KR102625416B1 - 항-인자 ix 파두아 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명에 제공된 것은 항-인자 IX 파두아 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 관련된 폴리펩타이드, 컨쥬게이트 및 키트 또한 제공된다. 본 발명은 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법에 사용될 수 있다.

Description

항-인자 IX 파두아 항체{ANTI-FACTOR IX PADUA ANTIBODIES}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라서 2016년 5월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/337,118 및 2016년 5월 24일에 출원된 62/340,834에 대해 우선권을 주장하며, 둘 다 또는 이들의 전체가 참고문헌으로서 본 발명에 인용된다.

전자적으로 제출된 내용의 참고문헌에 의한 인용

이의 전체가 참고문헌으로서 인용된 것은 본 명세서와 동시에 제출된 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록이며, 하기와 같이 확인된다: 2016년 5월 16일에 생성된, “50573_SeqListing.txt”로 명명된 28,804 byte ACII (Text) 파일.

배경

혈우병에 대한 미래 치료 옵션으로서 큰 가능성을 지닌다. 한 임상 시험에서, 심각한 혈우병 B를 가진 대상이 FⅨ의 항진-기능성 변이체인, 성숙한 펩타이드 서열의 338 위치 (또는 전단백질전구물질(preproprotein) 서열의 384 위치)에서 Arg가 Leu으로 단일 아미노산 치환된 인자 IX (FⅨ) 파두아를 암호화하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로 처리된다. 전이유전자 산물 (FⅨ 파두아)의 특이적인 검출은 인자 대체의 성공을 평가하는데 유용할 것이다. 그러나, 일부 환자들이 인자 IX 교차-반응 물질 (CRM)을 가지고 있기 때문에, 처리된 환자에서 FⅨ 파두아의 특이적인 검출은 여전히 어렵다. 일부 CRM-양성 (CRM+) 환자들은 예를 들어, 현재 사용 가능한 FⅨ 파두아-결합 약제와 교차-반응하는 야생형 (WT) 인자 IX를 발현하므로, FⅨ 파두아가 그러한 CRM+ 환자에 의해 발현되는지 검출하는 것이 어렵게 만든다.

개요

본 발명에 제공되는 것은 야생형 FⅨ와의 교차-반응 없이 FⅨ 파두아 (FⅨp)를 특이적으로 인식하는 결합 컨스트럭트이다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 FⅨ 파두아에 결합하고 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 WT 인자 IX에 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 각각의 서열번호 6-11를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이며, 선택적으로, 상기에서 (i) 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재하며, 및/또는 (ii) 폴리펩타이드가 선택적으로 추가로 DYKDDDDK (서열번호 12)를 포함하는 FLAG 태그 및/또는 HHHHHH (서열번호 13)를 포함하는 헥사-His 태그를 포함하며, 선택적으로, 상기에서 FLAG 태그 및/또는 헥사-His 태그는 폴리펩타이드의 C-말단에 위치한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 본 발명에 기술된 바와 같이 (i) 면역 글로불린 중쇄의 불변 영역, (ii) 면역 글로불린 경쇄의 불변 영역, 또는 (iii) 면역 글로불린 중쇄의 불변 영역 및 면역 글로불린 경쇄의 불변 영역 둘 다에 컨쥬게이션된 항원-결합 단편을 포함하는 컨쥬게이트이다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 본 발명에 기술된 바와 같이 이종 모이어티에 연결 또는 컨쥬게이션된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 컨쥬게이트이다. 예시적인 측면에서, 컨쥬게이트는 본 발명에 기술된 바와 같이 폴리머, 탄수화물, 지질, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 또는 검출제에 컨쥬게이션된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

본 발명에 기술된 바와 같이 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 컨쥬게이트, 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 추가적으로 제공된다. 핵산을 포함하는 벡터 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다.

또한, 본 발명에 제공되는 것은 관련된 키트이다. 예시적인 구현예에서, 키트는 본 발명에 기술된 바와 같이 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 컨쥬게이트, 핵산, 벡터, 숙주세포 또는 이의 조합, 및 선택적으로 사용 지침을 포함한다. 예시적인 측면에서, 키트는 또한 고체 지지체를 포함하며, 선택적으로 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트는 고체 지지체에 미리-코팅된다. 예시적인 측면에서, 키트는 또한 키트에서 제공된 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트에 결합하는 이차 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 기술된 바와 같이, 생물학적 샘플, 예를 들어, 인간으로부터 수득한 생물학적 샘플과 혼합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공한다. 예시적인 측면에서, 샘플은 인간 혈장, 또는 이의 희석된 분획, 및/또는 인간 조직, 또는 이의 세포를 포함한다. 예시적인 측면에서, 생물학적 샘플은 인간 혈장 단백질을 포함하며, 상기에서 하나 이상의 인간 혈장 단백질은 인자 IX, 인자 II, 및 인자 X, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로 조성물은 검출제를 포함한다.

본 발명에 제공된 그러한 결합 컨스트럭트는 예를 들어, 야생형 FⅨ를 포함하는 샘플, 예를 들어, 임상 또는 전임상 샘플에서, 예를 들어,FⅨ 파두아의 명백한 또는 특이적인 검출이 가능하게 하는 검출 방법에 유용하다. 따라서, 본 발명에 제공되는 것은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인자 IX 파두아를 대상으로부터 수득한 샘플에서 검출하는 방법이다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (i) 샘플을 결합 컨스트럭트 (본 발명에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트)와 접촉시켜 복합체, 예를 들어, FⅨp 및 결합 컨스트럭트를 포함하는 면역 복합체를 형성하고, 및 (ii) 샘플에서 복합체를 검출하는 것을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 WT 인자 IX 및 FⅨ 파두아의 아미노산 서열의 개략도를 나타낸다.
도 2는 FⅨ 파두아 (왼쪽 패널) 또는 WT 인자 IX (오른쪽 패널)의 5 μg/ml BC1 (Z-축에 가장 가까운 파란색 바 (즉, 왼쪽으로)), 1 μg/ml BC1 (파란색 바의 오른쪽 빨간색 바), 0.2 μg/ml BC1 (빨간색 바에 인접한 초록색 바) 또는 0.04 μg/ml BC1로 코팅된 Ni²⁺ 플레이트에 대한 결합 신호 그래프를 나타낸다.
도 3은 MaxiSorp 플레이트 상에 코팅된 BC1 (세모), BC2 (다이아몬드) 또는 BC3 (네모)의 표시된 FⅨ 파두아 농도에 대한 결합 신호 그래프를 나타낸다.
도 4는 벤즈아미딘 없이 WT 인자 IX 5 μg/ml을 함유하는 5% 인간 혈장 용액 중의 표시된 FⅨ 파두아 농도에 대한 BC1의 결합 신호 그래프를 나타낸다.
도 5는 2%BSA/PBS (다이아몬드), 50 mM 벤즈아미딘 (네모)을 포함하는 5% 혈장 용액, 50 mM 벤즈아미딘 (세모)을 포함하는 10% 혈장 용액, 또는 50 mM 벤즈아미딘 (X)을 포함하는 20% 혈장 용액 중의 표시된 FⅨ 파두아 농도에 대한 BC1의 결합 신호 그래프를 나타낸다
도 6은 BC1 (네모), BC2 (세모), BC4 (다이아몬드), 또는 음성 대조군 (X)의 WT 인자 IX 및 50 mM 벤즈아미딘을 포함하는 20% (v/v) 혈장 용액 중의 표시된 FⅨ 파두아의 농도에 대한 결합 신호 그래프를 나타낸다
도 7은 BC1 (왼쪽 패널) 및 BC4 (오른쪽 패널)의 표시된 농도의 응고 인자: FⅨ 파두아 (다이아몬드); 인자 II (네모); 및 인자 X (세모)에 대한 두 개의 결합 신호 그래프를 나타낸다.
도 8은 BC5 (왼쪽 패널) 및 BC6 (오른쪽 패널)의 표시된 농도 (μg/ml)의 WT 인자 IX (다이아몬드)에 대한 또는 FⅨ 파두아 (네모)에 대한 두 개의 결합 신호그래프를 나타낸다.
도 9는 실시예 2에 기술된 ELISA의 요소의 개략도를 나타낸다.
도 10은 실시예 1에 기술된 ELISA의 요소의 개략도를 나타낸다.
도 11은 FⅨ 파두아 (동그라미) 또는 기준 인간 혈장 샘플 (다이아몬드)를 함유하는 샘플을 이용한 FⅨ 파두아 ELISA의 농도-반응 커브의 그래프를 나타낸다.
도 12는 표시된 FⅨ 파두아 양의 6개의 표준 FⅨ 파두아 (표준 D1 내지 D6)를 이용한 ELISA의 검량선(calibration curve) 그래프를 나타낸다.
도 13은 완충액 중의 또는 정상 혈장 또는 FⅨ-결핍 혈장 중의 FⅨ 파두아를 이용한 FⅨ 파두아 ELISA의 희석-반응 커브 그래프를 나타낸다.
도 14는 인용된 원숭이 혈장 샘플을 이용한 FⅨ 파두아 ELISA의 희석-반응 커브의 그래프를 나타낸다.
도 15는 FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 대상의 FⅨ 파두아 발현 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 샘플의 응고 활성 및 단백질 측정 그래프를 나타낸다.
도 16은 FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 두 번째 대상의 FⅨ 파두아 발현 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 샘플의 응고 활성 및 단백질 측정 그래프를 나타낸다.
도 17은 FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)이 없는 대상의 FⅨ 파두아 발현 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 샘플의 응고 활성 및 단백질 측정 그래프를 나타낸다.
도 18은 FⅨ 농도의 함수로서의 신호 그래프를 나타내며, 여기에서 신호는 FⅨ 파두아-특이적인 발색 활성 분석에 의해 생성된다.
도 19는 IX 파두아 특이적인 Fab 및 패닝 및 차단 펩타이드에 사용된 서열 (FⅨ 파두아 중의 L338는 빨간색 및 박스로 표시했으며, FⅨ wt 중의 R338는 초록색 및 박스로 표시했다)의 생성에 대한 전략의 개략도를 나타낸다.
도 20은 정제된 미니 항체 (이가 Fab)의 개략적인 구조를 나타낸다.
도 21은 돼지 FⅨa의 X-선 구조 (도 21A)를 나타내며 Arg338가 돼지 FⅨa의 중쇄의 표면 상 및 인간 FⅨ 파두아의 개략도 상에 위치하고 Leu338임을 입증하는 것을 보여준다.
도 22는 정제된 Fab가 FⅨ 파두아에 특이적으로 결합하고 FⅨ wt 항원에 결합하지 않는 것을 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 22는 wt 및 파두아 항원에 대해 정제된 이가 Fab로부터 얻은 ELISA 그래프를 나타낸다. 상이한 패닝 전략으로부터 수득한, 이가 Fab가 wt 및 파두아 펩타이드 및 단백질에 대한 특이성에 대해 테스트되었다. 결과는 배경에 대한 증가 배수로 표시되었으며 (도 22A), (도 22B)는 수립된 ELISA의 개략도 나타낸다. 컬럼의 순서는 범례에 나타난 바와 동일하다 (즉, Ab42 컬럼이 왼쪽에 있다). 자세한 것은, 실시예 5의 방법 기술을 참고하라.
도 23은 정제된 이가 Fab가 20% 인간 혈장 매트릭스(matrix) 중의 FⅨ wt에 교차 반응을 나타내지 않는 것을 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 23은 20% 혈장의 존재하에서 정제된 이가 Fab의 ELISA 그래프를 나타낸다. 정제된 이가 Fab가 5 μg/mL FⅨ wt 및 표시된 파두아 FⅨ 농도를 함유하는 20% 인간 혈장으로 코팅 및 인큐베이션되었다 (도 23A). 검출은 HRP 표지된 다클론 염소 항 FⅨ 항체 (100 ng/ml)로 수행되었다. ELISA 수립의 개략도 (도 23B). 라인은 범례와 동일한 순서이다.
도 24는 선택된 후보자 Ab42의 표면 플라즈마 공명 (SPR) 분석을 보여주는 그래프를 나타낸다. His-태깅된 미니 항체 Ab42가 FⅨ 파두아와 KD= 59 nM (ka: 4.3x 10⁴ 1/Ms; kd:0.002531 1/s)로 결합하나 (도 24A), NTA-BIAcore 센서 칩 상의 FⅨ wt에는 결합하지 않는다 (도 24B). 점선은 미가공 데이터(raw data)를 나타내며, 실선은 적합화된 데이터(fitted data)를 나타낸다. 라인들은 범례와 동일한 순서이다.
도 25는 면역 분석의 설명을 나타낸다.
도 26은 정제된 FⅨp 샘플 및 5 μg/Ml의 정상 FⅨ 농도 가진 신선-동결 기준 혈장 제제에 대해 얻은 농도-반응 커브로 나타낸 분석 선택성을 보여주는 그래프가 분석의 선택성을 입증하는 것을 나타낸다. 인간 혈장은 본질적으로 반응을 보이지 않았다.
도 27은 0.85 내지 27.1 ng의 FⅨp/mL 범위의 6-포인트 검량선의 그래프가 적절한 선형성을 가지는 것을 나타낸다. 그들의 정확성은 상관 계수 r, 상대적 총 오차 (RTE), 및 역-적합된 시도의 결과로 입증되었다.
도 28은 정장 및 FⅨ-결핍 혈장에서 평행 연구(parallelism study)를 보여주는 그래프 세트를 나타낸다. FⅨp-첨가된 혈장의 희석-반응 커브의 기울기는 완충액 단계 희석물에서 얻은 기울기와 <5%으로 상이해, 혈장 매트릭스가 분석 수행에 영향을 미치지 않았음을 나타냈다.
도 29는 ELISA의 감도에 대한 Ca²⁺의 영향을 보여주는 그래프를 나타낸다. 다클론 검출 항체 및 Ca-의존적 FⅨ의 EGF 도메인에 의해 야기된 것과 매우 유사하게, Ca²⁺에 의해 유발된 감도에서의 명확한 증가가 나타난다.
도 30은 임상시험 1/2상에서 AAV2/8 바이러스 벡터 처리된 첫 번째 환자 유래 구연산염 처리된 혈장 샘플의 분석을 보여주는 그래프 세트를 나타낸다. 첫 번째 환자로부터 수득한 혈장 샘플은 FⅨ 교차-반응 물질 양성 (CRM+)이었다.
도 31은 임상시험 1/2상에서 AAV2/8 바이러스 벡터 처리된 두 번째 환자 유래 구연산염 처리된 혈장 샘플의 분석을 보여주는 그래프 세트를 나타낸다. 두 번째 환자로부터 수득한 혈장 샘플은 FⅨ 교차-반응 물질 양성 (CRM+)이었다.
도 32는 임상시험 1/2상에서 AAV2/8 바이러스 벡터 처리된 세 번째 환자 유래 구연산염 처리된 혈장 샘플의 분석을 보여주는 그래프 세트를 나타낸다. 세 번째 환자로부터 수득한 혈장 샘플은 FⅨ 교차-반응 물질 양성 (CRM+)이 아니었다.

본 발명에 제공되는 것은 야생형 FⅨ에 대한 교차-반응이 최소 또는 없이 특이적으로 FⅨ 파두아를 인식하는 결합 컨스트럭트이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 결합하고 야생형 (WT) 인자 IX에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 WT 인자 IX의 존재 하에 FⅨ 파두아와 결합한다 (그리고 WT 인자 IX와 결합하지 않는다). 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 유사한 또는 동일한 조건 하에서 FⅨ 파두아에 결합하고 WT 인자 IX 및 인자 II 및 인자 X 중 하나 또는 둘 모두, 또는 이의 임의의 다른 돌연변이된 또는 변형된 형태 (FⅨ 파두아를 제외한)와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 결합하고 인자 II 또는 인자 X 어느 것에도 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 결합하고 WT 인자 IX, 인자 II 및 인자 X 중 어느 것에도 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 WT 인자 IX, 인자 II 및 인자 X 존재하에 FⅨ 파두아에 결합한다 (WT 인자 IX, 인자 II 및 인자 X에 결합하지 않는다). 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 인간 혈청에 존재하는 수준의 WT 인자 IX, 인자 II, 및 인자 X를 포함하는 용액에 존재하는 경우에도 FⅨ 파두아의 에피토프 (서열번호 1)에 결합한다.

에피토프

본 발명에서 사용된 “에피토프”는 결합 컨스트럭트에 의해 결합되는 FⅨ 파두아의 또는 FⅨ 파두아 내의 영역을 의미한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 선형 에피토프이다. 본 발명에서 사용된 "선형 에피토프"는 결합 컨스트럭트에 의해 결합되는 FⅨ 파두아의 또는 FⅨ 파두아 내의 영역을 말하며, 이 영역은 FⅨ 파두아의 아미노산 서열의 근접한 아미노산으로 구성된다. 선형 에피토프의 아미노산은 인자 IX 파두아의 일차 구조에서 서로 인접하다. 따라서, 선형 에피토프는 항원, 즉, FⅨ 파두아의 아미노산 서열의 단편 또는 부분이다.

다른 예시적인 구현예에서, 에피토프는 입체형태적(conformational) 또는 구조적 에피토프이다. "입체형태적 에피토프" 또는 “구조적 에피토프”는 인자 IX 파두아가 제대로 폴딩된 상태일 때 서로 아주 가깝게 위치한 아미노산으로 구성된 에피토프를 의미한다. 선형 에피토프와는 달리, 입체형태적 또는 구조적 에피토프의 아미노산은 FⅨ 파두아의 일차 구조 (즉, 아미노산 서열)에서 서로 근접할 필요가 없다. 입체형태적 또는 구조적 에피토프는 항원 (FⅨp)의 아미노산 서열의 근접한 아미노산으로 반드시 구성되야하는 것은 아니다.

예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 FⅨ 파두아의 에피토프에 결합하며, 상기에서 에피토프는 서열번호 1의 아미노선 서열 내의 선형 에피토프이다. 예시적인 측면에서, 선형 에피토프는 DRATCLLSTKFT (서열번호 3)의 아미노산 서열 내에 존재한다. 예시적인 측면에서, 선형 에피토프는 적어도 서열번호 3의 L-L을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 WT 인자 IX, 인자 II, 및/또는 인자 X의 존재하에서도 FⅨ 파두아의 선형 에피토프에 결합한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 5 μg/mL의 WT 인자 IX의 존재하에서도 FⅨ 파두아의 에피토프에 결합한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 5 μg/mL의 WT 인자 IX의 존재하에서도 및 20% 인간 혈장 매트릭스에서도 FⅨ 파두아의 에피토프에 결합한다.

예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 WT FⅨ의 에피토프에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 서열번호 2 내의 또는 DRATCLRSTKFT (서열번호 14)내의 또는 LVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFH (서열번호 15) 내의 에피토프에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 결합 컨스트럭트가 FⅨ 파두아에 결합하는 경우와 유사한 또는 동일한 조건 하에서 WT FⅨ의 에피토프에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 WT FⅨ의 정상 혈장 수준을 포함하는 용액 중에 존재하는 경우에 WT FⅨ의 에피토프에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 5μg/mL의 WT FⅨ를 포함하는 용액 (예를 들어, 버퍼) (예를 들어, 약 5μg/mL의 WT FⅨ를 포함하는 인간 혈장 매트릭스) 중에 존재하는 경우에 WT FⅨ의 에피토프에 결합하지 않는다.

예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아의 에피토프 (서열번호 1)에 결합하며, 상기에서 에피토프는 아미노산 서열 LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH (서열번호 5)의 폴딩된 구조의 입체형태적 에피토프이다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아의 에피토프 (서열번호 1)에 결합하며, 상기에서 에피토프는 아미노산 서열 LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH (서열번호 5)의 폴딩된 구조의 입체형태적 에피토프이고, 상기에서 폴딩된 구조는 이황화 가교를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 WT 인자 IX, 인자 Ⅱ, 및/또는 인자 X의 존재하에서도 FⅨ 파두아의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 5 μg/mL의 WT 인자 IX의 존재하에서도 FⅨ 파두아의 에피토프에 결합한다.

친화도 및 결합성

본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 비-공유적 및 가역적인 방식으로 결합한다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트와 FⅨ 파두아의 결합력(binding strength)은 결합 컨스트럭트의 결합 부위와 에피토프 사이의 상호 작용 강도의 측정인 이의 친화도의 관점에서 기술될 수 있다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 대해 고-친화도를 가지며, 따라서 저-친화도 결합 컨스트럭트보다 더 단기간에 더 많은 양의 FⅨ 파두아와 결합할 것이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 10⁵ mol^-1 이상, 10⁶ mol^-1 이상, 10⁷ mol^-1 이상, 10⁸ mol^-1 이상, 10⁹ mol^-1 이상, 또는 10¹⁰ mol^-1 이상인, 평형 결합 상수(equilibrium association constant) KA를 가진다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 인간 혈장 중의 FⅨ 파두아에 대해 고친화도를 나타낸다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 인간 혈장을 포함하는 샘플 중의 WT 인자 IX에 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 약 5% 또는 그 이상의 인간 혈장을 포함하는 샘플 (예를 들어, 5% 인간 혈장 매트릭스) 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 약 10% 또는 그 이상의 인간 혈장을 포함하는 샘플 (예를 들어, 10% 인간 혈장 매트릭스) 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 약 20% 또는 그 이상의 인간 혈장을 포함하는 샘플 (예를 들어, 20% 인간 혈장 매트릭스) 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 15% 내지 약 20% 또는 그 이상의 인간 혈장을 포함하는 샘플 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 상당한 양의 WT 인자 IX가 샘플 중에 존재하는 경우에도 인자 IX 파두아에 결합한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 상당한 양의 인간 혈장 (예를 들어, 약 5% 또는 그 이상의 인간 혈장, 약 10% 또는 그 이상의 인간 혈장, 약 20% 또는 그 이상의 인간 혈장) 및 약 1 μg/mL 또는 그 이상의 WT 인자 IX 또는 약 2.5 μg/mL 또는 그 이상의 WT 인자 IX 또는 약 5 μg/mL 또는 그 이상의 WT 인자 IX 또는 약 10 μg/mL 또는 그 이상의 WT 인자 IX를 포함하는 샘플 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고, 인자 Ⅱ, 인자 V, 인자 VI, 인자 VⅡ, 인자 VⅢ, 인자 X, 인자 XI, 인자 XⅡ, 및 인자 XⅢ를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 응고 인자를 포함하는 샘플 중의 WT 인자 IX와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 WT 인자 IX에 결합하지 않으며, 추가로 인자 Ⅱ 또는 인자 X와 결합하지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 인자 IX 파두아에 결합하고 WT 인자 IX에 결합하지 않으며 추가로 인자 Ⅱ에도 인자 X에도 결합하지 않는다.

