KR102058624B1 - Marker TMEM43 for diagnosing sensorineural hearing loss and uses thereof - Google Patents
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Abstract
감각신경성 난청 진단을 위한 마커 TMEM43 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, TMEM43 유전자의 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 조성물, 및 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 키트 또는 조성물을 이용하여 TMEM43 유전자의 변이를 높은 민감도와 정확도로 분석할 수 있으며, 이러한 분석 결과를 바탕으로 감각신경성 난청을 효율적으로 진단할 수 있다.Marker TMEM43 and its use for diagnosing sensorineural hearing loss, specifically, a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of the exon region of the TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof The present invention relates to a method for detecting a mutation of genomic DNA in order to provide a diagnostic composition for sensorineural hearing loss disease, and to provide information about a diagnosis. It can be analyzed with accuracy, and based on the analysis result, it is possible to efficiently diagnose sensorineural hearing loss.
Description
유전자 변이를 검출하기 위한 감각신경성 난청 질환의 진단용 조성물, 감각신경성 난청 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 유전체의 변이를 검출하는 방법, 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 조성물, 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여 유전체의 변이를 검출하는 방법, 및 감각신경성 난청 질환 모델에 관한 것이다. A diagnostic composition for sensorineural hearing loss disease for detecting genetic variation, a method for detecting genotypic mutation for providing information on the diagnosis of sensorineural hearing loss disease, and a predictive prognosis for cochlear implant surgery in patients with sensorineural hearing loss. A composition, a method of detecting mutations in a genome, and a model of sensorineural hearing loss disease to provide information for predicting the prognosis for cochlear implant surgery in patients with sensorineural hearing loss.
선천성 난청(Congenital hearing loss)은 신생아 1,000명 중 3명 정도의 빈도로 발생하며, 50% 이상이 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다. 유전성 난청은 선천성으로 출생 후부터 나타나는데 난청 형태는 여러 종류이나 이 중 감각신경성 난청(Sensorineural Hearing Loss: SNHL)이 가장 흔하다. Congenital hearing loss occurs in about 3 out of 1,000 newborns, and more than 50% is known to be caused by genetic factors. Hereditary deafness is congenital and occurs after birth. There are many types of deafness, the most common of which is Sensorineural Hearing Loss (SNHL).
감각신경성 난청은 달팽이관의 소리를 감지하는 기능에 이상이 생기거나 소리에 의한 자극을 뇌로 전달하는 청신경 또는 중추신경계의 이상으로 발생하는 난청을 말한다. 감각신경성 난청은 증상에 따라서 증후군과 비증후군으로 분류되는데, 증후군 감각신경성 난청은 내이 기능 이상에 의한 것 이외의 다른 기관의 임상적 증상 또는 증후를 가지고 있는 경우를 의미한다. 이는 유전성 난청의 30%를 차지하고, 현재까지 300종류 이상의 증후군 난청이 보고되어 있다. 특징적인 증상이나 기형으로 쉽게 분류되므로 같은 원인을 갖는 환자들에서 원인 유전자를 용이하게 추적할 수 있다. 비증후군 감각신경성 난청은 내이 기능 이상 이외의 다른 기관의 이상 증상 또는 증후를 보이지 않는 경우를 의미하며, 청각 장애만을 나타낸다. 유전성 난청의 70%를 차지하고, 원인 유전자가 다양하여 난청의 유형, 유전 형태 등의 임상적 정보들을 토대로 전략적인 유전 진단이 요구된다. 비증후군 난청은 유전 형태에 의해서 80%가 열성 유전, 17%가 우성 유전, 2 내지 3%가 X-연관, 그리고 1%가 미토콘드리아 유전으로 발생하게 되는 것으로 알려져 있다. 감각신경성 난청은 와우의 외 유모 세포에 문제가 있는 일반적인 감각신경성 난청과 와우의 내 유모 세포나 신경자체 등에 문제가 있는 청각신경병증(auditory neuropathy)이 있다. 따라서, 청각신경병증은 이음향방출 또는 와우마이크로폰(cochlear microphonic: CM) 작용은 나타나지만, 청성뇌간반응은 나타나지 않거나 매우 비정상적인 소견을 보인다. 청각신경병증은 많은 환자에서 산발적(sporadic)으로 발생하지만 유전적인 경우도 있다. 상염색체 우성 유전(autosomal dominant inheritance pattern)인 경우 진행성 난청의 양상을 보이고 말초신경병증을 동반하는 경우가 많다. 상염색체 열성 유전(autosomal recessive inheritance pattern)의 경우 일반적으로 영아기에 고도난청을 보이고 말초신경병증을 동반하지 않는다. 알려진 원인 유전자 결함은 미엘린 단백질 제로(myelin protein zero: MPZ), 말단 미엘린 단백질 22(peripheral myelin protein: PMP22), 그리고 오토페를린(otoferlin: OTOF) 유전자 변이 등이 있다. Sensorineural hearing loss refers to hearing loss caused by abnormalities in the function of detecting the sound of the cochlea or abnormalities of the auditory nerve or central nervous system that transmits the stimulus induced by the sound to the brain. Sensorineural hearing loss is classified into syndrome and non-syndrome according to symptoms, and syndrome sensory hearing loss refers to cases having clinical symptoms or symptoms of other organs other than those due to inner ear dysfunction. It accounts for 30% of hereditary deafness, and more than 300 types of syndrome hearing loss have been reported. Because it is easily classified into characteristic symptoms or malformations, it is easy to follow the causal gene in patients with the same cause. Non-syndrome sensorineural hearing loss refers to a case in which abnormal symptoms or symptoms of organs other than inner ear dysfunction are not shown, and only hearing impairment. It accounts for 70% of hereditary deafness, and because the genes are diverse, strategic genetic diagnosis is required based on clinical information such as the type of hearing loss and hereditary form. Non-syndrome deafness is known to be caused by 80% of recessive inheritance, 17% of dominant inheritance, 2-3% of X-linked, and 1% of mitochondrial inheritance. Sensorineural hearing loss is a common sensory deafness that has problems with extra cochlear hair cells of the cochlea and auditory neuropathy that has problems with cochlear inner hair cells or the nerve itself. Therefore, auditory neuropathy has asymmetrical emission or cochlear microphonic (CM) action, but no auditory brainstem response or very abnormal findings. Hearing neuropathy occurs sporadic in many patients, but in some cases is hereditary. Autosomal dominant inheritance patterns are associated with progressive hearing loss and are often accompanied by peripheral neuropathy. Autosomal recessive inheritance patterns usually show high hearing loss in infants and do not have peripheral neuropathy. Known causal gene defects include myelin protein zero (MPZ), peripheral myelin protein 22 (PMP22), and otoferlin (OTOF) gene mutations.
감각신경성 난청 질환은 실제로 상당한 유병률을 가지고 있을 것으로 예상되나 특히 성인의 경우 정확한 진단의 부재로 미진단 사례가 많을 것으로 예상된다. 또한, 현재까지 일부 난청 유전자가 연구되었으나, TMEM43의 변이와 감각신경성 난청과의 관계에 대하여는 보고된 바가 전혀 없다. 이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 감각신경성 난청 질환을 진단하기 위한 마커를 찾기 위해 노력한 결과, TMEM43의 변이를 이용하여 감각신경성 난청을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Sensory hearing loss is actually expected to have a significant prevalence, but in adults it is expected that many cases have not been diagnosed due to the lack of accurate diagnosis. In addition, some deafness genes have been studied to date, but there have been no reports on the relationship between TMEM43 mutations and sensorineural hearing loss. Against this background, the present inventors have tried to find markers for diagnosing sensorineural hearing loss disease. The present invention was completed by confirming that mutations can be used to diagnose sensorineural hearing loss.
일 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 조성물을 제공한다. One aspect provides a composition for diagnosing sensorineural hearing loss comprising a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of an exon region of a TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof to detect TMEM43 mutations.
다른 양상은 개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계; 및 상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.Another aspect includes identifying a nucleotide sequence of genomic DNA isolated from an individual; And comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify the mutation of the genomic DNA to provide a method for detecting a mutation of the genomic DNA to provide information regarding the diagnosis of sensorineural hearing loss disease. To provide.
다른 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.Another aspect is to predict the prognosis for cochlear implant surgery in a patient with sensory nerve deafness comprising a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of the exon region of the TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof to detect TMEM43 mutations. It provides a composition for.
다른 양상은 개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계; 및 상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법을 제공한다. Another aspect includes identifying a nucleotide sequence of genomic DNA isolated from an individual; And comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify mutations in the genomic DNA to provide information for predicting the prognosis for cochlear implant surgery in patients with sensorineural hearing loss. Provided are methods for detecting mutations in DNA.
다른 양상은 TMEM43 변이를 포함하는 감각신경성 난청 질환 모델을 제공한다.Another aspect provides a model of sensorineural hearing loss comprising a TMEM43 mutation.
일 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 조성물을 제공한다. One aspect provides a composition for diagnosing sensorineural hearing loss comprising a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from a nucleotide sequence of an exon region of a TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof to detect TMEM43 mutations.
막관통 단백질 43(transmembrane protein 43: TMEM43)은 내부 핵막에서 단백질 복합체를 조직함으로써 핵막 구조체를 유지하는 기능을 하는 단백질이다. 상기 TMEM43은 인간의 경우, TMEM43 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 것일 수 있다. TMEM43은 인간의 경우, GenBank Accession No. NP_077310.1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 TMEM43 유전자는 인간의 경우, 상기 TMEM43의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, GenBank Accession No. NM_024334, NM_024334.2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. Transmembrane protein 43 (TMEM43) is a protein that functions to maintain nuclear membrane structures by organizing protein complexes in the inner nuclear membrane. The TMEM43 may be a protein encoded by the TMEM43 gene in humans. TMEM43 is a GenBank Accession No. It may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of NP_077310.1 or a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The TMEM43 gene, in humans, is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of TMEM43, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, GenBank Accession No. It may be a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of NM_024334, NM_024334.2, or a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
통상의 기술자라면 상기 등록번호를 이용하여 변이의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. Those skilled in the art will be able to easily identify the position and sequence of the mutation using the registration number. The specific sequence corresponding to the number registered in the UCSC genome browser or GenBank may change slightly over time. It will be apparent to one skilled in the art that the scope of the present invention also applies to such altered sequences.
상기 TMEM43은 내이에서 발현되는 것일 수 있다. 상기 TMEM43은 내이 내 내 유모 세포(inner hair cell) 또는 내 유모 주변의 지지세포(supporting cell)에서 발현되는 것일 수 있다. 상기 TMEM43은 발달되는(developing) 내이에서 자발적 활동(spontaneous activity)을 촉진시켜, 청각 발생 이전에 청신경원 세포의 생존과 성숙을 유도하는 것일 수 있다. The TMEM43 may be expressed in the inner ear. The TMEM43 may be expressed in inner hair cells in the inner ear or supporting cells around the inner hairs. The TMEM43 may promote spontaneous activity in the developing inner ear, inducing survival and maturation of auditory neuronal cells prior to hearing development.
상기 감각신경성 난청은 달팽이관의 소리를 감지하는 기능에 이상이 생기거나 소리에 의한 자극을 뇌로 전달하는 청신경 또는 중추신경계의 이상으로 발생하는 난청을 의미한다. 상기 감각신경성 난청은 비증후군 감각신경성 난청(Non Syndromal sensorineural hearing loss: NS-SNHL)일 수 있다. 상기 비증후군 감각신경성 난청은 내이 기능 이상 이외의 다른 기관의 이상 증상 또는 증후를 보이지 않는 난청을 의미한다. 상기 감각신경성 난청은 청각신경병증인 것일 수 있다. 청각신경병증은 소리 자극에 대해 청신경 섬유에서 발생하는 활동 전위의 동시성(synchrony)에 장애가 발생하여 유발되는 난청 질환으로서, 이음향방출이나 와우마이크로폰 작용은 나타나지만, 청성뇌간반응은 나타나지 않거나 매우 비정상적인 소견을 보이며, 병리학적으로는 외 유모 세포의 기능은 보존되어 있으면서, 내 유모 세포와 제1형 청신경세포를 통한 청각 전달로의 이상에 기인한다. The sensorineural hearing loss refers to the hearing loss caused by an abnormality in the function of detecting the sound of the cochlea or an abnormality of the auditory nerve or the central nervous system that transmits a stimulus caused by the sound to the brain. The sensorineural hearing loss may be non-syndromal sensorineural hearing loss (NS-SNHL). The non-syndrome sensorineural hearing loss refers to the hearing loss that does not show abnormal symptoms or symptoms of other organs other than the inner ear dysfunction. The sensorineural hearing loss may be auditory neuropathy. Hearing neuropathy is a hearing loss caused by the impairment of the synchrony of action potentials in the auditory nerve fibers with respect to sound stimulation. It has acute sound emission or cochlear mic effect but no auditory brainstem response or very abnormal findings. Pathologically, the function of external hair cells is preserved and is due to abnormalities in auditory transmission through inner hair cells and
용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이를 지닌 뉴클레오티드 폴리머를 의미하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산, 또는 올리고뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 특이적 결합 특성을 이용하여, 혼합물로로부터 표적 영역을 포함하는 표적 유전자 또는 그의 단편을 효과적으로 분리할 수 있다. The term "polynucleotide" refers to a nucleotide polymer of any length, which polynucleotide can be used interchangeably with nucleic acid, or oligonucleotide. The polynucleotide may specifically bind to the nucleotide sequence of the target region. The specific binding properties of these polynucleotides can be used to effectively separate target genes or fragments thereof including the target region from the mixture.
