KR101540920B1

KR101540920B1 - 항원-애주번트 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101540920B1
Application number: KR1020107003372A
Authority: KR
Inventors: 상드린 시가리니; 케빈 하퍼; 맨비 하시자
Original assignee: 사노피 파스퇴르 리미티드
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2015-08-03
Also published as: CN101801343A; US20090110699A1; CN105147611A; AU2008280755A1; WO2009012601A1; AU2008280755B2; US8790658B2; EP2182922A4; JP2015163652A; IL203428A; AU2008280755B9; BRPI0814594A2; EP2182922A1; MX2010001054A; KR20100038448A; ZA201001300B; CA2694083A1; JP2010534622A

Abstract

항원과 애주번트의 유리질 조성물, 및 이 조성물의 제조방법이 개시된다. 또한, 유리질 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형, 유리질 조성물의 재구성된 액체 제형, 백신 조성물, 및 유리질 조성물을 함유하는 키트도 개시된다. 또한, 유리질 조성물을 포유동물에게 투여하는 장치 및 상기 조성물을 투여하여 포유동물의 면역반응을 유도하는 방법도 개시된다.

Description

항원-애주번트 조성물 및 방법{Antigen-adjuvant compositions and methods}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 본 발명에 참고인용된, 2007년 7월 26일자 출원된 임시출원 제60/952,225호에 대해 우선권을 주장한다.

배경

백신 조성물은 일반적으로 하나 이상의 항원을 포함하나, 추가로 하나 이상의 애주번트뿐만 아니라 다양한 다른 성분도 포함한다. 백신 조성물은 흔히 액체 형태로 개체에게 투여되지만, 보관 및 수송을 위해서는 건조된 백신 조성물이 종종 바람직하다. 건조된 백신 조성물에 포함된 성분들의 경시적 안정성은 액체 조성물에 비해 향상될 수 있고, 건조된 조성물은 원심분리도 필요로 하지 않는다. 건조된 조성물은 개체에 투여하기 전에 액체 제형으로 재구성될 수 있다. 하지만, 건조된 백신 조성물의 제조방법은 아마도 조성물을 구성하는 성분들의 완전성을 변경시킴으로써 조성물의 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 알루미늄 염 애주번트(예, 알루미늄 포스페이트 애주번트, 알루미늄 하이드록사이드 애주번트, 명반)를 함유하는 조성물의 동결건조는 면역원성 활성을 상실시킬 수 있다.

각 성분들의 전반적인 완전성 외에도, 백신 조성물내 특성 성분들 간에 상호작용이 또한 조성물의 면역원성에 영향을 미칠 수도 있다. 한 예로, 항원의 알루미늄염 애주번트에 대한 흡착은 백신 조성물 내의 항원들의 면역원성을 증강시키는 것으로 생각된다. 백신 조성물내 애주번트에 항원이 흡착하는 능력에 영향을 미칠 수 있는 요인으로는, 예컨대 항원과 애주번트의 전기 하전, pH, 온도, 이온 강도, 부형제의 존재 및 기타 요인을 비롯한 다양한 요인이 있다. 또한, 백신 조성물의 제조방법, 예컨대 건조 조성물의 제조방법도 일반적으로 항원과 애주번트 사이의 결합에 영향을 미칠 수 있다.

항원과 무기 염 애주번트(예, 알루미늄 염)를 함유하는 안정한 면역원성 건조 백신 제제를 생산할 수 없는 것은 세계적인 백신 보급, 특히 개발도상국에 대한 보급에 영향을 미칠 수 있다. 항원과 애주번트를 함께 함유하는 건조 제제 없이는, 안정성이 떨어지고 감온성이 큰 액체 제제가 일반적으로 사용된다. 이러한 한 예로, 건조된 항원 성분의 재구성에는 알루미늄염 애주번트의 액체 제제가 일반적으로 사용된다. 이러한 재구성 절차의 변동성은 특히 의료 전문가가 부족한 지역에서 백신 산물의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 세계보건기구(WHO)는 이것을 주요 문제 분야로 확인했다. 이에 반해, 항원과 알루미늄 염 애주번트를 함께 함유하는 단일 건조 제제의 재구성은 비교적 간단하다.

요약

항원과 애주번트의 유리질 조성물이 개시된다. 한 예로, 유리질 조성물은 포말(foam) 형태이다. 한 예로, 항원은 단백질 또는 펩타이드이다. 한 예로, 애주번트는 알루미늄 염 애주번트이다. 한 예로, 유리질 조성물은 유리를 형성할 수 있는 폴리올 및/또는 합성 중합체를 함유한다. 유리질 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형뿐만 아니라 재구성된 액체 제형 역시 개시된다. 유리질 조성물의 제조방법, 및 포유동물에 투여하고 면역반응을 유도하는 방법도 개시된다. 또한, 유리질 조성물을 함유하는 키트 및 유리질 조성물로 코팅된 미세바늘 어레이(microneedle array)도 개시된다.

본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면에서, 백신 조성물 및 백신 조성물의 생산방법의 양태는 이하에 제시된 상세한 설명과 함께 실시예를 설명하는 작용을 하며 예시된 것이다. 물론, 도면에 예시된 양태들이 예시의 목적으로 제공된 것이지, 제한하기 위한 것이 아니라는 것은 당연한 것이다. 도면에 예시된 양태들로부터 변화, 변형 및 일탈이 이하에 개시되는 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어남이 없이 이루어질 수 있음은 인식할 수 있을 것이다.
도 1은 본 명세서의 실시예 2에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 포말 건조가 다양한 제제에서 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 효과를 조사한 연구의 예시적 결과이다. 수직 축은 중간 입자 크기의 측정값으로, 단위는 미크론이다.
도 2는 본 명세서의 실시예 3에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 포말 건조가 다양한 제제에서 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 효과를 조사한 연구의 예시적 결과이다. 수직 축은 중간 입자 크기의 측정값으로, 단위는 미크론이다.
도 3은 본 명세서의 실시예 4에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 알루미늄 포스페이트 애주번트를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 외관을 투과 전자 현미경으로 조사한 연구의 예시적 결과이다. 패널 (A)와 (B)의 전자 현미경 사진은 정비례로 150,000배 확대된 것이다. 패널(C)의 전자 현미경 사진은 정비례로 100,000배 확대된 것이다.
도 4는 본 명세서의 실시예 4에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 알루미늄 하이드록사이드 애주번트를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 외관을 투과 전자 현미경으로 조사한 연구의 예시적 결과이다. 전자 현미경 사진은 정비례로 100,000배 확대된 것이다.
도 5는 본 명세서의 실시예 5에 더 상세하게 설명되는 바와 같이, 다른 농도의 수크로스를 함유하는 제제에서 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 포말 건조 효과를 조사한 연구의 예시적 결과이다. 수직 축은 총 용적 백분율의 측정값이다. 수평 축은 평균 입자 크기의 측정값으로, 단위는 미크론이다.
도 6은 본 명세서의 실시예 6에 더 상세하게 설명되는 바와 같이, 알루미늄 애주번트에 대한 단백질 항원의 흡착 시에 포말 건조 효과를 조사한 연구의 예시적 결과이다. 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 백분율은 y축에 제시했다. 본 실험은 이반복으로 실시했다(x축에 샘플 번호 1과 2로 나타냄).
도 7은 본 명세서의 실시예 7에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 포말 건조 제제에서 알루미늄 애주번트에 대한 단백질 항원의 흡착을 경시적으로 조사한 연구의 예시적 결과이다. 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 백분율은 y축에 제시했다. 다양한 샘플들이 분석된 시간(주)은 x축에 제시했다.
도 8은 본 명세서의 실시예 8에 더 상세하게 설명되는 바와 같이 포말 건조 제제에서 알루미늄 애주번트에 대한 단백질 항원의 흡착을 경시적으로 조사한 연구의 예시적 결과이다. 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 백분율은 y축에 제시했다. 다양한 샘플들이 분석된 시간(주)은 x축에 제시했다.
도 9는 본 명세서의 실시예 9에 설명된 바와 같이 생산된 포말 건조 제형의 바이알을 예시한 것이다.
도 10은 본 명세서의 실시예 10에 더 상세하게 설명된 바와 같이 2차 건조가 25℃에서 수행된 건조 포말에서 여러 애주번트에 대한 단백질 항원의 경시적인 흡착을 조사한 연구의 예시적 결과이다. 애주번트에 흡착된 단백질 애주번트의 백분율은 y축에 제시했다. 다양한 샘플들이 분석된 시간(주)은 x축에 제시했다.
도 11은 본 명세서의 실시예 10에 더 상세하게 설명된 바와 같이 2차 건조가 37℃에서 수행된 건조 포말에서 여러 애주번트에 대한 단백질 항원의 경시적인 흡착을 조사한 연구의 예시적 결과이다. 애주번트에 흡착된 단백질 애주번트의 백분율은 y축에 제시했다. 다양한 샘플들이 분석된 시간(주)은 x축에 제시했다.

본 출원은 항원과 애주번트의 고형 유리질 조성물을 기술한다. 한 예로, 유리질 조성물은 기계적으로 안정한 다공성 구조물 또는 포말 형태이다. 한 예로, 유리질 조성물 내의 항원은 애주번트에 흡착되어 있다. 유리질 조성물의 제조방법도 개시된다. 유리질 조성물이 포말인 경우에, 이 조성물의 제조방법이 개시되며 포말 건조라 부른다. 또한, 유리질 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형 및 이 조성물의 제조방법도 개시된다. 항원과 애주번트의 고형 유리질 조성물의 재구성된 액체 형태도 개시된다. 또한, 유리질 항원과 애주번트 조성물의 제형을 이용하여 포유동물의 면역 반응을 유도하는 방법, 유리질 조성물을 함유하는 키트, 및 유리질 조성물의 제형을 포유동물에게 투여하는데 사용되는 방법 및 장치도 개시된다.

정의

다음은 본 명세서를 통해 사용될 수 있는 선택된 용어들의 정의를 포함한다. 이러한 정의들은 용어의 범위에 속하고 실행에 사용될 수 있는 성분들의 다양한 예 및/또는 형태를 포함한다. 이 예들은 제한하기 위한 것이 아니다. 이 용어들의 단수 및 복수 형태 모두 본 정의에 속한다.