예시적인 구현예에서, FⅨ 파두아에 대한 결합 컨스트럭트의 결합력은 이의 감도의 관점에서 기술될 수 있다. KD는 결합 컨스트럭트 및 FⅨ 파두아 사이의 k_off/k_on의 비율인 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant)이다. KD 및 KA는 반비례 관계이다. KD 값은 결합 컨스트럭트의 농도 (특정 실험에 필요한 결합 컨스트럭트의 양)와 관련되며, 따라서 KD 값이 낮을수록 (더 낮은 농도) 결합 컨스트럭트의 친화도가 높아진다. 예시적인 측면에서, FⅨ 파두아에 대한 결합 컨스트럭트의 결합력은 KD의 관점에서 기술될 수 있다. 예시적인 측면에서, FⅨp에 대한 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트의 KD는 약 1.0 x 10^-6 또는 그 이하, 약 1.0 x 10^-7 또는 그 이하, 약 1.0 x 10^-8 또는 그 이하, 약 1.0 x 10^-9 또는 그 이하, 약 1.0 x 10^-10 또는 그 이하이다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트의 KD는 마이크로몰, 나노몰, 피코몰 또는 펨토몰이다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트의 KD는 약 10^-4 내지 10^-6 또는 10^-7 내지 10^-9 또는 10^-10 내지 10^-12 또는 10^-13 내지 10^-15의 범위 내에 존재한다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트의 KD 는 약 100 nM 또는 그 이하이다. 특정 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트의 KD는 약 20 nM 내지 약 100 nM, 약 25 nM 내지 약 95 nM, 약 30 nM 내지 약 90 nM, 약 35 nM 내지 약 85 nM, 약 40 nM 내지 약 80 nM, 약 45 nM 내지 약 75 nM, 약 50 nM 내지 약 70 nM, 또는 약 55 nM 내지 약 65 nM이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트의 KD는 약 25 nM 내지 약 75 nM의 범위 내에 존재한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트의 KD는 약 50 nM 내지 약 60 nM의 범위 내에 존재한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트의 KD는 약 56 nM이다.

결합성은 항체-항원 복합체의 전체 강도 측정을 제공한다. 이는 세 가지 주요 매개 변수: 에피토프에 대한 결합 컨스트럭트의 친화도, 결합 컨스트럭트 및 FⅨ 파두아 둘의 결합가(valency), 및 상호 작용하는 부분의 구조적 배열(arrangement)에 의존적이다. 결합 컨스트럭트의 결합가 (항원 결합 부위의 수)가 클수록, 그 것이 결합할 수 있는 항원 (FⅨ 파두아)의 양이 더 많다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨp에 강한 결합성을 가진다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 다가(multivalent)이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 이가이다.

구조

본 발명에 기술된 결합 컨스트럭트는 다수의 구조 중 하나를 갖도록 조작될 수 있다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구조를 가진다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 항체에 기반하거나 이로부터 유래한 구조를 가진다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 본 발명 및 McEnaney et al., “Synthesized Molecules with the Targeting and Effector Functions of Antibodies” J. Am. Chem. Soc., 136 (52): 18034-18043 (2014); Binz and Pluckthun, “specific binding reagents”Curr Opin Biotechnol. 16(4):459-69 (2005); 및 Roque et al., “Antibodies and genetically engineered related molecules: production and purification”Biotechnol Prog. 20(3):639-54 (2004)에 기술된 것과 같은, 합성 항체 모방, 조작된 단백질, 또는 앱타머의 구조를 가진다.

항체 및 항원-결합 단편

예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 항체이다. 항체는 임의의 유형의 항체, 즉, 통상의 기술분야에 공지된 면역글로불린일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 항체는 클래스 또는 이소타입 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM의 항체이다. 예시적인 구현예에서, 본 발명에서 기술된 항체는 하나 이상의 알파, 델타, 입실론, 감마, 및/또는 뮤 중쇄를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 발명에서 기술된 항체는 하나 이상의 카파 또는 경쇄를 포함한다. 예시적인 측면에서, 항체는 IgG 항체이고 선택적으로 네 가지 인간 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중 하나이다.

또한, 일부 구현예에서 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 다클론 항체이다.

일부 구현예에서, 항체는 자연발생적 항체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭, 햄스터, 인간 등으로부터 분리된 및/또는 정제된 항체와 구조적으로 유사하거나 이로부터 유래한다. 이와 관련하여, 항체는 포유류 항체, 예를 들어, 마우스 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 말 항체, 닭 항체, 햄스터 항체, 인간 항체 등으로 간주될 수 있다. 예시적인 측면에서, 항체는 포유동물 항체의 서열만을 포함한다. 그러한 항체를 생산하는 방법은 통상의 기술분야에 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 본 발명의 “항체 생산 방법” 제목의 섹션에서 추가로 기술된다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 완전 인간 항체이거나, 비-인간 항체의 서열을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 항체는 유전적으로-조작된 항체이고 자연에서 발생하지 않는다. 예시적인 구현예에서, 항체는 단일 쇄(single chain) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 인간공학(humaneered) 항체, 이중 특이적 항체, 삼중특이적 항체 등일 수 있다. 유전 조작 기술은 또한 비-인간 원천으로부터 완전 인간 항체를 만들 수 있는 능력을 제공한다.

일부 측면에서, 유전적으로-조작된 항체는 FⅨ 파두아에 특이적인 단일 쇄 항체 (single chain antibody, SCA)이다. SCA 제작 방법은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Davis et al., Nature Biotechnology 9: 165-169 (1991)를 참조하라.

일부 측면에서, 항체는 키메라 항체이다. 본 발명에서 사용된 용어 ”키메라 항체"는 한 종(species) 유래 불변 도메인(constant domain) 및 두 번째 종 유래 가변 도메인(variable domain)을 함유하는 항체, 또는 더욱 일반적으로, 적어도 두 종 유래 아미노산 서열의 스트레치(stretches)를 함유하는 항체를 말한다. 특정 측면에서, 키메라 항체는 FⅨ 파두아에 결합한다.

일부 측면에서, 항체는 인간화 항체이다. 항체와 관련하여 사용될 때, 용어 "인간화된(humanized)"은 적어도 원래 원천의 항체보다 진짜 인간 항체와 더욱 유사한 구조 및 면역 기능을 가지도록 조작된 비-인간 원천 유래 CDR 영역을 가진 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화는 마우스 항체와 같은 비-인간 항체로부터 인간 항체로의 CDR 이식을 수반할 수 있다. 인간화는 또한 비-인간 서열을 더욱 인간 서열과 유사하게 보이도록 만들기 위해 선택된 아미노산 치환을 수반할 수 있다.

본 발명에서 용어 “키메라 또는 인간화된”의 사용은 상호 배타적인 의미가 아니고, 오히려 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 더 인간화된 키메라 항체를 포함하는 것을 의미한다. 문맥상 달리 나타내지 않는 경우를 제외하고, 키메라 항체 (이의 특성, 용도, 테스트 등)에 대한 서술은 인간화 항체에 적용되며, 인간화 항체에 대한 서술은 키메라 항체에도 적용된다. 마찬가지로, 문맥이 규정하는 경우를 제외하고, 그러한 서술은 또한 항체 및 그러한 항체의 항원-결합 단편에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.

일부 측면에서, 항체는 인간공학(humaneered)^TM 항체이다. 인간공학 기술은 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는 KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (South San Francisco, California)의 전매 방법이다. 인간공학™ 항체는 높은 친화도를 가지며, 인간 생식선(germline) 항체 서열과 매우 유사하다. 예를 들어, Tomasevic et al., Growth Factors 32: 223-235 (2014) 참조.

일부 측면에서, 항체는 FⅨ 파두아에 특이적인 CDR-이식 항체이다. CDR-이식 항체 제조 방법은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이의 전체가 참고 문헌으로 인용된, Lo, Benny, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Volume 248 (2004) 참조.

예시적인 구현예에서, 항체는 이중 특이적, 삼중특이적, 또는 다중-특이적이도록 조작되며, 항체는 둘 이상의 별개의 항원 결합 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 FⅨ 파두아에 특이적인 이중 특이적 또는 삼중특이적 항체이다. 이중 특이적 또는 삼중특이적 항체 제조 방법은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26: 649-658 (2005) 및 미국 특허 6,551,592참조. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아의 제 1 에피토프 및 FⅨ 파두아의 제 2 에피토프에 특이적인 이중-특이적인 항원-결합 컨스트럭트이다. 예시적인 구현예에서, 항체는 콰드로마(quadroma), 이종이량체(heterodimeric) 이중 특이적인 항체, 이중 특이적인 항체 융합, 이중 특이적인 항체 단편, 이중 특이적인 T-세포 관여항체 (bispecific T-cell engager, BiTE), 또는 다중-특이적인 항체이다. 예시적인 구현예에서, 항체는 익, 삼가, 또는 다가로 조작된다. 예를 들어, Cuesta et al., “antibodies: when design surpasses evolution”Trends in Biotechnology 28, 355-362 (2010); Holliger et al., “antibody fragments and the rise of single domains”Nat. Biotechnol. 23, 1126-1136 (2005); Chan et al., “antibodies for autoimmunity and inflammation”Nat Rev Immunol 10, 301-316 (2010); Byrne et al., “tale of two specificities: bispecific antibodies for therapeutic and diagnostic applications”Trends Biotechnol. 31, 621-632 (2013) 참조. 일부 구현예에서, 항체는 단량체(monomeric) 형태이나, 반면 다른 구현예에서, 항체는 하나 이상의 항체 (예를 들어, 각각이 제 1 항체의 동일한 에피토프를 인식하는)와 컨쥬게이트된다. 따라서, 일부 측면에서, 항체는 이량체, 폴리머, 올리고머, 또는 다량체 형태이다.

예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 항체의 항원-결합 단편이거나 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 단편 (본 발명에서 “항원-결합 부분”으로도 불리는)은 본 발명에서 기술된 임의의 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')₂, 단일특이적 또는 이중 특이적인 Fab₂, 삼중특이적인 Fab₃, 1가 IgG, scFv, dsFv, scFv-Fc, 이중 특이적인 디아바디(diabodies), 삼중특이적인 트리아바디(triabodies), 미니바디(minibody), 또는 IgNAR의 단편 (예를 들어, V-NAR), 또는 hcIgG의 단편 (예를 들어, VhH), 또는 bis-scFvs, Fab 발현 라이브러리에 의해 발현된 단편 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 항원 결합 부위를 가진 항체의 임의의 부분일 수 있다. 예시적인 측면에서, 항원-결합 단편은 도메인 항체, VhH 도메인, V-NAR 도메인, VH 도메인, VL 도메인 등이다. 기술된 항체 단편은 그러나 항체 단편의 이러한 예시적인 유형에 한정되지 않는다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 Fab 단편을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 두 개의 Fab 단편을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 링커를 통해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 두 개의 Fab 단편을 포함하는 미니바디를 포함하거나 미니바디이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 링커를 통해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 미니바디를 포함하거나 미니바디이다. 미니바디는 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Hu et al., Cancer Res 56: 3055-3061 (1996) 참조. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 링커를 통해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하고, 선택적으로 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase) 도메인을 포함하는 미니바디를 포함하거나 미니바디이다.

도메인 항체는 항체의 기능 결합 단위(functional binding unit)를 포함하며, 항체의 중쇄 (V_H) 또는 경쇄 (V_L)의 가변 영역에 상응할 수 있다. 도메인 항체는 약 13 kDa 또는 전체 항체의 약 1/10의 분자량 을 가질 수 있다. 도메인 항체는 본 발명에 기술된 항체들과 같은 전체 항체로부터 유래될 수 있다.

일부 구현예에서 결합 컨스트럭트는 단량체 또는 폴리머, 이중 특이적 또는 삼중특이적, 이가 또는 삼가이다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 단일특이적이다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 이중 특이적이다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 완전 인간 컨스트럭트이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 두 개의 Fab 단편을 포함하고 이가이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 구조가 동일한 두 개의 Fab 단편의 동종이량체이다. 따라서, 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 이가이나 FⅨ 파두아에 대해 단일특이적이다. 예시적인 측면에서, 동종이량체는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 통한 이량체이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 구조가 동일한 두 개의 Fab 미니 항체의 동종이량체이다. 따라서, 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 이가이나 FⅨ 파두아에 단일특이적이다. 예시적인 측면에서, 두 Fab 미니 항체의 동종이량체는 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 통한 이량체이다.

항체 분자의 항원-결합, 또는 유전자형(idiotype)을 함유하는 항체 단편은 통상의 기술분야에 공지된 기술로 생성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편; F(ab')₂ 단편의 이황화 가교 환원에 의해 생성될 수 있는 Fab' 단편; 및 항체 분자에 파파인 및 환원제를 처리함으로써 생성될 수 있는 두 개의 Fab' 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

합성 펩타이드를 통해 항체 경쇄의 V 도메인과 연결된 항체 중쇄의 가변 (V) 도메인을 포함하는 절두된 Fab 단편으로 이루어진 단쇄 가변 영역 단편 (single-chain variable region fragment, sFv) 항체 단편은 일상적인 재조합 DNA 기술 기법을 이용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 상기 Janeway et al., 참조). 마찬가지로, 이황화-안정화된 가변 영역 단편 (disulfide-stabilized variable region fragments, dsFv)이 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다 (예를 들어, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994) 참조).

재조합 항체 단편, 예를 들어, scFvs는 또한 다른 표적 항원에 높은 결합 결합성(binding avidity) 및 특이성을 갖는 안정한 다량체 올리고머로 조립되도록 조작될 수 있다. 그러한 디아바디 (이량체), 트리아바디 (삼량체) 또는 테트라바디 (사량체)는 통상의 기술분야에 공지되어 있다, 예를 들어, Kortt et al., Biomol Eng. 2001 18:95-108, (2001) 및 Todorovska et al., J Immunol Methods. 248:47-66, (2001) 참조.

이중 특이적인 항체 (bscAb)는 재조합 방법을 이용하여 글라이신-세린 링커를 통해 연결된 두 개의 단쇄 Fv 단편을 포함하는 분자이다. 예시적인 구현예에서 두 관심 항체의 V 경쇄 (V_L) 및 V 중쇄 (V_H) 도메인은 표준 PCR 방법을 이용하여 분리되었다. 각 하이브리도마에서 얻은 V_L 및 V_H cDNA는 그 후 2-단계 융합 PCR에서 연결되어 단쇄 단편을 형성하였다. 이중 특이적인 융합 단백질이 유사한 방식으로 제조되었다. 이중 특이적인 단쇄 항체 및 이중 특이적인 융합 단백질은 본 발명 기재의 범위 내에 포함되는 항체 물질이다. 예시적인 이중 특이적인 항체는 두 출원은 그 전체가 참고 문헌으로 본 발명에 인용된, 미국 특허 출원 공보번호 2005-0282233A1 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 2005/087812에 교시된다.

예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 동일한 표적 항원 분자 상에서 두 개의 다른 비-중첩 에피토프 결합 능력을 가지는 이중 파라토픽(biparatopic) 항체, 또는 이의 이중 파라토픽 항원-결합 단편이다. 동일한 세포 표면 표적에 동시에 결합함으로써, 이중 파라토픽 항체 및 이의 이중 파라토픽 항원-결합 단편은 결합 결합성을 향상시켜, 표적을 발현하는 세포에만 우선적으로 (강한) 결합을 유도하고, 따라서, 항체 선택성을 미세조정하는 결과를 낳을 수 있다. 동일한 표적 분자 상의 두 개의 상이한 에피토프에 동시에 결합함으로써 이중 파라토픽 항체 또는 이의 이중 파라토픽 항원-결합 단편이 단독으로 또는 조합되어 사용되는 경우 잠재적으로 모 항체 (또는 항원-결합 단편)로는 얻을 수 없는 새로운 기능을 획득할 수도 있음이 입증되었다. 예시적인 측면에서, 본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 이중 파라토픽하다.

예시적인 구현예에서, 항원-결합 단편은 이중 특이적, 삼중특이적, 또는 다중-특이적으로 조작된다. 예시적인 측면에서, 항원-결합 단편은 두 개 이상의 별개의 항원-결합 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 단편은 FⅨ 파두아 및 하나 이상의 다른 항원에 특이적인 이중 특이적 또는 삼중특이적 항체이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 제 1 FⅨ 파두아의 에피토프 및 제 2 FⅨ 파두아의 에피토프에 특이적인 이중-특이적인 항원 결합 단편이다. 예시적인 구현예에서, 항원-결합 단편은 이가, 삼가, 또는 다가로 조작된다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 단일특이적인 이가 Fab 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 단량체 형태이나, 반면 다른 구현예에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 항원-결합 단편 (예를 들어, 각각이 제 1 항원-결합 단편의 동일한 에피토프를 인식하는)과 컨쥬게이션된다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 단편은 이량체화, 폴리머화, 올리고머화, 또는 다량체화된다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 이량체 Fab 단편이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 완전 인간 이량체 Fab 단편이다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 통한 이량체이다. 예시적인 구현예에서, 항원-결합 단편은 이가, 삼가, 또는 다가로 조작된다. 예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 FⅨ 파두아에 단일특이적인 이량체 이가 Fab 단편이며, 상기에서 결합 컨스트럭트는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 통한 이량체이다.

예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SSYAIS (서열번호 6); GIVPAFGTANYAQKFQG (서열번호 7); SWGVISFAY (서열번호 8); RASQDISSYLN (서열번호 9); AASNLQS (서열번호 10); 및 MQYDSLPFTF (서열번호 11)의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 24 및 25둘 다의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 26 또는 서열번호 27 또는 서열번호 26 및 27 둘 다의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 예를 들어, 링커(들), 발현 태그 (예를 들어, His 태그, FLAG 태그, myc 태그, 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안(cyan) 형광 단백질, 증강된 녹색 형광 단백질 등)의 추가 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 His 태그 및/또는 FLAG 태그의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, FLAG 태그는 서열번호 12의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, His 태그는 서열번호 13의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 링커를 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Haylock et al., Int J. Oncol. 48(2): 461-470 (2016) 또는 Wang et al., Anal. Chem. 78: 997-1004 (2006)에 기술된 것과 같은 합성 이중 헬릭스 루프 헬릭스 모티프를 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 불변 항체 도메인을 포함한다. 그러한 항체 도메인은 Hu et al., Cancer Res 56: 3055-3061 (1996) 및 McGregor et al., Mol Immuno 31: 219-226 (1994)에 기술되어 있다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 Wang et al. (2006)에 기술된 것과 같은 세균성 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 28 또는 서열번호 27 또는 서열번호 28 및 27 둘 다의 서열을 포함한다.

앱타머

일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 항체의 유사체이다. 일부 측면에서, 결합 컨스트럭트는 앱타머이다. 최근 조합 과학 분야에서의 발전으로 인해 주어진 표적에 높은 친화도 및 특이성을 가진 짧은 폴리머 서열 (예를 들어, 올리고 핵산 또는 펩타이드 분자)이 발견되었다. 예를 들어, SELEX 기술이 포유동물 항체에 필적하는 결합 특성을 가진 DNA 및 RNA 앱타머 동정에 사용되었고, 면역학 분야는 무수한 화합물에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 생성 및 분리하였으며, 파지 디스플레이는 매우 양호한 결합 특성을 가진 새로운 펩타이드 서열을 발굴하는데 사용되었다. 이러한 분자 진화 기술의 성공에 기반하여, 임의의 표적 분자에 결합하는 분자가 생성될 수 있는 것이 확실하다. 종종 상보적인 염기쌍이 없는 짧은 영역으로부터 생성된 헤어핀 루프를 이용하는 앱타머, 및 상보적인 염기쌍이 없는 짧은 영역으로부터 생성된 헤어핀 루프를 사용하는 자연적으로 유래된 항체, 및 선형 펩타이드 파지 디스플레이 결과와 비교했을 때 개선된 결과를 보인 고리형(cyclic) 펩타이드를 사용하는 새로운 파지 디스플레이 라이브러리의 경우에서와 같이, 루프 구조는 종종 원하는 결합 속성을 제공하는 것과 연관된다. 앱타머에 대한 더 자세한 것은, 일반적으로 Gold, L., Singer, B., He, Y. Y., Brody. E., "Aptamers As Therapeutic and Diagnostic Agents," J. Biotechnol. 74:5-13 (2000)를 참고하라. 앱타머 생성을 위한 관련 기술은 이의 전체가 참고 문헌으로 인용된 미국 특허 번호 6,699,843에서 확인할 수 있다.

항체 또는 이의 항원-결합 단편 생산 방법

항체를 만드는 적합한 방법이 통상의 기술분야에 공지되었다. 예를 들어, 표준 하이브리도마 방법이 예를 들어, Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), 및 CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5^th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001))에 기술되어 있다.

