KR100393709B1 - Method for detecting environmental contaminant using recombinant animal cell line - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 동물 세포주를 이용한 환경 오염 물질의 탐지 방법에 관한 것으로, 시료를 c-fos 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자 또는 CMV 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염된 재조합 동물 세포주와 접촉시킨 후 상기 세포주의 형광을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면 시료중에 포함된 환경 호르몬 등의 환경 오염 물질을 고감도로 탐지한다.The present invention relates to a method for detecting environmental pollutants using a recombinant animal cell line, wherein the sample is transfected with an expression vector comprising a fusion gene of a c-fos promoter and a green fluorescent protein gene or a fusion gene of a CMV promoter and a green fluorescent protein gene. Measuring fluorescence of said cell line after contact with an infected recombinant animal cell line. According to the method of the present invention, environmental pollutants such as environmental hormones contained in the sample are detected with high sensitivity.
Description
본 발명은 재조합 동물 세포주를 이용한 환경 오염 물질의 탐지 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting environmental pollutants using recombinant animal cell lines.
현재까지 환경 오염 물질을 탐지하기 위한 바이오 센서로는 취급 등이 편리한 미생물이 주로 사용되었다. 그러나 바이오 센서로서 미생물은 인간과의 먼 연관 관계로 인해 인간에 대한 유해성을 평가하는 직접적인 기준이 되지 못하는 단점이 있었다. 특히 인체내에서 호르몬처럼 작용하는 환경 오염 물질인 환경 호르몬의 경우, 미생물 센서로는 적절하게 탐지되지 않는 실정이다.To date, microorganisms that are easy to handle have been mainly used as biosensors for detecting environmental pollutants. However, as a biosensor, microorganisms have a disadvantage in that they are not a direct criterion for evaluating harmfulness to humans because of their distant relationship with humans. In particular, environmental hormones, which are environmental pollutants that act like hormones in the human body, are not properly detected by microbial sensors.
이에 따라 본 발명자들은 환경 호르몬을 포함한 다양한 환경 오염 물질을 고감도로 탐지하는 방법을 개발하고자 예의 연구하였다.Accordingly, the present inventors earnestly studied to develop a method for detecting various environmental pollutants with high sensitivity including environmental hormones.
따라서 본 발명의 목적은 환경 호르몬을 포함한 다양한 환경 오염 물질을 고감도로 탐지하는 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting various environmental pollutants including environmental hormones with high sensitivity.
도 1은 발현 벡터 pKCFG의 제한 효소 지도이다.1 is a restriction map of the expression vector pKCFG.
도 2는 본 발명에 따른 방법의 각 단계를 나타내는 모식도이다.2 is a schematic diagram illustrating each step of the method according to the invention.
도 3은 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 성장률 변화를 나타내는 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the growth rate change of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the concentration of mitomycin C.
도 4는 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the fluorescence change of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the concentration of mitomycin C.
도 5는 비스페놀 A 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다.5 is a graph showing the fluorescence change of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the bisphenol A concentration.
도 6은 미토마이신 C의 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 성장률 변화를 나타내는 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the growth rate change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the concentration of mitomycin C.
도 7은 미토마이신 C의 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다.Figure 7 is a graph showing the fluorescence change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the concentration of mitomycin C.