본 명세서에 사용된 "애주번트"는 항원의 면역원성을 조절하는 제제 또는 물질을 의미한다. "면역원성을 조절하는"은 항원에 의해 자극된 면역 반응의 크기, 기간 및/또는 특이성을 향상시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 "비정질 고체"는 결정질 구조가 실질적으로 결여된 고체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "항원"은 면역 반응을 개시 및 매개할 수 있는 물질을 의미한다. 면역 반응을 자극 또는 강화시키는 항원은 면역원성이라 할 수 있고 면역원으로 언급될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "비등"은 액체가 기화할 때 일어나는 상 전이를 의미한다. "비등점"은 주어진 압력에서 액체 성질이고, 액체의 기압이 액체가 노출된 외압과 동일한 온도로 정의된다. 비등은 일반적으로 액체 내의 기포화로 육안으로 관찰된다.

본 명세서에 사용된 "포말"은 기계적으로 안정한 다공성 구조를 가진 비정질 고체 형태를 의미한다. 포말은 또한 "포말화된 유리"로 언급될 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "포말 건조"는 포말 형성 공정을 의미한다. 포말 건조는 유리질화 공정의 한 종류이다.

본 명세서에 사용된 "유리"는 실질적으로 비다공성인 비정질 고체의 한 종류이다.

본 명세서에 사용된 "유리 전이 온도"는 유리질 고체가 형성되는 온도를 의미한다. 비정질 고체는 유리 전이 온도 이하에서 유리질 상태이다. 유리 전이 온도는 "T_g"로 약칭될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "폴리올"은 폴리알콜을 의미하고, 더 일반적으로 유리 및/또는 포말을 형성할 수 있는 물질을 의미할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "백신"은 적어도 한 항원의 약제학적으로 허용되는 제형을 의미한다. 이러한 항원의 약제학적으로 허용되는 제형은 또한 제형 또는 투여의 활성, 안정성 등을 향상시키는 애주번트, 부형제, 희석제 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "진공"은 1 atm 또는 760 Torr 미만의 압력을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "점성"은 액체의 "농도" 또는 액체의 내부 유동 저항성을 의미한다. 여기서, 점성으로 언급되는 액체는 일반적으로 이하에 개시되는 바와 같은 포말 건조 공정에서 수행되듯이 진공 하에 비등될 수 있는 유체이다. 점성 액체는 또한 시럽으로 언급되기도 한다. 여기서, 점성 액체는 일반적으로 10⁶-10⁷ 파스칼초(Pascal seconds) 범위의 점도를 갖는다.

본 명세서에 사용된 "유리질 조성물"은 포말 및 유리를 포함하는 비정질 고체 종류를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "유리화"는 재료를 유리질 조성물로 변환시키는 방법을 의미한다.

항원

항원은 일반적으로 면역반응을 자극할 수 있는 물질이다(즉, 항원은 잠재적 면역원성이다). 항원에 의해 자극된 면역 반응은 체액성 또는 세포성 중 하나 또는 양자일 수 있고, 일반적으로 항원에 특이적이다. 따라서, 항원은 항체 분자에 의해 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 물질이다. 많은 종류의 생물학적 분자 및 여타 분자는 항원으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 다당류, 올리고당, 당, 지질, 인지질, 대사산물, 호르몬, 핵산 및 여타 분자, 및 이의 단편 및/또는 배합물을 포함하되, 이에 국한되지 않는 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 임의의 기원과 종류의 항원뿐만 아니라 열거되지 않은 여타 항원들도 본 명세서에 기술된 유리질 조성물 및 방법들에 사용될 수 있다.

항원은 선천적 기원(예, 자기 항원, 자가항원, 종양 관련 항원)에서 유래하거나, 또는 특정 포유동물이나 여타 동물에 외인성 기원(예, 감염성 인자 유래)에서 유래될 수 있다. 항원은 포유동물이 항원에 노출된 후 특이성이 다른 다수의 대응 항체 또는 세포 면역 반응을 일으킬 수 있다. 항원은 면역 반응(예, 면역화)을 유도하기 위해 다양한 경로, 예컨대 섭취, 흡입, 피부 접촉, 피하 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피내 주사, 점막 표면과의 접촉 및 기타 경로 등, 이에 국한되지 않는 경로를 통해 포유동물에게 의도적으로 도입시킬 수 있다.

항원은 세포의 전부 또는 일부, 세균, 바이러스 및 기타 미생물, 및 이들의 일부 또는 배합물과 같이 단일 분자보다 큰 성분의 일부를 포함하거나 그 일부일 수 있다. 세균 및 바이러스, 특히 포유동물의 질병에 원인인 세균 및 바이러스는 본 명세서에 기술된 유리질 조성물 및 방법에 유용할 수 있는 항원의 기원이다. 세균 항원은 세포의 외측 표면, 세포 내부, 편모 또는 여타 성분에서 유래한 단백질, 다당류 및 다른 분자를 포함한다. 다른 항원은 감염된 세포에서 분비되는 것 또는 세포사 또는 세포 파괴시에 방출되는 것일 수 있다. 이러한 항원의 예로는 디프테리아, 파상풍 및 보툴리누스중독 독소를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기술된 유리질 조성물에 사용될 수 있는 항원의 예로는, 로타바이러스 유래의 항원, 구제역의 원인 인자, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 헤르페스바이러스 종(단순 헤르페스 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병, 사이토메갈로바이러스), 광견병 바이러스, 폴리오 바이러스, A형, B형, C형 및 E형 간염, 디스템퍼, 베네주엘라 말 뇌척수염, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 라사 열병 바이러스, 폴리오마 바이러스, 갯과 파르보바이러스, 파필로마 바이러스, 진드기 매개의 뇌염, 우역, 리노바이러스, 장내바이러스, 멩고 바이러스, 파라믹소바이러스(볼거리, 홍역, 호흡기 세포융합 바이러스), 조류 감염성 기관지염 바이러스, HTLV1, HIV-1 및 -2, A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 파르보바이러스, 아데노바이러스, 토가바이러스(풍진, 황열, 뎅기열(예, 전막(pre-membrane) 및 외피 단백질)), 소 호흡기 세포융합 바이러스, 코로나바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 폴리오 바이러스, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 브루셀라 아보티스(Brucella abortis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella) 종, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 스트렙토코커스, 비브리오(Vibrio) (브이.콜레라(V. cholera), 브이.파라헤몰리티커스(V. parahaemolyticus)), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 브루셀라(Brucella) 종, 클렙시엘라(Klebsiella), 마이코박테리아 종(결핵, 조 결핵, BCG, 한센병), 뉴모코커스, 스타필로코커스, 엔테로박터(Enterobacter) 종, 파상풍, 탄저병, 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 수막염균 A, B, C, Y, W, W-135, 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pylori), 로칼리메아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 파스퇴렐라(Pasteurella)(피.헤모리티카(P. haemolytica), 피.멀토시다(P. multocida)), 클라미디아(Chlamydia)(씨.트라코마티스(C. trachomatis), 씨.프시타시(C. psittaci), 씨.뉴모니에(C. pneumonaie)), 매독(트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum)), 헤모필러스(Haemophilus) 종, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형, 마이코플라스마 종, 라임병(보렐리아 버그도페리(Borrelia burgdorferi)), 냉방병, 보툴리누스중독증(클로스트리듐 보툴리넘(Clostridium botulinum)), 코리네박테리엄 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 예르시니아 엔터콜리티카(Yersinia entercolitica), 리케챠 감염, 로키산 홍반열, 티푸스, 에를리흐증, 기생충 및 원생동물, 예컨대 말라리아(플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 피.비박스(P. vivax), 피.말라리에(P. malariae)), 주혈흡충, 트리파노소마, 레이시마니아, 사상충성 선충류, 트리코모나스증, 근육포자충증, 타크니아(Tacnia)(티.사지나타(T. saginata), 티.솔륨(T. solium)), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi), 선모충증(트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis)), 콕시디아증(에이메리아(Eimeria) 종), 진균, 예컨대 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 콕시디오이데스 진균증 등 유래의 항원을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다.

개시된 유리질 조성물 및 방법에 이용되는 항원은 천연 기원에서 유래되는 바와 같이, 항원의 천연 형태일 수 있다. 천연 항원은 또한 다른 형태, 예컨대 덜 독성인 형태로 변환될 수 있고, 이것은 단편이거나 또는 다른 결실, 부가 또는 변형을 포함할 수 있다. 이러한 항원의 변환된 형태는 일반적으로 면역원성을 유지할 것이다. 디프테리아 및 파상풍 유독소는 자연 항원의 해독된 형태의 예로, 이 경우에는 화학적(예, 포름알데하이드) 처리로 생산되었다. 항원의 독성을 제거하는 또 다른 방법은 공지되어 있고, 예컨대 단백질 항원의 효소 분해/단편화, 변성(일반적으로 열 또는 화학적 처리를 통해), 접합, 화학적 변형 및 기타 방법을 포함한다.

당해 분야에서는 단일 백신 제형 중의 다수의 항원을 투여하여 다수의 질병, 감염성 인자, 종류, 혈청형, 혈청변형 등에 대한 보호를 유도하는 것이 일반적이며, 본 발명의 조성물은 이와 유사하게 다수의 항원을 포함할 수 있다. 이와 같이 배합된 항원의 구체적인 예로는, 디프테리아, 파상풍 및 백일해, 및 여타 항원을 포함한다. 또한, 항원은 항원의 면역원성을 매개하는 운반 단백질과 결합될 수 있다. 이와 같이 접합된 항원의 예는 당업계에 공지되어 있고, 약제학적 제형 중에서 백신으로 시판되고 있다. 이러한 예시적 항원, 배합 항원, 운반체 결합된 항원 등은 모두 본 명세서에 기술된 유리질 조성물 및 방법에 포함될 수 있다.