간략하게, 다클론 항체는 동물을 본 발명에 기술된 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로 면역화하고 그 면역화된 동물로부터 항혈청(antisera)을 수집함으로써 제조된다. 다양한 동물 종이 항혈청 생산에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항-항혈청의 생산에 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 염소, 양, 돼지 또는 말을 포함하는 비-인간 동물이다. 토끼의 상대적으로 큰 혈액 부피 때문에, 토끼가 다클론 항체의 생산에 바람직한 선택이다. 선택된 FⅨ 파두아 에피토프에 면역반응성인 다클론 항혈청을 생성하는 예시적인 방법에서, 토끼의 면역화를 위해 50 μg의 FⅨ 파두아 항원이 프로인트 완전 보조제(Freund's Complete Adjuvant)에 유화되었다. 예를 들어, 21일의 간격으로, 50 μg의 에피토프가 부스팅(boost)을 위해 프로인트 불완전 보조제에 유화되었다. 다클론 항혈청은 항체 생성을 위한 시간을 감안한 후에 동물을 출혈시키고 전체 혈액으로부터 혈청 샘플을 제조함으로써 간단하게 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 단일클론 항체는 연속 배양 세포주에 의한 항체 분자의 생산에 제공하는 임의의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 원래 Koehler 및 Milstein (Nature 256: 495-497, 1975)에 의해 기술된 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kosbor et al., Immunol Today 4:72, 1983; Cote et al., Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983) 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96, (1985)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

간략하게, 예시적인 구현예에서, 단일클론 항체를 생성하기 위해, 마우스에 재조합 FⅨ 파두아 (예를 들어, 프로인트 완전 보조제에 유화된 10-20 μg)를 정기적으로 주사하여 이에 대한 항체를 형성하였다. 마우스는 PBS 중의 FⅨ 파두아로 최종 융합-전 부스팅하였으며, 4일 후 마우스를 희생시키고 이의 비장을 제거하였다. 비장을 무-혈청 RPMI 1640에 두고, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 100 units/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (RPMI) (Gibco, Canada)이 보충된 무-혈청 RPMI 1640로 잠긴 두 개의 현미경 반투명 말단 슬라이드 글라스의 사이의 비장을 분쇄함으로써 단일 세포 현탁액을 형성하였다. 세포 현탁액은 멸균 70-매쉬 Nitex cell strainer (Becton Dickinson, Parsippany, N.J.)로 여과되었고, 200 g로 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 20 ml의 무-혈청 RPMI에 재부유함으로써 2회 세척하였다. 세 마리의 비면역화 Balb/c 마우스로부터 얻은 비장세포를 유사한 방식으로 제조하였으며 대조군으로 사용하였다. 융합 전에 3일 동안 11% 우태아혈청 (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) 포함 RPMI에서 로그기(log phase)로 유지된 NS-1 골수종 세포를 200 g로 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 2회 세척하였다.

비장 세포 (1 x 10⁸)를 2.0 x 10⁷ NS-1 세포와 합치고 원심분리하고 상등액을 흡인하였다. 튜브를 탭핑하여 세포 펠릿을 밀어 움직이고, 37℃의 PEG 1500 (50% in 75 mM Hepes, pH 8.0) (Boehringer Mannheim) 1 ml을 교반하면서 1분에 걸쳐 첨가한 다음, 무-혈청 RPMI 7 ml을 7분에 걸쳐 첨가하였다. 추가적인 RPMI 8 ml을 첨가하고 세포를 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 펠릿을 15% FBS, 100 μM 소듐 하이포잔틴(sodium hypoxanthine), 0.4 μM 아미노프테린(aminopterin), 16 μM 티미딘(thymidine) (HAT) (Gibco), 25 units/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) 및 1.5 x 10⁶ 비장세포/ml을 함유하는 RPMI 200 ml에 재부유하고 10개의 Corning 평저 96-웰 조직 배양 플레이트 (Corning, Corning N.Y.)에 플레이팅하였다.

융합 2, 4, 및 6일차에, 배지 100 μl을 융합 플레이트의 웰에서 제거하고 새 배지로 교체하였다. 융합 8일차에, 하기와 같이 FⅨ 파두아에 결합하는 마우스 IgG의 존재를 테스트하는 ELISA로 융합이 스크리닝되었다. Immulon 4 플레이트 (Dynatech, Cambridge, Mass.)를 100 ng/웰로 25 mM Tris, pH 7.5에 희석한 EGFR로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 코팅 용액을 흡인하고 블로킹 용액 (CMF-PBS에 희석한 0.5% 생선 피부 젤라틴 (Sigma))을 200 μl/웰로 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20 (PBST)를 함유한 PBS로 3회 세척하고 배양 상등액 50 μl를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 및 상기와 같이 세척한 후, PBST로 1:3500로 희석한 염소 항-마우스 IgG(fc)와 컨쥬게이션된 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa.) 50 μl을 첨가하였다. 플레이트를 상기와 같이 인큐베이션하고 PBST로 4회 세척하고, 1 mg/ml o-페닐렌 디아민 (Sigma) 및 100 mM 시트레이트 중의 0.1 μl/ml 30% H₂O₂, pH 4.5로 이루어진 매트릭스 100 μl를 첨가하였다. 5분 후에 15% H₂SO₄ 50 μl를 첨가하여 정색 반응(color reaction)을 중지시켰다. 플레이트 리더 (Dynatech)에서 A₄₉₀를 판독하였다.

96-웰 플레이트로 희석함으로써 선택된 융합 웰을 2회 클로닝(cloned)하고 5일 수 콜로니/웰의 수를 육안으로 계수하였다. 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체를 이소스트립 시스템(Isostrip system) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)을 이용하여 분리하였다.

하이브리도마 기술이 사용되었을 때, 골수종(myeloma) 세포주가 사용될 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 공정에 사용하기 적합한 그러한 세포주는 바람직하게는 비-항체-생산성이고, 높은 융합 효율을 가지며 원하는 융합된 세포 (하이브리도마)만의 성장을 지원하는 특정 선택 배지에서 이들이 성장할 수 없게 만드는 효소 결핍증을 가진다. 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스인 경우, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/15XX0 Bul를 사용할 수 있고; 래트인 경우, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 사용할 수 있으며; 및 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6가 세포 융합과 관련해 모두 유용하다.

숙주 종에 따라, 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러한 보조제는 프로인트, 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide)과 같은 미네랄 젤, 및 리소레시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리음이온(polyanions), 펩타이드, 오일 유화액(oil emulsions), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 및 디니트로페놀(dinitrophenol)과 같은 표면 활성 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. BCG (bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파붐(Corynebacterium parvum)은 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.

또는, EBV-하이브리도마 방법 (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), 및 Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), 및 박테리오파지 벡터 발현 시스템 (예들 들어, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989) 참조)과 같은 다른 방법이 통상의 기술분야에 공지되었다. 또한, 비-인간 동물에서 항체를 생산하는 방법이 예를 들어, 미국 특허 5,545,806, 5,569,825, 및 5,714,352, 및 미국 특허 출원 공보 번호 2002/0197266 Al)에 기술되어 있다.

항체는 또한 Orlandi et al (Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837; 1989), 및 Winter G 및 Milstein C (Nature 349: 293-299, 1991)에 기재된 바와 같이 림프구 집단에서 생체 내 생산 유도함으로써 또는 재조합 면역 글로불린 라이브러리 또는 매우 특이적인 결합 시약의 패널을 스크리닝함으로써 생산될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 전체 서열이 공지되면, 재조합 단백질을 생산하는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, “Protein production and purification”Nat Methods 5(2): 135-146 (2008) 참조.

파지 디스플레이 또한 본 발명에 기재된 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 이와 관련해서, 항체의 항원-결합 가변 (V) 도메인을 암호화하는 파지 라이브러리가 표준 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 참조). 원하는 특이성을 가진 가변 영역을 암호화하는 파지가 원하는 항원에 특이적 결합을 위해 선택되며, 선택된 가변 도메인을 포함하는 완전한 또는 부분 항체가 재구성된다. 재구성된 항체를 암호화하는 핵산 서열을 단일클론 항체의 특성을 가진 항체가 세포에 의해 분비될 수 있도록 하이브리도마 생산에 사용된 골수종 세포와 같은 적합한 세포주로 도입한다 (예를 들어, 상기 Janeway et al.,, 상기 Huse et al.,, 및 미국 특허 6,265,150 참조). 또한 관련된 방법이 미국 특허 번호 5,403,484; 미국 특허 번호 5,571,698; 미국 특허 번호 5,837,500; 미국 특허 번호 5,702,892에 기술되어 있다. 미국 특허 번호 5,780,279; 미국 특허 번호 5,821,047; 미국 특허 번호 5,824,520; 미국 특허 번호 5,855,885; 미국 특허 번호 5,858,657; 미국 특허 번호 5,871,907; 미국 특허 번호 5,969,108; 미국 특허 번호 6,057,098; 및 미국 특허 번호 6,225,447에 기재된 기술.

항체는 특이적인 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자로 형질전환된 형질전환(transgenic) 마우스에 의해 생산될 수 있다. 그러한 방법은 통상의 기술분야에 공지되었고 예를 들어, 미국 특허 번호 5,545,806 및 5,569,825, 및 상기 Janeway et al.,에 기술되어 있다.

인간화 항체를 생성하는 방법은 통상의 기술분야에 공지되었고 예를 들어, 상기 Janeway et al., 미국 특허 번호 5,225,539, 5,585,089 및 5,693,761, 유럽 특허 번호 0239400 Bl, 및 영국 특허 번호 2188638에 자세히 기술되어 있다. 인간화된 항체는 또한 미국 특허 번호 5,639,641 및 Pedersen et al., J. MoI. Biol, 235, 959-973 (1994)에 기재된 항체 리서페이싱(resurfacin) 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 바람직한 키메라 또는 인간화된 항체는 인간 불변 영역을 가지나, 항체의 가변 영역, 또는 최소 CDR은 비-인간 종 유래이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 공지되어 있다. (미국 특허 번호 5,585,089, 및 5,693,762 참조.) 일반적으로, 인간화된 항체는 이의 프레임워크 영역에 도입된 하나 이상의 비-인간인 원천 유래 아미노산 잔기를 가진다. 인간화는 예를 들어, Jones et al. (Nature 321: 522-525, 1986), Riechmann et al., (Nature, 332: 323-327, 1988) 및 Verhoeyen et al. (Science 239:1534-1536, 1988)에 기술된 방법을 이용하여 설치류의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDRs)의 적어도 일부분을 상응하는 인간 항체의 영역으로 치환함으로써 수행될 수 있다. 조작된 항체를 제조하는 수많은 기술이 예를 들어, Owens and Young, J. Immunol. Meth., 168:149-165 (1994)에 기술되어 있다. 친화도 또는 면역원성을 조절하기 위해 추가적인 변이가 항체 프레임워크로 도입될 수 있다.

“키메라 항체”의 생산을 위해 발전된 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 가진 분자를 얻기 위해 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하는 기술이 사용될 수 있다 (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985)). 또는, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기술된 방법 (미국 특허 번호 4,946,778)이 EGFR- 또는 HSP90-특이적인 단일 쇄 항체를 생산하는데 적용될 수 있다.

마찬가지로, CDR을 분리하는 것으로 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용하여, CDR을 포함하는 조성물이 생성된다. 상보성 결정 영역은 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 각각에 대해 6개의 폴리펩타이드 루프, 3개의 루프로 특징지어진다. CDR에서 아미노산 위치는 본 발명에 참고 문헌으로 인용된 Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Department of Health and Human Services, (1983)에 의해 정의된다. 예를 들어, 인간 항체의 초가변 영역은 대략 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 잔기 28 내지 35에서, 49-59 부터 및 잔기 92-103부터 발견되는 것으로 정의된다 (Janeway and Travers, Immunobiology, 2^nd Edition, Garland Publishing, New York, (1996)). 뮤린(murine) CDR은 또한 대략 이들 아미노산 잔기에서 발견된다. CDR 영역이 상기 개시된 이들 근사 잔기의 여러 아미노산 내에서 발견될 수 있다는 것이 통상의 기술분야에서 이해된다. 면역 글로불린 가변 영역은 또한 CDR 주위의 4 개의 “프레임워크(framework)” 영역 (FR1-4)으로 이루어진다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 고도로 보존되어 있으며, 또한 인간 및 뮤린 서열 사이에서도 보존되어 있다.

단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 하나, 둘, 및/또는 세 개의 CDR을 포함하는 조성물이 생성된다. 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 클로닝 및 발현하는 기술이 통상의 기술분야에 잘 수립되어 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989) 참조). 증폭된 CDR 서열은 적절한 발현 벡터로 라이게이션된다. 하나, 둘, 셋, 네, 다섯 및/또는 여섯 개의 클로닝된 CDR을 포함하는 벡터는 선택적으로 CDR에 연결된 영역을 암호화하는 추가적인 폴리펩타이드를 함유한다.

뮤린 항체의 프레임워크 영역 (FR)은 1200개 이상의 인간 V_H 서열 및 1000개 이상의 V_L 서열을 포함하는 인간 항체 가변 서열의 큰 데이터베이스에서 선택된 호환 가능한 인간 프레임워크 영역으로 치환함으로써 인간화된다. 비교에 사용된 항체 서열의 데이터베이스는 Andrew C. R. Martin's KabatMan web page (http://www.rubic.rdg.ac.uk/abs/)에서 다운로드된다. CDR을 식별하기 위한 Kabat 방법은 임의의 인간 항체로부터 대략적인 CDR 및 프레임워크 영역을 묘사하고 CDR 및 FR을 결정하기 위한 뮤린 항체의 서열 유사성을 비교하기 위한 수단을 제공한다. 가장 잘 매치된 인간 V_H 및 V_L 서열은 높은 전체 프레임워크 매칭, 유사한 CDR 길이, 및 표준 및 VH / VL 불변 영역의 최소 미스매칭을 기반으로 선택된다. 뮤린 서열과 가장 유사한 인간 프레임워크 영역은 뮤린 CDR 사이에 삽입된다. 또는, 뮤린 프레임워크 영역이 인간 항체의 프레임워크 영역과 더 밀접하게 유사한 원래 프레임워크 영역의 전부 또는 일부의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.

추가적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 항체를 생성하기 위한 또 다른 유용한 기술은 합리적인 설계 유형의 접근법일 수 있다. 합리적인 설계의 목표는 그들이 상호 작용하는 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 또는 화합물의 구조적 유사체 (작용제, 길항제, 억제제, 펩티도미메틱, 결합 파트너, 등.)를 생산하는 것이다. 한 접근법에서, 항체 또는 이의 에피토프 결합 단편에 대한 3-차원 구조를 생성할 것이다. 이는 x-선 결정학, 컴퓨터 모델링에 의해 또는 두 접근법의 조합에 의해 달성될 수 있다. 선택 가능한 접근법, “알라닌 스캔(alanine scan)”은 알라닌을 가진 분자 전반에 걸친 잔기의 랜덤 대체 및 결정된 기능에 대한 결과적인 효과를 수반한다.

화학적으로 구성된 이중 특이적인 항체는 이종이기능 시약(heterobifunctional reagent) 숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)-프로피오네이트(succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)-propionate) (SPDP, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)와 같은 화학 물질을 사용하여 이종 Fab 또는 F(ab')₂ 단편과 화학적으로 가교(cross-linking)함으로써 제조될 수 있다. Fab 및 F(ab')₂ 단편은 파파인 또는 펩신 각각으로 소화함으로써 온전한 항체로부터 얻을 수 있다 (Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160:1686-701 (1984); Titus et al., J. Immunol., 138:4018-22 (1987)).

항체가 어떻게 생산되었는지와는 관례없이 FⅨ 파두아의 에피토프에 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트하는 방법은 통상의 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역침강, 표면 플라즈몬 공명, 및 경쟁적 결합 분석(competitive inhibition assay)와 같은 임의의 항체-항원 결합 분석을 포함한다 (예를 들어, 하기 Janeway et al., 및 미국 특허 출원 공보 번호 2002/0197266 참조).

폴리펩타이드

서열번호 6-11을 각각 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본 발명에 추가로 제공된다. 폴리펩타이드는 FⅨp에 결합하고 WT FⅨ에 결합하지 않으며, 예를 들어, 폴리펩타이드는 WT FⅨ의 존재하에서도, 선택적으로 다른 응고 인자, 예를 들어, 인자 Ⅱ 및 인자 X의 존재하에서도 FⅨp에만 결합한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 인간 혈장을 5% 이상, 10% 이상 또는 20% 이상 포함하는 샘플에서 FⅨp와 결합한다. 예시적인 측면에서, 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 24 및 25 둘 다의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 서열번호 26 또는 서열번호 27 또는 서열번호 26 및 27 둘 다의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 예를 들어, 링커(들), 발현 태그 (예를 들어, His 태그, FLAG 태그, myc 태그, 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안(cyan) 형광 단백질, 증강된 녹색 형광 단백질 등)의 추가 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 His 태그 및/또는 FLAG 태그의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, FLAG 태그는 서열번호 12의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, His 태그는 서열번호 13의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 링커를 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 Haylock et al., Int J. Oncol. 48(2): 461-470 (2016) 또는 Wang et al., Anal. Chem. 78: 997-1004 (2006)에 기술된 것과 같은 합성된 더블 헬릭스 루프 헬릭스 모티프의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 불변 항체 도메인의 서열을 포함한다. 그러한 항체 도메인은 Hu et al., Cancer Res 56: 3055-3061 (1996) 및 McGregor et al., Mol Immuno 31: 219-226 (1994)에 기술되어 있다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 상기 Wang et al. (2006)에 기술된 것과 같은 세균성 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 포함한다. 예시적인 측면에서, 폴리펩타이드는 서열번호 28 또는 서열번호 27 또는 서열번호 28 및 27 둘 다의 서열을 포함한다.

컨쥬게이트

본 발명에서 기술된 결합 컨스트럭트는 예를 들어, 글리코실화(glycosylation), 아미드화(amidation), 카르복실화(carboxylation), 또는 인산화(phosphorylation), 또는 산 부가 염, 아미드, 에스터, 특히 C-말단 에스터, 및 N-아실 유도체의 생성에 의해 변형될 수 있다. 결합 컨스트럭트는 또한 다른 모이어티와의 공유결합 또는 비공유결합 복합체, 즉, 컨쥬게이트의 형성에 의해 유도체를 생성하도록 변형될 수 있다. 공유결합 복합체는 결합 컨스트럭트를 포함하는 아미노산의 측쇄 상에서, 또는 N- 또는 C-말단에서 화학적 모이어티와 기능기의 연결에 의해 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 결합 컨스트럭트가 제 2 모이어티 (예를 들어, 이종 모이어티)에 부착(attached), 연결(linked), 연결(joined), 또는 컨쥬게이트되며 그 결과 컨쥬게이트를 생산한다. 따라서, 본 발명에 제공되는 것은 이종 모이어티에 (공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로) 연결된 본 발명에 기술된 결합 컨스트럭트를 포함하는 컨쥬게이트이다. 본 발명에서 사용된, 용어 “이종 모이어티”는 본 발명의 결합 컨스트럭트와 다른 임의의 분자 (화학적 또는 생화학적, 자연 발생적 또는 코딩되지 않은)를 말한다. 예시적인 이종 모이어티는 폴리머, 탄수화물, 지질, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, DNA 또는 RNA, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 치료제, (예를 들어, 세포독성제, 사이토카인), 진단제 또는 검출제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 다양한 이종 모이어티로 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 본 발명에서 논의된 바와 같이 추가적인 바람직한 특성을 부여한다. 일부 측면에서 화학적 변형은 이종 펩타이드, 다당류, 지질, 방사성동위원소, 비-표준 아미노산 잔기 및 핵산, 금속 킬레이트, 및 다양한 세포독성제와 같은 여러 다른 형태를 취한다.

일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 다양한 특성, 예를 들어, 증가된 용해도 및/또는 안정성 및/또는 반감기, 단백질 가수분해 절단에 대한 저항성, 간격 조정, 특정 세포 또는 조직 유형의 표적화를 부여하기 위해 이종 펩타이드와 융합된다. 일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 IgG 또는 다른 면역글로불린의 Fc 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 알칼라인 포스파테이즈 (AP)와 융합된다. Fc 또는 AP 융합 컨스트럭트 제조 방법은 국제 특허 공보 번호 WO 02/060950에서 확인된다. 결합 컨스트럭트와 특이적인 특성 (예를 들어, 반감기, 생체 이용률)을 가진 단백질 도메인의 융합에 의해, 본 발명의 결합 컨스트럭트에 이러한 특성을 부여하는 것이 가능하다.

결합 컨스트럭트는 방사성 표지, 형광 표지, 효소 (예를 들어, 열량 측정 또는 형광 측정 반응을 촉매하는), 기질(substrate), 고체 매트릭스, 또는 담체 (예를 들어, 비오틴 또는 아비딘)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 검출제 (예를 들어, 검출 가능한 표지 또는 리포터기)와 컨쥬게이트될 수 있다. 예시적인 측면에서, 형광 표지는 로다민 염료, 플루오레세인 염료 및/또는 시아닌 염료를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 형광 표지는 염료 세트, 예를 들어, 로다민 염료, TAMRA, 및 플루오레세인 염료, FAM을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형광 표지는 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 플리토레세인(Flitorescein)-EX, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 레드(Rhodamine Red)-X, 리사민 로다민(Lissamine rhodamine) B, 칼세인(Calcein), 플루오레세인, 로다민, 하나 이상의 BODIPY 염료, 텍사스 레드(Texas Red), 오레곤 그린 514, 및 하나 이상의 알렉사 피오스(Alexa Fhiors)로 이루어진 군으로부터 둘 이상의 염료를 선택하여 형성된 형광 염료 세트를 포함한다. 대표적인 BOD1PY 염료는 BODIPY FL, BODIPY R6G, BOD1PY TMR, BOD1PY 581/591 , BODIPY TR, BODIPY 630/650 및 BODIPY 650/665를 포함한다. 대표적인 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)는 알렉사 플루오로 50, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750 및 790을 포함한다. 예시적인 측면에서, 형광 표지는 Molecular Probes Handbook, 1 1th Edition (2010)에 기술된 하나 이상의 오레곤 그린 488, 플루오레세인-EX, FITC, 로다민 레드-X, 리사민 로다민 B, 칼세인, 플루오레세인, 로다민, BODIPYS, 및 텍사스 레드를 포함한다. 예시적인 측면에서, 검출 가능한 표지는 방사성동위원소, 발색단, 형광단, 형광 색소(fluorochrome), 효소 (예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제), 검출 가능한 신호 (예를 들어, 방사능, 형광, 색)를 방출하거나 표지를 이의 기질에 노출시킨 후 검출 가능한 신호를 방출하는 링커 분자 또는 다른 모이어티 또는 화합물로부터 선택된다. 다양한 검출 가능한 표지/기질 쌍 (예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제/디아미노벤지딘, 비오틴/스트렙타비딘, 루시퍼레이즈/루시페린), 항체 표지 방법, 및 항원을 검출하기 위해 표지된 이차 항체를 사용하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Harlow and Lane, eds. (Using Antibodies: A Laboratory Manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 참조.

