KR101196481B1 - Chip for detecting c-reactive protein and preparing method of the same - Google Patents

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Abstract

본원은 C-반응성 단백질에 대한 감도가 우수하고, 금속 기재와 결합력이 향상된 분자각인층을 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.The present application relates to a chip for detecting a C-reactive protein and a method of manufacturing the same, comprising a molecular stamping layer having excellent sensitivity to the C-reactive protein and having improved binding to a metal substrate.

Description

Ｃ-반응성 단백질 검출용 칩 및 이의 제조 방법{CHIP FOR DETECTING C-REACTIVE PROTEIN AND PREPARING METHOD OF THE SAME}Chip for detecting C-reactive protein and its manufacturing method {CHIP FOR DETECTING C-REACTIVE PROTEIN AND PREPARING METHOD OF THE SAME}

본원은 클릭 화학을 이용하여 C-반응성 단백질에 대한 감도가 우수하고 금속 기재와 결합력이 향상된 분자각인층을 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
The present application relates to a chip for detecting C-reactive protein and a method for manufacturing the same, including a molecular imprinted layer having excellent sensitivity to C-reactive protein and improved binding ability using C-reactive protein.

의학, 또는 바이오 분야에 있어서 검출용 칩 또는 바이오 마커의 효용성은 순환기 질환(C-reactive protein), 알츠하이머 질환(b-amyloid and tau), 자가면역질환(anti-nuclear antibody (ANA)) 등과 같은 질환의 진단에 있어 매우 중요하며, 상기 언급한 검출용 칩 또는 바이오 마커는 조기에 질환을 감지하는 것을 가능하게 한다.The effectiveness of detection chips or biomarkers in medicine or biotechnology can be attributed to diseases such as C-reactive protein, Alzheimer's disease (b-amyloid and tau), and anti-nuclear antibody (ANA). Very important in the diagnosis of the above, the above-mentioned detection chip or biomarker makes it possible to detect the disease early.

일반적으로, 상기 검출용 칩에 사용되는 프로브(probe) 물질로는 단백질인 항체, 유기분자 또는 헥산 등이 사용되고 있다. 상기 언급한 프로브 물질 중 항체를 프로브로 이용하는 분석법은 고가이면서 항체의 활성을 유지하기 위하여 제작된 칩의 특별한 보관 방법이 필요하게 된다. In general, an antibody, an organic molecule, or hexane, which is a protein, is used as a probe material used in the detection chip. Assays using an antibody as a probe among the above-mentioned probe materials are expensive and require a special storage method of a manufactured chip to maintain the activity of the antibody.

이에, 프로브 물질로써 항체를 이용하지 않고 유기분자나 핵산을 이용한 프로브 제작에 많은 연구가 진행되었으며, 이 중 유기분자 프로브는 중금속이나 저분자 수준의 물질을 검출할 수 있는 센서에 많이 이용되고 있으며, DNA 또는 RNA 프로브를 이용하여 DNA 또는 단백질을 검출하는데 사용하고 있다. 그러나 이들 유기분자 프로브는 각각의 항원에 대해 제작이 어렵기 때문에 가격이 비싸며 기질 상에 고정화를 위해 중간체를 필요로 하는 단점이 있다. 이러한 유기분자 프로브 제작 연구의 일환으로 고분자를 이용하는 분자각인 방법이 알려지면서 1990년 이후 매우 활발히 연구가 이루어져 왔고, 당과 아미노산 유도체에 대하여 분자인식 고분자가 개발된 이후 지금까지 20 여 종 이상의 화합물에 대한 분자인식 고분자가 보고되고 있다. 이와 관련하여, 분자각인 될 수 있는 많은 고분자가 연구되고 개발되었지만, 고분자 층이 감지막 형태로 제작되기 위해서는 고체 기질 상에 고정될 필요가 있다. 일반적으로 고분자를 고체 기질상에 고정시키는 방법으로 스핀코팅(spin coating)방법이 많이 사용되고 있으나, 분자각인의 스핀코팅는 결합자리를 변형시킬 수 있기 때문에 감도를 저하시키는 요인으로 작용하는 문제점이 있다. Therefore, many studies have been conducted on the production of probes using organic molecules or nucleic acids without using antibodies as probe materials. Among them, organic molecule probes are widely used in sensors capable of detecting heavy metals or low molecular substances. Alternatively, it is used to detect DNA or protein using an RNA probe. However, these organic molecule probes are expensive because they are difficult to manufacture for each antigen, and have the disadvantage of requiring an intermediate for immobilization on a substrate. As part of the research on the manufacture of organic molecular probes, molecular imprinting methods using polymers have been known and have been actively studied since 1990. Since the molecular recognition polymers have been developed for sugar and amino acid derivatives, more than 20 kinds of compounds have been studied. Molecular recognition polymers have been reported. In this regard, many polymers that can be molecularly imprinted have been studied and developed, but the polymer layer needs to be immobilized on a solid substrate in order to be manufactured in the form of a sensing film. In general, a spin coating method is widely used as a method of fixing a polymer on a solid substrate. However, spin coating of the molecular imprinting may deform the bonding site, which causes a problem of lowering sensitivity.

한편, 자기조립 단분자층(self-assembled monolayers; SAMs) 상에 고정된 분자 수용체는 특히 생체분자(biomolecule)를 검출하기 위해 사용되고 단백질, DNA, 효소, 및 다른 생체분자를 검출하기 위한 유용한 바이오 분석(bioanalytical) 툴로 개발되었다. 분자 수용체로 표적 분자의 결합은 무표지(label-free), 실시간, 및 재사용할 수 있는 방법으로 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR) 또는 수정 진동 마이크로 밸런스(Quartz Crystal Microbalance; QCM)에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 복합 매트릭스(세포 용해물, 혈청, 및 피와 같은)에서 생체분자 검출은 센서 기재 상에서 비특이적 상호 작용 때문에 크게 제한된다. 비특이적 단백질은 바이오센서의 표면과 서로 작용하여 잘못된 양성 응답을 만들어 내고 미정제 생체수액(crude biological fluids)에서 분석물질(analytes)의 검출을 방해한다. 그러므로, 표면 화학에서 광범위한 연구는 생체분자의 검출에서 비특이적 흡착 작용을 극복하기 위해 과거 십 년 동안 수행되었다.On the other hand, molecular receptors immobilized on self-assembled monolayers (SAMs) are particularly useful for detecting biomolecules and useful bioanalytical for detecting proteins, DNA, enzymes, and other biomolecules. Developed as a tool. Binding of target molecules to molecular receptors is measured by Surface Plasmon Resonance (SPR) or Quartz Crystal Microbalance (QCM) in a label-free, real-time, and reusable manner. Can be. However, biomolecule detection in complex matrices (such as cell lysates, serum, and blood) is greatly limited because of nonspecific interactions on the sensor substrate. Nonspecific proteins interact with the surface of the biosensor to produce false positive responses and interfere with the detection of analytes in crude biological fluids. Therefore, extensive research in surface chemistry has been conducted in the past decade to overcome the nonspecific adsorption action in the detection of biomolecules.

C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP)은 단백질의 펜트락신군(pentraxin family) 계열의 일원이고, 각 서브유닛(subunit)에 대하여, 자연 특이적 단백질인, 포스포콜린(phosphocholine; PC)에 대한 특이적 결합 자리를 가지고 있다. 셀이 손상될 때, CRP는 인식 및 식균성 세표(phagocytotic) 면역 반응을 시작하는 PC 에 결합한다. 평형 투석 실험(Equilibrium dialysis experiment)은, Ca2 +의 존재 하에서, CRP가 한개/서브유닛의 발렌스(valence)로 1.6 × 105 M- 1 의 PC 와 결합 상수로 결합하는 것을 나타냈다. 면역 전자 현미경(Immunoelectron microscopy)은 모든 PC-결합 사이트가 CRP 오량체(pentamer)의 표면 상에 있고, 상기 분자의 면과 거의 수직이라는 것을 나타냈다. CRP는 혈액에서 발견되는 단백질로서, 그의 레벨은 염증(inflammation) (급성 병기 단백질(acute-phase protein))에 반응하여 증가하고, 주로 염증의 마커로서 사용된다. 건강한 인간 혈청에서 CRP의 표준 농도는 보통 10 mg/L 미만이다. 더 높은 레벨은 가벼운 염증 및 바이러스의 감염 (10-40 mg/L), 활동적 염증, 박테리아 감염 (40-200 mg/L), 심한 박테리아 감염 및 화상(burn) (>200 mg/L) 에서 발견된다. 최근 연구는 CRP의 상승된 기저 레벨을 가진 환자가 당뇨병, 고혈압 및 심장 혈관 질환의 증가된 위험에 있다고 제안한다. 이런 이유로, ELISA, 면역 탁도 측정법(immunoturbidimetry), 면역확산(immunodiffusion) 및 시각적 응집(visual agglutination)과 같은 다양한 분석 방법이 이미 이용 가능함에도 불구하고, CRP 검출 및 정량화를 위한 빠르고, 저비용이고, 정확한 방법이 요구된다.
C-reactive protein (CRP) is a member of the pentraxin family family of proteins and is a naturally specific protein for each subunit, phosphocholine (PC). Has a specific binding site for. When cells are damaged, CRP binds to the PC, which initiates a recognition and phagocytotic immune response. Equilibrium dialysis experiments (Equilibrium dialysis experiment) are, in the presence of Ca + 2, CRP is one / a Valens (valence) of the sub-unit 1.6 × 10 5 M - showed that the binding to binding PC with the first constant. Immunoelectron microscopy showed that all PC-binding sites are on the surface of the CRP pentamer and are nearly perpendicular to the face of the molecule. CRP is a protein found in the blood whose level increases in response to inflammation (acute-phase protein) and is mainly used as a marker of inflammation. The standard concentration of CRP in healthy human serum is usually less than 10 mg / L. Higher levels are found in mild and viral infections (10-40 mg / L), active inflammation, bacterial infections (40-200 mg / L), severe bacterial infections and burns (> 200 mg / L) do. Recent studies suggest that patients with elevated basal levels of CRP are at increased risk of diabetes, hypertension and cardiovascular disease. For this reason, fast, low-cost, accurate methods for CRP detection and quantification, although a variety of analytical methods such as ELISA, immunoturbidimetry, immunodiffusion, and visual agglutination are already available. Is required.

이에, 본원은, 클릭(click) 화학 반응을 이용하여, C-반응성 단백질에 대한 감도가 우수하고, 금속 기재와 결합력이 향상된 분자각인층을 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩 및 그의 제조 방법을 제공하고자 한다. Accordingly, the present application, using a click chemical reaction, the C-reactive protein detection chip and a manufacturing method comprising a molecular stamping layer having excellent sensitivity to the C-reactive protein, and improved adhesion to the metal substrate To provide.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the problem to be solved by the present application is not limited to the problem described above, another problem that is not described will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본원의 일 측면은, 금속 기재 상에 형성되며 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층; 및, 상기 고정층 상에 형성되며, R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 분자각인층을 포함하며, 상기 분자각인층에 포함된 상기 포스포콜린 기는 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응하도록 배향되어 있으며, 상기 고정층과 상기 분자각인층은 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인층의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 결합되는 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩을 제공한다.In order to achieve the above object, an aspect of the present application, a pinned layer formed on a metal substrate and having an azide or acetylene end group R 1 ; And formed on the pinned layer, wherein R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group, and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length And a phosphocholine group included in the molecular imprinting layer, and are oriented to correspond to a phosphocholine binding site of each molecule of the C-reactive protein. the stamped and fixing layer and the molecular layer is included in the R 2 R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and the molecular imprinting layer of said fixed bed Provided is a chip for detecting C-reactive protein, which is bound by a click chemical reaction therebetween.

본원의 다른 측면은, 상기 본원에 따른 C-반응성 단백질 검출용 칩을 포함하는, 표면 플라즈몬 공명 센서를 제공한다.Another aspect of the present application provides a surface plasmon resonance sensor comprising a chip for detecting the C-reactive protein according to the present application.

