KR100230909B1 - 광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법 - Google Patents

광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제를 함유하는 투과성화 시약 중에서 시료 세포를 약 80 내지 95℃에서 가열시킴으로써 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 세포벽 전체를 물리적으로 파괴시키지 않고서 분해되지 않은 핵산의 큰 단편들을 유리시킨다. 핵산은 세포를 파괴하지 않고서 용액내로 유리되고, 추가로 정제하지 않아도 연구 및 시험에 적합하다. 본 출원에서 기재한 추출 방법은 신속하고, 수행하기 쉽고, 미생물을 포함하여 광범위의 각종 세포에 적용가능하다. 시료를 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제 존재 하에 80 내지 95℃에서 가열시키고, 시료에 선택한 미생물에 특이적인 핵산 프로브를 첨가하고, 프로브가 유리된 핵산과 혼성화하게 되는 조건 하에서 시료를 배양시키고, 임의의 혼성화된 프로브가 존재하는 지를 검출함으로써 임상 시료를 미생물의 존재 또는 부재에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 출원에서 기재한 핵산 추출 방법을 수행하기 위한 키트 또한 개시된다.

Description

[발명의 명칭]
광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법
[발명의 배경]
[발명의 기술 분야]
본 발명은 핵산 혼성화 방법 및 시험 유기체를 구체적으로 동정하기 위한 기타 진단 기술에 사용하기 적합한, 배양물, 임상 시험표본, 및 기타 시료로부터 광범위의 유기체의 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 광범위의 유기체로부터, 후속되는 혼성화, 검출 및 분석 유기체의 정량적 동정에 적합한 핵산을 추출하는데 적합한 투과성화 시약(permeablization reagent)을 사용하는 진단 키트에 관한 것이다.
[배경 기술]
분자 생물학 및 유전 공학의 현대적 기술의 출현은 질병 진단에 혁명을 일으켰다. 최근 수년 동안, 병원성 유기체, 특히 세균 및 효모와 같은 미생물의 동정은 미생물을 검출하고, 정량화하고, 미생물 종과 아종(亞種)을 구별하기 위한 점점 더 진보된 방법이 개발됨에 따라 훨씬 빨라지고 더욱 정확해졌다. 대부분은 아니더라도 다수의 이들 진단 기술은 상이한 병원체 종의 핵산 서열의 고유한 차이점 및 병원성 미생물과 비병원성 미생물간의 고유한 차이점을 이용한다. 이들 핵산 기재 진단 방법의 속도, 선별성 및 감응성은 보다 신속하고 보다 정확한 환자 치료를 가능하게 하여 공중 보건의 향상을 가져왔다.
미생물이 원인제 또는 질병의 인디케이터로서 관여하는 많은 질병의 진단을 위해 주로 핵산 혼성화에 의존하는 진단 키트가 개발되었다. 따라서 키트는, 전부 열거하는 것은 아니지만, 결핵 [미코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)], 일반적인 성형[클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 나이세리아 고노리애(Neisseria gonorrhoeae)], 호흡기 질환[미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae)], 인두염 및 류머티스열[그룹 A 스트렙토콕쿠스(Streptococcus)(에스. 피오게네스(S. pyogenes)], 후두개염[해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)]을 일으키는 미생물 뿐만 아니라 ARC 및 AIDS(HIV)의 원인제와 같은 바이러스의 검출 및(또는) 동정에 이용하거나 또는 의도할 수 있다. 이들 방법은 모두 표적 핵산이 용이하게 혼성화에 이용될 수 있어야 한다.
대부분의 미생물 핵산 추출 방법은 미생물의 세포벽을 부괴시키고(용해) 세포의 내용물을 완충 용액 내로 추출시키는 것을 포함한다. 이어서 지질, 탄수화물 및 단백질을 페놀 추출법을 수행하여 용액으로부터 제거할 수 있고, 핵산은 찬 에탄올로 침전시켜 추가로 정제시킨다. 미생물의 파괴, 또는 용해 방법은 통상 유기체 그 자체의 성질에 의존하지만, 최근까지의 연구는 한 개의 그람 음성균인 에세리히아콜리(Escherichia coli)에 크게 한정되어 있다[스텐트, 건더 에스.(Stent, Gunther S.) 및 칼렌더, 리차드(Calendar, Richard), Molecular Genetics 51 (제2판, 1978년) 참조].