일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 링커 없이 이종 모이어티에 직접적으로 연결된다. 대체적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 하나 이상의 링커를 통해 이종 모이어티에 간접적으로 연결된다. 직접적으로 함께 연결되건 링커를 통해 간접적으로 함께 연결되건, 결합 컨스트럭트는 공유결합 (예를 들어, 펩타이드, 에스터, 아미드, 또는 설피드릴 결합) 또는 비-공유결합 (예를 들어, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 결합, 정전기 상호작용 또는 이온 상호작용을 통해), 또는 이의 조합을 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 결합 컨스트럭트 및 이종 모이어티는 본 발명의 임의의 링커를 통한 연결을 포함하나, 이에 한정되지 않는 통상의 기술분야에 공지된 임의의 수단을 통해 연결될 수 있다.

본 발명에 기술된 결합 컨스트럭트의 특정 잔기는 이종 모이어티가 부착될 수 있는 예시적인 위치를 나타낸다. 예를 들어, Cys, His, Lys 및 N-말단 잔기, Arg, Tyr, Asp, Glu, Ser, Thr, Pro는 이종 모이어티가 부착될 수 있는 위치를 나타낸다. 일부 측면에서, 잔기 (또는 이의 부분)은 이종 모이어티의 부착에 앞서 하나 이상의 약제 및/또는 화학 물질로 활성화된다.

이기능제(bifunctional agent)를 이용한 유도체화(Derivatization)는 결합 컨스트럭트의 수용성 지지 매트릭스와의 가교화에 유용하다. 그러한 유도는 또한 결합 컨스트럭트에서 인접한 결합 요소, 또는 결합 요소를 이종 펩타이드, 예를 들어, Fc 단편에 연결할 수 있는 링커를 제공할 수 있다. 통상적으로 사용되는 가교제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 가진 에스터, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스터를 포함하는, 호모-이기능성 이미도에스터, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이기능성 말레이미드(maleimid)를 포함한다. 빛의 존재 하에서 가교를 형성할 수 있는 메틸-3-[(p-아지도페닐) 디티오] 프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광활성화 가능한(photoactivatable) 중간체를 생산한다. 또는, 참고문헌으로 본 발명에 인용된 미국 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에 기술된, 시아노겐 브로마이드-활성화 탄수화물과 같은 반응성 수용성 매트릭스들 및 반응성 기질은 단백질 고정화에 사용된다.

대체로, 화학적 유도체화는 단백질과 이종 모이어티, 예를 들어, 활성화된 폴리머 분자의 반응에 사용되는 임의의 적합한 조건하에서 수행될 수 있다. 폴리펩타이드의 화학적 유도체를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) 결합 컨스트럭트가 하나 이상의 폴리머 분자에 붙착되는 조건 하에서 결합 컨스트럭트와 이종 모이어티, 예를 들어, 활성화된 폴리머 분자 (폴리머 분자의 의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 같은)를 반응시키고, 및 (b) 반응 산물(들)을 얻는 단계를 포함할 것이다. 최적 반응 조건은 공지된 매개 변수 및 원하는 결과에 기반하여 결정될 것이다. 예를 들어, 폴리머 분자:단백질의 비율이 클수록, 부착된 폴리머 분자의 양이 많아진다. 일부 구현예에서, 화합물은 단일 폴리머 분자 모이어티를 아미노 말단에 가질 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,234,784 참조).

본 발명에서 기술된 유도된 결합 컨스트럭트는 비-유도된 분자에 비해 추가적인 활성, 향상된 또는 감소된 생물학적 활성, 또는 증가된 또는 감소된 반감기와 같은 다른 특성을 가질 수 있다.

컨쥬게이트: Fc 융합

인간 IgG의 Fc 영역과 같은 치환체(substituent)에 대해, 융합은 본 발명의 결합 컨스트럭트에 직접적으로 융합되거나 중개(intervening) 서열을 통해 융합될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역은 Fc 영역에 부착하기 위해 결합 컨스트럭트의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. Fc-융합 컨스트럭트 결과물은 단백질 A 친화도 컬럼 (Pierce, Rockford, Ill.)을 통해 정제할 수 있다. Fc 영역에 융합된 펩타이드 및 단백질은 융합되지 않은 상대에 비해 생체 내에서 현저히 증가된 반감기를 나타낼 수 있다. Fc 영역과의 융합은 융합 폴리펩타이드의 이량체화/다량체화를 허용한다. Fc 영역은 자연발생적인 Fc 영역일 수 있거나, 예를 들어, 치료 또는 진단 품질, 순환 시간, 감소된 응집과 같은 우수한 특성을 위해 변형될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 예를 들어, 면역 글로불린 또는 이의 부분 (예를 들어, 가변 영역, CDR, 또는 Fc 영역)과 융합되어, 컨쥬게이션된다. 면역 글로불린 (Ig)의 공지된 유형은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM을 포함한다. Fc 영역은 재활용 (반감기가 길어지는), 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)와 같은 활동을 수행하는 Fc 수용체와의 결합을 관할하는, Ig 중쇄의 C-말단 영역이다.

예를 들어, 어떤 정의에 따르면 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226내지 C-말단이다. “힌지 영역”은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230이다 (다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 시스테인 결합을 수반하는 시스테인을 정렬함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다). IgG의 Fc 영역은 두 개의 불변 도메인, CH2 및 CH3를 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 보통 아미노산 231 내지 아미노산 341이다. 인간 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은 아미노산 342 내지 447이다. 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 단편, 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대해 참조는 모두 Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md에 기반한다. 관련된 구현예에서, Fc 영역은 CH1 외의, 면역 글로불린 중쇄 유래 하나 이상의 원래의 또는 변형된 불변 영역, 예를 들어, IgG 및 IgA의 CH2 및 CH3 영역, 또는 IgE의 CH3 및 CH4 을 포함할 수 있다.

적합한 이종 모이어티는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역 글로불린 서열의 부분을 포함한다. 구제 수용체(salvage receptor) FcRn는 면역 글로불린 재활용하고 이들을 혈액에서 순환하도록 반환하는 것을 담당한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X-선 결정학에 기반하여 기술되어 왔다 (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Fc의 FcRn과의 주요 접촉 부위는 CH2 및 CH3 도메인의 접합부 근처에 있다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에서 이루어진다. 주요 접촉 위치는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428, 및 433-436을 포함한다.

면역 글로불린의 Fc 영역에 대한 아미노산 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 Fc 영역 변이체는 Fc 영역 (잔기 342-447)의 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 변형 및/또는 Fc 영역 (잔기 231-341)의 CH2 도메인에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. FcRn에 대해 증가된 친화도를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함한다 (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). 다른 돌연변이는 FcRn에 대한 친화도를 유의적으로 감소시키지 않으면서 Fc 영역의 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및/또는 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Fc 영역의 297번째 위치의 Asn을 Ala 또는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 고도로 보존된 N-글리코실화 위치를 제거하며, FcγRs로의 감소된 결합뿐만 아니라, Fc 영역의 연장된 반감기를 수반하는 감소된 면역원성을 초래할 수 있다 (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). FcγR에 대한 결합을 감소시키는 IgG1의 233-236 위치에서의 아미노산 변형이 이루어졌다 (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). 일부 예시적인 아미노산 치환은 이의 전부가 각각 본 발명에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 7,355,008 및 7,381,408에 기술되어 있다.

이종 모이어티: 폴리머, 탄수화물, 및 지질

예시적인 구현예에서, 이종 모이어티는 폴리머이다. 폴리머는 분지된 또는 비분지된 폴리머일 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량의 폴리머일 수 있다. 일부 구현예에서 폴리머는 약 2 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 가진다 (용어 "약"은 수용성 폴리머의 제조에서 일부 분자가 명시된 분자량보다 더, 조금 덜 무거운 것을 나타낸다). 폴리머의 평균 분자량은 일부 측면에서 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 약 12 kDa 내지 약 40 kDa 또는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa이다.

일부 구현예에서, 폴리머는 아실화를 위한 활성 에스터 또는 알킬레이션을 위한 알데하이드와 같은 단일 반응기를 가지도록 변형되기 때문에, 폴리머화 정도가 조절될 수 있다. 일부 구현예에서 폴리머는 수용성이기 때문에 부착된 단백질이 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않는다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 조성물이 치료 용도를 위해 사용된 경우, 폴리머는 약학적으로 허용 가능하다. 또한, 일부 측면에서, 폴리머는 폴리머의 혼합물, 예를 들어, 코-폴리머(co-polymer), 블록 코-폴리머이다.

일부 구현예에서, 폴리머는 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트를 포함하는 폴리알킬렌 및 이의 유도체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트)를 포함하는 아크릴 및 메타크릴산 에스터의 폴리머, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 에테르, 폴리바이닐 에스터, 폴리바이닐 할라이드, 폴리(바이닐 아세테이트), 및 폴리바이닐피롤리돈을 포함하는 폴리바이닐 폴리머, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이의 코-폴리머, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스터, 나이트로 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시-프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복실에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 및 셀룰로오스 황산 나트륨 염을 포함하는 셀룰로오스, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 및 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)을 포함하는 폴리에틸렌, 및 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 측면에서, 폴리머는 합성 생분해성 폴리머 (예를 들어, 젖산 및 글리콜산, 폴리무수물, 폴리(오쏘)에스터, 폴리우레탄, 폴리(부트 산), 폴리(발레르 산), 및 폴리(락타이드-코카프로락톤)의 폴리머), 및 천연 생분해성 폴리머 (예를 들어, 알지네이트 및 덱스트란 및 셀룰로오스를 포함하는 다른 다당류, 콜라겐, 이의 화학적 유도체 (화학기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌, 하이드록실기, 산소기의 치환, 부가, 및 통상의 기술자에 의해 일상적으로 이루어지는 다른 변형), 알부민 및 다른 친수성 단백질 (예를 들어, 제인 및 다른 프롤라민 및 소수성 단백질))와 임의의 코폴리머 또는 이의 혼합물을 포함하는 생분해성(biodegradable) 폴리머이다. 일반적으로, 이러한 물질은 효소적 가수분해 또는 생체 내에서 물에 노출됨으로써 표면 또는 전체적인 침식에 의해 분해된다.

일부 측면에서, 폴리머는 이의 교시가 본 발명에 인용된 H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587에 기술된 생체 흡수성(bioerodible) 하이드로젤, 폴리히알루론산, 카제인, 젤라틴, 글루틴, 폴리무수물, 폴리아크릴산, 알지네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트)과 같은 생체결합성(bioadhesive) 폴리머이다.

일부 구현예에서, 폴리머는 수용성 폴리머 또는 친수성 폴리머이다. 적합한 수용성 폴리머는 통상의 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 폴리바이닐피롤리돈, 하이드록시프로필 셀룰로오스 (HPC; Klucel), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC; Methocel), 나이트로셀룰로오스, 하이드록시프로필 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 부틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 펜틸셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 (Ethocel), 하이드록시에틸 셀룰로오스, 다양한 알킬 셀룰로오스 및 하이드록시알킬 셀룰로오스, 다양한 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 바이닐 아세테이트/크로톤산 코폴리머, 폴리-하이드록시알킬 메타크릴레이트, 하이드록시메틸 메타크릴레이트, 메타크릴산 코폴리머, 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타크릴레이트, 말레산 무수물/메틸 바이닐 에테르 코폴리머, 폴리 바이닐 알코올, 소듐 및 칼슘 폴리아크릴산, 폴리아크릴산, 산성 카르복시 폴리머, 카르복시폴리메틸렌, 카르복시바이닐 폴리머, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 코폴리머, 폴리메틸바이닐에테르 코-말레산 무수물, 카르복시메틸아미드, 포타슘 메타크릴레이트 디바이닐벤젠 코-폴리머, 폴리옥시에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 유도체, 염, 및 이의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 폴리머 또는 이의 혼합물은 N-결합된 또는 O-결합된 탄수화물, 당, 인산, 탄수화물; 당; 인산; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (모노-(C1-C 10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜를 포함하는, 단백질 유도체화에 사용되어 온 PEG의 형태를 포함하는); 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜; 덱스트란 (예를 들어, 약 6 Kd의 저분자 덱스트란와 같은), 셀룰로오스; 셀룰로오스; 다른 탄수화물-기반 폴리머, 폴리-(N-바이닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머, 폴리옥시에틸레이트화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리바이닐 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 공유결합적으로 부착된 다량체를 제조하는데 사용될 수 있는 이기능성 가교 분자이다.

본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 본 발명에서 사용된, 폴리에틸렌 글리콜은 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 단백질 유도체화에 사용될 수 있는 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것을 의미한다. PEG는 광범위한 범위의 분자량에서 사용 가능한 선형 또는 분지된 중성 폴리에테르이며, 물 및 대부분의 유기 용매에 가용성이다. PEG는 물에 존재할 때 일차적으로 이의 높은 역동적인 사슬 가동성(dynamic chain mobility) 및 친수성 성질을 통해 다른 폴리머 또는 펩타이드의 제거하는데 효과적이므로, 다른 단백질 또는 폴리머 표면에 부착될 때 워터 쉘(water shell) 또는 수화 구(hydration sphere)를 생성한다. PEG는 무독성, 비-면역원성이며, 식품의약품국(Food and Drug Administration)에 의해 내부 소비에 대해 승인되었다.

페길화된(pegylated) 화합물을 제조하는 방법은 (a) 화합물이 하나 이상의 PEG 기에 부착될 수 있는 조건하에서 화합물을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 같은)과 반응시키고, 및 (b) 반응 산물(들)을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 아실화 반응에 대한 최적 반응 조건은 공지된 매개 변수 및 원하는 결과에 기반하여 결정될 것이다. 예를 들어, PEG:화합물의 비율이 커질수록, 폴리-페길화된 산물의 퍼센트가 커진다. 일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 단일 PEG 모이어티를 N-말단에 하질 것이다. 본 발명에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 번호 8,234,784 참조.

일부 구현예에서, 이종 모이어티는 탄수화물이다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 단당류 (예를 들어, 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스), 이당류 (예를 들어, 수크로오스, 락토오스, 말토오스), 올리고당 (예를 들어, 라피노오스, 스타키오스), 다당류 (전분, 아밀레이즈, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 키틴, 칼로스, 라미나린, 자일란, 만난, 후코이단, 갈락토만난)이다.

일부 구현예에서, 이종 모이어티는 지질이다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 트롬복산, N-아실 에탄올아민, 글리세로지질(glycerolipid) (예를 들어, 일-치환 글리세롤, 이-치환 글리세롤, 삼-치환 글리세롤), 글리세로인지질 (예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린), 스핑고지질 (예를 들어, 스핑고신, 세라마이드), 스테롤지질 (예를 들어, 스테로이드, 콜레스테롤), 프레놀 지질, 사카로지질, 또는 폴리케타이드, 오일, 왁스, 콜레스테롤, 스테롤, 지용성 비타민, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질이다.

이종 모이어티: 치료제

일부 구현예에서, 이종 모이어티는 치료제이다. 치료제는 통상의 기술분야에 공지된 임의의 것일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 치료제의 예는 천연 효소, 천연 원천 유래 단백질, 재조합 단백질, 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 고리형 펩타이드, 항체, 수용체 작용제, 세포독성제, 면역 글로불린, 베타-아드레날린 차단제(beta-adrenergic blocking agents), 칼슘 채널 차단제(calcium channel blockers), 관상혈관확장제(coronary vasodilators), 감심배당체(cardiac glycosides), 항부정맥제(antiarrhythmics), 심장 교감신경흥분제(cardiac sympathomimetics), 안지오텐신변환효소 (angiotensin converting enzyme, ACE) 억제제, 이뇨제(diuretics), 강심제(inotropes), 콜레스테롤 및 트리들리세리드 감소제, 담즙산 격리제(bile acid sequestrants), 피브레이트(fibrates), 3-하이드록시-3-메틸글루테릴 (3-hydroxy-3-methylgluteryl, HMG)-CoA 리덕테이즈 억제제, 나이아신 유도체, 항부신제제(antiadrenergic agents), 알파-아드레날린 차단제, 중앙 작동 항부신제제(centrally acting antiadrenergic agents), 혈관확장제(vasodilators), 칼륨보전이뇨제(potassium-sparing agents), 티아자이드(thiazides) 및 관련 약제, 안지오텐신 Ⅱ 수용체 길항제, 말초혈관 확장제(peripheral vasodilators), 항안드로겐(antiandrogens), 에스트로겐(estrogens), 항생제(antibiotics), 레티노이드(retinoids), 인슐린(insulins) 및 유사체, 알파-글루코시데이즈(alpha-glucosidase) 억제제, 비구아니드(biguanides), 메글리티나이드(meglitinides), 설포닐우레아(sulfonylureas), 티아졸리딘디온(thizaolidinediones), 안드로겐(androgens), 프로게스토겐(progestogens), 골 대사 조절자(bone metabolism regulators), 뇌하수체 전엽 호르몬(anterior pituitary hormones), 시상하부 호르몬(hypothalamic hormones), 뇌하수체 후엽 호르몬(posterior pituitary hormones), 성선자극호르몬(gonadotropins), 성선자극호르몬-방출 호르몬 길항제, 배란 촉진제(ovulation stimulants), 선택적 에스트로겐 수용제 조절제(selective estrogen receptor modulators), 항갑상선제(antithyroid agents), 갑상선 호르몬(thyroid hormones), 벌크 형성제(bulk forming agents), 완하제(laxatives), 항연동제(antiperistaltics), 균집 조절제(flora modifiers), 장흡착제(intestinal adsorbents), 장 항-감염제, 항식욕부진제(antianorexic), 항악액질제(anticachexic), 항폭식제(antibulimics), 식욕억제제(appetite suppressants), 항비만제(antiobesity agents), 제산제(antacids), 상부위장관제(upper gastrointestinal tract agents), 항콜린제(anticholinergic agents), 아미노살리실산(aminosalicylic acid) 유도체, 생물학 반응 변형제(biological response modifiers), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 진경제(antispasmodics), 5-HT₄ 부분 작용제, 항히스타민제(antihistamines), 카나비노이드(cannabinoids), 도파민 길항제, 세로토닌 길항제, 세포보호제(cytoprotectives), 히스타민 H2-수용체 길항제, 점막보호제(mucosal protective agent), 수소 펌프(proton pump) 억제제, H. pylori 제균 치료, 적혈구 생성 촉진제(erythropoieses stimulants), 조혈제(hematopoietic agents), 빈혈 약제(anemia agents), 헤파린, 항피브린용해제(antifibrinolytics), 지혈제(hemostatics), 혈액 응고 인자, 아데노신 디포스페이트 억제제, 글리코단백질 수용체 억제제, 피브리노겐-혈소판 결합 억제제, 트롬복산-A₂ 억제제, 플라스미노겐 활성제, 항혈전제(antithrombotic agents), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 미네랄코르티코이드(mineralcorticoids), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 선택적 면역억제제(selective immunosuppressive agents), 항진균제(antifungals), 예방 치료 관련 약물, AIDS-연관 감염, 사이토메갈로바이러스, 비-뉴클레오시드 역전사 효소 억제제, 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제, 프로테이즈 억제제, 빈혈(anemia), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 아미노글리코시드(aminoglycosides), 카르바페넴(carbapenems), 세팔로스포린(cephalosporins), 글리코펩타이드, 린코사미드(lincosamides), 마크롤리(macrolies), 옥사졸리디논(oxazolidinones), 페니실린(penicillins), 스트렙토그라민(streptogramins), 설폰아미드, 트리메토프림(trimethoprim) 및 유도체, 테트라사이클린(tetracyclines), 구충제(anthelmintics), 아메바성(amebicies), 비구아니드(biguanides), 신코나 알칼로이드(cinchona alkaloids), 엽산 길항제, 퀴놀린 유도체, 폐포자충 요법(Pneumocystis carinii therapy), 하이드라지드(hydrazides), 이미다졸(imidazoles), 트리아졸(triazoles), 나이트로이미다졸, 고리형 아민, 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제제, 뉴클레오시드, 인산염 결합제(phosphate binders), 콜린에스터레이즈(cholinesterase) 억제제, 보조 요법(adjunctive therapy), 바르비투르산(barbiturates) 및 유도체, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 감마 아미노부티르산(gamma aminobutyric acid) 유도체, 히단토인(hydantoin) 유도체, 이미노스틸벤(iminostilbene) 유도체, 숙신이미드(succinimide) 유도체, 항경련제(anticonvulsants), 맥각알칼로이드(ergot alkaloids), 항편두통 제제(antimigrane preparations), 생물학적 반응 변경제(biological response modifiers), 카르바민산 에스터(carbamic acid eaters), 트리사이클릭 유도체, 탈분극제(depolarizing agents), 비탈분극제(nondepolarizing agents), 신경 근육성 마비 약제(neuromuscular paralytic agents), CNS 각성제(stimulants), 도파민성 시약(dopaminergic reagents), 모노아민 옥시데이즈(monoamine oxidase) 억제제, COMT 억제제, 알킬 설포네이트, 에렌이민, 이미다조테트라진(imidazotetrazines), 질소 머스타드 유사체, 나이트로소우레아(nitrosoureas), 백금-코팅 화합물, 항대사제(antimetabolites), 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 우레아 유도체, 안트라사이클린, 액티노마이신, 캠토테신(camptothecin) 유도체, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 탁산(taxanes), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids) 및 유사체, 항안드로겐, 항에스트로겐, 비스테로이드성아로마테이즈(nonsteroidal aromatase) 억제제, 단백질 카이네이즈 억제제, 항신생물제(antineoplastics), 항불안제(azaspirodecanedione) 유도체, 불안완화제(anxiolytics), 각성제(stimulants), 모노아민 재흡수(monoamind reuptake) 억제제, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 항우울제(antidepressants), 벤즈이속사졸 유도체, 부티로페논(butyrophenone) 유도체, 디벤조디아제핀(dibenzodiazepine) 유도체, 디벤조티아제핀(dibenzothiazepine) 유도체, 디페닐부틸피페리딘 유도체, 페노티아진(phenothiazines), 티에노벤조디아제핀(thienobenzodiazepine) 유도체, 티오잔틴(thioxanthene) 유도체, 알러젠 추출물(allergenic extracts), 비스테로이드성 약제, 류코트리엔 수용체 길항제, 잔틴, 엔도텔린(endothelin) 수용체 길항제, 프로스타글란딘, 폐 계면활성제(lung surfactants), 점액분해제(mucolytics), 항유사분열제(antimitotics), 요산배설촉진제(uricosurics), 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 억제제, 포스포디에스터레이즈(phosphodiesterase) 억제제, 메타민 염, 나이트로퓨란 유도체, 퀴놀론(quinolones), 평활근 이완제(smooth muscle relaxants), 부교감신경 흥분제(parasympathomimetic agents), 할로겐화 탄화수소(halogenated hydrocarbons), 아미노 벤조산의 에스터, 아미드 (예를 들어, 리도카인(lidocaine), 아티카인 하이드로클로라이드(articaine hydrochloride), 부피바카인 하이드로클로라이드(bupivacaine hydrochloride)), 해열제(antipyretics), 수면제(hynotics) 및 진정제(sedatives), 사이클로피롤론(cyclopyrrolones), 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidines), 비스테로이드성 항-염증 약물, 오피오이드(opioids), 파라-아미노페놀 유도체, 알코올 탈수소효소 억제제, 헤파린 길항제, 흡착제, 구토제, 오피오이드 길항제, 콜린에스터레이즈 재활성화제(cholinesterase reactivator), 니코틴 대체 요법, 비타민 A 유사체 및 길항제, 비타민 B 유사체 및 길항제, 비타민 C 유사체 및 길항제, 비타민 D 유사체 및 길항제, 비타민 E 유사체 및 길항제, 비타민 K 유사체 및 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