본원의 또 다른 측면은, 하기를 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법을 제공한다: Another aspect of the present application provides a method of manufacturing a chip for detecting C-reactive protein, comprising:

금속 기재 상에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층을 형성하는 단계; C-반응성 단백질과 R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하는 분자각인 물질을 혼합하여 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액을 형성하는 단계; 상기 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액에 상기 고정층이 형성된 금속 기재를 침지시켜, 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인 물질의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 금속 기재/고정층/분자각인 물질/C-반응성 단백질 복합체 층을 형성하는 단계; 및 상기 복합체 층으로부터 상기 C-반응성 단백질을 제거하여 분자각인층을 형성하는 단계.
Forming a fixed layer having an azide or acetylene end group R 1 on a metal substrate; Molecular imprinted material comprising a C-reactive protein and R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length Mixing to form a molecular imprinted substance / C-reactive protein mixture solution; Immersing a metal substrate in a fixed bed is formed in the molecular imprinted material / C- reactive protein mixture, the R 2 included in the R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and wherein the molecular imprinted material in the fixing layer Forming a metal substrate / fixed layer / molecular angle material / C-reactive protein complex layer by a click chemistry reaction therebetween; And removing the C-reactive protein from the complex layer to form a molecular imprinted layer.

본원에 의하여, 금속 기재와 결합력이 우수한 아지드(azide)-말단 자기조립단분자층을 형성하고, 상기 아지드(azide)-말단 자기조립단분자층 상에 클릭화학 반응을 이용하여 분자각인층을 형성함으로써, C-반응성 단백질에 대한 결합상수 등이 향상되어 검출 효과가 개선된 C-반응성 단백질 검출용 칩을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원의 상기 C-반응성 단백질 검출용 칩은 C-반응성 단백질에 대한 높은 결합상수를 나타냄으로써 저농도의 C-반응성 단백질도 검출가능하게 되어 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 혈청(serum) 내의 C-반응성 단백질의 농도도 측정가능하다. 또한, 상기 금속 기재 상에 형성된 상기 아지드(azide)-말단 자기조립단분자층은 그의 아지드 말단 기와 상기 분자각인층을 형성하는 분자각인 물질의 아세틸렌 기 사이의 클릭화학(click chemistry) 반응에 의해 각각 결합되어 효율적으로 상기 금속 기재 상에 분자각인층을 용이하게 고정시킬 수 있다. 또한, 본원에 따른 상기 C-반응성 단백질 검출용 칩은 항체를 사용하지 않는 점에서 종래 기술과 비교하여 제조 과정 및 사용 상 유리한 점을 가진다
According to the present invention, by forming an azide-end self-assembled monolayer having excellent bonding strength with a metal substrate, and forming a molecular imprinted layer on the azide-end self-assembled monolayer by using a click chemical reaction, The binding constant for the C-reactive protein may be improved to provide a chip for detecting the C-reactive protein with improved detection effect. More specifically, the C-reactive protein detection chip of the present application exhibits a high binding constant for the C-reactive protein, thereby making it possible to detect low concentrations of C-reactive protein, thereby using C in the serum using surface plasmon resonance. The concentration of reactive protein can also be measured. In addition, the azide-terminal self-assembled molecular layer formed on the metal substrate may be formed by a click chemistry reaction between its azide terminal group and an acetylene group of a molecular imprinting material forming the molecular imprinting layer. The molecular imprinting layer can be easily fixed to the metal substrate by being bonded. In addition, the C-reactive protein detection chip according to the present invention has an advantage in the manufacturing process and use compared to the prior art in that no antibody is used.

도 1은 본원의 일 구현예에 있어서, 11-아지도운데칸-1-티올(11-azidoundecane-1-thiol; azido-thiol) 및 6-프로파길옥시헥실포스포릴콜린(6-propargylhexylphosphorylcholine; propargyl-PC) 의 제조방법을 보여주는 화학식이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 있어서, C-반응성 단백질 검출용 칩을 제조하는 과정을 나타내는 공정도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 형성되는 표면 개질 각각에 대한 FT-IR 스펙트럼이다.
도 4는 대조용 폴리머(control polymer; CM), 분자각인 되지 않은 단분자층(moleculary non-imprinted monolayer) 및 분자각인 된 단분자층(moleculary imprinted monolayer) 각각과 C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP)의 농도의존적 결합을 나타내는 그래프이다.
도 5는 분자각인 되지 않은 단분자층 및 분자각인 된 단분자층 각각에 대한 C-반응성 단백질의 결합을 랑뮤어 등온 방정식에 따라 플롯(plot)한 그래프이다.
도 6은 분자각인 되지 않은 단분자층 및 분자각인 된 단분자층에 각각에 대한 C-반응성 단백질의 결합에 있어서, 유리(free) 포스포콜린의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 대조용 폴리머, 분자각인 되지 않은 단분자층 및 분자각인 된 단분자층 각각과 혈청 내의 C-반응성 단백질의 결합을 나타낸 그래프이다.
도 8은 복합체 메트릭스 중의 C-반응성 단백질과의 결합에 대한 유리 포스포콜린의 효과를 나타낸 그래프이다.1 is, according to one embodiment of the present application, 11-azidooundecan-1-thiol (11-azidoundecane-1-thiol; azido-thiol) and 6-propargyloxyhexylphosphorylcholine (6-propargylhexylphosphorylcholine; propargyl- Is a chemical formula showing the process for the preparation of PC).
2 is a flowchart illustrating a process of manufacturing a chip for detecting a C-reactive protein according to one embodiment of the present application.
3 is an FT-IR spectrum for each surface modification formed in accordance with an embodiment of the present disclosure.
4 shows the control polymer (CM), the molecular non-imprinted monolayer and the molecular imprinted monolayer, respectively, and the C-reactive protein (CRP). A graph showing concentration dependent binding.
FIG. 5 is a graph plotting the binding of C-reactive proteins to each of the unmolecular imprinted monolayers and the molecularly imprinted monolayers according to the Langmuir isothermal equation.
FIG. 6 is a graph showing the effect of free phosphocholine on the binding of C-reactive protein to each of the unmolecular imprinted monolayer and the unmolecular imprinted monolayer.
FIG. 7 is a graph showing the binding of C-reactive protein in serum with a control polymer, a non-molecular imprinted monolayer and a molecular imprinted monolayer.
8 is a graph showing the effect of free phosphocholine on binding to C-reactive protein in the complex matrix.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, which will be readily apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments and examples described herein. In the drawings, parts irrelevant to the description are omitted in order to clearly describe the present invention, and like reference numerals designate like parts throughout the specification.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when an element is referred to as "including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
As used herein, the terms "about", "substantially", and the like, are used at, or in close proximity to, numerical values when manufacturing and material tolerances inherent in the meanings indicated are provided to aid the understanding herein. In order to prevent the unfair use of unscrupulous infringers.

본원의 일 측면에 따른, C-반응성 단백질 검출용 칩은, 금속 기재 상에 형성되며 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층; 및, 상기 고정층 상에 형성되며, R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 분자각인층을 포함하며, 상기 분자각인층에 포함된 상기 포스포콜린 기는 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응하도록 배향되어 있으며, 상기 고정층과 상기 분자각인층은 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인층의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 결합되는 것이다.In accordance with an aspect of the present disclosure, a chip for detecting a C-reactive protein may include: a fixed layer formed on a metal substrate and having an azide or acetylene end group R 1 ; And formed on the pinned layer, wherein R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group, and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length And a phosphocholine group included in the molecular imprinting layer, and are oriented to correspond to a phosphocholine binding site of each molecule of the C-reactive protein. the stamped and fixing layer and the molecular layer is included in the R 2 R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and the molecular imprinting layer of said fixed bed It is bound by a click chemical reaction between them.

예시적 구현예에 있어서, 상기 고정층의 말단기 R1이 아지드기인 경우, 상기 분자각인층의 R2는 아세틸렌기이고, 상기 고정층의 말단기 R1이 아세틸렌기인 경우, 상기 분자각인층의 R2는 아지드기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In an exemplary embodiment, when the terminal group R 1 of the fixed layer is an azide group, R 2 of the molecular imprinting layer is an acetylene group, and when the terminal group R 1 of the fixed layer is an acetylene group, R of the molecular imprinting layer 2 may be an azide group, but is not limited thereto.

본원에서 센싱하고자 하는 타겟 물질은 C-반응성 단백질로서, 상기 C-반응성 단백질은 혈액 속에서 관찰되는 단백질 중 하나이다. 상기 C-반응성 단백질은 염증이 존재할 경우 증가하게 되므로, 주로 염증의 마커로서 사용될 수 있다. 상기 C-반응성 단백질의 생리학적인 기능은 C1Q 복합체(항원+항체)를 통하여 보체계를 활성화시키기 위해 죽거나 죽어가는 세포(그리고 박테리아의 일부 타입)의 표면 상에 나타나는 포스코콜린을 묶는 역할을 하며 C-반응성 단백질은 CRP의 수용기를 발현하는 대식세포의 식균작용을 높인다. 상기 C-반응성 단백질 각 분자는 5개 포스포콜린 기와 특이적으로 결합할 수 있는 결합자리(binding site)를 가진다. The target substance to be sensed herein is a C-reactive protein, which is one of the proteins observed in the blood. Since the C-reactive protein increases in the presence of inflammation, it can be mainly used as a marker of inflammation. The physiological function of the C-reactive protein acts to bind poscocholine that appears on the surface of dying or dying cells (and some types of bacteria) to activate the complement system through the C1Q complex (antigen + antibody). Proteins increase the phagocytosis of macrophages that express receptors of CRP. Each molecule of the C-reactive protein has a binding site capable of specifically binding to five phosphocholine groups.

이에, 본원에 따른 상기 C-반응성 단백질 검출용 칩에 있어서 상기 분자각인층의 말단은, 상기 포스포콜린 기 5개가 상기 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응하도록 배향된다.Thus, in the chip for detecting the C-reactive protein according to the present application, the terminal of the molecular imprinting layer is that the 5 phosphocholine groups are the phosphocholine binding sites of each molecule of the C-reactive protein (C-reactive protein). binding site).

예시적 구현예에 있어서, 상기 고정층은 표면에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고분자층, 자기조립단분자층 또는 마이카(mica) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 고분자층, 자기조립단분자층 또는 마이카(mica)는 상기 금속 기재 상에 티올기를 통하여 고정되며, 그의 표면은 아지드 또는 아세틸렌기를 가지거나 또는 적절한 표면 처리에 의하여 그의 표면이 아지드 또는 아세틸렌기를 가지도록 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In an exemplary embodiment, the pinned layer may be a polymer layer, a self-assembled monolayer or a mica having an azide or acetylene end group R 1 on the surface, but is not limited thereto. For example, the polymer layer, self-assembled monolayer or mica is fixed on the metal substrate through a thiol group, the surface of which has an azide or acetylene group or its surface is azide or by appropriate surface treatment It may be modified to have an acetylene group, but is not limited thereto.

상기 고분자층은 상기 금속 기재 상에 티올 기와 같은 작용기를 통하여 고정되고 그의 표면에 아지드 또는 아세틸렌기를 가지는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 고분자층은 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌글리콜아민, 에틸렌글리콜티올, NHS(Nhydroxysuccinimide)-에틸렌글리콜, 말레이미드-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, 말레이미드-폴리에틸렌글리콜, 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머 및 이들의 조합을 포함하여 형성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The polymer layer may be used without particular limitation as long as the polymer layer is fixed on the metal substrate through a functional group such as a thiol group and has an azide or acetylene group on the surface thereof. For example, the polymer layer may be polyacrylate, polymethacrylate, ethylene glycol amine, ethylene glycol thiol, NHS (Nhydroxysuccinimide) -ethylene glycol, maleimide-ethylene glycol, polyethylene glycol amine, polyethylene glycol thiol, (NHS) Polyethylene glycol, maleimide- polyethylene glycol, carbohydrate may be formed, including, but not limited to, polymers based on unit bonds.

예시적 구현예에 있어서, 상기 자기조립단분자층은 HS-Y-R1 (여기서, R1은 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, Y는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In an exemplary embodiment, the self-assembled monolayer may be formed including HS-YR 1 , wherein R 1 represents an azide or acetylene end group, and Y represents a spacer group having a length of 0.1 nm to 5 nm. However, it is not limited thereto.

