KR102041144B1 - A composition for refolding recombinant zika virus ediii protein, and a refolding method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 대장균 유래 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질의 가용화를 위한 조성물 및 이를 이용한 지카 재조합 단백질 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 ZIKV-EDIII 단백질의 내포체 분리 수득하여, 본 발명의 가용화 조성물을 통하여 안정적인 단백질 활성을 가지는 재조합 항원을 생산하는 방법이다. 생산된 ZIKV-EDIII 재조합 단백질 항원은 신속진단키트 테스트 적용, 마우스 면역시험을 통하여 지카바이러스 감염에 대한 효능이 우수한 서브유닛 백신으로서 가능성을 제시한다. The present invention relates to a composition for solubilizing E. coli-derived Zika virus envelope protein domain III recombinant protein, and to a method for producing Zika recombinant protein using the same. More specifically, the solubilized composition of the present invention is obtained by obtaining an inclusion body separation of ZIKV-EDIII protein. It is a method for producing a recombinant antigen having a stable protein activity through. The produced ZIKV-EDIII recombinant protein antigen shows potential as a subunit vaccine with high efficacy against Zika virus infection through rapid diagnostic kit test application and mouse immunoassay.
감염 또는 질병을 유발하는 마커 단백질을 진단 목적의 원료로 사용하는데 있어 자연 상태의 물질을 대량 공급하는 데에는 어려움이 있기 때문에 주로 유전자 재조합 기술을 사용하게 된다. 외래 단백질을 재조합을 통해 발현하는 시스템은 전통적으로 박테리아, 이스트, 곤충 또는 포유류의 세포, 재조합 식물이나 동물 등에 의한 것으로 분류할 수 있는데, 그 중 대장균은 손쉽게 다룰 수 있으며 유지 및 실험이 용이하다는 장점이 있다(Rosano G. L. 등, Front Microbiol, 5:172, 2014). 그러나, 대장균에서의 재조합 단백질 제조 과정에서는 때때로 타깃 단백질의 소수성, 이황화결합, 또는 독성 등의 원인으로 인해 불안정한 구조의 단백질이 비가역적 반응에 의해 고농도로 얽히는 불용성의 내포체가 형성된다. 내포체로 발현되는 경우, 액상의 재조합 단백질 형태로 이용할 수 없기 때문에 발현 시에 가용성 단백질로 바꾸어 발현 하거나, 또는 내포체 형태로 발현 후 가용화하는 것이 필수적이다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005). The use of marker proteins that cause infections or diseases as a raw material for diagnostic purposes makes it difficult to supply large quantities of natural substances. Recombinant systems expressing foreign proteins have traditionally been classified as bacterial, yeast, insect or mammalian cells, recombinant plants or animals, among which E. coli can be easily handled and maintained and tested. (Rosano GL et al., Front Microbiol, 5: 172, 2014). However, in the process of producing recombinant proteins in Escherichia coli, insoluble inclusion bodies in which unstable structures are entangled in high concentration by irreversible reaction are sometimes formed due to hydrophobicity, disulfide bond, or toxicity of the target protein. When expressed in inclusion bodies, it is not possible to use them in the form of liquid recombinant proteins, so it is essential to convert them into soluble proteins at the time of expression, or to solubilize them after expression in inclusion bodies (Singh SM et al., J Biosci Bioeng, 99 (4). ): 303-10, 2005).
위와 같은 문제를 해결하기 위한 방법 중 가용성 단백질로 발현하는 방법은 단백질 총합성량을 발현 온도나 프로모터, 배지, 발현 유도물질의 농도 등을 이용해 감소시키는 방법, 샤페론을 이용하는 방법, 분비 형태 또는 세포질(cytoplasm)로 발현하는 방법, 이황화결합 발현 전용 균주를 사용하는 방법, 표지단백질(tagging protein)을 이용하는 방법, 융합 형태의 단백질로 발현하는 방법 등이 포함되며, 내포체를 가용화 하는 방법으로는 화학성분을 이용하는 방법 등이 있다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005; Yamaguchi H. 등, Biomolecules, 4(1):235-51, 2014; Ghosh S. 등, Biotechniques, 37(3):418, 420, 422-3, 2004; Singh P. 등, PLoS One, 8(5):e63442, 2013). Among the methods for solving the above problems, the method of expressing the soluble protein is to reduce the total protein synthesis using the expression temperature, the concentration of the promoter, the medium, the expression inducer, etc., the method using chaperone, the secreted form or the cytoplasm (cytoplasm) ), A method of using a disulfide bond expression strain, a method of using a tagging protein, a method of expressing as a fusion protein, and the method of solubilizing the inclusion body includes. (Singh SM et al., J Biosci Bioeng, 99 (4): 303-10, 2005; Yamaguchi H. et al., Biomolecules, 4 (1): 235-51, 2014; Ghosh S. et al., Biotechniques, 37 (3): 418, 420, 422-3, 2004; Singh P. et al., PLoS One, 8 (5): e63442, 2013).
이러한 방법들 중 내포체를 가용화 하기 위해 화학성분을 이용하는 방법은 6M 이상의 우레아 또는 구아니디늄클로라이드 등의 카오트로픽제에 완충용액 성분을 포함한 조성으로 내포체를 변성하는 과정, 용액의 조성에 있어 각종 완충용액, 응집 방지 물질, 구조 안정화 물질, 계면활성제, 염, 킬레이트제, 산화환원제, 양이온성 물질 등의 조합으로 다양하게 구성될 수 있는 가용화 과정을 포함한다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005; Yamaguchi H. 등, Biomolecules, 4(1):235-51, 2014). Among these methods, the method of using chemical components to solubilize the inclusion body is to modify the inclusion body in a composition containing a buffer solution in a chaotropic agent such as urea or guanidinium chloride of 6M or more, and in various compositions of the solution. Solubilization processes that can be variously composed of a combination of a buffer solution, an anti-agglomerating substance, a structure stabilizing substance, a surfactant, a salt, a chelating agent, a redox agent, a cationic substance, and the like (Singh SM et al., J Biosci Bioeng, 99 (4): 303-10, 2005; Yamaguchi H. et al., Biomolecules, 4 (1): 235-51, 2014).
지카바이러스 1947년 우간다 지카 숲(ZIKA forest)의 히말라야 원숭이에서 처음 발견되었고, 1952년 나이지리아에서 인간에게 처음 감염된 것으로 기록되고 있다. 아메리카에서 주요 전염병으로 야기되고 있으며, 2015년 이래 최소 84 국가와 지역으로 퍼져 세계적으로 확산되어 문제시 되고 있다. 2013년 남태평양의 폴리네시아에서 뎅기열을 수반한 전염병이 크게 나타나게 되고, 이는 나중에 south pacific까지 퍼지게 되어 2015년 초 브라질 18개주에서 발생한 후 콜롬비아 등 중앙아메리카 및 북아메리카까지 자생적으로 전염되었다. Zika Virus First discovered in the rhesus monkeys of the ZIKA forest in Uganda in 1947, and recorded as the first human infection in Nigeria in 1952. It is a major epidemic in the Americas, and has spread to at least 84 countries and regions since 2015 and has been a global problem. In 2013, there was a significant outbreak of dengue-borne diseases in Polynesia in the South Pacific, which later spread to the south pacific, occurring in 18 states in Brazil in early 2015, and then spontaneously to Central and North America, including Colombia.
지카바이러스 감염시, 감염자의 80%는 무증상이지만, 관절통, 발열, 오한, 피로, 근육통, 혈뇨 등이 지속되다가 회복된다. 심한 경우에 길렝-바레(Guillain-Barre) 증후군, 횡격막 척수염, 뇌염, 뇌수막염, 말초 안면 마비와 같은 심각한 신경장애를 초래할 수 있으며, 임신 중 감염시, 소두증을 포함한 선천성 장애와 관련있다(Musso D 등, Clin Microbiol, 29:487-524,2016, Zanluca C 등, Microbes Infect 18:395-301,2016). 특히, 임신초기에 지카바이러스에 감염시, 소두증(microcephaly)을 동반할 위험이 50%이상 상승하며, 실제 소두증 신생아가 태어난 것으로 확인되며, 브라질에서는 2015년 10월에서 2016년 4월 사이 7015 소두증 증례를 보고하였고 이중 1113건의 지카바이러스에 의한 소두증이 확인되었다(Zanluca C 등, 110:569-572, 2015). In Zika virus infection, 80% of those infected are asymptomatic, but they continue to recover from joint pain, fever, chills, fatigue, muscle pain, and hematuria. In severe cases, it can lead to serious neurological disorders such as Guillain-Barre syndrome, diaphragmatic myelitis, encephalitis, meningitis, and peripheral facial palsy, and are associated with congenital disorders including microcephaly during pregnancy (Musso D et al. , Clin Microbiol, 29: 487-524,2016, Zanluca C et al., Microbes Infect 18: 395-301,2016). In particular, when Zika virus is infected in early pregnancy, the risk of microcephaly is increased by more than 50%, and it is confirmed that newborn microcephaly is born, and in Brazil, 7015 microcephaly between October 2015 and April 2016. Among them, 1113 cases of microcephaly caused by Zika virus were identified (Zanluca C et al., 110: 569-572, 2015).
