KR101465362B1

KR101465362B1 - Bioreactor system for enhancing differentiation of osteoblast, and method for culturing osteoblast using it

Info

Publication number: KR101465362B1
Application number: KR1020130109273A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 진규현
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2014-11-25

Abstract

The present invention relates to a bioreactor system for promoting the differentiation of osteoblasts and a method for culturing osteoblasts using the same. According to the bioreactor system for promoting the differentiation of osteoblasts of the present invention, a cell carrier consists of various synthetic polymers, has a three-dimensional shape, has a pore size and a pore ratio in a particular range, and can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts. A sinusoidal alternating current having strength and frequency in a particular range generated from an electrical field supplying unit is applied to the cell carrier through an electrode equipped in a cell culturing container, so that ALP activities and calcium deposition are enhanced. As a result, bone reinforcement can be significantly promoted, so that an optimal environment for growing osteoblasts inside or outside the body can be provided.

Description

Technical Field [0001] The present invention relates to a bioreactor system for promoting osteoblast differentiation and a method for culturing osteoblast cells using the same. BACKGROUND ART [0002]

본 발명은 조골세포 분화 촉진용 바이오리액터 시스템 및 이를 이용한 조골세포 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 전기 자극을 이용하여 조골세포의 분화를 촉진하는 바이오리액터 시스템 및 이를 이용한 조골세포 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a bioreactor system for promoting osteoblast differentiation and a method for culturing osteoblasts using the same, and more particularly, to a bioreactor system for promoting osteoblast differentiation using electrical stimulation and a method for culturing osteoblast cells using the same will be.

조직 재생 분야에서는, 이상적인 조직대용물을 얻기 위해 최적의 세포담체 특성, 다양한 성장인자의 방출 제어 및 고효율 바이오리액터 디자인에 대한 광범위한 연구가 이루어져 왔다. 특히 세포의 자극이 다양한 생리자극 효과(세포 증식, 세포 분화, 사이토카인 방출, 세포외기질(ECM) 단백질 합성)를 야기할 수 있기 때문에, 최근 바이오리액터 시스템에서 다양한 세포활성과 물리적(기계 및 전기) 자극 사이의 관계에 대한 몇몇 연구가 이루어졌다.In the field of tissue regeneration, extensive studies have been conducted on optimal cell carrier characteristics, controlled release of various growth factors, and high-efficiency bioreactor design to obtain an ideal tissue substitute. In particular, since stimulation of cells can cause a variety of physiological stimulatory effects (cell proliferation, differentiation, cytokine release, and extracellular matrix (ECM) protein synthesis) ) Stimuli were studied.

이러한 자극 중, 기계적 자극은 뼈와 연골 재생에 널리 응용되고 있다. physiologic periodic strain 조건 하에서, 재생된 골 조직의 기계적 특성은 기계적 자극을 받지 않은 골 조직에 비해 크게 향상되는데, 이는 뼈의 주요 유기성분인 골-특이 매트릭스 단백질 및 콜라겐의 합성이 기계적 자극에 의해 향상되었기 때문이다.Among these stimuli, mechanical stimulation is widely applied to bone and cartilage regeneration. Under physiologic periodic strain conditions, the mechanical properties of regenerated bone tissue are greatly enhanced compared to unstimulated bone tissue, which suggests that the synthesis of bone-specific matrix proteins and collagen, the major organic constituents of bone, Because.

또한, 기계적 자극은 조골세포의 증식과 방향성(orientation), 유전자 활성, 세포활성의 다른 특징에도 영향을 미칠 수 있는데, 이러한 현상은 전단 응력(shear stress)이 성장인자 신호전달경로의 활성, 세포골격-인테그린 상호작용, 스트레스 섬유(stress fibers)의 형성과 이들의 초점접착역(focal adhesion) 포인트 부착을 일으킬 수 있다는 메커니즘 면에서 명확히 설명되어졌다. 더욱이, 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)에서 기계적 자극의 효과는 Brown et al.,(R. A. Brown, R. Prajapati, D. A. McGrouther, I. V. Yannas and M. Eastwood, J. Cell. Physiol., 1998, 175, 323.)에 의해 잘 보고되었으며, 여기서 콜라겐에 포집된(embedded) 세포는 배향된 형태 및 주기적인 장력 자극을 갖는 매우 활성화된 유전자 발현을 나타낸다는 것을 기재하고 있다.Mechanical stimulation can also affect the proliferation and orientation of osteoblasts, gene activity, and other characteristics of cellular activity. This phenomenon can be explained by the fact that shear stress is related to the activity of the growth factor signaling pathway, -Integrin interaction, the formation of stress fibers and their ability to cause focal adhesion point attachment. Moreover, the effects of mechanical stimulation in dermal fibroblasts are described in Brown et al., (RA Brown, R. Prajapati, DA McGrouther, IV Yannas and M. Eastwood, J. Cell Physiol. ), Where cells implanted in collagen exhibit highly activated gene expression with oriented morphology and periodic tension stimulation.

마찬가지로, 전기적 및 전자기적 자극은 신경, 심장 및 뼈와 연골을 포함한 근골격계 조직에서 널리 적용되어왔다. 일반적으로, 전기 자극이 혈관형성, 근육세포재생, 줄기세포의 심근형성 및 향상된 심장근육세포 표현형(phenotype)을 포함한 세포활성범위를 촉진할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 일부 연구자들에 따르면, 전기 자극은 체외실험(in vitro)에서 다양한 사이토카인(BMP-2, IGF-1 및 VEGF) 뿐 아니라 조골세포의 높은 증식을 유도할 수 있다. 세포막 전하와 이온 이동이 세포의 신호 경로를 변경할 수 있는바, 이러한 세포 활성은 전기장에 의해 자극되며, 이로 인해 세포의 증식, 분화, 이동 및 심지어 유전자 발현의 차이가 야기된다. 더욱이, 저주파 전기 자극은 골 형성 동안 세포 내 칼슘 함량을 증가시킬 수 있고, 세포의 신호 경로를 조절하여 중간엽 줄기세포의 세포 증식과 분화에 영향을 줄 수도 있다.Similarly, electrical and electromagnetic stimulation has been widely applied in musculoskeletal tissues including nerves, heart, and bones and cartilage. In general, it is well known that electrical stimulation can promote the range of cellular activity including angiogenesis, muscle cell regeneration, myocardial formation of stem cells, and enhanced cardiac muscle cell phenotype. Also, according to some researchers, electrical stimulation can induce high proliferation of osteoblasts as well as various cytokines (BMP-2, IGF-1 and VEGF) in vitro. Cell membrane charge and ion transport can alter the cell's signal pathway, which is stimulated by the electric field, which causes cell proliferation, differentiation, migration, and even gene expression differences. Furthermore, low-frequency electrical stimulation can increase intracellular calcium content during bone formation and regulate cellular signaling pathways, which may affect cell proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells.

뿐만 아니라, 뼈가 선천적 전기적 특성을 가지고 있다는 것을 발견한 이래로 골절된 뼈의 치료를 개선하기 위해 특정기간 동안 내부 및 외부 전기 자극을 사용한 다양한 연구들이 실시되었고, 이러한 자극들은 약물 및 화학적 치료에 비해 몇몇의 생물학적으로 유리한 측면을 가지고 있다.In addition, since the discovery that bones have inherent electrical properties, a variety of studies using internal and external electrical stimulation have been conducted over a period of time to improve the treatment of fractured bones, Which has a biologically favorable aspect.

하지만, 전기 자극이 세포활성 측면에서 다양한 장점요소들을 가지고 있음에도 불구하고, 자기장 지속시간과 진동수(frequency), 세기(strength) 및 모드(mode)를 포함하는 전기적 조건의 다양한 변수(application) 때문에 일부 상반되는 결과를 보이는 단점이 있다. 특히 너무 높거나 적절치 않은 전기장 조건은 세포손상을 야기하고, 활성산소(ROS)를 배출하며, 열 충격 단백질을 생성하여, 결국 세포활성을 감소시킨다. However, despite the fact that electrical stimulation has a variety of beneficial elements in terms of cell activity, some applications of electrical conditions, including magnetic field duration and frequency, strength and mode, The results are shown in Fig. In particular, electric field conditions that are too high or inappropriate cause cell damage, release reactive oxygen species (ROS), produce heat shock proteins, and ultimately reduce cellular activity.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 챔버와 전극을 구비한 세포 배양 용기, 조골세포가 부착하여 성장하는 표면을 포함하고, 상기 챔버 내에 배치되는 3차원 격자 형태의 세포담체(scaffold); 및 상기 세포담체에 전기적 자극을 인가하기 위한 전기장을 발생시키는 전기장 공급부를 포함하여, 조골세포의 분화를 촉진하는데 최적의 진동수(frequency)와 세기(strength)를 갖는 자기장을 세포담체에 인가하여 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 조골세포 분화 촉진용 바이오리액터 시스템을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made keeping in mind the above problems occurring in the prior art, and an object of the present invention is to provide a cell culture container having a chamber and an electrode, Cell scaffold; And an electric field supply unit for generating an electric field for applying an electric stimulus to the cell carrier, wherein a magnetic field having a frequency and a strength optimum for promoting osteoblast differentiation is applied to the cell carrier, And to provide a bioreactor system for promoting the differentiation of osteoblast.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 조골 세포 배양 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다:It is still another object of the present invention to provide a method for osteoblast cell culture using the system, which comprises the following steps:

(1) 조골세포를 세포담체의 표면에 부착하는 단계;(1) attaching osteoblasts to the surface of a cell carrier;

(2) 상기 세포담체를 상기 챔버 내에 배치하는 단계;(2) disposing the cell carrier in the chamber;

(3) 상기 세포담체에 전기적 자극을 주지 않으면서 3일 동안 상기 조골세포를 배양하는 단계; 및(3) culturing the osteoblast cells for 3 days without applying electrical stimulation to the cell carrier; And

(4) 상기 전기장 공급부를 통해 발생하는 전기장을 상기 세포담체에 인가하면서 상기 조골세포를 배양하는 단계.(4) culturing the osteoblast while applying an electric field generated through the electric field supply unit to the cell carrier.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은 챔버와 전극을 구비한 세포 배양 용기; 조골세포가 부착하여 성장하는 표면을 포함하고, 상기 챔버 내에 배치되는 3차원 격자 형태의 세포담체(scaffold); 및 상기 세포담체에 전기적 자극을 인가하기 위한 전기장을 발생시키는 전기장 공급부를 포함하는, 조골세포 분화 촉진용 바이오리액터 시스템을 제공한다.The present invention relates to a cell culture container having a chamber and an electrode; A scaffold in the form of a three-dimensional lattice that includes a surface to which osteoblasts attach and grow; And an electric field supply unit for generating an electric field for applying electrical stimulation to the cell carrier. The present invention also provides a bioreactor system for promoting osteoblast differentiation.

