KR101704828B1 - Method for diagnosing inflammatory diseases through analysis of protein or gene of extracellular vesicle in a body fluid - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포부착 단백질을 수용성 단백질 형태와 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 분리한 후 각 형태의 세포부착 단백질을 정량 및/또는 형태별 존재량 비율 분석을 수행함으로써 염증성 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및/또는 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트 등을 제공한다. 본 발명의 진단방법은 체액 내 세포부착 단백질의 정량에 '존재 형태'라는 또 하나의 분석인자를 추가하여 세분화된 정량을 수행함으로써 염증성 질환의 진단 마커로써의 사용 가능성 및 진단의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease by separating a cell adhesion protein into a water soluble protein form and a membrane protein form contained in an extracellular endoplasmic reticulum and then analyzing each type of cell adhesion protein in terms of quantification and / . In addition, the present invention provides an inflammatory disease diagnostic kit or the like, characterized by measuring the abundance and / or the abundance ratio of the cell adhesion protein in the body fluids by the form. The diagnosis method of the present invention further improves the usability as a diagnostic marker of inflammatory diseases and the accuracy of diagnosis by performing a subdivision quantification by adding another analytical factor called " presence form " It is expected to be possible.

Description

체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법{Method for diagnosing inflammatory diseases through analysis of protein or gene of extracellular vesicle in a body fluid}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease by analyzing a protein or a gene of an extracellular endoplasmic reticulum in a body fluid,

본 발명은 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통하여 염증성 질환을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease through protein or gene analysis of extracellular endoplasmic reticulum in body fluid.

염증성 질환을 진단하는 비침투적 방법으로 환자의 체액에서 염증성 질환 특이적인 사이토카인/케모카인 양을 측정하는 것이 대표적이다. 현재 체액 내 C-반응성 단백시험(CRP)으로는 수용성 단백질의 정량적 측정 등이 사용되고 있다. 더불어, 염증 상황의 내피세포에서 발현이 증가하는 세포부착 단백질(cell adhesion molecule)인 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), E-selectin이 암환자 및 관상동맥질환, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환의 체액 내에서 높은 양이 존재함이 알려지면서 진단마커로써의 가능성이 제시되어 왔으나 체액 내 세포부착 단백질의 양이 질환 외의 환자 상태(예컨대, 감기와 같은 가벼운 염증상태)에 따라 변동되는 등 환자의 질환 상태를 온전히 대변하지 못하는 문제점이 있다.It is typical to measure inflammatory disease-specific cytokine / chemokine levels in the body fluids of patients by non-invasive methods for diagnosing inflammatory diseases. Currently, quantitative measurement of water-soluble proteins is being used as a C-reactive protein test (CRP) in body fluids. In addition, the cell adhesion molecules ICAM-1 (VCAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and E-selectin, which are expressed in inflammatory endothelial cells, And inflammatory diseases such as coronary artery disease and rheumatoid arthritis. However, it has been suggested that the amount of cell adhesion protein in the body fluids is influenced by the state of the patient other than the disease (for example, Mild inflammatory state), and the like.

최근 수용성 단백질 외에 세포밖 소포체라는 새로운 형태의 정보교환체가 거의 모든 종류의 세포에서 분비됨이 보고되었다. 세포밖 소포체는 이중 지질막으로 이루어진 수십 nm에서 수백 nm 크기를 가진 나노 소포체로 단백질, 지질, 및 유전자 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있다. 세포밖 소포체를 통해서 세포에 발현된 막단백질이 그것의 고유한 형태로 세포밖으로 분비 가능함이 알려졌는데, 그 일례로 세포부착 단백질이 있다. 세포밖 소포체의 존재가 알려지기 전까지는 세포막에 발현되어 있던 세포부착 단백질의 세포 바깥부분 도메인(extracellular domain)이 제한효소에 의해 잘려짐으로써 세포밖으로 분비되어 수용성 단백질 형태로만 존재한다고 생각되어 왔다. 그러나, 세포 부착 단백질이 세포밖 소포체에 포함되어 막단백질 형태로도 세포밖으로 분비될 수 있음이 알려졌다. 즉, 세포밖에 존재하는 세포 부착 단백질은 수용성 단백질 형태뿐만 아니라 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로도 존재가능하다. 이러한 사실에도 불구하고, 현재까지 체액 내 세포부착 단백질의 정량은 이러한 형태적 구분없이 이루어져 왔다.Recently, it has been reported that a new type of information exchanger called extracellular endoplasmic reticulum in addition to water-soluble proteins is secreted from almost all kinds of cells. The extracellular endoplasmic reticulum is composed of a biologically active substance such as protein, lipid, and gene, which is a nanosphere having a size of several tens nm to several hundreds of nanometers consisting of a dual lipid membrane. It is known that membrane proteins expressed in cells through the extracellular endoplasmic reticulum are able to secrete out of the cells in its unique form, for example, cell adhesion proteins. Until the extracellular endoplasmic reticulum is known, the extracellular domain of the cell adhesion protein expressed in the cell membrane is secreted out of the cell by the restriction enzyme, and it is thought to exist only in the form of a water soluble protein. However, it is known that the cell adhesion protein is contained in the extracellular endoplasmic reticulum and can be secreted out of the cell in the form of a membrane protein. That is, the cell adhesion protein existing outside the cell can exist not only as a water soluble protein form but also as a membrane protein contained in an extracellular endoplasmic reticulum. Despite this fact, until now, the quantification of cell adhesion proteins in body fluids has been made without such morphological differentiation.

또한, 유전자와 같이 세포 밖에서 불안정할 수 있는 물질들도 세포밖 소포체를 통해 세포밖 소포체 내부에 싸여져서 분비됨으로써 세포밖에서도 안정적으로 존재할 수 있다. 이를 바탕으로, 세포밖 소포체 내 유전자 분석을 통한 진단에 대한 연구가 진행되고 있다. 그 외 교아세포종(glioblastoma) 환자의 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체에서 변형된 형태의 EGFRⅧ의 유전자 탐지 여부를 기반으로 진단 가능성을 제시한 연구 결과가 있고, 전립선암 환자의 소변 내 세포밖 소포체에서 암세포 유래 세포밖 소포체의 유전체 분석을 통해 알아낸 전립선암 생체 마커인 PCA-3, TMPRSS2:ERG의 존재를 확인한 연구 결과가 있다. In addition, substances that may be unstable outside the cell, such as a gene, may be stably enclosed within the extracellular endoplasmic reticulum through the extracellular endoplasmic reticulum and secreted outside the cell. On the basis of this, studies on diagnosis through gene analysis in the extracellular endoplasmic reticulum are underway. Other studies have suggested the possibility of diagnosing EGFRVIII based on the detection of a modified form of EGFRVIII in the extracellular endoplasmic reticulum in the blood of patients with glioblastoma. In the case of prostate cancer patients, The results of a study confirming the presence of PCA-3, TMPRSS2: ERG, the biomarkers of the prostate cancer, which were found through genomic analysis of the extracellular endoplasmic reticulum.

