KR100508695B1 - 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 (insulin)의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물, 유화제, 유기용매, 인슐린 및 산성 수용액으로 이루어지는 인슐린의 경구투여용 액상 및 분말제형을 제조함으로써, 종래에 비해 인슐린의 제형 내 봉입율 및 생체효율성이 우수하며, 경구투여가 가능하여 편리성이 향상된 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법{Formulation for oral delivery of insulin and preparation method thereof}
본 발명은 인슐린 (insulin)의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물, 유화제, 유기용매, 인슐린 및 산성 수용액으로 이루어지는 인슐린의 경구투여용 액상 및 분말제형을 제조함으로써, 종래에 비해 인슐린의 제형 내 봉입율 및 생체효율성이 우수하며, 경구투여가 가능하여 편리성이 향상된 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것이다.
지질을 매개체로 한 약물전달체계는 원료 물질이 생체 적합성이므로 널리 활용되고 있다.
일반적으로, 지질을 매개체로 한 약물 제형은 에멀젼이나 리포좀이 있다. 이 중 에멀젼 제형은 유화제를 이용하여 지방 유제 기제를 물에 분산시킨 제형으로서, 특히 수중유화형 (oil/water형) 에멀젼은 난용성 약물을 지방 유제 기제에 용해시켜 가용화시킬 수 있다. 또한, 리포좀 제형은 지질 이중막으로 이루어진 구형의 지질 소낭 (vesicle)들로 이루어져 있으며, 난용성 약물은 지질 이중막 소낭 안에 존재하고 이들 지질 이중막 소낭이 물에 용해되어 난용성 약물의 가용화가 이루어진다.
한편, 지질을 이용한 제형에는 상기 두 가지 대표적인 제형 이외에도 1990년대 초 스웨덴 과학자들에 의해 개발된 큐보좀TM (CubosomeTM)이란 제형이 있다. 큐보좀TM 제형은 모노글리세라이드 (monoglyceride)에 물을 가하면 자발적으로 형성되는 안정한 입방상 (cubic phase) 구조체를 유화제를 이용하여 물에 분산시킨 것이다 [미국 특허 제5,531,925호].
큐보좀TM 입자의 내부는 입방상을 이루는 3차원적 망상 구조 (network structure)로 되어 있는데, 유상과 수상이 각각 연속적인 3차원적 통로로 구성되어 있고 유상과 수상 통로의 경계면에 비교적 넓은 면적의 중간층 (interface)이 존재한다.
따라서 기존의 에멀젼 제형이나 리포좀 제형이 각각 지용성 또는 수용성 약물의 가용화만 가능했던데 반해, 큐보좀TM 제형은 지용성, 수용성 약물 뿐만 아니라 양쪽성 약물까지 포함하여 보다 다양한 종류의 약물을 봉입하여 가용화시킬 수 있는 잇점이 있다.
큐보좀TM은 먼저 모노글리세라이드에 물과 유화제를 가하여 입방상의 점성이 강한 액상을 형성시키고 이것을 물에 분산시켜 제조하는데, 물에 분산시 큐보좀TM은 수 ㎛ 정도의 평균 입자 크기를 가지며 유화제의 비율이 높을 경우에는 1 ㎛ 이하의 입자 크기를 가질 수도 있다. 그러나, 약물의 가용화를 위해서는 좀더 미세한 큐보좀 입자를 얻어야 하므로 초음파 분쇄 (sonication), 미세유동화 (microfluidization), 균질화 (homogenization) 등의 방법을 통해 입방상의 점성이 강한 액상을 미세하게 분산시킨다.
상기와 같이, 기계적 도움을 받아 미세입자를 만들면 그 과정에 수반되는 고에너지 및 고온으로 인해 제형의 구성 성분이나 봉입된 물질이 물리화학적으로 불안정해지며, 초음파 분쇄시 공기와 격렬히 섞이게 되므로 구성 성분의 가수분해, 산화 등이 일어나는 문제점이 있다. 또한, 초음파 분쇄 등에 의해 균일한 작은 입자를 가진 분산액이 제조되어도 약 한달 정도의 시간이 경과하면 분산계가 불안정해지면서 입자의 응집 (aggregation)에 의해 상분리가 일어나는 문제점이 있다.
이와 같이, 큐보좀 제형은 종래 제형에 비해 향상된 특성을 가지면서도 제조시 미세입자로 만들기가 어려우며, 또한 만들어진 미세 입자는 안정성이 낮아 보관시 문제점이 있으므로 실제 약물을 가용화하는 제형으로는 제품화되지 못하고 있는 실정이다.
한편, 생리활성 물질인 펩타이드와 단백질은 작은 분자량의 화합물로 이루어진 약물에 비해 특이적인 약리활성 기능 (specific function)을 가진 치료약물 (therapeutics)이다.
그러나, 단백질은 위장관 내에서 단백질 분해효소 (protease)에 의해 분해되어 아미노산 형태로 흡수되기 때문에 단백질의 약리적 효과를 기대할 수 없다. 또한, 약리활성을 갖는 단백질을 주사제로 이용하는 경우에도 제거율 (clearance rate)이 높아서 자주 주사를 해야하는 등 약물의 투여방법에 많은 문제가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다양한 약물 전달 체계 (drug delivery system)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이 중 시클로스포린 (cyclosporin)은 펩타이드 약물 중 유일하게 경구용 제제의 개발에 성공한 경우이다. 시클로스포린이 시판되는 제형은 크레모포어 (Cremophor) 에멀젼 (emulsion)의 예비 농축제 (pre-concentrate) 형태로서 물에 분산시켜 자발적으로 형성된 마이크로에멀젼 (microemulsion)이다 (미국 특허 제5,438,072호). 그러나, 시클로스포린을 제외하고는 현재 경구용으로 판매되고 있는 펩타이드 또는 단백질 제제는 없는 실정이다.