본 발명의 일 구현예로, 상기 전극은 상기 세포 배양 용기의 2개의 일측벽에 각각 인접하여 평행하게 배치된 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the electrodes are arranged in parallel adjacent to two side walls of the cell culture container.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포담체는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리카프로락톤과 탄소나노튜브 혼합물(P/C) 또는 폴리카프로락톤과 β-트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate)(P/T) 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the cell carrier is selected from the group consisting of polycaprolactone (PCL), a mixture of polycaprolactone and carbon nanotube (P / C) or polycaprolactone and tricalcium phosphate (P / T ) Mixture.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포담체는 300~330μm의 공극크기와 53~55%의 공극률을 갖는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the cell carrier is characterized by having a pore size of 300 to 330 μm and a porosity of 53 to 55%.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 전기장 발생부는 사용자가 원하는 파형을 생성하는 함수 발생기; 및 상기 생성된 파형을 디스플레이함으로써 사용자가 파형을 확인할 수 있도록 하는 오실로스코프를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the electric field generator includes: a function generator for generating a waveform desired by a user; And an oscilloscope for allowing the user to confirm the waveform by displaying the generated waveform.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 함수 발생기는 정현파 교류를 생성하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the function generator generates a sinusoidal alternating current.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 정현파 교류는 45~65 mVcm^-1의 세기(strength) 및 57~63 Hz의 진동수(frequency)를 갖는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the sinusoidal alternating current has a strength of 45 to 65 mV cm ^-1 and a frequency of 57 to 63 Hz.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 조골 세포 배양 방법을 제공한다:The present invention also provides a method for osteoblast cell culture using the system, comprising the steps of:

본 발명의 일 구현예로, 상기 세포담체는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리카프로락톤과 탄소나노튜브 혼합물(P/C) 또는 폴리카프로락톤과 β-트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate)(P/T) 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the cell carrier is selected from the group consisting of polycaprolactone (PCL), polycaprolactone and a mixture of carbon nanotubes (P / C) or polycaprolactone and tricalcium phosphate (P / T ) Mixture.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (3)에서는 상기 세포담체에 45~65 mVcm^-1의 세기(strength) 및 57~63 Hz의 진동수(frequency)를 갖는 정현파 교류를 매일 30분씩 인가하는 것을 특징으로 하는, 조골세포 배양 방법.In another embodiment of the present invention, in step (3), sinusoidal alternating current having a strength of 45 to 65 mV cm ^-1 and a frequency of 57 to 63 Hz is applied to the cell carrier for 30 minutes every day Characterized in that the osteoblast cell culture method is used.

본 발명의 조골세포 분화 촉진용 바이오리액터 시스템에 따르면, 세포담체가 다양한 합성 고분자로 이루어지고 3차원 형태를 가질 뿐만 아니라 특정 범위의 공극크기와 공극률을 가짐으로써, 조골세포의 증식과 분화를 촉진시킬 수 있고, 세포 배양 용기에 구비된 전극을 통해 전기장 공급부에서 발생된 특정 범위의 세기(strength)와 진동수(frequency)를 갖는 정현파 교류가 세포담체에 인가됨으로써 ALP 활성과 칼슘증착(calcium deposition)이 증가되어 그 결과, 골 강화가 유의적으로 증가될 수 있는바, 조골세포의 체외 또는 체내 성장을 최적의 환경을 제공하는 효과가 있다.According to the bioreactor system for promoting osteoblast differentiation according to the present invention, the cell carrier is composed of various synthetic polymers and has a three-dimensional shape as well as a specific range of pore size and porosity, thereby promoting the proliferation and differentiation of osteoblasts And a sinusoidal alternating current having a certain range of strength and frequency generated in the electric field supply part through the electrode provided in the cell culture container is applied to the cell carrier, thereby increasing the ALP activity and calcium deposition As a result, bone strengthening can be significantly increased, and it is effective to provide an optimal environment for in vitro or in vivo growth of osteoblasts.

도 1의 (a)는 일반적인 melt-plotting시스템을 사용하여 세포담체의 제조공정을 개략적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 본 발명의 바이오리액터 시스템 및 배양용기를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2의 (a) 내지 (c)는 각각 PCL, P/C(PCL/CNT) 및 P/T(PCL/β-TCP) 세포담체의 표면과 단면을 SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a) 및 (b)는 각각 PCL, P/C(PCL/CNT) 및 P/T(PCL/β-TCP) 세포담체의 공극크기 및 공극률을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 PCL, P/C 및 P/T 세포담체의 응력-변형 곡선(stress strain curve)을 나타낸 것이고, (b)는 PCL, P/C 및 P/T 세포담체의 영률(young's modulus) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 전기 자극을 인가하지 않은 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서 1, 3, 4, 7, 14일 후의 생세포(viable cell) 수를 측정하기 위한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 전기 자극을 인가한 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서 4, 7, 14일 후의 생세포(viable cell) 수를 측정하기 위한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 세포담체가 없는 상태에서 조골세포와 전기장에 의한 영향을 관찰하기 위한 실험과정을 개략적으로 도시한 것이고, (b) 및 (c)는 각각 전기장을 인가한 PCL플레이트 및 전기장을 인가하지 않은 PCL 플레이트의 광학 이미지를 나타낸 것이다.
도 8의 (a) 내지 (c)는 전기장을 인가한 경우와 인가하지 않은 경우의 각 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서 세포배양 14일 후 Live/dead 세포를 분석한 결과를 나타낸 것이고, (d)는 세포담체 내 총 세포 수 대비 살아있는 세포 수의 비율을 전기장 자극이 없는 세포담체의 세포 생존능으로 정규화하여 나타낸 결과이다.
도 9의 (a) 내지 (c)는 전기장을 인가한 경우와 인가하지 않은 경우의 각 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서 세포배양 14일 후 칼슘과 인 신호 변화를 측정하기 위한 EDS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 세포에 미치는 전기적 자극의 효과를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 PBS에서 P/T 세포담체가 1, 3, 7일에 방출한 칼슘 이온 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 (a) 내지 (c)는 각각 β-TCP 0, 0.05, 및 0.1 wt%에 따라 전기 자극을 인가한 경우의 시간별 세포 이동결과를 나타낸 광학 이미지이고, (d)는 증식된 세포의 수축영역을 AutoCAD 2009버전으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13의 (a) 및 (b)는 각각 7일 내지 14일 간 전기 자극을 받은 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서의 상대적 ALP 활성 및 칼슘 증착을 측정한 결과를 나타낸 것이고, (c)는 상기 (a)와 (b)의 결과를 전기적 자극을 인가하지 않은 세포담체와 비교하여 상대적으로 나타낸 것이다.
도 14는 세포 배양 7일 및 14일 후 PCL, P/C 및 P/T 세포담체에서 강화작용을 확인한 ARS 염색 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 (a) schematically shows a process for producing a cell carrier using a general melt-plotting system, and FIGS. 2 (b) and 2 (c) schematically show a bioreactor system and a culture container of the present invention, respectively.
2 (a) to 2 (c) show SEM observations of the surface and cross-section of PCL, PC / PCT / PCT / PCT / PCT /
3 (a) and 3 (b) show the results of analysis of pore size and porosity of PCL, P / C (PCL / CNT) and P / T (PCL / β-TCP) cell carriers, respectively.
4 (a) shows stress strain curves of PCL, P / C and P / T cell carriers, (b) shows the stress strain curves of PCL, P / C and P / young's modulus.
FIG. 5 shows the results of MTT analysis for measuring the number of viable cells after 1, 3, 4, 7 and 14 days in PCL, P / C and P / T cell carriers without electrical stimulation.
FIG. 6 shows the results of MTT analysis for measuring the number of viable cells after 4, 7, and 14 days in the PCL, P / C, and P / T cell carriers to which electrical stimulation was applied.
7 (a) schematically shows an experimental procedure for observing the effect of osteoblasts and an electric field in the absence of a cell carrier, and (b) and (c) show a PCL plate and an electric field Lt; RTI ID = 0.0 > PCL < / RTI >
8 (a) to (c) show live / dead cell analysis after 14 days of cell culture in PCL, P / C and P / T cell carriers with and without an electric field, respectively (D) is the result of normalizing the ratio of the number of living cells to the total number of cells in the cell carrier by the cell viability of the cell carrier without electric field stimulation.
9 (a) to 9 (c) are graphs showing changes in calcium and phosphorus signal after 14 days of cell culture in PCL, P / C and P / T cell carriers with and without an electric field EDS The results of the analysis are shown.
Fig. 10 schematically shows the effect of electrical stimulation on the cells.
FIG. 11 shows the results of measuring the concentration of calcium ions released from the P / T cell carrier on days 1, 3 and 7 in PBS.
12 (a) to 12 (c) are optical images showing cell migration results in the case of applying electrical stimulation according to β-TCP 0, 0.05, and 0.1 wt%, respectively, Shrinkage area is measured by AutoCAD 2009 version.
13 (a) and 13 (b) show the results of measurement of relative ALP activity and calcium deposition in PCL, P / C and P / T cell carriers, respectively, which were subjected to electrical stimulation for 7 to 14 days c) shows the results of (a) and (b) above in comparison with a cell carrier to which no electrical stimulation is applied.
FIG. 14 shows the result of ARS staining confirming the enhancing action in PCL, P / C and P / T cell carriers after 7 and 14 days of cell culture.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 세포 배양 용기, 세포담체(scaffold) 및 전기장 공급부를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 바이오리액터 시스템을 제공한다.The present invention provides a bioreactor system for promoting osteoblast differentiation comprising a cell culture container, a cell carrier (scaffold), and an electric field supply part.