이. 콜리(E. coli)와 같은 그람 음성균으로부터 핵산의 추출법은 고전적으로 (a) 초음파, 연마재를 이용한 마쇄, 유리 비이드와의 진탕 및 프렌치 압력 세포와 같은 전단 또는 기계력의 사용 ; (b) 동결과 해동을 1회 이상 시행하거나 또는 라이소자임과 같은 용해 효소로 처리하여 세포벽을 약화시킨 다음, 강한 세제 또는 카오트로픽제(chaotropic reagent)(즉, 소수성 상호작용을 방해하는 시약)로 처리하여 세포막을 용해시키는 것을 포함한다. 상기 방법에서 모두, 용해질 성분은 기능질, 단백질(프로테아제 및 뉴클레아제와 같은 효소 포함), 탄수화물 및 지질 뿐만 아니라 추가의 정제를 필요로 할 수 있는 핵산을 포함한다.
이. 콜리 세포의 세제 보조된 효소 용해를 포함하는 방법이 문헌[Lysis of Escherichia coli with a Neutral Detergent, 곳슨(Godson, G.N.) 및 신샤이머(Sinsheimer, R.I.), 149 Biochem, Biophys. Acta 476(1967)]에 기재되어 있다. 샤인의 문헌(EPO 공고 제0061250호)은 라이소자임, 카오트로픽제 및(또는) 세제를 사용하여 숙주 유기체로부터 재조합 단백질을 회수하는 방법을 기재하고 있으며, 이 때 숙주 세포는 이. 콜리 균주이었다.
그람 양성 미생물의 용해는 그람 음성균의 경우에 비해, 세균 세포벽의 주성분인 펩티도글리칸층이 보다 두껍고 보다 치밀하기 때문에 상당히 더 어렵다. 용해효소를 사용한 일부 그람 양성 미생물의 용해가 보고되어 있다[예를 들면, Lysis of Grouped and Ungrouped Streptococci by Lysozyme, 콜만(Coleman, S.E.) 등, 2 Infect. and Immun 563-569(1970) ; Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme, 채시(Chassy, Bruce M.) 및 기우프리다(Giuffrida, Alfred), 39 Applied and Env. Micro. 153-158(1980) ; Lysis of Streptococcus mutans cells with Mutanolysin, a Lytic Enzyme prepared from a Culture Liquor of Streptomyces gloisporus 1829, 하마다(Hamada, S.) 등, 23 Archs. Oral Biol. 543-549(1978) ; Lysis and Protoplast Formation of Group B Streptococci by Mutanolysin, 칼란드라(Calandra, G.B.) 및 코울(Cole, R.M.), 28 Infect. and Immun. 1033-1037(1980) 참조].
그람 음성 병원균을 함유하는 임상 시료를 카오트로프(구아니듐 티오시아네이트(GuSCN)), 음이온계 세제(소듐 도데실 설페이트(SDS) 또는 N-라우오릴사르코신(사르코실)), 2가 금속 킬레이트제(에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)), 및 환원제(β-머캅토에탄올)을 함유하는 용액으로 처리하는 비효소성 조성물이 기재되어 있다[슈와르츠(Schwartz) 등, 미합중국 특허 제5,212,059호 참조]. 상기 조성물은 전시료가 한 번의 분석에 사용되는 용해/혼성화 용액으로 기재되어 있다.
주성분으로서 β-글루칸 및 키틴을 함유할 수 있는 효모 종의 세포벽은 조성이 세균과는 상이하고, 따라서 효모로부터 핵산을 추출하기 위한 효소성 방법은 종종 세균을 용해시키는데 사용된 것과는 상이한 특이성을 갖는 한 세트의 완전히 상이한 효소, 예를 들면 자이몰리아제를 포함한다.