이는 펩타이드 또는 단백질의 봉입이 어렵고, 봉입이 된다고 하여도 봉입과정 또는 저장 중에 변성 (denaturation)이 쉽게 일어나 제제로서의 약리학적 효과가 감소되기 때문이다.
인슐린 (insulin)은 인슐린 당뇨병 환자에게는 일생동안 투여해야 하는 약물로서, 현재까지 주로 피하주사에 의해 환자에게 투여되고 있다. 만약, 인슐린을 경구로 투여할 수 있다면 당뇨병의 치료에 획기적인 혁명적 진보를 가져올 것이다. 이에 따라 많은 세계적 제약회사와 연구팀들이 경구용 인슐린 제형을 개발하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다. 그러나, 위장관 내에 인슐린 흡수의 한계점 때문에 경구용 인슐린 제형의 개발은 아직 초기 단계에 머무르고 있는 실정이다. 또한, 인슐린과 같은 치료적 펩타이드는 장내의 단백질 분해효소 (protease)에 의해 빠르게 분해되어 약물의 흡수 및 약리적 활성이 저하되는 문제가 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 방법으로 인슐린을 보호하는 방법이 개발되었다. 예컨대, 인슐린을 리포좀 (liposome) 또는 고분자 마이크로스피어 (polymeric microsphere)에 봉입하여 투여하거나, 또는 단백질 분해효소 저해제 (protease inhibitor)를 함께 투여하여 인슐린의 분해를 억제하는 방법 등이 이용되고 있다.
그러나, 인슐린의 봉입에 사용되는 리포좀 등은 약물의 봉입효율이 낮고, 봉입과정 중 인슐린이 분해되는 등의 문제점으로 인하여 경구투여 시 그 효과가 미미한 단점이 있다.
또한, 단백질 분해효소 저해제를 병용 투여하는 경우에는 타 단백질의 분해도 억제되므로 이로 인한 부작용이 너무 심하기 때문에 임상적용이 현실적으로 어렵다.
이 외에도, 인슐린의 흡수를 높이기 위하여 장내 흡수 촉진제 (absorption enhancer)를 사용하는 방법이 있으나, 이때 사용되는 흡수 촉진제에 의한 부작용 역시 심각하다. 또한, 인슐린과 같은 단백질 약물의 장내 투과를 돕기 위하여 단백질의 접힘 (folding) 상태를 용해된 구체 (molten globule, MG)로 변화시켜 장내 투과성을 높이고자 한 노력도 있었다.
이와 같은 다양한 시도에도 불구하고 경구투여용 인슐린 제형은 현재까지 연구 초기 단계에 머물고 있으며, 실용화되기까지는 아직 요원한 실정이다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들이 발명한 대한민국 특허출원 제2000-12465호에서는 모노글리세라이드 (monoglyceride), 유화제 (emulsifier) 및 유기용매로 구성된 약물의 가용화용 조성물을 개발한 바 있다.
상기 가용화용 조성물은 여러 가지 물질, 특히 난용성 물질 및 양쪽성 물질 모두를 효과적으로 가용화시키는 것을 특징으로 하는데, 이 조성물은 물에 혼합한 후 흔들어 주거나 볼텍스 (vortex)하면 평균 입자의 크기가 500 nm 이하인 입자의 분산액을 쉽게 형성한다. 상기 가용화용 조성물은 약물의 분자량 및 극성에 따라 정도의 차이가 있지만 대부분의 약물을 높은 효율로 봉입한다. 하지만, 인슐린의 경우는 난용성 약물과 달리 상기 가용화용 조성물에 용해되지 않아 제제화에 어려움이 있으며, 인슐린은 모노글리세라이드 또는 유기용매와 혼합되지 않으므로 상기 가용화용 조성물과 혼합할 경우 석출되어 침전물을 형성하는 문제점이 제기되어 왔다.
이와 같이, 종래의 큐보좀TM 입자의 분산계는 안정성에서 문제가 있으며, 대한민국 특허출원 제2000-12465호의 발명은 난용성 물질은 쉽게 용해시키는 반면, 인슐린의 경우에는 용해되지 않고 입자형태로 응집물이 부유되므로 단일상을 이루지 못하는 문제점을 지니고 있어 인슐린을 효과적으로 제형에 봉입시키기 위한 제형의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명은 종래의 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 연구 노력한 결과, 모노글리세라이드계 화합물, 유화제, 유기용매, 인슐린 및 산성 수용액을 이용하여 인슐린을 봉입한 경구투여용 제형을 제조함으로써, 본 발명에 따른 인슐린 함유 경구투여용 제형을 물과 혼합한 후 가볍게 흔들어 주는 최소한의 기계적 도움으로도 쉽게 분산되어 500 ㎚ 이하의 입자 분산액을 형성할 뿐 아니라, 이와 같은 분산과정 중에서도 인슐린의 봉입율이 매우 우수한 인슐린의 경구투여용 제형 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 유효성분으로서 인슐린 (insulin) 0.01 ∼ 20 중량%과 1 종 이상의 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1 종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 산성 수용액 0.01 ∼ 10 중량%, 유기용매 1 ∼ 90 중량% 및 첨가제 0 ∼ 5 중량%로 이루어지는 인슐린 경구투여용 액상제형을 그 특징으로 한다.
