KR100542483B1 - THE PRODUCTION METHOD OF EGG CONTAINING MIXING IgY OF ANTI-E.coli IgY, ANTI-Rotarvirus IgY, ANTI-Astrovirus IgY AND THEREOF YOLK POWDER CONTAINING MIXING IgY, MIXING IgY POWDER, RAW POWERED MILK CONTAINING ABOVE YOLK POWDER COMPOUND OR IgY POWDER COMPOUND - Google Patents
THE PRODUCTION METHOD OF EGG CONTAINING MIXING IgY OF ANTI-E.coli IgY, ANTI-Rotarvirus IgY, ANTI-Astrovirus IgY AND THEREOF YOLK POWDER CONTAINING MIXING IgY, MIXING IgY POWDER, RAW POWERED MILK CONTAINING ABOVE YOLK POWDER COMPOUND OR IgY POWDER COMPOUND Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유아설사의 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스에 대한 복합적 항체인 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법과 상기 유아설사의 발병원인체 각각에 대한 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 관한 것이다.The present invention is an egg production method containing a complex special immune protein, which is a complex antibody against E. coli, rotavirus, astrovirus and the pathogens of infant diarrhea and eggs containing the special immune protein for each of the pathogens of infant diarrhea It relates to a production method.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 계란에서 분리한 복합특수면역단백질을 보유한 난황분말 또는 복합특수면역단백질분말을 함유한 조제분유에 관한 것이다.The present invention also relates to a powdered milk powder containing egg yolk powder or a complex special immune protein powder having a complex special immune protein isolated from the egg produced by the egg production method containing the complex special immune protein.
또한 본 발명은 상기 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 각각의 계란에서 난황분말을 분리하고 일정비율로 배합한 특수면역단백질을 보유한 난황분말의 혼합조성물을 함유한 조제분유에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is to prepare a formula containing a mixed composition of egg yolk powder containing a special immune protein separated from the yolk powder from each egg produced by the egg production method containing the special immune protein separately and blended in a certain ratio It is about.
또한 본 발명은 상기 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 각각의 계란에서 분리한 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 함유한 조제분유에 관한 것이다.The present invention also relates to a formula containing a mixed composition of special immune protein powder separated from each egg produced by the egg production method containing the special immune protein separately.
상기와 같이 특수면역단백질을 함유한 조제분유는 영유아기에 발생하는 설사질환의 발병원인체에 대한 항체인 특수면역단백질을 함유하므로 유아설사질환을 예방 및 치료할 수 있고, 설사를 유발하는 위장질환에 유용하게 사용할 수 있다.As described above, the formula containing the special immune protein contains a special immune protein, an antibody against the pathogen of diarrheal diseases occurring in infants and toddlers, thus preventing and treating infant diarrhea diseases, and useful for gastrointestinal diseases causing diarrhea. Can be used.
대장균(ETEC), 로타바이러스(Rotarvirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 조제분유, 특수면역단백질E. coli (ETEC), Rotarvirus, Astrovirus, formula, special immune protein
Description
도 1은 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스를 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 항-로타바이러스 및 항-아스트로바이러스 특수면역단백질의 역가변화도이고,1 is a diagram showing the titer of anti-rotavirus and anti-astrovirus specific immune proteins when E. coli, rotavirus and astrovirus are inoculated alone and E. coli and rotavirus and astrovirus are inoculated.
도 2는 대장균 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 항-대장균 특수면역단백질의 역가변화도이고,Figure 2 is a change in the titer of the anti-E. Coli special immune protein when E. coli alone inoculation and E. coli and rotavirus and astrovirus in combination,
도 3은 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스를 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 항-로타바이러스 및 항-아스트로바이러스 총 특수면역단백질의 평균역가도이고,3 is an average titer of anti-rotavirus and anti-astrovirus total special immune proteins when E. coli, rotavirus and astrovirus are inoculated alone and E. coli, Rotavirus and astrovirus are inoculated.
도 4는 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스를 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 항-로타바이러스 및 항-아스트로바이러스 특수면역단백질의 평균역가도이고,4 is an average titer of anti-rotavirus and anti-astrovirus special immune proteins when E. coli, rotavirus and astrovirus are inoculated alone and E. coli, Rotavirus and astrovirus are inoculated.
도 5는 대장균을 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 대장균 총 특수면역단백질의 평균역가도이고,5 is an average titer of total E. coli special immunoproteins when E. coli is inoculated alone and when E. coli and rotavirus and astrovirus are inoculated.
도 6은 대장균을 단독접종시 및 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 복합접종시 항-대장균 특수면역단백질의 평균역가도이다.Figure 6 is the average titer of anti-E. Coli special immune protein when E. coli alone inoculation and E. coli and rotavirus and astrovirus inoculated.
본 발명은 유아설사의 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스에 대한 복합적 항체인 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법과 상기 유아설사의 발병원인체 각각에 대한 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 관한 것이다.The present invention is an egg production method containing a complex special immune protein, which is a complex antibody against E. coli, rotavirus, astrovirus and the pathogens of infant diarrhea and eggs containing the special immune protein for each of the pathogens of infant diarrhea It relates to a production method.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 계란에서 분리한 복합특수면역단백질을 보유한 난황분말 또는 복합특수면역단백질분말을 함유한 조제분유에 관한 것이다.The present invention also relates to a powdered milk powder containing egg yolk powder or a complex special immune protein powder having a complex special immune protein isolated from the egg produced by the egg production method containing the complex special immune protein.
또한 본 발명은 상기 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 각각의 계란에서 난황분말을 분리하고 일정비율로 배합한 특수면역단백질을 보유한 난황분말의 혼합조성물을 함유한 조제분유에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is to prepare a formula containing a mixed composition of egg yolk powder containing a special immune protein separated from the yolk powder from each egg produced by the egg production method containing the special immune protein separately and blended in a certain ratio It is about.
또한 본 발명은 상기 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법에 의해 생산된 각각의 계란에서 분리한 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 함유한 조제분유에 관한 것이다.The present invention also relates to a formula containing a mixed composition of special immune protein powder separated from each egg produced by the egg production method containing the special immune protein separately.
일반적으로 대장균에는 유아에게 전염성 설사증이나 성인에게 급성장염을 일으키는 병원성 대장균(pathogenic E.coli)과 사람이나 동물의 대장상재균(Escherichia coli)인 비병원성 대장균이 있다.In general, Escherichia coli includes pathogenic E. coli, which causes infectious diarrhea in infants and acute enteritis in adults, and non-pathogenic E. coli , which is Escherichia coli in humans or animals.
본 발명과 관련한 상기 병원성 대장균(pathogenic E.coli)은 4종류로 분류된다. 최근 일본 및 미국 등 전 세계적으로 새롭게 대두된 대장균 O157:H7과 같이 베로독소(Verotoxin)를 생성하는 장관출혈성 대장균(Enterohemorrhageic E.coli:이하 EHEC라 약칭함)과 장독소(Enterotoxin)를 생성하는 장관독소원성 대장균(Enterotoxigenic E.coli:이하 ETEC라 약칭함)과 대장 점막의 상피세포를 침입하여 조직 내 감염을 일으키는 장관침투성 대장균(Enteroinvasive E.coli:이하 EIEC라 약칭함)과 성인에게 급성위장염을 일으키는 장관병원성 대장균(Enteropathogenic E.coli:이하 EPEC라 약칭함)으로 분류한다.The pathogenic E. coli according to the present invention is classified into four types. Enterohemorrhageic E. coli (hereinafter abbreviated as EHEC) and Enterotoxin, which produce verotoxin, such as E. coli O157: H7, which has recently emerged worldwide, including Japan and the United States. immunogenic E. coli toxins (Enterotoxigenic E.coli: hereinafter abbreviated as LA ETEC) and Secretary to invade the epithelium of the large intestine, causing mucosal tissue permeability of E. coli infections (Enteroinvasive E.coli: hereinafter abbreviated EIEC) and acute gastroenteritis in adults It is classified as enteropathogenic E. coli (hereinafter abbreviated as EPEC).
