KR101013456B1 - Composition for the culturing of simplicillium lamellicola bcp and culturing method using the composition - Google Patents

Composition for the culturing of simplicillium lamellicola bcp and culturing method using the composition Download PDF

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KR101013456B1 KR1020100117732A KR20100117732A KR101013456B1 KR 101013456 B1 KR101013456 B1 KR 101013456B1 KR 1020100117732 A KR1020100117732 A KR 1020100117732A KR 20100117732 A KR20100117732 A KR 20100117732A KR 101013456 B1 KR101013456 B1 KR 101013456B1
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이재호
신택수
김봉수
임재성
우성균
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주식회사 그린바이오텍
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor

Abstract

PURPOSE: A medium composition for culturing Simplicillium lamellicola BCP and a culture method are provided to enhance spore production and to improve spore stability. CONSTITUTION: A medium composition for culturing Simplicillium lamellicola BCP contains 1.0-5.0 w/v% of carbon source of fructose, dextrin, or sucrose and 0.5-4.0 w/v% of nitrogen source of soybean meal or tryptone. The composition additionally contains an inorganic source of magnesiuim sulfate, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sulfate zinc, potassium nitrate, ammonium nitrate, monobasic potassium phosphate, iodination potassium or sodium molybdate.

Description

심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법{Composition for the culturing of Simplicillium lamellicola BCP and culturing method using the composition}Composition for the culturing of Simplicillium lamellicola BCP and culturing method using the composition}

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a medium composition for culturing Simpliclium lamella cola BCP strains and a method of culturing the same.

균주 배양 시 어떠한 배지를 사용하느냐에 따라 균사 생장력이나 균총 모양이 달라질 수 있다. 균주를 배양하다 보면 균주들의 균사 생장력이 떨어지거나 균총의 선단부분이 불규칙하게 변하는 등의 변화를 나타내기도 하는데, 이는 배지의 조성이나 배양 조건이 달라진 데에 따른 경우가 많다. 경우에 따라서, 배지의 종류에 따라 균을 대량 증식시키는 데에도 어려움이 있을 수 있다. Mycelial growth or mycelial shape may vary depending on which medium is used for strain culture. When culturing strains, the strains may show changes in mycelial growth or irregular changes in the tip of the flora, which are often caused by changes in the composition or culture conditions of the medium. In some cases, depending on the type of medium, there may be difficulty in mass propagation of the bacteria.

따라서, 기존의 PDB(포테이토 덱스트로스 브로스, Potato dextrose broth)를 대체 가능하면서도 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 최적화할 수 있는 배지 선정이 중요하다. 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양에는 PDB가 주로 사용되어 왔으나, PDB는 복합배지로서 정확한 성분을 알 수 없는 문제점이 있다.
Therefore, it is important to select a medium that can replace the existing PDB (potato dextrose broth) while optimizing the culture of Simpliclium lamelicola BCP strains. PDB has been mainly used for the cultivation of S. simillium lamelicola BCP strains, but PDB is a complex medium has a problem that does not know the exact components.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 위한 최적의 배지 조성물 및 이를 이용한 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양방법을 제공하며, 구체적으로 본 발명은 수크로오스, 과당 및 덱스트린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및 대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원을 배지 성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 심플리실리움 라멜리콜라 BCP을 배양하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
The present invention provides an optimal medium composition for the cultivation of Simpliclium lamella cola BCP strains and a method of culturing the S. similisium lamellicola BCP strain using the same, and specifically the present invention is a group consisting of sucrose, fructose and dextrin At least one carbon source selected from; And soybean meal (soybean meal) and florisil simple Solarium la mellitic coke BCP (Simplicillium containing one or more nitrogen sources selected from the group consisting of Tryptone (tryptone) with medium components It is an object of the present invention to provide a medium composition for lamellicola BCP) strain culture and a method for culturing Simpliclium lamella cola BCP using the composition.

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 최적 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지 조성을 제공하고, 최적의 배양온도, 배양초기 pH, 배양시간을 설정함으로써, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물 및 배양 조건을 최적화하였다.
In order to solve the above problems, the present invention provides a medium composition comprising an optimal carbon source and a nitrogen source, and by setting the optimum incubation temperature, initial culture pH, incubation time, the culture medium composition for simplicity lamella cola BCP strain culture and Culture conditions were optimized.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 최적 배지 조성 및 배양 조건을 확립함으로써, 균질한 배지를 얻을 수 있고, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율을 2배 이상 높일 수 있으며, 포자 안정성을 크게 향상시킨다는 장점이 있다.
The present invention can obtain a homogeneous medium by establishing the optimum medium composition and culture conditions of the Simpliclium lamellicola BCP strain, can increase the yield of spores more than twice the Simpliclium lamellicola BCP strain, This has the advantage of greatly improving spore stability .

도 1은 배양 온도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 2는 배양 초기 pH에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 3은 배양 시간에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 그래프이다.
도 4는 초기 접종 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 그래프이다.
도 5는 과당(fructose) 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 6은 대두분(Soybean meal) 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 7은 PBD(Plackett-Burman Design)에 따라 배지 성분이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율에 미치는 주요인 효과 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8은 배지 종류에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 배양 수율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 배지 종류에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 경시 안정성 변화를 나타낸 그래프이다.
Figure 1 shows the results of measuring the spores production yield of Simplisium lameticola BCP according to the culture temperature.
Figure 2 shows the results of measuring the spores production yield of Simplisium lame- licola BCP according to the initial pH of the culture.
Figure 3 is a graph of the spore production of the Simplisium lamelicola BCP over time incubation.
Figure 4 is a graph of spore production of Simplisium lamelicola BCP according to the initial inoculation concentration.
Figure 5 shows the results of measuring the spores production yield of Simplisium lamelicola BCP according to fructose concentration.
Figure 6 shows the results of measuring the spores production yield of Simpliclium lamellicola BCP according to the soybean meal concentration.
Figure 7 shows the results of the main effect analysis on the spores production yield of Simpliclium lamelicola BCP strains according to Plackett-Burman Design (PBD).
Figure 8 is a graph showing the change in culture yield of Simplisium lamelicola BCP according to the type of medium.
Figure 9 is a graph showing the changes over time stability of Simplisium lamelicola BCP according to the type of medium.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 위한 최적의 배지 조성물 및 이를 이용한 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to an optimal medium composition for the cultivation of Simpliclium lamella cola BCP strains and a method of culturing the S. similisium lamelicola BCP strain using the same.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 수크로오스, 과당 및 덱스트린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및 대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원을 배지성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물을 포함한다. The present invention provides at least one carbon source selected from the group consisting of sucrose, fructose and dextrin; And soybean meal (soybean meal) and florisil simple Solarium la mellitic coke BCP (Simplicillium containing one or more nitrogen sources selected from the group consisting of Tryptone (tryptone) with medium components lamellicola BCP) strain culture medium composition.

