KR102262248B1 - 허혈성 뇌경색에의 다능성 줄기 세포의 동원 - Google Patents

허혈성 뇌경색에의 다능성 줄기 세포의 동원 Download PDF

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Abstract

피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하며, 다능성 줄기 세포의 수의 지표로 한, 피험자에 있어서의 뇌경색의 예후, 일과성 허혈 발작 후의 뇌경색 리스크 또는 무증후성 뇌경색을 예측 또는 진단하기 위한 검사 방법이 제공된다.

Description

허혈성 뇌경색에의 다능성 줄기 세포의 동원
본 발명은, 피험자에 있어서의 뇌경색의 예후, 일과성 허혈 발작 후의 뇌경색 리스크 또는 무증후성 뇌경색을 예측 또는 진단하기 위한 검사 방법, 및 상기 검사 방법에 이용되는 키트에 관한 것이다.
뇌졸중은 인간의 사망의 주요 원인 중 하나이다. 모든 뇌졸중 환자 중 80% 이상이 허혈성 뇌경색을 겪고 있다[1]. 많은 연구에도 불구하고, 뇌졸중의 치료는, 발증후 4.5시간 이내에 조직 플러스미노겐 활성화 인자(tPA)를 이용한 혈전 용해 요법에 여전히 한정되어 있다. 만성기의 허혈성 뇌경색의 환자에 대해서는, 지원적인 케어와 재활 치료만이 확립되어 있다. 따라서, 환자의 기능적 전귀(轉歸)를 개선하기 위한 대체 치료 접근이 필요로 된다.
최근의 연구에서는, 여러가지 줄기 세포/전구 세포가, 허혈성 뇌경색을 포함하는 여러가지 장애에 있어서, 골수로부터 말초혈에 동원되는 것이 실증되고 있다. 상기 세포에는 내피 전구 세포(EPC), 조혈 줄기 세포, CD31 양성 세포(혈관 전구 세포) 등이 포함되며, 뇌에서의 혈관 신생에 기여한다. 또한, 간엽계 줄기 세포(MSC)는, 신경 영양 인자 등을 방출하여 허혈성 뇌경색후의 기능 회복을 높인다[2]. 보다 중요한 것은, 이들은 또한, 신경 세포로 분화할 수 있는 소수의 다능성 세포를 포함한다[3]. 최근, 데자와 등은, 진피 선유아 세포 및 MSC 등의 성인 인간 간엽계 세포에 있어서, 독자적인 타입의 줄기 세포를 발견했다. 이들은, MSC 전체의 수%를 차지하고, 스트레스 내성이기 때문에, 다계통 분화 스트레스 내성(Muse: Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포로 명명되어 있다[4]. 이들은, 주지의 인간 배아 줄기(ES) 세포 마커인 시기 특이적 태아성 항원(SSEA: Stage Specific Embryonic Antigen)-3에 양성의 세포로서 효율적으로 단리할 수 있다. SSEA-3 항체를 이용하여, FACS에 의해, 인간 골수 및 선유아 세포로부터 Muse 세포를 효율적으로 분리할 수 있다[4]. Muse 세포는, 자기 복제할 수 있고, Nanog, Oct3/4 및 Sox2 등의 다능성과 관련된 유전자를 발현하여, 단일 세포로부터 내배엽, 외배엽 및 중배엽 계통의 세포로 분화할 수 있다. 사이토카인 유도하에, Muse 세포는, 약 90%의 매우 높은 비율로 뉴런 마커 양성 세포로 분화한다[5]. 동물 실험에서는, 인비보로 이식되었을 때에 조직 수복 세포로서 작용한다; 이들은, 손상 조직을 향해 이동하고, 몇가지 장애의 동물 모델에 있어서, 귀소되는 조직에 적합한 세포로 자발적으로 분화한다[4]. 실제로, Muse 세포는 마우스의 경색 뇌에 직접 주입되면, 숙주의 뇌에 생착한 후 조직에 삽입되고, 뉴런 마커를 발현하여, 현저하게 기능 회복을 높인다[6]. ES 세포나 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등의 주지의 다능성 줄기 세포와는 달리, Muse 세포는 텔로머라아제 활성이 낮아, 면역 부전 마우스 정소에 있어서 기형을 형성하지 않는다[5, 7].
본 발명자들은, 허혈성 뇌경색의 환자에 있어서, 그 급성기에 골수로부터 말초혈에 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포(Muse 세포)가 동원되는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하며, 다능성 줄기 세포의 수를 지표로 한, 피험자에 있어서의 뇌경색의 예후, 일과성 허혈 발작 후의 뇌경색 리스크 또는 무증후성 뇌경색을 예측 또는 진단하기 위한 검사 방법.
[2] 피험자로부터 채취된 혈액 시료가, 뇌경색 유사 증상의 발증 직후부터 60일까지의 기간에 채취된 것인 상기 [1]에 기재된 검사 방법.
[3] 다능성 줄기 세포가, 허혈성 뇌경색의 급성기에 있어서 골수로부터 말초혈에 동원된 것인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 검사 방법.
[4] 뇌경색의 예후와 피험자의 흡연 및/또는 음주의 유무를 관련짓는 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 검사 방법.
[5] 컷오프 값과 비교하는 공정을 더 포함하는 상기 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 검사 방법.
[6] 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정할 수 있는 시약을 포함하는, 상기 [1]∼[5] 중 어느 한 항에 기재된 검사 방법에 사용하기 위한 키트.
[7] 피험자와 뇌경색 치료약의 후보 화합물을 접촉시킨 후, 상기 피험자 유래의 혈액 시료 중의 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하는, 뇌경색 치료약을 스크리닝하는 방법.
[8] 컷오프 값과 비교하는 공정을 더 포함하는 상기 [7]에 기재된 스크리닝 방법.
본 발명에 의하면, 뇌경색의 예후를 예측할 수 있고, 또한, 일과성 허혈 발작에 기인한 뇌경색의 리스크를 진단할 수 있으며, 나아가 무증후성 뇌경색의 진단에 유용하다.
도 1은, 사이즈가 소, 중, 대인 뇌경색(화살표)의 대표적인 FLAIR 화상을 나타낸다.
도 2는, 건강한 사람(A) 및 허혈성 뇌경색(B)의 대표적인 FACS 데이터를 나타낸다. 상단 패널은 대조의 세포 계수 데이터를 나타내고, 중단 패널은 2차 항체만을 갖는 세포 계수 데이터를 나타내며, 하단 패널은 1차 및 2차 항체를 갖는 세포 계수 데이터를 나타낸다. SSEA-3 양성 세포는 하단 패널에서 동정된다(화살표).
