KR101715882B1 - - - Novel -caprolactam convertase and method for preparing -caprolactam using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 ε-카프로락탐 전환 효소에 관한 것으로서, 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 ε-카프로락탐 전환 효소, 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소는 수계에서도 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 변환시킬 수 있어서, 유기용매를 이용할 필요가 없는 등, ε-카프로락탐의 생성 과정에서 독성물질이나, 환경오염 부산물이 발생하지 않는바, 친환경적으로 ε-카프로락탐을 제조할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a novel? -Caprolactam converting enzyme, which comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from a Streptomyces genus, or an amino acid sequence having an amino acid sequence having a homology of at least 95% with SEQ ID NO: 1 -Caprolactam conversion enzyme, and a gene encoding the same. The ε-caprolactam conversion enzyme of the present invention can convert aminocaproic acid into ε-caprolactam even in the aqueous system, and thus it is not necessary to use an organic solvent. In the process of producing ε-caprolactam, toxic substances, There is an advantage that epsilon -caprolactam can be produced eco-friendly.

Description

신규 ε-카프로락탐 전환 효소 및 이를 이용한 ε-카프로락탐 생산 방법{Novel ε-caprolactam convertase, and method for preparing ε-caprolactam using the same}The novel? -Caprolactam converting enzyme and a method for producing? -Caprolactam using the same are provided. The novel? -Caprolactam converting enzyme and the method for preparing? -Caprolactam using the same,

본 발명은 신규한 ε-카프로락탐 전환 효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물 유래의 ε-카프로락탐 전환 효소에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel? -Caprolactam converting enzyme, and more specifically to an? -Caprolactam converting enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces .

ε-카프로락탐(ε-caprolactam)은 합성 폴리머 나일론 6, 합성 가죽, 폴리우레탄 링커의 전구체로 이용되는 물질로서, 세계 시장에서 톤당 $2700~3300로 각광받고 있는 모노머이다. ε-카프로락탐은 아미노카프론산(IUPAC 명칭: 6-아미노헥산산(6-aminohexanoic acid))의 락탐형 유기 화합물로, ε-카프로락탐 단량체의 개환 중합 반응에 의해 나일론-6가 생산된다. ε-카프로락탐을 생산하기 위한 출발 화합물은 벤젠인데, 상기 벤젠은 시클로헥산(cyclohexane) 또는 페놀(phenol)로 전환되고, 상기 시클로헥산 또는 페놀은 시클로헥사논(cyclohexanone)을 거쳐 시클로헥사논 옥심(cyclohexanone oxime)이 되고, 이 중간체는 황산 하에서 가열된다. 이 화학 반응은 베크만 전위(Beckman rearrangement)라고 알려져 있다. 상기와 같은 일련의 과정에서 출발 물질인 벤젠은 석유 화합물들의 정제를 통해 생산되지만, 화학 반응을 통해 ε-카프로락탐을 생산하는 공정은 독성물질인 벤젠의 사용, 환경오염 부산물의 생성 및 강산화제 사용 등의 문제점으로 인해 바이오 공정 기술연구에 대한 필요성이 증가하고 있는 추세이다. ε-caprolactam is a monomer used as a precursor of synthetic polymer nylon 6, synthetic leather, and polyurethane linker, and is being spotted at $ 2700-3,300 / ton in the world market. ? -caprolactam is a lactam-type organic compound of aminocaproic acid (IUPAC name: 6-aminohexanoic acid), and nylon-6 is produced by ring-opening polymerization of? -caprolactam monomer. The starting compound for producing epsilon -caprolactam is benzene, which is converted to cyclohexane or phenol, and the cyclohexane or phenol is converted to cyclohexanone via cyclohexanone oxime ( cyclohexanone oxime), which is heated under sulfuric acid. This chemical reaction is known as the Beckman rearrangement. In the above-mentioned series of processes, benzene, which is a starting material, is produced through purification of petroleum compounds. However, the process of producing ε-caprolactam through a chemical reaction involves the use of benzene as a toxic substance, the production of environmental pollution by- The need for bio-process technology research is increasing.

현재, 다른 방법으로서 바이오 생합성 과정을 통해 ε-카프로락탐의 전구체인 6-아미노헥사에노익산을 효소적 방법으로 전환하는 방법이나(특허문헌 1), 6-아미노카프론산, ε-카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로를 가지는 비-천연 미생물 유기체(특허문헌 2), 아디페이트, 6-아미노카프론산 또는 ε-카프로락탐 통로를 가지는 비-천연 미생물 유기체(특허문헌 3)에 관해 연구가 이루어지고 있고, 최근에는 유기용매 내에서 효소를 이용하여 아미노카프론 산으로부터 ε-카프로락탐 전환에 관한 연구가 보고되었지만(비특허문헌 1), 아직 수계에서 효소 혹은 미생물을 이용하여 ε-카프로락탐을 생산에 성공한 선례는 보고된 바가 없다. At present, as another method, a method of converting 6-aminohexanoic acid, which is a precursor of epsilon -caprolactam through an enzymatic biosynthetic process, by an enzymatic method (Patent Document 1), 6-aminocaproic acid, epsilon -caprolactam, Studies on non-natural microbial organisms with hexamethylenediamine or levulinic acid pathways (Patent Document 2), non-natural microbial organisms with adipate, 6-aminocaproic acid or epsilon -caprolactam pathways (Patent Document 3) Recently, studies on the conversion of epsilon -caprolactam from aminocaproic acid using an enzyme in an organic solvent have been reported (Non-Patent Document 1). However, it has been reported that an enzyme or microorganism is still used in the aqueous system to convert? -Capro There have been no previous reports of successful lactam production.

이에, 친환경적으로 ε-카프로락탐을 대량생산 할 수 있는 기술에 대한 수요가 증대되고 있는 실정이다.
Accordingly, there is a growing demand for a technology capable of mass-producing epsilon -caprolactam in an eco-friendly manner.