일 구현예에 있어서, 상기 자기조립단분자층 형성을 위한 상기 HS-Y-R1 에 있어서 상기 스페이서 기 Y는 이중결합, 삼중결합 및 방향족 고리 중 하나 이상을 포함할 수 있는 탄소수 1 내지 30의 탄화수소기 또는 옥시탄화수소기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 스페이서 기 Y는 이중결합, 삼중결합 및 방향족 고리 중 하나 이상을 포함할 수 있는 탄소수 1 내지 30, 또는 탄소수 1 내지 25, 또는 탄소수 1 내지 20, 또는 탄소수 1 내지 15의 탄화수소기 또는 옥시탄화수소기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에 있어서, 상기 스페이서 기 Y는 이중결합, 삼중결합 및 방향족 고리 중 하나 이상을 포함할 수 있는 탄소수 1 내지 30, 또는 탄소수 1 내지 25, 또는 탄소수 1 내지 20, 또는 탄소수 1 내지 15의 알킬렌기 또는 알킬렌옥사이드 (예: 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌옥사이드기 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 자기조립단분자층은 아지도-C1 - 30알킬렌-1-티올(azido-C1 -30alkylene -1-thiol), 아세틸렌-C1 - 30알킬렌-1-티올 또는 프로파길옥시-C1 - 30알킬렌-1-티올을 포함하여 형성된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment, in the HS-YR 1 for forming the self-assembled monolayer, the spacer group Y is a hydrocarbon group or oxy of 1 to 30 carbon atoms which may include one or more of a double bond, a triple bond and an aromatic ring. It may be a hydrocarbon group, but is not limited thereto. For example, the spacer group Y is a hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, or 1 to 25 carbon atoms, or 1 to 20 carbon atoms, or 1 to 15 carbon atoms which may include one or more of a double bond, a triple bond, and an aromatic ring. Or an oxyhydrocarbon group, but is not limited thereto. In one embodiment, the spacer group Y has 1 to 30 carbon atoms, or 1 to 25 carbon atoms, or 1 to 20 carbon atoms, or 1 to 15 carbon atoms which may include one or more of a double bond, a triple bond and an aromatic ring. It may be an alkylene group or an alkylene oxide (eg, polyethylene oxide, polypropylene oxide group, etc.), but is not limited thereto. E.g, The self-assembling monolayer is azido -C 1 - 30 alkylene-1-thiol (azido-C 1 -30 alkylene -1 -thiol), acetylenic -C 1 - 30 alkylene-1-thiol or propargyl oxy -C 1, but it will be formed, including 30 alkylene-1-thiol, but is not limited thereto.

예시적 구현예에서, 상기 금속 기재의 재료는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 C-반응성 단백질 검출용 칩 제조를 위해 통상적으로 사용되는 것이라면 제한없이 사용가능하다. 예를 들어, 상기 금속 기재는 금, 은, 구리, 또는 팔라듐으로 이뤄진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 금(Au)으로 이루어진 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In an exemplary embodiment, the material based on the metal is not particularly limited and may be used without limitation as long as it is conventionally used for manufacturing a chip for detecting C-reactive protein in the art. For example, the metal substrate may be made of gold, silver, copper, or palladium, and more preferably, may be made of gold (Au), but is not limited thereto.

예시적 구현예에 있어서, 상기 분자각인층은 R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에 있어서, 상기 분자각인층은 아세틸렌-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린, 프로파길옥시-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린 (propargyloxy-C1-30alkylene-phosphorylcholine) 또는 아지도-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린 (azido-C1 -30alkylene-phosphorylcholine) 을 포함하여 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In an exemplary embodiment, the molecular imprinted layer is R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length It may be formed to include, but is not limited thereto. In one embodiment, the molecular imprinting layer is acetylene -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline, propargyl oxy -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline (propargyloxy-C 1-30 alkylene-phosphorylcholine ) or azido -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline (azido-C 1 -30 alkylene- phosphorylcholine) , but may be formed, including, without being limited thereto.

상기 언급한 바와 같이, 티올기 등과 같은 금속과 결합가능한 작용기를 통하여 상기 금속 기재에 고정된 아지드(azide) 또는 아세틸렌-말단 자기조립단분자층을 형성하고, 상기 아지드 또는 아세틸렌-말단 자기조립단분자 층 상에 분자각인층을 클릭화학 반응에 의해 형성함으로써, 상기 금속 기재 상에 분자각인층의 고정이 용이하고, C-반응성 단백질에 대한 결합상수 등이 향상되어 검출 효과가 개선된 C-반응성 단백질 검출용 칩을 제조할 수 있다. 이에, 본원의 상기 C-반응성 단백질 검출용 칩은 C-반응성 단백질에 대한 높은 결합상수를 나타냄으로써 저농도의 C-반응성 단백질도 검출 가능하게 되어 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 혈청(serum) 내의 C-반응성 단백질의 농도도 측정가능하다. 또한, 상기 클릭화학(click chemistry) 반응은 pH-독립적이고, 매우 빠르고 효율적인 반응이어서 상기 금속 기재 상에 분자각인층을 용이하고 효율적으로 고정시킬 수 있다. 이에 따라, 본원에 있어서, 항체를 사용하지 않고 C-반응성 단백질 검출용 칩을 용이하게 제조할 수 있다.As mentioned above, an azide or acetylene-terminated self-assembled monolayer fixed to the metal substrate is formed through a functional group bondable with a metal such as a thiol group, and the azide or acetylene-terminated self-assembled molecule By forming a molecular imprinted layer on the layer by a click chemical reaction, it is easy to fix the molecular imprinted layer on the metal substrate, the binding constant for the C-reactive protein is improved, and the C-reactive protein with improved detection effect A chip for detection can be manufactured. Thus, the C-reactive protein detection chip of the present application exhibits a high binding constant for the C-reactive protein, thereby enabling the detection of low concentrations of C-reactive protein, thereby making it possible to detect C-reactivity in serum using surface plasmon resonance. Protein concentrations can also be measured. In addition, the click chemistry reaction is pH-independent, very fast and efficient so that the molecular imprinting layer can be easily and efficiently fixed on the metal substrate. Accordingly, in the present application, a chip for detecting a C-reactive protein can be easily manufactured without using an antibody.

본원의 다른 측면에 따른 C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법은 하기를 포함할 수 있다:According to another aspect of the present invention, a method for preparing a chip for detecting a C-reactive protein may include the following:

금속 기재 상에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층을 형성하는 단계; C-반응성 단백질과 R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하는 분자각인 물질을 혼합하여 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액을 형성하는 단계; 상기 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액에 상기 고정층이 형성된 금속 기재를 침지시켜, 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인 물질의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 금속 기재/고정층/분자각인 물질/C-반응성 단백질 복합체 층을 형성하는 단계; 및 상기 복합체 층으로부터 상기 C-반응성 단백질을 제거하여 분자각인층을 형성하는 단계.Forming a fixed layer having an azide or acetylene end group R 1 on a metal substrate; Molecular imprinted material comprising a C-reactive protein and R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length Mixing to form a molecular imprinted substance / C-reactive protein mixture solution; Immersing a metal substrate in a fixed bed is formed in the molecular imprinted material / C- reactive protein mixture, the R 2 included in the R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and wherein the molecular imprinted material in the fixing layer Forming a metal substrate / fixed layer / molecular angle material / C-reactive protein complex layer by a click chemistry reaction therebetween; And removing the C-reactive protein from the complex layer to form a molecular imprinted layer.

예시적 구현예에서, 상기 고정층의 말단기 R1이 아지드기인 경우 상기 분자각인 물질의 R2는 아세틸렌기이고, 상기 고정층의 말단기 R1이 아세틸렌기인 경우 상기 분자각인 물질의 R2는 아지드기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In an exemplary embodiment, if the terminal groups R 1 of the fixed-bed azide R 2 of the molecule imprinting substance when group is an acetylene group, and the end of the fixed bed short R 1 is an acetylene group of the molecular imprinted materials R 2 is O It may be a tick, but is not limited thereto.

예시적 구현예에 있어서, 상기 고정층은 표면에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고분자층, 자기조립단분자층 또는 마이카(mica) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In an exemplary embodiment, the pinned layer may be a polymer layer, a self-assembled monolayer or a mica having an azide or acetylene end group R 1 on the surface, but is not limited thereto.

상기 제조 방법은, 상기 복합체 층 형성 후에, 상기 분자각인 물질과 결합되지 않은 상기 고정층 부분에 프로파길 알콜을 반응시키는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The manufacturing method may further include, but is not limited to, reacting propargyl alcohol in a portion of the fixed layer that is not bonded with the molecular imprinting material after the composite layer is formed.

예시적 구현예에 있어서, 상기 제조 방법은, 상기 고정층이 형성된 금속 기재를 침지시키기 전에, 상기 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액을 예비 배양시켜 상기 분자각인 물질로부터 유래된 5개 포스포콜린 기들이 상기 C-반응성 단백질 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응되도록 배향시키는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In an exemplary embodiment, the preparation method comprises five phosphocholines derived from the molecular imprinting material by pre-culturing the molecular immobilized material / C-reactive protein mixed solution before immersing the metal substrate on which the fixed layer is formed. Orienting groups to correspond to the phosphocholine binding site of each molecule of the C-reactive protein may further include, but is not limited to.

예시적 구현예에 있어서, 상기 분자각인 물질과 상기 C-반응성 단백질은 당량비가 5 : 1이 되도록 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 C-반응성 단백질 각 분자는 5개의 포스포콜린 기와 결합할 수 있는 포스포콜린 결합 부위을 가지므로, 상기한 바와 같은 당량비로 상기 분자각인 물질과 상기 C-반응성 단백질을 혼합하여 반응시키거나 또는 예비 배양시키는 경우, 상기 분자각인 물질이 상기 C-반응성 단백질의 포스포콜린 결합 부위에 결합됨으로써 상기 분자각인 물질이 가지는 포스포콜린 기들이 상기 C-반응성 단백질의 포스포콜린 결합 부위에 대응되도록 배향될 수 있다.In an exemplary embodiment, the molecular inscription material and the C-reactive protein may be mixed to have an equivalent ratio of 5: 1, but are not limited thereto. For example, each molecule of the C-reactive protein has a phosphocholine binding site capable of binding to five phosphocholine groups, and thus reacts by mixing the molecular imprinted substance and the C-reactive protein in an equivalent ratio as described above. Or the pre-culture, the molecular imprinting substance is bound to the phosphocholine binding site of the C-reactive protein so that the phosphocholine groups of the molecular imprinting material are attached to the phosphocholine binding site of the C-reactive protein. May be oriented to correspond.

상기 본원의 일 측면에 따른 C-반응성 단백질 검출용 칩에 관하여 기재된 내용은 본원의 C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법에 대하여도 모두 적용되며, 편의를 위하여 중복기재를 생략한다.The information described about the chip for detecting C-reactive protein according to an aspect of the present application is also applicable to the method for manufacturing the chip for detecting the C-reactive protein of the present application, and duplicated descriptions are omitted for convenience.

본원의 또 다른 측면은, 상기 언급한 C-반응성 단백질 검출용 칩을 포함하는, 표면 플라즈몬 공명 센서를 제공한다. 또한, 상기 표면 플라즈몬 공명 센서는 상기 언급한 C-반응성 단백질 검출용 칩 및 이의 제조 방법에 관하여 기재된 모든 내용이 적용되며, 편의를 위하여 중복기재를 생략한다.
Another aspect of the present application provides a surface plasmon resonance sensor, comprising the above-mentioned C-reactive protein detection chip. In addition, the surface plasmon resonance sensor is applied to all the contents described with respect to the above-mentioned C-reactive protein detection chip and its manufacturing method is applied, and duplicated description is omitted for convenience.

이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present application is not limited thereto.

