KR101630888B1 - 표적 유전자의 발현을 억제하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등을 제공하는 것에 있다. 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X)라고 함) 및 상기 서열(X)와 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X')이라고 함)을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜을 함유하고, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스이며, 상기 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에 도달하는 리포솜인 조성물 등을 제공한다.

Description

표적 유전자의 발현을 억제하는 조성물{COMPOSITION FOR SUPPRESSING EXPRESSION OF TARGET GENE}
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등에 관한 것이다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 예컨대 RNA 간섭(RNA interference, 이하, RNAi라고 칭함)을 이용한 방법 등이 알려져 있고, 구체적으로는, 선충에서 표적으로 하는 유전자와 동일한 서열을 갖는 이중쇄 RNA를 도입하는 것에 의해, 상기 표적 유전자의 발현이 특이적으로 억제되는 현상이 보고되어 있다["네이처(Nature)", 1998년, 제391권, 제6669호, p. 806-811 참조]. 또한, 초파리에서 긴 이중쇄 RNA 대신에, 21∼23 염기 길이의 이중쇄 RNA를 도입하는 것에 의해서도, 표적 유전자의 발현이 억제되는 것이 발견되어, 이것은 단쇄 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)라고 명명되어 있다(국제 공개 제01/75164호 팜플렛 참조).
포유류 세포에서는, 긴 이중쇄 RNA를 도입한 경우, 바이러스 방어 기구에 의해 아폽토시스가 일어나, 특정 유전자의 발현을 억제할 수 없지만, 20∼29 염기의 siRNA라면, 이러한 반응이 일어나지 않고, 특정 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 것이 발견되었다. 그 중에서도 21∼25 염기의 것의 발현 억제 효과가 높다["네이처(Nature)", 2001년, 제411권, 제6836호, p. 494-498, "네이처 리뷰즈 제네틱스(Nature Reviews Genetics)", 2002년, 제3권, 제10호, p. 737-747, "몰리큘러 셀(Molecular Cell)", (미국), 2002년, 제10권, 제3호, p. 549-561, "네이처 바이오테크놀러지(Nature Biotechnology)", (미국), 2002년, 제20권, 제5호, p. 497-500]. 또한, 이중쇄 RNA가 아니며, 분자 내 하이브리드화(hybridize)에 의해, 헤어핀 구조를 갖는 단일쇄 RNA도, siRNA와 마찬가지로 RNAi를 나타낸다는 것이 보고되어 있다["프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언시즈 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)", 2002년, 제99권, 제9호, p. 6047-6052 참조].
RNAi에 대해서는, 생체내(in vivo) 시험에서도 다수 검증되어 있고, 50 염기쌍 이하의 siRNA를 이용한 태아의 동물에서의 효과(특허문헌 1 참조) 및 성체 마우스에서의 효과(특허문헌 2 참조)가 보고되어 있다. 또한, siRNA를 마우스 태아에게 정맥내 투여한 경우에, 신장, 비장, 폐, 췌장 및 간장의 각 장기에서 특정 유전자의 발현 억제 효과가 확인되어 있다(비특허문헌 1 참조). 또한, 뇌세포에서도 siRNA를 직접 투여하는 것에 의해 특정 유전자가 발현 억제된다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2 참조).
한편, 핵산의 세포 내로의 송달 수단으로서, 양이온성 리포솜이나 양이온성 폴리머를 이용하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 상기 방법에서는, 핵산을 함유하는 양이온성 리포솜이나 양이온성 폴리머의 정맥내 투여 후, 혈중으로부터 조속하게 핵산이 제거되어 버려, 표적 조직이 간장이나 폐 이외인 경우, 예컨대 종양 부위 등인 경우에는 핵산을 표적 조직에 송달할 수 없어, 충분한 작용의 발현을 가능하게 하는 데 도달하고 있지 않다. 그래서, 핵산이 혈중에서 조속하게 제거된다고 하는 문제점을 해결한 핵산 봉입 리포솜(리포솜 내에 핵산을 봉입한 리포솜)이 보고되어 있다(특허문헌 3∼6 및 비특허문헌 3 참조). 특허문헌 3에서는, 핵산 등을 봉입하는 리포솜의 제조 방법으로서, 예컨대, 양이온성 지질을 클로로포름에 미리 용해하고, 계속해서 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)의 수용액과 메탄올을 첨가하여 혼합한 후 원심분리함으로써 클로로포름층에 양이온성 지질/ODN의 복합체를 이행시키고, 클로로포름층을 추가로 추출하며, 이것에 폴리에틸렌글리콜화 인지질과 중성의 지질과 물을 첨가하여 유중수형(W/O) 에멀션을 형성하고, 역상 증발법으로 처리하여 ODN 내포 리포솜을 제조하는 방법이 보고되며, 특허문헌 4 및 비특허문헌 3에서는, ODN을, pH 3.8의 시트르산 수용액에 용해하고, 지질(에탄올 중)을 첨가하여, 에탄올 농도를 20 v/v%까지 낮춰 ODN 내포 리포솜을 조제하고, 사이징 여과하며, 투석에 의해, 과잉 에탄올을 제거한 후, 시료를 pH 7.5로 추가로 투석하여 리포솜 표면에 부착된 ODN을 제거하여 ODN 내포 리포솜을 제조하는 방법이 보고되고, 각각 핵산 등의 유효 성분을 봉입한 리포솜이 제조되고 있다.
이들에 대하여 특허문헌 5 및 6에서는, 액체 중에서 미립자를 지질 이중막으로 피복하는 방법으로 핵산 등의 유효 성분을 봉입한 리포솜을 제조하는 것이 보고되어 있다. 상기 방법에서는, 미립자가 분산되고 또 지질이 용해된 극성 유기 용매 함유 수용액 중의 극성 유기 용매의 농도를 감소시키는 것에 의해, 액체 중에서, 미립자가 지질 이중막으로 피복된다. 이 방법에서는, 예컨대 정맥 주사용 미립자 등에 적합한 크기의 지질 이중막으로 피복된 미립자(피복 미립자)가, 우수한 효율로 제조되고 있고, 또한, 특허문헌 5 및 6에서는 피복되는 미립자의 예로서 예컨대 ODN 또는 siRNA와 양이온성 지질로 이루어지는 정전적 상호 작용에 의해 형성되는 복합체가 예시되어 있다. 상기 미립자를 피복한 피복 미립자의 입자 직경은 작고, 주사제로서 사용 가능한 것, 상기 피복 미립자는, 정맥내에 투여한 경우, 높은 혈중 체류성을 나타내고, 종양 조직에 다수 집적한 것이 보고되어 있다.
[특허문헌]
특허문헌 1: 미국 공개 제2002-132788호
특허문헌 2: 국제 공개 제03/10180호 팜플렛
특허문헌 3: 일본 특허 공표 제2002-508765호 공보
특허문헌 4: 일본 특허 공표 제2002-501511호 공보
특허문헌 5: 국제 공개 제02/28367호 팜플렛
특허문헌 6: 국제 공개 제2006/080118호 팜플렛
[비특허문헌]
비특허문헌 1: 네이처 제네틱스(Nature Genetics), 2002년, 제32권, 제1호, p. 107-108
비특허문헌 2: 네이처 바이오테크놀러지(Nature Biotechnology), 2002년, 제20권, 제10호, p. 1006-1010
비특허문헌 3: 바이오키미카 에트 바이오피지카 악타(Biochimica et Biophysica Acta), 2001년, 제1510권, p. 152-166
본 발명의 목적은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 이하의 (1)∼(54)에 관한 것이다.
(1) 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X)라고 함) 및 상기 서열(X)와 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X')이라고 함)을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜을 함유하고, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스이며, 상기 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에 도달하는 리포솜인 조성물.
(2) 리포솜이 정맥내 투여 가능한 크기의 리포솜인, 상기 (1)에 기재된 조성물.
(3) RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 조성물.
(4) 표적 유전자가 종양 또는 염증에 관련되는 유전자인, 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(5) 표적 유전자가 혈관신생에 관련되는 유전자인, 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(6) 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠(Kruppel) 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인, 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(7) mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인, 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(8) RNA를 봉입한 리포솜이 리드 입자(lead particle)와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜이고,
상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인, (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(9) 극성 유기 용매가 알코올인, (8)에 기재된 조성물.
(10) 극성 유기 용매가 에탄올인, (8)에 기재된 조성물.
(11) 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, (8)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(12) RNA를 봉입한 리포솜이 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜이고,
상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(13) 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인, (11) 또는 (12)에 기재된 조성물.
(14) 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인, (11)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(15) 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인, (11)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(16) 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X1)이라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X1')이라고 함)을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜을 함유하고,
상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인, 암 또는 염증 질환의 치료제.
(17) 극성 유기 용매가 알코올인, (16)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(18) 극성 유기 용매가 에탄올인, (16)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(19) 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, (16)∼(18) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(20) 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하며,
상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, 암 또는 염증 질환의 치료제.
(21) 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인, (19) 또는 (20)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(22) 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인, (19)∼(21) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(23) 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인, (19)∼(22) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(24) RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인, (16)∼(23) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(25) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관신생에 관여하는 유전자인, (16)∼(23) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(26) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인, (16)∼(23) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(27) mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인, (16)∼(26) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료제.
(28) 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜을 함유하며,
상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이고, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인 조성물을 포유동물에게 투여하는, 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(29) 극성 유기 용매가 알코올인, (28)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(30) 극성 유기 용매가 에탄올인, (28)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(31) 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, (28)∼(30) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(32) 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하며,
상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 조성물을 포유동물에게 투여하는, 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(33) 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인, (31) 또는 (32)에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(34) 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인, (31)∼(33) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(35) 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인, (31)∼(34) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(36) RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인, (28)∼(35) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(37) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관신생에 관여하는 유전자인, (28)∼(35) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(38) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인, (28)∼(35) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(39) mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인, (28)∼(38) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 치료 방법.
(40) 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜을 함유하며,
상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이고, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인 조성물의 암 또는 염증 질환의 치료제의 제조를 위한 용도.
(41) 극성 유기 용매가 알코올인, (40)에 기재된 용도.
(42) 극성 유기 용매가 에탄올인, (40)에 기재된 용도.
(43) 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인, (40)∼(42) 중 어느 하나에 기재된 용도.
(44) 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하며,
상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 조성물의 암 또는 염증 질환의 치료제의 제조를 위한 용도.
(45) 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인, (43) 또는 (44)에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(46) 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인, (43)∼(45) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(47) 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인, (43)∼(46) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(48) RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인, (40)∼(47) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(49) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관신생에 관여하는 유전자인, (40)∼(47) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(50) 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인, (40)∼(47) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(51) mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인, (40)∼(50) 중 어느 하나에 기재된 암 또는 염증 질환의 용도.
(52) siRNA를 포함하는 피검액 중에, 핵산과 복합체를 형성하는 시약을 첨가하여, 상기 siRNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성시키고, 이 복합체를 분리한 후, 재용해액으로 용해하고, 얻어진 용액을 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석함으로써 상기 siRNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법.
(53) 피검액 중에, 피측정의 siRNA와 염기수가 다른 핵산을 IS로서 공존시키는 것을 특징으로 하는, (52)에 기재된 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법.
(54) 고속 액체 크로마토그래피법에 따른 분석에서의 검출 장치가 질량 분석 장치인 것을 특징으로 하는, (52) 또는 (53)에 기재된 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법.
본 발명의 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜을 함유하는 조성물을 포유류 등에게 투여함으로써, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 횡축은 제제 투여 후의 시간(시간)을, 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 2는 비교예 1에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 횡축은 제제 투여 후의 시간(시간)을, 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 횡축은 제제 투여 후의 시간(시간)을, 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 4는 실시예 3에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 횡축은 제제 투여 후의 시간(시간)을, 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 5는 비교예 2에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 횡축은 제제 투여 후의 시간(시간)을, 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 6은 실시예 4에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
도 7은 비교예 3에서 얻어진 제제를 투여했을 때의 혈액 중의 RNA의 농도를 나타내는 것이다. 종축은 혈액 중의 RNA의 농도(μ㏖/L)를 나타낸다.
본 발명에서의 표적 유전자로서는, 포유류에서 mRNA를 생성하여 발현하는 유전자이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 종양 또는 염증에 관련되는 유전자가 바람직하고, 혈관신생에 관여하는 유전자 등이 보다 바람직하며, 예컨대 혈관 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF라고 약기함), 혈관 내피 증식 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, 이하 VEGFR이라고 함), 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠 유사 인자(Kruppel-like factor, 이하 KLF라고 함), Ets 전사 인자, 핵 인자, 저산소 유도 인자 등의 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있고, 구체적으로는 VEGF 유전자, VEGFR 유전자, 섬유아세포 증식 인자 유전자, 섬유아세포 증식 인자 수용체 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 유전자, 간세포 증식 인자 유전자, 간세포 증식 인자 수용체 유전자, KLF 유전자, Ets 전사 인자 유전자, 핵 인자 유전자, 저산소 유도 인자 유전자 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 VEGF 유전자, VEGFR 유전자, KLF 유전자 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 KLF 유전자를 들 수 있으며, 보다 더욱 바람직하게는 KLF5 유전자를 들 수 있다.
KLF 패밀리는 C 말단의 징크 핑거(zinc finger) 모티프를 특징으로 하는 전사 인자의 패밀리이며, KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16 등이 알려져 있다. 포유류에서, KLF 패밀리는, 여러 가지 조직이나 세포, 예컨대 적혈구, 혈관 내피 세포, 평활근, 피부, 림프구 등의 분화에 중요한 것, 또한 암, 심혈관 질환, 간경변, 신장 질환, 면역 질환 등의 각종 질환의 병태 형성에 중요한 역할을 하고 있음이 보고되어 있다[더 저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(The Journal of Biological Chemistry), 2001년, 제276권, 제37호, p. 34355-34358, 게놈 바이올로지(Genome Biology), 2003년, 제4권, 제2호, p. 206].
