KR102038241B1 - 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 신규 저분자량 양이온성 지질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다른 지질 성분, 예컨대 콜레스테롤 및 PEG-지질과 조합하여 사용되어 올리고뉴클레오티드를 가진 지질 나노입자를 형성할 수 있는 신규 양이온성 지질을 제공한다. 본 발명의 목적은 간에서의 보다 낮은 지질 수준의 결과로서 보다 낮은 간 독성과 더불어 증진된 효능을 나타내는 양이온성 지질 스캐폴드를 제공하는 것이다. 본 발명은 하나의 짧은 지질 쇄를 갖는 저분자량 양이온성 지질을 사용하여 siRNA의 생체내 전달의 효율 및 허용성을 증진시킨다.
Description
본 발명은 다른 지질 성분, 예컨대 콜레스테롤 및 PEG-지질과 조합하여 사용되어 올리고뉴클레오티드를 가진 지질 나노입자를 형성하고, 세포 흡수와 엔도솜 탈출을 촉진하며, 시험관내 및 생체내 모두에서 표적 mRNA를 녹다운시킬 수 있는 신규 양이온성 지질에 관한 것이다.
양이온성 지질, 및 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA 및 miRNA의 전달을 위한 지질 나노입자에서 양이온성 지질의 사용이 이전에 개시되어 왔다. 지질 나노입자, 및 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA 및 miRNA의 전달을 위한 지질 나노입자의 사용이 이전에 개시되어 왔다. 올리고뉴클레오티드(siRNA 및 miRNA 포함) 및 올리고뉴클레오티드의 합성이 이전에 개시되어 왔다. (US 특허 출원: US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US 2009/0263407 및 US 2009/0285881 및 PCT 특허 출원: WO2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 및 WO2010/054406 참조). 또한 문헌 [Semple S. C. et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176] 참조.
다른 양이온성 지질이 하기 US 특허 출원에 개시되어 있다: US 2009/0263407, US 2009/0285881, US 2010/0055168, US 2010/0055169, US 2010/0063135, US 2010/0076055, US 2010/0099738 및 US 2010/0104629.
전통적인 양이온성 지질, 예컨대 CLinDMA 및 DLinDMA는 간으로의 siRNA 전달에 사용되어 왔지만, 고용량에서의 간 독성과 더불어 비-최적 전달 효율의 문제를 안고 있다. 본 발명의 목적은 간에서의 보다 낮은 지질 수준의 결과로서 보다 낮은 간 독성과 더불어 증진된 효능을 나타내는 양이온성 지질 스캐폴드를 제공하는 것이다. 본 발명은 하나의 짧은 지질 쇄를 갖는 저분자량 양이온성 지질을 사용하여 siRNA의 생체내 전달의 효율 및 허용성을 증진시킨다.
발명의 개요
본 발명은 다른 지질 성분, 예컨대 콜레스테롤 및 PEG-지질과 조합하여 사용되어 올리고뉴클레오티드를 가진 지질 나노입자를 형성할 수 있는 신규 양이온성 지질을 제공한다. 본 발명의 목적은 간에서의 보다 낮은 지질 수준의 결과로서 보다 낮은 간 독성과 더불어 증진된 효능을 나타내는 양이온성 지질 스캐폴드를 제공하는 것이다. 본 발명은 하나의 짧은 지질 쇄를 갖는 저분자량 양이온성 지질을 사용하여 siRNA의 생체내 전달의 효율 및 허용성을 증진시킨다.
도 1: 마우스에서의 LNP(화합물 1) 효능.
도 2: 래트(ApoB siRNA)에서의 LNP(화합물 32 및 33) 효능.
도 3: 래트 간에서의 양이온성 지질(화합물 32 및 33) 수준.
도 4: NHP에서의 LNP(화합물 32 및 33, ApoB siRNA) 효능.
도 5: NHP에서의 LNP(화합물 32 및 33, β-카테닌 siRNA) 효능.
도 6: LNP 투여후 NHP(화합물 32 및 33)에서의 피크 ALT 수준.
도 7: NHP 간에서의 양이온성 지질(화합물 32 및 33) 수준.
도 8: TRE-Met 마우스(화합물 33)에서의 간 β-카테닌 mRNA KD.
도 9: TRE-Met 마우스(화합물 33)에서의 종양 β-카테닌 mRNA KD.
도 10: TRE-met 마우스에서의 종양 성장 억제(화합물 33).
도 11: 마우스에서의 LNP(화합물 32 및 33) 효능.
도 12: TRE-Met 마우스(화합물 32)에서의 간 β-카테닌 mRNA KD.
도 13: TRE-Met 마우스(화합물 32)에서의 종양 β-카테닌 mRNA KD.
도 14: TRE-met 마우스에서의 종양 성장 억제(화합물 32).
도 2: 래트(ApoB siRNA)에서의 LNP(화합물 32 및 33) 효능.
도 3: 래트 간에서의 양이온성 지질(화합물 32 및 33) 수준.
도 4: NHP에서의 LNP(화합물 32 및 33, ApoB siRNA) 효능.
도 5: NHP에서의 LNP(화합물 32 및 33, β-카테닌 siRNA) 효능.
도 6: LNP 투여후 NHP(화합물 32 및 33)에서의 피크 ALT 수준.
도 7: NHP 간에서의 양이온성 지질(화합물 32 및 33) 수준.
도 8: TRE-Met 마우스(화합물 33)에서의 간 β-카테닌 mRNA KD.
도 9: TRE-Met 마우스(화합물 33)에서의 종양 β-카테닌 mRNA KD.
도 10: TRE-met 마우스에서의 종양 성장 억제(화합물 33).
도 11: 마우스에서의 LNP(화합물 32 및 33) 효능.
도 12: TRE-Met 마우스(화합물 32)에서의 간 β-카테닌 mRNA KD.
도 13: TRE-Met 마우스(화합물 32)에서의 종양 β-카테닌 mRNA KD.
도 14: TRE-met 마우스에서의 종양 성장 억제(화합물 32).
발명의 상세한 설명
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA 및 miRNA를 임의의 표적 유전자에 전달하기 위한 지질 나노입자에 유용한 신규 양이온성 지질의 효용에 관한 것이다. (US 특허 출원: US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US 2009/0263407 및 US 2009/0285881 및 PCT 특허 출원: WO2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 및 WO2010/054406 참조). 또한 문헌 [Semple S. C. et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176] 참조.
본 발명의 양이온성 지질은 올리고뉴클레오티드, 구체적으로 siRNA 및 miRNA의 전달을 위한 지질 나노입자에서의 유용한 성분이다.
본 발명의 제1 실시양태에서, 양이온성 지질은 화학식 A 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체로 표시된다.
<화학식 A>
상기 식에서,
R1 및 R2는 H, (C1-C6)알킬, 헤테로시클릴, 및 폴리아민 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 알킬, 헤테로시클릴 및 폴리아민은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 상기 질소에 더하여, N, O 및 S 중에서 선택된 1 또는 2개의 부가적인 헤테로원자를 임의로 함유하는 4 내지 7-원 모노시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있으며, 여기서 상기 모노시클릭 헤테로사이클은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R3은 H 및 (C1-C6)알킬 중에서 독립적으로 선택되고, 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R'은 할로겐, R", OR", SR", CN, CO2R" 또는 CON(R")2 중에서 독립적으로 선택되고;
R"은 H 및 (C1-C6)알킬 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 알킬은 할로겐 및 OH로 임의로 치환되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
제2 실시양태에서, 본 발명은,
R1 및 R2은 각각 메틸이고;
R3은 H이고;
n은 0이고;
L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택되고;
L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택되는 것인,
화학식 A를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 특징으로 한다.
제3 실시양태에서, 본 발명은,
R1 및 R2는 각각 메틸이고;
R3은 H이고;
n은 2이고;
L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택되고;
L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택되는 것인,
화학식 A를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 특징으로 한다.
구체적인 양이온성 지질은 다음과 같다:
(20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민(화합물 1);
(17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-9-아민(화합물 2);
(16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-8-아민(화합물 3);
(13Z,16Z)-N,N-디메틸도코사-13,16-디엔-5-아민(화합물 4);
(12Z,15Z)-N,N-디메틸헤니코사-12,15-디엔-4-아민(화합물 5);
(14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-6-아민(화합물 6);
(15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-7-아민(화합물 7);
(18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-10-아민(화합물 8);
(15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-5-아민(화합물 9);
(14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-4-아민(화합물 10);
(19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-9-아민(화합물 11);
(18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-8-아민(화합물 12);
(17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-7-아민(화합물 13);
(16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-6-아민(화합물 14);
(22Z,25Z)-N,N-디메틸헨트리아콘타-22,25-디엔-10-아민(화합물 15);
(21Z,24Z)-N,N-디메틸트리아콘타-21,24-디엔-9-아민(화합물 16);
(18Z)-N,N-디메틸헵타코스-18-엔-10-아민(화합물 17);
(17Z)-N,N-디메틸헥사코스-17-엔-9-아민(화합물 18);
(19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-7-아민(화합물 19); 및
N,N-디메틸헵타코산-10-아민(화합물 20);
(20Z,23Z)-N-에틸-N-메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민(화합물 21);
1-[(11Z,14Z)-1-노닐리코사-11,14-디엔-1-일]피롤리딘(화합물 22);
(20Z)-N,N-디메틸헵타코스-20-엔-10-아민(화합물 23);
(15Z)-N,N-디메틸헵타코스-15-엔-10-아민(화합물 24);
(14Z)-N,N-디메틸노나코스-14-엔-10-아민(화합물 25);
(17Z)-N,N-디메틸노나코스-17-엔-10-아민(화합물 26);
(24Z)-N,N-디메틸트리트리아콘트-24-엔-10-아민(화합물 27);
(20Z)-N,N-디메틸노나코스-20-엔-10-아민(화합물 28);
(22Z)-N,N-디메틸헨트리아콘트-22-엔-10-아민(화합물 29);
(16Z)-N,N-디메틸펜타코스-16-엔-8-아민(화합물 30);
(12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민(화합물 31);
(13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32);
N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헵타데칸-8-아민(화합물 33);
1-[(1S,2R)-2-헥실시클로프로필]-N,N-디메틸노나데칸-10-아민(화합물 34);
N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]노나데칸-10-아민(화합물 35);
N,N-디메틸-21-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헤니코산-10-아민(화합물 36);
N,N-디메틸-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-펜틸시클로프로필]메틸}시클로프로필]노나데칸-10-아민(화합물 37);
N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헥사데칸-8-아민(화합물 38);
N,N-디메틸-1-[(1R,2S)-2-운데실시클로프로필]테트라데칸-5-아민(화합물 39);
N,N-디메틸-3-{7-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헵틸}도데칸-1-아민(화합물 40);
1-[(1R,2S)-2-헵틸시클로프로필]-N,N-디메틸옥타데칸-9-아민(화합물 41);
1-[(1S,2R)-2-데실시클로프로필]-N,N-디메틸펜타데칸-6-아민(화합물 42);
N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]펜타데칸-8-아민(화합물 43); 및
(11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,23-트리엔-10-아민(화합물 44); 또는 그들의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체.
또 다른 실시양태에서, 개시된 양이온성 지질은 지질 나노입자의 제조에 유용하다.
또 다른 실시양태에서, 개시된 양이온성 지질은 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 지질 나노입자에서 유용한 성분이다.
또 다른 실시양태에서, 개시된 양이온성 지질은 siRNA 및 miRNA의 전달을 위한 지질 나노입자에서 유용한 성분이다.
또 다른 실시양태에서, 개시된 양이온성 지질은 siRNA의 전달을 위한 지질 나노입자에서 유용한 성분이다.
본 발명의 양이온성 지질은 비대칭 중심, 키랄축, 및 키랄면을 가질 수 있고(문헌 [E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190]에 기재), 라세미 화합물, 라세미 혼합물로서, 및 개별 부분입체이성질체로서 발생할 수 있으며, 광학 이성질체를 포함한 그의 모든 가능한 이성질체 및 혼합물이 본 발명에 포함된다. 또한, 본원 개시의 양이온성 지질은 호변이성질체로서 존재할 수 있으며, 비록 하나의 호변이성질체 구조만이 서술되지만 두 호변이성질 형태 모두 본 발명의 범위에 포함시키고자 한다.
본 발명의 양이온성 지질 상의 치환기 및 치환 패턴은 화학적으로 안정하고 당업계에 공지된 기술 및 후술되는 방법에 의해 즉시 입수가능한 출발 물질로부터 손쉽게 합성될 수 있는 양이온성 지질을 제공하도록 당업자에 의해 선택될 수 있음이 인식된다. 치환기 자체가 1개 초과의 기로 치환될 경우, 이들 다수의 기는, 안정한 구조가 생성되는 한, 동일한 탄소 상에 또는 상이한 탄소 상에 존재할 수 있음은 물론이다.
화학적으로 안정하고 당업계에 공지된 기술에 의해 즉시 입수가능한 출발 물질로부터 손쉽게 합성될 수 있는 양이온성 지질을 제공하도록 1개 이상의 Si 원자가 당업자에 의해 본 발명의 양이온성 지질 중으로 혼입될 수 있음은 물론이다.
화학식 A의 화합물에서, 원자는 그들의 천연 동위원소 존재비를 나타낼 수 있거나, 또는 원자의 1개 이상이 동일한 원자 번호를 갖지만, 자연에서 우세하게 발견되는 원자 질량 또는 질량수와는 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 특정 동위원소가 인위적으로 농축될 수 있다. 본 발명은 화학식 A의 화합물의 모든 적합한 동위원소 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 수소(H)의 상이한 동위원소 형태는 경수소(1H) 및 중수소(2H)를 포함한다. 경수소는 자연에서 발견되는 우세한 수소 동위원소이다. 중수소에 대한 농축은 생체내 반감기의 증가 또는 필요 용량의 감소와 같은 특정의 치료 이점을 제공할 수 있거나, 또는 생물학적 샘플의 특징규명을 위한 표준으로서 유용한 화합물을 제공할 수 있다. 화학식 A 내의 동위원소적으로 농축된 화합물은 당업자에 익히 공지된 통상의 기술에 의해 또는 적당한 동위원소적으로 농축된 시약 및/또는 중간체를 사용하여 본원에서의 반응식과 실시예에 기재된 것들과 유사한 공정에 의해 과도한 실험 없이 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄, 시클릭 또는 분지형 포화 지방족 탄화수소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 디엔, 트리엔 및 테트라엔 불포화 지방족 탄화수소를 포함한(이에 한정되지 않음), 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄, 시클릭 또는 분지형 불포화 지방족 탄화수소를 의미한다.
시클릭 "알킬" 또는 "알케닐"의 예로는 다음이 포함된다:
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤테로시클릴" 또는 "헤테로사이클"은 O, N 및 S로 이루어진 군 중에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 4- 내지 10-원 방향족 또는 비-방향족 헤테로사이클을 의미하고, 비시클릭 기를 포함한다. "헤테로시클릴"은 따라서 다음의 것들: 벤조이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 옥사졸린, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리미딜, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 아제티디닐, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로벤조이미다졸릴, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로벤조티오페닐, 디히드로벤족사졸릴, 디히드로푸라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로인돌릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로퀴놀리닐, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디히드로아제티디닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로티에닐, 및 그의 N-옥시드를 포함하며, 이들 모두는 R"중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리아민"은 2개 이상의 아미노 기를 갖는 화합물을 의미한다. 그의 예로는 푸트레신, 카다베린, 스페르미딘, 및 스페르민이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "할로겐"은 Br, Cl, F 및 I를 의미한다.
