KR101384642B1 - A pharmaceutical composition containing N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as a active ingredient for the prevention and treatment of parkinson's disease - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 N-말단 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)이 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease comprising N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1) as an active ingredient. Specifically, N-terminal removed ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 from which N-terminal 11 amino acids of UCH-L1 are removed (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1) By being located in the mitochondria, it was confirmed that it plays a major role in the regulation of stress that induces free radical species and mitochondrial damage, it can be used as an active ingredient in the composition for preventing and treating Parkinson's disease.

Description

Ｎ―말단이 제거된 유비퀴틴 Ｃ―말단 가수분해효소―Ｌ１（ＮＴ―ＵＣＨ―Ｌ１）를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition containing N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as a active ingredient for the prevention and treatment of parkinson's disease}A pharmaceutical composition containing N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal containing N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as an active ingredient. hydrolase-L1 as a active ingredient for the prevention and treatment of parkinson's disease}

본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention is a pharmaceutical for the prevention and treatment of Parkinson's disease comprising N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1) as an active ingredient To a red composition.

파킨슨병은 퇴행성 신경계 질환 중 두 번째를 차지하는 진행성 질환으로 노인 인구의 증가와 함께 그 발병률이 계속 증가하고 있어서 사회 및 경제적으로 문제가 되고 있는 난치성 질환이다. 현재 전세계적으로 약 4 백만 명이 이 질환에 걸려 있는 것으로 알려져 있으며, 미국의 경우 매년 약 5만 명씩 환자가 증가하고 있는 것으로 파악되고 있다. 발병률은 1천명 중 한 명 꼴로 연령이 높을수록 발생 빈도가 높다. 이 질환의 임상적 특징으로는 운동완서(Bradykinesia), 경직(Rigidity), 자세불안정(Postural instability)과 같은 운동성 이상 증상들과 인지기능장애(cognitive dysfunction), 우울증(Depression), 수면장애(sleep disorder), 통증(pain) 등을 동반하는 비운동성 이상 증상들이 있다(대한민국 공개특허 10-2010-0125843). 파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만, 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다. Parkinson's disease is the second most progressive disease of the degenerative nervous system. It is a refractory disease that is becoming a social and economic problem because the incidence rate continues to increase with the increase of the elderly population. About 4 million people are known to have this disease worldwide, and the number of patients in the United States is increasing by 50,000 each year. The incidence rate is one in 1,000, and the higher the age, the more frequent the occurrence. The clinical features of the disease include dyskinesia, cognitive dysfunction, depression, and sleep disorders such as bradykinesia, rigidity, and postural instability. ), Non-motor abnormalities accompanied by pain (pain) and the like (Korea Patent Publication No. 10-2010-0125843). The cause of Parkinson's disease is not known exactly, but the 'multiplicity hypothesis' that genetic and environmental factors interact with each other is the most widely accepted.

이와 같이 파킨슨병은 그 병인이 정확히 알려져 있지 않기 때문에, 근본적인 치료보다 주로 증상개선을 위한 치료방법들이 이용되고 있다. 현재 사용되고 있거나 개발중인 치료제들은 다음과 같다. 가장 많이 개발되어 사용되고 있는 약물로는 도파민 보충제인 레보도파(Levodopa)와 같은 도파민 전구체와 도파민 수용체 효현제(fenofibrate)등이 있다. 그 외에도, 파킨슨병을 치료하기 위하여 사용되고 있는 치료제로는 FDA 허가된 도파민 작용제(Dopamine Agonists), 카테콜-0-메틸트랜스퍼레이즈(catechol-O-methyltransferase inhibitor, COMT inhibitor), 모노아민 산화효소 B(monoamine oxidase B, MAO-B inhibitors), 항-콜린작용제(Anti-cholinergics) 등이 있으며, 뇌신경세포 보호제제, 항산화제, 뇌세포 고사 억제제, 뇌기능 항진제 등을 치료제로 이용하거나 개발하려는 노력들이 계속되고 있다(대한민국 공개특허 10-2010-0097059). 파킨슨병의 치료 기술이나 약물의 신경보호 효과에 대해서는, 파킨슨병의 급성 염증 단계로서 미토콘드리아의 기능 손상과 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인한 세포 사멸에 대한 것이 연구되고 있는 실정이다. As such, Parkinson's disease has not been known to be precisely known in its etiology, and thus, treatments for symptomatic improvement are used rather than radical treatment. Therapies currently in use or under development include: The most developed and used drugs include dopamine precursors such as levodopa, a dopamine supplement, and dopamine receptor agonists (fenofibrate). In addition, therapies used to treat Parkinson's disease include FDA-approved dopamine agonists, catechol-O-methyltransferase inhibitors (COMT inhibitors), and monoamine oxidase B ( monoamine oxidase B, MAO-B inhibitors) and anti-cholinergics, and efforts to use or develop brain neuroprotective agents, antioxidants, inhibitors of brain cell death, and anti-brain function are ongoing. (Republic of Korea Patent Publication 10-2010-0097059). As for the neuroprotective effect of Parkinson's disease and the neuroprotective effect of the drug, the acute inflammatory stage of Parkinson's disease is a study on cell death due to mitochondrial dysfunction and oxidative stress.

파킨슨병을 유발하는 요인으로서, 노화가 가장 큰 연관이 있는 것으로 알려져 있고, 농약 등과 같은 신경 독소들에 의한 환경적 요인, 활성 산소 그리고 유전적 요인(5-10% 정도) 등이 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전(mitochondria dysfunction)도 파킨슨병 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다(Grunblatt 등, J. Neural Transm. 111: 1543-1573, 2004). 유전적 요인으로는 알파시누클레인(a-synuclein), 파킨(Parkin), UCH-L1(Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1), DJ-1, NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), 신필린-1(Synuclein-alpha-interacting protein, Synphilin-1)등과 같은 유전자 돌연변이와 연관되어 있다고 알려져 있다(Dawson 등, Science 302:819-822, 2003).
Aging is known to be the most common cause of Parkinson's disease, and environmental factors, free radicals, and genetic factors (5-10%) caused by neurotoxins such as pesticides affect the onset. It is known to be mad. In addition, oxidative stress and mitochondria dysfunction may be associated with the pathogenesis of Parkinson's disease (Grunblatt et al., J. Neural Transm. 111: 1543-1573, 2004). Genetic factors include a-synuclein, Parkin, UCH-L1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1), DJ-1, NR4A2 (Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), It is known to be associated with gene mutations such as Synuclein-alpha-interacting protein (Synphilin-1) (Dawson et al., Science 302: 819-822, 2003).

UCH-L1 단백질은 유비퀴틴의 C-말단의 유비퀴틸 에스테르(ubiquityl esters)를 가수분해(hydrolyze)하여 단량체(monomer)를 만드는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11:141-148, 2000), 이 유전자의 변이는 93번 위치의 이소루신(Isoleucine) 아미노산이 메티오닌(Methionine) 아미노산으로 변이된 것으로 한 가계에서 이러한 변이가 우성형질로 유전됨이 보고되었다(Leroy 등, Nature 395:451-452, 1998). 그러나, 이와 같은 변이와 관련된 병리학적 데이터(Pathological data)는 아직 보고되지 않고 있다(대한민국 등록특허 10-0644364). 아울러, UCH-L1의 다양한 전사 후 변형, 예를 들면, 리신(lysine) 157에서 모노-유비퀴틴화(Meray, et al, J Biol Chem 282, 10567-10575(2007).), 시스테인(cysteine) 220에서 파르네실화(farnesylation)(Liu, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4635-4640(2009)), 시스테인 220에서 산화(Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264(2004)) 및 시스테인에서 152에서 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2)의 접합(Koharudin, L.M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107, 6835-6840(2010))이 보고된 바 있다. UCH-L1 protein is known to hydrolyze the C-terminal ubiquityl esters of ubiquitin to form monomers (Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11: 141-148, 2000), a mutation of this gene in which the isoleucine amino acid at position 93 has been transformed into a methionine amino acid, which has been reported to be dominant in a family (Leroy et al. Nature 395: 451-452, 1998). However, pathological data related to such mutations have not been reported yet (Republic of Korea Patent Registration 10-0644364). In addition, various post-transcriptional modifications of UCH-L1, eg, mono-ubiquitination at lysine 157 (Meray, et al, J Biol Chem 282, 10567-10575 (2007)), cysteine 220 Farnesylation (Liu, Z. et al., Proc Natl Acad Sci USA 106, 4635-4640 (2009)), oxidation at cysteine 220 (Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256) -13264 (2004)) and conjugation of 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) at 152 in cysteine (Koharudin, LM et al., Proc Natl Acad Sci USA 107, 6835-6840 (2010)) This has been reported.

UCH-L1은 파킨슨 병의 뇌에서 루이 체(Lewy bodies)라고 불리는 단백질 응집체의 구성 성분이며, 이는 UCH-L1 및 파킨슨병 사이에 가능한 연관성을 제시한다(Lowe, J. et al., J Pathol 161, 153-160(1990)). 또한, UCH-L1 변이에 의한 파킨슨병이 보고되었으며, UCH-L1은 유비퀴틴(ubiquitin)과 펩티드(peptide) 사이의 연결을 절단하는 효소로 시험관내에서 유비퀴틴 알데히드(aldehyde)로 이 효소를 억제하였을 때, 도파민성 신경 세포의 사멸과 α-시눌린(α-synulein)로 염색되는 세포질 내 봉입체가 형성된 것이 확인되었다(McNaught KS, et al., J Neurochem 2002;81:301-306). UCH-L1이 특발성 파킨슨병 및 알츠하이머병에서 하향조절되어 있으며, 산화적인 손상과 신경의 유비퀴틴화/디유비퀴틴화 기작 및 산발적인 알츠하이머병 및 파킨슨병 사이의 직접적인 관련성이 제시된 바 있다(Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264(2004)). UCH-L1 is a component of protein aggregates called Lewy bodies in the brain of Parkinson's disease, suggesting a possible link between UCH-L1 and Parkinson's disease (Lowe, J. et al., J Pathol 161). , 153-160 (1990)). In addition, Parkinson's disease caused by UCH-L1 mutation has been reported, and UCH-L1 is an enzyme that cleaves the link between ubiquitin and peptide, when it is inhibited by ubiquitin aldehyde in vitro. , The death of dopaminergic neurons and the formation of intracellular inclusion bodies stained with α-synulein were identified (McNaught KS, et al., J Neurochem 2002; 81: 301-306). UCH-L1 is downregulated in idiopathic Parkinson's disease and Alzheimer's disease, and a direct link between oxidative damage and neuronal ubiquitination / deubiquitination mechanisms and sporadic Alzheimer's and Parkinson's disease has been suggested (Choi, J. et al., J Biol Chem 279, 13256-13264 (2004).

또한, 최근에 UCH-L1는 암 전이 및 변형에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 구체적으로, UCH-L1을 이용한 암전이 진단용 조성물 및 이를 이용한 암전이 진단방법, 암전이 억제용 조성물 및 이를 이용한 암전이 억제방법, 암전이 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법이 개발된바 있다(대한민국 등록특허 10-0732298). 상기 UCH-L1은 암전이의 원인적 표적 단백질로서, 이의 발현 정도에 따라 세포이동도가 증가하므로, 이에 대한 모노클로날 항체, N-말단 펩티드에 대한 항체 또는 기질을 이용하여 암전이 진단에 사용할 수 있다. 또한, UCH-L1의 발현 또는 효소활성을 저해함으로써 암전이를 억제할 수 있으므로, UCH-L1의 억제제를 스크리닝하여 개발함으로써 항암치료의 보조제로서 암전이 억제용 약제로서 유용하게 사용될 수 있음을 개진하였다. In addition, UCH-L1 has recently been found to play a major role in cancer metastasis and transformation. In detail, a composition for diagnosing cancer metastasis using UCH-L1, a method for diagnosing cancer metastasis using the same, a composition for inhibiting cancer metastasis, a method for inhibiting metastasis using the same, a composition for screening cancer metastasis inhibitors, and a screening method using the same have been developed ( Republic of Korea Patent Registration 10-0732298). The UCH-L1 is a causative target protein of cancer metastasis, and its cell mobility increases according to its expression level, so that it can be used for diagnosing cancer metastasis using a monoclonal antibody, an antibody against N-terminal peptide, or a substrate thereof. Can be. In addition, since cancer metastasis can be suppressed by inhibiting the expression or enzymatic activity of UCH-L1, it has been demonstrated that screening and developing an inhibitor of UCH-L1 can be useful as an agent for inhibiting cancer metastasis as an adjuvant of anticancer treatment. .

이와 같이, UCH-L1는 파킨슨병의 병리 표식자인 루이체의 구성 성분이며, UCH-L1의 활성을 억제하였을 때, 도파민성 신경 세포의 사멸이 진행되는 것이 확인된 바 있고, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)의 염기서열이 밝혀진 바 있으나, NT-UCH-L1의 파킨슨병의 염증단계에서 나타나는 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 생체내 기능은 완전히 밝혀지지 않았다. As described above, UCH-L1 is a component of Lewy body, a pathological marker of Parkinson's disease, and when inhibition of UCH-L1 activity was observed, the death of dopaminergic neurons proceeded, and N- of UCH-L1 was confirmed. The nucleotide sequence of N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (NT-UCH-L1), from which the terminal 11 amino acids have been removed, has been found. In vivo function of mitochondrial stress and reactive oxygen species during the inflammatory phase of Parkinson's disease is not fully understood.

따라서, 본 발명자들은 UCH-L1의 N-말단의 일부 아미노산이 제거된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하고, 미토콘드리아 스트레스 및 활성산소종에 대한 효과를 확인하고자 하였으며, 결과적으로, NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors attempted to confirm the characteristics of NT-UCH-L1 from which some amino acids at the N-terminus of UCH-L1 were removed, and to confirm the effects on mitochondrial stress and reactive oxygen species. As a result, NT-UCH- Since L1 is located in the mitochondria, it was confirmed that it plays a major role in the regulation of stress that induces reactive oxygen species and mitochondrial damage, and completed the present invention by confirming that it can be used as an active ingredient for Parkinson's disease prevention and treatment composition. It was.

본 발명의 목적은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is to prevent and treat Parkinson's disease comprising N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1) as an active ingredient It is to provide a pharmaceutical composition.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention comprises N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1) as an active ingredient Provided is a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease.

또한, 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease, which contains a cell containing the vector as an active ingredient.

또한, 본 발명은In addition,

1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;1) measuring the expression level of NT-UCH-L1 protein in a sample derived from the subject as an experimental group;

2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및2) comparing the NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) with the NT-UCH-L1 protein expression level of a sample derived from a normal individual as a control; And

3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.3) Provides a protein detection method for providing information of Parkinson's disease diagnosis comprising the step of determining that the risk of developing Parkinson's disease when the NT-UCH-L1 protein expression level is reduced compared to the control.

또한, 본 발명은 In addition,

1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;1) treating the test compound or composition to a cell line expressing NT-UCH-L1 protein;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및2) measuring the extent of NT-UCH-L1 protein expression in the treated cell line of step 1); And

3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 3) providing a method for screening a candidate drug for treating Parkinson's disease comprising selecting a test compound or composition in which the amount of NT-UCH-L1 protein expression of step 2) is increased compared to a control cell line which has not been treated with the test compound or composition do.

아울러, 본 발명은In addition,

1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;1) treating the test compound or composition to the NT-UCH-L1 protein;

2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및2) measuring the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 1); And

3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
3) Parkinson's disease therapeutic agent comprising the step of selecting the test compound or composition in which the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 2) is increased compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein untreated with the test compound or composition Provided are methods for screening candidates.

UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)이 미토콘드리아에 위치함으로써, 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (NT-UCH-L1) from which the N-terminal 11 amino acids of UCH-L1 has been removed is located in the mitochondria. Since it was confirmed that it plays a major role in the regulation of stress inducing species and mitochondrial damage, it can be used as an active ingredient in the composition for preventing and treating Parkinson's disease.