상기한 바와 같이, 세포밖 소포체는 혈액, 복수, 모유, 활액 및 소변 등에 존재할 뿐만 아니라, 구성 성분과 양적 변화가 질환의 진행 정도를 대변할 것으로 판단되어 염증성 질환을 포함한 다양한 질환의 진단에서의 유용성이 기대되고 있다. As described above, since the extracellular endoplasmic reticulum is not only present in blood, ascites, breast milk, synovial fluid and urine, but also constitutional and quantitative changes are considered to represent the progression of disease, usefulness in diagnosis of various diseases including inflammatory diseases Is expected.

그러나, 아직까지 정상 상태 및 염증성 질환 상황에서 세포밖 소포체의 단백질과 유전자를 종합적으로 분석하고 진단에 활용하는 연구나 세포밖 소포체에 존재하는 염증성 질환 관련 단백질 및 유전자를 이용한 진단 방법에 대해 보고된 바 없다.However, studies have yet been made on the use of proteins and genes of extracellular endoplasmic reticulum for diagnosis and diagnosis in steady-state and inflammatory diseases, and diagnostic methods using proteins and genes related to inflammatory diseases in extracellular endoplasmic reticulum none.

따라서, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 염증성 질환 진단 방법에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for a study on a method for diagnosing an inflammatory disease that can overcome the above problems.

본 발명자들은 종래의 세포부착 단백질의 정량시 그것의 존재 형태(수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태)를 구분하지 아니하고 정량했던 부분을 개선하여, 체액 내 세포부착 단백질 정량을 이용한 진단에 새로운 분석인자(parameter)를 추가한 보다 정확한 질환 진단방법을 제공하고자 한다. 구체적으로 본 발명은 세포부착 단백질을 수용성 단백질 형태와 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 분리한 후 각 형태의 세포부착 단백질을 정량 및/또는 형태별 존재량 비율 분석을 수행함으로써 염증질환을 진단하는 방법을 제공하고자 한다.The inventors of the present invention have made improvements in the quantitative measurement of cell attachment protein without distinguishing its existing form (a water-soluble protein form or a membrane protein form contained in an extracellular endoplasmic reticulum) And to provide a more accurate diagnosis method by adding a new parameter to the disease. Specifically, the present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease by separating a cell adhesion protein into a water soluble protein form and a membrane protein form contained in an extracellular endoplasmic reticulum, and then analyzing each type of cell adhesion protein quantitatively and / Method.

또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 비교 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법을 제공하고자 한다.The present invention also provides a method for diagnosing an inflammatory disease characterized by comparing the gene expression amount present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluid.

이에 더하여, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및/또는 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트 등을 제공하고자 한다.In addition, the present invention provides an inflammatory disease diagnostic kit or the like, characterized by measuring the abundance amount and / or the abundance ratio of the cell adhesion protein in the body fluids.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은 체액 내 세포부착 단백질을 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획에 존재하는 단백질을 정량하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단방법을 제공한다. 상기 방법은 수용성 단백질 및 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 존재량의 비율을 비교하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.The present invention relates to a method for separating a cell adhesion protein in a body fluid into a water-soluble protein fraction and an extracellular endoplasmic reticulum fraction; And quantifying the protein present in the water soluble protein fraction and the extracellular endoplasmic reticulum fraction. The method may further comprise comparing the ratio of the amount of protein present in the water soluble protein and the extracellular endoplasmic reticulum.

본 발명의 일 실시예로, 상기 정량하는 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)을 포함한다.In one embodiment of the invention, the quantifying protein comprises intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), E-selectin, and VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1).

본 발명의 다른 실시예로, 상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함한다.In another embodiment of the present invention, the inflammatory disease includes cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis.

본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the body fluid is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose.

또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for diagnosing an inflammatory disease comprising the step of measuring the amount of gene expression present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluid.

상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.These genes include EDN1 (Endothelin 1), VCAM1 (Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1), SELE (Selectin E), NOS3 (Nitric oxide synthase 3), BMP4 (Bone morphogenetic protein 4) Von Willebrand factor), MPZ (Myelin protein zero), IRF1 (Interferon regulatory factor 1), TNF (Tumor necrosis factor), IL32 (Interleukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10 ) ligand 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8) Lt; RTI ID = 0.0 > (III). ≪ / RTI >

또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for diagnosing an inflammatory disease comprising measuring the amount of protein and gene expression present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluids.

또한, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및/또는 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides an inflammatory disease diagnostic kit, characterized by measuring the abundance and / or the abundance ratio of the cell adhesion protein in the body fluids by the form.

상기 세포부착 단백질은 수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 존재하는 것을 특징으로 한다.The cell adhesion protein is characterized by being present in the form of a water-soluble protein or a membrane protein contained in an extracellular endoplasmic reticulum.

상기 본 발명의 체액 및 염증성 질환은 전술한 바와 같다.The body fluids and inflammatory diseases of the present invention are as described above.

또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides an inflammatory disease diagnostic kit, characterized in that the amount of gene expression present in the extracellular endoplasmic reticulum in body fluids is measured.

상기 본 발명의 유전자는 전술한 바와 같다. The gene of the present invention is as described above.

또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides an inflammatory disease diagnostic kit, characterized by measuring the amount of protein and gene expression present in the extracellular endoplasmic reticulum in body fluids.

본 발명의 진단방법은 체액 내 세포부착 단백질의 정량에 '존재 형태' 라는 또 하나의 분석인자를 추가하여 세분화된 정량을 수행함으로써 염증성 질환의 진단 마커로써의 사용 가능성 및 진단의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.The diagnosis method of the present invention further improves the usability as a diagnostic marker of inflammatory diseases and the accuracy of diagnosis by performing a subdivision quantification by adding another analytical factor called " presence form " It is expected to be possible.