본 발명의 배지 조성물 중에는 탄소원이 1.0 내지 5.0 w/v%, 바람직하게 2 내지 4 w/v%, 보다 바람직하게 3 내지 3.5 w/v% 포함될 수 있다. 상기 범위 밖에서는 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있다.In the medium composition of the present invention, the carbon source may contain 1.0 to 5.0 w / v%, preferably 2 to 4 w / v%, and more preferably 3 to 3.5 w / v%. Outside the above range, the yield of spore production may be lowered.

본 발명의 배지 조성물 중에는 질소원이 0.5 내지 4.0 w/v%, 바람직하게 2 내지 4.0 w/v%, 보다 바람직하게 2.5 내지 3.0 w/v% 포함될 수 있다. 상기 범위 밖에서는 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있다. The medium composition of the present invention may contain 0.5 to 4.0 w / v%, preferably 2 to 4.0 w / v%, more preferably 2.5 to 3.0 w / v%. Outside the above range, the yield of spore production may be lowered.

본 발명의 배지 조성물은, 무기물원을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 이로 제한되지는 않으나, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화나트륨, 황산철(ferrous sulfate), 염화칼슘, 이인산칼륨(dipotassium phosphate), 황산구리, 황산아연, 질산칼륨, 질산암모늄, 인산이수소칼륨, 요오드화칼륨 및 몰리브덴산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이 바람직하다.The medium composition of the present invention may further include an inorganic source. In one embodiment of the invention, but not limited to, magnesium sulfate, potassium chloride, magnesium chloride, sodium chloride, ferrous sulfate, calcium chloride, dipotassium phosphate, copper sulfate, zinc sulfate, potassium nitrate, ammonium nitrate At least one selected from the group consisting of potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide and sodium molybdate is preferred.

본 발명은 특히 과당, 대두분, 황산마그네슘을 배지성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다. In particular, the present invention provides a medium composition for the culture of Simpliclium lamella cola BCP strain comprising fructose, soy flour, and magnesium sulfate as a medium component.

상기 배지는 보다 바람직하게 1.0 내지 5.0 w/v%의 과당; 0.5 내지 4.0 w/v%의 대두분; 0.1 내지 1 w/v%의 황산마그네슘을 포함함으로써, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율을 높일 수 있다.The medium is more preferably 1.0 to 5.0 w / v% fructose; Soy flour of 0.5 to 4.0 w / v%; By including 0.1 to 1 w / v% magnesium sulfate, it is possible to increase the yield of spores of the Simpliclium lamellicola BCP strain.

또한, 상기 배지에는 염화칼륨, 이인산칼륨 및 황산철과 같은 무기물원이 추가로 포함될 수 있으며, 상기 배지 중에는 0.1 내지 1 w/v%의 염화칼륨; 0.05 내지 0.5 w/v%의 이인산칼륨; 및 0.0001 내지 0.01 w/v%의 황산철이 포함될 수 있다. In addition, the medium may further include an inorganic source such as potassium chloride, potassium diphosphate and iron sulfate, and the medium includes 0.1 to 1 w / v% of potassium chloride; 0.05-0.5 w / v% potassium diphosphate; And 0.0001 to 0.01 w / v% of iron sulfate.

본 발명은 상기 언급된 배지 조성물 중에서 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of culturing the Simpliclium lamella cola BCP strain in the above-mentioned medium composition.

상기 배지 조성에 따라 제조한 배지에 초기 농도 0.1 내지 5 w/v%, 보다 구체적으로 0.5 내지 2 w/v% 수준의 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 씨드를 접종한다. 상기 농도범위 밖에서는 생육이 다소 낮아질 우려가 있다.The medium prepared according to the medium composition is inoculated with a Simlyllium lamelicola BCP strain seed having an initial concentration of 0.1 to 5 w / v%, more specifically 0.5 to 2 w / v%. Outside the concentration range, there is a fear that growth is somewhat lower.

배양 시, 배양 온도는 15 내지 37 ℃, 바람직하게 15 내지 33℃, 보다 바람직하게 20 내지 25℃로 할 수 있다. 배양 온도가 15℃ 이하인 경우, 생육 정도는 증가하나 생육 속도가 늦고 포자형성 수율이 크게 떨어질 우려가 있으며, 37℃ 이상인 경우 오염이 쉽게 일어나고 최종 배양산물의 양도 감소할 우려가 있다.In the culture, the culture temperature may be 15 to 37 ° C, preferably 15 to 33 ° C, more preferably 20 to 25 ° C. If the culture temperature is 15 ℃ or less, the growth rate is increased, but the growth rate is slow and the spore formation yield may be greatly reduced, if it is above 37 ℃ contamination occurs easily and the amount of the final culture product may be reduced.

배양 시, pH는 3 내지 8로 조절하는 것이 적합하며, 바람직하게 pH 3.5 내지 6, 보다 바람직하게 pH 4 내지 5일 수 있다. pH 3 미만에서는 생육이 거의 불가능하고, 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있고, pH 8을 초과하는 경우 최종 배양산물의 양이 감소할 수 있다. 상기 pH는 배양 초기의 pH를 말하며, 배양 초기란 영양배지를 멸균하고 심플리실리움 균을 접종하기 전 상태에서 균을 접종한 직후까지를 말한다. pH 조정은 멸균 이전에 이루어지나 최종적인 pH 측정은 멸균 직후에 이루어지므로 최초로 균을 접종하여 생장하기 시작하는 시기의 pH를 배양 초기 pH로 잡는다.In culture, the pH is suitably adjusted to 3 to 8, preferably pH 3.5 to 6, more preferably pH 4 to 5. If the pH is less than 3, it is almost impossible to grow, there is a fear that the yield of spore production is low, and if the pH is exceeded 8, the amount of the final culture may decrease. The pH refers to the pH of the initial culture, the initial culture refers to the sterilization of the nutrient medium and immediately after the inoculation of the bacteria in the state before the inoculation of the simple bacilli. The pH adjustment is made before sterilization, but the final pH measurement is made immediately after sterilization, so the pH at the time of inoculation and growth of the first bacteria is taken as the initial pH of the culture.

