KR101612999B1 - 활성화가능 이중특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원 2 가지 중 1 가지에 대한 결합 친화성이 감소된 이중특이적 항체로서, 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 이중특이적 항체, 및 그러한 이중특이적 항체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항원 2 가지 중 1 가지에 대한 결합 친화성이 감소된 이중특이적 항체로서, 종양- 또는 염증-조직/질환 특이적 프로테아제 (예를 들어 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제) 에 의해 활성화될 수 있는 이중특이적 항체; 및 그러한 이중특이적 항체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
조작된 단백질, 예컨대 2 가지 이상의 항원에 결합할 수 있는 이중- 또는 다중특이적 항체가 당업계에 공지되어 있다. 그러한 다중특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 접합, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
다양한 재조합 이중특이적 항체 형태가 최근에 개발되었고, 예를 들어 Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; WO 2001/090192; Carter, P.J., Immunol. Methods. 248 (2001) 7-15; Marvin, J.S., et al., Acta Pharmacol Sin. 26 (2005) 649-658; Marvin, J.S., et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 9 (2006) 184-193; Morrison, S.L., Nature Biotechnology 25 (2007) 1233-1234; Mueller, D., et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics 9 (2007) 319-326; Fischer, N., et al., Pathobiology 74 (2007) 3-14; WO 2007/095338; WO 2007/109254; WO 2007/024715; EP 2 050 764; 및 WO 2009/018386 에 기재되어 있다.
Gerspach, J., et al., Cancer Immunol Immunother 55 (2006) 1590-1600 은 세포 표면에서 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성제 (uPA) 매개 단백질분해 가공에 의한 TNF 전구약물의 표적-선별적 활성화에 관한 것이다.
Joshua, M., and Donaldson, J.M., et al., Cancer Biology & Therapy 8 (2009) 2145-2150 은 오프-타겟 효과 (off-target effect) 를 제한하는 은폐 치료용 항체의 디자인 및 개발에 관한 것이다.
WO 2009/021754 는 단일 및 다중특이적 항체 및 사용 방법에 관한 것이다. WO 2010/065882 는 조작된 다가 다중특이적 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
a) VH1 도메인 및 VL1 도메인을 포함하는 제 1 항원에 결합하는 제 1 항체, 및
b) 제 2 항원에 결합하는 제 2 항체
를 포함하는 이중특이적 항체로서,
이 경우 VH1 도메인은 N-말단에서 제 1 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고, VL1 도메인은 N-말단에서 제 2 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고,
하나의 링커는 조직- 또는 질환-특이적 프로테아제 절단 자리를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않고;
제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 배 이상 감소된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 하나의 양상은
a) VH1 도메인 및 VL1 도메인을 포함하는 제 1 항원에 결합하는 제 1 항체, 및
b) 제 2 항원에 결합하는 제 2 항체
를 포함하는 이중특이적 항체로서,
이 경우 VH1 도메인은 N-말단에서 제 1 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고, VL1 도메인은 N-말단에서 제 2 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고,
하나의 링커는 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 자리를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않고;
제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 배 이상 감소된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 전체 항체이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체의 첫번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체의 두번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다
a) - 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬;
- 2 개의 CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
- 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬.
바람직하게는 그러한 이중특이적 항체는
전체 항체의 중쇄의 첫번째 CH3 도메인 및 전체 항체의 두번째 CH3 도메인 각각이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 경계면이 변경을 포함하는 경계면에서 만나고;
이 경우 i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기로 대체되어, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동 (cavity) 에 위치가능한 융기 (protuberance) 를 생성하고,
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기로 대체되어, 두번째 CH3 도메인의 경계면 내에 첫번째 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치가능한 공동을 생성하는 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 Fv 조각이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체 Fv 조각의 첫번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체 Fv 조각의 두번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 전체 항체인 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-VL2-사슬; 또는
b) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-VL2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-VH2 사슬.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 VH2 도메인 및 VL2 도메인이 다이설파이드 가교에 의해 안정화되어 있는 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 Fab 조각이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체 Fab 조각의 첫번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체 Fab 조각의 두번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 전체 항체인 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-CL-VL2-사슬; 또는
b) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-CH1-VH2-사슬.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 Fv 조각인 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬; 또는
b) - 1 개의 VH1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬.
바람직하게는 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 10 배 이상 감소된다.
본 발명은 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 발명에 따른 항체의 재조합 생산을 위한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 발명에 따른 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 그러한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.
또한 본 발명은 발명에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하고 상기 항체를 상기 세포 또는 세포 배양물 상청액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는, 발명에 따른 재조합 항체의 생산 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 그러한 재조합 방법에 의해 수득된 항체를 포함한다.
또한 본 발명은 암 또는 염증을 앓는 환자의 치료 방법으로서, 그러한 질환을 갖는 것으로 진단된 (그러므로 그러한 치료가 필요한) 환자에게 유효량의 발명에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 항체는 바람직하게는 약학적 조성물로 투여된다.
발명에 따른 이중특이적 항체는 예를 들어 (종양-특이적 프로테아제를 분비 또는 발현하지 않거나 더 적은 정도로 발현하는 정상 세포/조직 또는 암 세포에 비해) 종양-특이적 프로테아제를 분비 또는 발현하는 암 세포의 동시 및 더욱 특이적인 표적화와 같은 귀중한 특성을 갖는다. 발명에 따른 이중특이적 항체는 종양-특이적 프로테아제가 분비 또는 발현되는 염증 영역 및 종양의 별도의 표적 또는 경로를 동시에 간섭할 수 있다. 그러므로, 발명에 따른 이중특이적 항체는 예를 들어 암 또는 염증 질환에서 그러한 표현형의 더 나은 억제를 매개한다. 또한 제한 (불활성화) 항체의 투여 및 그 후 원하는 작용 자리에서 이러한 항체의 자리-특이적 활성화에 의해, 완전 활성 (비제한) 항체의 전신 투여의 잠재적 독성 또는 부작용이 방지될 수 있다.
도 1: 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 전 (도 1a) 및 후 (도 1b) 의 발명에 따른 이중특이적 항체의 일반적 도식
도 2a-f: 발명에 따른 상이한 이중특이적 항체의 도식적 표현
도 3: 3가 이중특이적 항체 유도체의 구성
(a) 다이설파이드-안정화된 Fv 를 함유하는 결합 독립체의 모듈 구성;
(b) 표적 세포 상의 또는 시험관 내에서의 단백질분해 가공을 위한 인지 서열이 있는 커넥터-펩티드. MMP 에 의한 절단 후 1 개 초과의 커넥터 서열이 생성되었다. MMP 커넥터의 두번째 및 세번째 변이체는 서열 (GGGGS)2-GGPLGMLSQ(GGGGS)2 및 (GGGGS)2-GGPLGIAGQS(GGGGS)2 를 포함했다.
도 4: 3가 이중특이적 dsFv-함유 항체 유도체의 발현 및 정제
(a) 단백질-A 및 SEC 정제 후 단백질 제제의 환원 (reducing) SDS Page
(b) 커넥터에 MMP2/9 자리가 있는 3가 이중특이적 dsFv-함유 항체 Her3/MetSS_KHSS_M2 의 예시적 SEC 프로파일은 응집체가 없는 고도로 순수한 단량체 조성을 나타낸다.
도 5: 프로테아제 절단 전의 감소된 결합 친화성:
프로테아제 절단 전 및 후의 이중특이적 항체 유도체의 환원 SDS-Page.
(a) 프리시젼 (Prescission) 절단 자리를 함유하는 발명에 따른 이중특이적 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci) 는 생성시 감소된 결합 친화성을 갖고, 프리시젼 프로테아제에 노출될 때 활성화된다.
(b) MMP2/9 (Her3/MetSS_KHSS_M2) 또는 uPA 절단 자리 (Her3/MetSS_KHSS_U) 를 함유하는 발명에 따른 이중특이적 항체는 생성시 감소된 결합 친화성을 갖고, 이후 MMP2/9 또는 uPA 에 노출될 때 활성화된다.
도 6: 생세포에 대한 제한 및 비제한 3가 Her3-cMet 이중특이적 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci, Her3/MetSS_KHSS_M2) 의 결합.
Her3-발현, cMet 음성 T47D 세포에 대한 2가 비제한 Her3-모듈의 결합이 좌측 패널에 나타나 있다. Her3-음성, cMet 발현 A549 세포에 대한 상이한 제한 cMet-모듈의 결합이 우측 패널에 나타나 있다. 제한 모듈에 대해 불량한 결합이 관찰되지만, 특이적 프로테아제에 의한 해방 (unleashing) 은 완전한 결합 및 세포 상의 축적을 초래한다.
도 7: 세포 신호전달 검정에서 발명에 따른 3가 Her3-cMet 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci, Her3/MetSS_KHSS_M2, Her3/MetSS_KHSS_U) 의 저해 기능
(a) 인산화된-Her3 을 탐지하는 웨스턴 블롯은 비제한 Her3-독립체에 의한 신호전달 간섭을 입증한다.
(b) 인산화된-AKT 를 탐지하는 ELISA 는 비제한 cMet-독립체에 의한 HGF/c-Met 신호전달의 효과적 간섭을 입증하지만, 제한 형태의 동일한 분자는 활성이 더 낮다.
도 8: 4가 이중특이적 항체 유도체 (Tv_Erb-LeY_SS_M) 의 구성
(a) 다이설파이드-안정화된 Fv 를 함유하는 결합 독립체의 모듈 구성;
(b) 표적 세포 상의 또는 시험관 내에서의 단백질분해 가공을 위한 인지 서열이 있는 커넥터-펩티드.
도 2a-f: 발명에 따른 상이한 이중특이적 항체의 도식적 표현
도 3: 3가 이중특이적 항체 유도체의 구성
(a) 다이설파이드-안정화된 Fv 를 함유하는 결합 독립체의 모듈 구성;
(b) 표적 세포 상의 또는 시험관 내에서의 단백질분해 가공을 위한 인지 서열이 있는 커넥터-펩티드. MMP 에 의한 절단 후 1 개 초과의 커넥터 서열이 생성되었다. MMP 커넥터의 두번째 및 세번째 변이체는 서열 (GGGGS)2-GGPLGMLSQ(GGGGS)2 및 (GGGGS)2-GGPLGIAGQS(GGGGS)2 를 포함했다.
