KR101596581B1

KR101596581B1 - 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101596581B1
Application number: KR1020140074101A
Authority: KR
Inventors: 전세화; 김윤희; 장한규
Original assignee: 전세화
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2016-02-23
Also published as: US20170151288A1; KR20150145293A; JP2017519050A; WO2015194872A1

Abstract

본 발명은 단백질, 당, 완충액, 및 기본배지; 를 포함하고, 그리고 DMSO, Glycerol 및 혈청을 포함하지 않는 동물세포의 동결 보존용 배지;를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 세포치료제는 세포동결 및 해동과정을 거치면서 세포 내 조직재생촉진물질이 동결보존용 배지로 방출되면서 동물세포 뿐만 아니라 동물세포의 동결보존용 배지 모두가 조직재생 효능이 있는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 세포치료제는 바이알, 앰플 또는 프리필드시린지에 직접 동결 보관 가능하므로 사용편의성이 높고, 동결보존제 및 혈청을 사용하지 않으므로 별도의 세척 단계 없이 환부에 곧바로 적용이 가능하다.

Description

조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물 및 그의 제조방법 {Cell Therapy Preparation Inducing the Release of Cellular Substances for Tissue Regeneration}

본 발명은 동물세포의 동결 보존용 배지 및 동물세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.

세포치료제의 동결보관시 사용되는 동물세포의 동결보존용 배지는 일반적으로 DMSO(dimethylsulfoxide), 글리세롤(glycerol), EG(ethylene glycol)등을 사용하며, 부수적으로 덱스트란(dextran), 글루코스(glucose), 자당(sucrose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 과당(fructose), 트레할로스(trehalose), 라피노스(raffinose) 등을 목적에 따라 조합한 것인데, 목적에 따른 혼합조건이 까다롭기 때문에 제조방법이 복잡하고, 제조시 많은 비용이 소요된다는 단점이 있다. 또한 DMSO와 같은 동물세포의 동결보존용 배지를 사용하는 경우, DMSO는 세포독성을 가지고 있으므로, 동결 후 해동 시 DMSO를 제거하기 위해 세척 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다. 또한 세포생존률을 높이기 위하여 동결보존제의 함량 이상으로 소 유래 혈청 (FBS)을 많이 사용하나, 이는 세포치료제에서 이종단백질의 면역문제를 야기할 수 있으므로 반드시 최종적으로 제거되어야 한다. 또한 기존의 도포용 외용제는 사용 시 가스압을 이용한 별도의 장비로 분무하는 방식이 이용되는바 제조 비용이 높고 사용시 불편한 특징이 있다. 이에 따라, 제조가 간편하고, 별도의 세척과정 없이 바로 환부에 적용 가능한 세포치료제가 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허공보 제1101308호

본 발명의 목적은 동결보존용 배지 및 동물세포를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 동결보존용 배지 및 동물세포를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포치료제를 동결함으로써 조직재생 촉진물질이 방출되는 세포치료제를 제공하는 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단백질, 당, 아미노산, 완충액 및 기본배지를 포함하며, 종래 동결 보존제인 DMSO, Glycerol, Ethylene Glycol 및 혈정(Serum)을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 동물세포의 동결 보존용 배지; 및 동물세포;를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포치료제"는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제로, 본 발명에서는 동물세포를 이용하여 상처가 있는 조직을 재생하기 위해 사용되는 치료제를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "동결 보존용 배지"는 동물세포를 동결하여 보존하는 동안 세포를 보호하여 그 크기 및 형태가 동결 및 해동되는 동안 일정하게 유지되도록 해주는 배양액을 말한다. 또한 본 발명의 동결보존용 배지는 종래 동결보존제로 사용되는 DMSO, Glycerol, Ethylene Glycol 및 혈청을 함유하지 않는바, 별도의 세척단계가 요구되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "조직재생물질"은 동물세포가 방출하는 싸이토카인 등의 단백질을 말한다. 구체적으로 본 발명에서, 세포치료제가 세포동결 및 해동과정을 거치면서 동물세포 내 싸이토카인 등의 단백질을 동결보존용 배지로 방출하게 된다. 따라서 별도의 싸이토카인 방출시간이 요구되지 않으며, 미리 방출되어 있는 싸이토카인에 의해 초기 상처치유능을 촉진할 수 있는 효과를 낸다. 이로써 본 발명은 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제를 제공하며, 본 발명의 세포치료제가 함유하고 있는 싸이토카인이 환부에서 생물학적 대사과정에 의해 방출되어 조직을 재생하게 된다.