상기 장관독소원성 대장균(Enterotoxigenic E.coli)이 생산하는 장독소(Enterotoxin)는 이열성 독소(heat-labile enterotoxin, LT)와 내열성 독소(heat-stable enterotoxin, ST)로 나누며 장관독소원성 대장균에 감염된 환자로부터 분리한 균은 보통 이열성 독소나 내열성 독소 중 어느 하나를 생산하거나 이열성 독소와 내열성 독소를 모두 생산하기도 한다. 상기 장관독소원성 대장균은 소장 상부에서 증식해서 107/㎖∼109/㎖의 균농도에 달하면 설사증을 유발하게 된다.Enterotoxin produced by Enterotoxigenic E. coli is divided into heat-labile enterotoxin (LT) and heat-stable enterotoxin (ST), and is infected with enterotoxin-producing E. coli. The isolates from the patient usually produce either a dual toxin or a heat resistant toxin, or may produce both a heat resistant toxin and a heat resistant toxin. The enterotoxin E. coli proliferates in the upper part of the small intestine and reaches a bacterial concentration of 10 7 / ml to 10 9 / ml to induce diarrhea.
또한 설사를 유발하는 바이러스는 로타바이러스(Rotarvirus), 아스트로바이 러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 캘리시바이러스(Calicivirus), 노웍바이러스(Norwalkvirus) 등이 알려져 있다.In addition, viruses that cause diarrhea (Rotarvirus), Astrovirus (Astrovirus), Adenovirus (Adenovirus), Calicivirus (Calicivirus), Norwalkvirus (Norwalkvirus) and the like are known.
본 발명과 관련하는 상기 로타바이러스(Rotarvirus)는 레오비리데(Reoviridae)과에 속하며, 상기 로타바이러스의 유전체는 11개의 dsRNA 절편으로 구성되어 핵층, 내층, 외층의 3층 단백질로 둘러싸여 있다. 내층은 그룹 특이항원성을 나타내는 바이랄 단백질(Viral Protein6; VP6)로 구성되어 있다. 외층은 VP4와 VP7로 구성되며 바이러스 중화항체의 생산을 유도하는 주된 항원이다.The Rotarvirus according to the present invention belongs to the family of Reoviridae , and the genome of the rotavirus consists of 11 dsRNA fragments and is surrounded by three-layer proteins of the nuclear, inner and outer layers. The inner layer is composed of Viral Protein 6 (VP6), which exhibits group specific antigenicity. The outer layer consists of VP4 and VP7 and is the main antigen that induces the production of virus neutralizing antibodies.
본 발명과 관련하는 상기 아스트로바이러스(Astrovirus)는 설사의 원인이 되는 바이러스의 일종으로서 새롭게 확립된 아스트로비리데(Astroviridae)에 속하는 바이러스이고 외피막을 형성하지 않는 단층의 캡시드(capsid)로 구성되어 있다. 또한 상기 아스트로바이러스의 유전자는 단균사(single-stranded), 양성(positive-sense)의 RNA로서 약 6.8에서 7.3kb의 크기이다. 아스트로바이러스는 전자현미경 상에서 5∼6점의 별모양을 형성하기 때문에 이름을 아스트로바이러스로 명명하였다고 한다.The astrovirus according to the present invention is a virus belonging to the newly established astroviridae, which is a virus that causes diarrhea, and is composed of a single layer capsid which does not form an envelope. In addition, the gene of the astrovirus is a single-stranded, positive-sense RNA of about 6.8 to 7.3kb. Astroviruses are named as Astroviruses because they form five to six stars on an electron microscope.
상기에서 살펴본 대장균(ETEC)과 로타바이러스(Rotarvirus)와 아스트로바이러스(Astrovirus) 등으로 인한 유아설사증을 예방하기 위해 고가의 백신을 개발하고 있으나, 실용화 단계에서 많은 부작용이 나타나 이를 해결하기 위한 설사증을 일상적 식생활에서 예방 및 치료하기 위한 연구는 아직까지 미비한 편이다.In order to prevent infant diarrhea caused by E. coli (ETEC), Rotarvirus and Astrovirus, the vaccines are being developed. However, many side effects occur in the practical stages. Research to prevent and treat in the diet is still incomplete.
이에 본 발명자들은 유아설사의 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트 로바이러스에 대한 복합적 항체인 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법과 상기 유아설사의 발병원인체 각각에 대한 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란생산방법을 제공한다.Therefore, the present inventors separately include a method for producing eggs containing a complex special immune protein, which is a complex antibody against Escherichia coli, rotavirus, and astrovirus, which are the pathogens of infant diarrhea, and a special immune protein for each pathogen of the infant's diarrhea. Provide an egg production method.
또한 본 발명자들은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법으로 생산한 계란에서 분리한 복합특수면역단백질을 함유한 난황분말과 복합특수면역단백질분말을 제공한다.The present invention also provides a yolk powder and a complex special immune protein powder containing a complex special immune protein isolated from the eggs produced by the egg production method containing the complex special immune protein.
또한 본 발명자들은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 난황분말 또는 복합특수면역단백질분말을 함유한 조제분유를 제공한다.The present invention also provides a powdered yolk powder containing the complex special immune protein or a formula containing a complex special immune protein powder.
또한 본 발명자들은 상기 세가지 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란에서 분리하고 난황분말을 일정비율로 혼합하여 특수면역단백질을 함유한 난황분말 혼합조성물과 상기 세가지 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 특수면역단백질 혼합조성물을 제공한다.In addition, the present inventors are isolated from eggs containing the special immune protein for each of the three antigens separately, and yolk powder is mixed in a proportion to the yolk powder mixed composition containing a special immune protein and specific for each of the three antigens It provides a special immune protein mixture composition in which a proportion of immunoproteins is mixed.
또한 본 발명자들은 상기 특수면역단백질을 함유한 난황분말 혼합조성물 또는 특수면역단백질 혼합조성물을 함유한 조제분유를 제공한다.In addition, the present inventors provide a powdered yolk powder containing composition containing the special immune protein or a formula containing a special immune protein mixed composition.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은 유아설사의 발병원인체인 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원을 병아리에 동시접종하여 설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 공유한 계란 생산방법과 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원을 개별적으로 서로 다른 병아리에 접종하고 상기 세가지 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 계란 생산방법을 특징으로 한다.The present invention for achieving the above-described technical problem is a method for producing eggs sharing the complex special immune protein that can prevent diarrhea by inoculating coliform antigen, rotavirus antigen, astrovirus antigen, which is the pathogen of infant diarrhea, to chicks E. coli antigens, rotavirus antigens, and astrovirus antigens are individually inoculated into different chicks and characterized by egg production methods containing special immunoproteins for each of the three antigens.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 공유한 계란 생산방법으로 생산된 계란에서 추출한 난황분말 또는 상기 계란에서 추출한 복합특수면역단백질분말을 식품첨가제로 사용하여 유아설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 함유한 조제분유를 특징으로 한다.In another aspect, the present invention is a complex special immune protein that can prevent infant diarrhea by using a yolk powder extracted from eggs produced by the egg production method sharing the complex special immune protein or a complex special immune protein powder extracted from the egg as a food additive It is characterized by a formula containing.
또한 본 발명은 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각의 특수면역단백질을 함유한 계란 생산방법으로 생산된 상기 세가지 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 개별적인 계란에서 추출하여 특수면역단백질을 함유한 난황분말을 일정비율로 혼합한 난황혼합조성물과 상기 난황혼합조성물을 함유한 조제분유를 특징으로 한다.In addition, the present invention is extracted from the individual eggs containing the special immune protein for the three antigens produced by the egg production method containing each of the E. coli antigens, rotavirus antigens, Astrovirus antigens containing special immune protein It is characterized by a yolk blend composition comprising a yolk powder mixed at a predetermined ratio and a powdered milk powder containing the yolk blend composition.
또한 본 발명은 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각의 특수면역단백질을 함유한 계란 생산방법으로 생산된 상기 세가지 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 각각의 계란에서 추출한 특수면역단백질분말을 일정비율로 혼합한 특수면역단백질 혼합조성물과 상기 특수면역단백질 혼합조성물을 함유한 조제분유를 특징으로 한다.In addition, the present invention is a special immune protein powder extracted from each egg containing the special immune protein for the three antigens produced by the egg production method containing each of the E. coli antigen, rotavirus antigen, Astrovirus antigen It is characterized by a formula containing a special immune protein mixture composition mixed with a certain ratio and the special immune protein mixture composition.
상기와 같은 유아설사 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스를 수산화알루미늄과 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법은 다음과 같다.E. coli, rotavirus, and astroviruses, which are the pathogens of infant diarrhea, are emulsified with aluminum hydroxide and an emulsification adjuvant (ISA25) to produce eggs containing complex special immune proteins as follows.