도 3은, 허혈성 뇌경색 발증후 30일간의 SSEA-3+ 세포의 시간적 프로파일을 나타낸다. A) 감소한 그룹, B) 미변화 그룹, C) 증가한 그룹.
도 4는, SSEA-3 양성 세포의 소획분(녹색)을 나타내는 인간 골수에서의 형광 면역 조직 화학의 현미경 사진을 나타낸다. 스케일바 = 50 ㎛.
도 5는, 연령과 골수 중의 SSEA-3+ 세포의 비율 사이의 관계를 나타낸다. 흰색 원은 화학 요법을 받지 않은 환자의 데이터를 나타내고, 검은색 원은 화학 요법을 받은 환자의 데이터를 나타낸다.
이하, 본 발명의 설명을 위해 바람직한 실시형태에 관해 상세히 설명한다. 또, 본 발명은, 이하의 바람직한 실시형태에 한정되지 않고, 그 요지의 범위 내에서 다양하게 변형해도 되는 것은 당업자에게 이해된다.
본 발명은, 피험자의 골수로부터 말초혈에 동원된 다능성 줄기 세포(Muse 세포)의 수를 측정하는 것에 기초한, 피험자에 있어서의 뇌경색의 예후를 예측하는 검사 방법 및 검사 방법에 이용되는 키트 등을 제공한다.
1. 대상 질환
본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포(Muse 세포)의 혈중의 수를 측정함으로써, 뇌경색의 예후, 일과성 허혈 발작에 기초하는 뇌경색의 리스크, 및 무증후성 뇌경색의 진단을 목적으로 한다. 여기서, 「뇌경색」이란, 뇌혈관의 폐색이나 관류압 저하에 의해 뇌에 국소적인 허혈 부분이 생겨, 신경 세포의 불가역적 세포사를 나타낸 상태를 말한다. 보다 구체적으로는, 뇌내 소동맥이 폐색하여 발증하는 라크나 경색, 뇌내 대동맥이 죽종으로 폐색하여 발증하는 아테롬 혈전성 뇌경색, 심장 내의 혈전이 전자(栓子)가 되어 뇌내 동맥을 폐색하여 발증하는 심원성 뇌색전증을 모두 포함한다. 또한, 뇌경색에서도 급성기, 아급성기, 회복기(만성기) 등도 모두 포함한다. 본 발명에 있어서는, 발증 직후부터 60일까지의 피험자의 혈액 시료를 측정 대상으로 한다. 여기서, 「발증」이란, 환자의 정상적인 상태를 마지막으로 보았을 때, 또는 목격자가 없는 취침 중에 뇌경색이 발생했을 때의 취침시로 정의된다. 뇌경색은, 혈전의 유래에 의해 뇌혈전과 뇌색전으로 분류되며, 본 발명은, 뇌혈전 및 뇌색전의 진단, 나아가 뇌경색의 예후 진단에 유용하다. 「일과성 허혈 발작」이란, 뇌순환에서의 혈전 색전증에 기인하는 일과성의 급성 신경 기능 장애를 가리킨다. 본 발명에 따르면, 이러한 일과성 허혈 발작 후에 뇌경색을 발증할 수 있는지 어떤지의 리스크를 진단할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용할 때, 「무증후성 뇌경색」이란, 예컨대, 급성이며 우성인 뇌졸중을 특징짓는 증상, 예컨대 편측 부전 마비, 지각 감퇴 및/또는 실어증이 없는, 뇌조직에서의 허혈 상태를 가리킨다.
2. 다능성 줄기 세포
본 발명의 검사 방법 등에 사용되는 다능성 줄기 세포는, 본 발명자들의 한 사람인 데자와가, 인간 생체 내에 그 존재를 발견하여, 「Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포」로 명명한 세포이어도 좋다. 일반적으로, Muse 세포는, 골수액, 지방 조직(Ogura, F., etal., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epub)(published on Jan 17, 2014))이나 진피 결합 조직 등의 피부 조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합 조직에도 산재한다. 또한, 이 세포는, 다능성 줄기 세포와 간엽계 줄기 세포의 두 성질을 갖는 세포이며, 예컨대 각각의 세포 표면 마커인 「SSEA-3(Stage-specificembryonic antigen-3)」 양성으로서, 또는 「SSEA-3」과 「CD105」의 더블 양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 예컨대 이들 항원 마커를 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법 및 특징 등의 상세한 것은, 국제 공개 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 전술)에 의해 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계 세포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포가 모두 CD105 양성 세포인 것을 알 수 있다. 따라서 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 줄기 세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우는, 단순히 SSEA-3을 항원 마커로 하여 Muse 세포를 정제하여 사용할 수 있다. 또, 본 명세서에서는, 뇌경색(후유증을 포함)을 진단하는 방법에 사용될 수 있는, SSEA-3을 항원 마커로 하여, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 줄기 세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 단순히 「SSEA-3 양성 세포」로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에서는, 「비 Muse 세포」란, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직에 포함되는 세포이며, 「SSEA-3 양성 세포」이외의 세포를 가리킨다.
간단히 말하면, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 세포 표면 마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하여, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하여, 생체 조직(예컨대, 간엽계 조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기서, 「생체」란 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 전인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생 단계의 배아는 포함된다. 포유동물은 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 몰모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 가지고 분리되는 점에서, 배아 줄기 세포(ES 세포)나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또한, 「간엽계 조직」이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 탯줄, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예컨대, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방 조직으로부터 얻을 수 있다. 예컨대, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리 수단을 이용하여, 선유아 세포나 골수 간엽계 줄기 세포 등의 배양 간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리해도 좋다.
상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 예컨대 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중 양성을 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있지만, 인간 성인 피부에는 여러 타입의 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 그러나, Muse 세포는, 이들 세포와 동일하지 않다. 이러한 줄기 세포 및 전구 세포에는, 피부 유래 전구 세포(SKP), 신경제세포(NCSC), 멜라닌아세포(MB), 혈관 주위 세포(PC), 내피 전구 세포(EP), 지방 유래 줄기 세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유의 마커인 「비발현」을 지표로 하여, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF 인자(폰 빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커) 및 Dct(MB의 마커)로 이루어진 군에서 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예컨대, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 또한, CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 또한, 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.