화학식 A의 실시양태에서, R1 및 R2는 H 및 (C1-C6)알킬 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 상기 질소에 더하여, N, O 및 S 중에서 선택된 1 또는 2개의 부가적인 헤테로원자를 임의로 함유하는 4 내지 7-원 모노시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 헤테로사이클은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, R1 및 R2는 H, 메틸, 에틸 및 프로필 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 메틸, 에틸 및 프로필은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 상기 질소에 더하여, N, O 및 S 중에서 선택된 1 또는 2개의 부가적인 헤테로원자를 임의로 함유하는 4 내지 7-원 모노시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 헤테로사이클은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, R1 및 R2는 H, 메틸, 에틸 및 프로필 중에서 독립적으로 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, R1 및 R2는 각각 메틸이다.
화학식 A의 실시양태에서, R3은 H 및 메틸 중에서 독립적으로 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, R3은 H이다.
화학식 A의 실시양태에서, R'는 R"이다.
화학식 A의 실시양태에서, R"은 H, 메틸, 에틸 및 프로필 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 메틸, 에틸 및 프로필은 1개 이상의 할로겐 및 OH로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, R"은 H, 메틸, 에틸 및 프로필 중에서 독립적으로 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, n은 0, 1, 2 또는 3이다.
화학식 A의 실시양태에서, n은 0, 1 또는 2이다.
화학식 A의 실시양태에서, n은 0, 1 또는 2이다.
화학식 A의 실시양태에서, n은 0이다.
화학식 A의 실시양태에서, n은 2이다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택되고, 이들은 할로겐 및 OH로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C4-C24 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C12-C24 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C19 알케닐이다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 
이다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 
이다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택되고, 이들은 할로겐 및 OH로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C5-C9 알킬 및 C5-C9 알케닐 중에서 선택되고, 이들은 할로겐 및 OH로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C7-C9 알킬 및 C7-C9 알케닐 중에서 선택되고, 이들은 할로겐 및 OH로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C5-C9 알킬 및 C5-C9 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C7-C9 알킬 및 C7-C9 알케닐 중에서 선택된다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C3-C9 알킬이다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C5-C9 알킬이다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C7-C9 알킬이다.
화학식 A의 실시양태에서, L2는 C9 알킬이다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C4-C24 알킬 및 C4-C24 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; L2는 C3-C9 알킬 및 C3-C9 알케닐 중에서 선택되며, 상기 알킬 및 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C12-C24 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; L2는 C5-C9 알킬 중에서 선택되고, 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C19 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; L2는 C7-C9 알킬 중에서 선택되고, 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 C19 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; L2는 C9 알킬 중에서 선택되고, 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, L1은 직쇄 C19 알케닐 중에서 선택되고, 상기 알케닐은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; L2는 직쇄 C9 알킬 중에서 선택되고, 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
화학식 A의 실시양태에서, "헤테로시클릴"은 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 이미다졸 또는 피페라진이다.
화학식 A의 실시양태에서, "모노시클릭 헤테로시클릴"은 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 이미다졸 또는 피페라진이다.
화학식 A의 실시양태에서, "폴리아민"은 푸트레신, 카다베린, 스페르미딘 또는 스페르민이다.
일 실시양태에서, "알킬"은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 포화 지방족 탄화수소이다.
일 실시양태에서, "알케닐"은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 불포화 지방족 탄화수소이다.
본 발명에는 화학식 A의 양이온성 지질의 유리 형태뿐 아니라, 그의 제약상 허용되는 염과 입체이성질체도 포함된다. 본원에서 예시되는 분리된 특정 양이온성 지질의 일부는 아민 양이온성 지질의 양성자화 염이다. 용어 "유리 형태"란 비-염 형태의 아민 양이온성 지질을 말한다. 포함되는 제약상 허용되는 염은 본원 기재의 특정 양이온성 지질에 대해 예시된 분리된 염뿐만 아니라, 화학식 A의 양이온성 지질의 유리 형태의 모든 전형적인 제약상 허용되는 염도 포함한다. 기재된 특정 염 양이온성 지질의 유리 형태는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 유리 형태는 그 염을 적당한 묽은 염기 수용액, 예컨대 묽은 수성 NaOH, 탄산칼륨, 암모니아 및 중탄산나트륨으로 처리함으로써 재생성될 수 있다. 유리 형태는 그들의 각각의 염 형태와는 특정 물성, 예컨대 극성 용매에서의 용해도에 있어서 다소 상이할 수 있지만, 그 산 및 염기 염은 본 발명의 목적상 그들의 각각의 유리 형태와 제약학적으로 동등하다.
당해 양이온성 지질의 제약상 허용되는 염은 염기성 또는 산 모이어티를 함유하는 본 발명의 양이온성 지질로부터 통상의 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 염기성 양이온성 지질의 염은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 또는 유리 염기와 화학량론적 양 또는 과량의 목적하는 염-형성 무기 또는 유기 산을 적당한 용매 또는 용매의 다양한 조합 중에서 반응시킴으로써 제조된다. 이와 유사하게, 산성 화합물의 염은 적당한 무기 또는 유기 염기와의 반응에 의해 형성된다.
따라서, 본 발명의 양이온성 지질의 제약상 허용되는 염은 염기성의 당해 양이온성 지질을 무기 또는 유기 산과 반응시킴으로써 형성되는 본 발명의 양이온성 지질의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 예를 들어, 통상적인 무독성 염은 무기산, 예컨대 염산, 브로민산, 황산, 술팜산, 인산, 질산 등으로부터 유도되는 것들, 및 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시-벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이세티온산, 트리플루오로아세트산(TFA) 등으로부터 제조된 염을 포함한다.
본 발명의 양이온성 지질이 산성을 띠는 경우, 적합한 "제약상 허용되는 염"이란 무기 염기 및 유기 염기를 포함하여 제약상 허용되는 무독성 염기로부터 제조되는 염을 말한다. 무기 염기로부터 유도되는 염으로는 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 제2망가니즈 염, 제1망가니즈, 칼륨, 나트륨, 아연 염 등이 포함된다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨 염이다. 제약상 허용되는 유기 무독성 염기로부터 유도되는 염은 1급, 2급 및 3급 아민, 자연-발생 치환 아민을 포함한 치환 아민, 시클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N1-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등의 염을 포함한다.
전술한 제약상 허용되는 염 및 기타 전형적인 제약상 허용되는 염의 제조에 대해서는 문헌 [Berg et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci., 1977:66:1-19]에 보다 상세히 기술되어 있다.
또한 주의할 것은 본 발명의 양이온성 지질이 잠재적으로 내부염 또는 쯔비터이온이라는 사실인데, 그 이유는 생리학적 조건하에서 그 화합물 중의 탈양성자화된 산 부분, 예컨대 카르복실 기는 음이온성일 수 있고, 이어서 이러한 전자 전하는 양성자화된 또는 알킬화된 염기성 모이어티, 예컨대 4급 질소 원자의 양이온 전하에 대하여 내부적으로 균형을 잃을 수 있기 때문이다.
실시예
제공되는 실시예는 본 발명의 보다 상세한 이해를 돕고자 하는 것이다. 사용되는 특정 물질, 종류 및 조건은 본 발명의 보다 상세한 실례가 되는 것이며 본 발명의 정당한 범위를 제한하고자 함이 아니다. 양이온성 지질의 합성에 사용되는 시약은 시판되고 있거나 또는 당업자에 의해 용이하게 제조된다.
신규 양이온성 지질의 합성은 지질산 (I)을 출발 물질로 하는 선형 공정이다. N,O-디메틸 히드록실아민에 커플링하면 바인렙(Weinreb) 아미드 (II)가 생성된다. 그리냐르(Grignard) 첨가에 의해 케톤 (III)가 생성된다. 티타늄-매개 환원성 아미노화는 유형 (IV)의 최종 생성물을 생성한다.
<반응식 1>
단일 탄소-동족체화(homologated) 양이온성 지질 (V)의 합성은 지질 케톤 (III)을 출발 물질로 하는 선형 공정이다. 케톤에서 니트릴 (V)로의 전환은 TOSMIC 및 칼륨 tert-부톡시드로의 처리를 통해 달성된다. 니트릴에서 1급 아민으로의 환원, 뒤이어 환원성 아미노화를 수행하면 최종 양이온성 지질 (VI)이 제공된다.
<반응식 2>
2 탄소-동족체화 양이온성 지질 (IX)의 합성은 지질 케톤 (III)을 출발 물질로 하는 선형 공정이다. 케톤에서 α,β-불포화 아미드 (VII)로의 전환은 피터슨(Peterson) 조건하에서 달성된다. LS-셀렉트리드을 사용하여 α,β-불포화의 컨쥬게이트 환원을 수행하여 아미드 (VIII)를 생성한다. 수소화 알루미늄 리튬으로 아미드를 환원시키면 최종 양이온성 지질 (IX)이 제공된다.
<반응식 3>
시클로프로필-함유 지질은 반응식 4에 준하여 제조된다. 불포화 바인렙 아미드 (II)를 시몬스-스미스(Simmons-Smith) 시클로프로판화 조건에 투입하여 시클로프로필-함유 바인렙 아미드 (X)를 생성한다. 이들을 반응식 1 내지 3에 개괄된 바와 같이 최종 생성물쪽으로 계속 진행시킨다.
<반응식 4>
알릴 아민 양이온성 지질 (XVI)의 합성은 알데히드 (XI)를 출발 물질로 하는 선형 공정이다. t-부틸 아세테이트의 첨가는 β-히드록시 에스테르 (XII)를 생성한다. 히드록실 관능기에서 플루오로 기로의 전환, 뒤이어 산처리하면 β-플루오로산 (XIII)이 생성된다. 산에서 바인렙 아미드로의 전환, 뒤이어 그리냐르 첨가를 수행하면 β-플루오로 케톤 (XV)이 생성된다. 환원성 아미노화는 동시 제거를 유도하여 목적하는 알릴 아민 (XVI)을 생성한다.
<반응식 5>
20,23-노나코사디엔-10-아민, N,N-디메틸-, (20Z,23Z)(화합물 1)
11,14-에이코사디에노산, (11Z,14Z)- (50 g, 162 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드(31.6 g, 324 mmol), HOAt(44.1 g, 324 mmol), Et3N(45.2 mL, 324 mmol), 및 EDC(62.1 g, 324 mmol)를 DCM(810 mL) 중에 혼합하고, 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 이어서 반응을 5 x 700 mL 물로 세척한 다음, 1 x 600 mL 1M NaOH로 세척하고, 황산나트륨으로 건조, 셀라이트를 통해 여과 및 증발시켜 53.06 g(93%)의 11,14-에이코사디엔아미드, N-메톡시-N-메틸-, (11Z,14Z)를 투명한 금색 오일로서 수득하였다.
11,14-에이코사디엔아미드, N-메톡시-N-메틸-, (11Z,14Z)- 1 (4 g, 11.38 mmol)을 250 mL 플라스크 중의 건조 THF(50.0 ml)에 용해시킨 다음, 1M 노닐마그네슘 브로마이드(22.76 ml, 22.76 mmol)를 질소하에 주위온도에서 가하였다. 10 min 후, 반응을 과량의 포화 수성 NH4Cl로 서서히 켄칭시켰다. 반응을 헥산과 물로 분리 깔때기 중으로 세척, 진탕하고, 하부 수성층을 버린 다음, 상부층을 황산나트륨으로 건조, 여과, 및 증발시켜 조 케톤을 금색 오일로서 수득하였다. 상기 조 케톤에 디메틸아민(THF 중 2M)(14.22 ml, 28.4 mmol), 이어서 Ti(O-i-Pr)4(6.67 ml, 22.76 mmol)을 가한 다음 밤새 교반시켰다. 익일에, EtOH(50 ml), 이어서 NaBH4(0.646 g, 17.07 mmol)를 가하였다. 교반 5 min 후, 330 g 실리카 칼럼과 연결된(in line) 40 g 실리카 칼럼 상에 전체 반응액을 직접 주입하였다. 10 min 100% DCM, 이어서 30 min 0-15% MeOH/DCM으로 용리하여, 20,23-노나코사디엔-10-아민, N,N-디메틸-, (20Z,23Z)(1)(2.45 g, 5.47 mmol, 48.1% 수율)을 옅은 금색 오일로서 수집하였다.
화합물 2 내지 30은 신규 양이온성 지질이며, 상기 반응식 1에 준하여 제조하였다.
(12
Z
,15
Z
)-
N
,
N
-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민(화합물 31)
디메톡시에탄(45 mL) 중 케톤 (iii)(4.0 g, 9.55 mmol), TOSMIC(2.4 g, 12.4 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 칼륨 tert-부톡시드(19.1 mmol, tBuOH 중 19.1 mL의 1M 용액)로 처리하였다. 90분 후, 반응액을 헥산과 물 사이에 분배하였다. 유기물을 물로 세척, 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 당해 물질을 플래시 크로마토그래피(0-5% EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 생성물(약 20%의 s.m. 함유)을 수득하였다. 당해 혼합물을 그대로 후속 단계로 이월하였다. LC/MS (M+H) = 430.6.
수소화 알루미늄 리튬(23.9 mmol, THF 중 23.9 mL의 1M 용액)을 니트릴 (v)(3.42 g, 8 mmol)에 직접 주위 온도에서 가하고, 반응액을 20분간 교반하였다. 반응액을 100 mL THF로 희석, 0℃로 냉각한 다음, 황산나트륨 10수화물 용액으로 주의하여 켄칭시켰다. 고체를 여과하여 THF로 세척하였다. 여과물을 진공 중에서 증발시킨 다음, 직접 후속 반응 조생성물로 이월하였다. LC/MS (M+H) = 434.6.
디클로로에탄(100 mL) 중 1급 아민(3.45 g, 6.2 mmol)의 용액을 포름알데히드(1.6 mL, 21.7 mmol), 이어서 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드(6.6 g, 31 mmol)로 처리하였다. 5분 후, 반응을 디클로로메탄과 1N NaOH 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 조 혼합물을 역상 정제용 크로마토그래피(C8 칼럼)로 정제하여 (12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민을 제공하였다.
(13
Z
,16
Z
)-
N,N-
디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)
실릴 아미드 피터슨 시약(3.1 g, 16.7 mmol)을 THF(35 mL)에 용해시킨 다음 -63℃로 냉각하였다. 당해 용액에 nBuLi(16.7 mmol, 6.7 mL의 2.5M 용액)를 가하였다. 반응을 주위 온도로 30분 동안 가온하였다. 케톤(5.0 g, 11.9 mmol)을 제2 플라스크 중 THF(25 mL)에 용해시켰다. 케톤 용액을 -60℃ 내지 -40℃의 온도를 유지하면서 30분에 걸쳐서 피터슨 시약으로 옮겼다. 반응액을 1시간 동안 -40℃로 가온한 다음, 30분 동안 0℃로 가온하였다. 반응을 중탄산나트륨으로 켄칭, 부가적인 물로 희석한 다음, 물/헥산 사이에 분배하였다. 유기물을 염수로 세척, 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(0-40% MTBE/헥산)로 정제하여 α,β-불포화 아미드 (vii)를 수득하였다.
α,β-불포화 아미드 (vii)(1 g, 2.1 mmol) 및 LS-셀렉트리드(4.1 mmol, 4.1 mL의 1M 용액)를 밀봉 튜브에서 합한 다음 24시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응을 주위 온도로 냉각시키고, 염화암모늄 용액과 헵탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켜 아미드 (viii)를 수득하였다. 당해 중간체를 직접 후속 반응 조생성물로 이월하였다.
