KR100864584B1 - 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의용도 - Google Patents

비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엑센딘의 라이신 잔기에 비오틴을 수식시킨 엑센딘-4 유도체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체는 천연 엑센딘과 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서 약물의 체내 안정성을 증가시키며 점막을 통한 흡수를 촉진시킴으로서, 인슐린 과다분비, 또는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동 억제, 위 또는 장 공복 억제, 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발될 수 있는 질환들의 치료에 이용가능하며, 특히 당뇨병, 비만 및 과민성 장 증후군에 유용하다.
엑센딘-4 , 비오틴, 당뇨, 비만, 인슐린

Description

비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도 {Exendin derivative linked biotin, method for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 비오틴 또는 이의 접합체로 수식된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, 이하 GLP-1)은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 제 2형 당뇨병인 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병 (Type Ⅱ diabetes, Non-insulin dependence diabetes mellitus, NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌장 β-세포 퇴화의 예방 및 신생 β-세포의 생성촉진에 의한 인슐린 분비능의 회복 등의 작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, GLP-1의 현저한 특성은 인슐린 요법, 또는 인슐린 발현 증가에 의해 작용하는 경구 용법 및 몇몇 유형을 이용하는 경우에 나타나는 저혈당증 관련 위험을 수반하지 않고 인슐린 분비를 자극하는 능력에 있다. 뿐만 아니라, 혈당 강하제인 술폰요소제 (sulfonylurea) 등의 장 기 복용에 따른 췌장 내 β-세포의 사멸 및 괴사 등의 부작용을 수반하지 않는 것으로 알려져 있으므로 제 2형 당뇨병의 치료에 있어서 매우 유효하다.　
그러나, GLP-1 자체의 활성이 불충분하고, 2가지의 절단된 자연 발생 펩티드인 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체 내에서 빠르게 제거되어 생체 내 반감기가 매우 짧다는 사실에 의해 GLP-1 펩티드가 관여하는 요법의 유용성이 제한되어 왔다. 특히, 내생적으로 생성된 디펩티딜 펩티다아제 IV (dipeptidyl peptidase-Ⅳ, 이하 DPP-Ⅳ)는 N-말단 히스티딘 (7번) 및 알라닌 잔기 (8번)를 제거함으로써 GLP-1 펩티드를 불활성화 시키며, 이것이 짧은 생체 내 반감기에 대한 주요 원인인 것으로 알려져 있다 [참고문헌: O' Harte et al., 2000].
이에 의하여, DPP-IV 저해제를 사용하여 GLP-1의 분해를 억제하거나(P93/01, NVP-LAF237, NVP-DPP728, 815541A, 823093, MK-0431 등) GLP-1 수용체 작용물질 또는 GLP-1 유도체를 이용하여 (엑센딘, 리라글루타이드, GLP-1/CJC-1131 등) 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1 펩티드의 소실 반감기를 연장시키거나 신체로부터 펩티드 제거율을 감소시키기 위한 다양한 접근법이 시도되고 있다.
또한, 혈당 농도를 저하시키는 다른 군의 폴리펩티드인 엑센딘은 존 엥 (John Eng)에 의해 처음 제시되었으며(미국 등록특허 제5424286호, 엑센딘-3 [서열번호:1] HSDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS 및 엑센딘-4 참조), 엑센딘-4는 아래와 같은 서열구조를 갖고 GLP-1(7-36)NH2와 일부 서열 유사성 (53%)을 나타낸다 [참고문헌: Goke et al., 1993].
