KR102606381B1 - Novel Streptomyces murinus JS029 strain with anti-fungal activity against plant pathogenic fungi - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor)를 포함하여 스클레로티니아 스클레로티노룸(Sclerotinia sclerotinorum), 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 같은 식물 병원성 곰팡이에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며 식물의 생장을 촉진할 수도 있는 수탁번호 KACC 92370P로 기탁된 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) JS029 균주에 관한 것이다.The present invention includes Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotinorum , Pythium aphanidermatum , Rhizoctonia solani , and Streptomyces murinus JS029 strain deposited under the accession number KACC 92370P, which can exhibit excellent antibacterial activity against plant pathogenic fungi such as Fusarium oxysporum and can also promote plant growth. It's about.
Description
본 발명은 식물 병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성을 갖는 신규 스트렙토마이세스 뮤리누스 JS029 균주에 관한 것으로, 구체적으로 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor)를 포함하여 스클레로티니아 스클레로티노룸(Sclerotinia sclerotinorum), 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 같은 식물 병원성 곰팡이에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 식물의 생장을 촉진할 수도 있는 신규 스트렙토마이세스 뮤리누스 JS029 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Streptomyces murinus JS029 strain with antifungal activity against plant pathogenic fungi, specifically Sclerotinia sclerotinorum, including Sclerotinia minor. ), Pythium aphanidermatum , Rhizoctonia solani, and Fusarium oxysporum , and can exhibit excellent antibacterial activity against plant pathogenic fungi, and can enhance plant growth. It relates to a new Streptomyces murinus JS029 strain that may promote.
현대의 농업 시스템은 친환경적인 농작물 생산을 목표로 하고 있으며 농작물을 보호할 수 있는 새로운 천연자원 개발의 필요성이 높아지고 있다.Modern agricultural systems aim to produce environmentally friendly crops, and the need to develop new natural resources to protect crops is increasing.
푸사리움(Fusarium) 속, 라이족토니아(Rhizoctonia) 속, 피티움(Pythium) 속 등과 같이 토양전염성 병을 일으키는 곰팡이들은 다양한 기주 식물에 발생하여 월동체를 형성하며 토양 속에서 생존하므로 누적적으로 밀도가 증가되어 연작장해의 원인이 된다. 병이 진전된 후 병징이 육안으로 관찰되고 비생물성 병과 비슷한 외부 증상을 나타내기 때문에 초기 진단이 어렵다. 그뿐만 아니라 지하부에 병원균이 존재하므로 지상부병에 비해 방제가 어렵다.Fungi that cause soil-borne diseases, such as Fusarium , Rhizoctonia , and Pythium , occur on various host plants, form overwintering bodies, and survive in the soil, resulting in cumulative density. increases and causes continuous crop failure. Early diagnosis is difficult because after the disease progresses, symptoms are observed with the naked eye and external symptoms similar to non-biological diseases appear. In addition, because pathogens exist underground, control is more difficult than above-ground rot.
그중 자낭균에 속하는 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor)는 넓은 기주범위를 가지며 전 세계에서 가장 파괴적인 토양병원성 곰팡이 중 하나이다. 병든 식물체와 조직에 생성되는 검은 균핵은 겨울 동안 흙 위나 흙 속에서 휴면 상태로 존재하므로 부적합한 환경 조건에서도 긴 시간 생존한다. 중요한 농작물에 상당한 경제적 손상을 입히기 때문에 이 병원체를 방제하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.Among them, Sclerotinia minor , which belongs to the Ascomycetes, has a wide host range and is one of the most destructive soil pathogenic fungi in the world. Black sclerotia produced in diseased plants and tissues remain dormant on or in the soil during the winter, so they survive for a long time even in unsuitable environmental conditions. Because it causes significant economic damage to important crops, research is actively underway to control this pathogen.
토양전염성 곰팡이 방제에 토양 소독이 효과적이지만 공간적, 비용적인 어려움이 있을 뿐만 아니라 훈증제의 적용은 인축 및 환경오염의 위험성이 있다. 또한, 토양전염성 곰팡이를 방제하기 위한 다양한 작물보호제가 개발되어 있으나, 소비자들의 친환경 농산물에 대한 수요가 증가하면서 잔류 농약 등의 문제로부터 자유로운 생물학적 방제에 대한 관심도 증가하고 있다.Soil disinfection is effective in controlling soil-borne fungi, but there are space and cost difficulties, and the application of fumigants carries the risk of livestock and environmental pollution. In addition, various crop protection agents have been developed to control soil-borne fungi, but as consumer demand for eco-friendly agricultural products increases, interest in biological control free from problems such as residual pesticides is also increasing.
선행 연구에 따르면 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 미생물은 물과 토양에 500종 이상 분포하고 균사체로 성장하며 특정한 생활환을 가지는 방선균의 일종이다. 이들 중 일부는 대상 식물의 뿌리에 내생균으로 존재하여 다른 병원균의 접근과 침입을 억제한다. 또한, 일부는 엑티노마이신 D(actinomycin D)와 크로모마이신 A3(chromomycin A3) 등과 같은 항균 화합물을 생산하여 식물 병원균을 억제할 수 있으며 다양한 대사산물을 생산하고 식물 성장을 향상시키는 것으로 나타났다. 이러한 스트렙토마이세스의 특성을 이용하여 토양전염성 곰팡이 방제에 활용한다면 화학적 방제제의 좋은 대안이 될 것으로 사료된다.According to previous research, more than 500 species of microorganisms in the genus Streptomyces are distributed in water and soil, grow as mycelium, and are a type of actinomycetes with a specific life cycle. Some of these exist as endophytic bacteria in the roots of target plants and inhibit the access and invasion of other pathogens. In addition, some can inhibit plant pathogens by producing antibacterial compounds such as actinomycin D and chromomycin A3, etc., and have been shown to produce various metabolites and improve plant growth. It is believed that if these characteristics of Streptomyces are used to control soil-borne fungi, it will be a good alternative to chemical control agents.
이에 본 발명자들은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속을 중점으로 연구하여 토양 유래 식물 병원균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내며, 이에 따라 식물, 특히 농작물에 대한 환경 친화적인 병 방제 수단으로 활용할 수 있는 새로운 미생물을 발굴하고자 하였다.Accordingly, the present inventors focused on studying the genus Streptomyces and discovered new microorganisms that exhibit excellent antibacterial activity against soil-derived plant pathogens and can therefore be used as an environmentally friendly disease control method for plants, especially crops. I wanted to do it.
따라서 본 발명의 주된 목적은 식물 병원성 미생물, 특히 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor)와 같은 심각한 식물병을 야기하는 식물 병원성 미생물에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있는 새로운 균주, 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 균주를 제공하는데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to develop new strains, especially Streptomyces, that can exhibit excellent antibacterial activity against plant pathogenic microorganisms, especially plant pathogenic microorganisms that cause serious plant diseases, such as Sclerotinia minor. ) to provide strains of the genus.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92370P로 기탁된 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) JS029 균주를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a strain of Streptomyces murinus JS029 deposited under accession number KACC 92370P.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an antibacterial composition containing the above strain or its culture.