또한, 상기 특징을 갖는 Muse 세포는, 이하:
(i) 텔로머라아제 활성이 낮거나 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및/또는
(iv) 셀프 리뉴얼능을 가짐
으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 하나의 국면에서는, Muse 세포는 상기 성질을 전부 갖는다. 여기서, 상기 (i)에 관해, 「텔로머라아제 활성이 낮거나 없다」란, 예컨대 TRAPEZE XL 텔로머라아제 검출 키트(Millipore사)를 이용하여 텔로머라아제 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머라아제 활성이 「낮다」는 것은, 예컨대 체세포인 인간 선유아 세포와 동일한 정도의 텔로머라아제 활성을 갖고 있거나, 또는 Hela 세포와 비교해서 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 관해, Muse 세포는, 시험관내 및 생체내에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지며, 예컨대 시험관내로 유도 배양함으로써, 간세포, 신경 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 골세포, 지방 세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, 생체내로 정소에 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 또한, 정맥 주사에 의해 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주(遊走) 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 상기 (iii)에 관해, Muse 세포는, 부유 배양에서는 증식 속도 약 1.3일만에 증식하지만, 부유 배양에서는 1 세포로부터 증식하여, 배양체형 세포괴를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다는 성질을 갖지만, 이들 배양체형 세포괴를 접착 배양으로 가지고 가면, 다시 세포 증식이 시작되어, 세포괴로부터 증식한 세포가 확대되어 간다. 또한 정소에 이식한 경우, 적어도 반년간은 암(癌)화하지 않는다는 성질을 갖는다. 또한, 상기 (iv)에 관해, Muse 세포는, 전형적으로는, 셀프 리뉴얼(자기 복제)능을 갖는다. 여기서, 「셀프 리뉴얼」이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유 배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체형 세포괴에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체형 세포괴의 세포를 다시 1세포로 부유 배양으로 가지고 가는 것에 의해, 다음 세대의 배양체형 세포괴를 형성시켜, 그것으로부터 다시 3배엽성의 분화와 부유 배양에서의 배양체형 세포괴를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프 리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 된다.
3. 검사 방법
본 발명에 따르면, 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 Muse 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하며, Muse 세포의 수의 지표로 한, 피험자에 있어서의 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 검사 방법이 제공된다.
상기 검사 방법에 있어서, 「피검자」는, 뇌경색을 일으킬 가능성이 있는 동물이라면 어떠한 것이어도 좋으며, 보다 구체적으로는, 인간, 원숭이, 또는 래트 등의 설치류 등을 들 수 있다. 본 발명의 뇌경색의 검사 방법은, 그 중, 뇌경색이 의심되는 인간, 또는 뇌경색 발증후의 인간에 있어서 특히 바람직하게 행해진다.
상기 피검자로부터 채취된 「혈액 시료」로는, 골수로부터 말초혈에 동원된 Muse 세포를 함유하고, 그 수를 측정할 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는, EDTA 혈장, 시트르산 혈장 등의 혈장, 혈청, 전혈의 어느 것이어도 좋다. 이들 중, EDTA 혈장이 간편하게 채취할 수 있고, 보존이 용이하고 또한 채취량이 많기 때문에 바람직하게 이용된다. 피검자로부터 상기 혈액 시료를 채취하기 위해 채혈하는 타이밍은, 뇌경색의 진단을 행하는 타이밍이라면 어느 타이밍이어도 좋으며, 예컨대, 뇌경색 유사 증상의 발증 직후부터 60일까지의 기간인 것이 바람직하다.
혈액 시료 중에 포함되는 Muse 세포수의 측정 방법으로는, 예컨대, EDTA 함유 튜브에 채취한 또는 그것을 보존한 용액에 포함되는 Muse 세포를 형광 활성화 셀 소팅(FACS) 기술을 이용하여 용이하게 행할 수 있다. 상기 채취한 EDTA 용액에는, Muse 세포 외에 단핵 세포가 포함되기 때문에, 단핵 세포에서의 SSEA-3 양성 세포의 비율을 산출하여 Muse 세포의 수를 결정할 수 있다. 간단히 말하면, 단리된 단핵 세포에 항 SSEA-3 항체를 1차 항체로서 반응시키고, 그 후, 형광 표지한 2차 항체를 반응시켜, FACS 장치에 의해 세포수를 특정할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 검사 방법에 있어서는, 피검자로부터 채취된 혈액 시료(본 명세서 중에서는, 이것을 「검체」로 칭하는 경우가 있음) 중의 Muse의 함유수를 측정하고, 이것을 지표로 하여 뇌경색 또는 그 예후를 검사할 수 있다. 또한, 기존의 뇌경색 마커인 CRP나 D-dimer 등의 검체 중의 함유량을 조합해도 좋고, 혹은 임상증후의 관찰과 심장 초음파, MRI, MRA, 경부 혈관 초음파 등의 결과를 관련지은 복합 지표를 이용함으로써, 보다 적확하게 검사하는 것이 가능하다.
후술하는 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 뇌경색 발증후의 30일 이내에는, 골수로부터 동원된 혈액 중의 Muse 세포의 수의 증감에 의해, 주로 3개의 패턴으로 분류할 수 있다. 구체적으로는, (i) 발증후부터 유의미하게 세포수가 감소하는 패턴(도 3A), (ii) 발증후부터 세포수의 현저한 변화가 보이지 않는 패턴(도 3B), 및 (iii) 발증후부터 유의미하게 세포소가 증가하는 패턴(도 3B)으로 나누어진다. 이들 패턴은, 다변량 해석의 결과(표 1 참조)와 합하면, 흡연 환자는, 7일째 및/또는 30일째에 SSEA-3+ 세포의 수의 증가를 유의미하게 방해하고, 알콜 섭취 환자는 유의미하게 촉진한다. 이와 같이 하여, 본 발명의 검사 방법은, 뇌경색의 예후와 피험자의 흡연 및/또는 음주의 유무를 관련지을 수 있다. 여기서, 본 명세서에서 사용할 때, 피험자의 「금연」이란, 발증 또는 입원전의 3개월 이내에 매일을 기준으로 한 담배 흡연을 말한다. 또한, 「알콜 섭취」란, 피험자에 의한 알콜 섭취량이, 3개월 이내에 주당 150 g 초과의 알콜량을 소비하는 것을 말한다.