배양시, 배양 기간은 500 내지 5000 L 배양기 기준으로, 20시간 이상, 구체적으로 30시간 내지 7일, 보다 구체적으로 50시간 내지 6일일 수 있다. 배양 기간이 20시간 미만인 경우, 포자 보다 균사가 많아 건조 시 수율이 낮아질 우려가 있고, 배양 기간이 7일을 초과하는 경우 배양 과정에서 생긴 물질이 미생물을 사멸시켜 수율이 낮아질 우려가 있다. In the culture, the culture period may be 20 hours or more, specifically 30 hours to 7 days, more specifically 50 hours to 6 days on the basis of 500 to 5000 L incubator. If the incubation period is less than 20 hours, there is a fear that the yield is low when the drying period is more than the spores, and if the incubation period exceeds 7 days, the material produced during the culture process may kill the microorganisms and the yield may be lowered.

배양 시, 교반 속도 및 공기 투입율은 미생물의 생육에 맞추어 적절히 설정할 수 있으며, 배양 조건 및 상태에 따라 변동될 수 있다. 또한, 배양 시 생성되는 기포는 오염 등의 문제를 일으킬 수 있기 때문에 제거하는 것이 바람직하며, 예컨대 KONION GE-304 등과 같은 장치를 이용하여 소포를 실시할 수 있다. 초기 투입비율은 0.1 내지 1 w/v% 수준으로 할 수 있으며, 배양 중에 0.01 내지 0.1 w/v%의 수준으로 기포가 생길 때마다 투입하여 소포할 수 있다.In the culture, the stirring speed and the air input rate may be appropriately set according to the growth of the microorganism, and may vary depending on the culture conditions and conditions. In addition, since bubbles generated during the culture may cause problems such as contamination, it is preferable to remove them. For example, defoaming may be performed by using a device such as KONION GE-304. The initial input ratio may be 0.1 to 1 w / v% level, it can be injected into the vesicles every time bubbles are generated at the level of 0.01 to 0.1 w / v% during the culture.

최초 배양 직후 -90 내지 -10℃, 구체적으로 -80 내지 -20 ℃, 보다 구체적으로 -70 내지 -30 ℃의 온도로 동결하여 동결건조를 실시할 수 있으나, 배양액의 양이 많아 한 번에 동결을 시키기 어려운 경우에는 최종 pH를 5 미만으로 조정함으로써 오염과 미생물의 번식을 억제할 수 있다.
Immediately after the initial culture, the freeze-drying may be performed by freezing at a temperature of -90 to -10 ° C, specifically -80 to -20 ° C, more specifically -70 to -30 ° C, but freezing at a time due to the large amount of the culture solution. If it is difficult to reduce the contamination, the final pH can be adjusted to less than 5 to suppress contamination and propagation of microorganisms.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples according to the present invention and comparative examples not according to the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the examples given below.

<< 실시예Example 1> 1>

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 생장 배지를 제조하였다:Growth medium was prepared according to the composition described in Table 1 below:

배지 조성Badge composition 조성 성분Composition 함량(w/v%)Content (w / v%) 투입량(g/L)Input amount (g / L) 과당(Fructose)Fructose 3.03.0 3030 대두분(Soybean meal)Soybean meal 3.03.0 3030 MgSO4ㆍ7H2OMgSO 4 ㆍ 7H 2 O 0.50.5 55 KClKCl 0.50.5 55 K2HPO4 K 2 HPO 4 0.10.1 1One FeSO47H2OFeSO 4 7H 2 O 0.0010.001 0.010.01

<< 실험예Experimental Example >>

1. 균주 및 기본 배지 선정1. Selection of strains and basal medium

심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 한국화학연구원으로부터 분양받아 사용하였다[기탁번호: KCTC0639BP]. 상기 균주 1 w/v%를 배지에 접종하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.Simplicium lamelicola BCP strain was used by the Korea Research Institute of Chemical Technology [Accession Number: KCTC0639BP]. Inoculating the strain 1 w / v% in the medium was carried out the following experiment.

기본 배지로서 CDB(Czapek-Dox Broth: sucrose 30 g/L, sodium nitrate 3.0 g/L, dipotassium phosphate 1.0 g/L, magnesium sulfuate 0.5 g/L, potassium chloride 0.5 g/L, ferrous sulfate 0.01 g/L, pH 7.3)를 선정하였다.
CDB (Czapek-Dox Broth: sucrose 30 g / L, sodium nitrate 3.0 g / L, dipotassium phosphate 1.0 g / L, magnesium sulfuate 0.5 g / L, potassium chloride 0.5 g / L, ferrous sulfate 0.01 g / L , pH 7.3).

2. 물리적, 화학적 배양 조건 검토2. Review physical and chemical culture conditions

CDB 배지(50ml, 250ml-삼각플라스크)에서 배양 온도, 배양 초기 pH, 배양 시간과 같은 물리적, 및 화학적 배양 조건이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산량에 미치는 영향을 조사하였다. The effects of physical and chemical culture conditions such as culture temperature, initial pH and culture time on CDB medium (50ml, 250ml-triangular flasks) on the spore production of S. aureum B. sp.

PDA에서 7 ~ 10일간 자란 균총의 5×5㎟ 절편 5개를 접종하였다. 포자 생산 수율을 조사하기 위해서, 배양액 내 포자의 수를 400배 현미경 하에서 호모사이토미터를 이용하여 계수하였다. 배양액 내의 배양액의 물성은 대체로 균질적이었으나 전체적으로 작은 균체 덩어리가 다수 형성되었으며 현미경으로 관찰한 결과 이 덩어리에 많은 포자가 뭉쳐있는 것이 관찰되었다. 그래서 배양이 끝난 후 균질기로 10초간 마쇄하여 포자를 균질하게 풀어 준 후에 보르텍스 믹서(vortex mixer)로 충분히 현탁시킨 다음 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.
Five 5 × 5 mm sections of the flora grown on PDA for 7-10 days were inoculated. To examine the yield of spore production, the number of spores in the culture was counted using a homocytometer under a 400x microscope. The physical properties of the cultures in the culture were generally homogeneous, but a large number of small cell masses were formed as a whole, and microscopic observations showed that many spores were collected in the mass. Thus, after incubation, the homogenizer was crushed for 10 seconds to homogenize the spores, and then suspended in a vortex mixer, and the number of spores was counted. The test was repeated three times.

