KR100267747B1 - 돼지 대장균 및 유행성 설사바이러스에 의한 설사증 예방 및치료용 난황항체를 이용한 복합 면역제제 - Google Patents

돼지 대장균 및 유행성 설사바이러스에 의한 설사증 예방 및치료용 난황항체를 이용한 복합 면역제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자돈 설사병의 대표적인 원인체인 병원성 대장균과 돼지 유행성 설사 바이러스의 단독 또는 복합 감염증을 동시에 신속하고 효율적으로 치료 및 예방할 수 있는 수동면역요법 제제에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 복합 면역제제는 병원성 대장균의 3종 섬모항원과 돼지 유행성 설사 바이러스를 포함한 시험백신을 산란계에 접종한 후, 면역화된 닭의 달걀의 난황으로부터 특이항체를 추출하여 제제화한 것이다. 본 발명에 따른 복합 면역제제에 의하면 면역효율이 낮은 장관면역계의 예방능과 치료제가 없는 바이러스성 설사병의 치료도 가능하여 양돈산업의 생산성 향상과 돈육의 수출증대 등에 획기적으로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

돼지 대장균 및 유행성 설사바이러스에 의한 설사증 예방 및 치료용 난황항체를 이용한 복합 면역제제
본 발명은 돼지의 병원성 대장균 및 유행성 설사 바이러스에 의한 설사병을 동시에 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 경구용 복합 면역제제에 관한 것이다.
지금까지 돼지 설사병 방제 대책은 원인체별로 백신을 접종하여 예방하고 있다. 예를 들면, 병원성 대장균의 경구감염에 의해 발생되는 설사병의 경우에는, 소장의 점막에 부착하여 균의 증식을 유도하는 부착인자와, 증식한 균이 생성하는 장독소를 항원으로 하여 접종하고 있으며, 유행성 설사 바이러스에 의해 발생되는 설사병의 경우 바이러스의 약독화주를 항원으로 하여 접종하고 있다. 면역방법으로는, 임신모돈에 예방약을 접종하여 모돈에서 형성된 항체를 분만시 초유를 통하여 자돈으로 이행시키는 수동면역을 이용하고 있다.
그러나, 소화기계 장관면역기전상 방어력이 불완전하여 효율성이 낮고, 유행성 설사 바이러스에 의한 설사병의 경우 약독화주의 개발이 미약하여 실제 치료 측면에서 볼 때 치료가 불가능한 상태에 있다. 또, 모돈에 의존한 수동면역방식의 경우, 백신을 적절한 시기에 모돈에 접종하였어도 모돈의 면역기능과 주위환경 등의 영향으로 자돈에게 충분한 방어능력을 제공할 수 있는 항체의 형성능이 문제가 되며, 초유중에 충분한 항체가 포함되더라도 분만후 24시간내에 자돈들이 충분한 양의 초유를 섭취하는지 여부가 중요하다.
다른 방법으로 대장균의 단클론 항체의 이용 가능성이 시도되었으나 실용성이 크게 문제시 되었으며, 또 분리된 병원성 대장균에 대하여 감수성 있는 항생제를 선발하여 처치하는 방법도 있으나, 항생제의 남용으로 인한 내성균의 출현문제와 식육중 항생제 잔류로 인한 국민건강의 위협이 지적되고 있다.
한편, 80년대 후반에서 90년대 초에 이르러 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 달걀을 이용한 난황항체에 대한 연구가 시작되었으며, 대부분이 혈청중의 항체가의 예측을 목적으로 수행되었다. 시험은 일부분에 국한되어, 그리고 대부분 병원성 대장균을 이용하여 수행되었으며, 연구결과가 실용화되지는 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 상술한 연구결과들을 토대로 하여, 혈청중의 항체가 측정에 그치지 않고, 난황을 면역항체의 대량 생산에 이용하는 경우 일년에 4~5회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있으며, 더욱이 고도로 면역화된 달걀 1개로 새끼돼지 20두 정도의 1회 투여량을 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 더욱이, 산란계의 접종백신으로서 병원성 대장균의 섬모항원과 돼지 유행성 설사 바이러스의 약독화주를 복합하여 제작하는 경우, 병원성 대장균에 기인하는 설사병과 유행성 설사 바이러스에 기인하는 설사병을 동시에 방제할 수 있는 특이항체가 얻어지며, 이를 자돈에 투여함으로써 병원성 대장균과 돼지 유행성 설사 바이러스의 단독 또는 복합감염증을 동시에 신속하고 효율적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 병원성 대장균 및 돼지 유행성 설사 바이러스의 단독 및 복합 감염증을 동시에 신속하고 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 복합 면역제제를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성할 수 있는 복합 면역제제의 개발은 크게 두 단계로 구성된다. 즉, 산란계에 접종되어 항체를 형성할 수 있는 시험백신의 제조와, 시험백신을 이용한 면역제제의 조제로 구성된다.