지카바이러스는 크게 아시아계열과 아프리카계열 총 2가지로 나누어지며, 2015년초 전 세계적으로 대두되었던 브라질 및 중앙아메리카, 카리브해 근처에 나타난 지카바이러스는 아시아 계열의 바이러스로 확인되었다. 지카바이러스는 양성-센스, 단일가닥 RNA 바이러스로 플라비바이러스속, 플라비바이러스과에 속하며, 뎅기, 황열, 웨스트나일 등이 있다. 지카바이러스 구조는 3개의 구조적 단백질, 캡시드, Precursor membrane(prM), envelope(E)으로 구성되며, 7개의 비구조적 단백질 NS1, NS2, NS3, NS4, NS5로 이루어져 있다(Pierson TC 등, Fields virology, 747-794, 2013). 외피 당단백질은 EDI, EDII, EDIII 3개의 외부도메인으로 구성되며, 구조적으로 중심 아미노 말단도메인을 EDI, 이량체화 도메인 EDII, 카복시말단 Ig 유사도메인은 EDIII이다. 도메인 EDI 도메인 EDI (1-49; 136-195; 286-302 aa) 및 EDII는 연속적으로 인접하지 않으며, 가용성 힌지 영역 (EDI / II) 인 반면, EDIII (303-403aa)는 연속적인 도메인은 EDI에서 확장된다. 외피당단백질은 바이러스 어셈블리, cellular receptor 부착바이러스 entry와 관련된 후속 막 융합과 관련되어있다(Lazer HM, 등, J.Virol, 90:4864-75,2016). 또한, 외피 당단백질은 주요 항체반응의 주요타깃이며, 도메인 EDIII는 지카바이러스 중화반응에 특이적인 항체를 가지고 있어 강력한 항체반응을 유도하여 방어면역 가능하다.Zika virus is divided into two categories: Asian and African. Zika virus, which emerged around Brazil, Central America, and the Caribbean, which emerged worldwide in early 2015, was identified as an Asian virus. Zika virus is a positive-sense, single-stranded RNA virus belonging to the genus Flavivirus, Flavivirus family, dengue, yellow fever, West Nile. Zikavirus structure consists of three structural proteins, a capsid, a Precursor membrane (prM), and an envelope (E) and consists of seven nonstructural proteins NS1, NS2, NS3, NS4, and NS5 (Pierson TC et al., Fields virology, 747-794, 2013). The envelope glycoprotein consists of three external domains, EDI, EDII, and EDIII, and the structurally central amino terminal domain is EDI, the dimerization domain EDII, and the carboxy terminal Ig pseudodomain is EDIII. Domain EDI Domain EDI (1-49; 136-195; 286-302 aa) and EDII are not consecutively contiguous and are soluble hinge regions (EDI / II), whereas EDIII (303-403aa) is a continuous domain of EDI. Is expanded from. Envelope glycoproteins are involved in viral assembly, subsequent membrane fusion associated with cellular receptor adherent viral entry (Lazer HM, et al., J. Virol, 90: 4864-75,2016). In addition, the envelope glycoprotein is the main target of the major antibody reaction, domain EDIII has a specific antibody to the Zika virus neutralization reaction, inducing a strong antibody response can be protective immune.
지카바이러스 감염시 경미한 증상부터 위험 증상으로부터 예방하고자 전세계적으로 효과적인 지카 백신 개발이 필수적이라고 할 수 있다. 지카바이러스 백신 개발은 DNA 백신, 불활화, 약독화, mRNA, 재조합 서브유닛 백신, 핵산 백신 등 다양한 플랫폼으로 이루어지고 있으며, 전세계적으로 다국적기업, 연구기관에서 임상시험단계에 진행 중이다. 임상시험 단계 백신 형태는 DNA 백신, 불활화 지카바이러스 백신, 펩타이드 백신, mRNA 백신 등이 있으며 각 후보물질마다 임상진행속도에는 차이가 있지만 개발가능성이 비교적 높은 편으로 평가되고 있다. The development of effective Zika vaccines worldwide is essential to prevent minor to dangerous symptoms of Zika virus infection. Zika virus vaccine development consists of various platforms such as DNA vaccine, inactivation, attenuation, mRNA, recombinant subunit vaccine, nucleic acid vaccine, etc., and is in clinical trial stage of multinational companies and research institutes around the world. Phases of clinical trial vaccine include DNA vaccine, inactivated Zika virus vaccine, peptide vaccine, mRNA vaccine, etc. Although the clinical progress rate differs for each candidate, it is considered to have a high possibility of development.
한편, 생백신 또는 약독화 백신은 병원균 독성을 약하게 만들어 그 자체를 사용함으로써 1회 접종만으로 면역지속기간이 길어지는 장점이 있지만, 보관시 주의가 필요하고 몸 안에서 병원체들이 변이반응이 일어 날 수 있으며 독성이 나타나는 위험이 있다. 이에 반해 재조합항원백신(서브유닛백신)은 중화항체를 유도하는 표면항원을 발현시켜 면역에 사용함으로써 안정적이고, 대량생산이 가능하여 일관된 품질이 보장된다. 또한, 단회접종시 면역원성이 감소하는 경향이 있으나, 면역증강제 및 다회투여를 통하여 면역원성이 증가 가능하여 백신 효능을 향상시킬 수 있다. On the other hand, live vaccines or attenuated vaccines have the advantage of weakening pathogen toxicity and their own duration of immunity by only one inoculation, but they require careful preservation and may cause mutants in the body and cause toxic reactions. There is a risk of this appearing. In contrast, recombinant antigen vaccines (subunit vaccines) express surface antigens that induce neutralizing antibodies and are used for immunization, thus ensuring stable, mass-produced and consistent quality. In addition, the immunogenicity tends to decrease during a single inoculation, but the immunogenicity can be increased through an adjuvant and multiple doses to improve vaccine efficacy.
면역증강제는 서브유닛 백신의 면역원성을 높이고, 체내 지속력과 함께 면역 시스템을 활성화 하는 주요요소로 작용한다. 면역 증강제는 작용기전에 따라 장시간 체내에서 쉽게 분해되지 않는 특성을 통해 체액성 면역을 자극하는 Alum, liposome, emulsion 계열과, Toll-like receptor (TLR) 작용체로서 내재면역 자극 인자로 작용하여 세포성 면역반응을 높이는 MPL(monophosphoryl lipid A), LPS 계열 등이 존재하며, 현재 상용화된 인간백신 면역 증강제로 alum, MF59, AS03, AS04 등이 있고 여러 백신에 적용 시험하여 그 효능을 입증하고자 하는 면역 증강제가 다수 존재한다(Apostolico J.S 등, J immunology reseach , 2016).Immunostimulators increase the immunogenicity of subunit vaccines, and act as a major factor in activating the immune system along with the sustainability of the body. Immune enhancers are Alum, liposome, and emulsion series that stimulate humoral immunity through prolonged dissolution in the body depending on the mechanism of action, and as a toll-like receptor (TLR) agonist, which acts as an innate immune stimulating factor, resulting in cellular immunity. MPL (monophosphoryl lipid A) and LPS series to increase the response is present, and currently commercially available human vaccine immune enhancers include alum, MF59, AS03, AS04, etc. Many exist (Apostolico JS et al., J immunology reseach, 2016).
[선행 특허 문헌][Previous Patent Document]
대한민국 특허공개번호 제1020170103473호 Republic of Korea Patent Publication No. 1020170103473
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 내포체로 발현되는 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 단백질의 가용화와 관련하여 종래기술의 가용화 조성물보다 우수한 새로운 가용화 조성물을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above necessity, and an object of the present invention is to provide a new solubilization composition which is superior to the solubilization composition of the prior art with respect to the solubilization of Zikavirus envelope protein domain III protein expressed as an inclusion body.
본 발명의 다른 목적은 이러한 가용화 조성물을 이용하여 지카 재조합항원 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing a Zika recombinant antigen protein using such a solubilization composition.
상기의 목적을 발명하기 위해서 본 발명은 a)pH 8.5의 완충물질;b)글루타치온(GSH) 및 산화형 글루타치온(GSSG) 혼합물;c)염화나트륨; 및 d)아르기닌을 유효성분으로 포함하는 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질 가용화 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition comprising a) a buffer material of pH 8.5; b) a mixture of glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG); c) sodium chloride; And d) provides a Zika virus envelope protein domain III recombinant protein solubilizing composition comprising arginine as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 완충물질은 트리스(Tris-(hydroxymethyl)aminomethane) 완충 물질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the buffer material is preferably Tris- (hydroxymethyl) aminomethane buffer material, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 GSH 및 GSSG의 혼합 몰비는 5/1 내지 10/1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the mixing molar ratio of the GSH and GSSG is preferably 5/1 to 10/1, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 염화나트륨은 20 내지 180mM 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the sodium chloride is preferably in the range of 20 to 180mM, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 아르기닌 농도는 0.5M인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the arginine concentration is preferably 0.5M, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 염화 마그네슘 및 염화 칼슘을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the composition preferably further comprises magnesium chloride and calcium chloride, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 염화 마그네슘 및 염화 칼슘의 농도는 각각 2mM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the concentration of magnesium chloride and calcium chloride is preferably 2mM, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 a)내포체를 생산하는 재조합 균주로부터 내포체를 분리 수득하는 단계;및 b) 상기 수득된 내포체에 상기 본 발명의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질 가용화 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises the steps of: a) separating and obtaining an inclusion body from a recombinant strain producing an inclusion body; and b) treating the composition of the present invention with the obtained inclusion body. Provided are protein solubilization methods.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 내포체는 발현 완료된 세포에 세포파쇄용액 처리 후 원심분리 하여 얻어진 불용성 침전물을 버퍼로 부유해 파쇄 및 원심분리를 반복하는 워싱 과정을 거치는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, it is preferable that the inclusion body is subjected to a washing process in which an insoluble precipitate obtained by centrifugation after treatment with a cell lysing solution is suspended in a buffer, followed by crushing and centrifugation. No.