유리질 조성물에 포함되는 항원의 농도는 임의의 농도일 수 있으나, 일반적으로 개체 또는 포유동물에게 투여 시에 면역계를 자극하기에 충분한 것이다. 한 예로, 하나 이상의 항원의 농도는 10㎍/ml이다. 다른 예로, 하나 이상의 항원의 농도는 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎍/ml 일 수 있다. 다른 예로, 항원의 농도는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10mg/ml 또는 그 이상일 수 있다. 또한, 하나 이상의 항원의 농도는 위에 열거한 임의의 두 값 사이의 범위에 포함되는 것일 수 있다.

애주번트

애주번트는 일반적으로 항원의 면역원성을 증강시킬 수 있는 물질이다. 애주번트는 종종 백신 조성물에 첨가되어, 백신 조성물이 개체 또는 포유동물에게 투여되는 동안 및 투여된 후 기능을 한다. 애주번트는 후천적 면역 및 선천적 면역(예, 톨(toll) 유사 수용체)에서 역할을 할 수 있고, 일부 규명되지 않은 것을 비롯한 다양한 방식으로 작용할 수 있다.

자연 및 합성의 많은 물질들은 애주번트로 작용하는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 애주번트는 무기염, 스쿠알렌 혼합물, 뮤라밀 펩타이드, 사포닌 유도체, 마이코박테리움 세포벽 제제, 특정 에멀젼, 모노포스포릴 지질 A, 마이콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 면역자극 복합체(ISCOM), 사이토카인 애주번트, MF59 애주번트, 지질 애주번트, 점막 애주번트, 특정 세균 내독소 및 기타 성분, 특정 올리고뉴클레오타이드, PLG 및 기타 성분을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 이러한 애주번트는 본 명세서에 기술된 유리질 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

본 명세서에 개시된 유리질 조성물에 유용한 애주번트 중에는 무기염 애주번트, 특히 알루미늄 및 칼슘 염 애주번트가 있다. 알루미늄 염 애주번트는 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(결정질 알루미늄 옥시하이드록사이드 또는 AlOOH), 알루미늄 포스페이트 애주번트(비정질 알루미늄 하이드록시포스페이트) 및 명반(칼륨 알루미늄 설페이트 또는 AlK(SO₄)₂)을 포함한다. 조성물에 이용된 애주번트가 알루미늄염 애주번트일 때, 극온에 대한 노출이 흡착된 항원뿐만 아니라 알루미늄 애주번트의 면역원성 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 공지된 바와 같이, 조성물은 일반적으로 극온, 즉 빙점(0℃) 이하 또는 극한 가열(예, 70℃)에 적어도 장시간 동안 노출되지 않아야 한다.

항원이 알루미늄 염 애주번트에 흡착될 수 있다는 것은 당업계에 알려져 있다. 이러한 애주번트에 대한 항원의 흡착에는 적어도 부분적으로 정전기적 인력(electrostatic attraction)이 원인일 수 있다. 이러한 항원과 애주번트 사이의 정전기적 상호작용은 항원의 등전점(IEP)과 알루미늄 염 애주번트의 표면 전하(제로 전하 점 또는 PZC)를 감안해서 최적화할 수 있다. 한 예로, 단백질 항원의 IEP를 측정하고, 원하는 pH에서 반대 표면 전하를 가진 알루미늄 염 애주번트를 선택한다. 예를 들어, 거의 중성 pH에서, IEP < 7인 단백질 항원은 알루미늄 포스페이트 애주번트(PZC < 7)보다 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(PZC > 7)에 더 잘 흡착할 것이다. 이에 반해, 중성 pH에서 IEP > 7인 단백질 항원은 알루미늄 하이드록사이드 애주번트보다 알루미늄 포스페이트 애주번트에 더 잘 흡착할 것이다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 포말 건조 절차는 항원과 애주번트 간에 최적 미만의 정전기적 상호작용을 부분적으로 극복할 수 있어, 애주번트에 대한 항원 흡착을 증가시킨다. 이것은, 포말 건조되지 않은 제제 중의 알루미늄 염 애주번트에 대한 항원의 흡착과 비교했을 때, 포말 건조된 항원과 애주번트 제제에서의 알루미늄 염 애주번트에 대한 항원의 흡착 증가로 표시된다. 이러한 연구 및 결과는 본 명세서의 실시예에 더 상세하게 설명된다. 따라서, 포말 건조 방법은 항원과 애주번트의 최적이 아닌 배합을 사용하기 위한 수단을 제공할 수 있으며, 신규 항원과 애주번트 배합물을 제공할 수 있다. 한 예로, 포말 건조 방법은 알루미늄 포스페이트 애주번트에 흡착되는, IEP < 7인 단백질 항원의 조성물을 제공할 수 있다. 한 예로, 포말 건조 방법은 알루미늄 하이드록사이드 애주번트에 흡착되는 IEP > 7인 단백질 항원 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 항원과 애주번트의 다른 조성물도 생산될 수 있다. 한 예로, 알루미늄 하이드록사이드 애주번트에 흡착되는 IEP < 7인 단백질 항원의 조성물이 생산된다. 한 예로, 알루미늄 포스페이트 애주번트에 흡착되는 IEP > 7인 단백질 항원의 조성물이 생산된다.

유리질 조성물에 함유된 애주번트의 농도는 임의의 농도일 수 있으나, 일반적으로 개체 또는 포유동물에게 투여했을 때 항원의 면역계 자극능을 증강시키기에 충분한 농도이다. 한 예로, 하나 이상의 애주번트의 농도는 0.1mg/ml이다. 다른 예로, 하나 이상의 애주번트의 농도는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 심지어 10.0 mg/ml 또는 그 이상이다. 하나 이상의 애주번트의 농도는 또한 위에 열거한 임의의 두 값 사이의 범위에 속하는 농도일 수 있다.

유리 및 포말 형성 물질

포말 건조와 같은 유리화 공정을 거쳐야 하는 조성물은 일반적으로 유리질 조성물을 형성할 수 있거나 포말화된 유리와 같은 유리질 조성물의 형성을 촉진할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 것이다. 일반적으로, 이러한 물질을 함유하는 액체 제형은 냉각하여, 유리 또는 포말과 같이 결정질 구조가 실질적으로 없는 고체를 형성할 수 있다. 일반적으로, 액체에서 유리 또는 포말로의 변환 또는 전이는 유리 전이 온도(T_g)에서 또는 그 부근에서 일어난다. 일반적으로, 이러한 물질은 유리질 조성물 내의 항원 또는 애주번트의 활성을 방해하지 않는다. 또한, 이러한 물질은 항원 및/또는 애주번트를 안정화시킬 수 있고, 일반적으로 생물학적 성분의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 또한, 이러한 물질은 건조 공정 및 후속 보관에 견디기 위해 항원 및/또는 애주번트의 능력을 향상 또는 촉진시킬 수 있다.

유리 또는 포말을 형성시킬 수 있거나, 또는 유리 또는 포말의 형성을 촉진할 수 있는 다양한 물질이 사용될 수 있다. 이러한 일부 물질로는 당, 탄수화물, 폴리올, 중합체, 단백질, 펩타이드, 아미노산(예, 글리신, 알라닌, 아르기닌, 리신, 글루타민) 및 기타 성분이 포함된다. 이러한 물질의 배합물이 사용될 수도 있다. 이러한 물질은 다양한 명칭 또는 라벨을 사용하여 불릴 수 있다. 예를 들어, 이러한 물질 중 일부는 안정화제, 유리 형성제 또는 포말 형성제, 유리화 증강제, 폴리올, 보호제, 유리 또는 포말 매트릭스 형성 물질 및 여타 명칭으로 불릴 수 있다.

한 예로, 폴리올이 사용될 수 있다. 폴리올의 예로는 단순 당(예, 글루코스, 말토스, 슈크로스, 자일룰로스, 로보스, 만노스, 프럭토스, 라피노스, 트레할로스 등) 또는 탄수화물 당(예, 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨, 자일리톨, 말티톨, 시오말트, 락티톨 등)이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 락토스, 라피노스, 트레할로스, 슈크로스 등과 같은 물질은 안정화 당으로 불리기도 한다. 소르보스, 피스코스, 리불로스, 에리트룰로스 및 디하이드록시디메틸케톤과 같은 물질이 사용되기도 한다. 사용될 수 있는 메틸화된 단당류의 예로는 일부 아라비노 피라노사이드, 갈락토 피라노사이드, 글루코 피라노사이드, 만노 피라노사이드 또는 자일로 피라노사이드가 포함될 수 있다. 일부 경우에, "폴리올"이란 용어는 일반적으로 유리 및/또는 포말을 형성할 수 있는 물질 또는 유리 및/또는 포말의 형성을 촉진할 수 있는 물질을 지칭하는데 사용되기도 한다.

단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 이들의 대응하는 당 알콜은 유리 또는 포말을 형성하는데 또는 유리 또는 포말 형성을 촉진하는데 사용될 수 있다. 당 알콜 글리코사이드가 사용될 수 있다. 폴리하이드록시 화합물, 예컨대 탄수화물 유도체 및 화학적 변형 탄수화물이 사용될 수 있다. 팔라티니트(α-D-글루코피라노실-1 → 6-소르비톨(GPS) 및 α-D-글루코피라노실-1 → 6-만니톨(GPM)) 또는 이의 각각의 GPS 또는 GPM 성분이 사용되기도 한다. 일부 예에서, 수크로스, 메틸 α-D-글루코사이드, 2-HP-β-사이클로덱스트린 및 아르기닌은 단독으로 또는 다양한 배합물로 사용되기도 한다. 또한, 다당류가 사용될 수도 있다.

한 예에서, 중합체가 또한 본 명세서에 개시된 유리질 조성물의 형성 또는 형성 촉진이나 증강에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 중합체의 일부 예에는 폴리에틸렌 글리콜, 하이드록시에틸 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌이민 등이 포함된다. 당 공중합체, 예컨대 피콜 및 덱스트란도 사용될 수 있다.