KLF 패밀리 중 KLF5는, BTEB2(basic transcriptional element binding protein 2) 또는 IKLF(intestinal-enriched Kruppel-like factor)라고도 불린다. 혈관 평활근에서의 KLF5의 발현은, 발생 단계에서 제어를 받고 있으며, 태아의 혈관 평활근에서는, 높은 발현을 나타내는 데 대하여, 정상적인 성인의 혈관 평활근에서는 발현이 보이지 않게 된다. 또한, 벌룬 카테터에 의한 삭박 후에 신생한 혈관 내막의 평활근에서는, KLF5의 높은 발현이 보여지고, 동맥 경화나 재협착의 병변부의 평활근에서도 KLF5의 발현이 보여진다[서큘레이션(Circulation), 2000년, 제102권, 제20호, p. 2528-2534].
VEGF는, 1983년에, Ferrara 등에 의해 발견된 혈관 내피 세포에 특이적인 증식 인자이다. 같은 해에, Senger, Dvorak 등에 의해 혈관 투과성 작용을 갖는 인자가 발견되어 VPF(vascular permeability factor)라고 명명되었다. 단백질의 아미노산 서열 해석의 결과, 2개는 동일한 것을 알 수 있었다. VEGF는 혈관의 내측에 있는 내피 세포의 수용체에 결합하여 증식을 촉진한다. VEGF는 태아기에 혈관을 만들 뿐만 아니라, 병적인 혈관을 만들 때에도 작용하고 있다. 예컨대 암이 어느 정도 커져 산소 부족이 되면, VEGF와 그 수용체가 증가하여 혈관신생이 일어난다. 또한 혈관 투과성 항진 작용에 의해 암성 복수의 원인이 된다고도 생각되고 있다. 당뇨병이 진행되면 망막에 신생 혈관이 생기지만, 이것에도 VEGF가 작용하고 있다. 즉, 새로운 혈관을 만드는 단백이다. 저산소 상태에 의해 그 발현이 유도됨으로써 혈관신생에의 중요한 역할을 담당하고 있다고 할 수 있다. 또한 혈관신생뿐만 아니라, 종양 또는 염증성 병변 등에서 보여지는 부종의 메커니즘을 설명하는 데 있어서 본 인자의 관여가 강하게 시사되고 있다.
한편, VEGFR은 혈관 내피 세포나 암 세포 자신이 가지고 있으며, VEGFR이 수용체와 결합함으로써 수용체 자신이 인산화(활성화)되고, 그 결과 세포 내에 증식이나 유주 등 여러 가지 명령이 전달된다. 이 수용체의 인산화를 저해함으로써 세포 내의 전달을 저해하며, 혈관신생을 저해하는 것이 알려져 있다.
또한, 표적 유전자로서, 예컨대, B 세포/림프종(B-CELL CLL/LYMPHOMA, 이하 bcl이라고 약기함) 유전자를 들 수 있고, 바람직하게는 bcl2 유전자를 들 수 있다.
Bcl-2는, 몇 개의 세포종에서 아폽토시스에 의한 세포사의 저해를 나타내는, 미토콘드리아 내막 단백질이다. Bcl-2 단백질의 대량 발현에 의한 아폽토시스의 억제는, 암이나, 혈액학적 악성 질환 등의 원인이 된다고 생각되고 있다. 실제로, Bcl-2 단백질은 림프 육종, 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암 및 직장암 등 여러 가지 고형암에서 대량으로 생산되고 있다(T. J. McDonnell 등, "Cancer Research", 1992년 12월 15일, 52권, 24호, p. 6940-6944). 또한, 흉선의 아폽토시스에는 Bcl-2의 발현이 관계하고 있는 것이 나타나 있다(Kanavaros et al., Histol. Histopathol. 16(4): 1005-12 (Oct. 2001)).
Bcl-2 단백질이 대량으로 생산되는 세포에서는, 그 아폽토시스 억제 작용으로부터 세포사가 유도되지 않기 때문에, 여러 가지 항암제에 대한 약품 내성이 야기된다. 한편, 전립선암 세포에서 Bcl-2 생산을 억제하면, 세포 증식의 억제가 보이며, 아폽토시스를 유도하기 쉬워진다는 것이 알려져 있다(Shi et al., Cancer Biother. Radiopharm., 16(5): 421-9 (Oct. 2001)). 따라서, 고형암 및 혈액학적 악성 질환 등, 그 치유에서 아폽토시스의 촉진이 필요한 질환에서는, Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 방법은 효과적인 치료법 또는 예방법이 될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 RNA로서는, 상기 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기, 바람직하게는 17∼25 염기, 보다 바람직하게는 19∼23 염기의 서열(이하, 서열(X)라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X')이라고 함)을 포함하고 있는 RNA를 들 수 있고, 예컨대, 본 발명에서 이용되는 RNA에는, 서열(X)를 포함하는 센스쇄 및 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로 이루어지는 이중쇄 RNA, 상기 센스쇄와 상기 안티센스쇄가 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 헤어핀 구조를 갖는 RNA를 들 수 있다.
서열(X)를 포함하는 센스쇄로서는, 염기로서 서열(X)만을 포함하고 있는 RNA(이하, 서열(X)쇄라고 함), 서열(X)쇄의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양단에 1∼6개, 바람직하게는 2∼4개의 뉴클레오티드가 동일 또는 다르게 부가된 RNA를 들 수 있다.
상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로서는, 염기로서 상보 서열(X')만을 포함하고 있는 RNA(이하, 상보 서열(X')쇄라고 함), 상보 서열(X')쇄의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양단에 1∼6개, 바람직하게는 2∼4개의 뉴클레오티드가 동일 또는 다르게 부가된 이중쇄 RNA 등을 들 수 있다.
서열(X)를 포함하는 센스쇄와 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄가 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 헤어핀 구조를 갖는 RNA의 스페이서 올리고뉴클레오티드로서는, 6∼12 염기의 뉴클레오티드가 바람직하고, 그 5' 말단의 서열은 2개의 U인 것이 바람직하다. 스페이서 올리고뉴클레오티드의 예로서, UUCAAGAGA의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해 연결되는 2개의 RNA의 순서는 어느 쪽이 5' 측이 되어도 좋고, 서열(X)를 포함하는 센스쇄가 5' 측이 되는 것이 바람직하다.
서열(X)쇄 및 상보 서열(X')쇄에 부가되는 뉴클레오티드 및 스페이서 올리고뉴클레오티드의 염기는 구아닌, 아데닌, 시토신, 티민 및 우라실 중 어느 1종 또는 복수종이어도 좋고, 또한 각각의 염기에 결합하는 당이 리보스, 데옥시리보스 또는 2' 위치의 수산 기가 수식 기로 치환된 리보스 중 어느 것이어도 좋지만, 부가되는 뉴클레오티드로서는, 우리딜산(U) 및 데옥시티미딜산(dT) 중 어느 1종 또는 2종이 보다 바람직하다. 또한, 서열(X)쇄의 3' 말단에 부가되는 뉴클레오티드의 염기의 서열을, 표적 유전자의 mRNA 내에서 서열(X)와 인접하는 뉴클레오티드의 염기의 서열과 동일한 염기 서열로 하여도 좋고, 이 구조가 보다 바람직하다. 또한, 상보 서열(X')쇄의 3' 말단에 부가되는 뉴클레오티드의 염기의 서열을, 표적 유전자의 mRNA 내에서 서열(X)와 인접하는 뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 하여도 좋고, 이 구조가 보다 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 RNA의 보다 바람직한 예로서는, 예컨대, (a) 서열(X)를 포함하는 센스쇄 및 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로 이루어지는 이중쇄 RNA로서, 서열(X)가 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 19∼21 염기의 서열이고, 센스쇄가 서열(X)쇄 및 상기 서열(X)쇄의 3' 말단에 2∼4개의 동일 또는 다르게 부가된 뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스쇄가 상보 서열(X')쇄 및 상기 상보 서열(X')쇄의 3' 말단에 2∼4개의 동일 또는 다르게 부가된 뉴클레오티드로 이루어지는 것인 이중쇄 RNA, (b) 서열(X)를 포함하는 센스쇄 및 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로 이루어지는 이중쇄 RNA로서, 서열(X)가 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 23∼25 염기의 서열이고, 센스쇄가 서열(X)쇄이고, 안티센스쇄가 상보 서열(X')쇄인 이중쇄 RNA, (c) 서열(X)를 포함하는 센스쇄 및 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로 이루어지는 이중쇄 RNA로서, 서열(X)가 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 23∼27 염기의 서열이고, 센스쇄가 서열(X)쇄 및 상기 서열(X)쇄의 3' 말단에 2∼4개의 동일 또는 다르게 부가된 뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스쇄가 상보 서열(X')쇄 및 상기 상보 서열(X')쇄의 3' 말단에 2∼4개의 동일 또는 다르게 부가된 뉴클레오티드로 이루어지며, 상보 서열(X')쇄의 3' 말단에 부가되는 뉴클레오티드의 염기 서열이, 표적 유전자의 mRNA 내에서 서열(X)와 인접하는 뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열인 이중쇄 RNA 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 RNA로서는, 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA를 들 수 있다.
여기서는 Bcl2 유전자의 발현을 억제하는 RNA를 예로 들어, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA에 대해서 설명한다. 다른 유전자의 발현을 억제하는 RNA의 경우도 동일한 조작으로 얻을 수 있다.
bcl-2 유전자의 발현을 억제하는 RNA는, 진뱅크 수탁 번호(Genbank Accession No.) NM_000633으로서 등록되어 있는 bcl-2의 완전 길이 mRNA에 대응하는 DNA 염기 서열(서열 번호 29)에 기초하여 설계할 수 있다. 상기 DNA 염기 서열의 연속하는 15∼30 염기, 바람직하게는 17∼27 염기, 보다 바람직하게는 19∼25 염기의 부분 서열을 추출한다. 추출한 서열의 GC 함량을 계산하고, GC 함량이 20∼80%, 바람직하게는 30%∼70%, 보다 바람직하게는 40∼60%인 서열을 선택하며, 서열 중의 T를 U로 바꾼 염기 서열을 서열(X)로 한다. 선택된 서열(X)를 포함하는 센스쇄 및 서열(X)와 상보 서열인 상보 서열(X')을 포함하는 안티센스쇄로 이루어지는 이중쇄 RNA, 상기 센스쇄와 상기 안티센스쇄가 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 헤어핀 구조를 갖는 RNA가 bcl-2 유전자의 발현을 억제하는 RNA이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 RNA는, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%, 바람직하게는 10∼75%, 보다 바람직하게는 20∼65%, 가장 바람직하게는 30∼55%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스이다.
본 발명에서의 리보스의 2' 위치에서 수식 기로 치환되었다고 하는 것은, 2' 위치의 수산 기가 수식 기로 치환되어 있는 것을 의미하고, 리보스의 2' 위치의 수산 기와 입체 배치가 동일하여도 달라도 좋지만, 바람직하게는 리보스의 2' 위치의 수산 기와 입체 배치가 동일하다.
서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스 이외의 당은 리보스 또는 데옥시리보스이며, 바람직하게 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스 이외의 당은 전부 리보스이다.
본 발명에서 이용되는 RNA에는, 리보핵산의 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 황 원자 등의 다른 원자로 치환된 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 RNA의 5' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 5' 위치의 수산 기가 인산 기 또는 수식 기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등에 의해 인산 기 또는 수식 기가 되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다. 바람직하게는 센스쇄의 5' 말단의 염기에 결합하는 당은, 5' 위치의 수산 기가 인산화되어 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 RNA의 3' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 3' 위치의 수산 기가 인산 기 또는 수식 기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등에 의해 인산 기 또는 수식 기가 되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다.
본 발명에서의 수식 기로서는, 예컨대, 2'-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-알케닐, 2'-치환 알케닐, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-S-알킬, 2'-S-치환 알킬, 2'-S-알케닐, 2'-S-치환 알케닐, 2'-아미노, 2'-NH-알킬, 2'-NH-치환 알킬, 2'-NH-알케닐, 2'-NH-치환 알케닐, 2'-SO-알킬, 2'-SO-치환 알킬, 2'-카복시, 2'-CO-알킬, -CO-치환 알킬, -Se-알킬, -Se-치환 알킬, -SiH2-알킬, -SiH2-치환 알킬, 2'-ONO2, 2'-NO2, 2'-N3, 2'-NH-알킬, 2'-NH-치환 알킬, 2'-아미노산 잔기(아미노산의 카복실산으로부터 수산 기가 제거된 것), 2'-O-아미노산 잔기(상기 아미노산 잔기와 동의)를 들 수 있고, 또한, 2' 위치의 수식 기가 4' 위치의 탄소 원자에 가교한 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid)(BNA), 보다 구체적으로는, 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교한 록트 인공 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA), 및 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)] 등도 본 발명에서의 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스에 포함된다.
본 발명에서의 수식 기로서, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, -Se-알킬, -Se-치환 알킬이 바람직하고, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-(2-[N,N-디메틸]아미노옥시)에틸, 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-[2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸] 및 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸 등이 보다 바람직하며, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로 등이 보다 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명에서의 수식 기는, 그 크기로부터 바람직한 범위를 정의할 수도 있고, 플루오로의 크기부터 -O-부틸의 크기에 상당하는 것이 바람직하며, -O-메틸의 크기부터 -O-에틸의 크기에 상당하는 크기의 것이 보다 바람직하다.
수식 기에서의 알킬로서는, 예컨대 직쇄 또는 분기형의 탄소수 1∼6의, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 헥실 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸 등을 들 수 있다. 수식 기에서의 알케닐로서는, 예컨대 직쇄 또는 분기형의 탄소수 1∼6의, 예컨대 비닐, 알릴, 이소프로페닐 등을 들 수 있다.