상기 폴리뉴클레오티드는 단수개 또는 복수개인 것일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적인 뉴클레오티드와 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다. The polynucleotide may be singular or plural, and may be in the form of a single strand or a double strand. The polynucleotide is also composed of natural nucleotides, as well as modifications of natural nucleotides, analogs of natural nucleotides, sugars, bases or phosphoric acid sites of natural nucleotides, provided that they have the property of hybridizing with complementary nucleotides by hydrogen bonding. Nucleotides selected from the group consisting of nucleotides and combinations thereof (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)). . The polynucleotide may be DNA or RNA.
용어 "연속 뉴클레오티드 서열(contiguous nucleotide sequence)"은 인접한 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.The term "contiguous nucleotide sequence" means two or more contiguous nucleotide sequences.
용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. The term "complementary" means having a degree of complementarity capable of selectively hybridizing to the nucleotide sequence under certain specific hybridization or annealing conditions.
상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는, 상기 뉴클레오티드 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 뉴클레오티드 서열이 이용될 수 있으나, 특이적으로 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 뉴클레오티드 서열이 이용될 수도 있다. 또한, 상기 프라이머 또는 프로브는, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 특이적으로 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서, 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. The polynucleotide may be a primer or a probe. The primer or probe may be a nucleotide sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence, but a nucleotide sequence that is substantially complementary to a range that does not specifically prevent hybridization may be used. . In addition, the primer or probe may have a modified nucleotide sequence within a range that does not interfere specifically with hybridization with respect to the nucleotide sequence of the target region.
용어 "프라이머(primer)"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합 반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드인 것일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들면, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 5 내지 100nt, 5 내지 70nt, 10 내지 50nt, 또는 15 내지 30nt인 것일 수 있다. 예를 들면, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이가 5nt 미만의 크기를 가질 경우 표적 영역을 캡처하기 위한 정확도가 낮으며, 100nt 초과의 크기를 가질 경우 합성 비용이 증가하는 단점을 갖는다. 따라서 상기 프라이머는 경제적이면서 유전자 변이 검출에 최적화된 크기를 갖는다. 프라이머의 설계는 주어진 증폭하고자 하는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 상기 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램의 예는 PRIMER 3 프로그램이 포함된다. The term "primer" refers to a single strand of oligonucleotide that can act as a starting point in the polymerization of nucleotides by a polymerase. For example, the primers can serve as a starting point for template-directed DNA synthesis in suitable conditions and in suitable buffers, i.e. in the presence of four different nucleoside triphosphates and polymerases. May be a single strand of oligonucleotide. Suitable length of the primer can vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. The primer may be 5 to 100nt, 5 to 70nt, 10 to 50nt, or 15 to 30nt in length. For example, shorter primers can form hybridization complexes that are sufficiently stable with the template at low annealing temperatures. When the length of the primer has a size of less than 5nt, the accuracy for capturing the target region is low, and if the size of more than 100nt has a disadvantage of increasing the synthesis cost. Thus, the primers are economically sized and optimized for gene mutation detection. The design of the primer can be readily carried out by one of ordinary skill in the art with reference to the given nucleotide sequence of the target region to be amplified. For example, it can be designed using a commercially available primer design program. Examples of such commercially available primer design programs include the
상기 프라이머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 표지되는 것일 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, 32P 또는 35S와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)의 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입되는 것일 수 있다.The primer may further include a nucleotide analogue such as phosphorothioate, alkylphosphothioate, peptide nucleic acid or intercalating agent. In addition, the fluorescent substance may further include a label material that emits fluorescence, phosphorescence, or radioactivity. The fluorescent label material may be one of VIC, NED, FAM, PET, or a combination thereof. The labeling substance may be labeled at the 5 'end of the polynucleotide. In addition, the radiolabeled substance may be incorporated into an amplification product through a PCR reaction using a reaction solution of a polymerase chain reaction (PCR) to which radioisotopes such as 32 P or 35 S are added.
상기 프라이머는 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), PCR 연장 분석, PCR 단일 가닥 고차 구조 다형성(PCR-single strand conformation polymorphism: PCR-SSCP), TaqMan 방법 및 시퀀싱 등을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다.The primer may be used for allele specific PCR, PCR extension analysis, PCR single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), TaqMan method and methods using sequencing, etc. have.
용어 "프로브(probe)"는 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프로브는 길이가 5 내지 100nt, 10 내지 90nt, 15 내지 80nt, 20 내지 70nt, 또는 30 내지 50nt인 것일 수 있다. 상기 프로브의 길이가 10nt 미만의 크기를 가질 경우 표적 영역을 캡처하기 위한 정확도가 낮으며, 100nt 초과의 크기를 가질 경우 합성 비용이 증가하는 단점을 갖는다. 따라서 상기 프로브는 경제적이면서 유전자 변이 검출에 최적화된 크기를 갖는다. 상기 프로브는, 예를 들면, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열에 완전 상보적인 서열로 이루어진 완전 매치 프로브(perfect match probe) 및 변이 위치를 제외한 모든 뉴클레오티드 서열에 대하여 완전 상보적인 서열을 갖는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. The term "probe" refers to a polynucleotide capable of sequence specific binding to the complementary polynucleotide strand. The probe may have a length of 5 to 100nt, 10 to 90nt, 15 to 80nt, 20 to 70nt, or 30 to 50nt. When the length of the probe has a size of less than 10nt, the accuracy for capturing the target region is low, and when the size of the probe is greater than 100nt, the synthesis cost increases. Thus, the probes are economically sized and optimized for detecting genetic variation. The probe is selected from the group consisting of, for example, a perfect match probe consisting of a sequence completely complementary to a nucleotide sequence of a target region and a probe having a sequence that is completely complementary to all nucleotide sequences except for the mutation position. It may be.
상기 프로브는 혼성화 방법, 예를 들면, 마이크로어레이(microarray), 서던 블로팅, 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization) 및 DNA 칩 등을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 당해 기술 분야에 알려진 의미로 사용되며, 예를 들면, 기판 상의 복수 개의 구분된 영역에 프로브 또는 프로브의 집단이 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예를 들면, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼(wafer), 파이버(fiber), 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로브 또는 그에 상보적인 프로브는 개체로부터 수득된 핵산과 혼성화되고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정할 수 있는 방법에 이용되는 것일 수 있다.The probe may be used in a hybridization method, for example, using a microarray, southern blotting, dynamic allele-specific hybridization, a DNA chip, or the like. Microarray is used in the meaning known in the art, for example, a probe or a group of probes may be immobilized in a plurality of separate areas on the substrate. The substrate is a suitable rigid or semi-rigid support, for example membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, It may include microparticles and capillaries. The probe or a probe complementary thereto may be used in a method capable of hybridizing with a nucleic acid obtained from an individual and measuring the degree of hybridization obtained therefrom.
용어 "유전자"는 유전 정보를 결정하는 구조 단위를 의미하며, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA(tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조 유전자의 발현을 제어하는 조절 유전자, 예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유전자"는 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면 "유전자의 뉴클레오티드 서열"은 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 가닥에 포함된 뉴클레오티드 서열 및/또는 구조 유전자의 발현을 제어하는 뉴클레오티드 서열인 것일 수 있다.The term "gene" refers to a structural unit that determines genetic information and controls the expression of a structural gene, and / or structural gene having information that determines the amino acid sequence of a protein or the nucleotide sequence of a functional RNA (tRNA, rRNA, etc.). Regulatory genes, for example, may include a promoter, a suppressor (repressor), an operator (operator) and the like. The term "gene" is understood herein to mean a single stranded side comprising a nucleotide sequence that is transcribed to produce a product of a gene. For example, a "nucleotide sequence of a gene" may be a nucleotide sequence that controls the expression of a nucleotide sequence and / or structural genes contained in a single strand comprising a nucleotide sequence that is transcribed to produce a product of a gene.
용어 "엑손"은 DNA 서열 중 단백질의 합성 정보를 담고 있는 영역으로, 예를 들면 발현된 단백질의 일부 또는 전부를 암호화하는 핵산 분자를 의미한다.The term "exon" refers to a region of a DNA sequence that contains protein synthesis information, for example, a nucleic acid molecule that encodes some or all of the expressed protein.
상기 변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 뉴클레오티드 서열의 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열의 변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환(substitution), 삽입(insertion), 중복(duplication), 결실(deletion)(삽입 및 결실을 Insertion and Deletion: 'InDel'이라고도 함), 전좌(translocation) 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환은, 예를 들면, 단일 뉴클레오티드 변이(single nucleotide variant: SNV)인 것일 수 있다. The mutation may be one having a change in nucleotide sequence with respect to standard genomic DNA. Variation of the nucleotide sequence may include substitution, insertion, duplication, deletion of one or more nucleotide sequences relative to standard genomic DNA (insertion and deletion, also referred to as 'InDel'). , Translocation, and the like. Substitution of the one or more nucleotide sequences may be, for example, a single nucleotide variant (SNV).
상기 변이는 상염색체 우성 변이인 것일 수 있다. 상기 변이는 TMEM43 유전자의 엑손 영역, 예를 들면, 12번째 엑손 영역의 변이인 것일 수 있다. 상기 변이는 TMEM43 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T 변이인 것일 수 있다. 상기 변이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T 변이인 것일 수 있다. 상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T 변이는 서열번호 2의 뉴클레오티드서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드인 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 변이인 것일 수 있다. The mutation may be an autosomal dominant mutation. The mutation may be a mutation of an exon region of the TMEM43 gene, for example, the 12th exon region. The mutation may be a c.C1114T mutation in the nucleotide sequence of the TMEM43 gene. The mutation may be a c.C1114T mutation in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The c.C1114T mutation in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a mutation in which a cytosine (C), which is the 1114th nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, is substituted with thymine (T) in a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 It may be that.
상기 변이는 TMEM43 단백질의 아미노산 서열에서 p.R372X 변이인 것일 수 있다. 상기 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.R372X 변이인 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.R372X 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 서열번호 1의 N 말단으로부터 372번째 아미노산인 아르기닌(R)이 종결 코돈에 의하여 소실된 변이인 것일 수 있다.The mutation may be a p.R372X mutation in the amino acid sequence of the TMEM43 protein. The mutation may be a p.R372X mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The p.R372X mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be a mutation in which the arginine (R), which is the 372th amino acid from the N terminus of SEQ ID NO: 1, is lost by a stop codon in a polypeptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 have.
상기 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 변이 위치인 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. 또는, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 변이 위치인 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 그 서열이 동일하거나 상보적인 것일 수 있다. 하나의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 감각신경성 난청 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 감각신경성 난청 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 하나의 특정한 뉴클레오티드 서열을 가진 감각신경성 난청 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 및/또는 그에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.In order to detect the TMEM43 mutation, a polynucleotide comprising a continuous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of the exon region of the TMEM43 gene or its complementary polynucleotide is a single nucleotide mutation position in a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a polynucleotide capable of detecting the 1114th nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2. Alternatively, a polynucleotide comprising the 1114th nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, which is a single nucleotide variation position in the polynucleotide including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, may have the same or complementary sequence. If one single stranded polynucleotide is associated with the risk of developing a sensorineural hearing loss disease, it can be determined that the polynucleotide complementary to the single stranded polynucleotide is also associated with the risk of developing a sensorineural hearing loss disease. Thus, the composition may comprise a single stranded polynucleotide associated with the risk of developing a sensorineural hearing loss disease having one specific nucleotide sequence and / or a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary thereto.