폴리올, 또는 다른 포말 또는 유리 형성 또는 촉진 물질, 또는 이 물질들의 배합물의 농도는 일반적으로 점성 액체 조성물을 달성하기에 또는 액체의 점도 증가를 위해 설계된 공정 단계(이 단계의 논의는 이하에 설명됨) 이후에 점성 액체 조성물을 달성하기에 충분한 농도이다. 한 예에서, 폴리올, 합성 중합체 및 기타 유리 또는 포말 형성 물질의 총 농도는 5%이다. 한 예에서, 폴리올, 합성 중합체 및 기타 유리 또는 포말 형성물질의 총 농도는 적어도 5%이다. 다른 예에서, 상기 물질의 총 농도는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 심지어 그 이상이다. 또한, 하나 이상의 유리 또는 포말 형성 물질의 농도는 위에 열거한 임의의 두 값 사이의 범위에 속하는 것일 수 있다.

항원/애주번트/ 폴리올을 함유하는 액체

일반적으로, 항원, 애주번트 및 유리/포말 형성 또는 촉진 물질(예, 폴리올)을 함유하는 액체와 가능하다면 이하 논의될 다른 물질은 액체에 배합된 뒤, 이하에 논의되는 포말 건조 공정으로 처리된다. 이 성분들은 다양한 방식으로 액체에 배합될 수 있다. 한 예로, 항원과 애주번트가 먼저 액체에 배합되고 그 다음 폴리올이 첨가된다. 항원과 애주번트는 폴리올이 첨가되기 전에 일정 시간(예, 24 내지 48시간) 동안 액체에 함께 존재할 수 있다. 항원과 애주번트는 폴리올의 첨가 전에 다양한 온도(예, 2 내지 8℃)에서 항온처리될 수 있다. 이것은 항원과 애주번트 사이의 결합을 촉진할 수 있다. 다른 예로, 항원, 애주번트 및 폴리올이 동시에 액체에 첨가된다. 성분을 첨가하는 다른 조합도 가능하다.

항원, 애주번트 및 폴리올을 함유하는 액체는 일반적으로 수성 액체이나, 유기물이 사용되는 항원, 애주번트 및 폴리올과 융화성이면 적어도 약간의 농도로 유기물이 존재할 수도 있다. 수성 액체인 경우에, 액체는 완충화될 수 있다. 일반적으로, 사용된 완충계는 사용되는 항원, 애주번트 및 폴리올과 융화성이다.

다른 물질

항원, 애주번트 및 폴리올 외에 다른 물질은 유리질 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 이러한 다른 물질은 포말 건조 방법에 사용되어야 하는 항원/애주번트/폴리올을 함유하는 액체에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 물질은 예를 들어 포말 건조되어야 하는 액체의 성분인 항원, 애주번트 또는 폴리올의 가용화를 돕는 물질, 유리 또는 포말 형성을 증강시키거나 유리 또는 포말을 안정화시키는 물질, T_g에 영향을 미치는 물질, 유리 또는 포말의 건조를 증강시키는 물질, 유리 또는 포말 중의 항원 및/또는 애주번트를 안정화시키는(예컨대 분해(밀리아드 반응) 또는 응집을 방지하는) 물질, 및 다른 기능을 수행하는 물질을 포함할 수 있다. 또한, 염은 포말 건조되어야 하는 액체에 첨가될 수 있고, 유리질 조성물에 혼입될 수 있다. 생물학적 제제, 생물학적 조절물질, 약제학적 제제 등도 첨가될 수 있다.

포말 및 포말 건조

항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태는 유리화를 통해 제조된다. 유리화는 재료를 결정질 구조가 실질적으로 없는 유리계 비정질 고체로 변환시키는 방법이다. 또한, 유리화는 재료를 포말로 변환시키는 것을 의미한다. 유리질 고체의 고형화는 재료의 성질인 유리전이온도(T_g)에서 일어나고, 재료의 냉각 동안 일어난다. 유리전이온도는 유리 및 플라스틱과 같은 전적으로 또는 부분적으로 비정질인 상에 적용할 수 있다. 유리전이온도에서 또는 그 이하에서, 비정질 재료의 물성은 유리질 비정질 고체로 변환된다.

본 명세서에 개시된 유리질 고체 형태는 포말일 수 있다. 포말은 일반적으로 표면적이 큰, 안정한 다공성 구조이다. 포말은 두께가 다양할 수 있고, 일반적으로 유사 조성물의 비-포말 형태(예, 실제 유리)보다 덜 치밀하다. 본 명세서에 개시된 포말은 또한 포말화된 유리, 포말화된 유리 매트릭스, 건조된 포말 및 안정화된 포말이라고도 지칭되었다. 포말 건조 절차 및 이 방법과 절차를 수행하는 장치는 개시되어 있다(예컨대, 미국 특허 5,766,520, 6,509,146 및 6,964,771, 각 전문이 참고 인용됨). 포말 건조 방법은 일반적으로 포말 형성에 의해 다른 유리화 프로토콜과 구별된다. 포말은 다양한 액체, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 혼합물 및 용액으로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 적어도 액체가 항원을 함유하는 예에서, 제조된 액체는 생물학적 제제와 융화성이다.

포말 건조 방법은 샘플로부터 액체의 증발 및 포말의 형성을 유발하기 위해 진공 하에 액체의 비등을 이용한다. 비등은 대기압(즉, 진공 무존재)에서 액체를 비등시키는데 필요할 수 있는 고온으로 샘플이 처리되지 않도록 하기 위해 진공 하에 수행한다. 한 예에서, 액체가 비등되는 진공은 비교적 고 진공이다. 한 예에서, 압력은 <25 Torr(약 0.033 atm 미만)이다. 다른 예에서, 압력은 <10 Torr(약 0.013 atm 미만), <8 Torr(약 0.010 atm 미만) 또는 <5 Torr(약 0.007 atm 미만)이다. 일반적으로, 진공은 포말이 형성될 때까지 유지하지만, 포말이 형성된 후에도 일정 시간 동안 진공을 유지할 수 있다. 연속적인 진공의 적용은 형성된 포말의 잔류 수분 함량을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 진공은 약 4시간 동안 유지될 수 있지만, 진공의 기간은 이것보다 가감될 수 있다. 다른 예에서, 진공은 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 심지어 48시간 동안 유지될 수 있다.

비등 과정 동안 일어나는 액체의 증발은 일반적으로 샘플에 냉각 효과가 있어, 비등 동안 샘플 온도는 감소한다. 또한, 액체의 증발은 일반적으로 샘플의 유리전이온도(T_g)를 증가시키는 효과가 있어, 비등 동안 샘플의 T_g는 증가한다. 비등 과정 동안에 일정 시점에서 샘플 온도와 T_g는 일치하여 같아진다. 이 시점에서, 증가하는 T_g 이하로 샘플 온도가 계속 감소할 때 유리질 고체가 형성된다. 한 예에서, 유리질 고체는 포말이다.

비등 과정 동안, 샘플의 온도는 변동될 수 있지만, 일반적으로 샘플 중의 생물학적 재료의 원하는 성질(예, 면역원성)이 보유될 정도의 범위 내에서 유지된다. 한 예로, 비등 과정 동안의 온도는 100℃ 이하, 0℃ 이상일 수 있다. 한 예에서, 샘플의 온도는 70℃ 이하, 0℃ 이상을 유지한다. 다른 온도 범위도 가능하다. 한 예에서, 샘플의 적어도 일부는 적어도 순간적으로 0℃ 이하로 내려간다. 이 때, 슬러리가 형성될 것이다. 이러한 비등 단계를 수행하여 포말을 수득하는데 사용되는 장치는 일반적으로 이 공정 동안 샘플의 진공과 온도를 조절하는 능력이 있다. 일부 경우, 통상의 동결건조기 또는 변형 동결건조기가 사용될 수 있다.

포말 건조 공정의 전술한 "비등" 단계 전에, 공정 단계는 포말 건조 공정의 비등 단계로 처리되어야 하는 액체, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 혼합물 또는 용액의 점도를 증가시키도록 설계된 공정 단계가 수행될 수 있다. 일부 경우에, 이 단계는 선택적일 수 있다. "점도 증가" 단계는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 방법에서, 액체 샘플은 비교적 낮은 진공(예, 약 0.9 내지 0.1 atm 범위의 압력)으로 처리될 수 있다. 한 예에서는 약 0.2 atm 또는 152 Torr의 압력이 사용되기도 한다. 다른 압력이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 압력은 <1 atm, <0.9 atm, <0.8 atm, <0.7 atm, <0.6 atm, <0.5 atm, <0.4 atm, <0.3 atm, <0.2 atm 또는 심지어 <0.1 atm일 수 있다. 비교적 낮은 진공은 실온 또는 다른 온도에서 적용될 수 있다. 다른 방법에서, 액체는 진공 하의 비등에 의해 기화될 수 있다. 이 단계는 앞서 설명한 포말 건조 공정의 비등 단계와 별도로 수행하거나 연속해서 수행할 수 있다. 이 후자의 방법은 전술한 비등 단계에서와 유사한 조건 하에 수행될 수 있지만, 진공이 적용되는 진공과 기간은 다를 수 있다. 이러한 점도 증가 공정 단계 결말에는 출발 액체의 점도보다 높은 점도의 액체가 일반적으로 수득된다. 일부 경우에, 이러한 높은 점도의 액체는 시럽이라 불리기도 한다. 높은 점도의 액체는 전술한 포말을 수득하기 위해 비등 단계로 처리될 수 있다.