His 1 - Gly - Glu - Gly - The - Phe - The - Ser - Asp - Leu - Ser - Lys 12 - Gln - Met - Glu - Glu - Glu - Ala - Val -Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu- Lys 27 -Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 (서열번호 2: HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS)
한편, 엑센딘은 독도마뱀 또는 구슬도마뱀의 독에서 발견되며 엑센딘-3은 멕시코 구슬도마뱀인 헬로더마 호리덤 (Heloderma horridum)의 독에 존재하고, 엑센딘-4는 아메리칸 독도마뱀인 헬로더마 서스펙텀 (Heloderma suspectum)의 독에 존재한다. 또한, 엑센딘-4는 2번 및 3번 위치에서만 엑센딘-3과 상이하다. 포유동물 류에서 DPP-IV에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며, DPP-IV에 대해 2분 이하의 반감기를 갖는 GLP-1보다 더 긴 반감기를 갖고 있다[참고문헌: Kieffer TJ et al., 1995]. 생체 내 실험에서 2~4시간의 반감기를 나타내며, 1일 2~3회 복강투여로 충분한 혈중 농도에 도달할 수 있음이 밝혀진 바 있다[참고문헌: Fineman MS et al., 2003]. 또한, 엑센딘-4는 위장관 운동성을 조절하고 음식섭취를 감소시켜주며, 혈장 글루카곤을 억제한다고 알려져 있는데(미국 등록특허 제6858576호, 제6956026호 및 제6872700호), 엑센딘-4의 혈당조절작용과 관련하여 엑센딘-4 단일요법 뿐만 아니라 술포닐우레아 또는 메트포민 등의 항당뇨병 치료제와의 병용요법 모두에서 28일간의 투여 후 1% 범위 내에서 혈액 내 포도당과 결합한 혈색소 (헤모글로빈)의 양을 의미하는 당화혈색소 (HbA1C)의 수치를 낮추었다고 보고되었다[참고문헌: Egan JM et al., 2003]. 최근에는 Byetta™라는 상표로 합성 엑센딘-4가 미국 식품의약품안전청으로부터 시판 허가되었다.
한편, 비타민은 인체의 여러 가지 생리조절에 없어서는 안 될 필수 영양소로서 인간의 물질대사와 성장 특히, 소화효소, 항체 및 지방산의 생산에 직접적으로 관여하고 이들의 결핍 시 다양한 질병을 수반하게 된다. 그러나 인간과 포유동물의 경우 이러한 비타민들의 합성능력을 상실하였기 때문에 외부로부터 얻는 것이 필수적이고, 따라서 인간의 소장 (small intestine)에는 이러한 비타민을 흡수할 수 있는 수송시스템이 매우 잘 발달되어 있는데, 이들은 농도 또는 pH등 다양한 환경조건에 따라 능동 수송시스템 (Passive transport system), 농도 의존성 수동 수송시스템 (Passive transport system), 세포간 투과수송시스템 (intracellular transport system), 수용체 매개에 의한 세포내 운반 경로 (receptor-mediated endocytotic pathway) 등의 방법으로 인체 안으로 흡수되며 그 장내부위 또한 매우 다양하다. 예를 들어 티아민 (thiamin)과 니아신 (niacin)의 경우 그 대부분이 십이지장에서 흡수되며, 시아노코발라민 (cyanocobalamin)의 경우 소장 전반에 걸쳐 흡수가 일어난다. 이들은 각기 특유의 흡수 시스템을 가지고 있는데 이 중 가장 잘 알려져 있는 시스템은 능동수송 (active transport)의 한 종류인 비오틴 흡수 시스템인 Na-의존성 비타민 수송시스템 (Na-dependent multivitamin transport system)이다. 상기 시스템은 소장 이외에 간, 신장이나 심장 등 인체의 다양한 장기에 고루 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 시스템의 소장에서의 비오틴에 대한 친화도 상수는 약 2.6 nM 정도로 알려져 있다.
이에 의해, 본 발명에서는 엑센딘의 특정 위치에 비오틴이 선택적으로 수식 된 엑센딘 유도체를 제공함으로써, 순도가 높고 엑센딘의 체내 잔존 시간을 증가시킬 뿐만 아니라 점막을 통하여 쉽게 흡수되어, 주사에 의한 천연 엑센딘 투여의 치료효과에 유사한 약동학적 프로필과 약리적 성질을 갖는 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체를 제공하고, 2) 이를 유효성분으로 함유하는 인슐린 분비촉진 또는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명은 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 엑센딘은 천연 또는 재조합 엑센딘 가운데 어떠한 엑센딘도 바람직하게 수식될 수 있고, 엑센딘-4 인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체는 엑센딘-4의 12번 라이신 위치에서 비오틴이 수식된 형태 (Lys12-Mono-Biotin-엑센딘-4, 이하 MB1-엑센딘-4), 엑센딘-4의 27번 라이신 위치에서 비오틴이 수식된 형태 (Lys27-Mono-Biotin-엑센딘-4, 이하 MB2-엑센딘-4) 및 엑센딘-4의 12번과 27번 라이신 위치에서 비오틴이 수식된 형태 (Lys12, 27-Di-Biotin-엑센딘-4, 이하 DB-엑센딘-4)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 엑센딘-4의 12번과 27번 라이신 위치에서 비오틴이 수식된 형태이다.　