세포동결 영향을 미칠 수 있는 요인은 세포의 종류, 세포크기, 세포농도, 온도, 배지조성, pH, 삼투압 등의 여러 요건이 있으나 가장 중요한 것은 동결 시 배지조성이 된다.

본 발명의 구체예에서, 상기 배지 조성 중의 단백질은 전체 배지 중 1 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량이 1 중량% 미만이면 동결시 효과가 저하되고, 50 중량%를 초과하게 되면 세포가 포함하는 유용물질의 측정 실험에 영향을 미칠 수 있다.

또한 상기 동결 보존용 배지에는 당, 비타민 또는 당 및 비타민을 추가로 포함할 수 있다. 당은 전체 배지 조성물 중 당의 범위 0.1 중량% 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 상기 당의 함량이 0.1 중량% 미만에서는 동결효과가 저하되고, 20 중량% 초과에서는 당의 점도가 높아져 세포치료제를 분사하기가 쉽지 않다.

또한 상기 첨가되는 완충액은 전체 배지 조성물 중 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 완충액의 함량이 0.01 중량% 미만에서는 적정 pH의 완충작용이 약하며, 10 중량% 를 초과하는 경우는 완충액의 종류에 따라 세포독성이 있을 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단백질은 알부민(albumin) 등의 혈장단백질, 액틴(actin) 및 케라틴(keratin) 등의 세포구조단백질, 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등의 세포외기질단백질, 인테그린(integrin), 카드헤린(cadherin) 및 셀렉틴(selectin) 등의 세포부착단백질, 형질전환 성장 인자(TGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 등의 성장인자, 인슐린 및 에스트로겐 등의 호르몬, L-알라닌(L-alanine), L-아르기닌(L-arginine), L-시스테인(L-cysteine), L-글루타민(L-glutamine) 및 L-리신(L-lysine) 등의 아미노산 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단백질로 가장 바람직하게는 알부민을 사용할 수 있다. 상기 알부민은 혈청에서 가장 많은 비중의 단백질로서, 다양한 소분자의 캐리어 단백질로 작용하거나, 세포 배양시 세포성장을 돕는 효과가 있어, 세포동결보존제로 사용될 수 있다. 또한 알부민은 세포동결에 범용적으로 사용하는 소 혈청을 대체할 수 있으므로 의약품으로서의 안전성을 높일 수 있고, 세포에서 방출된 다양한 단백질의 안정성 유지에 효과가 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 당은 단당류, 이당류, 다당류를 모두 포함하며 덱스트로스(dextrose), 말토스(maltose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 말토오스(maltose), 라피노스(raffinose), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 이소말토스(isomaltose), 아라비노스(arabinose), 과당(fructose), 멜레디토스(melezitose), 멜리비오스(melibiose), 소비톨(sorbitol), 트리오스(triose), 자일로오스(xylose), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체예에서 바람직하게 상기 당은 수크로스, 라피노스 및/또는 덱스트로스를 사용할 수 있다. 수크로스는 균주에 따라 글리세롤보다 동결보존효과가 높은 것으로 보고되어 있고, 세포의 장기간 보관에 유용하며, 특히 적혈구 세포 동결 보존에 사용할 수 있다. 라피노스는 정자 동결에 특히 바람직하며, 덱스트로스는 적혈구 세포의 동결 보존에 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 비타민은 L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 엽산(folic acid), i-이노시톨(i-inositol), 비타민 B12(Vitamine B12) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 동물세포의 동결보존용 배지는 완충액을 포함한다. 본 발명의 완충액은 세포를 보호하여 그 크기 및 형태가 동결 및 해동되는 동안 일정하게 유지되도록 해주며 저장에 견디는 능력을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 완충액은 헤페스(HEPES), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution), EBSS (Earle's balanced salt solution), 트리신(Tricine), 트리스(tris), 테스(TES), 피페스(PIPES), 구연산 나트륨(Sodium Citrate), 아세트산 나트륨(Sodium Acetate), 인산 나트륨(Sodium phosphate), 소듐 β-글리세로포스페이트(Sodium β-glycerophosphate), 트리에탄올아민(Triethylamine), 중탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate), 염화나트륨(Sodium Chloride), 염화칼륨(Pottasium Chloride), 염화칼슘(Calcium Chloride) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 동물세포의 동결보존용 배지는 기본배지를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, '배지(culture medium)'라 함은 생체외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 말한다. 본 발명의 배지는 동결보존제인 DMSO, Glycerol, Ethylene Glycol 및 혈청을 사용하지 않는 기본배지를 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 기본배지는 인위적으로 합성하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Mineral Essential Medium: Gibco, Invitrogen, Newyork.), G-MEM(Glasgow's Mineral Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM), AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium(Gibco, Newyork, USA), Chang's Medium MesemCult-XF Medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada), Mc Coy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 글리세롤 또는 DMSO는 세포투과성이라 동결 보존 배지에 사용되는 경우, 상기 글리세롤 또는 DMSO가 세포 내에 침투하여 세포 수분량을 감소시킴으로써 동결 시 빙정형성을 억제한다. 그러나 본 발명의 동결보존용 배지는 세포 비침투성 물질인 수크로스, 라피노스, 덱스트로스와 같은 당, 혈청 및 알부민이 포함된다. 따라서 동결 직전 세포 내 수분의 유출을 막아 삼투평형을 조절하여 세포막 손상을 방지하고, 세포투과성 동결보존제인 Glycerol과 DMSO에 비하여 세포독성이 없다.