본 발명은 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계; 상기 1단계에 산성 수용액을 소량 가하여 pH를 산성으로 조정하는 2단계; 상기 2단계에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가한 후 교반하여 완전히 용해시키는 3단계; 상기 3단계에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 구성되는 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계; 산성 수용액을 준비하여 여기에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가하여 용해시키는 2단계; 상기 1단계의 용액과 2단계의 용액을 혼합시키는 3단계; 상기 3단계의 혼합용액에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계;로 구성되는 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 상기 인슐린 경구투여용 액상제형을 0 ∼ 30% (w/v)의 동결건조 보호제와 함께 동결건조한 인슐린 경구투여용 분말제형을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 인슐린을 포함하는 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조하는 1단계; 및 상기 1단계의 분산액에 선택적으로 동결건조 보호제를 첨가하여 동결건조시키는 2단계;로 구성되는 인슐린 경구투여용 분말제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형은 유효성분으로서 인슐린 (insulin) 0.01 ∼ 20 중량%과 1 종 이상의 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1 종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 산성 수용액 0.01 ∼ 10 중량%, 유기용매 1 ∼ 90 중량% 및 첨가제 0 ∼ 5 중량%로 이루어진다.
유효성분으로 사용되는 인슐린으로는 소 췌장 인슐린 (bovine pancreatic insulin), 인간 (human), 인간 재조합 (human recombinant), 돼지 췌장 (porcine pancreatic), arg-인슐린 (arg-insulin), 인슐린-바이오틴 (insulin-biotin), 인슐린-FITC (insulin-FITC), 리스프로 (LysPro, 미국 Eli Lilly), 폴리에틸렌 글리콜-인슐린 (polyethylene glycol-insulin, PEG-insulin) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 20 중량%가 바람직하다.
상기 모노글리세라이드계 화합물은 포화 또는 불포화된 C12 ∼ C22인 모노글리세라이드계 화합물 중에서 1 종 이상 선택하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 9 ∼ 90 중량%가 바람직하다. 모노글리세라이드계 화합물로는 모노올레인 (Monoolein), 모노팔미톨레인 (Monopalmitolein), 모노미리스톨레인 (Monomyristolein), 모노일레이딘 (Monoelaidin) 및 모노이루이신 (Monoerucin)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 모노올레인이 좋다.
유화제로는 인지질, 스핑고지질 (sphingolipid), 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 담즙산 (bile acid) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 90 중량%가 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 인지질로는 포스파티딜콜린 (Phosphatidyl Choline) 유도체, 포스파티딜에탄올아민 (Phosphatidyl ethanolamine) 유도체, 포스파티딜세린 (Phosphatidyl serine) 유도체, 친수성 고분자가 결합된 지질 (polymeric lipid)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 스핑고지질로는 세라마이드계 (ceramides), 세레브로사이드계 (cerebroside), 스핑고마이엘린계 (sphingomyelins)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 비이온성 계면 활성제로는 폴록사머 (Poloxamer; Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스테르 (Sorbitan esters; Span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 (polyoxyethylene sorbitans; Tween), 폴리옥시에틸렌 에테르 (polyoxy ehtylene ethers; Brij)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 음이온성 계면 활성제로는 포스파티딜세린 유도체, 포스파티딘산 (Phosphatidic acid) 유도체, 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 양이온성 계면 활성제로는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판 (1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드 (dimethyldioctadecylammonium chloride), N-[1-(1,2-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (N-[1-
(1,2-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레일-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-[(N',
N'-디메틸아미노)에탄]카바모일]콜레스테롤 (3β-[N-[(N',N'-dimethylamino
)ethan)carbamoyl]chloresterol)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 담즙산으로는 콜린산 (cholic acid)과 그의 염 및 유도체, 데옥시콜린산 (Deoxycholic acid)과 그의 염 및 유도체, 리토콜린산 (Lithocholic acid)과 그의 염 및 유도체, 체노콜린산 (Chenocholic acid)과 그의 염 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
산성 수용액으로는 염산, 인산, 탄산 수용액 또는 이들의 혼합용액 을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 10 중량%가 바람직하다. 만일, 산성 수용액을 사용하지 않고 중성 또는 염기성 수용액을 사용하면 인슐린이 응집(aggregate)하여 제형에 용해되지 않는 문제가 발생한다.
또한 유기용매로는 알코올, 에틸렌글리콜 (ethylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 (Polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide) 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 1 ∼ 90 중량%가 바람직하다.
또한, 상기 액상제형에는 지방산, 지방산의 에스테르류, 지방산의 알코올류 등과 같은 통상적으로 사용 가능한 첨가제를 0 ∼ 5 중량% 함유시킬 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법은
1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;
2) 상기 1단계에 산성 수용액을 소량 가하여 pH를 산성으로 조정하는 2단계;
3) 상기 2단계에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가한 후 교반하여 완전히 용해시키는 3단계;
4) 상기 3단계에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및
5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 이루어진다.
또한, 본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형은 상기 방법의 일부공정순서만 달리하여서도 제조할 수 있는 바, 예컨대 상기 방법의 2단계와 3단계에서 인슐린 분말의 용해와 첨가순서만 달리하여 제조할 수 있는 바, 그 구체적인 방법으로는
1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;
2) 산성 수용액을 준비하여 여기에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가하여 용해시키는 2단계;
3) 상기 1단계의 용액과 2단계의 용액을 혼합시키는 3단계;
4) 상기 3단계의 혼합용액에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및
5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 이루어진다.
이와같이, 본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법은 상기 각 제조 단계의 순서와 방법을 약간씩 변형하여도 동일한 목적물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 액상제형을 0 ∼ 30% (w/v)의 동결건조 보호제와 함께 동결건조하여 제조되는 인슐린 경구투여용 분말제형을 제공한다.
구체적으로 상기 분말제형의 제조방법은
1) 상기 인슐린을 포함하는 액상제형을 과량의 물에 분산시키는 1 단계; 및
2) 상기 단계 1의 분산액에 선택적으로 동결건조 보호제를 첨가하여 동결건조시키는 2 단계;로 이루어진다.