(1) 배양 온도에 따른 영향 측정(1) measuring the effect of incubation temperature

배지 제조 시 초기 pH는 7.3이었고, 배양 온도는 20, 22, 25, 27, 30℃로 달리하여 5일간 배양(120 rpm)한 다음, 위에 설명한 방법에 따라 배양액 내 포자 수를 계수하였다. Initial pH was 7.3 when the medium was prepared, the incubation temperature was changed to 20, 22, 25, 27, 30 ℃ for 5 days (120 rpm), and then the number of spores in the culture was counted according to the method described above.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP은 20℃ 이하의 저온에서는 포자 형성 수율이 다소 떨어졌고, 22℃가 최적 온도였으며, 25℃ 이후부터 포자 형성 수율이 떨어지는 경향을 나타내었다 [도 1].
Simplisium lamelicola BCP showed a slight drop in sporulation yield at a low temperature of 20 ° C. or lower, 22 ° C. at an optimum temperature, and a decrease in sporulation yield since 25 ° C. [FIG. 1].

(2) 배양 초기 (2) initial culture pHpH 에 따른 영향 측정The impact of

배양 온도는 22℃로 고정하였고, 배지의 pH는 HCl과 NaOH를 사용하여 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조정하여 5일간 배양(120 rpm)한 다음, 배양액 내 포자 수를 계수하였다. The culture temperature was fixed at 22 ℃, the pH of the medium was adjusted to 4, 5, 6, 7, 8 using HCl and NaOH for 5 days incubation (120 rpm), and the number of spores in the culture was counted.

배지의 초기 pH가 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율에 미치는 영향을 검토한 결과 7.0 이상의 염기성 pH에서는 포자 생산 수율이 낮았고 pH 4.0 ~ 5.0에서 우수하였으며 6.0 이상에서는 낮아졌다. 최적 pH는 4.5로 판단되었다[도 2].
As a result of examining the effect of the initial pH of the medium on the spore production yield of the Simlyillium lamelicola BCP, the spore production yield was low at the basic pH of 7.0 or higher, excellent at pH 4.0 ~ 5.0, and lower than the 6.0. The optimum pH was determined to be 4.5 [FIG. 2].

(3) 배양 시간에 따른 영향(3) Effect of incubation time

상기 두 실험에서 결정된 최적 온도 22℃와 최적 초기 pH 4.5 조건으로 1L 플라스크(working volume 200 ml)에서 3회 반복으로 9일간 배양(150 rpm)하면서 24시간 간격으로 5 ml씩 시료를 채취하여 배양액 내 포자 수를 계수하였다. Samples were taken at 5 ml intervals at 24 hour intervals during a 9-day incubation (150 rpm) for 3 days in a 1 L flask (working volume 200 ml) at an optimum temperature of 22 ° C. and an optimum initial pH of 4.5 determined in the two experiments. Spore count was counted.

배양 시간에 따른 포자 생산 추이를 조사한 결과 3일째까지는 포자가 거의 형성되지 않다가 3일 이후부터 급속히 형성되기 시작하여 5일째 거의 최대 수준에 도달하였으며, 8일까지 일정 수준을 유지하였다(도 3).
As a result of investigating the trend of spore production according to the incubation time, almost no spores were formed until the 3rd day and rapidly formed after the 3rd day and reached almost the maximum level on the 5th day, and remained constant until the 8th day (FIG. 3). .

3. 배지 최적화 조건 실험3. Experiment of medium optimization condition

(1) (One) 탄소원에On carbon 따른 영향 측정 Impact measurement

탄소원이 포자 생산 수율이 미치는 영향을 조사하기 위하여 CDB 배지의 탄소원으로 쓰이고 있는 수크로오스(sucrose)를 각각 다른 탄소원 1.5%(w/v)로 대체 첨가하여 제조하였다. 이 실험에서 시험한 탄소원은 가용성 전분(soluble starch), 덱스트린(dextrin), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 만니톨(mannitol), 갈락토오스(galactose), 과당(fructose), 글루코오스(glucose), CMC였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였고 배양액의 물성도 조사하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.In order to investigate the effect of spore production yield on the carbon source, sucrose, which is used as the carbon source of CDB medium, was prepared by substituting 1.5% (w / v) of different carbon sources. Carbon sources tested in this experiment were soluble starch, dextrin, maltose, lactose, mannitol, galactose, fructose, glucose, and CMC. It was. Culture conditions were fixed at a temperature of 22 ℃, initial pH 4.5, 120 rpm and incubated for 5 days. The number of spores in the final culture was counted and the physical properties of the culture were also investigated. The test was repeated three times.

탄소원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과 기본 배지인 CDB의 수크로오스 보다 우수한 효과별로 보인 탄소원은 과당이었고, 나머지 탄소원들은 수크로오스 보다 포자 생산 수율이 낮았을 뿐만 아니라 배양액의 물리적인 특성도 불리하였다(표 2). 가용성 전분은 균사덩어리가 매우 크게 형성되었고 말토오스, 락토오스, 갈락토오스도 비교적 큰 균사덩어리가 매우 많이 형성되었던 반면, 포자수는 낮았다. 글루코오스는 균사덩어리가 비교적 적은 편이었지만 포자수가 낮았다. 덱스트린은 배양액이 덩어리가 거의 없이 매우 균질적이었으나, 포자수가 비교적 낮은 편이었다. 과당은 기본 배지 CDB 보다는 덜 균질적이었지만, 포자수가 CDB 약 47% 증가하였고, 균사 덩어리도 거의 볼 수 없었다. 만니톨과 CMC에서는 곰팡이 생장이 일어나지 않았다. 이것은 이 형태의 탄소원을 심플리실리움 라멜리콜라 BCP이 이용하지 못하기 때문으로 생각되었다. As a result of investigating the effect of carbon source on the spore production yield, the carbon source showed better effect than sucrose of CDB, the basal medium, and fructose was lower than other sucrose. 2). Soluble starch had a very large mycelial mass, and maltose, lactose and galactose also had a relatively large mycelial mass, while the spore count was low. Glucose had a relatively low mycelial mass but low spore count. Dextrin was very homogenous with little lumps in culture, but had a relatively low spore count. Fructose was less homogeneous than basal medium CDB, but spore count increased about 47% and little mycelial mass was seen. Mold growth did not occur in mannitol and CMC. This was thought to be due to the fact that the carbon source of this type was not available to the Simlyillium lamelicola BCP.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 탄소원의 영향Effects of Carbon Sources on Spore Production Yield and Culture Characteristics of Simpliclium Lamelicola BCP 탄소원
(1.5 w/v%)
Carbon source
(1.5 w / v%)
포자 밀도
(conidia/ml)
Spore Density
(conidia / ml)
배양액의 특성Characteristics of culture
가용성 전분(Soluble starch)Soluble starch 3.2E+63.2E + 6 균사덩어리 형성 (+++)Mycelial mass formation (+++) 덱스트린(Dextrin)Dextrin 4.2E+74.2E + 7 균질적(+++)Homogeneous (+++) 말토오스(Maltose)Maltose 6.3E+66.3E + 6 균사덩어리 형성(++)Mycelial mass formation (++) 락토오스(Lactose)Lactose 1.9E+71.9E + 7 균사덩어리 형성(++)Mycelial mass formation (++) 만니톨(Manitol)Manitol 생장하지 않음Not growing -- 갈락토오스(Galactose)Galactose 7.5E+67.5E + 6 균사덩어리 형성(++)Mycelial mass formation (++) 과당(Fructose)Fructose 2.7E+82.7E + 8 균질적(+)Homogeneous (+) 글루코오스(Glucose)Glucose 3.4E+63.4E + 6 균사덩어리 형성(+)Mycelial mass formation (+) CMCCMC 생장하지 않음Not growing -- 수크로오스 (Czapek-Dox broth, 대조)Sucrose (Czapek-Dox broth, contrast) 1.7E+81.7E + 8 균질적(++)Homogeneous (++)