샤이네스(Sheiness) 및 리바인(Levine)의 문헌(PCT 출원 공개 제WO 92/07096호)은 질 병원균 검출용 진단 키트를 기재하고 있다. 시험 유기체는 효모인 칸디다(Candida), 그람 음성균인 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 및 세포벽이 없는 진핵 원생동물인 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)이었다. 보고에 따르면 그들이 사용한 용액은 핵산 혼성화에 의해 검출되었을 때 이들 유기체 각각으로부터 핵산을 유리시킬 수 있었다.
홈즈(Holmes)의 미합중국 특허 제4,830,969호는 배양시킨 세포를 “용해제” 중에서 비등시켜 핵산을 단리하는 방법을 기재한다.
봐세(Wase)의 문헌(EPO 공고 제0149514호)은 용해된 세균 세포 배양물로부터 서상 반응제(flocculating agent)를 제조하는 방법을 개시한다. 기재되어 있는 각종 세포 용해 개시 방법들 중의 하나는 열을 이용하는 것이다.
열만을 사용하는 것이 많은 연구자들이 용해시키기 어렵다고 생각했던 특정세균인 미코박테리아속으로부터 추가의 생화학적 조작에 적합한 무상 DNA를 제조하는데 효과적인 것으로 나타났다[롭슨(Robson), EPO 공고 제0547789A1호].
상기한 모든 방법들은 생물 시료 중의 광범위의 미생물로부터 후속되는 페놀추출 및 에탄올 침전 방법 필요없이 핵산 혼성화에 적합한 형태의 핵산(예를 들면, 리보좀 RNA 및(또는) 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DNA)을 유리시킬 수 있는 단일 시약의 이점은 없다.
[발명의 요약]
본 발명은 그람 음성 및 그람 양성 세균 및 효모를 포함하는 광범위의 각종 유기체로부터 핵산(예를 들면, RNA 및 DNA, 바람직하게는 리보좀 RNA 및(또는) 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DAN)을 유리시킬 수 있는 투과성화 시약의 사용에 관한 것이다. 이 시약은 용해 효소를 함유하지 않아도 되고, 고온에서, 바람직하게는 약 80 내지 100℃, 보다 바람직하게는 약 80 내지 95℃, 가장 바람직하게는 약 95℃에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 그람 음성 및 그람 양성 세균 및 효모를 포함하는 광범위의 유기체로부터 핵산, 바람직하게는 리보좀 RNA 및(또는) 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DNA를 추출하기 위한 투과성화 시약을 포함하는 키트 및 방법에 관한 것이다. 이어서 유리된 핵산은 각종 목적으로 사용될 수 있으며, 이들의 예로서는 핵산 증폭 방법, 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 또는 유리된 핵산의 특이적 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 들 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에서 기재한 조성물, 방법 및 기트는 시료 중에 함유되어 있는 유기체로부터 핵산을 신속하고 간단하게 제조할 수 있도록 디자인되었다.
광범위의 유기체와 함께 사용하기 위한 단일 핵산 추출 방법의 이점으로는 a) 실험 기술자들을 진단 시험을 수행할 수 있도록 훈련시키는 것과 관련된 시간 및 비용의 감소, b) 단일의 투과성화 시약이 다수의 제품에 사용될 수 있기 때문에 제조 비용의 절감, 및 c) 효소 기재 추출 시약의 품질 조절과 연관된 비용 및 시간의 감소를 들 수 있다. 따라서 본 발명의 제1 목적은 광범위의 미생물로부터 검출가능한 양의 핵산 유리를 야기시킬 수 있는 단일 시약을 제공하는 것이다.
많은 진단 키트들은 여전히 세포로부터 핵산을 유리시키는 효소의 사용에 의존하고 있다. 특정 시료가 분석가능한 많은 세포들을 함유하지 않기 때문에, 표적 미생물 또는 핵산이 단지 세포의 아집단(subpopulation)에서만 존재하기 때문에 효소 용해가 불충분하거나 또는 다른 이유로 혼성화에 이용될 수 있는 표적 핵산의 수율이 양호하지 않을 경우 진단 시스템의 감응성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2 목적은 다른 비교할 만한 방법 만큼 양호하거나 또는 더 나은 표적 핵산 수율을 제공하는 핵산 추출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3 목적은 시판되는 진단 분석 키트 내에 포함시키기 위해 값싸게 제조될 수 있는 핵산 추출 방법이다. 본 발명의 방법과 함께 사용되는 투과성화 시약은 비교적 값싼 실험실용 화학약품을 사용할 수 있고, 값비싼 용해 효소를 포함하지 않아도 된다.