동결건조시 제형 내 성분의 변성을 방지하기 위하여 동결건조 보호제 (cryoprotectant)를 사용할 수도 있으며, 상기 액상제형에 대해 0 ∼ 30% (w/v) 첨가하는 것이 바람직하다. 동결건조 보호제로는 만니톨 (mannitol) 또는 트리할로오즈 (trehalose) 등의 당류, 아르기닌 (arginine) 등의 아미노산류, 알부민 등의 단백질류를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 상기 액상 및 분말제형은 손으로 흔들어 주는 등의 최소한의 기계적 도움에 의해 쉽게 물에 분산시킬 수 있으며, 분산계를 형성하는 입자의 크기는 일반적으로 200 ㎚ 정도이며, 유화제나 약물의 성질에 따라 500 ㎚ 이하로 형성되어 종래에 비해 매우 작은 크기를 형성할 수 있다. 특히, 입자의 형성시 가혹한 기계적 힘을 가할 필요가 없으므로 입자의 구성 성분이나 약물이 변성되는 것을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 제형은 상온 이하에서 밀봉하여 장기간 동안 안정하게 보관할 수 있으며, 사용하기 전에 물을 첨가하여 분산액을 제조할 수 있으므로 제형의 특성이 변하지 않고 상분리 현상 또한 일어나지 않는다. 특히 장기 보관의 경우, 분말제형은 유기용매 및 수분과 접촉하지 않으므로 더욱 바람직하다.
이 외에도, 본 발명에 의한 제형은 상기의 간단한 제조공정 만으로도 50 ∼ 100% 정도의 인슐린 봉입율을 나타내므로 특히 약물 전달 체계에 유리하며, 본 발명에 의한 제형을 약물 전달 체계에 사용할 경우에는 경구투여, 구강내 투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내 투여, 피하주사, 근육주사, 경피 투여, 정맥주사 등이 가능하며, 경구투여가 가장 바람직하다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 1
1-1. 액상제형의 제조
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매에 플루로닉 F-127 20 ㎎을 용해시켰다. 필요에 따라 40℃ 이하로 가온하여 용해시켰다. 여기에 1 N 염산용액 8 ㎕를 가하여 pH를 3.0 ∼ 4.0으로 맞춘 후 인슐린 분말 8 ㎎ (1 ㎎ ≡28.3 U)을 가하고 교반하여 용해시켰다. 맑은 용액이 형성되면 모노올레인 100 ㎎을 가하여 완전히 용해시키고 산소를 포함하지 않은 질소기체 (oxygen-free nitrogen gas)를 이용하여 퍼징 (purging)하거나 감압하에서 에탄올을 완전히 증발시켜 액상제형을 제조하였다.
1-2. 액상제형의 특성 분석
① 인산염 완충용액 (PBS, Phosphate buffered saline, pH 7.4) 3 ㎖에 상기 액상제형 10 ㎕를 첨가하고 잘 흔들어 혼합하여 분산액을 제조한 후 입자 크기 및 분산도 (polydispersity)를 측정하였다. 본 발명에서 입자의 크기는 말버른 제타사이저 (Malvern Zetasizer)를 이용한 광자 분광법 (Photon Correlation spectroscopy; QELS법)을 이용하여 측정하였으며 동일한 시료를 3회 측정하여 평균값을 구하였고, 분산도 (polydispersity)는 입자 크기의 일반적인 분포도로 알려진 정상 로그 분포도의 로그-스케일에서의 분산 정도로 나타내었다 (Orr, Encyclopedia of emulsion technology, 1, 369-404, 1985). 하기의 모든 실시예에서도 입자 크기 및 분산도 측정에 상기 방법을 사용하였다.
그 결과, 상기 제형은 물에 잘 분산되었으며, 평균 입자도는 378.3 nm이고 분산도는 0.377이었다.
② 담즙산염 (bile salt)의 일종인 10-2 M 소듐 데옥시콜레이트 (Sodium deoxycholate) 수용액 3 ㎖에 상기 액상제형 10 ㎕를 첨가하고 잘 흔들어 혼합하여 분산액을 제조한 후 상기와 동일한 방법으로 평균 입자도와 분산도를 측정하였다.
그 결과, 상기 제형 역시 물에 매우 잘 분산되었으며, 평균 입자도는 365.1 nm이고 분산도는 0.431이었다.
③ 비교군으로 미국특허 제5,531,925호의 제조방법을 이용하여 인슐린을 포함하는 큐보좀TM (CubosomeTM) 용액을 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 1 ㎖ 용량의 주사기에 각각 1) 모노올레인 100 ㎎과 플루로닉 F-127 20 ㎎의 혼합물 및 2) PBS (pH 7.4) 120 ㎎에 인슐린 8 ㎎을 용해시킨 수용액을 넣고 세방향 스톱코크 (three-way stopcock)로 연결한 후 100회 이상 혼합하여 (by pushing back-and-forth) 점성이 매우 강한 큐빅상 (cubic phase)을 제조한 뒤 편광현미경 (polarized light microscopy)으로 큐빅상을 확인하였다. 이와 같이 제조된 인슐린을 포함한 큐빅상에 PBS (pH 7.4) 1 ㎖을 가하면서 초음파 분쇄 (sonication)하여 분산액인 큐보좀TM 용액을 제조한 후 상기와 동일한 방법으로 입자도를 측정하였다.
상기 분산액 100 ㎕를 PBS (pH 7.4) 3 ㎖에 희석하여 입자도를 측정한 결과, 평균 입자도는 148.5 nm이고 분산도는 0.178이었다. 비교군의 경우 초음파 분쇄를 하지 않은 경우에는 입자가 분산되지 않았고 볼텍스 (vortex)를 할 경우에는 수 mm 크기 이상의 입자가 관찰되었다
실시예 2. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 2
2-1. 액상제형의 제조
인슐린을 2 ㎎ 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
2-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균 입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우에는 평균 입자도가 259.3 ㎚이고 분산도는 0.174이었다. 또한, 10-2 M 소듐 데옥시콜레이트 수용액에 분산시켰을 경우에는 평균 입자도가 250.3 ㎚이고 분산도는 0.351이었다.
