KR100563616B1 - ?-Glucan derivative, manufacture of the derivative, adhesion Barrier using ?-glucan and method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제에 관한 것으로, 상기 유착방지제는 생분해성 기간을 조절할 수 있으며 생체적합성이 뛰어나며 유착방지효과가 우수하며, 생체내 흡수시 면역증강의 효과가 있다.The present invention relates to a beta glucan derivative, a method for preparing the same, and an anti-adhesion agent using a beta glucan derivative, based on a pachyman structure, which is a polysaccharide obtained from a mushroom, based on substitution of its glucose residue with acetamide. The anti-adhesion agent can adjust the biodegradable period, has excellent biocompatibility, excellent anti-adhesion effect, and has an effect of enhancing immune upon absorption in vivo.

베타글루칸 유도체, 파키만(pachyman), 유착방지제Beta glucan derivatives, pachyman, anti-adhesion agents

Description

베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제, 그의 제조방법{β-Glucan derivative, manufacture of the derivative, adhesion Barrier using β-glucan and method thereof}Beta-glucan derivatives, preparation method thereof and anti-adhesion agent using beta-glucan derivatives, preparation method thereof {β-Glucan derivative, manufacture of the derivative, adhesion Barrier using β-glucan and method

본 발명은 자연계에 존재하는 베타글루칸, 특히 복령다당체인 파키만(pachyman)을 수용성조절반응을 통하여 새로운 베타글루칸 유도체(AA-파키만), 그의 제조방법과 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 생체의 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 결합하여 그의 안정성 및 수용성이 증가된 새로운 수용성 다당체 및 이를 복령으로부터 얻는 경제적인 제조방법에 관한 것이며, 또한 상기의 새로운 다당체를 이용하여 생체적합성이 뛰어나며 유착방지의 효과가 우수하면서 생분해성이 좋으며 생체내 흡수시 면역증강효과가 탁월한 유착방지제에 관한 것이다.The present invention relates to a novel beta glucan derivative (AA-Pachman), a method for preparing the same, and an anti-adhesion agent using beta glucan derivatives through a water solubility control reaction of beta glucan, particularly, the cyclic polysaccharide pachyman. . Specifically, the present invention relates to a novel water-soluble polysaccharide obtained by binding an acetamide group to a glucose moiety of a polysaccharide that exhibits antitumor activity by increasing the immune function of the living body and increasing its stability and water solubility, and an economical method for producing the same from Fukryeong. In addition, the present invention relates to an anti-adhesion agent having excellent biocompatibility, excellent anti-adhesion effect, good biodegradability, and excellent immuno-enhancing effect when absorbed in vivo using the new polysaccharide.

버섯 등에서 여러가지 종류의 다당체가 분리되고 그의 항종양 활성이 알려져 이를 이용한 다양한 연구가 이루어져 왔다. 실제적으로 표고버섯의 자실체에서 분리한 다당체인 렌티난(Lentinan), 구름버섯 자실체 및 배양균사체에서 분리한 단백 다당체인 크레스틴(Krestin), 치마버섯 배양여액에서 분리한 다당체인 쉬조필란(Shizophillan) 등이 항종양 활성 등을 나타내는 의약품으로 시판되고 있으며, 상황의 배양 균사체의 열수 추출물도 국내에서 생산되어 시판되고 있다.Various kinds of polysaccharides are isolated from mushrooms and their antitumor activity is known and various studies have been made using them. Lentinan, a polysaccharide isolated from the fruiting body of shiitake mushrooms, Krestin, a protein polysaccharide isolated from the fruiting body and culture mycelium from shiitake mushrooms, and Shizophillan, a polysaccharide isolated from the culture filtrate It is commercially available as a drug showing antitumor activity and the like, and hydrothermal extracts of cultured mycelium of the situation are also produced and marketed in Korea.

복령은 담자균류의 구멍장이버섯과에 속하는 포리아 코코스(Poria cocos)의 균핵으로 주요성분이 파키만(Pachyman)으로, 전기한 파키만(Pachyman)은 실험을 통해 항종양 활성을 나타내는 것을 확인하였으나, 물에 잘 녹지 않는 성질이 있고 그 사용에 있어서도 어려움이 있다. Fukryeong is a fungal nucleus of Poria cocos belonging to the fungus of the Basidiomycetes, and its main ingredient is Pachyman, which was confirmed by Pachyman. It is insoluble in water and has difficulty in its use.

유착이란 인체의 조직이나 기관이 정상상태에서는 분리가 되어있으나 상처를 받거나 인위적인 힘이 가하여 졌을 때 섬유조직을 형성하여 서로 떨어지지 않는 상태를 말하며, 이러한 유착이 생기는 것을 방지하는 제품이 유착방지제이다.       Adhesion refers to a state in which tissues or organs of the human body are separated in a normal state but are not separated from each other by forming a fibrous tissue when a wound or an artificial force is applied, and a product that prevents such adhesion is an anti-adhesion agent.

외과적 수술로 발생한 조직의 손상부위는 자연적으로 치유가 되는데, 이 때 주변의 조직과 비정상적인 유착이 일어나는 빈도는 수술환자의 63-93%에 이르며, 이로 인한 부작용으로는 장기능장애, 장폐색, 만성통증 및 불임 등의 후유증과 더불어 재수술시 개복의 어려움 등을 들 수 있다. 이와 같은 이유로 수술 후의 장기 유착을 방지하기 위한 유착방지제에 대한 개발이 전세계적으로 진행되고 있다.       Surgical damage to tissues is naturally healed. At this time, the frequency of abnormal adhesions with surrounding tissues is 63-93% of surgical patients. Pain and infertility, as well as the difficulty of reopening surgery. For this reason, the development of anti-adhesion agents for preventing long-term adhesion after surgery is in progress worldwide.