할로겐으로서는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
아미노산으로서는, 예컨대 지방족 아미노산(구체적으로는, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신 등), 하이드록시아미노산(구체적으로는, 세린, 트레오닌 등), 산성 아미노산(구체적으로는, 아스파라긴산, 글루탐산 등), 산성 아미노산 아미드(구체적으로는, 아스파라긴, 글루타민 등), 염기성 아미노산(구체적으로는, 리신, 하이드록시리신, 아르기닌, 오르니틴 등), 황 함유 아미노산(구체적으로는, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 등), 이미노산(구체적으로는, 프롤린, 4-하이드록시프롤린 등) 등을 들 수 있다.
치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로서는, 예컨대, 할로겐(상기 할로겐과 동의), 하이드록시, 술파닐, 아미노, 옥소, -O-알킬(상기 알킬과 동의), -S-알킬(상기 알킬과 동의), -NH-알킬(상기 알킬과 동의), 디알킬아미노옥시(상기 2개의 알킬은 동일하거나 다르며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노(상기 2개의 알킬은 동일하거나 다르며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노알킬렌옥시(상기 2개의 알킬은 동일하거나 다르며 상기 알킬과 동의이고, 상기 알킬렌은 상기 알킬로부터 수소가 제거된 것을 의미함) 등을 들 수 있고, 치환수는 바람직하게는 1∼3이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 RNA는, 제조 방법이나 원료나 중간체에 관계없이, 예컨대 원료나 중간체가 DNA 또는 데옥시리보스여도, 최종적으로 구조식이 동일하면 본 발명에서 이용되는 RNA에 포함된다. 즉, 본 발명에서의 리보스의 2' 위치에서 산소 원자가 제거된 리보스는 데옥시리보스를 포함하고, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스는 2' 위치에서 수소가 수식 기로 치환된 데옥시리보스를 포함한다.
본 발명에서 이용되는 RNA에서, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스는, 인접하는 것이 최소한이 되도록 분포하는 것이 바람직하고, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스를 1개, 2개 및 3개 간격으로 조합하여, 전혀 인접시키지 않고 분포하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 특히 서열(X)의 염기에 결합하는 리보스는, 1개 간격으로, 전혀 인접시키지 않고, 30∼55%가, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 것이 보다 바람직하다.
또한, 서열(X) 및 상보 서열(X')에서의 상보적 염기쌍은, 양쪽이 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 것보다도, 한쪽만이 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 것이 바람직하고, 상기 바람직한 형태 중에서, 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스를 1개, 2개 및 3개 간격으로 조합하여, 전혀 인접시키지 않고 분포시키는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 RNA는, 기지의 RNA 또는 DNA 합성법 및 RNA 또는 DNA 수식법을 이용하여 제조하면 좋다. 예컨대 홋카이도 시스템 사이언스 가부시키가이샤 등에 화학 합성을 의뢰하여 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물에서의 리포솜(이하 리포솜(A))으로서는, 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜이 바람직하다. 상기 리포솜(A)은 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에 도달하는 리포솜이면 특별히 한정되지 않지만, 리포솜에 의해, 각각 도달하기 쉬운 조직 또는 장기가 알려져 있기 때문에, 적절하게 선택하여야 한다.
본 발명에 이용하는 리포솜(A)으로서는, 예컨대, 양이온성 지질/RNA의 복합체를 소수성의 유기 용매 층에 분산시키고, 폴리에틸렌글리콜화 지질과 중성의 지질과 물을 첨가하여 유중수형(W/O) 에멀션을 형성하고, 역상 증발법으로 처리하여 제조된 리포솜(일본 특허 공표 제2002-501511호 공보 참조), RNA를 산성의 전해질 수용액에 용해하고, 지질(에탄올 중)을 첨가하여, 에탄올 농도를 낮춰 RNA 내포 리포솜을 조제한 후, 시료의 pH를 높여 투석하여 리포솜 표면에 부착된 상기 RNA를 제거하여 제조된 리포솜(일본 특허 공표 제2002-501511호 공보 및 바이오키미카 에트 바이오피지카 악타(Biochimica et Biophysica Acta), 2001년, 제1510권, p. 152-166 참조), 리드 입자와 상기 RNA를 포함하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 봉입하는 지질 이중막으로 구성된 리포솜(국제 공개 제02/28367호 팜플렛 및 국제 공개 제2006/080118호 팜플렛 참조) 등을 들 수 있고, 리드 입자와 상기 RNA를 포함하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 봉입하는 지질 이중막으로 구성된 리포솜이 바람직하며, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이고, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것이 보다 바람직하다. 또한, 리포솜(A)으로서는, 바람직하게는 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막으로 구성되고, 상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 것인 리포솜도 예로 들 수 있으며, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이고, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명에서 분산이란 용해되지 않고 분산되는 것을 의미한다.
이들 예시한 리포솜은, 종양 또는 염증이 생긴 조직 또는 장기, 구체적으로는 고형 종양 및 고형암, 혈관 또는 혈관 근방의 염증 부위 등에 송달된다는 것이 보고되어 있고, 종양 또는 염증에 관련되는 유전자를 표적 유전자로 한 경우에, 보다 바람직하게 이용할 수 있는 리포솜으로서 들 수 있다.
또한, 이들 예시한 리포솜은, 혈액 중에서의 체류성이 높아진 리포솜으로서도 보고되어 있고, 어떠한 조직이나 장기에도 체순환을 통해 송달될 가능성이 높아져 있기 때문에, 표적으로 할 수 있는 유전자는 제한되지 않는다.
본 발명에서의 리드 입자로서는, 예컨대, 지질 집합체, 리포솜, 고분자 미셀 등인 미립자를 들 수 있고, 바람직하게는 리포솜인 미립자를 들 수 있다. 본 발명에서의 리드 입자는, 지질 집합체, 리포솜, 고분자 미셀 등을 2개 이상 조합한 복합체, 예컨대 지질 집합체, 리포솜 등의 구성 성분인 지질을 포함하는 복합체로서의 고분자 미셀, 고분자 미셀의 구성 성분인 고분자를 포함하는 복합체로서의 지질 집합체, 리포솜 등이어도 좋다.
리드 입자로서의 지질 집합체 또는 리포솜(이하 리포솜(B))은, 예컨대 지질 및/또는 계면활성제 등, 바람직하게는 지질 또는 지질 및 계면활성제에 의해 구성되는 것이 바람직하다. 상기 지질로서는, 단순 지질, 복합 지질 또는 유도 지질 중 어느 것이어도 좋고, 예컨대 인지질, 글리세로당지질, 스핑고당지질, 스핑고이드, 스테롤 또는 양이온성 지질 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 인지질 또는 양이온성 지질을 들 수 있다. 또한, 지질로서는, 예컨대 계면활성제(후기의 계면활성제와 동의) 또는 고분자(후기의 고분자와 동의, 구체적으로는 덱스트란 등) 또는 폴리옥시에틸렌 유도체(구체적으로는 폴리에틸렌글리콜 등) 등의 지질 유도체도 포함된다. 계면활성제로서는, 예컨대 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 또는 양성 계면활성제 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 인지질로서는, 예컨대 포스파티딜콜린(구체적으로는 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린 등), 포스파티딜에탄올아민(구체적으로는 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 등), 글리세로인지질(구체적으로는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 리소포스파티딜콜린 등), 스핑고인지질(구체적으로는 스핑고미엘린, 세라미드 포스포에탄올아민, 세라미드 포스포글리세롤, 세라미드 포스포글리세로인산 등), 글리세로포스포노지질, 스핑고포스포노지질, 천연 레시틴(구체적으로는 난황 레시틴, 대두 레시틴 등) 또는 수소 첨가 인지질(구체적으로는 수소 첨가 포스파티딜콜린 등) 등의 천연 또는 합성 인지질을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 글리세로당지질로서는, 예컨대 술폭시리보실 글리세리드, 디글리코실 디글리세리드, 디갈락토실 디글리세리드, 갈락토실 디글리세리드 또는 글리코실 디글리세리드 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 스핑고당지질로서는, 예컨대 갈락토실 세레브로시드, 락토실 세레브로시드 또는 강글리오시드 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 스핑고이드로서는, 예컨대 스핑간(sphingan), 이코사스핑간, 스핑고신 또는 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 유도체로서는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간 또는 스핑고신 등의 -NH2를 -NHCO(CH2)xCH3(식 중, x는 0∼18의 정수를 나타내고, 그 중에서도 6, 12 또는 18이 바람직함)으로 변환한 것 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 스테롤로서는, 예컨대 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고카스테롤, 푸코스테롤 또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol) 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 지질에서의 양이온성 지질로서는, 예컨대, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민(DODAP), N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄(DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스퍼민카복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로초산(DOSPA), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄(DMRIE) 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄(DORIE) 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 비이온성 계면활성제로서는, 예컨대 모노올레산폴리옥시에틸렌솔비탄(구체적으로는 폴리솔베이트 80 등), 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜(구체적으로는 플루로닉 F68 등), 솔비탄 지방산 에스테르(구체적으로는 솔비탄모노라우레이트, 솔비탄모노올레이트 등), 폴리옥시에틸렌 유도체(구체적으로는 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 등) 또는 글리세린 지방산 에스테르 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 음이온성 계면활성제로서는, 예컨대 아실사르코신, 알킬황산나트륨, 알킬벤젠술폰산염, 탄소수 7∼22의 지방산나트륨 등을 들 수 있다. 구체적으로는 도데실황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨 또는 타우로데옥시콜산나트륨 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 양이온성 계면활성제로서는, 예컨대 알킬아민염, 아실아민염, 제4차 암모늄염, 아민 유도체 등을 들 수 있다. 구체적으로는 염화 벤잘코늄, 아실아미노에틸디에틸아민염, N-알킬폴리알킬폴리아민염, 지방산 폴리에틸렌폴리아미드, 세틸트리메틸암모늄브롬화물, 도데실트리메틸암모늄브롬화물, 알킬폴리옥시에틸렌아민, N-알킬아미노프로필아민 또는 지방산 트리에탄올아민에스테르 등을 들 수 있다.
상기 리드 입자를 구성하는 양성 계면활성제로서는, 예컨대 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산 또는 N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술폰산 등을 들 수 있다.
리포솜(B)에서는, 이들 지질 및 계면활성제는, 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 이용되고, 바람직하게는 2종 이상 조합하여 이용된다. 2종 이상 조합하여 이용하는 경우의 조합으로서는, 예컨대 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린, 폴리에틸렌글리콜화 인지질 및 콜레스테롤로부터 선택되는 2 성분 이상의 조합, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 폴리에틸렌글리콜화 인지질 및 콜레스테롤로부터 선택되는 2 성분 이상의 조합, EPC와 DOTAP의 조합, EPC, DOTAP 및 폴리에틸렌글리콜화 인지질의 조합, EPC, DOTAP, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜화 인지질의 조합 등을 들 수 있다.
또한, 리포솜(B)은, 필요에 따라, 예컨대 콜레스테롤 등의 스테롤 등의 막 안정화제, 예컨대 토코페롤 등의 항산화제 등을 함유하고 있어도 좋다. 이들 안정화제는 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
지질 집합체로서는, 예컨대 구형 미셀, 구형 역 미셀, 소시지형 미셀, 소시지형 역 미셀, 판형 미셀, 판형 역 미셀, 헥사고날 I, 헥사고날 II 및 지질 2분자 이상으로 이루어지는 회합체, 에멀션 입자(예컨대 지방유제, 비이온성 계면활성제와 대두유로 이루어지는 에멀션, 지질 에멀션, 지질 나노스피어 등의 수중유형(O/W) 에멀션이나 수중유중수형(W/O/W) 에멀션 입자 등)를 들 수 있다.
고분자 미셀로서는, 예컨대 단백질, 알부민, 덱스트란, 폴리펙트(polyfect), 키토산, 덱스트란황산, 예컨대 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아스파라긴산, 스티렌말레산 공중합체, 이소프로필아크릴아미드-아크릴피롤리돈 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 수식 덴드리머, 폴리젖산, 폴리젖산폴리글리콜산 또는 폴리에틸렌글리콜화 폴리젖산 등의 고분자 또는 이들의 염 1 이상으로 이루어지는 미셀을 들 수 있다.
여기서, 고분자에서의 염은, 예컨대 금속염, 암모늄염, 산 부가염, 유기 아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 포함한다. 금속염으로서는, 예컨대 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염 또는 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로서는, 예컨대 암모늄 또는 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 산 부가염으로서는, 예컨대 염산염, 황산염, 질산염 또는 인산염 등의 무기산염, 및 초산염, 말레산염, 푸마르산염 또는 시트르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 유기 아민 부가염으로서는, 예컨대 모르폴린 또는 피페리딘 등의 부가염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로서는, 예컨대 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 글루탐산 또는 리신 등의 부가염을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서의 리드 입자는, 예컨대 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제 등을 함유할 수 있다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제는, 리드 입자로서 함유되어도 좋고, 리드 입자에 부가하여 이용하여도 좋다.
당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제로서는, 바람직하게는, 당지질, 또는 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제는, 분자의 일부가 리드 입자의 다른 구성 성분과 예컨대 소수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 가지며, 다른 부분이 리드 입자의 제조 시의 용매와 예컨대 친수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 갖는, 2면성을 갖는 물질인 것이 바람직하다.
당, 펩티드 또는 핵산의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 자당, 솔비톨, 젖당 등의 당, 예컨대 카세인 유래 펩티드, 난백 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드, 글루타티온 등의 펩티드, 또는 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA, ODN 등의 핵산과, 상기 리드 입자의 정의 중에서 예로 든 지질 또는 예컨대 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산, 라우르산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것 등을 들 수 있다.
또한, 당의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 상기 리드 입자의 정의 중에서 예로 든 글리세로당지질 또는 스핑고당지질 등도 포함된다.