또한, 본 발명에서 발굴한 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 내피세포로부터 유래한 세포밖 소포체가 가지는 유전자로, 실제로 염증성 질환에서 혈관의 손상이 특이적임을 감안할 때 이들 유전자 분석은 향후 혈액을 통한 진단에 매우 유용할 것으로 여겨진다. In addition, the gene whose expression is increased in the inflammatory disease state excited by the present invention is a gene belonging to the extracellular endoplasmic reticulum-derived endoplasmic reticulum. Actually, considering that the damage of blood vessels is specific in inflammatory diseases, It is thought to be very useful for diagnosis through

이에 더하여, 본 발명은 단백질 수준에서의 정량뿐만 아니라, 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 염증성 질환 관련 유전자 발현량을 분석하여 염증성 질환을 진단하는 방법을 제공함으로써, 궁극적으로 세포밖 소포체 단백질 및 유전자를 동시에 측정하는 멀티플렉스(multiplex) 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing an inflammatory disease by analyzing the amount of expression of an inflammatory disease-related gene existing in extracellular endoplasmic reticulum in body fluid as well as quantification at a protein level, thereby ultimately obtaining an extracellular endoplasmic reticulum protein and a gene And provides a multiplex diagnostic method for simultaneous measurement.

도 1은 염증 상황의 내피세포에서 유래한 세포밖 소포체를 투과전자현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 세포배양액에서 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하는 과정을 나타낸 그림이며, 도 2b는 세포배양액 전체, 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 대해 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이고, 도 2c는 세포밖 소포체의 표면에 ICAM-1이 존재함을 면역학적 투과전자현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 암환자의 복수 및 혈액에서 유래한 세포밖 소포체의 형태를 투과전자현미경을 통해 분석한 결과이며, 도 3b는 정상인과 직장암 환자의 혈액에서 유래한 세포밖 소포체에 대하여 수크로즈의 밀도구배를 사용한 초고속원심분리 후에 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법을 실시한 결과이고, 도 3c는 세포밖 소포체 표면의 ICAM-1을 면역투과전자현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상과 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내에 존재하는 수용성 단백질 형태 및 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 ICAM-1을 sandwich ELISA(R&D Systems)를 통해 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체에서 분석한 18종의 염증성 질환 관련 유전자 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체에서 real time PCR을 통한 유전자 분석에 사용된 프라이머 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 7a는 정상 및 염증 상황에서 내피세포의 18종 염증성 질환 관련 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현량을 나타낸 real time PCR 결과이며, 도 7b는 유전자 발현양이 200 배 이하인 유전자에 대해서만 그 발현량을 나타낸 real time PCR 결과이다.
도 8은 정상 및 염증 상황에서 내피세포 유래 세포밖 소포체의 18종 염증성 질환 관련 유전자 발현 변화를 보여주는 real time PCR 결과이다.Fig. 1 shows the results of transmission electron microscopy of the extracellular endoplasmic reticulum-derived endothelial cells in an inflammatory state.
FIG. 2A is a graph showing a process of separating a water-soluble protein fraction and an extracellular endoplasmic reticulum in a cell culture medium. FIG. 2B is a graph showing the results of the whole cell culture, ICAM-1, VCAM-1 and E -selectin. Fig. 2C shows the result of immunological transmission electron microscopy that ICAM-1 is present on the surface of the extracellular endoplasmic reticulum.
FIG. 3A shows the results of transmission electron microscopy of the morphology of extracellular endoplasmic reticulum derived from the ascites and blood of a cancer patient, FIG. 3B shows the results of analysis of the extracellular endoplasmic reticulum derived from blood of normal and rectal cancer patients, , And ICAM-1 on the surface of the extracellular endoplasmic reticulum was examined using an immuno-transmission electron microscope. The result of Western blotting using ICAM-1 antibody is shown in FIG.
FIG. 4 shows the results of quantitative determination of ICAM-1 in the water-soluble protein form and the membrane protein form contained in the extracellular endoplasmic reticulum in the blood of a normal and arteriosclerosis animal model through a sandwich ELISA (R & D Systems).
FIG. 5 shows information on 18 kinds of inflammatory diseases-related genes analyzed from endothelial cell or endothelial cell-derived extracellular endoplasmic reticulum.
FIG. 6 shows a primer sequence used for gene analysis through real time PCR in endothelial cells or endothelial cell-derived extracellular endoplasmic reticulum.
FIG. 7a shows the results of real-time PCR showing the expression levels of all 18 genes related to inflammatory diseases of 18 kinds of endothelial cells in normal and inflammatory conditions. FIG. 7b shows the expression levels of the genes only for genes having the expression level of 200 or less This is the real-time PCR result.
Fig. 8 shows real-time PCR results showing the expression of 18 types of inflammatory disease-related genes in endothelial cell-derived endoplasmic reticulum endoplasmic reticulum in normal and inflammatory conditions.

종래부터 체액 내 세포부착 단백질의 정량을 통한 진단 가능성은 제기되어 왔으나, 체액 내 세포부착 단백질의 양은 질환 외의 환자 상태에 따라 변동되는 등의 문제점이 있었다. 이에, 본 발명자들은 종래의 세포부착 단백질의 정량시 그것의 존재 형태 (수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태) 를 구분하지 않고 정량했던 부분을 개선하여, 세포부착 단백질을 수용성 단백질 형태, 및 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 분리 후 각 형태의 세포부착 단백질을 정량하고 형태별 존재량 비율 분석을 수행함으로써 체액 내 세포부착 단백질 정량을 이용한 진단에 '존재 형태' 라는 새로운 분석인자(parameter)를 추가함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Conventionally, the possibility of diagnosis through the quantification of cell adhesion proteins in body fluids has been raised, but the amount of cell adhesion protein in body fluids has been disadvantageously varied depending on the state of the patient other than the disease. Accordingly, the inventors of the present invention have made improvements in the quantification of cell attachment proteins without distinguishing their existing forms (water-soluble protein forms or membrane protein forms contained in extracellular endoplasmic reticulum) , And extracellular endoplasmic reticulum (EGF), and then analyzed for the presence of each type of cell adhesion protein and analyzed by the abundance ratio of each type. parameter, to complete the present invention.