US2009-0137759AUS2009-0137759A US2010-0317069AUS2010-0317069A US7,799,545BUS7,799,545B

E. Stavila et al., "Synthesis of lactams using enzyme-catalyzed aminolysis," Tetrahedron Letters, 54(5) (2013) 370-372 E. Stavila et al., "Synthesis of lactams using enzyme-catalyzed aminolysis," Tetrahedron Letters, 54 (5) (2013) 370-372

본 발명의 목적은 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물인 스트렙토미세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus) 유래의 신규한 ε-카프로락탐 전환 효소, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 이용한 ε-카프로락탐의 생산 방법을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is MRS Streptomyces (Streptomyces) in the microorganism Streptomyces MRS Rapa US shinny kusu (Streptomyces rapamycinicus) novel ε- caprolactam conversion enzyme derived from the gene encoding the same, a recombinant expression vector containing the gene, the recombinant A transformant transformed with an expression vector, and a method for producing? -Caprolactam using the? -Caprolactam converting enzyme.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 ε-카프로락탐 전환 효소를 제공한다.One aspect of the present invention provides an ε-caprolactam-converting enzyme comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having 95% or more homology with SEQ ID NO: 1.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 측면은 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a recombinant expression vector containing the gene and a transformant into which the expression vector is introduced.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 포함하는 상기 ε-카프로락탐 생산용 조성물, 및 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 아미노카프론산과 반응시키는 단계를 포함하는 ε-카프로락탐의 생산 방법을 제공한다.
In order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a composition for producing ε-caprolactam, which comprises the ε-caprolactam conversion enzyme, and a method for reacting the ε-caprolactam conversion enzyme with aminocaproic acid Lt; RTI ID = 0.0 > e-caprolactam < / RTI >

본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소는 수계에서도 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 변환시킬 수 있어서, 유기용매를 이용할 필요가 없는 등, ε-카프로락탐의 생성 과정에서 독성물질이나, 환경오염 부산물이 발생하지 않는바, 친환경적으로 ε-카프로락탐을 제조할 수 있다.The ε-caprolactam conversion enzyme of the present invention can convert aminocaproic acid into ε-caprolactam even in the aqueous system, and thus it is not necessary to use an organic solvent. In the process of producing ε-caprolactam, toxic substances, Epsilon -caprolactam can be produced eco-friendly.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 WP_020873096.1 단백질을 SDS-PGAE로 확인한 사진으로서, "Crude"는 형질전환체에서 발현되는 전체 단백질을 나타낸 것이고, "Purified"는 정제 및 분리된 WP_020873096.1 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 WP_020873096.1 단백질의 ε-카프로락탐 전환 효소로서의 활성을 확인한 결과를 나타낸 스펙트럼이다.
도 3은 온도가 WP_020873096.1 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 4는 pH가 WP_020873096.1 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프로서, ●는 PIPES 완충 용액에서의 활성도를 나타낸 것이고, ○는 HEPPS 완충 용액에서의 활성도를 나타낸 것이다.
도 5는 조효소가 WP_020873096.1 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 6은 WP_020873096.1 단백질의 ε-카프로락탐 전환 효소로서의 전환율을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.FIG. 1 is a photograph of WP_020873096.1 protein purified and overexpressed in a transformant and confirmed by SDS-PGAE, wherein "Crude" represents the whole protein expressed in a transformant, and "Purified" WP_020873096.1 protein.
Fig. 2 is a spectrum showing the result of confirming the activity of WP020873096.1 protein as? -Caprolactam converting enzyme.
Fig. 3 is a graph showing the effect of temperature on enzyme activity of WP020873096.1 protein.
FIG. 4 is a graph showing the effect of pH on the enzymatic activity of the WP_020873096.1 protein. FIG. 4 shows the activity in the PIPES buffer solution, and FIG. 4 shows the activity in the HEPPS buffer solution.
5 is a graph showing the effect of coenzyme on enzyme activity of WP020873096.1 protein.
6 is a graph showing the results of confirming the conversion rate of WP020873096.1 protein as? -Caprolactam converting enzyme.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
First, terms used in the specification of the present invention will be described.

본 발명에서 일컫는 'ε-카프로락탐 전환 효소'는 하기 반응식과 같이 아미노카프론산(IUPAC 명칭: 6-aminohexanoic acid)을 ε-카프로락탐으로 변환시키는 활성을 가진 효소를 의미한다.
Refers in the present invention, ε- caprolactam-converting enzyme "is to aminocaproic acid as reaction scheme (IUPAC name: 6-aminohexanoic acid) means the enzyme that has an activity for converting the ε- caprolactam.

[반응식][Reaction Scheme]

Figure 112015022518312-pat00001

Figure 112015022518312-pat00001

본 발명에서 일컫는 ε-카프로락탐 전환 효소 '1 단위(unit)'는 pH 7.5 및 40℃의 조건에서 1분당 1nmole의 카프로락탐을 생산하는데 필요한 ε-카프로락탐 전환 효소의 양을 의미한다.
Ε- caprolactam converting enzyme, 1 unit (unit) "refers in the present invention means an amount of a lactam-converting enzyme ε- caprolactone required to produce 1 caprolactam 1nmole per minute under the conditions of pH 7.5 and 40 ℃.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. One. ε-카프로락탐 전환 효소 및 그 유전자? -caprolactam conversion enzyme and its gene

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 ε-카프로락탐 전환 효소를 제공한다.One aspect of the present invention provides an ε-caprolactam-converting enzyme comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having 95% or more homology with SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자를 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a gene of? -Caprolactam converting enzyme encoding the? -Caprolactam converting enzyme.

본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소는 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 스트렙토미세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus)로부터 유래한 것이 바람직하다.The epsilon -caprolactam converting enzyme of the present invention may be derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces , and is preferably derived from Streptomyces rapamycinicus .

본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 ε-카프로락탐 전환 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.The ε-caprolactam-converting enzyme of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the ε-caprolactam converting enzyme can be added to the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by deletion, , Or fragments of amino acids having different sequences by the combination of < RTI ID = 0.0 > Amino acid exchange at the level of proteins and peptides that do not globally alter the activity of the epsilon -caprolactam converting enzyme is known in the art. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like. Accordingly, the present invention includes a protein having substantially the same amino acid sequence as the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a mutant thereof, or an active fragment thereof. The substantially same protein means those having an amino acid sequence homology of not less than 80%, preferably not less than 90%, and most preferably not less than 95%, but is not limited thereto, and has homology of not less than 80% Is encompassed within the scope of the present invention.

상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.The gene of the? -Caprolactam converting enzyme is preferably composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. However, the gene encoding epsilon -caprolactam-converting enzyme of the present invention and its mutant or its active fragment may be modified in various ways in the encoding region within a range that does not change the amino acid sequence of the enzyme and its mutant or its active fragment expressed from the coding region A variety of mutations can be made within a range that does not affect the expression of the gene even in the portion other than the coding region, and such mutant genes are also included in the scope of the present invention. Therefore, the present invention includes a gene consisting of a base sequence substantially identical to the gene of SEQ ID NO: 2, and a fragment thereof. The term "gene comprising substantially the same base sequence" as used herein refers to those having 80% or more, preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of sequence homology, but is not limited thereto, and 80% or more of the sequence homology And if the encoded protein has the same enzymatic activity, it is included in the present invention. As described above, as long as the ε-caprolactam converting enzyme of the present invention encodes a protein having the equivalent activity, one or more nucleotide bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof. And are included in the scope of the present invention.