시험백신의 제조를 위하여, 우선 병원성 인자에 대해 면역원성이 우수한 항원의 선정 및 항체생성능을 증강시켜 주는 보조제의 적정 사용이 중요하다. 본 발명에서는 항원으로서 병원성 대장균의 섬모항원 K88, K99 및 987p와, 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus : PEDV) 약독화주(KCTC 8641P)를 사용한다. 섬모항원들은 대량 생성할 수 있는 조건에서 배양하여 균체에서 이들 항원만을 분리, 정제하였고, 돼지 유행성 설사 바이러스는 조직배양상에서 증식성이 좋지않아 역가가 낮기 때문에, 배양 후 원심분리하여 고농도로 농축시키고 여기에 상품화된 유성 보조제인 ISA(Incomplete Seppic Adjuvant)를 첨가하여 면역형성능을 향상시킨다. 복합백신은 분리, 정제된 섬모항원들과 돼지 유행성 설사 바이러스를 대략 동량 혼합한 후, 유성 보조제인 ISA에 대략 3:7로 유제화하여 제작한다.
본 발명자들의 병원성 대장균의 섬모항원들에 대한 연구에 의하면, 3종의 섬모항원들, K88, K99, 987p을 모두 포함하는 복합백신으로 구성하여 접종하는 경우가 단독 접종시에 비하여 각각의 섬모항원의 항체가가 월등히 높게 나타났다. 즉, 복합백신의 경우 각 섬모항원의 접종량을 각 섬모항원 단독 사용시의 접종량보다 훨씬 적게 하여도 유사한 정도 이상의 항체가를 얻을 수 있다.
난황중 항체가
K88단독(170㎍/마리) K99단독(81㎍/마리) 987p단독(211㎍/마리) K88 + K99 + 987p(22.2 + 9.6 + 41.8㎍/마리)
항원 K88 K99 987p K88 K99 987p
접종 0.179 0.387 0.402 0.205 0.426 0.294
접종후 2주 0.245 0.654 0.667 0.144 0.454 0.217
접종후 3주 1.030 0.819 1.635 0.391 0.919
주식회사 LT : 이열성 장독소접종은 보좌제로서 30%의 알루미늄하이드록사이드겔을 사용하여 근육주사하였다.
다음으로, 면역제제는 제조된 복합백신을 산란계에 접종하여, 면역화된 닭의 달걀의 난황으로부터 분리하여 조제한다. 달걀의 난황에는 고농도의 지방분이 있어 항체의 작용을 용이하게 하기 위해서는 항체만을 고효율로 순수 분리하는 것이 필요하며, 특히 생체에 유해하지 않아야 한다. 본 발명에서는 분리한 난황을 인산완충액(PBS : pH 7.0~7.2)으로 희석시킨 용액에 카라기난을 가한 후 원심분리하여 난황리포단백질을 침전시켜 그 상층액으로부터 얻은 난황 수용성 단백질을 이용한다.
난황항체추출법에서, 항체가의 측정을 목적으로 하는 경우에는 주로 클로로포름으로 항체를 추출하였으나, 본 발명에서와 같이 예방 및 치료를 목적으로 하는 면역제제의 경우에는 생체 안전성이 무엇보다 중요하다. 또한, 추출재료의 선정은 생체 안전성 외에도 항체의 회수율을 고려하여야 하는데, 이는 추출중에 추출재료가 항체의 단백질 변성을 유발하여 항체 역가를 감소시키는 경우도 있기 때문이다. 본 발명에서 선정한 카라기난 용액은 식품첨가물로서 공인된 검 용액으로 생체 안전성이 우수하며, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 항체 회수율 및 회수한 항체의 역가가 다른 추출재료에 비해 높다. 표 2는 3종의 섬모항원들을 포함한 복합백신을 적용한 경우의 자료이다.