구체적으로, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질을 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획에 존재하는 단백질을 정량하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단방법을 제공한다. Specifically, the present invention relates to a method for producing a cell adhesion protein, comprising: separating a cell adhesion protein in a body fluid into a water-soluble protein fraction and an extracellular endoplasmic reticulum fraction; And quantifying the protein present in the water soluble protein fraction and the extracellular endoplasmic reticulum fraction.

또한, 본 발명은 단백질 수준에서의 정량뿐만 아니라, 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 염증성 질환 관련 유전자 분석 결과를 바탕으로 세포밖 소포체 단백질 및 유전자를 동시에 측정하는 멀티플렉스(multiplex) 진단 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 염증성 질환 진단에 있어서 1) 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및 존재 비율 비교, 2) 체액 내 세포밖 소포체 내 염증성 유전자 양상 분석을 수행함으로써 보다 정확한 염증성 질환의 진단 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a multiplex diagnosis method for simultaneously measuring extracellular endoplasmic reticulum protein and gene based on analysis results of an inflammatory disease gene existing in extracellular endoplasmic reticulum in body fluid as well as quantification at a protein level . That is, the present invention provides a method for diagnosing inflammatory diseases by 1) comparing the abundance and existence ratio of cell adhesion proteins in the body fluid, 2) analyzing the inflammatory gene expression pattern in extracellular endoplasmic reticulum in body fluids, do.

이에 더하여, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트, 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트, 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트 등을 제공한다.In addition, the present invention relates to an inflammatory disease diagnostic kit characterized by measuring the abundance and the abundance ratio of cell adhesion proteins in body fluids by type, an inflammatory disease characterized by measuring the amount of gene expression present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluids A diagnostic kit, a kit for diagnosing an inflammatory disease characterized by measuring the amount of protein and gene expression present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluids, and the like.

본 발명에서 "세포밖 소포체"란 세포에서 생성되어 세포밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베시클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "extracellular endoplasmic reticulum" is an endoplasmic reticulum produced in a cell and secreted outside the cell, including, but not limited to, exosome, microvesicle, microparticle and the like.

본 발명에서 "체액"은 혈액, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 콧물 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.The term "body fluid" as used herein includes, but is not limited to, blood, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears,

본 발명의 일 구현예에서 환자의 혈액 및 복수에서 분리한 세포밖 소포체는 내피세포 외에도 다수의 세포로부터 유래한 세포밖 소포체를 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the extracellular endoplasmic reticulum isolated from the blood and ascites of the patient may comprise extracellular endoplasmic reticulum from a number of cells in addition to endothelial cells.

본 발명에서 단백질 및 유전자 분석을 수행하는 세포밖 소포체는 내피세포로부터 유래하는 세포밖 소포체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular endoplasmic reticulum that performs protein and gene analysis in the present invention may be an endoplasmic reticulum-derived extracellular endoplasmic reticulum, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용된 내피세포는 인간에서 유래한 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 내피세포에서 염증 상황을 유도하는 물질은 대표적인 염증성 사이토카인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.The endothelial cells used in the present invention include those derived from humans. A substance that induces inflammatory conditions in the endothelial cells used in the present invention is, but is not limited to, the typical inflammatory cytokine TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha).

본 발명의 세포밖 소포체는 이중 지질막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 유래한 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 유전자 및 대사물 등을 가지고 있다.The extracellular endoplasmic reticulum of the present invention is distinguished from the inside and the outside by the double lipid membrane, and has cell membrane lipids and cell membrane proteins, genes and metabolites of the derived cells.

본 발명에서 염증성 질환 진단에 사용되는 세포밖 소포체는 체액의 연속적인 원심분리(centrifugation) 및 초고속원심분리(ultracentrifugation)를 통해 분리할 수 있으며, 기존에 각각의 체액에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the extracellular endoplasmic reticulum used for the diagnosis of inflammatory diseases can be separated by continuous centrifugation and ultracentrifugation of body fluids, and a method for separating extracellular endoplasmic reticulum from each body fluid But is not limited thereto.

상기 세포밖 소포체의 구성 성분 중에서 분석에 사용되는 단백질과 유전자 성분은 염증성 질환과 관련된 세포부착 단백질과 18종의 유전자이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 18종의 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 이다.Among the components of the extracellular endoplasmic reticulum, the proteins and gene components used for the analysis are not limited to the cell adhesion proteins involved in inflammatory diseases and 18 genes. The 18 genes are selected from the group consisting of EDN1 (Endothelin 1), VCAM1 (Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1), SELE (Selectin E), NOS3 (Nitric oxide synthase 3), Bone morphogenetic protein 4 , Interferon regulatory factor 1 (IRF1), Tumor necrosis factor (ILF), IL32 (Interleukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10 (Chemokine (CXX motif) ligand 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8) (Coagulation factor III).

상기 세포밖 소포체의 구성 성분 중에서 분석에 사용되는 단백질은 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA, enzyme-linked immunoabsortion assay), 웨스턴 블랏팅 (Western Blotting) 등을 통해 확인될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Among the constituents of the extracellular endoplasmic reticulum, proteins used for the analysis can be identified through enzyme-linked immunoabsorption assay (ELISA), Western blotting, and the like, but are not limited thereto.

본 발명에서 체액 내 존재하는 단백질의 형태는 수용성 단백질과 막단백질 형태로 나뉘는데, 체액 내 존재하는 막단백질 형태의 단백질을 가지는 것은 세포밖 소포체가 유일하다.In the present invention, the form of the protein present in the body fluid is divided into a water-soluble protein and a membrane protein form, and the only extracellular endoplasmic reticulum having a membrane protein form in the body fluid is unique.

본 발명에서 염증성 질환 진단에 사용되는 유전자는 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자로, 유전자 중에서도 자극에 대해 발현 차이를 보이는 mRNA에 대한 비교이다.In the present invention, the gene used for the diagnosis of inflammatory diseases is a gene existing in the extracellular endoplasmic reticulum, and among the genes, the mRNA showing the difference in expression against the stimulus.

상기 유전자 발현의 차이를 유도하는 자극은 염증성 질환인 경우, 염증성 사이토카인/케모카인, 활성 산소종이 대표적이나 이에 제한되는 것은 아니다.In the case of an inflammatory disease, the stimulation that induces the difference in gene expression is not limited to inflammatory cytokine / chemokine and reactive oxygen species.