본 발명의 항균용 조성물에 있어서, 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor), 스클레로티니아 스클레로티노룸(Sclerotinia sclerotinorum), 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항균용인 것이 바람직하다.In the antibacterial composition of the present invention, Sclerotinia minor , Sclerotinia sclerotinorum , Pythium aphanidermatum , Rhizoctonia solani ( Rhizoctonia solani ) and Fusarium oxysporum ( Fusarium oxysporum ) It is preferable that it is for antibacterial use against one or more selected from the group consisting of.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing the above strain or its culture.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 있어서, 배추 균핵병, 토마토 균핵병, 고추 균핵병, 감귤나무 균핵병, 돌나물 마름병, 벼잎집무늬마름병, 수박 덩굴쪼김병 및 멜론 덩굴쪼김병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물인 것이 바람직하다.In the composition for controlling plant diseases of the present invention, for controlling one or more plant diseases selected from the group consisting of cabbage sclerotia, tomato sclerotia, pepper sclerotia, citrus sclerotia, sedum blight, rice leaf sheath blight, watermelon vine sclerotia and melon vine sclerotia. It is preferable that it is a composition.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for promoting plant growth containing the above strain or a culture thereof.
본 발명의 균주는 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor)를 포함하여, 스클레로티니아 스클레로티노룸(Sclerotinia sclerotinorum), 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 같은 식물 병원성 곰팡이에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 식물의 생장을 촉진할 수도 있다.Strains of the present invention include Sclerotinia minor , Sclerotinia sclerotinorum , Pythium aphanidermatum , Rhizoctonia solani ) and Fusarium oxysporum , and can exhibit excellent antibacterial activity against plant pathogenic fungi, and can also promote plant growth.
도 1은 본 발명 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) JS029 균주의 미생물 수탁증을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 JS029 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이의 균사 생장 억제 활성을 관찰하기 위해 사용한 페트리접시와 여기에 적용한 JS029 균주 및 곰팡이의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 억제력을 검정하기 위해 사용한 이중 배양 검정의 실험 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 MS 배지에서 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 억제 효과를 관찰하기 위한 실험 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 JS029 균주의 포장 적용성을 조사하기 위한 실험 방법을 나타낸 것이다.
도 7은 배지의 종류에 따른 본 발명 JS029 균주의 형태적 특성 실험 결과를 나타낸 것이다. (A), ISP-4 배지; (B), LB 배지; (C), NA 배지; (D), PDA 배지; (E), TSA 배지.
도 8은 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 균사 생장 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 억제력에 대한 이중 배양 검정 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 MS 배지에서의 본 발명 JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 11 및 12는 본 발명 JS029 균주의 포장 적용성 실험 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the microbial accession certificate of the present invention Streptomyces murinus ( Streptomyces murinus ) JS029 strain.
Figure 2 shows the 16S rRNA gene sequence of the JS029 strain of the present invention.
Figure 3 shows the Petri dish used to observe the mycelial growth inhibitory activity of soil pathogenic fungi of the JS029 strain of the present invention and the locations of the JS029 strain and fungus applied thereto.
Figure 4 shows the experimental method of the dual culture assay used to test the inhibitory ability of the JS029 strain of the present invention against soil pathogenic fungi.
Figure 5 shows an experimental method for observing the inhibitory effect of soil pathogenic fungi of the JS029 strain of the present invention on MS medium.
Figure 6 shows an experimental method to investigate the packaging applicability of the JS029 strain of the present invention.
Figure 7 shows the results of an experiment on morphological characteristics of the JS029 strain of the present invention according to the type of medium. (A), ISP-4 medium; (B), LB medium; (C), NA medium; (D), PDA medium; (E), TSA badge.
Figure 8 shows the results of an experiment on the inhibition of soil pathogenic fungal mycelial growth of the JS029 strain of the present invention.
Figure 9 shows the results of a dual culture assay experiment on the inhibitory ability of the JS029 strain of the present invention against soil pathogenic fungi.
Figure 10 shows the results of an experiment for inhibiting soil pathogenic fungi of the JS029 strain of the present invention on MS medium.
Figures 11 and 12 show the results of the packaging applicability test of the JS029 strain of the present invention.
본 발명의 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) JS029 균주는 썩은 나무 시료에서 분리되어 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92370P로 기탁되어 있다(도 1).The Streptomyces murinus JS029 strain of the present invention was isolated from a rotten wood sample and deposited in the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) of the National Institute of Agricultural Sciences under the accession number KACC 92370P (Figure 1).
본 발명의 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 서열을 가진다(도 2).The strain of the present invention has the 16S rRNA gene sequence of SEQ ID NO: 1 (FIG. 2).
본 발명의 균주는 TSA(tryptic soy agar), PDA(potato dextrose agar), PDB(potato dextrose broth), ISP-2, CZ(Czapek-dox), MYA(malt yeast extract agar), LB(Luria-Bertani), NA(nutrient agar), ISP-4 등의 배지를 사용하여 배양할 수 있다.The strains of the present invention include tryptic soy agar (TSA), potato dextrose agar (PDA), potato dextrose broth (PDB), ISP-2, Czapek-dox (CZ), malt yeast extract agar (MYA), and Luria-Bertani (LB). ), NA (nutrient agar), ISP-4, etc. can be used for culture.
본 발명의 균주는 pH 5 내지 pH 9의 pH 조건에서 배양할 수 있다.The strain of the present invention can be cultured under pH conditions of pH 5 to pH 9.
본 발명의 균주는 28 내지 37℃의 온도 조건에서 배양할 수 있다.The strain of the present invention can be cultured under temperature conditions of 28 to 37°C.
본 발명의 균주는 4%(w/v) 이하의 NaCl 농도 조건에서 배양할 수 있다.The strain of the present invention can be cultured under NaCl concentration conditions of 4% (w/v) or less.
본 발명의 균주는 스클레로티니아 마이너(Sclerotinia minor), 스클레로티니아 스클레로티노룸(Sclerotinia sclerotinorum), 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 같은 식물 병원성 곰팡이에 대해 우수한 항진균 활성을 나타낼 수 있으며, 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)와 같은 세균에 대한 항균 활성 또한 나타낼 수 있다.Strains of the present invention include Sclerotinia minor , Sclerotinia sclerotinorum , Pythium aphanidermatum , Rhizoctonia solani , and It can exhibit excellent antifungal activity against plant pathogenic fungi such as Fusarium oxysporum , and can also exhibit antibacterial activity against bacteria such as Clavibacter michiganensis .
본 발명의 항균용 조성물은 이러한 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함함으로써, 상기와 같은 진균 및 세균을 포함하여 다양한 미생물의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.The antibacterial composition of the present invention can effectively inhibit the growth of various microorganisms, including the above-mentioned fungi and bacteria, by including the strain of the present invention or a culture thereof.