도 8은 비스페놀 A 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다.8 is a graph showing the fluorescence change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the bisphenol A concentration.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 시료를 c-fos 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자 또는 CMV 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염된 재조합 동물 세포주와 접촉시킨 후 상기 세포주의 형광을 측정하는 단계를 포함하는, 환경 오염 물질의 탐지 방법을 제공한다.According to the above object, in the present invention, the cell line is contacted with a recombinant animal cell line transfected with an expression vector comprising a fusion gene of a c-fos promoter and a green fluorescent protein gene or a fusion gene of a CMV promoter and a green fluorescent protein gene. It provides a method of detecting environmental pollutants, comprising the step of measuring the fluorescence of.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 사용된 동물 세포주는 c-fos 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자 또는 CMV 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 재조합 동물 세포주로서, c-fos 프로모터 또는 CMV 프로모터를 녹색 형광 단백질 유전자와 통상적인 방법에 따라 연결한 후 적절한 벡터에 삽입하고 얻어진 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시켜 얻을 수 있다. 상기 c-fos 프로모터는 세포사멸(apoptosis) 또는 암화 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 환경 오염 물질에 의해 활성화된다. 녹색 형광 단백질 유전자는 녹색 형광을 발하는 단백질을 코딩하는 유전자로, 해파리(Aquorea victoria)로부터 분리된 야생형 유전자 외에도 야생형보다 35 배 강한 형광을 발하도록 유전공학적으로 변형시킨 변이형 유전자(EGFP)도 포함한다. 상기 c-fos 프로모터, CMV 프로모터 및 녹색 형광 단백질 유전자(EGFP)는 공지된 서열(각각 GenBank 등록번호 제 K00650 호, 제 U55762 호 및 living colors GFP Application Notes, Clonetech catalog)에 기초해 통상적인 방법에 따라 화학적으로 합성하거나 중합효소 연쇄 반응(PCR)하여 얻을 수 있으며, 숙주 동물 세포주로는 상기 융합 유전자의 발현에 적합한 것인 한 어느 것이라도 좋고, Rat-2 섬유아세포, COS-7 세포, 마이엘로마 세포 등을 예를 들 수 있으며, 특히 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 바람직하다.The animal cell line used in the present invention is a recombinant animal cell line transfected with an expression vector comprising a fusion gene of a c-fos promoter and a green fluorescent protein gene or a fusion gene of a CMV promoter and a green fluorescent protein gene, and a c-fos promoter or CMV. The promoter can be obtained by linking the promoter with the green fluorescent protein gene according to a conventional method, inserting into an appropriate vector, and introducing the obtained vector into an appropriate animal cell line. The c-fos promoter is known to be involved in the process of apoptosis or cancer and is activated by environmental pollutants. The green fluorescent protein gene is a gene encoding a protein that emits green fluorescence. In addition to the wild-type gene isolated from Aquorea victoria , the mutant gene (EGFP) has been genetically modified to emit 35 times stronger fluorescence than the wild-type. . The c-fos promoter, CMV promoter and green fluorescent protein gene (EGFP) were prepared according to conventional methods based on known sequences (GenBank Accession Nos. K00650, U55762 and living colors GFP Application Notes, Clonetech catalog, respectively). Can be obtained by chemical synthesis or polymerase chain reaction (PCR), any of the host animal cell line may be suitable for expression of the fusion gene, Rat-2 fibroblasts, COS-7 cells, myeloma Cells etc. are mentioned, Especially Chinese hamster ovary (CHO) cell is preferable.
본 발명의 한 태양에 따른 세포주의 대표적인 예로는, 서열번호: 1의 염기서열을 갖는, c-fos 프로모터와 녹색 형광 단백질의 융합 유전자를 포함하는, 도 1의 제한효소 지도를 갖는 발현 벡터 pKCFG로 형질감염된 재조합 동물 세포주 KFC-A10을 들 수 있으며 이 세포주 KFC-A10은 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 7월 1일자 기탁번호 제 KCTC 0817BP 호로 기탁되었다. 이 세포주는 환경 오염 물질에 의해 발현이 유도되어 녹색 형광을 발하며, 이 때 형광도는 환경 오염 물질에 대해 농도의존적으로 증가한다.Representative examples of cell lines according to one aspect of the present invention include an expression vector pKCFG having a restriction enzyme map of FIG. 1, comprising a fusion gene of a c-fos promoter and a green fluorescent protein having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The transfected recombinant animal cell line KFC-A10, which was deposited with the Accession No. KCTC 0817BP dated July 1, 2000, to the Genebank of Biotechnology. This cell line is induced by expression of environmental pollutants and emits green fluorescence, where fluorescence increases concentration-dependently with respect to environmental pollutants.