대장균항원과 로타바이러스항원과 아스트로바이러스항원을 수산화알루미늄으로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세가지 동일항원들을 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액을 상기 병아리에 2주 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종하여 총 3회 접종하는 단계;로 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산한다.Preparing a mixed bacterial emulsion by emulsifying E. coli antigen, rotavirus antigen, and astrovirus antigen with aluminum hydroxide; Inoculating 0.5 ml of the mixed bacterial emulsification solution on a chick once; Preparing a mixed bacterial emulsion by emulsifying the three identical antigens with an emulsification aid (ISA25); Inoculating the mixed bacterial emulsification solution to the chick two times at 0.5 ml two times intervals in total three times; the anti-E. Coli special immune protein (IgY) and anti-rotavirus special immune protein (IgY) to the eggs produced by ) To produce an egg with a complex special immune protein (IgY) against the anti-mixed bacteria, characterized in that it shares the anti-astrovirus special immune protein (IgY).
상기 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란의 생산단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Referring to the production step of the egg containing the complex special immune protein (IgY) in more detail as follows.
대장균항원:로타바이러스항원:아스트로바이러스항원:유화보조제 비율이 2.4:2.3:2.3:3이 되도록, 8.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.24㎖와 108TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.23㎖와 108TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.23㎖를 수산화알루미늄 0.3㎖로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세 가지 동일비율의 동일항원들을 유화보조제(ISA25) 0.3㎖로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액을 상기 병아리에 2주 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종하여 총 3회 접종하는 단계;로 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산한다.E. coli antigen: Rotavirus antigen: Astrovirus antigen: Emulsification aid ratio of 2.4: 2.3: 2.3: 3, 0.24 ml of 8.0 × 10 8 / ml Escherichia coli solution antigen and 0.23 ml of 10 8 TCID 50 Rotavirus inactivated
상기와 같은 유아설사 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스를 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)와 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법은 다음과 같다.E. coli, rotavirus, and astroviruses, which are the pathogens of infant diarrhea, are emulsified with Adjuvant complete Freund's and Adjuvant incomplete Freund's to produce eggs containing complex special immune proteins. Is as follows.
대장균항원과 로타바이러스항원과 아스트로바이러스항원을 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세가지 동일항원들을 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액을 상기 병아리에 2주 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종하여 총 3회 접종하는 단계로 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산한다.Preparing a mixed bacterial emulsion by emulsifying E. coli antigens, rotavirus antigens, and astrovirus antigens with Adjuvant complete Freund's; Inoculating 0.5 ml of the mixed bacterial emulsification solution on a chick once; Emulsifying the three identical antigens with Adjuvant incomplete Freund's to prepare a mixed bacterial emulsion; Anti-E. Coli special immunoprotein (IgY) and anti-rotavirus special immune protein (IgY) in the eggs produced by inoculating the mixed bacterial emulsification solution to the chick two times at a rate of 0.5 ml two times at intervals of two weeks. Produces eggs with complex special immune protein (IgY) against the anti-mixed bacteria, characterized in that to share the anti-astrovirus special immune protein (IgY).
상기 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란의 생산단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Referring to the production step of the egg containing the complex special immune protein (IgY) in more detail as follows.
대장균항원:로타바이러스항원:아스트로바이러스항원:유화보조제 비율이 2.4:2.3:2.3:3이 되도록, 8.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.24㎖와 108TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.23㎖와 108TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.23㎖를 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세가지 동일비율의 동일항원들을 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's) 0.3㎖로 유화시켜 혼합균유화액을 제조하는 단계; 상기 혼합균유화액을 상기 병아리에 2주 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종하여 총 3회 접종하는 단계;로 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산한다.E. coli antigen: Rotavirus antigen: Astrovirus antigen: Emulsification aid ratio of 2.4: 2.3: 2.3: 3, 0.24 ml of 8.0 × 10 8 / ml Escherichia coli solution antigen and 0.23 ml of 10 8 TCID 50 Rotavirus inactivated
또한 상기 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 함유한 계란을 난가공 공장에서 난황을 분리하고 알카리이온수로 지방층을 제거하여 농축여과하며 동결건조하여 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질을 함유한 난황분말을 생산한다.In addition, the egg yolk is separated from egg processing plants containing both anti-E. Coli special immune protein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY), and anti-astrovirus special immune protein (IgY) produced by the above method. It removes fat layer with alkaline ionized water, concentrates filtration, and freeze-dried to produce yolk powder containing complex special immune protein against anti-bacterial bacteria.
또한 상기의 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 함유한 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거하는 단계; 상기 난황막이 제거된 난황과 알카리이온수(pH 9.0)를 첨가하여 교반하고 24시간 정치하는 단계; 상기 정치한 난황 혼합액에 알카리이온수(pH 10.0)를 난황혼합액의 18배 분량(72ℓ)을 첨가하고 방치하는 단계; 및 상기 방치된 난황혼합액의 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과하여 동결건조하는 단계로 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질 분말을 생산한다.In addition, the egg yolk membrane containing the anti-E. Coli special immune protein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY) and anti-astrovirus special immune protein (IgY) produced by the above method at the same container Removing; Adding the egg yolk and alkaline ionized water (pH 9.0) from which the egg yolk film was removed, stirring and standing for 24 hours; Adding alkaline ionized water (pH 10.0) to an amount of 18 times (72 L) of the egg yolk mixture and leaving it in the remaining egg yolk mixture; And lyophilizing the supernatant liquid, which is suspended in the upper layer of the left egg yolk mixture, and concentrated filtration of the supernatant that has not been precipitated to produce the complex special immune protein powder against the anti-bacterial bacteria.
상기와 같은 방법으로 생산한 항 혼합균에 대한 복합특수면역단백질을 함유한 난황분말 또는 복합특수면역단백질(IgY)분말을 조제분유에 첨가하여 특수면역단백질을 함유한 조제분유를 생산한다.The yolk powder or the complex special immunoprotein (IgY) powder containing the complex special immune protein against the anti-mixture produced by the above method is added to the formula to produce the formula containing the special immune protein.
유아설사증 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스 각각을 수산화알루미늄과 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 상기 세가지 유아설사증 발병원인체에 대한 각각의 특수면역단백질을 함유한 개별적인 계란을 생산하여 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물과 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.E. coli, rotavirus, and astroviruses, which cause infant diarrhea, are emulsified with aluminum hydroxide and an emulsification aid (ISA25) to produce individual eggs containing each of the special immune proteins for the three causes of infantile diarrhea. The method for preparing the mixed composition of the yolk powder containing and the special immune protein powder is as follows.
대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각에 대해 수산화알루미늄 비율을 1:1이 되도록, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50
, 아스트로바이러스 107TCID50 포함된 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세가지 동일비율의 동일항원을 다시 동량의 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 상 기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여, 총3회 접종하는 단계;로 생산한 상기 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 개별적인 계란에서 추출한 각각의 수용성단백질(crude IgY) 분말을 배합비가 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물을 제조한다.Emulsify 2.0 × 10 8 / mL E. coli antigen 0.25ml and aluminum hydroxide 0.25ml so that the ratio of aluminum hydroxide is 1: 1 for each of E. coli, Rotavirus and Astrovirus antigens, and 2.0 × 10 7 TCID 50 Emulsifying 0.25 ml of rotavirus inactivated antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide, and emulsifying 2.0 ml of 2.0 × 10 7 TCID 50 astrovirus inactivated antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide to prepare individual bacterial emulsions for the respective antigens. ;
대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각에 대해 수산화알루미늄 비율을 1:1이 되도록, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50
, 아스트로바이러스 107TCID50 포함된 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세 가지 동일비율의 동일항원을 다시 동량의 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여, 총3회 접종하는 단계;로 생산한 상기 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 개별적인 계란에서 추출한 각각의 수용성단백질(crude IgY) 분말을 배합비가 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 제조한다.Emulsify 2.0 × 10 8 / mL E. coli antigen 0.25ml and aluminum hydroxide 0.25ml so that the ratio of aluminum hydroxide is 1: 1 for each of E. coli, Rotavirus and Astrovirus antigens, and 2.0 × 10 7 TCID 50 Emulsifying 0.25 ml of rotavirus inactivated antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide, and emulsifying 2.0 ml of 2.0 × 10 7 TCID 50 astrovirus inactivated antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide to prepare individual bacterial emulsions for the respective antigens. ;
유아설사증 발병원인체인 대장균, 로타바이러스, 아스트로바이러스 각각을 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 상기 세가지 유아설사증 발병원인체에 대한 각각의 특수면역단백질을 함유한 개별적인 계란을 생산하여 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물과 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.E. coli, rotavirus, and astrovirus, each of which causes infant diarrhea, are emulsified with adjuvant complete freund's and adjuvant incomplete freund's, and each of the special immune proteins for the three infants with diarrhea. The method for producing a mixed composition of egg yolk powder containing a special immune protein and a special immune protein powder by producing individual eggs containing is as follows.