바람직하게는 본 발명의 항균용 조성물은 스클레로티니아 마이너, 스클레로티니아 스클레로티노룸, 피티움 아파니더마툼, 라이족토니아 솔라니 및 푸사리움 옥시스포룸으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항균용 조성물이다.Preferably, the antibacterial composition of the present invention is one selected from the group consisting of Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotinorum, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum. It is an antibacterial composition for the above conditions.
본 발명의 항균용 조성물에 포함되는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 다양한 형태, 예를 들어 현탁액(예를 들어, 포자 현탁액), 건조물(예를 들어, 포자 또는 배양액의 동결건조물) 등의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 배양물은 균주의 세포가 포함된 것이거나 세포가 제외된 것일 수 있다. 이때 세포는 포자를 포함할 수 있다. 세포가 제외된 것은 예를 들어 균주 배양액에서 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 세포를 제거하여 수득할 수 있다.The strain of the present invention or its culture contained in the antibacterial composition of the present invention takes various forms, for example, suspension (e.g., spore suspension), dried product (e.g., lyophilized product of spores or culture medium), etc. may be included. Additionally, the culture may contain cells of the strain or may exclude cells. At this time, the cells may contain spores. Excluding cells can be obtained, for example, by removing cells from the strain culture medium by methods such as filtration or centrifugation.
본 발명의 항균용 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을, 예를 들어 건조 중량을 기준으로, 0.01 내지 100중량%로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.The antibacterial composition of the present invention may contain the strain of the present invention or its culture in various amounts. For example, the composition may include, for example, 0.01 to 100% by weight of the strain of the present invention or its culture, based on dry weight, but is not limited thereto.
일 실시형태에서, 본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 종에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 속에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 미생물 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 항균 물질을 포함하지 않는다. 이때 다른 항균 물질은 기존에 항균 활성이 알려진 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외의 물질을 의미한다.In one embodiment, the antibacterial composition of the present invention does not contain other strains or cultures belonging to the same species as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the antibacterial composition of the present invention does not contain other strains or cultures belonging to the same genus as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the antibacterial composition of the present invention does not contain any other microorganisms or cultures other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the antibacterial composition of the present invention does not contain any antibacterial substances other than the strain of the present invention or its culture. At this time, other antibacterial substances refer to substances other than the strain of the present invention or its culture whose antibacterial activity is previously known.
본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 항균 제제로의 제제화에 통상적으로 포함되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.In addition to the strain or culture thereof of the present invention, the antibacterial composition of the present invention may further include additives commonly included in the formulation of antibacterial agents, such as buffers, diluents, and excipients.
본 발명의 항균용 조성물은 예를 들어 대상(항균 효과가 발휘되도록 하고자 하는 대상)의 표면에 분사하거나 대상과 혼합하거나 대상과 함께 포장하는 등의 다양한 방식으로 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 통상의 기술자라면 본 명세서에 제시된 본 발명 균주의 항균 활성 등을 바탕으로 조성물의 상태, 대상의 상태, 목적하는 효과 등에 따라 적절히 변경하여 적용할 수 있을 것이다.The antibacterial composition of the present invention can be used in various ways, such as spraying on the surface of an object (an object for which an antibacterial effect is to be exerted), mixing with the object, or packaging with the object, but is not limited thereto. A person skilled in the art would be able to appropriately change and apply the composition according to the state of the composition, the state of the object, the desired effect, etc., based on the antibacterial activity of the strain of the present invention presented in this specification.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 상기와 같이 식물 병원성 곰팡이에 대해 우수한 항진균 활성을 갖는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함함으로써, 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다.The composition for controlling plant diseases of the present invention can effectively control plant diseases by containing the strain or culture thereof of the present invention having excellent antifungal activity against plant pathogenic fungi as described above.
본 발명의 균주는 스클레로티니아 마이너, 스클레로티니아 스클레로티노룸, 피티움 아파니더마툼, 라이족토니아 솔라니 및 푸사리움 옥시스포룸에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 스클레로티니아 마이너는 배추, 토마토 등에 균핵병을 유발하고, 스클레로티니아 스클레로티노룸은 고추, 감귤나무 등에 균핵병을 유발하고, 피티움 아파니더마툼은 돌나물 마름병을 유발하고, 라이족토니아 솔라니는 벼 잎집무늬마름병을 유발하고 푸사리움 옥시스포룸은 수박, 멜론 등에 덩굴쪼김병을 유발한다. 따라서 바람직하게는 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 배추 균핵병, 토마토 균핵병, 고추 균핵병, 감귤나무 균핵병, 돌나물 마름병, 벼잎집무늬마름병, 수박 덩굴쪼김병 및 멜론 덩굴쪼김병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물이다.The strain of the present invention can exhibit excellent antibacterial activity against Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotinorum, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum, and Clerotinia minor causes sclerotia disease in cabbage and tomatoes, Sclerotinia sclerotinorum causes sclerotia disease in peppers and citrus trees, Pythium aphanidermatum causes sedum blight, and Rhizoctonia Solani causes sheath blight in rice, and Fusarium oxysporum causes vine scorch in watermelons, melons, etc. Therefore, preferably, the composition for controlling plant diseases of the present invention is one or more plant diseases selected from the group consisting of cabbage sclerotia, tomato sclerotia, pepper sclerotia, citrus sclerotia, sedum blight, rice leaf sheath blight, watermelon vine sclerotia, and melon vine sclerotia. It is a pest control composition.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 포함되는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 다양한 형태, 예를 들어 현탁액(예를 들어, 포자 현탁액), 건조물(예를 들어, 포자 또는 배양액의 동결건조물) 등의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 배양물은 균주의 세포가 포함된 것이거나 세포가 제외된 것일 수 있다. 이때 세포는 포자를 포함할 수 있다. 세포가 제외된 것은 예를 들어 균주 배양액에서 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 세포를 제거하여 수득할 수 있다.The strain of the present invention or its culture contained in the composition for controlling plant diseases of the present invention may be in various forms, for example, suspension (e.g., spore suspension), dried product (e.g., lyophilized product of spores or culture medium), etc. It may be included in the form of . Additionally, the culture may contain cells of the strain or may exclude cells. At this time, the cells may contain spores. Excluding cells can be obtained, for example, by removing cells from the strain culture medium by methods such as filtration or centrifugation.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을, 예를 들어 건조 중량을 기준으로, 0.01 내지 100중량%로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.The composition for controlling plant diseases of the present invention may contain the strain of the present invention or its culture in various amounts. For example, the composition may include, for example, 0.01 to 100% by weight of the strain of the present invention or its culture, based on dry weight, but is not limited thereto.