수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로스, 덱스트란, 콘드로이틴황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀런, 올리고글리세롤 등 또는 이들의 유도체와, 상기 리드 입자의 정의 중에서 예로 든 지질, 또는 예컨대 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산 또는 라우르산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 폴리글리세린 유도체 등의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜화 지질(구체적으로는 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민(보다 구체적으로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DSPE) 등), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 크레모포어 이엘(CREMOPHOR EL) 등), 폴리에틸렌글리콜솔비탄지방산에스테르류(구체적으로는 모노올레산폴리옥시에틸렌솔비탄 등) 또는 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜화 지질을 들 수 있다.
폴리글리세린 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리글리세린화 지질(구체적으로는 폴리글리세린-포스파티딜에탄올아민 등) 또는 폴리글리세린지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리글리세린화 지질을 들 수 있다.
계면활성제로서는, 예컨대 상기 리드 입자의 정의 중에서 예로 든 계면활성제, 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 글리세린지방산에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있다.
상기한 리드 입자는 양전하를 갖는 것이 바람직하다. 여기서 기술하는, 양전하란, 상기 RNA 내의 전하, 분자 내 분극 등에 대하여 정전적 인력을 발생시키는 전하, 표면 분극 등을 포함한다. 리드 입자가 양전하를 갖기 위해서는, 리드 입자는, 양이온성 물질을 함유하는 것이 바람직하고, 리드 입자는, 양이온성 지질을 함유하는 것이 보다 바람직하다.
리드 입자에 함유되는 양이온성 물질은, 양이온성을 나타내는 물질이지만, 양이온성 기와 음이온성 기 둘 다를 갖는 양성의 물질이어도, pH나, 다른 물질과의 결합 등에 의해 상대적인 음성도가 변화하기 때문에, 그때그때에 따라 양이온성 물질로 분류될 수 있는 것도 포함된다. 이들 양이온성 물질은, 리드 입자로서 함유되어도 좋고, 리드 입자에 부가하여 이용하여도 좋다.
양이온성 물질로서는, 예컨대 상기한 리드 입자의 정의에서 예시한 것 중의 양이온성 물질[구체적으로는, 지질에서의 양이온성 물질, 양이온성 계면활성제(상기와 동의), 양이온성 고분자 등], 등전점 이하의 값의 pH에서 양이온성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상을 들 수 있다.
지질에서의 양이온성 물질로서는, 예컨대 DOTAP, DODAP, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DORIE 또는 DC-Chol 등을 들 수 있다.
양이온성 고분자로서는, 예컨대 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리펙트(polyfect) 또는 키토산 등을 들 수 있다.
등전점 이하의 값의 pH에서 양이온성을 나타내는 단백질 또는 펩티드로서는, 그 물질의 등전점 이하의 값의 pH에서 양이온성을 나타내는 단백질 또는 펩티드이면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 단백질 또는 펩티드로서는, 예컨대, 알부민, 오로소뮤코이드, 글로불린, 피브리노겐, 펩신 또는 리보뉴클레아제 T1 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 리드 입자는, 공지의 제조 방법 또는 그에 준하여 제조할 수 있고, 어떠한 제조 방법으로 제조된 것이어도 좋다. 예컨대, 리드 입자의 하나인 리포솜(B)의 제조에는, 공지의 리포솜의 조제 방법을 적용할 수 있다. 공지의 리포솜의 조제 방법으로서는, 예컨대 뱅검(Bangham) 등의 리포솜 조제법["저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.)", 1965년, 제13권, p. 238-252 참조], 에탄올 주입법["저널 오브 셀 바이올로지(J. Cell Biol.)", 1975년, 제66권, p. 621-634 참조], 프렌치프레스법["에프이비에스 레터즈(FEBS Lett.)", 1979년, 제99권, p. 210-214 참조], 동결 융해법["아카이브스 오브 바이오케미스트리 앤드 바이오피직스(Arch. Biochem. Biophys.)", 1981년, 제212권, p. 186-194 참조], 역상 증발법["프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)", 1978년, 제75권, p. 4194-4198 참조] 또는 pH 구배법(예컨대 일본 특허 제2572554호 공보, 일본 특허 제2659136호 공보 등 참조) 등을 들 수 있다. 리포솜(B)의 제조 시에 리포솜(B)을 분산시키는 용액으로서는, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리적 식염액 또는 아미노산 수액 등을 이용할 수 있다. 또한, 리포솜(B)의 제조 시에는, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 시스테인 또는 에틸렌디아민4초산(EDTA) 등의 항산화제, 예컨대 글리세린, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제 등의 첨가도 가능하다. 또한, 지질 등을 예컨대 에탄올 등의 유기 용매에 용해하고, 용매를 유거한 후, 생리식염수 등을 첨가, 진탕 교반하여, 리포솜을 형성시킴으로써도 리포솜(B)을 제조할 수 있다.
또한, 예컨대 비이온성 계면활성제(상기와 동의), 양이온성 계면활성제(상기와 동의), 음이온성 계면활성제(상기와 동의), 고분자, 폴리옥시에틸렌 유도체 등에 의한 리포솜(B) 등의 리드 입자의 표면 개질도 임의로 행할 수 있다[라직(D. D. Lasic), 마틴(F. Martin) 편저, "스텔스 리포솜즈(Stealth Liposomes)"(미국), 씨알씨 프레스 잉크(CRC Press Inc), 1995년, p. 93-102 참조]. 표면 개질에 사용할 수 있는 고분자로서는, 예컨대 덱스트란, 풀런, 만난, 아밀로펙틴 또는 하이드록시에틸전분 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 유도체로서는, 예컨대 폴리솔베이트 80, 플루로닉 F68, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 또는 PEG-DSPE 등을 들 수 있다. 리포솜(B) 등의 리드 입자의 표면 개질은, 리드 입자에 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제를 함유시키는 방법 중 하나에 의해서도 행할 수 있다.
리포솜(B)의 평균 입자경은, 원하는 대로 자유롭게 선택할 수 있지만, 하기하는 리드 입자경으로 하는 것이 바람직하다. 리포솜(B)의 평균 입자경을 조절하는 방법으로서는, 예컨대 익스트루전법, 큰 다중막 리포솜(MLV)을 기계적으로 분쇄(구체적으로는 맨톤 가울린(manton gaulin), 마이크로플루이다이저 등을 사용)하는 방법[뮬러(R. H. Muller), 베니타(S. Benita), 봄(B. Bohm) 편저, "에멀션 앤드 나노서스펜션즈 포 더 포뮬레이션 오브 풀리 솔러블 드럭스(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)", 독일, 사이언티픽 퍼블리셔즈 슈투트가르트(Scientific Publishers Stuttgart), 1998년, p. 267-294 참조] 등을 들 수 있다.
또한, 리드 입자인, 예컨대 지질 집합체, 리포솜(B), 고분자 미셀 등으로부터 선택되는 2개 이상을 조합시킨 복합체의 제조 방법은, 예컨대 수중에서 지질, 고분자 등을 혼합할 뿐이어도 좋고, 원하는 대로 정립 공정이나 무균화 공정 등을 추가로 부가할 수도 있다. 또한, 상기 복합체의 제조는 예컨대 아세톤 또는 에테르 등 여러 가지의 용매 중에서 행하는 것도 가능하다.
본 발명에서의 리드 입자의 크기는, 평균 입자경이 수㎚∼수십㎛인 것이 바람직하고, 약 10 ㎚∼1,000 ㎚인 것이 보다 바람직하며, 약 50 ㎚∼300 ㎚인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서의 리드 입자와 RNA를 포함하는 복합 입자를 피복하는 지질 이중막의 구성 성분으로서는, 예컨대 상기 리드 입자의 정의 중에서 예로 든 지질 또는 계면활성제 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 지질 또는 계면활성제 중의 중성 지질을 들 수 있다. 여기서, 상기 중성 지질이란, 지질 또는 계면활성제 중의, 상기 리드 입자가 양전하를 갖는 경우에서의 양이온성 물질 중에서 예로 든 지질에서의 양이온성 물질과 양이온성 계면활성제 및 후기하는 부착 경합제 중에서 예로 든 음이온성 지질과 음이온성 계면활성제를 제외한 것을 말하며, 중성 지질로서 보다 바람직하게는, 인지질, 글리세로당지질 또는 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 인지질을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 EPC를 들 수 있다. 이들 지질 또는 계면활성제는 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜 이용할 수 있다.
또한, 복합 입자를 피복하는 지질 이중막의 구성 성분은, 극성 유기 용매에 가용인 것이 바람직하고, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액 중에는, 분산 가능한 것이 바람직하다. 특정 농도로 상기 극성 용매를 포함하는 액 중의 상기 극성 용매의 농도는, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 분산 가능하며, 상기 복합 입자도 분산 가능한 농도가 바람직하다. 상기 극성 유기 용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 2-프로판올, n-부탄올, 2-부탄올, tert-부탄올 등의 알코올, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 알코올이 바람직하며, 에탄올이 보다 바람직하다.
본 발명에서의 극성 유기 용매를 포함하는 액 중의, 극성 유기 용매 이외의 용매로서는, 예컨대, 물, 액체 이산화탄소, 액체 탄화수소, 할로겐화 탄소 또는 할로겐화 탄화수소 등을 들 수 있고, 바람직하게는 물을 들 수 있다. 또한, 이온 또는 완충 성분 등을 포함하고 있어도 좋다. 용매는 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있지만, 2종 이상 이용하는 경우는, 상용하는 조합이 바람직하다.
또한, 복합 입자를 피복하는 지질 이중막에 이용되는 지질로서는, 예컨대 합성 지질 등도 바람직하게 예로 들 수 있다. 합성 지질로서는, 예컨대 불소 첨가 포스파티딜콜린, 불소 첨가 계면활성제 또는 브롬화 디알킬암모늄 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 다른 지질 등과 조합하여 이용되어도 좋다.
또한, 복합 입자를 피복하는 지질 이중막은, 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체 또는 상기 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예컨대 상기 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체, 또는 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지방족 탄화수소 유도체를 들 수 있다. 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체로서는, 상기 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 보다 바람직하고, 상기 폴리에틸렌글리콜화 인지질이 보다 바람직하며, 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명에서의 수용성 물질의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 수용성 물질과, 예컨대 장쇄 지방족 알코올, 폴리옥시프로필렌알킬 또는 글리세린지방산에스테르의 알코올성 잔기 등이 결합하여 이루어지는 것을 들 수 있다.
당, 펩티드 또는 핵산의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예컨대 자당, 솔비톨 또는 젖당 등의 당, 예컨대 카세인 유래 펩티드, 난백 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드 또는 글루타티온 등의 펩티드, 또는 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA 또는 ODN 등의 핵산의 지방족 탄화수소 유도체를 들 수 있다.
수용성 고분자의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로스, 덱스트란, 콘드로이틴황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀런, 올리고글리세롤 등 또는 이들의 유도체의 지방족 탄화수소 유도체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체 또는 폴리글리세린 유도체 등의 지방족 탄화수소 유도체를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 지방족 탄화수소 유도체를 들 수 있다.
리드 입자가 리포솜(B)인 미립자인 경우, 리포솜(B)과 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 것이 리포솜(A)이 되고, 그 구성으로부터 협의의 리포솜으로 분류되며, 리드 입자가 리포솜(B)인 미립자 이외인 경우에도, 지질 이중막으로 피복되어 있기 때문에, 광의의 리포솜으로 분류된다. 본 발명에서, 리드 입자가 리포솜(B)인 미립자인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서의 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자는, 상기 리드 입자 제조 후 또는 상기 리드 입자 제조와 동시에, 상기 RNA를 리드 입자에 부착 또는 봉입하여 복합 입자를 제조할 수 있고, 또한 상기 복합 입자 제조 후 또는 복합 입자 제조와 동시에, 지질 이중막으로 상기 복합 입자를 피복함으로써 리포솜(A)을 제조할 수 있다. 리포솜(A)은, 예컨대, 일본 특허 공표 제2002-508765호 공보, 일본 특허 공표 제2002-501511호 공보, "바이오키미카 에트 바이오피지카 악타(Biochimica et Biophysica Acta)", 2001년, 제1510권, p. 152-166, 국제 공개 제02/28367호 팜플렛 등의 공지의 제조 방법 또는 그것에 준하여 제조하거나, 예컨대 리드 입자에 상기 RNA를 부착 또는 봉입하여 복합 입자를 제조한 후, 상기 복합 입자 및 피복층 성분을, 상기 피복층 성분이 가용인 극성 유기 용매를 포함하는, 상기 복합 입자가 용해되지 않고, 상기 피복층 성분이 분산 상태로 존재하는 것이 가능한 농도의 액 중에 분산시키는 공정 및 상기 복합 입자를 상기 피복층 성분으로 피복하는 공정을 포함하는 제조 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에서의 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자는, 리드 입자를 수중에서 제조하고, 상기 리드 입자 제조 후 또는 상기 리드 입자 제조와 동시에 상기 RNA를 물에 분산 또는 용해하여 혼합하고, 상기 RNA를 리드 입자에 부착 또는 봉입시킴으로써 복합 입자를 제조하거나, 또는 리드 입자를 임의의 용매 중에서 제조한 후, 상기 리드 입자를 수중에 분산시키고, 상기 RNA를 수중에 분산 또는 용해하여 혼합하고, 리드 입자에 상기 RNA를 부착시킴으로써 제조하는 것이 바람직하고, 리드 입자를 수중에서 제조하고, 상기 리드 입자를 제조한 후, 상기 RNA를 물에 분산 또는 용해하여 혼합하고, 리드 입자에 상기 RNA를 부착시킴으로써 제조하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물에서의 리포솜(A)의 바람직한 제조 방법으로서는, 이하의 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자를 제조하는 공정(공정 1) 및 상기 복합 입자를 지질 이중막으로 피복하는 공정(공정 2 또는 공정 3)을 포함하는 제조 방법을 들 수 있다.