대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각에 대해 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)비율을 1:1이 되도록, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스107TCID50, 아스트로바이러스 107TCID50 포 함된 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세가지 동일비율의 동일항원을 다시 동량의 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여, 총3회 접종하는 단계;로 생산한 상기 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 개별적인 계란에서 추출한 각각의 수용성단백질(crude IgY) 분말을 배합비가 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물을 제조한다.0.25 mL of 2.0 × 10 8 / mL E. coli antigen and Freund's complete adjuvant so that the ratio of Adjuvant complete Freund's is 1: 1 for each of E. coli, Rotavirus and Astrovirus antigens. Freund's) 0.25 ml emulsified, 0.25 ml 2.0 × 10 7 TCID 50 rotavirus inactivated antigen and 0.25 ml Adjuvant complete Freund's adjuvant, 2.0 × 10 7 TCID 50 Astrovirus inactivated antigen 0.25 ml And emulsifying 0.25 ml of Freund's complete adjuvant (Adjuvant complete Freund's) to prepare individual microemulsions for each antigen;
대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원 각각에 대해 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 비율을 1:1이 되도록, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50, 아스트로바이러스 107TCID50 포 함된 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하는 단계; 상기 세 가지 동일비율의 동일항원을 다시 동량의 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 제조하는 단계; 상기 각각의 항원에 대한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여, 총 3회 접종하는 단계;로 생산한 상기 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 개별적인 계란에서 추출한 각각의 수용성단백질(crude IgY) 분말을 배합비가 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질분말의 혼합조성물을 제조한다.0.25 × 2.0 × 10 8 / ml E. coli antigen and Freund's complete adjuvant so that the ratio of Adjuvant complete Freund's is 1: 1 for each of E. coli, Rotavirus and Astrovirus antigens. Freund's) 0.25 ml emulsified, 0.25 ml 2.0 × 10 7 TCID 50 rotavirus inactivated antigen and 0.25 ml Adjuvant complete Freund's adjuvant, 2.0 × 10 7 TCID 50 Astrovirus inactivated antigen 0.25 ml And emulsifying 0.25 ml of Freund's complete adjuvant (Adjuvant complete Freund's) to prepare individual microemulsions for each antigen;
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1Example 1
1. 대장균(Enteropathogenic E.coli) 분리동정 및 항원제조1.Isolation Identification and Antigen Production of Enteropathogenic E. coli
가) 사람에서의 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli;ETEC) 분리 및 동정A) Isolation and Identification of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in Humans
본 발명에 사용된 대장균(Enterotoxigenic E.coli)은 설사증상을 나타낸 소아의 분변에서 분리하였다. 상기 항원으로 사용된 대장균(Enterotoxigenic E.coli)의 분리는 다음과 같은 방법으로 하였다. 소아의 설사분변을 혈액한천배지에 도말 후 37℃항온기에서 18시간 배양하여 α-용혈성을 나타내는 하나의 대장균 집락을 선택하였다. 선택된 집락은 멕콘키 배지(MacConkey agar)에서 핑크색의 집락으로 자랐으며, EMB배지(EMB agar)에 도말하여 철녹색(metalic green)으로 자라는 대장균의 특이적인 집락성상을 확인하였다. 이렇게 분리된 대장균을 EB-E01로 명명하였다.Escherichia coli (Enterotoxigenic E. coli ) used in the present invention was isolated from feces of children with diarrhea symptoms. Escherichia coli (Enterotoxigenic E. coli ) used as the antigen was performed in the following manner. Diarrhea in children was plated on blood agar medium and cultured at 37 ° C for 18 hours to select one colony of E. coli showing α-hemolysis. The selected colonies grew to pink colonies on MacConkey agar, and confirmed the specific colony characteristics of Escherichia coli, which grew to metallic green by smearing on EMB medium (EMB agar). This isolated E. coli was named EB-E01.
나) 독소(Toxin) 생산능 확인B) Toxin Production Capacity Verification
상기 대장균(Enterotoxigenic E.coli)을 분리하고 동정하여 장관독소원성(enterotoxigenicity)의 주요원인인 장관성독소(Entrotoxin)의 생산능을 중합효소반응(Polymerase chain reaction; 이하 PCR이라 함)기법을 이용하여 확인하였다. 열안정성 독소(heat stable toxin:이하 ST라 약칭함)의 STa1 유전자와 열 불안정성 독소(heat lable toxin:이하 LT라 약칭함)의 LTh 유전자에 대한 특이 원형체(Primer)를 이용한 다복합(multiplex) PCR기법을 이용하여 증폭하였다.Enterotoxigenic E. coli is isolated and identified to produce enterotoxin, a major cause of enterotoxigenicity, using a polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR) technique. Confirmed. Multiplex PCR using specific primers for the STa1 gene of heat stable toxin (abbreviated as ST) and LTh gene of heat unstable toxin (abbreviated as LT) Amplification was done using the technique.
ST 독소 확인용 원형체는The ST toxin prototype
sense primer ; CCCCTCTTTTAGTCAGTCsense primer; CCCCTCTTTTAGTCAGTC
anti-sense primer ; CCAGCACAGGCAGGATTACAanti-sense primer; CCAGCACAGGCAGGATTACA
165bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.What was constructed to amplify the final product of 165 bps was used.
LT 독소 확인용 원형체는The prototype for LT toxin identification is
sense primer ; CAGACTATCAGTCAGAGGTTGsense primer; CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
anti-sense primer ; TTCATACTGATTGCCGCAanti-sense primer; TTCATACTGATTGCCGCA
417bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다. 상기 증폭은 PCR 기법을 이용하여 증폭하였다.What was constructed to amplify the final product of 417bps was used. The amplification was amplified using the PCR technique.
상기 PCR기법의 PCR조건은 전-변성 온도(Pre-denaturation temperature)가 95℃하에서 5분간, 변성온도(Denaturation temperature)가 94℃하에서 1분간, 병합온도(Annealing temperature)가 56℃하에서 1분간, 연장온도(Elongation temperature)가 72℃하에서 1분간, 후-연장온도(Post-elongation temperature)가 72℃하에서 10분간으로 진행되었다. 상기 PCR기법에 의해 증폭된 산물은 2% 한천겔(agarose gel)을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 본 발명에 사용된 분리균주인 대장균(Enterotoxigenic E.coli)이 ST(열안정성 독소)를 생산하는 것을 확인하였다.PCR conditions of the PCR method is 5 minutes at the pre-denaturation temperature (95 ℃), denaturation temperature (Denaturation temperature) 94 minutes 1 minute, annealing temperature (56 ℃) 1 minute, Elongation temperature was performed for 1 minute under 72 degreeC, and post-elongation temperature for 10 minutes under 72 degreeC. The product amplified by the PCR technique was confirmed by electrophoresis using 2% agar gel (agarose gel). It was confirmed that Escherichia coli ( Enterotoxigenic E. coli ), which is used in the present invention, produces ST ( thermotable toxin).
다) 대장균(Enterotoxigenic E.coli:ETEC) 항원제조C) Production of Enterotoxigenic E. coli: ETEC
상기 ST(열안정성 독소)를 생산하는 대장균(Enterotoxigenic E.coli)주를 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agar)에 접종 후 37℃항온기에서 18시간 배양 후 하나의 집락(colony)을 5㎖의 트립티케이스 소이 브로쓰(Trypticase soy broth)에 접종했다. 2시간 후 대량의 트립티케이스 소이 브로쓰에 접종하여 37℃에서 48시간 정치배양하였다. 포름알데하이드(formaldehyde)를 상기 정치배양된 균액의 0.2%되도록 혼합하고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 수확하였고 멸균생리식염수(pH7.2)로 3회 세척하였다. 수확된 균체는 410nm에서 O.D.(Oculus Dexter)가 1.2∼1.3되도록 생리식염수에 부유시킨 뒤 사용하였다.After inoculating the ST-producing Escherichia coli ( Enterotoxigenic E. coli ) strain into Trypticase soy agar and incubating at 37 ° C for 18 hours, one colony (colony) was 5 ml. Trypticase soy broth was inoculated. After 2 hours, inoculated into a large amount of tryticase soy broth and incubated for 48 hours at 37 ℃. Formaldehyde was mixed to 0.2% of the cultured cells and inactivated at room temperature for 24 hours. The inactivated bacterial solution was harvested by centrifugation at 4,000 rpm for 20 minutes and washed three times with sterile physiological saline (pH 7.2). The harvested cells were used after floating in physiological saline so that OD (Oculus Dexter) was 1.2-1.3 at 410 nm.