세포 배양 용기는 세포를 접종하여 부착시킨 세포담체를 수용하여 세포를 배양시키기 위한 구성으로서, 세포담체를 수용할 수 있는 챔버와 세포담체에 전기적 자극을 인가할 수 있는 전극을 포함할 수 있다. 이때, 전극은 세포 배양 용기의 2개의 일측벽에 각각 인접하여 평행하게 배치되는 것이 바람직하다. 또한, 세포 배양 용기는 10mm × 10mm × 8mm 크기를 갖는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.The cell culture container may include a chamber capable of accommodating the cell carrier and an electrode capable of applying electrical stimulation to the cell carrier. At this time, it is preferable that the electrodes are disposed adjacent to and parallel to the two side walls of the cell culture container. In addition, the cell culture container preferably has a size of 10 mm x 10 mm x 8 mm, but is not limited thereto.

세포담체(scaffold)는 세포가 부착되어 증식(성장)되기 위한 구성으로서, 보다 구체적으로 조골세포가 부착하여 성장하는 표면을 포함한 3차원 격자 형태를 가진다. 3차원 공간 세포담체의 세포환경이 세포증식과 분화에 더 유리하기 때문에 3차원 형태의 세포담체는 실제 조직을 재생하는데 매우 효과적이다.The cell carrier (scaffold) is a structure for attaching and growing (growing) cells, and more specifically, has a three-dimensional lattice form including a surface on which osteoblasts adhere and grow. Since the cell environment of the three-dimensional space cell carrier is more advantageous for cell proliferation and differentiation, the three-dimensional cell carrier is very effective in regenerating the actual tissue.

3차원 공간 세포담체에서는 최적의 미세공극구조가 요구되는데, 이는 공극크기, 공극률 및 공극 상호연결성을 포함한 미세공극구조가 골 형성 신호 발현, 세포담체에 접종된(seeded) 세포의 연속분화 및 기계적 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 특히 적절한 공극크기는 세포 이동과 뼈 성장(혈관신생)을 촉진할 수 있으며, 공극률과 공극 상호연결성(굴곡 또는 투과도)은 세포담체에서 세포 점착, 이동, 심지어 분화에 영향을 줄 수 있다. 이에, 본 발명의 세포담체는 골 조직 재생을 위하여 200μm 이상의 공극크기 및 50-55%의 공극률을 가지는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 300~330μm의 공극크기 및 53~55%의 공극률을 가질 수 있다.The optimal microporous structure is required in the three-dimensional space cell carrier because the microporous structure including pore size, porosity and pore interconnection can be used for the expression of bone formation signal, the continuous differentiation of seeded cells in the cell carrier, As well. Particularly adequate pore size can promote cell migration and bone growth (angiogenesis), and porosity and pore interconnection (curvature or permeability) can affect cellular adhesion, migration, and even differentiation in cell carriers. Accordingly, the cell carrier of the present invention preferably has a pore size of 200 μm or more and a porosity of 50-55% for regenerating bone tissue, more preferably a porosity of 300-330 μm and a porosity of 53-55% have.

또한, 세포담체는 생체적합성 또는 생분해성 고분자로 이루어지는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니고, 경우에 따라서는 세포담체의 기계적 특성을 향상시키기 위하여 세라믹 또는 탄소나노튜브를 혼합할 수도 있다. 적절한 기계적 특성은 세포담체에서 매우 중요한데, 이는 세포담체가 새롭게 형성된 조직에서 충분한 기계적 서포트를 하지 않는다면 재생된 조직은 형태를 유지할 수 없기 때문이다. 또한, 생물학적 관점에서, 세포담체의 낮은 기계적 강도는 낮은 세포부착 및 증식을 유도할 수 있다. 따라서 공극구조와 함께 기계적 특성은 세포담체 디자인에서 매우 중요한 요소이다. 일반적인 혼합 이론에 따르면, 혼합물의 기계적 특성은 분산 및 매트릭스 재료의 기계적 특성, 강화재료의 기하학적 형태, 및 분산 재료와 매트릭스 재료 사이의 계면 특성과 강하게 관련될 수 있다. 바이오세라믹스는 그들의 생체적합성과 생리적 환경에서의 골전도성, 생분해안정성, 뼈의 미네랄 상(mineral phase)에서의 화학적 유사성 등 때문에 임상응용에서 가장 일반적으로 사용하는 재료이며, 탄소나노튜브(CNTs)는 우수한 기계적 강도와 신경 세포담체에서 전기전도를 제공하기 때문에 조직 재생재료의 분산상으로 광범위하게 사용되어왔다. 더욱이, 세포담체의 표면에서, CNTs는 인접조직에 지형학적 신호를 제공하는데, 이는 그들의 크기가 기저막 섬유의 크기와 유사하기 때문이다.The cell carrier is preferably composed of a biocompatible or biodegradable polymer. However, the cell carrier is not limited thereto. In some cases, a ceramic or carbon nanotube may be mixed to improve the mechanical properties of the cell carrier. Appropriate mechanical properties are very important in cell carriers because regenerated tissue can not maintain shape unless the cell carrier provides sufficient mechanical support in the newly formed tissue. Also, from a biological point of view, the low mechanical strength of the cell carrier can induce low cell adhesion and proliferation. Therefore, mechanical properties along with pore structure are very important factors in cell carrier design. According to general mixing theory, the mechanical properties of the mixture can be strongly related to the mechanical properties of the dispersion and matrix material, the geometric shape of the reinforcing material, and the interfacial properties between the dispersing material and the matrix material. Bioceramics are the most commonly used materials in clinical applications due to their biocompatibility and bone conduction in physiological environment, stability of biodegradation, chemical similarity in the mineral phase of bones, and carbon nanotubes (CNTs) Has been extensively used as a dispersed phase of tissue regeneration material because it provides mechanical strength and electrical conduction in nerve cell carriers. Moreover, at the surface of the cell carrier, CNTs provide a geographical signal to adjacent tissue, since their size is similar to the size of basement membrane fibers.

이에, 본 발명의 세포담체의 제조를 위해 사용될 수 있는 생체적합성(생분해성) 고분자는 폴리락타이드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌옥사이드 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 세라믹은 β-트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 칼슘메타포스페이트, 하이드록시아파타이드, 옥시아파타이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 나노섬유는 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 사용할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.Accordingly, biocompatible (biodegradable) polymers that can be used for the production of the cell carrier of the present invention include polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polytrimethylene carbene carbonate, polyamino acid, polyorthoester, polyethylene oxide And copolymers thereof, and the ceramic may be selected from the group consisting of? -Tricalcium phosphate, monocalcium phosphate, calcium metaphosphate, hydroxyapatite, oxyacetate, and mixtures thereof, , Nanofibers can use single-walled carbon nanotubes (SWNTs), but are not limited thereto.

가장 바람직하게는, 본 발명의 세포담체는 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리카프로락톤과 탄소나노튜브 혼합물(P/C) 또는 폴리카프로락톤과 β-트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate; β-TCP)(P/T) 혼합물로 이루어질 수 있다. P/C 세포담체에서, 탄소나노튜브(CNT)가 높은 농도로 함유되는 경우에는 상당한 탄소나노튜브 덩어리를 유발할 수 있고, PCL과 CNTs 혼합물의 점도가 매우 높아 플로팅 기계를 사용하여 혼합물을 압출할 수 없는바, 탄소나노튜브(CNT)는 0.2wt% 이하로 포함되는 것이 바람직하다. 또한, P/T 세포담체에서는, β-TCP가 높은 농도로 함유되는 경우 점도가 매우 높아지는 문제점이 있는바, 20wt% 이하로 포함되는 것이 바람직하다.Most preferably, the cell carrier of the present invention is a polycaprolactone (PCL), a mixture of polycaprolactone and carbon nanotube (P / C) or polycaprolactone and tricalcium phosphate (β-TCP ) (P / T) mixture. In a P / C cell carrier, when a high concentration of carbon nanotubes (CNT) is contained, a considerable amount of carbon nanotube aggregates can be generated. Since the viscosity of the mixture of PCL and CNTs is very high, the mixture can be extruded using a floating machine And the carbon nanotube (CNT) is preferably contained in an amount of 0.2 wt% or less. In addition, in the P / T cell carrier, when β-TCP is contained at a high concentration, there is a problem that the viscosity becomes extremely high, and it is preferable that the P / T cell carrier is contained in an amount of 20 wt% or less.

전기장 발생부는 세포담체에 전기적 자극을 인가하기 위한 구성으로서, 함수 발생기 및 오실로스코프를 포함할 수 있다. 함수 발생기는 사용자가 원하는 형태의 파형(waveform)을 생성하며, 바람직하게는 45~65 mVcm^-1의 세기(strength) 및 57~63 Hz의 진동수(frequency)를 갖는 정현파 교류를 생성하는 것이 바람직하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 생성된 파형은 오실로스코프로 입력되며, 상기 오실로스코프는 상기 생성된 파형을 디스플레이함으로써 사용자가 파형을 확인할 수 있도록 한다.The electric field generating portion may include a function generator and an oscilloscope for applying electrical stimulation to the cell carrier. The function generator preferably generates a waveform of a desired shape and preferably produces sinusoidal alternating current having a strength of 45 to 65 mV cm ^-1 and a frequency of 57 to 63 Hz This is not restrictive. The generated waveform is input to an oscilloscope, which displays the generated waveform so that the user can check the waveform.