현재 시판 중인 유착방지제로는 패드타입으로는 Johnson & Johnson사의 Interceed®, 젤타입으로는 Gliatech사의 Adcon®, 필름타입으로는 Genzyme사의 Seprafilm®, Macropore사의 SurgiWrap® 등이 있다. 이 중 Gliatech사의 Adcon®은 2002년 5월 판매가 중지당하였고 이 기술을 Wright Medical Group에 판매하므로서 현재 시판중인 유착방지제품은 매우 적은 수를 보이고 있다.  Commercially available anti-adhesion agents include Johnson & Johnson's Interceed® as a pad type, Adcon® by Gliatech, Seprafilm® by Genzyme, and SurgiWrap® by Macropore. Among them, Gliatech's Adcon® was discontinued in May 2002, and the technology was sold to Wright Medical Group, with very few anti-adhesion products on the market.

Johnson & Johnson사의 Inerceed®는 산화재생성셀룰로스가 주성분으로서 부직포형태를 이루고 있으며 기능적으로는 물에 대한 용해도가 높아 생체내에서의 형태유지율이 낮은 단점이 있다. Genzyme사의 Seprafilm®은 카르복시메칠셀룰로스(CMC)와 히알루론나트륨의 화학적변형물질이 주성분으로서 개복수술에 국한되어서만 사용가능하며, 기능적으로는 부스러지기 쉽고 투명성이 높지 않으며, 조직과의 점착성이 너무 높은 점 등의 단점이 있다. Macropore사의 SurgiWrap®은 Polylactide가 주성분으로 투명도가 높으며 최근 널리 사용되는 제품인데 기능적으로는 조직과의 점착성이 상대적으로 낮고 생체내 분해 최소기간이 6개월로 길어 사용범위에 제한을 받는 점, 경제적으로는 매우 고가인 점 등의 단점이 있다.       Johnson & Johnson's Inerceed® is composed of oxidatively regenerated cellulose, which is composed of non-woven fabrics, and has a low solubility in water due to its high solubility in water. Genzyme's Seprafilm® is a chemically modified substance of carboxymethyl cellulose (CMC) and sodium hyaluronic acid, which can be used only in laparotomy and is functionally fragile, not highly transparent, and too sticky to tissues. There are disadvantages such as points. Macropore's SurgiWrap® is a polylactide-based component with high transparency and is widely used in recent years.It is functionally resistant to tissues and has a minimum duration of in vivo degradation of 6 months, which limits its use range. There are disadvantages such as being very expensive.

이와 함께 개발 중인 생체분해성 신소재의 예로서 히아루론산(HA, hyaluronic acid; USP 4,141,973)은 비교적 빠른 시간 내에 생체내에서 분해, 흡수되는 단점이 있으며, 가격 또한 매우 고가이다. Hyaluronic acid (HA, USP 4,141,973) is an example of a biodegradable new material under development, and has a disadvantage in that it is decomposed and absorbed in vivo within a relatively fast time, and the price is also very expensive.

카르복시메칠셀룰로스(CMC, carboxymethyl cellulose)나 나트륨카르복시메칠셀룰로스(SCMC, sodium carboxymethyl cellulose)를 주성분으로 하는 기술(KR 공개 2003-55102, KR 공개 2002-11955, KR 공개 2001-10151, KR 10-316200, KR 특0135707, WO 2001/05370, WO 2000/59516, WO 1998/13927)이 많이 제시되고 있으나 이 소재는 지나치게 빨리 용해 및 흡수되기 때문에 유착방지 효과를 보이지 못한다. Technology based on carboxymethyl cellulose (CMC, carboxymethyl cellulose) or sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) (KR publication 2003-55102, KR publication 2002-11955, KR publication 2001-10151, KR 10-316200, KR Patent No. 035707, WO 2001/05370, WO 2000/59516, WO 1998/13927) have been proposed, but this material does not show an anti-adhesion effect because it is dissolved and absorbed too quickly.

알긴산나트륨(SA, sodium alginate; USP 5,266,326)과 하이드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC, hydroxypropyl methyl cellulose; USP 5,318,780)를 이용한 제자리 젤화(in situ gelation)는 조직 접착력의 부족으로 유착방지 효율이 낮고 시술이 복잡한 단점이 있다.In situ gelation with sodium alginate (SAP 5,266,326) and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC, USP 5,318,780) has low adhesion and low complexity due to lack of tissue adhesion. There are disadvantages.

위와 같이 생체내에서의 빠른 분해 및 흡수의 단점을 극복하기 위한 기술로서 생분해성 고분자간의 가교를 형성하는 방법이 제시되었다. 히아루론산(HA, hyaluronic acid)과 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 이용한 방법(USP 5,760,200)은 하이드로젤 구조를 유지하기 위하여 EDC[1-ethyl-3(3-dimethyaminopropyl)carbo diimide hydrochloride]를 반응시키는데 이때 사용되는 EDC는 생체독성을 가지며, 이를 제거하기위한 후속 공정이 까다로우며, 재료인 HA가 고가일 뿐만 아니라 제조된 필름은 유연성과 강도가 약하여 취급과 시술에 어려운 점이 많다.As a technique for overcoming the disadvantages of rapid degradation and absorption in vivo as described above, a method of forming crosslinks between biodegradable polymers has been proposed. The method using hyaluronic acid (HA) and carboxymethylcellulose (CMC) (USP 5,760,200) is used to react EDC [1-ethyl-3 (3-dimethyaminopropyl) carbo diimide hydrochloride] to maintain the hydrogel structure. The EDC is biotoxic, and the subsequent process to remove it is difficult, and the material HA is expensive, and the produced film is difficult to handle and procedure due to its low flexibility and strength.

카르복시폴리사카라이드(CPS, carboxypolysaccharide)와 폴리에테르(PE, polyether)를 주성분으로 하는 유착방지제(USP 5,906,997, KR 공개 2001-13927)는 수분으로 포화된 이후에는 조직과의 점착성이 떨어지는 단점이 있다.Adhesion inhibitors based on carboxypolysaccharide (CPS, carboxypolysaccharide) and polyether (PE, polyether) (USP 5,906, 997, KR publication 2001-13927) have a disadvantage of poor adhesion to tissues after being saturated with water.