2. 로타바이러스(rotarvirus)의 분리 동정 및 항원제조2. Isolation Identification and Antigen Production of Rotarvirus
1) 로타바이러스(rotarvirus) 항원제조1) Rotarvirus Antigen Production
① 세포배양① Cell culture
레서스 원숭이(Rhesus monkey) 태아의 신장으로부터 유래된 MA-104cell을 로타바이러스 분리 및 증폭을 위해 사용하였다. 세포증식용 배지로는 10% 소의 태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 듀베코스 필수배지(Dubeccous essential medium:이하 DMEM이라 약칭함)를 사용하였다. 세포배양조건은 이산화탄소 5%함유하는 37℃항온기에서 배양하였다.MA-104 cells derived from the kidneys of Rhesus monkey fetuses were used for rotavirus isolation and amplification. As a cell proliferation medium, Dubeccous essential medium (hereinafter abbreviated as DMEM) to which 10% fetal bovine serum was added was used. Cell culture conditions were incubated in a 37 ℃ thermostat containing 5% of carbon dioxide.
② 대변검체에서 바이러스 분리 및 바이러스 증폭② Virus isolation and amplification of virus from stool sample
I) 대변검체I) Fecal specimen
설사증상을 일으킨 유아의 설사변을 실험에 사용하였다.Diarrhea in infants with diarrhea symptoms was used in the experiment.
II) Electropherotyping(일렉트로페로타이핑)II) Electropherotyping
상기 설사변검체의 로타바이러스 양성여부를 확인하기 위하여 Electropherotyping(일렉트로페로타이핑)을 실시하였다. 설사변검체 100㎍을 쏘오디움 아세테이트(sodium acetate, 0.1M)용액 1㎖에 희석하여 진탕한 후 동량의 페놀:클로로포름:이소아밀:알코올(Phenol:chloroform:isoamyl alcohol=25:24:1)을 첨가하여 진탕하였다. 상기 진탕 후, 원심분리를 12,000rpm에서 10분간 실시한 뒤 상층액을 취하였다.Electropherotyping was performed to confirm the rotavirus positiveness of the diarrhea samples. 100 µg of diarrhea specimen was diluted in 1 ml of sodium acetate (0.1M) solution and shaken. Then, the same amount of phenol: chloroform: isoamyl alcohol was added. (Phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24: 1) And shaken. After the shaking, centrifugation was performed at 12,000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was taken.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis: PAGE)은 레밀리(Laemli)방법에 따라 8%의 폴리아크릴아미드 평판 겔(polyacrylamide slab gel)에 상기방법으로 추출한 RNA를 넣고 10mA로 16시간 전기영동하였다. 전기 영동이 끝난 뒤, 고정액에서 30분간 고정 후 질산은(silver nitrate, 0.01M)용액으로 2시간 동안 염색을 하였다. 염색한 겔(gel)을 쏘디움 보로히드라이드(sodium borohydride, 0.0023M)용액으로 10분간 환원과정을 거친 뒤 고정하였다. 고정 후, 로타바이러스 특유의 띠가 확인되는 것을 양성으로 판정하였다. 양성판정된 로타바이러스를 EB-RS02로 명명하였다.Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was electrophoresed at 10 mA for 16 hours with RNA extracted from the above method in 8% polyacrylamide slab gel according to the Laemli method. . After the electrophoresis, the dye was fixed in a fixed solution for 30 minutes and then stained with silver nitrate (silver nitrate, 0.01M) solution for 2 hours. The dyed gel was fixed with sodium borohydride (0.0023M) solution for 10 minutes after reduction. After fixation, it was determined as positive that a band unique to rotavirus was identified. The positively determined rotavirus was named EB-RS02.
III) 로타바이러스의 분리III) Isolation of Rotavirus
설사변검체 중 electrophenotyping(일레트로페로타이핑)에서 상기 양성판정된 로타바이러스를 이용하여 로타바이러스를 분리하였다. 로타바이러스의 처리배지는 트립신(Trypsin) 10㎍/㎖ 첨가된 비혈청함유 DMEM을 이용하였으며 유지배지는 0.5 ㎍/㎖의 트립신(Trypsin)이 첨가된 비혈청함유 DMEM을 사용하였다.Rotavirus was isolated using the positively determined rotavirus in electrophenotyping (iletroferrotyping) of diarrhea samples. Rotavirus treated medium was used non-serum-containing DMEM with trypsin 10μg / ㎖ and non-serum containing DMEM with 0.5μg / ㎖ trypsin was used.
상기 양성판정된 설사변검체 200㎍을 처리배지 2㎖에 진탕하여 4℃에서 16시간 반응 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 원심분리를 3000rpm에서 10분간 실시하여 상층액을 얻었으며, 상층액은 0.45㎛ 필터(filter)를 이용하여 여과(filteration)하였다. MA-104cell을 1×105cells/㎖로 접종(seeding)하여 70%정도 단층(monolayer)이 되었을 때 비혈청함유 DMEM으로 3회 세척후 처리배지(Trypsin10㎍/㎖)에서 반응된 설사변검체시료를 접종했다. 접종된 시료를 37℃에서 1시간 30분 감작시킨 뒤 비혈청함유 DMEM으로 1회 세척 후 유지배지로 교환하였고 세포배양조건과 동일한 환경에서 접종된 세포를 배양하였다. 배양된 세포를 세포변성효과(CPE)여부를 관찰하여 세포변성효과가 나타나면 배양상층액을 3회 얼 리고 녹이는 과정을 반복하여 -20℃에 보관하며 다음 배양에 사용하였다.200 μg of the positively determined diarrhea specimen was shaken in 2 ml of the treated medium and reacted at 4 ° C. for 16 hours and then at 37 ° C. for 1 hour. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, and the supernatant was filtered using a 0.45 μm filter. When the MA-104cell was seeded at 1 × 10 5 cells / ml and became 70% monolayer, it was washed three times with non-serum-containing DMEM and reacted with diarrhea specimens in treated medium (Trypsin10㎍ / ㎖). Was inoculated. The inoculated sample was sensitized at 37 ° C. for 1
IV) 로타바이러스의 증폭IV) Amplification of Rotavirus
MA-104cell을 1×105cells/㎖로 접종(seeding)하여 70%정도 단층(monolayer)이 되었을 때, 비혈청함유 DMEM으로 3회 세척 후 처리배지(Trypsin 10㎍/㎖)에서 4℃에서 16시간 반응된 바이러스를 접종했다. 37℃에서 1시간 30분간 감작시킨 뒤 비혈청함유 DMEM으로 1회 세척후 유지배지로 교환하였고 세포배양조건과 동일한 환경에서 접종된 세포를 배양하였다. 배양한 세포를 세포변성효과(CPE)여부를 관찰하여 세포변성효과가 나타나면 배양상층액을 3회 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 -20℃에 보관하였다.When MA-104cell was seeded at 1 × 10 5 cells / ml and became 70% monolayer, it was washed three times with non-serum-containing DMEM and then treated at 4 ° C. in treated medium (Trypsin 10µg / ml). The virus was inoculated for 16 hours. After sensitization at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes, the cells were washed once with non-serum-containing DMEM, exchanged with maintenance medium, and cultured inoculated under the same conditions as cell culture conditions. When the cells were cultured and observed for cytopathic effect (CPE), the cell denaturation effect was stored and stored at -20 ° C by repeatedly freezing and thawing the culture supernatant three times.