본 발명의 일 실시예에서는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리카프로락톤과 탄소나노튜브 혼합물(P/C) 또는 폴리카프로락톤과 β-트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate)(P/T) 혼합물로 이루어진 3개의 세포담체를 제조하고(실시예 2 참조)하고, 이의 물리적 분석을 수행한 결과, 상기 세포담체가 3차원 형태를 가지고, 300~330μm의 공극크기와 50~55%의 공극률를 가지며, 우수한 인장강도를 가짐을 확인하였다(실시예 3 참조).In one embodiment of the present invention, a polycaprolactone (PCL), a mixture of polycaprolactone and a carbon nanotube mixture (P / C) or a mixture of polycaprolactone and? -Triccium phosphate (P / T) As a result of physical analysis thereof, it was found that the cell carrier had a three-dimensional morphology, a pore size of 300 to 330 μm, a porosity of 50 to 55%, an excellent tensile strength (See Example 3).

본 발명의 다른 실시예에서는 전기 자극 유무에 따른 조골세포의 분화도를 측정한 결과, 교류 전기장(55±8mVcm^-1 및 60Hz)을 세포담체에 인가하는 경우 ALP 활성과 칼슘증착(calcium deposition)이 증가되어 그 결과, 골 강화가 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다(실시예 8 및 9 참조).In another embodiment of the present invention, the degree of differentiation of osteoblasts according to the presence or absence of electrical stimulation resulted in an increase in ALP activity and calcium deposition when an alternating electric field (55 ± 8 mV cm ^-1 and 60 Hz) was applied to the cell carrier As a result, it was confirmed that bone strengthening was significantly increased (see Examples 8 and 9).

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 바이오리액터 시스템을 이용한 조골 세포 배양 방법을 제공한다:Accordingly, as another aspect of the present invention, the present invention provides a method for osteoblast cell culture using the bioreactor system comprising the steps of:

(4) 상기 전기장 공급부를 통해 발생하는 전기장을 상기 세포담체에 인가하면서 상기 조골세포를 배양하는 단계.
(4) culturing the osteoblast while applying an electric field generated through the electric field supply unit to the cell carrier.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 실험방법Example 1. Experimental Method

1-1. in vitro 세포 배양1-1. in vitro cell culture

세포담체(6×6×2mm)를 70% 에탄올(EtOH)과 자외선(UV)으로 살균하고, 하룻밤동안 배양배지에 두었다. 세포담체 내 세포활성에서의 전기 자극의 영향을 관찰하기 위해 MG63 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 사용했다. MG63세포는 소태아 혈청(fetal bovine serum)(Hyclone) 10%, 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone) 1%를 추가한 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium) 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양되었다. 세포를 passage 7 까지 유지시키고 트립신-EDTA처리에 의해 수집하였다. 세포는 1×10⁵ 세포 50 μl^- ¹밀도로 세포담체에 접종되고, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양되었고, 이때 배지는 격일로 교환했다. 전기 자극을 가한 세포담체 및 전기 자극을 가하지 않은 세포담체 상의 세포의 형태를 평가하기 위해, 14일 후 세포를 SEM으로 조사했다. 세포/세포담체 구조를 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 고정시키고, 단계별 에탄올 시리즈로 탈수시켰다. 건조된 세포담체를 금으로 코딩하고, SEM으로 관찰하였다.
Cell carriers (6 x 6 x 2 mm) were sterilized with 70% ethanol (EtOH) and ultraviolet light (UV) and placed in culture medium overnight. MG63 cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were used to observe the effect of electrical stimulation on cellular activity in the cell carrier. MG63 cells were cultured in dulbecco's modified eagle's medium (Hyclone, Logan, UT, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (Hyclone) and 1% penicillin / streptomycin (Hyclone). Cells were maintained up to passage 7 and collected by trypsin-EDTA treatment. Cells were inoculated on a cell carrier at a density of 1 × 10 ⁵ cells 50 μl ^- ¹ , incubated at 37 ° C in 5% CO ₂ They were cultivated in the environment, at which time the badges were replaced every other day. Cells were examined by SEM after 14 days in order to evaluate the morphology of the cells on the electrical stimulus and on the cell carrier without electrical stimulation. The cell / cell carrier structure was fixed in 2.5% glutaraldehyde and dehydrated with a series of ethanol series. The dried cell carrier was coded with gold and observed with SEM.

1-2. MTT 분석법1-2. MTT assay

4, 7, 14일 후의 세포 생존능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 분석법(Cell Proliferation Kit I; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)으로 확인했다. 상기 분석법은 자주색 포르마잔 결정(purple formazan crystals)을 생성하는 살아있는 세포 내에서 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의한 yellow tetrazolium salt MTT의 분해를 기반으로 한다. 세포담체 상의 세포를 37℃에서 4시간 동안 MTT 0.5mg ml^-1로 배양한 후, microplate reader(EL800; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용해 570nm에서 흡광도를 측정했다. 5개의 샘플은 각각의 배양 기간 동안 테스트되었으며, 각 테스트는 3회 실시되었다.
The cell viability after 4, 7 and 14 days was confirmed by MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay (Cell Proliferation Kit I; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) did. This assay is based on the degradation of yellow tetrazolium salt MTT by mitochondrial dehydrogenase in living cells producing purple formazan crystals. Cells on the cell carrier were incubated with MTT 0.5 mg ml ^-1 for 4 hours at 37 ° C and absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader (EL800; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Five samples were tested during each incubation period, and each test was performed three times.

1-3.통계 분석1-3. Statistical Analysis

제시된 모든 데이터를 평균±SD로 표시하였다. 통계분석은 SPSS(ver. 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용한 single-factor analyses of variance(ANOVA)로 이루어져 있다. 유의 수준을 p < 0.05.로 설정하였다.
All data presented were expressed as mean ± SD. Statistical analysis consisted of single-factor analyzes of variance (ANOVA) using SPSS (ver. 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The significance level was set at p <0.05.

실시예 2. 세포담체(scaffold) 제조Example 2. Preparation of cell scaffold

PCL(Mw=80,000; melting temperature=60℃)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)로부터 얻었고, β-TCP 파우더와 단일벽 나노튜브(SWNTs)는 각각 Fluka(St Louis, MO, USA)와 Sigma-Aldrich로부터 얻었다.Β-TCP powder and single-walled nanotubes (SWNTs) were obtained from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), PCL (Mw = 80,000; melting temperature = 60 ° C) And Sigma-Aldrich.

세포담체는 melt-plotting시스템을 사용하여 제조하였으며, 도 1의 (a)는 일반적인 melt-plotting시스템을 사용하여 세포담체의 제조공정을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 1의 (a)에 나타낸 바와 같이, melt-plotting 시스템은 컴퓨터-제어 3D 구동 시스템(DTR3-2210-T-SG; DASA Robot, Bucheon, South Korea)과 고온-디스펜싱 시스템(AD-3000C; Ugin-tech, Siheung, South Korea)으로 구성되어 있다. 분산된 재료가 PCL 혼합물의 점도를 매우 증가시킬 수 있기 때문에 β-TCP와 SWNTs의 중량분율(weight fraction)은 마이크로 크기의 노즐을 통한 분출을 위한 최대 농도이다.The cell carrier was prepared using a melt-plotting system, and FIG. 1 (a) is a schematic representation of a cell carrier manufacturing process using a general melt-plotting system. 1 (a), the melt-plotting system includes a computer-controlled 3D drive system (DTR3-2210-T-SG; DASA Robot, Bucheon, South Korea) and a hot-dispensing system (AD-3000C; Ugin-tech, Siheung, South Korea). Since the dispersed material can greatly increase the viscosity of the PCL mixture, the weight fraction of β-TCP and SWNTs is the maximum concentration for ejection through a micro-sized nozzle.

먼저, 생분해성 PCL 파우더와 β-TCP 20wt% 및 CNT 파우더 0.2wt%를 혼합하여 플로팅 재료(plotting material)를 준비한 후, 상기 혼합물을 110℃ 가열 실린더에 주입했다. 녹은 P/T 및 P/C가 일정한 압력으로 가열된 250μm 니들 팁을 통해 방출되었다. 방출공정 동안 PCL 내 β-TCP와 CNT의 균일한 분포를 얻기 위해, 방출된 가닥(strut)은 동결분쇄기(freezer mill)에서 재분쇄되었다. 분쇄된 PCL/β-TCP 및 PCL/CNT 혼합물을 플로팅(plotting) 시스템의 히팅 배럴(heating barrel)에 다시 채우고, 플로팅 스테이지(plotting stage)에서 수직 가닥(strut)을 가지고 layer-by-layer 방식으로 플로팅되었다. 이때, 세 개의 세포담체 제조를 위해 디스펜서에 인가할 공기압은 60±30kPa로 설정하였다. 또한, 각각의 세포담체의 가닥(strut) 직경(diameter)을 제어하기 위해, 압출 헤드의 속도를 다음과 같이 변경했다: PCL에 대해서는 7mm s^-1, P/C에 대해서는 6.25 mm s^-1 및 P/T에 대해서는 5 mm s^-1. 상기 과정을 통해 균일한 공극크기와 공극률을 가진 세포담체를 얻었다.
First, biodegradable PCL powder was mixed with 20 wt% of β-TCP and 0.2 wt% of CNT powder to prepare a plotting material, and then the mixture was injected into a heating cylinder at 110 ° C. The molten P / T and P / C were released through a 250 μm needle tip heated to a constant pressure. In order to obtain a uniform distribution of β-TCP and CNT in the PCL during the release process, the released struts were re-milled in a freezer mill. The pulverized PCL /? -TCP and PCL / CNT mixture is refilled into the heating barrel of the plotting system and the stratum in the plotting stage is layer-by-layer It was floating. At this time, the air pressure to be applied to the dispenser for the preparation of three cell carriers was set to 60 ± 30 kPa. In order to control the strut diameter of each cell carrier, the speed of the extrusion head was changed as follows: 7 mm s ^{-1 for} PCL, 6.25 mm s ^-1 for P / C and 5 mm s ^-1 for P / T. Through the above procedure, a cell carrier having uniform pore size and porosity was obtained.