일 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 종에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 속에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 미생물 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 식물병 방제 물질을 포함하지 않는다. 이때 다른 식물병 방제 물질은 기존에 식물병 방제 효과가 알려진 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외의 물질을 의미한다.In one embodiment, the composition for controlling plant diseases of the present invention does not contain other strains or cultures belonging to the same species as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the composition for controlling plant diseases of the present invention does not contain other strains or cultures belonging to the same genus as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the composition for controlling plant diseases of the present invention does not contain any other microorganisms or cultures other than the strain or culture thereof of the present invention. In another embodiment, the composition for controlling plant diseases of the present invention does not contain any other plant disease controlling substances other than the strain of the present invention or its culture. At this time, other plant disease control substances refer to substances other than the strain or culture of the present invention whose plant disease control effect is known.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 식물병 방제 제제로의 제제화에 통상적으로 포함되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.The composition for controlling plant diseases of the present invention may further include additives, such as buffers, diluents, and excipients, which are commonly included in the formulation of plant disease control preparations, in addition to the strain or culture thereof of the present invention. .
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 예를 들어 대상 식물(식물병을 방제하고자 하는 식물)을 재배할 토양에 분사하거나 이 토양과 혼합하거나 대상 식물의 표면에 분사하는 등의 다양한 방식으로 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 통상의 기술자라면 본 명세서에 제시된 본 발명 균주의 식물병 방제 효과 등을 바탕으로 조성물의 상태, 대상의 상태, 목적하는 효과 등에 따라 적절히 변경하여 적용할 수 있을 것이다.The composition for controlling plant diseases of the present invention can be used in various ways, such as spraying on the soil in which the target plant (plant for which the plant disease is to be controlled) will be grown, mixing with the soil, or spraying on the surface of the target plant. , but is not limited to this. A person skilled in the art will be able to appropriately change and apply the composition according to the state of the composition, the state of the object, the desired effect, etc., based on the plant disease control effect of the strain of the present invention presented in this specification.
본 발명의 균주는 상기와 같은 항균 활성 및 식물병 방제 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 식물 성장을 촉진할 수 있다. 따라서 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함함으로써, 식물 성장을 효과적으로 촉진할 수 있다.The strain of the present invention can not only exhibit antibacterial activity and plant disease control effects as described above, but can also promote plant growth. Therefore, the composition for promoting plant growth of the present invention can effectively promote plant growth by containing the strain of the present invention or its culture.
바람직하게는 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 배추 성장 촉진용 조성물이다.Preferably, the composition for promoting plant growth of the present invention is a composition for promoting growth of cabbage.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물에 포함되는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 다양한 형태, 예를 들어 현탁액(예를 들어, 포자 현탁액), 건조물(예를 들어, 포자 또는 배양액의 동결건조물) 등의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 배양물은 균주의 세포가 포함된 것이거나 세포가 제외된 것일 수 있다. 이때 세포는 포자를 포함할 수 있다. 세포가 제외된 것은 예를 들어 균주 배양액에서 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 세포를 제거하여 수득할 수 있다.The strain of the present invention or its culture contained in the composition for promoting plant growth of the present invention may be in various forms, such as suspension (e.g., spore suspension), dried product (e.g., lyophilized product of spores or culture medium), etc. It may be included in the form of . Additionally, the culture may contain cells of the strain or may exclude cells. At this time, the cells may contain spores. Excluding cells can be obtained, for example, by removing cells from the strain culture medium by methods such as filtration or centrifugation.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을, 예를 들어 건조 중량을 기준으로, 0.01 내지 100중량%로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.The composition for promoting plant growth of the present invention may include the strain of the present invention or its culture in various amounts. For example, the composition may include, for example, 0.01 to 100% by weight of the strain of the present invention or its culture, based on dry weight, but is not limited thereto.
일 실시형태에서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 종에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 본 발명의 균주와 같은 속에 속하는 다른 균주 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 미생물 또는 이의 배양물을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 식물 성장 촉진 물질을 포함하지 않는다. 이때 다른 식물 성장 촉진 물질은 기존에 식물 성장 촉진 효과가 알려진 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외의 물질을 의미한다.In one embodiment, the composition for promoting plant growth of the present invention does not contain other strains or cultures belonging to the same species as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the composition for promoting plant growth of the present invention does not include other strains or cultures belonging to the same genus as the strain of the present invention other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the composition for promoting plant growth of the present invention does not contain any other microorganisms or cultures other than the strain of the present invention or the culture thereof. In another embodiment, the composition for promoting plant growth of the present invention does not contain any plant growth promoting substances other than the strain of the present invention or its culture. At this time, other plant growth promoting substances refer to substances other than the strain of the present invention or its culture whose plant growth promoting effect is known.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 식물 성장 촉진 제제로의 제제화에 통상적으로 포함되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.In addition to the strain or culture thereof of the present invention, the composition for plant growth promotion of the present invention may further include additives commonly included in the formulation of plant growth promotion preparations, such as buffers, diluents, and excipients. .
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 예를 들어 대상 식물(성장을 촉진하고자 하는 식물)을 재배할 토양에 분사하거나 이 토양과 혼합하거나 대상 식물의 표면에 분사하는 등의 다양한 방식으로 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 통상의 기술자라면 본 명세서에 제시된 본 발명 균주의 식물 성장 촉진 효과 등을 바탕으로 조성물의 상태, 대상의 상태, 목적하는 효과 등에 따라 적절히 변경하여 적용할 수 있을 것이다.The composition for promoting plant growth of the present invention can be used in various ways, such as spraying on the soil in which the target plant (the plant whose growth is to be promoted) will be grown, mixing it with the soil, or spraying it on the surface of the target plant. It is not limited to this. A person skilled in the art would be able to appropriately change and apply the composition according to the state of the composition, the state of the object, the desired effect, etc., based on the plant growth promoting effect of the strain of the present invention presented in this specification.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. Since these examples are merely for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 균주 분리Example 1. Strain isolation
다음의 방법으로 본 발명의 JS029 균주를 분리하였다.The JS029 strain of the present invention was isolated by the following method.
썩은 나무 시료 100g을 1000㎖의 멸균수에 1차 희석한 후 멸균수에 10-1 내지 10-5으로 연속희석법으로 희석하였다. 1차 희석액은 최종농도 20% 글리세롤에 섞어 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 연속희석된 희석액을 각각 100㎕씩 TSA(tryptic soy agar), PDA(potato dextrose agar), ISP-2 등의 고체배지에 도말한 후 28℃에서 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배양으로 생성된 콜로니 중에서 형태적으로 방선균으로 구분되는 콜로니들만 3차례 이상의 계대배양을 통해 순수한 콜로니로 회수하였다. 순수배양된 콜로니는 5일간 고체 배양하여 포자 형성을 유도한 후 최종농도 20% 글리세롤에 섞어 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다.100 g of rotten wood sample was first diluted in 1000 ml of sterilized water and then diluted in sterilized water from 10 -1 to 10 -5 by serial dilution. The first dilution was mixed with glycerol to a final concentration of 20% and stored in an ultra-low temperature freezer at -80°C. 100 ㎕ of each serially diluted solution was spread on solid media such as tryptic soy agar (TSA), potato dextrose agar (PDA), and ISP-2, and then cultured at 28°C for 24 or 48 hours. Among the colonies generated by culture, only those that were morphologically classified as actinomycetes were recovered as pure colonies through subculture three or more times. Purely cultured colonies were cultured on solids for 5 days to induce spore formation, then mixed with glycerol at a final concentration of 20% and stored in an ultra-low temperature freezer at -80°C.