V) 로타바이러스의 불활화V) Inactivation of Rotavirus
로타바이러스(rotarvirus)의 불활화는 2-브로모에틸아미드(2-Bromoethylamide:이하 BEI이라 약칭함)를 이용하였다. 로타바이러스(rotarvirus)에 최종농도 0.004M의 BEI를 첨가하여 37℃에서 5시간 반응하여 불활화하였으며, 반응은 0.004M의 쏘오디움 티오황산용액(sodium thiosulfate solution, 2M)으로 정지하였다.Inactivation of rotarvirus was used as 2-bromoethylamide (hereinafter abbreviated as BEI). Rotarvirus was inactivated by addition of BEI at a final concentration of 0.004M for 5 hours at 37 ° C, and the reaction was stopped with 0.004M of sodium thiosulfate solution (2M).
VII) 엘리사(ELISA)용 로타바이러스항원의 제조VII) Preparation of Rotavirus Antigens for ELISA
MA-104cell에서 증폭된 로타바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속원심분리하였다. 원심분리 후 침전물을 2㎖의 완충용액을 넣고 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 부유한다. 부유된 액체는 18㎑에서 1분간 3회 고주파분리(sonication)하여 엘리 사(ELISA)항원으로 이용하였다.Rotavirus amplified in MA-104cell was ultracentrifuged for 90 minutes at 25,000 rpm. After centrifugation, the precipitate was added with 2 ml of buffer solution and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours to be suspended. The suspended liquid was sonicated three times for 1 minute at 18 Hz and used as an ELISA antigen.
3. 아스트로바이러스(Astrovirus) 항원제조3. Production of Astrovirus Antigen
1)아스트로바이러스(Astrovirus) 항원제조1) Production of Astrovirus Antigen
i) 세포배양i) cell culture
CaCo-24cell을 아스트로바이러스의 증폭을 위해 사용하였다. 세포증식용 배지로는 10% 소의 태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM을 사용하였다. 세포배양조건은 이산화탄소 5% 함유하는 37℃ 항온기에서 배양하였다.CaCo-24cell was used for amplification of astrovirus. DMEM with 10% bovine fetal bovine serum was used as a cell growth medium. Cell culture conditions were incubated in a 37 ℃ thermostat containing 5% of carbon dioxide.
ii) 아스트로바이러스의 증폭ii) amplification of astroviruses
아스트로바이러스의 처리배지는 트립신(Trypsin) 10㎍/㎖ 첨가된 비혈청함유 DMEM을 이용하였으며 유지배지는 0.5㎍/㎖의 트립신(Trypsin)이 첨가된 비혈청함유 DMEM을 사용하였다. CaCo-2cell을 1×105cells/㎖로 접종(seeding)하여 70%정도 단층(monolayer)이 되었을 때 비혈청함유 DMEM으로 3회 세척 후 처리배지(Trypsin 10㎍/㎖)에서 37℃에서 30분간 반응된 아스트로바이러스를 접종했다. 접종된 아스트로바이러스를 37℃에서 1시간 동안 감작시킨 뒤 비혈청함유 DMEM으로 1회 세척 후 유지배지(Trypsin 0.5㎍/㎖)로 교환하였고 세포배양조건과 동일한 환경에서 접종된 세포를 배양하였다. 배양한 세포를 세포변성효과(CPE)여부를 관찰하여 세포변성효과가 나타나면 배양상층액을 3회 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 -20℃에 보관하였다.Astrovirus treatment medium was used non-serum-containing DMEM with trypsin 10μg / ㎖ and non-serum-containing DMEM was added 0.5μg / ㎖ trypsin (Trypsin). When CaCo-2cell was seeded at 1 × 10 5 cells / ml and became 70% monolayer, it was washed three times with non-serum-containing DMEM and then washed at 37 ° C in a treatment medium (
iii) 아스트로바이러스의 불활화iii) inactivation of astroviruses
아스트로바이러스의 불활화는 2-브로모에틸아미드(2-Bromoethylamide:이하 BEI라 약칭함)를 이용하였다. 아스트로바이러스에 최종농도 0.004M의 BEI를 첨가하여 37℃에서 5시간 반응하여 불활화하였으며, 반응은 0.004M의 티오황산염용액(sodium thiosulfate solution, 2M)으로 정지하였다.As for the inactivation of the astrovirus, 2-bromoethylamide (2-Bromoethylamide: hereinafter abbreviated as BEI) was used. Astrovirus was inactivated by addition of BEI at a final concentration of 0.004M for 5 hours at 37 ° C, and the reaction was stopped with 0.004M of sodium thiosulfate solution (2M).
iV) 엘리사(ELISA)용 아스트로바이러스항원의 제조iV) Preparation of Astrovirus Antigen for ELISA
CaCo-2cell에서 증폭된 아스트로바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속원심분리하였다. 원심분리 후 침전물을 2㎖의 완충용액을 넣고 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 부유한다. 부유된 액체는 18㎑에서 1분간 3회 고주파분리(sonication)하여 엘리사(ELISA)항원으로 이용하였다.Astrovirus amplified in CaCo-2cell was ultrafast centrifuged for 90 minutes at 25,000rpm. After centrifugation, the precipitate was added with 2 ml of buffer solution and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours to be suspended. The suspended liquid was sonicated three times for 1 minute at 18 Hz and used as an ELISA antigen.
이하 실시예는 세가지 항체를 복합적으로 생산하여 그 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출한 복합특수면역단백질을 이용한 조제분유에 관한 것이다.The following example relates to a formula using a complex special immune protein extracted from the egg produced by the production method of the three antibodies in combination.
4. 복합된 세 가지 항원을 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)4. Inoculate three complex antigens into chicks and boost the laying hens
(가) 중추 12주령의 병아리에 접종된 항원은 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50, 아스트로바이러스 107TCID50이었으며, 대장균항원: 로타바이러스항원:아스트로바이러스항원:유화보조제의 비율은 2.4:2.3:2.3:3으로 하였다. 보다 상세하게는 8.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.24㎖와 108TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.23㎖와 108TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.23㎖를 수산화알루미늄 0.3㎖ 로 유화시킨 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하고, 2회째부터 부스팅에 사용된 유화보조제는 공지된 ISA25를 사용하여 유화시킨 혼합균유화액을 상기 병아리에 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여 총3회 접종하였다.Of the oil additives: (a) an antigen challenge in chickens of a central 12-week-old was was number E. coli cells were 10 8 / ㎖,
(나) 중추 12주령의 병아리에 접종된 항원은 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50, 아스트로바이러스 107TCID50이었으며, 대장균항원:로타바이러스항원:아스트로바이러스항원:유화보조제의 비율은 2.4:2.3:2.3:3으로 하였다. 보다 상세하게는, 8.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.24㎖와 108TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.23㎖와 108TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.23㎖를 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 0.5㎖를 병아리에 1회 접종하고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 유화보조제는 공지된 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 유화시킨 혼합균유화액을 상기 병아리에 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여 총3회 접종하였다.(B) Antigens inoculated into chicks 12 weeks of age were
상기 (가), (나)의 결과 상기 혼합균유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.As a result of (a) and (b), anti-E. Coli special immunoprotein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY), and anti-astrovirus special immunity in eggs produced from the laying hens inoculated with the mixed bacterial emulsion Eggs that shared protein (IgY) simultaneously were produced.
5. 신선난황분리, 난황분말추출, 특수면역단백질 분리 및 역가 측정5. Fresh egg yolk separation, egg yolk powder extraction, special immune protein isolation and titer measurement
가) 신선난황분리Fresh egg yolk separation
상기 방법에 의하여 생산된 계란을 깨서 난황을 제외한 난백을 분리하여 신선난황을 플라스크나 병에 넣는다.Eggs produced by the above method are broken and egg whites except egg yolk are separated and fresh egg yolk is placed in a flask or bottle.
나) 난황분말B) egg yolk powder
상기 분리된 신선난황을 원심분리하고 동결건조하여 난황분말을 추출한다.The separated egg yolk is centrifuged and lyophilized to extract yolk powder.
다) 특수면역단백질 분리 및 역가 측정C) Immune protein isolation and titer measurement
시험 분석에 사용된 특수면역단백질의 분리 및 측정법은 공지된 방법으로 하였다.The isolation and measurement method of the special immune protein used in the test analysis was a known method.
막을 제거한 난황 35g를 250㎖병에 넣은 다음, 증류수 35㎖을 첨가하여 교반하였다. 수분간 실온에서 방치한 후 난황의 4배 분량(140㎖)의 λ-카라기난(0.1%)과 혼합하여, 다시 30분간 방치해 둔 다음 10,000×g에서 15분간 원심분리했다. 침전물은 주로 인지질이므로 제거하고, 상층액은 수용성 단백질이므로 이 부분을 #2 여지로 여과했다.35 g of the yolk removed from the membrane was placed in a 250 ml bottle, and 35 ml of distilled water was added thereto, followed by stirring. After standing at room temperature for several minutes, the mixture was mixed with four times the amount of egg yolk (140 mL) of lambda-carrageenan (0.1%), and left for another 30 minutes, followed by centrifugation at 10,000 x g for 15 minutes. The precipitate was removed primarily because of phospholipids, and the part was filtered # 2 because the supernatant was a water soluble protein.