(2) 과당((2) fructose ( FructoseFructose ) 농도에 따른 영향 측정) Effect of concentration

상기 탄소원 실험에서 포자 생산 수율이 제일 높고 배양액의 물성도 우수했던 과당에 대하여 농도에 따른 포자 생산 수율을 조사하였다. CDB 기본 배지에서 탄소원으로 쓰이고 있는 수크로오스를 빼고 과당으로 대체하여 1.0 w/v%부터 1.0 w/v% 단위로 5.0 w/v%까지 과당 함량을 높여가며 배지를 제조하였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.In the carbon source experiment, the yield of spore production according to the concentration was investigated for fructose, which had the highest yield of spore production and excellent physical properties of the culture solution. The medium was prepared by removing the sucrose used as a carbon source from the CDB basal medium and replacing the fructose with an increase in the fructose content from 1.0 w / v% to 5.0 w / v% in units of 1.0 w / v%. Culture conditions were fixed at a temperature of 22 ℃, initial pH 4.5, 120 rpm and incubated for 5 days. Spore count was counted in the final culture. The test was repeated three times.

위의 탄소원 시험 결과에 따라 과당의 최적 농도를 조사하였다. 1.0 w/v%부터 1.0 w/v% 간격으로 5.0 w/v%까지 시험한 결과, 3.0 ~ 5.0 w/v%까지 높은 포자 생산 수율을 보여주었고 그 이전에는 감소하는 경향을 보였다(도 5). 과당의 탄소원 농도 변이를 고려하여 최적 조건은 3.0%로 정하였다.
The optimum concentration of fructose was investigated according to the above carbon source test results. Testing from 1.0 w / v% to 5.0 w / v% at intervals of 1.0 w / v% showed high yield of spore production from 3.0 to 5.0 w / v% and decreased before that (Figure 5). . Considering the variation in carbon source concentration of fructose, the optimum condition was set to 3.0%.

(3) 질소원에 따른 영향 측정(3) measuring the effect of nitrogen source

질소원이 포자 생산 수율이 미치는 영향을 조사하기 위하여 CDB 배지의 질소원으로 쓰이고 있는 NaNO3를 3 w/v%를 없애고 각각 다른 질소원을 1.0 w/v% 첨가하여 제조하였다. 탄소원은 앞의 실험에서 결정된 과당 3 w/v%로 수크로오스 3 w/v%를 대체하였다. 이 실험에서 시험한 질소원은 대두분, 이스트 추출물, 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 비프 추출물(beef extract), (NH4)2SO4, NH4Cl, NH2CO2, NH3NO3였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다. In order to investigate the effect of nitrogen source spore production yield, NaNO 3 used as a nitrogen source of CDB medium was removed by removing 3 w / v% and adding 1.0 w / v% of each other nitrogen source. The carbon source replaced 3 w / v% sucrose with 3 w / v% fructose determined in the previous experiment. The nitrogen sources tested in this experiment were soybean meal, yeast extract, tryptone, peptone, beep extract, (NH 4 ) 2 SO 4 , NH 4 Cl, NH 2 CO 2 , NH 3 NO 3 . Culture conditions were fixed at a temperature of 22 ℃, initial pH 4.5, 120 rpm and incubated for 5 days. Spore count was counted in the final culture.

질소원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과, 기본 배지인 CDB의 질산나트륨보다 우수한 효과별로 보인 질소원은 대두분(soybean meal) 및 트립톤이었다(표 3). 전반적으로 암모니아 형태의 질소원은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP이 잘 이용하지 못하는 것으로 나타났다.As a result of investigating the effect of nitrogen source on spore production yield, soybean meal and tryptone were shown to be superior to sodium nitrate in basal medium CDB (Table 3). Overall, the nitrogen source in the form of ammonia was found to be poorly used by the Simlyillium lamelicola BCP.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 질소원의 영향Influence of Nitrogen Sources on Spore Production Yield and Culture Characteristics of Simplisium Lamelicola BCP 질소원
(1.0 w/v%)
Nitrogen source
(1.0 w / v%)
포자 밀도
(conidia/ml)
Spore Density
(conidia / ml)
대두분(Soybean meal)Soybean meal 5.0E+85.0E + 8 이스트 추출물(Yeast extract)Yeast extract 2.8E+82.8E + 8 트립톤(Tryptone)Tryptone 1.4E+81.4E + 8 펩톤(Peptone)Peptone 7.5E+77.5E + 7 비프 추출물(Beef extract)Beef extract 1.2E+61.2E + 6 (NH4)2SO4 (NH 4 ) 2 SO 4 1.3E+41.3E + 4 NH4ClNH 4 Cl <1.0E+4(검출한계 이하)<1.0E + 4 (below detection limit) NH2CO2 NH 2 CO 2 <1.0E+4(검출한계 이하)<1.0E + 4 (below detection limit) NH3NO3 NH 3 NO 3 1.2E+71.2E + 7 NaNO3 (Czapek-Dox broth, 대조)NaNO 3 (Czapek-Dox broth, control) 1.2E+81.2E + 8

(4) 대두분((4) soybean meal ( SoybeanSoybean mealmeal ) 농도에 따른 영향 측정 ) Effect of concentration

상기 질소원 실험에서 포자 생산 수율이 제일 높았고 배양액의 물성도 우수했던 대두분에 대하여 농도에 따른 포자 생산 수율을 조사하였다. 기본 배지 CDB에서 탄소원은 과당 3 w/v%를 사용하였고 질소원은 대두분을 0.5 w/v%부터 4.0 w/v%까지 1.0 w/v%씩 증가시켜 배지를 제조하였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.In the nitrogen source experiment, the yield of spore production according to the concentration was investigated for the soybean meal having the highest yield of spores and excellent physical properties of the culture solution. In the basal medium CDB, the carbon source was 3 w / v% of fructose and the nitrogen source was prepared by increasing the soy flour by 1.0 w / v% from 0.5 w / v% to 4.0 w / v%. Culture conditions were fixed at a temperature of 22 ℃, initial pH 4.5, 120 rpm and incubated for 5 days. Spore count was counted in the final culture. The test was repeated three times.