본 발명의 제4 목적은 세포가 핵산을 용액 내로 유리시키도록 하는 온화하고 간단한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 추출 단계 후에 많은 표적 미생물의 세포벽을 실질적으로 무상 상태로 두기 때문에, 유리된 핵산은 기타 원하지 않는 세포 성분들과 혼합되지 않는다. 대부분의 원하지 않는 세포 물질은 세포 내에 남아있고, 상징액 중의 핵산은 원심분리에 의해 세포로부터 분리하여 별도로 분석할 수 있지만, 이것이 본 발명의 실행에 필수적인 것은 아니다. 본 발명은 또한 숙련된 및 숙련되지 않은 실험 작업자 모두가 핵산, 특히 리보좀 RNA 및(또는) 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DAN를 한 단계로 추출할 수 있도록 신속하고 간단하다. 게다가, 본 추출 방법은 핵산에 온화하여, 추가의 정제없이 혼성화 분석에서와 같은 후속 용도에 적합한 핵산을 제조한다.
진단 분석의 제1 단계에서 실험 기술자들의 잠재적으로 해로운 미생물에 대한 노출을 최소화시키는 것이 바람직하기 때문에, 본 발명의 제5 목적은 임상 시료로부터 핵산을 추출하는 비교적 안전한 방법을 제공하는 것이다. 이것은 2가지 방식으로, 즉 표적 세포로부터 대부분의 표적 핵산을 유리시키는데 필요한 시간을 최소화시킴으로써, 및 대부분의 병원균을 신속하게 죽일 수 있는 충분히 높은 온도(즉, 약 80 내지 100도시의 온도)에서 투과성화 단계를 실행함으로써 행해진다.
본 발명은 그람 양성 및 그람 음성 세균 및 효모 외의 유기체, 예를 들면 아스테로콕쿠스속, 원생동물 및 엔벨로프가 있는 바이러스(enveloped virus), 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 투과성화될 수 있는, 세균 또는 효모보다 덜 견고한 세포벽을 갖거나 또는 세포벽을 전혀 갖지 않는 배양시킨 진핵 세포와 같은 기타 세포들에 적용할 수 있다. 상기 경우 본 발명은 여전히 온화하지만 세균 또는 효모의 경우에 일어나는 것보다 심한 세포벽 또는 막 손상을 일으킬 수 있다.
[정의]
하기 용어들은 본 명세서에서 다르게 언급되지 않는 한, 본 출원에서 다음과 같은 의미를 갖는다.
“효소 용해”란 유기체의 세포벽을 완전히 또는 부분적으로 소화시키는 효소로 세포 또는 세포들을 처리함에 따라 세포 또는 일군의 세포를 파괴 개방시키거나 또는 세포내 성분들 중의 일부 또는 전부를 유리시키는 것을 의미한다.
“세제”란 소수성 영역 또는 소수성 용매 및 세포막의 소수성 부분과 상호작용할 수 있는 기와, 친수성 영역 또는 용액 중에서 양 또는 음의 전하를 가질 수 있거나 또는 전혀 전하를 갖지 않는 극성 영역을 가질 수 있는 기를 갖는 분자 또는 분자군을 의미한다.
“비이온계 세제”란 그의 친수성 영역 또는 기 중에 1개 이상의 하전되지 않은 극성 기 또는 이온을 함유하는 세제를 의미한다.
“이온계 세제”란 그의 친수성 영역 또는 기 중에 1개 이상의 양 또는 음으로 하전된 기 또는 이온을 함유하는 세제를 의미한다.
“금속 킬레이트제” 또는 “킬레이트제”란 금속 이온과 결합하거나, 착화합물을 형성하거나 또는 배위결합하여 용액 중의 금속 이온의 유효 농도를 감소시킬 수 있는 분자 또는 분자군을 의미한다.