또 본 발명은 상기 본 발명의 가용화 방법에 의하여 얻어진 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질을 재조합 항원으로 사용하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of using the Zika virus envelope protein domain III recombinant protein obtained by the solubilization method of the present invention as a recombinant antigen.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 사용된 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질 항원 또는 상기 항원에 대한 항체를 포함하는 지카바이러스 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a Zika virus envelope protein domain III recombinant protein antigen or Zika virus diagnostic kit comprising the antibody to the antigen used by the method of the present invention.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 사용된 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질 항원을 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스에 대한 백신용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for a vaccine against Zika virus comprising as an active ingredient the Zika virus coat protein domain III recombinant protein antigen used by the method of the present invention.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 재조합 항원은 마우스 면역을 통하여 항체 생성 및 중화항체 효능을 제공한다.The present invention is a recombinant antigen produced by the method provides antibody production and neutralizing antibody efficacy through mouse immunity.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 지카 재조합 항원 10㎍이상, 면역증강제 Alum 및 MPL을 포함한 LPS 계열의 혼합제제를 사용하는 백신용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for a vaccine using a mixture of LPS series, including 10 μg or more of Zika recombinant antigen produced by the above method, an adjuvant Alum and MPL.
이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명은 종래기술에서 제공한 96종의 가용화 조성물 조건을 탐색하여, 새로운 내포체로 발현되는 ZIKV-EDIII 재조합 단백질 항원의 활성구조, 항원성, 면역능을 높이는 가장 우수한 조건을 제공한다. The present invention searches the conditions of 96 solubilizing compositions provided in the prior art, and provides the best conditions for enhancing the active structure, antigenicity, and immunity of ZIKV-EDIII recombinant protein antigen expressed as a new inclusion body.
또한, 상기 조건으로부터 얻어진 재조합 단백질 생산 방법을 적용하여 지카바이러스 외피단백질 도메인 III(ZIKV-EDIII) 재조합 단백질 항원을 제공한다. In addition, the recombinant protein production method obtained from the above conditions is applied to provide a Zika virus envelope protein domain III (ZIKV-EDIII) recombinant protein antigen.
본 발명은 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 재조합 단백질은 발현, 변성, 정제, 가용화, 투석, 농축의 일련의 과정을 거쳐 생산한다. 본 발명에서 제공되는 방법으로 수득한 ZIKV-EDIII 단백질 항원은 마우스 면역시험으로 면역보조제, 적정 면역 도즈를 선정하였고, 이는 우수한 중화항체능을 나타냄에 따라 백신으로서의 효능을 제공할 수 있다.The present invention produces a Zika virus envelope protein domain III recombinant protein through a series of processes of expression, denaturation, purification, solubilization, dialysis and concentration. The ZIKV-EDIII protein antigen obtained by the method provided in the present invention was selected as an adjuvant, an appropriate immune dose by the mouse immunoassay, which can provide efficacy as a vaccine as it exhibits excellent neutralizing antibody activity.
상기 지카바이러스의 외피단백질 도메인 III(ZIKV-EDIII)는 지카바이러스에 대한 강력한 항체 형성 및 방어면역이 가능한 주요 타겟으로, 본 발명의 ZIKV-EDIII는 높은 항체가와 다수의 중화항체 생성으로 효과적인 면역 반응을 유도한다.The envelope protein domain III of Zika virus (ZIKV-EDIII) is a major target capable of potent antibody formation and protective immunity against Zika virus, and ZIKV-EDIII of the present invention has an effective immune response due to the high antibody titer and the generation of multiple neutralizing antibodies. Induce.
본 발명은 상기 지카바이러스 도메인 III 발현벡터에 있어서, 상기벡터는 pET-28a 벡터가 용이하며, 기타벡터(pET-22b) 사용시 플라스미드 불안정성 및 타깃 단백질 독성으로 인하여 발현이 어려웠기 때문이다. pET-28a 벡터는 상용벡터로, 당업자가 용이하게 구입할 수 있으므로 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.In the present invention, the Zika virus domain III expression vector, which is a pET-28a vector is easy, and because the expression was difficult due to plasmid instability and target protein toxicity when using other vectors (pET-22b). Since the pET-28a vector is a commercial vector, a person skilled in the art can easily purchase the detailed description thereof.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
본 발명에 있어서, 숙주세포는 원핵세포로 대장균이 바람직하며, T7 프로모터를 가진 BL21, Rosetta, Origami와 같은 계열의 다양한 대장균을 이용하여 형질전환 할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 BL21(DE3) 균주를 사용하였으나, 이에 한정하지 않는다.In the present invention, the host cell is Escherichia coli is preferred as a prokaryotic cell, and can be transformed using a variety of Escherichia coli such as BL21, Rosetta, Origami having a T7 promoter, according to a preferred embodiment of the present invention BL21 ( DE3) strain was used, but not limited thereto.
상기 대장균 유래 타깃 단백질 과발현 유도 시, 발현온도, 유도시점, 유도물질의 농도, 유도 후 발현시간 등이 주요 실험 조건이며, ZIKV-EDIII는 O.D600 0.5-0.6이였으며, IPTG 농도 1mM, 4시간 발현하는 것이 바람직하였다.When E. coli-derived target protein overexpression is induced, expression temperature, time of induction, concentration of inducer, expression time after induction are the main experimental conditions, and ZIKV-EDIII was OD 600 0.5-0.6,
지카 재조합 단백질(ZIKV-EDIII)을 포함하는 내포체를 분리하는 방법은 발현 후 수득한 균체는 세포파쇄용액 bugbuster(Novagen) 사용하여 교반 후 원심분리하여 침전물을 분리하여 상기 내포체를 분리할 수 있다. 상기 침전물은 트리스 버퍼로 침전물을 부유, 초음파 파쇄, 원심분리를 반복하여 침전물을 회수한다. 회수한 침전물은 고농도의 카오트로픽제를 반드시 포함한 변성용액으로 용해시킨다. 지카 재조합 단백질은 8M 우레아, 트리스, 소듐클로라이드, GSH, GSSG의 변성용액을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 카오트로픽제는 8M 우레아 또는 6M 이상의 구아니디늄클로라이드일 수 있고, 환원제는 GSH, GSSH외 DTT, 시스테인, 2-머캅토에탄올 이 선택될 수 있다.In the method of separating the inclusion bodies containing Zika recombinant protein (ZIKV-EDIII), the cells obtained after expression may be separated by centrifugation after stirring using a cell disruption solution bugbuster (Novagen) to separate the precipitates. . The precipitate is suspended in the Tris buffer, the ultrasonic crushing, centrifugation is repeated to recover the precipitate. The recovered precipitate is dissolved in a denatured solution containing a high concentration of chaotropic agent. Zika recombinant protein is preferably a modified solution of 8M urea, tris, sodium chloride, GSH, GSSG, but is not limited thereto. The chaotropic agent may be 8M urea or 6M or more guanidinium chloride, and the reducing agent may be selected from GSH, GSSH, DTT, cysteine, 2-mercaptoethanol.
변성된 지카 단백질 정제 시에는 프로본드 니켈 킬레이트 레진을 사용하여 결합한 뒤, 우레아가 첨가된 정제 완충용액을 이용하여 pH별로 타깃 단백질을 수득하는 것이 바람직하다.When the denatured Zika protein is purified, it is preferable to bind with Probond Nickel Chelate Resin, and then obtain a target protein for each pH using a purification buffer containing urea.
종래 발명은, 수득한 변성 상태의 단백질을 이용하여 가용화 조건을 신속하게 설정할 수 있도록 다양한 화학성분의 농도와 비율을 포함하는 96종의 용액 조성물을 제공한다. The conventional invention provides 96 solution compositions containing concentrations and ratios of various chemical components so as to quickly set solubilization conditions using the obtained denatured protein.
본 발명의 실시예에서 지카 재조합 단백질의 가용화 조성물은 pH8.5 트리스 50mM 완충용액으로 0.5M 아르기닌, 2mM GSH와 0.2mM GSSG 또는 10mM GSH와 2mM GSSG 혼합용액, 20, 60, 또는 180mM 소듐클로라이드, 및/또는 0 또는 2mM 마그네슘클로라이드와 칼슘클로라이드 혼합용액의 조합이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. In an embodiment of the present invention, the solubilizing composition of Zika recombinant protein is 0.5M arginine, 2mM GSH and 0.2mM GSSG or 10mM GSH and 2mM GSSG mixed solution, 20, 60, or 180mM sodium chloride with pH8.5 Tris 50mM buffer, and And / or a combination of 0 or 2 mM magnesium chloride and calcium chloride mixed solution is most preferred but not limited thereto.