그 외 젤란검(gellan gum, KR 공개 2003-55102, 공개 2002-11955), 키토산(chitosan, KR 공개 2003-71119, 공개 2001-107068), 플루란(pullulan, KR 공개 2003-71119), 커들란(curdlan, KR 공개 2003-71119), 아교(gellatin, KR 공개 2001-107601), 폴리에틸글리콜(PEG, polyethylglycol, KR 공개 2001-107067, KR 공개 2001-107068), 아가로오스(agarose, KR 공개 2001-107067, 공개 2001-107068), 덱스트란(dextran, KR 특0135707), 하이드록시에틸셀룰로스(HEC, hydroxyethyl cellulose, KR 공고 1997-10545, 공고 1995-13460), 헤파린(heparin, KR 공고 1995 -13460) 등의 소재를 이용한 기술들이 개발되어지고 있다. Other gellan gums (KR publication 2003-55102, publication 2002-11955), chitosan (KR publication 2003-71119, publication 2001-107068), pullulan (KR publication 2003-71119), curdlan (curdlan, KR publication 2003-71119), glue (gellatin, KR publication 2001-107601), polyethylglycol (PEG, polyethylglycol, KR publication 2001-107067, KR publication 2001-107068), agarose (agarose, KR publication 2001-107067, published 2001-107068), dextran (KR special 035707), hydroxyethyl cellulose (HEC, hydroxyethyl cellulose, KR notification 1997-10545, notification 1995-13460), heparin, KR notification 1995- 13460) and the like using technologies such as materials are being developed.

그러나 상기의 소재들은 그 분해성이 매우 빠르거나 느림으로 인하여 단독 또는 여러 소재를 혼용하여 연구개발되는 시도가 이루어지고 있으나 여전히 제한적인 기능을 갖고 있는 단점이 있다.        However, the above-mentioned materials have been attempted to be researched and developed alone or in combination of various materials due to their fast or slow degradability, but still have a limited function.

본 발명은 상술한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 버섯에서 항종양 활성을 가지면서 사용이 용이한 수용성이 조절된 새로운 다당체와 그의 제조방법을 제공하며, 종래의 유착방지제의 생분해성 기간의 문제점을 해소하고 유착방지효능이 향상되며 분해 및 흡수 후에 면역기능을 증강시킨 새로운 소재의 유착방지제를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention, in order to solve the conventional problems as described above, provides a novel polysaccharide with an anti-tumor activity in the mushroom and easy to use water-soluble controlled polysaccharide and a method for preparing the same, the biodegradable period of the conventional anti-adhesion agent It is an object of the present invention to solve the problem, to improve the anti-adhesion effect, and to provide an anti-adhesion agent of a new material which enhances immune function after decomposition and absorption.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은.The present invention to achieve the above object.

버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 베타글루칸 유도체을 제공한다.It provides a beta glucan derivative represented by the following formula (1) characterized in that its glucose residue is substituted with acetamide based on the pachyman structure, which is a polysaccharide obtained from a mushroom.

Figure 112005068599444-pat00005
Figure 112005068599444-pat00005

상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH2CONH2)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.In Formula 1, R and R 'is an acetamide group (-CH 2 CONH 2 ), m and n are the number of each monomer, m is 40 to 60, n is in the range of 60 to 100.

상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체이다.The polysaccharide is a beta glucan derivative, characterized in that it comprises a bokyeong polysaccharide, low polysaccharide and yeast polysaccharide.

또한, 본 발명은 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 제공한다.In addition, the present invention provides a beta glucan derivative, characterized in that the degree of substitution of the acetamide is 0.01 to 0.5.

또한, 본 발명은 (a) 버섯의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 다당체를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 추출분리한 다당체에 이소프로판올을 포함하는 저급알코올의 반응용매를 가하여 교반시키는 단계; (c) 상기 (b)단계의 용액에 수산화나트륨 또는 수산화칼슘을 포함하는 알칼리용액 중에서 선택하여 전체 중량의 0.1 내지 50%를 중화제로 첨가하여 교반시키는 단계; (d) 상기 (c)단계의 용액에 클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산 등의 클로로화합물 중 1선택하여 반응물질로 가하여 30 내지 80℃의 반응온도에서 반응시키는 단계; (e) 상기 (d)단계의 용액을 원심분리하여 얻은 침전물을 알코올 용매로 씻어낸 후 감압건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention (a) extracting the dry powder of the mushrooms with an alkali to separate the polysaccharide; (b) adding and stirring a reaction solvent of a lower alcohol containing isopropanol to the extracted polysaccharide of step (a); (c) selecting from an alkaline solution containing sodium hydroxide or calcium hydroxide in the solution of step (b) and adding 0.1 to 50% of the total weight as a neutralizing agent to stir; (d) To the solution of step (c) is selected from chloro compounds such as chloroacetic acid, chloroacetamide, dichloroacetamide, trichloroacetamide, chloroacetyl chloride, chloroacrylic acid and the like as a reaction material to 30 ~ 80 ℃ Reacting at a reaction temperature; (e) providing a method for producing a beta glucan derivative comprising the step of washing the precipitate obtained by centrifuging the solution of step (d) with an alcohol solvent and drying under reduced pressure.

또한, 본 발명은 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 하기 화학식1로 표시되는 베타글루칸 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an anti-adhesion agent comprising a beta glucan derivative represented by the following formula (1) in which a glucose residue is substituted with acetamide based on a pachyman structure, which is a polysaccharide obtained from a mushroom. .

화학식 1.Formula 1.

Figure 112005068599444-pat00008
Figure 112005068599444-pat00008

또한, 본 발명은 상기 베타글루칸 유도체는 중량비 1 내지 30%의 금속이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.In addition, the present invention provides an anti-adhesion agent, characterized in that the beta glucan derivative contains 1 to 30% by weight of metal ions.

또한, 본 발명은 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 제공한다.In addition, the present invention provides a beta glucan derivative, characterized in that the degree of substitution of the acetamide is 0.01 to 0.5.

또한, 본 발명은 상기의 베타글루칸 유도체를 포함하여 분말, 젤, 박막 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an anti-adhesion agent comprising a beta glucan derivative having a powder, gel, thin film form.