α,β-불포화 아미드 (vii)의 택일적인 컨쥬게이트 환원은 수소화구리 환원의 이용을 수반한다:
5L RB에서, 구리 촉매(9.77 g, 17.13 mmol)를 질소하에서 톨루엔(1713 ml)에 용해시켰다. 여기에 PMHS(알드리치(Aldrich)로부터 입수, 304 ml, 1371 mmol)를 일시에 가하였다. 반응을 5분간 숙성시켰다. 용액에 α,β-불포화 아미드 (vii)(167.16 g, 343 mmol)를 가하였다. 이어서 당해 혼합물에 t-아밀 알콜(113 ml, 1028 mmol)을 3h에 걸쳐서 시린지 펌프를 통해 가하였다. 첨가 완료 후, 용액에 약 1700 mL 20% NH4OH를 반응에 조금씩 가하였다. 주의: 켄칭 초기에는 격렬한 비등 및 발포가 있으므로 면밀히 모니터링하여야 하며, 수산화암모늄을 서서히 조금씩 첨가하였다. 반응액을 물과 헥산 사이에 분배하였다. 유기물을 셀라이트를 통해 여과하고 진공 중에서 증발시켰다. 생성되는 고무질 고체 물질을 기계적 교반기를 이용하여 헥산 중에서 분쇄하여 작은 미립자를 수득한 다음, 이를 여과하여 헥산으로 세척하였다. 이어서 유기물을 진공 중에서 증발시키고 플래시 크로마토그래피(실리카, 0-15% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 목적하는 아미드 (viii)를 수득하였다. LC/MS (M+H) = 490.7.
아미드 (viii)(2.85 g, 5.8 mmol)의 용액에 수소화 알루미늄 리튬(8.7 mmol, 8.7 mL의 1M 용액)을 가하였다. 반응을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음, 황산나트륨 10수화물 용액을 서서히 가하여 켄칭시켰다. 고체를 여과하고, THF로 세척한 다음, 여과물을 진공 중에서 증발시켰다. 조 혼합물을 역상 정제용 크로마토그래피(C8 칼럼)로 정제하여 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)을 오일로서 제공하였다.
N
,
N
-디메틸-1-(2-옥틸시클로프로필)헵타데칸-8-아민(화합물 33)
0℃로 냉각한 DCM(500 mL) 중 올레산(1 g, 3.5 mmol)의 용액에 CDI(0.63 g, 3.9 mmol)를 가하였다. 반응을 30분 동안 주위 온도로 가온한 다음, 0℃로 냉각하고, 먼저 트리에틸아민(0.39 g, 3.9 mmol)으로, 이어서 디메틸 히드록실아민 히드로클로라이드(0.38 g, 3.9 mmol)로 처리하였다. 1시간 후, 반응액을 물과 헵탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산마그네슘상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켜 조 바인렙 아미드 (ii)를 수득하고 이를 직접 후속 반응으로 이월하였다.
디클로로메탄(130 mL) 중 디에틸아연(70.3 mmol, 70.3 mL의 1M 용액)의 용액을 -1℃로 냉각하고, TFA(8.0 g, 70.3 mmol)로 적가 처리하였다. 30분 후, 디아이오도메탄(18.8 g, 70.3 mmol)을 가하고, 이를 30분 동안 얼음조에서 숙성시켰다. 당해 용액에 바인렙 아미드 (ii)(7.6 g, 23.4 mmol)를 가하였다. 반응을 주위 온도로 가온하여 1시간 동안 교반하였다. 반응을 염화암모늄 용액(100 mL)으로 켄칭하고, 유기층을 분배, 10% 티오황산나트륨으로 세척, 황산마그네슘상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(0-30% MTBE/헵탄)로 정제하여 목적 생성물 (x)를 수득하였다.
바인렙 아미드 (x)에서 화합물 33으로의 전환은 상기 화합물 1에 대해 기술된 것(노닐 그리냐르 첨가에 이은 환원성 아미노화)과 유사한 방식으로 수행하였다.
화합물 34 내지 43은 신규 양이온성 지질이며, 상기 반응식 1 내지 4에 준하여 제조하였다.
(11
E
,20
Z
,23
Z
)-
N
,
N
-디메틸노나코사-11,20,23-트리엔-10-아민(화합물 44)
-78℃로 냉각한 THF(127 mL) 중 LDA(95 mmol, 47.5 mL의 2M 용액)의 용액에 t-부틸 아세테이트를 가하였다. 반응을 15분 동안 교반한 다음, 알데히드 (xi)를 가하였다. 반응을 염화암모늄 용액으로 즉시 켄칭시키고, 주위 온도로 가온한 다음, 물/펜탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. LC/MS (M+H-tBu) = 325.4.
히드록시 케톤 (xii)(7 g, 18.4 mmol)을 디클로로메탄(150 mL)에 용해시켜 0℃로 냉각한 다음, 데옥소플루오르(7.3 g, 33.1 mmol)로 처리하였다. 반응을 16시간 동안 교반하면서 주위 온도로 가온한 다음, 중탄산나트륨 용액으로 켄칭하였다. 반응을 분배하고, 유기물을 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 플래시 칼럼 크로마토그래피(0-5% 에틸 아세테이트/헥산)로 β-플루오로 에스테르를 수득하였다.
디클로로메탄 중의 플루오로 에스테르 중간체(6 g, 15.6 mmol)를 염화수소(157 mmol, 디옥산 중 39.2 mL의 4M 용액)로 처리하고, 반응액을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응액을 진공 중에서 증발시켜 목적하는 β-플루오로산 (xiii)을 수득하였다. LC/MS (M+H) = 327.3.
플루오로 카르복실산 (xiii)(5.1 g, 15.7 mmol), EDC(6.0 g, 31.4 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드(3.1 g, 31.4 mmol), 트리메틸아민(4.0 g, 39.2 mmol), 및 HOAt(4.3 g, 31.4 mmol)를 DCM(78 mL) 중에서 합하여 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응액을 물/DCM 사이에 분배하고, 유기물을 물(3x)과 NaOH 용액(1x)으로 세척, 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 조 물질을 역상 정제용 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 바인렙 아미드 (xiv)를 수득하였다. LC/MS (M+H) = 370.4.
THF(50 mL) 중 바인렙 아미드 xiv(4.3 g, 11.7 mmol)의 용액을 노닐마그네슘 브로마이드(23.4 mmol, 23.4 mL의 1M 용액)로 주위 온도에서 처리하였다. 1시간 후 반응을 염화암모늄 용액으로 켄칭하고 물과 펜탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조, 여과 및 진공 중에서 증발시켰다. 당해 물질을 후속 단계 조생성물로 이월하였다.
케톤 (xv)(5.1 g, 11.7 mmol)을 디메틸아민(29.3 mmol, THF 중 14.7 mL의 2M 용액)과 티타늄(IV) 이소프로폭시드(6.7 g, 23.5 mmol)로 처리하고, 반응을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에탄올(50 mL), 이어서 수소화붕소나트륨(0.67 g, 17.6 mmol)을 가하였다. 반응액을 실리카 칼럼에 직접 로딩하고, 플래시 크로마토그래피(0-15% MeOH/DCM)로 정제하였다. 물질은 정제용 역상 크로마토그래피에 의한 2차 정제를 요하였으며 그에 따라 (11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,23-트리엔-10-아민을 수득하였다.
화합물 45는 문헌 [Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176], WO2010/042877 A1, WO2010/048536 A2, WO2010/088537 A2, 및 WO2009/127060 A1에 기재된 바와 같은 DLinKC2DMA이다.
화합물 46은 WO2010/054401, 및 WO2010/144740 A1에 기재된 바와 같은 MC3이다.
LNP 조성물
본 발명의 하기 지질 나노입자 조성물(LNP)은 올리고뉴클레오티드, 구체적으로는 siRNA 및 miRNA의 전달에 유용하다:
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 56.6/38/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 60/38/2;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 67.3/29/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 49.3/47/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 50.3/44.3/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10; 및
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10.
LNP 공정 설명:
지질 나노입자(LNP)는 충돌 제트 공정으로 제조된다. 입자는 알콜에 용해된 지질을 시트레이트 완충제에 용해된 siRNA와 혼합함으로써 형성된다. 지질:siRNA의 혼합비는 45-55% 지질 및 65-45% siRNA로 표적화된다. 지질 용액은 본 발명의 신규한 양이온성 지질, 헬퍼 지질(콜레스테롤), PEG(예를 들어, PEG-C-DMA, PEG-DMG) 지질, 및 DSPC를 5 내지 15 mg/mL의 농도, 알콜(예를 들어, 에탄올)중 9 내지 12 mg/mL의 표적 농도로 함유한다. 지질의 비율은 양이온성 지질에 대하여 25 내지 98의 몰% 범위, 35 내지 65의 표적 범위를 가지며, 헬퍼 지질은 0 내지 75의 몰% 범위, 30 내지 50의 표적 범위를 가지며, PEG 지질은 1 내지 15의 몰% 범위, 1 내지 6의 표적 범위를 가지며, DSPC는 0 내지 15의 몰% 범위, 0 내지 12의 표적 범위를 가진다. siRNA 용액은 1종 이상의 siRNA 서열을 pH 범위 3.5 내지 5의 시트르산나트륨 완충 염 용액 중 0.3 내지 1.0 mg/mL의 농도 범위로, 0.3 내지 0.9 mg/mL의 표적 범위로 함유한다. 두 액체를 30 내지 40℃를 표적 온도로 하여 15 내지 40℃ 범위의 온도로 가열한 다음, 충돌 제트 믹서에서 혼합하여 즉시 LNP를 형성하였다. teeID는 0.25 내지 1.0 mm의 범위 및 10 내지 600 mL/min의 총 유량을 갖는다. 유량과 튜빙 ID의 조합은 LNP의 입자 크기를 30 내지 200 nm으로 조절하는 효과가 있다. 이어서 용액을 보다 높은 pH의 완충 용액과 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위로 하되 1:2 vol:vol을 표적으로 하는 혼합비로 혼합한다. 당해 완충 용액은 30 내지 40℃를 표적으로 하여 15 내지 40℃의 범위의 온도에 있다. 혼합된 LNP를 음이온 교환 여과 단계에 투입하기에 앞서 30분 내지 2 hr 유지시킨다. 인큐베이션하는 동안의 온도는 30 내지 40℃을 표적으로 하여 15 내지 40℃의 범위이다. 인큐베이션 후, 용액을 음이온 교환 분리 단계를 포함하여 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 당해 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜빙 ID 및 10 내지 2000 mL/min의 유량을 사용한다. LNP를 농축하고, 한외여과 공정을 통해 정용여과하면, 여기서 알콜은 제거되고, 시트레이트 완충제는 최종 완충제 용액, 예컨대 포스페이트 완충 염수로 교환된다. 한외여과 공정은 접선 흐름 여과 포맷(TFF)을 사용한다. 당해 공정은 30 내지 500 KD의 막 공칭 분자량 컷오프 범위를 사용한다. 막 포맷은 중공 섬유 또는 편평 시트 카세트일 수 있다. 적당한 분자량 컷오프를 갖는 TFF 공정은 잔류액 중에 LNP를 존속시키고, 여과물 또는 투과액은 알콜; 시트레이트 완충제; 최종 완충제 폐액을 함유한다. TFF 공정은 초기 농도 내지 1 내지 3 mg/mL의 siRNA 농도에 이르는 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 용액을 10 내지 20 용적에 대해 최종 완충제에 대하여 정용여과하여 알콜을 제거하고 완충제 교환을 수행한다. 물질을 이어서 부가적으로 1 내지 3배 농축한다. LNP 공정의 최종 단계는 LNP 농축 용액을 멸균 여과하고, 생성물을 바이알에 넣는 것이다.
분석 절차:
1) siRNA 농도
siRNA 이중체 농도는 2996 PDA 검출기를 구비한 워터스 2695 알리안스(Waters 2695 Alliance) 시스템(워터스 코포레이션(Waters Corporation), 미국 매사추세츠주 밀포드)을 사용하여 강 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(SAX-HPLC)로 측정한다. 별도로는 RNAi 전달 비히클(Delivery Vehicle)(RDV)로도 호칭되는 LNP를 0.5% 트리톤(Triton) X-100으로 처리하여 전체 siRNA를 유리시키고, 254 nm에서 UV 검출을 수행하는 디오넥스 바이오LC DNA팩(Dionex BioLC DNAPac) PA 200(4x250 mm) 칼럼을 사용하여 SAX 분리에 의해 분석한다. 이동상은 A: 25 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH, pH 7.0 및 B: 250 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH, pH 7.0, 직선 구배: 0 내지 15 min 및 유량: 1 ml/min로 이루어진다. siRNA의 양은 siRNA 표준 곡선과 비교함으로써 측정된다.
2) 캡슐화율
형광 시약 SYBR 골드(SYBR Gold)를 RNA 정량에 사용하여 RDV의 캡슐화율을 모니터링한다. RDV를 트리톤 X-100과 함께 또는 그것없이 사용하여 유리 siRNA 및 전체 siRNA 양을 측정한다. 검정은 스펙트라맥스(SpectraMax) M5e 마이크로플레이트 분광광도계(몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 수행한다. 샘플을 485 nm에서 여기시키고, 형광 방출을 530 nm에서 측정하였다. siRNA의 양은 siRNA 표준 곡선과 비교함으로써 측정된다.
캡슐화율 = (1- 유리 siRNA/전체 siRNA) x100%
3) 입자 크기 및 다분산도
1 ㎍ siRNA를 함유하는 RDV를 1 x PBS로 3 ml의 최종 용적이 되게 희석한다. 샘플의 입자 크기 및 다분산도는 제타PALS(ZetaPALS) 기기(브룩헤이븐 인스투르먼츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corporation), 미국 뉴욕주 홀츠빌)를 사용하여 동적 광산란법으로 측정한다. 산란 강도는 He-Ne 레이저로 25℃에서 90°의 산란각으로 측정된다.
4) 제타 전위 분석
1 ㎍ siRNA를 함유하는 RDV를 1 mM 트리스 완충제(pH 7.4)로 2 ml의 최종 용적이 되게 희석한다. 샘플의 전기영동 이동도는 전극 및 전원으로서 He-Ne 레이저를 구비한 제타PALS 기기(브룩헤이븐 인스투르먼츠 코포레이션, 미국 뉴욕주 홀츠빌)를 사용하여 측정된다. 제타 전위의 계산에 스몰루코프스키(Smoluchowski) 한계를 가정한다.
5) 지질 분석
개별 지질 농도는 코로나-대전 에어로졸 검출기(CAD)(이에스에이 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(ESA Biosciences, Inc.), 미국 매사추세츠주 켈름스포드)를 구비한 워터스 2695 알리안스 시스템(워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 측정된다. RDV 중의 개별 지질은 CAD를 구비한 애질런트 조르박스(Agilent Zorbax) SB-C18(50 x 4.6 mm, 1.8 ㎛ 입자 크기) 칼럼을 사용하여 60℃에서 분석한다. 이동상은 A: H2O 중 0.1% TFA 및 B: IPA 중 0.1% TFA로 구성된다. 구배는 0시부터 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B에서 1.00 min에서 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B로; 1.00 내지 5.00 min에 걸쳐서 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B; 5.00 min부터 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B에서 10.00 min에서 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B로; 10.00 min부터 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B에서 15.00 min에서 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B로; 및 15.00 min부터 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B에서 20.00 min에서 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B로, 1 ml/min의 유량으로 변화시킨다. 개별 지질 농도는 RDV 중의 모든 지질 성분을 가지고 2차 곡선 맞춤(quadratic curve fit)으로 표준 곡선과 비교함으로써 측정된다. 각 지질의 몰%는 그의 분자량에 기초하여 계산된다.