본 발명은 상기 방법으로 조제된 지카 재조합 단백질 항원(ZIKV-EDIII)은 항원-항체 면역기반 크로마토그래피 신속 진단 키트에 사용될 수 있다. The present invention can be used in the antigen-antibody immunobased chromatography rapid diagnostic kit Zika recombinant protein antigen (ZIKV-EDIII) prepared by the above method.
또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 재조합 항원은 마우스 면역을 통하여 항체 생성 및 중화항체 효능을 제공한다. In addition, the present invention provides a recombinant antigen produced by the above method to produce antibody and neutralizing antibody efficacy through mouse immunity.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 지카 재조합 항원 10㎍이상, 면역증강제 Alum 및 MPL을 포함한 LPS 계열의 혼합제제를 사용하는 백신용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for a vaccine using a mixture of LPS series, including 10 μg or more of Zika recombinant antigen produced by the above method, an adjuvant Alum and MPL.
본 발명에서 중화항체란, 바이러스에 대한 특이적인 항체 중 바이러스 입자 표면과 결합하여 바이러스의 감염성을 중화하는 항체를 말하며, 바이러스에 대한 중화항체의 측정은 백신의 효능평가에 중요하다. 본 발명의 구현예에 따르면 중화항체 측정으로 바이러스 중화항체 측정으로 플라크 감소 중화항체 검사(PRNT)를 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 ZIKV-EDIII 재조합 항원은 면역접종량 10㎍이상, 면역증강제 혼합제제 함유 시, PRNT 50은 20 이상으로 우수한 중화항체 효능이 확인되었다. 한편, 지카 외피단백질 또는 도메인 III 타깃으로 재조합단백질 항원에 대한 중화항체 효능은 몇 가지 연구에서 보고되었다. In the present invention, the neutralizing antibody refers to an antibody which binds to the virus particle surface and neutralizes the infectivity of the virus among specific antibodies to the virus, and the measurement of the neutralizing antibody against the virus is important for evaluating the efficacy of the vaccine. According to an embodiment of the present invention, the plaque reduction neutralizing antibody test (PRNT) was used as the neutralizing antibody as the virus neutralizing antibody. As a result, the ZIKV-EDIII recombinant antigen of the present invention was confirmed to have an excellent neutralizing antibody efficacy of 10 µg or more of immunization amount and 20 or more of PRNT 50 when containing an adjuvant mixture. Meanwhile, the efficacy of neutralizing antibodies against recombinant protein antigens as Zika envelope protein or domain III targets has been reported in several studies.
특히 대장균 유래 도메인 III 재조합 단백질 항원으로 마우스 면역 시험 결과, 중화항체가 확인 시 PRNT 50이 20미만로 나타났으며 Insect cell 발현 외피단백질 역시 유사한 결과가 보고되었다(Yang M. 등, j. Vaccine, 2017; Albert TO 등, mSphere, 3(1) e0057-17, 2018). 본 발명의 연구 결과와 비교해보았을 때, 본 발명의 지카 재조합 단백질의 안정적인 가용화 조성물 및 면역증강제의 효과로 사료된다. In particular, mouse immunization with E. coli-derived domain III recombinant protein antigen resulted in a PRNT 50 of less than 20 when neutralizing antibodies were identified, and similar results were reported for insect cell-expressing envelope proteins (Yang M. et al., J. Vaccine, 2017). Albert TO et al., MSphere, 3 (1) e0057-17, 2018). Compared with the study results of the present invention, it is considered that the stable solubilizing composition of the Zika recombinant protein of the present invention and the effect of an immunopotentiator.
또한, 본 발명에 있어서, 면역증강제는 지카 재조합 단백질 항원의 면역원성 및 지속력을 높이고자 사용되며 그 유효성은 마우스 시험에 투여하여 발생되는 지카 재조합 단백질 항원에 대한 항체 및 중화항체가를 통하여 결정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 수산화알루미늄(Alum) 및 MPL(monophosphoryl lipid A)이 혼합된 면역 증강제이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항원 전달체로 작용하는 Alum을 포함하여 MF58, AS03, liposome 등이 있으며, 내재면역 자극인자로 세포성 면반응을 높이는 MPL을 포함하여 LPS 계열, CpGODN, AS04등을 사용할 수 있다. In addition, in the present invention, an immunopotentiator is used to increase the immunogenicity and persistence of Zika recombinant protein antigen, and its effectiveness can be determined through the antibody and neutralizing antibody titer of Zika recombinant protein antigen generated by administration in mouse test. . According to a preferred embodiment of the present invention, aluminum hydroxide (Alum) and MPL (monophosphoryl lipid A) are mixed immune enhancers, but is not limited thereto. There are MF58, AS03, liposome, etc., including Alum, which acts as an antigen carrier, and LPS series, CpGODN, AS04, etc., including MPL, which enhance cellular immune response, can be used as intrinsic immune stimulating factors.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 지카 재조합 항원의 가용화 조성물을 통하여 보다 손쉽게 지카 재조합 항원 제조 및 대량생산 할 수 있다. 본 발명에서 제조된 ZIKV-EDIII 재조합 항원은 종래 가용화 조성조건에 비해 면역학적 검증 및 면역크로마토그래피를 통하여 보다 뛰어난 성능을 나타내었다. 이렇게 조제된 지카 재조합항원은 면역크로마토그래피 신속진단키트에 단백질 마커 원료로 적용 가능하다. 또한, 마우스 면역 시험을 통하여 면역보조제 및 면역 도스로 우수한 항체가 성능 및 중화항체 효능을 검증함에 따라 서브유닛 재조합 백신 원료로 적용 가능할 것으로 사료된다. As can be seen through the present invention, the solubilized composition of the Zika recombinant antigen of the present invention can be more easily produced and mass produced Zika recombinant antigen. ZIKV-EDIII recombinant antigen prepared in the present invention showed more excellent performance through immunological verification and immunochromatography than the conventional solubilization composition conditions. The Zika recombinant antigen thus prepared can be applied as a protein marker material to an immunochromatography rapid diagnostic kit. In addition, it is thought that the superior antibody as an adjuvant and immune dose through the mouse immunoassay can be applied as a subunit recombinant vaccine raw material as the performance and neutralizing antibody efficacy are verified.
도 1은 지카 외피단백질 도메인 III 단백질 발현 벡터 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 웨스턴 블랏 결과로, 가용화 조성화 버퍼별(트리스, HEPES, 글라이신) 조제된 지카 외피단백질 도메인 III 재조합 단백질의 항원성을 검증한 결과이다. a는 항-지카 단클론항체_외피단백질 Envelope, b는 항-지카 단클론항체_EDIII로 검증 결과이다. M은 분자량 마터, 라인 1은 트리스-ZIKV-EDIII, 라인2는 HEPES-ZIKV-EDIII, 라인 3은 글라이신-ZIKV-EDIII 재조합 항원 단백질
도 3은 가용화 조성화 버퍼별(트리스, HEPES, 글라이신) 조제된 지카 외피단백질 도메인 III 재조합 항원 단백질을 골드 컨쥬게이트의 원료로 하여 면역 크로마토그래피 신속진단키트를 제작하고, 이를 양성 혈청을 이용해 검사한 결과이다. 1은 Negative control, 2는 트리스-ZIKV-EDIII, 3은 HEPES-ZIKV-EDIII, 4는 글라이신-ZIKV-EDIII 재조합 항원
도 4는 ELISA 결과로, 지카 재조합항원 면역농도(10㎍, 25㎍, 50㎍)및 면역보조제 Alum+MPL 함유 시험으로 재조합항원 단독 대비 면역증강제 Alum과 MPL 혼합제제에서 항체가 증가를 확인하였다.
도 5는 End point titer결과로, 최종 반응역가를 확인시, 25㎍, 50㎍ 항원과 Alum 및 MPL 혼합제제에서 104에 가까운 end point titer로 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
도 6은 ZIKV-EDIII 재조합항원 및 면역증강제(Alum 및 MPL 혼합제제) 함유하여 면역화된 마우스에서 중화항체 측정 결과이다. 지카재조합항원 단독 면역시, 중화항체 효능은 확인되지 않았으며, 면역증강제가 함유된 ZIKV-EDIII 재조합항원 10㎍는 PRNT50=20, 25㎍, 50㎍ 에서 PRNT 50=40 이 확인되었다. Figure 1 is a schematic diagram showing the structure of Zika envelope protein domain III protein expression vector.