위 질소원 실험에서 우수한 질소원으로 선발된 대두분의 최적 농도를 알아보기 위하여 0.5 w/v%부터 1.0 w/v% 단위로 4.0 w/v%까지 농도 시험을 시행한 결과 3.0 ~ 4.0 w/v%에서 최대 포자 생산 수율을 보였다(도 6). 그러나, 2.0 w/v% 이하에서는 급격히 포자 생산 수율이 감소하는 것으로 나타났다. 대두분의 질소원 농도 변이 및 원료비용 등을 고려하여 최적 조건은 3.0 w/v%로 정하였다.
In order to determine the optimal concentration of soy flour selected as an excellent nitrogen source in the above nitrogen source experiment, the concentration test was performed from 0.5 w / v% to 4.0 w / v% in units of 1.0 w / v% from 3.0 to 4.0 w / v%. Showed the maximum spore production yield (Fig. 6). However, below 2.0 w / v%, the yield of spores was rapidly decreased. Considering the variation of nitrogen source concentration of soy flour and raw material cost, the optimum condition was set to 3.0 w / v%.

(5) (5) 무기물원에In mineral garden 따른 영향 Effect

CDB에서 무기물원으로 함유되어 있는 이인산칼륨(Dipotassium phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfuate), 염화칼륨(potassium chloride), 황산철(ferrous sulfate)을 빼고 9가지 무기물(magnesium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, ferrous sulfate, calcium chloride, cupric sulfate, magnesium chloride, Zinc sulfate, barium chloride)을 한 가지씩 0.1 w/v% 첨가하여 포자 생산 수율에 미치는 영향을 시험하였다. 탄소원은 과당 3.0 w/v%, 질소원은 대두분 3.0 w/v%를 첨가하였다. 배양조건은 배양온도 25℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였고 시험은 3회 반복하였다.Nine minerals (magnesium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, potassium chloride, potassium sulfate, potassium sulfate, ferrous sulfate) except potassium diphosphassium (phosphate), magnesium sulfate (potassium chloride), and ferrous sulfate in the CDB Ferrous sulfate, calcium chloride, cupric sulfate, magnesium chloride, Zinc sulfate, barium chloride) were added to the yield of spores by adding 0.1 w / v%. A carbon source of 3.0 w / v% of fructose and a nitrogen source of 3.0 w / v% were added. Culture conditions were incubated for 5 days at 25 ℃, initial pH 4.5, 120 rpm. Spore count in the final culture was counted and the test was repeated three times.

각종 무기물원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과, 단일 무기물이 포자 생산 수율을 증가시키는 효과는 나타나지 않았다(표 4). 이것은 여러 무기물이 동시에 일정양이 필요하거나 어느 한 가지가 절대적으로 필요하지는 않다는 것을 의미할 수 있다. As a result of investigating the effect of various mineral sources on the yield of spores, there was no effect of increasing the yield of spores from a single mineral (Table 4). This may mean that several minerals need a certain amount at the same time, or that neither is absolutely necessary.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 무기물원의 영향Influence of Mineral Sources on Spore Production Yield and Culture Characteristics of Simplisium Lamelicola BCP 무기물원
(0.1 w/v%)
Mineral garden
(0.1 w / v%)
포자 밀도
(conidia/ml)
Spore Density
(conidia / ml)
황산마그네슘(Magnesium sulfate)Magnesium Sulfate 1.0E+81.0E + 8 염화나트륨(Sodium chloride)Sodium chloride 2.3E+72.3E + 7 염화칼륨(Potassium chloride)Potassium chloride 1.8E+81.8E + 8 황산철(Ferrous sulfate)Ferrous sulfate 1.6E+71.6E + 7 염화칼슘(Calcium chloride)Calcium chloride 8.2E+78.2E + 7 황산동(Cupric sulfate)Cupric sulfate 5.6E+75.6E + 7 염화마그네슘(Magnesium chloride)Magnesium chloride 1.2E+81.2E + 8 황산아연(Zinc sulfate)Zinc sulfate 5.6E+75.6E + 7 염화바륨(Barium chloride)Barium chloride <1.0E+4<1.0E + 4

이 실험으로 필요한 무기물원을 결정하기 어렵기 때문에 CDB에서 주로 사용되는 무기물원을 중심으로 주요인 효과를 찾아내는 PBD 기술을 적용하여 주로 필요한 무기물원을 선정하고자 하였다.
Because it is difficult to determine the mineral source required by this experiment, we tried to select the mineral source that is needed mainly by applying the PBD technology that finds the main effect centering on the mineral source that is mainly used in CDB.

(6) PBD((6) PBD ( PlackettPlackett -- BurmanBurman DesignDesign ))

상기 실험에서 탄소원으로 선발된 과당과 질소원으로 선발된 대두분을 포함하여 기존의 질소원 질산나트륨과 기본 배지 CDB의 무기물 4가지(magnesium sulfate, dipotassium phosphate, potassium chloride, ferrous sulfate) 중에서 포자 생산 수율에 크게 영향을 미치는 요인을 찾아내기 위하여 PBD(Plackett-Burman Design)에 따라 시험하였다. PBD란 사용된 배지성분이 생장에 어떤 영향을 주는지를 알 수 있는 통계적 처리 방법이며, 이것은 배지 성분 중 주효과를 나타내는 성분들을 찾아낼 수 있다. In the above experiment, the yield of spores was greatly increased in the yield of four minerals (magnesium sulfate, dipotassium phosphate, potassium chloride, ferrous sulfate) of the existing nitrogen source sodium nitrate and the basic medium CDB including fructose selected as a carbon source and soy flour selected as a nitrogen source. The test was conducted according to the PBD (Plackett-Burman Design) to find out the factors influencing. PBD is a statistical method of knowing how the media component used affects the growth, and it can find out the components of the media component that exhibit the main effect.

