KR101109125B1 - 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 이를 이용한 생체 내 혈관신생 유도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포를 3차원 세포집합체(cell cluster) 형태로 배양하여 혈관세포로 분화시키는 방법 및 생체 내 혈관신생을 위한 상기 3차원 세포집합체의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 1) 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기 혹은 성장인자가 고정화된 배양용기에 접착시켜 배양하는 단계; 2) 배양된 줄기세포의 밀도가 증가함에 따라 줄기세포가 배양용기로부터 탈착되어 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 3) 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 줄기세포가 혈관세포로 분화되는 단계를 포함하는, 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 3차원 세포집합체를 혈관신생을 위한 세포치료제로 사용하는 용도에 관한 것이다.

Description

줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 이를 이용한 생체 내 혈관신생 유도{METHOD FOR THE DIFFERENTIATION OF STEM CELLS INTO VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS AND INDUCTION OF ANGIOGENESIS USING THE SAME}
본 발명은 줄기세포를 3차원 세포집합체 형태로 배양하여 혈관세포로 분화시키는 방법 및 생체 내 혈관신생을 위한 상기 3차원 세포집합체의 용도에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관의 내피세포가 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 분해하고, 이동, 분열 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 과정으로, 상처 수복, 배아 발생, 종양 형성, 만성염증, 비만 등 여러 가지 생리적 및 병리적 현상에 관여한다. 혈관신생 과정은 혈관내피세포의 증식 및 혈관벽으로부터 자극이 있는 방향의 주변조직으로의 이동을 포함한다. 이어서 다양한 단백질 분해효소가 활성화되어 혈관내피세포가 기저막을 침윤시키고 루프를 형성하며, 형성된 루프들이 분화되어 관을 형성하게 된다.
이러한 혈관신생 과정은 다양한 종류의 촉진인자 및 억제인자에 의해 엄격히 조절되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1), 혈소판 인자-4(platelet factor-4), 엔지오스타틴(angiostatin) 등의 혈관신생 억제인자와, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 등과 같은 혈관신생 촉진인자가 평상시에는 양적 평형상태를 유지하여 혈관신생이 일어나지 않지만, 상처나 암이 발생한 경우 상처난 조직의 재생 및 암의 성장을 위하여 혈관신생 억제인자와 촉진인자의 양적 평형상태가 깨어지고 새로운 혈관이 형성되는데, 이때 혈관신생 촉진인자의 과다 발현이 관여하게 된다.
혈관신생은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 예를 들어 혈관신생이 미발달된 태반은 유산의 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우 조직이나 기관의 기능 이상을 유발하거나 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다. 따라서 혈관의 미형성으로 인한 저산소(hypoxia) 상태 또는 저영양(undernutrition) 상태의 유발로 인한 조직 손상을 감소시키고, 원활한 조직 재생을 위해 새로운 혈관신생을 유도하거나 촉진시키고자 하는 치료법의 개발이 필요하다.
혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생요법이라 하는데, 이미 VEGF와 같은 혈관신생 촉진인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한 FGF, 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 및 혈소판-유도 내피 성장인자(platelet-derived endothelial growth factor, PDEGF) 등의 혈관신생 촉진인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다. 그러나 상기 인자들은 단백질로서 분리?정제하기 어렵고, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있다.
1997년에 아사하라(Asahara) 연구팀에 의해 CD34+ 조혈(hematopoietic) 전구세포를 성인의 순환계에서 분리한 후 생체 외에서 내피전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs)로 명명된 내피-계열 세포로 분화시킬 수 있음이 보고되었다. 상기 결과를 토대로 골수-유래 세포와 생체 외에서 증식된 혈관내피전구세포를 수족 허혈성 질환의 재생과 심근 재생에 사용하였고, 이 혈관내피전구세포는 혈관 재생을 위한 자가이식에 시도되었다. 그 이후에 지방 조직의 버팀질 혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF) 뿐만 아니라 골수, 제대혈 (umbilical cord blood) 등에서도 발견되는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs) 역시 혈관내피세포로 분화할 수 있음이 보고되었다. 지방줄기세포는 생체 외에서 혈관내피세포로 분화할 수 있고 허혈성 동물모델에서 초기 혈관신생 움직임을 보였다.
그러나 중간엽줄기세포를 이용한 허혈성 동물모델에서 줄기세포는 낱개의 세포로 이식되기 때문에, 실제로 줄기세포 자체가 혈관신생을 유도하기 보다는 줄기세포로부터 분비되는 성장인자에 의해 숙주(host)의 혈관신생이 유도된다는 보고가 주를 이루고 있다. 약간의 줄기세포가 새롭게 형성되는 혈관에 유입되기는 하지만, 줄기세포 자체에 의한 혈관신생에 대해서는 아직까지 보고된 예가 없다. 그 외에도, 지방조직을 분해하여 생성된 세포 중에서 버팀질 혈관 분획(SVF)을 배양하지 않고 동물에 이식하여 혈관내피세포로 분화시킬 수 있음이 보고되었다. 그러나 상기 방법은 지방줄기세포의 계대배양에 의한 증식을 유도하지 않아 지방줄기세포로부터 분화되는 혈관내피세포의 양이 매우 적으며, 특히 분화된 혈관내피세포의 증식율 및 분화율이 낮아 그 응용이 제한적이다.
이에 본 발명자들은 줄기세포를 이용한 혈관신생요법으로서 생체 내에 이식된 줄기세포의 효율적인 혈관신생을 유도하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 세포-기질간 상호작용에 의해 물리적으로 접착시켜 배양하거나 상기 배양용기 표면에 고정된 성장인자와의 상호작용에 의해 성장인자에 결합된 상태로 배양하면, 초기에는 줄기세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식하다가 높은 세포 밀도에서 세포-세포간 상호작용이 세포-기질간 상호작용보다 강해지면 증식된 줄기세포가 배양용기 표면으로부터 탈착되어 3차원 세포집합체(cell cluster)를 형성하게 되고, 이렇게 형성된 세포집합체 내에서 줄기세포가 혈관신생 촉진인자를 분비할 뿐만 아니라 혈관세포로 분화되는 것을 발견하고, 이를 토대로 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 혈관신생을 위한 세포치료제로 이용하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체 내에서 줄기세포를 이용한 혈관신생을 유도하기 위하여 줄기세포를 3차원 세포집합체 형태로 배양함으로써 단시간에 대량으로 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 3차원 세포집합체를 혈관계 질환의 세포치료제 또는 조직공학용 복합 지지체의 기능성 세포로서 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기 혹은 성장인자가 고정화된 배양용기에 접착시켜 배양하는 단계;
2) 배양된 줄기세포가 높은 세포 밀도에서 배양용기로부터 탈착되어 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
3) 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 줄기세포가 혈관세포로 분화되는 단계를 포함하는, 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 3차원 세포집합체를 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 또는 창상 치료를 위한 세포치료용 조성물을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 3차원 세포집합체가 생분해성 지지체에 파종(loading)되어 있는 혈관 재생을 위한 조직공학용 복합 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 분화방법은 줄기세포와 소수성 배양용기 표면과의 물리적 상호작용 또는 그에 고정된 성장인자와의 생화학적 상호작용을 이용하여 줄기세포를 3차원 세포집합체 형태로 배양함으로써 세포집합체 내부에 저산소 상태를 조성하여 혈관신생 촉진인자를 과다 생산하고 그로 인해 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 분화방법에 따라 수득된 3차원 세포집합체를 생체 내에 이식하면 풍부한 혈관신생 촉진인자와 줄기세포로부터 분화된 혈관세포에 의해 생체 내에서 성숙한 혈관을 효과적으로 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 세포집합체는 혈관 질환 또는 창상 치료를 위한 세포치료제로서 뿐만 아니라 생분해성 지지체와 함께 혈관 재생을 위한 조직공학용 복합 지지체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 인간 피하 지방조직으로부터 분리된 다분화능 지방줄기세포를 위상차 현미경으로 관찰한 사진(40×)이고,