<사용한 물질들><Used materials>

화학적 합성을 위한 모든 시약들은 Sigma-Aldrich Chemical사 로부터 구입되었고 추가 정제 없이 사용되었다. 인간 혈장 및 모든 버퍼 성분들 또한 Sigma-Aldrich Chemical사 로부터 구입되었다. CRP-네가티브 인간 혈청(N-혈청)은 Cenogenics 사(Morganville, USA)로부터 구입된 CRPA Latex Test Set의 성분을 사용하였다. 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, HyClone(R)는 Thermo Scientific사(Rochester, USA) 로부터 구입되었다. 1H (400MHz) 및 13C (100MHz) NMR 스펙트럼은 Bruker Spectrospin 400 을 이용하여 측정되었다. FT-IR 스펙트럼은 Thermo Nicolet IR 분광계(모델: IR380)에 의해 측정되었고, FT-IR/ATR (Attenuated Total Reflection, 감쇠 전반사) 측정을 위해, 질소 퍼지된 챔버가 구비된 Thermo Nicolet iS10 FT-IR 분광계가 사용되었다. 전자분무(electrospray) 이온화 질량 분광법은 Waters Micromass ZQ (MM1) 질량 분광계 상에서 수행되었다. SPR 측정은 K-MAC 사 (Daejeon, Korea) 로부터 구입된 SPR LAB을 이용하여 수행되었다. 또한, SPR LAB에 사용된 금-코팅된 수정(quartz) 칩은 K-MAC 사로부터 구입되었다.
All reagents for chemical synthesis were purchased from Sigma-Aldrich Chemical and used without further purification. Human plasma and all buffer components were also purchased from Sigma-Aldrich Chemical. CRP-negative human serum (N-serum) used the components of the CRPA Latex Test Set purchased from Cenogenics (Morganville, USA). Phosphate buffered saline (PBS, HyClone (R) was purchased from Thermo Scientific, Rochester, USA.) 1H (400 MHz) and 13C (100 MHz) NMR spectra were measured using a Bruker Spectrospin 400. IR spectra were measured by a Thermo Nicolet IR spectrometer (model: IR380) and used by the Thermo Nicolet iS10 FT-IR spectrometer with a nitrogen purged chamber for ttenuated total reflection (FT-IR / ATR) measurements. Electrospray ionization mass spectrometry was performed on a Waters Micromass ZQ (MM1) mass spectrometer SPR measurements were performed using SPR LAB purchased from K-MAC (Daejeon, Korea). The gold-coated quartz chips used in were purchased from K-MAC.

[[ 제조예Manufacturing example 1]  One]

11-11- 아지도운데칸Azidoundekan -1--One- 티올의Thiol 합성 synthesis

11-브로모-1-데카놀(1g, 3.98mmol; 11-bromo-1-undecanol), 소듐 아지드(285mg, 4.38mmol; sodium azide) 및 요오드화물칼륨(potassium iodide)은 에탄올 중에 용해되었고, 20 시간 동안 환류되었다. 상기 용액 중 용매는 감압 하에서 제거되었고 상기 용액 중 잔류물은 디에틸 에테르 중에 용해되었다. 상기 에테르 중에 용해된 잔류 혼합물은, 물에 의해 세정 처리되었고, 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조되었고, 상기 용매는 감압 하에서 제거되었고, 상기 용매 제거에 의해 생성된 미정제 생성물은 실리칼 겔(Rf = 0.3, hexane:EtOAc=5:1) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 1(868 mg, 102.2%)을 수득하였다(IR: 3332, 2924, 2853, 2091; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.57 (t, 2H, OCH2), 3.32 (s, 1H, OH), 3.25 (t, 2H, N3CH2), 1.57 (m, 4H, HOCH2CH2(CH2)7CH2), 1.28 (m, 14H, HOCH2CH2(CH2)7); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ62.4, 51.4, 32.6, 29.5, 29.4, 29.1, 28.8, 26.7, 25.7; exact mass calcd for C11H23N3O: 213.18, found: 236 [M+Na]+).11-bromo-1-decanol (1 g, 3.98 mmol; 11-bromo-1-undecanol), sodium azide (285 mg, 4.38 mmol; sodium azide) and potassium iodide were dissolved in ethanol, Reflux for 20 hours. The solvent in the solution was removed under reduced pressure and the residue in the solution was dissolved in diethyl ether. The residual mixture dissolved in the ether was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure, and the crude product produced by the solvent removal was a silica gel (R f). = 0.3, hexane: EtOAc = 5: 1), which was purified by column chromatography to give Compound 1 (868 mg, 102.2%) (IR: 3332, 2924, 2853, 2091; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) ) δ 3.57 (t, 2H, OCH 2 ), 3.32 (s, 1H, OH), 3.25 (t, 2H, N 3 CH 2 ), 1.57 (m, 4H, HOCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 CH 2 ), 1.28 (m, 14H, HOCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 62.4, 51.4, 32.6, 29.5, 29.4, 29.1, 28.8, 26.7, 25.7; exact mass calcd for C 11 H 23 N 3 O: 213.18, found: 236 [M + Na] + ).

상기 화합물 1 (868mg, 4.09mmol), 메탄설포닐 클로라이드 (1.26g, 11.0mmol) 및 트리에틸아민 (2.44g, 24.1mmol)는 THF 중에 용해되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 얼음물의 첨가 후에, 상기 혼합물 중 유기상(organic phase)은 상기 혼합물 중 수상으로부터 분리되었고, 상기 수상은 디에틸 에테르에 의해 2회 추출되었다. 다음에, 상기 유기상은 1M HCl, 탈이온수, 및 포화된 중탄산나트륨에 의해 세정처리 되었다. 상기 유기상은 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조시킨 후에, 상기 유기상의 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그에 의해 형성된 미정제 생성물은 실리칼 겔 (Rf = 0.4, hexane:EtOAc=5:1) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 2 (1.17g, 98.2%)를 수득하였다(IR: 2925, 2854, 2092, 1180; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 4.21 (t, 2H, OCH2), 3.26 (t. CH2N3), 3.00 (s, 3H, CH3S), 1.74 (m, 2H, OCH2CH2), 1.59(m, 2H, CH2CH2N3) 1.39-1.18 (m, 14H, OCH2CH2(CH2)7); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ70.4, 51.4, 37.1, 29.4, 29.3, 29.11, 29.10, 29.0, 28.8, 26.7, 25.4; exact mass calcd for C12H25N3O3S: 291.16, found: 314 [M+Na]+).Compound 1 (868 mg, 4.09 mmol), methanesulfonyl chloride (1.26 g, 11.0 mmol) and triethylamine (2.44 g, 24.1 mmol) were dissolved in THF. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After addition of ice water, the organic phase in the mixture was separated from the water phase in the mixture and the water phase was extracted twice with diethyl ether. The organic phase was then washed with 1M HCl, deionized water, and saturated sodium bicarbonate. After the organic phase was dried over anhydrous magnesium sulphate, the solvent of the organic phase was removed under reduced pressure, and the crude product formed thereby had a silica gel (R f). = 0.4, hexane: EtOAc = 5: 1) purified by column chromatography to give compound 2 (1.17 g, 98.2%) (IR: 2925, 2854, 2092, 1180; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) ) δ 4.21 (t, 2H, OCH 2 ), 3.26 (t. CH 2 N 3 ), 3.00 (s, 3H, CH 3 S), 1.74 (m, 2H, OCH 2 CH 2 ), 1.59 (m, 2H , CH 2 CH 2 N 3 ) 1.39-1.18 (m, 14H, OCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ70.4, 51.4, 37.1, 29.4, 29.3, 29.11, 29.10, 29.0, 28.8, 26.7, 25.4; exact mass calcd for C 12 H 25 N 3 O 3 S: 291.16, found: 314 [M + Na] + ).

상기 화합물 2 (1.17 mg, 4.01 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트 (917 mg, 8.03 mmol)는 90 mL DMF 중에 용해되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 1 시간 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물 중 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 상기 반응 혼합물 중 잔류물은 디에틸 에테르 중에 용해되었다. 상기 잔류물로 이루어진 유기상은, 물에 의해 세정처리 되었고, 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조되었고, 상기 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그에 의해 형성되는 미정제 생성물은 실리칼 겔 (Rf =0.7, hexane:EtOAc=9:1) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 3 (831 mg, 76.4%)을 수득하였다(IR: 2924, 2853, 2092, 1690; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.25 (t, 2H, CH2N3), 2.85 (t, 2H, SCH2), 2.31 (s, 3H, CH2CO), 1.57 (m, 4H, SCH2CH2(CH2)7CH2), 1.35-1.27 (m, 14H, SCH2CH2(CH2)7); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ195.8, 51.4, 30.6, 29.5, 29.4, 29.15, 29.11, 28.86, 28.81, 26.7; exact mass calcd for C13H25N3OS: 271.17, found: 294 [M+Na]+).Compound 2 (1.17 mg, 4.01 mmol) and potassium thioacetate (917 mg, 8.03 mmol) were dissolved in 90 mL DMF. The reaction mixture was stirred at rt for 1 h. The solvent in the reaction mixture was removed under reduced pressure and the residue in the reaction mixture was dissolved in diethyl ether. The organic phase consisting of the residue was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure, and the crude product formed thereby was a silica gel (R f). = 0.7, hexane: EtOAc = 9: 1) purified by column chromatography to give compound 3 (831 mg, 76.4%) (IR: 2924, 2853, 2092, 1690; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) ) δ 3.25 (t, 2H, CH 2 N 3 ), 2.85 (t, 2H, SCH 2 ), 2.31 (s, 3H, CH 2 CO), 1.57 (m, 4H, SCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 CH 2 ), 1.35-1.27 (m, 14H, SCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 195.8, 51.4, 30.6, 29.5, 29.4, 29.15, 29.11, 28.86, 28.81, 26.7; exact mass calcd for C 13 H 25 N 3 OS: 271.17, found: 294 [M + Na] + ).

상기 화합물 3 (588 mg, 2.17mmol)은 40 ml 메탄올 및 2 ml 진한 HCl 중에 용해되었고 상기 반응 혼합물은 3 시간 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 물에 의해 급랭(quench)되었고 상기 반응 혼합물 중 수상은 디에틸 에테르에 의해 2회 추출되었다. 상기 반응 혼합물중 유기상은 물에 의해 세정처리 되었고, 무수 마그네슘 설페이트에 위에서 건조시켰다. 상기 유기상의 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그에 의해 형성된 미정제 생성물은 실리칼 겔 (Rf = 0.8, hexane:EtOAc=9:1) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 4 (471 mg, 94.6%)을 수득하였다(IR: 2923, 2852, 2090; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.25 (t, 2H, CH2N3), 2.51 (q, 2H, SCH2), 1.60 (m, 4H, SCH2CH2(CH2)7CH2), 1.35-1.28 (m, 15H, HSCH2CH2(CH2)7); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ51.4, 34.1, 29.5, 29.1, 29.0, 29.8, 28.4, 26.7, 24.6).
The compound 3 (588 mg, 2.17 mmol) was dissolved in 40 ml methanol and 2 ml concentrated HCl and the reaction mixture was stirred for 3 hours. The reaction mixture was quenched with water and the aqueous phase in the reaction mixture was extracted twice with diethyl ether. The organic phase in the reaction mixture was washed with water and dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent of the organic phase was removed under reduced pressure, and the crude product formed thereby was purified by silica gel (R f). = 0.8, hexane: EtOAc = 9: 1) purified by column chromatography to give compound 4 (471 mg, 94.6%) (IR: 2923, 2852, 2090; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 3.25 (t, 2H, CH 2 N 3 ), 2.51 (q, 2H, SCH 2 ), 1.60 (m, 4H, SCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 CH 2 ), 1.35-1.28 (m, 15H, HSCH 2 CH 2 (CH 2 ) 7 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 51.4, 34.1, 29.5, 29.1, 29.0, 29.8, 28.4, 26.7, 24.6).