도 4: 3가 이중특이적 dsFv-함유 항체 유도체의 발현 및 정제
(a) 단백질-A 및 SEC 정제 후 단백질 제제의 환원 (reducing) SDS Page
(b) 커넥터에 MMP2/9 자리가 있는 3가 이중특이적 dsFv-함유 항체 Her3/MetSS_KHSS_M2 의 예시적 SEC 프로파일은 응집체가 없는 고도로 순수한 단량체 조성을 나타낸다.
도 5: 프로테아제 절단 전의 감소된 결합 친화성:
프로테아제 절단 전 및 후의 이중특이적 항체 유도체의 환원 SDS-Page.
(a) 프리시젼 (Prescission) 절단 자리를 함유하는 발명에 따른 이중특이적 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci) 는 생성시 감소된 결합 친화성을 갖고, 프리시젼 프로테아제에 노출될 때 활성화된다.
(b) MMP2/9 (Her3/MetSS_KHSS_M2) 또는 uPA 절단 자리 (Her3/MetSS_KHSS_U) 를 함유하는 발명에 따른 이중특이적 항체는 생성시 감소된 결합 친화성을 갖고, 이후 MMP2/9 또는 uPA 에 노출될 때 활성화된다.
도 6: 생세포에 대한 제한 및 비제한 3가 Her3-cMet 이중특이적 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci, Her3/MetSS_KHSS_M2) 의 결합.
Her3-발현, cMet 음성 T47D 세포에 대한 2가 비제한 Her3-모듈의 결합이 좌측 패널에 나타나 있다. Her3-음성, cMet 발현 A549 세포에 대한 상이한 제한 cMet-모듈의 결합이 우측 패널에 나타나 있다. 제한 모듈에 대해 불량한 결합이 관찰되지만, 특이적 프로테아제에 의한 해방 (unleashing) 은 완전한 결합 및 세포 상의 축적을 초래한다.
도 7: 세포 신호전달 검정에서 발명에 따른 3가 Her3-cMet 항체 (Her3/MetSS_KHSS_PreSci, Her3/MetSS_KHSS_M2, Her3/MetSS_KHSS_U) 의 저해 기능
(a) 인산화된-Her3 을 탐지하는 웨스턴 블롯은 비제한 Her3-독립체에 의한 신호전달 간섭을 입증한다.
(b) 인산화된-AKT 를 탐지하는 ELISA 는 비제한 cMet-독립체에 의한 HGF/c-Met 신호전달의 효과적 간섭을 입증하지만, 제한 형태의 동일한 분자는 활성이 더 낮다.
도 8: 4가 이중특이적 항체 유도체 (Tv_Erb-LeY_SS_M) 의 구성
(a) 다이설파이드-안정화된 Fv 를 함유하는 결합 독립체의 모듈 구성;
(b) 표적 세포 상의 또는 시험관 내에서의 단백질분해 가공을 위한 인지 서열이 있는 커넥터-펩티드.
본 발명의 하나의 양상은
a) VH1 도메인 및 VL1 도메인을 포함하는 제 1 항원에 결합하는 제 1 항체, 및
b) 제 2 항원에 결합하는 제 2 항체
를 포함하는 이중특이적 항체로서,
이 경우 VH1 도메인은 N-말단에서 제 1 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고, VL1 도메인은 N-말단에서 제 2 펩티드 링커를 통해 제 2 항체에 융합되어 있고,
하나의 링커는 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 자리를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않고;
제 1 항원에 대한 이중특이적 항체 (그 안의 프로테아제 절단 자리가 절단되지 않음) 의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 배 이상 감소된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
발명에 따른 이중특이적 항체는 프로테아제 절단 자리가 절단된 후 그의 이중특이성 (즉 제 1 및 제 2 항원에 결합하는 능력) 을 보유하는 것을 특징으로 한다.
용어 "항체" 는 전체 항체, 항체 조각, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 또한 발명에 따른 특성이 보유되는 한 유전자 조작된 항체를 제한 없이 포함하는 다양한 형태의 항체를 포함한다. "항체 조각" 은 전체 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변 도메인, 또는 적어도 그의 항원 결합 자리를 포함한다. 항체 조각의 예는 Fv 조각, Fab 조각, 다이아바디 (diabody) 및 단일-사슬 항체 분자를 포함한다. 또한, 항체 조각은 VH 도메인의 특징을 갖는 폴리펩티드, 즉 VL 도메인과 함께 기능적 항원 결합 자리로 조립되어 그 특성을 제공할 수 있는 폴리펩티드를 포함하거나, VL 도메인의 특징을 갖는 폴리펩티드, 즉 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 자리로 조립되어 그 특성을 제공할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "전체 항체" 는 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 항체를 의미한다. 전체 항체의 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3) (VH-CH1-HR-CH2-CH3 으로 축약됨); 및 서브클래스 IgE 항체의 경우 임의로 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 전체 항체의 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전체 항체의 경쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다 (VL-CL 으로 축약됨). 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 은 κ(카파) 또는 λ (람다) 일 수 있다. 전체 항체 사슬은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 (즉 경쇄와 중쇄 사이) 및 전체 항체 중쇄의 힌지 영역 사이에서 폴리펩티드간 다이설파이드 결합을 통해 함께 연결되어 있다. 전형적인 전체 항체의 예는 자연 항체 예컨대 IgG (예를 들어 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD, 및 IgE 이다. 발명에 따른 전체 항체는 단일 종 예를 들어 인간에서 유래하거나, 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 발명에 따른 전체 항체는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는, 한 쌍의 VH 및 VL 에 의해 각각 형성된 2 개의 항원 결합 자리를 포함한다. 상기 전체 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 있는 마지막 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "사슬" 은 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 VH 도메인, VL 도메인, 항체 중쇄, 항체 경쇄, CH1-VH 조각 등) 을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "가변 도메인" (경쇄 (VL) 의 가변 도메인, 중쇄 (VH) 의 가변 도메인) 은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 의미한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적 구조를 갖고, 각각의 도메인은 3 개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된, 서열이 광범위하게 보존된 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 구조를 취하고, CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR 은 3-차원 구조가 골격 영역에 의해 유지되고, 다른 사슬의 CDR 과 함께 항원 결합 자리를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하므로, 발명의 추가의 대상을 제공한다. 예를 들어, 용어 VH1 도메인은 제 1 (1) 항원에 결합하는 제 1 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 나타내고, 용어 VL1 도메인은 상기 제 1 항원에 결합하는 상기 제 1 항체의 상응하는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역 (HVR)" 또는 "항체의 항원-결합 부분 또는 항원 결합 자리" 는 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 각 사슬의 CDR 은 그러한 골격 아미노산에 의해 분리되어 있다. 특히, 중쇄의 CDR3 이 항원 결합에 가장 크게 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 표준 정의에 따라 결정된다.
본원에서 사용되는 용어 "결합" 또는 "결합하다" 은 시험관내 검정에서, 바람직하게는 정제된 야생형 항원에 의한 플라스몬 공명 검정 (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 나타낸다. 결합 친화성은 KD (= kD/ka) 값으로 정의된다. ka 는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 연합에 대한 속도 상수이고, kD 는 해리 상수이다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선별적 인지를 나타낸다. 자연 항체는, 예를 들어, 단일특이적이다. 이중특이적 항체는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 항체가 1 개 초과의 특이성을 갖는 경우, 인지된 에피토프는 단일 항원 또는 1 개 초과의 항원과 연관될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 결합 자리가 1 개 초과인 항체를 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 용어 "가" 는 항체 분자에 명시된 수의 결합 자리가 존재함을 의미한다. 예를 들어 자연 항체 또는 발명에 따른 전체 항체는 2 개의 결합 자리를 갖고 이가이다. 그와 같이, 용어 "3가" 는 항체 분자에 3 개의 결합 자리가 존재함을 의미한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 로 측정할 때, 95% 초과 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 리뷰에 대해, 예를 들어, Flatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 정상적으로 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적 동질 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 나타내며, 즉, 예를 들어 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는, 집단을 구성하는 개별 항체가 동등하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)들에게로 향하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 하나의 항원의 단일 결정인자에게로 향한다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 실질적 동질 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 여겨지면 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브라도마법, 재조합 DNA 법, 파지-디스플레이법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 제한 없이 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 그러한 방법 및 기타 예시적 모노클로날 항체 제조 방법이 본원에 기재되어 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 출처 또는 종에서 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종에서 유래하는 항체를 나타내다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 HVR (예를 들어, CDR) 의 전부 또는 실질적 전부가 비-인간 항체에 해당하고, FR 의 전부 또는 실질적 전부가 인간 항체에 해당하는, 1 개 이상, 전형적으로는 2 개의 가변 도메인의 실질적 전부를 포함할 것이다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 나타낸다.
항체의 "클래스" 는 항체의 중쇄에 포함된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 나타낸다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 5 개의 주요 항체 클래스가 존재하며, 이들 중 여럿은 서브클래스 (아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 호칭된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 제외한다.
"Fv 조각" 은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 전체 항체이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체의 첫번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체의 두번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다
- 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
(예시적 도식에 대해 도 2a 를 또한 참조).
그러한 이질이합체 이중특이적 항체의 수율을 개선하기 위해, 예를 들어 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 에서 여러가지 예로 상세히 기재된 "놉-인투-홀 (knob-into-holes)" 기술에 의해 전체 항체의 CH3 도메인이 변경될 수 있다. 이러한 방법에서 2 개의 CH3 도메인을 함유하는 양쪽 중쇄의 이질이합체화를 증가시키도록, 이들 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면이 변경된다. (2 개의 중쇄의) 2 개의 CH3 도메인 각각이 "놉 (knob)" 일 수 있고, 한편 다른 하나가 "홀 (hole)" 이다. 다이설파이드 가교의 도입은 이질이합체를 추가로 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율을 증가시킨다.
따라서 발명의 하나의 양상에서 상기 이중특이적 항체는 전체 항체의 중쇄의 첫번째 CH3 도메인 및 전체 항체의 두번째 CH3 도메인 각각이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 경계면이 변경을 포함하는 경계면에서 만나고;
이 경우 i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기로 대체되어, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동에 위치가능한 융기 ("놉") 를 생성하고,
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기로 대체되어, 두번째 CH3 도메인의 경계면 내에 첫번째 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치가능한 공동 ("홀") 을 생성하는 것을 추가의 특징으로 한다.