실시예 3. 세포담체의 물리적 분석Example 3. Physical analysis of cell carrier

3-1. 구조적 형태 분석3-1. Structural Shape Analysis

실시예 2를 통해 제조된 세 개의 세포담체에 대한 구조적 형태를 SEM(scanning electron microscope; Sirion, Hillsboro, OR, USA)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 보다 구체적으로 도 2의 (a) 내지 (c)는 각각 PCL, P/C(PCL/CNT) 및 P/T(PCL/β-TCP) 세포담체의 표면과 단면을 SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.The structural form of the three cell carriers prepared in Example 2 was observed with a scanning electron microscope (Sirion, Hillsboro, OR, USA). The results are shown in FIG. More specifically, FIGS. 2 (a) to 2 (c) show SEM observation of the surface and cross section of PCL, P / C (PCL / CNT) and P / T (PCL / will be.

도 2에 나타낸 바와 같이, 가닥(strut)은 초기 디자인으로 잘 유지되었고, 공극구조는 모든 세포담체가 균일함을 확인할 수 있었다.
As shown in Fig. 2, the strut was well maintained in the initial design, and the pore structure was found to be uniform in all cell carriers.

3-2. 3-2. 공극크기Pore size 및 공극률 분석 And porosity analysis

세포담체의 공극 크기는 상기 실시예 3-1을 통해 얻은 SEM 이미지로 측정된 가닥(strut) 사이의 거리로 규정하였다. The pore size of the cell carrier was defined as the distance between the struts measured by the SEM image obtained in Example 3-1.

또한, PCL, P/C 및 P/T 세포담체의 공극률은 하기의 수학식 1을 통해 산출하였다.The porosity of the PCL, P / C and P / T cell carriers was calculated by the following equation (1).

[수학식 1] [Equation 1]

공극률(%)=(1-세포담체의 겉보기 밀도/ 세포담체의 산술적 평균밀도) Porosity (%) = (1 - apparent density of cell carrier / arithmetic average density of cell carrier)

여기서 세포담체의 겉보기 밀도는 다음과 같이 정의했다: Here, the apparent density of the cell carrier was defined as:

세포담체의 겉보기 밀도 = (세포담체의 중량)/(세포담체의 부피, 직사각형 모양으로 가정) Apparent density of cell carrier = (weight of cell carrier) / (volume of cell carrier, assuming a rectangular shape)

한편, 세포담체의 산술적 평균 밀도를 계산하기위해, 혼합물의 간단한 규칙과 CNTs, β-TCP, PCL의 밀도(각각 1.8, 3.14, 및 1.145g cm^-3)를 적용했다.On the other hand, to calculate the arithmetic average density of cell carriers, simple rules of mixture and density of CNTs, β-TCP, PCL (1.8, 3.14, and 1.145 g cm ^{-3 respectively} ) were applied.

도 3의 (a) 및 (b)는 PCL, P/C(PCL/CNT) 및 P/T(PCL/β-TCP) 세포담체의 공극크기와 공극률을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 측정된 평균 공극크기는 313±12μm이었고, 공극률은 53±2%임을 확인할 수 있었다. 공극크기와 공극률이 디자인된 값과 일치하지는 않았으나, 가공조건(온도, 노즐 크기, 노즐 이동속도)에서 가닥(strut)의 가공내성(processing tolerance)과 출구팽창을 고려한다면 측정된 세포담체의 공극크기와 공극률은 합리적인 것으로 사료된다.
3 (a) and 3 (b) show the results of analyzing the pore size and porosity of PCL, PC / CNT and P / T (PCL / β-TCP) cell carriers. As shown in FIG. 3, the measured average pore size was 313. + -. 12 .mu.m and the porosity was 53. + -. 2%. Although the pore size and porosity did not agree with the designed values, it was found that when considering the processing tolerance and outlet expansion of the struts under the processing conditions (temperature, nozzle size, nozzle moving speed) And porosity are considered to be reasonable.

3-3. 인장강도 측정3-3. Tensile strength measurement

세포담체(20×10×2mm)의 기계적 특성은 인장모드에서 microtensile tester(Toptech 2000; Chemilab, Suwon, South Korea)를 사용하여 측정하였다. 기계적 데이터는 10개의 독자적 실험에서 얻었고, 모든 데이터는 단일 표준편차(SD)를 가진 평균값으로 나타냈다. 가닥(strut) 두께는 광학현미경으로 세 가지 다른 지점에서 측정하고, 측정된 값의 평균으로 하였다. 샘플은 실온, 2mm s^- ¹속도에서 연신되는(stretched)데는 실패했다.The mechanical properties of the cell carrier (20 × 10 × 2 mm) were measured in a tensile mode using a microtensile tester (Toptech 2000; Chemilab, Suwon, South Korea). Mechanical data were obtained from 10 independent experiments, and all data were expressed as mean with a single standard deviation (SD). The strut thickness was measured at three different points with an optical microscope and the average of the measured values. The sample failed to stretch at room temperature, 2 mm s ^- ¹ speed.

도 4의 (a)는 PCL, P/C 및 P/T 세포담체의 응력-변형 곡선(stress strain curve)을 나타낸 것이고, (b)는 PCL, P/C 및 P/T 세포담체의 영률(young's modulus) 결과를 나타낸 것이다.4 (a) shows stress strain curves of PCL, P / C and P / T cell carriers, (b) shows the stress strain curves of PCL, P / C and P / young's modulus.

도 4에 나타낸 바와 같이, 상호연결된 가닥(strut)으로 인하여, 모든 곡선은 변동 피크(peak)를 보이며, 혼합 세포담체(P/T)의 영률(young's modulus)은 PCL 세포담체에 비해 매우 증가하였음을 확인할 수 있었다. 하지만, PCL 세포담체와 비교한 P/C 세포담체에서의 영률의 증가는 통계적으로 무시할 수 있을 정도인데, 이는 CNTs의 낮은 농도(0.2wt%) 때문이다.
As shown in FIG. 4, all the curves showed a fluctuating peak due to the interconnected struts, and the Young's modulus of the mixed cell carrier (P / T) was greatly increased compared to the PCL cell carrier . However, the increase in the Young's modulus in the P / C cell carrier compared to PCL cell carriers is statistically negligible, due to the low concentration of CNTs (0.2 wt%).

실시예Example 4. 4. MTTMTT 분석을 통한 전기 자극 유무에 따른 조골세포 Analysis of osteoblasts by electrical stimulation 생존능Survival 측정 Measure

4-1. 전기 자극을 인가하지 않은 경우4-1. If no electrical stimulation is applied

실시예 2를 통해 제조된 각각의 3D 세포담체의 표면에 조골세포를 접종하고, 조골세포의 부착이 안정적으로 이루어지도록 하기 위하여 처음 3일 동안 전기장을 인가하지 않았다. 이렇게 전기 자극을 받지 않은 세포담체에 대하여 MTT분석을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.The osteoblast cells were inoculated on the surface of each 3D cell carrier prepared in Example 2 and the electric field was not applied for the first 3 days in order to stably attach the osteoblasts. The MTT analysis was performed on the cell carriers which were not subjected to the electric stimulation, and the results are shown in FIG.

도 5에 나타낸 바와 같이, 세포담체 내 대부분의 세포들은 세포담체 재료에 상관없이 잘 증식함을 확인할 수 있었다. 비록 P/T 세포담체 내 세포가 상당히 증식되었지만, P/C 세포담체 내 세포의 증식은 PCL 세포담체에서와 다르지 않았다. 이러한 현상은 β-TCP가 생리활성물질로 작용하여, PCL의 소수성 표면에 세포 부착을 증가시킨 반면, PCL 세포담체에서 분산 재료인 CNTs가 중요한 세포증식을 유도하지 않았기 때문인 것으로 사료된다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that most cells in the cell carrier proliferate irrespective of the cell carrier material. Although the cells in the P / T cell carrier were significantly proliferated, the proliferation of the cells in the P / C cell carrier was not different from that in the PCL cell carrier. This phenomenon appears to be due to the fact that β-TCP acts as a physiologically active substance and increases cell adhesion on the hydrophobic surface of PCL, whereas CNTs, a dispersing material in PCL cell carrier, did not induce significant cell proliferation.

한편, Pan et al.(L. Pan, X. Pei, R. He, Q. Wan and J. Wang, Colloids Surf., B, 2012, 93, 226.)에서는 최적의 표면 거칠기 때문에, PCL 세포담체 내 CNTs 0.5wt%가 다른 어떤 중량%(0.25, 1, 2wt%)에 비해 골수-유래 스트로마 세포(stroma cell)의 높은 증식을 더 크게 유도할 수 있다고 제안했다. 이러한 관점에서 볼 때, CNT 혼합 세포담체에는 높은 세포증식 유도를 위한 CNTs의 최적의 중량%가 존재할 수 있다.
On the other hand, because of the optimal surface roughness, the PCL cell carrier (L. Pan, X. Pei, R. He, Q. Wan and J. Wang, Colloids Surf., B, 2012, 93, Suggesting that 0.5 wt% of CNTs can induce higher proliferation of bone marrow-derived stroma cells to a greater extent than any other weight percent (0.25, 1, 2 wt%). From this viewpoint, optimal weight percent of CNTs for inducing high cell proliferation may be present in CNT mixed cell carriers.