도 1은 인간 폐암 및 신경아세포종 세포주에서 NT-UCH-L1의 확인 및 이의 UCH-L1와의 구조 및 효소적 차이점을 나타낸 도이다.
도 1a는 기존에 밝혀진 인간 UCH-L1의 변종을 나타낸 도이다.
도 1b는 NCI-HI57 및 SH-SY5Y 유래 UCH-L를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 상기 도 1b의 스팟 1을 MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 상기 도 1b의 스팟 3을 MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 UCH-L1의 결실된 N말단의 대체된 아미노산을 나타낸 도이다.
도 1f는 UCH-L1의 결실된 N말단을 펩티드 서열분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1g는 UCH-L1의 결실된 N말단이 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하는 것을나타낸 도이다.
도 1h는 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 유비퀴틴 가수분해 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1i는 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역침강된 Flag-UCH-L1 및 Flag-NT-UCH-L1의 가수 분해 효소 활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 1j는 세포 이동 분석을 통한 NT-UCH-L1의 암세포 침입 능력이 없음을 나타낸 도이다.
도 1k 및 1l은 UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 수소-중수소 교환 결과를 나타낸 도이다.
도 1m은 HDX연구로 정제된 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1n은 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)를 포함하는 UCH-L1 및 NT-UCH-L1 펩티드의 대표적인 HDX 영역을 나타낸 도이다.
도 2는 NT-UCH-L1의 Lys15 및 Lys157 잔기의 모노유비퀴틴화(Monoubiquitination)을 나타낸 도이다.
도 2a는 pcDNA3.1 UCH-L1-myc 또는 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc인 빈 벡터가 일시적으로 형질도입된(transfected) NCI-H157 세포를 항-myc 항체를 이용하여 면역침강한 도이다.
도 2b는 도 2a의 화살표가 있는 두 밴드를 자르고, 트립신 분해 후에 nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용하여 서열분석한 것을 나타낸 도이다.
도 2c는 pcDNA3.1 UCH-L1-myc 및 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc인 빈 벡터가 일시적으로 형질도입된 NCI-H157 세포를 항-myc 항체로 면역침강하고, 항-myc 및 항-유비퀴틴(ubiquitin) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석한 도이다;
*: 비특이적인 밴드들.
도 2d는 Lys15를 포함하는 NT-UCH-L1 펩티드의 MS 범위를 나타낸 도이다.
도 2e는 다양한 UCH-L1 형태를 포함하는 pcDNA3.1 플라스미드가 일시적으로 형질도입된 HEK293T 세포를 나타낸 도이다.
도 2f는 UCH-L1의 제시된 형태를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포를 항-myc 항체를 이용하여 면역침강하고, SDS-PAGE로 분석하며, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역블랏한 도이다;
*: 비특이적 밴드들.
도 3은 NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화가 NT-UCH-L1의 저장소이며, NT-UCH-L1의 위치 및 기능을 결정하는 것을 분석한 도이다.
도 3a는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1을 발현하는 세포를 항-myc 및 Alexa Fluor 488 2차 항체(녹색)으로 가시화한 것을 나타낸 도이다;
미토콘드리아 및 핵을 Mitotracker®(붉은색) 및 DAPI(파란색)로 각각 염색하였다.
도 3b는 DMSO 또는 10 μM CCCP 처리된 세포를 세포질 및 미토콘드리아 분획물로 분획하고, UCH-L1을 항-myc 항체 이용하여 면역블랏하여, 항-Hsp60을 이용하여 미토콘드리아 마커 단백질인 Hsp60을 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 프로테아좀(proteasome)에서 NT-UCH-L1의 CCCP로 유도된 분해를 나타낸 도이다.
도 3d는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포의 Mitotracker® 염색을 나타낸 도이다.
도 3e는 NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 NCI-H157 세포에 열충격을 주고, 회복한 후 세포를 용해성 및 불용성 분획물로 분리하고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 3f는 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI-H157세포에 열충격을 주고, 사이클로헥시마이드(cycloheximide)가 있거나 없는 조건에서 회복하였을 때 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 NT-UCH-L1의 응집 현상을 나타낸 도이다.
도 4a는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 10 ㎍/ml 사이클로헥시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 10 ㎍/ml 사이클로헥시마이드를 제시된 시간 동안 처리하고 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH4Cl 또는 10 mM 3MA를 16시간 동안 처리하고 항-myc를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4d는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH4Cl 및 10 mM 3MA로 16시간 동안 처리하고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 4e는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO 또는 10 μM MG132를 9 시간 동안 처리하고, 용해성 및 불용성 분획물로 분리한 것을 나타낸 도이다. 시료는 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4f는 UCH-L1, NT-UCH-L1, 및 K15/157R NT-UCH-L1를 안정하게 발현하는 NCI H157 세포에 DMSO 또는 10 μM MG132를 처리하고 용해성 및 불용성 분획물로 분획한 것을 나타낸 도이다.
도 4g는 세포에 16시간 동안 DMSO 또는 10 μM MG132를 처리하고, 고정 및 침투 후에, myc가 붙은 단백질을 항-myc 및 Alexa Flour 488 2차 항체(녹색)로 탐지한 것을 나타낸 도이다;
파란색: DAPI 염색.
도 4h는 SN4741 세포에 pcDNA3.1 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 일시적으로 형질도입하고, 세포를 용해성 및 불용해성 분획물로 분리한 결과를 나타낸 도이다.
도 4i는 다양한 양의 pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc 발현 플라스미드가 일시적으로 형질도입된 SN4741세포를 용해성 및 불용해성 분획물로 분리하고, 환원 및 비환원 젤에서 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4j는 FPLC를 이용하여 분획된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 나타낸다; 분획물을 비환원 및 환원 SDS-PAGE 젤에서 분석하였다. UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 항-UCH-L1 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4k는 세포에 다양한 농도의 H2O2를 1시간 동안 37℃에서 처리하고, 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다;
UCH-L1는 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 4l는 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 HeLa 세포에 10 μM CCCP를, MG132가 있거나 없이, 6시간 동안 처리한 결과를 나타낸 도이다;
세포를 환원 및 비환원 젤을 이용하여 분석하였고, 항-myc 항체를 이용하여 면역블랏하였다.
도 5는 C90/132S NT-UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 비교를 나타낸 도이다.
도 5a는 재조합 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 이의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다.
도 5b는 재조합 NT-UCH-L1의 대표적인 이황화 결합의 영역을 나타낸다.
도 5c는 UCH-L1 3D 구조의 시스테인 잔기를 나타낸 도이다.
도 5d는 재조합 UCH-L1, NT-UCH-L1 및 이의 Cys 변종을 비환원 SDS-PAGE 젤에서 분석한 것을 나타낸다.
도 5e UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 C90/132S NT-UCH-L1-myc을 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 항-myc 항체 및 Alexa Fluor 488 2차 항체(녹색)으로 가시화한 결과를 나타낸 도이다;
붉은색: Mitotracker®;및
파란색: DAPI.
도 5f는 C0 NT-UCH-L1-myc를 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 나타낸다.
도 5g는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc, C90/132S NT-UCH-L1-myc 및 C0 NT-UCH-L1-myc(모든 시스테인이 세린으로 대체된)을 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 10 ㎍/ml CHX으로 제시된 시간 동안 처리하고, 항-myc 항체 및 GAPDH 항체를 이용하여 면역블랏한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키고, 미토콘드리아 손상 시약으로부터 세포를 보호하는 것을 나타낸 도이다.
도 6a는 DMSO 또는 10 μM CCCP가 처리된 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 나타낸 도이다;
세포를 CM-H2DCFDA로 염색하였고, FACS 분석기를 이용하여 세포내 활성산소종 수준을 분석하였다.
도 6b UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 DMSO, 25 μM 또는 50 μM CCCP로 처리하였을 때, 세포 생장을 실시간 세포 분석기를 이용하여 관측한 것을 나타낸 도이다;
값은 평균 ± SD로 나타낸다.
도 6c는 NT-UCH-L1의 기능의 도해를 나타낸다;
NT-UCH-L1는 미토콘드리아에 있는 반면, Ub-NT-UCH-L1는 세포질에 있다. Ub-NT-UCH-L1 및 NT-UCH-L1는 평형 상태에 있다(①). 용해성 NT-UCH-L1가 감소되면, ub-NT-UCH-L1는 디유비퀴틴화(deubiquitinated)된다. 또한, 새로이 합성된 NT-UCH-L1는 손실을 채우고, 충분한 NT-UCH-L1이 사용가능해졌을 때, Ub-NT-UCH-L1이 발생된다. NT-UCH-L1의 양이 상기 포화수준 이상으로 증가할 때나 미토콘드리아가 스트레스를 받았을 때, 우선적으로 Cys90 및 Cys132를 포함하는 분자내 이황화 결합을 통해 응집한다(②). NT-UCH-L1이 불용성이 되면, 용해성 분획물로 돌아가지 않는 것으로 보인다. 미토콘드리아안의 상기 응집체는 프로테아좀에 의해 분해된다(③). NT-UCH-L1는 정상 상태에서 프로테아좀에 의해 분해된다(④).
도 6d는 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 DMSO, 10 nM, 100 nM 또는 1 μM 로테논(rotenone)을 처리하였을 때 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the identification of NT-UCH-L1 and its structural and enzymatic differences with UCH-L1 in human lung cancer and neuroblastoma cell lines.
Figure 1a is a diagram showing a variant of human UCH-L1 previously known.
FIG. 1B is a diagram showing the results of 2D-PAGE and Western blot analysis of NCI-HI57 and SH-SY5Y-derived UCH-L.
FIG. 1C shows mass spectroscopic (MS) of proteomics including spot fingerprinting of spot 1 of FIG. 1B using peptide fingerprinting using MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS. FIG. Figure shows the results analyzed by the method.
FIG. 1D is a diagram illustrating the results of analyzing the spot 3 of FIG. 1B by mass spectrometry of proteomics including peptide fingerprinting using MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS. FIG. to be.
Figure 1E is a diagram showing the substituted N-terminal substituted amino acid of UCH-L1.
Figure 1f is a diagram showing the results of peptide sequencing the deleted N terminal of UCH-L1.
1G is a diagram showing that the deleted N terminus of UCH-L1 corresponds to exon 1 of the UCH-L1 gene (PARK5).
Figure 1h is a diagram showing the results of confirming the ubiquitin hydrolase activity of the purified recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1.
1i is a diagram showing the results of comparing the hydrolase activity of Flag-UCH-L1 and Flag-NT-UCH-L1 immunoprecipitated from lysates of NCI-H157 cells.
Figure 1j is a diagram showing the lack of cancer cell invasion ability of NT-UCH-L1 through cell migration assay.
1K and 1L show the results of hydrogen-deuterium exchange of UCH-L1 and NT-UCH-L1.
Figure 1m is a diagram showing the results of analyzing the UCH-L1, NT-UCH-L1 and C90 / 132S NT-UCH-L1 purified by the HDX study.
FIG. 1N shows a representative HDX region of UCH-L1 and NT-UCH-L1 peptides containing a cysteine active site ( 82 MKQTIGNSCGTIGL 95 ).
2 is a diagram showing monoubiquitination of Lys15 and Lys157 residues of NT-UCH-L1.
2A shows immunoprecipitation of NCI-H157 cells transiently transfected with an empty vector, either pcDNA3.1 UCH-L1-myc or pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc, using an anti-myc antibody. to be.
FIG. 2B is a diagram showing two bands with arrows of FIG. 2A cut and sequenced using nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS after trypsin digestion.
2C shows immunoprecipitation of NCI-H157 cells transiently transduced with empty vectors, pcDNA3.1 UCH-L1-myc and pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc, with anti-myc antibody and anti-myc and anti -Analysis by Western blot using ubiquitin antibody;
*: Nonspecific bands.
2D is a diagram showing the MS range of NT-UCH-L1 peptide including Lys15.
FIG. 2E shows HEK293T cells transiently transduced with pcDNA3.1 plasmid containing various UCH-L1 forms.
FIG. 2F shows that NCI-H157 cells stably expressing the proposed form of UCH-L1 were immunoprecipitated using anti-myc antibodies, analyzed by SDS-PAGE, and immunoblot using anti-myc and anti-ubiquitin antibodies. It is a degree;
*: Nonspecific bands.
3 is a diagram analyzing that monoubiquitination of NT-UCH-L1 is a reservoir of NT-UCH-L1 and determines the location and function of NT-UCH-L1.
3A is a diagram showing visualization of cells expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1 with anti-myc and Alexa Fluor 488 secondary antibody (green) ;
Mitochondria and nuclei were stained with Mitotracker ® ( red) and DAPI (blue), respectively.
Figure 3b is the result of fractionating DMSO or 10 μM CCCP treated cells into cytoplasm and mitochondrial fraction, immunoblot UCH-L1 with anti-myc antibody, immunoblot the mitochondrial marker protein Hsp60 with anti-Hsp60 Is a diagram showing.
Figure 3c is a diagram showing CCCP induced degradation of NT-UCH-L1 in proteasome.
3D shows Mitotracker ® staining of HeLa cells stably expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc.
FIG. 3E shows the results of thermal shock on NCI-H157 cells stably expressing NT-UCH-L1-myc, and after recovery, the cells were separated into soluble and insoluble fractions and immunoblotted using anti-myc antibody. It is also.
Figure 3f is a diagram showing the results when the thermal shock to NCI-H157 cells stably expressing K15 / 157R NT-UCH-L1, and recovered in a condition with or without cycloheximide.
Figure 4 is a diagram showing the aggregation phenomenon of NT-UCH-L1.
FIG. 4A shows that 10 μg / ml cycloheximide was treated in HeLa cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 for a given time and using anti-myc antibody. Shows the results of immunoblotting.
FIG. 4B shows that 10 μg / ml cycloheximide was treated to NCI H157 cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 for a given time, and immunized with an antibody. The figure which showed the blot result.
4C shows DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH 4 Cl or 10 mM 3MA for 16 h in NCI H157 cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1. Figure shows the results of treatment and immunoblotting using anti-myc.
4D is treated for 16 hours with DMSO, 10 μM MG132, 10 mM NH 4 Cl and 10 mM 3MA to HeLa cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1. Fig. 2 shows the results of immunoblotting using anti-myc antibody.
4E shows that HeLa cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 were treated with DMSO or 10 μM MG132 for 9 hours and separated into soluble and insoluble fractions. The figure shown. Samples were immunoblotted using anti-myc antibodies.
4F is a diagram showing that NCI H157 cells stably expressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 were treated with DMSO or 10 μM MG132 and fractionated into soluble and insoluble fractions. .
4G is a diagram showing the cells treated with DMSO or 10 μM MG132 for 16 hours, and after fixation and infiltration, myc-labeled proteins were detected with anti-myc and Alexa Flour 488 secondary antibodies (green);
Blue: DAPI stained.
4H is a diagram showing the results of transient transduction of pcDNA3.1 UCH-L1, NT-UCH-L1, and K15 / 157R NT-UCH-L1 into SN4741 cells, and separation of cells into soluble and insoluble fractions.
FIG. 4i shows SN4741 cells transiently transduced with various amounts of pcDNA3.1 NT-UCH-L1-myc expression plasmids into soluble and insoluble fractions and analyzed on reduced and non-reducing gels.
4j shows recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1 fractionated using FPLC; Fractions were analyzed on non-reducing and reducing SDS-PAGE gels. UCH-L1 and NT-UCH-L1 were immunoblotted using anti-UCH-L1 antibody.
Figure 4k is a diagram showing the results of the cells treated with various concentrations of H 2 O 2 for 1 hour at 37 ℃, using a reducing and non-reducing gel;
UCH-L1 was immunoblotted using anti-myc antibody.
4L shows the results of treatment of HeLa cells expressing K15 / 157R NT-UCH-L1 with 10 μM CCCP for 6 hours with or without MG132;
Cells were analyzed using reducing and non-reducing gels and immunoblotted using anti-myc antibodies.
5 shows a comparison between C90 / 132S NT-UCH-L1 and NT-UCH-L1.
5A shows analysis of recombinant UCH-L1, NT-UCH-L1 and Cys variants thereof on non-reducing SDS-PAGE gels.
5B shows regions of representative disulfide bonds of recombinant NT-UCH-L1.
5C is a diagram showing cysteine residues of the UCH-L1 3D structure.
5D shows analysis of recombinant UCH-L1, NT-UCH-L1 and Cys variants thereof on non-reducing SDS-PAGE gels.
5E Visualization of HeLa cells transiently expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and C90 / 132S NT-UCH-L1-myc with anti-myc antibody and Alexa Fluor 488 secondary antibody (green) Is a diagram showing one result;
Red: Mitotracker ® ; and
Blue: DAPI.
5F is C 0 HeLa cells that transiently express NT-UCH-L1-myc are shown.
5G shows UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc, C90 / 132S NT-UCH-L1-myc and C 0 HeLa cells transiently expressing NT-UCH-L1-myc (all cysteines replaced with serine) were treated for 10 ug / ml CHX for the time indicated and immunoblotted with anti-myc antibody and GAPDH antibody. Is a diagram showing.
Figure 6 shows that NT-UCH-L1 reduces intracellular ROS levels and protects cells from mitochondrial damaging reagents.
6A shows HeLa cells stably expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc treated with DMSO or 10 μM CCCP;
Cells were stained with CM-H 2 DCFDA and analyzed for intracellular reactive oxygen species levels using a FACS analyzer.
6B HeLa cells stably expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc, and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc were treated with DMSO, 25 μM or 50 μM CCCP, resulting in cell growth. Shows the observation using a real-time cell analyzer;
Values are expressed as mean ± SD.
6C shows a diagram of the function of NT-UCH-L1;
NT-UCH-L1 is in the mitochondria, while Ub-NT-UCH-L1 is in the cytoplasm. Ub-NT-UCH-L1 and NT-UCH-L1 are in equilibrium (1). When soluble NT-UCH-L1 is reduced, ub-NT-UCH-L1 is deubiquitinated. In addition, the newly synthesized NT-UCH-L1 fills the loss, and when enough NT-UCH-L1 is available, Ub-NT-UCH-L1 is generated. When the amount of NT-UCH-L1 increases above the saturation level or when the mitochondria are stressed, they preferentially aggregate through intramolecular disulfide bonds containing Cys90 and Cys132 (2). If NT-UCH-L1 is insoluble, it does not appear to return to the soluble fraction. The aggregates in the mitochondria are degraded by the proteasome (③). NT-UCH-L1 is degraded by the proteasome at steady state (④).
6D shows DMSO, 10 nM, 100 nM or 1 μM rotenone on HeLa cells stably expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc. Figure shows the result when processing.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical for preventing and treating Parkinson's disease comprising N-terminal ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1) as an active ingredient. To provide a composition.