실시예 2. 균주 평가Example 2. Strain evaluation
2-1. 방법2-1. method
2-1-1. 염기서열 해독 및 상동성 검색2-1-1. Base sequence decoding and homology search
JS029 균주의 콜로니를 PDB 액체배지에 접종하여 3일 동안 진탕배양한 후 배양액을 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 사용한 16S rRNA 유전자 염기서열 해독은 ㈜제노텍에 의뢰하였으며, bacterial universal primer(518F, 785F, 800R, 907R)를 사용하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검사는 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였고, 표준균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 관련된 분류군의 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 Ezbiocloud 서버(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon)에서 수행하였다.Colonies of the JS029 strain were inoculated into PDB liquid medium and cultured with shaking for 3 days. The culture was then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant and recover the cells. The 16S rRNA gene sequence decoding using the recovered bacterial cells was commissioned by Genotech Co., Ltd. and was performed using bacterial universal primers (518F, 785F, 800R, 907R). The homology test of the 16S rRNA gene sequence was performed using the BLAST program, and the similarity with standard strains (type strains) was investigated and the 16S rRNA gene sequence of related taxa was secured through the Ezbiocloud server (http:/ /www.ezbiocloud.net/ eztaxon).
2-1-2. 항진균 활성 검정을 위한 토양병원성 곰팡이와 JS029 균주의 준비 및 배양 조건2-1-2. Preparation and culture conditions of soil pathogenic fungi and JS029 strain for antifungal activity assay
토양병원성 곰팡이는 MEA(malt extract agar) 배지에서 25℃, 암상태에서 7일간 배양하였다. 배양된 곰팡이 균사의 끝부분을 직경 5㎜ 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 펀칭한 뒤, 배지와 함께 9㎝ 페트리접시(높이 15㎜, 직경 90㎜; SPL, 서울, 한국)의 중앙에 접종하였다.Soil pathogenic fungi were cultured on MEA (malt extract agar) medium at 25°C in the dark for 7 days. The tip of the cultured fungal hyphae was punched using a cork borer with a diameter of 5 mm, and then inoculated into the center of a 9 cm Petri dish (height 15 mm, diameter 90 mm; SPL, Seoul, Korea) along with the medium. did.
JS029 균주는 CZ(Czapek-dox) 배지에 스트리킹(streaking)하여 25℃로 3주간 배양하였다.Strain JS029 was streaked on CZ (Czapek-dox) medium and cultured at 25°C for 3 weeks.
2-1-3. JS029 균주에 의한 토양병원성 곰팡이의 균사 생장 억제 관찰2-1-3. Observation of inhibition of mycelial growth of soil pathogenic fungi by strain JS029
토양병원균 곰팡이에 대한 JS029 균주의 항균활성을 알아보기 위해 24.5 × 24.5㎝ 사각 페트리접시(245㎜ × 245㎜ × 20㎜; SPL, 서울, 한국)에 JS029 균주와 13종의 곰팡이를 MYA(malt yeast extract agar) 배지에 공동 접종하여 25℃ 암상태에서 7일간 배양한 뒤 결과를 측정하였다. JS029 균주의 포자 현탁액 준비의 경우 균주를 CZ(Czapek Dox agar) 배지에 스트리킹하여 3주간 배양한 뒤, 배양한 배지에 멸균 증류수 2㎖를 분주하여, 멸균 면봉을 이용하여 배지 표면을 문질러 포자를 수거하였다. 수거된 포자는 균사를 제거하기 위해 15㎖ 캡-튜브에 멸균된 미라클로스(miracloth)를 이용하여 걸러준 뒤 각 곰팡이로부터 30㎜ 떨어진 양쪽에 놓인 지름 6㎜의 페이퍼디스크에 15㎕로 분주하였다. 곰팡이는 7일간 배양한 배지에서 가장자리의 균사를 직경 5㎜ 코르크 보러를 이용하여 펀칭한 뒤 접종하였다. 이 방법으로 2반복으로 실험하였다. 대조군으로 멸균 증류수 15㎕를 페이퍼디스크에 분주하여 사용하였다(도 3).To investigate the antibacterial activity of strain JS029 against soil pathogenic fungi, strain JS029 and 13 types of fungi were incubated with MYA (malt yeast) in a 24.5 × 24.5 cm square petri dish (245 mm × 245 mm × 20 mm; SPL, Seoul, Korea). extract agar medium and cultured for 7 days in the dark at 25°C, and then measured the results. In the case of preparing a spore suspension of the JS029 strain, the strain was streaked on CZ (Czapek Dox agar) medium and cultured for 3 weeks, then 2 ml of sterilized distilled water was dispensed into the cultured medium, and the spores were collected by rubbing the surface of the medium using a sterile cotton swab. did. The collected spores were filtered using sterilized miracloth in a 15 ㎖ cap-tube to remove mycelia, and then dispensed at 15 ㎕ onto paper disks with a diameter of 6 mm placed on both sides 30 mm away from each fungus. The fungus was inoculated after punching the edge of the hyphae from the medium cultured for 7 days using a cork borer with a diameter of 5 mm. The experiment was repeated twice with this method. As a control, 15㎕ of sterilized distilled water was dispensed onto a paper disk and used (Figure 3).
2-1-4. 균주의 특성 구명2-1-4. Characterization of strains
JS029 균주의 성장 특성을 알아보기 위해서, NaCl을 최종농도 0 내지 5%(1%간격)가 되도록 각각 첨가한 PDA 고체배지에 접종한 후 3일간 배양하여 성장을 관찰하였으며, 성장에 영향을 미치는 pH 조건을 알아보기 위해서, pH 5.0 내지 pH 11.0(pH 1.0의 간격)의 고체배지를 만들어 접종한 후 3일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 또한 배양온도에 따른 성장을 관찰하기 위해서 4, 15, 28, 37℃에서 각각 3일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 형태분화는 LB, NA, PDA, ISP-4, TSA 등 5종의 고체배지에서 7일간 배양하면서 관찰하였다.To determine the growth characteristics of the JS029 strain, it was inoculated on PDA solid medium to which NaCl was added to a final concentration of 0 to 5% (at 1% intervals) and then cultured for 3 days to observe growth, and pH that affects growth was observed. To determine the conditions, solid media of pH 5.0 to pH 11.0 (pH 1.0 interval) were prepared, inoculated, and cultured for 3 days to observe growth. Additionally, in order to observe growth according to culture temperature, the cells were cultured at 4, 15, 28, and 37°C for 3 days respectively to observe growth. Morphological differentiation was observed by culturing for 7 days on five types of solid media, including LB, NA, PDA, ISP-4, and TSA.