도 1b는 인간 피하 지방조직으로부터 분리된 다분화능 지방줄기세포를 대상으로 표면항원 발현양상을 유세포 분석기로 분석한 결과이고,
도 2는 지방줄기세포의 다양한 배양용기 표면에 대한 세포 접착활성을 상기 표면에 접착된 단백질 양을 측정하여 정량화한 그래프이고,
도 3은 지방줄기세포를 다양한 세포 접착활성을 나타내는 배양용기에서 3일간 배양한 후 지방줄기세포의 3차원 세포집합체의 형성을 위상차 현미경으로 관찰한 사진(40× )이고,
도 4는 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 형성된 3차원 세포집합체의 CD29, CD34, Flk1,CD31 및 SMA에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 5는 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 형성된 3차원 세포집합체의 오스테오칼신, MHC, 네스틴 및 MAP-2에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 6은 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체를 위상차 현미경으로 관찰한 사진(40×)이고,
도 7은 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체에서 HIF-1α의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체의 내부에 혈관신생 촉진인자의 생성 여부를 분석한 결과이고,
도 9a는 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 혈청 함유 배지 존재 하에 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체의 CD29, CD34, Flk1 및 CD31에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 9b는 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 혈청 함유 배지 존재 하에 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체의 SMA, 네스틴 및 MAP-2에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 10은 본 발명에 따라 FGF가 고정된 배양용기에서 무혈청 배지 존재 하에 지방줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체의 CD29, CD34, Flk1 및 CD31에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 11은 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 누드마우스에 생체 이식하는 과정을 나타내는 모식도 및 생체 이식 3주 후 적출된 조직을 육안으로 관찰한 결과이고,
도 12는 도 11에서 본 발명에 따라 세포집합체가 생체 이식된 누드마우스로부터 적출된 조직의 SMA, CD31, CD34 및 KDR에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 13은 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체가 이식된 허혈성 래트 모델에서 허혈 조직의 SMA, CD29 및 CD31에 대한 면역학적 염색 결과이고,
도 14는 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체가 이식된 허혈성 래트 모델에서 하지 부분의 혈류 흐름을 측정하여 정량화한 그래프이다.
본 발명은 줄기세포를 3차원 세포집합체 형태로 배양하여 혈관세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 줄기세포가 배양용기의 표면 특성에 따라 접착활성이 달라지고 접착된 정도에 따라서 최종적으로 형성되는 세포의 형태가 달라질 수 있다는 발견에 기초한 것이다. 상기 발견에 따르면, 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에서 배양하게 되면 소수성 표면으로 인해 줄기세포와 배양용기 사이의 접착활성이 충분히 강하게 이루어지지 않게 되고, 그로 인해 배양 초기에는 세포-기질간 상호작용에 의해 줄기세포가 배양용기의 표면에 접착되어 증식하다가 배양시간이 경과함에 따라 높은 세포 밀도에서 줄기세포가 상기 표면으로부터 탈착되어 배양액 내에 부유된 상태로 증식하면서 세포-세포간 상호작용에 의해 3차원 세포집합체를 형성하게 되고, 이렇게 형성된 3차원 세포집합체에서 줄기세포의 혈관세포로의 분화가 일어난다.
생체재료의 표면에서 일어나는 세포의 접착은 다양한 기작(mechanism)에 의해 이루어지는데, 이는 크게 생물학적 인식을 매개로 하는 특이적 세포접착과, 정전기적 혹은 표면에너지에 의해 좌우되는 비특이적 세포접착으로 구분될 수 있다. 특이적 세포접착은 세포외기질(ECM) 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등에 존재하는 특정의 펩타이드 리간드(예컨대, 아르기닌-글리신-아스파르트산, Arg-Gly-Asp, RGD)가 세포막에 존재하는 접착 수용체인 인테그린(integrin)과 결합하여 일어나는 현상이다. 반면, 비특이적 세포접착은 인지질을 주요 구성성분으로 하는 세포막이 전기적으로 음성을 띠게 되므로 접착시키고자 하는 표면을 전기적으로 양성을 띠게 하여 세포의 접착을 유도하는 방법이다. 현재 사용되는 대부분의 조직세포 배양용 배양용기의 표면은 이러한 비특이적 세포접착 원리를 이용하여 플라즈마 처리에 의해 전기적 양성을 띠게 만든 제품이다. 그 외에도, 세포막의 표면에너지에 상응하게 접착시키고자 하는 표면에 적당한 표면에너지를 부여하면 세포의 접착을 유도할 수 있다.
혈액세포와는 달리 세포외기질에 접착하여 생육하는 상피세포 또는 중간엽세포와 같은 접착의존성 세포는 기질에 세포가 접착하지 않으면 세포사가 유도되며, 이러한 세포사를 아노키스(anokis)라고 칭한다. 기질에 대한 세포의 접착은 세포의 생육 및 분화에 많은 영향을 미친다.
이러한 접착의존성 세포의 시험관내 세포배양에는 세포-세포간 상호작용과 세포-기질간 상호작용이 관여하게 되는데, 세포-세포간 상호작용에 관여하는 힘보다 세포-기질간 상호작용에 관여하는 힘이 더 강해야만 세포가 배양용기 표면에서 2차원 단층을 형성하면서 증식할 수 있다. 한편, 배양 초기에 세포-기질간 상호작용에 관여하는 힘보다 세포-세포간 상호작용에 관여하는 힘이 더 강하여 세포가 배양용기 표면에 접착되지 못하면 대부분의 세포는 증식하지 못하고 사멸되게 된다. 따라서 접착의존성 세포의 3차원 배양을 유도하기 위해서는 초기에는 세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 배양되는 것이 중요하며, 이후 높은 세포 밀도에서 세포와 세포사이의 접착이 유도되면 배양용기로부터 떨어져 나와 부유된 상태로 세포들끼리 3차원 세포집합체를 형성하면서 증식할 수 있는 환경을 만들어 주어야 한다.
이에 본 발명자들은 3차원 세포집합체 형태로 세포배양을 유도하기 위해서 세포-세포간 상호작용보다 세포-기질간 상호작용에 관여하는 힘을 적절히 조절하여, 즉 배양 초기에는 세포가 배양용기 표면에 개개의 세포로 부착된 상태로 증식하지만 시간이 지나면 높은 세포 밀도에서 세포와 세포 사이의 접착이 유도되고, 배양용기 표면으로부터 세포가 탈착될 수 있는 정도로 세포접착을 약하게 유도하는 방법을 개발한 것이다.
이를 위해 본 발명에서는 먼저 다양한 표면 특성을 갖는 배양용기에 대한 줄기세포의 세포접착 활성을 지방줄기세포를 이용하여 조사하였다. 그 결과 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌과 같은 세포외기질(ECM) 단백질이 코팅된 배양용기, 및 표면이 플라즈마로 처리되어 전기적 양성을 띠는 조직세포 배양용기에서는 세포-기질간 상호작용이 우수하여 지방줄기세포가 상기 배양용기의 표면에 접착된 상태로 증식하는 반면, 친수성을 도입하기 위해 사용된 우 혈청 단백질(bovine serum protein, BSA) 및 양매성을 가지는 합성 당질고분자(poly-(N-p-vinylbenzyl-4-O-a-D-glucopyranosyl-D-gluconamide), PVMA; poly-(N-p-vinylbenzyl-4-O-b-D-galactopyranosyl-D-gluconamide), PVLA; poly-(N-p-vinylbenzyl-1,2-D-glucuronamide, PV6Gna)가 흡착된 배양용기에서는 표면에 대한 지방줄기세포의 접착이 매우 약하게 이루어졌다. 그러나 놀랍게도, 폴리스티렌 재질과 같이 표면이 소수성을 띠는 배양용기에서는 세포-기질간 상호작용이 충분히 강하지 않아 배양 초기에는 지방줄기세포가 배양용기의 표면에 접착되어 생육하지만 일정 시간 경과 후에는 이로부터 탈착되어 배양액 내에 부유된 상태로 증식하는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 표면이 소수성을 띠는 배양용기를 이용하여 배양시간에 따른 줄기세포의 접착활성을 조절함으로써 이를 3차원 세포집합체 형태로 배양하면 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있음을 발견하였다.