4-2. 전기 자극을 인가한 경우4-2. When electrical stimulation is applied

세포담체에 전기장을 인가하기 위해, 배양용기, 함수 발생기 및 오실로스코프로 구성되어 있는 리액터 시스템을 이용하였고, 상기 리액터 시스템 및 배양용기의 개략적인 모식도를 도 1의 (b) 및 (c)에 나타내었다. 도 1의 (b) 및 (c)에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 사용한 배양용기의 크기는 10×10×8mm이며, 배양 용기 내에는 평행한 전극이 삽입되어 있다. In order to apply an electric field to the cell carrier, a reactor system composed of a culture vessel, a function generator and an oscilloscope was used, and schematic schematics of the reactor system and the culture vessel are shown in FIGS. 1 (b) and 1 (c) . As shown in Figs. 1 (b) and 1 (c), the size of the culture container used in this example was 10 x 10 x 8 mm, and parallel electrodes were inserted in the culture container.

우선, 배양용기를 70% 에탄올(EtOH)과 자외선(UV)으로 살균한 후, 조골세포(MG63)를 1×10⁵ cells 50 μl^- ¹농도로 챔버(chamber) 내 세포담체(6×6×2mm)에 접종하였다. 세포담체에 세포를 안정적으로 부착시키기 위해, 주입한 세포를 3일 동안 전기 자극 없이 세포담체에서 배양한 후, 11일 동안 하루 30분씩 세포담체에 전기 자극을 인가했다. 즉, 두 개의 평행한 전극을 통해 전기 자극을 인가하였는데, 보다 구체적으로는 함수 발생기(WF1944B; NF Corp., Yokohama, Japan)를 사용하여 AC 전기 자극을 인가하였다. 이때, 인가된 전기장의 세기(strength)와 주파수(frequency)는 세포 손상을 최소화하는 안정 범위를 얻기 위해 하기의 표 1의 전기장 조건에서 선택되었다. 한편, 배지는 2일마다 교환해 주었으며, 전기 자극을 인가하지 않고 세포를 배양한 각각의 세포담체를 대조군으로 하였다.First, after sterilizing the culture container with 70% ethanol (EtOH) and ultraviolet (UV), osteoblasts (MG63) to 1 × 10 ⁵ cells 50 μl ^- the cell carrier ¹ level in the chamber (chamber) (6 × 6 × 2 mm). In order to stably attach the cells to the cell carrier, the injected cells were cultured in a cell carrier for 3 days without electric stimulation, and then electric stimulation was applied to the cell carrier for 30 minutes for 11 days. That is, electric stimulation was applied through two parallel electrodes. More specifically, AC electric stimulation was applied using a function generator (WF1944B; NF Corp., Yokohama, Japan). At this time, the strength and frequency of the applied electric field were selected under the electric field conditions of Table 1 below in order to obtain a stable range that minimizes cell damage. On the other hand, the medium was changed every 2 days, and each cell carrier cultured without electric stimulation was used as a control group.

상기 세포담체들에 대하여 MTT분석을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 전기 자극을 받은 모든 세포담체의 세포 생존능은 전기 자극을 받지 않은 세포담체의 세포 생존능이 비해 약 8-15% 낮음을 확인할 수 있었다. 이는 전기 자극이 세포담체에 가해지면, 전기영동 힘이 배지와 세포의 약간 불규칙한 유체 이동을 유발하여 부착/증식된 세포의 분리를 유발하기 때문인 것으로 사료된다. MTT analysis was performed on the cell carriers, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 6, the cell viability of all cell carriers that received electrical stimulation was about 8-15% lower than the cell viability of untreated cell carriers. This suggests that the electrophoretic force induces a slight irregular fluid movement in the medium and the cells to cause the separation of adhered / proliferated cells when the electrical stimulus is applied to the cell carrier.

한편, Mehrishi et al.,(J. N. Mehrishi and J. Bauer, Electrophoresis, 2002, 23, 1984.)에 따르면, 대부분의 세포의 전기영동 이동도(electrophoretic mobility)는 전기장 1Vcm^-1에서 1 μm s^-1이다. 이동도(mobility)는 "ε。ξ/η"로 정의 될 수 있는데, 여기서 ε。는 배지의 유전율(permittivity)을, η는 배지의 점도를, ξ는 세포의 전하 밀도 및 배지의 이온강도와 관련이 있는 제타 전위(zeta potential)를 나타낸다.
According to Mehrishi et al., (JN Mehrishi and J. Bauer, Electrophoresis, 2002, 23, 1984), the electrophoretic mobility of most cells is 1 m cm ^-1 to 1 μm s ^-1 to be. The mobility can be defined as "ε.ξ / η", where ε is the permittivity of the medium, η is the viscosity of the medium, ξ is the charge density of the cell and the ionic strength of the medium Indicating the relevant zeta potential.

실시예 5. 전기 자극 유무에 따른 세포 수축/이동성 분석Example 5: Cell shrinkage / mobility analysis with and without electrical stimulation

전기 자극 유무에 따른 세포의 수축/이동성을 분석하기 위해, 먼저 전기장 인가 없이 12시간 동안 PCL 플레이트에서 MG63 세포를 배양하였다. 12시간 경과 후, 전기장(55±8mVcm^-1 및 60Hz)을 PDL플레이트의 세포에 가하였다(도 7의 (a) 참조).To analyze the contraction / migration of cells according to electrical stimulation, MG63 cells were cultured on PCL plates for 12 hours without electric field application. After 12 hours elapsed, electric fields (55 +/- 8 mVcm < ^-1 > and 60 Hz) were applied to the cells of the PDL plate (see Fig. 7 (a)).

전기장을 인가한 PCL플레이트 및 전기장을 인가하지 않은 PCL 플레이트에서 세포를 배양한지 0, 15 및 30분에 각각의 광학 이미지를 얻었고, 그 결과를 도 7의 (b) 및 (c)에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 7의 (b)는 전기장을 인가한 PCL플레이트의 광학 이미지이고, (c)는 전기장을 인가하지 않은 PCL 플레이트의 광학 이미지를 나타낸 것이다. 한편, 화살표는 증식된 세포의 수축을 나타낸다.The optical images were obtained at 0, 15 and 30 minutes after the cells were cultured on the PCL plate to which the electric field was applied and the PCL plate to which the electric field was not applied, and the results are shown in FIGS. 7 (b) and 7 (c). More specifically, FIG. 7 (b) is an optical image of a PCL plate to which an electric field is applied, and FIG. 7 (c) is an optical image of a PCL plate to which no electric field is applied. On the other hand, arrows indicate the contraction of proliferated cells.

도 7의 (b) 및 (c)에서 나타낸 바와 같이, PCL 기질에 부착된 세포는 전기장을 가하는 동안 수축함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 전기 자극은 세포 이동에 영향을 줄 수 있고, 이로 인해 세포담체의 표면으로부터 세포의 수축/분리가 일어나 세포담체 상에 살아있는 세포(viable cell)의 수를 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. As shown in FIGS. 7 (b) and 7 (c), it was confirmed that the cells attached to the PCL substrate contracted during application of the electric field. From the above results, it can be seen that electrical stimulation can affect cell migration, resulting in contraction / separation of the cells from the surface of the cell carrier and reducing the number of viable cells on the cell carrier.

상기 결과로부터, 전기장 자극의 동전기적 힘(electrokinetic force)에 의해 세포가 영향을 받아 세포의 사멸 및 접착된 부분과의 탈락이 없이, 약 20% 정도의 응집율을 향상시켜 동일한 면적 내에서의 세포 밀도를 향상시킴을 확인할 수 있었다.From the above results, the cells were affected by the electrokinetic force of the electric field stimulus, and the cohesion ratio of about 20% was improved without the cell death and the dislocation of the bonded part, Thereby improving the density.

한편, Hwang et al.,(I. S. Kim, J. K. Song, Y. M. Song, T. H. Cho, T. H. Lee, S. J. Kim and S. J. Hwang, Tissue Eng. A, 2009, 15, 2411.; S. J. Hwang, Y. M. Song, T. H. Cho, R. Y. Kim, T. H. Lee, S. J. Kim, Y.-K. Seo and I. S. Kim, Tissue Eng. A, 2012, 18, 432.)에 따르면, 전기 자극된 인간 중간엽 스트로마 세포는 2차원 배지에서 증식되었다. 3D 세포담체에 동일한 전기장을 인가하였지만, 세포 증식은 전기 자극된 그룹과 대조군 그룹 간에 유사하였다.
SJ Hwang, YM Song, TH Cho, SJ Kim and SJ Hwang, Tissue Eng., 2009, 15, 2411. Hwang et al. According to RY Kim, TH Lee, SJ Kim, Y.-K. Seo and IS Kim, Tissue Eng.A, 2012, 18, 432.), electrostimulated human mesenchymal stromal cells proliferated in two-dimensional medium. The same electric field was applied to the 3D cell carrier, but cell proliferation was similar between the electrostimulated group and the control group.