이와 같이, 본 발명은, 뇌경색의 예후를 예측하는 검사 방법을 제공할 수 있다. 뇌경색의 예후는, 뇌경색 발증후 어떤 일정 기간의 후에, 그 피험자의 뇌경색에 의한 장애의 정도로 나타낸다. 장애의 정도는, 그 자체로 공지되어 있고, 이미 확정되어 있는 지표를 이용하여 평가할 수 있다. 지표로서, 예컨대 일본판 모디파이드ㆍ랭킹ㆍ스코어(mRS) 판정 기준(시노하라 유키토 등, mRS 신뢰성 연구 그룹, modified Rankin Scale의 신뢰성에 관한 연구-일본어판 판정 기준서 및 문진표의 소개, 뇌졸중 2007; 29:6-13) 등이 이용된다. 여기서, 「일정한 기간의 후」란, 발증후의 어느 시점이어도 좋지만, 피험자의 사회 복귀의 상태를 평가하는 관점에서, 예컨대, 발증으로부터 3개월∼1년후까지의 사이에 평가하는 것이 일반적이다. 예후의 예측에서는, 예상 방법의 유용성을 고려하여, 발증 직후부터 60일까지의 피험자로부터 취득한 혈액 시료 중의 Muse 세포의 수이며, 한정되지 않지만, 예컨대, 발증후 3개월후의 상기 피험자의 상태를 예측하는 방법 등이 바람직하다.
또, 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 Muse 세포의 수를 지표로 하여 상기 뇌경색의 예후 등을 검사하는 경우에는, 건강한 사람의 혈액 시료 중의 Muse 세포의 수와 비교해도 좋고, 적절한 컷오프 값을 규정하여 검사하는 방법이어도 좋다. 건강한 사람의 Muse 세포의 수는, 미리 뇌경색이 아닌 것이 임상적으로 확인된 건강한 사람으로부터 혈액을 채취하고, 피험자로부터 채취한 혈액 시료와 동일한 처리 및 측정을 행하여 정량함으로써 얻을 수 있다. 여기서, 「컷오프 값」이란, 일반적으로는, 어떤 물질에 착안하여 목적으로 하는 질환군과 비질환군을 판정하는 경우에 정하는 값을 말한다. 목적으로 하는 질환과 비질환을 판정하는 경우에, 컷오프 값 이하이면 음성 및 컷오프 값 이상이면 양성으로서, 또는 그 반대로, 컷오프 값 이하이면 양성 및 컷오프 값 이상이면 음성으로서 질환을 판정할 수 있다.
후술하는 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 건강한 사람에 있어서는 혈중의 Muse 세포의 수는, 측정에 의해 평균 3.5±4.3/μl인 것이 판명되었기 때문에, 상기 수치를 컷오프 값으로서 이용할 수 있다. 도 3에는, 뇌경색 환자 모두 상기 수치보다 높은 수치이며, 환자의 혈중에는 Muse 세포가 존재하고 있는 것이 나타나 있다. 따라서, 이러한 컷오프 값을 이용하는 것에 의해, 예컨대, 환자가 무증후성 뇌경색이라고 하는 진단에 응용할 수 있고, 또한, 뇌경색 치료약의 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 검사 방법에 의해 뇌경색의 진단이 이루어진 피험자는, 각각의 질환에 적합한 치료법을 받는 것에 의해, 예후의 경과나 치료 효과가 매우 양호해진다고 할 수 있다.
4. 뇌경색 측정용 키트
본 발명은 또한, 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 Muse 세포의 수를 측정할 수 있는 시약을 포함하는 상기 검사 방법에서 사용되는 키트, 뇌경색의 예방 또는 치료 효과의 평가, 또는 뇌경색 예방 또는 치료약의 스크리닝 방법을 행하기 위한 키트가 제공된다. 키트의 내용은, 시약 또는 측정 기기의 조합에 의해 구성되지만, 후술하는 각 구성 요소와 본질적으로 동일하거나, 또는 그 일부와 본질적으로 동일한 물질이 포함되어 있으면, 구성 및 형태가 상이하더라도 본 발명의 키트에 포함된다. 시약으로는, 예컨대, 면역 측정법에 의해 Muse 세포의 수를 측정하는 경우에는, 항 SSEA-3 항체를 포함한다. 또한, 필요에 따라, 생체 시료의 희석액, 항체 고정화 고상, 반응 완충액, 세정액, 표지된 2차 항체, 표지체의 검출용 시약, 표준 물질 등도 포함된다. 생체 시료의 희석액으로는, EDTA 용액, 계면 활성제, 완충제 등에 BSA나 카제인 등의 단백질을 포함하는 수용액 등을 들 수 있다.
반응 완충액은, 예컨대, Muse 세포의 표면 항원과 그것에 대한 1차 항체가 결합 반응을 할 때의 용매 환경을 제공하는 것이라면 어떠한 것이어도 좋다. 표지된 2차 항체는, 상기 1차 항체에 대한 항체이며, FITC, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP), 소소장 알칼리포스파다제, β-갈락토시다제 등이 표지된 항체가 이용된다.
5. 뇌경색의 치료 효과를 확인하는 방법
본 발명의 다른 양태는, 뇌경색 치료약이 투여된 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중의 Muse 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하는, 상기 피험자의 뇌경색의 치료 효과를 확인하는 방법이다. 뇌경색 치료약이란, 뇌경색을 치료할 수 있는 약으로서 이용되고 있는 것이라면 어떠한 것이어도 좋지만, 예컨대, 우로키나제, 조직 플러스미노겐 액티베이터 등의 혈전 용해제, 헤파린 등의 항응고제, 사이클로옥시게나제 저해약, 포스포리디에스테라제 저해약, 트롬복산 A2(TAX2) 합성 저해약 등의 항혈소판제, 프리 라디칼 스카벤저 등의 뇌보호약 등을 들 수 있다.
뇌경색 치료약이 투여된 피험자로부터 채취된 혈액 시료에서의 Muse 세포의 수가, 투여전의 양에 비교해서 증가 또는 감소하거나, 혹은, 뇌경색이 발증하지 않은 대조 피험자(예컨대, 건강한 사람)에서의 Muse 세포의 수에 근접한 경우, 치료 효과가 있다고 판정할 수 있다.