이러한 발견을 토대로, 본 발명에 따른 분화방법은
1) 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하는 단계;
2) 배양된 줄기세포의 밀도가 증가함에 따라 줄기세포가 배양용기로부터 탈착되어 배양액 내에 부유된 상태로 증식하면서 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
3) 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 줄기세포가 혈관내피세포로 분화되는 단계를 포함한다.
단계 1)은 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기 혹은 성장인자가 고정화된 배양용기에 접착시켜 배양하는 단계로, 이 단계에서 줄기세포는 소수성 표면과의 물리적 상호작용에 의해 배양용기에 접착되거나, 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자를 배양용기 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자와 줄기세포와의 생화학적 상호작용에 의해 배양용기에 접착될 수 있다.
단계 1)에 사용될 수 있는 줄기세포는 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가 필요할 경우 혈관, 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 가능성을 갖춘 세포로서, 특히 본래 자신이 있던 조직과 같은 성격의 조직에서만 활성화하는 다분화능 성체줄기세포가 바람직하다. 이러한 줄기세포의 예로서 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 유도만능줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서는, 줄기세포로 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 이용하여 이를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 세포-기질간 상호작용에 의해 물리적으로 접착시켜 배양한다. 본 발명에 적합한 인간 지방조직은 성숙한 지방세포와 이를 둘러싼 결체조직으로 구성된 것을 말하며, 환자 자신 또는 표현형이 일치하는 타인으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 이때 체내 위치에 상관없이 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법에 의하여 수득되는 모든 지방조직을 사용할 수 있다. 대표적으로, 피하 지방조직, 골수 지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직, 후복막 지방조직 등이 가능하다.
상기한 인간 지방조직으로부터 지방줄기세포는 공지의 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/04273호에 개시된 바와 같이, 지방조직으로부터 지방흡입(liposuction), 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유세포 제거 등의 과정을 통하여 획득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 지방흡입에서 부수적으로 수득된 인간 지방조직을 인산염 완충용액(PBS)으로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라게나제 타입 1을 첨가한 무혈청 배지를 이용하여 37℃에서 1 내지 6시간 동안 처리한다. 이어서 PBS로 세척한 후 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 바닥에 남은 펠렛(pellet)을 분리한다. 분리된 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리한다. 이로부터 수득된 상층액을 여과하여 적혈구 등의 부유세포와 세포 잔여물(debris)을 제거한 후 PBS로 세척한다. 혈청 함유 배지에서 24시간 동안 배양한 후 배양용기 바닥에 접착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 혈청 함유 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 다분화능 지방줄기세포를 수득한다. 상기와 같이 분리된 지방줄기세포는 수차례의 계대배양에도 계대수(passage number)가 16에 이르기까지 우수한 증식율을 나타낸다. 따라서 본 발명에 따라 인간 지방조직으로부터 분리된 다분화능 지방줄기세포는 이후의 3차원 세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 60% 조밀도(confluency)에서 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다. 이처럼 계대배양으로 충분히 증식시킨 지방줄기세포를 사용하게 되면 단시간 내에 대량으로 혈관내피세포의 분화를 유도할 수 있다.
상기와 같이 준비된 지방줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접종하여 배양하면, 배양용기의 소수성 표면으로 인해 지방줄기세포와 배양용기 사이에 세포-기질간 상호작용이 이루어져 물리적 흡착에 의해 지방줄기세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식하게 된다.
본 발명에 적합한 표면이 소수성을 띠는 배양용기는 통상적인 세포 배양용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 본 발명에 적합한 배양용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시양태에서는, 줄기세포와 소수성 배양용기 표면과의 상호작용에 의한 물리적 흡착 보다 효과적으로 줄기세포를 배양용기에 접착시키기 위해, 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자를 배양용기 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자와 줄기세포와의 생화학적 상호작용을 이용할 수 있다.
본 발명에 적합한 성장인자는 줄기세포에 접착활성을 갖는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 그의 예로는 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 헤파린 결합 도메인 (HBD) 등이 포함된다. 상기 성장인자는 5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 배양용기 표면에 고정될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자로 섬유아세포 성장인자(FGF)를 소수성 배양용기 표면에 고정시킨다. FGF(NCBI GenBank Accession No.EF506888.1)는 줄기세포의 세포막에 존재하는 FGF 수용체 또는 HSPG와 결합하여 지방줄기세포, 간엽줄기세포, 배아줄기세포 등의 배양 시 이들의 분화나 증식에 중요한 생물학적 기능을 발휘하는 성장인자이다.
배양용기 표면에 대한 성장인자의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 달성될 수 있는데, 전통적으로는 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등이 알려져 있다.
본 발명의 일 실시양태에서는, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행한다. 본 발명에서는 이렇게 줄기세포의 분화 및 증식에 필수적인 성장인자를 폴리펩티드 링커를 이용하여 성장인자 본래의 생물학적 활성을 유지하면서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자의 줄기세포에 대한 접착활성을 이용하여 상기 표면에 줄기세포를 접착시킴으로써 줄기세포의 효율적인 배양을 도모한다.
본 발명에 적합한 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 줄기세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 링커로는 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin), 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 폴리펩티드 링커로서 말토오스 결합 단백질(MBP)을 이용하여 배양용기 표면에의 성장인자 고정화를 수행한다. MBP(NCBI GenBank Accession No. AAB59056)는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질이다.
MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리하다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다.
이에 본 발명에서는 대장균에서 발현되는 단백질로서 말토오스와의 우수한 결합능력으로 발현 및 정제가 용이하다는 장점을 갖는 말토오스 결합 단백질(MBP)을 이용하여 말토오스의 카르복실 말단과 FGF의 아미노 말단을 결합시킨 재조합 단백질을 제조하고, 이 재조합 단백질을 MBP의 소수성 도메인을 링커로 이용하여 소수성을 띠는 배양용기 표면에 단순한 물리적 흡착에 의해 고정시킨 후, 고정된 재조합 단백질에서 여전히 생물학적 활성을 유지하는 FGF 부분과 줄기세포와의 접착을 통해 줄기세포를 배양용기 표면에 접착시킨다. 이때, MBP의 카르복실 말단은 재조합 단백질의 제조를 위해 FGF와의 결합에 이용되는 반면, 소수성 도메인을 포함하는 아미노 말단은 이후의 단계에서 소수성 표면에의 물리적 흡착에 이용된다.
상기와 같이 제공되는 말토오스 결합 단백질(MBP)의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 MBP-FGF 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조하거나, 이를 발현하는 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다. 이러한 형질전환 세균으로 2009년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11505BP로 기탁된 대장균 형질전환체 K12 TB1(pMAL-bFGF)를 예로 들 수 있다.