상기 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자를 분리하는 과정은 세포나 조직에서 유전자를 분리하는 기존의 방법 및 원리가 동일하며, 상기 발명에서는 RNeasy?Mini kit를 사용하였으나 유전자를 분리하는 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.The process of isolating genes existing in the extracellular endoplasmic reticulum in the body fluids is the same as the conventional method and principle of isolating genes in cells or tissues. In the present invention, RNeasy ™ Mini kit was used, It is not.

상기 분리한 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자는 oligo(dT)를 이용하여 cDNA로 합성된 뒤에 real time PCR을 수행하였으나, real time PCR을 수행하는데 사용되는 주형이 cDNA에 제한되는 것은 아니다.Genes present in the separated extracellular endoplasmic reticulum were synthesized into cDNA using oligo (dT) and then real time PCR was performed. However, the template used for performing real time PCR is not limited to cDNA.

본 발명의 염증 상황에서는 다수의 염증성 질환 관련 유전자의 발현이 증가하는데, 염증성 사이토카인인 TNF-α를 처리하였을 때 발현 증가를 보이는 모든 유전자가 변해야 하는 것은 아니다.In the inflammatory condition of the present invention, the expression of a number of inflammatory disease-related genes is increased. Not all genes showing an increase in expression when the inflammatory cytokine TNF-a is treated need to be changed.

본 발명의 정상 및 염증 상황의 내피세포에서 발현 차이를 보이는 다수의 유전자가 내피세포 유래 세포밖 소포체에서도 발현 차이를 보이나, 정확하게 일치해야 하는 것은 아니다.Although many genes exhibiting different expression in endothelial cells of the normal and inflammatory conditions of the present invention exhibit different expression even in the endothelial cell extracellular endoplasmic reticulum, they do not necessarily have to be exactly the same.

본 발명에서 세포부착 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the cell adhesion protein includes but is not limited to ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, and VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1).

본 발명에서 세포부착 단백질은 수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막 단백질의 형태로 구분하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the cell adhesion protein is classified into a water-soluble protein form or a membrane protein form contained in an extracellular endoplasmic reticulum.

본 발명에서 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 류마티스 관절염 등 다수의 급성 및 만성 염증성 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In the present invention, inflammatory diseases include, but are not limited to, a number of acute and chronic inflammatory diseases such as cancer, sepsis, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, and the like.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

[실시예] [ Example ]

실시예Example 1. 염증 상황의 내피세포에서 유래한  1. derived from endothelial cells in inflammatory conditions 세포밖Extracellular 소포체 확인  Identification of vesicles

인간내피세포(인간 제대 정맥 내피세포, HUVEC)에 염증성 싸이토카인인 TNF-α를 10 ng/ml 농도로 12시간 처리 후 세포배양액을 모았다. 이를 4℃, 500 x g에서 10분 동안 고속원심분리(high speed centrifugation)를 하고, 상층액을 수거하여 4℃, 3,000 x g에서 20분 동안 고속원심분리(high speed centrifugation)를 하였다. 상층액을 수거하여 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리(ultracetrifugation)를 한 후, 튜브 아래에 존재하는 침전물을 phosphatae-buffered saline(PBS)으로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다. Human endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) were treated with TNF-α, an inflammatory cytokine, at a concentration of 10 ng / ml for 12 hours. It was subjected to high speed centrifugation at 500 x g for 10 minutes at 4 DEG C, and the supernatant was collected and subjected to high speed centrifugation at 3,000 x g for 20 minutes at 4 DEG C. The supernatant was collected and subjected to ultracetrifugation at 100,000 x g for 2 hours at 4 ° C, and the extracellular endoplasmic reticulum was extracted by dissolving the precipitate present in the tube under phosphate-buffered saline (PBS).

도 1은 상기 방법으로 추출한 세포밖 소포체를 투과전자현미경으로 분석한 결과이다. 세포밖 소포체는 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 약 100 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
FIG. 1 shows the result of analysis of the extracellular endoplasmic reticulum extracted by the above-mentioned method using a transmission electron microscope. The extracellular endoplasmic reticulum is composed of a lipid bilayer and is approximately 100 nm in size and generally spherical.

실시예Example 2. 내피세포에서 분비된 세포부착 단백질의 수용성 단백질 형태 및  2. Water-soluble protein form of cell adhesion protein secreted from endothelial cells 세포밖Extracellular 소포체에 포함된  Contained in the endoplasmic reticulum 막단백질Membrane protein 형태별 분리 및 확인  Separation and identification by type

HUVEC에 TNF-α를 10 ng/ml 농도로 12시간 처리 후 세포배양액을 모으고 4℃, 500 x g에서 10분 동안 고속원심분리를 한 후, 상층액을 수거하여 4℃, 3,000 x g에서 20분 동안 고속원심분리를 하였다. 상층액을 수거하여 일부는 급속냉동 후 냉동고에 보관하고 나머지는 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리를 하였다. 상층액은 수거하여 급속냉동 후 보관하고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다. HUVEC was treated with TNF-α at a concentration of 10 ng / ml for 12 hours, and then the cell culture was collected and centrifuged at 500 xg for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected and centrifuged at 4,000C for 20 minutes Followed by high speed centrifugation. The supernatant was collected and stored in a freezer after rapid freezing and the rest was subjected to ultra-high speed centrifugation at 100,000 x g for 2 hours at 4 ° C. The supernatant was collected, stored after rapid freezing, and the extracellular endoplasmic reticulum was extracted by dissolving the precipitate present under the tube in PBS.

도 2a는 세포배양액에서 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하는 과정을 나타낸 그림이다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 초고속원심분리를 수행하기 전 상층액에는 세포배양액 내에 존재하는 모든 형태의 세포부착 단백질이, 초고속원심분리 후 얻은 상층액에는 수용성 단백질 형태의 세포부착 단백질이, 초고속원심분리 후의 침전물에는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 세포부착 단백질이 존재한다. 2A shows a process of separating a water-soluble protein portion and an extracellular endoplasmic reticulum from a cell culture fluid. As shown in FIG. 2A, in the supernatant prior to ultra-high-speed centrifugation, all types of cell adhesion proteins present in the cell culture fluid, the supernatant obtained after ultra-high-speed centrifugation, Subsequent sediments have cell adhesion proteins in the form of membrane proteins contained in extracellular endoplasmic reticulum.