또한 본 발명은 비오틴, 엑센딘 및 환원제를 완충용액 또는 유기용매에 첨가하여 반응시키는 단계 (단계 1); 상기 단계 1의 반응 혼합물을 일정온도 하에 빛을 차단하고 일정시간 동안 보관하는 단계 (단계 2); 상기 단계 2의 반응 완료 후, 미반응된 반응물들을 제거하는 단계 (단계 3) 및 상기 단계 3의 미반응된 반응물질이 제거된 생성물로부터 비오틴으로 수식된 엑센딘을 분리 및 정제하는 단계 (단계 4)를 포함하여 이루어지는 상기 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 단계 1에서 엑센딘에 대한 비오틴의 반응 몰비는 1 내지 4의 범위 내에서 적절하게 선택되는 것이 바람직하다. 적절한 상기 반응 몰비의 선택은 수식되는 비오틴의 분자 구조, 분자량뿐만 아니라 반응액의 pH, 반응 온도, 반응 시간 등을 고려해 바람직하게 선택될 수 있다.
상기 완충용액 또는 유기용매는 특별한 제한이 없으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 완충용액을 수식될 때 사용되는 비오틴에 따라 적절하게 선택 하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 단계 2의 보관온도 및 시간 상기 반응 몰비에 대하여 설명한 바와 같이, 수식되는 비오틴에 따라 적절하게 조절되는 것이 바람직하다. 4 ℃에서 6시간 동안 방치할 수도 있으며, 상온에서 더 짧은 시간 동안 방치할 수도 있다. 이는 수식되는 비오틴의 반응성의 정도와 관계된다. 방치되는 동안 수식반응이 수행되며, 적당한 시간의 경과 후, 글라이신 용액 및 트리플로로아세트산 용액 등을 사용하여 멈추게 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 단계 3의 미반응물의 제거는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들면, 적당한 완충용액, 예를 들면, PBS (phosphate buffered saline)와 같은 용액을 사용하여 투석법 (dialysis) 등에 의해 제거될 수 있다.
상기 단계 4의 분리 정제 등은 크기 배제 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 인슐린의 과다분비 또는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체을 유효성분으로 함유하는 조성물은 임상 투여 시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구로 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로오스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), PEG, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한 증식성 질환 또는 자가면역질환의 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1주 내지 2주에 수회 투여로도 유효 투여량의 투여가 가능하다. 또한 1일 유효투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 여러 번에 나누어 투입될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 엑센딘은 비오틴으로 수식됨으로써 체내 반감기가 증가되고, 천연 엑센딘과 유사한 생물학적 활성도를 나타낼 수 있다. 또한, 결합위치 및 결합수를 선택적으로 제한함으로써 이러한 요소들의 다양성으로부터 유발되는 부작용을 최소화시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체는 당뇨병 또는 비만 등과 같은 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환, 또는 과민성 장 증후군과 같은 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환 등을 예방 및 치료하는 데 유용하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 비오틴이 수식된 엑센딘-4 유도체의 제조
100 ㎕의 트리에틸아민 (TEA) (Sigma사, 9% TEA가 첨가된 DMSO 용액)을 100 ㎕의 엑센딘-4 (Bachem사, 0.3% TEA가 첨가된 DMSO 용액에서 10 mg/ml)을 첨가하고, 후속하여 100 ㎕의 비오틴-NHS (Sigma사, 0.3% TEA가 첨가된 DMSO 용액에서 0.8 mg/ml)을 첨가하여 잘 섞었다. 몰 비율은 1:2 (엑센딘-4 : Biotin-NHS)이며 혼합물은 실온에서 60분 동안 반응시켰고, 반응은 300 ㎕의 1% 트리풀로오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA)이 첨가된 증류수로 멈추게 하였다.