상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질 중 총 특수면역단백질의 함량과 특수면역단백질의 함량을 다음과 같이 측정하였다.The content of total special immune protein and the content of special immune protein in the water-soluble protein obtained by the filtration were measured as follows.
총 특수면역단백질 함량측정은 희석된 래빗 항-치크 IgG 항체(rabbit anti-chick IgG antibody)를 마이크로플레이트에 코팅하여 16시간 방치해 둔 다음 세척하였다. 이 마이크로플레이트에 상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질(조항체)을 넣어 반응시킨 후 세척한 다음, 1/30,000으로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. 여기에 HRP의 기질로는 TMB를 사용했고 반응 정지액으로는 2노르말 황산(2N-H2SO)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 1, 도 3, 도 4에 도시하였다.The total special immunoprotein content was measured by coating a diluted rabbit anti-chick IgG antibody on a microplate and leaving it for 16 hours before washing. The microplate was added with a water-soluble protein (coagulant) obtained by the above filtration and allowed to react, followed by washing, followed by addition of rabbit anti-cheek IgG Ab-HRP diluted to 1 / 30,000. Here, TRP was used as a substrate of HRP, and absorbance was measured at 450 nm using 2 -normal sulfuric acid (2N-H 2 SO) as a reaction stopper. This result is shown in FIG. 1, FIG. 3, FIG.
상기 도 3에서 보는 바와같이 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 프로인트 유화보조제를 사용하여 복합접종시 총 특수역단백질의 평균역가가 가장 높은 것으로 나타나 상기 세가지 항원을 복합접종시 상호 항원-항체 반응에 부작용이 나타나지 않는 것으로 나타났다.As shown in FIG. 3, E. coli, rotavirus, and astrovirus were found to have the highest average titers of total special reverse protein when inoculated with Freund's emulsifying adjuvant. No side effects were shown.
또한 로타바이러스를 프로인트 유화보조제로 유화시켜 접종시 총 특수역단백질의 평균역가 A와 로타바이러스를 ISA25 유화보조제로 유화시켜 접종시 총 특수역단백질의 평균역가 E는 모두 높은 역가를 나타냈으나, 프로인트 유화보조제를 사용한 A가 더 높은 총 특수역단백질의 평균역가를 나타냈다.Also, the average titer A of total special protein was emulsified by Freund's emulsification adjuvant and emulsified rotavirus with ISA25 emulsification aid. A using Freund's emulsifiers showed higher average titers of total special protein.
또한, 도 1은 도 4에서 보는바와 같이 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 프로인트 유화보조제를 사용하여 복합접종시 유아설사의 원인균인 로타바이러스의 특수면역단백질 역가변화 및 평균역가가 가장 높게 나타났으며, 평균적으로 프로인트 유화보조제를 사용하여 접종한 시험군의 특수면역단백질 평균역가가 ISA25 유화보조제를 사용하여 접종한 시험군의 특수면역단백질 평균역가가보다 높게 나타났다.In addition, as shown in Figure 4, E. coli, rotavirus and astrovirus using a Freund emulsification adjuvant showed the highest changes in the special immune protein titers and mean titers of rotavirus, which is the causative agent of infant diarrhea On average, the mean titer of special immune protein in test group inoculated with Freund's emulsion adjuvant was higher than that in test group inoculated with ISA25 emulsification adjuvant.
또한, 특수면역단백질의 함량 측정도 샌드위치 엘라이저(ELISA)방법에 의해 수행되었다. 대장균의 O.D. 값이 660nm에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였다. 상기 희석된 균체를 마이크로플레이트에 코팅하고 16시간 방치하였다. 이 마이크로 플레이트를 세척한 후 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시킨 다음 세척하여, 1/10,000으로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로는 2N-황산(2N-H2SO4)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도2, 도 5, 도 6에 도시하였다.In addition, the measurement of the content of the special immune protein was also performed by the sandwich ELISA (ELISA) method. The OD value of E. coli was diluted with buffer so as to be 0.05 at 660 nm. The diluted cells were coated on a microplate and left for 16 hours. After washing the microplate, the filtered water-soluble protein is added, reacted, and washed, and rabbit anti-cheek IgG Ab-HRP diluted to 1 / 10,000 is added. TMB was used as a substrate for HRP, and absorbance was measured at 450 nm using 2N-sulfuric acid (2N-H 2 SO 4 ) as a reaction stopper. This result is shown in FIG. 2, FIG. 5, FIG.
상기 도 5에서 보는 바와 같이, 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 프로인트 유화보조제를 사용하여 복합접종시 상기 세가지 항원들을 ISA25 유화보조제를 사용하여 복합접종시보다 총 특수면역단백질 평균역가가 높게 나타났다. 또한, 대장균을 프로인트 유화보조제를 사용하여 단독접종시 상기 대장균을 ISA25 유화보조제를 사용하여 단독접종시보다 총 특수면역단백질 평균역가가 높게 나타났다.As shown in FIG. 5, when the E. coli and the rotavirus and the Astrovirus were combined with Freund's emulsification aid, the three antigens were shown to have a higher total specific immune protein mean titer than the combination with the ISA25 emulsification aid. In addition, when E. coli was inoculated with Freund's emulsification aid, E. coli was shown to have a higher total specific immune protein mean titer than when inoculated with ISA25 emulsification aid.
도 2는 도 6에서 보는 바와같이 대장균과 로타바이러스와 아스트로바이러스를 프로인트 유화보조제로 유화시켜 복합접종한 시험군은 상기 세가지 항원들을 ISA25 유화보조제로 유화시켜 복합접종한 시험군보다 높은 특수면역단백질 역가변화 및 평균역가를 나타냈다.FIG. 2 is a test group emulsified with E. coli, rotavirus, and astrovirus emulsified with Freund's emulsifying adjuvant as shown in FIG. 6, which is higher than the test group emulsified with the three antigens emulsified with ISA25 emulsifying adjuvant. Titer changes and mean titers were shown.
6. 세 가지 항체를 함유한 조제분유 제조6. Preparation of Formula Powder Containing Three Antibodies
가) 수용성 단백질 추출A) Water Soluble Protein Extraction
수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다. 상기의 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 2kg을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0) 2ℓ를 첨가하여 교반하고 24시간 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량(72ℓ)을 섞은 후 24시간 방치하여 둔 다음, 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration Ststem: 시간당 50ℓ 농축, Membrane type: Hollow Fiber, 가동압력: 2-3㎏/㎠)하여 동결건조시키며 분리하였다.Water-soluble protein extraction was carried out in the following manner. Eggs which share the anti-E. Coli special immune protein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY) and anti-astrovirus special immune protein (IgY) produced by the above method, and eggs produced by the above method 2kg of egg yolk from which a yolk film was removed from a predetermined container was added, and 2 liters of the same amount of alkaline ionized water (pH 9.0) was added thereto, stirred and left to stand for 24 hours, followed by mixing 18 times the amount of alkaline water (pH 10.0) (72 liters). After standing for 24 hours, the fat layer suspended in the upper layer was removed, and the supernatant liquid which had not precipitated was concentrated-filtered (Ultra Filteration Ststem: 50 ℓ concentrated per hour, Membrane type: Hollow Fiber, operating pressure: 2-3㎏ / ㎠) and lyophilized. And separated.
나) 복합특수면역단백질을 함유한 조제분유 제조B) preparation of infant formula containing complex special immune protein;
앞 항에서와 같이 대장균항원과 로타바이러스항원과 아스트로바이러스항원으로 혼합시킨 복합항원을 접종 후 생산된 계란에서 추출한 수용성단백질(crude IgY) 분말을 첨가하여서 조제분유를 제조하였으며, 조제분유의 제조 배합비는 아래 제시된 바와 같다.Formula milk powder was prepared by adding the water-soluble protein (crude IgY) powder extracted from the eggs produced after inoculation with the mixed antigen mixed with E. coli, rotavirus and astrovirus antigens as in the previous section. As shown below.
