KR101895916B1 - 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법 - Google Patents
엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 기존에 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 선택적으로 정제할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 분리 방법과 비교하여 성능 또는 기능적 활성이 훨씬 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물을 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리 방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합하다.
Description
본 발명은 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 고순도로 분리 및 선택적으로 정제하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 효율적으로 분별하여 분리 및 선택적으로 정제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서로 다른 배치(batch)에서 배양된 세포 배양액, 하나의 배치에서 배양되어 각기 소분(小分)된 세포 배양액, 및 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터, 안정적이고 반복적으로, 동일 내지 유사한 성능 또는 기능적 활성을 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 방법을 이용하여, 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법 및 줄기세포 배양액 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 나노소포체인 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
이와 같은 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
초원심분리법(ultracentrifugation)은 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는데 지금까지 가장 널리 사용되었던 방법이나, 수율이 낮고, 분리하는데 시간이 많이 소요되며 노동집약적이고, 비싼 기기가 필요하다는 단점이 있다. 또한, 초원심분리법은 분리과정에서 엑소좀 또는 세포외 소포체에 손상을 줄 수 있어 후속 분석 과정이나 응용에 지장을 줄 수 있는 단점이 있다.
초미세여과법(ultrafiltration)은 초원심분리법과 함께 사용되어, 엑소좀 또는 세포외 소포체의 순도를 높일 수 있지만, 엑소좀 또는 세포외 소포체가 필터에 달라붙어 분리 후의 수율이 낮다는 문제점이 있다.
또한, 면역친화성 분리법은 항체를 엑소좀 또는 세포외 소포체에 붙여서 분리하는 방법으로 특이도가 높은 장점이 있지만, 항체를 만드는 과정과 분리 후 항체를 제거하는 과정이 필요하고 비용이 많이 드는 단점이 있으며 스케일-업(scale-up)에 부적합한 방식이다.
한편, 최근에는 엑소좀을 분리하는 방법으로 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등의 다양한 엑소좀 분리 키트가 상업적으로 판매되고 있으나, 사용이 간편한 대신 시약값이 고가여서 실험실 수준에서 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하기 위해 사용될 수는 있어도 대량으로 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하기에는 적합하지 않은 문제가 있다.
무엇보다도 엑소좀 또는 세포외 소포체의 분리과정에서 문제가 되는 것은 단백질과 같은 불순물이 섞여 함께 분리되거나 수율이 낮다는 점이다. 또한, 엑소좀 또는 세포외 소포체의 분리 및 정제에는 시간이 많이 소모되고 번거럽고 비용이 많이 소모된다. 또한, 순도를 높이기 위해 개발된 기존의 분리 방법은 스케일-업(scale-up)을 어렵게 하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에 부적합한 문제가 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 엑소좀 또는 세포외 소포체를 고순도로 경제적이고 효율적으로 분리 및 정제할 수 있는 동시에 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합한 기술에 대한 요구가 꾸준히 계속되고 있다. 즉, 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제하는 새로운 기술이 필요하다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)
Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648
본 발명의 목적은 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 효율적으로 분별하여 분리 및 선택적으로 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 생물학적 용액으로부터 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 선택적으로 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 서로 다른 배치(batch)에서 배양된 세포 배양액, 하나의 배치에서 배양되어 각기 소분(小分)된 세포 배양액, 및 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터, 안정적이고 반복적으로, 동일 내지 유사한 성능 또는 기능적 활성을 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 방법을 이용하여 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법 및 줄기세포 배양액 분획물의 제조방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접선흐름여과(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 효율적으로 분별하여 분리 및 선택적으로 정제할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 접선흐름여과(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 선택적으로 정제할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서로 다른 배치(batch)에서 배양된 세포 배양액, 단일 배치에서 배양되어 각기 소분(小分)된 세포 배양액, 및 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터, 안정적이고 반복적으로, 동일 내지 유사한 성능 또는 기능적 활성을 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)"는 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 줄기세포 종류, 분리 방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.