공정 1) 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 하는 복합 입자를 제조하는 공정
리드 입자를, 예컨대 물 등의 용매 중에 분산시키고, 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA를 분산 또는 용해하여 함유시켜 혼합하여, 리드 입자에 상기 RNA를 부착시키는 것이 바람직하다. 공정 1에서, 리드 입자의 응집을 억제하기 위해, 리드 입자는 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자인 것이 바람직하다. 응집 억제 물질로서는, 상기 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제를 바람직하게 들 수 있다. 또한, 리드 입자가, 양전하를 갖는 것인 경우, 리드 입자가 분산된 액 중에서, 상기 RNA와 부착 경합제를 공존시켜, 부착 경합제를 상기 RNA와 함께 리드 입자에 부착시켜도 좋고, 또한 리드 입자가 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자인 경우에도, 리드 입자의 응집을 보다 억제시키기 위해 부착 경합제를 이용하여도 좋다. 리드 입자와 상기 RNA의 조합으로서는, 복합 입자가 극성 유기 용매를 함유하는 액에 분산 가능해지는 조합을 선택하는 것이 바람직하고, 극성 유기 용매에 대한 복합 입자의 용해도가, 공정 2 또는 3에서 이용하는 지질 이중막의 구성 성분의 그것보다도 낮은 것이 보다 바람직하며, 또한, 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액 중에, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 분산 가능하고, 상기 복합 입자도 분산 가능한 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액이 존재하는 조합을 선택하는 것이 보다 바람직하다.
부착 경합제로서는, 예컨대 음이온성 물질 등을 들 수 있다. 상기 음이온성 물질은, 분자 내의 전하, 분자 내 분극 등에 의한 정전적 인력에 의해, 리드 입자에 정전적으로 부착되는 물질을 포함한다. 부착 경합제로서의 음이온성 물질은, 음이온성을 나타내는 물질이지만, 음이온성 기와 양이온성 기 둘 다를 갖는 양성의 물질이어도, pH나, 다른 물질과의 결합 등에 의해 상대적인 음성도가 변화하기 때문에, 그때그때에 따라 음이온성 물질로 분류될 수 있다.
음이온성 물질로서는 음이온성 지질, 음이온성 계면활성제(상기와 동의), 음이온성 고분자 등 또는 등전점 이상의 값의 pH에서 음이온성을 나타내는 단백질, 펩티드 또는 핵산 등을 들 수 있고, 바람직하게는 덱스트란황산, 덱스트란황산나트륨, 콘드로이틴황산, 콘드로이틴황산나트륨, 히알루론산, 콘드로이틴, 더마탄황산, 헤파란황산, 헤파린, 케라탄황산 또는 음이온성 덱스트란플루오레세인 등을 들 수 있다. 이들 음이온성 물질은 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜 이용할 수 있다.
음이온성 지질로서는, 예컨대 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 또는 포스파티드산 등을 들 수 있다.
음이온성 고분자로서는, 예컨대 폴리아스파라긴산, 스티렌말레산 공중합체, 이소프로필아크릴아미드-아크릴피롤리돈 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 수식 덴드리머, 폴리젖산, 폴리젖산폴리글리콜산, 폴리에틸렌글리콜화 폴리젖산, 덱스트란황산, 덱스트란황산나트륨, 콘드로이틴황산, 콘드로이틴황산나트륨, 히알루론산, 콘드로이틴, 더마탄황산, 헤파란황산, 헤파린, 케라탄황산 또는 음이온성 덱스트란플루오레세인 등을 들 수 있다.
등전점 이상의 값의 pH에서 음이온성을 나타내는 단백질 또는 펩티드로서는, 그 물질의 등전점 이상의 값의 pH에서 음이온성을 나타내는 단백질 또는 펩티드이면, 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 알부민, 오로소뮤코이드, 글로불린, 피브리노겐, 히스톤, 프로타민, 리보뉴클레아제 또는 리소자임 등을 들 수 있다.
음이온성 물질로서의 핵산으로서는, 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA 또는 ODN 등을 들 수 있고, 생리 활성을 나타내지 않는 것이면, 어떤 길이의 어떤 서열의 것이어도 좋다.
부착 경합제는, 리드 입자에 정전적으로 부착하는 것이 바람직하고, 리드 입자에 부착되어도 리드 입자를 응집시키는 것과 같은 가교를 형성하지 않는 크기의 물질이거나, 분자 내에 부착되는 부분과, 부착에 반발하여 리드 입자의 응집을 억제하는 부분을 갖는 물질인 것이 바람직하다.
공정 1은, 보다 구체적으로는, 예컨대 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자가 분산된 액을 제조하는 조작 및 상기 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA를 분산 또는 용해하여 함유시키는 조작(예컨대 상기 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA를 첨가하여 분산 또는 용해시키는 조작, 상기 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA가 분산 또는 용해된 액을 첨가하는 조작 등)을 포함하는 제조 방법에서 실시할 수 있다. 여기서, 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA를 분산 또는 용해하여 함유시키는 공정에 의해 얻어지는 복합 입자로서는, 구체적으로는, 양이온성 물질을 함유하는 리포솜(B)인 미립자에 상기 RNA가 부착되어 형성되는 복합 입자, 양이온성 물질을 함유하는 지질 집합체인 미립자에 상기 RNA가 부착되어 형성되는 복합 입자, 폴리-L-리신 등의 양이온성 고분자를 함유하는 고분자인 미립자에 상기 RNA가 부착되어 형성되는 복합 입자를 들 수 있다. 또한, 리드 입자가 분산된 액 중에, 상기 RNA를 분산 또는 용해하여 함유시키는 조작이, 상기 RNA가 분산 또는 용해된 액에 부착 경합제를 추가로 함유시켜, 이것을 상기 리드 입자가 분산된 액 중에 첨가하는 조작인 것이 바람직하고, 이 경우, 상기 리드 입자에, 상기 RNA와 상기 부착 경합제가 함께 부착되어 복합 입자가 제조되며, 상기 복합 입자의 제조 중에 있어서의 리드 입자의 응집도, 제조 후에 있어서의 복합 입자의 응집도 보다 억제되어 제조될 수 있다.
리드 입자의 리드 입자가 분산되는 액에 대한 비율은, 리드 입자에 상기 RNA가 부착할 수 있으면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 약 1 ㎍/mL∼1 g/mL인 것이 바람직하고, 약 0.1∼500 ㎎/mL인 것이 보다 바람직하다.
공정 2) 복합 입자를 지질 이중막으로 피복하는 공정(1)
공정 1에서 얻어진 복합 입자가 분산되고, 또한 지질 이중막의 구성 성분이 용해된 극성 유기 용매를 포함하는 액(액(A))을 조제하는 조작, 계속해서, 액(A) 중의 극성 유기 용매의 농도를 감소시킴으로써, 복합 입자를 지질 이중막으로 피복하는 조작을 포함하는 제조 방법에 의해 리포솜(A)을 제조할 수 있다. 이 경우, 리포솜(A)은 분산액(액(B))의 형태로 얻어진다. 액(A)에서의 용매는, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 가용이며, 상기 복합 입자가 분산 가능한 극성 유기 용매의 농도의 상기 극성 유기 용매를 포함하는 용매이고, 액(A) 중의 극성 유기 용매의 농도를 감소시킨 액(B)에서는, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 분산 가능하며, 상기 복합 입자도 분산 가능한 것이 바람직하다. 액(A) 중의 용매가, 극성 유기 용매와 극성 유기 용매 이외의 용매와의 혼합액인 경우, 예컨대 상기 극성 유기 용매와 혼합 가능한 극성 유기 용매 이외의 용매를 포함하는 용매(액(C))를 첨가하는 것, 및/또는, 증발 유거, 반투막 분리, 분류 등에 의해, 선택적으로 극성 유기 용매를 제거함으로써, 극성 유기 용매의 농도를 감소시킬 수 있다. 여기서, 액(C)는, 극성 유기 용매 이외의 용매를 포함하는 액이 바람직하지만, 극성 유기 용매도 액(A)에서의 극성 유기 용매의 농도보다 낮으면 포함하고 있어도 좋다.
공정 2에서의 극성 유기 용매 이외의 용매로서는, 예컨대, 물, 액체 이산화탄소, 액체 탄화수소, 할로겐화 탄소 또는 할로겐화 탄화수소 등을 들 수 있고, 바람직하게는 물을 들 수 있다. 또한, 액(A) 및 액(C)는, 이온 또는 완충 성분 등을 포함하고 있어도 좋다. 이들 용매는 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜 이용할 수 있다.
극성 유기 용매와 극성 유기 용매 이외의 용매의 조합은, 서로 혼합 가능한 조합인 것이 바람직하고, 액(A) 및 액(B) 중의 용매 및 액(C)에 대한, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분의 용해도 등을 고려하여 선택할 수 있다. 복합 입자에 대해서는, 액(A) 및 액(B) 중의 용매 및 액(C) 중 어느 것에 대한 용해도도 낮은 것이 바람직하고, 또한 극성 유기 용매 및 극성 유기 용매 이외의 용매 중 어느 것에 대한 용해도도 낮은 것이 바람직하며, 지질 이중막의 구성 성분은, 액(B) 중의 용매 및 액(C)에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하고, 액(A) 중의 용매에 대한 용해도가 높은 것이 바람직하며, 또한 극성 유기 용매에 대한 용해도가 높은 것이 바람직하고, 극성 유기 용매 이외의 용매에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하다. 여기서, 「복합 입자의 용해도가 낮다」란, 복합 입자에 함유되는 리드 입자, RNA 및 부착 경합제 등의 각 성분의, 용매 중에서의 용출성이 작은 것이며, 각 성분의 각각의 용해도가 높아도 각 성분 간의 결합 등에 의해 각 성분의 용출성이 작아져 있으면 된다. 예컨대, 리드 입자에 포함되는 성분 중 어느 하나의 액(A) 중의 용매에 대한 용해도가 높은 경우에도, 리드 입자가 양전하를 갖는 경우, RNA 내의 전하, 분자 내 분극 등과 정전적으로 결합함으로써 복합 입자 중의 성분의 용출이 억제되며, 복합 입자의 액(A) 중의 용매에 대한 용해도를 낮게 하는 것이 가능하다. 즉, 리드 입자가 양전하를 갖는 것은, 리포솜(A)의 제조에서, 복합 입자의 성분의 용출을 억제하며, 제조성과 수율을 향상시키는 효과도 구비하고 있다.
액(A)에서의 극성 유기 용매의 농도는, 지질 이중막의 구성 성분이 가용이며, 복합 입자가 분산 가능하면 특별히 한정되는 것은 아니고, 이용하는 용매나 복합 입자, 지질 이중막의 구성 성분의 종류 등에 따라 다르지만, 바람직하게는 약 30 v/v% 이상, 보다 바람직하게는 약 60∼90 v/v%이다. 또한, 액(B)에서의 극성 유기 용매의 농도는, 액(A)보다도 낮은 농도이며 상기 극성 유기 용매를 포함하고, 지질 이중막의 구성 성분이 분산 가능하며, 복합 입자도 분산 가능하면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 약 50 v/v% 이하이다.
액(A)를 조제하는 공정으로서는, 극성 유기 용매, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분, 필요에 따라 극성 유기 용매 이외의 용매를 혼합하여 액(A)를 조제하는 공정을 들 수 있다. 극성 유기 용매, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분, 필요에 따라 극성 유기 용매 이외의 용매는, 복합 입자가 용해되지 않으면, 이들을 첨가하는 순서에 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는, 예컨대 상기 복합 입자가 분산된 극성 유기 용매를 포함하는 액(액(D))을 조제하고, 액(D) 중의 극성 유기 용매와 동일 또는 다른 극성 유기 용매를 포함하는 용매에 상기 지질 이중막의 구성 성분을 용해시킨 액(액(E))을 조제하여, 액(D)와 액(E)를 혼합하여 조제하는 공정을 들 수 있다. 액(D)와 액(E)를 혼합하여 액(A)를 조제하는 때에는, 서서히 혼합하는 것이 바람직하다.
공정 3) 복합 입자를 지질 이중막으로 피복하는 공정(2)
공정 1에서 얻어진 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분을, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 가용인 극성 유기 용매를 포함하며 상기 지질 이중막의 구성 성분이 분산 상태로 존재하는 것이 가능한 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액(액(F)) 중에 분산시키는 조작을 포함하는 제조 방법으로 리포솜(A)을 제조할 수 있고, 이 경우, 리포솜(A)은 분산액의 상태로 얻어진다. 또한, 액(F)는, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 가용인 극성 유기 용매를 포함하지만, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가 함께 분산 가능한 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액이다.