또한, 상기 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the NT-UCH-L1 protein, or a pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease, which contains a cell containing the vector as an active ingredient.

상기 NT-UCH-L1 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. The NT-UCH-L1 protein may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

상기 NT-UCH-L1 단백질의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된바 있고(PGP9.5, accession number X04741), 이 중 cDNA 부분은 32번째에서 670번까지이며 이는 본 명세서에서 서열번호 1로 기재된다. The mRNA of the NT-UCH-L1 protein has been registered in the NCBI nucleotide database as protein gene product 9.5 (PGP9.5, accession number X04741), of which the cDNA portion is 32-670. Described herein as SEQ ID NO: 1.

상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. The vector may be linear DNA, plasmid DNA, or recombinant viral vector, but is not limited thereto.

상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. The recombinant virus may be any one selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, lentivirus, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은In addition,

1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;1) measuring the expression level of NT-UCH-L1 protein in a sample derived from the subject as an experimental group;

2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및2) comparing the NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) with the NT-UCH-L1 protein expression level of a sample derived from a normal individual as a control; And

3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.3) Provides a protein detection method for providing information of Parkinson's disease diagnosis comprising the step of determining that the risk of developing Parkinson's disease when the NT-UCH-L1 protein expression level is reduced compared to the control.

상기 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) is Western blotting, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining, immunoprecipitation And immunofluorescence (immunofluorescence) may be detected by any one method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 In addition,

1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;1) treating the test compound or composition to a cell line expressing NT-UCH-L1 protein;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및2) measuring the extent of NT-UCH-L1 protein expression in the treated cell line of step 1); And

3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 3) providing a method for screening a candidate drug for treating Parkinson's disease comprising selecting a test compound or composition in which the amount of NT-UCH-L1 protein expression of step 2) is increased compared to a control cell line which has not been treated with the test compound or composition do.

아울러, 본 발명은In addition,

1) 피검 화합물 또는 조성물을 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;1) treating the test compound or composition to the NT-UCH-L1 protein;

2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및2) measuring the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 1); And

3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
3) Parkinson's disease therapeutic agent comprising the step of selecting the test compound or composition in which the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 2) is increased compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein untreated with the test compound or composition Provided are methods for screening candidates.

본 발명의 구체적인 실시예에서, NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였을 때, 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟(spot)이 확인되었으며, 스팟 1 및 3(도 1b 왼쪽 위 패널 참조)을 잘랐고, MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 이들을 분석하였다. 스팟 1이 스팟 3(도 1d)에서 제시되는 펩티드 1MQLKPMEINPEMLNK15(1815.9144 Da)(도 1c 참조)가 부족하였으나, 펩티드 서열분석으로 입증함으로써(도 1f 참조) 새로운 펩티드 12MLNK15(505.2905 Da)(도 1e 참조)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면, 스팟 1은 NT-UCH-L1이었다(N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1). 또한, 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다(도 1b 오른쪽 패널 참조). 결실된 부위는 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하였다(도 1g 참조). 상기 결실된 11 개 아미노산의 mRNA는 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된바 있다(PGP9.5, accession number X04741). In a specific embodiment of the present invention, when performing 2D-PAGE and Western blot analysis of NCI-H157 human lung cancer cell line-derived UCH-L1, several UCH-L1 spots were identified, spots 1 and 3 (See FIG. 1b upper left panel), mass spectroscopic analysis of proteomics including peptide fingerprinting using MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS , MS) method. Spot 1 lacked Peptide 1 MQLKPMEINPEMLNK 15 (1815.9144 Da) (see FIG. 1C) as shown in Spot 3 (FIG. 1D), but new peptide 12 MLNK 15 (505.2905 Da) (as demonstrated by FIG. 1F) (see FIG. 1F) ( 1e). Spot 3 was UCH-L1 full length, while Spot 1 was NT-UCH-L1 (UCH-L1 lacking 11 N-terminal amino acids). In addition, the presence of NT-UCH-L1 was detected in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y (see FIG. 1B right panel). The deleted region corresponded to exon 1 of the UCH-L1 gene (PARK5) (see FIG. 1G). The deleted 11 amino acid mRNA has been registered in the NCBI nucleotide database as protein gene product 9.5 (PGP9.5, accession number X04741).

또한, UCH-L1의 유비퀴틴(ubiquitin) 가수분해 효소 활성 능력 및 암세포 침입을 증가시키는 능력을 NT-UCH-L1이 가지는지 확인하였을 때, NT-UCH-L1은 불활성화였고(도 1h), 암세포 침입 증가 능력을 가지지 않음을 확인하였다(도 1j 참조).In addition, when confirming that NT-UCH-L1 had the ability of ubiquitin hydrolase activity of UCH-L1 and the ability to increase cancer cell invasion, NT-UCH-L1 was inactivated (FIG. 1H). It was confirmed that it did not have the ability to increase invasion (see FIG. 1J).

UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비교하고자, 수소-중수소 교환을 이용하였을 때, 수소-중수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나, 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다(도 1k 및 1l 참조). 이것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였을때(도 1m 참조), UCH-L1보다 NT-UCH-L1의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어난 것을 확인하였다. NT-UCH-L1의 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다(도 1n 참조). To compare the tertiary structures of UCH-L1 and NT-UCH-L1, when hydrogen-deuterium exchange was used, hydrogen-deuterium exchange gradually occurred up to 16 hours in UCH-L1, whereas in NT-UCH-L1 This was completed in almost two minutes (see FIGS. 1K and 1L). This indicates that NT-UCH-L1 has a looser structure than UCH-L1. When the loose sites were confirmed by HDX analysis in peptides digested with pepsin (see FIG. 1M), it was confirmed that more deuterium exchange occurred at the N- and C-terminus of NT-UCH-L1 than UCH-L1. Peptides containing the cysteine active site of NT-UCH-L1 ( 82 MKQTIGNSCGTIGL 95 ) had less deuterium exchange than UCH-L1 (see FIG. 1N).

NT-UCH-L1의 Lys15 또는 Lys157에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자, 면역침강을 수행하였다. 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를, 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다(도 2a 화살표 참조). 이것을 면역침강으로 확인하였다(도 2c 오른쪽 패널 화살표 참조). NT-UCH-L1(도 2a 화살표 참조)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다(도 2b 참조). NT-UCH-L1-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다(도 2c 왼쪽 패널, 세 번째 레인 참조). 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NT-UCH-L1(Ub-NT-UCH-L1)로 확인한(도 2c 오른쪽 패널 참조) 반면, 탐지된 상기 희미한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1(도 2c 왼쪽 패널, 두 번째 레인 참조)이었다. To confirm monoubiquitination in Lys15 or Lys157 of NT-UCH-L1, immunoprecipitation was performed. The band precipitated together with the UCH-L1 was identified as about 7 kDa, ubiquitin (see arrow 2a). This was confirmed by immunoprecipitation (see arrow in FIG. 2C right panel). The two bands that settled together with NT-UCH-L1 (see FIG. 2A arrow) were identified as a mixture of UCH-L1 and ubiquitin (see FIG. 2B). Since the molecular mass difference between NT-UCH-L1-myc and the two bands is close to that of ubiquitin, western blot of immune complexes with anti-myc and anti-ubiquitin antibodies was performed. NT-UCH-L1 showed two distinct bands (FIG. 2C left panel, see lane 3). The above band was identified as monoubiquitinated NT-UCH-L1 (Ub-NT-UCH-L1) (see FIG. 2C right panel), while the faint band detected was monoubiquitinated UCH-L1 (FIG. 2C). Left panel, see second lane).

또한, 모노유비퀴틴화된 리신(lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여, 펩티드 서열분석 및 돌연변이 연구를 병행하였다. 면역침강된 Ub-NT-UCH-L1는 tandem MS로 펩티드 서열분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때, 114.04 Da의 증가(유비퀴틴의 C-말단 Gly-Gly)가 있다. NT-UCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며, Lys15에서 후보 유비퀴틴화(ubiquitination) 부위를 설정하였다(도 2d 참조). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, K15/157R 및 K60/157R를 구축하였고, 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석(도 2e 참조) 및 면역침강(도 2f 참조)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-L1의 두 개의 개체군이 있으며, 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고, 다른 하나는 K157에 되지만 둘 다는 아닌 것을 제시한다. In addition, peptide sequencing and mutation studies were combined to identify monoubiquitinated lysine (lysine) residues. Immunoprecipitated Ub-NT-UCH-L1 was analyzed by peptide sequencing with tandem MS. When lysine residues attach to ubiquitin, there is an increase of 114.04 Da (C-terminal Gly-Gly of ubiquitin). Modified peptides of NT-UCH-L1 were identified and candidate ubiquitination sites were set in Lys15 (see FIG. 2D). Three variants of NT-UCH-L1, K157R, K15 / 157R and K60 / 157R, were constructed and monoubiquitination in these variants was confirmed by Western blot analysis (see FIG. 2E) and immunoprecipitation (see FIG. 2F). Monoubiquitination of NT-UCH-L1 is significantly lost in cells overexpressing K157R NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 variants. These results suggest that there are two populations of Ub-NT-UCH-L1, one monoubiquitinated at K15 and the other at K157 but not both.

미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은, 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것, 또는 미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에, 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. HeLa 세포에서, UCH-L1-myc은 세포질에 주로 분포하였으나, NT-UCH-L1-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포하였으며, K15/157R NT-UCH-L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다(도 3a 참조). 이러한 분포를 HeLa 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아 분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다(도 3b 참조).The link between mitochondria and Parkinson's disease has already been demonstrated, for example, by the discovery that common features of autopsied Parkinson's disease brain tissue are due to mitochondrial dysfunction or that genetic products are associated with Parkinson's disease in mitochondria. Therefore, we analyzed the relative distribution of UCH-L1 and NT-UCH-L1 in the cytoplasm versus mitochondria. In HeLa cells, UCH-L1-myc was distributed mainly in the cytoplasm, while NT-UCH-L1-myc was distributed in both the cytoplasm and mitochondria, and K15 / 157R NT-UCH-L1 was distributed only in the mitochondria (FIG. 3A). Reference). This distribution was confirmed by Western blot studies of HeLa cell derived cytoplasm and mitochondrial fractions (see FIG. 3B).

NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 그 결과, 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R NT-UCH-L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 3d 참조).We investigated whether mitochondrial distribution of NT-UCH-L1 is related to mitochondrial damage. As a result, it was confirmed that the expression of NT-UCH-L1 or K15 / 157R NT-UCH-L1 in living cells did not affect the mitochondrial structure (see FIG. 3D).

Ub-NT-UCH-L1의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 열 충격을 수행하였고, 37℃에서 회복하였을 때, 열 충격 회복 동안에 사라지는 불용성 NT-UCH-L1을 유도하였다(도 3e 참조). 단백질 합성 저해제 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에, 상기 불용성 NT-UCH-L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다(도 3f 참조). 용해성 NT-UCH-L1이 감소할 때에, Ub-NT-UCH-L1이 이를 보충한다. NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고, 그 후에 Ub-NT-UCH-L1은 NT-UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서, Ub-NT-UCH-L1이 NT-UCH-L1가 감소될 때, NT-UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다. To explain the function of Ub-NT-UCH-L1, heat shock was performed on HeLa cells stably expressing NT-UCH-L1-myc, and insoluble NT- disappeared during heat shock recovery when recovered at 37 ° C. UCH-L1 was induced (see FIG. 3E). Since the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX) inhibits the restoration of soluble K15 / 157 NT-UCH-L1, the insoluble NT-UCH-L1 does not appear to dissolve again. Soluble NT-UCH-L1 disappeared immediately after heat shock (see FIG. 3F). When soluble NT-UCH-L1 decreases, Ub-NT-UCH-L1 compensates for it. NT-UCH-L1 recovered to normal levels in soluble fraction by 8 h recovery, after which Ub-NT-UCH-L1 was made from NT-UCH-L1. Thus, Ub-NT-UCH-L1 appears to serve as a reservoir of NT-UCH-L1 that supplies NT-UCH-L1 when NT-UCH-L1 is reduced.

NT-UCH-L1를 일시적으로 발현하거나, 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서 NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다. NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽게 분해되는지 확인하였다. CHX로 단백질 합성을 저해한 후에, UCH-L1 유전자의 메틸레이션(methylation)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc의 분해 속도를 비교하였다.그 결과, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다(도 4a 참조). 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH-L1-myc은 Ub-NT-UCH-L1보다 더 쉽게 사라졌다. NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자, MG132(프로테아좀 분해(proteasomal degradation)의 저해제), NH4Cl(리소좀 분해(lysosomal degradation)의 저해제) 및 3-메틸아데닌(3-methyladenine)(3MA, 자식작용의(autophagy)의 저해제)를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다. MG132 처리만이 NCI-H157(도 4c 참조) 뿐만 아니라 HeLa 세포(도 4d 참조)에서 NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다. 따라서, 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 것을 확인하였다. In both cells transiently or stably expressing NT-UCH-L1, the level of NT-UCH-L1 is less than that of UCH-L1. It was confirmed that NT-UCH-L1 is more easily degraded than UCH-L1. After inhibition of protein synthesis with CHX, UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / in HeLa cells whose expression of UCH-L1 was naturally inhibited by methylation of the UCH-L1 gene. The degradation rates of 157R NT-UCH-L1-myc were compared. As a result, it was confirmed that NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc degraded faster than UCH-L1 (FIG. 4A). Reference). Unubiquitinated K15 / 157R NT-UCH-L1-myc disappeared more easily than Ub-NT-UCH-L1. To understand how NT-UCH-L1 degrades, MG132 (inhibitor of proteasomal degradation), NH4Cl (inhibitor of lysosomal degradation) and 3-methyladenine (3MA, NT-UCH-L1 was quantified after treatment with cells of inhibitors of autophagy). Only MG132 treatment was found to cause accumulation of NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant in HeLa cells (see FIG. 4D) as well as NCI-H157 (see FIG. 4C). Thus, it was confirmed that NT-UCH-L1 is degraded by the ubiquitin-proteasome system at steady state.