한편, "부형제(excipient)"는 통상, 약제에 적당한 굳기나 형상을 주거나, 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정한 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 물질을 의미하나, 본 발명에서는 당업계에 알려진 "부형제(excipient)(또는 첨가제로 불리기도 함)"가 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다. 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 방법은, 생물학적 용액에 부형제(excipient)를 첨가하는 단계; 상기 부형제가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계; 및 상기 여과된 생물학적 용액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법은, 1차 분리 이후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
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본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 서로 다른 배치(batch)의 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 단일 배치로부터 각기 소분(小分)된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 있어서, 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 분리 방법에서 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 바와 같은 분리 방법을 이용하여 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 전술한 바와 같은 분리 방법을 이용하여, 생물학적 용액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하는 단계, 및 상기 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 준비하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 전술한 바와 같은 분리 방법을 이용하여 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 줄기세포 배양액 분획물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 전술한 바와 같은 분리 방법을 이용하여, 줄기세포의 배양액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 함유된 분획물을 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 또는 화장품을 포함하는 피부외용제로 제조될 수 있다. 상기 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 건강기능 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효 성분으로서 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(예를 들어, 줄기세포로부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체), 또는 이를 포함하는 분획물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함한다. 예를 들어, 상기 건강기능 식품 조성물은 영양제, 비타민, 전해질, 착색제, 단백질, 탄수화물, 지방, 조미제, 향미제, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 상기 건강기능 식품 조성물에 첨가되는 성분은 식품첨가물로서 적합해야 하는데, 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검, L-글루타민산나트륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구체예의 건강기능 식품 조성물의 형태는 특별히 제한되지는 않으나 드링크제, 과일 쥬스 음료, 야채 음료, 차, 기능수, 알콜 음료, 비타민 복합제 등을 포함할 수 있다. 상기 건강기능 식품 조성물은 최종 식품 중량에 대해 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(예를 들어, 줄기세포로부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체), 또는 이를 포함하는 분획물을 약 0.01 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 90 중량% 정도 포함하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 생물학적 용액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(예를 들어, 줄기세포로부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체) 이외에, 그 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 기능성 성분 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 마스크팩, 패취, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명의 방법은 접선흐름여과를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 효율적으로 분별하여 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 방법은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 기존에 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 선택적으로 정제할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 분리 방법과 비교하여 성능 또는 기능적 활성이 훨씬 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물을 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리 방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합하다.
본 발명의 방법은 서로 다른 배치(batch)에서 배양된 세포 배양액, 하나의 배치에서 배양되어 각기 소분(小分)된 세포 배양액, 및 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터, 안정적이고 반복적으로, 동일 내지 유사한 성능 또는 기능적 활성을 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 산업적 측면에서 안정적이고 반복적으로, 유용한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물을 대량으로 생산할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시하였다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물의 제조과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 7에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(Exosome and/or EV), CM은 줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 제거된 줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 8에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 2개의 서로 다른 배치로 생산한 배양액에서 각각 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), Harvest 1과 2는 배치(batch) 1에서 1차 및 2차에 걸쳐 생산된 배양액에서 각각 분리 정제한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용하였음을 의미한다.
도 10은 단일 배치로 생산된 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)을 의미한다.
도 11은 서로 다른 생산 주기(campaign)에서 생산된 배양액으로부터 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. NO 형성의 감소 정도는 인산염 완충용액과 덱사메타손을 처리한 대조군에서 형성된 NO에 대하여 각각의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 처리 농도별로 감소한 NO 양을 백분율(%)로 표시하였다.
도 12는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. A는 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이고, B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이며, C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 13의 A는 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 농도의존적으로 촉진함을 확인한 결과를 도시한다. 도 13의 B는 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 수득된 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가를 비교한 실험 결과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시하였다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물의 제조과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 7에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(Exosome and/or EV), CM은 줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 제거된 줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 8에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 2개의 서로 다른 배치로 생산한 배양액에서 각각 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), Harvest 1과 2는 배치(batch) 1에서 1차 및 2차에 걸쳐 생산된 배양액에서 각각 분리 정제한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용하였음을 의미한다.