실시예 3. 인슐린을 첨가한 액상제형의 제조 3 (용매의 변화)
3-1. 액상제형의 제조
무수에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수에탄올 280 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
3-2. 액상제형의 특성 분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 물에 매우 잘 분산되었으며 그 평균입자도가 188.9 ㎚, 분산도는 0.393이었다.
실시예 4. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 4
4-1. 액상제형의 제조
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수 에탄올과 프로필렌글리콜을 각각 180 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
4-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도가 307.6 ㎚, 분산도는 0.093이었다.
실시예 5. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 5
5-1. 액상제형의 제조
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수 에탄올과 프로필렌글리콜을 각각 120 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
5-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도가 252.9 nm, 분산도는 0.135이었다.
실시예 6. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 6
6-1. 액상제형의 제조
프로필렌글리콜 280 ㎎ 대신에 PEG400 280 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
6-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 239.8 ㎚, 분산도는 0.223이었다.
실시예 7. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 7
7-1. 액상제형의 제조
프로필렌글리콜 180 ㎎ 대신에 PEG400 180 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
7-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 222.8 ㎚, 분산도는 0.278이었다.
실시예 8. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 8
8-1. 액상제형의 제조
프로필렌 글리콜 120 ㎎ 대신에 PEG400 120 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.
8-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 229.8 ㎚, 분산도는 0.278이었다.
실시예 9. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 9
9-1. 액상제형의 제조
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매에 플루로닉 F-127 20 ㎎을 용해시켰다. 필요에 따라 40℃ 이하로 가온하여 용해시켰다. 한편, 인슐린 분말 8 mg (1 mg≡28.3 U)을 1 N 염산용액을 가하여 pH를 3.0∼4.0으로 맞춘 PBS에 용해시켜 인슐린 용액 10 ㎕를 제조하였다. 상기 두 용액을 혼합한 맑은 용액에 모노올레인 100 ㎎을 가하여 완전히 용해시키고 산소를 포함하지 않은 질소기체 (oxygen-free nitrogen gas)를 이용하여 퍼징 (purging)하거나 감압하에서 에탄올을 완전히 증발시켜 액상제형을 제조하였다.
9-2. 액상제형의 특성분석
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 268.6 ㎚, 분산도는 0.216이었다.
실시예 10. 흡수 촉진인자를 포함하는 인슐린 함유 액상제형의 제조
10-1. 액상제형의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 액상제형에 흡수 촉진인자로서 올레산 (oleic acid)을 2 ㎎ 첨가하여 액상제형을 제조하였다.
10-2. 액상제형의 특성분석
상기 액상제형 10 ㎕를 PBS (pH 7.4) 3 ㎖에 분산시켜 제조한 분산액의 입자도를 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정한 결과, 평균 입자도는 276.1 nm이고 분산도는 0.334이었다.
실시예 11. 인슐린을 포함하는 분말제형의 제조
상기 실시예 1와 동일한 방법으로 제조된 인슐린을 포함하는 액상제형 0.1 ㎖을 5% 트리할로오즈 수용액 1 ㎖에 첨가하고 손으로 흔들어 분산시킨 후 동결건조하여 분말제형을 제조하였다. 상기 분말제형 약 3 ㎎을 각각 3 ㎖의 증류수 또는 0.01 M 소듐 데옥시콜레이트 (sodium deoxicholate, NaDC) 수용액에 재분산시켜 분산액을 만든 후 실시예 1과 동일한 방법으로 입자크기 및 분산도를 측정하였다.
그 결과, 상기 제형은 물에 잘 분산되었으며, 물에 분산시킬 때 평균 입자도는 358.3 nm이고 분산도는 0.326이며 0.01M NaDC 용액에 분산시키면 평균 입자도는 218.2 nm이고 분산도는 0.182이었다.
상기 실시예 1 ∼ 11에서 보면, 본 발명에 따른 인슐린을 포함하는 액상 및 분말 제형의 입자크기가 380 nm이하로 매우 작으므로, 본 발명에 따른 액상 및 분말 제형의 분산성이 우수함을 확인하였다.
시험예 1. 인슐린 봉입효율 측정
① 상기 실시예 1에서 제조한 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 제조된 분산액에 다시 PBS (pH 7.4)를 첨가하여 1/20로 희석시킨 후 상기 희석액 2 ㎖을 센트리콘 (Centricon, Millipore, MWCO 100,000)에 넣고 상대원심력 1000 g에서 30분간 원심분리하였다. 상기에서 분리된 맑은 여과액 내의 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA 방법)을 사용하여 측정함으로써 입자에 봉입된 인슐린의 양을 환산하였다. 비교군으로 상기 실시예 1의 ③에서 제조된 큐보좀TM 용액의 입자 내 인슐린 봉입율을 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 큐보좀TM 용액의 입자 내 인슐린 봉입율은 10% 이내에 그쳐 90% 이상의 인슐린이 입자 내에 봉입되지 못한 채 용액에 용해되어 있음을 확인한 반면, 본 발명의 분산액의 입자 내 인슐린 봉입효율은 87.01%로 나타나 인슐린 봉입효율이 매우 우수하였다.
② 상기 실시예 2에서 제조한 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 제조된 분산액을 구멍 크기 (pore size)가 0.45 ㎛인 주사기 필터 (syringe filter)로 여과한 후 이를 다시 구멍 크기가 0.2 ㎛인 주사기 필터로 여과하였다. 상기 여액 내의 유리 인슐린 (free insulin)을 겔 통과 크로마토그래피 (Gel Permeation Chromatography, column : Ultrahydrogel 1000, Waters) 방법으로 측정하였다. 비교군으로 인슐린을 포함하지 않는 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 후 동일한 방법으로 얻은 여액을 사용하여 분산액 입자의 피크 (peak)를 확인하였다.