도 2b는 세포배양액 전체, 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 대해 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이, ICAM-1과 E-selectin은 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체 부분에 모두 존재하는 반면, VCAM-1은 수용성 단백질 부분에만 존재함을 확인하였다. FIG. 2B shows the result of Western blotting using ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin antibodies against the whole cell culture medium, the water-soluble protein portion in the cell culture medium and the extracellular endoplasmic reticulum. As shown in FIG. 2B, it was confirmed that ICAM-1 and E-selectin were present in both the water-soluble protein portion and the extracellular endoplasmic reticulum portion of the cell culture medium, while VCAM-1 was present only in the water-soluble protein portion.

도 2c는 세포밖 소포체의 표면에 ICAM-1이 존재함을 면역학적 투과전자현미경을 통해 확인한 결과이다. FIG. 2C shows the presence of ICAM-1 on the surface of the extracellular endoplasmic reticulum by immunohistochemical transmission electron microscopy.

상기 결과들은 세 가지 세포부착 단백질이 모두 세포밖으로 분비되나 그것의 분비 형태는 서로 다름을 의미한다.
These results indicate that all three cell adhesion proteins are secreted out of the cell but their secretion forms are different.

실시예Example 3. 정상인과 암환자 혈액 및 복수 내  3. Normal and cancer patients Blood and ascites 세포밖Extracellular 소포체 존재 확인  Identification of vesicle presence

정상인과 직장암 환자의 혈액 및 직장암 환자의 복수에서 실시예 1에서와 동일한 방법으로 세포밖 소포체를 분리하였다. The extracellular endoplasmic reticulum was isolated from the ascites of normal and rectal cancer patients with blood and rectal cancer in the same manner as in Example 1.

도 3a는 암환자의 복수 및 혈액에서 유래한 세포밖 소포체의 형태를 투과전자현미경을 통해 분석한 결과이며, 도 3b는 정상인과 직장암 환자의 혈액에서 유래한 세포밖 소포체가 전형적인 세포밖 소포체의 밀도를 가지며, ICAM-1이 세포밖 소포체에 존재함을 수크로즈의 밀도구배를 사용한 초고속원심분리 후에 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인한 결과이다. FIG. 3A shows the results of analysis of the morphology of the extracellular endoplasmic reticulum from the ascites and blood of a cancer patient through a transmission electron microscope, and FIG. 3B shows the out-of-cell endoplasmic reticulum derived from the blood of normal and rectal cancer patients, And that ICAM-1 is present in the extracellular endoplasmic reticulum after ultra-high-speed centrifugation using a density gradient of sucrose and Western blotting using ICAM-1 antibody.

보다 구체적으로, 초고속원심분리를 통해 분리한 세포밖 소포체를 1.5ml의 2.5 M 수크로즈 용액과 섞어 초고속원심분리 튜브에 넣고, 그 위에 2 ml의 1.6 M 수크로즈와 1.3 ml의 0.5 M 수크로즈를 쌓은 후 초고속원심분리를 수행하였다. 농도 구배에 따라 나누어진 분획을 튜브의 위쪽에서부터 각 0.5 ml씩 취하여 총 10개의 분획을 얻고 이에 대해 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, ICAM-1은 세포밖 소포체의 전형적인 밀도인 1.10~1.18 g/ml에서 확인되었다. More specifically, the extracellular endoplasmic reticulum isolated from ultrafast centrifugation was mixed with 1.5 ml of 2.5 M sucrose solution, placed in a high-speed centrifuge tube, and 2 ml of 1.6 M sucrose and 1.3 ml of 0.5 M sucrose were added thereto And then ultra-high speed centrifugation was carried out. The fraction divided according to the concentration gradient was taken from the upper part of the tube in an amount of 0.5 ml to obtain a total of 10 fractions, and Western blotting was performed using ICAM-1 antibody. As a result, ICAM-1 was identified at a typical density of 1.10-1.18 g / ml of extracellular endoplasmic reticulum.

도 3c는 세포밖 소포체 표면의 ICAM-1을 면역투과전자현미경을 이용하여 확인한 결과이다.
FIG. 3c shows the results of immunofluorescence electron microscopy (SEM) of ICAM-1 on the surface of the endoplasmic reticulum.

실시예Example 4. 정상과 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내 수용성 단백질 형태 및 세포밖 소포체에 포함된  4. Normal and atherosclerosis Animal model of blood soluble protein form and contained in extracellular endoplasmic reticulum 막단백질Membrane protein 형태의  Form ICAMICAM -1 정량 -1 Quantification

5주령의 ApoE knockout 마우스(Jackson Lab)에 웨스턴 다이어트(20% lipid, 1.5% cholesterol)를 섭취시킴으로써 동맥경화증 동물 모델을 만들었다. 이때 대조군으로써 정상 식이를 섭취한 5주령의 정상 마우스(C57BL/6)를 사용하였다. 식이 섭취 시작 8주 후에 Oil-red O 염색을 통해 ApoE knockout 마우스의 aortic sinus (대동맥동) 내 동맥경화병소를 확인하였다. 이 후, 마우스의 혈액을 취하여 이를 PBS에 희석하고 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리를 하여 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하였다. 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 존재하는 ICAM-1을 sandwich ELISA(R&D Systems)를 통해 정량한 결과를 도 4에 나타내었다. An animal model of arteriosclerosis was made by taking a Western diet (20% lipid, 1.5% cholesterol) in a 5 week old ApoE knockout mouse (Jackson Lab). At this time, a 5-week-old normal mouse (C57BL / 6) fed with a normal diet was used as a control group. Eight weeks after the start of the dietary intake, an atherosclerotic lesion in the aortic sinus of the ApoE knockout mouse was identified by Oil-red O staining. After that, mouse blood was diluted with PBS and ultra-high-speed centrifugation was performed at 100,000 x g for 2 hours at 4 ° C to separate the water-soluble protein portion and the extracellular endoplasmic reticulum. The results obtained by quantifying ICAM-1 present in the water-soluble protein moiety and the extracellular endoplasmic reticulum through a sandwich ELISA (R & D Systems) are shown in FIG.

