for 2, 3, and 4 hours, respectively, genetically engineered Salmonella Typhimurium was injected, and after 12 and 24 hours of reperfusion, the degree of ischemia-reperfusion damage was measured and the intensity of bioluminescence was measured at each stage. By measuring and counting the number of bacteria, it was possible to provide a quantitative biomarker for acute hypoxic ischemic tissue. First, ischemia was induced for 2, 3, and 4 hours, and then bioluminescence signals (p/s/cm 2 /sr) were measured 12 and 24 hours after reperfusion, and the results are shown in Figure 5 and Table 1.
도 5 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 재관류 12 시간보다 재관류 24 시간 후의 생체발광신호가 급격히 증가하였다. 또한, 허혈 유도 시간에 따라 생체발광신호가 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 허혈-재관류 손상에 따라 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움이 급성 저산소성 허혈성 조직에 선택적으로 군집하고 성장함으로써 생체발광신호의 세기에 따라 허혈성 장 손상의 중증도를 정량적으로 판단할 수 있는 정보를 제공하였다.As can be seen in Figure 5 and Table 1, the bioluminescence signal increased sharply after 24 hours of reperfusion than after 12 hours of reperfusion. In addition, it was confirmed that the bioluminescence signal significantly increased depending on the ischemia induction time. This provides information that can quantitatively determine the severity of ischemic intestinal damage according to the intensity of the bioluminescence signal by selectively colonizing and growing genetically engineered Salmonella Typhimurium in acute hypoxic ischemic tissue in response to ischemia-reperfusion injury. .
4-2. 박테리아 수 측정4-2. Bacteria count measurement
그 다음, 생체발광신호를 측정했던 소장 내 세 경색 부위를 채취하여 박테리아 수를 계수하여, 그 결과를 도 6 및 표 2에 나타내었다.Next, the three infarcted areas in the small intestine where bioluminescence signals were measured were collected and the number of bacteria was counted, and the results are shown in Figure 6 and Table 2.
도 6 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 재관류 12시간보다 재관류 24시간 후의 박테리아 수가 급격히 증가하였고, 또한 허혈 유도 시간에 따라 박테리아 수가 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 6 and Table 2, the number of bacteria increased rapidly 24 hours after reperfusion compared to 12 hours after reperfusion, and it was also confirmed that the number of bacteria significantly increased depending on the ischemia induction time.
결론적으로, 이를 통해 소장 내 급성 경색 질환에 있어서 유전자 조작된 Salmonella typhimurium의 군집과 성장을 통해 경색 질환의 진행 정도 및 분포도를 한 눈에 파악할 수 있었고, 정량적 분석에 따른 차별화된 진단 생체지표(quantitative biomarker)를 제공함으로써 급성 소장 경색 부위를 정확히 진단하고 예후를 판단하는데 중요한 단서를 제공하였다.In conclusion, through this, the degree of progression and distribution of infarction disease could be identified at a glance through the colony and growth of genetically engineered Salmonella typhimurium in acute infarction disease in the small intestine, and a differentiated diagnostic biomarker based on quantitative analysis was used. ) provided important clues in accurately diagnosing the area of acute small bowel infarction and determining prognosis.
소결 sintering
본 발명은 소장을 일정간격으로 거리를 두고 세 부위로 나눈 후 각각 2시간, 3시간, 4시간 동안 허혈을 유도한 후 유전자 조작된 Salmonella typhimurium을 주입과 동시에 12시간 및 24시간 재관류 후 각 경색 부위의 진행 단계별로 생체발광 정도 및 분포도를 영상화함으로써 급성 저산소성 허혈성 조직을 진단 및 예후판단에 관한 생체발광영상 및 정량적 생체지표를 제공함으로써 소장 내 급성경색에 대한 정확한 진단이 가능한 방법을 제공하고자 하였다.The present invention divides the small intestine into three parts at regular intervals, induces ischemia for 2 hours, 3 hours, and 4 hours, respectively, and then injects genetically modified Salmonella typhimurium and reperfuses each infarcted area for 12 hours and 24 hours. By imaging the degree and distribution of bioluminescence at each stage of progression, we aimed to provide a method for accurate diagnosis of acute infarction in the small intestine by providing bioluminescence images and quantitative biomarkers for diagnosis and prognosis of acute hypoxic ischemic tissue.