본 발명의 다른 태양에 따른 세포주의 대표적인 예로는, 서열번호: 2의 염기서열을 갖는, CMV 프로모터와 녹색 형광 단백질의 융합 유전자를 포함하는, 도 2의 제한효소 지도를 갖는 발현 벡터 pEGFP-N1로 형질감염된 재조합 동물 세포주 EFC-500을 들 수 있다. 이 세포주는 환경 오염 물질에 의해 발현이 억제되어 녹색 형광이 소멸하며, 이 때 형광도는 환경 오염 물질에 대해 농도의존적으로 감소하며, 이러한 형광도의 감소는 특히 저농도의 환경 오염 물질에 대해 현저하게 나타난다.Representative examples of cell lines according to another aspect of the present invention include an expression vector pEGFP-N1 having a restriction enzyme map of FIG. 2, comprising a fusion gene of a CMV promoter and a green fluorescent protein having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 And transfected recombinant animal cell line EFC-500. This cell line is suppressed by environmental pollutants and the green fluorescence disappears, where the fluorescence decreases in a concentration-dependent manner with respect to environmental pollutants, and this decrease in fluorescence is particularly significant for low concentrations of environmental pollutants. appear.
상기 세포주들은 환경 오염 물질에 대해 고감도로 반응하며, 미생물에 의해서는 탐지되지 않는 환경 호르몬에 대하여도 고감도로 반응한다.The cell lines respond with high sensitivity to environmental pollutants and with high sensitivity to environmental hormones that are not detected by microorganisms.
따라서, 본 발명의 세포주를 시료와 반응시킨 후 형광도를 측정함으로써 시료 중에 포함된 환경 오염 물질을 고감도로 탐지할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 탐지될 수 있는 환경 오염 물질로는 미토마이신 C(Mictomycin C), 비스페놀 A, 메틸브로마이드 등을 들 수 있다.Therefore, by measuring the fluorescence after reacting the cell line of the present invention with the sample, it is possible to detect the environmental pollutants contained in the sample with high sensitivity. Environmental pollutants that can be detected by the method of the present invention include mitomycin C, bisphenol A, methyl bromide and the like.
본 발명의 방법의 구체적인 예로는, 세포주 KFC-A10 또는 EFC-500을 1x105세포/㎖씩 테스트용 플레이트에 분주(seeding)한 후 10% 소태아혈청 및 700 ppm G418을 포함하는 ZKT-1 또는 DMEM 배지 중에서 배양한 다음, 세포 농도가 2x105세포/㎖가 된 때에 시료를 첨가하여 녹색 형광 단백질의 발현을 화학적으로 유도(chemical induction)한 후 배가시간(doubling time, 12 내지 15 시간) 간격으로 배양액을 채취하여 형광도를 측정하는 것이다. 배가시간 간격으로 측정하여야 하는 이유는 외부 독성에 의한 세포의 성장 속도 변화가 세포 분열 시간 즉 배가시간을 기준으로 하여 나타나기 때문이다. 형광도는 마이크로플레이트 형광 리더(microplate fluorescence reader)를 사용하여 여기(excitation) 파장 485 ㎚ 및 방출(emission) 파장 530 ㎚에서 측정할 수 있다.Specific examples of the method of the present invention include ZKT-1 or 10% fetal bovine serum and 700 ppm G418 after seeding the cell lines KFC-A10 or EFC-500 to test plates at 1 × 10 5 cells / ml. After culturing in DMEM medium, the cells were added at a concentration of 2x10 5 cells / ml to chemically induce the expression of green fluorescent protein by adding a sample and then at doubling time (12-15 hours) intervals. The culture is taken to measure the fluorescence. The reason for the measurement at the doubling time interval is that the change in the growth rate of the cells due to external toxicity appears based on the cell division time, that is, doubling time. Fluorescence can be measured at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 530 nm using a microplate fluorescence reader.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