NT-UCH-L1 응집 정도를 확인하기 위해, 세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Ardley, H.C. et al ., Mol Biol Cell 14, 4541-4556(2003)). 그 결과, MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때, NT-UCH-L1 및 그것의 K15/157R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고, 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다(도 4e 참조). MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-L1은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다(도 4e 중간 패널 참조). 이것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화-결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다(도 4e 아래 패널 참조). 또한, 이것은 NCI-H157 세포에서 보였다(도 4f 참조). 또한, 공초점 현미경을 이용하여 Hela 세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1의 응집은 MG132 처리 후에 증가하였다(도 4g 참조). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 응집되고, UCH-L1보다 프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가 응집을 저해하는 것을 나타낸다. To confirm the extent of NT-UCH-L1 aggregation, preparation of water-soluble and insoluble fractions of cell lysates was prepared as previously described (Ardley, HC meat al ., Mol Biol Cell 14 , 4541-4556 (2003). As a result, when characterizing NT-UCH-L1 accumulated in cells after MG132 treatment, NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variants readily accumulated in insoluble fractions and negligible levels of UCH-L1 Accumulated in the insoluble fraction (see FIG. 4E). After MG132 treatment, but not Ub-NT-UCH-L1, NT-UCH-L1 appeared in the insoluble fraction (see middle panel of FIG. 4E). This was more evident with the K15 / 157R NT-UCH-L1, a monoubiquitination-deficient strain that mostly accumulates in the insoluble fraction (see panel below FIG. 4E). This was also seen in NCI-H157 cells (see FIG. 4F). In addition, when examining insoluble fractions in Hela cells using confocal microscopy, aggregation of NT-UCH-L1, but not UCH-L1, increased after MG132 treatment (see FIG. 4G). These experiments show that NT-UCH-L1 aggregates more easily, degrades faster in proteasomes than UCH-L1, and the monoubiquitinated form of NT-UCH-L1 inhibits aggregation.

신경세포에서 NT-UCH-L1의 응집 현상을 설명하기 위해서, MG132없이, UCH-L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면, 일시적으로 발현하는 NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1의 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다(도 4h 참조). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다(도 4i 참조). 이것은 불용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고, 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아울러, 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 응집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-L1(S-S NT)을 포함하였다(도 4i 참조).To explain the aggregation of NT-UCH-L1 in neurons, without MG132, most of UCH-L1 is present in the soluble fraction, while transiently expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 More than 20% of the dopamine neuronal progenitor cell line SN4741 was present in the insoluble fraction (see FIG. 4H). Insoluble fractions thereof increased with increasing expression of NT-UCH-L1 (see FIG. 4I). This may be the limit for the level of insoluble NT-UCH-L1, indicating that below this limit NT-UCH-L1 maintains solubility in cells. In addition, insoluble fractions of NT-UCH-L1 were analyzed under conditions without reduction to determine if insoluble aggregation of NT-UCH-L1 occurred from covalent or non-covalent disulfide formation. The insoluble NT-UCH-L1 fraction contained disulfide crosslinked high molecular mass NT-UCH-L1 (S-S NT) which became a monomer under reducing conditions (see FIG. 4I).

다양한 UCH-L1-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드(plasmid)를 BL21(DE3)에 형질전환하였고, 생장시킨 후 상기 재조합 단백질을 Superdex 200, HR 10/30(GE Healthcare)에서 분리하였고, 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 그 결과, FPLC에서, NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면, 재조합 UCH-L1은 주로 단량체(약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다(도 4j 참조). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 응집체를 나타낸다. PET 17b plasmids containing various UCH-L1-6His forms were transformed into BL21 (DE3), and after growth, the recombinant protein was isolated from Superdex 200, HR 10/30 (GE Healthcare), and the fractions Were analyzed on SDS-PAGE with reduction and no reduction. As a result, in FPLC, NT-UCH-L1 eluted with a multimer greater than 66 kDa, whereas recombinant UCH-L1 eluted mainly as a monomer (about 30 kDa). It did not decompose into monomers under non-reducing conditions (see FIG. 4j). This represents NT-UCH-L1 form insoluble aggregates with intramolecular disulfide bonds sharing electron pairs.

세포가 스트레스를 받을 때, NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 시험하기 위해, HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)를 1 시간 동안 처리하였고, 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다(도 4k 참조). UCH-L1은 응집체를 형성하지 않았으나, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 H2O2 를 0.5 mM 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다. 또한, 이러한 응집이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 야기되는 것을 확인하였다. CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3b 및 도 3c 참조). NT-UCH-L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고, 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였을 때, CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다(도 4l 아래 패널 레인4 참조). 종합하면, 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다. When cells are stressed, it is assumed that NT-UCH-L1 will aggregate through intramolecular disulfide bonds. To test this hypothesis, HeLa cells were treated with varying concentrations of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) for 1 hour and separated by SDS-PAGE under both reducing and non-reducing conditions (see FIG. 4K). UCH-L1 did not form aggregates, but NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant formed disulfide-linked multimers in cells treated with at least 0.5 mM H 2 O 2 . It was also confirmed that this aggregation was caused by a response to mitochondrial stress such as CCCP treatment. CCCP induced degradation of NT-UCH-L1 in proteasomes (see FIGS. 3B and 3C). HeLa cells expressing NT-UCH-L1 were treated with CCCP and MG132, and when analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions, the loss of CCCP-induced NT-UCH-L1 was inhibited by the treatment of MG132 (FIG. 4L). See panel lane 4 below). Taken together, both oxidative and mitochondrial stress were found to induce disulfide crosslinking in NT-UCH-L1.

Cys90 및 Cys132에서 Ser으로 돌연변이가 NT-UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고, NT-UCH-L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를 포함하는 6개 시스테인(cysteine) 잔기를 가지며, 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다(도 5a 레인1 참조). 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 병행하여 적용하여, NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나, Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다(표 1 및 도 5b 참조). Cys132는 이를 포함하는 모든 5 개의 시스테인과 이황화 결합을 형성하였다(도 5c 참조). Cys132 및 Cys152은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기이다. NT-UCH-L1(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며, 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 응집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다(도 5a). 돌연변이 C90S는 적은 폴리머(polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다(도 5a 화살표 참조). 이러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다(도 5d 참조). It was intended to confirm that mutations from Cys90 and Cys132 to Ser increase the solubility of NT-UCH-L1, which has 6 cysteine residues containing Cys 90 at its active site and is non-reducing. It was confirmed that multimers were formed under the conditions (see FIG. 5A lane 1). The algorithm for finding disulfide sites, DBond and nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS, was applied in parallel to confirm disulfide bond formation in NT-UCH-L1. While many disulfides containing peptides were detected, it was confirmed that the trypsin peptide containing Cys47 was too long for MS analysis (see Table 1 and FIG. 5B). Cys132 formed a disulfide bond with all five cysteines including it (see FIG. 5C). Cys132 and Cys152 are two surface cysteine residues in UCH-L1. Six variants of NT-UCH-L1 (Cys replaced by Ser) were made and an attempt was made to find cysteine residues important for NT-UCH-L1 aggregation in the recombinant variant protein (FIG. 5A). Mutant C90S showed less polymer and more monomers of about 25 kDa size (see arrow of FIG. 5A). This indicates that C90 and C132 are responsible for disulfide crosslinking in NT-UCH-L1 (see FIG. 5D).

NT-UCH-L1 C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다. 일시적으로 NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역염색하였고, 공초점 현미경으로 가시화하였다(도 5e 참조). 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때, UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며, NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cys132이 미토콘드리아 분포에 중요한 것인지를 확인하고자, 모든 6 개 시스테인(cysteines)이 세린(serines)으로 돌연변이 되어 있는 변종(C0 NT-UCH-L1)의 분포를 조사하였고, 응집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다(도 5f 참조). 상기 C90/132S NT-UCH-L1의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다(도 1m 참조). 이것은 NT-UCH-L1의 전체적인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인(cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다. 그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고, 그들의 반감기를 측정하였다. 도 5g와 같이, NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며, 이는 C90/132S NT-UCH-L1의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다. We attempted to determine the location and stability of the NT-UCH-L1 C90 / 132S strain. HeLa cells transiently expressing NT-UCH-L1-myc or its C90 / 132S variant were immunostained and visualized by confocal microscopy (see FIG. 5E). When confirming the results shown in Figure 3a, UCH-L1 was mainly distributed in the cytoplasm, NT-UCH-L1 was distributed in the mitochondria and cytoplasm. The C90 / 132S NT-UCH-L1 strain was distributed in the cytoplasm and not in the mitochondria. To determine if Cys90 and Cys132 are important for the mitochondrial distribution, we examined the distribution of the strain (C 0 NT-UCH-L1), in which all six cysteines were mutated to serines, and C, forming aggregates 0 NT-UCH-L1 was confirmed to be distributed in both mitochondria and cytoplasm (see FIG. 5F). The tertiary structure of the C90 / 132S NT-UCH-L1 is looser than UCH-L1 and less than NT-UCH-L1 (see FIG. 1M). This suggests that the overall tertiary structure of NT-UCH-L1 and unspecified cysteine residues govern the mitochondrial distribution. We then investigated whether intramolecular disulfide bonds affect the half-life of NT-UCH-L1. HeLa cells expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc or C90 / 132S variants thereof transiently were treated with CHX and their half-life was measured. As shown in FIG. 5G, NT-UCH-L1 disappeared within 6 hours, but C90 / 132S NT-UCH-L1 remained up to 24 hours, which had a half-life of C90 / 132S NT-UCH-L1 compared to that of UCH-L1. Suggest something similar.

NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이것이 산화환원반응에 민감한 단백질인 것을 제시한다. 세포내 ROS의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH-L1의 분포는 ROS의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한 잠재력있는 역할을 제시한다. NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준에 영향을 주는지 확인한 결과, NT-UCH-L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH-L1 발현에 비해, 세포내 ROS 수준을 감소시켰다(도 6a 위의 패널 참조). NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock 또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 ROS 수준을 보였으며, 이는 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키는 것을 제시한다.The formation of intramolecular disulfide bonds in NT-UCH-L1 suggests that this is a protein sensitive to redox reactions. The distribution of NT-UCH-L1 in mitochondria, a major source of intracellular ROS, suggests a potential role for NT-UCH-L1 in the usefulness of ROS. Confirming that NT-UCH-L1 affects intracellular ROS levels, the expression of NT-UCH-L1 and K15 / 1157R NT-UCH-L1 decreased intracellular ROS levels compared to control mock and UCH-L1 expression. (See panel above FIG. 6A). Cells expressing NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant showed lower ROS levels than cells expressing mock or UCH-L1, suggesting that NT-UCH-L1 reduces intracellular ROS levels. do.

CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여, 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때, NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포 사멸을 벗어났으므로, NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제시한다(도 6b 참조). 다른 미토콘드리아 손상 시약(복합체 저해제)인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다(도 6d 참조). CCCP is known to induce mitochondrial damage and cell death, leading to phenomena associated with the onset of Parkinson's disease. When cell damage was induced by CCCP, and when the cytoprotective effect of NT-UCH-L1 was confirmed, cells expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 but not UCH-L1 were identified as CCCP. Beyond induced cell death, NT-UCH-L1 suggests protecting the cells from CCCP induced damage (see FIG. 6B). The resistance of NT-UCH-L1 to cell death induced by rotenone, another mitochondrial damaging reagent (complex inhibitor), was less than that of CCCP (see FIG. 6D).

따라서, UCH-L1의 N-말단의 11개 아미노산이 제거된 NT-UCH-L1가 미토콘드리아에 위치하면서 세포 내 활성산소종 및 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로, 이를 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
Therefore, it was confirmed that NT-UCH-L1 from which the N-terminal 11 amino acids of UCH-L1 was removed plays a major role in the regulation of stress that induces intracellular reactive oxygen species and mitochondrial damage while being located in the mitochondria. It can be used as an active ingredient of a composition for preventing and treating Parkinson's disease.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention in detail, and the present invention is not limited to the examples.

<< 실시예Example 1> N-말단이 제거된  1> N-terminal removed UCHUCH -- L1L1 의 확인 Confirmation of

<1-1> 세포 배양<1-1> Cell culture

인간 NCI-H157(폐암세포주), SH-SY5Y(인간 유래 신경아세포종 세포주) 및 HeLa 세포를 각각 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 페니실린 G(penicillin G)가 있는 RPMI 1640, dulbecco's modified eagle medium 및 minimum essential medium에서 유지하였다. 세포배양에 쓰인 배지 및 성분은 Invitrogen에서 구입하였다.
Human NCI-H157 (lung cancer cell line), SH-SY5Y (human-derived neuroblastoma cell line) and HeLa cells were 10% fetal bovine serum (FBS), streptomycin and penicillin G, respectively. In RPMI 1640, dulbecco's modified eagle medium and minimum essential medium. Media and components used for cell culture were purchased from Invitrogen.

<1-2> 항체<1-2> antibody

유비퀴틴(ubiquitin) C-말단 가수분해 효소(Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, UCH-L1) 및 myc tag의 N-말단 펩티드에 대한 폴리클로날(Polyclonal) 항체를 AbFrontier, Inc.(한국)에서 제작하였고, 특징화하였다. 다른 항체의 재료는 하기와 같다: 모노클로날 항-myc 항체(Millipore), 폴리클로날 항-UCH-L1 항체(Chemicon), 항-유비퀴틴(ubiquitin) 항체(Chemicon), flag-항체(M2)(Sigma), 항-튜뷸린 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.), 염소 항-마우스 항체(Molecular Probes).
Polyclonal antibodies to ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 and UCH-L1 and N-terminal peptides of myc tag were produced by AbFrontier, Inc. (Korea) And characterized. Materials for other antibodies are as follows: monoclonal anti-myc antibody (Millipore), polyclonal anti-UCH-L1 antibody (Chemicon), anti-ubiquitin antibody (Chemicon), flag-antibody (M2) (Sigma), anti-tubulin antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.), goat anti-mouse antibody (Molecular Probes).

<1-3> 2D 젤 전기영동(2D <1-3> 2D gel electrophoresis (2D gelcome electrophoresis전공기 ))

기존에 기재된 바와 같이 2D 젤 전기영동을 수행하였다(Jeong, J. et al . Mol Cell Proteomics 10,(2011)). 요약하면, 세포를 9.5 M 요소(urea), 2% TritonX-100, 5% β머캅토에탄올(βmercaptoethanol), 1.6% 파말라이트5-7(pharmalyte 5-7), 0.4% 파말라이트 3-10(pharmalyte 3-10), 50 mM DTT, 단백질 분해 효소 저해제 혼합제(protease inhibitor cocktail) 및 5 mM Na3VO4 이 포함된 완충액에 용해하였다. 단백질을 Immobline Drystrip 4-7 linear gels(GE Healthcare)에서 일렉트로포커스(electrofocuse)하였다. 평형 후에(50 mM tris(pH 8.8), 6 M 요소(urea) 2% SDS, 30% 글리세롤(glycerol), 스트립을 11% 2차원 SDS-PAGE 평판 젤에 두었고, 단백질을 분석하였다.
2D gel electrophoresis was performed as described previously (Jeong, J. meat al . Mol cell Proteomics 10, (2011). In summary, cells were treated with 9.5 M urea, 2% TritonX-100, 5% βmercaptoethanol, 1.6% Pharmalite 5-7, 0.4% Pharmalite 3-10 ( pharmalyte 3-10), 50 mM DTT, protease inhibitor cocktail and 5 mM Na 3 VO 4 It was dissolved in this contained buffer. Proteins were electrofocused on Immobline Drystrip 4-7 linear gels (GE Healthcare). After equilibration (50 mM tris pH 8.8), 6 M urea 2% SDS, 30% glycerol, strips were placed on 11% two-dimensional SDS-PAGE plate gels and the proteins analyzed.