다시 말하면 전체 항체의 중쇄의 첫번째 CH3 도메인 및 전체 항체의 두번째 CH3 도메인 각각이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 경계면을 포함하는 경계면에서 만나고;
이 경우 상기 경계면은 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이 경우 변경은:
i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어,
하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 경계면이 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 경계면과 만나고,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기로 대체되어, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동에 위치가능한 융기 ("놉") 를 생성하고,
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어,
두번째 CH3 도메인의 원래의 경계면이 이중특이적 항체 내의 원래의 첫번째 CH3 도메인의 경계면과 만나고,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기로 대체되어, 두번째 CH3 도메인의 경계면 내에 첫번째 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치가능한 공동 ("홀") 을 생성하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 상기 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기 ("놉") 는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 및 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 상기 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기 ("홀") 는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
발명의 하나의 양상에서 CH3 도메인 사이에 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록 하는 각각의 CH3 도메인의 위치에 시스테인 (C) 잔기를 도입하여 CH3 도메인 둘다가 추가로 변경된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들어 "놉 사슬" 의 CH3 도메인에 Y349C 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써 CH3 도메인 사이의 부가적 사슬간 다이설파이드 가교가 또한 사용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 따라서 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다 (하나의 CH3 도메인 내의 부가적 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인 내의 부가적 E356C 또는 S354C 돌연변이가 사슬간 다이설파이드 가교를 형성함) (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름). 그러나 또한 EP 1 870 459A1 에 기재된 다른 놉-인-홀 기술이 대안적으로 또는 부가적으로 사용될 수 있다. 상기 이중특이적 항체의 바람직한 예는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다 (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).
또다른 바람직한 구현예에서 상기 이중특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서 융기는 도입된 아르기닌 (R) 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에서 융기는 도입된 페닐알라닌 (F) 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에서 융기는 도입된 티로신 (Y) 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에서 융기는 도입된 트립토판 (W) 잔기를 포함한다.
하나의 구현예에서 공동은 도입된 알라닌 (A) 잔기에 의해 형성된다. 하나의 구현예에서 공동은 도입된 세린 (S) 잔기에 의해 형성된다. 하나의 구현예에서 공동은 도입된 트레오닌 (T) 잔기에 의해 형성된다. 하나의 구현예에서 공동은 도입된 발린 (V) 잔기에 의해 형성된다.
바람직하게는 그러한 이중특이적 항체는
VH1 도메인 및 VL1 도메인이
a) 다이설파이드 가교에 의해; 및/또는
b) CH1 도메인 및 CL 도메인에 의해 (VH1 및 VL1 도메인이 Fab 조각의 일부이도록)
안정화되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다
- 1 개의 CH1-VH1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL2 사슬
- 1 개의 CL-VL1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
(예시적 도식에 대해 도 2b 를 또한 참조).
발명의 하나의 양상에서 발명에 따른 이중특이적 항체 내에서, VH1/VL1 도메인 또는 VH2/VL2 도메인은 (존재하는 경우) 다이설파이드 안정화될 수 있다 (바람직하게는 CH1 및 CL 도메인이 그들 각각의 C-말단에서 융합되지 않았을 때). VH1/VL1 도메인 또는 VH2/VL2 도메인의 그러한 다이설파이드 안정화는 VH1/VL1 또는 VH2/VL2 의 가변 도메인 사이에 다이설파이드 결합을 도입함으로써 달성되고, 예를 들어 WO 94/029350, US 5,747,654, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. (1997) 1453-1459; Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Reiter, Y., et al., Protein Engineering 8 (1995) 1323-1331; Webber, K.O., et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter. Y., et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter, Y., et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter, Y., et al., International Journal of Cancer 58 (1994) 142-149; 또는 Reiter, Y., Cancer Research 54 (1994) 2714-2718 에 기재되어 있다.
다이설파이드 안정화된 Fv 의 하나의 구현예에서, 발명에 따른 항체에 포함된 Fv 의 가변 도메인 (VH1/VL1 또는 VH2/VL2) 사이의 다이설파이드 결합은 독립적으로 하기로부터 선택되는 각각의 Fv 에 대한 것이다:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이,
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 와 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 과 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이.
하나의 구현예에서 발명에 따른 항체에 포함된 Fv 의 가변 도메인 사이의 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44 와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이이다.
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 Fv 조각이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체 Fv 조각의 첫번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체 Fv 조각의 두번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 전체 항체인 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-VL2-사슬; 또는
b) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-VL2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-VH2 사슬
(예시적 도식에 대해 도 2c 를 또한 참조)
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는
VH2 도메인 및 VL2 도메인이 다이설파이드 가교에 의해 안정화되어 있는 것을 추가의 특징으로 한다.
"Fab 조각" 은 2 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어지고, 첫번째 사슬은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 로 이루어지고, 두번째 사슬은 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어진다 (각각 N-말단으로부터 C-말단 방향으로).
하나의 구현예에서 발명에 따른 이중특이적 항체는
제 2 항체가 Fab 조각이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체 Fab 조각의 첫번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있고,
VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체 Fab 조각의 두번째 사슬의 C-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, VH1 도메인은 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체의 CH1 도메인의 C-말단에 융합되어 있고, VL1 도메인은 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체의 CL 도메인의 C-말단에 융합되어 있거나; 또는
VH1 도메인은 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체의 CL 도메인의 C-말단에 융합되어 있고, VL1 도메인은 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체의 CH 도메인의 C-말단에 융합되어 있다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 전체 항체인 것을 추가의 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-CL-VL2-사슬; 또는
b) - 2 개의 CH3-CH2-CH1-VH1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬
- 2 개의 CL-VL1-펩티드 링커-CH1-VH2-사슬
(예시적 도식에 대해 도 2d 를 또한 참조).
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 제 1 항체가 Fv 조각인 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 이중특이적 항체는 C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다
a) - 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬; 또는
b) - 1 개의 VH1-펩티드 링커-CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH1-VH2 사슬
(예시적 도식에 대해 도 2e 를 또한 참조).
발명에서 사용되는 용어 "펩티드 링커" 는, 예를 들어 합성 기원의, 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다. 바람직하게는 상기 펩티드 링커는 5 개 이상 아미노산 길이, 바람직하게는 5 ~ 100 개, 더욱 바람직하게는 10 ~ 50 개 아미노산 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 따라 링커 길이를 달리 하여, 프로테아제 절단 전 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 배 이상 (하나의 구현예에서 10 배 이상, 하나의 구현예에서 20 배 이상) 감소될 수 있다. 하나의 구현예에서 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성은 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 ~ 1000 배 (바람직하게는 10 ~ 1000 배, 바람직하게는 10 ~ 500 배) 감소된다. 펩티드 링커의 각각의 말단은 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 VH 도메인, VL 도메인, 항체 중쇄, 항체 경쇄, CH1-VH 사슬 등) 에 접합되어 있다.
발명에 따른 이중특이적 항체 내의 펩티드 하나의 링커는 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에서 프로테아제 절단 자리가 없는 상기 펩티드 링커는 예를 들어 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 이고, 여기서 G = 글라이신, S = 세린), 및 (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, and m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0 이다.
발명에 따른 이중특이적 항체 내의 다른 펩티드 링커는 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 자리를 포함한다. 일반적으로 펩티드 링커 내의 프로테아제 절단 자리는 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 서열 또는 모티프이다. 상이한 프로테아제에 대한 자연 또는 합성 프로테아제 절단 자리가 예를 들어 Database, Vol. 2009, Article ID bap015, doi:10.1093/database/bap015 및 referred MEROPS peptide database (http://merops.sanger.ac.uk/) 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 자리" 는 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 (또는 펩티다제) 에 의해 절단되는 아미노산 서열 또는 모티프를 나타낸다. 용어 "종양- 또는 염증-특이적 프로테아제" 는 종양- 또는 염증-없는 영역 (예를 들어 상응하는 정상 조직의) 에서의 각각의 발현 수준에 비해 종양 영역 또는 염증 영역 (예를 들어 종양 조직의) 에서의 발현 수준이 높은 프로테아제를 나타낸다. 전형적인 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제가 예를 들어 표 1 및 해당 문헌 (표 1 에 제시됨) 에 기재되어 있다: 본원에서 사용되는 용어 프로테아제 또는 펩티다제는 호환가능하다.
C = 암; I = 염증
표 1:
종양- 및/또는 염증-특이적 프로테아제
위치: ex = 세포외; pm = 원형질 막; cs = 세포 표면; es = 내막계; en = 엔도솜; sg = 분비 과립; ly = 리소좀; ER = 소포체; TGN = 트랜스-골지 네트워크; (용어 본원에서 사용되는 "매트릭스 메탈로펩티다제" 는 "매트릭스 메탈로프로테이나제" 와 동등하다).
따라서 발명의 하나의 양상에서 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제는 MMP1, MMP2, MMP9, MMP3, MMP7, MMP12, MMP13, MMP14, 글루타메이트 카르복시펩티다제 II, 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 L2, 카텝신 0, 중성구 엘라스타제, 혈장 칼리크레인, KLK3, ADAM10, ADAM17, ADAMTS1, AMSH, ν-세크레타제 성분, uPA, FAP, APCE, ADAM 메탈로펩티다제 9, ADAM 메탈로펩티다제 28, ADAM-유사, 데사이신 1, 칼파인 2, (m/II) 대형 서브유닛, 카스파제 1, 어팝토시스-관련 시스테인 펩티다제 (IL-1 P 전환효소), 그란자임 A (그란자임 1, CTL-연관 세린 에스테라제 3), 칼리크레인-관련 펩티다제 11, 레구마인, N-아세틸화 알파-연결 산성 디펩티다제-유사 1 및 헵신으로 이루어지는, 바람직하게는 MMP1, MMP2, MMP9, MMP13, uPA, FAP, APCE 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테아제를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "조직- 또는 질환-특이적 프로테아제 절단 자리" 는 조직- 또는 질환-특이적 프로테아제 (또는 펩티다제) 에 의해 절단되는 아미노산 서열 또는 모티프를 나타낸다. 용어 "조직- 또는 질환-특이적 프로테아제" 는 조직 영역에서의 발현 수준이 그 특정 조직 (예를 들어 폐, 전립선, 췌장, 난소 등) 에 대해 또는 그 특정 질환 영역에 대해 (예를 들어 발현 수준이 예를 들어 종양-없는 영역 즉 상응하는 정상 조직에서의 각각의 발현 수준에 비해 더 높은 종양 질환에 대해) 전형적인 프로테아제를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 프로테아제 또는 펩티다제는 호환가능하다.