실시예 2: 비오틴이 수식된 엑센딘-4 유도체의 분리 정제와 확인
실시예 1을 통해 제조된 엑센딘-4 유도체들은 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, 이하 “RP-HPLC")로 분리하였다. 칼럼은 Jupiter RP-18 (250 × 10 mm, 5 μm, Phenomenex, USA)과 Capcell-pak RP-18 (250 × 4 mm, 5 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였으며, 이동상 조건은 36 ~ 41 % 용매 B (0.1% TFA가 첨가된 아세토나이트릴)와 64 ~ 59 % 용매 A (0.1% TFA가 첨가된 증류수)로 1 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. 각각의 피크는 UV흡광계 215 nm를 이용하여 정량하였다. 상기의 방법을 통하여 제조된 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체는 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 질량분석을 통하여 비오틴 접합 수를 확인하였다. 또한, 단백분해 효소인 라이신-C로 분해반응 후, MALDI-TOF 질량 분석기로 확인하였다. 정제된 각 결합체를 50 ㎕의 트리에틸아민-염산 완충액 (10 mmol/L; pH 7.4)에 1 mg/ml 농도로 용해한 뒤 50 ㎕의 효소 (1 mg/ml)를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 라이신C 분해 반응의 종료를 위해 5 μl의 10% (v/v) TFA를 첨가한 뒤, 반응 혼합물을 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석하였다.
　도 1과 2는 비오틴과 엑센딘-4의 반응 종료 후 혼합물 및 최종 분리한 수식된 엑센딘-4의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 반응 혼합물로부터 그림에 표 시된 4개의 서로 다른 물질을 분리하였고, 도 3에서와 같이 MALDI-TOF 질량 분석을 통하여 분리한 물질들의 분자량이 각각 미반응 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4와 일치함을 확인하였고, 분리한 수식된 엑센딘-4의 순도는 98% 이상이었다.
도 4는 비오틴과 엑센딘-4를 반응 시켜 분리한 물질을 라이신-C로 효소 분해 반응 후 반응액을 각각 MALDI-TOF 질량 분석하여 그 물질들이 각각 미반응 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4임을 확인하였다.
실시예 3: 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 생물학적 안정성 분석
　실시예 1 내지 2를 통하여 제조 및 분리한 수식된 엑센딘-4 유도체의 생물학적 안정성은 엑센딘-4를 주로 분해하는 효소인 트립신, 장액(intestinal homogenate)을 이용한 시간-잔존량 분석을 통하여 진행하였다.
<3-1> 트립신 효소에서의 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 안정성 분석실험
20 ㎕의 엑센딘-4와 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체를 각각 20 μl의 2 mM 트립신 (25 mM Phosphate Buffer, pH 6.5) 에 첨가한 후 37℃의 수용액에서 반응 시켰다. 반응은 100 ㎕의 1% TFA가 첨가된 증류수로 멈추게 하고 각 시간별로의 혼합물은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 방법은 실시예 2에서 언급한 바와 같으며 이동상 조건은 36 ~ 42%의 용매 B로 1 ml/min 유속을 유지하면서 10분 동안 진행하였다.
도 5는 트립신 효소에서의 엑센딘-4와 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 시간-잔존량 분석 결과이다. 도면에 나타낸 바와 같이 DB-엑센딘-4는 엑센딘-4에 비하여 트립신에 훨씬 강한 분해 저항성을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 트립신효소에서의 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 안정성 분석결과는 표 1에 나타내었다. 표1에 나타낸 바와 같이 엑센딘-4, MB-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 반감기는 각각 2.3분, 2.7분 및 28.1분으로써 MB-엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 반감기는 엑센딘-4에 비하여 각각 1.2배와 12.2배나 높았다.
[표 1] 트립신 효소에서의 안정성
GLP -1 종류 반감기 ( min ) 배수 ( Folds increase )
엑센딘-4 2.3 -
MB-엑센딘-4 2.7 1.2
DB-엑센딘-4 28.1 12.2
<3-2> 장액에서의 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 안정성 분석실험
20 ㎕의 엑센딘-4와 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체를 각각 20 ㎕의 장액에 첨가한 후 37℃의 수용액에서 반응 시켰다. 반응은 100 ㎕의 1% TFA가 첨가된 증류수로 멈추게 하고 각 시간별로의 혼합물은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 방법은 실시예 2에서 언급한 바와 같으며 이동상 조건은 36~45%의 용매 B로 1 ml/min 유속을 유지하면서 15분 동안 진행하였다.
도 6은 장액에서의 엑센딘-4와 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 시간-잔존량 분석 결과이다. 도 6에 나타낸 바와 같이 DB-엑센딘-4는 엑센딘-4에 비하여 장액에 훨씬 강한 분해 저항성을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 장액에서의 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 안정성 분석결과는 표 2에 나타내었다.　 표 2에서 알 수 있다시피 엑센딘-4, MB-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 반감기는 각각 2.4분, 2.7분 및 15.9분으로써 MB-엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 반감기는 엑센딘-4에 비하여 각각 1.1배와 6.6배나 높았다.