다른 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43의 일부 아미노산이 소실된 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위한 폴리펩티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 조성물을 제공한다. Another aspect provides a composition for diagnosing sensorineural hearing loss comprising a polypeptide for specifically detecting a polypeptide missing some amino acids of TMEM43 to detect TMEM43 mutations.
상기 조성물은 TMEM43 단백질에서 아미노산 결실 위치를 검출할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 아미노산 결실 위치인 상기 서열번호 1의 N 말단으로부터 372번째 아미노산을 검출할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. The composition may be one comprising a polypeptide capable of detecting the amino acid deletion position in the TMEM43 protein. The composition may include a polypeptide capable of detecting the 372th amino acid from the N-terminal of the SEQ ID NO: 1, the amino acid deletion position in the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
아미노산 변이는 넌센스 변이(nonsense mutation) 변이에 의한 것일 수 있다. 넌센스 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드가 바뀌어 종결코돈이 됨으로써, 아미노산을 더이상 생성하지 않는 변경을 의미한다. Amino acid mutations may be due to nonsense mutations. Nonsense variation refers to an alteration in which one or more nucleotides are changed to a stop codon, thereby no longer producing amino acids.
상기 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 아미노산 종결 및 소실되는 위치인 상기 서열번호 1의 N 말단으로부터 372번째 아미노산과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 372번째 아미노산은 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 암호화한 것 일 수 있고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 생성된 아미노산 서열을 검출할 수 있는 것일 수 있다. The polypeptide may specifically bind to the 372th amino acid from the N terminus of SEQ ID NO: 1, which is a position where the amino acid ends and disappears in the polypeptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The 372th amino acid may be a polynucleotide encoding a 1114 nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, the polypeptide is a 1114 nucleotide from the 5' end of SEQ ID NO: 2 is replaced by T It may be one that can detect the generated amino acid sequence.
상기 폴리펩티드는 항체 또는 항원 결합 단편인 것일 수 있고, 단수개 또는 복수개인 것일 수 있다. 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 것일 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미한다.The polypeptide may be an antibody or an antigen binding fragment, and may be singular or plural. Antibodies may be in the form of whole antibodies as well as containing functional fragments of antibody molecules. The whole antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is connected by heavy and disulfide bonds. The functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has an antigen binding function.
상기 폴리펩티드는 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역분석법(radio immunoassays), 효소 결합 면역분석법(Enzyme Linked Immunoabsorbent assay: ELISA), 면역블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다. 즉 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법에 이용될 수 있다. The polypeptide is immunocytochemical and immunohistochemistry, radioimmunoassay, radioimmunoassay, enzyme linked immunoassay assay (ELISA), immunoblotting, Faar assay, immunoprecipitation, latex It may be used in a method using aggregation, erythrocyte aggregation, non-turbidity, immunodiffusion, counter-current electrophoresis, single radical immunodiffusion, immunochromatography, protein chip and immunofluorescence. That is, it can be used in a method capable of measuring the binding of the antigen to the antibody.
다른 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 변이 위치인 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 또는, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 변이 위치인 서열번호 2의 5' 말단으로부터 1114번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 그 서열이 동일하거나 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.Another aspect provides a kit for diagnosing sensorineural hearing loss comprising a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of an exon region of the TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof to detect TMEM43 mutations. The kit may comprise a polynucleotide capable of detecting the 1114th nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, which is a single nucleotide variation position in the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Alternatively, the polynucleotide comprising the 1114th nucleotide from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, which is a single nucleotide variation position in the polynucleotide including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, may include a polynucleotide having the same or complementary sequence thereof. have.
상기 키트는, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드와 그의 특정 용도에 필요한 구성들을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드와 함께 그의 사용 방법에 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드가 핵산과 혼성화하는데 요구되는 알려진 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭하고, 증폭 산물의 존재 유무를 통하여, 개체의 감각신경성 난청 질환을 진단하기 위한 키트인 것일 수 있다. 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 프로브를 시료 중의 핵산과 혼성화시키고, 그 혼성화 결과로부터 개체의 감각신경성 난청 질환의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산의 혼성화에 필요한 시약, 버퍼, 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예를 들면, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소보조인자 및 dNTPs를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적 영역을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있으며, 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 영역이 증폭되고, 상기 비특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 영역이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 감각신경성 난청 질환과 연관된 표적 영역 또는 변이가 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 감각신경성 난청 질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함하는 것일 수 있다.The kit may be, for example, to include the polynucleotide and the components necessary for the specific use thereof. It may be one containing a reagent necessary for its use with the polynucleotide. The kit may further comprise a known substance required for the polynucleotide to hybridize with the nucleic acid. The kit may specifically be a kit for amplifying a nucleotide sequence of a target region and diagnosing sensorineural hearing loss disease in an individual through the presence or absence of an amplification product. Or a kit for hybridizing the polynucleotide or a probe derived therefrom with a nucleic acid in a sample, and diagnosing the risk of developing a sensory neurological hearing loss disease in the individual from the hybridization result. For example, it may further include a reagent, a buffer, a buffer, a cofactor, and / or a substrate required for hybridization of the nucleic acid. In addition, when the kit is subjected to a PCR amplification process, optionally, it may include a reagent required for PCR amplification, for example, buffer, DNA polymerase, DNA polymerase cofactor and dNTPs. In addition, the kit may further include instructions for use to amplify the target region, and may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above. For example, the instruction manual may be used for amplifying a target region in an amplification reaction using the specific primer, and when the target region is not amplified in the amplification reaction using the non-specific primer. And an explanation of the outcome determination, including a description of determining that there is an associated target area or variation, and from that result, determining the risk of developing the individual's sensorineural hearing loss disease.
상기 폴리뉴클레오티드 및 변이에 대하여는 전술한 바와 같다.The polynucleotides and variations are as described above.
다른 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43의 일부 아미노산이 소실된 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위한 폴리펩티드를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단용 키트를 제공한다. Another aspect provides a kit for diagnosing sensorineural hearing loss comprising a polypeptide for specifically detecting a polypeptide missing some amino acids of TMEM43 to detect TMEM43 mutations.
상기 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 372번째 아미노산이 소실된 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하기 위한, 폴리펩티드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 또는 장치가 포함되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 것은 유전자에서 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 이용하여 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있다. 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 선택적으로, 이차 항체 및 표지의 기질을 포함하는 것일 수 있다. The kit is one or more suitable for methods of analyzing a polypeptide for determining the expression level of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide that has lost the 372th amino acid in a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Other components or devices may be included. Measuring the expression level of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a process of confirming the presence and expression of the polypeptide or protein expressed in the gene, specific for the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 The amount of expression of the gene or the amount of protein can be confirmed using the polypeptide that binds to When the kit is subjected to an immunoassay, it may optionally be one comprising a substrate of a secondary antibody and a label.
상기 폴리펩티드 및 변이에 대하여는 전술한 바와 같다.Such polypeptides and variations are as described above.
다른 양상은 TMEM43의 p.R372X 변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.R372X 변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 벡터는 폴리뉴클레오티드의 운반체를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 시스템인 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 내에 존재하는 것일 수 있다. 상기 벡터에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.R372X 변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 동작 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 용어 "동작 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사 조절인자 결합 위치의 어레이와 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 상기 발현 벡터에서 이용 가능한 프로모터는 동물세포, 예를 들면, 포유동물세포에서 작동하여 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스 프로모터(cytomegalo virus: CMV) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 또는 베타-액틴 프로모터인 것일 수 있다. 상기 벡터는 이용 가능한 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 벡터에서 백본은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 다양한 벡터로부터 필요에 따라 선택된 것일 수 있다. 예를 들면, pCMV6-Entry, pHY92 벡터, pRC CMV 벡터, pIRES2-EGFP 벡터, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, YIp5 벡터, YCpl9 벡터, 엡스테인-바 바이러스 벡터, pMSG 벡터, pMAMneo-5 벡터, 배큘로바이러스 pDSVE 벡터, pSecTag2B 벡터 또는 yT&A 벡터인 것일 수 있다. 예를 들면, pCMV6-Entry 벡터에 삽입되어 있는 TMEM43의 p.R372X 변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 위치 지향 돌연변이와 중합효소 연쇄 반응과 같은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 제작되는 것일 수 있다. Another aspect provides a vector comprising a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a p.R372X variant of TMEM43. The vector may include a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a p.R372X mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Vector means a carrier of polynucleotides. The polynucleotide may be present in a vector, eg, an expression vector, which is a suitable expression system. In the vector, the polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a p.R372X mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be operably linked to a promoter. The term “operably linked” means a functional bond between an array of nucleic acid expression control sequences, eg, a promoter, signal sequence, or transcriptional regulator binding site, and another nucleic acid sequence, whereby the regulatory sequence To regulate transcription and / or translation of other nucleic acid sequences. Promoters available in the expression vectors are those that can operate in animal cells, for example mammalian cells to regulate the transcription of nucleotide sequences, and promoters derived from mammalian viruses and / or promoters derived from the genome of mammalian cells. It may be to include. For example, cytomegalo virus (CMV) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, or It may be a beta-actin promoter. The vector may be one that includes available polyadenylation sequences. The backbone in the vector may be selected as needed from various vectors suitable for expression of the polynucleotide. For example, pCMV6-Entry, pHY92 vector, pRC CMV vector, pIRES2-EGFP vector, SV40 vector, papilloma virus vector, YIp5 vector, YCpl9 vector, Epstein-Barr virus vector, pMSG vector, pMAMneo-5 vector, Baculus It may be a rovirus pDSVE vector, a pSecTag2B vector or a yT & A vector. For example, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a p.R372X variant of TMEM43 inserted into a pCMV6-Entry vector may be produced by methods known in the art, such as position-directed mutations and polymerase chain reactions. have.
다른 양상은 TMEM43 변이를 포함하는 감각신경성 난청 질환 모델을 제공한다.Another aspect provides a model of sensorineural hearing loss comprising a TMEM43 mutation.
상기 모델은 TMEM43 변이를 갖는 형질전환체인 것일 수 있다. The model may be a transformant having a TMEM43 mutation.
용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환된 세포 또는 형질전환된 동물을 의미한다. 상기 형질전환된 동물은 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 지속적으로 발현하는 동물을 의미한다. 상기 형질전환된 동물은 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열의 변이를 포함하는 것일 수 있다. 상기 형질전환된 동물은 TMEM43 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T 변이를 포함하는 것일 수 있다.The term “transformer” refers to a transformed cell or transformed animal into which a gene encoding one or more target proteins has been introduced. The transformed animal refers to an animal that continuously expresses TMEM43 with a p.R372X mutation. The transformed animal may be one containing a change in the nucleotide sequence of the exon region of the TMEM43 gene. The transformed animal may be one containing a c.C1114T mutation in the nucleotide sequence of the TMEM43 gene.
상기 형질전환된 동물은 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 암호화하는 동물의 유전자를 수정란에 주입하여 동물의 염색체 내로 통합되어 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 지속적으로 발현하는 동물인 것일 수 있다. 상기 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 암호화하는 유전자는 형질전환된 동물의 체세포 또는 생식세포, 또는 체세포 및 생식세포의 유전체에 삽입된 것일 수 있다. 상기 형질전환된 동물은 상기 벡터를 수정난 또는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ES 세포)에 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 레트로바이러스 감염(retroviral infection) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등의 방법으로 전달하여 제작되는 것일 수 있다. The transformed animal may be an animal that integrates the gene of an animal encoding TMEM43 having a p.R372X mutation into the fertilized egg and integrates into the animal's chromosome to continuously express TMEM43 having a p.R372X mutation. The gene encoding TMEM43 having the p.R372X mutation may be inserted into the somatic or germ cells of the transformed animal, or the genomes of somatic and germ cells. The transformed animal was microinjected (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al.) Into the fertilized egg or embryonic stem cells (ES cells). al., Virology, 52: 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al. , Gene, 10:87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), retroviral infection and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)).