도 10은 단일 배치로 생산된 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)을 의미한다.
도 11은 서로 다른 생산 주기(campaign)에서 생산된 배양액으로부터 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. NO 형성의 감소 정도는 인산염 완충용액과 덱사메타손을 처리한 대조군에서 형성된 NO에 대하여 각각의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 처리 농도별로 감소한 NO 양을 백분율(%)로 표시하였다.
도 12는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. A는 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이고, B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이며, C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 13의 A는 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 농도의존적으로 촉진함을 확인한 결과를 도시한다. 도 13의 B는 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 수득된 세포외 소포체에 의한 콜라겐 생성량 증가를 비교한 실험 결과를 도시한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: Thermo Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: Thermo Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (Thermo Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: Thermo Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: Thermo Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (Thermo Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다. 또한, HDF(Human dermal fibroblast) 세포 및 배지는 (주)세포바이오 (대한민국 서울특별시 소재)에서 구입하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS,Thermo Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 과정에서 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 배양액에 부형제를 첨가하였다. 부형제로서는 트레할로오스(trehalose)를 0.01 내지 30 중량% 첨가하였다. 부형제를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 전 배양액을 초음파처리(sonication)하여 잠재적인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 덩어리를 풀어주었다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 부형제를 첨가하였다. 부형제 처리에 따라 고순도이면서 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성 분석
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 배양액, TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(Thermo Fisher에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 후, 부형제의 첨가 여부에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 부형제가 존재하지 않는 상태에서 TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 경우, 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 부형제의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 과정에 부형제의 첨가 여부를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 부형제를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용한 경우나 부형제를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 크기도 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 기존에 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 분리 방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 따른 RAW 264.7 세포 독성 측정
RAW 264.7 세포에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 세포를 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 농도 별로, 예를 들어 3×106 입자/ml, 1×107 입자/ml, 3×107 입자/ml, 1×108 입자/ml, 3×108 입자/ml, 1×109 입자/ml의 농도로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하거나, 총 단백질량을 기준으로 0.03 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.3 μg/mL, 1 μg/mL, 3 μg/mL, 10 μg/mL로 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(Thermo Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정
RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지에 희석한 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 적정 농도로 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 8에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 유용한 기능적 활성(예를 들어, 염증 반응 감소 등)을 가지며, 본 발명의 분리방법이 임상이나 상업적으로 유용하게 활용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
한편, 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 산업적으로 이용하기 위해서는 안정적인 세포배양 및 세포배양액의 생산, 안정적인 분리 정제 방법의 확립이 선결되어야 한다. 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 안정적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 생산하고 분리 정제할 수 있는지 확인하기 위하여, 서로 다른 배치의 세포 배양액에서 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 정제하고 그 기능적인 유사함을 확인하였다. 도 9에서 도시한 바와 같이 서로 다른 배치의 줄기세포 배양으로부터 1회 또는 2회에 걸쳐 생산된 줄기세포 배양액에서 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리 정제된 각 배치의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다.
또한, 하나의 줄기세포 배양 배치에서 생산된 줄기세포 배양액은 필요에 따라 소분한 후 TFF 분리 정제를 수행할 수 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, 하나의 배치로 생산된 줄기세포 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 TFF 분리 정제를 수행하여 얻어진 각 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다.
뿐만 아니라, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 산업적으로 이용하기 위해서는 줄기세포 배양과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 정제가 주기적으로 이루어져야 한다. 이때, 각 주기(campaign)에서 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 기능이 동일하게 유지되어야 한다. 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 구체예의 방법에 의해 주기별로 생산된 각 주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 분리 방법에 따라 안정적이고 반복적으로 균일한 성능을 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 분리 방법에 따르면 산업적 측면에서 안정적이고 반복적으로, 유용한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물을 대량으로 생산할 수 있다.