[표 2] 장액에서의 안정성
GLP -1 종류 반감기 ( min ) 배수 ( Folds increase )
엑센딘-4 2.4 -
MB-엑센딘-4 2.7 1.1
DB-엑센딘-4 15.9 6.6
실시예 4: 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 생물학적 활성 측정
실시예 1 내지 2를 통하여 제조 및 분리된 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체 위치 이성질체들의 생물학적 활성 측정은 쥐에서 분리한 췌장소도를 이용한 인슐린 분비 촉진 실험 및 인슐린 분비 세포주 (INS-1 세포주)를 이용한 수용체 결합능 분석을 통하여 진행하였다.
　 <4-1> 인슐린 분비 촉진 실험
인슐린 분비 촉진 실험을 위하여 실험용 쥐 (Sprague Dawley rat)에서 콜라게네즈 분해 및 Ficoll 밀도차 분리법을 이용하여 췌장소도를 분리하였다. 분리된 췌장소도는 세포 배양기에서 2 ~ 3일간 배양한 후 20개씩 나누어 1 ml의 KRH 완충용액 (16.7 mM 포도당 포함)이 들어있는 24 well plate에 분주한 후 엑센딘-4, MB-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4를 각각 0.1, 1, 10, 100 nM이 되도록 첨가한 후 세포 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 200 ㎕의 배양액 시료를 취한 후 얻어진 시료중의 인슐린 농도는 인슐린 효소 면역분석 키트를 이용하여 측정하였다.
　도 7은 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 인슐린 분 비 촉진실험의 결과이다. 도 7에 나타낸 바와 같이 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4는 농도 의존적으로 인슐린 분비를 촉진하는 것으로 관찰되었다. 이러한 효과는 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4 사이에서 모두 농도 의존적으로 안정적인 증가 성향을 보임을 알 수 있다.
<4-2> 수용체 결합 시험
엑센딘-4 및 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체와 인슐린 분비 세포의 수용체인 GLP-1 수용체와의 상호작용은 수용체 결합 실험을 이용하여 분석하였다. 실험을 위하여 인슐린 분비 세포주인 INS-1 세포를 12 well plate의 각 well에 2.5×105개씩 분주한 후 약 2일간 배양하여 안정적으로 세포가 배양용기에 부착되게 하였다. 세포부착 후 세포배양액을 결합 완충액 (binding buffer)으로 교환하고 여기에 125I-엑센딘-4 (9-39)를 최종 30 pM이 되도록 첨가하였다. 후속하여 엑센딘-4 및 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체를 최종농도가 0.001 ~ 100 nM이 되도록 첨가한 후 상온에서 2시간동안 경쟁적 리셉터 결합을 진행시켰다. 실험 종료 후 세포는 차가운 인산 완충용액으로 3회 세척하여 결합이 되지 않은 125I-엑센딘-4를 제거하였다. 최종적으로 세포를 세포파괴용액 (lysis buffer)을 이용하여 파괴한 후 이 용액을 취하여 감마선 측정기를 통하여 세포결합 125I-엑센딘-4의 양을 측정하였다.
도 8은 인슐린 분비 세포 표면의 GLP-1 수용체와의 결합거동을 나타낸 것이 다. 도면에 나타낸 바와 같이 시료의 농도가 증가함에 따라서 경쟁적 125I-엑센딘-4의 결합이 줄어드는 거동을 보였다. 또한 위치 이성체들의 경우 수식 위치에 따라 결합 강도의 차이를 보임을 알 수 있었다. 실험을 통하여 얻어진 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 EC50 (50% 125I-엑센딘-4 결합시의 농도) 값들은 각각 0.9, 1.2, 1.8, 그리고 1.5 nM 이었다.
이와 같은 세포배양 조건하의 효과 및 수용체 결합 실험을 통하여 비오틴이 수식된 엑센딘-4 이성체들의 리셉터 결합능은 DB - 엑센딘 -4 < MB2 - 엑센딘 -4 < MB1 - 엑센딘 -4 < 엑센딘 -4 의 순서로 나타나는 경향을 보이나, 이러한 차이는 도 7에 나타낸 바와 같이 인슐린 분비 촉진능의 차이로는 나타나지 않는 것을 알 수 있다. 따라서 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체는 천연 엑센딘-4와 비교할 때 생물학적 활성이 동등함을 알 수 있었다.