[[ 제조예Manufacturing example 2] 2]

6-프로파길헥실포스포릴콜린(프로파길-6-propargylhexylphosphorylcholine (propargyl- 포스포릴콜린Phosphorylcholine )의 합성) Synthesis of

DMF (20 ml) 중에 1,6-헥산디올 (3g, 25.4 mmol)의 용액을 얼음 조(bath) 상에서 DMF (20 ml) 중 소듐 하이드라이드 (1.52 g, 38.1 mmol)의 서스펜션 안으로 적가하며 첨가하고, 얼음 조 조건에서 30분 동안 교반하였다. DMF (20 ml) 중 프로파길 브로마이드 (5.7 g, 38.1 mmol)가 상기 혼합물에 첨가되었고, 그리고 나서 상온에서 20 시간 동안 교반되었다. 상기 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그 미정제 생성물은 디에틸 에테르 중에 용해되었다. 상기 혼합물은 물에 의해 세정 처리되었고, 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조되고, 실리칼 겔 (Rf = 0.5, hexane/EtOAc=1:1) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 5 (1.80 g, 45.4%) 를 수득하였다( IR: 3373, 3292, 2933, 2858, 1093; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ4.13(s, 2H, HCCCH2O), 3.59 (t, 2H, CH2OH), 3.52 (t, 2H, CH2OCH2), 3.03 (s, 1H, CH2OH), 2.48 (s, 1H, HCCCH2O), 1.58 (m, 4H, OCH2CH2CH2CH2CH2), 1.38 (m, 4H, OCH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 79.8, 74.3, 70.0, 62.3, 57.9, 32.5, 29.3, 25.8, 25.5; exact mass calcd for C9H16O2: 156.12, found: 179 [M+Na]+).A solution of 1,6-hexanediol (3 g, 25.4 mmol) in DMF (20 ml) was added dropwise into a suspension of sodium hydride (1.52 g, 38.1 mmol) in DMF (20 ml) on an ice bath And stirred for 30 minutes under ice conditions. Propargyl bromide (5.7 g, 38.1 mmol) in DMF (20 ml) was added to the mixture and then stirred at room temperature for 20 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the crude product dissolved in diethyl ether. The mixture was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulphate and silica gel (R f). = 0.5, purified by column chromatography on hexane / EtOAc = 1: 1) to give compound 5 (1.80 g, 45.4%) (IR: 3373, 3292, 2933, 2858, 1093; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ4.13 (s, 2H, HCCCH 2 O), 3.59 (t, 2H, CH 2 OH), 3.52 (t, 2H, CH 2 OCH 2 ), 3.03 (s, 1H, CH 2 OH), 2.48 ( s, 1H, HCCCH 2 O), 1.58 (m, 4H, OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ), 1.38 (m, 4H, OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 79.8, 74.3, 70.0, 62.3, 57.9, 32.5, 29.3, 25.8, 25.5; exact mass calcd for C 9 H 16 O 2 : 156.12, found: 179 [M + Na] + ).

화합물 5 (600 mg, 3.84 mmol), 2-클로로-1,3,2-디옥사포스포란2-옥사이드 (1.09 g, 7.68 mmol) 및 트리에틸아민 (777 mg, 7.68 mmol)이 30 ml DCM 중에 용해되었다. 상기 반응 혼합물은 암실 조건에서 상온에서 72 시간 동안 교반되었다. 상기 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그 미정제 생성물은 실리칼 겔 (Rf = 0.3, hexane/EtOAc=1:4) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 화합물 6 (700 mg, 69.5%)을 수득하였다.Compound 5 (600 mg, 3.84 mmol), 2-chloro-1,3,2-dioxaphosphorane2-oxide (1.09 g, 7.68 mmol) and triethylamine (777 mg, 7.68 mmol) in 30 ml DCM Dissolved. The reaction mixture was stirred for 72 hours at room temperature under dark conditions. The solvent was removed under reduced pressure and the crude product was a silica gel (R f = 0.3, hexane / EtOAc = 1: 4), which was purified by column chromatography to give compound 6 (700 mg, 69.5%).

화합물 6 (700 mg, 2.66 mmol) 및 트리메틸아민 (1.57 g, 26.6 mmol)는 8 ml 아세토니트릴 중에 용해되었다. 상기 반응 혼합물은 60℃ 에서 20 시간 동안 교반되었다. 상기 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 그 미정제 생성물은 실리칼 겔 (클로로포름 : 메탄올 2:1 및 클로로포름 : 메탄올 : 물 50:50:4, Rf = 0.2) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 상기 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고 상기 잔류물은 무수 클로로포름 중에 용해에 여과시켜, 화합물 7 (411 mg, 48.1%)을 수득하였다(IR: 3350, 3296, 2936, 2860, 1086, 1059; 1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 4.28(m, 2H, POCH2CH2N+), 4.15(d, 2H, HCCCH2O), 3.90(q, 2H, CH2CH2CH2OP), 3.69(m, 2H, POCH2CH2N+), 3.54 (t, 2H, HCCCH2OCH2), 3.27 (s, 9H, N+(CH3)3), 2.85 (t, 1H, HCCCH2O), 1.64 (m, 4H, OCH2CH2CH2CH2CH2), 1.44 (m, 4H, OCH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ79.7, 74.8, 69.6, 65.5, 59.0, 57.4, 53.5, 30.4, 29.2, 25.6, 25.3; exact mass calcd for C14H28NO5P: 321.17, found: 322 [M+H]+).
Compound 6 (700 mg, 2.66 mmol) and trimethylamine (1.57 g, 26.6 mmol) were dissolved in 8 ml acetonitrile. The reaction mixture was stirred at 60 ° C. for 20 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the crude product was purified by silica gel (chloroform: methanol 2: 1 and chloroform: methanol: water 50: 50: 4, R f = 0.2) on column chromatography. The solvent was removed under reduced pressure the residue was filtered, dissolved in dry chloroform, compound 7 (411 mg, 48.1%) to give the (IR: 3350, 3296, 2936 , 2860, 1086, 1059; 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 4.28 (m, 2H, POCH 2 CH 2 N + ), 4.15 (d, 2H, HCCCH 2 O), 3.90 (q, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 OP), 3.69 (m, 2H, POCH 2 CH 2 N + ), 3.54 (t, 2H, HCCCH 2 OCH 2 ), 3.27 (s, 9H, N + (CH 3 ) 3 ), 2.85 (t, 1H, HCCCH 2 O), 1.64 (m, 4H, OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ), 1.44 (m, 4H, OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ79.7, 74.8, 69.6, 65.5, 59.0, 57.4, 53.5, 30.4, 29.2, 25.6, 25.3; exact mass calcd for C 14 H 28 NO 5 P: 321.17, found: 322 [M + H] + ).

[[ 실시예Example 1] One]

SPRSPR 칩의 표면 개질 Chip surface modification

SPR 칩의 표면 개질을 위한 전체적인 스킴은 도 2에 나타냈다. 아지드(N3)-말단 화합물을 가진 자기조립단분자층 (self assembled monolayers; SAMs)을 제조하기 위해, SPR 칩 (15 mm × 15 mm × 10 mm)은 상온에서 12 시간 동안 11-아지도운데칸-1-티올 (도 2)의 2 mM 에탄올성 용액 (20 ml) 중에 침지되었다. 기재는 에탄올로 수차례 완전히 세정되었고, 그리고 나서 N2 가스 하에서 건조시켰다. 클릭 반응의 프리-테스트로서, 금 기재 (5 mm × 5 mm × 1 mm)는 위에서 기술된 동일한 방식으로 11-아지도운데칸-1-티올로 코팅되었고, 1 ml PBS 중 1 μmol 프로파길-포스포릴콜린 (도 2), 0.5 μmol 황산구리 (II)?5수화물 및 1 μmol 아스코르빈산나트륨을 포함하는 반응 혼합물 중에 4℃ 에서 16 시간 동안 위치시켰다. The overall scheme for surface modification of SPR chips is shown in FIG. 2. In order to prepare self assembled monolayers (SAMs) with azide (N 3 ) -terminated compounds, SPR chips (15 mm × 15 mm × 10 mm) were subjected to 11-azidoundane- for 12 hours at room temperature. Immerse in 2 mM ethanol solution (20 ml) of 1-thiol (FIG. 2). The substrate was washed several times with ethanol and then dried under N 2 gas. As a pre-test of the click reaction, the gold substrate (5 mm × 5 mm × 1 mm) was coated with 11-azidoundecan-1-thiol in the same manner described above and 1 μmol propargyl-force in 1 ml PBS It was placed at 4 ° C. for 16 hours in a reaction mixture containing forylcholine (FIG. 2), 0.5 μmol copper (II) sulfate pentahydrate and 1 μmol sodium ascorbate.

분자각인 된 단분자층(moleculary imprinted monolayer; MIM)을 준비하기 위해, 3.32 nmol 프로파길 포스포릴콜린(phosphorylcholine; PC)은 얼음 조에서 30분 동안, 1 ml 바인딩 버퍼 (0.1 M Tris/HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8.0) 중 0.66 nmol C-반응성 단백질(c-reactive protein; CRP)(프로파길 포스포릴콜린 : CRP 5:1의 몰 비)로 예비 배양되었다. 클릭 화학반응 중 하나인, 1,3-쌍극자 고리 부가반응(1,3-dipolar cycloaddition reaction)은 1.66 nmol 구리 설페이트 (II)?수화물, 3.32 nmol 아스코르빈산나트륨 및 4℃에서 16 시간 동안 예비 배양된 상기 프로파길 포스포릴콜린-CRP 복합체를 포함하는 20 ml PBS 버퍼 용액에, 11-아지도운데칸-1-티올의 자기조립단분자층으로 코팅된 SPR 칩을 위치시킴으로써 수행되었다. 상기 프로파길 포스포릴콜린 : 황산구리 : 아스코르빈산나트륨의 몰 비는 1:0.5:1이었다. To prepare a molecularly imprinted monolayer (MIM), 3.32 nmol propargyl phosphorylcholine (PC) was placed in an ice bath for 30 minutes in 1 ml binding buffer (0.1 M Tris / HCl, 150 mM NaCl). , 5 mM CaCl 2 , pH 8.0) were pre-cultured with 0.66 nmol C-reactive protein (CRP) (mole ratio of propargyl phosphorylcholine: CRP 5: 1). One of the click chemistries, the 1,3-dipolar cycloaddition reaction, was pre-incubated for 16 hours at 1.66 nmol copper sulfate (II)? Hydrate, 3.32 nmol sodium ascorbate, and 4 ° C. In a 20 ml PBS buffer solution containing the propargyl phosphorylcholine-CRP complex, the SPR chip was coated with a self-assembled monolayer of 11-azidodecane-1-thiol. The molar ratio of propargyl phosphorylcholine: copper sulfate: sodium ascorbate was 1: 0.5: 1.

분자각인 되지 않은 단분자층(non-imprinted monolayer)을 준비하기 위해, CRP가 상기 반응 혼합물에 첨가되지 않는 것을 제외하고, 모든 단계들은 상기 분자각인 된 단분자층에서와 동일하게 수행되었다. 상기 반응이 완전히 끝난 후에, 상기 표면은 차가운 PBS에 의해 완전히 세정 처리되었고, N2 가스 하에서 건조되었다.In order to prepare a non-imprinted monolayer, all steps were performed in the same manner as in the molecular imprinted monolayer, except that no CRP was added to the reaction mixture. After the reaction was complete, the surface was thoroughly cleaned by cold PBS and dried under N 2 gas.

상기 클릭 반응에 관여하지 않았던 아지드 말단을 차단하기 위해, 프로파길 알콜이 또 다른 클릭 반응을 위해 상기 기재에 첨가되었다. 상기 기재는 20 μmol 프로파지 알콜, 10 μmol 황산구리 (II)?6수화물, 및 20 μmol 아스코르빈산나트륨을 포함하는 20 ml PBS 중에 상온에서 5 시간 동안, 침지되었다. To block azide ends that were not involved in the click reaction, propargyl alcohol was added to the substrate for another click reaction. The substrate was immersed for 5 hours at room temperature in 20 ml PBS containing 20 μmol propage alcohol, 10 μmol copper sulfate (II) hexahydrate, and 20 μmol sodium ascorbate.

대조용 폴리머(control polymer; CM)를 준비하기 위해, N3-말단 자기조립단분자층에 의해 코팅된 SPR 칩은 클릭 반응에 의해 프로파길 알콜에 의해 직접적으로 개질되었다. 프로파길 포스포릴콜린에 의해 코팅되지 않은 표면을 수득하였다. To prepare a control polymer (CM), the SPR chip coated by the N 3 -terminal self-assembled monolayer was modified directly with propargyl alcohol by a click reaction. A surface uncoated by propargyl phosphorylcholine was obtained.

상기 분자각인 된 단분자층으로부터 CRP를 제거하기 위해, 표면 개질된 SPR 칩 및 금 기재를 용리(elution) 버퍼 (0.1 M Tris/HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0에) 중에 상온에서 30분 동안 침지시켰다. 마지막으로 상기 기재는 탈이온수, 아세톤 및 에탄올로 완전히 세정되었고, N2 가스 하에서 건조시켰다.
To remove CRP from the imprinted monolayer, the surface modified SPR chip and gold substrate were subjected to 30 minutes at room temperature in elution buffer (0.1 M Tris / HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0). Soak. Finally the substrate was thoroughly washed with deionized water, acetone and ethanol and dried under N 2 gas.