화합물 32 제형에 대한 일반 LNP 공정 설명:
지질 나노입자를 충돌 제트 공정으로 제조하였다. 알콜 중에 용해된 지질을 시트레이트 완충제에 용해된 siRNA와 혼합함으로써 입자를 형성하였다. 지질 용액은 양이온성 지질, 헬퍼 지질(콜레스테롤), PEG(예를 들어, PEG-C-DMA, PEG-DMG) 지질, 및 DSPC를 5 내지 15 mg/mL의 농도, 알콜(예를 들어, 에탄올) 중 9 내지 12 mg/mL의 표적 농도로 함유하였다. 지질의 비율은 양이온성 지질에 대하여 25 내지 98의 몰% 범위로서, 35 내지 65의 표적 범위를 가지며, 헬퍼 지질은 0 내지 75의 몰% 범위로서, 30 내지 50의 표적 범위를 가지며, PEG 지질은 1 내지 15의 몰% 범위로서, 1 내지 6의 표적 범위를 가지며, DSPC는 0 내지 15의 몰% 범위로서, 0 내지 12의 표적 범위를 가졌다. siRNA 용액은 pH 범위 3.5 내지 5의 시트르산나트륨 완충 염 용액 중 1종 이상의 siRNA 서열을 0.3 내지 0.6 mg/mL의 농도 범위로 함유하였고, 표적 범위는 0.3 내지 0.9 mg/mL였다. 두 용액을 30 내지 40℃를 표적 온도로 하여 15 내지 40℃ 범위의 온도로 가열한 다음, 충돌 제트 믹서에서 혼합하여 즉시 LNP를 형성하였다. teeID는 0.25 내지 1.0 mm의 범위 및 10 내지 600 mL/분의 총 유량을 가졌다. 유량과 튜빙 ID의 조합은 LNP의 입자 크기를 30 내지 200 nm으로 조절하는 효과가 있었다. 이어서 LNP 현탁액을 보다 높은 pH의 완충 용액과 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위로 하되 1:2 vol:vol을 표적으로 하는 혼합비로 혼합하였다. 당해 완충 용액은 30 내지 40℃를 표적으로 하여 15 내지 40℃의 범위의 온도에 있었다. 당해 LNP 현탁액을 보다 높은 pH의 완충 용액과 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위로 하되 1:2 vol:vol을 표적으로 하는 혼합비로 추가 혼합하였다. 완충 용액은, 30 내지 40℃를 표적으로 하여 15 내지 40℃의 범위의 온도에 있었다. 혼합된 LNP를 음이온 교환 여과 단계에 앞서 30분 내지 2 hr 유지시켰다. 인큐베이션하는 동안의 온도는 15 내지 40℃의 범위였으며, 표적 온도는 30 내지 40℃였다. 인큐베이션 후, LNP 현탁액을 음이온 교환 분리 단계를 포함하여 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 당해 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜빙 ID 및 10 내지 2000 mL/분의 유량을 사용하였다. LNP를 농축하고, 한외여과 공정을 통해 정용여과하였으며, 여기서 알콜은 제거되었고, 시트레이트 완충제는 최종 완충제 용액, 예컨대 포스페이트 완충 염수로 교환되었다. 한외여과 공정은 접선 흐름 여과 포맷(TFF)을 사용하였다. 당해 공정은 30 내지 500 KD의 막 공칭 분자량 컷오프 범위를 사용하였다. 막 포맷은 중공 섬유 또는 편평 시트 카세트였다. 적당한 분자량 컷오프를 갖는 TFF 공정은 잔류액 중에 LNP를 존속시켰고, 여과물 또는 투과액은 알콜; 시트레이트 완충제; 및 최종 완충제 폐액을 함유하였다. TFF 공정은 초기 농도 내지 1 내지 3 mg/mL의 siRNA 농도에 이르는 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 현탁액을 10 내지 20 용적에 대해 최종 완충제에 대하여 정용여과하여 알콜을 제거하고 완충제 교환을 수행하였다. 물질을 이어서 부가적으로 1 내지 3배 농축하였다. LNP 공정의 최종 단계는 LNP 농축 용액을 멸균 여과하고, 생성물을 바이알에 넣는 것이었다.
분석 절차:
siRNA 농도
siRNA 이중체 농도는 2996 PDA 검출기를 구비한 워터스 2695 알리안스 시스템(워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 사용하여 강 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(SAX-HPLC)로 측정하였다. 다르게는 RNAi 전달 비히클(RDV)로도 호칭되는 LNP를 0.5% 트리톤 X-100으로 처리하여 전체 siRNA를 유리시키고 254 nm에서 UV 검출을 수행하는 디오넥스 바이오LC DNA팩 PA 200(4x250 mm) 칼럼을 사용하여 SAX 분리에 의해 분석하였다. 이동상은 A: 25 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH, pH 7.0 및 B: 250 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH, pH 7.0, 직선 구배: 0 내지 15 min 및 유량: 1 ml/분으로 이루어졌다. siRNA의 양은 siRNA 표준 곡선과 비교함으로써 측정되었다.
캡슐화율
형광 시약 SYBR 골드를 RNA 정량에 사용하여 RDV의 캡슐화율을 모니터링하였다. RDV를 트리톤 X-100과 함께 또는 그것없이 사용하여 유리 siRNA 및 전체 siRNA 양을 측정하였다. 검정은 스펙트라맥스 M5e 마이크로플레이트 분광광도계(몰리큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 수행한다. 샘플을 485 nm에서 여기시키고, 형광 방출을 530 nm에서 측정하였다. siRNA의 양은 siRNA 표준 곡선과 비교함으로써 측정된다.
캡슐화율 = (1- 유리 siRNA/전체 siRNA) x100%
입자 크기 및 다분산도
1 ㎍ siRNA를 함유하는 RDV를 1 x PBS로 3 ml의 최종 용적이 되게 희석하였다. 샘플의 입자 크기 및 다분산도는 제타PALS 기기(브룩헤이븐 인스투르먼츠 코포레이션, 미국 뉴욕주 홀츠빌)를 사용하여 동적 광 산란법으로 측정하였다. 산란 강도는 He-Ne 레이저로 25℃에서 90°의 산란각으로 측정되었다.
제타 전위 분석
1 ㎍ siRNA를 함유하는 RDV를 1 mM 트리스 완충제(pH 7.4)로 2 ml의 최종 용적이 되게 희석하였다. 샘플의 전기영동 이동도는 전극 및 전원으로서 He-Ne 레이저를 구비한 제타PALS 기기(브룩헤이븐 인스투르먼츠 코포레이션, 미국 뉴욕주 홀츠빌)를 사용하여 측정되었다. 제타 전위의 계산에 스몰루코프스키 한계를 가정하였다.
지질 분석
개별 지질 농도는 코로나-대전 에어로졸 검출기(CAD)(이에스에이 바이오사이언시즈 인코포레이티드, 미국 매사추세츠주 켈름스포드)를 구비한 워터스 2695 알리안스 시스템(워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 측정되었다. RDV 중의 개별 지질은 CAD를 구비한 애질런트 조르박스 SB-C18(50 x 4.6 mm, 1.8 ㎛ 입자 크기) 칼럼을 사용하여 60℃에서 분석하였다. 이동상은 A: H2O 중 0.1% TFA 및 B: IPA 중 0.1% TFA로 구성되었다. 구배는 0시부터 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B에서 1.00 min에서 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B로; 1.00 내지 5.00 min에 걸쳐서 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B; 5.00 min부터 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B에서 10.00 min에서 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B로; 10.00 min부터 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B에서 15.00 min에서 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B로; 및 15.00 min부터 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B에서 20.00 min에서 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B로, 1 ml/분의 유량으로 변화시켰다. 개별 지질 농도는 RDV 중의 모든 지질 성분을 가지고 2차 곡선 맞춤으로 표준 곡선과 비교함으로써 측정되었다. 각 지질의 몰%는 그의 분자량에 기초하여 계산되었다.
표 1의 다양한 제형을 위한 일반 LNP 제조
siRNA 및/또는 담체 분자를 20 mM 시트르산나트륨 완충제(pH 5.0)에 약 0.40 mg/mL의 농도로 용해시킴으로써 표 1의 siRNA 나노입자 현탁액을 제조한다. 지질 용액은 양이온성 지질(예를 들어, 32, 표 2의 구조 참조), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-DMG의 혼합물(비율은 표 1에 제시)을 무수 에탄올에 약 8 mg/mL의 농도로 용해시킴으로써 제조된다. 질소:포스페이트의 비는 6:1에 근접한다.
거의 등용적의 siRNA/담체 및 지질 용액을 두 FPLC 펌프를 이용하여 동일 유량으로 혼합 T 커넥터로 전달한다. 배압 밸브를 이용하여 목적하는 입자 크기로 조정한다. 생성되는 유백색 혼합물을 멸균 유리병에 수집한다. 이어서 당해 혼합물을 등용적의 시트레이트 완충제로, 이어서 등용적의 PBS(pH 7.4)로 희석한 다음, 이온-교환막을 통해 여과하여 혼합물 중에 있을 임의의 유리 siRNA/담체를 제거한다. PBS(7.4)에 대한 한외여과를 이용하여 에탄올을 제거하고 완충제를 교환한다. 목적하는 용적으로 농축하여 최종 LNP를 수득한 다음 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균여과한다. 수득된 LNP는 입자 크기, 제타 전위, 알콜 함량, 총 지질 함량, 캡슐화된 핵산, 및 총 핵산 농도에 관하여 특징분석된다.
LNP 제조 공정
비-제한 실시예에서, LNP는 다음과 같이 대량으로 제조된다. 공정은 (1) 지질 용액의 제조; (2) siRNA/담체 용액의 제조; (3) 혼합/입자 형성; (4) 인큐베이션; (5) 희석; (6) 한외여과 및 농축으로 이루어진다.
지질 용액의 제조
2L 유리 시약병 및 측정용 실린더를 발열물질 제거한다. 지질을 실온으로 가온한다. 8.0 g의 화합물 32를 피펫을 이용하여 유리 시약병에 옮긴 다음, 1.2 g의 DSPC, 3.5 g의 콜레스테롤과 0.9 g의 PEG-DMG를 가한다. 혼합물에 1L의 에탄올을 가한다. 시약병을 가열된 수조에 넣는데, 온도는 50℃를 초과하지 않도록 한다. 지질 현탁액을 교반 막대로 교반한다. 열전대 프로브를 밀봉 어댑터를 구비한 둥근 바닥 플라스크의 하나의 경부를 통해 현탁액에 넣는다. 현탁액을 투명해질 때까지 30 내지 40℃에서 가열한다. 용액을 실온으로 냉각시킨다.
siRNA/담체 용액의 제조
코닝(Corning) 저장병과 같은 멸균 용기에 siRNA-1 분말의 물 보정 계수(대략 1.2)의 0.4 g배를 칭량해 넣는다. siRNA를 발열물질-제거된 2L 유리 시약병으로 옮긴다. 칭량 용기를 시트레이트 완충제(20 mM, pH 5.0)로 3회 세정하고, 세정액을 2L 유리병에 넣고, 적당량의 시트레이트 완충제로 1L가 되게 만든다. siRNA 용액의 농도는 하기 절차를 이용하여 UV 분광계로 측정한다. 20 ㎕를 용액으로부터 취하여, 50배 희석하여 1000 ㎕로 되게 한 다음, 시트레이트 완충제로 블랭킹(blanking) 후 A260 nm에서 UV 판독을 기록한다. 이 과정을 반복한다. 두 샘플에 대한 판독이 일치하면, 평균을 취하고, siRNA의 흡광 계수에 기초하여 농도를 계산한다. 최종 농도가 0.40±0.01 mg/mL의 범위를 벗어나면, 더 많은 siRNA/담체 분말을 가하거나, 또는 더 많은 시트레이트 완충제를 가하여 농도를 조정한다. 당해 공정을, 적용할 수 있으면, 제2 siRNA에 대해 반복한다.
이와 달리, siRNA/담체 용액이 2종 이상의 siRNA 이중체 및/또는 담체의 칵테일 대신에 단일 siRNA 이중체 및/또는 담체를 포함하여 구성된 경우, siRNA/담체를 20 mM 시트레이트 완충제(pH 5.0)에 용해시켜 0.4 mg/mL의 최종 농도가 되게 한다.
이어서 지질 및 에탄올 용액을 마스터 플렉스 페리스탈틱 펌프(Master Flex Peristaltic Pump) 모델 7520-40을 사용하여 발열물질-제거된 유리 용기에 팔 아크로팩(Pall Acropak) 20 0.8/0.2 ㎛ 멸균 필터 PN 12203을 통해 멸균여과하여 캡슐화 공정을 위한 멸균 출발 물질을 제공한다. 여과 공정은 80 mL 스케일, 막 면적 20 cm2로 수행된다. 유량은 280 mL/분이다. 당해 공정은 튜빙 직경과 여과 면적을 증가시킴으로써 규모조절이 가능하다.
입자 형성 - 혼합 단계
2-배럴 시린지-구동 펌프(하바드 33 트윈 시린지(Harvard 33 Twin Syringe))를 사용하여, 멸균 지질/에탄올 용액 및 멸균 siRNA/담체 또는 siRNA/담체 칵테일/시트레이트 완충제(20 mM 시트레이트 완충제, pH 5.0) 용액을 0.5 mm ID T-믹서(혼합 단계 I)에서 동등하거나, 또는 거의 동등한 유량으로 혼합한다. 생성되는 배출구 LNP 현탁액은 40 내지 50 vol% 에탄올을 함유하였다. 45 vol% 에탄올 배출구 현탁액을 목적으로 하는 경우, 멸균 지질/에탄올 및 멸균 siRNA/담체 또는 siRNA/담체 칵테일/시트레이트 완충제 용액을 각각 54 mL/min 및 66 mL/min의 유량으로 혼합하여, 혼합 배출구의 총 유량이 120 mL/min이 되게 한다.
희석
혼합 단계 I의 배출구 스트림을 4 mm ID T-믹서(혼합 단계 II)에 직접 공급하며, 여기서 그 스트림은 보다 높은 pH의 완충 용액(20 mM 시트르산나트륨, 300 mM 염화나트륨, pH 6.0)으로 1:1 vol:vol%의 비로 희석된다. 당해 완충 용액은 온도가 30 내지 40℃의 범위이며, 연동 펌프(콜 파머 마스터플렉스(Cole Parmer MasterFlex) L/S 600 RPM)를 통해 120 mL/min의 유량으로 4 mm T-믹서로 전달된다.
혼합 단계 II의 배출구 스트림을 6 mm ID T-믹서(혼합 단계 III)에 직접 공급하며, 여기서 그 스트림은 보다 높은 pH의 완충 용액(PBS, pH 7.4)으로 1:1 vol:vol%의 비로 희석된다. 당해 완충 용액은 온도가 15 내지 25℃의 범위이며, 연동 펌프(콜 파머 마스터플렉스 L/S 600 RPM)를 통해 240 mL/min의 유량으로 6 mm T-믹서로 전달된다.
인큐베이션 및 유리 siRNA 제거
혼합 단계 III의 배출구 스트림을 혼합 후 30분 인큐베이션을 위해 유지시킨다. 인큐베이션은 35 내지 40℃의 온도에서 수행되며, 공정내(in-process) 현탁액은 광으로부터 보호하였다. 인큐베이션 후, 유리(비-캡슐화) siRNA를 무스탕(Mustang) Q 크로마토그래피 필터(캡슐)를 이용하여 음이온 교환을 통해 제거한다. 사용에 앞서, 크로마토그래피 필터를 1N NaOH, 1M NaCl, 및 PBS 중 12.5 vol% 에탄올의 최종 용액의 플러시(flush)로 순차적으로 예비처리한다. 최종 플러시의 pH를 pH <8이 보장되도록 체크한다. 이어서 인큐베이션한 LNP 스트림을 연동 펌프(콜 파머 마스터플렉스 L/S 600 RPM)를 매개로 무스탕 Q 필터를 통해 대략 100 mL/min의 유량으로 여과한다. 여과 스트림을 하기와 같은 한외여과 및 농축을 위해 멸균 유리 용기에 수납한다.