제조예 1: 세포주 KFC-A10의 제작Preparation Example 1 Preparation of Cell Line KFC-A10
(단계 1) 융합 유전자의 제작(Step 1) Construction of the fusion gene
c-fos 프로모터를 포함하는 벡터 pfoslcf(한림대학교 김 재홍 박사로부터 입수함)를 서열번호: 3 및 4의 프라이머와 함께 PCR을 수행하여 c-fos 프로모터 영역의 DNA 단편을 얻었다. 또한 CMV 프로모터와 녹색 형광 단백질의 유전자를 포함하는 벡터 pEGFP-N1(Clonetech사)를 제한효소 Ase I 및 Bgl II로 절단하여 CMV 프로모터를 제거한 후, 여기에 상기 c-fos 프로모터 영역의 DNA 단편을 삽입하여, c-fos 프로모터와 녹색 형광 단백질 유전자의 융합 유전자가 포함된 발현 벡터를 제조하였으며 이 벡터를 pKCFG로 명명하였다. 도 1은 벡터 pKCFG의 제한효소지도이다.The vector pfoslcf containing the c-fos promoter (obtained from Dr. Jaehong Kim, Hallym University) was subjected to PCR with primers SEQ ID NOs: 3 and 4 to obtain DNA fragments of the c-fos promoter region. In addition, the vector pEGFP-N1 (Clonetech Co., Ltd.) containing the genes of the CMV promoter and the green fluorescent protein was cleaved with restriction enzymes Ase I and Bgl II to remove the CMV promoter, and then the DNA fragment of the c-fos promoter region was inserted therein. Thus, an expression vector containing a fusion gene of the c-fos promoter and the green fluorescent protein gene was prepared, and this vector was named pKCFG. 1 is a restriction map of the vector pKCFG.
(단계 2) pKCFG 의 동물 세포에로의 도입(Step 2) Introduction of pKCFG into Animal Cells
단계 1에서 얻은 벡터 pKCFG를, CaPO4DNA 침전 방법(Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory mannual,New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))에 따라 포유 동물 세포주 CHO/DHFR-(GBF, 독일)에 형질감염(transfection)시켰다.PKCFG the vector obtained in step 1, CaPO 4 precipitated DNA methods (. Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) mammalian cell lines CHO / DHFR according to the - ( GBF, Germany).
(단계 3) 형질감염된 세포의 확인(Step 3) Identification of Transfected Cells
융합 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해, 단계 2에서 얻은 세포들을 10% 소태아혈청 및 700 ppm G418이 포함된 ZKT-1 배지에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 형광 현미경하(100x 배율)에서 관찰하였으며, 그 결과 강한 녹색 형광을 발하는 세포를 형질감염된 세포로 확인하였다. 즉, 형질감염된 세포에서는 소태아혈청 중에 포함된 성장호르몬 성분에 의해 융합 유전자의 발현이 유도되어 녹색형광을 발한다.To confirm the introduction of the fusion gene, the cells obtained in step 2 were incubated for 24 hours at 37 ℃ in ZKT-1 medium containing 10% fetal bovine serum and 700 ppm G418, under fluorescence microscopy (100x magnification) It was observed in, and as a result, the cells emitting strong green fluorescence were identified as transfected cells. That is, in the transfected cells, the expression of the fusion gene is induced by the growth hormone component contained in the fetal bovine serum to emit green fluorescence.
(단계 4) 안정된 세포주의 선별(Step 4) Selection of Stable Cell Lines
도입된 융합 유전자를 안정하고 효율적으로 발현하는 세포주를 얻기 위해,단계 3에서 확인된 형질전환 세포를 700 ppm G418을 함유하는 선택 배지(10% FBS, HT supplement(10E-4M Hypoxanthin, 10E-5M Thymidine), ZKT-Imedia, 700 ppm G418)에서 37 ℃에서 168 시간 동안 배양하였다.In order to obtain a cell line stably and efficiently expressing the introduced fusion gene, the transformed cells identified in step 3 were selected as a medium containing 700 ppm G418 (10% FBS, HT supplement (10E-4M Hypoxanthin, 10E-5M Thymidine). ), ZKT-Imedia, 700 ppm G418) at 37 ° C. for 168 hours.