<1-4> 질량 분광분석(<1-4> mass spectrometry MassMass spectrometryspectrometry , , MSMS ))

기존에 밝혀진 UCH-L1의 몇개의 변종(Strausberg, R.L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16899-16903(2002)(도 1a)외에 다른 변종이 있는지 확인하고자, 상기 실시예 <1-3>에서 준비한 단백질 젤 스팟(spot)을 분리하였고, 이를 트립신(trypsin)으로 소화시켰으며, 상기 결과 펩티드를 Jeong, J. et al ., Mol Cell Proteomics 10, M110 000513(2011), Seo, J. et al . J Proteome Res 7, 587-602(2008), 및 Lee, E. et al., PLoS one 4, e7949(2009)에 기재한 바와 같이 분석하였다. 소화된 펩티드를 nanoacquity UPLCTMESI/MS(SYNAPTTM HDMSTM Waters)로 분석하였다. 통합된 electrospray ionization PicoTipTM(± 10 μm, New Objective)가 있는 C18 reversed-phase 75 μm ID × 150 mm analytical column(1.7 μm particle size, BEH130 C18, Waters)를 이용하여 펩티드를 분리하였다. 7 ㎕ 펩티드(peptide) 혼합물을 완충액 A(물/포름산(formic acid); 100:0.1, v/v)에 용해하였고, 컬럼(column)에 주입하였으며, 5-80 % 완충액 B(아세토니트릴(acetonitril)/포름산; 100:0.1, v/v)의 선형 경사도로 120분 이상 용출하였다. 시료를 trap column cartridge(ID 180 μm × 20 mm, Symmetry® C18, Waters)로 분리 전에 탈염하였다. 초기에, 상기 흐름 속도는 300 nl/분으로 설정하였고, 상기 모세관 전압(capillary voltage)(2.5 keV)를 분사 전에 LC 이동상으로 적용하였다. 크로마토그래피(Chromatography)를 MS에 일렬로 수행하였다. 효율적인 데이터 의존적인 수득을 위한 MS 한도(parameter)는 질량분광분석부터 MS/MS까지로 전환되는 10개 및 3 개 요소 이상의 강도였다. 상기 개별적인 MS/MS 범위를 Micromass ProteinLynx Global Server(PLGSTM) 2.1 data processing 소프트웨어 및 단독 MASCOT-searchable 정점 목록(peak list)(.pkl) 파일과 같은 결과로 단독 LC 운용을 조합하고, 매끄럽게 하였고, 디아이소토프(deisotoped)하였고, 센트로이드(centroided)하여 각 전구체로부터 수득하였다. 상기 정점 목록 파일을 MASCOT(global search engine)를 사용하여, SwissProt database에 의문을 제기하는데 하기 변수와 함께 사용하였다: 펩티드 질량 관용, 0.2 Da; MS/MS 이온 질량 관용, 0.2 Da; 1까지 손실된 트립신 분해 부위 허용; 아세틸레이션(acetylation), 디아미데이션(deamidation), 피로-글루(pyro-glu)(N-term E, Q), 산화(oxidation), 포르밀화(formylation), 인산화(phosphorylation), 카바미도메틸(carbamidomethyl) 및 시스테인 프로피온아미드(cysteine propionamide)와 같은 다양한 수식을 고려하였지만, 수식을 고정하지 않았고; 효소를 트립신으로 한정하지 않았으며; 분류학(toxonomy)을 마우스로 한정하지 않았다. 모든 보고된 과제는 MASCOT로부터 범위의 자동적 및 수동적 해석으로 확인하였다. In order to check if there are other variants of UCH-L1 (Strausberg, RL et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 16899-16903 (2002) (FIG. 1A), which have been previously known, Protein gel spots prepared in &gt; were isolated and digested with trypsin, and the resulting peptides were prepared in Jeong, J. meat al ., Mol Cell Proteomics 10 , M 110 000513 (2011), Seo, J. meat al . J Proteome Res 7 , 587-602 (2008), and Lee, E. et al., PLoS As described in one 4 , e7949 (2009). Digested peptides were nanoacquity UPLC TM ESI / MS (SYNAPT TM) HDMS TM Waters). Peptides were separated using C18 reversed-phase 75 μm ID × 150 mm analytical column (1.7 μm particle size, BEH130 C18, Waters) with integrated electrospray ionization PicoTip ™ (± 10 μm, New Objective). 7 μl peptide mixture was dissolved in Buffer A (water / formic acid; 100: 0.1, v / v), injected into the column, 5-80% Buffer B (acetonitril ) / Formic acid; 100: 0.1, v / v) eluted for at least 120 minutes. Samples were desalted prior to separation to trap column cartridge (ID 180 μm × 20 mm, Symmetry ® C18, Waters). Initially, the flow rate was set to 300 nl / min and the capillary voltage (2.5 keV) was applied to the LC mobile phase before spraying. Chromatography was performed inline with MS. MS parameters for efficient data dependent acquisition were intensities of 10 and 3 elements or more, ranging from mass spectrometry to MS / MS. The individual MS / MS ranges were combined, smoothed, and deisotope as a result of Micromass ProteinLynx Global Server (PLGSTM) 2.1 data processing software and standalone MASCOT-searchable peak list (.pkl) files. deisotoped and centroided to obtain from each precursor. The vertex listing file was used with the following variables to question the SwissProt database using a global search engine (MASCOT): peptide mass tolerance, 0.2 Da; MS / MS ion mass tolerance, 0.2 Da; Allow up to 1 trypsin digestion site; Acetylation, deamidation, pyro-glu (N-term E, Q), oxidation, formylation, phosphorylation, carbamidomethyl ( various formulas were considered, such as carbamidomethyl) and cysteine propionamide, but the formulas were not fixed; The enzyme was not limited to trypsin; Toxonomy was not limited to mice. All reported challenges were confirmed by automatic and manual interpretation of the range from MASCOT.

그 결과, NCI-H157 인간 폐암세포주 유래 UCH-L1를 2D-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였을 때, 몇몇의 UCH-L1에 관한 스팟(spot)이 확인되었다. 상기 대응하는 은이 염색된 2D 젤(도 1b 왼쪽 중간 패널)로부터 스팟 1 및 3을(도 1b 왼쪽 위 패널) 잘랐고, MALDI-TOF MS를 이용한 펩티드 핑거프린팅(fingerprinting) 및 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용한 펩티드 서열분석을 포함하는 단백질체학의 질량 분광분석(mass spectroscopic, MS) 방법으로 이들을 분석하였다. 스팟 1이 스팟 3(도 1d)에서 제시되는 펩티드 1MQLKPMEINPEMLNK15(1815.9144 Da)(도 1c)가 부족하였으나, 펩티드 서열분석으로 입증함으로써(도 1f) 새로운 펩티드 12MLNK15(505.2905 Da)(도 1e)로 대체된 것을 확인하였다. 스팟 3은 UCH-L1 전장인 반면, 스팟 1은 NT-UCH-L1이었다(N-말단 아미노산이 11개 부족한 UCH-L1). 제거된 구조를 확인하고자, 상기 합성 펩티드 1MQLKPMEINPE11에 대한 토끼 항체를 얻어냈다. 스팟 1이 N-말단 펩티드에 대한 항체로 탐지될 수 없는 것을 확인하였다(도 1b 왼쪽 바닥 패널). 또한, 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 NT-UCH-L1 존재를 탐지하였다(도 1b 오른쪽 패널). 결실된 부위는 UCH-L1 유전자(PARK5)의 엑손 1(exon 1)에 해당하였다(도 1g). 상기 11 개 아미노산이 결실된 단백질의 mRNA은 단백질 유전자 생산물 9.5로서 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스(nucleotide database)에 등록된 바있다(PGP9.5, accession number X04741).
As a result, when 2D-PAGE and Western blot analysis of the UCI-H1 derived from the NCI-H157 human lung cancer cell line was performed, spots regarding several UCH-L1 were identified. Spots 1 and 3 (Figure 1b upper left panel) were cut from the corresponding silver stained 2D gel (Figure 1b left middle panel), peptide fingerprinting and nanoUPLC-ESI-q- using MALDI-TOF MS. These were analyzed by mass spectroscopic (MS) methods of proteomics including peptide sequencing using TOF tandem MS. Spot 1 lacks peptide 1 MQLKPMEINPEMLNK 15 (1815.9144 Da) (FIG. 1C) as shown in spot 3 (FIG. 1D), but is verified by peptide sequencing (FIG. 1F) new peptide 12 MLNK 15 (505.2905 Da) (FIG. 1E). It was confirmed that replaced with). Spot 3 was UCH-L1 full length, while Spot 1 was NT-UCH-L1 (UCH-L1 lacking 11 N-terminal amino acids). To confirm the removed structure, a rabbit antibody against the synthetic peptide 1 MQLKPMEINPE 11 was obtained. It was confirmed that Spot 1 could not be detected with an antibody against the N-terminal peptide (FIG. 1B left bottom panel). In addition, the presence of NT-UCH-L1 was detected in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y (FIG. 1B right panel). The deleted region corresponded to exon 1 of the UCH-L1 gene (PARK5) (FIG. 1G). The mRNA of the 11 amino acid-deleted protein has been registered in the NCBI nucleotide database as protein gene product 9.5 (PGP9.5, accession number X04741).

<< 실시예Example 2> 2> UCHUCH -- L1L1 을 발현하는 안정화된 세포주의 수립A stabilized cell line expressing

UCH-L1 및 NT-UCH-L1 야생형 유전자 발현을 위한 렌티바이러스 벡터를 LentiM1.4 벡터의 Xba I-EcoR V 부위로 PCR 유전자 단편을 도입함으로써 구축하였다. 기존에 기재된 바와 같이 위형 렌티바이러스를 제작하였고, UCH-L1의 안정한 발현을 위해 사용하였다(Dull, T. et al ., J Virol 72, 8463-8471(1998) 및 Follenzi, A., Ailles, L.E., Bakovic, S., Geuna, M. & Naldini, L., Nat Genet 25, 217-222(2000)).
Lentiviral vectors for UCH-L1 and NT-UCH-L1 wild type gene expression were constructed by introducing PCR gene fragments into the Xba I-EcoR V region of the LentiM1.4 vector. Gastric lentiviral was constructed as described previously and used for stable expression of UCH-L1 (Dull, T. meat al ., J Virol 72 , 8463-8471 (1998) and Follenzi, A., Ailles, LE, Bakovic, S., Geuna, M. & Naldini, L., Nat Genet 25 , 217-222 (2000).

<< 실시예Example 3>  3> UCHUCH -- L1L1 및  And NTNT -- UCHUCH -- L1L1 활성의 측정 Measurement of activity

상기 유비퀴틴-C-말단 가수분해 효소 활성을 유비퀴틴-C-말단 7-아미도-4-메틸쿠마린(ubiquitin-C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin, Ub-AMC)(AG scientific)를 사용하여 기존에 기재된 바와 같이 측정하였다(Kim, H.J. et al ., Oncogene 28, 117-127(2009)). The ubiquitin-C-terminal hydrolase activity Ubiquitin -C- terminal 7 by using the amido-4-methyl coumarin (ubiquitin-C-terminal 7- amido-4-methylcoumarin, Ub-AMC) (AG scientific) was measured as described in conventional (Kim, HJ meat al ., Oncogene 28 , 117-127 (2009)).

그 결과, NT-UCH-L1은 유비퀴틴(ubiquitin) 가수분해 효소 활성 능력을 가지지 않는 것을 확인하였다. NT-UCH-L1이 UCH-L1 효소 활성을 나타내는지 시험하기 위해, 정제된 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1로 유비퀴틴(ubiquitin)-AMC 유래 가수분해적 방출된 형광을 비교하였다. NT-UCH-L1는 불활성화였다(도 1h). 이것은 NCI-H157 세포의 용해물로부터 면역침강된 Flag-UCH-L1 및 Flag-NT-UCH-L1의 가수 분해 효소 활성을 비교함으로써 확인하였다. Flag-UCH-L1은 가수 분해 효소 활성을 나타냈지만, Flag-NT-UCH-L1은 나타내지 않았다(도 1i).
As a result, it was confirmed that NT-UCH-L1 does not have ubiquitin hydrolase activity ability. To test if NT-UCH-L1 exhibited UCH-L1 enzymatic activity, ubiquitin-AMC derived hydrolytically released fluorescence was compared with purified recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1. NT-UCH-L1 was inactivated (FIG. 1H). This was confirmed by comparing the hydrolase activity of Flag-UCH-L1 and Flag-NT-UCH-L1 immunoprecipitated from lysates of NCI-H157 cells. Flag-UCH-L1 showed hydrolase activity, but Flag-NT-UCH-L1 did not show (FIG. 1I).

<< 실시예Example 4> 세포 이동 분석을 통한  4> through cell migration assay NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 암세포 침입 능력 확인Cancer cell invasion ability

세포 이동 분석을 24-웰 케모텍시스 챔버 트랜스웰(24-well chemotaxis chamber transwell)(Corning, NY) 및 마트리젤(matrigel)(MatrigelTM basement membrane matrix, BD Bioscience)을 이용하여 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(Kim, H.J. et al ., Oncogene 28, 117-127(2009)). Cell migration assays were as described previously using 24-well chemotaxis chamber transwells (Corning, NY) and Matrigel (Matrigel ™ basement membrane matrix, BD Bioscience). (Kim, HJ meat al . , Oncogene 28 , 117-127 (2009)).

그 결과, NT-UCH-L1는 암세포 침입을 증가시키는 UCH-L1의 능력을 가지지 않음을 확인하였다(도 1j).
As a result, it was confirmed that NT-UCH-L1 does not have the ability of UCH-L1 to increase cancer cell invasion (Fig. 1J).

<< 실시예Example 5> 5> 수소/ 중수소 교환(Hydrogen / deuterium exchange ( HydrogenHydrogen // DeuteriumDeuterium exchangeexchange , , HDXHDX )을 이용한) NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 3차 구조 확인 Tertiary structure

UCH-L1 및 NT-UCH-L1의 3차 구조를 비교하기 위해, 단백질 구조의 동역학 및 변화를 특징화하기 위한 유용한 도구인 수소/중수소 교환(hydrogen/deuterium exchange, HDX)을 이용하였다. 재조합 UCH-L1 및 NT-UCH-L1를 중수소(D2O)에서 다양한 시간으로 배양하였고, 온전한 단백질을 tandem MS를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, UCH-L1, NT-UCH-L1 및 C90/132S NT-UCH-L1(약 1 ㎍/㎕)를 10배 표지 완충액(D2O 안의 20 mM PBS, pH 7.4)으로 희석하였고, 몇몇의 시간의 척도 동안 25℃에서 유지하였다. 상기 표지 반응을 25 mM 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)/25 mM 디소듐 숙신산 완충액(disodium succinate buffer), pH 2.3로 캔치(quenche)하였다(이것은 포름산으로 적정하였다). 펩신 소화를 위해, 돼지 펩신(1 ㎍/㎕)을 각 캔치된 단백질 시료에 첨가하였고, 주입 후에 0℃에서 3분 동안 배양하였다(Hoofnagle, A.N., Resing, K.A. & Ahn, N.G., Methods Mol Biol 250, 283-298(2004) 및 Lee, T., Hoofnagle et al., J Mol Biol 353, 600-612(2005)). 펩신 펩티드를 기존에 기재된 바와 같이 탈염하였고, 분리하였다(Jeong, J. et al., Mol Cell Proteomics 10, M110 000513(2011)). autosampler chamber를 5℃로 설정하였다. 중수소 역-교환을 최소화하기 위해 트랩(trap), 분석 컬럼 및 모든 배관을 얼음 배스(bath)에 두었다. 이동상(mobile phase) 병 둘 다를 얼음에 두었고, 이동상 둘 다는 0.1% FA를 포함하였다. 상기 경사도 크로마토그래피를 0.6 ㎕/분의 흐름 속도에서 수행하였고, nanoAcquityTM/ESI/MS(SYNAPTTM HDMSTM, Waters)로 일렬로 분사하였다. 모든 질량 범위 측정을 모세관 전압(capillary voltage) 2.5 kV, 콘 전압(cone voltage) 35 V, 추출 콘 전압(extraction cone voltage) 4.0 V, 재료 온도 80℃에서 수행하였다. TOF mode scan을 m/z 300-1500의 범위에서 1초의 스캔 시간으로 수행하였다. To compare the tertiary structures of UCH-L1 and NT-UCH-L1, hydrogen / deuterium exchange (HDX) was used, a useful tool for characterizing the kinetics and changes in protein structure. Recombinant UCH-L1 and NT-UCH-L1 were incubated at various times in deuterium (D 2 O) and intact proteins were analyzed using tandem MS. Specifically, UCH-L1, NT-UCH-L1 and C90 / 132S NT-UCH-L1 (about 1 μg / μl) were diluted with 10-fold label buffer (20 mM PBS in D 2 O, pH 7.4) and several It was kept at 25 ° C. for a measure of time. The labeling reaction was quenched with 25 mM trisodium citrate / 25 mM disodium succinate buffer, pH 2.3 (it was titrated with formic acid). For pepsin digestion, porcine pepsin (1 μg / μl) was added to each canned protein sample and incubated for 3 minutes at 0 ° C. after injection (Hoofnagle, AN, Resing, KA & Ahn, NG, Methods). Mol Biol 250 , 283-298 (2004) and Lee, T., Hoofnagle et al., J Mol Biol 353 , 600-612 (2005)). Pepsin peptides were desalted and isolated as previously described (Jeong, J. et al., Mol Cell Proteomics 10 , M 110 000513 (2011)). The autosampler chamber was set to 5 ° C. Traps, analytical columns and all tubing were placed in an ice bath to minimize deuterium back-exchange. Both mobile phase bottles were placed on ice and both mobile phases contained 0.1% FA. The gradient chromatography was performed at a flow rate of 0.6 μl / min and sprayed in series with nanoAcquity ™ / ESI / MS (SYNAPT ™ HDMS ™ , Waters). All mass range measurements were performed at a capillary voltage of 2.5 kV, a cone voltage of 35 V, an extraction cone voltage of 4.0 V, and a material temperature of 80 ° C. TOF mode scan was performed with a scan time of 1 second in the range of m / z 300-1500.