실시예 6. 전기 자극 유무에 따른 Live/dead 세포 분석Example 6. Live / dead cell analysis with and without electrical stimulation

세포배양 14일 후 전기 자극 받은 세포담체 상의 세포 생존능을 측정하기 위해, MG63 세포를 배양기에서 30분 동안 칼세이 AM(calcein AM) 0.15mM 및 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1) 2mM에 노출시켰다. 염색된 세포는 디지털 카메라(U-LS30-3; Olympus)가 탑재된 형광 현미경(CKX41; Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 세포 생존능을 측정하기 위해, 이미지J프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA)을 통해 이미지를 캡처하고 녹색(live)과 적색(dead) 스팟의 수를 처리(processed)하였고, 그 결과를 도 8의 (a) 내지 (c)에 나타내었다. 또한, 세포담체 내 총 세포 수 대비 살아있는 세포 수의 비율을 소프트웨어를 사용하여 산출하였고, 이때 상기 비율은 전기장 자극이 없는 각 세포담체의 세포 생존능으로 정규화하였으며, 그 결과를 도 8의 (d)에 나타내었다. 한편, 전기 자극을 인가하지 않고 세포를 배양한 각각의 세포담체를 대조군으로 하였다.14 days after cell culture, MG63 cells were cultured in an incubator for 30 minutes with 0.15 mM of calcein AM and 2 mM of ethidium homodimer-1 to measure cell viability on the electrostimulated cell carrier Exposed. The stained cells were analyzed with a fluorescence microscope (CKX41; Olympus, Tokyo, Japan) equipped with a digital camera (U-LS30-3; Olympus). To measure cell viability, an image was captured through an Image J program (NIH, Bethesda, MD, USA) and processed with the number of live and dead spots, (a) to (c). In addition, the ratio of the number of living cells to the total number of cells in the cell carrier was calculated using software, and the ratio was normalized by the cell viability of each cell carrier without electric field stimulation. The results are shown in FIG. 8 (d) Respectively. On the other hand, each cell carrier in which cells were cultured without applying electrical stimulation was used as a control.

도 8의 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같이, 전기 자극된 세포담체 상에서 죽은 세포는 전기장에 자극되지 않은 세포담체 상의 세포보다 더 광범위하게 퍼져있음을 확인할 수 있었고, 이는 세포증식과 유사한 이유 때문인 것으로 사료된다. 하지만, 세포담체(PCL, P/C, P/T) 중에서, 세포 생존능에 더 의미있는 증가는 P/C나 PCL 세포담체보다 P/T 세포담체에서의 증가이다(도 8의 (d) 참조). 이러한 결과는 P/C나 PCL 세포담체와 비교하여, β-TCP 입자에 의한 세포담체의 거친 표면과 세포담체 내 β-TCP의 친수성 특성이 세포에 결합하는 사이트를 제공하기 때문에 일어나는 것으로 사료된다. As shown in Figures 8 (a) to 8 (c), it can be seen that cells dead on the electrically stimulated cell carrier are more widespread than cells on the cell carrier that are not stimulated by the electric field, . However, a more significant increase in cell viability in the cell carriers (PCL, P / C, P / T) is the increase in P / T cell carriers than P / C or PCL cell carriers (see FIG. ). These results suggest that the rough surface of the cell carrier due to β-TCP particles and the hydrophilic property of β-TCP in the cell carrier provide sites for binding to the cells, as compared with P / C or PCL cell carriers.

한편, 이전 연구인 P/T 나노섬유와 젤라틴/β-TCP 나노섬유 시스템에서도 유사한 결과가 나타났으며, 이는 MG63 세포의 높은 세포 부착은 나노섬유 표면에서 β-TCP 파우더를 돌출시킴으로써 많아진 세포 결합 사이트 때문에 일어난다는 것을 보여주는 것이다.
Similar results were obtained in the previous study, P / T nanofibers and gelatin / β-TCP nanofiber systems, which showed that high cell attachment of MG63 cells caused β-TCP powder to protrude from the nanofiber surface, It is to show that it happens because of.

실시예 7. 전기 자극 유무에 따른 칼슘과 인 신호 변화 측정Example 7. Measurement of calcium and phosphorus signal changes with and without electrical stimulation

세포배양 14일 후 전기 자극 받은 각각의 세포담체의 형태적 특징을 SEM 현미경으로 확인하면서, 세포담체 내 세포 표면의 칼슘과 인을 확인하기 위해 EDS(energy-dispersive spectroscopy) 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 9의 (a) 내지 (c) 및 표 2에 나타내었다.After 14 days of cell culture, EDS (energy-dispersive spectroscopy) analysis was performed to confirm the morphological characteristics of each cell carrier that was electrically stimulated by SEM microscope and to confirm the calcium and phosphorus on the cell surface of the cell carrier. Are shown in Figs. 9 (a) to (c) and Table 2.

도 9의 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같이, 세포는 세포담체 재료와 관계없이 모든 세포담체의 가닥(strut) 상에 잘 분포되었고, 특히 P/T세포담체에서, 세포가 더 조밀하게 가닥(strut)을 뒤덮은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 전기 자극을 받은 세포 담체 및 전기 자극을 받지 않은 세포담체의 결과가 유사했다. 또한, 전기 자극을 받은 그룹과 자극을 받지 않은 그룹 사이의 SEM이미지를 비교하였을 때, 약간 낮은 수의 세포가 전기 자극을 받은 그룹에서 나타났다.As shown in Figs. 9 (a) to 9 (c), the cells were well distributed on the struts of all the cell carriers regardless of the cell carrier materials, and particularly in the P / T cell carriers, Struts were covered, which was similar to that of the cell carriers that received electrical stimulation and those that did not receive electrical stimulation. Also, when comparing the SEM images between the electrostimulated and unstimulated groups, a slightly lower number of cells appeared in the electrostimulated group.

또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, 칼슘과 인의 양은 전기 자극된 P/T 세포담체의 경우가 PCL 및 P/C 세포담체에서의 경우보다 상당히 높음을 확인할 수 있었다.
In addition, as shown in Table 2, it was confirmed that the amount of calcium and phosphorus was significantly higher in the case of the electrically stimulated P / T cell carrier than in the case of the PCL and P / C cell carrier.

실시예 8. P/T 세포담체로부터의 칼슘 이온 방출 측정Example 8. Calcium ion release measurement from P / T cell carrier

전기 자극이 세포 대사작용의 중요한 조절자인 칼슘 이온에 영향을 미칠 수 있다. 비록 세포 배양배지 내 여러 이온들이 전기장에 관련되어 있지만, 현재 칼슘이온이 가장 중요한 캐리어로 알려져 있고, 심지어 세포 분극의 시작(onset) 및 대사작용에 영향을 미칠 수 있다. 전기 자극은 세포의 많은 전기생리학적에 원인이 되는 이온 채널을 작동시키고, 이온은 많은 엔자임 시스템을 자극하며, 이에 대한 자세한 설명은 도 10에 나타내었다. 자극된 세포활성을 통해, 뼈의 ECM의 강화작용에 중요한 콜라겐, 오스테오넥틴(osteonectin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)이 효과적으로 발현될 수 있다.Electrical stimulation can affect calcium ion, an important regulator of cellular metabolism. Although several ions in cell culture media are involved in the electric field, current calcium ions are known to be the most important carriers and can even affect the onset and metabolism of cellular polarization. Electrical stimulation activates ion channels which cause many electrophysiologic effects of cells, and ions stimulate many enzyme systems, and a detailed description thereof is shown in FIG. Through stimulated cellular activity, collagen, osteonectin, and osteocalcin, important for enhancing the ECM of the bone, can be effectively expressed.

세포의 전기자극의 이론적 메커니즘에 따라, 칼슘 이온은 세포 활성과 분극에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 실시예에서는 유도결합질량분석기(DRC II; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 PCL/β-TCP 세포담체가 1, 3, 7일 동안 세포 없이 침지된 PBS(phosphate-buffered saline) 내의 칼슘 농도를 측정함으로써 칼슘 이온 방출 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.Depending on the theoretical mechanism of cellular electrical stimulation, calcium ions play an important role in cell activity and polarization. Thus, in this example, the PCL / β-TCP cell carrier was immobilized in PBS (phosphate-free) for 1, 3, and 7 days without cells using an inductively coupled mass spectrometer (DRC II; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) buffered saline) to determine the degree of calcium ion release. The results are shown in FIG.

도 11에 나타낸 바와 같이, 방출되는 칼슘 이온은 침지 시간이 증가함에 따라 점차 증가함을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 PCL 및 P/C 세포담체로부터 방출된 칼슘이온과 비교하여, P/T 세포담체로부터 방출된 칼슘이온이 세포를 크게 자극할 수 있고, 이로 인해 ECM의 높은 칼슘 강화작용을 야기시킨다는 것을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 11, it was confirmed that the calcium ions released gradually increased with increasing immersion time. From the above results, it was found that compared with the calcium ions released from PCL and P / C cell carriers, Can stimulate cells to a large extent, resulting in a high calcium-enhancing action of ECM.

추가적으로, 세포자극에서 방출된 칼슘이온의 효과를 관찰하기 위해, 다양한 함량의 β-TCP(0, 0.05, 및 0.1 wt%)에 따라 전기 자극을 인가한 경우의 세포 이동과 전기 자극을 인가하지 않은 경우의 세포 이동을 나타내는 광학 이미지를 확인했고, 그 결과를 도 12의 (a) 내지 (c)에 나타내었다. 구체적인 실험 과정은 β-TCP 파우더를 추가하였다는 것을 제외하곤 실시예 5와 동일하였다. 또한, 증식된 세포의 수축영역을 AutoCAD 2009버전으로 측정하였고, 그 결과를 도 12의 (d)에 나타내었다.In addition, in order to observe the effect of calcium ions released from cell stimulation, cell migration and electrical stimulation in the case of electrical stimulation with various contents of β-TCP (0, 0.05, and 0.1 wt%) , And the results are shown in Figs. 12 (a) to 12 (c). The specific experimental procedure was the same as in Example 5, except that β-TCP powder was added. In addition, the shrinkage area of the proliferated cells was measured by the AutoCAD 2009 version, and the results are shown in FIG. 12 (d).

도 12의 (d)에 나타낸 바와 같이, 증식된 세포의 수축영역은 배지 내 β-TCP 함량이 증가함에 따라 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
As shown in (d) of FIG. 12, it was confirmed that the contraction region of the proliferated cells greatly increased as the β-TCP content in the medium increased.