이와 같이 수득된 MBP-FGF 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시키는 과정은 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, MBP-FGF 재조합 단백질의 고정화는 상기 재조합 단백질을 적합한 완충용액, 예컨대 인산염 완충용액(buffered phosphate saline, PBS), 트윈20/PBS, 트리스-HCl 완충용액, 중탄산염 완충용액(bicarbonate buffer) 등에 1 ng/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 희석한 후 이 희석액을 소수성 표면을 갖는 배양용기에 첨가하고 4 내지 25℃에서 1 내지 24시간 동안 반응시키면, MBP의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인과 상기 소수성 표면의 물리적 흡착에 의해 재조합 단백질이 소수성 표면에 고정된다. 이때, 소수성 표면에 고정되는 MBP-FGF 재조합 단백질의 농도는 5 내지 100 ㎍/㎖가 바람직하다.
상기와 같이 표면이 소수성을 띠는 배양용기 표면에 고정된 재조합 단백질은 세포 인식에 중요한 FGF가 외부로 노출되어 있어 줄기세포의 세포막에 존재하는 FGF 수용체 또는 HSPG에 용이하게 결합하여 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 담당할 수 있다. 따라서 FGF가 고정된 배양용기에서 줄기세포를 배양하면 줄기세포와 FGF와의 직접적인 상호작용에 의해 줄기세포가 배양용기에 부착된 상태로 배양될 수 있다.
전술한 바와 같이, 단계 1)에서 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 세포-기질간 상호작용에 의해 물리적으로 접착시켜 배양하거나 상기 배양용기 표면에 고정된 성장인자와의 생화학적 상호작용에 의해 성장인자에 결합된 상태로 배양하면, 초기에는 줄기세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식한다.
단계 2)에서는 단계 1)에서 줄기세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식하다가 높은 세포 밀도에서 세포-세포간 상호작용이 세포-기질간 상호작용보다 강해지면 줄기세포가 배양용기 표면으로부터 탈착되어 배양액 내에 부유된 상태로 증식하면서 서로 응집되어 육안으로 검출 가능한 밀리미터 크기의 부유하는 3차원 세포집합체(cell cluster)를 형성하는 단계이다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 표면이 소수성을 띠어 이에 대한 세포접착이 상대적으로 약하게 일어나는 배양용기로서 폴리스티렌으로 제조된 비-조직세포 배양용 플레이트(non-tissue culture plate; NTCP)에 인간 지방줄기세포를 접종하여 3차원 세포집합체의 형성을 유도한다. 폴리스티렌 NTCP에 접종된 지방줄기세포는 초기에 세포-기질간 상호작용에 의해 플레이트 표면에서 약한 세포접착이 유도되어 접착된 상태로 2차원 단층으로 증식하다가 배양시간이 경과함에 따라 세포의 밀도가 높아지면 세포-기질간 상호작용보다 세포-세포간 상호작용이 더 강하게 작용하여 2차원 단층 배양된 세포들이 배양용기 표면에서 탈착된다. 이때 초기에는 지방줄기세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 배양되는 것이 중요한데, 초기부터 세포접착이 일어나지 않고 부유된 상태로 배양되면 형성되는 3차원 세포집합체의 크기가 작고 대부분의 세포가 사멸되는 현상을 보인다. 배양용기로부터 탈착된 세포를 배양액 내에 부유된 상태로 더 배양하게 되면 세포-세포간 상호작용에 의해 세포들이 서로 응집되면서 3차원 세포집합체가 형성된다. 이렇게 형성되는 3차원 세포집합체는 초기에는 세포들이 약하게 결합되어 있으나 배양시간이 경과함에 따라 세포-세포간 상호작용에 의해 세포집합체를 형성하고 있는 세포들 사이의 접착력이 강화되어 조밀한(compact) 3차원 세포집합체를 형성하게 된다.
본 발명에 따라 형성된 3차원 세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기, 바람직하게는 3차원 구조의 최장폭에 해당하는 부분의 직경이 400 ㎛ 내지 1 ㎜의 직경을 갖는다. 본 발명에서 3차원 세포집합체의 크기는 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화에 매우 중요한데, 이는 세포집합체의 크기가 커짐에 따라 내부로의 산소 투과가 감소하게 되고, 이로 인해 저산소 환경이 조성되면 혈관내피세포의 분화에 영향을 미치는 다양한 혈관신생 촉진인자의 생성이 유도되기 때문이다. 따라서 3차원 세포집합체의 직경이 400 ㎛ 미만인 경우에는 줄기세포의 혈관내피세포로의 효과적인 분화가 이루어지지 않을 수 있는 반면, 이의 직경이 1 ㎜를 초과하는 경우에는 세포집합체 내의 과도한 산소 결핍으로 인해 세포사가 유발되는 문제점이 발생할 수 있다.
일반적으로 단층 배양된 세포에 인위적으로 산소 공급을 제한하여 저산소 상태를 조성하면 VEGF와 같은 혈관신생 촉진인자가 생산될 수 있으나, 이렇게 생산된 혈관신생 촉진인자는 과량의 배지 속으로 노출 확산되어 실질적으로 세포가 섭취하게 될 확률이 낮다. 반면 본 발명에서와 같이 세포집합체를 형성하게 되면, 세포집합체 내부에서 생성된 혈관신생 촉진인자들이 세포집합체 내부에서 직접 세포에 의해 섭취될 수 있다. 따라서 줄기세포는 고농도의 혈관신생 촉진인자가 존재하는 환경에서 자라게 되고, 혈관내피세포로의 분화가 효과적으로 이루어진다.
상기한 범위의 크기를 갖는 3차원 세포집합체를 형성하기 위해서는, 단계 2)에서 줄기세포가 1× 104 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 접종되는 것이 바람직하다. 접종되는 줄기세포의 농도가 1× 104 세포/㎠ 미만일 경우에는 세포집합체의 크기가 재현성을 얻을 수 없고, 이의 농도가 1× 105 세포/㎠를 초과하는 경우에는 과다한 세포의 접종으로 세포사가 일어나는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 지방줄기세포의 3차원 세포집합체 형성을 유도하기 위하여, 분리된 지방줄기세포를 혈청 배지에 현탁한 후 폴리스티렌 웰 플레이트의 각 웰에 1× 104 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 접종한 결과, 2× 104 세포/㎠ 이상의 농도에서 배양 3일째에 500 ㎛ 내지 1 ㎜의 직경을 갖는 3차원 세포집합체의 형성이 유도되는 것을 확인한다. 접종되는 지방줄기세포의 초기 농도에 따라 형성되는 3차원 세포집합체의 크기가 달라질 수 있으며, 바람직하게는 4× 104 세포/㎠ 이상의 농도로 접종하는 것이 육안으로 식별가능한 크기의 3차원 세포집합체를 형성하고 회수하기에 편리하다.
단계 3)에서는 줄기세포가 단계 2)에서 형성된 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 혈관내피세포로 분화되는 단계로, 줄기세포가 3차원 세포집합체 형태로 배양되면, 세포집합체가 형성됨에 따라 내부로의 산소 투과가 감소하게 되고 그로 인해 저산소 상태가 조성된다. 세포집합체 내부에 조성된 저산소 상태는 혈관내피세포의 분화에 영향을 미치는 다양한 혈관신생 촉진인자의 생성을 유도하고, 그 결과로 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화가 이루어지는 것이다.
상기 단계 1)에서 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하는 경우에는, 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포로 구성된 3차원 세포집합체를 수득하기 위해 줄기세포를 배양용기에 접종하고 35℃내지 38.5℃에서 1 내지 7일간 배양하는 것이 바람직하다.
다르게는, 단계 1)에서 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자가 고정되어 있는 배양용기에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 경우에는, 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포로 구성된 3차원 세포집합체를 수득하기 위해 줄기세포를 배양용기에 접종하고 35℃내지 38.5℃에서 1 내지 7일간 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양에 적합한 배지는 줄기세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, DMEM과 Ham's F12가 1:1의 부피비로 혼합된 DMEM/F12 배지에 우 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 배지를 사용한다.