또한, 본 발명은 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계;상기 현탁액을 마이크로플루다이저(microfluidizer)로 균질화시키는 단계; 상기 균질화된 현탁액을 유리판에 부어 클린벤치내에서 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박막형 유착방지제의 제조방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of suspending a beta glucan derivative in water; homogenizing the suspension with a microfluidizer; The homogenized suspension is poured into a glass plate and dried in a clean bench to provide a method for producing a thin film anti-adhesion agent.

또한, 본 발명은 면역증강 활성 및 수용성질을 갖는 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계: 상기 현탁액을 균질화시키는 단계; 상기 균질화된 현탁액을 코팅기에 의해 박막을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박막형 유착방지제의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of suspending a beta glucan derivative having immunostimulating activity and water-soluble in water: homogenizing the suspension; It provides a method for producing a thin film type anti-adhesion agent comprising the step of preparing a thin film by the coating machine to the homogenized suspension.

상기의 베타글루칸 유도체는 면역증가 활성이 있으며 세포 독성이 거의 없으며 수용성이 조절된 것이다.The beta glucan derivative has immunostimulating activity, little cytotoxicity, and water solubility is controlled.

본 발명의 베타글루칸 유도체는 아세트아마이드기의 치환도가 0.01-1.0인 것이 바람직하며, 치환도가 0.2~0.4일때가 가장 바람직하다. 본 발명의 베타글루칸 유도체의 물리화학적 특성은 다음과 같다.In the beta glucan derivative of the present invention, the degree of substitution of acetamide group is preferably 0.01-1.0, and most preferably, when the degree of substitution is 0.2-0.4. Physical and chemical properties of the beta glucan derivatives of the present invention are as follows.

(1) 성상(1) appearance

본 발명의 베타글루칸 유도체는 백색 또는 담황백색을 띠며 무미이면서 무취이다.The beta glucan derivative of the present invention is white or pale yellow white, tasteless and odorless.

(2) 분자량(2) molecular weight

본 발명의 베타글루칸 유도체의 분자량 범위는 5-20 x 106이며 평균분자량은 8.7 x 106이다.The molecular weight range of the beta glucan derivative of the present invention is 5-20 x 10 6 and the average molecular weight is 8.7 x 10 6 .

(3) 융해점(3) melting point

본 발명의 베타글루칸 유도체는 융해점이 나타나지 않고 170℃ 이상의 고온에서 탄화되는 특징이 있다.The beta glucan derivative of the present invention is characterized by being carbonized at a high temperature of 170 ° C. or more without melting point.

(4) 용해도(4) solubility

본 발명의 베타글루칸 유도체는 물에 대한 용해도가 매우 낮으며 수분 함유시 젤을 형성하며, 메탄올, 에타올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 에테르 및 석유에테르에는 용해되지 않는다.The beta glucan derivatives of the present invention have very low solubility in water and form gels when contained in water, and do not dissolve in methanol, ethanol, butanol, acetone, ethyl acetate, methylene chloride, chloroform, hexane, ether and petroleum ether. .

(5) 적외선 흡수 스펙트럼(5) infrared absorption spectrum

본 발명의 베타글루칸 유도체는 브롬화칼륨 디스크법을 이용한 적외선 흡수 스펙트럼으로 분석하면 파수 3,400cm-1, 2,920cm-1, 1,650cm-1, 1,600cm-1 , 1,470-1,400cm-1, 1,100 - 1,000cm-1, 890cm-1에서 흡수대가 나타난다. 이 때 890cm-1의 흡수대는 베타-글리코사이드에 의한 것이다.Beta-glucan derivative of the present invention is analyzed by infrared absorption spectrum using potassium bromide disk method wave number 3,400cm -1 , 2,920cm -1 , 1,650cm -1 , 1,600cm -1 , 1,470-1,400cm -1 , 1,100-1,000 cm -1, the absorption band appears at 890cm -1. At this time, the absorption band of 890 cm -1 is due to beta-glycoside.

(6) 총당 분석(6) total sugar analysis

본 발명의 베타글루칸 유도체의 총당은 페놀-황산법으로 분석하며, 그 분석 결과 100% 모두 당류인 것으로 나타난다.The total sugars of the beta glucan derivatives of the present invention are analyzed by the phenol-sulfuric acid method, and the analysis shows that 100% are all sugars.

(7) 총단백질 분석(7) total protein analysis

본 발명의 베타글루칸 유도체의 총단백질은 로우리-폴린(Lowry-Folin)법으로 분석하며, 그 분석 결과는 0%로 나타난다.The total protein of the beta glucan derivative of the present invention is analyzed by Lowry-Folin method, and the analysis result is 0%.

또한 본 발명은 유착방지효과를 나타내는 베타글루칸 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 복령의 건조 분말을 사이토(Saito) 등의 방법에 따라 알칼리로 추출하여 복령다당체를 분리한다. 상기 복령 다당체에 반응용매를 가하여 교반시키고, 다시 중화제를 첨가하여 교반시킨 다음 반응물질을 가하여 반응시키고 이를 원심분리하여 얻어진 침전물을 적당한 용매로 씻어낸 다음 감압 건조시킴으로서 상기 베타글루칸 유도체를 제조한다.The present invention also provides a method for producing a beta glucan derivative exhibiting an anti-adhesion effect. Specifically, the present invention extracts the dry powder of Bokryeong with alkali according to a method such as Saito to separate the Bokryeong polysaccharide. The beta glucan derivative is prepared by adding a reaction solvent to the Bokyong polysaccharide, stirring the mixture, adding a neutralizing agent, stirring the mixture, and reacting by adding the reactant. The precipitate obtained by centrifugation is washed with a suitable solvent and dried under reduced pressure.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.  Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. The following examples are illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

[실시예 1] 베타글루칸 유도체 제조Example 1 Preparation of Beta Glucan Derivative

[비교예 1]아세트아미노기 치환도 0.5Comparative Example 1 Acetamino Group Substitution Degree 0.5

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 4.6㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.375g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 20㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차 례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.85g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대한 용해도가 5% 이상이었으며, 5% 수용액 상태로 3개월 보관하여도 침전물이 생성되지 않았다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 4.6 ml of 10% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes so that no gel was formed, and 0.375 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction solution was washed with 20 ml of 70% ethanol added with 10 ml of acetic acid and again washed with 80% ethanol and ethanol anhydrous in sequence. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain 0.85 g of white glucan derivative. The derivative had a solubility in water of at least 5%, and no precipitate was formed even when stored for 3 months in a 5% aqueous solution.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 1번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as the first sample.