액(F)의 조제 방법은 어떠한 형태도 취할 수 있다. 예컨대 복합 입자의 분산액과, 지질 이중막의 구성 성분의 용해액 또는 분산액을 조제한 후, 양액을 혼합하여 액(F)를 조제하여도 좋고, 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분 중 어느 한쪽의 분산액을 조제하고, 그 분산액에, 고체 상태의 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분의 나머지 한쪽을 첨가하여 분산시켜 액(F)를 조제하여도 좋다. 복합 입자의 분산액과, 지질 이중막의 구성 성분의 용해액 또는 분산액을 혼합하는 경우에는, 복합 입자의 분산매는, 미리 극성 유기 용매를 포함하고 있어도 좋고, 지질 이중막의 구성 성분의 용매 또는 분산매는 극성 유기 용매를 포함하는 액 또는 극성 유기 용매만으로 구성되는 액이어도 좋다. 한편, 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분 중 어느 한쪽의 분산액을 조제하고, 상기 분산액에, 고체 상태의 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분의 나머지 한쪽을 첨가하는 경우에는, 상기 분산액은, 극성 유기 용매를 포함하는 액인 것이 바람직하다. 또한, 액(F)를 조제한 후에 복합 입자가 용해되지 않고, 지질 이중막의 구성 성분이 분산되어 있는 경우에는, 복합 입자가 용해되지 않고, 지질 이중막의 구성 성분이 분산되는 극성 유기 용매 농도의 범위이면 극성 유기 용매를 첨가하여도 좋고, 극성 유기 용매를 제거하여도 좋으며, 또는 농도를 감소시켜도 좋다. 한편, 액(F)를 조제한 후에 복합 입자는 용해되고 있지 않지만, 지질 이중막의 구성 성분이 용해되어 있는 경우에는, 복합 입자가 용해되지 않고, 지질 이중막의 구성 성분이 분산되는 극성 유기 용매 농도의 범위에서 극성 유기 용매를 제거하거나 또는 농도를 감소시키면 좋다. 또한, 복합 입자와 지질 이중막의 구성 성분을 미리 극성 유기 용매 이외의 용매 중에서 혼합하고, 그곳에 복합 입자가 용해되지 않고, 지질 이중막의 구성 성분이 분산되는 극성 유기 용매 농도의 범위에서 극성 유기 용매를 첨가하여도 좋다. 그 경우에는, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분 각각을 극성 유기 용매 이외의 용매 중에 분산시키고, 양 분산액을 혼합한 후에, 극성 유기 용매를 첨가하여도 좋고, 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분 중 어느 한쪽을 극성 유기 용매 이외의 용매 중에 분산시키고, 그 분산액에, 고체 상태의 복합 입자 또는 지질 이중막의 구성 성분의 나머지 한쪽을 첨가하여 분산시킨 후에, 극성 유기 용매를 첨가하여도 좋다. 또한, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분이 분산되고, 극성 유기 용매를 함유하는 액을, 복합 입자가 지질 이중막으로 피복되는 데 충분한 시간 동안 정치 또는 혼합하는 조작을 포함하는 것이 바람직하다. 복합 입자와 지질 이중막의 구성 성분을, 극성 유기 용매를 함유하는 액 중에 분산시킨 후, 정치 또는 혼합하는 시간은, 복합 입자 및 지질 이중막의 구성 성분을, 극성 유기 용매를 함유하는 액 중에 분산시킨 후에 순간적으로 종료시키는 것이 아니면 제한은 없지만, 지질 이중막의 구성 성분이나, 극성 유기 용매를 함유하는 액의 종류에 따라 임의로 설정할 수 있고, 얻어진 리포솜(A)의 수율이 정상량이 되는 시간을 설정하는 것이 바람직하며, 예컨대 약 3초∼30분이다.
액(F)에서의 극성 유기 용매 이외의 용매로서는, 예컨대 공정 2에서의 극성 유기 용매 이외의 용매로 예시한 것을 들 수 있고, 바람직하게는 물을 들 수 있다.
액(F)에서의 극성 유기 용매의 농도는, 복합 입자와, 지질 이중막의 구성 성분이 함께 분산되어 있는 조건만 만족하고 있으면 특별히 한정되는 것이 아니며, 이용하는 용매나 복합 입자, 지질 이중막의 구성 성분의 종류 등에 따라 다르지만, 바람직하게는 약 1∼80 v/v%, 보다 바람직하게는 약 10∼60 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 20∼50 v/v%, 가장 바람직하게는 약 30∼40 v/v%이다.
본 발명에서, 「지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 대하여 가용」이란, 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 용해되는 성질을 갖는 경우, 가용화제 등을 이용함으로써 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 용해되는 성질을 갖는 경우, 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매 중에서 응집체 또는 미셀 등을 형성하여 유탁 또는 에멀션화할 수 있는 성질을 갖는 경우 등을 포함한다. 또한, 「지질 이중막의 구성 성분이 분산된다」란, 지질 이중막의 구성 성분의 전부가 응집체 또는 미셀 등을 형성하여 유탁 또는 에멀션화하고 있는 상태, 지질 이중막의 구성 성분의 일부가 응집체 또는 미셀 등을 형성하여 유탁 또는 에멀션화하고, 나머지 부분이 용해되고 있는 상태, 지질 이중막의 구성 성분의 일부가 응집체 또는 미셀 등을 형성하여 유탁 또는 에멀션화하고, 나머지 부분이 침전되고 있는 상태 등을 포함한다. 또한, 「지질 이중막의 구성 성분이 용해된다」란, 지질 이중막의 구성 성분의 전부가 응집체 또는 미셀 등을 형성하여 유탁 또는 에멀션화하고 있는 상태를 포함하지 않는다.
본 발명에서, 「복합 입자가 분산된다」란, 복합 입자가 현탁 또는 유탁 또는 에멀션화하고 있는 상태를 말하며, 복합 입자의 일부가 현탁 또는 유탁 또는 에멀션화하고, 나머지 부분이 용해되고 있는 상태, 복합 입자의 일부가 유탁 또는 에멀션화하고, 나머지 부분이 침전하고 있는 상태 등을 포함한다. 「복합 입자가 용해되지 않는다」란, 상기 「복합 입자가 분산된다」와 동의이다.
본 발명에서의 리포솜(A)의 제조 방법에서 이용되는, 극성 유기 용매 함유 수용액 중의 복합 입자의 농도는, 복합 입자를 지질 이중막으로 피복할 수 있으면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 약 1 ㎍/mL∼1 g/mL인 것이 바람직하고, 약 0.1∼500 ㎎/mL인 것이 보다 바람직하다. 또한, 이용되는 지질 이중막의 구성 성분의 농도는, 복합 입자를 피복할 수 있으면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 약 1 ㎍/mL∼1 g/mL인 것이 바람직하고, 약 0.1∼400 ㎎/mL인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 리포솜(A)에 대한 지질 이중막의 비율은, 중량비로 약 1:0.1∼1:1,000이 바람직하고, 약 1:1∼1:10이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명에서의 리포솜(A)의 크기는, 평균 입자경이 약 300 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 약 200 ㎚ 이하인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로는, 예컨대 주사 가능한 크기인 것이 바람직하다.
또한, 상기에서 얻어지는 리포솜(A)에 항체 등의 단백질, 당류, 당지질, 아미노산, 핵산, 여러 가지 저분자 화합물 또는 고분자 화합물 등의 물질에 의한 수식을 행할 수도 있고, 이들에서 얻어지는 피복 복합 입자도 리포솜(A)에 포함된다. 예컨대, 타겟팅에 응용하기 위해, 상기에서 얻어지는 리포솜(A)에 대하여, 항체 등의 단백질, 펩티드 또는 지방산류 등에 의한 지질 이중막의 표면 수식을 추가로 행할 수도 있다[라직(D. D. Lasic), 마틴(F. Martin) 편저, "스텔스 리포솜즈(Stealth Liposomes)"(미국), 씨알씨 프레스 잉크(CRC Press Inc), 1995년, p. 93-102 참조]. 또한, 리포솜(A)에 예컨대 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체에 의한 표면 개질도 임의로 행할 수 있고, 이들 표면 개질에 이용되는 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체는, 상기 지질 이중막의 구성 성분으로서의 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체와 동의이다.
본 발명의 조성물은, 인간을 포함하는 포유동물에게 투여하는 것에 의해, 상기 RNA가 표적 유전자의 발현 부위에 송달되면, 생체내에서 포유류의 세포에, 유전자의 발현을 억제하는 RNA 등을 도입할 수 있어, 유전자 등의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 조성물에서의 표적 유전자가, 예컨대 종양 또는 염증에 관련되는 유전자이면, 본 발명의 조성물을, 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제, 바람직하게는 고형암 또는 혈관 또는 혈관 근방의 염증의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물에서의 표적 유전자가, 혈관신생에 관련되는 유전자 등이면, 혈관 평활근의 증식이나 혈관신생 등을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 조성물을, 예컨대 혈관 평활근의 증식이나 혈관신생을 수반하는 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 설명한 본 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는, 암 또는 염증 질환의 치료 방법도 제공한다. 투여 대상은 인간인 것이 바람직하고, 암 또는 염증 질환에 걸린 인간이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은, 암 또는 염증 질환의 치료제 또는 예방제에 관한 생체내 스크리닝계에서 피오씨[POC(Proof of concept)] 취득의 툴로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물은, 예컨대 혈액 성분 등의 생체 성분(예컨대 혈액, 소화관 등) 중에서의 상기 RNA의 안정화, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성의 증대 등을 목적으로 하는 제제로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 의약품의 암 또는 염증 질환 등의 치료제 또는 예방제로서 사용하는 경우, 투여 경로로서는, 치료에 있어서 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하고, 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여 또는 경구 투여를 들 수 있으며, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 근육내 투여를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여량은, 투여 대상의 병상이나 연령, 투여 경로 등에 따라 다르지만, 예컨대 RNA로 환산한 1일 투여량이 약 0.1 ㎍∼1,000 ㎎이 되도록 투여하면 좋다.
정맥내 투여 또는 근육내 투여에 적당한 제제로서는, 예컨대 주사제를 들 수 있고, 전술한 방법에 따라 조제한 리포솜(A)의 분산액을 그대로 예컨대 주사제 등의 형태로서 이용하는 것도 가능하지만, 상기 분산액으로부터 예컨대 여과, 원심분리 등에 의해 용매를 제거하여 사용하는 것도, 상기 분산액을 동결 건조하여 사용하거나 또는 예컨대 만니톨, 락토스, 트레할로스, 말토스 또는 글리신 등의 부형제를 첨가한 분산액을 동결 건조하여 사용할 수도 있다.
주사제의 경우, 상기 리포솜(A)의 분산액 또는 상기 용매를 제거 또는 동결 건조한 리포솜(A)에, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리적 식염액 또는 아미노산 수액 등을 혼합하여 주사제를 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 시스테인 또는 EDTA 등의 항산화제 또는 글리세린, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제 등을 첨가하여 주사제를 조제하는 것도 가능하다. 또한, 예컨대 글리세린 등의 동결 보존제를 첨가하여 동결 보존할 수도 있다.
본 발명의 암 또는 염증 질환의 치료제로서는, 상기 설명한 본 발명의 조성물 중, RNA가 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X1)이라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X1')이라고 함)을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA이고, 리포솜(A)이 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜으로서, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 리포솜, 또는 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜으로서, 상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 리포솜인 경우의, 상기 리포솜을 함유하는 조성물을 들 수 있다. 본 발명의 암 또는 염증 질환의 치료제에서, 암으로서는, 바람직하게는 고형암을 들 수 있고, 염증 질환으로서는, 바람직하게는 혈관 또는 혈관 근방의 염증을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 설명한 본 발명의 조성물 중, RNA가 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)이라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 RNA이고, 리포솜(A)이 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜으로서, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 리포솜, 또는 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜으로서, 상기 지질 이중막이, 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 리포솜인 경우의, 상기 리포솜을 함유하는 조성물의, 암 또는 염증 질환의 치료제, 바람직하게는 고형암 또는 혈관 또는 혈관 근방의 염증의 치료제의 제조를 위한 용도도 제공한다.
다음에, 실시예 및 시험예에 의해, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것이 아니다.
[실시예 1]
실시예 1에서 이용한 RNA는, BCL2 유전자의 mRNA의 연속하는 19 염기의 서열(이하, 서열(X2)라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 서열(X2')이라고 함)을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 1), 안티센스: 5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 2)](이하, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.1이라고 함)이며, 서열(X2)및 상보 서열(X2')의 염기에 결합하는 리보스의 합계의 50%가 2'-O-메틸기로 치환된 리보스이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 Eurogentec사(벨기에)로부터 입수하여, 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
DOTAP(아반티 폴라 리피즈사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/증류수(오츠카세이야쿠사 제조)를 40 ㎎/16 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하고, 볼텍스 믹서로 진탕 교반하였다. 이 현탁액을 70℃에서 0.4 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코스터사 제조)에 10회, 0.2 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 3회, 0.1 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코닝사 제조)에 10회, 추가로 0.05 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 20회 통과시켰다. 동적 광 산란(Dynamic light scattering; DLS)으로 얻어진 리드 입자의 평균 입자경을 측정한 바, 73.01 ㎚였다.
한편, EPC(니혼유시사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/에탄올(와코쥰야쿠사 제조)/물을 15 ㎎/3.125 ㎎/0.625 mL/0.375 mL가 되도록 혼합하고, 지질 이중막의 구성 성분의 용액을 조제하였다.
얻어진 리드 입자의 분산액 0.875 mL에, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.1/물을 24 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하여 얻어진 수용액 0.2917 mL를 혼합하여 복합 입자를 조제하였다. 얻어진 복합 입자의 분산액을, 지질 이중막의 구성 성분의 용액 4.667 mL에 첨가하고, 계속해서 1.459 mL의 증류수를 첨가하며, 0.4667 mL의 지질 이중막의 구성 성분의 용액을 첨가한 후, 증류수 54.31 mL를 서서히 첨가하여, 에탄올의 농도가 5% 이하가 되도록 조정하였다. 얻어진 리포솜 현탁액의 초원심(80분간, 110,000×g, 25℃)을 행하고, 상청을 제거하였다. 발생한 침전을 약 5 mL의 생리식염수(오츠카세이야쿠사 제조)로 재현탁하였다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 92.89 ㎚였다. 또한, 리포솜 내의 2'-OMe BCL2siRNA Exp.1의 정량을 행한 바, 농도는 1.2460 ㎎/mL이며, 충전한 2'-OMe BCL2siRNA Exp.1의 양에 대한 회수율은 88.02%였다. 마지막으로 3.270 mL의 생리식염수를 첨가하고, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.1 농도를 0.75 ㎎/mL로 조정하여, 제제를 얻었다.
[비교예 1]
비교예 1에서 이용한 RNA는, 서열(X2) 및 상보 서열(X2')을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 3), 안티센스: 5'-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 4)](이하, BCL2siRNA Com.1이라고 함)이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 Eurogentec사(벨기에)로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
실시예 1과 동일하게 하여 얻어진 리드 입자의 분산액 0.5 mL에, BCL2siRNA Com.1의 24 ㎎/mL 수용액 0.1667 mL를 혼합하여 복합 입자를 조제하였다. 얻어진 복합 입자의 분산액을, 지질 이중막의 구성 성분의 용액 2.667 mL에 첨가하고, 계속해서 0.8334 mL의 증류수를 첨가하며, 0.2667 mL의 지질 이중막의 구성 성분의 용액을 첨가한 후, 증류수 31.03 mL를 서서히 첨가하여, 에탄올의 농도가 5% 이하가 되도록 조정하였다. 얻어진 리포솜 현탁액의 초원심(80분간, 110,000×g, 25℃)을 행하고, 상청을 제거하였다. 생긴 침전을 약 2 mL의 생리식염수(오츠카세이야쿠사 제조)로 재현탁하였다.