상기와 같이 배양용기 표면에 줄기세포를 접착시켜 배양하여 형성된 3차원 세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기, 바람직하게는 400 ㎛ 내지 1 ㎜의 직경을 가지고 있어 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 회수할 수 있다. 이렇게 회수된 3차원 세포집합체는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 집합체 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포집합체 형태 그대로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 형성된 3차원 세포집합체를 면역학적 염색으로 분석한 결과, 혈관내피세포에 특이적인 면역학적 표현형을 나타내어 지방줄기세포가 혈관내피세포로 분화되었음을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에 따라 형성된 3차원 세포집합체는 중간엽줄기세포 및 상피세포에서 발현되는 표면항원인 CD29, 혈관내피세포에서 발현되는 표면항원인 CD34, Flk1(fetal liver kinase 1) 및 CD31(endothelial cell adhesion molecule, PECAM) 그리고 평활근세포에서 발현되는 SMA(smooth muscle actin)에 대해서는 양성반응을 나타낸 반면, 골세포, 평활근세포 및 신경세포에서 발현되는 표면항원인 오스테오칼신(osteocalcin), 네스틴(nestin) 및 MAP-2에 대해서는 모두 음성반응을 나타내었다.
상기 결과로부터 본 발명에 따라 줄기세포를 3차원 세포집합체 형태로 배양하여 수득된 세포는 혈관세포 특이적인 표면항원을 발현하는 것으로 확인되어, 줄기세포가 혈관세포로 분화되었음을 알 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포의 혈관세포로의 분화방법은, 표면이 소수성을 띠는 배양용기를 사용하거나 상기 배양용기 표면에 고정된 성장인자를 이용하여 배양용기에 대한 줄기세포의 접착활성을 조절함으로써 3차원 세포집합체의 형성을 통해 줄기세포를 혈관세포로 효과적으로 분화시킬 수 있다. 또한 본 발명의 분화방법에 따라 수득된 3차원 세포집합체를 생체 내에 이식하면 풍부한 혈관신생 촉진인자와 줄기세포로부터 분화된 혈관세포에 의해 생체 내에서 성숙한 혈관을 효과적으로 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 세포집합체는 혈관 질환 또는 창상 치료를 위한 세포치료제로서 뿐만 아니라 생분해성 지지체와 함께 혈관 재생을 위한 조직공학용 복합 지지체로서 유용하게 사용될 수 있다.
이에 본 발명은 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 또는 창상치료에 유용한 세포치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 혈관 질환은 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 허혈성 질환 등을 포함하고, 예를 들면, 동맥경화증, 안정형 및 불안정형 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 뇌졸중, 일과성 및 허혈성 발작, 지주막하 출혈 등을 포함한다.
본 발명에 따른 세포치료용 조성물의 투여량은 유효성분인 세포집합체를 구성하는 줄기세포로부터 분화된 혈관세포를 기준으로 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 유효성분으로서 세포집합체와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 본 발명에 따른 세포치료용 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황(含硫)환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
이처럼 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 세포치료용 조성물은 창상치료, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 허혈성질환 등의 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 유효성분으로 함유하는 혈관 재생을 위한 조직공학용 복합 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 조직공학용 복합 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체가 파종(loading)되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항(抗)석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다. 이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 대표적으로 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다.
이때 복합 지지체 중의 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 상기 범위 미만이면 복합 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않아 지지체의 기계적 강도가 약해지는 반면, 이의 함량이 상기 범위를 초과하면 세포집합체의 파종이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있다.
상기와 같이 성형 제조된 복합 지지체는 파종된 세포집합체를 이식된 조직 내로 전달하고, 3차원적으로 세포가 부착 성장하여 새로운 조직이 형성되도록 하는 역할을 한다. 이때 복합 지지체에 세포가 부착 성장되기 위해서는 지지체의 공극의 크기와 구조가 중요한 요소가 되는데, 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장될 수 있도록 하기 위해서는 공극이 서로 연결된(inter-connecting) 구조를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 복합 지지체에서 공극은 50 내지 600 ㎛의 평균 직경을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조직공학용 복합 지지체에는 유효성분인 세포집합체를 구성하는 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포를 기준으로 혈관내피세포가 복합 지지체에 대하여 2× 104 내지 1× 105 세포/㎠로 파종되는 것이 바람직하다. 만약 혈관내피세포의 농도가 상기 범위 미만이면 혈관내피세포의 혈관 재생을 자극하는 효과가 미미한 반면, 이의 농도가 상기 범위를 초과하면 영양분과 산소의 부족으로 접종된 세포가 사멸하는 문제가 발생할 수 있다.
이처럼 복합 지지체에 접종된 세포집합체는 이를 구성하는 혈관내피세포가 혈관세포로 분화하여 본 발명에 따른 조직공학용 복합 지지체가 이식된 조직에서 효과적으로 혈관 조직의 재생을 유도할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<참조예 1> 인간 지방조직으로부터 다분화능 줄기세포의 분리
가톨릭대학교 성형외과 연구실에서 분양받은 정상인의 피하 지방조직을 2% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS로 3회 세척하여 오염된 혈액을 제거한 후 수술용 가위로 잘게 조각내었다(chopping). 이 지방조직을 미리 준비한 조직용해액(무혈청 DMEM + 1% BSA(w/v) + 0.3% 콜라게나제 타입 1)에 담그고 2시간 동안 37℃에서 교반한 후 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액과 펠렛을 분리하였다. 상층액은 버리고 바닥에 남은 펠렛을 회수하여 PBS로 세척한 후 1,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 100 ㎛ 메쉬(mesh)로 여과하여 조직파편들(debris)을 제거한 후 PBS로 세척하였다. 이로부터 분리된 세포들을 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지(Welgene)에 배양하였다. 배양 24시간 후 접착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하여 제거하였고, 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 인간 피하 지방조직 유래 줄기세포를 수득하였다.
도 1a는 상기 방법에 따라 인간 피하 지방조직으로부터 분리된 다분화능 줄기세포를 위상차 현미경(Nikon)으로 100× 배율 하에서 관찰한 사진이고, 도 1b는 상기 다분화능 줄기세포를 대상으로 세포 표면항원의 발현양상을 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석한 결과이다. 이때, 중간엽 줄기세포의 확인을 위한 표면항원으로 CD29, CD90 및 CD105를 사용하였고, 줄기세포의 분리, 배양 중 다른 세포의 혼입 여부를 관찰하기 위한 표면항원으로 CD34 및 HLA-DR을 사용하여 분석하였다. 상기 결과로부터 인간 피하지방 조직에서 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 표현형을 가지는 지방줄기세포임을 확인하였다.
<실시예 1> 지방줄기세포의 다양한 배양용기 표면에 대한 접착활성 조사
비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에 다양한 세포외 기질 단백질(extracellular matrix proteins)로서 각각 콜라겐 타입 1(collagen type 1), 콜라겐 타입 4, 피브로넥틴(fibronectin, FN) 및 라미닌(laminine) 20 ㎍/㎖, 당질고분자 (PVMA, poly-(N-p-vinylbenzyl-4-O-a-D-glucopyranosyl-)-D-gluconamide) 100 ㎍/㎖, 및 BSA 100 ㎍/㎖을 첨가하고 웰 플레이트를 25℃에서 4시간 동안 보관하여 코팅한 후 PBS로 3회 세척하였다. 상기 웰 플레이트에 100 ㎍/㎖ BSA를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 차단(blocking)한 후 다시 PBS로 3회 세척하였다.