컨쥬게이트: 검출제

예시적인 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 검출제와 컨쥬게이트된다. 예시적인 구현예에서, 검출제는 효소적 활성, 방사성, 발색 활성, 및/또는 결합 활성에 기반한 검출 가능한 (측정 가능한) 신호를 방출할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 신호는 방사성, 발색성, 비색성, 형광성, 화학 발광성, 증강된 화학 발광성, 직접 형광, 시간-분해 형광, 직접 화학 발광, 인광성, 효소적, 또는 마이크로- 또는 나노 입자, 스트렙타비딘/아비딘-비오틴 및 단백질 A의 결합에 기반한 신호이다. 예시적인 구현예에서, 검출제는 효소, 방사성 동위원소, DNA 리포터, 화학 발광 또는 형광 리포터, 또는 전기화학발광 태그를 포함한다. 예시적인 측면에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼라인 포스파테이즈 (AP), 글루코오스 옥시데이즈, 또는 베타-갈락토시데이즈이다. 예시적인 측면에서, 특정 시약에 노출되었을 때 효소는 화학 발광 또는 광 생성을 야기한다. 예시적인 측면에서, 방사성동위원소는 I¹²⁵ 이다. 예시적인 측면에서, DNA 리포터는 DNA 프로브이다. 예시적인 측면에서, 형광 리포터는 피코에리트린(phycoerythrin, PE), 예를 들어, B-PE, R-PE, 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)이다.

컨쥬게이트: 이량체 & 다량체

일부 구현예에서, 결합 컨스트럭트는 본 발명의 결합 컨스트럭트 하나 이상이 함께 연결된 이량체 또는 다량체로 제공된다. 일부 측면에서 이량체는 함께 연결된 동일한 유형 (예를 들어, 동일한 구조)의 두 개의 결합 컨스트럭트를 포함하는 동종이량체이다. 대체적인 측면에서, 이량체는 본 발명의 두 개의 결합 컨스트럭트를 포함하는 이종이량체이며, 상기에서 두 개의 결합 컨스트럭트는 구조적으로 서로 상이하다. 일부 측면에서 다량체는 하나 이상의 본 발명의 결합 컨스트럭트를 포함하는 동종다량체이며 각 결합 컨스트럭트는 동일한 유형 (예를 들어, 동일한 구조)의 컨스트럭트이다. 대체적인 측면에서, 다량체는 하나 이상의 본 발명의 결합 컨스트럭트 포함하는 이종다량체이며, 상기에서 이종다량체의 두 개 이상의 결합 컨스트럭트는 서로 구조적으로 상이하다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 이량체, 예를 들어, 각 Fab 단편은 FⅨp에 결합하고 WT FⅨ에 결합하지 않는, 두 개의 Fab 단편의 동종이량체를 포함하며, 예를 들어, WT FⅨ의 존재하에서도 또는 인간 혈장을 포함하는 샘플에서도 FⅨp에 결합한다. 예시적인 측면에서, 두 개의 Fab 단편을 포함하는 동종이량체는 이가이지만 FⅨp에 단일특이적이다. 예시적인 측면에서, 동종이량체의 각 Fab 단편은 서열번호 6-11의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재한다. 예시적인 측면에서, 동종이량체의 각 Fab 단편은 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 24 및 25 둘 다의 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 동종이량체의 각 Fab 단편은 서열번호 26 또는 서열번호 27 또는 서열번호 26 및 27 둘 다의 서열을 포함한다.

둘 이상의 결합 컨스트럭트는 표준 결합제(linking agent) 및 통상의 기술자에게 공지된 절차를 이용하여 함께 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 두 개의 (또는 그 이상) 결합 컨스트럭트를 연결하는 링커는 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는 이황화 결합이다. 예를 들어, 이량체의 각 단량체는 이황화 결합의 형성에 참여한 각각의 설프하이드릴 및 황 원자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프이다. 예시적인 측면에서, 이량체의 각 단량체는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 통해 연결된다. 예시적인 측면에서, 이량체의 각각의 단량체는 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 통해 연결된다.

예시적인 측면에서, 두 개의 Fab 단편을 포함하는 동종이량체는 두 개의 Fab 단편을 연결하는 링커를 포함한다. 예시적인 측면에서, 동종이량체는 Haylock et al., Int J. Oncol. 48(2): 461-470 (2016) 또는 Wang et al., Anal. Chem. 78: 997-1004 (2006)에 기술된 것과 같은 합성 더블 헬릭스 루프 헬릭스 모티프를 포함한다. 예시적인 측면에서, 동종이량체는 불변 항체 도메인을 포함한다. 그러한 항체 도메인은 Hu et al., Cancer Res 56: 3055-3061 (1996) 및 McGregor et al., Mol Immuno 31: 219-226 (1994)에 기술되어 있다. 예시적인 측면에서, 동종이량체는 세균성 상기 Wang et al. (2006)에 기술된 것과 같은 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 포함한다. 예시적인 측면에서, 동종이량체는 서열번호 28 또는 서열번호 27 또는 서열번호 28 및 27 둘 다의 서열을 포함한다.

핵산

본 발명에 추가로 제공되는 것은 본 발명에 기술된 임의의 결합 컨스트럭트 (예를 들어, 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다. 본 발명에 사용된 “핵산”은 "폴리뉴클레오타이드," "올리고뉴클레오타이드," 및 "핵산 분자,"를 포함하며, 일반적으로 단일-가닥 또는 이중-가닥, 합성되거나 천연 원천으로부터 얻을 수 있고 (예를 들어, 분리된 및/또는 정제된), 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있으며, 및 천연, 비-천연 또는 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 사이에서 발견되는 포스포디에스터 대신 포스포로아미데이트 결합 또는 포스포로티오에이트 결합과 같은 변경된 뉴클레오타이드-간 연결(inter-nucleotide linkage)을 함유할 수 있는, DNA 또는 RNA의 폴리머를 의미한다. 일반적으로 핵산이 임의의 삽입, 결실, 역위, 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에서 논의된 일부 경우에, 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위, 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산은 재조합된 핵산이다. 본 발명에서 사용된, 용어 “재조합”은 (i) 살아있는 세포 외부에서 천연 또는 합성 핵산 세그먼트(segments)와 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자의 결합에 의해 제작된 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에서 기술된 것들의 복제에서 기인한 분자를 말한다. 본 발명의 목적을 위해, 복제는 실험실 내 복제 또는 생체 내 복제일 수 있다.

통상의 기술분야에 공지된 절차를 이용하여 핵산은 화학적 합성 및/또는 효소적 라이게이션 반응에 기반해 제작될 수 있다. 예를 들어, 상기 Sambrook et al., 및 상기 Ausubel et al., 참조. 예를 들어, 자연발생한 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 혼성화 시 형성된 이합체(duplex)의 생리학적 안정성을 증가시키도록 다양하게 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드)를 이용하여 핵산이 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸) 우라실, 5- 카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N -치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸암모메틸우라실, 5- 메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'- 메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실- 5-옥시아세트산 (v), 뷔부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신(queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2- 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 3- (3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또는, 본 발명의 하나 이상의 핵산은 Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) 및 Synthegen (Houston, TX)와 같은 회사에서 구매할 수 있다.

일부 측면에서, 핵산은 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트의 일부만을 암호화한다. 예를 들어, 컨쥬게이트가 아미노산을 포함하지 않는 폴리머를 포함해서 핵산에 의해 암호화되지 않는 경우, 핵산은 핵산에 의해 암호화될 수 있는 컨쥬게이트의 일부분만을 암호화한다. 예시적인 구현예에서, 핵산은 각각의 서열번호 6-11를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 핵산은 각각의 서열번호 6-11를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하며 상기에서 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재한다. 예시적인 측면에서, 핵산은 발현 태그, 예를 들어, DYKDDDDK (서열번호 12)를 포함하는 FLAG 태그 및/또는 HHHHHH (서열번호 13)를 포함하는 헥사-His 태그를 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

핵산은 예를 들어, 본 발명의 결합 컨스트럭트의 재조합 생산 방법에 유용하다.

재조합 발현 벡터

본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터, 또는 “벡터”에 혼입(incorporated)될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 “벡터들”을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 “재조합 발현 벡터” 또는 “벡터”는 컨스트럭트가 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 벡터가 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 세포 내에서 발현하기에 충분한 조건 하의 세포와 접촉되었을 때, 숙주 세포에 의해 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드의 발현을 가능하게 하는 유전적으로-변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트를 의미한다. 본 발명의 벡터는 전체로는 자연-발생적이지 않다. 그러나, 벡터의 부분은 자연-발생적일 수 있다. 발명의 재조합 발현 벡터는 단일-가닥 또는 이중 가닥, 합성되거나 천연 원천으로부터 부분적으로 얻을 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 종류의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 자연-발생적 또는 비-자연 발생적 뉴클레오타이드 간 연결, 또는 이들 연결 유형 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변경된 뉴클레오타이드 또는 비-자연 발생적 뉴클레오타이드 간 연결은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질도입(transform) 또는 형질전환(transfect)하는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같은, 전파 및 증식을 위해 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 벡터를 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, LaJoIIa, CA), pET 시리즈 (Novagen, Madison, WI), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 및 pEX 시리즈 (Clontech, Palo Alto, CA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. λGTIO, λGTl 1, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNMl 149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터이다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 예를 들어, 상기 Sambrook et al.,, 및 상기 Ausubel et al.,에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 원형(circular) 또는 선형인 발현 벡터의 컨스트럭트는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 기능적인 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들어, CoIEl, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.

바람직하게, 재조합 발현 벡터는 적절히 및 벡터가 DNA- 또는 RNA- 기반인지가 고려하여, 벡터가 도입될 숙주 (예를 들어, 박테리아, 진균류, 식물, 또는 동물)의 유형에 특이적인, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을 포함한다.

재조합 발현 벡터는 폴리펩타이드 (이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함하는)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 자연성 또는 비자연성 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강력한, 약한, 유도 가능한, 조직-특이적인 및 발생-특이적인, 프로모터의 선택은 기술자의 통상의 기술 범위 내에 있다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서열의 프로모터와의 조합은 또한 기술자의 통상의 기술 범위 내에 있다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복 (long-terminal repeat)에서 발견된 프로모터일 수 있다.

발명의 재조합 발현 벡터는 일시적인(transient) 발현, 안정적인(stable) 발현, 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현(constitutive expression) 또는 유도적 발현(inducible expression)을 위해 만들어질 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 만들어질 수 있다.

숙주 세포

본 발명은 본 발명에 기술된 임의의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명에서 사용된, 용어 “숙주 세포”는 발명의 재조합 발현 벡터를 함유하거나 발현할 수 있는 세포의 임의의 유형을 말한다. 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 식물, 동물, 진균류, 또는 조류일 수 있으며, 또는 원핵생물 세포, 예를 들어, 세균 또는 원생 동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 일차 세포, 즉, 예를 들어, 인간의 기관에서 직접적으로 분리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 부착 세포 또는 현탁 세포, 즉 현탁액에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 통상의 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, DH5α E. coli 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovarian) 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293세포 등을 포함한다. 재조합 발현 벡터의 증폭 또는 복제의 목적을 위해, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, DH5α 세포인 것이 바람직하다. 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 목적을 위해, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포인 것이 바람직하다.

키트

본 발명에 제공되는 것은 본 발명의 하나 이상의 임의의 결합 컨스트럭트를 포함하는 키트이다. 예시적인 구현예에서, 키트는 본 발명에 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트 또는 핵산 또는 벡터 또는 숙주 세포 또는 전술한 것의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 측면에서, 결합 컨스트럭트는 키트에 미리 결정된 양 또는 농도로 제공된다. 예를 들어, 키트는 샘플에서 FⅨ 파두아를 검출하기 위한 미리 정해진 양의 결합 컨스트럭트를 포함하는 검출 키트일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 결합 컨스트럭트는 키트에 수용액으로 제공된다. 예시적인 측면에서, 수용액은 사용자에게 드라이아이스 상에서 제공된다. 일부 측면에서, 수용액은 키트의 다른 요소와 별도로 사용자에게 제공된다. 예시적인 구현예에서, 본 발명의 결합 컨스트럭트는 키트에 동결건조된 또는 다른 냉동-건조 형태로 제공된다. 예시적인 측면에서, 본 발명의 결합 컨스트럭트는 키트에 냉동된 또는 냉각보존된 형태로 제공된다. 예시적인 측면에서, 키트에서 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트의 농도는 약 1-10 μg/mL 또는 약 1-5 μg/mL이다. 예시적인 측면에서, 키트에서 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트의 농도는 약 1.5 μg/mL 내지 약 2.0 μg/mL이다.

예시적인 측면에서, 키트는 고체 지지체를 포함하며, 예시적인 측면에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트는 고체 지지체 상에 미리-코팅된다. 예시적인 측면에서, 키트는 튜브, 디쉬, 플라스크, 백, 플레이트 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트), 멤브레인, 필터, 비드, 화이버, 프로브 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 지지체를 포함한다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리머로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 아가로오스, 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리아크릴아마이드, 라텍스, 또는 공극 조절 유리로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 아가로오스로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리바이닐 디플루오라이드 (PVDF), 나이트로셀룰로오스, 나일론 66, 프로트란 나이트로셀룰로오스, 또는 종이로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 멤브레인은 Immobilon®Protran®, QuickDraw®, Westran®, Whatman® 또는 Hybond® 멤브레인 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 중 하나이다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리머 비드, 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인 또는 필터이다. 예시적인 측면에서, 키트는 약 100 ng 또는 그 이상, 약 150 ng 또는 그 이상, 약 200 ng 또는 그 이상, 약 500 ng 또는 그 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 용액으로 미리-코팅된 고체 지지체를 포함한다. 특정 측면에서, 키트는 약 50 ng 내지 약 550 ng, 약 100 ng 내지 약 500 ng, 약 125 ng 내지 약 400 ng, 약 150 ng 내지 약 350 ng, 약 175 ng 내지 약 300 ng, 또는 약 200 ng 내지 약 250 ng의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 용액으로 미리-코팅된 고체 지지체를 포함한다. 특정 측면에서, 키트는 약 100 ng 내지 약 150 ng, 약 150 ng 내지 약 200 ng, 약 200 ng 내지 약 500 ng의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 용액으로 미리-코팅된 고체 지지체를 포함한다. 예시적인 측면에서, 키트는 미리-분주된 양의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 고체 지지체를 포함한다. 예시적인 측면에서, 키트는 마이크로타이터 플레이트를 포함하며, 상기에서 마이크로타이터 플레이트의 각 웰은 약 1-10 μg/mL 또는 약 1-5 μg/mL의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 용액을 약 100 μL 내지 약 500 μL 포함하는 용액을 포함한다. 예시적인 측면에서, 키트는 마이크로타이터 플레이트를 포함하며, 상기에서 마이크로타이터 플레이트의 각 웰은 약 2.5 μg/mL의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 용액을 약 100 μL 내지 약 500 μL 포함하는 용액을 포함한다.

예시적인 측면에서, 키트는 본 발명에 기술된 검출 방법에 사용되는 추가적인 시약, 기질, 용매, 완충액, 희석제 등을 포함한다. 예시적인 측면에서, 하나 이상의 임의의 추가적인 요소는 키트에 미리 정해진 양, 예를 들어, 검출 분석에 필요하거나 적합한 양으로 제공된다. 예시적인 측면에서, 키트는 FⅨ 파두아-결합 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트에 결합하는 이차 항체를 포함한다. 예시적인 측면에서, 이차 항체는 검출제를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 예시적인 구현예에서, 검출제는 효소, 방사성 동위원소, DNA 리포터, 발색 또는 형광 리포터, 또는 전기 화학 발광 태그를 포함한다. 검출제는 본 발명에 기술된 임의의 검출제일 수 있다. 예시적인 측면에서, 이차 항체 또는 FⅨ 파두아-결합 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트는 검출제에 부착된다.

조성물

본 발명에 제공되는 것은 본 발명의 임의의 하나 이상의 결합 컨스트럭트를 포함하는 조성물이다. 예시적인 측면에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이 검출제와 혼합된 결합 컨스트럭트를 포함한다. 예시적인 측면에서, 검출제는 본 발명에 기술된 임의의 검출제이다. “컨쥬게이트: 검출제” 제목의 섹션 참조.

예시적인 측면에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이 대상으로부터 수득한 생물학적 샘플과 혼합된 결합 컨스트럭트를 포함한다. 예시적인 측면에서, 생물학적 샘플은 본 발명에 기술된 임의의 생물학적 샘플이다. “샘플” 제목의 섹션 참조. 예시적인 측면에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이, 인간 혈장, 또는 이의 희석된 분획을 포함하는 생물학적 샘플과 혼합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 예시적인 측면에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이, 인간 조직, 또는 이의 세포를 포함하는 생물학적 샘플과 혼합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 예시적인 측면에서, 생물학적 샘플은 간 조직을 포함한다. 예시적인 측면에서, 조성물은 추가로 검출제를 포함한다.

샘플, 예를 들어, 인간 혈장 단백질을 포함하는 생물학적 샘플과 혼합된 본 발명의 임의의 하나 이상의 결합 컨스트럭트를 포함하는 조성물이 본 발명에 추가로 제공된다. 예시적인 측면에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이, 인자 IX, 인자 Ⅱ, 및 인자 X, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 혈장 단백질과 혼합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 예시적인 측면에서, 조성물은 추가로 검출제를 포함한다.

검출 방법

본 발명에 제공된 결합 컨스트럭트는 예를 들어, 샘플, 예를 들어, 예를 들어, FⅨ 파두아 및 WT FⅨ를 포함하는 임상 샘플에서 FⅨ 파두아의 명백하거나 특이적인 검출을 가능하게 하는 검출 방법에 유용하다. 결합 컨스트럭트는 방사면역측정법 (RIA), 마그네틱 면역분석(magnetic immunoassay, MIA), 면역세포화학적(immunocytochemical, ICC) 분석, 면역조직화학적(immunohistochemical, IHC) 분석, 면역형광 분석(immunofluorescent assays), ELISA, EIA, ELISPOT, 효소 증폭 면역분석(enzyme multiplied immunoassay), 방사결합 분석(radiobinding assay), 웨스턴 블롯(Western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 닷 블랏(dot blots), 유세포 분석(flow cytometry), 실시간 면역정량 PCR(real-time immunoquantitative PCR), 단백질 마이크로어레이 등과 같은, 통상의 기술 분야에 공지된 임의의 항체-기반 분석 또는 기술 또는 면역 분석에 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, The Immunoassay Handbook (Fourth Edition); Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques, ed. Wild, Elsevier Ltd. (Oxford, UK) 2013, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY) 2012, and Immunoassay, Diamandis and Christopolous, Academic Press 1996 참조.

따라서, 본 발명에 제공되는 것은 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하기 위한 본 발명에 기술된 결합 컨스트럭트 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트), 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 키트의 용도이다. 예시적인 측면에서, 샘플은 FⅨ 파두아를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 투여받은 대상으로부터 수득한 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 대상은 출혈 장애를 앓고 있고 선택적으로 이종 인자 IX 파두아를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 발현에 의해 달성되는 인자 IX 대체 요법을 받고 있다.

또한 본 발명에 제공되는 것은 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법이다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (i) 샘플을 본 발명에 기술된 바와 같이 결합 컨스트럭트 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트)와 접촉시켜 FⅨ 파두아 및 결합 컨스트럭트 (예를 들어, 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트)를 포함하는 복합체 (예를 들어, 면역 복합체)를 형성하고, 및 (ii) 복합체를 검출하는 것을 포함한다.