PBD는 하기 표 5와 같이 12개의 실험군과 3개의 기준군을 사용하고 12개의 실험군에는 +run 은 200% 의 배지 성분을, -run 은 20%의 배지 성분으로 하여 12개 run을 각각 배지별로 +6개, -6개씩 무작위화 하여 만든 배지와 중심값인 0값으로 이뤄진 배지(기준군)를 3개 만들어 그 값을 기준으로 한다. 1~12번까지는 +와 - 의 무작위화한 배지 조성에 의한 것이고, 1315번은 중심값에 의한 배지 조성이다. 이 각 run에 대하여 얻어진 포자 밀도값에 대하여 표준 편차 의해 그 실행치의 증가가 그 값에 어떤 효과를 보여주는지를 알 수 있게 된다. 주효과는 각 성분에 대한 +run의 표준편차 값에서 -run 값을 뺀 것으로 나타내는데 +표준편차 값이 높은 것일수록 주요 효과를 나타내는 배지 성분이 되며, 이 성분의 증가가 세포의 성장에 절대적인 도움이 된다는 것을 의미한다.PBD uses 12 test groups and 3 reference groups as shown in Table 5 below, and 12 run groups were used for 12 run groups with + run for 200% of medium components and -run for 20% of medium components. Make three badges (reference group) consisting of six randomized and -6 randomized badges and a median of zero. Numbers 1-12 are due to the randomized media composition of + and-, and 1315 is the media composition by the median. With respect to the spore density values obtained for each of these runs, the standard deviation shows how the increase in the run value affects the values. The main effect is indicated by subtracting the -run value from the standard deviation value of + run for each component.The higher the standard deviation value is, the more important the media component is.The increase in this component is absolutely helpful for cell growth. It means.

이 연구에 적용한 Plackett-Burman Design(PBD)Plackett-Burman Design (PBD) applied to this study RunRun FructoseFructose Soybean
meal
Soybean
meal
Magnesium
sulfate
Magnesium
sulfate
Sodium
nitrate
Sodium
nitrate
Dipotassium phosphateDipotassium phosphate Potassium chloridePotassium chloride Ferrous
sulfate
Ferrous
sulfate
1One +(30)+ (30) -(3.0)-(3.0) +(5.0)+ (5.0) -(0.3)-(0.3) -(0.1)-(0.1) -(0.5)-(0.5) +(0.01)+ (0.01) 22 +(30)+ (30) +(30)+ (30) -(0.5)-(0.5) +(3.0)+ (3.0) -(0.1)-(0.1) -(0.5)-(0.5) -(0.001)-(0.001) 33 -(3.0)-(3.0) +(30)+ (30) +(5.0)+ (5.0) -(0.3)-(0.3) +(1.0)+ (1.0) -(0.5)-(0.5) -(0.001)-(0.001) 44 +(30)+ (30) -(3.0)-(3.0) +(5.0)+ (5.0) +(3.0)+ (3.0) -(0.1)-(0.1) +(5.0)+ (5.0) -(0.001)-(0.001) 55 +(30)+ (30) +(30)+ (30) -(0.5)-(0.5) +(3.0)+ (3.0) +(1.0)+ (1.0) -(0.5)-(0.5) +(0.01)+ (0.01) 66 +(30)+ (30) +(30)+ (30) +(5.0)+ (5.0) -(0.3)-(0.3) +(1.0)+ (1.0) +(5.0)+ (5.0) -(0.001)-(0.001) 77 -(3.0)-(3.0) +(30)+ (30) +(5.0)+ (5.0) +(3.0)+ (3.0) -(0.1)-(0.1) +(5.0)+ (5.0) +(0.01)+ (0.01) 88 -(3.0)-(3.0) -(3.0)-(3.0) +(5.0)+ (5.0) +(3.0)+ (3.0) +(1.0)+ (1.0) -(0.5)-(0.5) +(0.01)+ (0.01) 99 -(3.0)-(3.0) -(3.0)-(3.0) -(0.5)-(0.5) +(3.0)+ (3.0) +(1.0)+ (1.0) +(5.0)+ (5.0) -(0.001)-(0.001) 1010 +(30)+ (30) -(3.0)-(3.0) -(0.5)-(0.5) -(0.3)-(0.3) +(1.0)+ (1.0) +(5.0)+ (5.0) +(0.01)+ (0.01) 1111 -(3.0)-(3.0) +(30)+ (30) -(0.5)-(0.5) -(0.3)-(0.3) -(0.1)-(0.1) +(5.0)+ (5.0) +(0.01)+ (0.01) 1212 -(3.0)-(3.0) -(3.0)-(3.0) -(0.5)-(0.5) -(0.3)-(0.3) -(0.1)-(0.1) -(0.5)-(0.5) -(0.001)-(0.001) 1313 0(16.5)0 (16.5) 0(16.5)0 (16.5) 0(2.75)0 (2.75) 0(1.75)0 (1.75) 0(0.55)0 (0.55) 0(2.75)0 (2.75) 0(0.0055)0 (0.0055) 1414 0(16.5)0 (16.5) 0(16.5)0 (16.5) 0(2.75)0 (2.75) 0(1.75)0 (1.75) 0(0.55)0 (0.55) 0(2.75)0 (2.75) 0(0.0055)0 (0.0055) 1515 0(16.5)0 (16.5) 0(16.5)0 (16.5) 0(2.75)0 (2.75) 0(1.75)0 (1.75) 0(0.55)0 (0.55) 0(2.75)0 (2.75) 0(0.0055)0 (0.0055)

* 괄호안의 값은 각 성분의 함량(g/L)* The values in parentheses indicate the content of each component (g / L)

최적 탄소원 과당과 최적 질소원 대두분 외에 어느 무기물원이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율을 향상시키는데 필요한지를 알아보기 위하여 PBD 기술을 적용하였다. 그 결과, 과당, 대두분, 황산마그네슘, 염화칼륨의 함량은 더 높여주는 것이 포자 생산 수율에 유리한 것으로 나타났고, 반대로 질산나트륨의 함량은 줄이는 것이 유리한 것으로 나타났다(도 7). 이인산칼륨, 황산철은 포자 생산 수율에 큰 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다.
In addition to the optimal carbon source fructose and the optimum nitrogen source soy flour, PBD technology was applied to find out which mineral source is needed to improve the yield of spore production of the Simlyillium lamelicola BCP. As a result, it was found that increasing the content of fructose, soy flour, magnesium sulfate, and potassium chloride is advantageous for the yield of spores, and conversely, it is advantageous to reduce the content of sodium nitrate (FIG. 7). Potassium diphosphate and iron sulfate did not appear to have a significant effect on the yield of spore production.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 액체배양 배지 조성Composition of liquid culture medium of S. simillium lamelicola BCP strain 성분ingredient 농도 (g/L)Concentration (g / L) 함량(w/v%)Content (w / v%) 과당fruit sugar 30.0 30.0 33 대두분Soy flour 30.0 30.0 33 MgSO4ㆍ7H2OMgSO 4 ㆍ 7H 2 O 5.05.0 0.50.5 KClKCl 5.05.0 0.50.5 K2HPO4 K 2 HPO 4 1.0 1.0 0.10.1 FeSO4ㆍ7H2OFeSO 4 7 H 2 O 0.01 0.01 0.0010.001