그 결과, 상기 실시예 2에서 제조된 액상제형으로부터 얻은 여액에서는 유리 인슐린의 피크가 검출되지 않았는데, 이러한 결과는 본 발명의 액상제형의 입자 내 인슐린 봉입효율이 100.0%임을 나타내는 것이다.
③ 상기 실시예 10에서 제조된 올레산을 포함한 인슐린 함유 액상제제 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 볼텍스하여 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 형성된 분산액에 PBS (pH 7.4)를 가해 1/20로 희석한 후 상기 희석액 2 ㎖을 센트리콘 (Centricon , Millipore, MWCO 100,000)에 넣고 상대원심력 1000 g에서 30분간 원심분리하였다. 상기에서 분리된 맑은 여과액 내의 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA 방법)을 사용하여 측정함으로써 입자에 봉입된 인슐린의 양을 환산하였다.
그 결과, 본 발명의 올레산을 포함한 인슐린 함유 액상제제의 입자 내 인슐린 봉입효율은 50%이었다.
시험예 2. In vivo 경구투여 실험 1
상기 실시예 1에서 제조된 액상제형으로 동물실험을 수행하였다.
2-1. 액상제형 내의 인슐린의 생리활성 보존여부 실험
인슐린을 포함한 액상제형 50 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.0 ㎖에 분산시켜 인슐린 농도 28.3 U/㎖의 분산액을 제조하였다. 상기 분산액의 평균 입자도는 345.8 nm이고 분산도는 0.341이었다. 인슐린 투여전의 정상 휘스터계 수컷 랫트 (Wistar rats, male, 6∼7주령)를 4시간 동안 절식시킨 후 꼬리 정맥 (tail vein)에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 이 값을 초기값으로 사용하였다. 측정직후 인슐린으로 3 U/Kg에 해당하는 만큼의 분산액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 본 발명의 인슐린을 포함하지 않은 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 분산액과 인슐린을 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 용액을 비교군으로 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, PBS에 용해된 주사용 인슐린 용액과 비교한 결과 본 발명의 액상제형에 포함된 인슐린의 생리활성이 보존되어 있음을 관찰하였으므로, 본발명의 제형의 분산액을 하기의 동물실험에 사용하였다.
2-2. 당뇨 유도
6주령의 휘스터계 수컷 랫트를 8∼10시간 동안 절식시킨 후 스트렙토조토신 (streptozotocin)과 알록산 모노하이드레이트 (alloxan monohydrate)가 용해된 일반 생리 식염수 (normal saline solution) 100 ㎎/㎏을 복강 내로 이틀 간격으로 3회 반복 주사하였다. 상기와 같이 처리된 랫트로부터 일주일 후 혈액을 채혈하여 혈당치를 측정하였고, 이들 중 비공복 상태에서의 혈당치가 400 ㎎/dL 이상으로 나타난 랫트를 당뇨가 유도된 것으로 간주하여 하기의 실험을 수행하였다.
2-3. 액상제형의 경구투여 실험
인슐린을 포함한 액상제형 50 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.0 ㎖에 분산시켜 인슐린 농도 28.3 U/㎖의 분산액을 제조하였다. 6∼7주령의 정상 랫트와 상기 시험예 2-2에서 선별된 당뇨가 유도된 랫트를 4시간 동안 절식시킨 후 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 상기 값을 약물투여 전 초기값으로 사용하였다. 상기 실험동물에 위 존데 (gastric sonde)를 사용하여 3% NaHCO3/PBS를 0.8 ㎖씩 경구투여하여 위산을 중화시켰다. 약 30분 후 상기에서 제조된 분산액을 인슐린 농도가 30, 50 및 100 U/㎏이 되도록 위 존데로 경구투여하였다. 비교군으로 인슐린을 포함하지 않은 액상제형의 분산액 및 인슐린/PBS 용액을 사용하여 동일한 방법으로 경구투여하였다. 약물투여 후 1, 2, 3, 4 및 6시간 째에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였다. 투여전 초기값을 100%로 하여 각 시간대의 혈당치를 환산하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액으로 인슐린이 100 U/㎏ 농도로 투여된 당뇨가 유발된 랫트 실험군에서는 초기 혈당치에 비하여 6시간 경과 후 80% 이상 감소되었고 30 및 50 U/㎏ 투여군에서도 40% 이상 혈당치가 감소된 반면, 인슐린을 함유하지 않은 분산액만을 투여한 경우에는 혈당치가 크게 저하되지 않음을 확인하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 정상 랫트 실험군에서도 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액으로 인슐린이 30∼100 U/㎏ 농도로 투여된 경우에 혈당치가 초기에 비하여 20∼50% 정도 감소하였으나, 인슐린을 함유하지 않은 분산액만을 투여한 경우에는 혈당치에 거의 변화가 나타나지 않았다. 또한, PBS 용액에 용해시킨 인슐린을 투여한 경우는 정상 랫트 및 당뇨가 유발된 랫트 실험군 모두에서 혈당이 저하되지 않았다.
시험예 3. In vivo 경구투여 실험 2
상기 실시예 10에서 제조된 액상제형을 이용하여 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 정상 랫트를 대상으로 실험하였다. 비교예로서 상기 실시예 1에서 제조된 인슐린함유 액상제형과 인슐린을 함유하지 않은 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 분산액을 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 정상 랫트에 경구투여한 경우에는 혈당치가 40% 정도 감소하였으나, 올레산을 함유한 인슐린 함유 액상제형의 분산액을 경구투여한 경우에는 인슐린 투여 후 2시간 만에 혈당치가 초기에 비하여 75% 이상 감소하여 흡수 촉진인자로서 첨가된 올레산 (oleic acid)으로 인하여 인슐린의 흡수가 촉진되었음을 확인하였다.