또한 본 발명의 동물세포의 동결보존용 배지는 동결과정을 거치면서 동물세포 내 사이토카인과 같은 유용물질이 동결보존용 배지로 방출되어, 동물세포뿐만 아니라 동결보존용 배지 그 자체로서 상처를 치료하고, 조직을 재생할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 동물세포는 배지 내 세포농도 1x10⁵ cells/ml 내지 1x10⁸ cells/ml 가 되도록 포함시킬 수 있으며, 바람직하게는 배지 내 세포농도 1X10⁶ cells/ml 내지 1x10⁷ cells/ml가 되도록 포함시킬 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 동물세포는 성체세포 또는 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 성체세포는 표피, 진피, 피하지방층에 존재하는 세포로서, 케라틴 세포, 멜라닌세포, 랑게르한스세포, 머켈세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 지방세포, 모낭줄기세포 및 혈액세포, 간세포, 신경세포, 인대세포, 상피세포, 연골세포, 골세포 등 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에서, 상기 케라틴 세포의 기원조직으로는 분화된 피부, 피부 부속기관 또는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 역분화줄기세포가 적합하다. 기원조직이 피부인 경우에는 포피(foreskin), 겨드랑이, 엉덩이, 유방, 두피, 치골부 또는 음낭으로부터 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 기원조직이 피부 부속기관인 경우에는 모낭, 땀샘, 피지샘 또는 모세혈관에서 유래된 것을 사용하는 것이 적합하다. 모낭은 성숙기(anagen)의 모낭으로부터 유래되고 모낭의 케라틴 세포가 붙어있는 머리카락을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성체줄기세포는 다양한 조직으로부터 분리할 수 있으며, 예를 들어, 태반-유래 줄기세포, 골수-유래 줄기세포, 제대혈-유래 줄기세포, 지방-유래 줄기세포, 낙태아 전뇌 유래 신경줄기세포(stillborn fetal brain derived neural stem cells), 또는 성체세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 등을 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 세포치료제는 피부, 연골, 골, 혈관, 뇌, 간, 심장, 인대, 근육, 척수, 혈액, 골수, 폐, 치아, 신경, 각막, 망막, 식도, 척추, 신장, 췌장 또는 요도로부터 선택되는 조직들을 재생하기 위해 사용될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명은 단백질, 완충액을 기본배지와 혼합하여 동물세포의 동결 보존용 배지를 제조하는 단계; 상기 동물세포의 동결 보존용 배지에 동물세포를 혼입하는 단계; 및 상기 동물세포가 혼입된 동결보존용 배지를 동결하는 단계; 를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포치료제가 동결보관된 바이알, 앰플 또는 프리필드시린지 (Pre-filled Syringe)를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "프리필드시린지"는 주사기내에 약물이 직접 충전된 사전 충전형 주사기를 의미하며, 본 발명에서 세포치료제가 미리 충전되어 보관되어 있는 레디-투-유즈(ready-to-use) 형태의 주사기를 말한다. 본 발명의 프리필드시린지는 세포치료제가 충진되어 있으며, 동결보관 후 해동하여, 별도의 세척단계 없이 곧바로 조직재생을 위해 환부에 적용될 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명의 세포치료제는 프리필드시린지가 아닌 바이알 또는 앰플에 동결보관 후, 환부적용 직전에 시린지를 사용할 수도 있다.