예시적인 구현예에서, FⅨ 파두아는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

예시적인 구현예에서, 복합체를 검출하는 것은 검출제의 신호를 검출하는 것을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 신호는 효소적 활성, 방사능, 발색 활성 및/또는 결합 활성에 기반한다. 예시적인 구현예에서, 신호는 방사성, 발색성, 비색성, 형광성, 화학 발광성, 증강된 화학 발광성, 직접 형광, 시간-분해 형광, 직접 화학 발광, 인광성, 효소적, 또는 마이크로- 또는 나노 입자, 스트렙타비딘/아비딘-비오틴 및 단백질 A의 결합에 기반한 신호이다. 예시적인 구현예에서, 검출제는 효소, 방사성 동위원소, DNA 리포터, 발색 또는 형광 리포터, 또는 전기 화학 발광 태그를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 복합체를 검출하는 것은 복합체를 검출 또는 전극의 저항 변화 (FⅨ 파두아가 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트에 결합함에 따른)를 측정하는데 표면 플라즈몬 공명을 수행하는 것을 포함한다. Gonzalez-Daz et al., "Plasmonic Au/Co/Au nanosandwiches with Enhanced Magneto-Optical Activity" Small　4(2): 202-5 (2008) 및 Tsekenis (2008). "Label-less immunosensor assay for myelin basic protein based upon an ac impedance protocol." Analytical Chemistry　80　(6): 2058-62 (2008) 참조. 예시적인 측면에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼라인 포스파테이즈 (AP), 글루코오스 옥시데이즈, 또는 베타-갈락토시데이즈이다. 예시적인 측면에서, 효소는 이들이 화학발광하거나 빛을 생산하도록 만드는 시약에 노출된다. 예시적인 측면에서, 방사성동위원소는 I¹²⁵이다. 예시적인 측면에서, DNA 리포터는 DNA 프로브이다. 예를 들어, Rajkovic, "Immunoquantitative real-time PCR for detection and quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin B in foods." Applied and Environmental Microbiology 72 (10): 6593-9 (2006); 및 Gofflot "Immuno-quantitative polymerase chain reaction for detection and quantitation of prion protein." Journal of Immunoassay and Immunochemistry 25 (3): 241-58 (2004) 참조. 예시적인 측면에서, 형광 리포터는 피코에리트린 (PE), 예를 들어, B-PE, R-PE, 또는 알로피코시아닌 (APC)이다

예시적인 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 검출제에 컨쥬게이션된다. 예시적인 구현예에서, 컨쥬게이트는 검출제를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 검출제에 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이트가 검출제를 포함하지 않는다. 그러한 예시적인 구현예에서, 방법은 샘플을 검출제를 포함하는 이차 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기에서 이차 항체는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트에 결합한다. 이차 항체가 항-FⅨ 파두아 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트에 결합할 것이라면, 이차 항체는 임의의 이소타입 또는 클래스의 임의의 항체일 수 있다.

예시적인 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 고체 지지체에 컨쥬게이션된다. 예시적인 구현예에서, 컨쥬게이트는 고체 지지체를 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체는 튜브, 디쉬, 플라스크, 백, 플레이트 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트), 멤브레인, 필터, 비드, 화이버, 프로브 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리머로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 아가로오스, 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리아크릴아마이드, 라텍스, 또는 공극 조절 유리로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 아가로오스로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리바이닐 디플루오라이드 (PVDF), 나이트로셀룰로오스, 나일론 66, 프로트란 나이트로셀룰로오스, 또는 종이로 만들어진다. 예시적인 측면에서, 멤브레인은 Immobilon®Protran®, QuickDraw®, Westran®, Whatman® 또는 Hybond® 멤브레인 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 중 하나이다. 예시적인 측면에서, 고체 지지체는 폴리머 비드, 자성 또는 상자성 비드, 마이크로타이터플레이트, 멤브레인 또는 필터이다.

대상

예시적인 구현예에서, 본 발명에서 인용된 대상은 마우스 및 햄스터와 같은 설치목(Rodentia)의 포유동물, 및 토끼와 같은 중치류(Logomorpha) 목의 포유동물, 고양잇과(Feline) (고양이) 및 개과(Canines) (개)를 포함하는 식육목 유래 포유동물, 우과(Bovine) (소) 및 멧돼지과(Swine) (돼지)를 포함하는 우제류(Artiodactyla) 목 유래 포유동물 또는 말과(Equine) (말)를 포함하는 말목(Perissodactyla)의 포유동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 포유동물이다. 일부 측면에서, 포유동물은 영장류(Primates), 광비원류(Ceboids), 또는 시모이드(Simoids) (원숭이) 목 또는 유인원목(Anthropoids) (인간 및 유인원)이다. 예시적인 측면에서, 포유동물은 인간이다. 예시적인 측면에서, 인간 대상은 성인, 예를 들어, 18세 또는 그 이상, 또는 청소년기이다. 예시적인 측면에서, 대상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 FⅨ 파두아를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터가 투여되었다. 예시적인 측면에서, 대상은 출혈 장애를 가진다. 예시적인 측면에서, 대상은 대상의 피가 제대로 응고되지 않는 출혈 장애를 가진다. 예시적인 측면에서, 대상은 인자 IX, 예를 들어, WT 인자 IX의 발현이 결핍되거나 낮은 발현 수준을 나타낸다. 예시적인 측면에서, 대상은 인자 IX을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 가진다. 예시적인 측면에서, 대상은 혈우병, 예를 들어, 혈우병 B (크리스마스증으로도 알려진)을 앓는다. 예시적인 측면에서, 대상은 정상보다 높은 응고 활성을 나타낸다. 예시적인 측면에서, 대상은 자연-발생적인 FⅨ 파두아, 예를 들어, FⅨ 파두아의 발현을 유발하는 유전자 돌연변이를 가진다.

샘플

예시적인 구현예에서, 본 발명에서 인용된 샘플은 하나 이상의 체액, 예를 들어, 인간 체액을 포함하는 생물학적 샘플이다. 예시적인 측면에서, 샘플은 대상으로부터 수득한 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 모유, 타액, 점액, 정액, 질 분비물, 세포 추출물, 염증성 체액(inflammatory fluids), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 대변, 유리액(vitreous humor), 또는 소변을 포함하나, 이에 한정되지 않는 체액을 포함한다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈액, 혈장, 또는 혈청을 포함한다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈액, 혈장, 또는 혈청으로부터 제조된다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈액, 혈장, 또는 혈청의 분획이다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플이다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈액 또는 이의 분획 (예를 들어, 혈장, 혈청)을 포함한다. 예시적인 측면에서, 샘플은 혈장을 포함하거나 혈장이다.

예시적인 측면에서, 샘플은 인간 조직 샘플이다. 예시적인 측면에서, 인간 조직 샘플은 근육 조직, 상피 조직, 결합 조직, 또는 신경 조직을 포함한다. 예시적인 측면에서, 인간 조직 샘플은 골조직을 포함한다. 예시적인 측면에서, 인간 조직 샘플은 심장 조직, 비장 조직, 림프절 조직, 뇌 조직, 척수 조직, 신경 조직, 귀, 코 또는 눈 조직, 유방 조직, 피하 조직, 유선(mammary gland) 조직, 골수 조직, 림프 조직, 비인두(nasopharynx) 조직, 후두(larynx) 조직, 기관(tracheal) 조직, 기관지(bronchus) 조직, 폐 조직, 피부 조직, 침샘 조직, 혀 또는 입 유래 조직, 구강인두(oropharynx) 조직, 인후두 (laryngopharynx)조직, 식도(esophagus) 조직, 위 조직, 소장 조직, 맹장(appendix) 조직, 대장(colon) 조직, 결장(rectal) 조직, 항문(anal) 조직, 간 조직, 담관(biliary tract) 조직, 췌장 조직, 담낭(gall bladder) 조직, 신장 조직, 요관(ureter) 조직, 방광(bladder) 조직, 요도(urethra) 조직, 자중(uterine) 조직, 질 조직, 외음부(vulvar) 조직, 난소 조직, 태반 조직, 음낭(scrotum) 조직, 음경(penis) 조직, 전립선 조직, 고환 조직, 정낭(seminal vesicle) 조직, 뇌하수체(pituitary) 조직, 송과체(pineal) 조직, 갑상샘 조직, 부갑상샘 조직, 부신(adrenal) 조직, 또는 랑게르한스섬 조직을 포함한다. 예시적인 측면에서, 인간 조직 샘플은 간 조직 또는 비장 조직 또는 신장 조직을 포함한다. 예시적인 측면에서, 인간 조직 샘플은 간 조직을 포함한다.

하기의 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 예시일 뿐이며 이의 범위를 한정하려는 것이 아니다.

실시예

실시예 1

본 실시예는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 만드는 방법을 보여준다.

파지 디스플레이 방법이 FⅨ 파두아 결합 컨스트럭트(binding construct)에 특이적인 후보 선택에 사용되었다. 후보를 포획하기 위해, 338 위치에 단일 아미노산 치환을 가진 선형 펩타이드, 338 위치에 단일 아미노산 치환을 가진 구조적 펩타이드, 또는 재조합 FⅨ 파두아 전장을 이용하여 파지 라이브러리가 스크리닝되었다. 야생형 FⅨ 서열과 경쟁이 있는 및 FⅨ 서열과 경쟁이 없는, 3 라운드 패닝으로 몇몇 후보 결합 컨스트럭트를 동정하였다. 수득한 후보들의 특이성 및 친화도를 결정하기 위해 BIACORE 및 ELISA 실험이 수행되었다.

서열 DRATCLLSTKFT를 포함하는 선형 펩타이드로 한 후보 (BC1로 명명)를 수득하고, 서열 LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH을 포함하는 구조적 펩타이드로 두 후보 (BC2 및 BC3로 명명)를 수득하였다. FⅨ 파두아가 번갈아가며 나타난 선형 펩타이드 또는 구조적 펩타이드를 포함하는 펩타이드로 또 다른 후보 (BC4)를 수득하였다.

스크리닝 분석은 후보가 FⅨ 파두아에 결합하는 것을 보였다. BC2 및 BC3의 경우 야생형 FⅨ에 대한 결합 신호 (배경 대비 배수)는 11 미만인 반면, FⅨ 파두아에 대한 결합 신호 (배경 대비 배수)가 71 초과였다. BC1의 경우, FⅨ에 대한 결합 신호 (배경 대비 배수)는 1인 반면, FⅨ 파두아에 대한 결합 신호는 거의 200에 가까웠다. 스크리닝 분석 제 2 세트에서, 야생형 FⅨ에 대한 결합 신호는 BC1, BC2, 및 BC3의 각각의 경우 1 또는 그 이하인 반면, BC1, BC2, 및 BC3의 경우 FⅨ 파두아에 대한 결합 신호는 각각 70, 30, 및 10이었다. BC4는 36 이상의 FⅨ 파두아에 대한 결합 신호를 보여준 반면, 야생형 FⅨ에 대한 신호는 약 1이었다.

FⅨ 파두아에 대한 BC1의 결합은 BC1의 농도와 FⅨ 파두아의 농도가 다양하게 코팅된 Ni²⁺ 플레이트 상에서 ELISA를 통해 테스트되었다. 테스트된 BC1 및 FⅨ 파두아의 농도는 .04 μg/ml, 0.2 μg/ml, 1 μg/ml, 및 5 μg/ml이었다. BC1의 FⅨ 파두아에 대한 결합 신호가 wt FⅨ 대조군과 비교되었다. 테스트된 농도 각각에서, FⅨ 파두아의 BC1에 대한 결합이 WT FⅨ의 BC1에 대한 결합보다 컸다 (도 2).

야생형 FⅨ의 존재하에서 BC1, BC2, 및 BC3의 FⅨ 파두아에 대한 결합이 ELISA를 통해 테스트되었다 (도 10에 나타난 바와 같이). MaxiSorp 플레이트는 5 μg/mL의 BC1, BC2, 또는 BC3 및 FⅨ 파두아를 다양한 농도로 함유하는 용액으로 코팅되었으며, 야생형 FⅨ 5 μg/mL가 코팅된 플레이트에 첨가되었다. 테스트된 FⅨ 파두아 농도는 0 μg/mL, 0.156 μg/mL, 0.313 μg/mL, 0.625 μg/mL, 1.25 μg/mL, 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 및 10 μg/mL이었다. 도 3에 나타난 바와 같이, BC1은 WT 인자 IX의 존재하에서도 FⅨ 파두아에 대해 강력한 친화도를 보였다. BC1은 WT 인자 IX가 5 μg/mL존재할 때 가장 높은 감도(sensitivity)를 보였다.

5% 인간 혈장 및 5 μg/mL WT 인자 IX가 존재할 때 다양한 농도의 FⅨ 파두아에 대한 BC1의 결합이 ELISA를 통해 테스트되었다 (도 10에 나타난 바와 같이). 도 4에 나타난 바와 같이, WT 인자 IX 및 다른 혈장 단백질의 존재하에서도, FⅨ 파두아에 대한 BC1 결합이 FⅨ 파두아의 농도가 증가함에 따라 증가한다. FⅨ 파두아는 25 ng/ml 내지 1000 ng/ml로 다양하였다.

벤즈아미딘 50 mM을 함유하는 다양한 %의 혈장 용액에서의 FⅨ 파두아에 대한 BC1의 결합이 ELISA (도 10에 나타난 바와 같이)를 통해 테스트되었다. 용액은 5%, 10%, 또는 20% (v/v) 혈장 용액이었다. 도 5에 나타난 바와 같이, BC1은 20% 혈장 용액에서 3.13 ng/ml 내지 200 ng/ml의 범위의 FⅨ 파두아를 검출할 수 있었다.

WT 인자 IX 5 μg/mL을 함유하는 20% 인간 현장의 존재 하에서, BC1, BC2, 및 BC4의 FⅨ 파두아에 대한 결합이 ELISA로 테스트되었다. 분석에 사용된 FⅨ 파두아의 농도는 0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 ng/ml이었다. 도 6에 나타난 바와 같이, BC1은 가장 높은 감도를 나타낸 반면, BC2는 가장 낮은 감도를 나타냈고 WT 인자 IX 5 μg/mL을 함유하는 20% 인간 혈장 샘플에서 FⅨ 파두아와의 결합에 실패하였다. BC4는 FⅨ 파두아에 대해 BC1보다 낮은 결합능(binding ability)을 보였다 (도 6). BC2와 같이, BC3은 샘플을 함유하는 20% 인간 혈장에서 FⅨ 파두아-특이적 검출 항체로 기능하지 못했다 (데이터 미도시).

다른 응고 인자에 대한 BC1 및 BC4의 결합이 ELISA를 통해 테스트되었다. 특히, 인자 Ⅱ 및 인자 X에 대한 BC1 또는 BC4의 결합이 테스트되었다. 도 7에 나타난 바와 같이, BC1의 결합이 인자 Ⅱ 또는 인자 X에 대한 교차-반응을 나타내지 않고 FⅨ 파두아에 대해 매우 특이적이었던 반면, BC4는 반대로 인자 Ⅱ에 경미한 교차-반응을 보였다.

BC1의 결합이 FⅨ 파두아에 대해 특이적이었다. 반면, 두 개의 다른 결합 컨스트럭트 (BC5 및 BC6)는 구조적 펩타이드를 이용한 파지 디스플레이를 통해 만들어졌다. 도 8에 나타난 바와 같이, WT FⅨ에 대한 유의미한 결합이 입증되었기 때문에, BC5 및 BC6의 결합은 FⅨ 파두아에 대해 특이적이지 않았다.

BC1에 대한 KD 값이 Biacore 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 통해 결정되었다. BC1의 KD는 56 nM이었다. BC1은 FⅨ 파두아에 대해 다른 후보들에 비해 가장 높은 친화도를 보였다. 이 값은 상용되는 항체의 KD (M) 값보다 더 좋거나, 유사하다. 예를 들어, 상업적으로 사용 가능한 양(sheep) 항-인간 야생형 FⅨ 항체의 KD(M) 값은 3.11 x 10^-9이다.

BC1의 중쇄 및 경쇄의 CDRs의 서열은 PCR 후 서열을 번역하여 결정였으며 서열은 하기와 같다:

선형 펩타이드로 수득한 BC1는 고유한 및 특이적인 FⅨ 파두아 결합을 제공하였고 이 활성이 확인되었다. BC1은 ~3 ng/mL의 혈장의 검출 한계를 나타냈고 매우 높은 농도 (>5 μg/mL)에서도 야생형 FⅨ에 대한 교차 반응을 나타내지 않았다.

이 데이터는 매우 특이적인 항-FⅨ 파두아 항체가 생성되었음을 뒷받침한다. 이 항체는 인간 혈장 샘플에서 FⅨ 파두아와 결합하고, 임의의 WT 인자 IX, 인자 Ⅱ 및 인자 X와는 결합하지 않는다. 이 데이터는 이 항체가 예를 들어, 야생형 FⅨ 및 FⅨ 파두아 항원 수준을 선택적으로 구별하는 임상 분석의 개발에 사용될 수 있음을 뒷받침한다.

실시예 2

본 실시예는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 방법을 보여준다.

새로 개발된 인자 IX 파두아 (FⅨp)-특이적 결합 항체 (BC1)의 Fab 단편이 표준 조건을 이용하여 2 μg/mL로 96-웰 마이크로플레이트에 코팅되었다. 상업적으로-사용 가능한 비오틴화된 다클론 양 항-인간 FⅨ IgG 및 스트렙타비딘-퍼옥시다아제가 검출 시스템으로서 사용되었다. 분석 요소의 개략도를 도 9에 나타냈다.

27.1 - 0.85 ng/mL 범위의 FⅨp 농도를 포함하는 FⅨp 제제로 6-포인트 검량선을 생성함으로써 분석 보정(Assay calibration)하였다. 환자의 샘플은 5 mg/mL 소혈청 알부민, 10 mM 벤즈아미딘, 10 mM CaCl₂ 및 0.05% Tween 20를 함유하는 HEPES/NaCl 버퍼로 희석하였다.

정상 인간 혈장 또는 정제된 인간 FⅨ는 FⅨp-특이적 ELISA에서 신호를 나타내지 않았다. 정확한 검량선이 얻어졌다. 1/10-희석된 정상 인간 혈장에 첨가한 FⅨp는 버퍼 중의 분석 표준에 대해 얻은 것과 평행한 희석 반응 곡선으로 허용 가능한 회수율(recovery)을 나타냈다. 중요한 것은, FⅨp를 암호화하는 발현 벡터로 처리된 6명 환자의 샘플의 분석은 시간에 따라 매우 유사한 FⅨp 단백질 및 FⅨ 활성 커브를 보여줬으며, 교차-반응 물질 양성(cross-reactive material positive, CRM+) 환자의 샘플은 CRM- 환자에 비해 FⅨp 단백질 신호가 증가하지 않는 것으로 나타나, 분석의 특이성을 나타냈다.

FⅨp-특이적 ELISA는 FⅨp 단백질의 측정에 의한 치료 결과의 추가적인 모니터링을 가능하게 한다.

실시예 3

본 실시예는 FⅨ 파두아에 대한 선택적 ELISA를 및 인간 혈장 샘플을 테스트하기 위한 ELISA의 용도를 보여준다.

BC1 (0.94 mg/mL) 제제를 pH 9.5의 0.1 M NaHCO₃-Na₂CO₃을 이용하여 1/500로 희석하였고 100　μL/웰로 0 내지 +10℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션함으로써 Maxisorp F96 플레이트의 웰에 결합시켰다. 샘플 및 시약의 희석 및 플레이트의 블로킹에 사용된 희석 버퍼 (DB)는 0.1 M Hepes, 비오틴-없는 소 혈청 알부민 (BSA)을 5 mg/mL 함유하는 pH 7.2의 0.1 M NaCl, 10　mM Ca²⁺, 0.05% Tween 20 (Bio-Rad, EIA 등급) 및 10 mM 벤즈아미딘이었다. 코팅 후에, 플레이트는 0.05% Tween 20를 함유하는 인산염-완충 식염수로 세척되었고 상온 (RT, 18 내지 26℃)에서 60분 동안 200 μL DB/웰로 인큐베이션함으로써 웰이 블로킹되었다. 블로킹 단계는 세척함으로써 종료되었다. 그 후 1+1 단계 희석법으로 제조된 표준/샘플 희석물이 플레이트에 직접 로딩되었다. 희석물 (100 μL/웰)을 RT에서 60분 동안 플레이트에서 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 다시 세척하고, F9-1030A (CoaChrom)에서 제조된 비오틴화된 다클론 양 항-인간 FⅨ 검출 항체를 첨가하였다 (100 μL/웰; 사용 희석 1/500). RT에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 세척하고, 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 (DakoCytomation)를 첨가하고 (100 μL/웰; 1/4,000 희석) RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적이고 광범위한 세척 과정 후, 결합된 퍼옥시다아제 활성을 즉시 사용 가능한(ready-to-use) 퍼옥시다아제 기질 SureBlue로 측정하였고, 3 N 황산으로 반응을 중지시켰다. 그 후 플레이트를 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 측정하였고, 620 nm에서 얻은 결과를 뺐다.

도 11은 정제된 인간 FⅨ 파두아 제제 및 5 μg/mL의 WT FⅨ 농도를 가진 신선-동결 대조군 혈장 제제 (CRYOCheck; Precision Biologics)에 대해 얻은 농도-반응 곡선을 나타낸다.

29 내지 0.91 ng/mL의 범위를 포함하는 재조합 인간 FⅨ 파두아 농도에 대해 얻은 용량-반응 곡선은 정확성, 정밀도 및 선형성에 대한 요건을 충족시켰으며, 따라서 샘플 추정에 적절하다고 여겨졌다. 특히, 로그-로그 회귀 곡선의 상관 계수는 0.9985였고 평균 정확성은 101.4% 및 정밀도는 7.0%였다. 정확성 및 정밀도는 검량선의 6개의 농도에 대해 측정된 신호를 역-적합(back-fitting)함으로써 계산되었다. 데이터는 추가로 FⅨ 파두아에 대한 접근법의 완벽한 특이성을 입증했다: 정상 혈장 농도 5 μg/mL에서 FⅨ wt를 함유하고 1/10의 최소 희석을 이용하여 측정된 인간 기준 혈장은 어떠한 신호도 유발하지 않았다.