상기 실험 결과를 종합하여 하기 표 7과 같은 최적 배지 조성을 정하였다. PBD 결과에서 양을 늘리는 것이 유리하다고 판단되었던 황산마그네슘(magnesium sulfate)과 염화칼륨(potassium chloride)의 양은 CDB의 함량 기준 0.05 w/v% 보다 높게 0.5 w/v%로 정하였다. 대신 함량을 줄이는 것이 유리하다고 판단되었던 질산나트륨(sodium nitrate)은 배지 조성에서 제거하였다. PBD에서 주효과가 크게 나타나지 않았던 이인산칼륨(dipotassium phosphate), 황산철(ferrous sulfate)은 CDB와 동일한 함량으로 정하였다. 과당과 대두분의 함량은 PBD 결과에 따르면 함량을 늘리는 것이 포자 생산 수율을 올리는데 유리한 것으로 나타났지만 농도별 결과에 따라 농도를 올릴 경우 억제 효과가 나타날 우려가 있었으므로 앞서 실험에서 결정된 최적 농도로 정하였다.By combining the results of the experiment to determine the optimum medium composition as shown in Table 7. The amount of magnesium sulfate and potassium chloride, which was considered to be advantageous in the PBD results, was set to 0.5 w / v% higher than 0.05 w / v% based on the CDB content. Instead sodium nitrate (sodium nitrate), which was considered advantageous in reducing the content, was removed from the medium composition. Potassium diphosphate (dipotassium phosphate) and ferrous sulfate (ferrous sulfate), which did not show a major effect in PBD, were set to the same content as CDB. According to the PBD results, it was found that increasing the content of fructose and soy flour was advantageous to increase the yield of spore production, but according to the results of concentration, there was a risk of inhibitory effect when the concentration was increased. .

최적 배지 조성Optimal medium composition 성분ingredient 함량(g/L)Content (g / L) 함량(w/v%)Content (w / v%) 과당fruit sugar 30.030.0 33 대두분Soy flour 30.030.0 33 황산마그네슘(Magnesium sulfate)Magnesium Sulfate 5.05.0 0.50.5 염화칼륨(Potassium chloride)Potassium chloride 5.05.0 0.50.5 이인산칼륨(Dipotassium phosphate)Dipotassium phosphate 1.01.0 0.10.1 황산철(Ferrous sulfate)Ferrous sulfate 0.010.01 0.0010.001

상기 표 7의 최적 배지 조성과 PDB(포테이토 덱스트로스 배지)로 심플리실리움 라멜리콜라 BCP를 배양한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.8 and 9 show the results of culturing the Simlyillium lamelicola BCP with the optimum medium composition and PDB (potato dextrose medium) shown in Table 7 above.

Claims (10)

과당, 덱스트린 및 수크로오스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및
대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원
을 배지성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물.
At least one carbon source selected from the group consisting of fructose, dextrin and sucrose; And
One or more nitrogen sources selected from the group consisting of soybean meal and tryptone
Simplicillium lamelilla BCP ( Simiplicillium lamellicola BCP) strain culture medium composition comprising a as a medium component.
제 1 항에 있어서,
황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 염화칼슘, 이인산칼륨, 황산구리, 황산아연, 질산칼륨, 질산암모늄, 인산이수소칼륨, 요오드화칼륨 및 몰리브덴산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 무기물원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
The method of claim 1,
At least one mineral selected from the group consisting of magnesium sulfate, potassium chloride, magnesium chloride, sodium chloride, iron sulfate, calcium chloride, potassium diphosphate, copper sulfate, zinc sulfate, potassium nitrate, ammonium nitrate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide and sodium molybdate A culture medium composition for the culture of simplicity lamella cola BCP strain further comprising a circle.
제 1 항에 있어서,
상기 배지에 1.0 내지 5.0 w/v%의 탄소원 및 0.5 내지 4.0 w/v%의 질소원이 함유되는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
The method of claim 1,
The culture medium composition for simplicity lamella cola BCP strains, characterized in that the medium contains 1.0 to 5.0 w / v% carbon source and 0.5 to 4.0 w / v% nitrogen source.
제 1 항에 있어서,
상기 배지는 1.0 내지 5.0 w/v%의 과당; 0.5 내지 4.0 w/v%의 대두분; 0.1 내지 1 w/v%의 황산마그네슘을 필수 배지성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
The method of claim 1,
The badge is 1.0 To 5.0 w / v% fructose; Soy flour of 0.5 to 4.0 w / v%; A culture medium composition for simplicity lamella cola BCP strains comprising 0.1 to 1 w / v% of magnesium sulfate as an essential medium component.
제 4 항에 있어서,
0.1 내지 1 w/v%의 염화칼륨; 0.05 내지 0.5 w/v%의 이인산칼륨; 및 0.0001 내지 0.01 w/v%의 황산철을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
The method of claim 4, wherein
0.1 to 1 w / v% potassium chloride; 0.05-0.5 w / v% potassium diphosphate; And 0.0001 to 0.01 w / v% of iron sulfate.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
A method of culturing the Simpliclium lamellicola BCP strain in the medium composition of any one of claims 1 to 5.
제 6 항에 있어서,
상기 배지에 0.1 내지 5 w/v%의 심플리실리움 라멜리콜라 BCP를 접종하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
The method according to claim 6,
Method for culturing the simplicity lamellicola BCP strain, characterized in that the medium is inoculated with 0.1 to 5 w / v% of the simplicity lamellicola BCP.
제 6 항에 있어서,
배양 온도가 15 내지 37℃인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
The method according to claim 6,
Method for culturing the Simpliclium lamella cola BCP strain, characterized in that the culture temperature is 15 to 37 ℃.
제 6 항에 있어서,
배양 pH가 3 내지 8인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
The method according to claim 6,
Method for culturing the Simpliclium lamella cola BCP strain, characterized in that the culture pH is 3 to 8.
제 6 항에 있어서,
배양 기간이 20시간 이상인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
The method according to claim 6,
A method of culturing the Simlyillium lamella cola BCP strain, characterized in that the culture period is 20 hours or more.
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