하나의 구현예에서 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성은 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 10 배 이상 감소된다.
하나의 구현예에서 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성은 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 20 배 이상 감소된다.
하나의 구현예에서 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성은 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 ~ 100000 배 감소된다.
하나의 구현예에서 제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성은 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 ~ 1000 배 (바람직하게는 10 ~ 1000 배, 바람직하게는 10 ~ 500 배) 감소된다.
"효과기 기능" 은 항체 아이소형에 따라 다른, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 용어 "Fc 영역" 은 불변 영역의 일부 이상을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 선천 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복시-말단까지 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재 또는 부재할 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 기재된, EU 인덱스로도 호칭되는, EU 넘버링 시스템에 따른다.
항체 조각은 본원에 기재된 무손상 항체의 단백질분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 (예를 들어 대장균 또는 파지, 또는 포유류 세포) 에 의한 생산을 제한 없이 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
발명에 따른 항체는 재조합 수단에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산이고, 추가의 양상은 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 생산 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현 및 그 후 항체의 단리 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 숙주 세포에서 상기와 같은 항체의 발현을 위해, 각각의 수식 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 적당한 원핵 또는 진핵 숙주 세포 예컨대 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모, 또는 대장균 세포에서 발현이 실시되고, 세포 (상청액 또는 용해 후 세포) 로부터 항체가 회수된다. 항체의 일반적인 재조합 생산 방법이 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 리뷰 논문 Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 에 기재되어 있다. 즉, 발명에 따른 이중특이적 항체는 재조합 발현된다.
이중특이적 항체는 적합하게는 배양 배지로부터 종래의 면역글로불린 정제 절차 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토크래피에 의해 분리된다. 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 종래의 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포가 그러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 그 후 그렇지 않은 경우 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포를 발현 벡터로 트랜스펙션시켜, 숙주 세포에서 재조합 모노클로날 항체가 합성된다.
이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이체) 는 항체 DNA 내로 적당한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써, 또는 뉴클레오티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 수식은, 그러나, 매우 제한 범위에서, 예를 들어 위에 기재된 바와 같이, 실시될 수 있다. 예를 들어, 수식은 위에 언급된 항체 특성 예컨대 IgG 아이소형 및 항원 결합을 변경하지 않으나, 재조합 생산의 수율, 단백질 안정성을 개선하거나 정제를 촉진할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 의미한다. 하나의 구현예에서 HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용되는 표현 "세포," "세포주" 및 "세포 배양" 은 호환되게 사용되고, 이러한 명칭들은 모두 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 전달의 수에 관계 없이 대상 세포 및 그로부터 유래하는 배양물을 포함한다. 또한, 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지는 않을 것이라고 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 것와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
NS0 세포에서의 발현이, 예를 들어, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 에 기재되어 있다. 일시적 발현이, 예를 들어, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝이 Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 이 Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 및 Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 에 기재되어 있다.
원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 자리를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 "작동적으로 연결되어 있다" 고 한다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되어 있다; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다; 또는 리보솜 결합 자리는 그것이 해독을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결되어 있다" 는 것은 연결되어 있는 DNA 서열들이 인접해 있고, 분비 리더의 경우 인접해 있고 해독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 가까운 제한 자리에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 자리가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래의 관습에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환" 은 숙주 세포 내로 벡터/핵산을 전달하는 과정을 나타낸다. 강한 세포 벽 장벽이 없는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 트랜스펙션은 예를 들어 Graham, F.L., and van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467 에 기재된 인산 칼슘 침전법에 의해 실시된다. 그러나, DNA 를 세포 내로 도입하는 다른 방법 예컨대 핵 주입 또는 원형질 융합이 또한 사용될 수 있다. 튼튼한 세포벽 구조를 함유하는 원핵 세포 또는 세포가 사용되는 경우, 예를 들어 트랜스펙션 방법 중 하나는 Cohen, S.N, et al, PNAS. 69 (1972) 2110-2114 et seq 에 기재된 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리법이다.
본원에서 사용되는 "발현" 은 핵산이 mRNA 로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA (또한 전사체로도 언급됨) 가 이후 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 해독되는 과정을 나타낸다. 전사체 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 유전자 산물로 언급된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 에서 유래하는 경우, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터" 는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는 핵산 분자, 특히 자가-복제 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 DNA 또는 RNA 의 세포 내 삽입 (예를 들어, 염색체 통합) 기능을 하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA 의 복제 기능을 하는 복제 벡터, 및 주로 DNA 또는 RNA 의 전사 및/또는 해독 기능을 하는 발현 벡터를 포함한다. 위에 기재된 기능 하나 초과를 제공하는 벡터가 또한 포함된다.
"발현 벡터" 는, 적당한 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 폴리펩티드로 전사 및 해독될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템" 은 보통 원하는 발현 산물을 생산하는 기능을 할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 나타낸다.
세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들어 기타 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 잘 알려진 방법들을 포함하는 표준 기술에 의해 항체의 정제가 실시된다. Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 참조. 단백질 정제를 위한 상이한 방법들이 잘 정립되고 널리 사용되고 있으며, 예를 들면 미생물 단백질을 이용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식의 교환), 호황성 흡착 (예를 들어 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드를 이용함), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산을 이용함), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질을 이용함), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이다.
발명의 하나의 양상은 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 발명의 또다른 양상은 약학적 조성물의 제조를 위한 발명에 따른 항체의 용도이다. 발명의 추가의 양상은 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제공한다.
이들 조성물은 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차에 의해, 그리고 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 당, 염화 나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사용 약학적 형태의 지연된 흡수를 초래할 수 있다.
선택되는 투여 경로에 관계 없이, 본 발명의 화합물 (적합한 수화 형태로 사용될 수 있음), 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적이면서도 환자에게 독성이 아닌 활성 성분의 양을 수득하도록, 본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준이 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 지속기간, 이용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 및 과거 병력 등 의학 분야에서 잘 알려진 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 다를 것이다.
조성물은 멸균되어야 하고 주사기로 전달할 수 있을 정도로 유체여야 한다. 물에 더하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수이다.
예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유체성이 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화 나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.
발명의 하나의 구현예는 암 치료를 위한 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
발명의 또다른 양상은 암 치료를 위한 상기 약학적 조성물이다.
발명의 또다른 양상은 암 치료용 약제의 제조를 위한 발명에 따른 항체의 용도이다.
발명의 또다른 양상은 암을 앓는 환자의 치료 방법으로서, 발명에 따른 항체를 그러한 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
발명의 하나의 구현예는 염증 치료를 위한 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
발명의 또다른 양상은 염증 치료를 위한 상기 약학적 조성물이다.
발명의 또다른 양상은 염증 치료용 약제의 제조를 위한 발명에 따른 항체의 용도이다.
발명의 또다른 양상은 염증을 앓는 환자의 치료 방법으로서, 발명에 따른 항체를 그러한 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
본원에서 사용되는 "약학적 담체" 는 생리적으로 적합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 투여 경로로 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그것의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 화합물을 그러한 물질과 동시에 투여하는 것이 필수적일 수도 있다. 예를 들어, 화합물은 대상에게 적당한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 중에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 약학적 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 물질의 사용이 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 구절 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는" 은 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 통상적으로 주사에 의하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 은 증식성 질환, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비 소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 대장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경관 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 콩팥 또는 수뇨관 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계 (CNS) 의 신생물, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유윙 육종, 상기 임의의 암의 난치성 형태, 또는 상기 암 하나 이상의 조합을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "염증" 은 관절염, 류마티스 관절염, 췌장염, 간염, 맥관염, 건선, 다발성근염, 피부근염, 천식, 염증성 천식, 자가면역 질환 (예를 들어 홍반성 낭창, 염증성 관절염을 포함), 장 염증성 질환 (예를 들어 궤양성 대장염, 염증성 창자 질환, 크론병, 복강 질환을 포함) 및 관련 질환을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 그의 문법적 변형 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는") 은 치료되는 개체의 자연 과정을 변경하기 위한 의료적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 발명의 항체는 질환 발달을 지연시키거나 질환 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
물질, 예를 들어, 약학적 제형/조성물의 "유효량" 은, 필요한 투여량에서 및 시간 동안, 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 나타낸다.
하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 발명의 목적에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변형이 가해질 수 있다고 이해된다.
서열 목록의 설명
실험 절차
실시예
재조합 DNA 기술
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) 에 기재된 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작했다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 지침에 따라 사용했다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이타 관리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보가 Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242 에 제공되어 있다. 항체 사슬의 아미노산을 EU 넘버링 (Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242) 에 따라 넘버링한다. GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 의 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax's Vector NTI Advance 묶음 버전 8.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석달기 및 도해에 사용했다.
DNA 서열분석
SequiServe (Vaterstetten, Germany) 및 Geneart AG (Regensburg, Germany) 에서 이중 나선 서열분석을 실시하여 DNA 서열을 확인했다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 Geneart AG (Regensburg, Germany) 가 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 제조했다. 하나의 제한 엔도뉴클레아제 절단 자리가 측면에 있는 유전자 분절을 pGA18 (ampR) 플라스미드 내로 클로닝했다. 플라스미드 DNA 를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, 농도를 UV 분광분석법으로 측정했다. 서브클로닝된 유전자 조각의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 적당하고/거나 필요한 경우, 5'-BamHI 및 3'-XbaI 제한 자리를 사용했다. 모든 구축물이 진핵 세포에서의 분비를 위한 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 디자인했다.
발현 플라스미드의 구축
모든 중 VH /또는 VL 융합 단백질 및 경쇄 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드의 구축에 Roche 발현 벡터를 사용했다. 상기 벡터는 하기 요소들로 구성된다:
- 선별 마커로서의 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바바 바이러스 (EBV) 의 복제 기점, oriP,
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점,
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 로부터의 조기발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열, 및
- 유일 BamHI 및 XbaI 제한 자리.
면역글로불린 융합 유전자를 유전자 합성에 의해 제조하고, 기재된 바와 같은 pGA18 (ampR) 플라스미드 내로 클로닝했다. 합성된 DNA 분절을 보유하는 pG18 (ampR) 플라스미드 및 Roche 발현 벡터를 BamHI 및 XbaI 제한 효소 (Roche Molecular Biochemicals) 로 소화시키고 아가로스 겔 전기영동을 실시했다. 정제된 중쇄 및 경쇄 코딩 DNA 분절을 그 후 단리된 Roche 발현 벡터 BamHI/XbaI 조각에 결찰시켜 최종 발현 벡터를 수득했다. 최종 발현 벡터로 대장균을 형질전환시키고, 발현된 플라스미드 DNA 를 단리하고 (Miniprep), 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석을 실시했다. 정확한 클론을 150 ㎖ LB-Amp 배지에서 성장시키고, 다시 플라스미드 DNA 를 단리하고 (Maxiprep), 서열 완전성을 DNA 서열분석에 의해 확인했다.