도 4에 나타난 바와 같이, 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내에 수용성 단백질 형태의 ICAM-1과 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 ICAM-1이 모두 증가되어 있음을 알 수 있다. 상기 결과는 두 가지 형태의 세포부착 단백질의 정량결과가 질환 상황과 연관이 있음을 의미한다.
As shown in FIG. 4, it can be seen that ICAM-1 in the form of a water-soluble protein and ICAM-1 in the form of a membrane protein contained in the extracellular endoplasmic reticulum are both increased in the blood of an animal model of arteriosclerosis. The above results indicate that the quantification results of the two types of cell adhesion proteins are related to the disease state.

실시예Example 5. 내피세포 및 내피세포 유래  5. Endothelial cell and endothelial cell origin 세포밖Extracellular 소포체에서 유전자 분리 및 유전자의 발현 변화 확인 Identification of gene expression and gene expression in the endoplasmic reticulum

선행 논문 연구 결과를 바탕으로, 염증성 질환 상황의 내피세포에서 유전자 발현 차이를 보인 유전자 18종을 선정하였다. 내피세포 유래 세포밖 소포체의 유전자 분석에 사용된 18종의 유전자에 대한 정보는 도 5에 나타내었다.Based on the results of previous research, 18 genes with different gene expression in endothelial cells of inflammatory disease were selected. Information on 18 genes used for gene analysis of endothelial cell-derived extracellular endoplasmic reticulum is shown in FIG.

내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체는 RNeasy?Mini kit(QIAGEN, Cat. No. 74104)를 사용해 유전자 (RNA)를 분리하였다. 분리된 유전자는 3' 말단의 poly A tail과 결합하는 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 상보적 DNA(cDNA, complementary DNA)로 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형(template)으로 사용하여 실시간 중합연쇄반응(Real time PCR, real time polymerase chain reaction)을 통해 유전자의 발현 변화를 분석하였다. Real time PCR은 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TAKARA, Cat. No. RR066A)를 이용해 수행하였으며, 전체 중합 반응은 45 사이클까지 확인하였다. 유전자의 발현량 차이는 SYBR 형광값이 측정되기 시작하는 사이클인 Ct(threshold cycle)값을 이용한 상대적인 정량을 수행하였다. 중합 반응이 동일한 유전자 양으로부터 시작되었는지 확인하기 위해 세포에서 항상 발현하는 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH를 항상 같이 확인하였다. Real time PCR로 정상 및 염증성 질환 상황에서 내피세포 및 내피세포 유래 세포밖 소포체에서의 유전자 발현 차이를 확인한 18 종 유전자의 프라이머 염기 서열은 도 6에 나타내었다.
The endoplasmic reticulum or endothelial cell extracellular endoplasmic reticulum was isolated using the RNeasy ™ Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104). The isolated gene was synthesized with complementary DNA (cDNA) using oligo (dT) primer that binds to the poly A tail at the 3 'end. Real time PCR (real time polymerase chain reaction) was used to analyze the expression of the gene in the synthesized cDNA as a template. Real-time PCR was performed using the One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit (TAKARA, Cat. No. RR066A). The relative amount of gene expression was measured using a threshold cycle (Ct), which is a cycle in which the SYBR fluorescence value starts to be measured. GAPDH, a housekeeping gene that is always expressed in cells, was always confirmed to confirm that the polymerization reaction started from the same amount of gene. The primer sequences of 18 genes that confirmed the difference in gene expression in endothelial cells and endothelial cell-derived endoplasmic reticulum in normal and inflammatory disease conditions by real time PCR are shown in FIG.

실시예Example 6. 내피세포에서의 염증성 질환 관련 유전자의 발현 변화 분석 6. Analysis of Expression Changes of Inflammatory Disease Related Gene in Endothelial Cells

내피세포에서 염증 상황을 유도하기 위해 TNF-α(10 ng/ml)를 24시간 처리하였다. 정상 상황 및 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황의 내피세포에서 RNeasy?Mini kit(QIAGEN, Cat. No. 74104) 를 사용해 유전자(RNA)를 분리한 뒤에 real time PCR(TAKARA, Cat. No. RR066A)을 수행하여 정량 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. TNF-α (10 ng / ml) was treated for 24 hours to induce inflammation in endothelial cells. (RNA) was isolated from the endothelial cells under normal conditions and inflammatory conditions induced by TNF-α using the RNeasy ™ kit (QIAGEN, Cat. No. 74104), followed by real time PCR (TAKARA, Cat. No. RR066A ), And the results are shown in FIG.

상기 도 5에서 명시한 염증성 질환 관련 유전자 18종에 대해 분석을 수행한 결과, 내피세포에서 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자를 확인하였다. As a result of analyzing 18 kinds of genes related to inflammatory diseases shown in FIG. 5, genes showing that endothelial cells increase expression in an inflammatory disease state compared with normal conditions were identified.

도 7a는 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현을 표시한 것이며, 도 7b는 유전자 발현량이 200 배 이하인 유전자에 대해서만 표시한 것이다. FIG. 7A shows gene expression for all 18 genes, and FIG. 7B shows only genes for gene expression amounts up to 200 times.

구체적으로, "200배"라 함은 유전자 발현량을 서로 간에 비교하였을 때, 정상 상황에 비해 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황에서 유전자의 발현량이 200 배 증가하였다는 것을 의미한다. 18종 유전자 간에 발현량의 차이가 커서 200 배 이하인 유전자에 대해서만 추가로 도 7b에 나타낸 것이다. Specifically, "200-fold" means that the expression level of the gene is increased 200-fold in the inflammatory condition induced by TNF-α compared with the normal state when gene expression levels are compared with each other. The difference in the expression level between the 18 genes is so large that only the genes having the size of 200 times or less are shown in FIG. 7B.

염증성 질환 관련 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 CXCL10, ICAM1, SELE가 가장 큰 발현 차이를 보이며, 이외에도 VCAM1, IL6, TNF, TNFAIP2, IRF1, IL32의 발현 증가가 특이적임을 확인하였다.
The expression of VCAM1, IL6, TNF, TNFAIP2, IRF1 and IL32 was found to be highly specific in CXCL10, ICAM1 and SELE.