시험예 4. In vivo 십이지장 내 투여실험
상기 실시예 2에서 제조된 액상제형으로 동물실험을 수행하였다.
4-1. 액상제형 내 인슐린의 생리활성 보존여부 실험
상기 시험예 12-1과 동일한 방법으로 액상제형 내의 인슐린 활성을 측정하여 액상제형내의 인슐린의 활성이 보존된 것을 확인한 후 분산액을 취하여 하기의 동물실험을 수행하였다.
4-2. 분산액 제조
상기 실시예 2에서 제조된 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 또는 10-2 M 소듐 데옥시콜레이트 수용액 800 ㎕에 분산시켜 인슐린 농도가 1 ㎎ (≡28.3U)/㎖인 분산액을 제조하였다.
4-3. 분산액의 십이지장 내 투여실험
16시간 동안 절식시킨 180∼220 g의 휘스터계 수컷 랫트에 우레탄 (Urethane)과 자일라진·HCl (xylazine·HCl)을 각각 1.0 g, 12 ㎎/㎖의 농도로 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 후 상기 혼합액 1.0 ㎖/㎏을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 충분히 마취가 유도된 후 실험동물의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 이 값을 초기값으로 사용하였다. 실험동물을 수술대에 고정시키고 복부를 절개하여 십이지장을 노출시킨 후 26 게이지 바늘 (gauge needle)을 사용하여 분산액을 인슐린 농도가 100 U/㎏이 되도록 장관 내로 주입하였다. 절개부위를 봉합한 후 1, 2, 3, 4 및 6시간 째에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였다. 약물투여 전 초기값을 100%로 하여 각 시간대별 혈당치를 환산하였다. 비교군으로서 인슐린/PBS, 인슐린을 포함하지 않는 액상제제의 분산액, 인슐린 용액과 인슐린을 포함하지 않은 액상제제의 분산액의 혼합물을 상기와 동일한 방법으로 십이지장 내 투여하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 담즙산염 (bile salt)의 일종인 10-2 M 소듐 데옥시콜레이트 수용액에 인슐린 함유 액상제형을 분산시킨 경우에 정상 랫트에서의 혈당치가 20% 정도 감소하여 분산액으로 인산염 완충용액 보다 담즙산염을 사용하는 것이 더 효율적임을 확인하였다.
시험예 5. In vitro 인슐린 방출실험
상기 실시예 1에서 제조한 액상제형 400 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.6 ㎖에 분산시켜 분산액을 제조한 후 투석막 백 (dialysis bag, MWCO = 300,000, Spectra/Por, Spectrum Medical Industries, Inc. Laguna Hills, CA. 미국)에 넣고 양쪽을 클로져 (closure)로 묶은 뒤 10 ㎖의 인산염 완충용액 (Phosphate buffered saline, pH = 7.4)에 담가 37℃ 와동수조에서 방출실험을 수행하였다. 일정한 시간간격에 따라 투석막 백 외부의 인산염 완충용액을 취하여 방출되어 나온 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA방법)으로 정량하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 인슐린을 함유한 액상제형을 PBS 또는 담즙산염 수용액에 분산시킬 경우에는 70 % 이상의 인슐린이 방출되지 않고 입자내에 존재하는 반면, 큐보좀TM에 봉입된 인슐린은 모두 방출되었다.
상기 시험예 1 ∼ 5에서 보면, 본 발명에 의한 인슐린 함유 제형의 분산액 내의 입자 내 인슐린 봉입효율에 매우 우수하며, 또한 본 발명에 따른 제형을 주사 또는 경구 투여시 탁월하게 혈당을 저하시킴을 확인하였다.
상술 한 바와 같이, 본 발명에 의한 인슐린 함유 경구투여용 제형은 손으로 흔들어 주는 등의 최소한의 기계적 도움에 의해 쉽게 분산되어 작고 균일한 입자를 형성하고, 제형의 입자 내 인슐린 봉입률이 매우 우수하여 주사 또는 경구 투여시 탁월하게 혈당을 저하시키므로 인슐린 전달 시스템에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 인슐린 (insulin)을 함유한 액상제형을 정상 수컷 랫트의 꼬리 정맥에 주사한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액
- ○ - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린 (인슐린 농도 3 U/kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 3 U/kg)
도 2는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 당뇨가 유발된 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 100 U/kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 50 U/kg)
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 30 U/kg)
도 3은 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상의 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 100 U/kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 50 U/kg)
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 30 U/kg)
도 4는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 투여량 30 U/㎏)
- ▼ - ; 본 발명의 올레산 (oleic acid)과 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 투여량 30 U/㎏)
도 5는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상 수컷 랫트의 십이지장 내 투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액
- ○ - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린 (인슐린 투여량 100 U/㎏)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액과 인슐린 용액을 혼합한 혼합액
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 인산염 완충용액 (PBS)에 분산시킨 분산액 (인슐린 투여량 100 U/㎏)
- ■ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 담즙산에 분산시킨 분산액 (인슐린 투여량 100 U/㎏)
도 6은 인슐린을 함유한 액상제형의 약물 방출 속도를 나타낸 그래프이다.
- ● - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린
- ○ - ; 종래 기술로 제조된 인슐린 함유 큐보좀TM (cubosomeTM) 제형
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 물에 분산시킨 분산액
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 담즙산 용액에 분산시킨 분산액

Claims (22)

  1. 유효성분으로서 인슐린 (insulin) 0.01 ∼ 20 중량%과 1 종 이상의 탄소수 12 ∼ 22인 포화 또는 불포화된 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1 종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 산성 수용액 0.01 ∼ 10 중량%, 유기용매 1 ∼ 90 중량% 및 첨가제 0 ∼ 5 중량%로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 제형내에 인슐린이 봉입되어 있는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  2. 제 1 항에 있어서, 인슐린은 소 췌장 인슐린 (bovine pancreatic insulin), 인간 (human), 인간 재조합 (human recombinant), 돼지 췌장 (porcine pancreatic), arg-인슐린 (arg-insulin), 인슐린-바이오틴 (insulin-biotin), 인슐린-FITC (insulin-FITC) 및 LysPro 폴리에틸렌 글리콜-인슐린 [LysPro (Eli Lilly) polyethylene glycol-insulin, (PEG-insulin)]으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 모노글리세라이드계 화합물은 모노올레인 (Monoolein), 모노팔미톨레인 (Monopalmitolein), 모노미리스톨레인 (Monomyristolein), 모노일레이딘 (Monoelaidin) 및 모노이루이신 (Monoerucin)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  5. 제 1 항에 있어서, 유화제는 인지질, 스핑고지질 (Sphingolipid), 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 담즙산 (bile acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  6. 제 5 항에 있어서, 인지질은 포스파티딜콜린 (Phosphatidyl choline) 유도체, 포스파티딜에탄올아민 (Phosphatidyl ethanolamine) 유도체, 포스파티딜세린 (Phosphatidyl serine) 유도체 및 친수성 고분자가 결합된 지질 (polymeric lipid)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  7. 제 5 항에 있어서, 스핑고지질은 세라마이드계 (ceramides), 세레브로사이드계 (cerebroside), 스핑고마이엘린계 (sphingomyelins)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  8. 제 5 항에 있어서, 비이온성 계면 활성제로는 폴록사머 (Poloxamer; Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스테르 (Sorbitan esters; Span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 (polyoxyethylene sorbitans; Tween) 및 폴리옥시에틸렌 에테르 (polyoxy ehtylene ethers; Brij)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  9. 제 5 항에 있어서, 음이온성 계면 활성제는 포스파티딜세린 유도체, 포스파티딘산 (Phosphatidic acid) 유도체 및 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  10. 제 5 항에 있어서, 양이온성 계면 활성제로는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판 (1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드 (dimethyldioctadecylammonium chloride), N-[1-(1,2-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (N-[1-(1,2-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레일-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleyl-3-ethylphos-phocholine) 및 3β-[N-[(N`,N'-디메틸아미노)에탄]카바모일]콜레스테롤 (3β-[N-[(N',N'-dimethylamino)ethan)carbamoyl]chloresterol)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  11. 제 5 항에 있어서, 담즙산은 콜린산 (cholic acid)과 그의 염 및 유도체, 데옥시콜린산 (deoxycholic acid)과 그의 염 및 유도체, 리토콜린산 (Lithocholic acid)과 그의 염 및 유도체 및 체노콜린산 (chenocholic acid)과 그의 염 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  12. 제 1 항에 있어서, 산성 수용액은 염산, 인산, 탄산 수용액 및 이들의 혼합용액으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  13. 제 1 항에 있어서, 유기용매는 알코올, 에틸렌글리콜 (ethylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide) 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  14. 제 1 항에 있어서, 첨가제는 지방산, 지방산의 에스테르류 및 지방산의 알코올류로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  15. 제 1 항에 있어서, 인슐린의 경구투여용 액상제형은 경구투여, 구강내 투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내 투여, 피하주사, 근육주사, 경피 투여 및 정맥주사로 구성된 군으로부터 선택된 투여방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형.
  16. 인슐린의 경구투여용 액상제형의 제조방법에 있어서,
    1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;
    2) 상기 1단계에 산성 수용액을 소량 가하여 pH를 산성으로 조정하는 2단계;
    3) 상기 2단계에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가한 후 교반하여 완전히 용해시키는 3단계;
    4) 상기 3단계에 1 종 이상의 탄소수 12 ∼ 22인 포화 또는 불포화된 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및
    5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계
    로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형의 제조방법.
  17. 인슐린의 경구투여용 액상제형의 제조방법에 있어서,
    1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;
    2) 산성 수용액을 준비하여 여기에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가하여 용해시키는 2단계;
    3) 상기 1단계의 용액과 2단계의 용액을 혼합시키는 3단계;
    4) 상기 3단계의 혼합용액에 1 종 이상의 탄소수 12 ∼ 22인 포화 또는 불포화된 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및
    5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계
    로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 액상제형의 제조방법.
  18. 제 1 항에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형을 0 ∼ 30% (w/v)의 동결건조 보호제와 함께 동결건조한 인슐린의 경구투여용 분말제형.
  19. 제 18 항에 있어서, 동결건조 보호제는 당류, 아미노산류, 단백질류로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 분말제형.
  20. 제 19 항에 있어서, 당류는 만니톨 (mannitol) 또는 트리할로오즈 (trehalose)이고, 아미노산류는 아르기닌 (arginine)이고, 단백질류는 알부민인 것임을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 분말제형.
  21. 제 18 항에 있어서, 인슐린의 경구투여용 분말제형은 경구투여, 구강내 투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내 투여, 피하주사, 근육주사, 경피 투여 및 정맥주사로 구성된 군으로부터 선택된 투여방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 분말제형.
  22. 인슐린의 경구투여용 분말제형의 제조방법에 있어서,
    1) 제 1 항에 따른 인슐린을 포함하는 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조하는 1단계; 및
    2) 상기 1단계의 분산액에 선택적으로 동결건조 보호제를 첨가하여 동결건조시키는 2단계;
    로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 경구투여용 분말제형의 제조방법.
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