실시예 2Example 2
본 실시예는 두 가지 항체를 독립적으로 생산 후 항체 혼합 및 그 생산방법 에 의하여 생산된 계란에서 추출한 특수면역단백질을 이용한 조제분유에 관한 것이다.This embodiment relates to formula prepared using special immune protein extracted from the eggs produced by the antibody mixture and the production method after the two antibodies are produced independently.
1. 대장균 (Enteropathogenic E.coli) 분리동정 및 항원제조 1.Isolation Identification and Antigen Production of Enteropathogenic E. coli
본 발명에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다.E. coli used in the present invention was isolated from humans.
대장균의 분리,동정, 및 항원제조는 실시예1에 제시된 바와 동일하다.Isolation, identification, and antigen production of E. coli are the same as those shown in Example 1.
2. 로타바이러스( Rotarvirus) 항원제조2. Preparation of Rotarvirus Antigen
로타바이러스의 항원제조도 실시예1에 제시된 바와 동일하다.Antigen preparation of rotavirus is also the same as that shown in Example 1.
3. 아스트로바이러스(Astrovirus) 항원제조3. Production of Astrovirus Antigen
아스트로바이러스의 항원제조도 실시예1에 제시된 바와 동일하다Antigen production of astroviruses is also the same as that shown in Example 1.
4. 세 가지 항원을 독립적으로 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)4. Inoculate three antigens independently into chicks and boost the laying hens
가) 중추 12주령의 병아리에 접종하기 위한 개별균유화액의 구성비율은 다음과 같이 하였다. 대장균항원: 유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 로타바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 아스트로바이러스항원:유화보조제의 비율을 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖과 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 수산화알루미늄 0.25㎖를 유화시켜 개별적으로 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107
TCID50, 아스 트로바이러스 107TCID50 포함된 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하고, 2회 째부터는 유화보조제(ISA25)를 사용하여 상기 개별균유화액과 동일비율로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여 총3회 접종하는 방법으로, 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 3회 접종하였다.A) The composition ratio of individual emulsification solution for inoculation into 12-week-old chicks was as follows. The ratio of E. coli antigen: emulsifying adjuvant is 1: 1, the ratio of rotavirus antigen: emulsifying adjuvant is 1: 1, and the ratio of astroviral antigen: emulsifying adjuvant is 1: 1, 2.0 × 10 8 / ml 0.25 ml of Escherichia coli antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide are emulsified, 0.25 ml of 2.0 × 10 7 TCID 50 rotavirus inactivated antigen and 0.25 ml of aluminum hydroxide are emulsified, and 0.25 ml of 2.0 × 10 7 TCID 50 astrovirus inactivated antigen. And emulsified 0.25 ml of aluminum hydroxide, individually, the number of
나) 중추 12주령의 병아리에 대장균항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 로타바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 아스트로바이러스항원:유화보조제의 비율을 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.25㎖과 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 로타바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시키고, 2.0×107TCID50 아스트로바이러스 불활화항원 0.25㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.25㎖를 유화시켜 개별적으로 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50, 아스트로바이러스 10
7TCID50 포함된 상기 대장균항원, 로타바이러스항원, 아스트로바이러스항원에 대한 개별균유화액 0.5㎖를 서로 다른 병아리에 1회 접종하고, 2회 째부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 상기 개별균유화액과 동일비율로 유화시킨 개별 균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 다시 0.5㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하여 총 3회 접종하는 방법으로 상기 대장균항원과 로타바이러스항원과 아스트로바이러스항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 3회 접종하였다.B) The ratio of E. coli antigen: emulsification adjuvant shall be 1: 1, the ratio of rotavirus antigen: emulsification adjuvant shall be 1: 1, and the ratio of astroviral antigen: emulsification adjuvant shall be 1: 1 0.25 ml of 2.0 × 10 8 / ml E. coli antigens and 0.25 ml of adjuvant complete Freund's were emulsified, 0.25 ml of 2.0 × 10 7 TCID 50 rotavirus inactivated antigen and adjuvant complete Freund's) emulsified 0.25 ml, emulsified 2.0 × 10 7 TCID 50 astrovirus inactivated antigen 0.25 ml and adjuvant complete Freund's 0.25 ml individually to give
상기 가), 나)의 결과 상기 개별균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY), 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY), 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 독립적으로 함유한 계란을 생산하였다.As a result of the a) and b), the eggs produced from the laying hens inoculated with the individual bacterial emulsions had anti-E. Coli special immune protein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY), anti-astrovirus special immune protein ( Eggs containing IgY) independently were produced.
5. 신선난황분리, 난황분말추출, 면역 단백질 분리 및 역가 측정5. Fresh egg yolk separation, egg yolk powder extraction, immune protein isolation and titer measurement
신선난황분리, 난황분말추출, 시험분석에 사용한 면역 단백질의 분리 및 측정법은 실시예1과 같다.Fresh egg separation, egg yolk powder extraction, separation and measurement of the immune protein used in the test analysis is the same as in Example 1.
6. 수용성 특수면역단백질 추출6. Water Soluble Special Immune Protein
수용성 특수면역단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다. 상기의 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)과 항-아스트로바이러스 특수면역단백질(IgY)을 함유하는 각각의 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 2kg을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9.0) 2ℓ를 첨가하여 교반하고 24시간 정치한 후, 다시 알카리이온수(pH 10.0)를 18배 분량(72ℓ)을 섞은 후 24시간 방치하여 둔 다음, 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축여과(Ultra Filteration Ststem: 시간당 50ℓ 농축, Membrane type: Hollow Fiber, 가동압력: 2-3kg/㎠)하여 동결건조시키며 분리하였다.Water-soluble special immunoprotein extraction was carried out in the following manner. Each egg containing the anti-E. Coli special immune protein (IgY), anti-rotavirus special immune protein (IgY) and anti-astrovirus special immune protein (IgY) produced by the above method is placed in a container with an egg yolk membrane. 2kg of the removed yolk was added, and 2 liters of the same amount of alkaline ionized water (pH 9.0) was added thereto, stirred and left to stand for 24 hours, and then mixed with 18 times the amount of alkaline water (pH 10.0) (72 liters) and left for 24 hours. The fat layer suspended in the upper layer was removed, and the supernatant that had not precipitated was concentrated by filtration (Ultra Filteration Ststem: 50 l per hour, Membrane type: Hollow Fiber, operating pressure: 2-3kg / ㎠), and lyophilized.
7. 혼합 면역단백질을 함유한 조제분유 제조7. Preparation of Formula Powder Containing Mixed Immune Protein
앞 항에서와 같이 개별적으로 대장균항원과 로타바이러스(Rotarvirus)항원과 아스트로바이러스항원을 접종 후, 생산된 계란에서 추출한 수용성특수단백질(crude IgY) 분말이나 난황분말을 각각 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1로 혼합한 혼합조성물을 식품첨가제로 사용하였으며, 조제분유의 제조 배합비는 아래 제시된바와 같다.As shown in the previous section, after inoculating Escherichia coli, Rotarvirus and Astrovirus antigens, water-soluble powder IgY powder or egg yolk powder extracted from the produced eggs is 1: 1: 1, 2: A mixed composition of 1: 1, 3: 1: 1, 4: 1: 1, 5: 1: 1 was used as a food additive, and the preparation ratio of the formula is as shown below.
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.The present invention is not limited to the technical spirit of the specific embodiments, tables or drawings described above, and those skilled in the art without departing from the spirit of the invention claimed in the claims Anyone may make various modifications, as well as such changes fall within the scope of the claims.
상기에서 상세히 설명하였듯이, 유아설사증 발병원인체에 대한 복합특수면역단백질 또는 유아설사증 발병원인체에 대한 개별적인 특수면역단백질을 함유한 혼 합조성물을 첨가한 조제분유는 유아설사증 발병원인체와 유아설사증 발병원인체의 항체인 특수면역단백질 간의 항원-항체 반응으로 직접적으로 설사증을 예방 및 치료할 수 있으며, 상기 설사증을 유발하는 장염도 예방 및 치료할 수 있다.As described in detail above, the formula formula containing the mixed special immune protein for the onset of infantile diarrhea or the individual special immune protein for the onset of infantile diarrhea may be the antibody of the onset of the onset of infantile diarrhea and the onset of infantile diarrhea. Antibody-antibody reactions between phosphorus special immune proteins can directly prevent and treat diarrhea, and can also prevent and treat enteritis causing diarrhea.
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