“핵산의 유리”는 유리 방법이 핵산 혼성화 분석에 유용하도록 충분한 양의 핵산의 유리를 의미하고자 하는 것이다.
“핵산” 또는 “핵산들”이란 길이가 2개 이상, 바람직하게는 10개 이상의 뉴클레오티드인 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드를 의미한다. 용어 “핵산”은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 및 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 용어 “핵산”은 단일 스트랜드 또는 2중 스트랜드의 폴리뉴클레오티드 또는 이들 둘 모두를 말할 수 있다.
“표적 핵산”이란 검출하고자 하는 표적 핵산 서열을 포함하는 핵산을 의미한다. 바람직하게는 상기 서열은 특정 유기체의 특징이다.
“표적 핵산 서열” 또는 “표적 서열”이란 특이적 핵산 서열 또는 이에 상보적인 핵산 서열을 의미한다.
“표적 유기체”란 본 발명의 방법을 사용하여 동정하고자 하는 임의의 종의 원핵 또는 진핵 유기체 또는 임의의 바이러스를 의미한다. 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 상기유기체는 생물 시료 내에, 예를 들면 소파물(scrapings) 또는 면봉채집물(swabs) 중에 함유된다. 바람직하게는, 유기체는 병원성 미생물이다.
“생물 시료”란 동물, 식물, 세균, 바이러스 또는 원생생물 기원의 물질들을 함유하는 임의의 시험표본 또는 시료를 의미한다. 상기 시료에는 식품 또는 농업용 시료 ; 환경 시료; 체액, 분비물 또는 배출물, 예를 들면 요, 혈액, 우유, 뇌척수액, 객담, 타액, 변, 폐 흡인물, 눈물, 임파액 또는 정액을 함유하는 시료 ; 인후 또는 생식기 면봉채집물 ; 및 세균, 바이러스, 식물 또는 동물 세포 배양물, 현탁액 또는 용해질이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 생물 시료는 리보뉴클레아제를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
“임상 시료”란 질병의 진단 및 치료 목적으로 시험하거나 또는 관찰하기 위해 인체 또는 동물로부터 얻은 생물 시료를 의미한다.
“상보적”이란 핵산 혼성화에 적합한 조건 하에서 한 핵산 스트랜드 영역의 뉴클레오티드 염기와 다른 핵산 스트랜드 영역의 뉴클레오티드 염기 사이에 안정한 수소 결합을 형성시키는 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. 즉, 수소 결합은 가장 일반적으로는 한 스트랜드 상의 아데노신(A) 잔기와 다른 스트랜드 상의 티민(T) 또는 우라실(U) 잔기 사이에, 및 한 스트랜드 상의 구아닌(G) 잔기와 다른 스트랜드상의 시토신(C) 잔기 사이에 형성된다. 상기 상보적 영역은 일반적으로 각 핵산 스트랜드의 약 15 내지 100개의 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다.
“충분히 상보적”이란 핵산 혼성화에 적합한 조건 하에서 2중 스트랜드를 이룬 수소 결합된 영역을 형성할 수 있음을 의미한다. 2개의 핵산 스트랜드가 인접 또는 대응하는 특이적 영역에 대해 100% 상보성을 갖는 경우, 이들 2개의 핵산 스트랜드는 충분히 상보적이지만, 100% 미만의 상보성을 갖는 영역을 갖는 2개의 단일 스트랜드의 핵산이 혼성화 조건 하에서 2중 스트랜드 영역을 형성할 수 있다. 따라서, 100% 상보적이지는 않지만 혼성화 조건 하에서 안정한 2중 스트랜드 영역을 형성할 수 있는 상기 영역을 충분히 상보적인 것으로 간주한다.
“용해”란 핵산을 비롯한 세포내 성분들을 주위 매질로 유리시키는 세포벽 및 (또는) 막의 물리적 파열 또는 파괴를 포함하는 세포 해리를 의미한다.
“투과성화” 또는 “투과성화시키다”란 검출가능한 양의 핵산을 세포로부터 주위 매질로 유리시키는 세포벽 및(또는) 막의 해리를 의미한다.
“투과성화 시약”이란 세포 또는 일군의 세포를 투과성화시킬 수 있는 화학적 또는 물리적 시약, 또는 이들 둘 모두를 의미한다.