Figure 2 shows the results of Western blot, verifying the antigenicity of Zika envelope protein domain III recombinant protein prepared by solubilization composition buffer (Tris, HEPES, glycine). a is the anti-Zika monoclonal antibody_envelope protein Envelope, b is the anti-Zika monoclonal antibody_EDIII. M is molecular weight marter,
FIG. 3 shows an immunochromatography rapid diagnostic kit prepared using a Zika coat protein domain III recombinant antigen protein prepared by solubilization composition buffer (Tris, HEPES, glycine) as a gold conjugate, and tested using positive serum. to be. 1 is Negative control, 2 is Tris-ZIKV-EDIII, 3 is HEPES-ZIKV-EDIII, 4 is Glycine-ZIKV-EDIII recombinant antigen
Figure 4 shows the increase in antibody in the immune enhancer Alum + MPL formulation compared to recombinant antigen alone in the ELISA results, Zika recombinant antigen immunoconcentration (10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍) and the adjuvant Alum + MPL test.
Figure 5 shows the end point titer, when confirming the final reaction titer, it was confirmed that the high end point titer close to 10 4 in the mixture of 25 ㎍, 50 ㎍ antigen and Alum and MPL formulations.
Figure 6 shows the results of neutralizing antibodies in mice immunized with ZIKV-EDIII recombinant antigen and immunostimulant (Alum and MPL combination formulation). When immunizing with Zika recombination antigen alone, neutralizing antibody efficacy was not confirmed. PRNT 50 = 40 was confirmed at 10 µg of ZIKV-EDIII recombinant antigen containing an adjuvant PRNT50 = 20, 25 µg and 50 µg.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 다음 실시예에 의해 국한되지, 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. These examples are intended to explain the invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1 : One : 표면단백질을Surface proteins 암호화하는 유전자 합성 Gene Synthesis Encoding
지카바이러스 외피단백질 도메인 III 개발을 위해서, 주요면역 유발인자에 해당하는 구조단백질인 외피 단백질의 합성 gene을 확보하였다. Colombia strain(GenBank accession no. KU820897.1, Brazil strain과 target 서열 동일)을 선정하여 대장균에서 발현이 용이하도록 codon optimization 하였다. In order to develop the Zika virus envelope protein domain III, a synthetic gene of the envelope protein, a structural protein corresponding to a major immune trigger, was obtained. Colombia strain (GenBank accession no. KU820897.1, target sequence identical to Brazil strain) was selected and codon optimized to facilitate expression in E. coli.
실시예Example 2 : 2 : 대장균유래E. coli derived 지카바이러스Zika virus 재조합단백질Recombinant protein 클로닝Cloning
지카바이러스 외피단백질 합성 gene을 이용해 외피단백질 domain III(EDIII) 대장균 유래 재조합 항원을 발현하고자 하였다. 해당 target DNA를 얻기 위하여 표 1의 프라이머를 이용해 PCR을 수행 후, 전기영동 하여 약, 445bp 크기의 타깃 DNA가 얻어진 것을 확인하였다. 이때, 발현 벡터는 pET-28a을 이용하였다. 타깃 DNA를 BamHI, XhoI(Takara, Japan) 제한효소를 37℃에서 처리하여 동일 제한효소로 처리된 발현벡터인 pET-28a(Novagen, USA)를 이용해 도 1과 같이 서브 클로닝 하였다. 대장균 DH5α와 동일하게 앰피실린을 포함하는 배지를 이용해 조제 벡터(ZIKV-EDIII-pET28a)가 포함된 BL21(DE3)(Invitrogen, USA) 균주인 ZIKV-EDIII-pET-BL21을 선별하였다We used the Zika virus envelope protein synthesis gene to express recombinant protein derived from E. coli envelope protein domain III (EDIII). PCR was performed using the primers of Table 1 to obtain the target DNA, followed by electrophoresis, and the target DNA of about 445bp size was obtained. At this time, pET-28a was used as the expression vector. The target DNA was subcloned as shown in FIG. 1 using pET-28a (Novagen, USA), an expression vector treated with BamHI, XhoI (Takara, Japan) restriction enzyme at 37 ° C. and treated with the same restriction enzyme. ZIKV-EDIII-pET-BL21, a BL21 (DE3) (Invitrogen, USA) strain containing the preparation vector (ZIKV-EDIII-pET28a), was selected using a medium containing ampicillin in the same manner as E. coli DH5α.
표 1은 프라이머 서열 Table 1 shows the primer sequences
실시예Example 3 : 3: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII -- pETpET -BL21 재조합 단백질의 발현Expression of BL21 Recombinant Protein
시험관 내(in vitro) 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해 선별된 균주는 β(IPTG) 유도를 기반으로, 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 발현하였다. 재조합 대장균의 발현 시, 발현 온도와 유도시점 흡광도(OD600), 유도물질 IPTG의 농도, 진탕배양 조건, 유도 후 발현 시간 등이 실험 조건으로 적용된다. 조건시험을 통해 흡광도(OD600=0.5-0.6)에서 유도물질 IPTG 1.0mM을 사용하여 37℃230rpm 쉐이커 인큐베이터(shaker incubator)에서 4시간 동안 발현하는 최적의 조건을 확립하였다. 재조합 단백질을 지닌 박테리아 세포를 분석하기 위해 수득한 균체 1g 당 세포파쇄용액 bugbuster(Novagen) 5ml을 사용하여 20분 교반 후 단백질 추출(protein extraction) 하였고, 10% SDS-PAGE을 통해 15kDa 위치에서 과발현 양상을 확인하였다. 발현된 재조합 단백질은 가용성 단편이 아닌 불용성 펠렛(Insoluble pellet)에서 확인되었다. Strains selected to confirm the expression of Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein in vitro were expressed Zikavirus envelope protein domain III based on β (IPTG) induction. When the recombinant E. coli is expressed, the expression temperature, the absorbance at the time of induction (OD600), the concentration of the inducer IPTG, the shaking culture condition, and the expression time after induction are applied as experimental conditions. The condition test established an optimal condition of expression for 4 hours in a 37 ° C. 230 rpm shaker incubator using 1.0 mM of the inducer IPTG at absorbance (OD600 = 0.5-0.6). Protein extraction was carried out using 5 ml of cell disruption solution bugbuster (Novagen) per 20 g of bacteria obtained for analysis of bacterial cells containing recombinant protein, followed by protein extraction for 20 minutes, and overexpression at 15 kDa via 10% SDS-PAGE. It was confirmed. The expressed recombinant protein was identified in insoluble pellets rather than soluble fragments.
실시예Example 4 : 4 : ZIKV ZIKV -- EDIIIEDIII -- pETpET -BL21 재조합 단백질 -BL21 recombinant protein 내포체Inclusion 분리 수득 Separation obtained
불용성 펠렛 형태로 발현된 재조합 단백질은 세포파쇄용액과 교반 후 얻어진 상등액과 동일 부피의 트리스((Tris-(hydroxymethyl) aminomethane)버퍼로 침전물을 부유해 초음파 파쇄 및 원심분리를 반복하여 얻어진 상등액을 제거하였다. 최종 불용성 펠렛은 카오트로픽 변성제(chaotropic denaturant) 8M 우레아(Urea)와 2mM 환원형 글루타치온(reduced glutathione, GSH)과 1mM 산화형 이황화 글루타치온(glutathione disulfide, GSSG)를 첨가 후 16시간 동안 4°C 보관하면서 단백질의 3차 구조를 풀어내어 가용화(solubilization) 하여 변성 단백질 수득하였다. Recombinant protein expressed in the form of insoluble pellets was suspended in a cell lysate solution and the supernatant obtained by stirring and suspended in a precipitate with the same volume of Tris ((hydroxymethyl) aminomethane) buffer to remove the supernatant obtained by repeated ultrasonic crushing and centrifugation. Final insoluble pellets were stored at 4 ° C for 16 hours after addition of 8oM chaotropic denaturant Urea, 2mM reduced glutathione (GSH) and 1mM glutathione disulfide (GSSG). Denatured protein was obtained by solubilization by releasing the tertiary structure of the protein.
실시예Example 5 : 5: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII -- pETpET -BL21 재조합 단백질 정제 -BL21 Recombinant Protein Purification
상기 변성 단백질 ZIKV-EDIII 재조합 단백질의 정제를 위해, 6x His-tag 재조합 단백질 및 니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 콘주게이트를 함께 이용하여 오픈컬럼 정제를 진행하였다. 정제 전, 시린지 필터를 이용해 불순물을 제거하였고, 프로본드 니켈 레진(Probond nickel resin, NOVEX)을 사용하여 타깃단백질 C-term 말단의 6x His-tag 상온 2시간 교반하여 결합하였다. 우레아가 첨가된 정제 완충용액을 이용하고, 정제 버퍼는 8M 우레아, 20Mm 소듐포스페이트, 0.5M 소듐크로라이드로, pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9, pH 4.0으로 타깃단백질과 결합 시, pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9 버퍼는 워싱, 용리시에는 pH 4.0버퍼를 사용하였다. For purification of the denatured protein ZIKV-EDIII recombinant protein, open column purification was performed using 6x His-tag recombinant protein and nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) conjugate together. Before purification, impurities were removed using a syringe filter, and bound by stirring for 2 hours at 6x His-tag at room temperature of the target protein C-term using Probond nickel resin (NOVEX). Using a urea-added purification buffer, the purification buffer is 8M urea, 20Mm sodium phosphate, 0.5M sodium chloride, pH 7.8, pH 6.5, when combined with the target protein at pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9, pH 4.0 6.5, pH 5.9 buffer was used for washing, elution pH 4.0 buffer.