이 과정에서 벡터 pKCFG로 형질감염된 세포는 이 벡터에 포함된 항 네오마이신 유전자의 발현에 의해 생존하였다. 생존한 세포들에서 녹색 형광 단백질의 발현율은 각기 다르게 나타내었으며, 이 상태에서 유전자의 기능이 손상되기도 하였다.In the process, cells transfected with the vector pKCFG survived the expression of the anti neomycin gene included in the vector. The expression rate of green fluorescent protein was different in surviving cells, which impaired gene function.
(단계 5) 단일 세포주의 선별(Step 5) Selection of Single Cell Lines
형질감염된 세포들로부터 단일 세포주를 얻기 위해, 다음과 같이 서브클로닝(subcloning)하였다. 단계 4에서 얻은 형질감염 세포들을 배양한 후 희석하고 96 웰 플레이트에 각 웰당 한 개의 세포가 들어가도록 분주하여 1 주일 동안 배양하여 단일 콜로니를 선택하였다. 이 콜로니를 24 웰 플레이트에서 배양한 후 6 웰 플레이트에서 배양하여 단일 세포주를 얻었다.To obtain a single cell line from the transfected cells, they were subcloned as follows. The transfected cells obtained in step 4 were incubated, diluted and aliquoted into one well per 96 well plate and cultured for one week to select single colonies. The colonies were cultured in 24 well plates and then in 6 well plates to obtain a single cell line.
(단계 6) 단일 세포주의 계대 배양(Step 6) Passage culture of single cell line
단계 5에서 얻은 단일 세포주를 3 회 계대 배양하여, 안정하게 녹색 형광 단백질을 발현하는 세포주(stable green fluorescence cell line)를 얻었으며 이를 세포주 KFC-A10로 명명하였다. 이 세포주 KFC-A10을 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 7월 1일자 기탁번호 제 KCTC 0817BP 호로 기탁하였다.The single cell line obtained in step 5 was passaged three times to obtain a stable green fluorescence cell line stably expressing a green fluorescent protein, which was named cell line KFC-A10. This cell line, KFC-A10, was deposited with the Genetic Bank of Biotechnology Research Institute under the accession number KCTC 0817BP dated July 1, 2000.
제조예 2: 세포주 EFC-500의 제작Preparation Example 2 Preparation of Cell Line EFC-500
항상성(constitutive)으로 발현하는 CMV 프로모터하류에 녹색 형광 단백질 유전자가 융합된 유전자를 포함하는 pEGFP-N1(clonetech)을 야생형(wild type) CHO 세포(GBF, 독일)에 도입시킨다는 점을 제외하고는 제조예 1의 단계 1 내지 6에서와 동일한 방법으로 실시하여, 안정하게 녹색 형광 단백질을 발현하는 세포주를 얻었으며, 이를 세포주 EFC-500로 명명하였다.Except that pEGFP-N1 (clonetech) containing a fusion of a green fluorescent protein gene downstream of the CMV promoter expressing constitutive is introduced into wild type CHO cells (GBF, Germany) In the same manner as in steps 1 to 6 of Example 1, a cell line stably expressing a green fluorescent protein was obtained, which was named as cell line EFC-500.