한외여과, 농축 및 멸균 여과
한외여과 공정은 시한(時限) 공정이며, 유량은 신중히 모니터링되어야 한다. 이는 2-단계 공정으로서; 첫 번째는 희석 물질을 취합하여 대략 8배 농축하여 대략 0.3 내지 0.6 mg/mL siRNA의 농도가 되게 하는 농축 단계이다.
첫 번째 단계에서, 한외여과막 100 kDa PES(스펙트럼 랩스(Spectrum Labs))이 설치된 링 스탠드를 연동 펌프(스펙트럼 크로스플로II 시스템(Spectrum KrosFloII System))에 부착한다. 9.2 L의 멸균 증류수를 저장소에 가하고; 3 L를 폐액으로 배출시킨 다음, 나머지를 투과액을 통과하여 폐액으로 배출시킨다. 5.3 L의 0.25N 수산화나트륨을 저장소에 가하는데, 1.5 L는 폐액으로 배출되고, 3.1 L는 투과액을 통과하여 폐액으로 배출된다. 잔류 수산화나트륨을 소독을 위해 시스템에 유지시키고(적어도 10분), 이어서 펌프를 배출시킨다. 9.2 L의 70(v/v)% 이소프로필 알콜을 저장소에 가하는데, 1.5 L는 폐액으로 배출되고, 나머지는 투과액을 통과하여 폐액으로 배출된다. 6 L의 조건화 완충제(포스페이트 완충 염수 중 12.5% 에탄올)를 배출된 1.5 L와 함께 폐액으로 배출시키고, 나머지는 폐액이 중성 pH(7 내지 8)가 될 때까지 투과액을 거쳐 배출된다. 막 플럭스 값을 기록하고, 이어서 펌프를 배출시킨다.
희석된 LNP 용액을 저장소에 1.1 L 눈금표시까지 넣는다. 펌프를 2.3 L/min으로 작동시킨다. 재순환 5분 후, 투과액 펌프를 62.5 mL/min으로 작동시키며, 액체 수준은 저장소에서 대략 950 mL로 일정하다. 희석된 LNP 용액을 9.8 L에서 1.1 L로 140분에 걸쳐 농축하고, 모든 희석 LNP 용액이 저장소로 옮겨지면 펌프를 가동중지한다.
두 번째 단계는 에탄올/수성 완충제를 포스페이트 완충 염수로 교환하는 정용여과 단계이다. 당해 단계 동안, 대략 10 내지 20 정용여과 용적의 포스페이트 완충 염수가 사용된다. 정용여과 후, 두 번째 농축을 수행하여 LNP 현탁액을 3배 농축하여 대략 1 내지 1.5 mg/mL siRNA가 되게 한다. 농축 현탁액을 멸균 플라스틱 PETG 병에 수집한다. 이어서 최종 현탁액을 바이알 충전에 앞서 최종 멸균을 위해 팔(Pall) 0.45 ㎛ PES 및 팔 0.2 ㎛ PES 필터를 통해 순차적으로 여과시킨다.
일 실시양태에서, 본 발명의 LNP 조성물은 화학식 A의 양이온성 지질, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG-DMG를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 LNP 조성물은 동결보호제를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 베르바스코스, 만니톨, 글루코스, 락토스, 말토스, 말토트리오스-헵타오스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 인슐린, 솔비톨, 글리세롤, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 프롤린, 디메틸술폭시드 또는 이들의 임의의 조합이다.
또 다른 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스이다.
또 다른 실시양태에서, 동결보호제는 트레할로스이다.
또 다른 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스와 트레할로스의 조합이다.
또 다른 실시양태에서, LNP 조성물은 양이온성 지질 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32), 콜레스테롤, DSPC 및 PEG-DMG를 포함한다.
수득된 LNP는 입자 크기, 제타 전위, 알콜 함량, 총 지질 함량, 캡슐화된 핵산, 및 총 핵산 농도에 관하여 특징분석된다.
당업자라면 본 발명이 상기 목적을 수행하고 언급된 목표와 이점, 거기에 내포되어 있는 것들을 달성하는 데에 아주 적합함을 쉽게 인지할 것이다. 현재 바람직한 실시양태를 대표하는 본원 기재의 방법 및 조성물은 예시적인 것이며 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지는 않는다. 거기에서의 변화 및 다른 용도가 당업자에게 떠오를 것이며, 이들도 본 발명의 취지 안에 포함되며, 특허청구범위에 의해 규정된다.
전술한 LNP 공정을 이용하여, 하기 비율을 갖는 특정 LNP를 동정하였다:
공칭 조성물:
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 60/38/2
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10
Luc siRNA
AUGC - 리보스
iB - 역위된 데옥시 무염기성
UC - 2' 플루오로
AGT - 2' 데옥시
AGU - 2' OCH3
공칭 조성물
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 60/38/2
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10
ApoB siRNA
AUGC - 리보스
iB - 역위된 데옥시 무염기성
UC - 2' 플루오로
AGT - 2' 데옥시
AGU - 2' OCH3
UsA - 포스포로티오에이트 연결
베타-카테닌 siRNA
AUGC - 리보스
iB - 역위된 데옥시 무염기성
UC - 2' 플루오로
AGT - 2' 데옥시
AGU - 2' OCH3
UsA - 포스포로티오에이트 연결
AUGC - 리보스
iB - 역위된 데옥시 무염기성
UC - 2' 플루오로
AGT - 2' 데옥시
AGU - 2' OCH3
UsA - 포스포로티오에이트 연결
AUGC - 리보스
iB - 역위된 데옥시 무염기성
UC - 2' 플루오로
AGT - 2' 데옥시
AGU - 2' OCH3
UsA - 포스포로티오에이트 연결
올리고뉴클레오티드 합성은 당업계에 익히 공지되어 있다. (US 특허 출원: US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US 2009/0263407 및 US 2009/0285881 및 PCT 특허 출원: WO2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 및 WO2010/054406 참조). 실시예에서 개시되고 사용되는 siRNA는 표준 고체 상 절차를 통해 합성하였다.
실시예 1
마우스 생체내 효능 평가
바로 위에서 기술한 공칭 조성물에서, 화합물 1 내지 44를 사용하는 LNP를 생체내 효능에 대하여 평가하였다. siRNA는 반딧불이(포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)) 루시퍼라제 유전자(수탁번호 M15077)에 대한 mRNA 전사물을 표적으로 한다. 루시퍼라제 siRNA의 1차 서열 및 화학적 변형 패턴은 앞에서 나타내었다. 생체내 루시퍼라제 모델은 모든 세포에 반딧불이 루시퍼라제-코딩 서열이 존재하는 트랜스제닉 마우스를 이용한다. 다나 화버 캔서 인스티튜트(Dana Farber Cancer Institute)로부터 허가받은 ROSA26-LoxP-Stop-LoxP-Luc(LSL-Luc) 트랜스제닉 마우스를, 우선 LSL 서열을 재조합 Ad-Cre 바이러스(벡터 바이오랩스(Vector Biolabs))로 제거함으로써 루시퍼라제 유전자의 발현을 유도한다. 바이러스의 장기친화성(organo-tropic) 성향에 기인하여, 꼬리 정맥 주사를 통해 전달될 때 발현은 간에 국한된다. 루시페린 기질(캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences))의 투여 후 IVIS 이미저(제노진(Xenogen))를 사용하여 광 출력을 측정함으로써 간에서의 루시퍼라제 발현 수준을 정량한다. 투여전 발광 수준은 RDV의 투여에 앞서 측정된다. PBS 중 루시페린(15 mg/mL)을 150 ㎕의 용적으로 복강내(IP) 주사한다. 4분 인큐베이션 기간 후, 마우스를 이소플루란으로 마취하여 IVIS 이미저에 넣는다. PBS 비히클 중의 RDV(siRNA 함유)를 0.2 mL의 용적으로 꼬리 정맥 주사하였다. 최종 용량 수준은 0.1 내지 0.5 mg/kg siRNA 범위였다. 대조군으로서 PBS 비히클을 단독 투여하였다. 마우스를 전술한 방법을 이용하여 투여 48시간후 영상화하였다. 루시페린 광 출력의 변화는 루시퍼라제 mRNA 수준과 직접 상관관계가 있으며, 루시퍼라제 siRNA 활성의 간접 측정을 나타낸다. 생체내 효능 결과는 투여전 발광 수준에 대한 발광의 %억제로서 표현된다. 루시퍼라제 siRNA RDV의 전신 투여는 루시퍼라제 발현을 용량 의존적 방식으로 감소시켰다. 옥틸-CLinDMA(OCD) 양이온성 지질을 함유하는 RDV로 투여한 것에 비해 화합물 1 함유 RDV로 투여한 마우스에서 더 큰 효능이 관찰되었다(도 1). OCD는 공지되어 있고, WO2010/021865에 기재되어 있다. MC3(화합물 46) 양이온성 지질을 함유하는 RDV 대비, 화합물 32 및 33 함유 RDV로 투여한 마우스에서 유사한 효능이 관찰되었다(도 11).
실시예 2
시험관내 ApoE 결합 검정
LNP를 90% 붉은털원숭이 혈청 중 37℃에서 4 ㎍/mL의 최종 LNP 농도로 인큐베이션한다. 인큐베이션은 20분간 궤도 회전으로 수행한다. 인큐베이션 후, 샘플을 PBS에 1:20 희석하고, 100 ㎕의 각 희석 샘플을 항-PEG 항체 코팅된 96-웰 플레이트(라이프 다이애그노스틱스(Life Diagnostics) 카탈로그 번호 P-0001PL)의 웰에 분취한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 300 ㎕의 PBS로 5회 세척한다. 세척 후, 50 ㎕의 0.2% 트리톤 X-100을 각각의 웰에 가하고, 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트 진탕기 상에서 1분간 750 rpm으로 진탕한다. 샘플을 샘플의 ApoE ELISA 및 스템 루프 PCR 분석을 수행하기에 앞서 동결시킨다.
ApoE ELISA 검정을 수행하여 붉은털원숭이 혈청에서의 인큐베이션 후 LNP에 결합한 ApoE를 정량한다. 항-ApoE 항체(밀리포어(Milipore), 카탈로그 번호 AB947)를 PBS에 1:1000 희석하고, 100 ㎕의 희석 항체를 폴리스티렌 고-결합 플레이트의 각각의 웰에 가한다. 항체가 있는 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션 후, 플레이트를 200 ㎕의 PBS로 2회 세척한다. 다음으로, PBS에 1% BSA와 0.05% 트윈-20을 함유하는 200 ㎕의 완충제(인큐베이션 완충제)를 각각의 웰에 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 5회 세척한다. 동결된 트리톤 용해 시험 샘플을 해동시켜 인큐베이션 완충제로 1:6 희석하고, 100 ㎕의 시험 샘플을 ApoE 항체 플레이트의 웰에 분취한다. 인큐베이션은 1시간 동안 실온에서 행하며, 이어서 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 5회 세척한다. 세척 후, 인큐베이션 완충제에 1:500으로 희석한 100 ㎕의 비오티닐화 항-ApoE 항체(맵텍(Mabtech), 카탈로그 번호 E887-비오틴)를 각각의 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, PBS 중의 0.05% 트윈-20로 5회 세척한다. 이어서 100 ㎕/웰의 스트렙타비딘-HPR(써모(Thermo), 카탈로그 번호 TS-125-HR)을 가한 다음, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. PBS 중의 0.05% 트윈-20으로 5회 세척 후, 100 ㎕의 TMB 기질(써모, 카탈로그 번호 34028)을 각각의 웰에 가하고, 이어서 실온에서 20분간 암실에서 인큐베이션한다. 비색 반응을 100 ㎕의 TMB 정지 용액(KPL, 카탈로그 번호 50-85-04)으로 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 붉은털원숭이 재조합 ApoE를 0.03% 트리톤 X-100을 함유한 인큐베이션 완충제에 100 ng/mL 내지 0.78 ng/mL 범위의 농도로 희석함으로써 ApoE 표준 곡선을 작도한다. 시험 샘플과 병행하여 ApoE 표준을 ELISA로 평가한다. 붉은털원숭이 혈청만 있는(LNP 없음) 대조군을 이용하여 ELISA에서 비-LNP-의존성 ApoE 신호에 대한 배경 제거를 달성한다.
스템 루프 RT-PCR 프로토콜
결합한 ApoE를 항-PEG 항체 플레이트에 결합한 LNP의 양으로 정규화하기 위하여, 항-PEG 항체 웰에 보유된 siRNA의 양을 스템-루프 PCR로 정량하고, LNP당 캡슐화된 siRNA의 개수와 상관지워 웰당 결합된 총 LNP 입자의 근사 측정치를 얻는다.
스파이크(spiked) 표준 곡선 샘플의 제조:
siRNA의 분자량(ApoB 17063에 대해 13693 g/mol)을 이용하여 표준 곡선을 작도하여 카피수를 계산한다. 고도 기준(high standard)은 3 ㎕당 1011개 카피를 함유하여야 한다. 최저 기준이 3 ㎕당 102개 카피를 함유할 때까지 검정 플레이트의 열을 가로질러서 10배 연속 희석을 수행한다. 0.2% 트리톤 X-100을 물에 1:80 희석하고, 피펫으로 20 ㎕의 희석 트리톤 X-100을 96-웰 플레이트의 10개의 웰로 옮긴다. 30 ㎕의 연속 희석 표준 곡선 및 믹스를 플레이트의 각각의 웰에 가한다. 10 ㎕의 스파이크 표준 곡선이 역전사 반응에 사용된다.
스템-루프 RT-PCR - 시험 샘플 및 표준 곡선:
PEG 항체 플레이트 포획으로부터의 트리톤 용해물을 뉴클레아제-비함유 수에 1:2000 희석한다. 10 ㎕의 'RT-프라이머 믹스(RT-Primer Mix)'(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 택맨 마이크로RNA 역전사 키트(TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit) 카탈로그 번호 4366596)을 96-웰 마이크로-앰프(Micro-Amp) QPCR 플레이트(ABI 카탈로그 번호 N801-0560)의 각각의 웰에 가한다.
10 ㎕의 각 시험 샘플(1:2000 희석) 또는 스파이크 표준 곡선(상기)을 96-웰 플레이트에 분취한다. 플레이트를 매트(ABI 카탈로그 번호 N801-0550)로 피복하여 증발을 최소화한다. 플레이트를 잠시 800 rpm으로 1분간 원심분리한다. 다음으로, 플레이트를 하기 사이클링 파라미터를 사용하여 써모사이클러 상에서 주행시킨다:
다음으로, 10 ㎕의 'RT 믹스(Mix)'를 각각의 웰(어플라이드 바이오시스템즈, 택맨 마이크로RNA 역전사 키트 카탈로그 번호 4366596)에 가한다.
RT 사이클링 반응은 30 ㎕의 총 용적에 대해 10 ㎕의 시험 샘플, 10 ㎕의 RT 프라이머 믹스 및 10 ㎕의 RT 믹스 성분으로 이루어진다. 총 30 ㎕의 전체 RT 믹스중 RT-프라이머의 최종 농도는 200 nM이다. 이어서 플레이트를 동일한 플레이트 매트로 밀봉하고, 잠시 800 rpm으로 1분간 원심분리한 다음, 하기 사이클링 파라미터를 사용하여 써모사이클러 상에서 주행시킨다:
다음으로, 15 ㎕의 패스트 엔자임(Fast Enzyme)/프라이머-프로브 믹스를 미사용 패스트(Fast) 96-웰 플레이트(어플라이드 바이오시스템즈, 택맨 패스트 유니버설 PCR 마스터 믹스(TaqMan Fast Universal PCR Master Mix), 카탈로그 번호 4352042)의 각각의 웰에 가한다.