실시예 9. 전기 자극 유무에 따른 조골세포 분화 촉진능 측정Example 9 Measurement of osteoblast differentiation promoting ability according to electric stimulation

9-1. ALP(알카리성 인산분해효소 활동) 활성 분석9-1. ALP (Alkaline Phosphatase Activity) activity assay

7 및 14일 동안 조골세포 활성 마커인 ALP(alkaline phosphatase)는, p-NPP(p-nitrophenyl phosphate)로부터의 p-nitrophenol의 방출을 측정하여 분석되었다. MG63 세포가 접종된 세포담체는 PBS로 가볍게 헹군 후, Triton X-100 0.1%를 포함한 Tris버퍼(10mM, pH 7.5)에서 10분 동안 배양했다. 이어서 ALP키트(Procedure no. ALP-10; Sigma-Aldrich)를 사용하여 용해물(lysate) 100ml를 p-NPP용액 100ml를 포함한 96-well 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. ALP의 존재에서, p-NPP는 p-니트로페놀(p-nitrophenol)과 무기 인(inorganic phosphate)으로 변환되었다. ALP 활성은 405nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었고, 그 결과를 도 13의 (a)에 나타내었다.ALP (alkaline phosphatase), an osteoblast activity marker for 7 and 14 days, was analyzed by measuring the release of p-nitrophenol from p-NPP (p-nitrophenyl phosphate). Cell carriers inoculated with MG63 cells were lightly rinsed with PBS and cultured in Tris buffer (10 mM, pH 7.5) containing 0.1% Triton X-100 for 10 minutes. 100 ml of lysate was then added to a 96-well tissue culture plate containing 100 ml of p-NPP solution using an ALP kit (Procedure No. ALP-10; Sigma-Aldrich). In the presence of ALP, p-NPP was converted to p-nitrophenol and inorganic phosphate. The ALP activity was determined by measuring the absorbance at 405 nm, and the results are shown in Fig. 13 (a).

도 13의 (a)에 나타낸 바와 같이, 전기 자극을 받은 모든 세포담체에서 ALP활성이 전기 자극을 받지 않은 세포담체에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 전기 자극은 다른 세포담체(PCL 및 P/C)에 비해 P/T 세포담체의 골 강화작용에 크게 영향을 미쳤음을 확인할 수 있었다(도 13의 (c) 참조).
As shown in FIG. 13 (a), it was confirmed that the ALP activity was increased in all the cell carriers subjected to the electric stimulation compared to the cell carriers not receiving the electric stimulation. In particular, it was confirmed that the electrical stimulation greatly influences the bone-strengthening action of the P / T cell carrier as compared with other cell carriers (PCL and P / C) (see FIG.

9-2. 칼슘 증착9-2. Calcium deposition

배양 7일 및 14일째 각 세포담체 상에서의 칼슘 증착을 ARS(alizarin red S)염료를 사용하여 확인하였고, 그 결과를 도 13의 (b)에 나타내었다. ARS데이터 상에서 P/T 세포담체 내 남은 β-TCP 입자의 영향을 피하기 위해, P/T 세포담체에 대한 대조 실험을 수행했고, 이 때 P/T세포담체는 세포배양공정에 사용한 것과 완전히 동일한 공정 하에 세포 없이 7일 및 14일 동안 배지에서 배양하였다. 세포 없이 배양된 P/T 세포담체의 평균 OD 값을 세포를 배양한 세포담체의 OD 값에서 뺐다.Calcium deposition on each cell carrier on days 7 and 14 of culture was confirmed using ARS (alizarin red S) dye and the results are shown in FIG. 13 (b). In order to avoid the influence of the remaining β-TCP particles in the P / T cell carrier on the ARS data, a control experiment on the P / T cell carrier was carried out, in which the P / T cell carrier was completely identical to the one used in the cell culture process 0.0 > 7 < / RTI > and 14 days. The average OD value of the P / T cell carrier cultured without cells was subtracted from the OD value of the cell carrier in which the cells were cultured.

도 13의 (b)에 나타낸 바와 같이, 전기 자극을 받은 모든 세포담체에서 칼슘증착이 전기 자극을 받지 않은 세포담체에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, β-TCP 및 전기 자극으로부터 방출된 칼슘이온으로 인해 조골세포의 분화가 촉진되었음을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 13 (b), it was confirmed that the calcium deposition was increased in all the cell carriers subjected to the electric stimulation as compared with the cell carriers not receiving the electric stimulation. From the above results, it was found that the osteoblast differentiation was promoted by the beta-TCP and calcium ions released from the electric stimulation.

9-3. BCA 분석9-3. BCA analysis

실시예 9-1 및 9-2를 통해 측정한 ALP 활성과 칼슘증착은 표 3에서 나타낸 총 단백질 함량으로 정규화하였다.The ALP activity and calcium deposition measured through Examples 9-1 and 9-2 were normalized to the total protein content shown in Table 3.

총 단백질 함량은 BCA(bicinchoninic acid) protein assay(Thermo Scientific Pierce, Waltham, MA, USA)을 사용하여 측정되었다. 배양 7일 및 14일 후, 세포기질을 분석하였다. 세포기질을 PBS로 세척하고, 트리톤 X-100(0.1%) 1ml로 용해하였다. 트리톤 용해물(25μl)의 부분표본(aliquot)을 BCA working reagent 200μl에 추가하고, 그 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 단백질 농도는 ELISA 리더를 사용하여 562nm에서의 흡광도를 통해 결정되었고, 농도 곡선을 이용하여 총 단백질 농도로 변환하였다.
Total protein content was measured using a bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Thermo Scientific Pierce, Waltham, Mass., USA). After 7 and 14 days of culture, cell matrices were analyzed. The cell substrate was washed with PBS and lysed with 1 ml of Triton X-100 (0.1%). A aliquot of triton lysate (25 μl) was added to 200 μl of BCA working reagent and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. Protein concentration was determined by absorbance at 562 nm using an ELISA reader and converted to total protein concentration using a concentration curve.

9-4. 강화작용(mineralization) 확인9-4. Confirmation of mineralization

강화작용(mineralization)은 알리자린(Alizarin) S 염색에 의해 확인되었다. MG63 세포를 vitamin C 50 μg ml^-1 및 β-glycerophosphate 10mM을 포함한 DMEM에서 7일 및 14일 동안 배양하고, 세포를 PBS로 세 번 세척한 다음, 1시간 동안 차가운 에탄올(4℃) 70%(v/v)로 고정하고, 공기-건조시켰다. 에탄올로 고정시킨 표본을 alizarin red S(pH 4.2) 40mM로 1시간 염색하고, 증류수로 세 번 세척하였다. 표본을 인산 나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)(pH 7.0) 10mM에서 세틸피리디움 클로라이드(cetylpyridium chloride) 10%로 15분 동안 탈색하였다. ELISA reader (EL800; Bio-Tek Instruments)를 사용하여 562nm에서 광학밀도(optical density)를 측정하였다. 측정된 OD 값은 총 단백질 함량을 사용하여 정규화되었고, 상대적 칼슘 증착으로 제시되었다. 또한, 7일 및 14일 동안 alizarin red S로 염색한 세포담체 내 칼슘을 광학현미경(BX51; Olympus)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.Mineralization was confirmed by Alizarin S staining. MG63 cells were cultured for 7 days and 14 days in DMEM containing 50 μg ml ^-1 of vitamin C and 10 mM of β-glycerophosphate, and the cells were washed three times with PBS and then incubated for 1 hour in cold ethanol (4 ° C) at 70% v / v) and air-dried. The ethanol-fixed specimens were stained with 40 mM alizarin red S (pH 4.2) for 1 hour and washed three times with distilled water. The sample was decolorized with 10% cetylpyridium chloride in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) for 15 minutes. The optical density was measured at 562 nm using an ELISA reader (EL800; Bio-Tek Instruments). The measured OD values were normalized using total protein content and presented as relative calcium deposition. In addition, calcium in the cell carrier stained with alizarin red S for 7 days and 14 days was observed under an optical microscope (BX51; Olympus), and the results are shown in FIG.

도 14에 나타낸 바와 같이, 다른 세포담체에 비해 P/T 세포담체에서 칼슘농도가 높음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, P/T 세포담체 내 β-TCP는 전기 자극 하에 골 강화작용을 지원하는 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 14, it was confirmed that the calcium concentration in the P / T cell carrier was higher than in other cell carriers. From the above results, it was found that β-TCP in the P / T cell carrier plays an important role in supporting the bone-strengthening action under electric stimulation.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

Claims

A cell culture container having a chamber and an electrode;
A scaffold in the form of a three-dimensional lattice that includes a surface to which osteoblasts attach and grow; And
And an electric field supply unit for generating an electric field for applying electrical stimulation to the cell carrier,
The cell carrier is composed of a mixture of polycaprolactone and? - tricalcium phosphate (P / T)
The electric field generator includes a function generator for generating a waveform desired by a user and an oscilloscope for allowing the user to confirm the waveform by displaying the generated waveform,
Wherein the function generator generates a sinusoidal alternating current with a frequency of 45 to 65 mVcm < ^-1 > and a frequency of 57 to 63 Hz.

The method according to claim 1,
Wherein the electrodes are disposed adjacent to and parallel to two side walls of the cell culture container, respectively.

delete

The bioreactor system according to claim 1, wherein the cell carrier has a pore size of 300 to 330 μm and a porosity of 53 to 55%.

delete

(1) attaching osteoblasts to the surface of a cell carrier;
(2) disposing the cell carrier in the chamber;
(3) culturing the osteoblast cells for 3 days without applying electrical stimulation to the cell carrier; And
(4) culturing the osteoblast while applying an electric field generated through the electric field supply unit to the cell carrier,
The cell carrier is composed of a mixture of polycaprolactone and? - tricalcium phosphate (P / T)
Characterized in that in step (4), a sinusoidal alternating current having a strength of 45 to 65 mV cm ^-1 and a frequency of 57 to 63 Hz is applied to the cell carrier Osteoblast cell culture method.

delete