상기 ε-카프로락탐 전환 효소에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contained in the epsilon -caprolactam conversion enzyme is preferably encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but the present invention is not limited thereto. As long as the protein can be encoded, it may be encoded by a gene consisting of another nucleotide sequence substantially identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Such a base sequence may be a single strand or a double strand, and may be a DNA molecule or an RNA molecule.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 스트렙토미세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus)에서 유래한 가설 단백질(hypothetical protein)인 서열번호 1의 아미노산 서열(Gene Bank Accession No. WP_020873096.1)을 갖는 단백질(이하 'WP_020873096.1 단백질'이라고 합니다)의 기능을 규명하기 위하여 상기 WP_020873096.1 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 WP_020873096.1 단백질이 ε-카프로락탐 전환 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(도 2 참고).
In a preferred embodiment of the present invention, the present inventors have identified a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Gene Bank Accession No. WP_020873096.1) which is a hypothetical protein derived from Streptomyces rapamycinicus The protein WP_020873096.1 was isolated and purified (see FIG. 1) to examine the function of the WP_020873096.1 protein (hereinafter referred to as 'WP_020873096.1 protein'). And had activity as an enzyme (see Fig. 2).

2. 2. ε-카프로락탐 전환 효소의 발현 벡터 및 형질전환체an expression vector of? -caprolactam converting enzyme and a transformant

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a recombinant expression vector containing the gene of? -Caprolactam converting enzyme of the present invention and a transformant into which the expression vector is introduced.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자를 포함한다.The recombinant expression vector of the present invention includes the gene of the? -Caprolactam converting enzyme.

상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. The expression vector includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.The recombinant expression vector can be used as an expression control sequence such as a promoter, a terminator, an enhancer or the like depending on the kind of a host cell into which the ε-caprolactam converting enzyme of the present invention is to be produced, Etc. can be suitably combined according to the purpose.

상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. The expression vector may further include a selection marker for selecting a host cell to which the vector is introduced, and may include a replication origin when the expression vector is a replication capable vector.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.In addition, the recombinant expression vector may include a sequence for facilitating the purification of the expression protein, and more specifically, a gene encoding a tag for separation and purification so as to be operable to the gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme of the present invention Lt; / RTI > At this time, GST, poly-Arg, FLAG, His-tag and c-myc may be used singly or two or more of them may be sequentially connected.

상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 ε-카프로락탐 전환 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.The gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme can be cloned through a restriction enzyme cleavage site. When a gene encoding the protein cleavage enzyme recognition site is used in the vector, the gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme And then the protein is ligated in frame so as to obtain the enzyme and then cleaved with the protein cleaving enzyme so that the original form of the [epsilon] -caprolactam converting enzyme can be produced.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.In a specific example of the present invention, a recombinant cloning vector was prepared by inserting the ε-caprolactam converting enzyme gene of the present invention into pET28a (+), which is a plasmid vector. Various vectors for prokaryotic cells or eukaryotic cells (such as pPIC and pPICZ) are known in addition to pET28a (+) used in the production of the above cloning vector. Therefore, various expression vectors other than the above vectors may be used depending on the purpose of expression.

본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 ε-카프로락탐 전환 효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.The recombinant expression vector of the present invention contains an ε-caprolactam converting enzyme gene and can be used as a vector capable of producing the recombinant expression vector.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.In addition, a recombinant expression vector containing a gene encoding? -Caprolactam converting enzyme is introduced into the transformant of the present invention.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. The recombinant expression vector according to the present invention can be transformed into any suitable host cell selected from the group consisting of bacteria, yeast, E. coli, fungi, plant cells and animal cells according to the purpose of expression, . For example, the host cell may be Escherichia coli ( E. coli BL21 (DE3), DH5α, etc.) or yeast cell ( Saccharomyces sp., Pichia sp. At this time, a suitable culture method and medium conditions depending on the kind of the host cell can be easily selected by those skilled in the art from the known art.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.As a method of introducing the recombinant expression vector for the production of the transformant of the present invention, known techniques such as heat shock method, electric shock method and the like can be used.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.In a specific example of the present invention, Escherichia coli was transformed with Escherichia coli as a host cell to transform a recombinant expression vector containing a gene encoding the? -Caprolactam-converting enzyme of the present invention into a transformant.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 ε-카프로락탐 전환 효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
Since the ε-caprolactam converting enzyme is a novel sequence protein having an enzyme activity, the protein expressed from the transformant can be obtained by mass-culturing the transformant and expressing the gene, thereby mass-producing the ε-caprolactam converting enzyme . ≪ / RTI >

3. 3. ε-카프로락탐 전환 효소의 생산 방법Production method of? -caprolactam converting enzyme

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 ε-카프로락탐 전환 효소를 생산하는 방법을 제공한다.In yet another aspect of the present invention, there is provided a method for producing ε-caprolactam-converting enzyme using a transformant into which a recombinant expression vector containing a gene encoding an ε-caprolactam-converting enzyme of the present invention is introduced .

본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소 생산 방법은 1) 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 ε-카프로락탐 전환 효소 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 ε-카프로락탐 전환 효소를 분리하는 단계를 포함한다. The method for producing an? -Caprolactam converting enzyme of the present invention comprises the steps of: 1) culturing a transformant into which a recombinant expression vector containing a gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme of the present invention is introduced; 2) inducing expression of the gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme in the transformant cultured in the step 1); And 3) separating the? -Caprolactam conversion enzyme from the culture of the transformant in which the expression of the? -Caprolactam converting enzyme gene is induced in the step 2).

상기 단계 1)의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 ε-카프로락탐 전환 효소의 정제 또는 원래 형태의 ε-카프로락탐 전환 효소의 수득이 가능할 수 있다.The gene coding for the tag for separation and purification or the site of cleavage of the protein cleavage enzyme may be additionally linked to the N-terminus of the gene encoding the? -Caprolactam converting enzyme in step 1), and thus the recombinant? -Caprolactam converting enzyme Lt; RTI ID = 0.0 > of epsilon -caprolactam < / RTI > converting enzyme in its original form.

상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. The cultivation of the transformant in the above step 1) can be carried out according to a known method, and the conditions such as the culture temperature, the culture time and the pH of the culture medium can be appropriately controlled. In addition, the culture method may include a batch culture, a continuous culture, and a fed-batch culture. The culture medium used should suitably meet the requirements of a particular strain.

상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 ε-카프로락탐 전환 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 ε-카프로락탐 전환 효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.Separation of the ε-caprolactam-converting enzyme from the culture produced by the above-mentioned culture in the step 3) can be carried out by a conventional method such as centrifugation, filtration and the like. The ε-caprolactam conversion enzyme separated by the above method can be purified in a conventional manner, for example, by salting out (eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (using acetone, ethanol or the like Protein fraction precipitation), dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, ultrafiltration and the like can be used alone or in combination to purify the enzyme of the present invention.

본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 단백질이 ε-카프로락탐 전환 효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 ε-카프로락탐 전환 효소의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
In the specific examples of the present invention, it was confirmed that the purified protein showed the activity of? -Caprolactam converting enzyme (see FIG. 2). From the above results, it can be seen that the ε-caprolactam-converting enzyme can be mass-produced according to the production method of the present invention.