6. 뇌경색 예방 혹은 치료약의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 양태는, 피험자와 뇌경색 치료약의 후보 화합물을 접촉시킨 후, 상기 피험자의 혈액 시료 중의 Muse 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하는 뇌경색 치료약의 스크리닝 방법이다. 이 스크리닝 방법에서의 피험자란, 혈액 시료에서의 Muse 세포의 수가, 뇌경색 상태와 동일한 이상(異常)을 나타내는 비인간 동물 개체일 수 있다. 뇌경색의 증상을 갖는 동물로는, 예컨대 외과적 수법 등으로 뇌경색 상태를 형성시킨 뇌경색 모델 비인간 동물(Yuji Kuge, Kazuo Minematsu et al. Nylon Monofilament for Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. Stroke, 26, 1655(1995)) 등을 들 수 있다. 혈액 시료 중의 Muse 세포의 수를 기초로, 뇌경색 상태의 비인간 동물 개체(예컨대 마우스나 래트)에서 인간의 어떤 병형과 유사한 병태를 구축할 수 있다면, 어떤 병형의 뇌경색 환자의 치료약을 개발하기 위한 실험계를 확립할 수 있다. 또한, 비인간 동물 개체의 예후를 Muse 세포의 수를 모니터링함으로써, 인간의 뇌경색의 예후에 유효한 치료약을 개발하는 것이 가능해진다.
이들 피험자에게 접촉시키는 뇌경색 치료약 후보 화합물(이하, 「후보 화합물」이라고 칭하는 경우가 있음)로는, 예컨대, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 저분자 합성 화합물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 좋고, 또는 공지의 화합물이어도 좋다. 후보 화합물과 접촉시킨 피험자의 Muse 세포의 수가, 접촉전의 수에 비교해서 증가 또는 감소하거나, 혹은, 대조 피험자의 Muse 세포의 수에 근접한 경우, 상기 후보 화합물은 뇌경색에 대하여 치료 효과를 갖는다고 판정할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.
재료 및 방법
(1) 피험자
본 연구에는, 발증후 24시간 이내에 텐트 상 영역의 허혈성 뇌경색을 이유로 병원에 입원한 29명의 성인 환자가 포함되었다. 라크나 경색의 환자는 제외되었다. 남성 16명, 여성 13명이었다. 평균 연령은 71.4±13.3세이며, 41세부터 93세였다. 본 연구는, 도야마 대학병원 및 제생회 후쿠야마 병원의 윤리 심사 위원회에 의해 승인되고, 각 참가자로부터 사전 동의를 얻었다.
본 발명자들은, 연령, 성별, 입원시의 NIHSS, 과거의 병력, 흡연, 알콜 섭취, 허혈성 뇌경색의 서브타입, 뇌경색의 위치와 크기, 발증후 1개월의 모디파이드ㆍ랭킹ㆍ스코어를 포함하는 임상 데이터를 각 환자에 있어서 수집했다. 과거의 병력에는, 허혈성 및 출혈성 뇌졸중, 고혈압, 진성 당뇨병 및 고지혈증이 포함된다. 고혈압은, 140/90 mmHg보다 높은 혈압 또는 강압제가 현재 사용되는 것으로서 정의되었다. 진성 당뇨병은, 6.5%보다 높은 헤모글로빈 A1C값 또는 현재의 항당뇨병약의 사용으로서 정의되었다. 140 mg/dl보다 높은 혈청 저밀도 리포단백질(LDL) 콜레스테롤 레벨 또는 지질 저하제의 현재의 사용을 갖는 환자는, 고지혈증으로 간주되었다. 현재의 흡연은, 입원전 3개월 이내에 매일을 기준으로 한 임의의 담배 흡연으로 정의되었다. 현재의 알콜 섭취량은, 3개월 이내에 주당 150 g 초과의 알콜 소비량으로 정의되었다.
(2) 생리학적 및 실험적 데이터
입원시에는, 모든 환자에 있어서 혈압, ECG 및 실험 데이터가 기록되었다. 이들 시험은, 발증의 7일후 및 30일후에 반복되었다.
(3) 방사선 검사
입원시에, 1.5 테슬라의 MR 장치를 이용하여, 확산 강조 화상, T2 강조 화상, 유체 감쇠 반전 회복(FLAIR) 화상, 및 MR 혈관 조영이 모든 환자에 있어서 얻어졌다. 뇌경색의 크기를 소, 중, 대의 3그룹으로 나누어졌다. 뇌경색의 크기는, 2개를 넘는 피질지의 영역에 병변이 위치하는 경우에 대, 병변이 하나의 피질지의 영역에 위치하는 경우에 중, 병변이 더욱 작아지는 경우에 소로서 등급을 나누었다(도 1).
(4) 순환하는 SSEA-3+ 세포의 정량
순환 SSEA-3+ 세포를 정량하기 위해, 입원시 및 7일째와 30일째에 모든 환자로부터 말초혈을 총 3 ml 얻었다. 혈액을 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 함유 튜브 내에서 보존했다. 단핵 세포를 단리하기 위해, 혈액을 등용량의 생리식염수로 희석하고, 2 ml의 Lymphoprep(Axis-Shield Diagnostics Ltd., Scotland) 상에 중층하여, 실온에서 15분간, 800 g으로 원심 분리했다. 다음으로, 형광 활성화 셀 소팅(FACS) 기술을 이용하여, 단핵 세포에서의 SSEA-3 양성 세포의 비율을 결정했다. 간결하게 하면, 단리된 단핵 세포(약 1×106)를 0.5% 소혈청 알부민 및 2 mM EDTA(FACS 완충액)을 함유하는 100 μl의 빙랭 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁했다. SSEA-3(1:50 희석, Millipore, MAB4303)에 대한 1차 항체를 첨가하고, 서서히 요동시키면서 4℃에서 60분간 인큐베이트했다. 1차 항체 결합후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세정하고, 1:100의 FITC 결합 염소 항래트 IgM(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Baltimore, PA)를 함유하는 100 μl의 FACS 완충액에 재현탁하고, 서서히 요동시키면서 4℃의 암소에서 60분간 인큐베이트했다. 2차 항체 결합후, 세포를 빙랭 FACS 완충액으로 3회 세정하고, 1 ml의 빙랭 FACS 완충액에 재현탁하고, 세포 스트레이너 튜브(No.352235, BD Falcon)에 통과시키고, 즉시 FACSCanto TM II(BD Biosciences)로 분석했다. 모든 FACS 분석에 있어서, 비특이적 결합 및/또는 자가 형광의 가능성을 배제하기 위해, 세포의 대조 시료(2차 항체에만 노출된)를 사용했다. BD FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여, FITC 양성 세포의 수를 카운트했다. SSEA-3+ 세포의 절대수는, 이하의 식에 따라서 계산되었다:
FACS 상의 SSEA-3+ 세포수(/μl) = (전체 WBC의 수-PMN의 수)(/μl)×SSEA-3+ 세포(%)(식 중, PMN은 다형 핵세포를 나타낸다)
본 연구에서는, 심혈관 장애의 기존 병력이 없는 건강한 사람 5명의 SSEA-3+ 세포의 대조치를 결정하기 위해 말초혈을 얻었다. 남성 2명, 여성 3명이며, 평균 연령 56.2±4.2세였다. 본 연구에서는, SSEA-3+ 세포의 절대수는, 7일째 또는 30일째에서 입원시의 대조의 2배 이상으로 증가했을 때에는 증가했다고 판단되고, 7일째 또는 30일째에서 입원시의 대조의 반감 미만으로 감소했을 때에는 감소했다고 판정되었다.