HEK293 세포에서 면역글로불린 변이체의 일시적 발현
FreeStyle™ 293 발현 시스템을 제조사의 지침 (Invitrogen, USA) 에 따라 사용하여 인간 배아 콩팥 293-F 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 재조합 면역글로불린 변이체를 발현시켰다. 간략히, 현탁 FreeStyle™ 293-F 세포를 FreeStyle™ 293 발현 배지에서 37℃/8% CO2 에서 배양하고, 트랜스펙션하는 날에 세포를 새로운 배지에 밀도 1-2x106 생세포/㎖ 로 파종했다. 325 ㎕ 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 ㎍ 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 250 ㎖ 최종 트랜스펙션 부피로 사용하여 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 DNA-293fectin™ 복합체를 제조했다. 325 ㎕ 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 ㎍ 의 "놉-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1:2 몰비로 250 ㎖ 최종 트랜스펙션 부피로 사용하여 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 "놉-인투-홀" DNA-293fectin 복합체를 제조했다. 트랜스펙션한지 7 일 후에 30 분 동안 14000 g 로 원심분리하여 항체 함유 세포 배양물 상청액을 수집하고 멸균 필터 (0.22 ㎛) 를 통해 여과시켰다. 정제 전까지 상청액을 -20℃ 에서 저장했다.
이중특이적 및 대조군 항체의 정제
Protein A-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden) 를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 및 대조군 항체를 정제했다. 간략히, PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형시킨 HiTrap ProteinA HP (5 ㎖) 칼럼에 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 적용했다. 결합되지 않은 단백질을 평형 완충액으로 씻어냈다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.8 로 용리하고, 단백질 함유 분획을 0.1 ㎖ 1 M Tris, pH 8.5 로 중화시켰다. 그 후, 용리된 단백질 분획을 모으고, Amicon Ultra 원심 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 사용하여 부피 3 ㎖ 로 농축하고, 20mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 으로 평형시킨 Superdex200 HiLoad 120 ㎖ 16/60 겔 투과 칼럼 (GE Healthcare, Sweden) 에 로딩했다. 정제된 이중특이적 및 대조군 항체와 5 % 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 분획을 모으고, 1.0 ㎎/㎖ 앨리쿼트로 -80℃ 에서 저장했다.
정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 기초하여 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 확인했다. 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하의 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 이중특이적 및 대조군 항체의 순도 및 분자 질량을 분석했다. NuPAGE® 프리-캐스트 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다 (4-20 % Tris-글라이신 겔). 25℃ 에서 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0 영동용 완충액 중에서 Superdex 200 분석적 크기-배제 칼럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 사용하는 고성능 SEC 에 의해 이중특이적 및 대조군 항체 샘플의 응집체 함량을 분석했다. 25 ㎍ 단백질을 칼럼에 유속 0.5 ㎖/분 으로 주입하고 50 분에 걸쳐 등용매 용리했다. 안정성 분석을 위해, 농도 1 ㎎/㎖ 의 정제된 단백질을 4℃ 및 40℃ 에서 7 일 동안 인큐베이팅한 후, 고성능 SEC 에 의해 평가했다. 펩티드-N-글리코시다제 F (Roche Molecular Biochemicals) 에 의한 효소 처리로 N-글리칸을 제거한 후 NanoElectrospray Q-TOF 질량 분광분석법에 의해 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 백본의 완전성을 확인했다.
실시예 1
표적 1 에 대한 비제한 2가 결합 및 표적 2 에 대한 감소된 결합을 나타내는 발명에 따른 이중특이적 항체의 디자인
첫번째 시도에서 제 2 항원에 특이적인 제 2 결합 모이어티로서 하나의 부가적 Fv 를 보유하는 제 1 항원에 결합하는 전체 항체에 기초하여 유도체를 생성했다 (도 2a 참조). VHCys44 와 VLCys100 사이에 사슬간 다이설파이드를 도입했다 (WO 94/029350, US 5,747,654, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. (1997) 1453-1459; Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Reiter, Y., et al., Protein Engineering 8 (1995) 1323-1331; Webber, K.O., et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter. Y., et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter, Y., et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter, Y., et al., International Journal of Cancer 58 (1994) 142-149; 또는 Reiter, Y., Cancer Research 54 (1994) 2714-2718). dsFv 의 VHCys44 를 전체 항체의 첫번째 중쇄의 CH3 도메인에 융합시키고, 상응하는 VLCys100 모듈을 전체 항체의 두번째 중쇄의 CH3 도메인에 융합시켰다.
박테리아 봉입체 리폴딩 또는 주변세포질 분비에 의해 적정한 수율로 별도로 발현된 모듈로부터 dsFv 가 조립될 수 있음이 이전에 밝혀졌다 (WO 94/029350, US 5,747,654; Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. (1997) 1453-1459).
dsFv 의 하나의 성분을 커넥터 펩티드를 통해 하나의 H-사슬의 C-말단에, 상응하는 다른 성분을 또다른 커넥터 펩티드에 의해 두번째 H-사슬의 C-말단에 연결시켰다. 수득된 단백질이 도 3a 에 제시되어 있고, 커넥터 펩티드가 도 3b 에 열거되어 있다. 이러한 접근의 근거는 H-사슬의 효과적 이합체화가 dsFv 성분들을 함께 모으고 이질이합체화를 촉진하는 것이었다. 2 VH 또는 2 VL 모듈을 함유하는 분자의 비생산적 조립을 감소시키기 위해, 상보적 놉-인투-홀 돌연변이를 IgG 의 H-사슬에 도입했다. 이들 돌연변이는 상이한 H-사슬의 이질이합체화를 촉진하기 위해 Merchant, A.M. 등 (Nature Biotechnology 16 (1998) 677-681 and Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621) 이 고안했으며, 하나의 H-사슬 내의 T366W 돌연변이 및 상응하는 다른 사슬 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이로 이루어진다. dsFv-함유 이중특이체 생성을 위한 우리의 디자인은 VHCys44 에 융합된 CH3 도메인에 '놉' 을 그리고, VLCys100 을 보유하는 H-사슬에 상보적 '홀' 을 도입하는 것이었다.
이질이합체 dsFv 의 양쪽 성분을 CH3 에 계류 (tether) 시켰다. 부피가 큰 CH3 도메인에 VH 및 VL 의 N-말단을 이렇게 동시 부착해도 Fv 의 구조는 영향을 받지 않는다. 그러나, 항원에 따라 (예를 들어 링커 길이 및 각각의 항원 구조에 따라) 항원에 대한 접근성이 제한될 수 있으며, 그 이유는 CDR 영역이 CH3 가 위치하는 방향을 향하기 때문이다. 또한, 2 개의 연결점에서 계류시키면 Fv 가 회전하거나 CH3 옆으로 이동하는 자유가 매우 제한된다. 그 때문에 항원은 CH3 과 Fv 사이를 비집고 들어가야 한다. 이는 항원에의 접근성에 영향을 미치고 친화성을 감소시킬 수 있으며, 실제로 우리는 이를 이중특이적 항체의 이중-연결된 dsFv 모이어티에서 관찰했다 (표 3 의 SPR 데이타 참조). 입체 장애로 인한 항원 접근성 문제와 일관되게, 친화성 측정에서 이중-계류된 dsFv 에 대해 유의하게 감소된 결합률 (on-rate) 이 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, Fv 의 구조적 완전성은 온전해 보이며, 그 이유는 일단 항원이 결합하면 해리율 (off-rate) 이 비수식 항체와 동일하기 때문이다. 이중특이적 항체의 IgG-유사 접근성 팔의 결합에 대한 친화성 값 (예상대로 완전한 친화성을 가짐), 뿐만 아니라 부가적 이중-계류된 dsFv 에 대한 친화성 값이 표 3 에 열거되어 있다. 우리는 이중-계류 후 입체 장애로 인해 결합률이 감소된 dsFv 모듈에 대해 '제한 또는 감소된 결합 모드' 라는 용어를 사용한다.
예시적으로, 하기 항체를 디자인하고 재조합적으로 발현시켰다 (또한 도 2a 를 참조):
실시예 2
표적 1 에 대한 비제한 2가 결합 및 표적 2 에 대한 감소된 결합을 나타내는 발명에 따른 이중특이적 항체의 발현 및 정제
분비된 이중특이적 항체 유도체의 생산을 위해 일시적 발현을 적용했다. L-사슬 및 수식 H-사슬을 인코딩하는 플라스미드로 HEK 293 현탁 세포를 동시-트랜스펙션시켰다. 분비된 항체 유도체를 함유하는 배양물 상청액을 1 주일 후에 수집했다. 이러한 상청액은 정제 전에 동결되고 -20 ℃ 에서 저장될 수 있으며, 이는 수율에 영향을 미치지 않는다. 단백질 A 에 대한 완전한 결합 능력이 증명된 종래의 IgG 과 동일한 방식으로 단백질 A 및 SEC 에 의해 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제했다.
세포 배양물 상청액에서의 발현 수율은 일시적으로 발현된 비수식 항체보다 낮았으나 여전히 적정 범위 내에 있었다. 모든 정제 단계를 완료한 후, 균일한 단백질이 수율 4 ~ 20 ㎎/L 로 수득되었다. 부가적 dsFv 모이어티의 VH 와 VL 사이에 펩티드 링커가 없음에도 불구하고, 안정성 분석은 특이한 농도- 또는 온도 의존적 분해 또는 응집에 대한 징후를 밝히지 못했다. 단백질은 안정적이었고, 동결-해동을 잘 견뎠다. 환원 및 비-환원 조건 하의 3가 이중특이적 항체 유도체 및 그의 성분의 크기, 균일성, 및 조성이 도 4 에 제시되어 있다. 각각의 단백질의 정체 및 조성을 질량 분광분석법에 의해 확인했다 (표 2).