상기 참조예 1에서 준비된 지방줄기세포를 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지에 현탁한 후, NTCP, 조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Tissue Culture Treated 96-well Plate, "TCP", Falcon사), 및 상기 NTCP에 ECM 단백질, 당질고분자 및 BSA가 각각 코팅된 웰 플레이트에 웰당 1.3× 104 세포/㎠의 농도로 접종하고 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포를 접종하고 0.25, 0.5, 1, 2 및 4시간째에 세포의 부착정도 및 형태를 관찰하였다. 이어서 각 시간대 별로 플레이트 표면에 접착된 세포를 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)으로 용해한 후 BCA(Bicinchoninic Acid) 단백질 분석으로 접착된 세포를 정량하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, BSA와 당질고분자로 코팅된 NTCP에서는 배양기간에 상관없이 세포 접착이 일어나지 않은 반면, TCP 및 피브로넥틴으로 코팅된 NTCP에서는 세포 접종하고 1시간째부터 높은 세포 접착율을 나타내었고, NTCP에서는 세포 접종하고 2시간까지는 세포 접착율이 높지 않았으나, 세포 접종하고 4시간 경과 후부터 세포 접착율이 현저하게 증가하는 것이 관찰되었다. 이로부터 BSA와 당질고분자가 코팅된 경우에는 지방줄기세포의 접착활성이 가장 낮은 반면, PTCP 및 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질이 코팅된 경우에는 지방줄기세포의 접착활성이 가장 높았고, 폴리스티렌과 같이 표면이 소수성을 띠는 NTCP에서는 지방줄기세포의 접착활성이 약하게 유도됨을 확인하였다.
<실시예 2> 지방줄기세포의 3차원 세포집합체 형성
배양용기 표면에 대한 지방줄기세포의 접착활성과 3차원 세포집합체 형성의 상관관계를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서와 같이, 비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(NTCP, 폴리스티렌), ECM 단백질로서 콜라겐 및 피브로넥틴, 당질고분자(PVMA), BSA가 각각 코팅된 NTCP, 및 조직세포 배양용 96-웰 플레이트(TCP)에 웰당 4× 104 세포/㎠의 지방줄기세포를 접종한 후 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지에서 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 각 세포접착 표면에서 지방줄기세포의 3차원 세포집합체 형성 여부를 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 표면이 소수성을 띠어 세포접착이 약하게 유도되는 NTCP에서 육안으로 검출가능한 크기로 지방줄기세포의 3차원 세포집합체가 형성되었는데, 상기 3차원 세포집합체는 약 500 ㎛ 이상의 직경을 갖는 것으로 확인되었다. 반면, 세포접착이 강하게 유도되는 피브로넥틴이 코팅된 NTCP나 TCP에서는 지방줄기세포가 2차원적으로 플레이트 표면에 넓게 접착된 상태로 단층 배양되어 세포집합체가 형성되지 않았고, 세포접착이 거의 유도되지 않는 BSA 및 PVMA가 코팅된 NTCP에서는 간헐적으로 100 ㎛ 이하 크기의 세포집합체가 형성되었으나, 그 크기가 너무 작았다. 상기 결과로부터 사용되는 배양용기의 표면에 대한 접착활성에 따라 지방줄기세포의 3차원 세포집합체 형성이 영향을 받으며, 육안으로 검출가능한 크기의 3차원 세포집합체를 형성하기 위해서는 초기에는 세포접착이 약하게 유도되다가 시간이 경과함에 따라 세포 밀도가 증가하면서 세포들이 탈착되어 부유된 상태로 증식하게 되는 폴리스티렌 재질의 NTCP와 같이 표면이 소수성을 띠는 배양용기를 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다.
NTCP에서 육안으로 검출가능한 크기의 3차원 세포집합체를 형성하는데 요구되는 지방줄기세포의 유효농도를 조사하기 위하여, 상기 참조예 1에서 수득된 지방줄기세포를 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지를 함유하는 24-웰 및 6-웰 NTCP의 각 웰에 0.5× 104 세포/㎠ 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 접종하고 3일간 배양하였다. 그 결과, 2× 104 세포/㎠ 이상의 세포 농도에서 육안으로 검출가능한 크기의 3차원 세포집합체 형성이 효율적으로 유도됨을 확인하였다.
<실시예 3> 3차원 세포집합체의 면역학적 분석
상기 실시예 2에서와 같이 지방줄기세포를 4× 104 세포/㎠ 농도로 6-웰 NTCP에 접종하고 배양하여 형성된 3차원 세포집합체를 회수하여 OCT 화합물을 이용하여 -70℃에서 고정한 후 마이크로톰을 이용해 4 ㎛ 두께로 자른 후 그 절편을 슬라이드 글라스에 고정시키고 면역학적 염색을 수행하였다. 다르게는, 회수된 3차원 세포집합체를 주사기를 이용해 물리적으로 와해시킨 후 이를 슬라이드 글라스 위에 놓고 4시간 동안 부착시켰다. 이어서 상기 슬라이드 글라스를 PBS로 수회 세척하고 4% 파라포름알데하이드 용액에 담가 30분간 실온에서 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 면역학적 염색을 수행하였다. 면역학적 염색은 상기에서 준비된 슬라이드 글라스를 일차항체를 함유한 PBS에 담가 밤새 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고, 이를 다시 이차항체와 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고 봉입(mounting)한 후 형광현미경으로 분석하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 형성된 3차원 세포집합체는 CD29, CD34, Flk1 및 CD31 및 SMA에 대해서는 양성반응을 나타낸 반면, 오스테오칼신(osteocalcin), 네스틴(nestin) 및 MAP-2에 대해서는 음성반응을 나타내었다. CD29는 중간엽줄기세포 및 상피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이고, CD34, Flk1 및 CD31은 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이고 SMA는 평활근세포에서 특이적으로 발현되는 세포내 골격 단백질이다. 또한, 오스테오칼신, 네스틴 및 MAP-2는 골세포, 신경세포에서 특이적으로 발현되는 단백질이다. 상기 결과로부터 지방줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에서 배양하여 형성된 3차원 세포집합체가 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성되어 있음을 확인하였다.
도 4는 상기와 같이 지방줄기세포로부터 형성된 3차원 세포집합체의 CD29, CD34, Flk1, CD31 및 SMA에 대한 면역학적 염색 결과이고, 도 5는 오스테오칼신, MHC, 네스틴 및 MAP-2에 대한 면역학적 염색 결과이다.
<실시예 4> 소수성 표면에의 성장인자 고정화
줄기세포의 세포집합체 형태로의 배양을 더욱 효과적으로 유도하기 위해, 소수성 표면을 갖는 배양용기에 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자를 고정시켰다. 이때 성장인자는 폴리펩티드 링커로 말토스 결합 단백질(MBP)과 재조합 단백질 형태로 발현된 섬유아세포 성장인자(FGF)를 사용하였다.
구체적으로, MBP의 카르복실 말단에 FGF의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질을 대장균 형질전환체 K12 TB1(pMAL-bFGF)(KCTC-11505BP)로부터 발현시킨 후 분리, 정제하였다. 상기 대장균 형질전환체로부터 발현되어 분리, 정제된 MBP-FGF 재조합 단백질은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다. 이와 같이 수득된 MBP-FGF 재조합 단백질은 FGF가 MBP와의 재조합 단백질 형태로 발현되어 정제되더라도 본연의 FGF 활성을 그대로 유지하고 있어 줄기세포와의 생화학적 상호작용에 사용될 수 있다.