4. 4. ε-카프로락탐의 생산 방법 및 ε-카프로락탐 생산용 조성물Process for producing ε-caprolactam and composition for producing ε-caprolactam

본 발명의 또 다른은 측면은 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 이용하여 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐을 생산하는 방법 및 ε-카프로락탐의 생산에 이용되는 ε-카프로락탐 생산용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention relates to a method for producing epsilon -caprolactam from aminocaproic acid by using the epsilon -caprolactam conversion enzyme of the present invention and a method for producing epsilon -caprolactam composition for producing epsilon -caprolactam to provide.

본 발명의 ε-카프로락탐 생산용 조성물은 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 포함한다.The composition for producing [epsilon] -caprolactam of the present invention includes the [epsilon] -caprolactam converting enzyme of the present invention.

또한, 본 발명의 ε-카프로락탐의 생산 방법은 1) 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소를 아미노카프론산과 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 ε-카프로락탐을 회수하는 단계를 포함한다.Also, the method for producing? -Caprolactam of the present invention comprises the steps of: 1) reacting the? -Caprolactam converting enzyme of the present invention with aminocaproic acid; And 2) recovering? -Caprolactam from the reaction product resulting from the reaction in step 1).

상기 ε-카프로락탐의 생산 방법 및 ε-카프로락탐 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 ε-카프로락탐 전환 효소의 효소 활성을 이용하는 것이다. 다시 말해서, 상기 ε-카프로락탐 전환 효소를 이용하여 그 기질인 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐을 생성하는 것이다.The production method of the? -Caprolactam and the composition for producing? -Caprolactam are based on the enzyme activity of the? -Caprolactam conversion enzyme of the present invention in vitro . In other words, the above-mentioned? -Caprolactam conversion enzyme is used to produce? -Caprolactam from its substrate aminocaproic acid.

상기 단계 1)의 반응은 30℃ 내지 50℃의 온도 범위, 바람직하게는 35℃ 내지 45℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 6.5 내지 8.5의 pH 범위, 바람직하게는 7 내지 8의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 7.5의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.The reaction of step 1) may be performed at a temperature in the range of 30 ° C to 50 ° C, preferably at a temperature in the range of 35 ° C to 45 ° C, and more preferably at a temperature of about 40 ° C, but is not limited thereto. In addition, the reaction of step 1) above may be carried out at a pH of 6.5 to 8.5, preferably at a pH of 7 to 8, more preferably at a pH of 7.5, but is not limited thereto.

또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 ε-카프로락탐 전환 효소의 활성을 향상시키기 위하여 상기 ε-카프로락탐 전환 효소와 함께, NAD, NADH, FDH 등의 조효소가 함께 포함될 수 있고, 특히 FDH가 함께 포함되는 것이 바람직하다.In addition, in order to improve the activity of the? -Caprolactam converting enzyme, the reaction of step 1) may include a coenzyme such as NAD, NADH and FDH together with the? -Caprolactam converting enzyme, .

상기 단계 1)의 반응에서, 상기 아미노카프론산은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 아미노카프론산은 목적하는 ε-카프로락탐의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 또한, 상기 아미노카프론산의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 아미노카프론산이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 ε-카프로락탐 전환 효소에 의하여 ε-카프로락탐을 지속적으로 생성할 수 있다.In the reaction of step 1), the aminocaproic acid is preferably injected from the outside, and the aminocaproic acid should be injected in a sufficient amount in accordance with the amount of the desired? -Caprolactam. In addition, the injection of the aminocaproic acid can be carried out continuously. In particular, when the aminocaproic acid is continuously injected, the? -Caprolactam conversion enzyme can continuously produce? -Caprolactam.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 ε-카프로락탐 전환 효소에 의하여 아미노카프론산으로부터 ε-카프로락탐이 생산됨을 확인하였고(도 2 참조), 이러한 ε-카프로락탐 전환 효소의 효소 활성이 40℃에 가까운 온도에서 반응을 수행할수록, 7.5에 가까운 pH에서 반응을 수행할수록, 그리고 조효소와 함께 반응을 수행할수록 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 내지 5 참고).
In a specific example of the present invention, it was confirmed that ε-caprolactam was produced from aminocaproic acid by the ε-caprolactam converting enzyme as described above (see FIG. 2), and the enzymatic activity of this ε- , The reaction was performed at a pH close to 7.5, and the reaction was further improved with the coenzyme (see FIGS. 3 to 5).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
However, the following examples illustrate the present invention in detail, and the present invention is not limited by the following examples.

Gene Bank Accession No. WP_020873096.1 단백질의 분리Gene Bank Accession No. WP_020873096.1 Protein Isolation

[1-1] [1-1] WP_020873096.1 단백질의 클로닝 및 형질전환WP_020873096.1 Protein cloning and transformation

스트렙토미세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus) 유래의 가설 단백질(hypothetical protein)인 서열번호 1의 아미노산 서열(Gene Bank Accession No. WP_020873096.1)을 갖는 단백질(이하 'WP_020873096.1 단백질'이라고 합니다)을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열(Gene Bank Accession No. CP006567.1)을 기초로, 다음 표 1과 같이 NdeI의 제한효소 절단위치를 갖는 서열번호 3의 정방향 프라이머와 XhoI의 제한효소 절단위치를 갖는 서열번호 4의 역방향 프라이머를 각각 설계하였다(표 1에서 밑줄은 제한효소 절단위치를 나타냄).
(Hereinafter referred to as "WP_020873096.1 protein") having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Gene Bank Accession No. WP_020873096.1), which is a hypothetical protein derived from Streptomyces rapamycinicus , In order to obtain the restriction enzyme cleavage site of the forward primer of SEQ ID NO: 3 and XhoI having restriction enzyme cleavage sites of NdeI as shown in Table 1 below based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (Gene Bank Accession No. CP006567.1) (Underlined in Table 1 represents restriction enzyme cleavage sites). ≪ tb >< TABLE >

프라이머 쌍Primer pair 서열order 정방향 프라이머Forward primer 5'-TTTCATATGagcaacacagacggaag-3'5'-TTT CATATG agcaacacagacggaag-3 ' 역방향 프라이머Reverse primer 5'-TTTCTCGAGtcaccgctgggcgtcgttccgg-3'5'-TTT CTCGAG tcaccgctgggcgtcgttccgg-3 '

㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열(Gene Bank Accession No. CP006567.1)의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을 제한효소 NdeI 및 XhoI로 절단된 플라스미드 벡터 pET28a(+) (Novagen, 미국)의 다중 클로닝 자리에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
The gene of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (Gene Bank Accession No. CP006567.1) was synthesized by requesting Bioneer Co., Ltd., and PCR was performed using the synthesized gene as a template and the primer pairs designed as above, The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was amplified. The PCR product containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 amplified as described above was inserted into the multiple cloning site of the plasmid vector pET28a (+) digested with restriction enzymes NdeI and XhoI (Novagen, USA) to prepare a recombinant expression vector. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was correctly inserted through sequencing (Macrogen Co., Ltd.), which was transformed into Escherichia coli strain ER2566 (Novagen, USA). The transformant thus obtained was added with a 20% glycerin solution and stored frozen before use.