상기 형질전환된 동물은 유전자 가위 (programmable nuclease), 예를 들면, 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease : ZFN), TALEN (transcriptional activator-like effector nuclease), CRISPR/ Cas, 또는 CRISPR/ Cpf1 등의 방법으로 전달하여 제작되는 것일 수 있다. 상기 형질전환된 동물은 상기 TMEM43의 p.R372X 변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 수정란 또는 배아줄기세포에 전달하는 단계에 이어, 가임신된 동물을 준비하는 단계, 상기 수정란을 가임신된 동물의 자궁에 이식하는 단계, 상기 수정란이 새끼로 태어나도록 동물을 기르는 단계, 자손을 수득하여 TMEM43의 p.R372X 변이의 발현 여부를 선별하는 단계를 수행하여 수득할 수 있다. 상기 형질전환된 동물은 인간을 제외한 다양한 포유류를 포함하며, 이에 제한되는 것인 아니나, 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등일 수 있다.The transformed animal may be a genetic nuclease such as zinc finger nuclease (ZFN), transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN), CRISPR / Cas, or CRISPR / Cpf1. It may be to be delivered by the method. The transformed animal is to deliver a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a p.R372X mutation of the TMEM43 to fertilized eggs or embryonic stem cells, to prepare a fertility animal, the fertility of the fertilized egg Implanting into the uterus of the animal, rearing the animal so that the fertilized egg is born, and obtaining progeny to screen for the expression of p.R372X mutation of TMEM43. The transformed animal includes various mammals except humans, but is not limited thereto, and may be mouse, rat, cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat, and the like.
상기 형질전환된 세포는 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 지속적으로 발현하는 세포를 의미한다. 상기 세포는 체세포 또는 생식세포, 또는 체세포 및 생식세포인 것일 수 있다. 상기 형질전환된 세포는 상기 벡터를 세포 내로 도입하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들면, 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 레트로바이러스 감염 및 유전자 밤바드먼트 등을 이용할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.The transformed cell refers to a cell that continuously expresses TMEM43 with a p.R372X mutation. The cells may be somatic or germ cells, or somatic and germ cells. The transformed cell may use a known method for introducing the vector into the cell, and suitable standard techniques such as microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposomes, as known in the art. -Mediated transfection, DEAE-dextran treatment, retroviral infections and gene balmbodies can be used, but are not limited to these. At this time, the circular vector may be cut with an appropriate restriction enzyme and introduced into a linear vector form.
상기 형질전환체는 p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 지속적으로 발현하므로, 감각신경성 난청 치료제 또는 치료 방법을 스크리닝하는데 이용되는 것일 수 있다. 상기 감각신경성 난청 치료제를 스크리닝하는 것은, p.R372X 변이를 갖는 TMEM43를 지속적으로 발현하는 형질전환체에 분석하고자 하는 시험 물질을 가하는 단계, 상기 형질전환체에서 감각신경성 난청의 치료 또는 경감 정도를 분석 및 평가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 형질전환된 세포 또는 형질전환된 동물에 분석하고자 하는 시험 물질을 가하는 것은, 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. Since the transformant continuously expresses TMEM43 having a p.R372X mutation, the transformant may be used for screening a therapeutic agent or treatment method for sensorineural hearing loss. Screening of the sensory neurodeafness screening agent includes the steps of adding a test substance to be analyzed to a transformant that continuously expresses TMEM43 having a p.R372X mutation, and analyzing the degree of treatment or alleviation of sensorineural hearing loss in the transformant. And evaluating. Adding the test substance to be analyzed to the transformed cells or the transformed animal can be carried out by various methods known to those skilled in the art.
다른 양상은 개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계; 및 상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 감각신경성 난청 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법을 제공한다. Another aspect includes identifying a nucleotide sequence of genomic DNA isolated from an individual; And comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify the mutation of the genomic DNA to provide a method for detecting a mutation of the genomic DNA to provide information regarding the diagnosis of sensorineural hearing loss disease. To provide.
상기 방법은 개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함한다.The method includes identifying a nucleotide sequence of genomic DNA isolated from an individual.
상기 개체는 감각신경성 난청 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 감각신경성 난청 질환이 발병하거나 또는 발병한 것으로 의심되는 대상인 것일 수 있다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 인간(Homo sapiens), 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 아시아계 인, 또는 한국인일 수 있다. "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.The subject refers to a subject for predicting the risk of developing a sensorineural hearing loss disease. The subject may be a subject having or suspected of having a sensorineural hearing loss disease. The subject may include a vertebrate, mammal, human ( Homo sapiens ), mouse, rat, cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat and the like. For example, the human may be Asian or Korean. "Subject" and "patient" are used interchangeably herein.
상기 방법에서 개체로부터 분리된 유전체 DNA는 생물학적 시료로부터 분리된 유전체 DNA 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 생물학적 시료는 순수하게 분리된 핵산, 조 분리된 핵산, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물, 또는 세포 유리 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 유전체 DNA를 분리하는 방법은 통상의 핵산 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다. The genomic DNA isolated from an individual in the method may be genomic DNA or fragment thereof isolated from a biological sample. The biological sample may include blood, tissue, urine, mucus, saliva, tears, plasma, serum, sputum, spinal fluid, pleural fluid, nipple aspirate, lymph, airway, serous, urogenital fluid, breast milk, lymphatic system fluid, semen, cerebrospinal fluid, Intratracheal fluid, ascites, cystic tumor fluid, amniotic fluid, or a combination thereof. The biological sample may be purely isolated nucleic acid, crude isolated nucleic acid, cell lysate comprising nucleic acid, or cell free nucleic acid. The method of separating genomic DNA from a biological sample can be performed by conventional nucleic acid separation methods.
상기 방법에서 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계는 염색체 내 표적 영역 또는 각 위치에서의 뉴클레오티드를 결정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 알려진 핵산의 뉴클레오티드 시퀀싱 방법(sequencing method)에 의하여 염색체 내 표적 영역 또는 각 위치에서의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 생거(또는 디데옥시) 시퀀싱 방법 또는 막삼-길버트(화학 절단) 방법을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출 가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일 염기 연장(single base primer extension: SBE) 방법이 이용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 또한, 차세대 염기 시퀀싱을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "차세대 염기시퀀싱(next generation sequencing: NGS)은 칩(Chip)기반 그리고 PCR 기반 쌍-말단(paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다. 차세대 염기시퀀싱에 의해 짧은 시간 내에 분석 대상이 되는 시료에 대해 대량의 염기서열 데이터를 생성할 수 있다.Identifying the nucleotide sequence of the genomic DNA in the method means determining the nucleotide at each position or target region in the chromosome. For example, the nucleotide sequencing method of known nucleic acids can directly determine the nucleotides at the target region or at each position in the chromosome. Nucleotide sequencing methods may include Sanger (or dideoxy) sequencing methods or Maksam-Gilbert (chemical cleavage) methods. In addition, the nucleotide sequence of the target region can be determined by hybridizing the probe with the polynucleotide of interest and analyzing the hybridization result. The degree of hybridization can be confirmed, for example, by labeling a target nucleic acid with a detectable label and detecting the hybridized target nucleic acid, or by an electrical method or the like. In addition, a single base primer extension (SBE) method may be used. Nucleotide sequencing methods may also include next generation base sequencing. The term "next generation sequencing (NGS) fragments the full-length genome in a chip-based and PCR-based paired-end format, and fragments the fragment at ultrafast speeds based on chemical hybridization. This technique refers to a technique for performing sequencing A large amount of base sequence data can be generated for a sample to be analyzed within a short time by next-generation sequencing.
상기 방법은 분리된 유전체 DNA를 임의의 크기로 단편화(fragmentation)하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편화는 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 초음파의 사용에 의해 유전체 DNA를 단편화할 수 있다. 상기 방법은 상기 유전체 DNA를 단편화한 후, 단편화된 유전체 DNA의 양 말단에 증폭을 위한 서열을 리게이션(ligation)시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 증폭을 위한 서열, 예를 들면, 쌍-말단 태그(paired-end tag), 유니버설 태그(universal tag) 등의 리게이션 방법은 통상의 기술자가 적절히 선택하여 수행할 수 있다.The method may comprise fragmenting the isolated genomic DNA to any size. The fragmentation can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, genomic DNA can be fragmented by the use of ultrasound. The method may include fragmenting the genomic DNA and then ligation of a sequence for amplification at both ends of the fragmented genomic DNA. The ligation method for the amplification, for example, a paired-end tag, a universal tag, etc. may be appropriately selected by a person skilled in the art.
상기 방법은 분리된 유전체 DNA와 상기 조성물 중의 상기 폴리뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 조성물 중에 포함된 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드가 표적으로 하는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전체 DNA의 단편의 혼성화 산물을 얻는 것일 수 있다. 상기 혼성화는 상기 조성물을 분리된 유전체 DNA과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 혼성화는 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산의 혼성화에 적절한 것으로 알려진 버퍼 중에서 상기 폴리뉴클레오티드와 분리된 유전체 DNA를 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 혼성화는 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 혼성화에 적절한 온도는 예를 들면, 약 40℃ 내지 약 80℃, 약 50℃ 내지 약 75℃, 약 60℃ 내지 약 70℃, 또는 약 62℃ 내지 약 67℃인 것일 수 있다. 또한, 혼성화 온도는 이에 제한되지 않고, 상기 조성물 중에 포함된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 길이에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 혼성화 시간은 예를 들면, 1 시간 내지 12시간(밤새) 동안일 수 있다. The method may comprise obtaining a hybridized product of the isolated genomic DNA and the polynucleotide in the composition. The method may be to obtain a hybridization product of a polynucleotide included in the composition and a fragment of genomic DNA having a nucleotide sequence of a target region targeted by the polynucleotide. The hybridization can be accomplished by contacting the composition with isolated genomic DNA. The hybridization can be performed by known methods. For example, it can be performed by incubating the genomic DNA isolated from the polynucleotide in a buffer known to be suitable for hybridization of nucleic acids. Hybridization can be carried out at an appropriate temperature. Suitable temperatures for hybridization may be, for example, about 40 ° C. to about 80 ° C., about 50 ° C. to about 75 ° C., about 60 ° C. to about 70 ° C., or about 62 ° C. to about 67 ° C. In addition, the hybridization temperature is not limited thereto, and may be appropriately selected depending on the nucleotide sequence and the length of the polynucleotide included in the composition. Hybridization time can be, for example, for 1 hour to 12 hours (overnight).
상기 방법은 분리된 유전체 DNA와 상기 조성물 중의 상기 폴리뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계 후, 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계 전에, 상기 분리된 유전체 DNA와 상기 폴리뉴클레오티드의 혼성화 산물을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리는 폴리뉴클레오티드에 부착된 분리 또는 정제를 위한 모이어티를 이용하는 것일 수 있다. 상기 분리 또는 정제는 모이어티에 특이적으로 결합하는 물질 또는 자기장에 의해 이루어질 수 있다.The method comprises the steps of: obtaining a hybridization product of the isolated genomic DNA and the polynucleotide in the composition, and before identifying the nucleotide sequence of the isolated genomic DNA, separating the hybridization product of the isolated genomic DNA and the polynucleotide It may be to include a step. The separation may be using a moiety for separation or purification attached to the polynucleotide. The separation or purification may be by a substance or magnetic field that specifically binds to the moiety.
상기 방법은 상기 분리된 혼성화 산물 또는 분리된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 상기 주형의 양 말단에 증폭을 위한 서열을 리게이션하고, 상기 증폭을 위한 서열에 상보적인 유니버설 프라이머(universal primer)를 프라이머로서 사용하여 PCR하여, 상기 분리된 혼성화 산물 또는 분리된 유전체 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 증폭된 산물을 이용하여 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다.The method uses the isolated hybridization product or the separated genomic DNA as a template, ligates a sequence for amplification at both ends of the template, and uses a universal primer complementary to the sequence for the amplification as a primer. By using PCR, it may be to amplify the isolated hybridization product or isolated genomic DNA. The nucleotide sequence can be identified using the amplified product.
상기 방법은 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함한다. 용어 "표준 뉴클레오티드 서열(reference neucleotide sequence)"은 변이 확인을 위해 참조가 되는, 변이를 포함하지 않는 인간 유전체 서열인 것일 수 있다. 표준 뉴클레오티드 서열은, 참조 유전체의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소의 데이터베이스에 게시된 인간 유전자의 뉴클레오티드 서열, 구체적으로, NCBI37.1 또는 UCSC hg19(GRCh37)인 것일 수 있다. 상기 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열과 표준 뉴클레오티드 서열 간의 비교는 공지된 다양한 서열 비교 분석프로그램, 예를 들면 Maq, Bowtie, SOAP, GSNAP 등을 이용하여 수행할 수 있다.The method includes comparing the identified nucleotide sequence of genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify mutations in the genomic DNA. The term "reference neucleotide sequence" may be a human genomic sequence that does not include a mutation, to which reference is made for identification of the mutation. The standard nucleotide sequence may be a nucleotide sequence of a reference genome, for example, a nucleotide sequence of a human gene, specifically NCBI37.1 or UCSC hg19 (GRCh37), published in a database of the National Institute of Biotechnology Information Institute of the National Institutes of Health. . The comparison between the nucleotide sequence of the genomic DNA and the standard nucleotide sequence can be performed using various known sequence comparison analysis programs, for example, Maq, Bowtie, SOAP, GSNAP and the like.