ApoB 프라이머 및 프로브 서열:
5 ㎕의 각 RT 반응을 패스트 엔자임 믹스 플레이트에 가한다. 플레이트를 1분간 1000 rpm으로 원심분리하고, 패스트 블록(Fast Block)을 구비한 ABI7900 상에서 QPCR 분석을 수행한다. 사이클링 파라미터는 다음과 같다: 1 사이클 - 95℃에서 20초, 이어서 40 사이클 - 95℃에서 1초, 60℃에서 20초.
QPCR 결과를 이용하여 PEG 항체 포획 플레이트 트리톤 용해물 중의 siRNA 농도를 계산한다. LNP 입자당 500 siRNA의 개산에 기초하여, 항-PEG 항체 플레이트의 각각의 웰에 보유된 LNP의 개수를 계산해낼 수 있다. ApoE ELISA로 측정한 웰당 ApoE 농도 및 웰당 LNP 입자의 개수를 이용하여, LNP 입자당 결합한 근사치의 ApoE 분자수를 계산해낼 수 있다.
LNP당 결합한 ApoE 분자수
실시예 3
헤파린 세파로스 하이-트랩(HI-TRAP)
TM
결합 검정
중성의 표면 전하를 띠는 지질 나노입자(LNP)는 전기영동용 완충제로서 1X 둘베코 포스페이트 완충 염수(DPBS)로 헤파린 세파로스 상에의 주입 후에 보유되는 것이 아니라 칼럼 공극 용적(void volume)중에 용리된다. 혈청 아포리포단백질 E(ApoE)는 헤파린 술페이트와의 고-친화성 결합을 보이며, LNP는 정제 및/또는 재조합 인간 ApoE 또는 혈청 샘플과의 인큐베이션 후 그들의 ApoE에의 고유 결합능(지질 나노입자 조성 및 ApoE 농도 모두에 의존)에 따라 어느 정도까지는 헤파린 세파로스에 결합하는 것으로 나타났다. 표면 결합된 ApoE를 갖는 지질 나노입자는 헤파린 세파로스에 고-친화성으로 결합하고, 고염(1M NaCl)에서만 용리된다.
헤파린 세파로스 결합 검정을 전개하여 ApoE-LNP 복합체가 헤파린 세파로스에 대하여 나타내는 고-친화성 상호작용에 기초하여 지질 나노입자에의 혈청 ApoE 결합을 평가하였다.
인큐베이션
지질 나노입자를 37℃에서 20 min 동안 50 ㎍/mL의 최종 siRNA 농도로 1X 둘베코 포스페이트 완충 염수(DPBS) 중 다양한 농도의 정제 또는 재조합 인간 아포리포단백질 E 또는 0.1 내지 50% 래트/마우스/붉은털원숭이/인간 혈청과 인큐베이션하였다. ApoE 또는 혈청과의 인큐베이션 후, LNP 샘플을 1X DPBS를 사용하여 10배 희석하고, 헤파린 세파로스 크로마토그래피로 분석하였다. 보유된 LNP의 피크 면적(적절한 블랭크 신호의 공제 후)을 ApoE 및/또는 혈청 인큐베이션을 하지 않은 LNP 대조군의 총 피크 면적과 비교하여 ApoE/혈청과의 인큐베이션 후 고-친화성 헤파린 상호작용으로의 전환을 겪는 LNP의 백분율을 측정한다.
헤파린 세파로스 하이-트랩
TM
크로마토그래피 조건
헤파린 세파로스 하이-트랩TM 크로마토그래피 칼럼(지이 헬스케어(GE Healthcare); 1 mL 베드 용적)을 1X 또는 2X 둘베코 PBS로 평형화시킨다; 더 높은 2X 염 농도는 헤파린 세파로스 상에서의 더 높은 고유 잔류를 보이는(더 높은 표면 양전하에 기인하는 것으로 추정) LNP에 대해 사용한다.
이동상 A: 1X 또는 2X DPBS
이동상 B: 10 mM 인산나트륨 완충제(pH 7.0) 중 1M NaCl
100% A, 10분 동안 등용매적으로 전달, 이어서 100% B로 단계 구배; 추가의 10 min 동안 유지; 다시 100% A로 단계 구배 및 후속 샘플의 주입에 앞서 추가의 10 min 동안 재평형화
유량: 1 mL/min
샘플 주입량: 50 ㎕
검출: 260 nm에서 UV
붉은털원숭이 혈청 인큐베이션(2X DPBS 조건)에 대한 하이-트랩
TM
결합 결과
실시예 4
래트 생체내 효능 및 독성 평가
전술한 공칭 조성물 중의 화합물을 사용하는 LNP를 스프라그-돌리(Crl:CD(SD) 암컷 래트(찰스 리버 랩스(Charles River Labs))에서의 생체내 효능 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제의 증가에 대해 평가하였다. siRNA는 ApoB 유전자(수탁번호 NM 019287)에 대한 mRNA 전사물을 표적으로 한다. ApoB siRNA의 1차 서열 및 화학적 변형 패턴을 앞서 나타내었다. PBS 비히클 중의 RDV(siRNA 함유)를 1 내지 1.5 mL의 용적으로 꼬리 정맥 주사하였다. 주입속도는 대략 3 ml/min이다. 5마리의 래트가 각각의 투여 그룹에 사용되었다. LNP 투여 후, 래트를 표준 식이와 물이 존재하는 케이지에 넣는다. 투여 6시간 후, 먹이를 케이지로부터 제거한다. LNP 투여 24시간 후 동물 부검을 수행한다. 래트를 이소플루란하에서 5분 동안 마취시킨 다음, 사혈이 완료될 때까지 이소플루란의 전달을 지속시키는 노즈콘(nose cone)에 래트를 안치시킴으로써 마취하에 유지한다. 23 게이지 버터플라이 정맥천자 세트를 이용하여 대정맥으로부터 채혈하여 혈청 화학 분석을 위해 혈청 분리기 배큐테이너에 분취한다. 절개한 간 미상엽의 천공물을 취하여 mRNA 분석을 위해 RNA레이터(RNALater)(앰비온(Ambion))에 넣는다. 보관된 간 조직을 균질화하고, 제조업자의 지시에 따라 퀴아젠(Qiagen) 비드 밀과 퀴아젠 miRNA-이지(Easy) RNA 분리 키트를 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 간 ApoB mRNA 수준을 정량적 RT-PCR로 측정하였다. 래트 ApoB 시판 프로브 세트(어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 RN01499054_m1)를 사용하여 정제 RNA로부터 메시지를 증폭시켰다. 96-웰 패스트 블록을 구비한 ABI 7500 기기 상에서 PCR 반응을 수행하였다. ApoB mRNA 수준을 하우스키핑 PPIB(NM 011149) mRNA로 정규화하였다. PPIB mRNA 수준은 시판 프로브 세트(어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 Mm00478295_m1)를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. 결과는 ApoB mRNA/PPIB mRNA의 비로서 표현된다. 모든 mRNA 데이터를 PBS 대조군 용량에 대해 표현한다. 혈청 ALT 및 AST 분석을 지멘스(Siemens) 알라닌 아미노트랜스퍼라제(카탈로그 번호 03039631) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(카탈로그 번호 03039631) 시약을 사용하여 지멘스 아드비아 1800 클리니컬 케미스트리 애널라이저(Siemens Advia 1800 Clinical Chemistry Analyzer) 상에서 수행하였다. 양이온성 지질 DLinKC2DMA(화합물 45) 또는 MC3(화합물 46, 도 2)을 함유하는 RDV로 투여한 것에 비해 화합물 32 또는 33 함유 RDV로 투여한 래트에서 유사한 효능 및 개선된 허용성이 관찰되었다.
실시예 5
래트/원숭이 간에서 양이온성 지질 수준의 측정
간 조직을 20-ml 바이알에 칭량하여, 9 v/w의 물에 제노그라인더(GenoGrinder) 2000(오피에스 다이애그노스틱스(OPS Diagnostics), 1600 스트로크/min, 5 min)을 사용하여 균질화하였다. 각 조직 균질화물의 50 ㎕ 분취량을 300 ㎕의 추출/단백질-침전 용매(500 nM 내부 표준을 함유하는 50/50 아세토니트릴/메탄올)와 혼합한 다음, 플레이트를 원심분리시켜 침전 단백질을 침강시켰다. 이어서 각 상청액의 200 ㎕의 용적을 96-웰 플레이트의 개개의 웰에 옮기고, 10 ㎕ 샘플을 LC/MS-MS로 직접 분석하였다.
화합물의 메탄올 스톡 용액의 기지량을 비처리 래트 간 균질화물(9 vol 물/중량 간) 중으로 스파이킹함으로써 표준을 제조하였다. 분취량(50 ㎕)의 각 표준/간 균질화물을 300 ㎕의 추출/단백질 침전 용매(500 nM 내부 표준을 함유하는 50/50 아세토니트릴/메탄올)와 혼합하고, 플레이트를 원심분리하여 침전 단백질을 침강시켰다. 각 상청액의 200 ㎕의 용적을 96-웰 플레이트의 개개의 웰에 옮기고, 10 ㎕의 각 표준을 LC/MS-MS로 직접 분석하였다.
간 균질화물로부터 제조하고 추출한 표준에 대한 절대적 정량을 API 4000 3단 4중극자 질량 분광측정계(어플라이드 바이오시스템즈)에 연결된 아리아(Aria) LX-2 HPLC 시스템(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 수행하였다. 각각의 실행에 대해, 총 10 ㎕ 샘플을 주위 온도에서 BDS 하이퍼실(Hypersil) C8 HPLC 칼럼(써모, 50 x 2 mm, 3 ㎛)에 주입하였다.
이동상 A: 95% H2O/5% 메탄올/10 mM 암모늄 포르메이트/0.1% 포름산, 이동상 B: 40% 메탄올/60% n-프로판올/10 mM 암모늄 포르메이트/0.1% 포름산. 유량은 0.5 mL/min였고, 구배 용리 프로파일은 다음과 같다: 80% A에서 0.25 min 유지, 1.6 min에 걸쳐서 100% B로 선형 램핑(linear ramping), 100% B에서 2.5 min 유지, 이어서 80% A로 되돌아가 1.75 min 유지. 총 실행 시간은 5.8 min이었다. API 4000 소스 파라미터는 CAD: 4, CUR: 15, GS1: 65, GS2: 35, IS: 4000, TEM: 550, CXP: 15, DP: 60, EP: 10였다.
화합물 32 또는 33 함유 RDV로 투여한 래트에서, 간 수준은 양이온성 지질 DLinKC2DMA(화합물 45) 또는 MC3(화합물 46, 도 3)을 함유하는 RDV와 유사하거나 또는 그보다 낮았다. 화합물 32 또는 33 함유 RDV로 투여한 원숭이에서, 간 수준은 양이온성 지질 DLinKC2DMA(화합물 45) 또는 MC3(화합물 46, 도 7)을 함유하는 RDV보다 낮았다.
실시예 6
ApoB 효능의 붉은털원숭이 생체내
평가
전술한 공칭 조성물 중의 화합물을 사용하는 LNP를 수컷 또는 암컷 마카카 물라타(Macaca mulatta) 원숭이(붉은털원숭이)에서 생체내 효능에 대하여 평가하였다. siRNA는 ApoB 유전자(수탁번호 XM 001097404)에 대한 mRNA 전사물을 표적으로 한다. ApoB siRNA의 1차 서열 및 화학적 변형 패턴을 앞서 나타내었다. PBS 비히클 중의 RDV(siRNA 함유)를 복재 정맥에 20 mL/분의 주입 속도로 0.25 mg/킬로그램 siRNA의 용량 수준으로 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 주입량은 1.9 내지 2.1 mL/킬로그램이었고, 원숭이는 체중이 2.5 내지 4.5 킬로그램 범위였다. RDV 또는 PBS 대조군을 3마리의 원숭이에 투여하였다. 투여 여러 날 후, 혈청 화학 분석을 위해 대퇴부 동맥으로부터 1 mL 혈액 샘플을 뽑아내었다. 원숭이는 채혈에 앞서 밤새 절식시켰다. 효능의 척도로서, LDL-C를 ApoB mRNA 감소의 하류 대리 마커로서 모니터링하였다. 화합물 32 및 33(0.25 mg/kg)을 함유하는 RDV의 전신 투여 4일 후에, LDL-C의 혈청 수준은 투여전 수준의 30% 미만으로 감소하였다(도 4).
실시예 7
붉은털원숭이 생체내 β-카테닌 효능 평가
투여 7일전 연구일에, 수컷 붉은털원숭이로부터 복강경 수술 절제(원숭이 1마리당 하나의 무작위 선택된 간엽의 외연부로부터 하나의 생검 샘플의 절제)로 간 생검 샘플(약 0.5 내지 1 그램/샘플)을 수집하였다. 5 mm 조직 천공을 이용하여 각각의 투여전 생검으로부터 3개의 비-인접한 약 50 mg 샘플을 샘플링하였다. 샘플을 추후의 CTNNB1 mRNA 분석을 위해 RNA레이터TM(앰비온)에 보관하였다.
연구일 0일차에, 원숭이에 포스페이트 완충 염수 중 지질 나노입자(LNP) 시험 물품의 현탁액(0.05 내지 0.1 mg siRNA/mL)을 단회 정맥내 볼루스 주사를 통해 0.67, 1.34 또는 3.34 mg siRNA/m2의 표적 용량으로 투여하였다. 투여 목적상, 체표면적(m2)은 하기에 주어진 확립된 상대 성장 스케일링 관계식(allometric scaling relationship)(1)에 따라 체중으로부터 평가하였다:
BSA (m
2
) = 0.11 * BW (kg 단위)
0.65
연구일 2일차 및 7일차에, LNP 투여 48시간 및 168시간 후, 간 생검 샘플(약 0.5 내지 1 그램/샘플)을 원숭이로부터 복강경 수술 절제로 수집하였다(원숭이 1마리당 2개의 별개의 무작위 선택된 간엽을 절제하였다). 5 mm 조직 천공을 이용하여 각각의 48 hr 및 168 hr 외과적 생검 샘플당 3개의 비-인접한 약 50 mg 샘플을 샘플링하였다. 샘플은 추후의 CTNNB1 mRNA 분석을 위해 RNA레이터TM(앰비온)에 보관하였다.
CTNNB1에 대해 유효하고, 펩티딜프롤릴 이소머라제 B(또한 PPIB 또는 시클로필린 B로도 알려져 있음)의 mRNA 수준과 18S 리보솜 RNA(18S rRNA)의 RNA 수준에 대하여 정규화한 프라이머/프로브 세트를 사용하여 상대적인 정량적 RT-PCR로 CTNNB1 mRNA 수준을 측정하였다. CTNNB1 mRNA 간 발현의 변화는 투여후 샘플과 각각의 상응하는 원숭이의 투여전 간 샘플간 PCR 역치 사이클 수의 차이(ΔΔCt)로서 측정되었다.
CTNNB1 mRNA 녹다운(전처리 수준에 관해서)의 계산은 하기 관계식을 이용하여 ΔΔCt로부터 계산해내었다:
mRNA (% 녹다운) = 100-(100/2-ΔΔCt)
화합물 32와 33 및 베타-카테닌 siRNA를 함유하는 RDV로 투여한 원숭이는 0.67 내지 3.34 mg/m2 범위의 용량에서 강건한 KD를 보였다(도 5).
(1) FDA 지침서: "Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" July 2005, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration- Center for Drug Evaluation and Research (CDER).