[1-2] [1-2] WP_020873096.1 단백질의 과발현 및 정제WP_020873096.1 Protein overexpression and purification

상기 실시예 [1-2]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3 ㎖의 LB 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 500 ㎖의 LB 배지가 포함된 2000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 WP_020873096.1 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 WP_020873096.1 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 16℃로 조정하였다.In the above Example [1-2], the cryopreserved transformant was inoculated into a test tube containing 3 ml of LB medium and cultured at 37 ° C in a shaking incubator at 600 nm until the absorbance reached 2.0. Respectively. Then, the cultured medium was added to a 2000 ml flask containing 500 ml of LB medium, and the culture was performed. When the absorbance at 600 nm was 0.6, IPTG (isopropyl-1 -thio-β-D-galactopyranoside) was added to induce overexpression of WP020873096.1 protein. In the process of inducing overexpression of WP020873096.1 protein as described above, the agitation speed was adjusted to 200 rpm and the incubation temperature was maintained at 37 ° C. After the addition of IPTG, the agitation speed was set to 150 rpm, the incubation temperature was set to 16 ° C. Respectively.

또한, 상기와 같이 WP_020873096.1 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 4℃에서 6000g로 30분 동안 원심분리하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척한 다음, 50mM의 제1인산나트륨(NaHPO4), 300mM의 NaCl, 10mMdml 이미다졸(immidazole) 및 0.1mM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, 단백분해효소 저해제)를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다. The culture of the transformant in which the overexpression of WP020873096.1 protein was induced was centrifuged at 6000g for 30 minutes at 4 DEG C, washed twice with 0.85% NaCl, and then washed with 50 mM sodium phosphate (NaHPO 4 ), 300 mM NaCl, 10 mM dm imidazole and 0.1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, protease inhibitor), and the cells were disrupted by the sonication method to obtain a cell lysate (cell lysate).

상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 13000Xg로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit? His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그라피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 WP_020873096.1 단백질을 분리하였다.The cell lysate thus obtained was further centrifuged at 13000 x g for 20 minutes at 4 캜 to obtain a supernatant . (Bio-Rad Laboratories, USA), equipped with a His tag adsorption column (Bio-Rad Laboratories, USA), as described in WP020873096.1 Proteins were isolated.

이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Taq이 붙어 있는 42.5 kDa의 WP_020873096.1 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
As a result of SDS-PAGE analysis of the separated proteins, 42.5 kDa of WP_020873096.1 protein having His-Taq attached thereto was overexpressed and purified and isolated from the cell lysate of the transformant (Fig. 1).

Gene Bank Accession No. WP_020873096.1 단백질의 활성 확인Gene Bank Accession No. WP_020873096.1 Identification of protein activity

본 발명자들은 상기 WP_020873096.1 단백질이 하기 반응식과 같은 'ε-카프로락탐 전환 효소'로서의 활성을 가질 것으로 예상하고, 이를 확인하였다.
The inventors of the present invention have anticipated that the protein WP_020873096.1 has an activity as an ε -caprolactam converting enzyme as shown in the following reaction formula, and confirmed this.

[반응식][Reaction Scheme]

Figure 112015022518312-pat00002

Figure 112015022518312-pat00002

구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 30 단위/㎖와 아미노카프론산 1mM을 50 mM의 HEPES 완충 용액(pH 7.5)에 첨가한 다음, 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 최종 농도가 200mM이 되도록 HCl을 첨가하였다. 그리고 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 아미노카프론산과 ε-카프로락탐의 농도를 측정하였다. 이때 상기 농도의 측정은 LC-MS 검출기와 C18 칼럼(Agilent Technologies, 미국)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행하였고, 상기 C18 칼럼은 25℃에서 0.4㎖/분의 속도로 1-70% 아세토니트릴(acetonitrile)을 순차적으로 통과시키도록 조정하였다.Specifically, 30 units / ml of WP_020873096.1 protein purified and isolated in Example [1-2] and 1 mM aminocaproic acid were added to a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5), followed by reaction for 10 minutes , HCl was added to a final concentration of 200 mM to terminate the reaction. The concentration of aminocaproic acid and epsilon -caprolactam was measured in the buffer solution as described above. The concentration was measured using high pressure liquid chromatography equipped with an LC-MS detector and a C18 column (Agilent Technologies, USA), and the C18 column was eluted with 1-70% And acetonitrile was sequentially passed through the column.

그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서는 아미노카프론산과 ε-카프로락탐이 모두 검출되었고(도 2), 애초에 존재하지도 않았던 ε-카프로락탐이 위 반응 결과 생성된 결과로부터 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질이 아미노카프론산을 ε-카프로락탐으로 변환시키는, ε-카프로락탐 전환 효소로서의 활성을 가짐을 확인하였으며, 상기 WP_020873096.1 단백질은 그 ε-카프로락탐 전환 효소로서의 특이 활성도(specific activity)가 3090±1.2 nmole / min /㎎ 임을 확인하였다.
As a result, the aminocaproic acid and epsilon -caprolactam were all detected in the buffer solution as described above (Fig. 2), and the result of the above reaction was found to be? -Caprolactam, 1-2], WP_020873096.1 protein had an activity as an epsilon -caprolactam conversion enzyme that converts aminocaproic acid to epsilon -caprolactam , and the WP020873096.1 protein has an activity as an ? -Caprolactam The specific activity as a lactam - converting enzyme was 3090 ± 1.2 nmole / min / ㎎ .

WP_020873096.1 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건에 관한 연구WP_020873096.1 A study on the conditions affecting enzyme activity of protein

본 발명자들은, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, WP_020873096.1 단백질이 ε-카프로락탐 전환 효소로서 작용함에 그 활성에 영향을 미치는 조건들에 대하여 연구를 진행하였고, 그로부터 상기 WP_020873096.1 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.
As described in Example 2 above, the inventors of the present invention have conducted studies on conditions that affect the activity of WP020873096.1 protein as an? -Caprolactam converting enzyme, from which the protein of WP020873096.1 protein Optimal activity conditions were derived.