상기 방법은 상기 유전체 DNA의 변이가 확인된 경우, 상기 개체를 감각신경성 난청 질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 개체가 감각신경성 난청 질환을 갖는 것으로 진단할 수 있다. 상기 위험군은 표준 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 군 또는 정상인 군에 비하여 감각신경성 난청 질환 발병의 확률이 증가되어 있는 것으로 예측 또는 진단된 군을 의미한다. When the mutation of the genomic DNA is confirmed, the method may include determining that the individual belongs to a high risk group of the risk of developing a sensorineural hearing loss disease. That is, it can be diagnosed that the individual has sensorineural hearing loss disease. The risk group refers to a group having a standard nucleotide sequence or a group predicted or diagnosed with an increased probability of developing a sensorineural hearing loss disease compared to a normal group.
상기 변이에 대하여는 전술한 바와 같다. The variation is as described above.
다른 양상은 TMEM43 변이를 검출하기 위하여 TMEM43 유전자의 엑손 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다. Another aspect is to predict the prognosis for cochlear implant surgery in a patient with sensory nerve deafness comprising a polynucleotide comprising a contiguous nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of the exon region of the TMEM43 gene or a complementary polynucleotide thereof to detect TMEM43 mutations. It provides a composition for.
상기 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후는 예측하는 것은, 와우 이식수술 시 말소리를 이해할 수 있을 것인지 또는 와우 이식수술 후에 말소리를 더 잘 이해할 수 있을 것인지 예측하는 것을 의미한다. 예를 들면, 청성뇌간반응이 정상적으로 나타나게 될 것인지를 예측하는 것일 수 있다. 상기 변이를 갖는 감각신경성 난청 환자는 내 유모 세포 또는 내 유모 세포 주변의 지지세포에 이상을 갖는 것이고, 청신경 전도에 문제가 없을 것이므로, 와우 이식수술 시 예후가 긍정적일 것으로 예측될 수 있다. Predicting the prognosis for the cochlear implant surgery of the sensorineural hearing loss patient means predicting whether speech can be understood during the cochlear implant surgery or better understood after the cochlear implant surgery. For example, it may be to predict whether the auditory brainstem response will be normal. Patients with sensorineural hearing loss having the above mutations have abnormalities in the inner hair cells or the supporting cells around the inner hair cells, and there will be no problem in the conduction of the auditory nerves.
상기 변이, 폴리뉴클레오티드, 감각신경성 난청에 대하여는 전술한 바와 같다.The mutation, polynucleotide and sensorineural hearing loss are as described above.
다른 양상은 개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계; 및 상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 감각신경성 난청 환자의 와우이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법을 제공한다. Another aspect includes identifying a nucleotide sequence of genomic DNA isolated from an individual; And comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify mutations in the genomic DNA to provide information for predicting prognosis for cochlear implant surgery in patients with sensorineural hearing loss. Provided are methods for detecting mutations in DNA.
개체로부터 분리된 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계; 및 상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계는 전술한 바와 같다.Identifying the nucleotide sequence of genomic DNA isolated from the individual; And comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify the variation of the genomic DNA as described above.
상기 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은, 와우 이식수술 시 말소리를 이해할 수 있을 것인지 또는 와우 이식수술 후에 말소리를 더 잘 이해할 수 있을 것인지 예측하는 것을 의미한다. 예를 들면, 청성뇌간반응이 정상적으로 나타나게 될 것인지를 예측하는 것일 수 있다. Providing information for predicting the prognosis for cochlear implant surgery in patients with sensorineural hearing loss means predicting whether speech can be understood during cochlear implant surgery or better understood after cochlear implant surgery. . For example, it may be to predict whether the auditory brainstem response will be normal.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the meaning as commonly understood by those skilled in the art in the related field of the present invention.
일 양상에 따른 조성물 또는 키트를 이용하여 TMEM43 유전자의 변이를 높은 민감도와 정확도로 분석할 수 있으며, 이러한 분석 결과를 바탕으로 감각신경성 난청을 효율적으로 진단할 수 있다.Using the composition or kit according to one aspect, the mutation of the TMEM43 gene can be analyzed with high sensitivity and accuracy, and the sensory neuron hearing loss can be efficiently diagnosed based on the analysis result.
도 1a 및 도 1b는 코호트(SB162)의 구성원이 속한 가계도 및 TMEM43 변이를 확인한 과정을 나타낸다.
도 2는 마우스에서 TMEM43이 발현되는 기관을 확인한 결과이다.
도 3은 4 내지 5일령, 및 20일령 마우스의 내이에서 TMEM43이 발현되는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 4일령, 15일령, 및 20일령 마우스의 내이에서 TMEM43의 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 5는 TMEM43의 p.R372X 변이를 갖는 형질전환된 동물을 제작하는 과정을 나타낸다. Auditorin은 TMEM43를 의미한다.
도 6은 2, 7, 및 13 개월령 TMEM43+/+ 및 TMEM43+/ tm1Cby 마우스 유모 세포의 세망판(reticular lamina)에서 내부 경계 세포(inner border cell) 및 경계 세포(border cell)를 나타낸 주사 전사 현미경 이미지이다. 여기서, 녹색 및 연녹색은 내부 경계 세포를 나타내고, 주황색 및 노랑색은 각각 경계 세포를 나타낸다.
도 7은 6 및 9개월령의 TMEM43+/+ 및 TMEM43+/ tm1Cby 마우스에서 4, 8, 16, 및 32 kHz에 대한 평균 ABR 임계값을 나타낸다. Auditorin은 TMEM43를 의미한다.Figures 1a and 1b shows the process of identifying the family tree and TMEM43 mutation belonging to the members of the cohort (SB162).
Figure 2 shows the results of confirming the organ expressing TMEM43 in the mouse.
3 is a result confirming that TMEM43 is expressed in the inner ear of 4 to 5 days old and 20 days old mice.
Figure 4 shows the results of confirming the expression of TMEM43 in the inner ear of 4, 15 and 20 days old mice.
5 shows the process of making a transformed animal with a p.R372X variant of TMEM43. Auditorin stands for TMEM43.
6 shows TMEM43 + / + and TMEM43 + / tm1Cby at 2, 7, and 13 months of age. Scanning transcription microscopy images showing inner border cells and border cells in the retinal lamina of mouse hair cells. Here, green and light green represent inner border cells, and orange and yellow represent border cells, respectively.
7 shows TMEM43 + / + and TMEM43 + / tm1Cby at 6 and 9 months of age. Mean ABR thresholds for 4, 8, 16, and 32 kHz in mice are shown. Auditorin stands for TMEM43.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 감각신경성 난청 환자로부터 1. From patients with sensorineural hearing loss TMEM43의Of TMEM43 p. p. R372XR372X 변이 검출 및 TMEM43의 p.R372X 변이를 갖는 동물 모델에서 감각신경성 난청 확인 Mutation Detection and Identification of Sensorineural Hearing Loss in Animal Models with p.R372X Mutation of TMEM43
1. 실험 개체 선택1. Select Experiment Object
본 연구는 분당 서울대학교 병원의 심의위원회로부터 승인을 받아 수행하였다(IRB-B-1007-105-402 및 IRBYH-0905-041-281). This study was approved by the Deliberation Committee of Seoul National University Bundang Hospital (IRB-B-1007-105-402 and IRBYH-0905-041-281).
청각신경병증의 유전적 원인을 조사하기 위해, 표준화된 청력검사 또는 가족력 데이터를 바탕으로 성인 발병형 진행성 청각신경병증을 상염색체 우성 유전 방식으로 분리한 가계도(SB162)을 확인하였다. 정상 피험자(290)와 비교했을 때, 청각신경병증의 영향을 받는 피험자(291, 284, 304)는, 순음 청력도(Pure Tone Average: PTA)에서 소리에 대한 감수성이 감퇴하고, 언어 구별 점수 (Speech discrimination Score: SDS)에서 손상 인식되고, 청성뇌간반응(Auditory Brainstem Respons: ABR)의 완전한 부재를 갖고, 변조 이음향방출(distortion product otoacoustic emissions: DPOAE) 또는 달팽이관 마이크로폰(Cochlea microphonic potential: CM)은 정상이었다. To investigate the genetic cause of auditory neuropathy, a family tree (SB162) was used to isolate adult-onset progressive auditory neuropathy by autosomal dominant genetic method based on standardized hearing test or family history data. Compared to the
구체적으로, 난청 가계 780 가계, 총 1100명에서, 15 가계의 성인 청각신경병증 가계를 1차적으로 선별하였다. 성인 청각신경병증의 경우, 발병 연령이 언어 습득기 이후인 가계를 2차적으로 선별하였다. 이어서, 임상 양상, 전기생리학적 소견, 및 후보 유전자 풀(pool)에서 유전진단을 토대로, 성인 청각신경병증을 하기의 3가지 유형으로 분류하였다.Specifically, 1,100 hearing impaired households were screened first in 780 households with hearing loss. In adult auditory neuropathy, households whose age of onset was after language acquisition were selected secondarily. Subsequently, adult auditory neuropathy was categorized into three types based on clinical manifestations, electrophysiological findings, and genetic diagnosis in candidate gene pools.
- 유형 1: 기 알려진 난청 유전자가 원인인 경우(예를 들면, DIAPH3)Type 1: Caused by previously known deafness genes (eg DIAPH3)
- 유형 2: 기 알려진 난청 유전자에서 원인 유전자를 찾지 못하고, 전기자극 청성뇌간반응(Electrically evoked auditory brainstem response:E-ABR)이 존재하는 경우Type 2: If a causative gene cannot be found in previously known hearing loss genes and an electrically evoked auditory brainstem response (E-ABR) is present.
- 유형 3: 기 알려진 난청 유전자에서 원인 유전자를 찾지 못하고, 전기자극 청성뇌간반응이 존재하지 않는 경우Type 3: If no causative gene is found in previously known hearing loss genes and no electrical stimulating auditory brainstem response exists
2. 분자 유전 스크리닝 2. Molecular Genetic Screening
감각신경성 난청과 연관된 후보 변이를 스크리닝하기 위하여, 다음과 같이 수행하였다. To screen for candidate variations associated with sensorineural hearing loss, the following was performed.
4명의 피험자(SB162-284, 289, 290, 291)에 대한 연계 분석으로부터 3p25-26 영역에 대하여 표적 엑솜 시퀀싱을 수행하고, 후보 변이체를 나열하였다. ESP6500과 1000G에서 1 % 미만의 소수 대립 유전자 빈도를 갖는 변이를 확인하였다. 유전 패턴이 일치하는 변이를 남겨두고, 플래깅(flagged) dbSNP 아닌 dbSNP는 필터링하였다. 이어서, 622종의 정상 대조군을 이용하여, 한국인 특이적인 공통 변이를 제거하였다. 염색체 3에 대한 게놈 수준 log2 비율을 조사하였다. Target exome sequencing was performed on the 3p25-26 region from linkage analysis for 4 subjects (SB162-284, 289, 290, 291) and listed candidate variants. Mutations with minor allele frequencies of less than 1% were identified in ESP6500 and 1000G. The genetic patterns were filtered and dbSNPs were filtered rather than the flagged dbSNPs. 622 normal controls were then used to remove Korean specific common mutations. The genome level log2 ratio for
동시에, 표적 엑솜 시퀀싱에서 변이가 발견되지 않거나 가계 내의 환자수가 많아서 멘델 유전으로 예상되는 경우를 분석하기 위하여, 4명의 피험자(SB162-284, 289, 290, 291)에 대하여 전체 엑솜 시퀀싱(Whole exome sequencing: WES)을 수행하였다. 감각신경성 난청을 보인 피험자로부터 전혈을 추출하고, SureSelect Human All Exon 키트 V3(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 전체 엑솜 시퀀싱을 수행하였다. 또한 101 염기쌍 말단 판독을 갖는 HiSeq 2000(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 바이오인포매틱스 분석은 Whole-exome sequencing reveals diverse modes of inheritance in sporadic mild to moderate sensorineural hearing loss in a pediatric population. Genet Med 17: 901-911에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시퀀싱 리드는 BWA v 0.7.5 및 SAMTOOLS v 0.1.18을 이용하여 인간 참조 유전체(hg19)에 정렬하였고, CATK v 2.4-7 및 Picard v 1.93을 이용하여 정렬, 색인화, 재배치, 및 중복을 표시하였다. GATK Unified Genotyper를 이용하여 변이를 명명하였고, 변이를 재확인하였다. ANNOVAR를 이용하여 변이를 어노테이션하였다. 이 후, 상기 가계의 최종 후보 변이를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 확인하였다. At the same time, whole exome sequencing was performed on four subjects (SB162-284, 289, 290, 291) to analyze a case where no mutations were found in the target exome sequencing, or because the number of patients in the household is expected to be Mendelian. : WES) was performed. Whole blood was extracted from subjects with sensorineural hearing loss and whole exome sequencing was performed using SureSelect Human All Exon Kit V3 (Agilent, Santa Clara, Calif., USA). It was also sequenced using HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, Calif., USA) with 101 base pair terminal reads. Bioinformatics analysis reveals Whole-exome sequencing reveals diverse modes of inheritance in sporadic mild to moderate sensorineural hearing loss in a pediatric population. Genet Med 17: performed as described in 901-911. Sequencing reads were aligned to the human reference genome (hg19) using BWA v 0.7.5 and SAMTOOLS v 0.1.18 and sorted, indexed, rearranged, and duplicated using CATK v 2.4-7 and Picard v 1.93. . Mutations were named using the GATK Unified Genotyper, and the mutations were reconfirmed. Variations were annotated using ANNOVAR. Thereafter, the final candidate variation of the household was confirmed by Sanger sequencing.