비등 단계 후에는 비등 단계로부터 수득되는 포말을 건조하거나 또는 포말의 수분 함량을 줄이기 위해 설계되는 공정 단계가 포함될 수 있다. 일부 경우에, 이 단계는 선택적일 수 있다. 이 단계는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 한 예에서, 포말은 진공(진공 건조)로 처리될 수 있다. 진공 건조의 한 예에서, 압력은 <5 Torr(약 0.007 atm 미만)일 수 있다. 다른 예에서, 압력은 <1 Torr(약 0.0013 atm 미만)일 수 있다. 다른 압력이 진공 건조 단계에 사용될 수도 있다. 다른 예에서, 포말은 건조제, 예컨대 DRIERITE™의 존재 하에 보관될 수 있다. 다른 예에서, 포말은 건조제의 존재 하에 진공 건조될 수도 있다. 포말의 수분 함량을 감소시키는 다른 방법이 사용될 수도 있다. 이러한 "2차 건조" 단계는 다양한 온도에서 다양한 기간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 2차 건조는 25, 37, 40, 55℃ 또는 다른 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 2차 건조는 일정 시간, 일정 일 수, 일정 주일 또는 일정 개월 동안 수행될 수 있다. 종종, 2차 건조 절차는 샘플 크기, 초기 수분 농도 등에 따라 연장된 시간 동안 진행될 수 있다. 한 예에서, 절차는 12시간이 넘는 기간 동안 수행되고 일반적으로 24시간 또는 48시간 넘게 수행되기도 한다. 당업자는 충분한 건조를 달성하기 위해 통상의 실험으로 더욱 정확한 파라미터를 알아낼 수 있을 것이다. 대안적으로, 샘플에 존재하는 물의 농도는 샘플의 원하는 잔류 수분에 도달하면 2차 건조 단계가 정지될 수 있도록 다양한 센서 시스템에 의해 측정될 수 있다.

일반적으로, 2차 건조 공정 단계의 완료 시에 샘플의 잔류 수분 함량은 2차 건조 단계를 거치기 전 샘플의 잔류 수분 함량보다 적다. 예를 들어, 2차 건조 공정을 완료한 샘플은 잔류 수분 함량이 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 심지어 그 이하일 수 있다. 수분 함량은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 한 예에서, 칼 피셔 기술이 유리질 고체의 잔류 수분 함량을 측정하는데 사용된다. 이 단계에 의해 달성되는 포말의 수분 함량 감소는 포말이 아닌 유리질 조성물에 비해 포말의 증가된 표면적으로 인해 촉진된다.

전술한 2차 건조 단계에 의해 제공되는, 샘플 수분 함량의 추가 감소는 샘플의 유리전이온도(T_g)를 증가시키는 것으로 생각된다. 전술한 바와 같이, 유리질 상태는 샘플이 T_g 이하로 냉각될 때 비등 단계 동안 형성된다. 후속 2차 건조 단계는 일반적으로 유리질 샘플의 수분 함량의 추가 감소 및 T_g 증가를 유발한다. T_g에서 또는 그 이상에서 유리질 샘플의 가열 또는 보관은 유리질 샘플의 변화를 유발할 수 있고, 이는 샘플 성분의 장기 안정성에 유익하지 않을 수 있다. 따라서, 유리질 샘플은 일반적으로 T_g 이하에서 보관한다. 수분 함량 감소, 이에 따른 T_g 증가로 인해, 샘플은 이 샘플이나 이의 성분들의 안정성에 영향을 미침이 없이 고온에서 보관될 수 있다(아마도 저온 유통 체인 또는 온도 조절 유통 체인의 필요를 줄일 수 있다). 일반적으로, 샘플은 2차 건조 단계 종료 시 또는 그 후에 T_g 이하의 온도로 냉각하여, 샘플이 액체로 재구성되어 개체에 투여할 때까지 샘플 보관 중에 안정한 형태를 유지하게 할 수 있다.

본 명세서에 예시된 한 예에 따르면, 항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태는 이하에 제시되는 포말 건조 방법을 이용하여 제조한다:

(1) 항원, 애주번트 및 폴리올을 함유하는 점성 액체의 제조;

(2) 진공 하 비등에 의한 기계적으로 안정한 다공성 구조("포말")의 형성;

(3) 혼합물의 유리전이온도를 원하는 보관 온도 이상으로 증가시키기에 충분한, 샘플로부터 수분을 제거하기 위한 증가된 진공에 포말의 노출; 및

(4) 보관 온도에서 장기간 안정성을 나타내는 항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태를 달성하기 위한 유리전이온도 이하로의 샘플의 냉각.

유리질 조성물의 특징은 조성물의 항원과 애주번트가 모두 완전성(즉, 유의적으로 분해 또는 응집하지 않음)을 보유한다는 것이다. 예를 들어, 유리질 조성물의 항원은 유의적인 분해가 없는 것으로 확인된다. 항원의 완전성은 심지어 항원을 함유하는 유리질 조성물이 일정 시간 동안 보관될 때에도 실질적으로 유지된다. 한 예로, 포말 건조된 제제 중의 단백질 항원은 실질적인 분해가 없고 25℃, 37℃ 또는 55℃에서 52주 동안 보관된 후에도 순도를 유지한다. 또한, 애주번트의 완전성도 유리질 조성물에서 유지된다. 한 예에서, 포말 건조된 알루미늄 염 애주번트는 광산란법으로 측정하고 투과전자현미경으로 관찰 시, 응집 또는 분해하지 않는다.

유리질 조성물의 특징은 애주번트에 대한 항원의 흡착이다. 애주번트에 대한 항원의 흡착은 또한 애주번트에 대한 항원의 결합 또는 항원과 애주번트 사이의 결합이라고 언급되기도 한다. 유리 및 포말 제제의 특징은, 유리화 공정을 거치지 않은 항원과 애주번트의 액체 제제에 비해 더 많은 항원이 애주번트에 흡착되는 것이다. 한 예로, 포말 건조된 제제 중의 애주번트에 대한 항원의 흡착은 포말 건조된 제제가 액체 형태로 재구성된 다음에 측정한다. 한 예로, 이와 같이 재구성된 제제 중의 애주번트는 원심분리에 의해 침전되어 액체로부터 분리될 수 있다. 그 다음, 애주번트와 결합되거나 애주번트에 흡착된 항원의 양을 측정할 수 있다. 한 예로, 유리질 조성물에 존재하는 항원의 적어도 10%가 애주번트에 흡착된다. 한 예로, 유리질 조성물에 존재하는 항원의 적어도 20%가 애주번트에 흡착된다. 한 예로, 유리질 조성물에 존재하는 항원의 적어도 30%가 애주번트에 흡착된다. 다른 예에서는 유리질 조성물에 존재하는 항원의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%가 조성물 중의 애주번트에 흡착된다. 이러한 항원과 애주번트 사이의 결합은 유리질 조성물이 다양한 온도에서 일정 기간(수주, 수개월 또는 심지어 수년) 동안 보관될 때 유지된다. 한 예에서, 항원은 유리질 조성물이 25, 37 또는 55℃에서 52주 동안 보관된 후에도 애주번트에 흡착되어 있는 것으로 관찰된다. 다른 보관 온도가 사용될 수도 있다.

제형 및 투여

고체 유리질 조성물, 및 이 유리질 조성물의 재구성된 액체 제형에 존재하는 항원은 조성물이 투여된 포유동물이나 개체에서 면역 반응을 자극하는 능력 또는 면역원성 활성을 보유한다. 마찬가지로, 고체 유리질 조성물 및 이 유리질 조성물의 재구성된 액체 제형에 존재하는 애주번트는 조성물의 항원의 면역원성을 증강시키는 능력을 보유한다.

한 예로, 항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태는 백신의 제조에 유용할 수 있다. 일반적으로, 백신은 항원/애주번트/폴리올 유리질 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형이다. 항원, 애주번트 및 폴리올 성분 외에, 백신 조성물은 안정화제, 유화제, 보존제, 운반체뿐만 아니라 pH 및/또는 등장성에 영향을 미치는 물질을 포함할 수 있는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 다른 치료제를 비롯한 다른 물질이 포함되어도 좋다. 이러한 물질들은 유리질 조성물의 일부일 수도 있고, 또는 유리질 조성물의 재구성된 액체 제형에 첨가되어도 좋다. 이러한 물질들은 다양한 기능, 예컨대 안정성 증강, 약제학적 허용성, 전달 개선 등을 수행할 수 있다.

또한, 백신 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형은 희석제 및 다른 부형제를 포함할 수도 있다. 희석제의 예로는 결합제, 붕해제 또는 분산제, 예컨대 전분, 셀룰로스 유도체, 페놀, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 글리세린을 포함할 수 있다. 다른 부형제로는 폴리소르베이트(Tween) 80 등이 포함될 수 있다.

항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태는 항원/애주번트/폴리올 조성물의 유리질 고체 형태 및 유리질 고체를 통상의 장치 또는 여타 장치를 이용하여 포유동물에게 투여하기 위해 용이하게 재구성시키기 위한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 재구성 용액을 포함하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 조성물의 액체 형태를 투여하는 장치(예, 피하주사기, 미세바늘 어레이)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 유리질 백신 조성물 또는 이의 제형을 개체 또는 다른 포유동물에게 투여하여 포유동물의 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이것은 포유동물의 면역계에 항원/애주번트를 노출시키기 위해 포유동물에게 조성물의 약제학적으로 허용되는 제형을 투여함으로써 달성할 수 있다. 투여는 1회 수행하거나 또는 수회 수행할 수 있다. 한 예로, 1회 또는 그 이상의 투여는 소위 "초회 자극(prime-boost)" 프로토콜의 일부로 수행될 수 있다. 다른 투여 시스템으로는 시간 방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템이 포함될 수 있다.

허용될 수 있는 투여 경로로는 피내 투여(주사기 또는 미세바늘 어레이 시스템), 경구 투여, 직장 투여, 표면 투여, 비측 투여, 점막 투여, 근육내, 정맥내, 피하 또는 여타 비경구 투여 경로가 포함된다. 본 명세서에 개시된 조성물에 포유동물의 노출은 포유동물에 일시적 또는 영구적인 면역 반응을 형성시킬 수 있다. 면역 반응은 이후 항원에 노출 시, 종종 이후 항원이 유도되는 감염성 인자에 노출 시 포유동물을 보호할 수 있다. 또한, 치료 효과도 가능하다.

본 명세서에 개시된 조성물 및 백신은 또한 다양한 전달 시스템에 혼입될 수 있다. 한 예로, 조성물은 투여용 "미세바늘 어레이" 또는 "미세바늘 패치"에 적용될 수 있다. 이러한 미세바늘 어레이 또는 패치는 일반적으로 백킹재(backing material)에 부착되고 건조 백신 형태로 코팅된 복수의 바늘형 돌기를 포함한다. 포유동물의 피부에 적용되었을 때, 바늘형 돌기는 피부를 뚫고 들어가 백신을 전달하여 피검 포유동물의 면역화를 실시한다.