[3-1] [3-1] 온도의 영향Influence of temperature

상기 WP_020873096.1 단백질의 효소의 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 30 단위/㎖와 아미노카프론산 1mM을 50 mM의 HEPES 완충 용액(pH 7.5)에 첨가한 다음, 5개의 실험군을 30℃, 35℃, 40℃, 45℃ 및 50℃의 온도에 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 최종 농도가 200mM이 되도록 HCl을 첨가하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 아미노카프론산과 ε-카프로락탐의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다. In order to confirm the effect of the temperature on the activity of the protein of WP_020873096.1 protein, 30 units / ml of WP_020873096.1 protein purified and isolated in Example [1-2] and 1 mM of aminocaproic acid were dissolved in 50 mM HEPES After adding to the buffer (pH 7.5), the five experimental groups were reacted for 10 minutes at temperatures of 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C, 45 ° C and 50 ° C, and the final concentration was adjusted to 200 mM HCl was added. Then, in the same manner as in Example 2, the concentration of aminocaproic acid and epsilon -caprolactam was measured in the buffer solution, and the relative values were compared.

그 결과, WP_020873096.1 단백질의 효소 활성은 40℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 3).
As a result, it was confirmed that the enzymatic activity of WP_020873096.1 protein gradually became better as it was closer to 40 ° C (FIG. 3).

[3-2] [3-2] pH의 영향Effect of pH

상기 WP_020873096.1 단백질의 효소의 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 30 단위/㎖와 아미노카프론산 1mM을 50 mM의 PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충 용액에 첨가하여 pH를 6.5 내지 7.5의 범위에서, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 30 단위/㎖와 아미노카프론산 1mM을 50 mM의 HEPES 완충 용액에 첨가하여 pH를 7.5 내지 8.5의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 40℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 최종 농도가 200mM이 되도록 HCl을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 아미노카프론산과 ε-카프로락탐의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.In order to confirm the influence of the pH on the enzyme activity of the WP_020873096.1 protein, 30 units / ml of WP_020873096.1 protein purified and isolated in Example [1-2] and 1 mM of aminocaproic acid were dissolved in 50 mM PIPES (2-ethanesulfonic acid) buffer solution in the range of pH 6.5 to 7.5, and the protein WP_020873096.1 protein purified and separated in the above Example [1-2] at a concentration of 30 units / Ml and 1 mM of aminocaproic acid were added to 50 mM HEPES buffer to react the pH in the range of 7.5 to 8.5, respectively. The enzyme reaction was carried out at a temperature of 40 DEG C for 10 minutes and then the reaction was terminated by adding HCl to a final concentration of 200 mM. Then, in the same manner as in Example 2, the concentration of aminocaproic acid and epsilon -caprolactam was measured in the buffer solution, and the relative values were compared.

그 결과, WP_020873096.1 단백질의 효소 활성은 pH가 7.5에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).
As a result, it was confirmed that the enzyme activity of WP_020873096.1 protein gradually became better as the pH became closer to 7.5 (FIG. 4).

[3-3] [3-3] 조효소의 영향Effect of coenzyme

상기 WP_020873096.1 단백질의 효소의 활성에 조효소가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 30 단위/㎖ 및 아미노카프론산 1mM과 함께, 10mM의 NAD, NADH, FDH를 50 mM의 HEPES 완충 용액(pH 7.5)에 첨가하고, 40℃의 온도에서 10분 동안 반응시킨 다음, 최종 농도가 200mM이 되도록 HCl을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 아미노카프론산과 ε-카프로락탐의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.In order to confirm the effect of the coenzyme on the enzyme activity of the WP_020873096.1 protein, 30 units / ml of WP_020873096.1 protein purified and isolated in Example [1-2] and 1 mM of aminocaproic acid were mixed with 10 mM NAD, NADH, and FDH were added to 50 mM HEPES buffer (pH 7.5), reacted at 40 ° C for 10 minutes, and the reaction was terminated by addition of HCl to a final concentration of 200 mM. Then, in the same manner as in Example 2, the concentration of aminocaproic acid and epsilon -caprolactam was measured in the buffer solution, and the relative values were compared.

그 결과, WP_020873096.1 단백질의 효소 활성은 NAD, NADH, FDH와 같은 조효소에 의한 영향은 없는 것으로 확인되었다(도 5).
As a result, it was confirmed that the enzyme activity of WP_020873096.1 protein was not influenced by coenzyme such as NAD, NADH, FDH (FIG. 5).

WP_020873096.1 단백질의 전환율 확인WP_020873096.1 Identification of Protein Conversion

최종적으로 본 발명자들은 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 WP_020873096.1 단백질 150 단위/㎖와 아미노카프론산 10mM을 50 mM의 HEPES 완충 용액(pH 7.5)에 첨가하여 반응시키고, 상기 반응이 진행되는 동안 10분, 30분, 60분, 120분, 180분 별로 완충 용액을 췌취하여 각 췌취물에 최종 농도가 200mM이 되도록 HCl을 첨가하였다. 그리고 상기와 같이 반응이 종료된 각각의 시간별 완충 용액에서 아미노카프론산과 ε-카프로락탐의 농도를 측정하였다.Finally, the present inventors added 150 units / ml of WP_020873096.1 protein purified and isolated in Example [1-2] and 10 mM of aminocaproic acid to 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5) During this progression, the buffer solution was poured at 10, 30, 60, 120 and 180 minutes, and HCl was added to each pancreas to a final concentration of 200 mM. Then, the concentrations of aminocaproic acid and epsilon -caprolactam were measured in each buffer solution at the end of the reaction as described above.

그 결과, 10분, 30분 및 60분의 완충 용액에서는 ε-카프로락탐의 검출량이 점점 증가하였으나, 120분 및 180분의 완충 용액에서는 60분의 완충 용액에서와 비슷한 양(약 2mM)의 ε-카프로락탐이 검출되었다(도 6).As a result, the detection amount of ε-caprolactam was gradually increased in the buffer solutions of 10 minutes, 30 minutes and 60 minutes, but in the buffer solutions of 120 minutes and 180 minutes, ε -Caprolactam was detected (Fig. 6).