후보 변이는 코딩 영역의 동의 변이(synonymous variant)와 비코딩 영역의 변이로 필터링하였다. 1 % 미만의 소수 대립 유전자 빈도를 갖는 변이를 엑솜 시퀀싱 프로젝트 Exome Sequencing Project 6500 : ESP6500), 1000 게놈 프로젝트(1000 Genome Project: 1000G), 엑솜 집합 컨소시움(The Exome Aggregation Consortium : ExAC), 및 81 명의 한국인 개체의 엑솜에 대한 데이터 베이스에 기초하여 선별하였다. 이어서, 리드 뎁스가 10X 이상이면서 유전형 품질 점수가 20 이상인, 동형 접합형 변이 및 복합 이형 접합형 변이(homozygous variants and compound heterozygote variants)를 선별하였다. 최종적으로, 임상적으로 의미가 없는 dbSNP ID의 변이를 제외하고, ANSD 표현형과 공-분리(co-segregation)된 20 종의 후보 변이를 확인하였다. 4명의 가족에 대하여 WES를 수행한 후, 14명의 다른 가족에 대하여 분리 분석(segregation study)을 수행하고, TMEM43의 p.R372X를 최종적으로 선별하였다.Candidate variations were filtered by synonymous variants of coding regions and variations of non-coding regions. Variants with a minority allele frequency of less than 1% were found in the Exome Sequencing Project 6500, ESP6500, 1000 Genome Project (1000G), The Exome Aggregation Consortium (ExAC), and 81 Koreans. Screening was based on a database of individual exomes. Homozygous variants and compound heterozygote variants were then screened with a lead depth of at least 10 × and genotyping quality scores of at least 20. Finally, 20 candidate mutations co-segregated with the ANSD phenotype were identified except for clinically insignificant dbSNP ID variations. After WES for four families, a segregation study was performed for 14 other families, and finally p.R372X of TMEM43 was selected.
GenbankIDGenbankID
-284*-284 *
NM_138287 DTX3L
NM_138287
NM_002755 MAP2K1
NM_002755
NM_020950 KIAA1614
NM_057177 PARD3B
NM_001243900 HDLBP
NM_003613 CILP
NM_001885 CRYAB
NM_001885
NM_153813 ZFPM1
NM_153813
NM_177401 MIDN
NM_017553 INO80
NM_001144875 DOK3
NM_001079515 TBCE
NM_024334 TMEM43
NM_014757 MAML1
NM_020247 ADCK3
NM_018728 MYO5C
NM_018728
NM_001272004 EPC1
NM_001017973 P4HA2
NM_001257308 KIAA1024L
NM_001257308
NM_017519 ARID1B
NM_017519
insGCGc.1029_1030
insGCG
insAAp.A343del
insAA
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NM_017519
insGCGc.1029_1030
insGCG
insAAp.A343del
insAA
(+: 질병의 영향을 받음)(+: Affected by disease)
도 1a 및 도 1b는 코호트(SB162)의 구성원이 속한 가계도 및 TMEM43 변이를 확인한 과정을 나타낸다. dbSNP 데이터베이스, 대립 유전자 빈도, 및 유전 패턴에 기초한 필터링 과정 이후, 및 TMEM43에서 R372X의 변이가 이형접합체로 검출되었으며, 유전자의 변이를 선별하는 과정에서 확인된 변이의 수를 하기 표 3에 나타내었다. Figures 1a and 1b shows the process of identifying the family tree and TMEM43 mutation belonging to the members of the cohort (SB162). After filtering based on the dbSNP database, allele frequency, and genetic pattern, and in TMEM43, mutations in R372X were detected as heterozygotes, and the number of mutations identified in the process of selecting mutations in the genes is shown in Table 3 below.
상기 p.R372X 변이는 상염색체 우성으로 유전된 것으로 추정된다. 또한, 상기 p.R372X 변이는 정상 청력을 갖는 한국인 대조군의 염색체에서는 검출되지 않았다. The p.R372X mutation is believed to be inherited as an autosomal dominant. In addition, the p.R372X mutation was not detected in the chromosomes of the Korean control group with normal hearing.
3. 3. TMEM43의Of TMEM43 발현 위치(localization) 분석 Expression localization analysis
(3.1) 다양한 마우스조직에서의 (3.1) in various mouse tissues TMEM43TMEM43 발현 확인 Expression confirmation
129Sv/Ev 마우스를 펜토바르비탈 소듐(pentobarbital sodium)으로 마취하였다(50 mg/kg). 표적 인자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위하여, 제조사의 지시에 따라, TRIZOL®(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 및 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, USA)를 이용하여, 전체 달팽이관(cochlea)(P1), 심장(P120), 눈(P42), 뇌(P28), 신장(P28), 및 간(P28)에서 총 RNA를 추출하였다. 이어서, 올리고 dT 프라이머 및 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 TMEM43 및 Gapdh에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였으며, 이 때의 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 2분, 이어서, 95℃에서 20초, 55℃에서 10초, 및 70℃에서 10초로 35회, 72℃에서 5분. 증폭 산물(15 ㎕)를 2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고 에티디움 브로미드(ethidium bromide)로 가시화하였다. 이 때, TMEM43 및 Gapdh 특이적인 프라이머 서열은 다음과 같다: TMEM43 정방향 프라이머 : 5'-CTTCCTGGAACGGCTGAG-3' (서열번호 3) 및 TMEM43 역방향 프라이머 5'-CACCAGCCTTCCTTCATTCT-3' (서열번호 4), Gapdh 정방향 프라이머: 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3') (서열번호 5) 및 Gapdh 역방향 프라이머: 5'-CACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3' (서열번호 6).129Sv / Ev mice were anesthetized with pentobarbital sodium (50 mg / kg). To determine the mRNA expression level of the target factor, the whole cochlea (P1), using TRIZOL ® (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) and RNeasy kit (Qiagen, Valencia, USA), according to the manufacturer's instructions ), Total RNA was extracted from the heart (P120), eyes (P42), brain (P28), kidney (P28), and liver (P28). The cDNA was then synthesized using oligo dT primers and extracted RNA. Using the synthesized cDNA and primer sets specific for TMEM43 and Gapdh, polymerase chain reaction (PCR) was performed, and PCR conditions were as follows: 2 minutes at 95 ° C, followed by 95 20 seconds at < RTI ID = 0.0 > C, < / RTI > Amplification products (15 μl) were electrophoresed on 2% agarose gel and visualized with ethidium bromide. At this time, the TMEM43 and Gapdh specific primer sequences are as follows: TMEM43 forward primer: 5'-CTTCCTGGAACGGCTGAG-3 '(SEQ ID NO: 3) and TMEM43 reverse primer 5'-CACCAGCCTTCCTTCATTCT-3' (SEQ ID NO: 4), Gapdh forward Primer: 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ') (SEQ ID NO: 5) and Gapdh reverse primer: 5'-CACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 6).
도 2는 마우스에서 TMEM43이 발현되는 기관을 확인한 결과이다. 도 2에 나타난 바와 같이, TMEM43은 내이 내 달팽이관에서 발현되는 것을 알 수 있다.Figure 2 shows the results of confirming the organ expressing TMEM43 in the mouse. As shown in Figure 2, it can be seen that TMEM43 is expressed in the inner cochlea.
(3.2) 마우스 내이에서 (3.2) In the mouse inner ear TMEM43TMEM43 발현 분석 Expression analysis
마우스 TMEM43의 NH2-말단에 대하여 지시되는 래빗 폴리클로날 항혈청(AbClon)을 제작하였다. 펩티드 서열은 NH2-SRKEHVKVTSE-COOH (서열번호 7)와 같다. 1차 항체는 래빗 항-TMEM43 모노클로날 항체(1:500, Abcam, Ab184164), 래빗 항-TMEM43 폴리클로날 항체(1:100, Novus, Cat#NBP1-84132, Littleton, USA 80120), 마우스 항-mCherry 모노클로날(1:500, Abcam, ab125096), 마우스 항-칼레티닌(calretinin) 모노클로날 항체(1:500, Millipore, MAB1568), 고트 폴리클로날 항-Na+, K+-ATPase-α3 항체(NKA, 1:250, Santa Cruz, SC-16052), 및 마우스 모노클로날 항-CtBP2 항체(1:500, BD Transduction Laboratories, 612044)를 사용하였다. 이차 항체는 돈키 또는 고트(life technologies)에서 제작된 것을 1:1000으로 희석하여 사용하였다. Rabbit polyclonal antiserum (AbClon) was directed to the NH 2 -terminus of mouse TMEM43 . Peptide sequence is the same as NH 2 -SRKEHVKVTSE-COOH (SEQ ID NO: 7). Primary antibodies are rabbit anti-TMEM43 monoclonal antibody (1: 500, Abcam, Ab184164), rabbit anti-TMEM43 polyclonal antibody (1: 100, Novus, Cat # NBP1-84132, Littleton, USA 80120), mouse Anti-mCherry monoclonal (1: 500, Abcam, ab125096), mouse anti-calretinin monoclonal antibody (1: 500, Millipore, MAB1568), goth polyclonal anti-Na + , K + - ATPase-α3 antibody (NKA, 1: 250, Santa Cruz, SC-16052), and mouse monoclonal anti-CtBP2 antibody (1: 500, BD Transduction Laboratories, 612044) were used. Secondary antibodies were used at 1: 1000 dilution made from donkey or goth (life technologies).
마우스 내이(C57BL/6, P9 및 P15)를 차가운 4%의 파라포름알데히드에서 약 1시간 동안 고정하였다. 달팽이관(Cochlear turns)을 절개하고 5%의 고트 혈청 및 0.25%의 트리톤(Triton)X-100를 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함하는 블로킹/투과 버퍼(blocking/permeabilizing buffer)에서 인큐베이션하여, 조직 샘플을 제작하였다. 이어서, 상기 조직 샘플을 1차 항체와 4 oC에서 밤새 인큐베이션하고, 3회 세척한 후, 형광 물질이 결합된 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 조직 샘플을 블로킹/투과 버퍼로 세척하고, 인산염 완충 식염수로 세척하였다. Fluorsave 시약(Calbiochem, 345789)을 이용하여 상기 조직 샘플을 유리 슬라이드에 마운팅하고, 커버슬립(coverslip)으로 덮은 뒤, 현미경 샘플을 제작하였다. 도립 형광(epifluorescence) 현미경 및 공초점 레이저 주사(a confocal laser scanning) 현미경(LSM710, Zeiss)을 사용하여 현미경 샘플에서 이미지를 수득하였다. Mouse inner ear (C57BL / 6, P9 and P15) was fixed in cold 4% paraformaldehyde for about 1 hour. The tissue sample is incubated in a cochlear turns and incubated in a blocking / permeabilizing buffer containing phosphate buffered saline containing 5% goth serum and 0.25% Triton X-100. Produced. Subsequently, the tissue sample was separated from the primary antibody and 4 o Incubated at C overnight, washed three times and incubated with fluorescent secondary antibody for 1 hour at room temperature. The tissue sample was then washed with blocking / permeation buffer and with phosphate buffered saline. The tissue sample was mounted on a glass slide using Fluorsave reagent (Calbiochem, 345789), covered with coverslips, and microscopic samples were prepared. Images were obtained from microscope samples using an inverted fluorescence microscope and a confocal laser scanning microscope (LSM710, Zeiss).