ELISA는 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 542.42 μg/ml의 단백질 농도를 가진 또 다른 재조합 인간 FⅨ 파두아 제제를 이용하여 검량선이 얻어졌다. 2310 IU/mg 단백질의 특정 응고 활성이 이 제제를 항진활성(hyperactive) FⅨ 파두아 변이체로서 명확하게 분류하였다. 1/20,000 내지 1/640,000 범위의 단계 희석법 희석물은 27.1-0.85 ng/mL 범위의 FⅨ 농도로 정의된다. 도 12는 블랭크-보정된 평균 신호의 로그 및 6개 분석 표준의 FⅨ 농도 사이의 선형 회귀 곡선으로 얻은 표준 검량선을 나타낸다. 삽입은 역-적합된 분석 교정기(calibrator) D1 내지 D6와 이들 각각의 공칭 농도의 일치를 나타낸다. FⅨ 파두아에 대한 검량선은 27.1 내지 0.85 ng/mL의 농도 범위에서 좋은 선형성을 나타낸다. 이는 평균 상관 계수 r=0.9992 (범위: 0.9986 - 0.9996)로 나타내지고, 검량선의 개별 포인트에 대해 계산된 역-적합된 농도에 의해 뒷받침되며, 전체 범위에 걸쳐 예상된 것보다 9% (범위: 91.1% 내지 108.6%) 미만으로 달랐다. 이 역-적합 데이터들은 리간드-결합 분석의 적합한 검량선을 식별하기 위한 생체 시료 분석법 검증(bioanalytical method validation)에 대한 EMA 가이드라인에 의해 정의된 요건을 쉽게 충족시킨다. 검량선의 상대적 총 오차(relative total error, RTE)는 낮았다. 특히, RTE는 검량선 표준의 평균 블랭크-보정된 광학 밀도 (optical densities, ODs)를 역-적합하여 계산되었다. 수득한 농도는 이들의 희석배수로 곱해 정규화하였다. RTE는 분석 표준의 공칭된 농도 및 역-적합 접근법으로 결정된 평균 농도 및 이 평균 농도의 이중 표준 편차들 간의 절대차의 합으로 계산되었다. 또한, 기울기(slope)의 낮은 RSD는 이들 커브가 임상 환경(clinical setting)에서 사용될 분석에서 요구되는 재현성에서 얻어질 수 있음을 보여주었다.

ELISA가 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 정상 신선-동결 인간 혈장 및 FⅨ-결핍 혈장에 FⅨ 파두아를 첨가하였다. 혈장 제제를 첨가한 두 계의 단계 희석물은 1/10 희석에서 시작하였다. 도 13은 버퍼에서 얻은 것들과 비교한 두 혈장 샘플의 희석-반응 커브(dilution-response curves)를 나타낸다. FⅨ 파두아-첨가 혈장 샘플에 대해 얻은 희석-반응 커브의 기울기는 버퍼 희석물에 대해 얻은 것과 5% 미만으로 달랐다. 이는 혈장 매트릭스가 분석 수행에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다.

통상적인 다클론 항-인간 FⅨ 항체는 또한 인간과 원숭이 FⅨ 간의 높은 서열 상동성 때문에 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 FⅨ (파일에 있는 데이터)에 결합한다. 따라서, FⅨ 파두아 ELISA의 선택성이 구연산염 처리된 원숭이 혈장의 매트릭스에 대해서도 확인되었다. 특히, 구연산염 처리된 암컷 및 수컷 원숭이 혈장 샘플에 FⅨ 파두아가 첨가되었고 1/10의 최소 희석 배수에서 시작한 단계 희석물을 측정하였다. 도 14는 버퍼에서 얻은 결과와 비교한 두 혈장 샘플의 희석-반응 커브를 나타낸다.

FⅨ 파두아-첨가된 혈장 샘플에 대해 얻은 희석-반응 커브의 기울기는 버퍼 단계 희석물에 대해 얻은 것과 4% 미만으로 달랐다. 이는 구연산염 처리된 원숭이 혈장 매트릭스가 분석 수행에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다. 더욱이, 첨가된 FⅨ 파두아 농도의 회수율은 암컷 혈장 샘플 및 수컷 혈장 샘플 각각에 대해 91.3% 및 103.1%였다.

FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 임상 시험 1/2상의 대상에서 FⅨ 파두아를 발현하는 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 얻은 구연산염 처리된 혈장 샘플에서 FⅨ 파두아를 측정하였다. 대상 유래 혈장 샘플을 이용하여, FⅨ 파두아 ELISA를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 대상으로부터 얻은 혈장 샘플을 이용한 FⅨ 응고 활성 및 FⅨ 항원 측정이 표준 방법을 이용하여 수행되었다. 도 15는 임상 시험 1/2상에서 대상으로부터 얻은 혈장 샘플에 대해 수행된 FⅨ 활성 및 FⅨ 단백질 측정 결과를 나타내며, 그 결과는 1 U/mL에 가까운 FⅨ 항원 농도를 지속적으로 보여주지만, FⅨ 활성은 정량 하한 아래로 나타났다. 이 데이터는 대상이 통상적인 FⅨ ELISA로 측정 가능한 CRM+, 즉, 응고-비활성 FⅨ 단백질을 입증할 자격을 부여하였다. 활성 전환을 위해 분석 표준 (2310 IU/mg)의 특정 활성을 사용하고, 항원 전환을 위해 5 μg/mL의 정상 인간 FⅨ 농도를 사용하여, ng/mL로 얻은 FⅨ 파두아 ELISA의 결과를 활성 및 항원 단위로 전환하였다.

FⅨ 활성이 측정된 것을 입증하는 FⅨ 활성 데이터와 평행한 FⅨ 파두아 ELISA 데이터는 FIC 파두아의 발현에 의존적이다. 반면, FⅨ 파두아-특이적 ELISA로 측정된 FⅨ 항원 농도는 표준 ELISA로 얻은 것보다 명백하게 낮았고, 이는 FⅨ 파두아 ELISA가 CRM+ 물질 및 FⅨ 파두아를 구별할 수 있음을 입증한다.

FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 임상 시험 1/2상의 두 번째 대상에서 FⅨ 파두아를 발현하는 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 얻은 구연산염 처리된 혈장 샘플에서 FⅨ 파두아를 측정하였다. 두 번째 대상 유래 혈장 샘플을 이용하여, FⅨ 파두아 ELISA가 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 두 번째 대상으로부터 얻은 혈장 샘플을 이용한 FⅨ 응고 활성 및 FⅨ 항원 측정이 표준 방법을 이용하여 수행되었다. 도 16은 두 번째 대상으로부터 얻은 혈장 샘플에 대해 수행된 FⅨ 활성 FⅨ 단백질 측정 결과를 나타내며, 그 결과는 0.8 U/mL에 가까운 FⅨ 항원 농도를 지속적으로 보여주지만, FⅨ 활성은 정량 하한 아래로 나타났다. 이 데이터는 대상이 통상적인 FⅨ ELISA로 측정 가능한 CRM+, 즉, 응고-비활성 FⅨ 단백질을 입증할 자격을 부여하였다. FⅨ 파두아 ELISA의 결과, 활성 전환을 위해 분석 표준 (2310 IU/mg)의 특정 활성을 사용하고, 항원 전환을 위해 5 μg/mL의 정상 인간 FⅨ 농도를 사용하여, ng/mL로 얻은 FⅨ 파두아 ELISA의 결과를 활성 및 항원 단위로 전환하였다.

FⅨ 활성이 측정된 것을 입증하는 FⅨ 활성 데이터와 평행한 FⅨ 파두아 ELISA 데이터는 FIC 파두아의 발현에 의존적이다. 반면, FⅨ 파두아-특이적 ELISA로 측정된 FⅨ 항원 농도는 표준 ELISA로 얻은 것보다 명백하게 낮았고, 이는 FⅨ 파두아 ELISA가 CRM+ 물질 및 FⅨ 파두아를 구별할 수 있음을 입증한다.

FⅨ CRM+이 없는 임상 시험 1/2상의 대상에서 FⅨ 파두아를 발현하는 AAV2/8 바이러스 벡터 처리 후 얻은 구연산염 처리된 혈장 샘플에서 FⅨ 파두아를 측정하였다. FⅨ CRM+이 없는 대상 유래 혈장 샘플을 이용하여, FⅨ 파두아 ELISA가 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. FⅨ CRM+가 없는 대상 유래 혈장 샘플을 이용한 FⅨ 응고 활성 및 FⅨ 항원 측정이 표준 방법을 이용하여 수행되었다. 도 17은 대상으로부터 얻은 혈장 샘플에 대해 수행된 FⅨ 활성 FⅨ 단백질 측정 결과를 나타내며, 그 결과는 CRM+이 지속적으로 없는 것으로 나타났다. FⅨ 파두아 ELISA의 결과, 활성 전환을 위해 분석 표준 (2310 IU/mg)의 특정 활성을 사용하고, 항원 전환을 위해 5 μg/mL의 정상 인간 FⅨ 농도를 사용하여, ng/mL로 얻은 FⅨ 파두아 ELISA의 결과를 활성 및 항원 단위로 전환하였다. FⅨ 활성이 측정된 것을 입증하는 FⅨ 활성 및 FⅨ 단백질 데이터와 평행한 FⅨ 파두아 ELISA 데이터는 FIC 파두아의 발현에 의존적이다.

실시예 4

FⅨ 발색 활성 분석 또한 BC1를 이용하여 개발되었다. FⅨ 파두아는 플레이트-결합된 BC1에 결합함으로써 샘플 매트릭스로부터 선택적으로 정제되었다. 인간 FⅨ 야생형을 포함하는 비-결합된 샘플 성분들은 발색 인자 IX Test 221806 (Hyphen Biomed)가 마이크로플레이트의 웰에 적용되기 전에 광범위한 세척으로 제거되었다. 샘플은 상기 기술된 희석 버퍼로 희석되었다. 도 18은 FⅨ 파두아 및 정상 기준 혈장 제제에 대해 얻은 용량 반응-커브를 나타낸다.

FⅨ 파두아는 농도-반응 커브를 나타내는 반면, 약 1 U/mL의 FⅨ 농도를 가진 정상 기준 혈장 농도는 어떤 측정 가능한 신호도 보이지 않았다. 이 데이터는 FⅨ 파두아-특이적 활성 분석을 기술하고 동시에 이의 특이성을 확인한 접근법의 실행 가능성을 입증했다.

실시예 5

FⅨ 야생형 및 FⅨ 파두아 변이체 사이를 식별하는 항체의 분리에 대해 하기에 기술한다.

FⅨ 파두아는 단일 아미노산 교환 (FⅨ R338L)을 가진, 야생형 FⅨ의 항진-기능성(hyper-functional) 자연 발생적 변이체이다. 혈우병(hemophilia) B 유전자 치료(Gene therapy)에 대한 FⅨ 파두아의 유용성이 전임상 모델에서 밝혀졌으며 현재 임상 1/2상 프로그램에서 연구 중이다. 치료의 성공 평가는 주로 FⅨ 파두아 전이유전자(transgene)의 발현 여부에 달려있으나, 야생형 FⅨ 및 FⅨ 파두아를 구별하는 항체가 부족하여 방해받는다. 야생형 FⅨ와 교차 반응없이 FⅨ 파두아를 특이적으로 인식하는 항체는 임상 샘플에서 FⅨ 파두아를 분명하게 검출하는 분석의 개발을 가능하게 한다. 파지 디스플레이 방법이 특정한 FⅨ 파두아 결합제(binder)를 선택하는데 사용되었다. 파지 라이브러리는 위치 338에 단일 아미노산 치환을 가진 선형 및 구조적 펩타이드와 전장 재조합 FⅨ 파두아로 스크리닝되었다. 야생형 FⅨ 서열과 경쟁이 있는 및 경쟁이 없는 3 라운드 패닝이 여러 결합제를 동정하였다. 수득한 항체의 특이성 및 친화도를 결정하기 위해 BIACORE (표면 플라즈몬 공명) 및 ELISA 실험이 수행되었다. 다양한 항체가 처음에 상이한 파지 디스플레이 패닝 경로로부터 동정되었다. 선형 펩타이드 경로로부터 생성된 항체는 고유한 및 특이적인 FⅨ 파두아 결합을 나타냈다. 선택된 항체는 ~3 ng/mL 혈장의 검출 한계를 가졌으며 매우 높은 농도 (>50 μg/mL)에서도 야생형 FⅨ에 교차 반응을 나타내지 않았다. 매우 특이적인 항-FⅨ 파두아 항체는 야생형 FⅨ 및 FⅨ 파두아 항원 수준을 선택적으로 구별하기 위한 임상 분석의 개발에 사용될 수 있다.

도입:

FⅨ 파두아는 단일 아미노산 교환 (FⅨ R338L)을 가진, FⅨ 야생형 (wt)의 자연 발생적 항진-기능성 변이체이다. 이 기능 획득 돌연변이는 정상 FⅨ에 비해 8- 내지 10-배의 특이적인 응고 활성 증가를 야기한다. 시험관 내에서, 재조합 FⅨ-R338L는 재조합 FⅨ 야생형보다 5- 내지 10-배 높은 특이적인 응고 활성을 가졌다 [1]. 혈우병 B 유전자 치료에 대한 FⅨ 파두아의 유용성이 전임상 모델에서 밝혀졌으며, 현재 임상 시험 1/2상에서 연구 중이다. 치료의 성공 평가는 주로 FⅨ 파두아 전이유전자 발현 여부에 달려있으나, FⅨ wt 및 FⅨ 파두아를 구별하는 항체가 부족하여 방해받는다.

본 연구의 목적은 임상 샘플에서 FⅨ wt의 존재하에 FⅨ 파두아를 검출할 수 있도록 FⅨ 야생형에 교차 반응 없이 FⅨ 파두아에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 것이었다.

본 연구 동안 수행된 방법을 하기에 기술한다.

항 파두아 FⅨ 특이적인 항체의 생성: HuCAL PLATINUM®라이브러리 및 CysDisplay®기술에 기반한 파지 디스플레이 기술로 항체 (이가 Fab)를 생성하였다. FⅨ 파두아에 특이적인 항체를 분리하기 위해 4가지 상이한 접근법이 적용되었다 (도 19). 두 가지가 338 위치에 단일 아미노산 치환을 가진 펩타이드와 함께 고체상 또는 액체상 (비드) 분석 중 하나에서 수행되었다. 세 번째 및 네 번째 전략은 전장의 활성 FⅨ 파두아 단백질을 포함하였다. 각 전략에 대해 적절한 음성 대조군 (wt 펩타이드 또는 FⅨ wt)을 포함하는 3 라운드 패닝이 수행되었다. 고유한 양성 클론의 Fab가 생산되었고 FⅨ 파두아 항원에 대한 특이적인 결합이 테스트되었다. ELISA를 위해, 항원 [5 μg/mL]이 코팅되었고 Fab 단편 [2 μg/mL]과 인큐베이션 된 후 항 Fab AP 컨쥬게이트로 검출하였다

혈장 ELISA: Fab는 MaxiSorp ELISA 플레이트 상에 코팅되었고 [5 μg/mL] 50 mM 벤즈아미딘을 더한 PBS 버퍼로 희석된 20% 인간 혈장과 인큐베이션되었다. 혈장에 5 μg/mL rFⅨ wt 및 증가하는 농도의 rFⅨ 파두아 (HEK293에서 자체 생산한)가 첨가되었다. 검출은 HRP 표지된 다클론 염소(goat) 항 FⅨ 항체 (100 ng/mL)를 이용하여 수행하였다.

BiaCore: 모든 실험은 25℃에서 Biacore™200 기구 및 니켈-코팅된 바이오센서 칩 (NTA-Chip GE Healthcare)을 이용하여 수행되었다. 기구를 처음 세 번을 HBS-EP 러닝 버퍼로 준비하고, 변형되지 않고 Fab 리간드가 없는 유동 세포(flow cell) 1 (FC1)이 기준 유동 세포로서 사용되었다. 유동 세포 2 (FC2)가 ~500 RU FⅨ 파두아 특이적인 Ab42의 고정에 사용되었다. 리간드 농도는 100 내지 6.25 nM의 범위였다.

본 연구의 결과는 하기에 기술되었다.

돼지 wt FⅨ의 구조 분석은 단일 파두아 변형 (R338L)이 단백질 [2]의 표면에 위치하므로(도 21), 매우 특이적인 항체의 생성에 적합한 에피토프임을 밝혔다. ELISA로 정제된 이가 Fab가 항원 특이성 (도 22) 및 20% 인간 혈장 내의 FⅨ wt에 대한 교차 반응에 대해 테스트되었다 (도 23). 첨가된 FⅨ wt을 5 μg/mL 첨가하는 20% 혈장 매트릭스에서, 4개의 분리된 이가 Fab 중 오직 두 개 (Ab42 및 Ab76)만이 FⅨ 파두아에 특이적으로 결합하였다. 오직 Ab42만이 인간 FⅡ 및 인간 FX에 대해 어떤 교차 반응도 나타내지 않았다 (데이터 미도시).

이 데이터들에 기반으로, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 매우 특이적인 항 FⅨ 파두아 미니 항체 Ab42가 생성된 것으로 결론지었다. 선택된 후보는 FⅨ 야생형 또는 FⅡ 또는 FX와 같은 다른 일반 혈액 인자 단백질에 교차 반응을 나타내지 않았다. FⅨ 파두아에 대한 효율적인 결합이 인간 혈장 매트릭스 (20%) 및 일반적인 농도의 FⅨ wt 존재하에서 나타났다. 미니 항체 Ab42는 현재 임상 시험 1/2상 동안 처리된 환자 유래 혈장에서 FⅨ 파두아 분석에 사용된다 (하기 참조).

상기 기술된 연구에서, 하기의 참고 문헌이 인용된다: (1) Simioni et al., X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua) N Engl J Med 2009; 361: 1671-5; 및 (2) Brandstetter et al., X-ray structure of dotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and hemophilia B. Proc Nail Acad Sci U S A. 1995 Oct 10; 92(21): 9796-800.

혈우병 B 유전자 치료를 모니터링하기 위한 FⅨ 파두아-특이적인 면역 분석(immunoassay)의 개발 및 적용이 하기에 기술한다.

유전자 치료는 혈우병에 대한 미래 치료 옵션으로서 큰 가능성을 지닌다. 한 임상 시험 1/2상에서, 심각한 혈우병 B를 가진 대상에서, AAV2/8 바이러스 벡터가 단일 아미노산 교환 (R338L)을 가진 FⅨ의 항진-기능성 변이체인 FⅨ 파두아 (FⅨp) 발현하는데 사용된다. 전이유전자 산물의 특이적인 검출은 치료의 성공을 평가하는데 중요하나, FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 환자에게서는 어렵다. FⅨp-특이적인 ELISA의 개발 및 FⅨ 파두아를 발현하는 AAV2/8 바이러스 벡터로 처리 후 혈우병 B 환자의 혈장에서 발현된 FⅨp의 측정에 대한 이 분석의 적용. 새로 개발된 FⅨp-특이적 결합 항체의 Fab 단편이 표준 조건을 이용하여 96-웰 마이크로플레이트에 2 μg/mL로 코팅되었다. 비오틴화된 다클론 양 항-인간 FⅨ IgG 및 스트렙타비딘 퍼옥시다아제가 검출 시스템으로서 사용되었다. 분석 검정은 27.1 - 0.85 ng/mL 범위의 FⅨp 농도를 포함하는 FⅨp 제제로 6-포인트 검량선을 생성하여 얻었다. 환자의 샘플은 5 mg/mL 소혈청 알부민, 10 mM 벤즈아미딘, 10 mM CaCl₂ 및 0.05% Tween 20를 함유하는 HEPES/NaCl 버퍼로 희석되었다. 정상 인간 혈장 또는 정제된 인간 FⅨ는 FⅨp-특이적인 ELISA에서 신호를 나타내지 않았다. 정확한 검량선이 얻어졌다. 1/10-희석된 정상 인간 혈장에 첨가한 FⅨp는 버퍼 중의 분석 표준에 대해 얻은 것과 평행한 희석 반응 곡선으로 허용 가능한 회수율(recovery)을 나타냈다. 중요한 것은, FⅨp를 암호화하는 AAV로 처리된 6명 환자의 샘플의 분석은 시간에 따라 매우 유사한 FⅨp 단백질 및 FⅨ 활성 커브를 보여줬으며, CRM+ 환자의 샘플은 CRM- 환자에 비해 FⅨp 단백질 신호가 증가하지 않는 것으로 나타나, 분석의 특이성을 나타냈다. FⅨp-특이적 ELISA는 FⅨp 단백질의 측정에 의한 치료 결과의 추가적인 모니터링을 가능하게 한다. 이는 이 접근법의 실행 가능성을 입증하는 첫 번째 데이터를 나타낸다.

도입:

혈우병에 대한 미래 치료 옵션으로서 큰 가능성을 지닌다 [1]. 한 임상 시험 1/2상에서, 심각한 혈우병 B를 가진 대상에서, AAV2/8 바이러스 벡터가 단일 아미노산 교환 (R338L)을 가진 FⅨ의 항진-기능성 변이체인, FⅨ 파두아 (FⅨp) [2] 발현하는데 사용된다. 전이유전자 산물의 특이적인 검출은 치료의 성공을 평가하는데 중요하나, FⅨ 교차-반응 물질 (CRM+)을 가진 환자에게서는 어렵다.

도 25는 본 연구에서 기술된 방법 (분석)의 원리를 도시한다. 항-FⅨ 파두아 Fab는 마이크로플레이트 웰에 코팅되고 샘플로부터 FⅨ 파두아를 선택적으로 포획한다. 비-결합된 샘플 화합물을 제거하는 세척 단계 후에, 결합된 FⅨ 파두아가 자체 제작된 비오틴화된 다클론 양 항-FⅨ IgG 및 스트렙타비딘 퍼옥시다아제를 이용하여 검출된다. 결합된 HRP 활성이 즉시 사용 가능한 HRP 기질 SureBlue 이용하여 측정된다.

본 연구 동안 수행된 방법을 하기에 기술한다.