“선별 시약”이란 핵산 프로브를 포함하는 혼성화된 2중 스트랜드의 핵산 영역과 혼성화되지 않은 단일 스트랜드의 핵산 및(또는) 핵산 프로브를 화학적으로 또는 물리적으로 구별할 수 있는 방법에 사용되는 시약을 의미한다.
“검출 시약”이란 한 스트랜드가 핵산 프로브인 2중 스트랜드의 핵산 영역을 갖는 핵산을 검출할 수 있는 방법에 사용되는 시약을 의미한다.
“프로브 시약”이란 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 뉴클레이티드 서열을 갖는 핵산 프로브를 함유하는 시약을 의미하는 것으로서, 상기 프로브는 일반적으로 혼성화 분석시에 검출가능한 리포터기를 갖는다.
본 발명의 한 면은 광범위의 미생물이 핵산, 바람직하게는 리보좀 RNA 및(또는) 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DNA를 용액내로 유리시키도록 유도하는 비효소적 방법에 관한 것이다. 한 실시예에서는, 동정하고자 하는 세포를 함유하는 시료를 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제를 함유하는 추출 용액과 혼합시킨다. 현탁액을 약 85 내지 95℃의 온도로 약 5분 내지 15분 동안 가열시킨다. 가열시, 핵산은, 현미경 하에 관찰하였을 때 시료 세포의 세포벽을 관찰가능한 정도로 파괴시키지 않고서 용액 내로 유리된다. 이렇게 유리된 핵산은 추가의 정제 없이도 혼성화, 증폭, 또는 기타 유전 조작에 적합하다.
본 발명은 미생물로부터 핵산을 추출하기 위한 신속하고 저렴하며 온화한 방법을 제공한다. 추출 단계를 수행하는데 효소를 사용하지 않음으로써, 비용, 가변성, 및 핵산의 효소 개재 추출법과 관련된 단점들을 상당히 감소시킨다.
게다가, 본 발명은 투과성화 시약 또는 용해의 일부로서의 카오트로픽제를 필요로 하지 않는다. 카오트로픽제는 일반적으로 매우 높은 농도로 사용되고 비싸다. 이들 고농도 때문에, 진단 키트의 수송 또는 저장 동안에 카오트로프(chaotropes)가 추출 용액으로부터 침전될 수 있다. 핵산을 추출시키는데 사용되는 카오트로프는 후속되는 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 필요한 조건들을 변화시킬 수 있고, PCR 또는 기타 표적 증폭 방법과 같은 효소 개재 반응에서 추출된 핵산과는 완전히 비혼용성일 수 있다. 후자의 경우, 추출된 핵산으로부터 카오트로프를 분리할 필요가 있는데, 이는 전체 프로토콜에 제거 단계를 추가하는 것으로 잘못된 결과를 낳을 가능성을 증가시킨다. 게다가, GuSCN과 같은 카오트로프는 그들의 높은 점도 때문에 피펫을 사용하기 어렵다. 따라서, 임상 시료 중의 핵산을 추출하는 방법에 있어서 카오트로프의 부재는 경제적으로 및 계산상으로 유용하다.
제2면에서는, 분석하고자 하는 미생물을 뉴클레아제, 예를 들면 리보뉴클레아제를 함유할 수 있는 임상 시료 또는 기타 생물 시료로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 분석 미생물로부터 유리된 핵산과 프로브의 혼성화 의해 미생물을 동정하기 위한 임상적 인후 및 생식기 면봉채집 시험표본을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 경우, 전체 면봉채집물을 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제를 함유하는 투과성화 용액과 접촉시키거나 또는 용액 중에 침지시킬 수 있다. 소정의 표적 핵산이 RNA인 경우, 투과성화 시약에는 음이온계 세제, 예를 들면 리튬 라우릴 설페이트 또는 소듐 도데실 설페이트의 추가의 첨가가 수반된다. 음이온계 세제는 임상 시험표본 중에 존재하여 표적 핵산을 분해시키는 뉴클레아제를 불활성화시킬 수 있다. 이어서 투과성화 용액 중의 면봉채집물을 약 5 내지 30분 동안 약 80 내지 95℃로 가열시켜 미생물로부터 핵산을 유리시킬 수 있다.