실시예 1: 미토마이신 C 농도에 따른 세포주 KFC-A10의 형광도 변화Example 1 Fluorescence Changes of Cell Line KFC-A10 According to Mitomycin C Concentration
도 2는 본 발명에 따른 유해성 탐지 방법의 각 단계를 나타낸다. 도 2에 기재된 단계에 따라, 제조예 1에서 얻은 세포주 KFC-A10을 1x105세포/㎖씩 테스트용 플레이트에 분주(seeding)한 후 배지(10 % 소태아혈청, ZKT-1, HT supplement) 중에서 37 ℃에서 24 동안 배양하였다. 세포 농도가 2x105세포/㎖가 된 때에 여기에 미토마이신 C(Mitomycin C)를 농도별로 첨가하여 녹색 형광 단백질의 발현을 화학적으로 유도하였다. 이후 배가시간(doubling time, 12 내지 15 시간) 간격으로 시료를 채취하여 세포의 성장, 생존률 및 형광도를 측정하였으며, 대조군으로는 독성 물질을 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 세포수는 혈구계(hematocytometer)를 이용하여 계수하였으며, 생존률은 트립판 블루 염색하여 조사하였다. 형광도는 마이크로플레이트 형광 리더(microplate fluorescence reader)를 사용하여 측정하여 FL(fluorescence intensity) 단위로 나타내었으며, 이 때 여기(excitation) 파장은485 ㎚이고, 방출(emission) 파장은 530 ㎚이었다. 형광도는 대조군의 형광도에 대한 시료의 형광도의 비율(SFL: speicifc fluorescence intensity)로 나타내었다.2 shows each step of the hazard detection method according to the invention. According to the steps described in FIG. 2, the cell line KFC-A10 obtained in Preparation Example 1 was seeded on the test plate at 1 × 10 5 cells / ml, and then in medium (10% fetal bovine serum, ZKT-1, HT supplement). Incubated at 37 ° C for 24 hours. When the cell concentration was 2 × 10 5 cells / ml, mitomycin C was added to each concentration to induce the expression of green fluorescent protein chemically. Then, samples were collected at doubling time (12 to 15 hours) intervals to measure the growth, viability and fluorescence of the cells. As a control, a toxic substance was not added. Cell number was counted using a hematocytometer, and survival rate was examined by trypan blue staining. Fluorescence was measured using a microplate fluorescence reader and expressed in units of fluorescence intensity, wherein the excitation wavelength was 485 nm and the emission wavelength was 530 nm. Fluorescence is expressed as the ratio of fluorescence (Se: speicifc fluorescence intensity) of the sample to the fluorescence of the control.
도 3은 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 성장률 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 미토마이신 C의 농도가 증가함에 따라 본 발명의 세포주 KFC-A10의 성장률도 감소하였다. 이때 대조군의 성장률은 0.036/시였으며 미토마이신 C 처리군의 성장률은 대조군의 성장률에 대한 백분율로 나타내었다.Figure 3 is a graph showing the growth rate change of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the concentration of mitomycin C. As shown in Figure 3, as the concentration of mitomycin C increased, the growth rate of the cell line KFC-A10 of the present invention also decreased. At this time, the growth rate of the control group was 0.036 / hour and the growth rate of the mitomycin C treatment group was expressed as a percentage of the growth rate of the control group.
도 4는 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 형광도의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 본 발명의 세포주 KFC-A10은 미토마이신 C의 농도가 증가함에 따라 형광도가 증가하였다.4 is a graph showing the change in fluorescence of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the concentration of mitomycin C. As shown in Figure 4, the cell line KFC-A10 of the present invention increased the fluorescence as the concentration of mitomycin C increased.
실시예 2: 비스페놀 A 농도에 따른 세포주 KFC-A10의 형광도 변화Example 2 Fluorescence Change of Cell Line KFC-A10 According to Bisphenol A Concentration
미토마이신 C 대신에 환경 호르몬인 비스페놀 A(bisphenol A)를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 세포의 형광도를 측정하였다.Cell fluorescence was measured in the same manner as in Example 1 except for using bisphenol A, an environmental hormone instead of mitomycin C.
도 5는 비스페놀 A 농도에 따른 본 발명의 세포주 KFC-A10의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 세포주 KFC-A10은 비스페놀 A의 농도가 증가함에 따라 형광도가 증가하다가 1,000 ppb인 때에 정점에 이르렀고 5,000 ppb에서는 세포 사멸로 인해 감소하였다.5 is a graph showing the fluorescence change of the cell line KFC-A10 of the present invention according to the bisphenol A concentration. As shown in FIG. 5, the cell line KFC-A10 increased as the concentration of bisphenol A increased and reached its peak at 1,000 ppb, and decreased due to cell death at 5,000 ppb.