본 발명의 세포치료제는 세포를 주사기에 충진시켜 동결 보관하는 레디-투-유즈(Ready-to-use) 타입의 세포치료제이다. 종래의 세포치료제는 세포가 생착, 분열, 증식, 이동 및 분화 등의 과정에서 분비하는 싸이토카인에 의해 상처가 치료되는 원리를 갖는다. 따라서 세포치료제를 환부에 적용하고 싸이토카인 등의 단백질을 분비하기까지 일정 시간이 소요된다.

이와 달리 본 발명의 동결보존용 배지는 DMSO, Glycerol, Ethylene Glycol 및 혈청을 함유하지 않는바, 별도의 세척단계가 요구되지 않는다. 또한 본 발명의 세포치료제는 세포동결 및 해동과정을 거치면서 동물세포 내 싸이토카인 등의 단백질이 동결보존용 배지 배지로 일부 방출되어 있다. 따라서 별도의 싸이토카인 방출시간이 요구되지 않으며, 미리 방출되어 있는 싸이토카인에 의해 초기 상처치유능을 촉진할 수 있는 효과가 있다. 즉, 본 발명의 세포치료제는 동물세포 및 동결보존용 배지 모두에 상처치유 효능이 있다. 따라서 상기 세포치료제를 프리필드시린지에 충진시켜 동결보관하며, 해동 후 곧바로 환부에 적용이 가능하다. 즉, 본 발명의 동결보관된 세포치료제는, 해동한 후 세척 없이 곧바로 사용할 수 있다. 이로써 본 발명의 세포치료제가 함유하고 있는 싸이토카인이 환부에서 생물학적 대사과정에 의해 방출되어 조직을 재생하게 된다.

본 발명의 세포치료제는 세포동결 및 해동과정을 거치면서 세포 내 싸이토카인 등의 단백질이 동물세포의 동결보존용 배지로 일부 방출되어 있어 상처에 적용 즉시 바로 상처치료를 촉진할 수 있다. 본 발명의 세포치료제는 동물세포 및 동결보존용 배지 모두에 상처치유 효능이 있으므로 방출되어 있는 싸이토카인에 의한 초기 상처치유능을 촉진할 수 있다. 또한 본 발명의 세포치료제는 동결보존제 DMSO, Glycerol, Ethylene Glycol 뿐만 아니라, 혈청을 사용하지 않으므로 별도의 세척 단계 없이 환부에 바로 적용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 프리필드시린지에 담긴 세포치료제를 나타낸다.
도 2는 비교군인 파이펫팅(A) 및 본 발명의 프리필드시린지형 세포치료제(B)를 분사하고 12일 경과 후의 케라틴 세포의 콜로니 형성능을 분석한 결과이다.
도 3은 동결 후 세포 및 동물세포의 세포 용해물 (Cell lysate) 및 무세포상층액(CFS)의 IL-1a, FGF, TGF-a 및 VEGF 사이토카인 방출량을 정량분석한 결과이다.
도 4는 무세포상층액(CFS)의 상처치유능을 분석하기 위해 케라틴 세포의 증식(A) 및 세포 이동능(B)에 미치는 영향을 3일간 분석한 결과이다(CON:음성대조군; EGF:양성대조군; CFS:무세포상층액)
도 5는 ICR 마우스에 상처를 유발하고, 처치하지 않은 음성대조군과 본 발명의 세포치료제 처리 후, 4, 7, 10 및 14일째의 상처부위의 변화를 비교한 것이다.
도 6은 ICR 마우스에 상처를 유발하고, 처치하지 않은 음성대조군과 본 발명의 세포치료제 처리 후, 4, 7, 10 및 14일째의 상처 치료율을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 케라틴 세포( keratinocytes )의 배양 및 동결

실시예 1-1. 케라틴 세포 배양

인간 포어 스킨(Human foreskin)에서 분리한 케라틴 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM:F12(3:1) 배지를 이용하여 3T3 feeder와 공배양하였다. T75 culture flask에서 계대배양을 거친 케라틴 세포를 배양하고, 배양 5~6일째 3T3 feeder를 제거한 후, 케라틴 세포만을 수집하였다.