방법 설 명 단백질 농도(280㎚) 항체수율(㎎/난황1g) 항체의 비활성(A.U./난황1g)
A 천연 검 용액 방법 22.3 2.304 246.8
B-1 GammaYolkTM방법(Pharmacia Biotech의 시판품 : IgY 추출 키트) 6.00 0.766 50.4
B-2 GammaYolkTM방법 + 정제 4.77 1.009 71.8
C-1 EGGstractTM방법(Promega의 시판품 : IgY 추출 키트) 3.70 0.919 99.2
C-2 EGGstractTM방법 + 정제 3.06 0.949 124.7
이용되는 산란계로는 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 접종은 피하주사, 근육주사, 복강내 주사 등 일반적인 면역방법을 이용한다.
항원의 투여량은 원하는 항체가가 얻어지고, 또한 산란계에 대하여 악영향을 미치지 않을 정도의 양을 적당히 선택한다. 바람직하게는 닭마리당 각각의 세가지 섬모항원이 약 100㎍의 농도가 되게 접종한다. 또한, 처음 면역후 추가면역은 목적하는 항체의 항체가에 의해 결정할 수 있다.
본 발명의 면역제제는 동결건조시켜 오랫동안 보관하면서 사용할 수 있으며, 질병의 발생 정도에 따라 투여 농도를 자유롭게 조절할 수 있다.
또한, 면역제제의 설사병 예방 및 치료효과를 향상시키기 위하여, 면역단백질을 증가시킬 수 있는 켈프밀(Kelp meal)을 면역시킬 닭의 사료에 2~4% 첨가할 수도 있으며, 수동면역법인 난황항체에 비특이적 능동면역능을 증강시켜 주기 위하여 면역증강제로서, 예를 들면 국내특허 공개 97-32884호에 개시된 면역증강제 -- 포도상구균(Staphylococcus aureuscowan Ⅰ)의 사(死) 균체 또는 정제 단백질; 보데텔라균(Bordetella pertussisATCC 9797)의 정제 단백질을 유효성분으로 함유함 --를 첨가할 수도 있다.
본 발명의 면역제제의 적용방법은 설사증 예방을 위하여 분만직후 모든 신생자돈에, 치료를 위하여 발병초기에 집중적으로 경구투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 복합 면역제제는 대장균의 부착인자들 및 설사 바이러스의 소장 점막에의 부착을 억제할 수 있어 병원성 대장균 및 돼지 유행성 설사 바이러스의 단독 또는 복합 감염에 의한 돼지의 설사증을 동시에 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 특히, 면역기능이 불완전한 갓 태어난 자돈에게 우수한 면역능력을 줄 수 있으며, 면역형성기간없이 투여즉시 효과를 볼 수 있다. 또한, 항원별로 접종하지 않고 복합항원을 산란계에 접종함으로써 손쉽게 다종의 고면역 달걀을 생산, 이용할 수 있으며, 일년에 4~5회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있으며, 더욱이 고도로 면역화된 달걀 1개로 새끼돼지 20두 정도의 1회 투여량을 생산할 수 있다. 또, 직접 먹이거나 사료에 배합하여 급여하는 경구용 제제이기 때문에 누구나 손쉽게 사용할 수 있으며, 설사 원인체가 있는 장에 직접 작용하여 신속하게 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있다.
이하, 면역제제의 제조법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
(1) 시험백신의 제조 :
(1-1) 항원의 준비 :
시험백신의 생산을 위한 대장균 섬모항원은 미국 NADC(national animal disease center)에서 분양받아 수의과학연구소에서 보관중인 대장균 균주인 S-175(K88 항원생산용), S-20(K99 항원생산용), S-171(987p 항원생산용) 균주를 밍카배지(Minca broth)에 37℃, 24시간 진탕배양한 후, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 수집한 균을 사용하였다. 이 균을 적당량의 인산완충액(PBS, Phosphate Buffered Saline, pH7.0)으로 부유하여 0℃에서 2분간 2회 블렌딩한 후, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수거하고, 여기에 암모니움설페이트를 과포화 용액이 되도록 서서히 가하였다. 얻은 과포화된 용액을 5℃에서 정치하여 형성된 섬모단백을 원신수집하여 PBS에서 투석하고, 농도가 100㎍/수로 되도록 조정하여 항원으로 사용하였다.
돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)로는 공동 발명자가 기 출원한 국내특허 공개 제 1996-23048호의 돼지 유행성 설사 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 사용하였다. 이 약독화주를, α-MEM 배지에 0.1~10%의 농도로 트립토스인산염 브로쓰(Tryptose Phosphate Broth : TPB)와 효모추출액 및 1~5%의 트립신을 첨가한 배지의 Vero(African green monkey kidney) 세포에서, 37oC에서, 4~7일간 배양한 후, 초고속원심분리에 의해 농축한 후에, TEN 완충액(10mM의 트리스-HCl, 100mM의 NaCl, 1mM의 EDTA, pH 7.0~8.0)에 부유시켜 항원으로 사용하였다.