도 3은 4 내지 5일령, 및 20일령 마우스의 내이에서 TMEM43이 발현되는 것을 확인한 결과이다. 도 3에 나타난 바와 같이, TMEM43은 내유모 세포 주변의 지지세포에서 발현되는 것을 알 수 있다. 도 4는 4일령, 15일령, 및 20일령 마우스의 내이에서 TMEM43의 발현 양상을 확인한 결과이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 마우스에서 TMEM43은 내이에서 발현되고, 시간이 경과하는 경우에도 내이 내 내유모 세포 주변의 지지세포에서 지속적으로 발현되는 것을 알 수 있다. 또한, TMEM43의 발현 양상은 자발적 활동의 양상과 일치하는 소견을 보였다 (미도시). 3 is a result confirming that TMEM43 is expressed in the inner ear of 4 to 5 days old and 20 days old mice. As shown in Figure 3, it can be seen that TMEM43 is expressed in the supporting cells around the inner hair cells. Figure 4 shows the results of confirming the expression of TMEM43 in the inner ear of 4, 15 and 20 days old mice. As shown in FIG. 4, in mice, TMEM43 is expressed in the inner ear, and even if time passes, it can be seen that it is continuously expressed in supporting cells around inner hair cells in the inner ear. In addition, the expression pattern of TMEM43 was consistent with that of spontaneous activity (not shown).
4. 4. TMEM43이TMEM43 결핍된 마우스 및 Mouse deficient and TMEM43의Of TMEM43 p. p. R372XR372X 변이를 갖는 형질전환 마우스(transgenic mouse) 제작 및 표현형 분석 Construction and Phenotypic Analysis of Mutant Transgenic Mouse
(4.1) (4.1) CRISPRCRISPR /Of Cas9Cas9 기술을 이용한 Using technology TMEM43이TMEM43 결핍된( Deficient ( TMEM43TMEM43 knockinknockin ) 마우스 및 ) Mouse and TMEM43의Of TMEM43 p. p. R372XR372X 변이를 갖는 마우스 제작 Making a mouse with mutation
TMEM43-R372X 넉-인(Knock-in)(C57BL/6J;129S-TMEM43tm1Cby) 마우스 모델을 크리스퍼(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: CRISPR) 방법을 이용하여 제작하였다. TMEM43-R372X Knock-in (C57BL / 6J; 129S- TMEM43tm1Cby ) mouse model was constructed using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) method.
도 5는 TMEM43의 p.R372X 변이를 갖는 형질전환된 동물을 제작하는 과정을 나타낸다. 상기 모델에서, TMEM43 단백질(유전자 ID: NM_028766)의 372 위치에서 아르기닌(Arginine: R)을 종결코돈으로 치환하였다. 오프 타겟 프로파일(off-target profile) 및 변이 위치까지의 거리를 기준으로, gRNA를 제작하였다. 변이 위치에 근접하게 위치한 두 gRNA 후보(TMEM43 gRNA1: 5’- TTAGAGCAGCCCACAGCGGTCGG -3’ (서열번호 8); TMEM43 gRNA2: 5’- CCGATTAGAGCAGCCCACAGCGG -3’ (서열번호 9))를 평가하였다. CCG는 PAM(Protospacer Adjacent Motif) 서열을 나타낸다.5 shows the process of making a transformed animal with a p.R372X variant of TMEM43. In this model, arginine (R) was substituted with a stop codon at position 372 of the TMEM43 protein (gene ID: NM_028766). Based on the off-target profile and distance to the mutation site, gRNAs were constructed. Two gRNA candidates located close to the mutation site ( TMEM43 gRNA1: 5′-TTAGAGCAGCCCACAGCGGT CGG- 3 ′ (SEQ ID NO: 8); TMEM43 gRNA2: 5'- CCGATTAGAGCAGCCCACAG CGG- 3 '(SEQ ID NO: 9)) was evaluated. CCG stands for Protospacer Adjacent Motif (PAM) sequence.
gRNA 활성을 측정하기 위하여, 제조사의 지시에 따라, SURVEYOR 변이 검출 키트(IDT)를 사용하여, SURVEYOR 분석을 수행하였다. 확인된 gRNAs에 근거하여, 단일 가닥 올리고 데옥시 뉴클레오티드 공여체(single stranded oligodeoxynucleotide donor: ssODN)를 설계하고 합성하였다. 160bp의 공여체 DNA는 TMEM43 유전자의 1114 위치에 상응하는 엑손 12에 도입된 변이(C->T)에 인접(flanking)하는 두 상동성 암(arm)을 포함한다. 또한, 수선된 게놈이 Cas9 복합체에 의해 재표적화되는 것을 방지하기 위해, 두번째 종결 코돈에 상응하는 추가적인 변이를 도입하였다. 62개의 C57BL/6J 배아에 ssODN 공여체, gRNA 전사 TMEM43, 및 Cas9 mRNA를 포함하는 CRISPR 칵테일을 세포질을 통해 주입하였다. 62개의 배아 중에서 49개의 배아를 스크리닝하여 선별하고, 2 마리의 CD1 마우스에 이식하였다. 모든 암컷은 임신하여, 9마리의 새끼 F0을 출산하였다. 암컷 F0를 야생형 수컷 C57BL/6J 마우스와 교배시키고, F1를 얻은 후, 생식세포의 유전전달 (germline transmission) 여부를 확인하였다. 모든 마우스에서 대하여, 표적 위치에서 점 돌연변이(point mutation)가 존재하는지 여부를 PCR 및 시퀀싱을 통하여 분석하였다. 유전형을 확인하기 위하여, DNeasy® 혈액 & 조직 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 약 1mm 내지 약 2mm의 꼬리에서 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA(5 ㎕), 25 mM의 MgCl2,2 mM의 dNTPs, 10 pM의 프라이머, 및 0.02 U의 TOYOBO KOD Hot Start DNA 중합효소(Invitrogen/Life Technologies, Billerica, Massachusetts, USA)를 이용하여, PCR을 수행하였으며, 이 때의 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 2분, 이어서, 95℃에서 20초, 59℃에서 10초, 및 72℃에서 10초로 35회, 72℃에서 10분. 이 때, 넉-인 대립인자의 존재를 확인하기 위한, 프라이머 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머 5'-ccacagTGGACTGGTTTCCT-3' (서열번호 10), 및 역방향 프라이머 5'-GGCTTCACTCCAGCTTTTTG-3' (서열번호 11). 상기 프라이머 서열에 의한 증폭 산물의 크기는 약 213bp이다. 증폭된 산물은 생거 시퀀싱으로 재확인하였다(Macrogen Inc., Seoul, KOR).To measure gRNA activity, a SURVEYOR assay was performed using the SURVEYOR Mutation Detection Kit (IDT) according to the manufacturer's instructions. Based on the identified gRNAs, single stranded oligodeoxynucleotide donors (ssODNs) were designed and synthesized. The 160 bp donor DNA contains two homologous arms flanking the mutation introduced at
(4.2) (4.2) TMEM43의Of TMEM43 p. p. R372XR372X 변이를 갖는 형질전환 마우스 Transgenic Mice with Mutations SEMSEM 분석 analysis
2, 7 및 13개월령의 TMEM43+/+ 및 TMEM43+/ tm1Cby 마우스에서 달팽이관(cochleae)을 분리하고, 2.5%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 함유하는 0.1 M의 소듐 카코딜레이트 버퍼(sodium cacodylate buffer)(pH 7.4)에 희석된 2%의 파라포름알데히드 용액에서, 상온에서 1시간 동안 고정시켰다. 골 낭(bony capsule)을 절개하고, 외측벽(lateral wall), 라이스너 막(Reissner's membrane) 및 덮개막(tectorial membrane)를 제거하였다. 코르티 기관을 절개하고, 0.1 M의 소듐 카코디레이트(sodium cacodylate) 버퍼(pH 7.4), 2mM의 칼슘 클로리드, 2.5%의 글루타르알데히드 및 3.5%의 수크로스를 함유하는 용액에서, 4℃에서 밤새 고정시켰다. 조직을 고정시킨 후, 오스뮴 테트록시드-티오카보하이드라지드(osmium tetroxide - thiocarbohydrazide) 방법을 이용하여 조직 샘플을 제작하고 주사 전자 현미경으로 관찰하였다. 이어서, 상기 조직 샘플을 농도 구배를 갖는 에탄올 용액에서 탈수(dehydrate) 시키고, 건조시키고, 스퍼터 코팅 장치(sputter coater)를 사용하여 백금 코팅하였다(E1030; Hitachi, Tokyo, Japan). 코르티 기관의 표면을 10 또는 15 kV로 작동하는 냉전계방출 주사 전사 현미경(cold-field emission SEM)(SU8220, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 캡쳐하였다. 현미경 이미지는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 이용하여 수득하였다. TMEM43 + / + and
도 6은 2, 7, 및 13 개월령 TMEM43+/+ 및 TMEM43+/ tm1Cby 마우스 유모 세포의 세망판(reticular lamina)에서 내부 경계 세포(inner border cell) 및 경계 세포(border cell)를 나타낸 주사 전사 현미경 이미지이다. 여기서, 녹색 및 연녹색은 내부 경계 세포를 나타내고, 주황색 및 노랑색은 각각 경계 세포를 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, TMEM43+/ tm1Cby 마우스의 내부 경계 세포 및 경계 세포의 면적이 야생형 마우스의 내부 경계 세포 및 경계 세포의 면적에 비하여 감소되어 있음을 알 수 있다. 내부 경계 세포 및 경계 세포가 수축 및 감소됨에 따라, 청신경 전위가 억제되어 있는 것으로 예상된다.6 shows TMEM43 + / + and TMEM43 + / tm1Cby at 2, 7, and 13 months of age. Scanning transcription microscopy images showing inner border cells and border cells in the retinal lamina of mouse hair cells. Here, green and light green represent inner border cells, and orange and yellow represent border cells, respectively. As shown in FIG. 6, TMEM43 + / tm1Cby It can be seen that the area of the inner border cells and border cells of the mouse is reduced compared to the area of the border cells and border cells of the wild-type mouse. As the inner border cells and border cells shrink and decrease, it is expected that auditory nerve translocation is suppressed.