한 양태에서, 항원/애주번트/폴리올 조성물을 함유하는 용액은 포말 건조 공정 전에 미세바늘 어레이에 적용되고, 코팅된 마이크로어레이가 그 다음 포말 건조 공정에 노출된다. 다른 양태에 따르면, 포말 건조 공정의 초기 단계에 제조된 점성 용액(즉, 비등 공정 단계 전에)을 미세바늘 어레이의 표면 위에 코팅하고, 이 점성 용액 코팅된 미세바늘 어레이에 나머지 포말 건조 절차를 실시한다. 어떠한 절차 하에서도 적어도 하나의 항원과 적어도 하나의 애주번트를 포함하는 유리질 조성물이 코팅된 미세바늘 어레이가 수득된다. 이러한 어레이는 포유동물에게 항원뿐만 아니라 항원과 애주번트를 투여하는데 사용되어 포유동물의 예방접종 및 항원에 대한 면역반응을 달성할 수 있다.

실시예

이하 실시예는 본 발명의 구체예를 예시하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예 1. 항원과 애주번트 의 포말 건조

명반 또는 알루미늄 포스페이트 애주번트 3mg/ml, PhtD라는 명칭의 스트렙토코커스 뉴모니에 유래의 단백질 항원(Adamou et al., Infect. Immun. 69: 949-958, 2001) 200㎍, 및 인산나트륨 완충액(pH 7.2) 중의 40% 수크로스를 함유하는 혼합물을 제조했다. 본 연구에 사용된 PhtD 단백질은 예상 등전점이 5.1이었다. 대조용으로, 앞에서와 같이 PhtD 단백질과 수크로스를 함유하지만 알루미늄 애주번트가 없는 샘플을 제조했다. 이 혼합물은 단백질 분해 가능성을 최소화하고 항원과 애주번트의 결합을 촉진하기 위해 건조 전에 2 내지 8℃에서 보관했다(예, 24 내지 48시간). 또는, 알루미늄 포스페이트의 인산염 완충화된 용액 및 PhtD 단백질만을 항온처리하고, 이후에 수크로스는 건조 공정 전에 첨가했다. 이 혼합물의 분취량을 각 용기에 배분하고 낮은 진공(정수압 P = 0.2 atm) 하에 상온에서 4시간 동안 건조시켰다. 샘플을 그 다음 높은 진공(P < 0.01 atm) 하에 4시간 동안 비등시켰다. 이 후자 단계 동안, 안정한 건조 포말이 각 용기에 형성되었다. 샘플은 그 다음 DRIERITE™(W.A. Hammond Drierite Co., Ltd. Xenia, OH 54385) 상에서 진공하에 55℃(2차 건조)에서 8일 동안 보관했다. 그 다음, 이 샘플들을 다양한 시간 동안 보관한 뒤, 재현탁시켜 수용액을 만들었다. 재구성된 샘플은 그 다음 이하 실시예에 기술되는 다양한 연구에 사용했다.

실시예 2. 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 포말 건조의 효과

알루미늄 애주번트의 완전성에 미치는 포말 건조의 효과를 평가하기 위해, 실질적으로 실시예 1의 설명에 따라 제조된 포말 건조물의 재구성 샘플을, 크기가 공지된 표준물에 대해 보정된 입자 분석기(Malvern Zetasizer)로 분석하여, 샘플에 함유된 입자의 평균 크기를 측정했다. 포말 건조 공정이 알루미늄 애주번트 완전성에 유해 영향을 미친다면, 샘플내 입자의 평균 입자 크기는 변화한 것으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 포말 건조가 알루미늄 애주번트의 분해를 유발한다면, 재구성된 샘플의 입자 크기는 포말 건조되지 않은 동등 샘플의 입자 크기보다 작을 것이다. 이에 반해, 포말 건조가 알루미늄 애주번트의 응집을 유발한다면, 재구성된 샘플의 입자 크기는 포말 건조되지 않은 동등 샘플의 입자 크기보다 클 것이다.

첨부 도면의 도 1에서, PhtD 단백질과 수크로스를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 입자 크기(B) 또는 PhtD 단백질, 명반 및 수크로스를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 입자 크기(C)를 포말 건조 처리되지 않은 액체 샘플과 비교했다. 포말 건조되지 않은 액체 샘플은 명반 단독(A), PhtD 단백질, 명반 및 수크로스(D) 및 PhtD 단백질과 명반(E)을 포함했다. 도시된 바와 같이, 비포말 건조된 명반(A)에서 나타나는 평균 입자 크기는 분해 또는 응집이 전혀 일어나지 않은 명반의 입자 크기를 나타냈다. PhtD 단백질, 명반 및 수크로스를 함유하는 비포말 건조 샘플(D), 및 PhtD 단백질과 명반을 함유하는 비포말 건조 샘플(E)의 평균 입자 크기는 비포말 건조 명반 샘플(A)과 유사했다. 또한, PhtD 단백질, 명반 및 수크로스를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플(C)의 평균 입자 크기는 비포말 건조 샘플(A), (D) 및 (E)와 유사했다. 이 데이터는 포말 건조가 알루미늄 애주번트의 유의적인 분해 또는 응집을 초래하지 않음을 시사했다. PhtD 단백질과 수크로스를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플(B)의 평균 입자 크기는 검사된 다른 샘플들보다 작은 것으로 나타났다.

실시예 3. 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 포말 건조의 효과

애주번트 안정성에 관한 추가 연구로, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드 애주번트, PhtD 단백질 및 40% 수크로스를 실질적으로 실시예 1의 기술에 따라 제조했다. 포말 건조 샘플은 재구성시키고, 크기가 공지된 표준물에 대해 보정된 입자 분석기(Malvern Mastersizer 2000)으로 분석하여, 샘플에 함유된 입자의 평균 크기를 측정했다.

첨부 도면의 도 2에서는 알루미늄 포스페이트 애주번트(A) 또는 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(B)를 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 평균 입자 크기를 포말 건조 처리되지 않은 액체 샘플(각각 (C) 및 (D))과 비교했다. 예시된 바와 같이, 포말 건조된 알루미늄 포스페이트(A)에서 관찰되는 평균 입자 크기는 액체 알루미늄 포스페이트(C)와 유사했다. 이와 마찬가지로, 포말 건조된 알루미늄 하이드록사이드(B)에서 관찰되는 평균 입자 크기는 액체 알루미늄 하이드록사이드(D)와 유사했다. 이 데이터는 포말 건조가 알루미늄 애주번트의 유의적인 분해 또는 응집을 초래하지 않음을 시사했다.

실시예 4. 재구성된 포말 건조 애주번트 제제의 투과전자현미경( TEM )에 의한 외관

알루미늄 애주번트의 완전성에 미치는 포말 건조의 효과를 평가하기 위해, 실시예 1의 기술에 따라 실질적으로 제조된 포말 건조물의 재구성 샘플(단, PhtD 단백질은 생략함)을 재구성시킨 뒤, 투과전자현미경(TEM) 검사를 위해 준비했다. 포말 건조되지 않은 액체 샘플도 TEM을 위해 준비했다. 대조군으로, TEM용으로 직접 제조된 알루미늄 애주번트(수크로스 무함유)도 사용했다. 전자 현미경사진은 x100,000 내지 x150,000의 정비례 배율로 촬영했다.

첨부 도면의 도 3에서는 포말 건조된 알루미늄 포스페이트 애주번트(A), 포말 건조되지 않은 알루미늄 포스페이트 애주번트(B), 및 TEM용으로 직접 준비된 알루미늄 포스페이트 애주번트(C)가 관찰된다. 첨부 도면의 도 4에서는 포말 건조된 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(A), 포말 건조되지 않은 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(B), 및 TEM용으로 직접 준비된 알루미늄 하이드록사이드 애주번트(C)가 관찰된다. 이 데이터는 포말 건조가 알루미늄 애주번트들의 유의적인 응집을 초래하지 않았음을 보여준다.

실시예 5. 포말 건조 동안 알루미늄 애주번트 안정성에 미치는 폴리올 농도의 효과

포말 건조 동안 알루미늄 애주번트의 완전성에 미치는 폴리올의 여러 농도의 효과를 평가하기 위해, 포말 건조된 알루미늄 포스페이트 애주번트(3mg/ml), PhtD 단백질(200㎍) 및 40%, 30% 또는 5% 농도의 수크로스를 실질적으로 실시예 1의 기술에 따라 포말 건조시켰다. 그 다음, 샘플을 재구성시키고, 크기가 공지된 표준물에 대해 보정된 입자 분석기(Malvern Mastersizer 2000)로 분석하여 샘플 내에 함유된 입자의 평균 크기를 측정했다.

첨부 도면의 도 5에서는 수크로스를 40%(A), 30%(B) 및 5%(C) 함유하는 재구성된 포말 건조 샘플의 입자 크기를, 포말 건조되지 않은 알루미늄 포스페이트 애주번트, PhtD 단백질 및 5% 수크로스를 함유하는 액체 샘플(D)과 비교했다. 예시된 바와 같이, 40% 수크로스(A) 및 30% 수크로스(B)의 존재 하에 포말 건조된 알루미늄 애주번트의 평균 입자 크기는 서로 크기가 유사할 뿐만 아니라 포말 건조되지 않은 5% 수크로스 샘플(D)과도 유사했다. 이러한 샘플들의 샘플 크기는 도 1과 2에 예시된 것과 유사했다. 5% 수크로스의 존재 하에 포말 건조된 재구성된 샘플(D)의 평균 입자 크기는 다른 샘플들보다 컸다. 이것은, 폴리올(이 예에서는 수크로스)의 저농도에서는 알루미늄 애주번트(이 예에서는 알루미늄 포스페이트 애주번트)의 응집이 약간 일어날 수 있다는 것을 시사할 수 있다.

실시예 6. 항원과 알루미늄 애주번트 사이의 결합에 미치는 포말 건조의 효과

포말 건조 공정으로 인한 항원과 애주번트 사이의 결합 또는 알루미늄 애주번트에 대한 단백질 항원의 흡착을 평가하기 위해, 이하에 기술된 연구를 수행했다. 이 연구는 액체에서 형성된 항원과 애주번트 사이에 형성된 결합을 건조 형태에서 보존하는 포말 건조의 능력 및 건조 포말 중의 항원과 애주번트 사이의 결합이 건조 샘플이 재구성되었을 때 유지되는 정도를 조사했다.