상기와 같은 결과로부터, 150 단위/㎖의 WP_020873096.1 단백질은 60분 정도에서 그 활성이 포화되고, 이 때의 최대 전환율은 약 20% 정도임을 확인하였다.
From the above results, it was confirmed that the protein of 150 units / ml WP_020873096.1 protein saturates its activity at about 60 minutes, and the maximum conversion rate at this time is about 20%.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the scope of the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be possible to change it appropriately.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel upsilon-caprolactam convertase, and method for preparing upsilon-caprolactam using the same <130> 2014-DPA-0976 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 385 <212> PRT <213> Streptomyces rapamycinicus <400> 1 Met Ser Asn Thr Asp Gly Arg His Asp Ala Arg Phe Asp Thr Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys Phe Glu Gln Asn Val Ala Ser Gly Glu Glu Leu Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu Asp Met Asp Gly Asp Val Val Ile Asp Leu Trp Gly Gly 35 40 45 Phe Arg Asp Pro Ala Arg Thr Val Ala Trp Asp Glu His Thr Ile Thr 50 55 60 Asn Val Trp Ser Thr Thr Lys Ala Val Thr Ser Leu Ala Ala Leu Met 65 70 75 80 Leu Val Asp Arg Gly Glu Leu Asp Ile His Ala Pro Val Val Glu Tyr 85 90 95 Trp Pro Glu Phe Ala Ala Asn Gly Lys Gln Gly Val Glu Ile Arg His 100 105 110 Leu Leu Ser His Thr Ser Gly Val Ala Gly Leu Asp Gln Pro Ala Val 115 120 125 Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Trp Glu Lys Ser Thr Thr Arg Met Ala Ala 130 135 140 Gln Ala Pro Trp Trp Glu Pro Gly Thr Ala Ser Gly Tyr His Leu Thr 145 150 155 160 Asn Phe Gly His Leu Leu Gly Glu Val Val Arg Arg Val Ser Gly Lys 165 170 175 Pro Leu Lys Arg Phe Val Ala Glu Glu Ile Ala Gly Pro Leu Gly Ala 180 185 190 Asp Phe Gln Ile Gly Ala Ala Glu Glu Asp Trp Gly Arg Ile Ala Asn 195 200 205 Val Ile Pro Pro Pro Pro Met Arg Phe Asp Ala Asp Ala Leu Gly Ala 210 215 220 Asp Asn Pro Gly Val Lys Ala Ala Ser Gly Pro Phe Ile Glu Ala Ala 225 230 235 240 Asp Ala Asn Thr Pro Glu Trp Arg Arg Ala Asp Met Gly Ala Ile Asn 245 250 255 Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Val Ala Arg Met Leu Ser Ala Ile Ala 260 265 270 Arg Gly Gly Glu Val Asp Gly Val Arg Leu Leu Gly Pro Asp Thr Ile 275 280 285 Asp Leu Ile Phe Asn Glu Gln Ala Asn Gly Val Asp Leu Val Leu Gly 290 295 300 Ile Pro Leu Arg Trp Gly Val Gly Tyr Ala Leu Pro Arg Lys Asp Thr 305 310 315 320 Ile Ala Trp Ile Pro Asp Gly Arg Ile Cys Phe Trp Gly Gly Trp Gly 325 330 335 Gly Ser Met Ile Ile Met Asp Leu Asp Arg Arg Met Thr Ile Ser Tyr 340 345 350 Met Met Asn Gly Met Ala Pro Gly Ile Ile Gly Ser Asp Arg Ser Gly 355 360 365 Thr Tyr Val Thr Ala Ile Tyr Asp Ala Leu Arg Asn Asp Ala Gln Arg 370 375 380 Glx 385 <210> 2 <211> 1155 <212> DNA <213> Streptomyces rapamycinicus <400> 2 atgagcaaca cagacggaag gcacgacgcc cgattcgaca ccgtccgcgc caagttcgaa 60 cagaacgtgg cctccggcga ggaactgggc gcgtccctgg tcctcgacat ggacggcgac 120 gtcgtcatcg acctgtgggg cggcttccgc gacccggctc gcaccgtggc gtgggacgaa 180 cacaccataa ccaatgtgtg gtcgaccacg aaggccgtca ccagcctggc ggcgctcatg 240 ctcgtcgatc gtggcgaact cgacatccac gccccggtgg tcgagtactg gcccgagttc 300 gccgccaacg gcaaacaggg cgtcgaaatc cgccaccttc tctcgcacac ctccggggtc 360 gccggtctcg accagcccgc cgtgctcgag gacctctacg actgggagaa gtccaccacc 420 cggatggccg ctcaggcccc gtggtgggag ccgggaacgg cctcgggcta ccacttgacg 480 aacttcggtc acctgctcgg cgaggtcgtc cgccgcgtga gcggaaagcc cctgaagcgg 540 ttcgtcgccg aggagatcgc cggcccgctg ggcgccgact tccagatcgg tgccgccgag 600 gaggactggg gccggatcgc gaacgtgatt ccgccacccc ccatgcggtt cgacgccgac 660 gccctgggag cggacaaccc gggcgtcaag gccgcgagcg gacccttcat agaggcggcc 720 gacgccaaca caccggagtg gcgccgcgcg gacatgggcg cgatcaacgg gcatggcaac 780 gctcgctccg tcgcccgaat gctgtccgcg atcgcccgcg gtggtgaggt cgacggcgtc 840 cgcctgctcg gcccggacac gatcgatctc atcttcaacg agcaggccaa cggtgtggac 900 ctggtcctcg gcatcccgct gcgctggggt gtcggctatg cgttgcccag gaaggacacc 960 atcgcctgga tccccgacgg aaggatctgc ttctggggag gctggggcgg gtcaatgatc 1020 atcatggacc tcgatcggcg catgaccatt tcctacatga tgaacgggat ggcccccggc 1080 atcatcggtt ccgaccggag cggcacctac gtcacggcca tctacgacgc gctccggaac 1140 gacgcccagc ggtga 1155 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 3 tttctcgagt caccgctggg cgtcgttccg g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 2 <400> 4 tttctcgagt caccgctggg cgtcgttccg g 31 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel upsilon-caprolactam convertase, and method for preparing          upsilon-caprolactam using the same <130> 2014-DPA-0976 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 385 <212> PRT <213> Streptomyces rapamycinicus <400> 1 Met Ser Asn Thr Asp Gly Arg His Asp Ala Arg Phe Asp Thr Val Arg   1 5 10 15 Ala Lys Phe Glu Gln Asn Val Ala Ser Gly Glu Glu Leu Gly Ala Ser              20 25 30 Leu Val Leu Asp Met Asp Gly Asp Val Val Ile Asp Leu Trp Gly Gly          35 40 45 Phe Arg Asp Pro Ala Arg Thr Val Ala Trp Asp Glu His Thr Ile Thr      50 55 60 Asn Val Trp Ser Thr Thr Lys Ala Val Thr Ser Leu Ala Ala Leu Met  65 70 75 80 Leu Val Asp Arg Gly Glu Leu Asp Ile His Ala Pro Val Val Glu Tyr                  85 90 95 Trp Pro Glu Phe Ala Ala Asn Gly Lys Gln Gly Val Glu Ile Arg His             100 105 110 Leu Leu Ser His Thr Ser Gly Val Ala Gly Leu Asp Gln Pro Ala Val         115 120 125 Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Trp Glu Lys Ser Thr Thr Arg Met Ala Ala     130 135 140 Gln Ala Pro Trp Trp Glu Pro Gly Thr Ala Ser Gly Tyr His Leu Thr 145 150 155 160 Asn Phe Gly His Leu Leu Gly Glu Val Val Arg Arg Val Ser Gly Lys                 165 170 175 Pro Leu Lys Arg Phe Val Ala Glu Glu Ile Ala Gly Pro Leu Gly Ala             180 185 190 Asp Phe Gln Ile Gly Ala Ala Glu Glu Asp Trp Gly Arg Ile Ala Asn         195 200 205 Val Ile Pro Pro Pro Met Arg Phe Asp Ala Asp Ala Leu Gly Ala     210 215 220 Asp Asn Pro Gly Val Lys Ala Ala Ser Gly Pro Phe Ile Glu Ala Ala 225 230 235 240 Asp Ala Asn Thr Pro Glu Trp Arg Arg Ala Asp Met Gly Ala Ile Asn                 245 250 255 Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Val Ala Arg Met Leu Ser Ala Ile Ala             260 265 270 Arg Gly Gly Glu Val Asp Gly Val Arg Leu Leu Gly Pro Asp Thr Ile         275 280 285 Asp Leu Ile Phe Asn Glu Gln Ala Asn Gly Val Asp Leu Val Leu Gly     290 295 300 Ile Pro Leu Arg Trp Gly Val Gly Tyr Ala Leu Pro Arg Lys Asp Thr 305 310 315 320 Ile Ala Trp Ile Pro Asp Gly Arg Ile Cys Phe Trp Gly Gly Trp Gly                 325 330 335 Gly Ser Met Ile Ile Met Asp Leu Asp Arg Arg Met Thr Ile Ser Tyr             340 345 350 Met Met Asn Gly Met Ala Pro Gly Ile Ile Gly Ser Asp Arg Ser Gly         355 360 365 Thr Tyr Val Thr Ala Ile Tyr Asp Ala Leu Arg Asn Ala Gln Arg     370 375 380 Glx 385 <210> 2 <211> 1155 <212> DNA <213> Streptomyces rapamycinicus <400> 2 atgagcaaca cagacggaag gcacgacgcc cgattcgaca ccgtccgcgc caagttcgaa 60 cgaacgtgg cctccggcga ggaactgggc gcgtccctgg tcctcgacat ggacggcgac 120 gtcgtcatcg acctgtgggg cggcttccgc gacccggctc gcaccgtggc gtgggacgaa 180 cacaccataa ccaatgtgtg gtcgaccacg aaggccgtca ccagcctggc ggcgctcatg 240 ctcgtcgatc gtggcgaact cgacatccac gccccggtgg tcgagtactg gcccgagttc 300 gccgccaacg gcaaacaggg cgtcgaaatc cgccaccttc tctcgcacac ctccggggtc 360 gccggtctcg accagcccgc cgtgctcgag gacctctacg actgggagaa gtccaccacc 420 cggatggccg ctcaggcccc gtggtgggag ccgggaacgg cctcgggcta ccacttgacg 480 aacttcggtc acctgctcgg cgaggtcgtc cgccgcgtga gcggaaagcc cctgaagcgg 540 ttcgtcgccg aggagatcgc cggcccgctg ggcgccgact tccagatcgg tgccgccgag 600 gaggactggg gccggatcgc gaacgtgatt ccgccacccc ccatgcggtt cgacgccgac 660 gccctgggag cggacaaccc gggcgtcaag gccgcgagcg gacccttcat agaggcggcc 720 gacgccaaca caccggagtg gcgccgcgcg gacatgggcg cgatcaacgg gcatggcaac 780 gctcgctccg tcgcccgaat gctgtccgcg atcgcccgcg gtggtgaggt cgacggcgtc 840 cgcctgctcg gcccggacac gatcgatctc atcttcaacg agcaggccaa cggtgtggac 900 ctggtcctcg gcatcccgct gcgctggggt gtcggctatg cgttgcccag gaaggacacc 960 atcgcctgga tccccgacgg aaggatctgc ttctggggag gctggggcgg gtcaatgatc 1020 atcatggacc tcgatcggcg catgaccatt tcctacatga tgaacgggat ggcccccggc 1080 atcatcggtt ccgaccggag cggcacctac gtcacggcca tctacgacgc gctccggaac 1140 gacgcccagc ggtga 1155 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 3 tttctcgagt caccgctggg cgtcgttccg g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Reverse primer for SEQ ID NO. 2 <400> 4 tttctcgagt caccgctggg cgtcgttccg g 31