ELISA 절차: Fab 제제 Ab42 (0.94 mg/mL)를 pH 9.5의 0.1 M NaHCO₃-Na₂CO₃로 1/500로 희석하였으며 100 μL/웰로 0 내지 +10℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 함으로써 Maxisorp F96 플레이트의 웰에 결합시켰다. 샘플 및 시약 희석 및 플레이트의 블로킹에 사용된 희석 버퍼 (DB)는 0.1 M HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.2, 5 mg/mL 비오틴-없는 소혈청 알부민 (BSA), 10 mM Ca²⁺, 0.05% Tween 20 (Bio-Rad, EIA grade), 및 10 mM 벤즈아미딘을 함유한다. 코팅 후에, 플레이트를 0.05% Tween 20를 함유하는 인산염-완충 식염수로 세척하였다. 그 후 웰을 200 μL DB/웰로 상온 (RT)에서 60분 동안 블로킹하였다. 블로킹 단계는 세척으로 종료되었다. 그 후, 1+1 단계 희석법으로 준비된 표준/샘플의 희석물이 플레이트에 직접 로딩되었다. 희석물 (100 μL/웰)을 RT에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, F9-1030A (A-Coa)에서 제조된 비오틴화된 다클론 양 항-인간 FⅨ 검출 항체 (100 μL/웰; 11500 희석)를 첨가하였다. RT에서 60분 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 다시 세척하고, 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 (DakoCytomation)를 첨가 (100 μL/웰: 1/4,000 희석)하였으며 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후, 결합된 퍼옥시다아제 활성을 즉시 사용 가능한(ready-to-use) 퍼옥시다아제 기질 SureBlue (KPL)로 측정하였고, 3 N 황산으로 반응을 중지시켰다. 그 후 플레이트를 450 nm에서 측정하였고, 620 nm에서 얻은 결과를 뺐다. 542.4 μg/mL의 단백질 농도를 나타내는 정제된 재조합 FⅨ 파두아 (FⅨp) 제제로 검량선을 구성하였다. 2,310 IU/mg 단백질의 특이적인 응고 활성은 본 제제를 항진활성 FⅨ 파두아 변이체로 명확하게 분류했다. 1/20,000 내지 1/640,000 범위의 단계 희석법 희석물은 27.1 내지 0.85 ng/mL 범위의 FⅨ 농도로 정의된다.

본 연구의 결과는 하기 및 도에 기술되었다. 확립된 표준 방법을 적용하여 FⅨ 응고 활성 및 FⅨ 항원 측정이 수행되었다; 구연산염 처리된 혈장 샘플에 대해서도 ELISA로 FⅨ 파두아 단백질의 특이적인 측정을 수행하였다. ng/mL로 얻은 FⅨ 파두아 ELISA의 결과를 활성 및 항원 단위로 전환하였다. 특히, FⅨp ELISA의 분석 표준으로 사용된 2,310 IU FⅨ/mg의 정제된 재조합 FⅨ 파두아 제제의 특이적인 활성이 활성 단위(activity unit) 계산에 사용되었고, 항원 혈장 단위로의 전환은 5 μg/mL의 정상 FⅨ 혈장 농도에 기초하였다. 도 26-29는 정상 및 FⅨ-결핍 혈장에서의 분석 선택성, 검량선, 평행성 연구 및 ELISA의 감도에 대한 칼슘의 영향을 각각 나타낸다.

AAV2/8 바이러스 벡터를 처리한 환자로부터 혈장 샘플이 수득되었다. 도 30-32는 세 환자로부터 수득한 샘플에서의 FⅨ 파두아의 활성 및 발현을 나타낸다. 대상 05-001로부터 수득한 혈장 샘플은 1 U/mL에 가까운 FⅨ 항원 농도를 일관되게 나타냈으나, FⅨ 활성은 정량 하한 아래로 나타났다. 이 데이터는 통상적인 FⅨ ELISA로 측정 가능한 FIS교차-반응 물질 (CRM+), 즉, 응고-불활성 FⅨ 단백질의 존재를 나타낸다. FⅨp ELISA 데이터는 FⅨ 활성 데이터와 평행적이어서, FⅨ 활성 측정이 FⅨ 파두아의 발현에 의존적인 것을 입증했다. 반면, FⅨ 파두아-특이적인 ELISA로 츨정된 FⅨ 항원 농도는 표준 ELISA로 얻은 것들보다 명확하게 낮아, FⅨ 파두아 ELISA가 CRM+ 물질 및 FⅨ 파두아 간의 차이를 허용한다는 것을 입증했다. CRM+ 수준이 더 낮지만 대상 10-005 유래 샘플에 대해 유사한 데이터가 나타난 반면, 대상 03-004 유래 샘플은 CRM+을 함유하지 않아, 두 ELISA 시스템에 대해서도 평행 시간-대-농도 곡선의 결과가 되었다.

이들 데이터로부터, FⅨp의 포획을 위해 매우 특이적인 Fab 단편을 이용하는 것에 기반한 FⅨ 파두아-특이적인 ELISA가 FⅨp의 측정에 의한 치료 결과의 추가적인 모니터링을 허용하는 것으로 결론이 내려졌다. 이들은 본 접근법의 타당성을 입증하는 첫 데이터이다.

상기 기술된 연구에서, 하기의 참고 문헌들이 인용된다: [1] Simioni P, et al (2009): NEJM 361, 1671-1675. X-Linked thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua); [2] Crudele JM, et al (2015). Blood 125:1553-1561. AAV liver expression of FⅨ-Padua prevents and eradicates FⅨ inhibitor without increasing thrombogenicity in hemophilia B dogs and mice.

본 명세서의 구현예는 하기와 같이 기술될 수 있다:

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인자 IX 파두아(Factor IX 파두아)에 결합하고 아미노산 서열 (서열번호 2)을 포함하는 야생형 (WT) 인자 IX에 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

2. 상기에서 에피토프는 아미노산 서열 DRATCLLSTKFT (서열번호 3) 내의 선형 에피토프인, 서열번호 1의 에피토프에 결합하는 제 1구현예의 항체 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

3. 상기에서 에피토프는 아미노산 서열 LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH (서열번호 5)의 폴딩된 구조의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)인, 서열번호 1의 에피토프에 결합하는 제 1구현예의 항체 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

4. 상기에서 폴딩된 구조는 이황화 가교(disulfide bridge)를 포함하는, 제 1 또는 제 3 구현예의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

5. DRATCLRSTKFT (서열번호 14) 또는 LVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFH (서열번호 15)의 아미노산 서열에 결합하지 않는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편

6. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인자 IX 파두아에 약 100 nM 또는 그 이하의 K_D로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

7. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인자 IX 파두아에 약 25 내지 약 75 nM 범위 내의 K_D로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

8. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인자 IX 파두아에 약 50 nM 내지 약 60 nM 범위 내의 K_D로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

9. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 혈청을 포함하는 샘플에서 인자 IX 파두아에 약 20 nM 내지 약 100 nM, 약 25 nM 내지 약 95 nM, 약 30 nM 내지 약 90 nM, 약 35 nM 내지 약 85 nM, 약 40 nM 내지 약 80 nM, 약 45 nM 내지 약 75 nM, 약 50 nM 내지 약 70 nM, 또는 약 55 nM 내지 약 65 nM 범위 내의 K_D로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

10. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 혈청을 포함하는 샘플에서 인자 IX 파두아에 결합하고 WT 인자 IX에 결합하지 않으며, 선택적으로, 상기에서 샘플은 적어도 또는 약 5%, 적어도 또는 약 10%, 또는 적어도 또는 약 20%의 인간 혈청을 포함하고 샘플은 적어도 또는 약 5 μg/mL의 WT 인자 IX를 포함하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

11. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인자 Ⅱ 폴리펩타이드 또는 인자 X 폴리펩타이드와 결합하지 않는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

12. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인자 Ⅱ와도 인자 X와도 결합하지 않는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

13. Fab 또는 Fab2' 항체 단편인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

14. 단일특이적인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

15. 완전 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

16. 이가인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

17. 이가이나 FⅨ 파투아에 대해 단일특이적인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

18. 이량체 Fab 단편 또는 이량체 Fab 미니 항체를 포함하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

19. 링커를 통한 이량체 Fab 단편인, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

20. (i) SSYAIS (서열번호 6); GIVPAFGTANYAQKFQG (서열번호 7); SWGVISFAY (서열번호 8); RASQDISSYLN (서열번호 9); AASNLQS (서열번호 10); 및 MQYDSLPFTF (서열번호 11)의 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 24 및 25의 아미노산 서열 또는 (iii) 서열번호 26 또는 서열번호 27 또는 서열번호 26 및 27의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

21. 선택적으로, (i) 하나 이상의 아미노산이 각각의 서열번호 6-11 사이에 존재하고, 및/또는 (ii) 폴리펩타이드가 선택적으로 DYKDDDDK (서열번호 12)를 포함하는 FLAG 태그 및/또는 HHHHHH (서열번호 13)를 포함하는 헥사-His 태그를 추가로 포함하는, 서열번호 6-11을 각각 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.

22. FLAG 태그 및/또는 헥사-His 태그는 폴리펩타이드의 C-말단에 위치하는, 제 21구현예의 폴리펩타이드.

23. 이종 모이어티에 컨쥬게이트되는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드를 포함하는 컨쥬게이트.

24. 상기에서 이종 모이어티는 폴리머, 탄수화물, 지질, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 검출제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는, 제 23 구현예의 컨쥬게이트.

25. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 아가로오스, 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리아크릴아마이드, 라텍스 또는 공극 조절 유리와 컨쥬게이트되는, 제 23 또는 24 구현예의 컨쥬게이트.

26. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 형광단, 발색단, 방사성동위원소, 효소 표지, 또는 비오틴과 컨쥬게이트되는, 제 23 구현예 내지 제 25 구현예 중 어느 하나의 컨쥬게이트.

27. 제 19 구현예의 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는, 제 23 구현예 내지 제 26 구현예의 컨쥬게이트.

28. 상기에서 이량체의 폴리펩티드가 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 구조를 통해 연결된, 제 27 구현예 중 어느 하나의 컨쥬게이트.

29. 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 컨쥬게이트, 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.

30. 제 29 구현예의 핵산을 포함하는 벡터.

31. 제 29 구현예의 핵산 또는 제 30 구현예의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

32. 1 내지 20 구현예의 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제 21 또는 제 22 구현예의 폴리펩타이드, 제 23 구현예 내지 제 28 구현예 중 어느 하나의 컨쥬게이트, 제 29 구현예의 핵산, 제 30 구현예의 벡터, 및/또는 제 31 구현예의 숙주 세포를 포함하는 키트.

33. 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 컨쥬게이트에 결합하는 이차 항체를 추가로 포함하는 제 32 구현예의 키트.

34. 고체 지지체를 추가로 포함하는, 제 32 구현예 또는 제 33 구현예의 키트.

35. 상기에서, 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트가 고체 지지체에 미리 코팅되는, 제 32 구현예 내지 제 34 구현예 중 어느 하나의 키트.

36. 상기에서 고체 지지체는 폴리머 비드, 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 또는 필터인 제 34 구현예 또는 제 35 구현예의 키트.

37. 항원 결합 단편을 약 100 ng 또는 그 이상, 약 150 ng 또는 그 이상, 약 200 ng 또는 그 이상, 약 500 ng 또는 그 이상 포함하는 용액으로 미리 코팅된 고체 지지체를 포함하는, 제 35 구현예 또는 제 36 구현예의 키트.

38. 사용 지침을 추가로 포함하는 제 32 구현예 내지 제 37 구현예 중 어느 하나의 키트.

39. 인간 혈장, 또는 이의 희석된 분획, 및/또는 인간 조직, 또는 이의 세포를 포함하는 인간으로부터 수득한 생물학적 샘플과 혼합되고, 선택적으로, 검출제를 포함하는, 제 1구현예 내지 제 20 구현예 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.

40. 인간 혈장 단백질을 포함하는 인간으로부터 수득한 생물학적 샘플과 혼합되고, 상기에서, 하나 이상의 인간 혈장 단백질은 인자 IX, 인자 IX의 변이체, 인자 Ⅱ, 인자 Ⅱ의 변이체, 인자 X, 및 인자 X의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제 1 구현예 내지 제 20 구현예 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.

41. 상기에서 조성물은 검출제를 포함하는, 제 40 구현예의 조성물.

42. 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하기 위한, 제 1 구현예 내지 제 20 구현예 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제 21 구현예 또는 제 22 구현예의 폴리펩타이드, 제 23 구현예 내지 제 28 구현예 중 어느 하나의 컨쥬게이트, 제 29 구현예의 핵산, 제 30 구현예의 벡터, 제 31 구현예의 숙주 세포, 및/또는 제 32 구현예 내지 제 38 구현예 중 어느 하나의 키트의 용도.

43. (i) 샘플을 제 1구현예 내지 제 20 구현예 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제 21 구현예 또는 제 22 구현예의 폴리펩타이드, 또는 제 23 구현예 내지 제 28 구현예 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 접촉시켜 인자 IX 파두아 및 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 복합체를 형성하고, 및 (ii) 샘플에서 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.

44. 상기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드는 검출제 및/또는 고체 지지체에 컨쥬게이트되거나, 상기에서 컨쥬게이트는 검출제를 포함하는, 제 43 구현예의 방법.

45. 검출제를 포함하고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트와 결합하는 이차 항체와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는, 제 43 구현예 또는 제 44 구현예의 방법.

46. 상기에서 복합체를 검출하는 것은 검출제의 신호를 검출하는 것을 포함하는, 제 43 구현예 내지 제 45 구현예 중 어느 하나의 방법.

47. 상기에서 신호는 효소적 활성, 결합 활성 및/또는 발색 활성인, 제 46 구현예의 방법.

48. 상기에서 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 또는 혈장 샘플인, 제 43 구현예 내지 제 47 구현예 중 어느 하나의 방법.

49. 상기에서 대상은 인자 IX 파두아를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 처리되어 온, 제 43 구현예 내지 제 48 구현예 중 어느 하나의 방법.

50. 본 발명에 기재된 결합 컨스트럭트.

본 발명에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 각각의 참고 문헌이 개별적으로 및 특이적으로 참조로서 포함된 것으로 나타낸 것 및 본 발명에 그 전체가 명시된 것과 동일한 정도로 본 발명에 참고 문헌으로서 인용된다.

본 발명에서 달리 지시되거나 문맥상 명확하게 부인하지 않는 한, 개시 내용을 설명하는 맥락에서 (특히, 하기의 청구항의 맥락에서) “a”및 “”및 “” 및 유사한 지시 대상 용어의 사용은 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 “포함하는(comprising),” “가지는,” “포함하는(including),” 및 “함유하는”은 개방형 용어 (즉, “”포함하나, 이에 한정되지 않는”을 의미함)로서 해석되어야 한다.

본 발명에서 달리 명시하지 않는 한, 값의 범위의 설명은 단지 각각의 범위 내에 포함되는 개별 값 및 각 종점(endpoint)을 개별적으로 참조하는 약식 방법으로 제공하려는 의도이며, 각 개별 값 및 종점은 본 발명에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다.

본 발명에 기술된 모든 방법은 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥상 명확하게 부인하지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 발명에서 제공된 임의의 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, “와 같은”)의 사용은 단지 개시 내용을 더 잘 분명히 하려는 의도이며, 다르게 청구하지 않는 한 개시 내용의 범위의 제한을 제기하는 것이 아니다. 명세서의 어떠한 언어도 개시 내용의 실시에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

발명자들에게 알려진 개시 내용을 수행하기 위한 최선의 방식을 포함하는 본 개시 내용의 바람직한 구현예가 여기에 기술된다. 상기 설명을 읽음으로써 이들 바람직한 구현예의 변형이 통상의 기술자에게 명백해질 수 있다. 발명자들은 통상의 기술자가 이러한 적절한 변형을 이용할 것으로 예상하며, 발명자들은 개시 내용이 본 발명에서 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되도록 하려는 의도이다. 따라서, 본 개시 내용은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본 발명에 첨부된 청구항에 인용된 소재의 모든 변경 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본 발명에 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥상 명확하게 부인하지 않는 한, 이의 모든 가능한 변형들에서 상기-기술된 요소의 임의의 조합이 본 개시 내용에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> BAXALTA INCORPORATED BAXALTA GMBH <120> ANTI-FACTOR IX PADUA ANTIBODIES <130> 31315/50573 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 <210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 20 25 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 His His His His His His 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 20 25 <210> 16 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank / AAH51332.1 <309> 2006-07-15 <313> (1)..(622) <400> 16 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu 35 40 45 Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro 85 90 95 Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu 100 105 110 Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu 115 120 125 Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser 130 135 140 Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val 165 170 175 Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr 180 185 190 Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro 195 200 205 Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg 210 215 220 Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Ala 260 265 270 Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu 275 280 285 Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp 290 295 300 Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys 325 330 335 Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu 340 345 350 Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser 355 360 365 Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys 370 375 380 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 385 390 395 400 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn 405 410 415 Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr 420 425 430 Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr 435 440 445 Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala 450 455 460 Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro 465 470 475 480 Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly 485 490 495 Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr 500 505 510 Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu 515 520 525 Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile 530 535 540 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 545 550 555 560 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 565 570 575 Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu 580 585 590 Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg 595 600 605 Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 610 615 620 <210> 17 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> PRF / 1205236A <309> 1996-10-18 <313> (1)..(467) <400> 17 Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn Asn Ile 1 5 10 15 Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys 20 25 30 Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu 35 40 45 Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn 50 55 60 Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln 65 70 75 80 Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu 85 90 95 Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser 100 105 110 Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser 115 120 125 Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys 130 135 140 Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala 165 170 175 Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro 180 185 190 Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu 195 200 205 Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys 210 215 220 Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu 225 230 235 240 Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala 245 250 255 Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Glu Gly Asp Arg Asn Thr 260 265 270 Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile 275 280 285 Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val 290 295 300 Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala 305 310 315 320 Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys 325 330 335 Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln 340 345 350 Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser 355 360 365 Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala 370 375 380 Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val 405 410 415 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr 420 425 430 Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg 435 440 445 Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser 450 455 460 Pro Leu Lys 465 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 26 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Ala 210 <210> 28 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Pro Lys 210 215 220 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys 225 230 235 240 His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu Leu Glu Glu 245 250 255 Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala 260 265 270 Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ala Pro His His His His 275 280 285 His His 290

Claims (20)

1. 함께 결합된 2개의 항원-결합 단편을 포함하는 항-인자 IX 파두아 단백질로서,
   상기 항원-결합 단편 중 적어도 하나는 SSYAIS(서열번호 6)의 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR 1), GIVPAFGTANYAQKFQG(서열번호 7)의 중쇄 CDR 2, SWGVISFAY(서열번호 8)의 중쇄 CDR 3, RASQDISSYLN(서열번호 9)의 경쇄 CDR 1, AASNLQS(서열번호 10)의 경쇄 CDR 2 및 MQYDSLPFTF(서열번호 11)의 경쇄 CDR 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 상기 항원-결합 단편 중 적어도 하나는 서열번호 24 및 25의 아미노산 서열 또는 서열번호 26 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
3. 제 1항에 있어서, 상기 2개의 항원-결합 단편은 이황화 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 구조, 또는 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 통하여 함께 결합되는 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
4. 제 1항에 있어서, 상기 항원-결합 단편 중 적어도 하나는 Fab 항체 단편, Fab2' 항체 단편, 또는 Fab 미니 항체인 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
5. 제 1항에 있어서, DYKDDDDK (서열번호 12)를 포함하는 FLAG 태그, HHHHHH (서열번호 13)를 포함하는 헥사-His 태그, 또는 DYKDDDDK (서열번호 12)를 포함하는 FLAG 태그 및 HHHHHH (서열번호 13)를 포함하는 헥사-His 태그 둘다를 추가로 포함하며,
   상기 FLAG 태그, 헥사-His 태그, 또는 FLAG 태그 및 헥사-His 태그 둘다는 항-인자 IX 파두아 단백질의 C-말단에 위치되는 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
6. 제 1항에 있어서, 상기 항-인자 IX 파두아 단백질은 알칼라인 포스파테이즈 도메인을 통하여 결합되는 이량체 Fab2' 항체 단편인 것인, 항-인자 IX 파두아 단백질.
7. 청구항 제1항의 항-인자 IX 파두아 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산.
8. 청구항 제7항의 핵산을 포함하는 것인, 벡터.
9. 청구항 제7항의 핵산을 포함하는 것인, 숙주 세포.
10. (i) 청구항 제 1항의 항-인자 IX 파두아 단백질과, 사용 설명서 및 (ⅱ) 상기 (i)의 항-인자 IX 파두아 단백질에 결합하는 이차 항체를 포함하는, 키트.
11. 제 10항에 있어서, 고체 지지체 및, 폴리머 비드, 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 또는 필터를 더 포함하는 것인, 키트.
12. (i) 샘플을 청구항 제1항의 항-인자 IX 파두아 단백질과 접촉시켜, 인자 IX 파두아 및 항-인자 IX 파두아 단백질을 포함하는 복합체를 형성하고,
    상기 항-인자 IX 파두아 단백질은 야생형 인자 IX에 결합하지 않으며, (ⅱ) 샘플에서 복합체를 검출하는 것을 포함하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 항-인자 IX 파두아 단백질이 검출제, 고체 지지체, 또는 검출제 및 고체 지지체 둘다에 컨쥬게이트되는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 샘플을 검출제를 포함하는 이차 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 이차 항체가 항-인자 IX 파두아 단백질에 결합하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 복합체를 검출하는 것은 검출제의 신호를 검출하는 것을 포함하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 신호는 효소 활성, 결합 활성, 발색 활성, 또는 이들의 조합인 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
17. 제 12항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 혈장 샘플인 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아를 검출하는 방법.
18. (i) 샘플을 청구항 제1항의 항-인자 IX 파두아 단백질과 접촉시켜, 인자 IX 파두아 및 항-인자 IX 파두아 단백질을 포함하는 복합체를 형성하고,
    여기서, 상기 항-인자 IX 파두아 단백질은 야생형 인자 IX에 결합하지 않으며,
    (ⅱ) 샘플에서 인자 IX 파두아 활성을 검출하는 것을 포함하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아 활성을 검출하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 야생형 인자 IX를 제거하는 것을 더 포함하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아 활성을 검출하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 인자 IX 파두아 활성을 검출하는 것은 발색 기질의 가수분해를 검출하는 것을 포함하는 것인, 대상으로부터 수득한 샘플에서 인자 IX 파두아 활성을 검출하는 방법.