(1-2) 시험백신의 제조 :
위에서 얻은 대장균의 섬모항원들과 PEDV를 동량 혼합한 후, 유성 보조제인 ISA-70에 3:7로 유제화하여 복합백신을 제조하였다.
(2) 면역 :
산란계의 면역은 약 20주령의 백색 레그혼계에 상기 (1)단계에서 얻은 복합백신을 1차에는 10%의 알루미늄 겔에 흡착시켜 1㎖씩 양쪽 다리 근육에 주사하였고, 2차 접종은 1차 접종 2주후, 3차 접종은 2차 접종 3주후에 항원을 ISA-70 보조제에 혼합하여 0.5㎖씩 양쪽 다리 근육에 각기 주사하였다.
(3) 난황항체의 추출 및 복합 면역제제의 조제 :
난황중의 항체의 추출은, 먼저 고역가의 수집한 달걀을 알코올로 잘 소독한후에 달걀의 노른자만을 50㎖ 원심튜브로 모았다. 노른자의 부피와 동량의 인산완충액(PBS)을 가한 후에 30초간 볼텍스(vortex)하여 난황이 완전히 희석액에 섞이도록 하였다. 희석한 난황액에 두배량의 검용액(0.1%의 카라기난 용액)을 가하고 실온에서 30분간 정치시킨 후, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수집하고, 이를 여과지(Whatman No. 2 Paper filter)로 여과하였다. 얻은 여과액을 동결건조하여 대장균 및 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 특이 복합항체를 함유하는 난황수용성단백분말을 조제하였다.
<시험예 1>닭에 대한 복합백신의 면역원성 및 항체가
상기 (2)단계에서의 1차, 2차 및 3차 접종 후, 주기별 혈중 및 난황중의 항체가를 효소면역법(ELISA)을 이용하여 조사하였다.
난황중 항체가의 조사를 위한 항체의 추출은 클로로포름을 이용하여 실시하였으며, 혈중 항체가는 닭의 혈액에서 혈청을 분리하여 사용하였다.
효소면역법은 각각 면역에 이용한 3종의 섬모항원들과 PEDV 약독화주를 ELISA용 플레이트에 코팅시킨 후에 PBS액으로 난황은 100배, 혈청은 200배 희석하여 실시하였으며, 405㎚에서 흡광도를 측정하여, 각각의 흡광도를 이용하여 혈중 및 난황중의 항체가를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
주기별 혈중 및 난황중 항체가
항원 재료 효소면역항체가 (O.D)
접종전 1차접종 2주후 2차접종 2주후 3차접종 2주후
K88 항원 혈청난황 0.8370.782 1.2960.923 1.2551.522 2.1321.963
K99 항원 혈청난황 0.3620.423 1.4361.531 1.7241.889 2.2682.045
987p 항원 혈청난황 0.6990.702 1.0481.084 1.7631.481 2.0412.251
PEDV 약독화주 혈청난황 0.2940.096 0.3350.212 0.9200.882 1.0620.970
표 3에서 보는 바와 같이, 1차접종 2주후부터 항체가 증가하여 3차접종 2주후에 가장 높은 항체가 분포를 나타내었다.
<시험예 2>마우스에서의 대장균 공격 접종에 대한 복합난황항체의 방어효과
상기 (3)단계에서 얻은 복합 면역제제를 이용하여 마우스에 대한 예방효과를 시험하였다.
복합난황항체의 대장균(K88) 공격 접종에 대한 방어효과를 조사하기 위하여, ICR 마우스의 복강에 복합난황항체를 0.3㎖ 접종하고, 1일후에 병원성 대장균으로 공격 접종하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
마우스에서의 병원성 대장균에 대한 복합면역제제의 방어효과
시험군 마우스의 방어 효과
1 MLD 공격 접종 10 MLD 공격 접종
생존수 방어율(%) 생존수 방어율(%)
원액 난황 투여군 0/4 100 0/4 100
2배 희석 난황 투여군 0/4 100 1/4 75
5배 희석 난황 투여군 0/4 100 2/4 50
10배 희석 난황 투여군 0/4 100 3/4 25
대조군 4/4 0 4/4 0
표 4에서 1 MLD 공격 접종에서는 난황을 10배로 희석 투여한 마우스도 100% 방어를 하였으나, 10 MLD 공격접종에서는 난황 원액 투여군만 100% 방어하였고, 10배 희석 투여군은 25%의 방어율을 보였다.