FTFT -- IRIR 에 의한  On by SPRSPR 칩의 표면 특성 분석 Surface Characterization of Chips

FT-IR / ATR 스펙트럼은 스마트 SAGA (Smart Apertured Grazing Angle) 를 구비한 Thermo Nicolet iS10 FT-IR 분광계를 이용하여 단일 반사 모드에서 획득되었다. 상기 각 반응 단계에서 기능화된 금 표면의 IR 스펙트럼은 650-4000 cm-1 범위에서 수집되었다. 모든 스펙트럼은 512 스캔에 의해 평균화되었고 깨끗한 금 표면에 대하여 투과 모드로 보고되었다.
FT-IR / ATR spectra were acquired in single reflection mode using a Thermo Nicolet iS10 FT-IR spectrometer with Smart Apertured Grazing Angle (SAGA). IR spectra of the gold surface functionalized in each reaction step were collected in the range of 650-4000 cm −1 . All spectra were averaged by 512 scans and reported in transmission mode on a clean gold surface.

표면 surface 플라즈몬Plasmon 공명( resonance( SPRSPR ) 연구에 의한 By research CRPCRP 결합 분석 Binding analysis

각 기재에 대한 CRP 결합은 SPR LAB (K-MAC 사)에 의해 측정되었다. 상기 샘플 희석 및 용리는 유량 20 ml/min, 25℃ 에서 바인딩 버퍼에 의해 수행되었다. 상기 SPR 칩 상으로 CRP의 결합은, 바인딩 버퍼 중 100 pM 내지 400 nM의, 단백질 용액의 300 의 1회 주입에 의해 실행되었다. N-혈청은 바인딩 버퍼 중 2% 용액으로 희석되었다. BSA는 PBS 중 1% 용액으로 준비되었고, 바인딩 버퍼 중 10 mM 유리(free) 포스포콜린(f-phosphocholine)은 CRP의 포스포릴콜린 특이적 결합을 확인하는데 사용되었다. 단백질 결합은 공명 각도로 기록되었고, 입사 각도 변위(Δ°)로 보고되었다.
CRP binding to each substrate was measured by SPR LAB (K-MAC). The sample dilution and elution was performed with binding buffer at a flow rate of 20 ml / min, 25 ° C. Binding of CRP onto the SPR chip was performed by one injection of 300 of protein solution, 100 pM to 400 nM in binding buffer. N-serum was diluted with 2% solution in binding buffer. BSA was prepared as a 1% solution in PBS and 10 mM free f-phosphocholine in binding buffer was used to confirm phosphorylcholine specific binding of CRP. Protein binding was recorded at resonance angle and reported as incident angle displacement (Δ °).

SPRSPR 센서의 표면 특성 분석  Surface Characterization of Sensors

연속적 클릭 화학을 위하여 금 기재 표면 상에 아지드 기를 도입하기 위해, 금 기재를 상온에서 12 시간 동안 아지드-함유 티올인, 11-아지도운데칸-1-티올의 2 mM 에탄올성 용액에 침지시킴으로써 형성되었다. 상기 결과로 수득된 자기조립단분자층은 FT-IR/ATS에 의해 특성을 분석하였다. 상기 IR 스펙트럼에서, 자기조립단분자층의 특성 피크를 2850 cm-1 (대칭적 메틸 C-H 스트레칭), 2930 cm-1 (비대칭 메틸 C-H 스트레칭) 및 2090 cm-1 (비대칭 N3 스트레칭 모드)에서 관찰했다(도 3 b). In order to introduce an azide group onto the surface of the gold substrate for continuous click chemistry, the gold substrate was immersed in a 2 mM ethanol solution of 11-azidoundecan-1-thiol, an azide-containing thiol, at room temperature for 12 hours. Formed. The resulting self-assembled monolayers were characterized by FT-IR / ATS. In the IR spectrum, the characteristic peaks of the self-assembled monolayers were observed at 2850 cm −1 (symmetrical methyl CH stretching), 2930 cm −1 (asymmetric methyl CH stretching) and 2090 cm −1 (asymmetric N 3 stretching mode) ( 3 b).

상기 클릭 화학이 프로파길 포스포릴콜린에 의해 발생했다는 것을 확인하기 위해, 프로파길 포스포릴콜린 (1 mM)의 초과 몰 농도는 11-아지도운데칸-1-티올로 코팅된 금 기재를 포함하는 상기 반응 혼합물에 첨가되었다. 도 3c는 트리아졸의 4-사이트에서 초과량의 프로파길 포스포릴콜린에 의해 프로파길 포스포릴콜린이 치환된 금 기재의 IR 스펙트럼을 나타낸다. 상기 스펙트럼에서, 2090 cm- 1 에서 비대칭 N3 스트레칭 피크는 사라졌으며, 이는 상기 프로파길 포스포릴콜린의 표면 정착이 아지드 기 및 아세틸렌 기 사이에서 성공적인 커플링에 의해 형성된 것임을 보여준다. To confirm that the click chemistry was caused by propargyl phosphorylcholine, the excess molar concentration of propargyl phosphorylcholine (1 mM) was determined by including a gold substrate coated with 11-azidoundocan-1-thiol. Added to the reaction mixture. FIG. 3C shows the IR spectrum of a gold based substrate with propargyl phosphorylcholine substituted by excess propargyl phosphorylcholine at the 4-site of triazole. In the spectrum, 2090 cm - 1 in N 3 asymmetric stretch peak disappeared, indicating that the propargyl phosphoryl choline group and the surface of the fixing azide formed by the successful coupling between the acetylene group.

분자각인 되지 않은 단분자층(Click-NIM) 및 분자각인 된 단분자층(Click-MIM) 합성에서, 프로파길 포스포릴콜린의 몰 농도는 166 nM 이었고, IR 스펙트럼에서 2090 cm- 1 에서 비대칭 N3 스트레칭 피크가 없어지지 않았으며(도 3d 및 도 3e), 이는 상기 유리(free) N3 기가 표면 상에서 남아있었다는 것을 보여주었다. In the molecule are not imprinted monolayer (Click-NIM) and molecular imprinting a monolayer (Click-MIM) synthesis, Pro molar concentration of pagil phosphoryl choline was 166 nM, 2090 cm in the IR spectrum is asymmetric N 3 stretching peak at 1 3D and 3E), which is free N 3 It was shown that the group remained on the surface.

상기 유리 N3기의 활성 표면을 켄치(quench)하기 위해, 또 다른 클릭 반응이 차단제(blocking agent)인, 프로파길 알콜의 첨가가 수행되었다. 차단 반응 후에 대조용 폴리머(Blocking-CM), 분자각인 되지 않은 단분자층(Blocking-NIMM), 및 분자각인 된 단분자층(Blocking-MIM)의 IR 스펙트럼(도 3f, 도 3g 및 도 3h) 은 N3 그룹이 완전히 프로파길 알콜에 의해 보호되었다는 것을 보여주었으며, 이는 2090 CM- 1 에서의 상기 비대칭 N3 스트레칭 피크는 완전히 없어진 것으로 확인할 수 있었다. 2850 CM-1 (대칭 메틸 C-H 스트레칭) 및 2930 CM-1 (비대칭 메틸 C-H 스트레칭)에서의 피크는 상기 클릭 반응 후에도 보존되었다.
In order to quench the active surface of the free N 3 group, addition of propargyl alcohol, where another click reaction was a blocking agent, was performed. The IR spectra of the control polymer (Blocking-CM), the non-molecular imprinted monolayer (Blocking-NIMM), and the molecular imprinted monomolecular layer (Blocking-MIM) after the blocking reaction are shown in the N 3 group. It was shown that this was completely protected by propargyl alcohol, which confirmed that the asymmetric N 3 stretching peak at 2090 CM - 1 was completely gone. Peaks at 2850 CM- 1 (symmetric methyl CH stretch) and 2930 CM- 1 (asymmetric methyl CH stretch) were preserved even after the click reaction.

분자각인Molecular Imprinting 된  Done 단원자층으로In unit CRPCRP 의 결합 특성 분석Binding properties

SPR 기술은 금속에 흡착된 물질의 매우 얇은 층의 굴절률을 측정하기 위한 광학적 방법이다. 용액 중에 표적 분자와 상기 칩 표면 상에 고정된 분자 수용체 사이에서 결합의 정도는 반사율 변화를 모니터링함으로써 용이하게 관찰되고 정량화된다. 상기 SPR 기술의 장점 중 하나는 상기 표적 분자 또는 수용체 분자에 대해 라벨링(labeling)을 사용하지 않고서 높은 감도를 나타내는 것이다. 상기 개질된 금 표면 상으로 CRP의 결합을 연구하기 위해 SPR을 이용하였다. SPR technology is an optical method for measuring the refractive index of a very thin layer of material adsorbed on a metal. The degree of binding between the target molecule in solution and the molecular receptor immobilized on the chip surface is readily observed and quantified by monitoring the change in reflectance. One of the advantages of the SPR technique is its high sensitivity without the use of labeling for the target molecule or receptor molecule. SPR was used to study the binding of CRP onto the modified gold surface.

본원에서 사용된 시스템, SPR LAB (K-MAC 사)에서, 반사율은 광 빔의 입사 각도의 함수로서 측정된다. 코팅된 금 센서 표면에 대하여, 각도 변화는 상기 코팅된 표면에 결합된 ~10 pg/mm2 의 단백질에 해당하는 약 1 millidegree의 해상도로 측정된다. SPR 시스템에 대한 분석은 공명 각도의 변화에 의해 측정되었고, 이는 상기 센서 표면에 결합된 분석 물질(analyte)의 양과 연관되었다. 정상-상태 SPR 신호에서와 차이는 입사각도변위(Δ°)로서 정의되는데, 이는 흡착된 단백질의 질량에 비례한다 (0.1°≒ 1 ng/mm2). 상기 입사각도변위는 버퍼로 5 분간 세정한 후에 입사 각도와 단백질 주입 이전 입사 각도에 의해 계산된다. In the system used herein, SPR LAB (K-MAC), the reflectance is measured as a function of the angle of incidence of the light beam. For the coated gold sensor surface, the angular change is measured at a resolution of about 1 millidegree corresponding to ˜10 pg / mm 2 protein bound to the coated surface. The analysis for the SPR system was measured by the change in the angle of resonance, which was associated with the amount of analyte bound to the sensor surface. The difference from the steady-state SPR signal is defined as the incident angle displacement (Δ °), which is proportional to the mass of adsorbed protein (0.1 ° ≒ 1 ng / mm 2 ). The angle of incidence of displacement is calculated by the angle of incidence after washing with a buffer for 5 minutes and the angle of incidence before protein injection.

X-선 결정학 연구에 의하여, CRP의 직경은 12 nm 이었고, SPR 칩의 결합 영역이 28.9 mm 임을 알 수 있었다. 그러므로, 상기 SPR 칩의 전체 결합능력은 CRP의 분자량 115 kDa에 기초하여, 49 ng (=1.7 ng/mm2)로서 계산될 수 있다.According to X-ray crystallography studies, the diameter of the CRP was 12 nm and the binding area of the SPR chip was 28.9 mm. I could see that. Therefore, the overall binding capacity of the SPR chip can be calculated as 49 ng (= 1.7 ng / mm 2 ), based on the molecular weight of 115 kDa of the CRP.