실시예 1-2. 동물세포의 동결보존용 배지의 제조 및 케라틴 세포의 동결

동물세포의 동결보존을 위한 배지는 1% 인간 알부민, 1% 수크로스, 1% 덱스트로스, 1% 라피노스, 25mM HEPES, 20mM Sodium carbonate (NaHCO3)을 DMEM(GIBCO BRL)배지에 혼합시켜 제조하였다. 상기 배지에 케라틴 세포를 2X10⁶ cells/ml의 세포농도가 되도록 혼합하였다. 혼합한 세포용액을 프리필드시린지에 1 ml씩 옮겨 담고, -20°C 에서 -70°C까지 점진적으로 온도를 낮추어 동결 보관하였다(도 1).

실시예 2: 콜로니 형성능 분석

동결세포를 해동한 후, 프리필드시린지를 이용하여 분사시켜 콜로니 형성능을 분석하였다. 비교군으로는 일반적인 파이펫을 이용한 방법으로 본 발명의 프리필드시린지형 세포치료제와 비교 분석하였다. 총 세포수가 1x10² 이 되도록 배양용기에 분사한 후, 12일간 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지를 이용하여 3T3 feeder와 공배양하였다. 배양 12일째 10% formalin에 고정시킨 후, rhodamine B 염색용액으로 세포를 염색하였다.

파이펫을 이용한 방법과 유사하게 프리필드시린지를 통해 분사한 케라틴 세포는 배양 용기에 골고루 부착되었으며, 10²의 세포를 분사한 경우 배양 12일째 프리필드시린지로 분사한 케라틴 세포의 콜로니 형성능이 파이펫 방식과 비교하여 동등이상으로 관찰되었다(도 2).

실시예 3: 프리필드시린지에 동결 보관된 케라틴 세포 ( keratinocytes )의 사이토카인 분석

프리필드시린지에 동결 보관된 세포를 용해하여 얻은 세포 용해물 (Cell lysate)과 동결보존용 배지로 방출된 사이토카인량을 측정하기 위하여 동결 보관된 세포를 원심분리하여 세포와 배지상층액(무세포상층액, Cell-Free Supernatant, CFS)을 분리하였다. 상처치유에 관여하는 사이토카인을 ELISA법으로 정량한 결과, IL-1α, FGF, VEGF, TGF-α등의 사이토카인이 세포와 동결보존용 배지에서 모두 측정되었다(도 3).

실시예 4: 무세포상층액(CFS)의 in vitro 상처치유능 분석

무세포상층액(CFS)의 상처치유능을 분석하기 위해 재상피화의 주 기전인 케라틴 세포의 증식과 이동능에 미치는 영향을 분석하였다. 프리필드시린지에 동결 보관된 세포를 원심분리하여 상층액만을 분리하였다. 케라틴 세포의 세포증식은 MTT assay법으로, 세포이동은 megacolony assay법을 이용하였으며, 양성대조군으로 1ng/ml EGF를 사용하여 3일간 분석하였다. 분석결과, 세포증식(도 4A)은 배양 3일째 음성대조군(Con)이 140%로 증가한 반면, 무세포상층액(CFS) 처리군에서는 212%로 증가하였고, 양성대조군(EGF)과 유사한 효능을 보였다. 세포이동(도 4B)은 배양 3일째 음성대조군(Con)에 비하여 무세포상층액(CFS) 처리군에서는 1.8배 증가하였고 양성대조군(EGF)과 유사한 효능을 보였다.