<시험예 3>복합 감염된 야외 설사 자돈에 대한 난황항체 투여후의 생존율
병원성 대장균과 PEDV 복합 감염 자돈에 대한 난황항체의 예방, 치료효과를 시험하기 위하여, 돼지 설사증이 발생한 자돈군에 상기 (3)단계에서 얻은 복합 면역제제를 분만직후부터 4㎖를 1일 2회 3일간 투여하고 폐사상황을 조사하였다. 복합 감염 여부는 돼지 설사증이 확인된 자돈의 설사변에서 병원성 대장균을 분리동정하여 판단하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
대장균/PEDV 복합 감염 자돈에 대한 예방 및 치료효과
면역제제의투여 여부 설사발생두수 예방 및 치료 효과
폐사두수 생존율*
투여군무투여군 24 두19 두 6두18두 75%5.3%
주식회사 * 투여군 생존 자돈에서 설사 및 탈수 완화의 치료효과를 나타냄
표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 복합면역제제를 투여한 경우 생존율이 75%로, 무투여군의 5.3% 보다 월등히 높았으며, 설사 및 탈수증상의 완화도 보였다.
<시험예 4>면역증강제 첨가에 따른 마우스에서의 대장균 공격 접종에 대한 복합난황항체의 방어효과
상기 (3)단계에서 얻은 복합 면역제제에 국내특허 공개 97-32884호에서 개시된 면역증강제를 첨가한 제제를 이용하여 마우스에 대한 예방 및 치료효과를 시험하였다.
복합난황항체의 대장균(K88) 공격 접종에 대한 방어효과를 조사하기 위하여, ICR 마우스의 복강에 상기한 제제를 0.3㎖ 접종하고, 1일후에 병원성 대장균으로 공격 접종하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
마우스에서의 면역증강제-첨가 병원성 대장균에 대한 복합면역제제의 방어효과
시험군 공시수 마우스의 방어 효과
1 MLD 공격 접종 10 MLD 공격 접종
폐사수 예방효과(%) 폐사수 예방효과(%)
원액 난황 투여군 12 0 100 1 83.3
면역증강제 투여군 12 0 100 1 83.3
난황/면역증강제 투여군 12 0 100 0 100
무투여군 12 12 0 12 0
표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 복합면역제제에 면역증강제를 부가적으로 첨가하는 경우 예방효과가 100%로 매우 우수하였다.
본 발명에 따른 복합 면역제제는 대장균의 부착인자들 및 설사 바이러스의 소장 점막에의 부착을 억제할 수 있어 병원성 대장균 및 돼지 유행성 설사 바이러스의 단독 또는 복합 감염에 의한 돼지의 설사증을 동시에 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 특히, 면역기능이 불완전한 갓 태어난 자돈에게 우수한 면역능력을 줄 수 있으며, 면역형성기간없이 투여즉시 효과를 볼 수 있다. 또한, 항원별로 접종하지 않고 복합항원을 산란계에 접종함으로써 손쉽게 다종의 고면역 달걀을 생산, 이용할 수 있으며, 일년에 4~5회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있으며, 더욱이 고도로 면역화된 달걀 1개로 새끼돼지 20두 정도의 1회 투여량을 생산할 수 있다. 또, 직접 먹이거나 사료에 배합하여 급여하는 경구용 제제이기 때문에 누구나 손쉽게 사용할 수 있으며, 설사 원인체가 있는 장에 직접 작용하여 신속하게 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있다.

Claims (2)

  1. 병원성 대장균의 섬모항원 K88, K99, 987p와, 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus : PEDV) 약독화주(KCTC 8641P) 및 유성 보조제인 ISA(Incomplete Seppic Adjuvant)를 포함한 시험백신을, 산란계에 접종한 후, 면역화된 닭의 달걀로부터 분리한 난황을 인산완충액으로 희석시킨 후, 얻은 난황희석액에 카라기난을 가하여 원심분리한 후, 얻은 상층액을 여과하여 제조한 난황수용성 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 돼지 대장균 및 유행성 설사 바이러스에 의한 설사증에 대한 복합 면역제제.
  2. 제 1항에 있어서, 면역증강제를 더 함유함을 특징으로 하는 복합 면역제제.
KR1019980011876A 1998-04-03 1998-04-03 돼지 대장균 및 유행성 설사바이러스에 의한 설사증 예방 및치료용 난황항체를 이용한 복합 면역제제 KR100267747B1 (ko)

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