도 4는 금 기재, 대조용 폴리머(control polymer; CM), 분자각인 되지 않은 단분자층(NIM), 및 분자각인 된 단분자층(MIM) 각각에 대하여 C-반응성 단백질(CRP)의 결합에 의한 SPR 시그널을 나타낸다. 대조용 폴리머의 경우, CRP 결합은 관찰되지 않았다. 분자각인 된 단분자층(MIM)의 경우에서, 상기 CRP 의 결합은 CRP 농도, 10 nM 에서 포화된 경우의 결합에 비하여 거의 절반이었고, CRP 농도 100 nM 에서부터 결합은 거의 포화상태에 이르렀다. 분자각인 되지 않은 단분자층(NIM)에서, 100 nM 농도까지는 CRP 와의 결합이 관찰되지 않았고, 200 nM 에서부터 400 nM 까지 CRP 결합이 급격하게 증가하였다. 분자각인 되지 않은 단분자층 및 분자각인 된 단분자층 각각에 대한 CRP의 농도-의존적 결합은, 포스포릴콜린이 성공적으로 클릭 화학에 의해 상기 금 표면 상에 도입되었다는 것을 보여주었고, 분자각인 된 단분자층 및 분자각인 되지 않은 단분자층 각각에 대한 CRP의 결합 능력을 제공했음을 알 수 있었다. 그리고, 분자각인 되지 않은 단분자층과 CRP의 결합 간에 어떤 비-특이적 결합이 없다면, 총 CRP 결합능력 (결합 사이트의 수)은 분자각인 된 단분자층보다 분자각인 되지 않은 단분자층에서 더 높은 것으로 보일 가능성이 있었다. FIG. 4 shows SPR signals by binding of C-reactive protein (CRP) to gold substrate, control polymer (CM), non-molecular imprinted monolayer (NIM), and molecular imprinted monolayer (MIM), respectively. Indicates. For control polymers, no CRP binding was observed. In the case of the molecular imprinted monolayer (MIM), the binding of the CRP was almost half that of the CRP concentration at 10 nM, and the binding was almost saturated at the CRP concentration of 100 nM. In the non-molecular imprinted monolayer (NIM), no binding to CRP was observed up to 100 nM concentration, and CRP binding increased rapidly from 200 nM to 400 nM. Concentration-dependent binding of CRP to each of the non-molecular imprinted monolayers and the molecularly immobilized monolayers showed that phosphorylcholine was successfully introduced on the gold surface by click chemistry, It was found that the binding capacity of CRP was provided to each unmolecule layer. And, if there was no non-specific binding between the unmolecular imprinted monolayer and the CRP binding, the total CRP binding capacity (number of binding sites) was likely to appear higher in the non-molecular imprinted monolayer than the molecular imprinted monolayer. .

랑뮤어 흡착 모델을 사용하여, 분자각인 되지 않은 단분자층 및 분자각인 된 단분자층 각각과 CRP 간의 결합 상수와 최대 결합능력(Rmax)을 계산하였다. 도 4에서 나타난 CRP 농도와 각도 변위의 상관 관계는 하기 반응식, 수정된 랑뮤어 방정식 모델로서 표현되었다:Using the Langmuir adsorption model, the binding constant and maximum binding capacity (R max ) between each unmolecular imprinted monolayer and the immobilized monolayer were determined. The correlation of CRP concentration and angular displacement shown in FIG. 4 was expressed as the following scheme, a modified Langmuir equation model:

Figure 112010073415410-pat00001
Figure 112010073415410-pat00001

여기서 R은 평형에서 CRP 결합에 의해 초래된 입사 각도 변위, C는 CRP 농도, Rmax는 C가 무한대일 때 각도 변위이고, KA는 겉보기(apparent) 결합 상수이다. Where R is the incident angular displacement caused by CRP coupling at equilibrium, C is the CRP concentration, R max is the angular displacement when C is infinity, and K A is the apparent coupling constant.

상기 방정식 (1)에 따라 플롯(plot)한 결과, 그래프는 직선 형태를 보였고 절편(intercept)에 대한 기울기의 비율은 KA였다(도 5). 분자각인 된 단분자층과 CRP에 대한 KA의 값은 1.33 ×108 M- 1 로 결정되었다. 그러나, 분자각인 되지 않은 단분자층과 CRP 간의 결합은 랑뮤어 방정식을 따르지 않았으며, C 및 C/R 는 반비례 관계를 나타냈다. 상기 반비례 관계를 나타내는 이유는 정확하게 설명될 수 없지만, 그것은 분자각인 되지 않은 단분자층에 대한 CRP의 비-특이적 결합과 관련되는 것으로 생각되었다. When plotted according to Equation (1), the graph showed a straight line and the ratio of slope to intercept was K A (FIG. 5). A numerator value of K for the imprinted monolayer and CRP was 1.33 × 10 8 M - was determined to be 1. However, the binding between the unmolecular imprinted monolayer and CRP did not follow the Langmuir equation, and C and C / R showed an inverse relationship. The reason for exhibiting the inverse relationship cannot be explained precisely, but it was thought to be related to the non-specific binding of CRP to the unmolecular imprinted monolayer.

계산 상, SPR 칩 상에 CRP의 최대 커버리지는 49 ng이었다. 그러나, 100 nM CRP이 샘플 튜브 (100 nM = 12.0 ng/ml, 칩 표면 = 51.5 ml 의 버퍼 부피)로 주입되었을 때 샘플이 구동하는 동안 총 CRP 618 ng 이 칩 표면에 주입되었다. NIM 에 대한 CRP 결합이 100 nM 및 200 nM CRP 사이에서 시작했기 때문에, 상기 표면은 CRP 결합의 초기에 CRPs에 의해 완전히 커버될 수 있으며, 그리고 나서 단백질-단백질 인력(attraction)은 PC-특이적 흡착에 이어 NIM에 대한 CRP의 갑작스런 비-특이적 결합을 일으켰다. By calculation, the maximum coverage of CRP on the SPR chip was 49 ng. However, when 100 nM CRP was injected into the sample tube (100 nM = 12.0 ng / ml, chip surface = 51.5 ml buffer volume), a total of 618 ng CRP was injected to the chip surface while the sample was running. Since CRP binding to NIM started between 100 nM and 200 nM CRP, the surface can be completely covered by CRPs at the beginning of CRP binding, and then protein-protein attraction is PC-specific adsorption This resulted in a sudden non-specific binding of CRP to NIM.

상기 MIM의 Rmax 는, 1 ng ≒Δ0.1°의 가정 하에서, 4 ng/mm2 CRP 결합 및 SPR 칩 표면의 계산된 최대 커버리지의 8% 에 해당하는 0.014°로 계산되었다.
The R max of the MIM was calculated to be 0.014 °, corresponding to 8% of the calculated maximum coverage of the 4 ng / mm 2 CRP bond and the SPR chip surface, under the assumption of 1 ng ≒ Δ0.1 °.

유리 Glass 포스포콜린Phosphocholine 효과 effect

분자 수용체에 대한 CRP의 특이적 결합이 발생하는지에 대하여 조사하기 위하여, 유리 포스포콜린(fPC) 효과가 연구되었다. 분자각인 된 단분자층에 대하여, 200 nM CRP 및 10 mM fPC 을 포함하는 300 ㎕ 바인딩 버퍼 샘플의 두 세트가 준비되었고, 한 샘플은 예비 배양 없이 직접적으로 주입되었고, 다른 샘플은 상온에서 15분 예비 배양 뒤에 주입되었다. 도 6은 분자각인 된 단분자층 및 분자각인 되지 않은 단분자층에 CRP 결합의 fPC 효과의 결과를 나타낸다. 상기 샘플 주입에서 입사 각도의 빠른 감소는 단지 fPC (데이터 미도시)의 효과 때문이었으며, 이는 칼슘-Fpc 이온성 화합물의 형태로 상기 표면으로부터 칼슘 이온의 박탈(deprivation)에 의해 야기될 수 없다. CRP 및 fPC의 예비 배양이 없는 경우, 상기 입사 각도 변위 (0. 007°)는 분자각인 된 단분자층에서 관찰되었고, CRP 결합의 양은 분자각인 된 단분자층 결합능력의 표준 곡선(도 4, y = 0.0016ln(x) + 0.0368)에 따라 8.2 nM CRP 주입에 해당되었으며, 분자각인 된 단분자층에 대한 Rmax (0.014)의 거의 절반이었다. 상기 샘플이 예비 배양되었을 때, 분자각인 된 단분자층 상에서 결합은 관찰되지 않았다. 이것은 fPC이 샘플의 예비 배양 동안에 CRP와 복합체를 형성했다는 것을 의미하고, 상기 fPC-CRP 복합체는 분자각인 된 단분자층 표면 상에서 상기 분자 수용체에 결합할 수 없다. 그러나, fPC-CRP의 예비 배양이 없는 경우, CRP는 부분적으로 PC 수용체 사이트에 결합할 수 있다. 상기 결과는 분자각인 된 단분자층에 대한 CRP 결합이 분자 각인 및 클릭 화학에 의해 합성된 상기 분자 수용체에 매우 특이적인 것을 보여주었다. 15 분 예비 배양을 거친 상기 CRP-fPC 용액이 분자각인 되지 않은 단분자층에 주입되었을 때, 상기 결합은 0.004° 각도 변위로서 관찰되었다. 이 결과는 도 4에 나타낸 관계에 따른 분자각인 되지 않은 단분자층 에 대한 CRP 결합이 비-특이적 결합에 부분적으로 기인되며, 이는 포스포릴콜린에 대한 CRP의 결합 사이트가 샘플에서 fPC에 의해 차단되었을 때 분자각인 되지 않은 단분자층 표면으로 흡착이 발생하기 때문인 것으로 판단된다.To investigate whether specific binding of CRP to molecular receptors occurs, the free phosphocholine (fPC) effect was studied. For the molecular imprinted monolayers, two sets of 300 μL binding buffer samples containing 200 nM CRP and 10 mM fPC were prepared, one sample was injected directly without preincubation, and the other sample was after 15 minutes preincubation at room temperature. Injected. 6 shows the results of the fPC effect of CRP binding on the molecularly imprinted monolayer and the non-molecular imprinted monolayer. The rapid reduction of the angle of incidence in the sample injection was only due to the effect of fPC (data not shown), which cannot be caused by deprivation of calcium ions from the surface in the form of calcium-Fpc ionic compounds. In the absence of pre-culture of CRP and fPC, the incident angular displacement (0.007 °) was observed in the molecular imprinted monolayer, and the amount of CRP binding was the standard curve of the molecular imprinted monolayer binding capacity (Fig. 4, y = 0.0016ln). (x) + 0.0368), corresponding to 8.2 nM CRP injection, almost half of the R max (0.014) for the imprinted monolayer. When the sample was preincubated, no binding was observed on the imprinted monolayer. This means that fPC formed a complex with CRP during the preliminary culture of the sample, and the fPC-CRP complex was unable to bind the molecular receptor on the imprinted monolayer. However, in the absence of preculture of fPC-CRP, CRP can partially bind to the PC receptor site. The results showed that CRP binding to the imprinted monolayer is very specific for the molecular receptor synthesized by molecular imprinting and click chemistry. When the CRP-fPC solution after 15 min preculture was injected into a monomolecular layer that was not imprinted with the molecule, the bond was observed as a 0.004 ° angular displacement. This result is in part due to non-specific binding of CRP binding to the unmolecular monolayer, according to the relationship shown in FIG. 4, when the binding site of CRP to phosphorylcholine was blocked by fPC in the sample. It is considered that the adsorption occurs on the surface of the monomolecular layer which is not imprinted with molecules.

분자각인 되지 않은 단분자층에서 랑뮤어 등온 모델을 따르지 않는 도 5에 나타낸 랑뮤어 등온선 연구의 결과와 함께 고려될 때, 포스포릴콜린 수용체- 조정 특이적 결합뿐 아니라, 상기 포스포릴콜린 수용체를 통하지 않는 비-특이적 결합이 분자각인 되지 않은 단분자층에 대한 CRP 결합에 상당히 포함되었다고 판단된다.
Considered with the results of the Langmuir isotherm study shown in FIG. 5, which does not follow the Langmuir isotherm model in unmolecular imprinted monolayers, not only phosphorylcholine receptor-regulated specific binding, but also non-phosphorylcholine receptors It is believed that -specific binding is significantly involved in CRP binding to unmolecular imprinted monolayers.