DLS에서 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 88.31 ㎚였다. 또한, 리포솜 내의 BCL2siRNA Com.1의 정량을 행한 바, 농도는 1.7332 ㎎/mL이며, 충전한 BCL2siRNA Com.1의 양에 대한 회수율은 90.09%였다. 마지막으로 0.3232 mL의 생리식염수를 첨가하고, BCL2siRNA Com.1 농도를 1.5 ㎎/mL로 조정하여, 제제를 얻었다.
[시험예 1]
실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 제제를, 웅성 Balb/c 마우스(6주령, 니혼쿠레아)에게, 약액(siRNA 농도 750 ㎍/mL) 200 μL를 꼬리 정맥으로부터, 7일간의 간격을 두고 2회 투여하였다(투여량은 150 ㎍/마우스). 2회째 투여 후, 투여 0.5, 3, 7 및 24시간 후에, 꼬리 동맥으로부터 1시점에 대해 10 μL의 혈액을 채취하고, 변성 용액(denaturing solution)(4 ㏖/L 구아니딘티오시아네이트, 25 m㏖/L 시트르산나트륨, 0.1 v/v% 2-머캅토에탄올, 0.5 w/v% 소듐 N-라우로일 사코신; 이하, D 용액이라고 함) 90 μL를 첨가하여 혼합하여, 10 v/v% 혈액으로 하였다.
실시예 1에서 얻어진 제제의 투여 군의 10 v/v% 혈액 10 μL에, 디에틸피로카보네이트 수용액(디에틸피로카보네이트를 초순수에 대하여 0.1 v/v%의 용량으로 첨가하여 혼합하였음) 10 μL, I.S. 용액(I.S.로서 농도가 0.3 μ㏖/L인 상기 디에틸피로카보네이트 수용액) 10 μL, D 용액 100 μL, 2 m㏖/L 초산나트륨(pH 4.0) 10 μL 및 TE(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 포화 페놀/클로로포름 용액(TE 포화 페놀과 클로로포름을 1/1의 용량비로 혼합한 후의 하층을 이용하였음) 150 μL를 첨가하여 혼합하고, 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상청 65 μL에 GenTLE 용액(GenTLE 침전 담체(precipitation carrier)(다카라 바이오)를 상기 디에틸피로카보네이트 수용액으로 15배 희석하였음) 15 μL를 첨가하여 혼합한 후, 에탄올 200 μL를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 10분간 이상 정치하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상청을 버리고, 침전에 75 v/v% 에탄올 200 μL를 첨가하였다. 4℃, 132,000×g에서 15분간 원심분리하고, 상청을 버려, 침전을 풍건한 후, 재용해액(디에틸피로카보네이트/트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물을 0.1/0.4/30/1,000의 용량비로 혼합하였음) 100 μL에 용해하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하고, 상청을 분석 시료로 하여, HPLC법으로 정량하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.
<장치>
HPLC 장치: ACQUITY UPLC 시스템(Waters)
질량 분석 장치: API4000 Q TRAP(Applied Biosystems/MDS Sciex)
해석 소프트웨어: Analyst 1.4.2(Applied Biosystems/MDS Sciex)
<HPLC 조건>
내표준물질(I.S.)
5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 5)
5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 6)
컬럼: Xbridge C 18(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 50 ㎜, Waters)
프리 필터: Xbridge guard cartridge(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 10 ㎜, Waters)
컬럼 온도: 65℃
이동층: 트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물(0.4/30/1,000):메탄올=93:7∼75:25
주입량: 25 μL
검출: 질량 분석 장치(이온화법: 전기분무 이온화, 네거티브, 이온원 온도: 500℃)
비교예 1에서 얻어진 제제의 투여 군의 10 v/v% 혈액 10 μL에, 디에틸피로카보네이트 수용액(디에틸피로카보네이트를 초순수에 대하여 0.1 v/v%의 용량으로 첨가하여 혼합하였음) 10 μL, I.S. 용액(I.S.로서 농도가 0.3 μ㏖/L인 상기 디에틸피로카보네이트 수용액) 10 μL, D 용액 100 μL, 2 m㏖/L 초산나트륨(pH 4.0) 10 μL 및 산성 포화 페놀/클로로포름 용액(산성 포화 페놀과 클로로포름을 1/1의 용량비로 혼합한 후의 하층을 이용하였음) 150 μL를 첨가하여 혼합하고, 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상청 65 μL에 GenTLE 용액(GenTLE 침전 담체(다카라 바이오)를 상기 디에틸피로카보네이트 수용액으로 15배 희석하였음) 15 μL를 첨가하여 혼합한 후, 에탄올 200 μL를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 10분간 이상 정치하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상청을 버리고, 침전에 75 v/v% 에탄올 200 μL를 첨가하였다. 4℃, 132,000×g에서 15분간 원심분리하고, 상청을 버려, 침전을 풍건한 후, 재용해액(디에틸피로카보네이트/트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물을 0.1/0.4/30/1,000의 용량비로 혼합하였음) 100 μL에 용해하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하고, 상청을 분석 시료로 하여, HPLC법으로 정량하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
<장치>
HPLC 장치: ACQUITY UPLC 시스템(Waters)
질량 분석 장치: API4000 Q TRAP(Applied Biosystems/MDS Sciex)
해석 소프트웨어: Analyst 1.4.2(Applied Biosystems/MDS Sciex)
<HPLC 조건>
내표준물질(I.S.)
5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG dTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 7)
5'-CAG GCA UGU UGA CUU CAC dTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 8)
컬럼: Xbridge C 18(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 50 ㎜, Waters)
프리 필터: Xbridge guard cartridge(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 10 ㎜, Waters)
컬럼 온도: 65℃
이동층: 트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물(0.4/30/1,000):메탄올=93:7∼75:25
주입량: 25 μL
검출: 질량 분석 장치(이온화법: 전기분무 이온화, 네거티브, 이온원 온도: 500℃)
본 발명은 간편하며 정밀도가 좋은 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법도 제공한다. 본 발명의 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법으로서는, 상기 시험예 1에 구체적으로 나타낸 바와 같이, 피검액 중의 siRNA를, 바람직하게는 피측정의 siRNA와 염기수가 다른 핵산을 IS로서 공존시켜, 핵산과 복합체를 형성하는 시약, 예컨대 GenTLE 용액을 첨가하여, 전기적으로 중성인 복합체를 형성시키고, 이 복합체를 분리한 후, 재용해액으로 용해하고, 얻어진 용액을 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석함으로써 siRNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법을 들 수 있다.
또한, 혈액 중의 siRNA 농도의 측정은, 본 발명의 혈액 중의 siRNA 농도의 측정 방법에 한정되는 것이 아니며, 통상법에 따라 혈액 중의 siRNA의 농도를 측정하여도 상관없다.
도 1 및 도 2로부터, 실시예 1에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에서는, 비교예 1에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에 비하여, RNA의 혈액 중 농도 추이가 높은 것을 나타내고 있다. 즉, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 본 발명의 조성물은, 혈중 체류성이 보다 개선되고, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성을 증대시킬 수 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 2]
실시예 2에서 이용한 RNA는, BCL2 유전자의 mRNA의 연속하는 19 염기의 서열(이하, 서열(X3)이라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X3')이라고 함)을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 9), 안티센스: 5'-mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 10)](이하, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.2라고 함)이며, 서열(X3) 및 상보 서열(X3')의 염기에 결합하는 리보스의 합계의 50%가 2'-O-메틸기로 치환된 리보스이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 홋카이도 시스템 사이언스로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
DOTAP(아반티 폴라 리피즈사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/증류수(오츠카세이야쿠사 제조)를 40 ㎎/16 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하고, 볼텍스 믹서로 진탕 교반하였다. 이 현탁액을 70℃에서 0.4 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코스터사 제조)에 10회, 0.2 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 3회, 0.1 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코닝사 제조)에 10회, 추가로 0.05 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 20회 통과시켰다. 동적 광 산란(DLS)으로 얻어진 리드 입자의 평균 입자경을 측정한 바, 70.71 ㎚였다.
한편, EPC(니혼유시사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/에탄올(와코쥰야쿠사 제조)/물을 15 ㎎/3.125 ㎎/0.625 mL/0.375 mL가 되도록 혼합하여, 지질 이중막의 구성 성분의 용액을 조제하였다.
얻어진 리드 입자의 분산액 0.225 mL에, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.2/물을 24 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하여 얻어진 수용액 0.075 mL를 혼합하여 복합 입자를 조제하였다. 얻어진 복합 입자의 분산액을, 지질 이중막의 구성 성분의 용액 1.2 mL에 첨가하고, 계속해서 0.375 mL의 증류수를 첨가하며, 추가로 EPC/PEG-DSPE를 62.5 ㎎/62.5 ㎎/mL가 되도록 40 vol% 에탄올에 용해한 용액 0.12 mL를 첨가한 후, 증류수 13.965 mL를 서서히 첨가하여, 에탄올의 농도가 5 vol% 이하가 되도록 조정하였다. 얻어진 리포솜 현탁액의 초원심(80분간, 110,000×g, 25℃)을 행하여, 상청을 제거하였다. 발생한 침전을 생리식염수(오츠카세이야쿠사 제조)로 재현탁하였다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 88.52 ㎚였다. 또한, 리포솜 내의 2'-OMe BCL2siRNA Exp.2의 정량을 행한 바, 농도는 2.307 ㎎/mL이며, 충전한 2'-OMe BCL2siRNA Exp.2의 양에 대한 회수율은 87.2%였다. 마지막으로 0.366 mL의 생리식염수를 첨가하고, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.2 농도를 1.5 ㎎/mL로 조정하여, 제제를 얻었다.
[실시예 3]
실시예 3에서 이용한 RNA는, 서열(X3) 및 상보 서열(X3')을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 11), 안티센스: 5'-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 12)](이하, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.3이라고 함)이며, 서열(X3) 및 상보 서열(X3')의 염기에 결합하는 리보스의 24%가 2'-O-메틸기로 치환된 리보스이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 홋카이도 시스템 사이언스로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
2'-OMe BCL2siRNA Exp.2를 2'-OMe BCL2siRNA Exp.3으로 한 것 이외에, 실시예 2와 동일하게 하여 제제를 얻었다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 91.42 ㎚였다.
[비교예 2]
비교예 2에서 이용한 RNA는, 서열(X3) 및 상보 서열(X3')을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 13), 안티센스: 5'-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 14)](이하, BCL2siRNA Com.2라고 함)이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 홋카이도 시스템 사이언스로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
2'-OMe BCL2siRNA Exp.2를 BCL2siRNA Com.2로 한 것 이외에, 실시예 2와 동일하게 하여 제제를 얻었다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 96.52 ㎚였다.
[시험예 2]
실시예 2, 3 및 비교예 2에서 얻어진 제제를, 웅성 Balb/c 마우스(6주령, 니혼쿠레아)에게, 약액(siRNA 농도 750 ㎍/mL) 200 μL를 꼬리 정맥으로부터, 7일간의 간격을 두고 2회 투여하였다(투여량은 150 ㎍/마우스). 2회째 투여 후, 투여 0.5, 3, 7 및 24시간 후에, 꼬리 동맥으로부터 1시점에 대해 10 μL의 혈액을 채취하고, 변성 용액(4 ㏖/L 구아니딘티오시아네이트, 25 m㏖/L 시트르산나트륨, 1 m㏖/L 디티오트레이톨, 0.5 w/v% 소듐 N-라우로일 사코신; 이하, D 용액이라고 함) 90 μL를 첨가하여 혼합하여, 10 v/v% 혈액으로 하였다.
각 투여 군의 10 v/v% 혈액 50 μL에, 디에틸피로카보네이트 수용액(디에틸피로카보네이트를 초순수에 대하여 0.1 v/v%의 용량으로 첨가하여 혼합하였음) 5 μL, I.S. 용액(I.S.로서 농도가 0.3 μ㏖/L인 상기 디에틸피로카보네이트 수용액) 10 μL, D 용액 50 μL, 2 m㏖/L 초산나트륨(pH 4.0) 10 μL 및 산성 포화 페놀/클로로포름 용액(산성 포화 페놀과 클로로포름을 1/1의 용량비로 혼합한 후의 하층을 이용하였음) 150 μL를 첨가하여 혼합하고, 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상청 65 μL에 GenTLE 용액(GenTLE 침전 담체(다카라 바이오)를 상기 디에틸피로카보네이트 수용액으로 15배 희석하였음) 15 μL를 첨가하여 혼합한 후, 에탄올 200 μL를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 10분간 이상 정치하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상청을 버리고, 침전에 75 v/v% 에탄올 200 μL를 첨가하였다. 4℃, 132,000×g에서 15분간 원심분리하고, 상청을 버려, 침전을 풍건한 후, 재용해액(디에틸피로카보네이트/트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물을 0.1/0.4/30/1,000의 용량비로 혼합하였음) 100 μL에 용해하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하고, 상청을 분석 시료로 하여, HPLC법으로 정량하였다. 결과를 각각 도 3∼5에 나타낸다.