실시예 8
붉은털원숭이 생체내 ALT 증가 평가
원심분리 후 응고된 원숭이 전혈로부터 수거한 혈청에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 측정한다. 국제 임상 화학 연맹(International Federation of Clinical Chemistry) 표준화 절차와 시약을 사용하여 자동 화학 분석기인 로슈 모듈러 시스템(Roche Modular System)으로 혈청 중 ALT의 효소 활성을 측정한다. 분석기의 컴퓨터는 표준 곡선과 비교하여 샘플 중의 계산된 ALT 활성에 대한 흡광도 측정을 이용한다. ALT 활성은 국제단위/리터(IU/L)로 보고된다.
화합물 32 및 33을 함유하는 RDV로 투여한 원숭이는 양이온성 지질 DLinKC2DMA(화합물 45) 또는 MC3(화합물 46, 도 6)을 함유하는 RDV로 투여한 원숭이보다 더 낮은 피크 ALT 상승을 보였다.
실시예 9
간세포 암종 마우스 모델에서의 평가
간세포 암종으로의 β-카테닌 siRNA(siRNAβ-cat)의 전달에 있어서 LNP의 활성을 TRE-MET로 명명된 마우스 간세포 암종(HCC) 모델에서 평가하였다. TRE-MET 마우스는 7량화된 상류 tet-오퍼레이터와 함께 hCMV 프로모터하에서 인간 MET 트랜스진이 발현되는 FVB/N 유전적 배경의 트랜스제닉 마우스이다. TRE-MET 마우스를 LAP-tTA 계통과 교배시킬 경우, 이중 트랜스제닉(TRE-MET/LAP-tTA) 마우스는 간-특이적 방식으로 MET을 발현하며, 이는 독시시클린의 투여에 의해 억제될 수 있다. 이들 마우스는 약 3개월령에서 간 표면 상에 시각적으로 식별가능한 종양 소결절과 함께 HCC가 발생하며, 종양은 HCC에 전형적인 확산성 소주(小柱) 성장 패턴을 보이고, HCC 종양 마커인 알파-태아단백질(AFP)을 발현한다. 추가로, TRE-MET 마우스의 종양에서의 돌연변이 분석은 또한 종양의 대략 95%에서 베타-카테닌 유전자에서 활성화 돌연변이를 동정하였다. 이들 특징은 TRE-MET HCC 마우스 모델이 β-카테닌 siRNA의 LNP-매개성 전달 및 종양 성장에 대한 결과로서 생기는 효능의 평가에 적합하게 만든다.
간 및 종양 조직 모두에서 β-카테닌 mRNA의 침묵화에 있어서 β-카테닌-함유 LNP의 영향을, 종양을 보유한 TRE-MET 마우스에서 약력학(PD) 연구로 먼저 평가하였다. 상이한 용량의 LNP 또는 고용량의 LNP 대조군 siRNA를 정맥내 투여하고, 72시간 후 부검을 행하여 택맨(Taqman)에 의한 β-카테닌 mRNA 수준의 측정을 위한 간 및 종양 조직을 채취하였다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 화합물 33은 간 및 종양 조직 모두에서 β-카테닌 mRNA의 강건한 용량-의존적 녹다운을 유도한 반면에, 대조군 siRNA 또는 PBS를 투여받은 동물에서는 β-카테닌 녹다운이 관찰되지 않았다. 0.1 mpk 및 0.05 mpk의 LNP는 정상의 간에서 각각 88% 및 69% KD를 유도하였다. 종양에서의 KD는 70%(2 mpk) 내지 약 40%(0.1 또는 0.05 mpk) 범위이다. 도 12 및 13에 도시된 바와 같이, 화합물 32는 간 및 종양 조직 모두에서 β-카테닌 mRNA의 강건한 용량-의존적 녹다운을 유도한 반면에, 대조군 siRNA 또는 PBS를 투여받은 동물에서는 β-카테닌 녹다운이 관찰되지 않았다. 0.1 mpk 및 0.05 mpk의 LNP는 정상의 간에서 각각 76% 및 78% KD를 유도하였다. 종양에서의 KD는 47%(0.25 mpk) 내지 약 20-30%(0.1 또는 0.05 mpk) 범위이다.
종양 성장에 미치는 LNP의 영향을 다용량 효능 연구로 평가하였다. TRE-MET HCC 마우스에 화합물 33/siRNAβ-cat, 화합물 32/siRNAβ-cat, 대조군 siRNA 또는 PBS로 주 1회로 3주간(3회 용량) 투여하고, 각 동물에서의 종양 용적을 1차 투여 7일전 및 최종 투여 3일 후 마이크로CT 스캔에 의해 측정하였다(도 10 및 14). 또한, 최종 투여 7일 후, β-카테닌 mRNA 수준의 평가를 위해 간 및 종양 조직을 수집하였다. PBS 또는 대조군 siRNA를 투여받은 마우스가 종양 부하에 있어서 360 내지 470% 성장을 나타낸 반면에, 화합물 33/siRNAβ-cat로 처리한 마우스는 용량-의존적 방식으로 심원한 종양 성장 억제 또는 퇴행을 보여주었다(도 10). 2 mpk 및 0.5 mpk의 화합물 33/siRNAβ-cat는 각각 60% 및 40% 종양 퇴행을 유도하였고, 0.05 mpk는 종양 정지를 초래하였다. PBS 또는 대조군 siRNA를 투여받은 마우스는 종양 부하에 있어서 약 350% 성장을 보인 반면에, 화합물 32/siRNAβ-cat로 처리한 마우스는 용량-의존적 방식으로 심원한 종양 성장 억제 또는 퇴행을 보여주었다(도 14). 0.5, 0.25 및 0.1 mg/kg의 화합물 32/siRNAβ-cat는 각각 37, 58, 및 37% 종양 퇴행을 유도하였고, 0.05 mpk는 종양 정지를 초래하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Merck Sharp & Dohme Corp.
Stanton, Matthew G.
Budzik, Brian W.
Beutner, Gregory L.
Liao, Hongbiao
<120> NOVEL LOW MOLECULAR WEIGHT CATIONIC LIPIDS FOR OLIGONUCLEOTIDE DELIVERY
<130> MRL-MIS-00044
<150> 61/384,486
<151> 2010-09-20
<150> 61/514,270
<151> 2011-08-02
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
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sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<223> Synthetic
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 14
agtgcagggt ccgag 15
Claims (6)
- 화학식 iii, v, vii, viii, 및 x로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간체 화합물을 이용하여,
<화학식 iii>
<화학식 v>
<화학식 vii>
<화학식 viii>
<화학식 x>
하기 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 제조하는 방법.
<화학식 A>
상기 식에서,
R1 및 R2는 H 및 (C1-C6)알킬 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 알킬은 R' 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R3은 H이고;
R'은 할로겐, R", OR", SR", CN, CO2R" 또는 CON(R")2 중에서 독립적으로 선택되고;
R"은 H 및 (C1-C6)알킬 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 알킬은 할로겐 및 OH로 임의로 치환되고;
n은 0, 1 또는 2이고;
L1은 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되는 직쇄 C19 알케닐, 또는이고;
L2는 C9 알킬이다. - 제1항에 있어서,
R1 및 R2가 각각 메틸이고;
R3이 H이고;
n이 0이고;
L1이 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되는 직쇄 C19 알케닐, 또는이고;
L2가 C9 알킬인, 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
R1 및 R2가 각각 메틸이고;
R3이 H이고;
n이 1이고;
L1이 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되는 직쇄 C19 알케닐, 또는이고;
L2가 C9 알킬인, 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
R1 및 R2가 각각 메틸이고;
R3이 H이고;
n이 2이고;
L1이 R' 중에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되는 직쇄 C19 알케닐, 또는이고;
L2가 C9 알킬인, 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서, 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체가
(12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민(화합물 31);
(13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32); 및
N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헵타데칸-8-아민(화합물 33)
중에서 선택되는 것인, 화학식 A의 양이온성 지질 또는 그의 임의의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 제조하는 방법. - 화학식 iii, v, vii, viii, 및 x로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
<화학식 iii>
<화학식 v>
<화학식 vii>
<화학식 viii>
<화학식 x>
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| HRP20220717T1 (hr) | 2011-12-16 | 2022-07-22 | Modernatx, Inc. | Modificirani pripravci mrna |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| AU2013243947A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
| CA2868391A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Stephane Bancel | Polynucleotides comprising n1-methyl-pseudouridine and methods for preparing the same |
| US10501512B2 (en) | 2012-04-02 | 2019-12-10 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| EP2838877B1 (en) | 2012-04-19 | 2018-09-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Novel diester and triester based low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery |
| ES2921623T3 (es) | 2012-11-26 | 2022-08-30 | Modernatx Inc | ARN modificado terminalmente |
| EP2971010B1 (en) | 2013-03-14 | 2020-06-10 | ModernaTX, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| PL3019619T3 (pl) | 2013-07-11 | 2022-01-10 | Modernatx, Inc. | Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania |
| WO2015034928A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| WO2015034925A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| AU2014351482B2 (en) | 2013-11-22 | 2020-08-20 | Mina Therapeutics Limited | C/EBP alpha short activating RNA compositions and methods of use |
| WO2015105131A1 (ja) * | 2014-01-09 | 2015-07-16 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | カチオン性脂質 |
| EP3096741B1 (en) | 2014-01-21 | 2020-09-02 | Anjarium Biosciences AG | Process for the production of hybridosomes |
| US10821175B2 (en) | 2014-02-25 | 2020-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems |
| HRP20220070T1 (hr) | 2014-04-23 | 2022-04-01 | Modernatx, Inc. | Cjepiva nukleinske kiseline |
| WO2015178343A1 (ja) * | 2014-05-20 | 2015-11-26 | 国立大学法人北海道大学 | ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体 |
| PL3766916T3 (pl) | 2014-06-25 | 2023-02-27 | Acuitas Therapeutics Inc. | Nowe lipidy i formulacje nanocząstek lipidowych do dostarczania kwasów nukleinowych |
| US20170204152A1 (en) | 2014-07-16 | 2017-07-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| US20170210788A1 (en) | 2014-07-23 | 2017-07-27 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of intrabodies |
| WO2016065349A2 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | University Of Maryland, Baltimore | Short non-coding protein regulatory rnas (sprrnas) and methods of use |
| AU2015364508A1 (en) | 2014-12-18 | 2017-07-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | ReversirTM compounds |
| IL283545B2 (en) | 2015-06-29 | 2023-09-01 | Acuitas Therapeutics Inc | Lipids and nanoparticulate lipid formulations for delivery of nucleic acids |
| ES2910425T3 (es) | 2015-09-17 | 2022-05-12 | Modernatx Inc | Compuestos y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos |
| JP6921833B2 (ja) | 2015-10-22 | 2021-08-18 | モデルナティーエックス， インコーポレイテッド | ヒトサイトメガロウイルスワクチン |
| HRP20230209T1 (hr) | 2015-10-28 | 2023-04-14 | Acuitas Therapeutics Inc. | Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina |
| SI3386484T1 (sl) | 2015-12-10 | 2022-06-30 | Modernatx, Inc. | Sestave in metode za dovajanje terapevtskih sredstev |
| RS63051B1 (sr) | 2015-12-22 | 2022-04-29 | Modernatx Inc | Jedinjenja i kompozicije za intracelularnu isporuku agenasa |
| SI3394093T1 (sl) | 2015-12-23 | 2022-05-31 | Modernatx, Inc. | Metode uporabe liganda OX40, ki kodira polinukleotid |
| US20190241658A1 (en) | 2016-01-10 | 2019-08-08 | Modernatx, Inc. | Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies |
| WO2017180917A2 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Modernatx, Inc. | Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery |
| KR20230074598A (ko) | 2016-05-18 | 2023-05-30 | 모더나티엑스, 인크. | 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 |
| EP3476832B1 (en) | 2016-06-24 | 2023-04-19 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Cationic lipid |
| US11583504B2 (en) | 2016-11-08 | 2023-02-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
| KR20190132405A (ko) | 2017-03-15 | 2019-11-27 | 모더나티엑스, 인크. | 치료제의 세포내 전달을 위한 화합물 및 조성물 |
| WO2018170336A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle formulation |
| AU2018234814B2 (en) | 2017-03-15 | 2022-06-30 | Modernatx, Inc. | Crystal forms of amino lipids |
| EP3603648A4 (en) | 2017-03-29 | 2020-12-30 | Shionogi & Co., Ltd | COMPLEX OF NUCLEIC ACID MEDICINAL AND MULTI-BRANCHED LIPID |
| AU2018270111B2 (en) | 2017-05-18 | 2022-07-14 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof |
| US20200268666A1 (en) | 2017-06-14 | 2020-08-27 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding coagulation factor viii |
| EP3638215A4 (en) | 2017-06-15 | 2021-03-24 | Modernatx, Inc. | RNA FORMULATIONS |
| JP7202009B2 (ja) * | 2017-06-15 | 2023-01-11 | 国立大学法人北海道大学 | ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体 |
| AU2018326799A1 (en) | 2017-08-31 | 2020-02-27 | Modernatx, Inc. | Methods of making lipid nanoparticles |
| WO2019048632A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Mina Therapeutics Limited | STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATORY RNA (PARNA) OF HNF4A AND METHODS OF USE |
| EP3679140B1 (en) | 2017-09-08 | 2022-11-16 | MiNA Therapeutics Limited | Stabilized cebpa sarna compositions and methods of use |
| CN111417621A (zh) | 2017-12-27 | 2020-07-14 | 卫材R&D管理有限公司 | 阳离子脂质 |
| CA3088546A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Stabilized rsv f proteins and uses thereof |
| EP4242307A3 (en) | 2018-04-12 | 2023-12-27 | MiNA Therapeutics Limited | Sirt1-sarna compositions and methods of use |
| CA3100050A1 (en) | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Lupagen, Inc. | Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells |
| US20210317461A1 (en) | 2018-08-09 | 2021-10-14 | Verseau Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide compositions for targeting ccr2 and csf1r and uses thereof |
| EP3852732A1 (en) | 2018-09-19 | 2021-07-28 | ModernaTX, Inc. | Peg lipids and uses thereof |
| JP2022500543A (ja) | 2018-09-19 | 2022-01-04 | モデルナティーエックス， インコーポレイテッド | 高純度ｐｅｇ脂質及びそれらの使用 |
| WO2020128031A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Curevac Ag | Rna for malaria vaccines |
| AU2020205717A1 (en) | 2019-01-11 | 2021-08-12 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
| CA3125511A1 (en) | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Curevac Ag | Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophthalmic diseases |
| WO2020208361A1 (en) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Mina Therapeutics Limited | Sirt1-sarna compositions and methods of use |
| WO2020254535A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Curevac Ag | Rotavirus mrna vaccine |
| JP2022542839A (ja) | 2019-07-19 | 2022-10-07 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー | リコンビナーゼ組成物及び使用方法 |
| CN114555127A (zh) | 2019-08-06 | 2022-05-27 | L.E.A.F.控股集团公司 | 制备聚谷氨酸化抗叶酸剂的方法以及它们的组合物的用途 |
| CN114502204A (zh) | 2019-08-14 | 2022-05-13 | 库尔维科公司 | 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物 |
| CA3150452A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Generation Bio Co. | Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof |
| CA3154618A1 (en) | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Modernatx, Inc. | Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
| AU2020352552A1 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-17 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression |
| JP2022548320A (ja) | 2019-09-23 | 2022-11-17 | オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド | アポリポタンパク質ｂ（ａｐｏｂ）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法 |
| CN116113430A (zh) | 2020-02-04 | 2023-05-12 | 奎尔法克股份有限公司 | 冠状病毒疫苗 |
| AR121292A1 (es) | 2020-02-14 | 2022-05-04 | Merck Sharp & Dohme | Vacuna contra hpv |
| EP4118207A1 (en) | 2020-03-11 | 2023-01-18 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression |
| AU2021244559A1 (en) | 2020-03-24 | 2022-11-17 | Generation Bio Co. | Non-viral DNA vectors and uses thereof for expressing Gaucher therapeutics |
| US20230138409A1 (en) | 2020-03-24 | 2023-05-04 | Generation Bio Co. | Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics |
| CA3179444A1 (en) | 2020-05-20 | 2021-11-25 | Avak Kahvejian | Immunogenic compositions and uses thereof |
| CA3179420A1 (en) | 2020-05-20 | 2021-11-25 | Avak Kahvejian | Coronavirus antigen compositions and their uses |
| CN116018405A (zh) | 2020-05-29 | 2023-04-25 | 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 | Trem组合物及其相关方法 |
| JP2023530229A (ja) | 2020-05-29 | 2023-07-14 | キュアバック エスイー | 核酸ベースの混合ワクチン |
| EP4158032A2 (en) | 2020-05-29 | 2023-04-05 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Trem compositions and methods relating thereto |
| US11976019B2 (en) | 2020-07-16 | 2024-05-07 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Cationic lipids for use in lipid nanoparticles |
| IL299925A (en) | 2020-07-27 | 2023-03-01 | Anjarium Biosciences Ag | Compounds of DNA molecules, methods for their preparation and methods of using them |
| WO2022023559A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-03 | Curevac Ag | Nucleic acid encoded antibody mixtures |
| CA3189854A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Modernatx, Inc. | Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium |
| WO2022043551A2 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Curevac Ag | Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines |
| CN116157148A (zh) | 2020-09-03 | 2023-05-23 | 旗舰创业创新第六有限责任公司 | 免疫原性组合物及其用途 |
| GB2603454A (en) | 2020-12-09 | 2022-08-10 | Ucl Business Ltd | Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders |
| WO2022137133A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Rna vaccine against sars-cov-2 variants |
| WO2022135993A2 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration |
| IL303886A (en) | 2020-12-23 | 2023-08-01 | Flagship Pioneering Inc | Modified TREMS vehicles and their uses |
| EP4087938A2 (en) | 2021-01-27 | 2022-11-16 | CureVac AG | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
| TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
| US11524023B2 (en) | 2021-02-19 | 2022-12-13 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same |
| EP4312999A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic compositions |
| CA3214137A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Mina Therapeutics Limited | Tmem173 sarna compositions and methods of use |
| CA3171429A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-09-30 | Alexander SCHWENGER | Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna |
| US20220325287A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-13 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer |
| JP2024517427A (ja) | 2021-04-20 | 2024-04-22 | アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー | アミロ－α－１，６－グルコシダーゼ、４－α－グルカノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の組成物、その作製の方法、及びその使用の方法 |
| KR20240011714A (ko) | 2021-04-27 | 2024-01-26 | 제너레이션 바이오 컴퍼니 | 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도 |
| EP4329884A1 (en) | 2021-04-27 | 2024-03-06 | Generation Bio Co. | Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof |
| WO2022233880A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Curevac Ag | Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression |
| WO2022261394A1 (en) | 2021-06-11 | 2022-12-15 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Rna polymerase iii promoters and methods of use |
| WO2023283359A2 (en) | 2021-07-07 | 2023-01-12 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression |
| WO2023009547A1 (en) | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and uses thereof |
| WO2023014974A1 (en) | 2021-08-06 | 2023-02-09 | University Of Iowa Research Foundation | Double stranded mrna vaccines |
| CN118019547A (zh) | 2021-08-19 | 2024-05-10 | 默沙东有限责任公司 | 热稳定脂质纳米粒子及其使用方法 |
| CN115724806A (zh) * | 2021-08-25 | 2023-03-03 | 广州谷森制药有限公司 | 新型阳离子脂质化合物（二） |
| AU2022336664A1 (en) | 2021-09-03 | 2024-01-18 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine |
| KR20240049810A (ko) | 2021-09-03 | 2024-04-17 | 큐어백 에스이 | 핵산 전달용 신규 지질 나노입자 |
| WO2023031855A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids |
| AR127073A1 (es) | 2021-09-17 | 2023-12-13 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Composiciones y métodos para producir polirribonucleótidos circulares |
| AU2022370530A1 (en) | 2021-10-18 | 2024-05-02 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions and methods for purifying polyribonucleotides |
| WO2023073228A1 (en) | 2021-10-29 | 2023-05-04 | CureVac SE | Improved circular rna for expressing therapeutic proteins |
| WO2023081526A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Orna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides |
| WO2023086465A1 (en) | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Modernatx, Inc. | Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium |
| WO2023096990A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc | Coronavirus immunogen compositions and their uses |
| WO2023096963A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses |
| WO2023097003A2 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Immunogenic compositions and their uses |
| WO2023099884A1 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Mina Therapeutics Limited | Pax6 sarna compositions and methods of use |
| GB202117758D0 (en) | 2021-12-09 | 2022-01-26 | Ucl Business Ltd | Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders |
| AR128002A1 (es) | 2021-12-17 | 2024-03-20 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Métodos de enriquecimiento de rna circular en condiciones desnaturalizantes |
| TW202340461A (zh) | 2021-12-22 | 2023-10-16 | 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 | 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法 |
| WO2023122789A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides |
| WO2023135273A2 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Anjarium Biosciences Ag | Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof |
| WO2023144330A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | CureVac SE | Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors |
| WO2023154818A1 (en) | 2022-02-09 | 2023-08-17 | Modernatx, Inc. | Mucosal administration methods and formulations |
| WO2023161350A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | Io Biotech Aps | Nucleotide delivery of cancer therapy |
| WO2023170435A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Mina Therapeutics Limited | Il10 sarna compositions and methods of use |
| WO2023177655A1 (en) | 2022-03-14 | 2023-09-21 | Generation Bio Co. | Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use |
| WO2023183616A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Senda Biosciences, Inc. | Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same |
| WO2023191628A1 (en) * | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Bioneedle Drug Delivery B.V. | A process for storing biologically active constructs in a biodegradable material |
| WO2023196634A2 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Vaccines and related methods |
| WO2023220083A1 (en) | 2022-05-09 | 2023-11-16 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders |
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| WO2023227608A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide |
| WO2023239756A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Generation Bio Co. | Lipid nanoparticle compositions and uses thereof |
| WO2023242817A2 (en) | 2022-06-18 | 2023-12-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2 |
| WO2023250112A1 (en) | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions of modified trems and uses thereof |
| US20240042021A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Immunomodulatory proteins and related methods |
| WO2024033901A1 (en) | 2022-08-12 | 2024-02-15 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use |
| WO2024035952A1 (en) | 2022-08-12 | 2024-02-15 | Remix Therapeutics Inc. | Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites |
| WO2024040222A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Generation Bio Co. | Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof |
| WO2024049979A2 (en) | 2022-08-31 | 2024-03-07 | Senda Biosciences, Inc. | Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same |
| EP4342460A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-27 | NovoArc GmbH | Lipid nanoparticle with nucleic acid cargo |
| WO2024068545A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-04-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
| WO2024077191A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer |
| US20240156949A1 (en) | 2022-10-28 | 2024-05-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic Acid Based Vaccine |
| WO2024097664A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions and methods for purifying polyribonucleotides |
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| WO2024102730A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Orna Therapeutics, Inc. | Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides |
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| WO2024102762A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Orna Therapeutics, Inc. | Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides |
Family Cites Families (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2366534A (en) * | 1941-07-30 | 1945-01-02 | Du Pont | Production of long-chain tertiary amines |
| US3391192A (en) * | 1965-01-29 | 1968-07-02 | Phillips Petroleum Co | Production of aldehydes |
| US3492353A (en) * | 1965-11-29 | 1970-01-27 | Phillips Petroleum Co | Preparation of higher molecular weight amines from 1-olefins and trimethylamine |
| CH479506A (de) * | 1967-03-15 | 1969-10-15 | Roure Bertrand Dupont Sa | Verfahren zur Herstellung eines Undecatriens |
| JPS4839451A (ko) * | 1971-09-28 | 1973-06-09 | ||
| US3873621A (en) * | 1972-05-22 | 1975-03-25 | Univ Minnesota | Method for preparing amines |
| US3976697A (en) * | 1974-10-29 | 1976-08-24 | Texaco Inc. | Preparation of tertiary amines |
| AT340888B (de) * | 1975-07-02 | 1978-01-10 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung neuer quartarer ammoniumverbindungen |
| US4057644A (en) * | 1975-08-22 | 1977-11-08 | Labaz | Active derivatives of methylamine in therapeutic compositions and methods of use |
| US4431836A (en) * | 1981-02-23 | 1984-02-14 | Uop Inc. | Hydrogenation using chitin and chitosan based immobilized metal catalysts |
| DE3414236A1 (de) * | 1984-04-14 | 1985-10-24 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verfahren zur herstellung von polyphenylenethern und deren verwendung zur herstellung von formteilen |
| JPH062642B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1994-01-12 | 花王株式会社 | 殺ダニ剤 |
| GB8730010D0 (en) * | 1987-12-23 | 1988-02-03 | Smith Kline French Lab | Compounds |
| DE4037735A1 (de) * | 1990-11-27 | 1992-06-04 | Langhals Heinz | Neue perylenfarbstoffe und ihre verwendung in metallic-lackierungen |
| JP2515447B2 (ja) * | 1991-07-22 | 1996-07-10 | 花王株式会社 | 非対称型のジ・長鎖アルキル基又はアルケニル基を有する第３級アミン |
| JP3160304B2 (ja) * | 1991-04-12 | 2001-04-25 | 花王株式会社 | β−分岐アルキル第１級アミンの製造法 |
| JP2706595B2 (ja) * | 1991-04-22 | 1998-01-28 | 花王株式会社 | Ｎ−アルキルもしくはアルケニル−ｎ−メチルアミンの製造方法 |
| DE19516940A1 (de) * | 1995-05-09 | 1996-11-14 | Rwe Dea Ag | Herstellung von primären Guerbetaminen |
| EP0769532B1 (de) * | 1995-10-12 | 2002-03-13 | Ciba SC Holding AG | Naphthalinlactamimid-Fluoreszenzfarbstoffe |
| US5840835A (en) * | 1995-10-30 | 1998-11-24 | Merck & Co., Inc. | Inhibitors of peptide binding to MHC class II proteins |
| ES2187764T3 (es) * | 1996-03-26 | 2003-06-16 | Basf Ag | Reforzantes del poder de blanqueo para composiciones de blanqueo y de detergentes para textiles. |
| FR2764602B1 (fr) * | 1997-06-11 | 1999-07-30 | Oreal | Composition cosmetique comprenant un amide et nouveaux amides |
| WO1999065855A2 (de) * | 1998-06-18 | 1999-12-23 | Merck Patent Gmbh | Kombinatorische bibliotheken geminal substituierter amine |
| DE19960377A1 (de) * | 1999-12-14 | 2001-06-21 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Herstellung kombinatorischer Aminbibliotheken |
| US7514098B2 (en) * | 2001-05-30 | 2009-04-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Use of targeted cross-linked nanoparticles for in vivo gene delivery |
| JP2003029367A (ja) * | 2001-07-11 | 2003-01-29 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料及びヒドロキシルアミン化合物 |
| JP2003096048A (ja) * | 2001-09-27 | 2003-04-03 | Nof Corp | アミンオキシドの製造方法 |
| EP1549624B1 (en) * | 2002-10-08 | 2009-05-13 | The Scripps Research Institute | Inhibitors of fatty acid amide hydrolase |
| US7745651B2 (en) | 2004-06-07 | 2010-06-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
| CA2586592A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | The Procter & Gamble Company | Process for making long chain internal fatty tertiary amines |
| US7404969B2 (en) | 2005-02-14 | 2008-07-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules |
| EP1922300A2 (en) | 2005-02-14 | 2008-05-21 | Sirna Therapeutics Inc. | Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them |
| DE102005060074A1 (de) * | 2005-12-15 | 2007-06-21 | Heinz Prof. Dr. Langhals | Domino-Metathesereaktion zur Darstellung von Farbstoff-Cyclophanen mit großen Stokes-Shifts |
| DE102006050672A1 (de) * | 2006-10-24 | 2008-04-30 | Curacyte Discovery Gmbh | Hemmstoffe des Plasmins und des Plasmakallikreins |
| WO2008103276A2 (en) * | 2007-02-16 | 2008-08-28 | Merck & Co., Inc. | Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules |
| JP2008239965A (ja) * | 2007-02-28 | 2008-10-09 | Sanyo Chem Ind Ltd | 光学部材用粘着剤 |
| TWI428135B (zh) * | 2007-03-26 | 2014-03-01 | Hirofumi Takeuchi | And a carrier composition for quick-acting nucleic acid delivery |
| EP3494964B1 (en) * | 2007-05-14 | 2021-04-07 | Konica Minolta Holdings, Inc. | Liposome and method for producing liposome |
| US20110117125A1 (en) | 2008-01-02 | 2011-05-19 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
| PT2279254T (pt) | 2008-04-15 | 2017-09-04 | Protiva Biotherapeutics Inc | Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico |
| US20100055169A1 (en) | 2008-04-16 | 2010-03-04 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
| US20100055168A1 (en) | 2008-04-16 | 2010-03-04 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
| US20090285881A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-11-19 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
| US20100076055A1 (en) | 2008-04-16 | 2010-03-25 | Abbott Laboratories | Cationic Lipids and Uses Thereof |
| US20090263407A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Abbott Laboratories | Cationic Lipids and Uses Thereof |
| US20100104629A1 (en) | 2008-04-16 | 2010-04-29 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
| WO2009132131A1 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Amino lipid based improved lipid formulation |
| WO2010021865A1 (en) | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids |
| WO2010030730A1 (en) | 2008-09-10 | 2010-03-18 | Abbott Laboratories | Polyethylene glycol lipid conjugates and uses thereof |
| US20100063135A1 (en) | 2008-09-10 | 2010-03-11 | Abbott Laboratories | Polyethylene glycol lipid conjugates and uses thereof |
| PL2350043T3 (pl) | 2008-10-09 | 2014-09-30 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Ulepszone aminolipidy i sposoby dostarczania kwasów nukleinowych |
| WO2010048536A2 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Processes for preparing lipids |
| JP5832898B2 (ja) | 2008-11-10 | 2015-12-16 | テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物 |
| WO2010054384A1 (en) | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
| US20120101148A1 (en) | 2009-01-29 | 2012-04-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | lipid formulation |
| CN102625696B (zh) | 2009-06-10 | 2015-06-03 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 改进的脂质制剂 |
| CN107090456B (zh) * | 2010-08-02 | 2022-01-18 | 瑟纳治疗公司 | 使用短干扰核酸的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1基因表达的抑制 |
| HUE044815T2 (hu) * | 2010-08-17 | 2019-11-28 | Sirna Therapeutics Inc | Hepatitisz B vírus (HBV) génexpressziójának RNS-interferencia közvetített gátlása, rövid interferáló nukleinsav (SINS) alkalmazásával |
| US9233997B2 (en) * | 2010-08-26 | 2016-01-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| MX349088B (es) * | 2010-09-20 | 2017-07-10 | Merck Sharp & Dohme | Lípidos catiónicos novedosos de bajo peso molecular para la entrega de oligonucleótidos. |
| EP3766975A1 (en) * | 2010-10-29 | 2021-01-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
| JP5748531B2 (ja) | 2011-04-12 | 2015-07-15 | 株式会社小糸製作所 | 車両用灯具 |
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