SPRSPR 칩의 선택성  Chip selectivity

본원에서 합성된 분자 수용체(분자각인 물질)의 결합 선별성을 연구했다. 2% N-혈청이 주입되었고, 상기 표면이 안정화 되고 나서 200 nM CRP의 주입이 이어졌다. CM 및 분자각인 되지 않은 단분자층에 대하여, 상기 CRP 결합은 2% N-혈청이 상기 표면을 덮은 후에는 발생하지 않았다. 그러나, 분자각인 된 단분자층에서, 200 nM (0.020°) 및 400 nM (0.032°) CRP에 의한 입사 각도 변위는 2% N-혈청이 표면을 덮은 후에도 관찰되었다(도 7). 이 결과는 분자각인 된 단분자층 표면 상의 상기 분자 수용체가 다른 혈청 단백질에 의해 대체되지 않았다는 것을 의미한다. 도 4에서, 농도 의존적 CRP 결합 곡선은 입사 각도 변위가 200 nM CRP 에서 0.013 및 400 nM CRP에서 0.014 이었다는 것을 나타내었다. 각도 변위의 차이는 다음과 같은 측정 조건의 차이에 기인했다 : 1) 2% N-혈청은 단백질-단백질 상호 작용에 의한 분자 수용체로의 CRP의 결합 상태의 안정성을 향상시켰고, 상기 표면으로부터 결합한 CRP의 세정에 의한 제거를 감소시켰다, 2) 300 ㎕ 2% N-혈청 (70 mg/ml 오리지날 혈청 단백질 농축을 기반으로) 중 혈청 단백질의 ~420 ㎍ 인, 단백질의 많은 양의 주입에 의해 초래되는 기기편차(instrumental deviation). N-혈청 단백질의 존재 하에서 SPR 칩으로 CRP의 포스포릴콜린-특이적 결합을 확인하기 위해, 10 mM fPC은 상기 샘플 용액(2% N-혈청 + 200 nM CRP) 에 처리되었고, 15분 동안 예비 배양되었다. 샘플 주입 전에, 1% BSA가 혈청 중 많은 양의 단백질에 의해 비-특이적 결합으로부터 보호하기 위해, 상기 표면에 주입되었다. 도 8은, 혈청 단백질이 상기 분자 수용체에 동시 처리되었을지라도, fPC이 분자각인 된 단분자층에 대한 CRP 결합을 완전히 억제했다는 것을 보여준다. 이것은 CRP 및 N-혈청 혼합물에 의하여 분자각인 된 단분자층 에서 관찰된 입사 각도 변위가 다른 단백질의 비-특이적 결합으로부터가 아니고, CRP-수용체 결합으로부터 발생되었다는 것을 의미한다. 2% 혈청 및 200 nM CRP가 동시 처리되었을 때, 각도 변위 0.026°가 관찰되었다 (도 8). 그 결과로서, 혈청 단백질 중 CRP는 수용체에 특이적으로 결합하고, 인간 혈청 중 CRP의 검출에 적용할 수 있다.
The binding selectivity of the molecular receptor (molecular phosphorus substance) synthesized here was studied. 2% N-serum was injected, followed by injection of 200 nM CRP after the surface had stabilized. For CM and unmolecular imprinted monolayers, the CRP binding did not occur after 2% N-serum covered the surface. However, in the molecular imprinted monolayer, the incident angle shift by 200 nM (0.020 °) and 400 nM (0.032 °) CRP was observed even after 2% N-serum covered the surface (FIG. 7). This result means that the molecular receptor on the surface of the imprinted monolayer was not replaced by another serum protein. In FIG. 4, the concentration dependent CRP binding curves showed that the incident angular displacements were 0.013 at 200 nM CRP and 0.014 at 400 nM CRP. The difference in angular displacement was due to the difference in measurement conditions as follows: 1) 2% N-serum improved the stability of the binding state of CRP to molecular receptors by protein-protein interactions, and the CRP bound from the surface Removal by washing of 2) caused by injection of large amounts of protein, ˜420 μg of serum protein in 300 μl 2% N-serum (based on 70 mg / ml original serum protein concentration) Instrumental deviation. To confirm phosphorylcholine-specific binding of CRP to the SPR chip in the presence of N-serum protein, 10 mM fPC was treated in the sample solution (2% N-serum + 200 nM CRP) and preliminary for 15 minutes. Incubated. Prior to sample injection, 1% BSA was injected on the surface to protect against non-specific binding by a large amount of protein in serum. 8 shows that fPC completely inhibited CRP binding to the imprinted monolayer of molecules even though serum proteins were co-treated with the molecular receptor. This means that the incident angle shift observed in the monolayer imprinted with CRP and N-serum mixture was not from non-specific binding of other proteins but from CRP-receptor binding. When 2% serum and 200 nM CRP were co-treated, an angular displacement of 0.026 ° was observed (FIG. 8). As a result, CRP in serum proteins specifically binds to receptors and can be applied to the detection of CRP in human serum.

상기에서는 본원의 바람직한 구현예 및 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.Although described above with reference to preferred embodiments and examples of the present application, those skilled in the art to which the present invention pertains without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the claims below. It will be understood that various modifications and changes can be made.

Claims (13)

금속 기재 상에 형성되며 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층; 및,
상기 고정층 상에 형성되며, R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 분자각인층을 포함하며,
상기 분자각인층에 포함된 상기 포스포콜린 기는 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응하도록 배향되어 있으며,
상기 고정층과 상기 분자각인층은 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인층의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 결합되는 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
A fixed layer formed on the metal substrate and having an azide or acetylene end group R 1 ; And,
Formed, including formed on the fixed bed, R 2 -X- phosphocholine (wherein, R 2 is azido or acetylene end denotes the short-term, X represents an spacer (spacer) of 0.1 nm to 5 nm in length) Including a molecular imprinted layer,
The phosphocholine group included in the molecular imprinting layer is oriented to correspond to the phosphocholine binding site of each molecule of the C-reactive protein,
The stamped and fixing layer and the molecular layer is included in the R 2 R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and the molecular imprinting layer of said fixed bed C-reactive protein detection chip, which is bound by a click chemical reaction between.
제 1 항에 있어서,
상기 고정층의 말단기 R1이 아지드기인 경우, 상기 분자각인층의 R2는 아세틸렌기이고, 상기 고정층의 말단기 R1이 아세틸렌기인 경우, 상기 분자각인층의 R2는 아지드기인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 1,
If the terminal groups R 1 of the fixed-bed azide group, R 2 of the molecule imprinting layer is an acetylene group, and when the end of the fixed bed short R 1 is an acetylene group, R 2 of the molecule imprinting layer is an azide group, C Reactive protein detection chip.
제 1 항에 있어서,
상기 고정층은 표면에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고분자층, 자기조립단분자층 또는 마이카(mica)인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 1,
The pinned layer is a polymer layer, self-assembled monolayer or mica having an azide or acetylene end group R 1 on the surface, C-reactive protein detection chip.
제 3 항에 있어서,
상기 자기조립단분자층은 HS-Y-R1 (여기서, R1은 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, Y는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서 기를 나타냄)을 포함하여 형성된 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 3, wherein
The self-assembled monolayer is formed by including HS-YR 1 (wherein R 1 represents an azide or acetylene end group, Y represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm length), C-reactive protein detection chip.
제 1 항에 있어서,
상기 금속 기재는 금, 은, 구리, 팔라듐 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 금속을 포함하는 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 1,
The metal substrate is gold, silver, copper, palladium and a chip selected from the group consisting of a combination thereof, C-reactive protein detection chip.
제 1 항에 있어서,
상기 분자각인층은 아세틸렌-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린, 프로파길옥시-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린 (propargyloxy-C1 -30alkylene-phosphorylcholine) 또는 아지도-C1 - 30알킬렌-포스포릴콜린 (azido-C1 -30alkylene-phosphorylcholine) 을 포함하여 형성된 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 1,
Layer imprinting the acetylene molecule is -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline, propargyl oxy -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline (propargyloxy-C 1 -30 alkylene- phosphorylcholine) or azido -C 1 - 30 alkylene-phosphoryl choline (azido-C 1 -30 alkylene- phosphorylcholine) which will, C- reactive protein detection chips formed including.
제 4 항에 있어서,
상기 자기조립단분자층은 아지도-C1 - 30알킬렌-1-티올(azido-C1 -30alkylene -1-thiol), 아세틸렌-C1 - 30알킬렌-1-티올 또는 프로파길옥시-C1 - 30알킬렌-1-티올을 포함하여 형성된 것인, C-반응성 단백질 검출용 칩.
The method of claim 4, wherein
The self-assembling monolayer is azido -C 1 - 30 alkylene-1-thiol (azido-C 1 -30 alkylene -1 -thiol), acetylenic -C 1 - 30 alkylene-1-thiol or propargyl oxy -C 1 - 30 alkylene-1-thiol of, C- reactive protein detection chip that is formed, including.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 C-반응성 단백질 검출용 칩을 포함하는, 표면 플라즈몬 공명 센서.
Surface plasmon resonance sensor comprising a chip for detecting C-reactive protein according to any one of claims 1 to 7.
금속 기재 상에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고정층을 형성하는 단계;
C-반응성 단백질과 R2-X-포스포콜린 (여기서, R2는 아지드 또는 아세틸렌 말단기를 나타내며, X는 0.1 nm 내지 5 nm 길이의 스페이서(spacer) 기를 나타냄)을 포함하는 분자각인 물질을 혼합하여 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액을 형성하는 단계;
상기 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액에 상기 고정층이 형성된 금속 기재를 침지시켜, 상기 고정층의 말단기 R1와 상기 분자각인 물질의 R2-X-포스포콜린에 포함된 R2 사이의 클릭(click) 화학 반응에 의하여 금속 기재/고정층/분자각인 물질/C-반응성 단백질 복합체 층을 형성하는 단계; 및
상기 복합체 층으로부터 상기 C-반응성 단백질을 제거하여 분자각인층을 형성하는 단계:
를 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법.
Forming a fixed layer having an azide or acetylene end group R 1 on a metal substrate;
Molecular imprinted material comprising a C-reactive protein and R 2 -X-phosphocholine, wherein R 2 represents an azide or acetylene end group and X represents a spacer group of 0.1 nm to 5 nm in length Mixing to form a molecular imprinted substance / C-reactive protein mixture solution;
Immersing a metal substrate in a fixed bed is formed in the molecular imprinted material / C- reactive protein mixture, the R 2 included in the R 2 -X- phosphocholine the end group R 1 and wherein the molecular imprinted material in the fixing layer Forming a metal substrate / fixed layer / molecular angle material / C-reactive protein complex layer by a click chemistry reaction therebetween; And
Removing the C-reactive protein from the complex layer to form a molecular imprinting layer;
Including, C-reactive protein detection chip manufacturing method.
제 9 항에 있어서,
상기 고정층의 말단기 R1이 아지드기인 경우 상기 분자각인 물질의 R2는 아세틸렌기이고, 상기 고정층의 말단기 R1이 아세틸렌기인 경우 상기 분자각인 물질의 R2는 아지드기인, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법.
The method of claim 9,
If the terminal groups R 1 of the fixed-bed azide group R 2 of the molecular imprinted material is an acetylene group, and the terminal groups R 1 is an acetylene group of the R 2 of the above fixed bed molecular imprinted material is an azide group, C- reactive Method for manufacturing a chip for protein detection.
제 9 항에 있어서,
상기 고정층은 표면에 아지드 또는 아세틸렌 말단기 R1를 가지는 고분자층, 자기조립단분자층 또는 마이카(mica)인, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법.
The method of claim 9,
The pinned layer is a polymer layer, a self-assembled monolayer or a mica having an azide or acetylene end group R 1 on the surface, C-reactive protein detection chip manufacturing method.
제 9 항에 있어서,
상기 복합체 층 형성 후에, 상기 분자각인 물질과 결합되지 않은 상기 고정층 부분에 프로파길 알콜을 반응시키는 것을 추가 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법.
The method of claim 9,
After formation of the complex layer, further comprising reacting propargyl alcohol to the portion of the fixed layer that is not bound with the molecular imprinting material.
제 9 항에 있어서,
상기 고정층이 형성된 금속 기재를 침지시키기 전에, 상기 분자각인 물질/C-반응성 단백질 혼합 용액을 예비 배양시켜 상기 분자각인 물질로부터 유래된 5개 포스포콜린 기들이 상기 C-반응성 단백질 각 분자의 포스포콜린 결합자리(binding site)에 대응되도록 배향시키는 것을 추가 포함하는, C-반응성 단백질 검출용 칩의 제조 방법.The method of claim 9,
Prior to immersing the metal substrate on which the pinned layer is formed, pre-culturing the molecular imprinted substance / C-reactive protein mixed solution so that the five phosphocholine groups derived from the molecular imprinted material are phosphors of each molecule of the C-reactive protein. A method of manufacturing a chip for detecting a C-reactive protein further comprising aligning to correspond to a choline binding site.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2001318099A (en) 2000-02-29 2001-11-16 Kyowa Medex Co Ltd Measuring method and measuring reagent for c-reactive protein
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