[비교예 2]아세트아미노기 치환도 0.4Comparative Example 2 Acetamino Group Substitution Degree 0.4

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 3.68㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.3g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.82g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대한 용해도가 0.5%였으며, 0.5% 수용액 상태로 3개월 보관하여도 침전물이 생성되지 않았다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 3.68 ml of 10% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, vigorously shaken for 90 minutes so that no gel was formed, and 0.3 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, 10 ml of acetic acid was added and washed with 200 ml of 70% ethanol, and then washed again with 80% ethanol and ethanol anhydrous. Precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain 0.82 g of white glucan derivative. The derivative had a solubility in water of 0.5%, and no precipitate was formed even when stored for 3 months in a 0.5% aqueous solution.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 2번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as the second sample.

[비교예 3]아세트아미노기 치환도 0.3Comparative Example 3 Acetamino Group Substitution Degree 0.3

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 2.76㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.225g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.83g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 용해되지 않고 젤을 형성하였다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 2.76 ml of 10% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes to prevent gel formation, and 0.225 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, 10 ml of acetic acid was added and washed with 200 ml of 70% ethanol, and then washed again with 80% ethanol and ethanol anhydrous. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain a 0.83 g white glucan derivative. The derivative did not dissolve in water and formed a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 3번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as sample 3.

[비교예 4]아세트아미노기 치환도 0.2Comparative Example 4 Acetamino Group Substitution Degree 0.2

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 9.2㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.15g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.7g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 9.2 ml of 2% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes to prevent gel formation, and 0.15 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, 10 ml of acetic acid was added and washed with 200 ml of 70% ethanol, and then washed again with 80% ethanol and ethanol anhydrous. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain a beta glucan derivative, 0.7 g of white powder. The derivative did not dissolve in water and did not form a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 4번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as the fourth sample.

[비교예 5]아세트아미노기 치환도 0.1Comparative Example 5 Acetamino Group Substitution Degree 0.1

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 4.6㎖를 10분에 1㎖의 속도 로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.075g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.7g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, and shaken at room temperature for 30 minutes. Then, 4.6 ml of 2% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes so that no gel was formed, and 0.075 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, 10 ml of acetic acid was added and washed with 200 ml of 70% ethanol, and then washed again with 80% ethanol and ethanol anhydrous. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain a beta glucan derivative, 0.7 g of white powder. The derivative did not dissolve in water and did not form a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 5번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivatives prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as the fifth sample.

[비교예 6]아세트아미노기 치환도 0.06Comparative Example 6 Acetamino Group Substitution Degree 0.06

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 2.8㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.045g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.74g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 2.8 ml of 2% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes to prevent gel formation, and 0.045 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, 10 ml of acetic acid was added and washed with 200 ml of 70% ethanol, and then washed again with 80% ethanol and ethanol anhydrous. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain 0.74 g of a white powder of beta glucan derivative. The derivative did not dissolve in water and did not form a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 6번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this comparative example, a thin film was prepared, which was used as the sixth sample.

[비교예 7]아세트아미노기 치환도 0.03Comparative Example 7 Acetamino Group Substitution Degree 0.03

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 1.4㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.0225g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차       1 g of beta glucan obtained from Bokryeong was placed in a reactor, 30 ml of isopropanol was added thereto, shaken at room temperature for 30 minutes, and 1.4 ml of 2% sodium hydroxide solution was added at a rate of 1 ml in 10 minutes. At this time, the mixture was vigorously shaken for 90 minutes so that no gel was formed, and 0.0225 g of chloroacetamide was added thereto and reacted at 50-60 ° C. for 1 hour. After the reaction, wash with 200 ml of 70% ethanol added with 10 ml of acetic acid, and again with 80% ethanol and ethanol anhydrous.

례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.76g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.Washed out as usual. The precipitated polysaccharide was separated and dried under reduced pressure to obtain a beta glucan derivative of 0.76 g of white powder. The derivative did not dissolve in water and did not form a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 7번 시료로 하였다.       In order to investigate the anti-adhesion effect of the beta glucan derivative prepared in this Comparative Example, a thin film was prepared, which was used as the seventh sample.

[비교예 8]복령의 베타글루칸[Comparative Example 8] Beta-glucan of the Booryeong

복령에서 얻어진 베타글루칸 자체를 사용하였으며. 이는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.       The beta glucan itself obtained from Bokryeong was used. It did not dissolve in water and did not form a gel.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체와의 유착방지효과를 비교하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 8번 시료로 하였다.       In order to compare the anti-adhesion effect with the beta glucan derivative prepared in this Comparative Example, a thin film was prepared, which was used as the eighth sample.

[실시예 2] 베타글루칸 유도체의 박막 제조Example 2 Thin Film Preparation of Beta Glucan Derivative

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체 및 베타글루칸 0.5g을 50㎖의 물에 현탁시키고 마이크로플루다이저(microfluidizer)를 이용하여 균질화를 시킨다음 가로세로 각각 18cm인 유리판에 부어 클린벤치내에서 하루 동안 건조시켜 박막을 제조하여 1 - 8번 시료를 얻었다.       0.5 g of each derivative and beta glucan obtained in Comparative Examples 1 to 8 of Example 1 were suspended in 50 ml of water, homogenized using a microfluidizer, and then poured into a glass plate 18 cm wide and clean. A thin film was prepared by drying in a bench for 1 day to obtain samples 1-8.