정제된 MBP-FGF 재조합 단백질을 무균작업대(Sanyo)에서 0.22 ㎛ 주사기 필터(Millex GV, Millipore)를 이용해 여과한 후 10 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕씩 비-조직세포 배양용 24-웰 플레이트(NTCP, 폴리스티렌, Falcon)에 첨가하고 재조합 단백질이 플레이트 표면에 고정되도록 무균작업대 안에서 4시간 동안 방치하였다. 그 후 상기 24-웰 플레이트를 PBS 200 ㎕로 3회 세척하고, MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 웰 표면과 줄기세포와의 비특이적 결합을 방지하기 위해 일부 웰에는 1% BSA(bovine serum albumin, Sigma) 200 ㎕를 첨가하고 무균작업대 안에서 2시간 동안 더 처리한 후 PBS 200 ㎕로 3회 세척하여 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 24-웰 플레이트를 준비하였다.
<실시예 5> 성장인자가 고정된 표면에서 세포집합체의 형성
상기 실시예 4에서 준비된 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 24-웰 플레이트에 웰당 4×104 세포/㎠의 농도로 참조예 1에서 준비된 지방줄기세포를 접종하였다. 이때 10% FBS 함유 또는 무혈청 DMEM/F12 배지를 사용하여 37℃에서 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 각 웰에서 지방줄기세포의 세포집합체 형성 여부를 위상차 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 배양 초기에는 지방줄기세포에 특이적인 접착활성을 나타내는 MBP-FGF 재조합 단백질과의 생화학적 상호작용에 의해 지방줄기세포가 플레이트 표면에 접착된 상태로 증식하다가, 세포의 밀도가 증가함에 따라 플레이트 표면으로부터 탈착되어 3차원 세포집합체를 형성하는 것을 알 수 있다. 특히, 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지에서는 배양 1일째부터 세포집합체가 형성되기 시작하면서 3일 후에는 약 800 ㎛의 직경을 갖는 구(sphere) 형태의 세포집합체가 형성되었고, 무혈청 DMEM/F12 배지에서는 배양 3일 후에 약 500 ㎛의 직경을 갖는 세포집합체가 형성되었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질의 배양용기 표면에의 고정화가 줄기세포의 세포집합체 형성에 중요한 역할을 담당하고 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> 세포집합체 내부의 저산소 상태 확인
세포집합체 형성으로 인해 세포집합체 내부에 저산소 상태가 조성되는지 여부를 확인하기 위해, HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α) 유전자 발현을 역전사효소 중합연쇄반응(RT-PCR)을 통해 분석하였다. HIF-1α는 세포의 저산소 상태에서 세포의 반응을 매개하는 대표적인 역할을 하는 전사조절인자로, 저산소 상태에서 안정성 및 활성이 증가되며 표적유전자의 저산소 반응 요소(Hypoxia response element, HRE)에 결함함으로써 관련 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명에서는 HIF-1α의 발현을 저산소 상태의 지표로 삼고 세포집합체 내 이의 발현을 조사하였다. 먼저 FBS 함유 DMEM/F12 배지 존재 하에 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 웰 플레이트에서 줄기세포를 배양하여 1일, 2일 및 3일째에 수득된 세포집합체로부터 트리졸 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 이를 주형으로 역전사효소(Superscript Ⅱ reverse transcriptase)와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고 HIF-1α 유전자의 발현을 확인하기 위해 서열번호: 2 및 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 시발체 쌍을 사용하여 중합반응을 수행하였다 (HIF-1α sense: TGGACTCTGATCATCTGACC, HIF-1α anti-sense: CTCAAGTTGCTGGTCATCAG). 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 배양 1일째에 형성된 세포집합체에서 HIF-1α 유전자의 발현이 검출되어 세포집합체 내부에 저산소 상태가 조성되었음을 확인하였다.
<실시예 7> 세포집합체 내 혈관신생 촉진인자의 생산 증가
줄기세포의 세포집합체가 형성되면서 조성된 저산소 상태로 인해 혈관신생 촉진인자의 생성이 증가되었는지 여부를 조사하기 위해, 혈관신생 단백질 분석 키트(Human Angiogenesis Array Kit, R&D Systems, Ltd.)를 이용하여 혈관신생과 관련된 단백질의 발현을 분석하였다. 시판되는 배양용기에서 단층으로 배양된 지방줄기세포(대조군)와 상기 실시예 5에서와 같이 MBP-FGF 재조합 단백질이 표면에 고정되어 있는 배양용기에서 세포집합체 형태로 배양된 지방줄기세포(1일째 및 3일째)를 회수하였다. 회수한 세포를 5×106개씩 PBS로 수회 세척한 후 각각의 세포에 세포 파쇄액(lysis buffer)을 500 ㎕씩 첨가하였다. 이를 피펫으로 수회 혼합한 후 4℃에서 30분간 반응시켜 세포 파쇄액을 수득하였다. 수득된 세포 파쇄액을 14,000× g에서 5분간 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 단백질이 녹아있는 상층액을 분리한 후 이의 단백질 농도를 정량하였다. 혈관신생 단백질 분석 키트 내 4-웰 멀티-디쉬의 각 웰에 상기에서 분리된 상층액을 각각 0.5 ㎖씩 분주한 후 블롯 완충액 2 ㎖과 니트로셀룰로스 막을 넣고 진동 플랫폼(rocking platform)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 상기 니트로셀룰로스 막에는 도 8에 나타난 바와 같은 55개의 혈관신생 관련 단백질 항체가 불롯팅되어 있다. 상기 멀티-디쉬를 수회 세척 후 바이오틴-접합 항체(biotin-conjugated antibodies) 1.5 ㎖을 첨가하고 4℃에서 약 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 상기 멀티-디쉬를 수회 세척하고 스트렙타비딘-호스래디쉬(streptavidin?horseradish)와 화학형광 검출 시약(chemiluminescent detection reagents) 1.5 ㎖을 첨가하여 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 영상 판독기(image reader) LAS-3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 혈관신생 관련 단백질의 발현 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 배양용기에서 형성된 지방줄기세포의 세포집합체는 배양 1일째부터 VEGF, 안지오제닌(angiogenin), IL-8을 비롯한 다양한 혈관신생 관련 단백질의 과발현이 검출되었다. 상기 결과는 본 발명에 따라 3차원 세포집합체 형태로 줄기세포를 배양하면, 세포집합체가 형성됨에 따라 내부로의 산소 투과가 감소하게 되고 그로 인해 저산소 환경이 조성되어 혈관내피세포의 분화에 영향을 미치는 다양한 혈관신생 촉진인자의 생성이 유도됨을 나타내는 것이다.
<실시예 8> 세포집합체 내 줄기세포의 혈관세포로의 분화
실시예 5에서와 같이 MBP-FGF 재조합 단백질이 표면에 고정되어 있는 배양용기에서 지방줄기세포를 4× 104 세포/㎠ 농도로 배양하여 형성된 세포집합체를 회수한 후 OCT 화합물을 이용하여 -70℃에서 고정한 후 마이크로톰을 이용해 4 ㎛ 두께로 자른 다음 그 절편을 슬라이드 글라스에 고정시키고 면역학적 염색을 수행하였다. 면역학적 염색은 준비된 슬라이드 글라스를 1차 항체를 함유한 PBS에 담가 밤새 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고, 이를 다시 2차 항체와 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고 봉입한 후 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 FGF가 표면에 고정되어 있는 배양용기에서 지방줄기세포의 배양에 의해 형성된 세포집합체는 CD29, CD34, Flk1, CD31 및 SMA에 대해서는 양성반응을 나타낸 반면, 오스테오칼신(osteocalcin), 네스틴(nestin) 및 MAP-2에 대해서는 음성반응을 나타내었다. CD29는 중간엽줄기세포 및 상피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이고, CD34, Flk1 및 CD31은 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이다. SMA는 평활근세포에서 특이적으로 발현하는 단백질이다. 또한, 오스테오칼신, 네스틴 및 MAP-2는 골세포, 신경세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이다. 상기 결과로부터 지방줄기세포를 FGF가 고정된 표면에서 배양하여 형성된 세포집합체는 지방줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포로 구성되어 있음을 확인하였다.