(5) 조직학적 분석
인간 골수에서의 SSEA-3+ 세포의 비율 및 분포를 밝히기 위해, 뇌혈관 질환의 병력이 없는 8명의 부검 환자로부터 검체를 얻었다. 남성은 5명, 여성은 3명이었다. 평균 연령은 63.9±9.0세이며, 57세부터 73세까지의 범위였다. 그들은, 심근경색, 악성 종양, 심부전 등의 여러 질환으로 인해 사망했다. 검체를 완충화된 포르말린(4%) 중에서 고정하고, 파라핀에 포매했다. 그 후, 두께 4 ㎛의 세그먼트를 다음 염색을 위해 조제했다. 탈파라핀화된 세그먼트를 압력 포트로 2분간, 항원 회수함으로써 처리했다. 면역 조직 화학을 이용하여, 인간 골수 중의 SSEA-3+ 세포를 동정했다. 간단히 하면, 각 세그먼트를 4℃에서 하룻밤, SSEA-3에 대한 1차 항체(래트 모노크로날, 1:100 희석, Millipore, MAB4303)로 처리하고, 다음으로, 플루오레세인(FITC) Sffini Pure(염소 항래트 IgM, 1:50 희석, Jackson Immunoresearch)와 함께, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 마지막으로, DAPI를 포함하는 ProLong Gold Antifade 시약을 이용하여 실온에서 24시간, 세그먼트를 염색했다. 골수 세포 전체의 SSEA-3+ 세포의 비율을 20×의 배율로 현미경(BZ9000, Keyence Co., Osaka, Japan) 하에서 무작위로 5시야에 있어서 계산했다.
(6) 통계 분석
데이터를 평균±SD로서 나타냈다. χ2 검정을 이용하여 분류　변수를 비교했다. 연속　변수는, 2개의 그룹　사이의 양측 부대(不對) t 검정 및 3개의 그룹 사이의 1인자 ANOVA를 이용하여 비교되었다. P값이 0.05 미만이면, 차이는 통계적으로 유의미하다고 간주되었다.
복수의 선형 회귀 분석을 행하여, 입원시의 순환하는 SSEA-3+ 세포의 수를 예측하는 중요한 인자를 동정했다. 또한, 다변량 로지스틱 회귀 분석을 행하여, 허혈성 뇌경색 발증후 7일째 또는 30일째에 순환하는 SSEA-3+ 세포의 증가를 결정하기 위한 독립된 인자를 동정했다. 단변량 해석에서 얻어진 P<0.40을 이용하여, 전진 단계적 모델의 작성 수법을 파라미터에 관해 실시했다. 최종 다변량 해석에서는, 통계적 유의 수준을 P<0.05로 설정했다. 결과는, 조정된 오즈(odds)비(OR) 및 대응하는 95% 신뢰 구간(CI)으로서 나타냈다.
실시예 1 : 임상적 특징
입원시의 평균 NIHSS는 8.6±7.4이며, 0∼24의 범위였다. 임상 진단에는, 17명의 심장 색전증, 7명의 아테롬 혈전성 뇌졸중, 3명의 대동맥 색전증 및 2명의 다른 환자가 포함되었다. 과거의 병력에는, 16명에 있어서 고혈압증, 3명에 있어서 당뇨병, 4명에 있어서 고지혈증, 7명에 있어서 흡연, 10명에 있어서 알콜 섭취였다.
30일째의 평균 mRS는 2.3±2.2이며, 0∼6의 범위였다. 발증후 8∼30일 사이에 2명의 환자(6.9%)가 사망하고, 입원시 및 7일째만의 데이터를 본 연구에 있어서 분석했다. 뇌경색의 크기는, 13명의 환자에 있어서 소, 10명에 있어서 중, 6명에 있어서 대로 나누어졌다.
실시예 2 : 순환하는 SSEA -3 + 세포
도 2는, 대조 및 허혈성 뇌경색을 갖는 환자의 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 건강한 사람 대조에 있어서, SSEA-3+ 세포의 수는, 0∼10 μl의 범위에서 매우 적었다. 평균치는 3.5±4.3/μl였다. 한편, 입원시의 SSEA-3+ 세포의 베이스라인수는 환자 사이에서 크게 상이했다. SSEA-3+ 세포의 평균수는 81.9±78.0/μl이며, 4.7∼249.1/μl의 범위였다. 따라서, 29명의 피험자 중 22명(75.9%)에 있어서, 허혈성 뇌경색이 발증하고 나서 24시간 이내에 SSEA-3+ 세포의 수가 현저히 증가했다. 단변량 해석에서는, 입원시의 SSEA-3+ 세포의 수와, 연령, 성별, 입원시의 NIHSS, 과거의 이력, 허혈성 뇌경색의 서브타입, 뇌경색의 사이즈 및 30일째의 mRS 사이에 유의미한 관계가 없는 것을 검출했다. 다중 선형 회귀 분석은 또한, 입원시에 순환하는 SSEA-3+ 세포의 절대수를 예측하는 중요한 인자를 동정하지 않았다.
순환하는 SSEA-3+ 세포의 수를, 발증후 30일 이내에 연속적으로 평가했다. 이들의 수는, 7일째 및 30일째에, 각각 81.9±78.0/μl로부터 86.9±80.8/μl 및 68.7±64.9/μl로 변화했다. 3개의 시점 사이에 유의차는 없었다. 도 3은, 순환하는 SSEA-3+ 세포의 수의 시간적 프로파일을 나타낸다. 동태는 3개의 패턴으로 나눌 수 있었다; 29명의 환자 중 8명(27.6%)에 있어서, 순환하는 SSEA-3+ 세포의 수는 7일째에 유의미하게 감소했다. 이들의 수는, 8명의 환자 중 7명에 있어서 30일째에 회복되지 않았다. 29명의 환자 중 13명(44.8%)에서는, 발증후 30일 이내에 그 수는 유의미하게 변화되지 않고, 대조보다 높은 레벨을 유지했다. 그러나, 29명의 환자의 다른 8명(27.6%)에서는, 순환하는 SSEA-3+ 세포의 수는, 7일째 및/또는 30일째에 유의미하게 계속 증가했다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 단변량 해석에서는, 허혈성 뇌경색의 발증후 30일간, 순환하는 SSEA-3+ 세포의 지속적인 증가를 예측하기 위한 중요한 인자가 동정되지 않았다. 그러나, 다변량 로지스틱 회귀 분석에 의해, 발증후 30일 이내에, 허혈성 뇌경색 환자의 순환하는 SSEA-3+ 세포의 계속적인 증가에, 현재의 흡연 및 알콜 섭취가 유의미하게 영향을 미치는 것이 나타났다. 오즈비는, 현재의 흡연에서는 0.0027(P=0.0336, 95% CI=0-0.633), 알콜 섭취에서는 1,688(P=0.0220, 95% CI=2.91-978,046)이었다.