[실험예1]베타글루칸 유도체의 안전성(in vitro, 세포독성)시험Experimental Example 1 Safety of in vitro glucan derivatives ( in vitro , cytotoxicity)

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체의 세포독성의 여부를 조사하기 위하여 3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 이용한 MTT 검색법을 실시하였다. 인체 정상세포 유래인 HS27 세포를 1 x 105세포/㎖의 농도가 되도록 인산완충용액(PBS)으로 조정하여 96-웰 마이크로플레이트(Falcon, USA)에 웰(well) 당 100㎕ 씩 넣었다. 다음 상기 1 - 8번 유도체 분말을 1㎎/㎖ 농도로 인산완충용액에 현탁시키고 1/10씩 희석하여 0.1㎍/㎖ 농도가 되는 때까지 계속 희석하고 최종 부피가 200㎕가 되도록 맞추어 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 다음 MTT 시약이 5㎎/㎖ 농도로 들어있는 인산완충용액을 20㎕씩 첨가하여 4시간동안 배양하고, 상층액 180㎕를 제거하고 0.04N 염산-이소프로판올 100㎕를 첨가하여 하루밤동안 방치한 다음 이를 자동 엘리자판독기(Molecular Devices Corp., USA)를 이용하여 560㎚에서 흡광도를 측정하므로서 세포생존율을 측정하였다.       In order to investigate the cytotoxicity of each derivative obtained in Comparative Examples 1-8 of Example 1, 3- (4,5-dimethyldiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT MTT search method using). HS27 cells derived from human normal cells were adjusted to phosphate buffer solution (PBS) to a concentration of 1 × 10 5 cells / ml and placed in 100 μl per well in a 96-well microplate (Falcon, USA). Next, the derivative powders 1-8 were suspended in a phosphate buffer solution at a concentration of 1 mg / ml, diluted 1/10 to continue dilution until the concentration was 0.1 µg / ml, and the final volume was adjusted to 200 µl at 37 ° C., Incubated for 48 hours in a 5% CO2 incubator. Next, incubate for 4 hours by adding 20 μl of a phosphate buffer solution containing 5 mg / ml of MTT reagent, remove 180 μl of supernatant, and add 100 μl of 0.04N hydrochloric acid-isopropanol to stand overnight. Cell viability was measured by measuring the absorbance at 560 nm using an automatic eliza reader (Molecular Devices Corp., USA).

평균 생존율(%) = 시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도 x 100Mean survival rate (%) = absorbance of sample treated group / absorbance of control group x 100

그 결과, 본 발명의 글루칸 유도체는 직접적인 세포독성을 나타내지 않아 안전한 물질임을 알 수 있었다(표 1 참조).As a result, the glucan derivative of the present invention did not show direct cytotoxicity and was found to be a safe substance (see Table 1).

본 발명의 글루칸 유도체의 HS27 세포주에 대한 직접적인 세포독성 실험Direct Cytotoxicity of the Glucan Derivatives of the Invention on HS27 Cell Line 시료명Sample Name 시료농도(㎍/㎖)Sample concentration (㎍ / ㎖) 세포 평균 생존율(%)Cell average survival rate (%) 1번 시료Sample 1 1,0001,000 102.5102.5 100100 101.7101.7 1010 107.7107.7 1One 100.2100.2 0.10.1 101.5101.5 2번 시료Sample 2 1,0001,000 110.2110.2 100100 102.3102.3 1010 100.8100.8 1One 100.2100.2 0.10.1 108.9108.9 3번 시료Sample 3 1,0001,000 105.4105.4 100100 103.7103.7 1010 100.2100.2 1One 100.9100.9 0.10.1 111.1111.1 4번 시료Sample 4 1,0001,000 108.2108.2 100100 100.7100.7 1010 105.3105.3 1One 104.7104.7 0.10.1 107.3107.3 5번 시료Sample 5 1,0001,000 104.2104.2 100100 100.9100.9 1010 108.1108.1 1One 106.4106.4 0.10.1 107.7107.7 6번 시료Sample 6 1,0001,000 100.1100.1 100100 102.2102.2 1010 108.5108.5 1One 104.3104.3 0.10.1 102.7102.7 7번 시료Sample 7 1,0001,000 108.4108.4 100100 109.2109.2 1010 100.8100.8 1One 102.9102.9 0.10.1 106.5106.5 8번 시료Sample 8 1,0001,000 104.7104.7 100100 107.9107.9 1010 108,2108,2 1One 100.3100.3 0.10.1 105.4105.4

[실험예2]Experimental Example 2

베타글루칸 유도체의 안전성(in vivo, 동물경구독성)시험Safety of beta glucan derivatives ( in vivo , animal oral toxicity)

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체의 안전성을 조사하기 위하여 경구독성시험을 실시하였다. 동물은 흰쥐(ICR mouse)를 사용하였으며, 평균체중 18g의 흰쥐를 구입하여 1주일간 적응시킨 후 1군에 10마리로하여 모두 8군으로 실험하였다. 보사 상세하게는 8개의 유도체를 물에 현탁시킨 후, 1주일간 적응시킨 흰쥐에 1,000㎎/㎏의 용량을 강제로 경구투여 시킨 후 2주일간 치사율, 행동특성, 탈모 및 피부발진 등의 이상증상을 조사하였다. 그 결과 8군의 80마리 모두 이상증상을 보이지 않았다.       Oral toxicity test was conducted to investigate the safety of each derivative obtained in Comparative Examples 1-8 of Example 1. Animals were used as rats (ICR mouse), and rats with an average body weight of 18 g were purchased for 1 week, and 10 rats were used in one group. In detail, eight derivatives were suspended in water, and the rats, which had been adapted for one week, were forcibly administered orally at a dose of 1,000 mg / kg for two weeks. It was. As a result, all 80 animals in 8 groups showed no symptoms.