실시예 3: 미토마이신 C 농도에 따른 세포주 EFC-500의 형광도 변화Example 3: Change in Fluorescence of Cell Line EFC-500 According to Mitomycin C Concentration
제조예 2에서 얻은 세포주 EFC-500를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일하게 실시하여, 세포의 성장, 생존률 및 형광도를 측정하였다.Except for using the cell line EFC-500 obtained in Preparation Example 2 was carried out in the same manner as in Example 1, to measure the growth, survival rate and fluorescence of the cells.
도 6은 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 성장률 변화를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 미토마이신 C의 농도가 증가함에 따라 세포주 EFC-500의 성장률도 감소하였으며, 이러한 감소는 세포주 EFC-A10에서와 비슷하였다. 이때 대조군의 성장률은 0.039/시였으며 미토마이신 C 처리군의 성장률은 대조군의 성장률에 대해 농도의존적으로 감소하였다.Figure 6 is a graph showing the growth rate change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the concentration of mitomycin C. As shown in FIG. 6, as the concentration of mitomycin C increased, the growth rate of the cell line EFC-500 also decreased, and this decrease was similar to that of the cell line EFC-A10. At this time, the growth rate of the control group was 0.039 / hr, and the growth rate of the mitomycin C treatment group was decreased in a concentration-dependent manner with respect to the growth rate of the control group.
도 7은 미토마이신 C 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 세포주 EFC-500은 고강도의 형광을 일정하게 발하였으며 미토마이신 C의 농도가 증가함에 따라 형광도가 감소하였다. 이러한 양상은 본 발명의 세포주 KFC-A10이 미토마이신 C 농도가 증가함에 따라 그 형광도가 감소하는 것과는 다르다.7 is a graph showing the fluorescence change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the concentration of mitomycin C. As shown in FIG. 7, the cell line EFC-500 emits high intensity fluorescence constantly and decreases in fluorescence as the concentration of mitomycin C increases. This aspect is different from the decrease in the fluorescence of the cell line KFC-A10 of the present invention as the mitomycin C concentration increases.
실시예 4: 비스페놀 A 농도에 따른 세포주 EFC-500의 형광도 변화Example 4: Change in Fluorescence of Cell Line EFC-500 According to Bisphenol A Concentration
제조예 2에서 얻은 세포주 EFC-500를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 2에서와 동일하게 실시하여, 세포의 성장, 생존률 및 형광도를 측정하였다.Except for using the cell line EFC-500 obtained in Preparation Example 2 was carried out in the same manner as in Example 2, to measure the growth, survival rate and fluorescence of the cells.
도 8은 비스페놀 A 농도에 따른 본 발명의 세포주 EFC-500의 형광도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 세포주 EFC-500의 형광도는 비스페놀 10 ppb의 농도에서 급격히 떨어졌으며, 이 후 농도가 증가에 따른 변화가 미미하였다.따라서 세포주 EFC-500은 저농도의 비스페놀 A를 감지할 수 있는 장점이 있다.8 is a graph showing the fluorescence change of the cell line EFC-500 of the present invention according to the bisphenol A concentration. As shown in FIG. 8, the fluorescence of the cell line EFC-500 dropped sharply at the concentration of 10 ppb of bisphenol, after which the change was insignificant. Therefore, the cell line EFC-500 could detect low concentrations of bisphenol A. There is an advantage.
본 발명의 방법은, 환경 호르몬 등을 포함한 환경 오염 물질에 반응하여 농도의존적으로 녹색 형광 단백질을 발현하는 동물 세포주 KFC-A10 또는 농도의존적으로 녹색 형광 단백질의 발현이 감소되는 동물 세포주 EFC-500을 사용함으로써 환경 오염 물질을 고감도로 탐지하므로, 환경 오염 물질의 유해성을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.The method of the present invention uses an animal cell line KFC-A10 which expresses green fluorescent protein in a concentration-dependent manner or an animal cell line EFC-500 in which the expression of a green fluorescent protein is reduced in a concentration-dependent manner in response to environmental contaminants including environmental hormones and the like. By detecting the environmental pollutants with high sensitivity, it can be usefully used to evaluate the harmfulness of the environmental pollutants.
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