본 발명은 허혈 유도 후 재관류 12시간 손상에서 생체발광신호(p/s/cm2/sr) 세기가 표준값 (2시간에서 획득한 생체발광신호) 대비 3시간 허혈 유도시 94% 정도로 증가하였고, 4시간 허혈 유도 시 289% 정도로 증가하였다. 연속적으로 재관류 24시간 손상에서 생체발광신호 세기가 표준값 대비 3시간 허혈 유도 시 886% 정도로 증가하였고, 4시간 허혈 유도 시 1,501% 정도로 급격히 증가하였다. 이를 통해 재관류 24시간 손상이 재관류 12시간 손상보다 훨씬 더 심한 경색증을 보이는 것으로 판단할 수 있고, 허혈 유발이 4시간 진행된 경우 또한 심한 경색증을 보이는 것을 알 수 있다. In the present invention, the intensity of the bioluminescence signal (p/s/cm 2 /sr) in the 12-hour reperfusion injury after inducing ischemia increased by about 94% when inducing ischemia for 3 hours compared to the standard value (bioluminescence signal obtained at 2 hours), 4 It increased to about 289% when temporal ischemia was induced. In 24 hours of continuous reperfusion, the bioluminescence signal intensity increased to about 886% of the standard value when ischemia was induced for 3 hours, and rapidly increased to about 1,501% when ischemia was induced for 4 hours. Through this, it can be determined that damage at 24 hours of reperfusion shows much more severe infarction than damage at 12 hours of reperfusion, and that severe infarction is also seen when ischemia is induced for 4 hours.
박테리아 수를 측정해 보았을 때 재관류 12시간 손상에서 박테리아 수(CFU/g)가 표준값 대비 3시간 허혈 유도시 151% 정도로 증가하였고, 4시간 허혈 유도시 319% 정도로 증가하였다. 연속적으로 재관류 24시간 손상에서 박테리아 수가 표준값 대비 3시간 허혈 유도시 1,256% 정도로 증가하였고, 4시간 허혈 유도시 2,043% 정도로 급격히 증가하였다. 이를 통해 재관류 24시간 손상이 재관류 12시간 손상보다 훨씬 더 심한 경색증을 보이는 것으로 판단할 수 있고, 허혈 유발이 4시간 진행된 경우 또한 심한 경색증을 보이는 것으로 고려할 수 있다.When measuring the number of bacteria, the number of bacteria (CFU/g) in 12-hour reperfusion injury increased to about 151% when ischemia was induced for 3 hours compared to the standard value, and increased to about 319% when ischemia was induced for 4 hours. In 24 hours of continuous reperfusion, the number of bacteria increased to about 1,256% of the standard value when ischemia was induced for 3 hours, and rapidly increased to about 2,043% when ischemia was induced for 4 hours. Through this, it can be judged that damage at 24 hours of reperfusion shows much more severe infarction than damage at 12 hours of reperfusion, and if ischemia is induced for 4 hours, it can also be considered to show severe infarction.
통계statistics
본 발명의 후처리 통계학적 분석에 있어서 모든 측정치는 평균±표준오차로 표시하며, 자료의 통계학적 분석은 클러스칼 월리스 검증(Kruskal-Wallis one-way analysis of variance)을 적용하였고 통계값 0.05 미만을 유의한 것으로 평가하였다.In the post-processing statistical analysis of the present invention, all measurements are expressed as mean ± standard error, and the Kruskal-Wallis one-way analysis of variance was applied to the statistical analysis of the data, and a statistical value of less than 0.05 was applied. It was evaluated as significant.
Claims (13)
급성 저산소성 허혈성 조직 시료에서 정량적 분석 지표를 획득하는 획득 단계; 및
획득된 정량적 분석 지표를 분석하는 분석 단계로서,
상기 시료는 유전자 조작된 살모넬라 티피뮤리움 박테리아를 주입한 후의 시료이고,
상기 정량적 분석 지표는 생체발광신호이며,
상기 분석 단계는 상기 생체발광신호를 정량적으로 계산하는 계산 단계를 포함한다.A method that provides the information needed to diagnose acute hypoxic ischemic tissue in the small intestine, including the following steps:
An acquisition step of acquiring quantitative analysis indicators from an acute hypoxic ischemic tissue sample; and
As an analysis step of analyzing the obtained quantitative analysis indicators,
The sample is a sample after injection of genetically engineered Salmonella Typhimurium bacteria,
The quantitative analysis indicator is a bioluminescence signal,
The analysis step includes a calculation step of quantitatively calculating the bioluminescence signal.
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2021
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