[실험예3]Experimental Example 3

베타글루칸 유도체 필름의 유착방지효과(in vivo, 동물모델)시험Anti-Adhesion Effect of Beta Glucan Derivative Film ( in vivo , Animal Model)

실시예 1의 비교예 3에서 얻은 3번 시료와 3번 유도체의 5%(W/W)중량의 금속이온인 칼슘이온(Ca2+)을 첨가한 3-1번 시료를 사용하였고, 평균체중 230g의 SD(Sprague-Dawley) 래트 암컷을 시험에 사용하였다. SD 래트를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 후 깨끗한 수술기구를 사용하여 복부 중앙을 개복하여 소장을 노출시키고 표면에 찰과상을 내어 출혈이 생기도록 하였으며, 이에 상응하는 복벽을 사포로 마찰시켜 출혈반점을 일으킨 다음 대조군은 그대로, 3번 시료의 처리군은 박막을 상처부위에 점착한 다음 장기의 찰과상 부위와 복벽의 상처부위가 인접하도록 복강내에 재배치하고 복벽과 피부층을 일반외과 수술법에 의하여 봉합하였다. 이 때 각 처리군은 10마리로 하였으며, 7일 후 쥐를 안락사시킨다음 개복하여 유착방지율, 형태유지율 및 장기의 이상변화 유무를 확인하였다.Sample 3-1 obtained in Comparative Example 3 of Example 1 and sample 3-1 added calcium ion (Ca 2+ ), which is a metal ion of 5% (W / W) weight of the derivative 3, were used. 230 g of Sprague-Dawley (SD) rat females were used for the test. SD rats were anesthetized with diethyl ether, and then a clean surgical instrument was used to open the center of the abdomen to expose the small intestine and scratch the surface to cause bleeding. The corresponding abdominal wall was rubbed with sandpaper to bleed. After causing spots, the control group of sample No. 3 adhered the thin film to the wound area, and then relocated the abdominal wall and skin layer adjacent to the abrasion site of the organ and the wound site of the abdominal wall and sutured the abdominal wall and skin layer by general surgery. . At this time, each treatment group was 10 rats, and after 7 days, the rats were euthanized and then opened to confirm the prevention of adhesion, shape retention, and abnormal change of organs.

유착의 정도는 아래의 등급체계를 이용하였으며 유착발생의 기준은 복벽에 대한 유착을 기준으로 하였다.       The degree of adhesion was determined using the following grading system. The criteria for adhesion was based on adhesion to the abdominal wall.

0등급 : 유착발생 없음Class 0: No adhesion

1등급 : 복강내 지방질이 상처부위에 약간 붙어 있음Grade 1: Abdominal fat adheres slightly to the wound

2등급 : 장간막 등과 상처부위가 유착되어 실 같은 형태를 나타냄Level 2: The mesentery and the wound are in contact with each other.

3등급 : 혈관성조직이 발달하였고 소장과 복벽이 심하게 유착됨Grade 3: Vascular tissue is developed and the small intestine and abdominal wall are heavily adhered

박막형태유지 정도는 박막의 형태를 기준으로 하였다.       Thin film shape maintenance degree was based on the thin film shape.

0등급 : 형태의 변화 없음Class 0: No change of form

1등급 : 약간의 젤화가 일어나 박막의 두께가 두꺼워졌으나 형태는 유지하고 있음Grade 1: A little gelation caused the thin film to be thick but retained form.

2등급 : 젤화가 일어나 박막의 형태를 유지하지 못하나 젤화된 물질은 그대로 있음Level 2: Gelation does not maintain the shape of the thin film, but the gelled material remains intact

3등급 : 젤화가 일어나며 일부의 물질이 분해 및 흡수가 일어남Grade 3: Gelation occurs and some substances are decomposed and absorbed.

그 결과 대조군의 평균유착정도에 비하여 현저한 유착방지효과를 나타내었으며, 장기의 이상변화가 나타나지 않았다. 특히 칼슘이 첨가된 3-1번 시료의 경우 형태유지율이 3번 시료보다 우수한 것으로 나타났다.       As a result, it showed a significant anti-adhesion effect compared to the average degree of adhesion of the control group, there was no abnormal change of organ. In particular, in the case of sample 3-1 with calcium, the shape retention rate was better than that in sample 3.

본 발명의 글루칸 유도체의 유착방지효과, 박막형태유지율시험Anti-adhesion Effect, Thin Film Form Retention Rate Test of Glucan Derivative of the Present Invention 시료sample 등급Rating 유착방지효과Adhesion prevention effect 박막형태유지율 Thin Film Form Retention Rate 개체수Number of individuals 평균등급Average rating 개체수Number of individuals 평균등급Average rating 대조군 Control 00 00 (1×1 + 2×2 + 3×7)/10 = 2.6 (1 × 1 + 2 × 2 + 3 × 7) / 10 = 2.6 -- -  - 1One 1One -- 22 22 -- 33 77 -- 3번시료 Sample 3 00 77 (1×2 + 2×1) /10 = 0.4 (1 × 2 + 2 × 1) / 10 = 0.4 88 (1×2)/10= 0.2 (1 × 2) / 10 = 0.2 1One 22 22 22 1One 00 33 00 00 3-1시료 3-1 sample 00 88 (1×2)/10= 0.2 (1 × 2) / 10 = 0.2 1010 0.0 0.0 1One 22 00 22 00 00 33 00 00

본 발명에 따른 베타글루칸 유도체는 생체의 면역활성을 강화시켜 항종양 활성을 나타내므로 세포 독성이 거의 없고, 각 포도당 잔기를 아세트아마이드기로 치환시켜 안정성이 향상되고 파키만에 비하여 수용성 조절의 효과가 있다.Beta-glucan derivatives according to the present invention exhibits anti-tumor activity by enhancing the immune activity of the living body, so there is almost no cytotoxicity. .

또한, 본 발명에 따른 베타글루칸 유도체는 간단한 제조방법을 통해 얻을 수 있으며, 상기의 제조방법은 비용이 적게 들므로 경제적 효과가 있으며, 반응물질로 클로로아세트아마이드를 사용하여 제조한 베타글루칸 유도체는 제조의 용이성, 우수한 안정성, 면역효과의 증강의 효과가 있다.In addition, the beta glucan derivatives according to the present invention can be obtained through a simple manufacturing method, the production method is economical because it is low cost, the beta glucan derivatives prepared using chloroacetamide as a reactant is prepared Ease of use, excellent stability, there is an effect of enhancing the immune effect.