오픈 컬럼 정제 시, 컬럼에 니켈 레진을 첨가한 뒤 증류수로 충분히 워싱한다. 워싱한 레진에 pH 7.8 완충버퍼를 레진부피의 5-10배 부피로 흘려준다. ZIKV-EDIII 변성 단백질을 컬럼에 주입한 후 레진과 함께 부드럽게 부유한 뒤 코니칼 튜브에 옮겨 상온 2시간 교반기에서 결합시킨다. 결합된 변성단백질을 컬럼에 옮긴 뒤, 바인딩되지 않은 버퍼, pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9 순으로 완충용액을 흘려 워싱하고, 최종 용리시킬 pH 4.0버퍼를 흘려주어 타깃 단백질 ZIKV-EDIII를 얻었다. 회수된 각 pH 분획 별로 10% SDS-PAGE을 통해 타깃이 용리(elution)된 용액을 확인하였다. In open column purification, nickel resin is added to the column, followed by washing with distilled water. The pH 7.8 buffer buffer is poured into the washed resin at a volume of 5-10 times the volume of the resin. After ZIKV-EDIII denatured protein is injected into the column, it is gently suspended together with the resin, and then transferred to a conical tube and combined in an agitator at room temperature for 2 hours. The bound denatured protein was transferred to a column, washed with a buffer solution in the order of unbound buffer, pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9, and a pH 4.0 buffer to be eluted to obtain a target protein ZIKV-EDIII. For each recovered pH fraction, the target eluted solution was identified through 10% SDS-PAGE.
실시예Example 6 : 6: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII -- pETpET -BL21 재조합 단백질의 Of BL21 recombinant protein 가용화Solubilization 방법 Way
상기방법으로 정제한 변성 상태의 ZIKV-EDIII 재조합 단백질을 표2와 같은 다양한 화학성분의 농도와 비율의 용액 조성물을 미니스케일로 96종을 시험하였다. 각 가용화 조성물 1ml 내에 단백질 농도 기준 50mg/ml 이상 100mg/ml 내외의 변성 용액을 1/100 부피 비로 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 16시간 이상 반응하였다. 반응 후 4℃16,000g에서 10분 이상 원심분리 하여도 불용성 침전물의 형성이 확인되지 않은 가용화 용액 조성을 확립하였다.96 kinds of ZIKV-EDIII recombinant proteins purified by the above method were tested in miniscale for solution compositions of various concentrations and ratios of various chemical components as shown in Table 2. Within 1 ml of each solubilizing composition, a denaturation solution of about 50 mg / ml or more and 100 mg / ml based on protein concentration was added and mixed at a 1/100 volume ratio, followed by reaction at 4 ° C. for 16 hours or more. The solubilization solution composition was confirmed in which formation of insoluble precipitate was not confirmed even after centrifugation at 16,000 g for 4 minutes at 4 ° C.
50mMBuffer
50mM
(pH 6.5)MES
(pH 6.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 7.5)HEPES
(pH 7.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 8.5)Tris-HCl
(pH 8.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 9.5)Glycine
(pH 9.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
표 2 는 96종 미니스케일 스크리닝 조성결과, Table 2 shows the 96 kinds of miniscale screening results.
표 3과 같이 ZIKV-EDIII 재조합 단백질의 가용화 가능한 조성은 pH 7.5 HEPES 버퍼는 0.5M Arginine, 염화마그네슘, 염화칼륨이 포함된 34~36, 46~48번, Glycine 버퍼도 동일한 82~84, 94~96번 조성물이 적합함을 확인하였다. 트리스 버퍼는 55~60, 67~72번으로 위 조성에서 마그네슘, 염화칼륨의 유무 상관없이 가용화 가능하였다. As shown in Table 3, the solubilizable composition of the ZIKV-EDIII recombinant protein is pH 7.5 HEPES buffer, 34-36, 46-48, containing 0.5M Arginine, magnesium chloride, potassium chloride, and 82-84, 94-96, which are identical to Glycine buffer. Burn compositions were found to be suitable. Tris buffer was 55-60, 67-72, solubilized with or without magnesium and potassium chloride in the above composition.
상기 ZIKV-EDIII 변성용액은 각 pH를 적정할 수 있는 완충물질에 따른 조성 한 가지씩을 택하여 총 3가지 가용화 조성물에 적용하여 4℃에서 16시간 이상 반응하였다. The modified solution of ZIKV-EDIII was applied to three solubilizing compositions by selecting one composition according to a buffer material capable of titrating each pH and reacting at 4 ° C. for at least 16 hours.
50mMBuffer
50mM
(pH 6.5)MES
(pH 6.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 7.5)HEPES
(pH 7.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 8.5)Tris-HCl
(pH 8.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
(pH 9.5)Glycine
(pH 9.5)
2/0.2mMGSH / GSSG
2 / 0.2mM
10/2mMGSH / GSSG
10 / 2mM
표 3은 지카 재조합항원의 96종 미니스케일 스크리닝 결과Table 3 shows 96 mini-scale screening results of Zika recombinant antigens
실시예Example 7 : 7: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII -- pETpET -BL21의 투석과 농축을 통한 Through dialysis and enrichment of BL21 ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII 단백질 확보 Protein acquisition
가용화(refolding) 단백질을 포함하는 용액은 희석된 타깃 단백질과 더불어 카오트로픽제 등 다양한 화학성분을 포함하므로 항원 물질로 다양한 분야에 적용하는데 어려움이 따른다. 투석막을 이용해 완충용액 성분으로 충분히 교환하여 원치 않은 화학성분을 제거하였다. 10mM 트리스 완충용액에서 교반하며 투석용액을 반복적으로 교체하여 가용화 버퍼 내 조성물을 제거하였다. 이 후, 단백질 분리막을 포함하는 원심분리형 아미콘(Amicon) 튜브를 이용한 농축 과정을 거쳐 고농도의 ZIKV-EDIII 단백질을 수득할 수 있었다. 상기 방법으로 수득한 ZIKV-EDIII 단백질은 HEPES, 트리스, 글라이신 버퍼 가용화 조성물을 적용한 3종류로, 각 최종 단백질 항원의 비교 검증을 실시하였다. Solutions containing a solubilizing (refolding) protein contains a variety of chemical components, such as chaotropic agent in addition to the diluted target protein is difficult to apply to a variety of fields as antigenic material. The dialysis membrane was sufficiently exchanged with the buffer component to remove unwanted chemical components. The composition in the solubilization buffer was removed by repeatedly changing the dialysis solution with stirring in 10 mM Tris buffer. Thereafter, a high concentration of ZIKV-EDIII protein was obtained through a concentration process using a centrifugal Amicon tube including a protein separation membrane. The ZIKV-EDIII protein obtained by the above method was subjected to comparative verification of each final protein antigen in three types to which HEPES, Tris, and glycine buffer solubilizing compositions were applied.
실시예Example 8 : 8 : ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII 재조합 항원의 면역학적 검증 Immunological Validation of Recombinant Antigens
상기 조제된 3종류의 ZIKV-EDIII 재조합 항원의 면역학적 방법으로 검증하고자 웨스턴 블랏을 실시하였다. 재조합단백질 ZIKV-EDIII는 SDS page loading dye를 첨가하여 100도씨 15분간 중탕하고, 이를 10-12% SDS-PAGE에 80-100V로 전기염동을 실시한다. Trans blot SD(BIO-RAD)를 이용해 PVDF 막(whatman, USA)에 반-건조법으로 단백질을 80V에서 40분동안 옮기고, 상기 PVDF막은 5% 스킨밀크 용액에서 1시간 교반하여 블로킹하였다. 이후 TBST 용액으로 교반해 반복 워싱하고, TBS로 1:2500으로 희석한 마우스 유래 항-ZIKV(Envelope), 항-ZIKV(EDIII) 단클론 항체와 교반해 1-2시간 결합시켰다. TBST 완충용액으로 반복 워싱하였고, 2차 항체 HRP가 결합된 염소 유래 항-마우스 면역글로블린G를 TBS에 1:5000 희석한 뒤 30분 반응하였다. 이를 TBST로 반복워싱하였고, 디아미노벤지딘(SIGMA Aldrich, Germany)를 이용하여 발색하여 확인하였다. Western blot was performed to verify the immunological method of the three ZIKV-EDIII recombinant antigens prepared above. Recombinant protein ZIKV-EDIII was added to SDS page loading dye and bathed at 100 ° C for 15 minutes, followed by electrophoresis at 80-12V on 10-12% SDS-PAGE. Trans blot SD (BIO-RAD) was used to transfer proteins to PVDF membrane (whatman, USA) by semi-drying for 40 minutes at 80V, and the PVDF membrane was blocked by stirring for 1 hour in 5% skin milk solution. Then, the mixture was stirred with TBST solution and washed repeatedly, and then mixed with mouse-derived anti-ZIKV (Envelope) and anti-ZIKV (EDIII) monoclonal antibodies diluted 1: 2500 with TBS, and allowed to bind for 1-2 hours. Washing was repeated with TBST buffer, and goat-derived anti-mouse immunoglobulin G conjugated with secondary antibody HRP was diluted 1: 5000 in TBS and reacted for 30 minutes. This was repeatedly washed with TBST and confirmed by color development using diaminobenzidine (SIGMA Aldrich, Germany).