Figure 112018068788381-pct00001
허혈성 뇌경색후의 순환하는 SSEA-3+ 세포의 증가에 대한 독립된 예측 인자.
OR: 오즈비, CI: 신뢰 구간.
실시예 3 : 인간 골수에서의 SSEA -3 + 세포의 분포
골수 세포의 소획분은 SSEA-3에 대하여 양성이었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, SSEA-3+ 세포의 분포는 균일하지 않았다. 이들은 클러스터와 같이 분포되어 있었다. SSEA-3+ 세포의 비율은, 0%부터 0.5%까지 변화하고, 평균치는 0.2±0.17%였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, SSEA-3+ 세포의 비율은, 악성 종양 때문에 화학 요법을 처치받은 3명의 환자에 있어서 0.1% 미만이었다. 이들 3명의 환자를 제외하면, 통계학적으로 유의미하지 않지만, 환자의 연령과 골수 중의 SSEA-3+ 세포의 비율 사이에 마이너스의 상관이 생기는 경향이 있었다.
고찰
이 연구에서는, SSEA-3에 대한 1차 항체를 이용하여 골수의 검체를 염색했다. 이것은, 이전의 연구에서는, 골수에서의 Muse 세포의 국재를 나타내고 있지 않기 때문이다. 결과적으로 이 연구는, SSEA-3+ 세포가 골수 세포 전체의 약 0.2%에 해당하는 것을 나타내고 있다. 이전의 연구에 따르면, Muse 세포는, 인간 골수의 흡인액 중에 0.03%의 비율로 동정되고, MSC에서는 5∼6%의 비율로 동정된다[5]. 이들 집단은, 연령과 함께 서서히 감소하는 경향이 있지만, 필시 시료의 사이즈가 작기 때문에 통계적 유의성을 얻을 수 없다. 흥미롭게도, 화학 요법과 방사선 조사가 줄기 세포/전구 세포 및 MSC을 포함하는 골수 세포의 장기적인 손상을 야기할 가능성이 있기 때문에, 악성 종양에 대한 화학 요법으로 처치된 환자에서는, Muse 세포의 집단은 매우 작았다[8]. 따라서, 화학 요법후에, SSEA-3+ 세포조차도 불가역적 또는 지속적인 손상을 입는 경우가 있다.
현재, 골수 중의 줄기 세포/전구 세포는, 허혈성 뇌경색을 포함하는 여러가지 질환에 있어서 말초혈에 신속히 동원되는 것이 잘 알려져 있다[2]. 조기 전구 마커를 발현하는 비조혈 줄기 세포는, 급성 심근경색[9, 10] 및 허혈성 뇌경색[11] 후에, 골수로부터 말초혈에 동원된다. 최근, Yu 등(2013)은, 급성 심근경색의 환자로부터 0일째, 1일째 및 7일째에 말초혈 단핵 세포를 단리하여, 배아 줄기 세포 마커의 mRNA 발현을 측정했다. 그들은, Oct4, Nanog, CD31 및 VE-카드헤린의 mRNA 레벨이 0일째 및 1일째에 말초혈에 있어서 유의미하게 높았다고 보고하고 있다[12]. 또한, 허혈성 뇌경색의 환자에서도 동일한 현상이 관찰되고 있다[13, 14]. 현재의 지견은, 이러한 이전의 데이터를 모방하고 있다. 따라서, 순환하는 SSEA-3+ 세포의 수는, 29명의 허혈성 뇌경색 환자 중 22명에 있어서, 대조보다 입원시에 매우 많았다.
이 연구에서는, 허혈성 뇌경색 환자 사이에서, 입원시의 SSEA-3+ 세포의 베이스라인수가 크게 달랐다. 임상 파라미터는, SSEA-3+ 세포의 베이스라인수를 예측하지 않았다. 30일 이내의 동태도 환자에 따라 크게 다르다. 결과는 이전의 연구와 매우 상관되어 있다. 따라서, Dunac 등(2007)은, 25명의 허혈성 뇌경색 환자의 CD34 양성 세포의 동원을 평가하여, 환자마다, 및 1명의 환자에 관해 1일마다, 세포수에 큰 변동이 있는 것을 발견했다[15]. 그러나, 본 연구는, 29명의 환자 중 8명(27.6%)이, 허혈성 뇌경색의 발증후, 30일간 말초혈 중에 SSEA-3+ 세포를 착실하고 또한 연속적으로 동원한 것을 나타냈다(도 2). 이것에 대하여, 이전의 연구에서는, 내피 전구 세포를 포함하는 줄기 세포/전구 세포의 동원은, 발증후 24∼48시간에 피크에 달하고, 급성 심근경색 환자의 대조 레벨로 되돌아가는 것이 나타나 있다[16]. Taguchi 등(2004)은 또한, CD34 양성 세포가 7일간 지속적으로 증가하고, 그 후, 30일째에 베이스라인 레벨까지 감소하는 것을 보고하고 있다[13]. 따라서, 줄기 세포/전구 세포의 동원의 시간적 프로파일은, 환자의 상태 및 동원된 세포의 타입에 크게 의존할 수 있다.