또한, 본 발명에 따른 유착방지제는 생분해성의 기간을 조절할 수 있으며, 생체적합성이 뛰어나고 유착방지의 효과가 우수하며 생체내 흡수시 면역증강효과가 있다.In addition, the anti-adhesion agent according to the present invention can adjust the period of biodegradability, has excellent biocompatibility, excellent effect of anti-adhesion, and has an immune enhancing effect upon absorption in vivo.

Claims (13)

다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 하기 화학식1으로 표시되는 베타글루칸 유도체.A beta glucan derivative represented by the following formula (1) characterized in that its glucose residue is substituted with acetamide on the basis of the polysaccharide pachyman structure. 화학식1Formula 1
Figure 112005068599444-pat00006
Figure 112005068599444-pat00006
상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH2CONH2)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.In Formula 1, R and R 'is an acetamide group (-CH 2 CONH 2 ), m and n are the number of each monomer, m is 40 to 60, n is in the range of 60 to 100.
제1항에 있어서, 상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체.[Claim 2] The beta glucan derivative according to claim 1, wherein the polysaccharide comprises a plural polysaccharide, an oligosaccharide, and a yeast polysaccharide. 제1항에 있어서, 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체.The beta glucan derivative according to claim 1, wherein the degree of substitution of acetamide is 0.01 to 0.5. (a) 버섯의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 다당체를 분리하는 단계;(a) extracting the dry powder of the mushroom with alkali to separate the polysaccharide; (b) 상기 (a)단계에서 추출분리한 다당체에 이소프로판올을 포함하는 저급알코올의 반응용매를 가하여 교반시키는 단계; (b) adding and stirring a reaction solvent of a lower alcohol including isopropanol to the polysaccharide extracted in step (a); (c) 상기 (b)단계의 용액에 수산화나트륨 또는 수산화칼슘을 포함하는 알칼리용액 중에서 선택하여 전체 중량의 0.1 내지 50%를 중화제로 첨가하여 교반시키는 단계;(c) selecting from an alkaline solution containing sodium hydroxide or calcium hydroxide in the solution of step (b) and adding 0.1 to 50% of the total weight as a neutralizing agent to stir; (d) 상기 (c)단계의 용액에 클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산 등의 클로로화합물 중 1선택하여 반응물질로 가하여 30 내지 80℃의 반응온도에서 반응시키는 단계;(d) To the solution of step (c) is selected from chloro compounds such as chloroacetic acid, chloroacetamide, dichloroacetamide, trichloroacetamide, chloroacetyl chloride, chloroacrylic acid and the like as a reaction material to 30 ~ 80 ℃ Reacting at a reaction temperature; (e) 상기 (d)단계의 용액을 원심분리하여 얻은 침전물을 알코올 용매로 씻어낸 후 감압건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 베타글루칸 유도체의 제조방법.(E) a method for producing a beta glucan derivative of formula (I) comprising the step of washing the precipitate obtained by centrifuging the solution of step (d) with an alcohol solvent and drying under reduced pressure. 장기의 비정상적인 유착을 방지하는 유착방지제에 있어서,In the anti-adhesion agent which prevents abnormal adhesion of organs, 상기 유착방지제는 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 하기 화학식1으로 표시되는 베타글루칸 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.The anti-adhesion agent is an anti-adhesion agent using a beta glucan derivative, characterized in that it comprises a beta glucan derivative represented by the following formula (1) in which a glucose residue is substituted with acetamide based on a pachyman structure which is a polysaccharide obtained from a mushroom. . 화학식1Formula 1
Figure 112005068599444-pat00007
Figure 112005068599444-pat00007
상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH2CONH2)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.In Formula 1, R and R 'is an acetamide group (-CH 2 CONH 2 ), m and n are the number of each monomer, m is 40 to 60, n is in the range of 60 to 100.
제5항에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 중량비 0.1 내지 30%의 금속이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.6. The anti-adhesion agent using beta glucan derivatives according to claim 5, wherein the beta glucan derivative contains metal ions in a weight ratio of 0.1 to 30%. 제5항에 있어서, 상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포 함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.6. The anti-adhesion agent using beta glucan derivatives according to claim 5, wherein the polysaccharide comprises a plural polysaccharide, an oligosaccharide, and a yeast polysaccharide. 제5항에 있어서, 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제The anti-adhesion agent using beta glucan derivatives according to claim 5, wherein the degree of substitution of acetamide is 0.01 to 0.5. 제5항에 있어서, 상기의 유착방지제는 분말, 젤, 박막 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.The anti-adhesion agent according to claim 5, wherein the anti-adhesion agent has a powder, a gel, or a thin film form. 제5항에 있어서, The method of claim 5, 상기 베타글루칸 유도체는 면역증강 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.The beta glucan derivative is an anti-adhesion using a beta glucan derivative, characterized in that it has an immune enhancing activity. 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계: Suspending a beta glucan derivative in which a glucose residue is substituted with acetamide based on a pachyman structure in water: 상기 현탁액을 균질화시키는 단계; 및Homogenizing the suspension; And 상기 균질화된 현탁액을 클린벤치내에서 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.Method for preparing an anti-adhesion using a beta glucan derivative of formula 1 characterized in that it comprises the step of drying the homogenized suspension in a clean bench. 면역증강 활성 및 수용성질을 갖는 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계: Suspending a beta glucan derivative having immunopotentiating activity and water solubility in water: 상기 현탁액을 균질화시키는 단계;및Homogenizing the suspension; and 상기 균질화된 현탁액을 코팅기에 의해 박막을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.Method for producing an anti-adhesion agent using a beta glucan derivative of formula 1 characterized in that it comprises the step of preparing a thin film by the homogenized suspension coating machine. 제11항 또는 제12항에 있어서,The method according to claim 11 or 12, wherein 상기 현탁액을 균질화하는 단계는 마이크로플루다이저(microfluidizer)를 이용하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.Homogenizing the suspension is a method of preparing an anti-adhesion agent using a beta glucan derivative of the formula (1), characterized in that using a microfluidizer (microfluidizer).
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