표 2:
이중특이적 항체 유도체의 예시적 발현 및 정제
단백질분해 가공에 의한 제한 결합 자리의 특이적 활성화를 위한 커넥터 펩티드
dsFv 성분의 CH3-도메인에의 이중-계류는 항원 접근을 감소시켜 dsFv 의 기능을 불활성화시킨다. 하나의 커넥터 펩티드 주위에서의 Fv 의 자유 회전은 항원에의 접근을 증가시킬 수 있지만, 2 개의 연결점에서의 dsFv 의 융합은 높은 정도의 유연성 또는 회전을 허용하지 않는다. 그러한 제한 dsFv 모이어티의 불활성화된 결합 기능을 재활성화시키기 위해, 우리는 2 개의 커넥터 펩티드 중 하나에 특이적 프로테아제 인지 자리를 도입했다 (도 3b 에 도식적으로 제시됨). 그러한 접근의 근거는 2 개의 연결 중 오직 하나를 해방시키기 위해 단백질분해 절단을 이용하는 것이었다. 단백질분해 가공 후에도, dsFv 는 여전히 그의 다른 커넥터를 통해 이중특이적 항체의 IgG 백본에 공유적으로 연결될 것이다. 그러나 이중-연결과 대조적으로, 오직 하나의 유연한 연결점에서의 부착은 유연성을 개선하고 자유 회전을 허용하여 항원에의 접근을 촉진할 수 있다. 도 3b 는 프로테아제에 의한 가공이 가능하도록 우리가 적용한 상이한 커넥터 서열을 보여준다. 표준 비-절단성 커넥터는 상이한 도메인으로 구성된 융합 단백질의 생성에 빈번히 사용되던 모티프인, Gly4Ser-반복단위 6 개로 구성된다. 단백질분해 가공을 위해, 우리는 이러한 커넥터의 중심 영역에 특이적 인지 서열을 도입했다.
첫번째 실험에서 커넥터 서열은 기질 메탈로프로테이나제 MMP 2 및 9 에 의해 인지될 수 있다. 높은 수준의 MMP 의 존재는 종양과 같은 병든 조직에 꽤 특이적이다. 이와 대조적으로, 대부분의 '정상적' 포유류 세포 예컨대 우리가 재조합 발현에 사용하는 HEK293 세포에는 유의한 수준의 MMP 가 존재하지 않는다. 그러므로, 제한 dsFv 를 함유하는 이중특이적 독립체는 불활성 전구체로서 발현되지만, 질환 조직에서 MMP2 및/또는 MMP9 에 노출될 때 활성화된다.
게다가 커넥터 서열은 프로테아제 유로키나제-유형-플라스미노겐 활성제 (uPA) 에 의해 인지될 수 있다. uPA 의 과발현은 다양한 악성 종양에서 발견되었고, 종양 침입 및 전이에 관여한다. 이와 대조적으로, 우리가 재조합 발현에 사용하는 HEK293 세포에는 유의한 수준의 uPA 가 존재하지 않는다. 그러므로, 제한 dsFv 를 함유하는 이중특이적 독립체는 불활성 전구체로서 발현되지만, 악성 종양 조직에서 uPA 에 노출될 때 활성화될 수 있었다.
실시예 3
MMP2/9 자리를 함유하는 이중특이적 항체는 제한 형태로 발현되고 정제되고, 오직 MMP2/9 에 노출될 때에만 활성화된다
MMP2/9 에 의해 인지되는 서열을 커넥터 내에 도입함으로써, 제 2 결합 독립체가 예를 들어 종양 또는 염증 조직에서 이러한 프로테아제를 만나기 전까지 불활성인, 이중특이적 dsFv-함유 독립체를 생산할 수 있다. 기질 메탈로프로테이나제 (MMP) 는 일부 질환 조직에서, 예를 들어 종양 또는 염증 조직의 환경에서 높은 수준으로 존재한다 (참고로 표 1 참조). 서열 GPLGMLSQ, GPLGLWAQ 및 GPLGIAGQ 는 MMP2 및 MMP9 에 대한 기질이다 (Netzel-Arnett, JBC, 1991; Netzel-Arnett, Biochemistry, 1993). 이들 서열을 커넥터 서열에 통합하여 MMP2/9 에 의해 해방될 수 있는 dsFv-융합을 생성했다 (도 3b 및 도 3 의 설명). 우리가 재조합 발현에 사용한 HEK293 세포에는 유의한 수준의 MMP 가 존재하지 않는다. 그 때문에, 그러한 커넥터가 있는 독립체의 발현 및 정제로 2 개의 확장된 H-사슬을 갖는 제한 분자가 수득된다. 단백질 A 및 SEC 정제 후 수율 10-20 ㎎/L (표 2 참조) 및 정제된 분자의 조성은 프리시젼 자리를 함유한 이중특이적 변이체와 거의 동일했다 (상기 참조). SDS-PAGE 는 (Her3-독립체의 L-사슬에 더하여) 높이 65 kD 에 단백질 (이중-)밴드가 존재함을 보여준다. 이 밴드는 C-말단에 부가적 커넥터 펩티드 (2 kd) 및 VH 또는 VL 도메인 (13 kD) 을 보유하는 H-사슬 (50 kd) 을 나타낸다.
CH3 과 VL 사이의 커넥터 내의 MMP2/9-자리의 절단으로 dsFv 의 제한이 해소되고, 결합 기능이 완전한 해방된 dsFv 가 초래된다. 도 5b 는 MMP-자리 함유 커넥터가 MMP2 의 존재 하에 절단될 수 있음을 보여준다. 이러한 가공의 결과는 확장된 H-사슬 중 하나가 정상 크기 (52 kd) 로 전환되고 13 kD 의 부가적 VL 도메인이 출현하는 것으로 확인할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법에 의해 보여지는 바와 같이 절단되었을 때에도 분자는 여전히 안정적 다이설파이드 결합에 의해 함께 연결되어 있다.
이중특이적 항체의 제한 및 MMP2 가공된 형태의 친화성의 비교가 표 3 에 열거되어 있다: MMP2 에 의한 가공은 이전에 이미 완전히 접근가능했던 항원 Her3 에 대한 결합을 변화시키지 않았다. 이는 MMP2 가 커넥터 내의 그의 인지 서열을 특이적으로 공격하고, 항체의 다른 위치는 공격하지 않음을 시사한다. 반면, MMP 가공에 의한 입체 장애의 해소는 dsFv 의 기능을 완전히 회복시켰고 cMet 에 대한 친화성을 5 배 초과로 개선했다 (표 3).
표 3:
3가 이중특이적 항체 유도체의 결합 친화성 및 프로테아제 절단 후 상응하는 이중특이적 항체 유도체와의 비교
MMP2/9-절단성 dsFv-함유 이중특이적 항체 유도체를 세포 검정으로 추가로 연구했다: FACS 실험 (도 6) 은 비제한 <Her3> 팔이 Her3-양성 암 세포에 특이적으로 결합함을 보여줬다. Her3 에 의존하는 신호전달 경로를 간섭하는 그의 기능이 또한 완전히 유지되었다 (도 7a).
MMP2/9 에 의해 활성화되는 제한 dsFv 모이어티를 갖는 MMP2/9-인지 자리 함유 이중특이체가 생물학적 기능을 나타내는지에 대한 의문을 다루기 위해, 우리는 A549 폐암 세포에서의 AKT 인산화를 HGF 신호전달에 대한 지표로서 결정했다. 도 7b 는 HGF-매개 AKT 신호전달에서 dsFv-매개 간섭에 대한 판독으로서의 AKT 인산화의 확인의 결과를 보여준다. 제한 형태 (불량한 결합) 가 세포에 적용될 때 오직 미미한 저해 활성을 볼 수 있지만, 푸린-가공된, 및 MMP 가공된 결합 능력이 완전한 형태에 의해 양호한 저해가 매개된다. 이는 dsFv 의 해방이 활성을 매개하는데 필수적임을 확인한다.
실시예 4
uPA 자리를 함유하는 이중특이적 항체는 제한 형태로 발현되고 정제되고, 오직 uPA 에 노출될 때에만 활성화된다
uPA 에 의해 인지되는 서열을 커넥터 내에 도입함으로써, 제 2 결합 독립체가 예를 들어 악성 종양에서 uPA 를 만나기 전까지 불활성인, 이중특이적 dsFv-함유 독립체를 생산할 수 있다. 우리는 uPA 에 대한 양호한 기질로 밝혀진 펩티드 서열 GGGRR 을 선택했다 (Chung, Bioorganic and medical chemistry letters, 2006). 이 서열을 하나의 중쇄의 커넥터 서열에 통합하여, uPA 에 의해 해방되는 dsFv-융합을 생성했다 (도 3b). 우리가 재조합 발현에 사용하는 HEK293 세포에는 유의한 수준의 uPA 가 존재하지 않는다. 그 때문에, uPA-인지 자리 함유 커넥터가 있는 독립체의 발현 및 정제로 2 개의 확장된 H-사슬을 갖는 제한 분자가 수득된다. 단백질 A 및 SEC 정제 후 수율 6-15 ㎎/L (표 2 참조) 및 정제된 분자의 조성은 프리시젼 자리를 함유한 이중특이적 변이체와 거의 동일했다 (상기 참조). SDS-PAGE 는 (Her3-독립체의 L-사슬에 더하여) 높이 65 kD 에 단백질 밴드가 존재함을 보여준다. 이 밴드는 C-말단에 부가적 커넥터 펩티드 (2 kd) 및 VH 또는 VL 도메인 (13 kD) 을 보유하는 H-사슬 (50 kd) 을 나타낸다 (도 4a).
CH3 과 VL 사이의 커넥터 내의 uPA-자리의 절단으로 dsFv 의 제한이 해소되고, 결합 기능이 완전한 해방된 dsFv 가 초래된다. 도 5b 는 uPA-자리 함유 커넥터가 uPA 의 존재 하에 절단될 수 있음을 보여준다. 이러한 가공의 결과는 확장된 H-사슬 중 하나가 정상 크기 (52 kd) 로 전환되고 13 kD 의 부가적 VL 도메인이 출현하는 것으로 확인할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법에 의해 보여지는 바와 같이 절단되었을 때에도 분자는 여전히 안정적 다이설파이드 결합에 의해 함께 연결되어 있다.