실시예Example 7. 내피세포 유래  7. Endothelial cell origin 세포밖Extracellular 소포체에서의 염증성 질환 관련 유전자의 발현 변화 Expression of Inflammatory Disease-Related Gene in Endoplasmic Reticulum

내피세포에 TNF-α(10 ng/ml)를 24시간 처리하였다. 정상 상황 및 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황의 내피세포에서 세포밖 소포체를 분리한 뒤에 이로부터 유전자를 분리하여 real time PCR을 수행하고 정량 분석한 결과는 도 8에 나타내었다. 상기 도 5에서 명시한 염증성 질환 관련 유전자 18종에 대해 분석을 수행한 결과, 세포밖 소포체에서 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자를 발굴하였다. Endothelial cells were treated with TNF-α (10 ng / ml) for 24 hours. The extracellular endoplasmic reticulum was isolated from endothelial cells under normal conditions and inflammatory conditions induced by TNF-α, and then the gene was isolated from the endothelial cells and subjected to real time PCR and quantitative analysis is shown in FIG. As a result of analyzing 18 kinds of genes related to the inflammatory diseases shown in FIG. 5, genes that express expression in the extracellular endoplasmic reticulum in an inflammatory disease state were found out compared to the normal state.

도 8a는 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현을 표시한 것이며, 도 8b는 유전자 발현량이 25 배 이하인 유전자에 대해서만 표시한 것이다. 염증성 질환 관련 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 ICK, TNFAIP2가 가장 큰 발현 차이를 보이며, 이외에도 ICAM1, SELE, BMP4, VWF, IRF1, CXCL10의 발현 증가가 특이적임을 확인하였다. 세포밖 소포체의 유전자 분석 결과, 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자의 종류는 내피세포에서의 유전자 분석 결과와 유사하나, 세포밖 소포체 특이적인 유전자 발현이 관찰되었다. FIG. 8A shows the gene expression for all 18 genes, and FIG. 8B shows only the genes for which the gene expression amount is 25 times or less. ICA, TNFAIP2, and ICAM1, SELE, BMP4, VWF, IRF1, and CXCL10 were found to be more specific in the expression of inflammatory diseases. As a result of genetic analysis of the extracellular endoplasmic reticulum, the type of the gene whose expression is increased in the inflammatory disease condition is similar to that of the endothelial cell, but the extracellular endoplasmic reticulum gene expression is observed.

상기 결과로부터, 세포밖 소포체는 유래 세포의 유전자 발현 상황을 어느 정도 대변하지만, 세포밖 소포체에 단백질이나 유전자가 실리는(loading) 특이적인 작용 기전에 의해 유래 세포에서 차이를 보이는 모든 유전자가 세포밖 소포체에서도 관찰되는 것은 아님을 알 수 있다.
From these results, the extracellular endoplasmic reticulum expresses the state of gene expression of the derived cells to a certain degree, but all the genes showing differences in the derived cells due to the specific mechanism of loading proteins or genes into the extracellular endoplasmic reticulum It is not observed in the endoplasmic reticulum.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

Claims (16)

체액 내 세포부착 단백질을 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획으로 분리하는 단계; 상기 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획에 존재하는 단백질을 정량하는 단계; 및 상기 정량한 수용성 단백질 및 세포밖 소포체에 존재하는 세포부착 단백질 양의 비율을 비교하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 진단을 위한 정보제공방법.Separating the cell adhesion protein in the body fluids into a water-soluble protein fraction and an extracellular vesicle fraction; Quantifying the protein present in the water soluble protein fraction and the extracellular endoplasmic reticulum fraction; And comparing the ratio of the quantified water soluble protein and the amount of cell adhesion protein present in the extracellular endoplasmic reticulum. 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 정량하는 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 또는 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)인 것을 특징으로 하는, 방법.The method according to claim 1,
Wherein said quantifying protein is intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), E-selectin, or VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1). 제 1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.The method according to claim 1,
Wherein said inflammatory disease comprises cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis. 제 1항에 있어서,
상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.The method according to claim 1,
Wherein the body fluid is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose. 제 1항에 있어서,
상기 방법은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는, 염증성 질환의 진단을 위한 정보제공방법.The method according to claim 1,
Said method further comprising the step of measuring the amount of gene expression present in the extracellular endoplasmic reticulum in body fluids. 제 6항에 있어서,
상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.The method according to claim 6,
These genes include EDN1 (endothelin 1), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1 (intercellular adhesion molecule 1), SELE (selectin E), NOS3 (nitric oxide synthase 3), BMP4 (bone morphogenetic protein 4) Von Willebrand factor), MPZ (Myelin protein zero), IRF1 (Interferon regulatory factor 1), TNF (Tumor necrosis factor), IL32 (Interleukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10 ) ligand 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8) III). ≪ / RTI > 제 6항에 있어서,
상기 유전자 발현량은 real time PCR에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.The method according to claim 6,
Wherein the amount of gene expression is measured by real time PCR. 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및 존재비율을 측정하기 위한 항-세포부착 단백질 항체를 포함하는, 염증성 질환 진단 키트.Cell adhesion protein antibody for measuring the abundance and the abundance ratio of the cell adhesion protein in the body fluids. 제 9항에 있어서,
상기 세포부착 단백질은 수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트.10. The method of claim 9,
Wherein the cell adhesion protein is present in the form of a water soluble protein or a membrane protein contained in an extracellular endoplasmic reticulum. 제 9항에 있어서,
상기 세포부착 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 또는 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트.10. The method of claim 9,
Wherein the cell adhesion protein is ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, or VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1). 제 9항에 있어서,
상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함하는 것인, 염증성 질환 진단 키트.10. The method of claim 9,
Wherein the inflammatory disease comprises cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis. 제 9항에 있어서,
상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염증성 질환 진단 키트.10. The method of claim 9,
Wherein the body fluid is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose. 제 9항에 있어서,
상기 키트는 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하기 위한 프라이머쌍을 더 포함하는, 염증성 질환 진단 키트.10. The method of claim 9,
Wherein said kit further comprises a primer pair for measuring the amount of gene expression present in extracellular endoplasmic reticulum in body fluids. 제 14항에 있어서,
상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트.15. The method of claim 14,
These genes include EDN1 (endothelin 1), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1 (intercellular adhesion molecule 1), SELE (selectin E), NOS3 (nitric oxide synthase 3), BMP4 (bone morphogenetic protein 4) Von Willebrand factor), MPZ (Myelin protein zero), IRF1 (Interferon regulatory factor 1), TNF (Tumor necrosis factor), IL32 (Interleukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10 ) ligand 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8) III). ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI > 삭제delete
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