2-1-5. 이중 배양 검정2-1-5. Dual culture assay
JS029 균주의 토양병원성 곰팡이 억제력을 검정하기 위해 병원체와 공동배양하여 균사 생장 저지대를 직접적으로 관찰할 수 있는 이중 배양 검정(dual culture assay)(Kunova et al., 2016) 방법을 이용하였다(도 4). 이 방법은 실험에 사용한 균이 억제물질을 가지고 있는 지의 여부를 1차적으로 판단할 시 주로 사용되며, 여러 병원체의 균사 생장을 비교할 수 있다는 장점이 있다.To test the ability of the JS029 strain to suppress soil pathogenic fungi, a dual culture assay (Kunova et al., 2016) method was used, which allows direct observation of mycelial growth low zones by co-culturing with pathogens (Figure 4). . This method is mainly used to determine primarily whether the bacteria used in the experiment contain inhibitory substances, and has the advantage of being able to compare the mycelial growth of several pathogens.
선별된 7종의 곰팡이 균주들을 MEA 배지에 배양하여 25℃ 암상태에서 7일간 보관한 뒤, 가장자리를 펀칭하여 9㎝ MEA 배지 페트리접시 중앙에 놓고 페트리접시 가장자리 4곳에 지름 6㎜ 페이어디스크를 치상하였다.The seven selected fungal strains were cultured in MEA medium and stored in the dark at 25°C for 7 days. Then, the edges were punched and placed in the center of a 9 cm MEA medium Petri dish, and 6 mm diameter payer disks were placed on four edges of the Petri dish. did.
JS029 균주를 CZ 배지에 스트리킹하여 배양하였다. 멸균 증류수를 이용하여 포자를 수거하고 멸균 증류수로 포자 농도를 108 cfu/㎖로 맞춰 준비하였다. 치상된 6㎜ 페이퍼디스크에 준비된 JS029 균주 포자 현탁액 15㎕를 분주한 후 25℃에서 일주일간 배양한 뒤 나타난 저지대를 측정하였다. 3반복으로 실험을 수행하였으며, 대조군의 경우 병원균을 접종한 뒤 페이퍼디스크에 멸균 증류수를 15㎕를 처리하였다.Strain JS029 was cultured by streaking on CZ medium. Spores were collected using sterilized distilled water, and the spore concentration was adjusted to 10 8 cfu/ml using sterilized distilled water. 15 ㎕ of the prepared JS029 strain spore suspension was dispensed onto a 6 mm paper disk and cultured at 25°C for a week, and then the low area that appeared was measured. The experiment was performed in three repetitions. In the control group, 15㎕ of sterilized distilled water was added to a paper disk after inoculation with pathogens.
2-1-6. MS(Murashige and Skoog) 배지를 이용한 곰팡이 억제 효과 관찰2-1-6. Observation of mold inhibition effect using MS (Murashige and Skoog) medium
JS029 균주를 사용하여 실제 작물에도 효과가 있는지 관찰하였다. JS029 균주를 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 스트리킹하고 스클레로티니아 마이너( Sclerotinia minor)를 PDA 배지에 치상하여 1주일간 25℃에서 배양한 후 5㎜ 코르크 보러로 가장자리를 펀칭하여 사용하였다. MS(Murashige and Skoog, 1962) 아가(agar) 배지를 사각 페트리접시(125 × 125 × 20㎜; SPL, 서울, 한국)에 굳힌 후 멸균된 셀로판지를 놓았다. 셀로판지와 맞닿게 일정한 간격으로 씨앗을 배치하였다. 대조군과 실험군 모두 페트리접시 양쪽에 펀칭한 배양 블록을 놓았다(도 5).Using the JS029 strain, we observed whether it was effective on actual crops. Strain JS029 was streaked on PDA (Potato Dextrose Agar) medium, and Sclerotinia minor was placed on PDA medium and cultured at 25°C for one week, and then used by punching the edges with a 5 mm cork bore. MS (Murashige and Skoog, 1962) agar medium was solidified in a square Petri dish (125 × 125 × 20 mm; SPL, Seoul, Korea) and then placed on sterilized cellophane. Seeds were placed at regular intervals in contact with the cellophane. Punched culture blocks were placed on both sides of the Petri dish in both the control and experimental groups (Figure 5).
대조군으로 PDA 배지를 5㎜ 코르크 보러로 펀칭하여 접종하였고, 실험군으로 (1) 스클레로티니아 마이너, (2) JS029 균주, (3) 스클레로티니아 마이너와 JS029 균주를 동시 접종하여 2주간 관찰하였다. 대조군으로 동일하게 PDA 배지만을 사용하였다.As a control group, PDA medium was punched and inoculated with a 5 mm cork bore, and as an experimental group, (1) Sclerotinia minor, (2) JS029 strain, and (3) Sclerotinia minor and JS029 strain were simultaneously inoculated and observed for 2 weeks. did. As a control, only PDA medium was used.
2-1-7. 실제 식물 실험을 통한 JS029 균주의 포장 적용성 연구2-1-7. Research on packaging applicability of strain JS029 through actual plant experiments
MS 배지에서 확인된 JS029 균주의 항균력이 흙에서도 동일하게 나타나는지를 확인하기 위해 실험을 진행하였다(도 6).An experiment was conducted to confirm whether the antibacterial activity of the JS029 strain identified on MS medium was the same in soil (Figure 6).
다른 병원균 및 미생물의 영향을 배제하기 위해 멸균한 흙을 사용하였다. 흙 150㎖에 멸균 증류수 60㎖을 섞어 멸균기(121℃, 15psi)에서 20분간 멸균한 후 식물 배양 접시(100 × 50㎜)(PP); SPL, 서울, 한국)에 담고 스클레로티니아 마이너 균핵 30개와 일주일간 JS029 균주를 배양한 PDA를 5㎜ 코르크 보러로 펀칭한 15개의 조각을 흙에 섞어 주었다. 대조군은 PDA를 펀칭하여 사용하였다.Sterilized soil was used to exclude the influence of other pathogens and microorganisms. 150 ml of soil was mixed with 60 ml of sterilized distilled water, sterilized in a sterilizer (121°C, 15 psi) for 20 minutes, and then placed in a plant culture dish (100 × 50 mm) (PP); SPL, Seoul, Korea) and 30 pieces of Sclerotinia minor sclerotia and 15 pieces of PDA cultured with the JS029 strain for a week were mixed with the soil. The control group was used by punching PDA.
이후 실험에서는 포자의 수를 동일하게 하여 실험에 진행하기 위해 포자 현탁액을 사용하였다. 멸균된 흙 250㎖에 D.W 130㎖를 섞어 멸균기(121℃, 15psi)에서 20분간 멸균한 후 배추 씨앗 5개를 파종하여 7일간 기른 후 대조군에는 멸균 증류수 10㎖를 분주하고 스클레로티니아 마이너 균핵만 접종한 것과 JS029 균주의 포자의 수를 107 cfu/㎖로 희석하여 10㎖를 분주한 것, 균핵과 포자 현탁액을 동시에 접종하여 식물 생육상(Growth chamber)에서 2주간 관찰하였다.In subsequent experiments, a spore suspension was used to proceed with the experiment with the same number of spores. 250 ml of sterilized soil was mixed with 130 ml of DW and sterilized in a sterilizer (121°C, 15 psi) for 20 minutes. Then, 5 cabbage seeds were sown and grown for 7 days. 10 ml of sterilized distilled water was dispensed to the control group and Sclerotinia minor sclerotia were added to the control group. The number of spores of strain JS029 was diluted to 10 7 cfu/ml and dispensed in 10 ml, and the sclerotia and spore suspension were simultaneously inoculated and observed in a growth chamber for 2 weeks.