이중특이적 항체의 제한 및 uPA 가공된 형태의 친화성의 비교가 표 3 에 열거되어 있다: uPA 에 의한 가공은 이전에 이미 완전히 접근가능했던 항원 Her3 에 대한 결합을 변화시키지 않았다. 이는 uPA 가 커넥터 내의 그의 인지 서열을 특이적으로 공격하고, 항체의 다른 위치는 공격하지 않음을 시사한다. 반면, 프리시젼 또는 푸린에 의한 절단에 대해 위에 나타낸 바와 동일한 방식으로 uPA 가공에 의한 입체 장애의 해소는 dsFv 의 기능을 완전히 회복시켰고, cMet 에 대한 친화성을 6 배 개선했다 (표 3).
uPA-절단성 dsFv-함유 이중특이적 항체 유도체를 세포 검정으로 추가로 연구했다: FACS 실험은 프리시젼- 또는 푸린-활성화된 분자에 대해 나타낸 바와 동일한 효능으로 비제한 <Her3> 팔이 Her3-양성 암 세포에 특이적으로 결합함을 보여줬다. Her3 에 의존하는 신호전달 경로를 간섭하는 그의 기능이 또한 완전히 유지되었다 (도 7a). uPA-절단성 dsFv-함유 이중특이적 항체가 uPA 에 의해 활성화될 수 있는지에 대한 의문을 다루기 위해, 우리는 A549 폐암 세포에서의 AKT 인산화를 HGF 신호전달에 대한 지표로서 결정했다. 대조군으로서, 푸린-활성화된 완전 활성 분자 및 비-절단된 (프리시젼) 제한 분자를 동일한 방식으로 적용했다. 도 7b 는 HGF-매개 AKT 신호전달에서 dsFv-매개 간섭에 대한 판독으로서의 AKT 인산화의 확인의 결과를 보여준다. 미가공 제한 형태 (불량한 결합) 가 세포에 적용될 때 감소된 저해 활성을 볼 수 있지만, 푸린-가공된 결합 능력이 완전한 형태에 의해 양호한 활성이 매개된다. 이는 dsFv 의 해방이 활성을 증가시키는데 필수적임을 확인한다.
이중-활성 보유 이중특이적 항체의 생산에 더하여, 생산 후 가공될 수 있는 하나의 불활성화된 결합 모이어티를 갖는 이중특이체를 생산할 수 있다. 그러한 분자는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 우리는 uPA 또는 MMP 인지 자리에 의해 가공될 수 있는 우리의 실시예 분자로, 우리가 불활성화된 모듈로 병든 세포를 표적화할 수 있고 (비제한 모이어티, 예를 들어 Her3 에 의해), 거기에서 제 2 (예를 들어 cMet) 독립체가 선별적으로 활성화될 수 있음을 증명한다.
이러한 형태는 완전히 활성화된 형태에서 일부 원치 않는 또는 비특이적인 활성을 보유하는 결합 독립체의 표적화되는 전달에 유리하다. 예를 들어, 정상 세포 상의 표적을 인지하지만 정상 세포에서 기능하는 것이 바람직하지 않은 모듈은 질환 조직에 도달할 때까지 은폐될 수 있다. 거기에서, 조직-특이적 프로테아제에 의해 제 2 결합 활성이 해방되어 완전한 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 접근은 '싱크 (sink)' 효과, 즉 원하는 위치에 도달하기 전 풍부한 표적에 대한 원치 않는 결합을 방지할 수 있다. 그것은 또한 항원을 보유하는 비-표적 조직에 대한 항체의 잠재적 (독성) 부작용을 개선 또는 방지할 수 있다. 예를 들어, 감염된 조직에서 또는 종양에서 (uPA 또는 MMP 를 통한) 제한 EGFR 항체의 표적화되는 활성화는 말초 조직에 대한 연관된 생물학적 (부)작용을 개선할 수 있다. 또는 표적화되는 사망-수용체 활성화 모듈의 은폐로 다른 조직에서는 효과를 나타내지 않는 종양 또는 염증 조직에서의 선별적 활성화가 가능할 것이다.
실시예 5
표적 1 에 대한 비제한 2가 결합 및 표적 2 에 대한 감소된 결합을 나타내는 4가 이중특이적 항체의 디자인 (Tv_Erb-LeY_SS_M)
하나의 표적 항원에 대한 비제한 결합 활성 및 제 2 항원에 대한 제한 활성을 갖는 추가의 항체 유도체를 생성할 수 있도록, 우리는 4 개의 항원 결합 자리를 보유하는 분자를 디자인했다. 본원에 기재된 실시예에서, 우리는 종양 세포의 표면에서 빈번히 발현되는 루이스 Y 탄수화물 항원을 인지하는 2 개의 결합 자리가 있는 항체 유도체를 생성했다. 4가 항체 유도체의 다른 2 개의 결합 자리는, 많은 종양 세포의 표면에 증가된 수준으로 존재하지만 여러 정상 조직에서도 발현되는 항원인, EGF-수용체를 인지했다.
하나의 표적 항원에 대한 비제한 결합 활성 및 제 2 항원에 대한 제한 활성을 갖는 4가 항체 유도체의 생성을 위해 우리가 선택한 디자인 형태는 수식 전장 IgG 에 기초했고, 도 8 에 묘사되어 있다: 제 1 특이성을 갖는 항체의 상응하는 VH 및 VL 도메인이 유연한 링커 펩티드를 통해 제 2 특이성의 전체 IgG 의 VH 및 VL 도메인의 N-말단에 융합되어 있다.
전체 분자의 N-말단에 위치하는 VH-VL 이질이합체 (제 1 특이성) 를 VH44-VL100 사슬간 다이설파이드에 의해 추가로 안정화시켰다. 이들 결합 모듈은 Y-형상 IgG 유도체의 2 개의 (확장된) 팔에서 완전히 노출되어 있고, 따라서 동족 표적 항원에 대한 비제한 결합을 매개한다. 우리의 실시예에서, 제 1 (비제한) 특이성은 LewisY (LeY) 항원을 향한다. 그러므로, 쥐 항체 B3 의 재조합 dsFv (VHcys44-VLcys100) 조각의 이전에 공개된 서열을 선택했다 (Brinkmann, U., et al., PNAS 90 (1993) 7538-7542).
제 2 특이성 결합을 매개하는 VH 및 VL 도메인은 제한 결합 모드의 결합 모듈을 형성한다. 이들 Fv 도메인의 N-말단을 제 1 특이성의 부가적 VH 또는 VL 도메인에 계류시켰다. 2 개의 위치에서의 이러한 N-말단 계류로 제 2 표적 항원에 대한 접근이 제한되었다 (그 결과 친화성이 감소되었다). 이들 계류된 Fv 에 의한 제 2 항원 결합의 제한은 VHcys44 또는 VLcys100 을 제한 Fv 의 도메인에 연결시키는 2 개의 펩티드 링커 중 하나 내에 프로테아제-자리를 도입함으로써 해소될 수 있다. 우리의 실시예에서, 제 2 (제한) 특이성은 EGFR 항원으로 향했다. 그 때문에, 에르비툭스 (세툭시맙) 의 이전에 공개된 서열을 선택했다 ({Li, 2005 1 /id}).
LeY dsFv 의 VHcys44 를 세툭시맙의 VH-도메인의 N-말단에 연결시키기 위해 우리가 적용했던 하나의 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGS 였다. 상응하는 제 2 링커는 마지막 8 개의 아미노산이 프로테아제 인지 서열로 대체되어 서열이 GGGGSGGGPLGLWAQ 였다. LeY dsFv 의 VLcys100 을 세툭시맙의 VL-도메인의 N-말단에 연결시키는 링커 서열 내로 우리가 도입했던 프로테아제 인지 서열은 GPLGLWAQ 였다. 이 자리는 MMP2 및 9 에 의해 인지 및 절단되어, 종양에서 절단 및 그에 따른 제 2 특이성의 해방이 가능했다 (표 1 참조). 그 결과 얻어지는 발명에 따른 4가 항체는 명칭이 Tv_Erb-LeY_SS_M 이고, 서열이 SEQ ID NO:16 (프로테아제 절단 자리 (MMP2 및 9 에 의해 절단가능함) 가 있는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 VL-Ckappa 에 융합된 B3 VHcys100 으로 이루어지는 수식 경쇄) 및 SEQ ID NO:17 (프로테아제 절단 자리가 없는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 중쇄에 융합된 B3 VHcys44 로 이루어지는 수식 중쇄) 이다.
발명에 따른 이러한 4가 항체 Tv_Erb-LeY_SS_M 을 인코딩하는 핵산 서열이 합성되었고 (Geneart, Regensburg FRG), 그들의 정체가 핵산 서열분석에 의해 확인되었다. 이러한 항체 유도체의 완전한 아미노산 서열 및 상응하는 핵산 서열이 SEQ ID NO:16 (프로테아제 절단 자리 (MMP2 및 9 에 의해 절단가능함) 가 있는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 VL-Ckappa 에 융합된 B3 VHcys100 으로 이루어지는 수식 경쇄) 및 SEQ ID NO:17 (프로테아제 절단 자리가 없는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 중쇄에 융합된 B3 VHcys44 로 이루어지는 수식 중쇄) 에 나타나 있다.
예시적으로, 하기 항체를 디자인하고 재조합적으로 발현시켰다 (또한 도 2c 참조):
실시예 6
LeY 항원에 대한 비제한 2가 결합 및 EGFR 에 대한 제한 - 활성화가능 결합을 나타내는 4가 이중특이적 항체 (Tv_Erb-LeY_SS_M) 의 발현, 정제 및 특성분석
프로테아제 절단 자리가 있는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 VL-Ckappa 에 융합된 B3 VHcys100 으로 이루어지는 수식 경쇄 (아미노산 서열이 SEQ ID NO:16 임) 및 프로테아제 절단 자리가 없는 펩티드 링커를 통해 세툭시맙 중쇄에 융합된 B3 VHcys44 로 이루어지는 수식 중쇄 (아미노산 서열이 SEQ ID NO:17 임) 를 인코딩하는 핵산 서열을 포유류 세포에서의 발현 및 후속 분비를 위해 벡터 내로 서브클로닝하고, 이들 벡터의 정체를 핵산 서열분석에 의해 확인했다.
분비된 이중특이적 항체 Tv_Erb-LeY_SS_M 의 생산을 위해 일시적 발현을 적용한다. 실시예 1 및 2 에 기재된 바와 동일한 방식으로 수식 L-사슬 및 수식 H-사슬을 인코딩하는 플라스미드로 HEK 293 현탁 세포를 동시-트랜스펙션시킨다. 분비된 항체 유도체를 함유하는 배양물 상청액을 1 주일 후에 수집한다. 그 후 이러한 상청액을 실시예 2 에 기재된 바와 동일한 방식으로 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제에 적용한다.