(4.3) (4.3) TMEM43의Of TMEM43 p. p. R372XR372X 변이를 갖는 형질전환 마우스 Transgenic Mice with Mutations ABRABR 분석 analysis
ABR는 무향실(anechoic room)에서 수행하였다. 마우스에 레보테프로마진 클로히드레이트(levomepromazin chlorhydrate) 0.1 mg을 투여하고, 케타민 클로히드레이트(ketamine chlorhydrate) 약 3.5mg를 15g의 마우스에 복강주사(intraperitoneal injection)로 투여하여 마취시켰다. ABR은 4 내지 32 kHz의 범위에서 교정된 짧은 톤 버스트(short tone burst)에 대한 응답을 수집하여 분석하였다. 뇌전도(electroencephalogram)는 표준 디지털 평균 시스템(standard digital averaging system)을 이용하여 정수리(vertex)와 동측성 꼭지돌기(ipsilateral mastoid)의 피하에서 스테인레스 스틸 전극을 통해 기록하였다. 모든 사운드 레벨에서, 톤 버스트에 대한 500 응답을 동기적 평균화(synchronous averaging)하였다. 임계값보다 큰 ABR은 규칙적인 간격의 파동으로 구성되었다 (I 내지 IV). 톤 버스트 수준은 10dB 내지 120dB SPL 피크 등가(peak-equivalent)에서 변화하는 반면, ABR 임계값은 적어도 하나의 반복가능한 파동(wave) IV 40.3 mV를 생성하는데 필요한 최소 자극 수준으로 수득하였다. 도 7은 6 및 9개월령의 TMEM43+/+ 및 TMEM43+/tm1Cby 마우스에서 4, 8, 16, 및 32 kHz에 대한 평균 ABR 임계값을 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, TMEM43+/ tm1Cby 마우스는 ABR 임계값이 야생형의 ABR 임계값에 비하여 높은 것을 알 수 있다. ABR was performed in an anechoic room. Mice were dosed with levomepromazin chlorhydrate (0.1 mg), and about 3.5 mg of ketamine chlorhydrate (15 mg) was anesthetized by intraperitoneal injection. The ABR collected and analyzed the response to a short tone burst calibrated in the range of 4 to 32 kHz. Electroencephalograms were recorded via stainless steel electrodes subcutaneously in the vertex and ipsilateral mastoids using a standard digital averaging system. At all sound levels, 500 responses to tone bursts were synchronous averaging. ABRs above the threshold consisted of regular intervals of waves (I to IV). The tone burst level varied from 10 dB to 120 dB SPL peak-equivalent, while the ABR threshold was obtained with the minimum stimulus level required to produce at least one repeatable wave IV 40.3 mV. 7 shows mean ABR thresholds for 4, 8, 16, and 32 kHz in TMEM43 + / + and TMEM43 + / tm1Cby mice at 6 and 9 months of age. As shown in FIG. 7, TMEM43 + / tm1Cby Mice can be seen that the ABR threshold is higher than the wild-type ABR threshold.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Marker TMEM43 for diagnosing sensorineural hearing loss and uses thereof <130> PN117550 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Asn Tyr Ser Ser Thr Ser Thr Arg Arg Glu His Val Lys 1 5 10 15 Val Lys Thr Ser Ser Gln Pro Gly Phe Leu Glu Arg Leu Ser Glu Thr 20 25 30 Ser Gly Gly Met Phe Val Gly Leu Met Ala Phe Leu Leu Ser Phe Tyr 35 40 45 Leu Ile Phe Thr Asn Glu Gly Arg Ala Leu Lys Thr Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Ala Glu Gly Leu Ser Leu Val Val Ser Pro Asp Ser Ile His Ser Val 65 70 75 80 Ala Pro Glu Asn Glu Gly Arg Leu Val His Ile Ile Gly Ala Leu Arg 85 90 95 Thr Ser Lys Leu Leu Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Val His Leu Pro Ala 100 105 110 Val Lys Leu Arg Arg His Val Glu Met Tyr Gln Trp Val Glu Thr Glu 115 120 125 Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Glu Asp Gly Gln Val Lys Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Tyr Ser Tyr Asn Thr Glu Trp Arg Ser Glu Ile Ile Asn Ser Lys Asn 145 150 155 160 Phe Asp Arg Glu Ile Gly His Lys Asn Pro Ser Ala Met Ala Val Glu 165 170 175 Ser Phe Met Ala Thr Ala Pro Phe Val Gln Ile Gly Arg Phe Phe Leu 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Ile Asp Lys Val Asp Asn Phe Lys Ser Leu Ser Leu 195 200 205 Ser Lys Leu Glu Asp Pro His Val Asp Ile Ile Arg Arg Gly Asp Phe 210 215 220 Phe Tyr His Ser Glu Asn Pro Lys Tyr Pro Glu Val Gly Asp Leu Arg 225 230 235 240 Val Ser Phe Ser Tyr Ala Gly Leu Ser Gly Asp Asp Pro Asp Leu Gly 245 250 255 Pro Ala His Val Val Thr Val Ile Ala Arg Gln Arg Gly Asp Gln Leu 260 265 270 Val Pro Phe Ser Thr Lys Ser Gly Asp Thr Leu Leu Leu Leu His His 275 280 285 Gly Asp Phe Ser Ala Glu Glu Val Phe His Arg Glu Leu Arg Ser Asn 290 295 300 Ser Met Lys Thr Trp Gly Leu Arg Ala Ala Gly Trp Met Ala Met Phe 305 310 315 320 Met Gly Leu Asn Leu Met Thr Arg Ile Leu Tyr Thr Leu Val Asp Trp 325 330 335 Phe Pro Val Phe Arg Asp Leu Val Asn Ile Gly Leu Lys Ala Phe Ala 340 345 350 Phe Cys Val Ala Thr Ser Leu Thr Leu Leu Thr Val Ala Ala Gly Trp 355 360 365 Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Trp Ala Leu Leu Ile Ala Gly Leu Ala Leu 370 375 380 Val Pro Ile Leu Val Ala Arg Thr Arg Val Pro Ala Lys Lys Leu Glu 385 390 395 400 <210> 2 <211> 1203 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 atggccgcga attattccag taccagtacc cggagagaac atgtcaaagt taaaaccagc 60 tcccagccag gcttcctgga acggctgagc gagacctcgg gtgggatgtt tgtggggctc 120 atggccttcc tgctctcctt ctacctaatt ttcaccaatg agggccgcgc attgaagacg 180 gcaacctcat tggctgaggg gctctcgctt gtggtgtctc ccgacagcat ccacagtgtg 240 gctccggaga atgaaggaag gctggtgcac atcattggcg ccttacggac atccaagctt 300 ttgtctgatc caaactatgg ggtccatctt ccggctgtga aactgcggag gcacgtggag 360 atgtaccaat gggtagaaac tgaggagtcc agggagtaca ccgaggatgg gcaggtgaag 420 aaggagacga ggtattccta caacactgaa tggaggtcag aaatcatcaa cagcaaaaac 480 ttcgaccgag agattggcca caaaaacccc agtgccatgg cagtggagtc attcatggca 540 acagccccct ttgtccaaat tggcaggttt ttcctctcgt caggcctcat cgacaaagtc 600 gacaacttca agtccctgag cctatccaag ctggaggacc ctcatgtgga catcattcgc 660 cgtggagact ttttctacca cagcgaaaat cccaagtatc cagaggtggg agacttgcgt 720 gtctcctttt cctatgctgg actgagcggc gatgaccctg acctgggccc agctcacgtg 780 gtcactgtga ttgcccggca gcggggtgac cagctagtcc cattctccac caagtctggg 840 gataccttac tgctcctgca ccacggggac ttctcagcag aggaggtgtt tcatagagaa 900 ctaaggagca actccatgaa gacctggggc ctgcgggcag ctggctggat ggccatgttc 960 atgggcctca accttatgac acggatcctc tacaccttgg tggactggtt tcctgttttc 1020 cgagacctgg tcaacattgg cctgaaagcc tttgccttct gtgtggccac ctcgctgacc 1080 ctgctgaccg tggcggctgg ctggctcttc taccgacccc tgtgggccct cctcattgcc 1140 ggcctggccc ttgtgcccat ccttgttgct cggacacggg tgccagccaa aaagttggag 1200 tga 1203 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM43 F-primer <400> 3 cttcctggaa cggctgag 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM43 R-primer <400> 4 caccagcctt ccttcattct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh F-primer <400> 5 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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UNIVERSITY HOSPITAL <120> Marker TMEM43 for diagnosing sensorineural hearing loss and uses about <130> PN117550 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Asn Tyr Ser Ser Thr Ser Thr Arg Arg Glu His Val Lys 1 5 10 15 Val Lys Thr Ser Ser Gln Pro Gly Phe Leu Glu Arg Leu Ser Glu Thr 20 25 30 Ser Gly Gly Met Phe Val Gly Leu Met Ala Phe Leu Leu Ser Phe Tyr 35 40 45 Leu Ile Phe Thr Asn Glu Gly Arg Ala Leu Lys Thr Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Ala Glu Gly Leu Ser Leu Val Val Ser Pro Asp Ser Ile His Ser Val 65 70 75 80 Ala Pro Glu Asn Glu Gly Arg Leu Val His Ile Ile Gly Ala Leu Arg 85 90 95 Thr Ser Lys Leu Leu Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Val His Leu Pro Ala 100 105 110 Val Lys Leu Arg Arg His Val Glu Met Tyr Gln Trp Val Glu Thr Glu 115 120 125 Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Glu Asp Gly Gln Val Lys Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Tyr Ser Tyr Asn Thr Glu Trp Arg Ser Glu Ile Ile Asn Ser Lys Asn 145 150 155 160 Phe Asp Arg Glu Ile Gly His Lys Asn Pro Ser Ala Met Ala Val Glu 165 170 175 Ser Phe Met Ala Thr Ala Pro Phe Val Gln Ile Gly Arg Phe Phe Leu 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Ile Asp Lys Val Asp Asn Phe Lys Ser Leu Ser Leu 195 200 205 Ser Lys Leu Glu Asp Pro His Val Asp Ile Ile Arg Arg Gly Asp Phe 210 215 220 Phe Tyr His Ser Glu Asn Pro Lys Tyr Pro Glu Val Gly Asp Leu Arg 225 230 235 240 Val Ser Phe Ser Tyr Ala Gly Leu Ser Gly Asp Asp Pro Asp Leu Gly 245 250 255 Pro Ala His Val Val Thr Val Ile Ala Arg Gln Arg Gly Asp Gln Leu 260 265 270 Val Pro Phe Ser Thr Lys Ser Gly Asp Thr Leu Leu Leu Leu His His 275 280 285 Gly Asp Phe Ser Ala Glu Glu Val Phe His Arg Glu Leu Arg Ser Asn 290 295 300 Ser Met Lys Thr Trp Gly Leu Arg Ala Ala Gly Trp Met Ala Met Phe 305 310 315 320 Met Gly Leu Asn Leu Met Thr Arg Ile Leu Tyr Thr Leu Val Asp Trp 325 330 335 Phe Pro Val Phe Arg Asp Leu Val Asn Ile Gly Leu Lys Ala Phe Ala 340 345 350 Phe Cys Val Ala Thr Ser Leu Thr Leu Leu Thr Val Ala Ala Gly Trp 355 360 365 Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Trp Ala Leu Leu Ile Ala Gly Leu Ala Leu 370 375 380 Val Pro Ile Leu Val Ala Arg Thr Arg Val Pro Ala Lys Lys Leu Glu 385 390 395 400 <210> 2 <211> 1203 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 atggccgcga attattccag taccagtacc cggagagaac atgtcaaagt taaaaccagc 60 tcccagccag gcttcctgga acggctgagc gagacctcgg gtgggatgtt tgtggggctc 120 atggccttcc tgctctcctt ctacctaatt ttcaccaatg agggccgcgc attgaagacg 180 gcaacctcat tggctgaggg gctctcgctt gtggtgtctc ccgacagcat ccacagtgtg 240 gctccggaga atgaaggaag gctggtgcac atcattggcg ccttacggac atccaagctt 300 ttgtctgatc caaactatgg ggtccatctt ccggctgtga aactgcggag gcacgtggag 360 atgtaccaat gggtagaaac tgaggagtcc agggagtaca ccgaggatgg gcaggtgaag 420 aaggagacga ggtattccta caacactgaa tggaggtcag aaatcatcaa cagcaaaaac 480 ttcgaccgag agattggcca caaaaacccc agtgccatgg cagtggagtc attcatggca 540 acagccccct ttgtccaaat tggcaggttt ttcctctcgt caggcctcat cgacaaagtc 600 gacaacttca agtccctgag cctatccaag ctggaggacc ctcatgtgga catcattcgc 660 cgtggagact ttttctacca cagcgaaaat cccaagtatc cagaggtggg agacttgcgt 720 gtctcctttt cctatgctgg actgagcggc gatgaccctg acctgggccc agctcacgtg 780 gtcactgtga ttgcccggca gcggggtgac cagctagtcc cattctccac caagtctggg 840 gataccttac tgctcctgca ccacggggac ttctcagcag aggaggtgtt tcatagagaa 900 ctaaggagca actccatgaa gacctggggc ctgcgggcag ctggctggat ggccatgttc 960 atgggcctca accttatgac acggatcctc tacaccttgg tggactggtt tcctgttttc 1020 cgagacctgg tcaacattgg cctgaaagcc tttgccttct gtgtggccac ctcgctgacc 1080 ctgctgaccg tggcggctgg ctggctcttc taccgacccc tgtgggccct cctcattgcc 1140 ggcctggccc ttgtgcccat ccttgttgct cggacacggg tgccagccaa aaagttggag 1200 tga 1203 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM43 F-primer <400> 3 cttcctggaa cggctgag 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM43 R-primer <400> 4 caccagcctt ccttcattct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh F-primer <400> 5 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh R-primer <400> 6 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Claims (21)
상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하고, 상기 변이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T인, 감각신경성 난청 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법.Identifying the nucleotide sequence of genomic DNA isolated from the individual; And
Comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA with a standard nucleotide sequence to identify a mutation in the genomic DNA, wherein the mutation is c.C1114T in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 for the diagnosis of sensorineural hearing loss disease A method for detecting mutations in genomic DNA to provide information.
상기 유전체 DNA의 확인된 뉴클레오티드 서열을 표준 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 상기 유전체 DNA의 변이를 확인하는 단계를 포함하고, 상기 변이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 c.C1114T인, 감각신경성 난청 환자의 와우 이식수술에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여 유전체 DNA의 변이를 검출하는 방법.Identifying the nucleotide sequence of genomic DNA isolated from the individual; And
Comparing the identified nucleotide sequence of the genomic DNA to a standard nucleotide sequence to identify a mutation of the genomic DNA, wherein the mutation is c. C1114T in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, wow of a sensorineural hearing loss patient A method of detecting mutations in genomic DNA to provide information for predicting prognosis for transplant surgery.
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