실시예 5: 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 동물 모델에서의 생물학적 활성 측정
<5-1> 동물 모델에서의 경구 내당력 측정
동물모델에서의 엑센딘-4 및 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 경구 내당력 (Oral glucose tolerance test)을 측정하기 위해 6주령 된 수컷 db/db 마우스 (C57/BLKS/J-db/db, Korea research institute of bioscience and biotechnology)에 100 ㎕의 엑센딘-4 및 수식된 엑센딘-4 (1 nmole/kg)들을 -30분에 복강주사 한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (200 mg/ml)를 경구 투여 하고 -30, 0, 15, 30, 60, 120, 180분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이 약물 투여군들과 대조군 (placebo, 생리식염수 주사)은 현격한 경구 내당력의 차이를 보임을 알 수 있었다. 대조군의 경우 포도당의 투여에 따라 급격한 혈당 상승 및 완만한 혈당 하강 거동을 보였다. 반면에 약물 투여군에서는 상대적으로 낮은 혈당 상승과 비교적 빠른 혈당 강하 거동을 나타내었다. 도 9의 결과를 바탕으로 0 ~ 180분 사이의 포도당 농도 곡선하 면적을 도식화한 것을 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이 DB-엑센딘-4 또는 엑센딘-4를 투여한 실험군의 경우 대조군 (식염수 주사)에 비하여 매우 빠른 혈중 포도당 제거능력을 보임을 알 수 있다. 이는 투여한 DB-엑센딘-4 또는 엑센딘-4에 의한 췌장 소도에서의 확장된 인슐린 분비능에 기인하는 것으로 사료된다. 따라서, 비오틴으로 화학적으로 수식된 DB-엑센딘-4가 천연 엑센딘과 동등한 생물학적 활성을 보임을 나타낸다.
<5-2> 동물 모델에서의 복강 내당력 측정
동물모델에서 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 경구투여 후 흡수거동 및 효능은 동물의 복강 내당력 변화의 조사를 통하여 관찰하였다.
동물모델에서의 엑센딘-4 및 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체의 복강 내당력 (Intraperitoneal glucose tolerance test)을 측정하기 위해 6주령된 수컷 db/db 마우스 (C57/BLKS/J-db/db, Korea research institute of bioscience and biotechnology)에 100 ㎕의 엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4 (1 mg/mouse, 엑센딘-4 기준)를 -30분에 경구투여 한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (200 mg/ml)를 복강주사 하고 -30, 0, 15, 30, 60, 120, 180분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다.
도11에 나타낸 바와 같이 약물 투여군들과 대조군 (placebo, 생리식염수 주사)은 현격한 복강 내당력의 차이를 보임을 알 수 있었다. 대조군의 경우 포도당의 투여에 따라 급격한 혈당 상승 및 완만한 혈당 하강 거동을 보였다. 반면에 DB-엑센딘-4 투여군에서는 상대적으로 낮은 혈당 상승과 비교적 빠른 혈당 강하 거동을 나타내었다. 또한 천연 엑센딘-4 투여군의 경우 대조군에 비하여는 어느 정도 향상되었지만 DB-엑센딘-4 투여군보다는 저하된 내당력 변화 거동을 보여 주었다. 이는 천연 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 서로 다른 장에서의 안정화 거동 및 흡수도의 차이에 기인하는 것으로 생각된다.
도 11의 결과를 바탕으로 0 ~ 180분 사이의 포도당 농도 곡선하 면적을 도식화한 것을 도 12에 나타내었다. 도면에 나타낸 바와 같이 DB-엑센딘-4,　엑센딘-4, 대조군의 순서로 복강 내당력이 줄어듬을 알 수 있었다. 또한 이러한 약효의 차이는 안정성 및 흡수도 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 　
본 발명은 실시예 <5-2>를 통하여 천연 엑센딘-4에 비하여 DB-엑센딘-4가 경구 투여시 보다 우수한 항당뇨 효과, 즉 복강 내당력의 증가를 보임을 알 수 있었다. 이를 보다 정밀하게 조사하기 위하여 DB-엑센딘-4의 경구투여 용량에 따른 경구 내당력의 변화를 조사하였다. 또한 이러한 변화된 내당력과 정상동물에서의 내당력의 차이를 조사하기 위하여 대조군으로 정상동물을 사용한 내당력을 조사하였다.