모든 정제 단계를 완료한 후, 생물물리적 및 기능적 분석을 위한 균일한 단백질 Tv_Erb-LeY_SS_M 이 수득된다. 이들 분석은 안정성 분석 (특정 농도- 또는 온도 의존적 분해 또는 응집의 부재를 확인함), 및 환원 및 비-환원 조건 하의 4가 이중특이적 항체 유도체 및 그들의 성분의 크기, 균일성, 및 조성을 다루는 실험을 포함한다. 단백질 Tv_Erb-LeY_SS_M 의 정체 및 조성을 질량 분광분석법에 의해 확인한다.
EGFR 가변 영역의 LeY dsFv 에의 이중-계류는 항원 접근을 감소시켜, EGFR 결합 모듈의 기능을 불활성화시킨다. 오직 하나의 커넥터 펩티드 주위에서의 Fv 의 자유 회전은 제 2 항원에의 접근을 극적으로 증가시킬 수 있지만, 2 개의 연결점에서의 융합은 높은 정도의 유연성 또는 회전을 허용하지 않는다.
제한 제 2 결합 모이어티의 불활성화된 결합 기능을 재활성화시키기 위해, 우리는 2 개의 커넥터 펩티드 중 하나에 특이적 프로테아제 인지 자리를 도입했다 (도 8 에 도식적으로 제시됨, SEQ ID NO:16 참조). 그러한 접근에 대한 우리의 근거는 2 개의 연결 중 오직 하나를 해방시키기 위해 단백질분해 절단을 이용하는 것이었다. 단백질분해 가공 후에도, dsFv 는 여전히 그의 다른 커넥터를 통해 이중특이적 항체의 IgG 마스터 분자에 공유적으로 연결될 것이다. 그러나 이중-연결과 대조적으로, 오직 하나의 유연한 연결점에서의 부착은 유연성을 개선하고 자유 회전을 허용하여 제 2 항원에의 접근을 촉진할 수 있다.
단백질분해 가공에 의한 제한 결합 자리 (EGFR 을 인지함) 의 특이적 활성화를 평가하기 위해, 우리는 기질 메탈로프로테이나제 (MMP) 2 및 9 에 의해 인지될 수 있는 융합 서열을 함유하는 프로테아제-부위를 함유하는 항체 유도체를 분석한다. 높은 수준의 MMP 의 존재는 종양과 같은 병든 조직에 꽤 특이적이다. 이와 대조적으로, 대부분의 '정상적' 포유류 세포 예컨대 우리가 재조합 발현에 사용하는 HEK293 세포에는 유의한 수준의 MMP 가 존재하지 않는다. 그러므로, 제한 결합 자리를 함유하는 이중특이적 독립체는 불활성 전구체로서 발현되지만 질환 조직에서 MMP2 및/또는 MMP9 에 노출될 때 활성화된다. 게다가, 커넥터 서열은 프로테아제 유로키나제-유형-플라스미노겐 활성제 (uPA) 에 의해 인지될 수 있다. uPA 의 과발현이 다양한 악성 종양에서 발견되었다.
실시예 2 에서의 우리의 발현 연구는 우리가 재조합 발현에 사용한 HEK293 세포에 유의한 수준의 MMP2 및 MMP9 가 존재하지 않음을 밝혔다. 그 때문에, 그러한 커넥터가 있는 독립체의 발현 및 정제로 제 2 결합 자리가 제한된 분자가 생성된다. 이는 절단되지 않은 확장된 경쇄 및 중쇄의 존재를 보여주는 SDS-PAGE 분석에 의해 확인할 수 있다. Tv_Erb-LeY_SS_M 의 VLCys100 과 VL 사이의 커넥터 내의 MMP2/9-자리의 절단으로 EGFR 결합 모이어티의 제한이 해소된다.
이러한 가공의 결과는 확장된 경쇄 중 하나가 정상 크기 (25 kd) 로 전환되고 13 kD 의 부가적 VLcys100 도메인이 출현하는 것으로 확인할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법에 의해 보여지는 바와 같이 절단되었을 때에도 분자는 여전히 안정적 다이설파이드 결합에 의해 함께 연결되어 있다.
제한 EGFR 결합 모이어티의 해소로 LeY 항원 뿐만 아니라 EGFR 에 대한 결합 기능이 제한되지 않는 해방된 분자가 초래된다. 제한 결합 모드로부터 해방된 완전히 접근가능한 결합 모드로의 전환의 효과는 제 2 표적 항원 EGFR 에 대한 결합 친화성을 측정함으로써 입증될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 분석을 통해 제한 형태에서 그의 동족 항원 (EGFR 의 세포외 도메인) 에 대한 제한 세툭시맙 모듈의 감소된 친화성이 보여질 수 있다. MMP2/9-절단은 제한의 해소를 매개하여, 세툭시맙-유래 결합 모듈의 친화성을 개선한다.
실시예 7
MCSP 에 대한 비제한 2가 결합 및 CD95 에 대한 감소된 결합을 나타내는 발명에 따른 이중특이적 항체의 발현 및 정제
(G 4 S) 3 링커를 프로테아제 절단 자리가 없는 펩티드 링커로 사용하고, MMP 특이적 프로테아제 절단 자리가 있는 상이한 링커 (MMP1, MMP2 및 MMP9 특이적 또는 교차-특이적) 를 종양-특이적 프로테아제 절단 자리가 있는 펩티드 링커로 사용하여, MCSP 에 대한 비제한 2가 결합 및 CD95 에 대한 감소된 결합을 나타내는 이중특이적 항체 (도 2d 에 따름) 를 발현시킨다. 분비된 이중특이적 항체 유도체의 생산을 위해 일시적 발현을 적용한다. L-사슬 및 수식 H-사슬을 인코딩하는 플라스미드로 HEK 293 현탁 세포를 동시-트랜스펙션시킨다. 분비되 항체 유도체를 함유하는 배양물 상청액을 1 주 후에 수집한다. 단백질 A 및 SEC 에 의해 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제한다.
수득된 정제된 이중특이적 항체를 SDS PAGE 및 질량 분광분석법을 사용하여 크기, 균일성, 및 조성에 대해 추가로 연구한다. 절단 전후의 결합 친화성을 표면 플라스몬 공명 분석을 통해 측정한다.
<110> Roche Glycart AG
<120> Activatable bispecific antibodies
<130> 26967 WO
<150> EP100173915.9
<151> 2010-08-24
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Her3/MetSS_KHSS_PreSci - HC1 (SS_KnobsHC1_VHcMet)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
465 470 475 480
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
485 490 495
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu
500 505 510
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Met
515 520 525
Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp
530 535 540
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
545 550 555 560
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
565 570 575
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Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Leu Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
465 470 475 480
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
485 490 495
Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser
500 505 510
Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
515 520 525
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser
530 535 540
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
545 550 555 560
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr
565 570 575
Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
580 585 590
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Her3/MetSS_KHSS_M3 - LC (Her3clone29_KO1_LC)
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Arg Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 597
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Her3/MetSS_KHSS_U - HC1 (SS_KnobsHC1_VHcMet)
<400> 13
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
465 470 475 480
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
485 490 495
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu
500 505 510
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Met
515 520 525
Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp
530 535 540
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
545 550 555 560
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
565 570 575
Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
580 585 590
Val Thr Val Ser Ser
595
<210> 14
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Her3/MetSS_KHSS_U - HC2 (SS_HolesHC2_VLcMet_U)
<400> 14
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg
450 455 460
Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
465 470 475 480
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
485 490 495
Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser
500 505 510
Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
515 520 525
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser
530 535 540
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
545 550 555 560
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr
565 570 575
Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
580 585 590
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Her3/MetSS_KHSS_U - LC (Her3clone29_KO1_LC)
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Arg Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 341
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tv_Erb-LeY_SS_M- modified light chain
<400> 16
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln Asp
115 120 125
Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu
130 135 140
Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile
145 150 155 160
His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
165 170 175
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu
195 200 205
Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
210 215 220
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 17
<211> 583
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tv_Erb-LeY_SS_M- modified heavy chain
<400> 17
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp
180 185 190
Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr
210 215 220
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe
225 230 235 240
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
Claims (24)
- a) VH1 도메인 및 VL1 도메인을 포함하는 제 1 항원에 결합하는 제 1 항체, 및
b) 제 2 항원에 결합하는 제 2 항체
를 포함하는 이중특이적 항체로서,
제 2 항체가 전체 항체이고;
VH1 도메인이 N-말단에서 제 1 링커를 통해 제 2 항체의 첫번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있고, VL1 도메인이 N-말단에서 제 2 링커를 통해 제 2 항체의 두번째 중쇄의 C-말단에 융합되어 있고;
하나의 링커는 종양- 또는 염증-특이적 프로테아제 절단 자리를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않고,
제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 5 배 이상 감소된 것을 특징으로 하며;
상기 전체 항체의 중쇄의 첫번째 CH3 도메인 및 전체 항체의 두번째 CH3 도메인 각각이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 경계면이 변경을 포함하는 경계면에서 만나고;
이 경우 i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기로 대체되어, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동에 위치가능한 융기를 생성하고,
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기로 대체되어, 두번째 CH3 도메인의 경계면 내에 첫번째 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치가능한 공동을 생성하는, 이중특이적 항체. - 삭제
- 제 1 항에 있어서, C-말단으로부터 N-말단까지 하기 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체
- 1 개의 VH1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬
- 2 개의 CL-VL2 사슬
- 1 개의 VL1-펩티드 링커-CH3-CH2-CH1-VH2 사슬. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 측쇄 부피가 더 큰 아미노산 잔기가 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 및 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 측쇄 부피가 더 작은 아미노산 잔기가 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체. - 제 5 항에 있어서,
CH3 도메인 사이에 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록 하는 각각의 CH3 도메인의 위치에 시스테인 (C) 잔기를 도입하여 CH3 도메인 둘다가 추가로 변경되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체. - 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
VH1 도메인 및 VL1 도메인이
a) 다이설파이드 가교에 의해; 및/또는
b) CH1 도메인 및 CL 도메인에 의해
안정화되어 있는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
제 1 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화성이 프로테아제 절단 자리가 절단된 상응하는 이중특이적 항체에 비해 10 배 이상 감소된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체. - 삭제
- 암 치료를 위한, 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 항체.
- 염증 치료를 위한, 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 항체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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