도 9a는 본 발명에 따라 성장인자가 고정된 배양용기에서 혈청 함유 배지 존재 하에 지방줄기세포로부터 형성된 세포집합체의 CD29, CD34, Flk1 및 CD31에 대한 면역학적 염색 결과이고, 도 9b는 SMA, 네스틴 및 MAP-2에 대한 면역학적 염색 결과이다. 도 10은 본 발명에 따라 성장인자가 고정된 배양용기에서 무혈청 배지 존재 하에 줄기세포로부터 형성된 세포집합체의 CD31, CD34 및 Flk1에 대한 면역학적 염색 결과이다.
<실시예 9> 세포집합체의 생체이식을 통한 혈관신생 평가
본 발명에 따라 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포로 구성된 세포집합체의 생체 내 혈관신생 효과를 평가하기 위해, 참조예 1에서 분리된 미분화 지방줄기세포 또는 실시예 5에서 수득된 세포집합체를 구성하는 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포 1×106개씩을 각각 마트리겔(Matri-gel, BD Biosciences, 주요 성분; 라미닌, 콜라겐 4, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycans, HSPG) 엔탁틴/니도겐(entactin/nidogen)) 500 ㎕와 피브리노겐(최종 농도 2 ㎎/㎖; 녹십자) 6 ㎕를 혼합한 용액에 첨가하여 혼합한 후 트롬빈(0.4 U; 녹십자) 2.5 ㎕를 첨가하였다. 준비된 젤 형태의 혼합액을 4주령의 수컷 BALB/c- 누드마우스(구입처: 중앙실험동물)를 대상으로 피하 주사하였다(도 11). 이때 대조군에는 PBS(phosphate buffered serum)만을 500 ㎕ 주입하였다. 주사 후 육안으로 내용물 주입을 확인하였고, 3주 후에 마우스를 질소 가스로 안락사 시킨 후 피하를 절개하고 젤을 회수하여 육안적 외관 관찰, 면역학적 염색 및 공초점 현미경(confocal microscope) 관찰을 통해 혈관신생을 확인하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 육안으로 외관을 관찰한 결과, 세포 이식 없이 마트리겔/피브린만을 이식한 경우에는 반투명한 형태의 젤이 그대로 유지되었고, 미분화 상태의 지방줄기세포를 마트리겔/피브린에 주입하여 이식한 경우에는 젤이 불투명해지면서 약간의 혈관신생이 관찰된 반면, 본 발명에 따라 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 마트리겔/피브린에 주입하여 이식한 경우에는 붉은색의 혈관이 많이 형성되어 있음을 확인하였다.
도 12는 상기 누드마우스로부터 마트리겔/피브린 겔이 주입된 조직을 적출한 후 항-인간(anti-human) CD31, CD34, KDR 및 SMA 항체를 사용하여 면역학적 염색을 실시한 결과이다. 그 결과, 마트리겔/피브린만을 이식한 경우에는 CD31 및 SMA에 대해서 염색이 되지 않았고, 미분화 상태의 지방줄기세포를 마트리겔/피브린에 주입하여 이식한 경우에는 CD31 및 SMA 양성반응을 보이는 세포가 소수 관찰되었지만 혈관과 같은 구조는 관찰되지 않았다. 반면, 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 마트리겔/피브린에 주입하여 이식한 경우에는 CD31, CD34, KDR 및 SMA에 대해서 모두 양성반응을 보였으며, 혈관과 유사한 형태의 관상 모양의 경로가 관찰되었다. 상기 결과는 누드마우스에 생성된 혈관이 그 부위에 이식된 세포집합체를 구성하는 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로부터 유래된 것임을 나타낸다.
<실시예 10> 세포집합체의 허혈성 래트 모델에서의 혈관신생 평가
본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체가 허혈성 동물모델에서 혈관재생을 위한 치료 효과를 나타내는지를 평가하기 위해, 스프라그-다우리 래트(Sprague-Dawley rats)에 에테르를 흡입시켜 마취한 후 하지 부분에 면도를 하고 피부를 절개해 대퇴동맥을 결찰하여 허혈 상태를 만들었다. 하지 대퇴동맥을 결찰하고 4시간 후 허혈 상태의 래트 8마리의 다리 근육에 직경 0.5 ㎝ 간격으로 참조예 1에서 분리된 미분화 지방줄기세포 또는 실시예 5에서 수득된 세포집합체를 구성하는 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포를 각각 5×106개씩 주사하였다. 이때 대조군은 래트 4마리의 다리 근육에 PBS(phosphate buffered serum)만을 주사하였다. 주사 후 1일째, 2주, 4주째 저체온 검사를 실시하였고, 4주 후에 레이저 도플러로 혈류의 흐름을 영상화하고 정량적으로 평가한 후, 래트를 질소 가스로 안락사 시킨 후 허혈 상태의 하지 부분을 적출하여 면역학적 염색을 통해 혈관신생을 확인하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 이식한 경우에만 항-인간 CD31, SMA 및 CD29에 대해 양성반응을 보였다. 도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체를 이식한 경우, 대조군이나 지방줄기세포를 이식한 경우보다, 혈류의 흐름이 증가함을 알 수 있다. 상기 결과는 본 발명에 따라 지방줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성된 세포집합체가 허혈성 하지의 혈관재생을 위한 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11505BP 2009년4월28일
서열목록 전자파일 첨부

Claims (28)

1) 지방줄기세포 또는 중간엽줄기세포 중에서 선택된 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하는 단계;
2) 파종된 줄기세포의 밀도가 증가함에 따라 줄기세포가 배양용기로부터 탈착되어 3차원 포집합체를 형성하는 단계; 및
3) 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 줄기세포가 혈관세포로 분화되는 단계
를 포함하는, 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 단계 1)에서 줄기세포가 1× 104 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 배양용기에 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)에서 배양용기가 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 및 금속 표면으로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 표면을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 고분자가 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트, 이들의 공중합체 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 금속이 스테인레스 스틸, 티탄, 금 및 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)에서 줄기세포가 소수성 표면과의 세포-기질간 상호작용에 의해 배양용기에 접착되거나, 배양용기 표면에 고정된 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자와의 상호작용에 의해 배양용기에 접착되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 성장인자가 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF) 및 헤파린 결합 도메인 (HBD) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 성장인자가 5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 배양용기 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 성장인자가 폴리펩티드 링커를 이용하여 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질 형태로 배양용기 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드 링커가 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin) 및 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질이 말토오스 결합 단백질(MBP)의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단이 융합되어 있고, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 2)에서 배양된 줄기세포의 밀도가 증가함에 따라 세포-기질간 상호작용보다 세포-세포간 상호작용이 강해지면서 줄기세포가 배양용기로부터 탈착되면서 3차원 세포집합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 3)에서 3차원 세포집합체 내부에 저산소 상태가 조성되면서 혈관신생 촉진인자의 생성이 증가하고 그로 인해 줄기세포가 혈관세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 3)에서 수득되는 세포집합체는 3차원 구조의 최장 폭에 해당하는 부분의 직경이 400 ㎛ 내지 1 ㎜의 직경을 갖고 줄기세포로부터 분화된 혈관세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)에서 줄기세포가 소수성 표면과의 세포-기질간 상호작용에 의해 배양용기에 접착되는 경우, 단계 1) 내지 3)의 배양이 35℃내지 38.5℃에서 1 내지 7일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)에서 배양용기 표면에 고정된 줄기세포에 접착활성을 갖는 성장인자와의 상호작용에 의해 배양용기에 접착되는 경우, 단계 1) 내지 3)의 배양이 35℃내지 38.5℃에서 1 내지 7일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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