실시예 5: 프리필드시린지에 동결 보관된 케라틴 세포 ( keratinocytes )의 in vivo 상처치유능 분석

총 24마리의 ICR(Imprinting Control Region)마우스의 등 부위 털을 제거한 후, 피부의 중앙에 검체 펀치를 사용하여 직경 1.2 cm의 상처를 유발하고, 프리필드시린지에 동결 보관한 케라틴 세포를 상온에서 수 분간 해동시킨 후, 2x10⁴ 및 4x10⁴의 세포가 도포되도록 분사하였다. 바셀린 거즈를 덮고, 폼드레싱 (Mepilex, Safetac)를 덮은 다음, 페하-하프트(Peha-haft, HARTMANN사) 붕대로 상처부위를 고정하고 4일, 7, 10, 14일째 상처부위를 사진 촬영하였다. 상처치유능은 초기 상처의 재상피화 면적 대비 각 날짜의 재상피화 면적을 측정하여 백분율로 분석하였다. 상처유발 10일째, 상처유발 후 처치하지 않은 음성대조군 (defect)에 비하여 2x10⁴ 또는 4x10⁴의 세포를 도포한 경우, 상처치유능이 90 %이상으로 완전히 치유된 것으로 관찰되었다 (도 5 및 도 6).

Claims

단백질, 당, 완충액 및 기본배지를 포함하는 동물세포의 동결 보존용 배지; 및 동물세포;를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물로서,
상기 동물세포의 동결 보존용 배지는 상기 단백질을 전체 배지 조성물 중 1 내지 50 중량%로 포함하고, 상기 당을 전체 배지 조성물 중 0.1 내지 20 중량%로 포함하고, 상기 완충액을 전체 배지 조성물 중 0.01 내지 10 중량%로 포함하고;
상기 동물세포의 동결 보존용 배지는 DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 및 혈청(serum)을 포함하지 않고;
상기 동물세포는 성체세포 또는 줄기세포이고; 그리고
상기 조성물은 동결 보관 후 해동하였을 때 세척 없이 곧바로 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 알부민, 액틴, 케라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 인테그린, 카드헤린, 셀렉틴, 형질전환 성장 인자(TGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린, 에스트로겐 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 당은 덱스트로스(dextrose), 말토스(maltose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 라피노스(raffinose), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 이소말토스(isomaltose), 아라비노스(arabinose), 과당(fructose), 멜레디토스(melezitose), 멜리비오스(melibiose), 소비톨(sorbitol), 트리오스(triose) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 완충액은 헤페스(HEPES), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution), EBSS (Earle's balanced salt solution), 트리신, 트리스, 테스, 피페스, 구연산 나트륨, 아세트산 나트륨, 인산 나트륨, 소듐 β-글리세로포스페이트, 트리에탄올아민, 중탄산수소나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, MEM, BME, F-10, F-12, α-MEM, G-MEM, DMEM:F12, Mc Coy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 성체세포는 케라틴 세포, 멜라닌세포, 랑게르한스세포, 머켈세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 지방세포, 모낭줄기세포, 혈액세포, 간세포, 신경세포, 인대세포, 상피세포, 연골세포, 골세포 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조직은 피부, 연골, 골, 혈관, 뇌, 간, 심장, 인대, 근육, 척수, 혈액, 골수, 폐, 치아, 신경, 각막, 망막, 식도, 척추, 신장, 췌장 또는 요도로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물.
단백질, 당, 완충액을 기본배지와 혼합하여 동물세포의 동결 보존용 배지를 제조하는 단계;
상기 동물세포의 동결 보존용 배지에 동물세포를 혼입하는 단계; 및
상기 동물세포가 혼입된 동결보존용 배지를 동결하는 단계;
를 포함하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물의 제조방법으로서,
상기 동물세포의 동결 보존용 배지는 상기 단백질을 전체 배지 조성물 중 1 내지 50 중량%로 포함하고, 상기 당을 전체 배지 조성물 중 0.1 내지 20 중량%로 포함하고, 상기 완충액을 전체 배지 조성물 중 0.01 내지 10 중량%로 포함하고;
상기 동물세포의 동결 보존용 배지는 DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 및 혈청(serum)을 포함하지 않고;
상기 동물세포는 성체세포 또는 줄기세포이고; 그리고
상기 조성물은 동결 보관 후 해동하였을 때 세척 없이 곧바로 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물의 제조방법.
삭제
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포치료제 조성물이 동결 보관된 바이알, 앰플 또는 프리필드시린지(Pre-filled Syringe).