결과, 도 2과 같이 ZIKV-EDIII 재조합 항원 3종에서 각각의 단클론 항체에 모두 특이적으로 반응하여 약 15kDa 크기의 단백질이 검출되었으나, 동일 실험 조건하에서 반응밴드 진한 정도는 트리스 가용화 버퍼로 제조된 재조합항원에 한해서 10-20배정도 진함을 나타내었다. 이는 트리스 가용화 버퍼로 제조된 지카 재조합 단백질 항원작용기 기능이 HEPES, 글라이신보다 안정성이 높은것으로 사료된다. As a result, as shown in FIG. 2, the protein of about 15 kDa was detected by specifically reacting with each monoclonal antibody in all three ZIKV-EDIII recombinant antigens, but under the same experimental conditions, the concentration of the reaction band was recombined with Tris solubilization buffer. The antigen was about 10-20 times thicker. This suggests that the Zika recombinant protein antigen function produced by Tris solubilization buffer is more stable than HEPES and glycine.
실시예Example 9 : 9: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII 재조합 항원의 항체 기반 면역 크로마토그래피 Antibody-based Immunochromatography of Recombinant Antigens 신속키트Quick Kit 적용 apply
상기방법으로 조제된 3종(HEPES, 트리스, 글라이신)의 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 재조합 단백질 항원은 콜로이달 골드와 반응시켜 컨쥬케이트를 제작하였다. 컨쥬게이트를 트윈 20으로 전처리 된 PE 골드용 패드를 사용하여 흡습시킨 후, 항-사람 면역글로불린 G와 M을 테스트 라인 원료로 분주하여 상기와 같이 신속키트를 제작하였다. 적합한 조성의 시료 희석 용액과 함께 BEI resouces에서 분양받은 ZIKV 양성 환자 혈청을 이용해 검사하였다. 충분한 전개 및 전개 초기 과량의 콜로이달 골드로 인한 잘못된 결과 분석을 배제하기 위하여 시료 로딩 후 10분째에 검사 결과를 확인하였다.Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein antigens prepared by the above method (HEPES, Tris, Glycine) were reacted with colloidal gold to prepare conjugates. After the conjugate was absorbed using a pad for PE gold pretreated with
결과, 도 3과 같이 항-사람 면역글로불린 G 테스트 라인 위치에 라인을 형성하였다. 조제된 3종(HEPES, 트리스, 글라이신)의 지카바이러스 외피단백질 도메인 III 재조합 단백질 항원에 골드 컨쥬게이트가 양성 혈청내 존재하는 항체와 반응하여 검출한 결과이다. 비교 결과, 트리스 항원에 대해 강양성을 보이는 반면, HEPES, 글라이신에서는 약양성으로 검출되는 것으로 보아, 트리스 지카항원의 단백질 구조의 안정성, 특이성, 정확성 등이 HEPES, 글라이신 보다 높은 것으로 사료된다. 따라서, 트리스 가용화 버퍼로 제조한 ZIKV-EDIII 재조합항원은 항체 기반 면역 크로마토그래피 신속 키트에 적용 가능할 것으로 사료된다. As a result, a line was formed at the anti-human immunoglobulin G test line position as shown in FIG. 3. It is the result of detecting by reacting the gold conjugate with the antibody which existed in positive serum to three prepared (HEPES, Tris, glycine) Zika virus coat protein domain III recombinant protein antigens. As a result, it was found that while it shows a strong positive against tris antigen, it is detected as weakly positive in HEPES and glycine, so that the stability, specificity, and accuracy of the protein structure of tris zika antigen are higher than HEPES and glycine. Therefore, ZIKV-EDIII recombinant antigen prepared with Tris solubilization buffer may be applicable to antibody-based immunochromatography rapid kits.
실시예Example 10 : 마우스 면역 시험_ 10: Mouse Immunity Test ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII 재조합 항원의 면역 증강제 효과 및 최적 항원접종량 선별 Immunostimulating Effect of Recombinant Antigens and Selection of Optimal Inoculation Volume
면역 신속진단키트 적용을 통해 선별된 상기 조제된 트리스 버퍼의 ZIKV-EDIII 재조합 단백질 항원의 마우스 면역을 실시하였다. 4주령 Balb/c 마우스를 구입하였고, 면역증강제 효과 확인 및 최적 항원 접종량 선별을 위하여, 재조합 항원 미첨가, 10㎍, 25㎍, 50㎍ , 면역증강제를 미첨가, Alum 및 MPL 혼합제제 군을 구성하여 마우스 5마리씩 실시하였다. 면역증강제 첨가 항원 조제 시, 먼저 Alum과 재조합항원을 2시간 흡착시켜 4도씨 보관한 후 MPL은 주사직전 혼합하여 반응없이 즉시 볼텍싱하여 사용하였다. 재조합 항원농도는 50㎍, 면역증강제 Alum은 10mg/ml, 2%농도로 stock 후 0.1% 사용하였으며, MPL은 1mg/ml 농도 stock 후 20㎍ 주사하였다. 마우스 입고 후, Normal serum 채혈 및 1주일 안정화 기간 설정한 뒤, 프라이밍, 1차 부스팅, 2차 부스팅 순으로 2주 간격으로 피하주사를 실시하였다. 항체 및 중화항체 확인은 백신 접종 1주일째, 최종채혈은 2차부스팅 2주째 수행 후 마우스 실험을 종료하였다. Mouse immunization of ZIKV-EDIII recombinant protein antigen of the prepared Tris buffer selected through the application of an immunoassay kit was performed. Four-week-old Balb / c mice were purchased, and recombinant antigen-free, 10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍ without immunostimulants, and a combination of Alum and MPL formulations were confirmed for confirming the effect of the immunopotentiator and selecting the optimal antigen inoculation. 5 mice each were carried out. When preparing an adjuvant-added antigen, Alum and recombinant antigen were adsorbed for 2 hours and stored at 4 ° C. MPL was mixed immediately before injection and immediately vortexed without reaction. Recombinant antigen concentration was 50㎍, Alum was 10mg / ml, 2% concentration, 0.1% stock after stock, MPL 20mg injection after 1mg / ml stock. After wearing the mouse, normal serum bleeding and one week stabilization period was set, and then subcutaneous injection was performed at intervals of two weeks in the order of priming, first boosting, and second boosting. Antibodies and neutralizing antibodies were confirmed at 1 week of vaccination and final blood collection was performed at 2 weeks of 2nd boosting.
실시예Example 11 : ELISA 11: ELISA
1) ZIKV-EDIII 재조합 항원에 의해 생성된 마우스 항-혈청의 항체가 테스트 1) Antibodies of mouse anti-serum generated by ZIKV-EDIII recombinant antigen were tested
마우스 면역시험 채혈의 항체생성여부를 확인하고자 ELISA 테스트를 수행하였다. ELISA 플레이트에 면역항원 ZIKV-EDIII를 1㎍/ml로 웰당 100㎕씩 분주하고 4도 16시간 이상 처리하였다. 항원 코팅한 웰은 TBST로 세척하였고, TBS에 녹인 0.5% 카제인 100㎕ 분주하여 37도 1시간 반응한 뒤 TBST로 세척하였다. 1:100으로 희석된 혈청시료를 웰에 첨가하고 37도 1시간 반응시킨 뒤, TBST로 세척하고 IgG 검출하고자 1:5000 희석한 Goat anti-mouse IgG HRP(제조사) 100㎕ 분주하여 37도 1시간 반응하였다. PBS 세척하여 TMB 발색을 진행하기 위해 웰당 chromogen 용액 25㎕ 와 TMB(Substrate) 50㎕혼합하여 75㎕씩 분주하여 반응시킨다. Negative control이 파란색 빛을 띄게되면 stop 용액 2M 황산용액 25㎕ 넣게 되면 노란색으로 변하면서 멈춘다. 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Mouse Immunoassay ELISA tests were performed to confirm the antibody production of blood samples. 100 μl / well of the immunogen ZIKV-EDIII was injected into the ELISA plate at 1 μg / ml and treated for 4 hours or more. Antigen-coated wells were washed with TBST, and 100 μl of 0.5% casein dissolved in TBS was reacted at 37 ° C. for 1 hour and then washed with TBST. Serum samples diluted 1: 100 were added to the wells, reacted at 37 degrees for 1 hour, washed with TBST, and 100 μl of Goat anti-mouse IgG HRP (manufacturer) diluted 1: 5000 was detected to detect IgG at 37 degrees for 1 hour. Reacted. In order to proceed with TMB coloration by washing with PBS, 25 μl of chromogen solution and 50 μl of TMB (Substrate) were mixed, and 75 μl was aliquoted. When the negative control turns blue, 25 μl of 2M sulfuric acid solution stops and turns yellow. Absorbance was measured at 450 nm.