<5-3> 경구투여 용량에 따른 효능검사
상기 실시예 <5-2>와 동일한 방법으로 진행하였으며, DB-엑센딘-4의 경우 각각 5, 1, 0.2 mg/mouse의 용량으로 -30분에 경구투여 하였으며, 200 ㎕의 글루코오스 (200 mg/ml)를 복강주사 하고 -30, 0, 15, 30, 60, 120, 180분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다. 또한 정상동물에서는 체중대비 동일한 용량의 글루코오스를 투여한 후 동일 시간대에 혈당 변화를 관찰하였다.
도 13에는 DB-엑센딘-4의 용량별 및 정상동물의 복강 내당력 변화를 나타내었다. 정상동물의 경우 가장 우수한 내당력 거동을 보였으며, 포도당 투여 후 약 120분 후에는 정상혈당으로 회귀함을 알 수 있었다. 반면에 DB-엑센딘-4 투여군들의 경우 투여 용량이 증가함에 따라서 내당력이 다소 증가하는 거동을 보여 주었으며, 5 및 1 mg/mouse의 용량으로 투여한 군에서는 2시간 후 정상 혈당으로 회귀한 반면 0.2 mg/mouse 투여군에서는 다소 저하된 내당력 거동을 보였으며, 2시간 이후까지도 고혈당 상태를 유지함을 알 수 있었다.
도 13의 결과를 바탕으로 0 ~ 180분 사이의 포도당 농도 곡선하 면적을 도식화한 것을 도 14에 나타내었다. 도면에 나타낸 바와 같이 투여군의 투여 용량이 감소함에 따라 복강 내당력이 줄어들었음을 알 수 있었다.
실시예 6: 비오틴으로 수식된 엑센딘 -4 유도체의 체내 약물동력학 거동 조사
상기 실시예 3 ~ 5에 의하여, 본 발명의 DB-엑센딘-4가 생물학적 안정성, 생물학적 활성 및 당뇨동물에서의 혈당강하 효과가 우수하여 지속형 펩티드 약물의 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서 이러한 지속형 특성의 원인을 조사하기 위하여 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 약물동력학적 거동을 관찰하였다. 체중이 200 g 정도인 실험용 쥐 (SD rat)에 시료를 1 nmole/rat (10 ㎍/rat)의 양으로 정맥주사와 경구투여한 후, 시간에 따른 혈중 약물농도의 변화를 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 혈액 샘플은 삽관된 경정맥으로부터 채취하였다.
SD 랫트에 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 정맥주사와 경구투여 후 혈중농도 변화는 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 DB-엑센딘-4는 경구투여 후 15~30분에서 최대혈중농도에 도달한 후 서서히 혈중농도가 감소되는 경향을 보였다. 그러나, 엑센딘-4의 경우는 정맥주사 후 빠른 시간 동안 급격한 혈중농도 감소를 보였으며, 3시간 이후에는 기저농도 (<2 ng/㎖)의 상태에 도달하였다. 또한 경구투여 후에도 혈중농도에 큰 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다.
도 15의 결과를 바탕으로 0 ~ 180분 사이의 혈중 농도 곡선하 면적을 도식화한 것을 도 16에 나타내었다. 도면에 나타낸 바와 같이 DB-엑센딘-4의 경구 투여 후 혈중 농도는 엑센딘-4를 정맥 주사한 후 혈중 농도의 3.96 %에 달하는 것으로 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 DB-엑센딘-4는 효과를 나타낼 수 있을 정도로 유효하게 경구투여를 통하여 흡수되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 실시예 3 ~ 6에 의하여, 비오틴이 화학적으로 수식된 엑센딘-4의 경우 생접합 과정을 통하여 엑센딘의 활성을 저하시키지 않고 안정성을 획기적으로 향상시킬 뿐만 아니라 장에서의 우수한 안정성과 흡수도에 기인한 향상된 항당뇨 효과를 보임을 알 수 있었다.