본 연구에서는 PhtD 단백질과 알루미늄 포스페이트 애주번트를 40% 수크로스에서 실질적으로 실시예 1의 기술에 따라 포말 건조시켰다. 건조된 샘플은 그 다음 용액으로 재구성시켰다. 대조군으로, 동일하지만 포말 건조되지 않은 PhtD 단백질, 알루미늄 애주번트 및 40% 수크로스 용액을 3.5시간 동안 회전 하에 2 내지 8℃로 항온처리했다. 그 다음, 포말 건조 샘플과 비포말 건조 샘플을 모두 원심분리하여 샘플에 함유된 알루미늄 애주번트를 이 애주번트에 결합 또는 흡착된 임의의 단백질 애주번트와 함께 펠릿으로 만들었다. 원심분리 후 상청액을 Micro BCA Protein Assay Kit(제품 번호 23235; Thermo Fisher Scientific; Rockford, Illinois, USA)를 사용하여 단백질 함량을 분석하여, 표준물과의 비교를 통해 상청액에 존재하는 단백질의 양을 측정했다. 상청액 중의 단백질은 알루미늄 애주번트에 결합되지 않은, 용액 중에 유리 상태인 단백질이다. 포말 건조 샘플에 존재하는 총 단백질의 양은 알려져 있기 때문에(200㎍/ml; 실시예 1 참조), 이 샘플 중의 총 단백질 함량으로부터 애주번트에 결합되지 않은 단백질의 함량(상청액 중의 단백질을 분석하는데 사용된 비색 반응으로 측정함)을 빼면, 애주번트에 흡착된 단백질의 함량이 수득된다.

본 연구의 결과는 첨부 도면의 도 6에 제시한다. 애주번트에 결합된 단백질 항원의 백분율은 y 축에 나타냈다. 본 실험은 이반복으로 수행했고, 샘플 번호 1과 2는 x 축에 나타냈다. 이 데이터는, 포말 건조 샘플(A)에서 알루미늄 포스페이트 애주번트에 대한 단백질 애주번트의 흡착(본 연구에서 약 30 내지 40% 사이)이 비포말 건조 샘플(B; 본 연구에서 약 10 내지 20%)에서보다 더 많았음을 보여주었다. 이 데이터들은 포말 건조가 용액에서 형성된 항원과 애주번트의 결합 또는 흡착을 증강시켰음을 시사한다. 또한, 이 데이터들은 건조 제제에서의 항원과 애주번트 사이의 결합이 샘플 재구성 시에도 유지되었음을 시사한다.

실시예 7. 항원과 알루미늄 애주번트 사이의 결합에 미치는 경시적 포말 건조 효과

포말 건조로 인한 항원과 애주번트 사이의 결합을 경시적으로 평가하기 위해 다음 연구를 수행했다. 1차 연구로, PhtD 단백질 및 알루미늄 애주번트를 실질적으로 실시예 1의 기술에 따라 포말 건조시켰다. 포말 건조 샘플을 25℃에서 0 내지 52주 동안 보관한 뒤, 재구성시켰다. 포말 건조 샘플을 재구성하기 약 24시간 전에, 비 포말 건조 액체 샘플(PhtD 단백질, 알루미늄 포스페이트 애주번트, 40% 수크로스)을 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.2)에 제조하고 2 내지 8℃에서 24시간 동안 항온처리했다. 이 후자 샘플을 비 포말 건조 제제의 대조군으로 사용했다. 각 시점마다, 포말 건조 및 비 포말 건조 샘플을 각각 원심분리하여 샘플에 함유된 알루미늄 애주번트를 애주번트에 결합된 임의의 단백질 애주번트와 함께 펠릿으로 만들었다. 원심분리 후의 상청액은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분석하여 표준물과의 비교를 통해 상청액에 존재하는 단백질 양을 측정했다. 실시예 6에서와 같이, 상청액 중의 단백질 양은 애주번트에 흡착된 단백질의 양을 계산하는데 사용했다.

본 연구의 결과는 첨부 도면의 도 7에 제시했다. 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 백분율은 y 축에 제시했다. x 축에는 포말 건조 샘플이 25℃에서 보관된 시간(주)을 나타냈다. 포말 건조 샘플은 (B)로 나타냈다. 비 포말 건조 샘플은 (A)로 나타냈다. 0주째, 본 실시예 연구에서 단백질 항원의 약 60%가 포말 건조 샘플의 알루미늄 애주번트에 흡착되는 것으로 관찰되었다. 이것은 비포말 건조된 액체 대조용 샘플 중의 알루미늄 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 약 10%와 비교된다. 본 연구에서, 알루미늄 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 양은 포말 건조 샘플에서 8주 및 26주에 모두 약 70%인 것으로 관찰된 반면, 비포말 건조된 액체 샘플 중의 알루미늄 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 양은 두 시점 모두에서 20% 이하로 유지되었다. 본 연구에서, 알루미늄 애주번트에 흡착된 단백질 항원의 양은 포말 건조된 샘플에서 52주째 감소한 것으로 관찰되었으나, 이 시점에서 비포말 건조된 액체 대조군보다는 여전히 높은 것이었다. 이 데이터는 항원과 애주번트 사이의 결합이 25℃에서 보관된 포말 건조 제제에서 경시적으로 안정하다는 것을 시사했다.

실시예 8. 포말 건조 제제 중의 항원과 알루미늄 애주번트 사이의 결합에 미치는 저장 온도의 경시적 효과

샘플이 다른 온도에서 보관되었을 때 포말 건조 샘플 중의 항원과 애주번트 사이의 결합을 경시적으로 평가하기 위해, 다음과 같은 연구를 수행했다. 항원과 애주번트의 수크로스 중의 제제를 실질적으로 실시예 1의 교시에 따라 포말 건조시켰다. 건조된 샘플을 그 다음 25℃ 또는 37℃에서 8주 또는 12주 동안 보관했다. 보관 기간 종료 시에, 건조된 샘플은 수용액으로 재구성시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하여 샘플에 함유된 알루미늄 애주번트를 이 애주번트에 흡착된 임의의 단백질 애주번트와 함께 펠릿으로 만들었다. 원심분리 후의 상청액은 RP-HPLC로 분석하여 상청액에 존재하는 단백질 양 및 애주번트에 흡착된 단백질 양을 실시예 7에 기술된 바와 같이 측정했다. 각 시점마다, 포말 건조 샘플에 존재하는 애주번트에 흡착된 단백질 양은 대조군으로 비 포말 건조된 액체 샘플에 존재하는 애주번트에 흡착된 단백질 양과 비슷했다.

본 연구의 결과는 첨부 도면의 도 8에 제시했다. 애주번트에 결합된 단백질 항원의 백분율은 y축에 제시했다. x축에는 포말 건조된 샘플이 분석 전에 보관된 시간(주)을 나타냈다. 0주째, 샘플(A)은 포말 건조됨이 없이 2 내지 8℃에서 항온처리된 포스페이트 완충액 중의 단백질 및 애주번트 함유 액체 샘플에 존재하는 애주번트에 결합된 단백질의 양이 40 내지 50% 사이인 것을 보여준다. 0주째 샘플(B) 및 (C)는 25℃(B) 또는 37℃(C)에서 최소 시간 동안 보관된 후 수용액으로 재구성된 포말 건조 샘플에 존재하는 애주번트에 흡착된 단백질 양을 보여준다. 이 데이터는 애주번트에 흡착된 단백질 백분율이 (B) 및 (C) 샘플 모두에서 약 60% 임을 보여주었다. 포말 건조 샘플이 재구성 전에 8주 동안 보관되었을 때, 25℃(B) 및 37℃(C) 모두에서 애주번트에 흡착된 단백질 양은 0주째 분석된 샘플에서 발견된 양과 유사했다. 이와 마찬가지로, 포말 건조 샘플을 재구성 및 분석 전에 12주 동안 보관했을 때, 25℃(B) 및 37℃(C) 모두에서 애주번트에 흡착된 항원의 양은 0주 및 8주째 애주번트에 흡착된 항원의 양과 유사하고, 보다 더 많은 경우도 보였다. 이러한 데이터는 단백질 항원과 애주번트 사이의 결합이 포말 건조 제제 중에서 25℃ 및 37℃ 하에 경시적으로 안정하다는 것을 시사했다.

실시예 9. 포말 건조 제제 중의 단백질 항원에 미치는 다른 안정화제 , 2차 건조 온도 및 다른 보관 온도의 효과

포말 건조 제제 중의 단백질 애주번트의 안정성에 미치는 다수의 인자(예, 안정화제, 2차 건조 온도, 포말 건조 제제의 보관 온도)를 평가하기 위해, 다음 연구를 수행했다. 혼합물은 이하 표 1에 제시한 바와 같이 제조하고, 그 다음 실질적으로 실시예 1의 교시에 따라 포말 건조시켰다. 포말을 형성하기 위한 비등 단계 후, 일부 샘플을 40℃에서 다른 샘플은 55℃에서 2차 건조를 수행했다.

포말 건조용 제형

	혼합물 조성(100ml)¹
제형	안정화제	애주번트
F1	수크로스 40g	알루미늄 포스페이트 300mg
F2	수크로스 40g 아르기닌 5g 모노나트륨 글루타메이트 5g	무함유
F3	수크로스 20g 메틸 α-D-글루코사이드 20g	무함유
F4	2-HP-β-사이클로덱스트린 40g 아르기닌 5g 모노나트륨 글루타메이트 5g	무함유
F5²	수크로스 40g	알루미늄 포스페이트 600mg
F6	2-HP-β-사이클로덱스트린 13.2g 아르기닌 4.98g 모노나트륨 글루타메이트 1.65g 수크로스 13.3g	무함유
¹ 모든 혼합물은 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 제조하고, 1 ml당 200㎍ PhtD 단백질을 함유했다. ² PhtD 단백질과 알루미늄 포스페이트 애주번트를 2 내지 8℃에서 24시간 동안 항온처리한 뒤 폴리올을 첨가하여 제조했다.