결과, 재조합 항원 미첨가, 10㎍, 25㎍, 50㎍, 면역증강제 미첨가, Alum 및 MPL 혼합제제 군을 구성하여 최종 분리 혈청을 ELISA 통해 항체가를 확인한 결과, 도 4 와 같이 재조합 항원 단독 면역 대비 ZIKV-EDIII 재조합 항원농도 증가 및 면역증강제 Alum 및 MPL 혼합제제 함유함에 따라 항체가가 증가한 것으로 확인되었다. As a result, the recombinant antigen was not added, 10 µg, 25 µg, 50 µg, no adjuvant, Alum and MPL mixed agent group was formed, and the final separated serum was identified by ELISA. It was confirmed that the antibody titer was increased with the increase of the control ZIKV-EDIII recombinant antigen concentration and the adjuvant Alum and MPL.
2) ZIKV-EDIII 재조합 항원에 의해 생성된 마우스 항-혈청의 End-point titer 테스트 2) End-point titer test of mouse anti-serum generated by ZIKV-EDIII recombinant antigen
생성된 총 항체가의 정량적 평가 방법으로 상기 항체가 검사에서 본 발명의 ZIKV-EDIII 재조합 항원에 대한 항혈청은 높은 항체 생성을 확인하였고, 각 군별 최종 혈청의 반응 역가를 확인하고자 재조합 항원의 항혈청을 1/100 희석 후 3배씩 단계별로 최대 0.1 x107까지 희석하였다. Cut off 450nm O.D 0.2를 기준으로 Cut off 이상의 연속 발색된 구간을 수치화하였고, 이외 상기 항체가 테스트와 동일한 방법으로 테스트를 실시하였다. As a method for quantitative evaluation of the generated total antibody titer, the antiserum against the ZIKV-EDIII recombinant antigen of the present invention was confirmed to have high antibody production in the antibody titer test. Diluted up to 0.1 × 10 7 in 3 fold steps after / 100 dilution. Cut off The continuous coloration over cut off based on 450nm OD 0.2 was quantified, except that the antibody was tested in the same manner as the test.
End-point titer 테스트 결과, 도 5와 같이 면역증강제 Alum 및 MPL이 함유된 재조합항원 농도 25㎍, 50㎍에서 end-point titer 기준으로 104 이상 나타내었으므로 최종 반응 역가가 매우 높은 수준으로 유도되는 것을 확인하였다. As a result of the end-point titer test, as shown in FIG. 5, the recombinant antigen concentrations of 25 μg and 50 μg containing the adjuvants Alum and MPL were expressed as 10 4 or more based on the end-point titer, resulting in very high final reaction titers. It was confirmed.
실시예Example 12 : 12: ZIKVZIKV -- EDIIIEDIII 재조합 항원에 의해 생성된 마우스 항-혈청의 Of mouse anti-serum produced by recombinant antigens 지카바이러스에Zika virus 대한 About 중화항체가Neutralizing antibody 측정 Measure
ZIKV-EDIII 재조합 항원에 의해 생성된 마우스 항-혈청의 지카바이러스에 대한 중화항체가를 측정하기 위해 플라크 감소 중화항체 검사(PRNT)를 실시하였다. 본 실험실에서 사용하는 표준 프로토콜에 따르며, 시험 절차 및 해석은 다음 단계로 이루어졌다. 베로 세포(Vero cell)는 10 % FBS (fetal bovine serum)와 1% Antibiotics(Gibco,USA)가 추가된 α-MEM(Gibco,USA) 에서 유지되었다. ZIKV-Mexico(멕시코 유래 지카바이러스)는 2 % FBS이 함유된 α-MEM을 사용하여 베로 세포에서 증식시켰다. 모든 마우스 혈청은 56℃에서 30분간 불활화하여 two-fold로 희석하였고, 지카바이러스는 희석된 혈청과 동일 양으로 혼합하였다. 혼합물은 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 배양되었다. 각 혼합물은 0.2ml씩 24-well에 접종하여 1시간 반 동안 세포에 흡착되게 배양하였다. 그 다음, 접종물을 제거한 후 1.4% 메틸셀룰로오즈 (methylcellulose)을 감염세포 위에 1ml씩 분주 한 뒤 4일 동안 추가적으로 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 제거하고 고정 및 염색을 위해 포르말린(formalin)과 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 사용하였고 30분 정치 후 물로 씻어냈다. 그리고 잘 말린 후 플라그 형성 여부를 관찰하였다. 모든 그룹은 3반복 이상 실험하여 결과 판독에 용이하게 하였고, 플라그 수가 50% 감소하는 최대 항-혈청 희석배수를 PRNT50 (plaque reduction neutralization endpoint)으로 결정하였다.Plaque reduction neutralizing antibody assay (PRNT) was performed to determine the neutralizing antibody titer of the Zika virus of mouse anti-serum produced by ZIKV-EDIII recombinant antigen. In accordance with the standard protocol used in this laboratory, the test procedure and interpretation consisted of the following steps. Vero cells were maintained in α-MEM (Gibco, USA) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% Antibiotics (Gibco, USA). ZIKV-Mexico (Mexico-derived Zikavirus) was grown in Vero cells using α-MEM containing 2% FBS. All mouse serum was inactivated at 56 ° C. for 30 min and diluted in two-fold, and Zika virus was mixed in the same amount as the diluted serum. The mixture was incubated for 30 minutes in a 37 ° C. incubator. Each mixture was inoculated with 0.2 ml of 24-well and incubated with cells for 1 and a half hours. Then, after removing the inoculum, 1.4% methylcellulose (methylcellulose) was dispensed on the infected cells by 1 ml and further incubated for 4 days. After the incubation period, the culture medium was removed, formalin and crystal violet were used for fixation and staining, and washed with water after standing for 30 minutes. After drying, the plaque was observed. All groups were subjected to three or more replicates to facilitate reading of the results, and a maximum anti-serum dilution factor of 50% reduction in plaque count was achieved in PRNT 50 (plaque reduction neutralization endpoint).
ZIKV-EDIII 재조합항원의 Alum 및 MPL 혼합제제의 면역 증강제 효과 및 최적 항원 접종량 선별을 위하여 마우스 면역시험을 시행하였고, 위와 같은 방법으로 중화항체시험을 통해 결과를 분석하였다. 도 6에서와 같이, ZIKV-EDIII 25㎍, 50㎍과 면역증강제 Alum 및 MPL 혼합제제가 접종된 혈청이 대략 PRNT50=40으로 확인됐으며, 이는 ZIKV-EDIII 재조합 항원 25㎍이 최적 항원 접종량이며, Alum 및 MPL 혼합제제에서 우수한 중화효능을 나타내고 있음을 확인하였다. The mouse immunoassay was performed to select the immune enhancer effect and optimal antigen inoculation of the combination of Alum and MPL of ZIKV-EDIII recombinant antigen, and the results were analyzed by neutralizing antibody test. As shown in FIG. 6, the serum inoculated with 25 µg, 50 µg of ZIKV-EDIII and an adjuvant Alum and MPL formulation was approximately PRNT50 = 40, indicating that 25 µg of ZIKV-EDIII recombinant antigen was the optimal antigen inoculation amount, Alum and It was confirmed that the MPL mixed agent showed an excellent neutralizing effect.
Claims (12)
b) 글루타치온(GSH) 및 산화형 글루타치온(GSSG)의 혼합 몰비가 5/1 내지 10/1인 글루타치온(GSH) 및 산화형 글루타치온(GSSG) 혼합물;
c) 20 내지 180mM 범위의 염화나트륨;
d)염화 마그네슘 및 염화 칼슘; 및
e)아르기닌을 유효성분으로 포함하는 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질을 재조합 항원으로 사용하기 위한 조성물.a) Tris- (hydroxymethyl) aminomethane buffer material at pH 8.5;
b) a mixture of glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) with a mixing molar ratio of glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) of 5/1 to 10/1;
c) sodium chloride in the range from 20 to 180 mM;
d) magnesium chloride and calcium chloride; And
e) A composition for using Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein comprising arginine as an active ingredient as a recombinant antigen.
b) 상기 수득된 내포체에 상기 제 1 항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질을 재조합 항원으로 사용하기 위한 방법.a) isolating and obtaining an inclusion body from a recombinant strain producing an inclusion body comprising a Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein; and
b) A method for using a Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein as a recombinant antigen, comprising treating the obtained inclusion body with the composition of any one of claims 1 to 3.
b) 상기 수득된 내포체에 상기 제 1 항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는
HEPES, 또는 글라이신 완충물질을 포함하는 조성물로 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질을 가용화 시킨 것과 비교하여 지카바이러스 외피 단백질 도메인 III 재조합 단백질 항원의 단백질 구조의 안정성 및 항체에 대한 특이성을 증가시키는 방법.a) isolating and obtaining an inclusion body from a recombinant strain producing an inclusion body comprising a Zika virus envelope protein domain III recombinant protein; And
b) treating the obtained inclusion body with the composition of any one of claims 1 to 3.
A method for increasing the stability of the Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein antigen and the specificity to the antibody as compared to solubilizing the Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein with a composition comprising HEPES, or glycine buffer.
7. The HEPES or glycine buffering method according to claim 6, wherein the inclusion body is subjected to a washing process in which an insoluble precipitate obtained by centrifugation after treatment with a cell lysing solution is suspended in a expressed cell, and then crushed and centrifuged. A method of increasing the stability of a Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein antigen and its specificity to antibodies as compared to the solubilization of Zikavirus envelope protein domain III recombinant protein with a composition comprising a substance.
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