또한, DB-엑센딘-4의 경우 투여 용량의 조절을 통한 내당력의 변화, 즉 용량과 효율간의 유기적 상관관계를 보임을 확인하였으며, 경구 투여를 통하여 당뇨동물에서도 정상동물과 유사한 내당력을 실현할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이에 의해 본 발명에 따른 비오틴으로 수식된 엑센딘-4 유도체는 당뇨병 또는 비만 등과 같은 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환, 또는 과민성 장 증후군과 같은 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환 등을 예방 및 치료하는 데 유용하다. 또한, 현재 대부분의 엑센딘 관련 물질도 주사제 형태으로 개발되고 있는 실정이고, 제2형 당뇨병 치료제는 매우 큰 시장을 형성하고 있으므로 경구제형 엑센딘 유도체로의 응용이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 엑센딘-4, Lys12-Mono-Biotin-엑센딘-4 (이하 MB1-엑센딘-4), Lys27-Mono-Biotin-엑센딘-4 (이하 MB2-엑센딘-4) 및 Lys12 , 27-Di-Biotin-엑센딘-4 (이하 DB-엑센딘-4) 혼합물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
　도2는 최종 분리된 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도3은 본 발명에 따른 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 MALDI-TOF 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 라이신-C 효소분해 반응 후 엑센딘-4, MB1-엑센딘-4, MB2-엑센딘-4 및 DB-엑센딘-4의 MALDI-TOF 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도5는 트립신 효소에서의 엑센딘-4와 비오틴이 수식된 엑센딘-4의 시간-잔존량 분석 결과이다.
도 6은 장액에서의 엑센딘-4와 비오틴이 수식된 엑센딘-4의 시간-잔존량 분석 결과이다.
도 7은 랫트 췌장소도에서 엑센딘-4와 비오틴이 수식된 엑센딘-4의 인슐린 분비 촉진 실험결과이다.
도8은 인슐린 분비 세포주 (INS-1)을 이용한 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 수용체 결합능 분석결과이다.
도9는 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4를 복강 주사한 후 실험동물에서의 혈당 변화 를 도식화한 것이다.
도 10은 도 9를 바탕으로 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 혈당 강하 결과를 나타낸 것이다.
도11은 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4를 경구 투여한 후 실험동물에서의 혈당 변화를 도식화한 것이다.
도 12는 도 11을 바탕으로 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 혈당 강하 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4를 농도-의존적으로 경구 투여한 후 실험동물에서의 혈당 변화를 도식화한 것이다.
도14는 도 13을 바탕으로 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 혈당 강하 결과를 나타낸 것이다.
도15는 랫트에 엑센딘-4와 DB-엑센딘-4의 정맥주사와 경구투여 후 혈중농도 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 도 15의 결과를 바탕으로 0 ~ 180분 사이의 혈중 농도 곡선하 면적을 도식화한 것이다.

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 2로 표시되는 엑센딘 4의 12번 라이신 잔기 및 27번 라이신 잔기 중 어느 하나 이상에 비오틴이 결합하는 것을 특징으로 하는 엑센딘 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 비오틴이 엑센딘-4의 12번 라이신 잔기 및 27번 라이신 잔기에 결합하는 것을 특징으로 하는 엑센딘 유도체.
  5. ⅰ) 서열번호 2의 엑센딘 4 와 비오틴 및 환원제를 완충용액 또는 유기용매에 첨가하여 반응시키는 단계;
    ⅱ)상기 i)단계의 반응 혼합물을 일정온도 하에 빛을 차단하고 일정시간 동안 보관하는 단계;
    ⅲ)상기 ii)단계의 반응 완료 후, 미반응된 반응물들을 제거하는 단계; 및
    ⅳ)상기 iii)단계의 미반응된 반응물질이 제거된 생성물로부터 비오틴으로 수식된 엑센딘을 분리 및 정제하는 단계를 포함하여 비오틴을 결합시킨 엑센딘 유도체를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 엑센딘 유도체가 제3항의 엑센딘 유도체임을 특징으로 하는 비오틴을 결합시킨 엑센딘 유도체를 제조하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, i)단계에서 서열번호 2의 엑센딘 4에 대한 비오틴의 반응 몰비는 1 내지 4의 범위 내인 것을 특징으로 비오틴을 결합시킨 엑센딘 유도체를 제조하는 방법.
  8. 제3항의 엑센딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제3항의 엑센딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제3항의 엑센딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 과민성 장 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 과민성 장 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제8항에 있어서, 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 과민성 장 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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