<장치>
HPLC 장치: ACQUITY UPLC 시스템(Waters)
질량 분석 장치: API4000 Q TRAP(Applied Biosystems/MDS Sciex)
해석 소프트웨어: Analyst 1.4.2(Applied Biosystems/MDS Sciex)
<HPLC 조건>
실시예 2: 5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 15)
5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 16)
실시예 3: 5'- GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT -3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 17)
5'-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 18)
비교예 2: 5'- GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT -3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 19)
5'-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 20)
컬럼: Xbridge C 18(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 50 ㎜, Waters)
프리 필터: Xbridge guard cartridge(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 10 ㎜, Waters)
컬럼 온도: 65℃
이동층: 트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물(0.4/30/1,000):메탄올=93:7∼75:25
주입량: 25 μL
검출: 질량 분석 장치(이온화법: 전기분무 이온화, 네거티브, 이온원 온도: 500℃)
도 3∼5로부터, 실시예 2 및 3에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에서는, 비교예 2에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에 비하여, RNA의 혈액 중 농도 추이가 높은 것을 나타내고 있다. 즉, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 본 발명의 조성물은, 혈중 체류성이 보다 개선되며, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성을 증대할 수 있는 것이 분명하게 되었다.
[실시예 4]
실시예 4에서 이용한 RNA는, BCL2 유전자의 mRNA의 연속하는 23 염기의 서열(이하, 서열(X4)라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X4')이라고 함)을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AmAU mAAdA dC-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 21), 안티센스: 5'-GUmU UmAU mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCmUmU-3'(5' 측으로부터 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25∼27번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 22)](이하, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.4라고 함)이며, 서열(X4) 및 상보 서열(X4')의 염기에 결합하는 리보스의 합계의 50%가 2'-O-메틸기로 치환된 리보스이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 홋카이도 시스템 사이언스로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
DOTAP(아반티 폴라 리피즈사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/증류수(오츠카세이야쿠사 제조)를 40 ㎎/16 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하고, 볼텍스 믹서로 진탕 교반하였다. 이 현탁액을 70℃에서 0.4 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코스터사 제조)에 10회, 0.2 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 5회, 0.1 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(코닝사 제조)에 10회, 추가로 0.05 ㎛의 폴리카보네이트막 필터(와트만사 제조)에 20회 통과시켰다. 동적 광 산란(DLS)으로 얻어진 리드 입자의 평균 입자경을 측정한 바, 72.93 ㎚였다.
한편, EPC(니혼유시사 제조)/PEG-DSPE(니혼유시사 제조)/에탄올(와코쥰야쿠사 제조)/물을 15 ㎎/3.125 ㎎/0.625 mL/0.375 mL가 되도록 혼합하여, 지질 이중막의 구성 성분의 용액을 조제하였다.
얻어진 리드 입자의 분산액 0.0125 mL에, 2'-OMe BCL2siRNA Exp.4/물을 24 ㎎/1 mL가 되도록 혼합하여 얻어진 수용액 0.00417 mL를 혼합하여 복합 입자를 조제하였다. 얻어진 복합 입자의 분산액을, 지질 이중막의 구성 성분의 용액 0.06667 mL에 첨가하고, 계속해서 0.02083 mL의 증류수를 첨가하였다. 추가로 EPC/PEG-DSPE를 62.5 ㎎/62.5 ㎎/mL가 되도록 40 vol% 에탄올에 용해한 용액을 0.00667 mL 첨가 후, 증류수 0.7758 mL를 서서히 첨가하여, 에탄올의 농도가 5 vol% 이하가 되도록 조정하였다. 얻어진 리포솜 현탁액을 식염수로 등장화하였다. 추가로 생리식염수(오츠카세이야쿠사 제조)로 최종 액량을 1 mL로 함으로써 2'-OMe BCL2siRNA Exp.4 농도를 0.1 ㎎/mL로 조정하여, 제제를 얻었다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 87.50 ㎚였다.
[비교예 3]
비교예 3에서 이용한 RNA는, 서열(X4) 및 상보 서열(X4')을 포함하는 이중쇄 RNA[센스: 5'-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AAU AAdA dC-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 23), 안티센스: 5'-GUU UAU UUG CUG AAG AUG UCA CUU CUU-3'(서열 번호 24)](이하, BCL2siRNA Com.3이라고 함)이다. 센스쇄 및 안티센스쇄는, 각각 홋카이도 시스템 사이언스로부터 입수하여 어닐링시킴으로써 이중쇄 RNA를 조제하였다.
2'-OMe BCL2siRNA Exp.4를 BCL2siRNA Com.3으로 한 것 이외에, 실시예 4와 동일하게 하여 제제를 얻었다.
DLS로 리포솜의 평균 입자경을 측정한 바, 94.32 ㎚였다.
[시험예 3]
실시예 4 및 비교예 3에서 얻어진 제제를, 웅성 Balb/c 마우스(6주령, 니혼쿠레아)에게, 약액(siRNA 농도 50 ㎍/mL) 100 μL를 꼬리 정맥으로부터, 7일간의 간격을 두고 2회 투여하였다(투여량은 5 ㎍/마우스). 2회째 투여 후, 투여 3시간 후에, 꼬리 동맥으로부터 1시점에 대해 10 μL의 혈액을 채취하고, 변성 용액(4 ㏖/L 구아니딘티오시아네이트, 25 m㏖/L 시트르산나트륨, 1 m㏖/L 디티오트레이톨, 0.5 w/v% 소듐 N-라우로일 사코신; 이하, D 용액이라고 함) 90 μL를 첨가하여 혼합하여, 10 v/v% 혈액으로 하였다.
각 투여 군의 10 v/v% 혈액 100 μL에, 디에틸피로카보네이트 수용액(디에틸피로카보네이트를 초순수에 대하여 0.1 v/v%의 용량으로 첨가하여 혼합하였음) 10 μL, I.S. 용액(I.S.로서 농도가 0.3 μ㏖/L인 상기 디에틸피로카보네이트 수용액) 10 μL, 2 m㏖/L 초산나트륨(pH 4.0) 10 μL 및 산성 포화 페놀/클로로포름 용액(산성 포화 페놀과 클로로포름을 1/1의 용량비로 혼합한 후의 하층을 이용하였음) 150 μL를 첨가하여 혼합하고, 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상청 30 μL에 GenTLE 용액(GenTLE 침전 담체(다카라 바이오)를 상기 디에틸피로카보네이트 수용액으로 15배 희석하였음) 10 μL를 첨가하여 혼합한 후, 에탄올 100 μL를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 10분간 이상 정치하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상청을 버리고, 침전에 75 v/v% 에탄올 100 μL를 첨가하였다. 4℃, 132,000×g에서 15분간 원심분리하고, 상청을 버려, 침전을 풍건한 후, 재용해액(디에틸피로카보네이트/트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물을 0.1/0.4/30/1,000의 용량비로 혼합하였음) 50 μL에 용해하였다. 4℃, 132,000×g에서 10분간 원심분리하고, 상청을 분석 시료로 하여, HPLC법으로 정량하였다. 결과를 각각 도 6 및 도 7에 나타낸다.
<장치>
HPLC 장치: ACQUITY UPLC 시스템(Waters)
질량 분석 장치: API4000 Q TRAP(Applied Biosystems/MDS Sciex)
해석 소프트웨어: Analyst 1.4.2(Applied Biosystems/MDS Sciex)
<HPLC 조건>
내표준물질(I.S.)
실시예 4: 5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 25)
5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스이며, 5' 측으로부터 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19번째의 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은 2'-O-메틸로 치환되어 있는 리보스임)(서열 번호 26)
비교예 3: 5'- GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT -3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 27)
5'-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT-3'(d가 첨부된 염기에 결합하는 당은 데옥시리보스임)(서열 번호 28)
컬럼: Xbridge C 18(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 50 ㎜, Waters)
프리 필터: Xbridge guard cartridge(3.5 ㎛, 2.1 ㎜ I.D. x 10 ㎜, Waters)
컬럼 온도: 65℃
이동층: 트리에틸아민/헥사플루오로이소프로판올/물(0.4/30/1,000):메탄올=93:7∼75:25
주입량: 25 μL
검출: 질량 분석 장치(이온화법: 전기분무 이온화, 네거티브, 이온원 온도: 500℃)
도 6 및 도 7로부터, 실시예 4에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에서는, 비교예 3에서 얻어진 제제를 투여한 마우스에 비하여, RNA의 혈액 중 농도 추이가 높은 것을 나타내고 있다. 즉, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 1∼90%가 2' 위치에서 수식 기로 치환된 리보스인 본 발명의 조성물은, 혈중 체류성이 보다 개선되며, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성을 증대시킬 수 있는 것이 분명해졌다.
본 발명의 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜을 함유하는 조성물을, 포유류 등에 투여함으로써, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
[서열표 프리텍스트]
서열 번호 1-실시예 1의 siRNA 센스쇄
서열 번호 2-실시예 1의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 3-비교예 1의 siRNA 센스쇄
서열 번호 4-비교예 1의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 5-실시예 1의 siRNA 센스쇄용의 IS
서열 번호 6-실시예 1의 siRNA 안티센스쇄용의 IS
서열 번호 7-비교예 1의 siRNA 센스쇄의 IS
서열 번호 8-비교예 1의 siRNA 안티센스쇄의 IS
서열 번호 9-실시예 2의 siRNA 센스쇄
서열 번호 10-실시예 2의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 11-실시예 3의 siRNA 센스쇄
서열 번호 12-실시예 3의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 13-비교예 2의 siRNA 센스쇄
서열 번호 14-비교예 2의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 15-실시예 2의 siRNA 센스쇄용의 IS
서열 번호 16-실시예 2의 siRNA 안티센스쇄용의 IS
서열 번호 17-실시예 3의 siRNA 센스쇄용의 IS
서열 번호 18-실시예 3의 siRNA 안티센스쇄용의 IS
서열 번호 19-비교예 2의 siRNA 센스쇄의 IS
서열 번호 20-비교예 2의 siRNA 안티센스쇄의 IS
서열 번호 21-실시예 4의 siRNA 센스쇄
서열 번호 22-실시예 4의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 23-비교예 3의 siRNA 센스쇄
서열 번호 24-비교예 3의 siRNA 안티센스쇄
서열 번호 25-실시예 4의 siRNA 센스쇄용의 IS
서열 번호 26-실시예 4의 siRNA 안티센스쇄용의 IS
서열 번호 27-비교예 3의 siRNA 센스쇄의 IS
서열 번호 28-비교예 3의 siRNA 안티센스쇄의 IS
서열 번호 29-bcl2 mRNA
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Preparation which inhibit gene expression <130> 1000P12027 <150> JP2008-200182 <151> 2008-08-01 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense of exp.1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> um <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> am <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> gm <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> am <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> am <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> cm <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> 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antisense of com.3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n = uracil <400> 28 caggcangnn gacnncactt 20 <210> 29 <211> 6492 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> bcl2 mRNA <400> 29 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg 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acatggttaa ggtaaagtaa 6360 gtctccagtt ggccaccatt agctataatg gcactttgtt tgtgttgttg gaaaaagtca 6420 cattgccatt aaactttcct tgtctgtcta gttaatattg tgaagaaaaa taaagtacag 6480 tgtgagatac tg 6492

Claims (32)

  1. 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X)라고 함) 및 상기 서열(X)와 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X')이라고 함)을 포함하는 RNA를 봉입한 리포솜을 함유하고, 서열(X) 및 상보 서열(X')의 염기에 결합하는 당의 합계의 10∼75%가 2' 위치에서 2'-O-메틸, 2'-O-에틸 및 2'-플루오로 중 하나로 치환된 리보스이며, 상기 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에 도달하는 리포솜인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 리포솜이 정맥내 투여 가능한 크기의 리포솜인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 표적 유전자가 종양 또는 염증에 관련되는 유전자인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 표적 유전자가 혈관신생에 관련되는 유전자인 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠(Kruppel) 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인 조성물.
  7. 제3항에 있어서, mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인 조성물.
  8. 제3항에 있어서, RNA를 봉입한 리포솜이 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜이고, 상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 극성 유기 용매가 알코올인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 극성 유기 용매가 에탄올인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 조성물.
  12. 제3항에 있어서, RNA를 봉입한 리포솜이 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와 상기 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜이고, 상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 조성물.
  16. 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(이하, 서열(X1)이라고 함) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(이하, 상보 서열(X1')이라고 함)을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 10∼75%가 2' 위치에서 2'-O-메틸, 2'-O-에틸 및 2'-플루오로 중 하나로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하는 리포솜을 함유하고,
    상기 지질 이중막의 구성 성분이 극성 유기 용매에 가용이며, 상기 지질 이중막의 구성 성분 및 상기 복합 입자가, 특정 농도로 상기 극성 유기 용매를 포함하는 액에 분산 가능한 것인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  17. 제16항에 있어서, 극성 유기 용매가 알코올인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  18. 제16항에 있어서, 극성 유기 용매가 에탄올인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  19. 제16항에 있어서, 리드 입자가 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자이고, 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  20. 양이온성 물질을 포함하는 리드 입자와, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자의 mRNA의 연속하는 15∼30 염기의 서열(서열(X1)) 및 상기 서열과 상보적인 염기의 서열(상보 서열(X1'))을 포함하는 RNA로서, 서열(X1) 및 상보 서열(X1')의 염기에 결합하는 당의 합계의 10∼75%가 2' 위치에서 2'-O-메틸, 2'-O-에틸 및 2'-플루오로 중 하나로 치환된 리보스인 RNA를 구성 성분으로 하는 복합 입자 및 상기 복합 입자를 피복하는 지질 이중막을 포함하고,
    상기 지질 이중막이 중성 지질, 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 하는 지질 이중막인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 양이온성 물질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸염화암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸브롬화암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  24. 제16항 또는 제20항에 있어서, RNA가 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 상기 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  25. 제16항 또는 제20항에 있어서, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관신생에 관여하는 유전자인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  26. 제16항 또는 제20항에 있어서, 종양 또는 염증에 관련되는 표적 유전자가 혈관 내피 증식 인자, 혈관 내피 증식 인자 수용체, 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠 유사 인자, Ets 전사 인자, 핵 인자 및 저산소 유도 인자 중 어느 하나의 유전자인 암 또는 염증 질환의 치료제.
  27. 제16항 또는 제20항에 있어서, mRNA가 인간 또는 마우스의 mRNA인 암 또는 염증 질환의 치료제.
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