실시예 6: 분리 방법에 따른 NO 형성 감소 효과의 비교
분리 방법에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NO 형성 감소 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체(도 12A 참조)는 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(도 12B 참조)와 비교하여 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 12C에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 종래의 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 종래 방법에 따라 분리된 세포외 소포체에 비해 입자크기 분포의 균일도와 NO 형성 억제 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 분리 방법은 종래의 분리 방법과 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 입자크기 분포의 균일성, NO 생성 억제, 염증 반응 감소 등)이 훨씬 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득할 수 있고, 산업적 측면에서 안정적이면서 반복적으로 이와 같이 성능 또는 기능적 활성이 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 생산할 수 있는 기술이다.
실시예 7: 피부 섬유아세포를 이용한 콜라겐 생성 촉진 효과 측정
이하에서는 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 콜라겐 생성 촉진 효과를 인체 피부 섬유아세포인 HDF(Human dermal fibroblast) 세포 또는 HS68 세포에서 확인하였다.
실시예 7-1: 농도의존적인 콜라겐 생성 촉진 확인
인체 피부 섬유아세포를 멀티웰 플레이트에 분주한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 농도 별(3μg/mL, 10μg/mL, 30μg/mL, 100μg/mL 및 300μg/mL)로 처리하여 배양하였다. 이후, 배양액을 회수하여 원심분리한 후, 원심분리된 배양액을 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트(Takara에서 구입)를 이용하여 제조사의 권고 방법에 따라 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 농도의존적으로 증가시킨 것을 확인할 수 있었고, 특히 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 300μg/mL의 농도로 처리한 경우, 음성 대조군을 기준으로 약 4.5배 정도 콜라겐 합성을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 13의 A). 이러한 결과는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 유용한 기능적 활성(예를 들어, 콜라겐 생성 촉진 등)을 가지며, 본 발명의 분리방법이 임상이나 상업적으로 유용하게 활용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 7-2: 분리 방법에 따른 콜라겐 생성량 증가의 비교
분리 방법에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 콜라겐 생성 촉진 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다.
인체 피부 섬유아세포를 멀티웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와, 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 각각 농도 별(3μg/mL 및 6μg/mL)로 처리하여 배양하였다. 그리고, 실시예 7-1에서 설명한 방법에 따라 콜라겐 생성량을 측정하여 비교하였다. 도 13의 B에 도시한 바와 같이, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 인체 피부 섬유아세포에 6μg/mL 처리한 경우, 종래의 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체를 인체 피부 섬유아세포에 6μg/mL 처리한 경우에 비해 콜라겐 생성량이 약 1.55배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 종래 방법에 따라 분리된 세포외 소포체에 비해 콜라겐 생성 촉진 효과 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 분리 방법은 종래의 분리 방법과 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 콜라겐 생성 촉진, 피부주름 개선, 피부탄력 개선, 피부 상처 치유, 피부 재생 등)이 훨씬 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득할 수 있고, 산업적 측면에서 안정적이면서 반복적으로 이와 같이 성능 또는 기능적 활성이 우수한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 생산할 수 있는 기술이다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (17)
- 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제 방법으로서,
(a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계;
(b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계;
(c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c)의 분리 단계 이후에, 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계를 포함하는, 분리 및 정제 방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제1항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제1항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (c)의 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 분리 및 정제 방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제10항에 있어서,
서로 다른 배치(batch)의 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제10항에 있어서,
단일 배치로부터 각기 소분(小分)된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제10항에 있어서,
서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터 각기 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 분리 및 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 생물학적 용액은 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 분리 및 정제 방법. - 제14항에 있어서,
상기 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포인, 분리 및 정제 방법. - 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
제1항에 기재된 분리 및 정제 방법을 이용하여 생물학적 용액으로부터 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하는 단계, 및
상기 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 준비하는 단계를 포함하는, 제조 방법. - 줄기세포 배양액 분획물의 제조방법으로서,
제15항에 기재된 분리 및 정제 방법을 이용하여, 줄기세포의 배양액으로부터 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 함유된 분획물을 수득하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
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| GRNT | Written decision to grant |