2-2. 결과2-2. result
2-2-1. 균주 동정 및 배양 특성 확인2-2-1. Strain identification and culture characteristics confirmation
JS029 균주는, 16S rRNA 유전자 염기서열 해독을 통한 상동성 검색결과, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 표준균주 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) NBRC 12799 및 스트렙토마이세스 그라미네아루스(Streptomyces graminearus) NBRC 15420와 99.93%, 스트렙토마이세스 말레이시엔스(Streptomyces malaysiense) MUSC 136과 98.76%, 스트렙토마이세스 시앙타넨시스(Streptomyces xiangtanensis) LUSFXJ와 98.71%, 스트렙토마이세스 미시오엔시스(Streptomyces misioensis) DSM 40306과 98.69%, 스트렙토마이세스 패올루테이크로마토젠스(Streptomyces phaeoluteichromatogenes) NRRL5799와 98.60%의 상동성을 보였고, 이에 따라 스트렙토마이세스 뮤리누스와 동일한 종으로 동정하여 스트렙토마이세스 뮤리누스 JS029로 명명하였다.As a result of homology search through 16S rRNA gene sequence decoding, strain JS029 was identified as the standard strains of the genus Streptomyces, Streptomyces murinus NBRC 12799 and Streptomyces graminearus NBRC 15420. and 99.93%, Streptomyces malaysiense MUSC 136 and 98.76%, Streptomyces xiangtanensis LUSFXJ and 98.71%, Streptomyces misioensis DSM 40306 and 98.69% , it showed 98.60% homology with Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL5799, and was therefore identified as the same species as Streptomyces murinus and named Streptomyces murinus JS029.
JS029 균주는, LB 고체배지에서 기저균사를 형성하고 기균사 및 포자를 형성하지 않으며 배지에 노란색 색소를 분비하였고, TSA 고체배지에서는 기저균사를 형성하고 배지에 노란색 색소를 분비하였고, NA 고체배지에서는 기균사를 형성하고 배지에 노란색 색소를 많이 분비하였고, PDA 고체배지에서는 회색의 포자를 형성하고 배지에 적은 양의 노란색 색소를 분비하였고, ISP-4 고체배지에서는 짙은 갈색의 포자를 형성하고 배지에 노란색 색소를 분비하였다(도 7).Strain JS029 formed basal hyphae on LB solid medium, did not form aerial hyphae or spores, and secreted yellow pigment into the medium; on TSA solid medium, it formed basal hyphae and secreted yellow pigment into the medium; and on NA solid medium, strain JS029 formed basal hyphae and secreted yellow pigment into the medium. Aerial hyphae were formed and a large amount of yellow pigment was secreted into the medium. On PDA solid medium, gray spores were formed and a small amount of yellow pigment was secreted into the medium. On ISP-4 solid medium, dark brown spores were formed and released into the medium. Yellow pigment was secreted (Figure 7).
JS029 균주는 pH 6.0 미만과 10.0 이상의 조건에서는 거의 성장하지 못하였고, pH 7.0의 조건에서 성장이 가장 좋은 것으로 관찰되었다. 또한 15℃ 이하의 조건에서는 성장하지 못하였고 28℃에서 최적의 성장이 관찰되었다. NaCl 농도가 1% 이하일 때 성장이 좋았으며 그 이상의 조건에서는 약한 성장을 보이다가 5% 이상의 조건에서는 전혀 자라지 못하였다(표 1).Strain JS029 hardly grew under conditions of pH less than 6.0 and above 10.0, and growth was observed to be best under conditions of pH 7.0. Additionally, growth was not possible under conditions below 15°C, and optimal growth was observed at 28°C. When the NaCl concentration was less than 1%, growth was good, and when the NaCl concentration was higher, growth was weak, but when the NaCl concentration was higher than 5%, it did not grow at all (Table 1).
-, 성장이 관찰되지 않음; -+, 매우 약한 성장이 관찰됨; +-, 약한 성장이 관찰됨; +, 양호한 성장이 관찰됨; ++, 우수한 성장이 관찰됨.-, no growth observed; -+, very weak growth observed; +-, weak growth observed; +, good growth observed; ++, excellent growth observed.
2-2-2. JS029 균주에 의한 토양병원성 곰팡이의 균사 생장 억제 관찰2-2-2. Observation of inhibition of mycelial growth of soil pathogenic fungi by strain JS029
실험에 사용한 토양 유래 식물병원성 곰팡이 및 세균은 총 14종으로 국립유전자원센터에서 입수하거나 직접 분리하여 실험에 사용하였다.A total of 14 types of soil-derived plant pathogenic fungi and bacteria used in the experiment were obtained from the National Genetic Resources Center or directly isolated and used in the experiment.
실험 실시 후 7일 뒤 저지대를 측정한 결과, 토양유래 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 JS029 균주의 항균 활성이 매우 우수한 것으로 나타났다(도 8 및 표 2).As a result of measuring the low-lying area 7 days after the experiment, the antibacterial activity of the JS029 strain against soil-derived plant pathogenic fungi and bacteria was found to be very excellent (Figure 8 and Table 2).
2-2-3. 이중 배양 검정2-2-3. Dual culture assay
JS029 균주와 곰팡이 7종에 대하여 이중 배양 검정을 실시하였다. 실험을 실시하고 7일 후 저지대를 측정한 결과, JS029 균주는 다양한 곰팡이 균주에 대해 저지대를 보였다. JS029 균주는 배추에서 분리된 균핵병균인 스클레로티니아 마이너에서 높은 균사 성장 저해를 보였다(도 9 및 표 3).A dual culture assay was performed on strain JS029 and 7 types of fungi. As a result of measuring the low area 7 days after conducting the experiment, strain JS029 showed low area against various fungal strains. Strain JS029 showed high inhibition of mycelial growth in Sclerotinia minor, a sclerotic fungus isolated from Chinese cabbage (Figure 9 and Table 3).
2-2-4. MS(Murashige and Skoog) 배지를 이용한 곰팡이 억제 효과 관찰2-2-4. Observation of mold inhibition effect using MS (Murashige and Skoog) medium
MS 배지를 이용하여 기주 식물 내에서의 곰팡이의 병원성과 JS029 균주의 병원성 저해 능력을 검정하였다. JS029가 높은 균사 저해능을 보였던 스클레로티니아 마이너와 배추를 MS 배지에서 기른 뒤 항균 활성을 검정하였다. 스클레로티니아 마이너와 기주인 배추에 JS029 균주를 적용하였을 때 초기 실험과 동일하게 높은 항균능을 보였다.Using MS medium, the pathogenicity of the fungus in the host plant and the pathogenicity inhibition ability of the JS029 strain were tested. Sclerotinia minor and Chinese cabbage, in which JS029 showed high mycelium inhibition ability, were grown on MS medium and tested for antibacterial activity. When strain JS029 was applied to Sclerotinia minor and its host cabbage, it showed high antibacterial activity, the same as in the initial experiment.