Claims (14)

서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 ε-카프로락탐 전환 효소.
An amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having 95% or more homology with SEQ ID NO: 1; or an epsilon -caprolactam conversion enzyme.
청구항 1에 있어서,
상기 효소는 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물 유래인 것을 특징으로 하는 ε-카프로락탐 전환 효소.
The method according to claim 1,
Wherein the enzyme is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces .
청구항 2에 있어서,
상기 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 미생물은 스트렙토미세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus) 유래인 것을 특징으로 하는 ε-카프로락탐 전환 효소.
The method of claim 2,
The Streptomyces MRS (Streptomyces) in the microorganism ε- caprolactam-converting enzyme, characterized in that Streptomyces MRS Rapa US shinny kusu (Streptomyces rapamycinicus) origin.
청구항 1의 ε-카프로락탐 전환 효소를 암호화하는 유전자.
A gene encoding the? -Caprolactam conversion enzyme of claim 1.
청구항 4에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
The method of claim 4,
Wherein the gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
청구항 4의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
A recombinant expression vector comprising the gene of claim 4.
청구항 6의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
A transformant in which the recombinant expression vector of claim 6 is introduced into a host cell.
청구항 7에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
The method of claim 7,
Wherein the host cell is Escherichia coli.
청구항 1의 ε-카프로락탐 전환 효소를 유효성분으로 포함하는 ε-카프로락탐 생산용 조성물.
A composition for producing ε-caprolactam, which comprises the ε-caprolactam-converting enzyme of claim 1 as an active ingredient.
청구항 8의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 형질전환체의 배양물로부터 ε-카프로락탐 전환 효소를 분리하는 단계를 포함하는 ε-카프로락탐 전환 효소의 생산 방법.
Culturing the transformant of claim 8; And
And separating the? -Caprolactam conversion enzyme from the culture of said transformant.
청구항 1의 ε-카프로락탐 전환 효소를 아미노카프론산과 반응시키는 단계;를 포함하는 ε-카프로락탐 생산 방법.
Reacting the? -Caprolactam-converting enzyme of claim 1 with aminocaproic acid to produce? -Caprolactam.
청구항 11에 있어서,
상기 ε-카프로락탐 전환 효소와 아미노카프론산의 반응 생성물로부터 ε-카프로락탐을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ε-카프로락탐 생산 방법.
The method of claim 11,
Recovering? -Caprolactam from the reaction product of said? -Caprolactam-converting enzyme and aminocaproic acid.
제8항의 형질전환체를 아미노카프론산의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 ε-카프로락탐 생산 방법.
Culturing the transformant of claim 8 in the presence of aminocaproic acid.
청구항 13에 있어서,
상기 형질전환체의 배양물로부터 ε-카프로락탐을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ε-카프로락탐 생산 방법.14. The method of claim 13,
And recovering? -Caprolactam from the culture of said transformant.
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