그 결과, 수소-중수소 교환이 점차적으로 UCH-L1에서 16시간까지 발생하였으나, 반면 NT-UCH-L1에서는 이것은 거의 2분 내에 완료되었다(도 1k 및 1l). 이것은 NT-UCH-L1이 UCH-L1보다 더 느슨한 구조를 가지는 것을 나타낸다. 상기 느슨한 부위를 펩신으로 분해된 펩티드내에서 HDX 분석으로 확인하였다(도 1m). UCH-L1보다 NT-UCH-L1의 N 말단 및 C 말단에서 더 많은 중수소 교환이 일어났다. NT-UCH-L1의 시스테인 활성 부위(82MKQTIGNSCGTIGL95)을 포함하는 펩티드는 중수소 교환이 UCH-L1보다 적었다(도 1n).
As a result, hydrogen-deuterium exchange occurred gradually up to 16 hours in UCH-L1, whereas in NT-UCH-L1 this was completed in almost 2 minutes (FIGS. 1K and 1L). This indicates that NT-UCH-L1 has a looser structure than UCH-L1. The loose sites were identified by HDX analysis in peptides digested with pepsin (FIG. 1M). More deuterium exchange occurred at the N and C termini of NT-UCH-L1 than UCH-L1. Peptides containing the cysteine active site of NT-UCH-L1 ( 82 MKQTIGNSCGTIGL 95 ) had less deuterium exchange than UCH-L1 (FIG. 1N).

<< 실시예Example 6>  6> NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 of Lys15Lys15 또는  or Lys157 에서From Lys157 모노유비퀴틴화Monoubiquitination 확인 Confirm

NT-UCH-L1의 Lys15 또는 Lys157에서 모노유비퀴틴화를 확인하고자, 면역침강을 수행하였다. 세포를 면역침강 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 50 mMNaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 ㎍/ml 아프로티닌(aprotinin), 10 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 10 ㎍/ml 펩스타틴(pepstatin), 1 mM Na3VO4, 0.5% NP-40)으로 용해하였다. 용해물을 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상기 상층액을 3시간 동안 4℃에서 단백질 G 세파로오스 비드(protein G sepharose beads)에 가교결합된 항-flag 또는 항-myc 항체와 함께 배양하였다. 비드를 면역침강 완충액으로 3회 세척하였고, 결합된 단백질을 젤 시료 완충액(62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 10%(w/v) glycerol, 5% β머캅토에탄올, 2.3% SDS)으로 용출하였고, SDS-PAGE로 분리하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc 및 NT-UCH-L1-myc를 발현하는 NCI-H157 세포 유래 용해물에 항-myc 항체를 처리하였고, 결과로 초래되는 면역침강을 분석하였다. UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 몇몇의 다른 밴드를 탐지하였고, tandem MS로 그들을 확인하였다. To confirm monoubiquitination in Lys15 or Lys157 of NT-UCH-L1, immunoprecipitation was performed. Cells were immunoprecipitated buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml pepstatin, 1 mM Na 3 VO 4 , 0.5% NP-40). Lysates were centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes and the supernatants incubated with anti-flag or anti-myc antibodies cross-linked to protein G sepharose beads at 4 ° C. for 3 hours. It was. The beads were washed three times with immunoprecipitation buffer, and the bound protein was washed with gel sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 10% (w / v) glycerol, 5% βmercaptoethanol, 2.3% SDS). Eluted and separated by SDS-PAGE. NCI-H157 cell derived lysates expressing UCH-L1-myc and NT-UCH-L1-myc transiently were treated with anti-myc antibodies and the resulting immunoprecipitation was analyzed. UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and several other bands were detected and confirmed by tandem MS.

그 결과, 상기 UCH-L1과 함께 같이 침전된 밴드를, 약 7 kDa, 유비퀴틴과 같이 확인하였다(도 2a 화살표). 이것을 면역침강으로 확인하였다(도 2c 오른쪽 패널 화살표 머리). NT-UCH-L1(도 2a 화살표)과 함께 같이 침강된 두 개의 밴드를 UCH-L1 및 유비퀴틴의 혼합체로 확인하였다(도 2b). NT-UCH-L1-myc 및 상기 두 개 밴드 사이의 분자적 질량 차이가 유비퀴틴의 그것에 근접하기 때문에, 항-myc 및 항-유비퀴틴 항체가 있는 면역 복합체의 웨스턴 블랏을 수행하였다. NT-UCH-L1는 두 개의 별개의 밴드를 나타냈다(도 2c 왼쪽 패널, 세 번째 레인). 상기 위의 밴드는 모노유비퀴틴화된 NT-UCH-L1(Ub-NT-UCH-L1)로 확인한(도 2c 오른쪽 패널) 반면, 탐지된 상기 희미한 밴드는 모노유비퀴틴화된 UCH-L1(도 2c 왼쪽 패널, 두 번째 레인)이었다. As a result, the band precipitated together with the UCH-L1 was confirmed as about 7 kDa, ubiquitin (Fig. 2a arrow). This was confirmed by immunoprecipitation (FIG. 2C right panel arrow head). Two bands that settled together with NT-UCH-L1 (Fig. 2a arrow) were identified as a mixture of UCH-L1 and ubiquitin (Fig. 2b). Since the molecular mass difference between NT-UCH-L1-myc and the two bands is close to that of ubiquitin, western blot of immune complexes with anti-myc and anti-ubiquitin antibodies was performed. NT-UCH-L1 showed two distinct bands (FIG. 2C left panel, third lane). The above band was identified as monoubiquitinated NT-UCH-L1 (Ub-NT-UCH-L1) (FIG. 2C right panel), while the faint band detected was monoubiquitinated UCH-L1 (FIG. 2C left). Panel, second lane).

또한, 모노유비퀴틴화된 리신(lysine, Lys) 잔기를 확인하기 위하여, 펩티드 서열분석 및 돌연변이 연구를 병행하였다. 면역침강된 Ub-NT-UCH-L1는 tandem MS로 펩티드 서열분석함으로써 분석하였다. 리신 잔기가 유비퀴틴에 부착할 때, 114.04 Da의 증가(유비퀴틴의 C-말단 Gly-Gly)가 있다. NT-UCH-L1의 변형된 펩티드를 확인하였으며, Lys15에서 후보 유비퀴틴화(ubiquitination) 부위를 설정하였다(도 2d). NT-UCH-L1의 세 가지 변종인 K157R, K15/157R 및 K60/157R를 구축하였고, 이들 변종에서 모노유비퀴틴화를 웨스턴 블랏 분석(도 2e) 및 면역침강(도 2f)으로 확인하였다. NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화는 K157R NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1 변종을 과발현하는 세포에서 상당히 없어진다. 이러한 결과는 Ub-NT-UCH-L1의 두 개의 개체군이 있으며, 한 개는 K15에 모노유비퀴틴화되고, 다른 하나는 K157에 되지만 둘 다는 아닌 것을 제시한다. In addition, peptide sequencing and mutation studies were combined to identify monoubiquitinated lysine (lysine) residues. Immunoprecipitated Ub-NT-UCH-L1 was analyzed by peptide sequencing with tandem MS. When lysine residues attach to ubiquitin, there is an increase of 114.04 Da (C-terminal Gly-Gly of ubiquitin). Modified peptides of NT-UCH-L1 were identified and candidate ubiquitination sites were set in Lys15 (FIG. 2D). Three variants of NT-UCH-L1, K157R, K15 / 157R and K60 / 157R, were constructed and monoubiquitination in these variants was confirmed by Western blot analysis (FIG. 2E) and immunoprecipitation (FIG. 2F). Monoubiquitination of NT-UCH-L1 is significantly lost in cells overexpressing K157R NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 variants. These results suggest that there are two populations of Ub-NT-UCH-L1, one monoubiquitinated at K15 and the other at K157 but not both.

<< 실시예Example 7> 7> UbUb -- NTNT -- UCHUCH -- L1L1 및  And NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 세포 내 위치 확인Intracellular placement of

<7-1> 면역조직화학염색 및 <7-1> Immunohistochemical Staining and 공초점Confocal 현미경을 이용한  Using a microscope UbUb -- NTNT -- UCHUCH -- L1L1 및  And NTNT -UCH-L1의 세포 내 위치 확인The intracellular location of -UCH-L1

미토콘드리아 및 파킨슨병 사이의 연관성은, 예를 들면 부검된 파킨슨병 뇌 조직의 일반적인 특징이 미토콘드리아 기능장애에 의한 것, 또는 미토콘드리아에서 파킨슨병이 연관된 유전자계 산물이 제시되는 것과 같은 발견에 의해 이미 증명되었기 때문에, 세포질 대 미토콘드리아에 있는 UCH-L1와 NT-UCH-L1의 상대적인 분포를 분석하였다. 세포를 SecureslipTM cell culture cover slip(Gracebiolab)에서 생장시켰다. 세포를 HBSS에서 250 nM of MitoTracker® Red 580와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분 동안 상온에서 고정하였다. 침투화를 0.1% Triton X-100 HBSS에서 15분 동안 상온에서 수행하였다. 세포는 불특정 단백질의 흡착을 차단하기 위해 3% BSA, 0.2% Tween 20 및 0.2% 젤라틴(gelatin) PBS로 1시간 동안 상온에서 처리하였다. 세포를 1% BSA 및 1% 수크로스(sucrose)를 포함하는 HBSS에 1:250으로 희석된 모노클로날 항-myc 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 1:50으로 희석된 Alexa Fluor 488이 접합된 염소 항 마우스 IgG 와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경하에서 분석하였다. 또한, 미토콘드리아 표적화를 예측하는 프로그램인 Predotar 및 MitoProt II-v1.101를 적용하였다. The link between mitochondria and Parkinson's disease has already been demonstrated, for example, by the discovery that common features of autopsied Parkinson's disease brain tissue are due to mitochondrial dysfunction or that genetic products are associated with Parkinson's disease in mitochondria. Therefore, we analyzed the relative distribution of UCH-L1 and NT-UCH-L1 in the cytoplasm versus mitochondria. Cells were grown on Secureslip ™ cell culture cover slip (Gracebiolab). Cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes with 250 nM of MitoTracker ® Red 580 in HBSS and fixed at room temperature for 10 minutes with 4% paraformaldehyde. Permeation was carried out at room temperature for 15 minutes in 0.1% Triton X-100 HBSS. Cells were treated at room temperature for 1 hour with 3% BSA, 0.2% Tween 20 and 0.2% gelatin PBS to block adsorption of unspecific proteins. Cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour with monoclonal anti-myc antibody diluted 1: 250 in HBSS containing 1% BSA and 1% sucrose. After washing three times with PBS, cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti mouse IgG diluted 1:50. Cells were analyzed under Zeiss LSM 510 META confocal microscope. In addition, Predotar and MitoProt II-v1.101, programs for predicting mitochondrial targeting, were applied.

그 결과, HeLa 세포에서, UCH-L1-myc은 세포질에 주로 분포하였으나, NT-UCH-L1-myc는 세포질 및 미토콘드리아 둘 다에 분포하였으며, K15/157R NT-UCH-L1는 오직 미토콘드리아에만 분포하였다(도 3a). 이러한 분포를 HeLa 세포 유래 세포질 및 미토콘드리아 분획물의 웨스턴 블랏 연구로 확인하였다(도 3b). UCH-L1 유래 11개의 N-말단 아미노산의 결실은 미토콘드리아 표적화 가능성을 증가시켰다: UCH-L1 및 NT-UCH-L1에 대한 각각 Predotar에서 0.00 및 0.41 및 MitoProt II에서 0.1032 및 0.4606의 예측 점수.
As a result, in HeLa cells, UCH-L1-myc was mainly distributed in the cytoplasm, but NT-UCH-L1-myc was distributed in both the cytoplasm and mitochondria, and K15 / 157R NT-UCH-L1 was distributed only in the mitochondria. (FIG. 3A). This distribution was confirmed by Western blot studies of HeLa cell derived cytoplasm and mitochondrial fractions (FIG. 3B). Deletion of 11 N-terminal amino acids from UCH-L1 increased mitochondrial targeting potential: predictive scores of 0.0003 and 0.41 in Predotar and 0.1032 and 0.4606 in MitoProt II, respectively for UCH-L1 and NT-UCH-L1.

<7-2> 미토콘드리아  <7-2> mitochondria 분획물의Fraction 제조 Produce

NT-UCH-L1의 미토콘드리아 분포가 미토콘드리아 손상에 관련하는지를 조사하였다. 세포의 미토콘드리아 분획물을 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Shim, J.H. et al ., Mitochondrion 11, 707-715(2011)). 세포를 단백질 분해효소 저해제 혼합물 및 10 mM NEM로 보충된 10 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 부유하였고, 게이지 바늘을 통해 20회 통과시켰다. 차가운 1.5 M 수크로스 용액 40 ㎕를 첨가한 후, 600 × g 에서 10분 동안 원심분리 후에, 상기 상층액을 14,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하였고, 동일 부피의 2x 젤 시료 완충액과 함께 혼합하였다. 상기 미토콘드리아 분획물을 포함하는 펠렛을 50 ㎕ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5으로 2회 세척하였고, 30 ㎕ 2x 젤 시료 완충액에서 용해하였다. 젤 시료 완충액 안의 동일 부피의 상기 상층액 및 젤 시료 완충액 혼합물 및 미토콘드리아 분획물을 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.We investigated whether mitochondrial distribution of NT-UCH-L1 is related to mitochondrial damage. Mitochondrial fractions of cells were prepared as previously described (Shim, JH meat al ., Mitochondrion 11 , 707-715 (2011)). Cells were suspended in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, supplemented with a protease inhibitor mixture and 10 mM NEM, and passed 20 times through a gauge needle. After addition of 40 μl of cold 1.5 M sucrose solution, after centrifugation at 600 × g for 10 minutes, the supernatant was centrifuged at 14,000 × g for 10 minutes and mixed with an equal volume of 2 × gel sample buffer. . Pellets containing the mitochondrial fractions were washed twice with 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 and dissolved in 30 μl 2 × gel sample buffer. Equal volumes of the supernatant and gel sample buffer mixture and mitochondrial fractions in gel sample buffer were analyzed on 10% SDS-PAGE.