MS 배지를 이용하여 시험관 내에서 배추에 JS029 균주를 적용하여 1주일 간격으로 총 2주간 관찰하였다.The JS029 strain was applied to Chinese cabbage in vitro using MS medium and observed at weekly intervals for a total of 2 weeks.
그 결과 스클레로티니아 마이너와 JS029 균주를 동시 접종한 실험구에서는 JS029 균주를 접종한 배지 쪽의 배추만이 생장하는 것으로 나타났다. 이는 JS029 균주가 스클레로티니아 마이너에 대한 항균 작용을 나타내어 배추 실생을 보호할 수 있음을 의미한다(도 10).As a result, in the experimental plot inoculated simultaneously with Sclerotinia minor and the JS029 strain, only cabbage grew on the medium inoculated with the JS029 strain. This means that strain JS029 exhibits antibacterial activity against Sclerotinia minor and can protect cabbage seedlings (FIG. 10).
2-2-5. 실제 식물 실험을 통한 JS029 균주의 포장 적용성 연구2-2-5. Research on packaging applicability of strain JS029 through actual plant experiments
토양 내에서 JS029 균주의 항균활성을 알아보기 위해 멸균된 흙에 포트당 씨앗 7개를 파종하여 실험을 수행하였다. 2주 동안 관찰한 결과 스클레로티니아 마이너만 접종된 포트와 달리 스클레로티니아 마이너와 JS029 균주를 동시 접종한 포트의 배추는 모두 살아남았다(도 11).To determine the antibacterial activity of the JS029 strain in soil, an experiment was conducted by sowing 7 seeds per pot in sterilized soil. As a result of observation for two weeks, unlike the pot inoculated only with Sclerotinia minor, all cabbages in the pot inoculated with Sclerotinia minor and the JS029 strain simultaneously survived (FIG. 11).
또한, 이 실험에서 대조군과 JS029 균주가 접종된 포트의 배추의 생장을 비교해 본 결과, JS029 균주가 접종된 식물의 성장이 대조군에 비해 촉진되는 것으로 나타났다. 실험 결과를 더 자세히 살펴보기 위해 식물 생장이 저해되지 않는 깊이가 깊은 포트(25㎝ 높이의 유리병)로 변경하여 실험을 수행하였다.In addition, as a result of comparing the growth of cabbage in pots inoculated with the control and JS029 strains in this experiment, it was found that the growth of plants inoculated with the JS029 strain was promoted compared to the control. To examine the experimental results in more detail, the experiment was performed by changing to a deep pot (25 cm high glass bottle) that does not inhibit plant growth.
실험을 실시하고 2주가 지난 후 모든 개체가 곰팡이에 감염된 스클레로티니아 마이너 포트와 다르게 동시 접종한 포트는 4주가 지난 후에도 배추가 정상적으로 생장하였다(도 12). 이 실험에서도 JS029 균주가 접종된 포트에서 식물의 생장이 촉진되는 것으로 나타났다. 각 생체량을 측정한 결과 JS029 균주를 접종한 포트의 배추와 대조군 포트의 배추의 생체량은 약 160㎎ 차이가 났으며, 동시 접종한 포트의 배추는 2,900㎎으로 측정되었다(표 4).Two weeks after the experiment was conducted, unlike the Sclerotinia minor pot in which all individuals were infected with the fungus, cabbage grew normally in the simultaneously inoculated pot even after four weeks (FIG. 12). This experiment also showed that plant growth was promoted in pots inoculated with the JS029 strain. As a result of measuring each biomass, there was a difference of about 160 mg in the biomass of the cabbage in the pot inoculated with the JS029 strain and the cabbage in the control pot, and the cabbage in the simultaneously inoculated pot was measured at 2,900 mg (Table 4).
<110> National Institute of Biological Resources <120> Novel Streptomyces murinus JS029 strain with anti-fungal activity against plant pathogenic fungi <130> ALP21024 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Streptomyces murinus JS029 <400> 1 tgctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgat gaagcccttc 60 ggggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctg cactctggga 120 caagccctgg aaacggggtc taataccgga tatgaccatc ttgggcatcc ttgatggtgt 180 aaagctccgg cggtgcagga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 240 caccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg 360 atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga 420 agaagcgaga gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 540 cttgtcacgt cgattgtgaa agctcggggc ttaaccccga gtctgcagtc gatacgggct 600 agctagagtg tggtagggga gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc 660 aggaggaaca ccggtggcga aggcggatct ctgggccatt actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtgggaacta 780 ggtgttggcg acattccacg tcgtcggtgc cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg 840 ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga 900 gcatgtggct taattcgacg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tacaccggaa 960 agcattagag atagtgcccc ccttgtggtc ggtgtacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag 1020 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cccgtgttgc 1080 cagcaggccc ttgtggtgct ggggactcac gggagaccgc cggggtcaac tcggaggaag 1140 gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacg tgctacaatg 1200 gccggtacaa tgagctgcga taccgtgagg tggagcgaat ctcaaaaagc cggtctcagt 1260 tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1320 cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcacgaaagt 1380 cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag ggagctgtcg aaggtgggac 1440 cagcgattgg gacgaagtcg taaa 1464 <110> National Institute of Biological Resources <120> Novel Streptomyces murinus JS029 strain with anti-fungal activity against plant pathogenic fungi <130> ALP21024 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Streptomyces murinus JS029 <400> 1 tgctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgat gaagcccttc 60 ggggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctg cactctggga 120 caagccctgg aaacggggtc taataccgga tatgaccatc ttgggcatcc ttgatggtgt 180 aaagctccgg cggtgcagga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 240 caccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg 360 atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga 420 agaagcgaga gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 540 cttgtcacgt cgattgtgaa agctcggggc ttaacccccga gtctgcagtc gatacgggct 600 agctagagtg tggtagggga gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc 660 aggaggaaca ccggtggcga aggcggatct ctgggccatt actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtgggaacta 780 ggtgttggcg acattccacg tcgtcggtgc cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg 840 ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga 900 gcatgtggct taattcgacg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tacaccggaa 960 agcattagag atagtgcccc ccttgtggtc ggtgtacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag 1020 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cccgtgttgc 1080 cagcaggccc ttgtggtgct ggggactcac gggagaccgc cggggtcaac tcggaggaag 1140 gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacg tgctacaatg 1200 gccggtacaa tgagctgcga taccgtgagg tggagcgaat ctcaaaaagc cggtctcagt 1260 tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1320 cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcacgaaagt 1380 cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag ggagctgtcg aaggtgggac 1440 cagcgattgg gacgaagtcg taaa 1464
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A composition for promoting cabbage growth comprising the strain of claim 1 or a culture thereof.
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2021
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