이전의 연구는, 내피 전구 세포의 동원이, 가령 및 진성 당뇨병을 포함하는 여러가지 요인에 의해 제어되는 것을 나타냈다. 반대의 결과도 보고되어 있지만, 이러한 모든 요인이 동원을 저해한다고 생각되고 있다[17, 18]. 그러나, 이 연구에서는, 이러한 요인의 어느 것도, SSEA-3+ 세포의 시간적 프로파일과 관련되지 않았다. 대신에, 본 연구는, 흡연 및 알콜 섭취가 허혈성 뇌경색후의 SSEA-3+ 세포 동원의 동태에 크게 영향을 미치는 것을 명확하게 나타내고 있다. 따라서, 흡연은, 7일째 및/또는 30일째에 SSEA-3+ 세포의 수의 증가를 유의미하게 방해하고, 알콜 섭취는 유의미하게 촉진한다. 실제로, 다수의 이전 연구는, 흡연 및 알콜에 의한 줄기 세포/전구 세포의 생물학적 특징에 미치는 영향을 강하게 시사하고 있다. Ludwig 등(2010)은, 순환하는 CD34 양성 세포의 수는, 비흡연자보다 흡연자에 있어서 유의미하게 낮은 것을 보고하고 있다[19]. Lamirault 등(2013)도 또한, 능동 흡연과 골수 및 혈액 중의 저 CD34 양성 세포 사이의 관련을 보고하고 있다[20]. 줄기 세포/전구 세포에 대한 흡연의 유해한 영향에는, 세포 및 이들의 제어 기구에 대한 직접적인 영향, 및 이들의 미소 환경의 변화가 포함된다. 줄기 세포/전구 세포의 연기 성분에 대한 노출은, 조직 리저버에 있어서의 이들 세포의 수와 질의 저하를 가져올 가능성이 있다[21]. 작용 메커니즘을 설명하기 위한 몇가지 가설이 있다. 이들 중, 흡연과 관련된 활성 산소종(ROS)의 생성은, 일산화질소(NO)의 생물학적 이용능을 저하시켜, 골수로부터의 동원을 감소시킬 가능성이 있다[22]. 알콜 남용도 또한 인간의 건강에 악영향을 미친다. 그러나, 역학적 연구는, 에탄올의 적당한 소비가, 관상동맥성 심질환, 돌연 심장사 및 허혈성 뇌경색의 리스크를 저하시키는 것을 나타내고 있다. 실제로, 중간 정도의 양의 에탄올은 배양 세포에 있어서 혈관 신생을 증강한다[23]. 또한, Chiva-Blanch 등(2014)은, 맥주의 비알콜 분획이, 심혈관 리스크가 높은 환자의 순환하는 내피 세포의 수를 증가시킨다고 보고하고 있다[24]. 레드와인의 중정도의 섭취도 또한, 당뇨병 마우스에 있어서 세포의 동원을 향상시킨다[25]. 따라서, 알콜에 포함되는 몇가지 성분은, 줄기 세포/전구 세포의 동원 및 에탄올 자체에 기여할 수 있다.
본 연구에서는, 순환하는 Muse 세포의 연속적인 증가는, 보다 양호한 기능적 전귀와 직접적인 관련은 없었다. 그러나, 최근의 관찰에 의하면, 말초혈 중의 줄기 세포/전구 세포의 동태는, 허혈성 뇌병변에서 발생하는 과정에 있어서 중요한 역할을 할 가능성이 있다[14]. 따라서, Dunac 등(2007)은, 순환하는 CD34 양성 세포를 측정하여, 이들의 동원의 정도는 허혈성 뇌경색후에 기능 회복과 직접 관계되어 있다고 결론지었다[15]. Gojska-Grymajio 등(2012)은 또한, CD34 양성 및 CD34/CXCR4 양성 세포의 동원의 증가는, 보다 양호한 기능적 전귀와 관계되어 있다고 보고하고 있다[14]. 따라서, 이러한 「고응답자」 환자는, 허혈성 뇌경색후의 양호한 기능적 전귀에 의해 특징지을 수 있지만, 이러한 동원된 세포는, 경색병변을 향해 이동하여, 인간에 있어서 손상된 뇌를 재생하는 것을 증명할 필요가 있다. 보다 폭넓은 연구에 의해, SSEA-3+ 세포의 동원이 허혈성 뇌경색후의 기능 회복에 기여할 수 있는지 어떤지 분명해질 것이다.
결론
본 연구는, 허혈성 뇌경색의 급성기에, 다능성의 Muse 세포가 골수로부터 말초혈에 동원되고 있는 것을 명확하게 나타내고 있다. 흡연 및 알콜 섭취는, Muse 세포의 시간적 프로파일에 유의미한 영향을 미친다. 이 연구에서는, SSEA-3+ 세포의 베이스라인수 및 동태는, 필시 말초혈 중의 양이 적기 때문에, 기능적 전귀와 관련이 없다. 그러나, 내인성의 Muse 세포를 증가시키는 치료적 개입, 또는 Muse 세포의 외인적 투여는, 허혈성 뇌경색후의 기능적 전귀를 개선하기 위한 신규 치료 전략이 된다.
전술한 모든 참고 문헌 및 대응하는 출원의 전체 개시는, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 삽입된다.
[참고 문헌]
Figure 112018068788381-pct00002
Figure 112018068788381-pct00003
Figure 112018068788381-pct00004
Figure 112018068788381-pct00005
Figure 112018068788381-pct00006

Claims (8)

  1. 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하며, 다능성 줄기 세포의 수를 지표로 한, 피험자에 있어서의 뇌경색, 무증후성 뇌경색, 또는 뇌경색 및 무증후성 뇌경색을 예측 또는 진단하기 위한 검사 방법으로서,
    (a) 피험자로부터 혈액 시료를 채취하는 공정;
    (b) 채취된 혈액 시료 중의 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정; 및
    (c) 측정된 다능성 줄기 세포의 수가 컷오프 값으로서의 3.5개/㎕를 초과할 경우, 해당 검사가 양성이라고 판정하는 공정
    을 포함하는, 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서, 피험자로부터 채취된 혈액 시료가, 뇌경색 유사 증상의 발증 직후부터 60일까지의 기간에 채취된 것인 검사 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다능성 줄기 세포가, 허혈성 뇌경색의 급성기에 있어서 골수로부터 말초혈에 동원된 것인 검사 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뇌경색의 예후와 피험자의 흡연 및 음주 중 어느 하나 이상의 유무를 관련짓는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  5. 삭제
  6. 피험자로부터 채취된 혈액 시료 중에 존재하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정할 수 있는 시약을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 기재된 검사 방법에 사용하기 위한 키트.
  7. 피험자와 뇌경색 치료약의 후보 화합물을 접촉시킨 후, 상기 피험자 유래의 혈액 시료 중의 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의 수를 측정하는 공정을 포함하는, 뇌경색 치료약을 스크리닝하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 컷오프 값과 비교하는 공정을 더 포함하는 스크리닝 방법.
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