그 결과, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R NT-UCH-L1 둘 다 세포질 또는 미토콘드리아 분획물에서 각각 6 시간 이내에 사라졌으나, UCH-L1의 수준은 변하지 않았다(도 3b). CCCP는 프로테아좀(proteasome)에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3c). 살아있는 세포에서 NT-UCH-L1 또는 K15/157R NT-UCH-L1의 발현은 미토콘드리아 구조에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 3d).
As a result, both NT-UCH-L1 and its K15 / 157R NT-UCH-L1 disappeared within 6 hours each in the cytoplasmic or mitochondrial fraction, but the level of UCH-L1 did not change (FIG. 3B). CCCP induced the degradation of NT-UCH-L1 in the proteasome (FIG. 3C). Expression of NT-UCH-L1 or K15 / 157R NT-UCH-L1 in living cells was confirmed not to affect mitochondrial structure (FIG. 3D).

<< 실시예Example 8>  8> 모노유비퀴틴화된Monoubiquitinated 형태( shape( MonoubiquitinatedMonoubiquitinated formform )가 용해성 ) Soluble NTNT -UCH-L1의 저장소인 것을 확인-Confirm that it is a repository for UCH-L1

Ub-NT-UCH-L1의 기능을 설명하기 위해, NT-UCH-L1-myc를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 45℃에서 30 분 동안 열 충격을 수행하였고, 37℃에서 회복하였다. To explain the function of Ub-NT-UCH-L1, HeLa cells stably expressing NT-UCH-L1-myc were subjected to heat shock at 45 ° C. for 30 minutes and recovered at 37 ° C.

그 결과, 열 충격은 회복 동안에 사라지는 불용성 NT-UCH-L1을 유도하였다(도 3e). 단백질 합성 저해제 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX)가 용해성 K15/157 NT-UCH-L1의 복원을 저해하기 때문에, 상기 불용성 NT-UCH-L1는 다시 용해되지 않는 것으로 보인다. 용해성 NT-UCH-L1은 열 충격 후에 즉시 사라졌다(도 3f). 용해성 NT-UCH-L1이 감소할 때에, Ub-NT-UCH-L1이 이를 보충한다. NT-UCH-L1 는 8 시간 회복에 의해 용해성 분획물 안의 정상 수준까지 회복하였고, 그 후에 Ub-NT-UCH-L1은 NT-UCH-L1로부터 만들어졌다. 따라서, Ub-NT-UCH-L1이 NT-UCH-L1가 감소될 때, NT-UCH-L1을 공급하는 NT-UCH-L1의 저장소로서 역할을 하는 것으로 보인다.
As a result, heat shock induced insoluble NT-UCH-L1 disappearing during recovery (FIG. 3E). Since the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX) inhibits the restoration of soluble K15 / 157 NT-UCH-L1, the insoluble NT-UCH-L1 does not appear to dissolve again. Soluble NT-UCH-L1 disappeared immediately after heat shock (FIG. 3F). When soluble NT-UCH-L1 decreases, Ub-NT-UCH-L1 compensates for it. NT-UCH-L1 recovered to normal levels in soluble fraction by 8 h recovery, after which Ub-NT-UCH-L1 was made from NT-UCH-L1. Thus, Ub-NT-UCH-L1 appears to serve as a reservoir of NT-UCH-L1 that supplies NT-UCH-L1 when NT-UCH-L1 is reduced.

<< 실시예Example 9> 9> NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 전환 정도 확인Check the degree of conversion of

NT-UCH-L1를 일시적으로 발현하거나, 안정적으로 발현하는 두 세포 안에서 NT-UCH-L1의 수준은 UCH-L1의 수준보다 적다. NT-UCH-L1이 UCH-L1에 비해 더 쉽게 분해되는지 확인하였다. CHX로 단백질 합성을 저해한 후에, UCH-L1 유전자의 메틸레이션(methylation)에 의해 UCH-L1의 발현이 자연적으로 저해된 HeLa 세포에서 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc의 분해 속도를 비교하였다.In both cells transiently or stably expressing NT-UCH-L1, the level of NT-UCH-L1 is less than that of UCH-L1. It was confirmed that NT-UCH-L1 is more easily degraded than UCH-L1. After inhibition of protein synthesis with CHX, UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc and K15 / in HeLa cells whose expression of UCH-L1 was naturally inhibited by methylation of the UCH-L1 gene. The degradation rate of 157R NT-UCH-L1-myc was compared.

그 결과, NT-UCH-L1-myc 및 K15/157R NT-UCH-L1-myc이 UCH-L1 보다 빠르게 분해되는 것을 확인하였다(도 4a). 유비퀴틴화되지 않은 K15/157R NT-UCH-L1-myc은 Ub-NT-UCH-L1보다 더 쉽게 사라졌다. 또한, 내생의 UCH-L1를 상당히 발현하는 NCI-H157 세포에서 이러한 분해 패턴을 보였다(도 4b). NT-UCH-L1이 어떻게 분해되는지 이해하고자, MG132(프로테아좀 분해(proteasomal degradation)의 저해제), NH4Cl(리소좀 분해(lysosomal degradation)의 저해제) 및 3-메틸아데닌(3-methyladenine)(3MA, 자식작용의(autophagy)의 저해제)를 세포에 처리한 후에 NT-UCH-L1를 정량하였다. MG132 처리만이 NCI-H157(도 4c) 뿐만 아니라 HeLa 세포(도 4d)에서 NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종의 축적을 야기하는 것을 확인하였다. 따라서, 정상상태에서 NT-UCH-L1은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해된다.
As a result, it was confirmed that NT-UCH-L1-myc and K15 / 157R NT-UCH-L1-myc were degraded faster than UCH-L1 (FIG. 4A). Unubiquitinated K15 / 157R NT-UCH-L1-myc disappeared more easily than Ub-NT-UCH-L1. In addition, this degradation pattern was shown in NCI-H157 cells expressing significantly endogenous UCH-L1 (FIG. 4B). To understand how NT-UCH-L1 degrades, MG132 (inhibitor of proteasomal degradation), NH4Cl (inhibitor of lysosomal degradation) and 3-methyladenine (3MA, NT-UCH-L1 was quantified after treatment with cells of inhibitors of autophagy). Only MG132 treatment was found to cause accumulation of NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant in HeLa cells (FIG. 4D) as well as NCI-H157 (FIG. 4C). Thus, at steady state NT-UCH-L1 is degraded by the ubiquitin-proteasome system.

<< 실시예Example 10>  10> NTNT -- UCHUCH -- L1L1 응집 정도 확인 Check the degree of cohesion

<10-1> 세포 <10-1> cells 용해물의Melt 수용성 및 불용성  Water soluble and insoluble 분획물Fraction 제조 Produce

세포 용해물의 수용성 및 불용성 분획물 제조를 기존에 기재한 바와 같이 제조하였다(Ardley, H.C. et al ., Mol Biol Cell 14, 4541-4556(2003)). 요약하면, 100 mm 세포 배양 플레이트의 세포를 500 ㎕ RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 1%(v/v) NP-40, 0.5%(wt/vol) 소듐데옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 0.1%(wt/vol) SDS, 단백질 분해 효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)(sigma), 10 mM NEM)에 26.5-게이지(gauge) 바늘을 통해 10회 통과함으로써 용해하였다. 12,000 × g에서 20 분 동안 원심분리 후에, 펠렛(pellet)을 200 ㎕ 젤 시료 완충액에서 재부유하였다. 상기 상층액을 2x 젤 시료 완충액의 동일 부피와 함께 혼합하였고, 10% SDS-PAGE에서 각 분획물의 20 ㎕을 분석하였다. MG132 처리 후에 세포 내에 축적된 NT-UCH-L1의 특징을 확인하였을 때, HeLa 세포를 MG132로 처리하였고, 세제로 용해성(soluble, S) 및 불용성(insoluble, I) 분획물로 분리하였다. Aqueous and insoluble fraction preparations of cell lysates were prepared as previously described (Ardley, HC meat al ., Mol Biol Cell 14 , 4541-4556 (2003). In summary, cells in a 100 mm cell culture plate were placed in 500 μl RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 1% (v / v) NP-40, 0.5% (wt / vol) sodium Dissolved by passing through a 26.5-gauge needle 10 times through sodium deoxycholate and 0.1% (wt / vol) SDS, protease inhibitor cocktail (sigma, 10 mM NEM). . After centrifugation at 12,000 × g for 20 minutes, the pellet was resuspended in 200 μl gel sample buffer. The supernatants were mixed with the same volume of 2 × gel sample buffer and 20 μl of each fraction was analyzed on 10% SDS-PAGE. When characterizing NT-UCH-L1 accumulated in cells after MG132 treatment, HeLa cells were treated with MG132 and separated into soluble (S) and insoluble (I) fractions with detergent.

그 결과, NT-UCH-L1 및 그것의 K15/157R 변종은 쉽게 불용성 분획물에 축적되었고, 무시할만한 수준의 UCH-L1이 불용성 분획물 안에 축적되었다(도 4e). MG132 처리 후에 Ub-NT-UCH-L1은 아니지만 NT-UCH-L1는 불용성 분획물 안에 나타났다(도 4e 중간 패널). 이것은 대부분 불용성 분획물에 축적되는 모노유비퀴틴화-결핍 변종인 K15/157R NT-UCH-L1이 더 확실하였다(도 4e 아래 패널). 또한, 이것은 NCI-H157 세포에서 보였다(도 4f). 또한, 공초점 현미경을 이용하여 Hela 세포에서 불용성 분획물을 조사하였을 때, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1의 응집은 MG132 처리 후에 증가하였다(도 4g). 이러한 실험은 NT-UCH-L1이 더 쉽게 응집되고, UCH-L1보다 프로테아좀에서 더 빠르게 분해되며, NT-UCH-L1의 모노유비퀴틴화된 형태가 응집을 저해하는 것을 나타낸다. As a result, NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant easily accumulated in the insoluble fraction and negligible levels of UCH-L1 accumulated in the insoluble fraction (FIG. 4E). NT-UCH-L1, but not Ub-NT-UCH-L1, appeared in the insoluble fraction after MG132 treatment (FIG. 4E middle panel). This was more evident with the K15 / 157R NT-UCH-L1, a monoubiquitination-deficient variant that mostly accumulates in the insoluble fraction (panel below FIG. 4E). This was also seen in NCI-H157 cells (FIG. 4F). In addition, when insoluble fractions were examined in Hela cells using confocal microscopy, aggregation of NT-UCH-L1, but not UCH-L1, increased after MG132 treatment (FIG. 4G). These experiments show that NT-UCH-L1 aggregates more easily, degrades faster in proteasomes than UCH-L1, and the monoubiquitinated form of NT-UCH-L1 inhibits aggregation.

신경세포에서 NT-UCH-L1의 응집 현상을 설명하기 위해서, MG132없이, UCH-L1의 대부분이 용해성 분획물에 존재하는 반면, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1이 일시적으로 발현하는 20% 이상이 불용성 분획물에 존재하는 도파민의 신경 전구 세포주 SN4741를 연구하였다(도 4h). NT-UCH-L1의 발현 증가와 함께 이것의 불용성 분획물이 증가하였다(도 4i). 이것은 불용성 NT-UCH-L1의 수준에 대한 한계점일 수 있고, 이러한 한계점 이하 NT-UCH-L1이 세포 안에서 용해성을 유지하는 것을 나타낸다. 아울러, 환원이 없는 조건하에 NT-UCH-L1의 불용성 분획물을 분석함으로써 공유 또는 비공유 이황화 형성으로부터 NT-UCH-L1의 불용성 응집이 발생하는지 확인하였다. 불용성 NT-UCH-L1 분획물은 환원 조건에서 단량체가 되는 이황화 가교결합된 높은 분자 질량 NT-UCH-L1(S-S NT)을 포함하였다(도 4i).
To explain NT-UCH-L1 aggregation in neurons, without MG132, most of UCH-L1 is present in soluble fractions, whereas NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1 are transiently expressed. More than 20% of the dopamine neuronal progenitor cell lines SN4741 were present in the insoluble fraction (FIG. 4H). Insoluble fractions thereof increased with increasing expression of NT-UCH-L1 (FIG. 4I). This may be the limit for the level of insoluble NT-UCH-L1, indicating that below this limit NT-UCH-L1 maintains solubility in cells. In addition, insoluble fractions of NT-UCH-L1 were analyzed under conditions without reduction to determine if insoluble aggregation of NT-UCH-L1 occurred from covalent or non-covalent disulfide formation. The insoluble NT-UCH-L1 fraction contained disulfide crosslinked high molecular mass NT-UCH-L1 (SS NT) which became a monomer under reducing conditions (FIG. 4I).

<10-2> 재조합 단백질의 제조, 그들의 분리 및 <10-2> Preparation of recombinant proteins, their isolation and FPLCFPLC

다양한 UCH-L1-6His 양식을 포함하는 pET 17b 플라스미드(plasmid)를 BL21(DE3)에 형질전환하였고, OD가 600 nm에서 0.6 ~ 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 생장시켰다. 단백질의 도입을 위해, 세포를 IPTG와 함께 25℃에서 2시간 동안 배양하였고, 수확하였으며, 용해 완충액(0.16 mg/ml 리소자임(lysozyme)이 있는 PBS, 0.1% Triton X-100, 2 ㎍/ml 아프로티닌(aprotinin), 1 mM PMSF, 10 mM 이미다졸(imidazole))에서 30분 동안 얼음에서 용해하였다. 상기 세포 용해물을 65,000 rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였고, 상층액을 Ni-NTA-agarose beads column(Qiagen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 Superdex 200, HR 10/30(GE Healthcare)에서 분리하였고, 상기 분획물을 환원 및 환원이 없는 상태에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. PET 17b plasmids containing various UCH-L1-6His forms were transformed into BL21 (DE3) and grown at 37 ° C. until the OD reached 0.6-0.8 at 600 nm. For the introduction of protein, cells were incubated with IPTG for 2 hours at 25 ° C., harvested and harvested, PBS with lysis buffer (0.16 mg / ml lysozyme, 0.1% Triton X-100, 2 μg / ml apro It was dissolved in ice for 30 minutes in aprotinin, 1 mM PMSF, 10 mM imidazole. The cell lysates were centrifuged at 65,000 rpm, 4 ° C. for 1 hour, and the supernatants were purified using Ni-NTA-agarose beads column (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. The recombinant protein was isolated in Superdex 200, HR 10/30 (GE Healthcare), and the fractions were analyzed on SDS-PAGE with reduction and no reduction.

그 결과, FPLC에서, NT-UCH-L1는 66 kDa 보다 더 큰 다량체로 용출된 반면, 재조합 UCH-L1은 주로 단량체(약 30 kDa)로서 용출되었다. 이것은 비환원 조건에서 단량체로 분해되지 않았다(도 4j). 이것은 전자쌍을 공유하는 분자내 이황화 결합이 있는 NT-UCH-L1 형태 불용성 응집체를 나타낸다.
As a result, in FPLC, NT-UCH-L1 eluted with a multimer greater than 66 kDa, whereas recombinant UCH-L1 eluted mainly as a monomer (about 30 kDa). It did not decompose into monomers under non-reducing conditions (FIG. 4J). This represents NT-UCH-L1 form insoluble aggregates with intramolecular disulfide bonds sharing electron pairs.