2차 건조 단계가 종료된 후, 샘플의 외관을 기록했다(첨부 도면의 도 9). 샘플은 일반적으로 포말(F1, F2, F3, F5 및 F6)처럼 보였다. 한 샘플(F4)은 치밀한 덩어리처럼 보였다.

또한, 2차 건조 단계의 종료 후, 샘플의 잔류 수분 함량을 칼 피셔 용적 적정 기술로 측정했다(미국 특허 4,740,471 참조). 이 기술은 건조 산물의 총 중량 대비 물의 중량 백분율을 측정한다. 이 데이터는 이하 표 2에 제시한다.

포말 건조 제형의 잔류 수분 함량

	특정 온도에서 2차건조 후 잔류 수분(중량%)
제형	40℃	55℃
F1	2.75	1.05
F2	3.67	1.79
F3	0.58	0.21
F4	0.41	0.18
F5	3.06	1.44
F6	2.28	1.21

이 결과는 2차 건조가 55℃에서 수행된 샘플에 남아있는 수분 함량이 일반적으로 2차 건조가 40℃에서 수행된 샘플에 남아있는 수분 함량보다 적다는 것을 보여준다.

포말 건조 샘플은 그 다음 23 내지 27℃(25℃로 표시됨), 35 내지 39℃(37℃로 표시됨), 또는 53 내지 57℃(55℃로 표시됨)에서 12개월 동안 보관했다. 이 기간 동안, 25℃와 37℃에서 보관된 샘플의 외관은 일부 색 변화를 제외하고는 실질적으로 변화하지 않은 것으로 나타났다. 하지만, 55℃에서 보관된 샘플의 경우, 포말은 일반적으로 12개월 후 "용융"된 것으로 나타났다. 하지만, F6 샘플은 55℃에서 12개월 보관 후에도 여전히 포말로 나타났다.

12개월 보관 기간 동안 다양한 온도에서 보관된 포말건조 샘플 중의 단백질 항원의 안정성을 측정하기 위해, 포말 건조 샘플을 다양한 시점에서 수용액으로 재구성시킨 후, RP-HPLC로 분석했다. 단백질 항원의 순도%는 RP-HPLC 컬럼에서 수득된 주요 단백질 피크에 존재하는 단백질 양을 측정하여, 이값을 컬럼에서 수득된 총 단백질 피크에 존재하는 단백질 양으로 나누어 계산했다. 순도%는 경시적인 단백질 안정성의 지표이다.

이 결과는 일반적으로 40℃와 55℃에서 2차 건조된 모든 검사 제형에서, 단백질의 순도는 샘플이 보관된 모든 온도(즉, 25, 37 및 55℃)에서 12개월 보관 기간 동안 80 내지 90%가 넘게 유지된다는 것을 보여주었다.

RP-HPLC 컬럼에서 투입 단백질의 총 회수율은 본 연구에서 일반적으로 약 80%였다. 하지만, 일부 경우에는 회수율이 더 낮게 나타났다. 2차 건조가 40℃에서 수행되고 55℃에서 보관된 애주번트 함유 F1 및 F5 제형으로부터의 단백질 회수율은 1주 후 20% 이하인 것으로 관찰되었다. 또한, 2차 건조가 55℃에서 수행되고 검사된 모든 온도(즉, 25, 37 및 55℃)에서 보관된 F1 제형으로부터 단백질 회수율은 약 60 내지 65%였다.

실시예 10. 다른 알루미늄 애주번트 이용 시의 포말 건조 제제의 형성 및 품질

다른 알루미늄 애주번트(즉, 알루미늄 포스페이트 애주번트 및 알루미늄 하이드록사이드 애주번트) 이용 시의 포말 건조 제제의 형성 및 품질을 평가하기 위해 다음 연구를 수행했다. 혼합물은 이하 표 3에 제시한 바와 같이 제조했고, 그 다음 실질적으로 실시예 1의 교시에 따라 포말 건조시켰다. 2차 건조는 55℃에서 수행했다.

포말 건조용 제형

	혼합물 조성(100ml)¹
제형	애주번트	완충액
F6	알루미늄 포스페이트 300mg	10mM 인산나트륨
F7	무함유	10mM 인산나트륨
F8	알루미늄 옥시하이드록사이드 125mg	10mM Tris-HCl
F9	무함유	10mM Tris-HCl
F10	알루미늄 포스페이트 300mg	인산염 완충화된 식염수
¹ 모든 혼합물은 1ml당 40g 수크로스 및 200㎍ PhtD 단백질을 함유했다. 모든 혼합물은 수크로스를 첨가하기 전에 24시간 동안 2 내지 8℃에서 PhtD 단백질 ± 애주번트를 천천히 혼합하여 제조했다.

포말 건조 제제의 형성 후, 샘플의 잔류 수분 함량은 칼 피셔 용적 적정 기술로 측정했다. 이 데이터는 하기 표 4에 제시했다.

포말 건조 제형의 잔류 수분 함량

제형	55℃에서 2차 건조 후 잔류 수분(중량%)
F6	1.38
F7	1.60
F8	1.40
F9	1.22
F10	1.61

포말 건조 샘플은 그 다음 23 내지 27℃(25℃로 표시됨) 또는 35 내지 39℃(37℃로 표시됨)에서 12개월 동안 보관했다. 이 기간 동안, 샘플의 외관에는 실질적인 차이가 관찰되지 않았다. 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정된 단백질 항원의 순도%는 12개월 동안 25℃에서 보관된 제형에서는 95% 이상 유지되었고, 37℃에서 보관된 제형에 대해서는 일반적으로 90% 이상 유지되었다. 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정된 투입 단백질의 총 회수율은 일반적으로 12개월 동안 제시된 제형마다 일정하게 유지되었다.

알루미늄 애주번트에 대한 단백질 항원의 흡착을 경시적으로 평가하기 위해, 포말 건조 제형을 용액에 재구성시키고 알루미늄 애주번트에 흡착된 단백질의 백분율은 실시예 7에 기술된 바와 같이 측정했다.

흡착 실험의 결과로, 25℃에서 포말 건조 제형의 보관에 대한 결과는 도 10에, 37℃에서 포말 건조 제형의 보관에 대한 결과는 도 11에 제시했다. 두 도면에서, 시간(주)에 따라(x 축) 애주번트에 흡착된 단백질%(y 축)는 도면에 표시된 바와 같이 F8(*), F6(●) 및 F10(-)에 대해 관찰되었다. 데이터는 트리스 완충액 중의 알루미늄 하이드록사이드에 대한 PhtD 단백질(F8)의 흡착이 인산나트륨 완충액 중의 알루미늄 포스페이트에 대한 PhtD 단백질(F6)의 흡착보다 우수한 것으로 관찰되었고, F6의 흡착은 PBS 중의 알루미늄 포스페이트에 대한 PhtD 단백질(F10)의 흡착보다 우수한 것으로 관찰되었다.

예시적 조성물, 방법 등은 명세서를 통해 예시되었지만, 이는 본 출원의 범위를 제한하거나 또는 어떠한 방식으로든지 한정하려는 의도가 아니다. 물론, 당해 조성물, 방법 등을 설명하기 위하여 성분 또는 방법의 유추할 수 있는 모든 조합을 기술하는 것은 불가능하다. 당업자에게는 추가 장점과 변형이 쉽게 보일 것이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 제시되고 설명된 상세한 구체예, 대표 장치 및 예시적 실시예에만 한정되지 않는다. 따라서, 본 출원은 본 출원의 범위에 속하는 변경, 변형 및 변동을 포함하는 것으로 간주한다. 더욱이, 상기 상세한 설명은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 오히려, 본 발명의 범위는 후속 청구의 범위와 이의 등가물에 의해 결정되어야 한다. "또는"이란 용어가 상세한 설명 또는 청구의 범위에 이용되는 한(예컨대, A 또는 B), 이것은 "A 또는 B 또는 A와 B"를 의미하는 것으로 간주한다. 출원인이 "단지 A 또는 B만, A와 B는 제외"를 나타내고자 할 때에는, "A와 B를 제외한 단지 A 또는 B만"이란 용어를 이용할 것이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "또는"는 포괄적 용도이지 배타적 용도가 아니다.

Claims

a) 적어도 하나의 항원 및 적어도 하나의 애주번트를 혼합하여 액체를 제조하고 상기 액체를 2 내지 8℃에서 적어도 24 시간 동안 보관하는 단계;
b) 이어서 적어도 하나의 폴리올 또는 합성 중합체를 상기 a)의 액체에 부가하여 점성 액체를 제조하는 단계;
c) 이어서 상기 점성 액체를 약 0.9 내지 0.1 atm의 낮은 진공하에 주위 온도에서 건조시키는 단계; 및
d) 이어서 상기 c)의 생성물을 0.033 atm 미만의 고 진공하에 비등시켜 포말 (foam)을 형성하는 단계
를 포함하는, 항원 및 애주번트의 유리질 조성물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 포말이 결정질 구조가 실질적으로 결여된 것인, 방법.
제1항에 있어서, 포말 중의 항원의 적어도 30%가 애주번트에 흡착되어 있는, 방법.
제1항에 있어서, 포말 중의 항원의 적어도 50%가 애주번트에 흡착되어 있는, 방법.
제4항에 있어서, 포말 중의 항원의 적어도 60%가 애주번트에 흡착되어 있는, 방법.
제1항에 있어서, 폴리올이 a)의 혼합물 중에 30%를 초과하는 농도로 존재하는, 방법.
제1항에 있어서, 폴리올이 슈크로스인 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)의 점성 액체를 단계 c) 전에 미세바늘 어레이에 적용시키는, 방법.
제1항에 있어서, 단계 c)의 생성물을 단계 d) 전에 미세바늘 어레이에 적용시키는, 방법.
포유동물에서 면역반응을 유도하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 유리질 조성물.
제10항에 따른 유리질 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
제8항 또는 제9항의 방법에 의해 제조된 미세바늘 어레이(microneedle array).
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