<< 실시예Example 11>  11> 산화적Oxidative 및 미토콘드리아 스트레스의  And of mitochondrial stress NTNT -- UCHUCH -- L1L1 내의  undergarment 이황화Lee Sang Hwa 가교결합Crosslinking 유도 확인 Induction confirmation

세포가 스트레스를 받을 때, NT-UCH-L1가 분자내 이황화 결합을 통해 응집할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 시험하기 위해, HeLa 세포에 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)를 1 시간 동안 처리하였고, 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 그들을 분리하였다(도 4k). UCH-L1은 응집체를 형성하지 않았으나, NT-UCH-L1 및 이것의 K15/157R 변종은 H2O2 를 0.5 mM 이상 처리한 세포내에서 이황화 결합된 다량체를 형성하였다. 또한, 이러한 응집이 CCCP 처리와 같은 미토콘드리아 스트레스에 대한 반응으로 야기되는 것을 확인하였다. CCCP는 프로테아좀에서 NT-UCH-L1의 분해를 유도하였다(도 3b 및 도 3c). NT-UCH-L1을 발현하는 HeLa 세포에 CCCP 및 MG132를 처리하였고, 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였을 때, CCCP로 유도된 NT-UCH-L1의 소실은 MG132의 처리로 저해되었다(도 4l 아래 패널 레인4). 하지만, 비환원 상태에서, NT-UCH-L1은 유지하였으나, 이의 원래 위치가 아니지만(위 패널 화살표), 대신에 더 높은 분자량 범위에 분산되었으며, 이는 프로테아좀 분석 전에 이황화 가교결합된 다량체를 형성하는 것을 제시한다. 종합하면, 산화적 및 미토콘드리아 스트레스 둘 다는 NT-UCH-L1 내의 이황화 가교결합을 유도하는 것을 확인하였다.
When cells are stressed, it is assumed that NT-UCH-L1 will aggregate through intramolecular disulfide bonds. To test this hypothesis, HeLa cells were treated with varying concentrations of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) for 1 hour and separated by SDS-PAGE under both reducing and non-reducing conditions (FIG. 4K). UCH-L1 did not form aggregates, but NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant formed disulfide-linked multimers in cells treated with at least 0.5 mM H 2 O 2 . It was also confirmed that this aggregation was caused by a response to mitochondrial stress such as CCCP treatment. CCCP induced degradation of NT-UCH-L1 in proteasomes (FIGS. 3B and 3C). HeLa cells expressing NT-UCH-L1 were treated with CCCP and MG132, and when analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions, the loss of CCCP-induced NT-UCH-L1 was inhibited by the treatment of MG132 (FIG. 4L). Bottom panel lane4). However, in the non-reduced state, NT-UCH-L1 was maintained, but not in its original position (up panel arrow), but instead dispersed in a higher molecular weight range, which dissociated the disulfide crosslinked multimer prior to proteasome analysis. Suggest forming. Taken together, both oxidative and mitochondrial stress were found to induce disulfide crosslinking in NT-UCH-L1.

<< 실시예Example 12>  12> Cys90Cys90 및  And Cys132Cys132 에서 in SerSer 으로 돌연변이가 As a mutation NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 용해성에 주는 영향 확인The effect on the solubility of

Cys90 및 Cys132에서 Ser으로 돌연변이는 NT-UCH-L1의 용해성을 증가시키는 것을 확인하고자 하였고, NT-UCH-L1는 이의 활성 부위에 Cys 90를 포함하는 6 시스테인(cysteine) 잔기를 가지며, 비환원 조건에서 다량체를 형성하는 것을 확인하였다(도 5a 레인1). 이황화 부위를 찾는 알고리즘 DBond와 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS를 병행하여 적용하여, NT-UCH-L1 내의 이황화 결합 형성을 확인하였다. 펩티드를 포함하는 많은 이황화물을 탐지하였으나, Cys47를 포함하는 트립신 펩티드가 MS 분석을 하기에 너무 긴 것을 확인하였다(표 1 및 도 5b). Cys132는 이를 포함하는 모든 5 개의 시스테인과 이황화 결합을 형성하였다(도 5c). Cys132 및 Cys152은 UCH-L1 안의 2 개의 표면 시스테인 잔기이다. NT-UCH-L1(Ser에 의해 대체된 Cys)의 6 개 변종을 만들었으며, 재조합 변종 단백질에서 NT-UCH-L1 응집에 중요한 시스테인 잔기를 찾는 것을 시도하였다(도 5a). 돌연변이 C90S는 적은 폴리머(polymer) 및 약 25 kDa 크기의 더 많은 단량체를 보였다(도 5a 화살표). 이러한 것은 C90 및 C132는 NT-UCH-L1에서 이황화 가교결합을 담당하는 것을 나타낸다(도 5d). The mutation from Cys90 and Cys132 to Ser was intended to confirm that the solubility of NT-UCH-L1 was increased, and NT-UCH-L1 has 6 cysteine residues containing Cys 90 at its active site, non-reducing conditions It was confirmed that the multimer was formed in (FIG. 5A lane 1). The algorithm for finding disulfide sites, DBond and nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS, was applied in parallel to confirm disulfide bond formation in NT-UCH-L1. While many disulfides containing peptides were detected, it was confirmed that the trypsin peptide containing Cys47 was too long for MS analysis (Table 1 and FIG. 5B). Cys132 formed a disulfide bond with all five cysteines including it (FIG. 5C). Cys132 and Cys152 are two surface cysteine residues in UCH-L1. Six variants of NT-UCH-L1 (Cys replaced by Ser) were made and an attempt was made to find cysteine residues important for NT-UCH-L1 aggregation in the recombinant variant protein (FIG. 5A). Mutant C90S showed less polymer and more monomers of about 25 kDa size (Figure 5A arrow). This shows that C90 and C132 are responsible for disulfide crosslinking in NT-UCH-L1 (FIG. 5D).

Figure 112012049916253-pat00001
Figure 112012049916253-pat00001

<< 실시예Example 13>  13> NTNT -- UCHUCH -- L1L1 C90C90 /132S 변종의 분포 위치 및 안정성 확인Location and stability of the 132S variant

NT-UCH-L1 C90/132S 변종의 위치 및 안정성을 확인하고자 하였다. 일시적으로 NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 면역염색하였고, 공초점 현미경으로 가시화하였다(도 5e). 도 3a에서 보여지는 결과를 확인하였을 때, UCH-L1이 주로 세포질에 분포하며, NT-UCH-L1은 미토콘드리아 및 세포질에 분포하였다. 상기 C90/132S NT-UCH-L1 변종은 세포질에 분포하였으며 미토콘드리아에는 분포하지 않았다. Cys90 및 Cys132이 미토콘드리아 분포에 중요한 것인지를 확인하고자, 모든 6 개 시스테인(cysteines)이 세린(serines)으로 돌연변이 되어 있는 변종(C0 NT-UCH-L1)의 분포를 조사하였고, 응집을 형성하는 C0 NT-UCH-L1이 미토콘드리아 및 세포질 둘 다에 분포하는 것을 확인하였다(도 5f). 상기 C90/132S NT-UCH-L1의 3차 구조는 UCH-L1 보다 더 느슨하고 NT-UCH-L1 보다 적다(도 1m). 이것은 NT-UCH-L1의 전체적인 3차 구조 및 특정하지 않은 시스테인(cysteine) 잔기가 미토콘드리아 분포를 주관하는 것을 제시한다. We attempted to determine the location and stability of the NT-UCH-L1 C90 / 132S strain. HeLa cells transiently expressing NT-UCH-L1-myc or its C90 / 132S variant were immunostained and visualized by confocal microscopy (FIG. 5E). When confirming the results shown in Figure 3a, UCH-L1 was mainly distributed in the cytoplasm, NT-UCH-L1 was distributed in the mitochondria and cytoplasm. The C90 / 132S NT-UCH-L1 strain was distributed in the cytoplasm and not in the mitochondria. To determine if Cys90 and Cys132 are important for the mitochondrial distribution, we examined the distribution of the strain (C 0 NT-UCH-L1), in which all six cysteines were mutated to serines, and C, forming aggregates 0 It was confirmed that NT-UCH-L1 was distributed in both mitochondria and cytoplasm (FIG. 5F). The tertiary structure of the C90 / 132S NT-UCH-L1 is looser than UCH-L1 and less than NT-UCH-L1 (FIG. 1M). This suggests that the overall tertiary structure of NT-UCH-L1 and unspecified cysteine residues govern the mitochondrial distribution.

그 후에 분자내 이황화 결합이 NT-UCH-L1의 반감기에 영향을 주는지 연구하였다. 일시적으로 UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc 또는 이의 C90/132S 변종을 발현하는 HeLa 세포를 CHX로 처리하였고, 그들의 반감기를 측정하였다. 도 5g와 같이, NT-UCH-L1는 6시간 이내에 사라졌으나, C90/132S NT-UCH-L1는 24시간까지 유지되었으며, 이는 C90/132S NT-UCH-L1의 반감기가 UCH-L1의 그것과 유사한 것을 제시한다.
We then investigated whether intramolecular disulfide bonds affect the half-life of NT-UCH-L1. HeLa cells expressing UCH-L1-myc, NT-UCH-L1-myc or C90 / 132S variants thereof transiently were treated with CHX and their half-life was measured. As shown in FIG. 5G, NT-UCH-L1 disappeared within 6 hours, but C90 / 132S NT-UCH-L1 remained up to 24 hours, which had a half-life of C90 / 132S NT-UCH-L1 compared to that of UCH-L1. Suggest something similar.

<< 실시예Example 14>  14> NTNT -- UCHUCH -- L1L1 가 end 세포내Intracellular ROSROS 수준에 주는 영향 확인 Your level of impact

NT-UCH-L1안의 분자내 이황화 결합의 형성은 이것이 산화환원반응에 민감한 단백질인 것을 제시한다. 세포내 ROS의 주요 공급원인 미토콘드리아에서 NT-UCH-L1의 분포는 ROS의 유용성에서 NT-UCH-L1에 대한 잠재력있는 역할을 제시한다. The formation of intramolecular disulfide bonds in NT-UCH-L1 suggests that this is a protein sensitive to redox reactions. The distribution of NT-UCH-L1 in mitochondria, a major source of intracellular ROS, suggests a potential role for NT-UCH-L1 in the usefulness of ROS.

NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준에 영향을 주는지 확인하고자, 세포내 ROS를 CM-H2DCFDA(Invitrogen)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다. 요약하면, 트립신을 처리한 세포를 세척하였고 0.5 ml HBSS에서 재부유 하였다. 3 ㎕ 0.5 mM CM-H2DCFDA를 첨가하였고 37℃에서 15분 동안 배양하였다. HBSS로 간단히 세척한 후에, 세포를 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)로 분석하였다.To determine if NT-UCH-L1 affects intracellular ROS levels, intracellular ROS was measured according to the manufacturer's instructions using CM-H 2 DCFDA (Invitrogen). In summary, trypsin treated cells were washed and resuspended in 0.5 ml HBSS. 3 μl 0.5 mM CM-H 2 DCFDA was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After a brief wash with HBSS, cells were analyzed with a BD FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences).

그 결과, NT-UCH-L1 및 K15/1157R NT-UCH-L1의 발현은 대조군 mock 및 UCH-L1 발현에 비해, 세포내 ROS 수준을 감소시켰다(도 6a 위의 패널). NT-UCH-L1 및 이의 K15/157R 변종을 발현하는 세포는 mock 또는 UCH-L1를 발현하는 세포보다 더 낮은 ROS 수준을 보였으며, 이는 NT-UCH-L1가 세포내 ROS 수준을 감소시키는 것을 제시한다.
As a result, expression of NT-UCH-L1 and K15 / 1157R NT-UCH-L1 decreased intracellular ROS levels compared to control mock and UCH-L1 expression (panel above FIG. 6A). Cells expressing NT-UCH-L1 and its K15 / 157R variant showed lower ROS levels than cells expressing mock or UCH-L1, suggesting that NT-UCH-L1 reduces intracellular ROS levels. do.

<< 실시예Example 15> 15> CCCPCCCP 로 유도된 손상으로부터 From damage induced NTNT -- UCHUCH -- L1L1 의 세포 보호 효과 확인 Your cell protection effect

CCCP는 미토콘드리아 손상 및 세포 사멸을 유도하여, 파킨슨병의 시작과 관련된 현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. CCCP로 세포 손상을 유도하였을 때, NT-UCH-L1의 세포 보호 효과를 확인하고자, 5,000 개의 HeLa 세포를 실시간 세포 분석기인 xCELLigence(Roche Applied Science)를 위해 96-웰 E-플레이트(E-plate)에 두었다. 24시간 후에, 세포를 0, 10 및 25 μM의 CCCP로 처리하였고, 세포 생장을 전기적 전압과 전류의 비(impedance)로 매 30분 마다 실시간 세포 분석기인 xCELLigence로 측정함으로써 관측하였다. 시료는 3회 반복하였다. CCCP is known to induce mitochondrial damage and cell death, leading to phenomena associated with the onset of Parkinson's disease. In order to confirm the cytoprotective effect of NT-UCH-L1 when CCCP induced cell damage, 5,000 HeLa cells were used for 96-well E-plate for xCELLigence (Roche Applied Science), a real-time cell analyzer. Put on. After 24 hours, cells were treated with CCCP of 0, 10 and 25 μM, and cell growth was observed by measuring every 30 minutes with xCELLigence, a real-time cell analyzer, with the impedance of electrical voltage and current. The sample was repeated three times.

그 결과, UCH-L1은 아니지만, NT-UCH-L1 및 K15/157R NT-UCH-L1를 발현하는 세포는 CCCP로 유도된 세포 사멸을 벗어났으므로, NT-UCH-L1는 CCCP로 유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제시한다(도 6b). 다른 미토콘드리아 손상 시약(복합체 저해제)인 로테논으로 유도된 세포 사멸에 대한 NT-UCH-L1의 저항성은 CCCP의 그것보다 적었다(도 6d).
As a result, NT-UCH-L1 was not CCCP-induced damage because cells expressing NT-UCH-L1 and K15 / 157R NT-UCH-L1, but not UCH-L1, were free of CCCP-induced cell death. To protect cells from (FIG. 6B). The resistance of NT-UCH-L1 to cell death induced by rotenone, another mitochondrial damaging reagent (complex inhibitor), was less than that of CCCP (FIG. 6D).

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (9)

서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(N-terminal Truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, NT-UCH-L1)을 유효성분으로 포함하고, 미토콘드리아 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
N-terminal truncated Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (NT-UCH-L1), from which the N-terminus encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is removed, is included as an active ingredient. , Pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease, characterized in that it inhibits mitochondrial damage.
제 1항의 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 NT-UCH-L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하고, 미토콘드리아 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
A vector comprising a polynucleotide encoding NT-UCH-L1 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of claim 1, or a cell containing the vector as an active ingredient, characterized in that it inhibits mitochondrial damage Parkinson's disease prevention and treatment pharmaceutical composition.
삭제delete 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease according to claim 2, wherein the vector is a linear DNA, a plasmid DNA or a recombinant viral vector.
제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing and treating Parkinson's disease according to claim 4, wherein the recombinant virus is any one selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, and lentivirus. .
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NT-UCH-L1 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
3) NT-UCH-L1 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 파킨슨 병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
1) measuring the expression level of NT-UCH-L1 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in a sample derived from the subject as an experimental group;
2) comparing the NT-UCH-L1 protein expression level of step 1) with the NT-UCH-L1 protein expression level of a sample derived from a normal individual as a control; And
3) A protein detection method for providing information of Parkinson's disease diagnosis comprising the step of determining that the risk of developing Parkinson's disease when the amount of NT-UCH-L1 protein expression is reduced compared to the control.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 NT-UCH-L1 단백질 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
According to claim 6, NT-UCH-L1 protein expression amount encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of step 1) is Western blotting, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , Immunohistochemical staining (immunohistochemical staining), immunoprecipitation (immunoprecipitation) and immunofluorescence (immunofluorescence) by any one method selected from the group consisting of a protein detection method.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 NT-UCH-L1 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NT-UCH-L1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
1) treating the test compound or composition to a cell line expressing NT-UCH-L1 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
2) measuring the extent of NT-UCH-L1 protein expression in the treated cell line of step 1); And
3) A method for screening a candidate drug for treating Parkinson's disease comprising selecting a test compound or composition in which the amount of NT-UCH-L1 protein expression of step 2) is increased compared to a control cell line which has not been treated with the test compound or composition.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화된 NT-UCH-L1 단백질에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NT-UCH-L1 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 NT-UCH-L1 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
1) treating the test compound or composition to the NT-UCH-L1 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
2) measuring the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 1); And
3) Parkinson's disease therapeutic agent comprising the step of selecting the test compound or composition in which the activity of the NT-UCH-L1 protein of step 2) is increased compared to the activity of the NT-UCH-L1 protein untreated with the test compound or composition Screening methods for candidates.
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