핵산 추출 단계의 속도 및 온도는 실험 기술자들의 감염성 유기체에의 노출을 감소시킨다. 상기한 80 내지 95℃의 온도에서는, 잠재적으로 간염 및 결핵의 원인제 및 HIV와 같은 병원성 유기체를 비롯한 대다수의 유기체들이 죽게 된다. 추출방법이 신속하고, 세포 현탁액이 시험관에서 시험관으로의 반복하여 이동되지 않고 수행될 수 있기 때문에, 잠재적 노출은 추가로 감소된다.
본 발명의 다른 면은 상기한 추출 방법을 수행하기 위한 시약 및 이어서 특정 미생물이 시료 중에 존재하는 지를 동정하기 위한 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 투과성화 시약, 프로브 시약, 선별 시약 및 검출 시약을 함유한다. 키트는 이온계 세제, 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제를 함유하는 투과성화 용액의 공급, 및 표적 핵산을 검출하고 동정하는데 필요한 시약의 공급을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 동정 및 검출 시약은 표적 미생물의 리보좀 RNA에 특이적인 1개 이상의 핵산 서열에 대해 충분히 상보적인 핵산 프로브 1종 이상을 함유하는 프로브 시약을 포함한다[예를 들면, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한 호간(Hogan) 등의 미합중국 특허 제5,216,143호 및 밀리먼(Milliman)과 하몬드(Hammond)의 미합중국 특허 제5,232,831호 참조]. 특이적 핵산 서열을 인식하여 이들과 결합할 수 있는 유도된 핵산 프로브를 함유하는 프로브 시약(예를 들면 포스포로티오에이트 및(또는) 메틸포스포네이트 연결을 함유하는 것)은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있고, 본 발명의 추출 방법과 함께 키트 중에 사용될 수 있도록 고안된다.
본 발명의 기타 특징, 용도 및 이점은 하기하는 바람직한 실시태양의 설명, 도면 및 특허 청구의 범위로부터 당업계의 통상의 숙련인에게 명백하게 드러날 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 95℃에서 변화시킨 기간 동안 배양시킨 그람 양성 미생물인 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 표적 핵산(리보좀 RNA)의 유리를 정량화하는 실험을 나타내는 그래프이고, 제2도는 첨가된 스트렙토콕쿠스 피오게네스 리보좀 RNA 공지된 양에 대한 혼성화 검출 시스템(HPA ; 하기함)의 감응성을 나타내는 실험을 보여주는 그래프이다.
제3도는 본 발명의 방법에 따라 표적 리보좀 RNA가 유리된 스트렙토콕쿠스 피오게네스 세포의 희석물에 대해 수행한 혼성화 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명에서 청구하는 방법 및 키트는 광범위의 미생물로부터의 핵산의 유리를 유발시키기 위하여, 및 후속되는 표적 미생물, 표적 미생물군 또는 다수의 상이한 표적 미생물에 특이적인 핵산 서열을 검출 및 동정하기 위하여 투과성화 시약을 사용할 뿐만 아니라 상기 방법을 수행하기 위한 장치, 배지 및 약제들의 조합물을 사용하는 것을 특징으로 한다. 각종 단계, 배지 및 시약들은 상기에서 일반적으로 논의하였으므로, 이제는 바람직한 실시태양을 설명하고자 한다. 이들 설명은 단지 설명을 목적으로 제공된 것으로서, 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하려는 것은 아니며, 본 발명은 단지 본 명세서를 결론짓는 특허 청구의 범위에 의해서만 정의되는 것이다.
[소정의 세포로부터 핵산의 추출]
핵산을 추출하고자 하는 표적 미생물은 각종 원(source)으로부터 얻을 수 있다. 분석하려는 세포가 의학 시료 중에 함유되어야 할 필요는 없으며, 당업계의 통상의 숙련인은 시료가 주어진 시스템에 사용되는 특정 검출 수단에 의해 검출되기에 충분한 양의 표적 미생물(및 따라서 표적 핵산)을 함유하는 한 임의의 기원의 시료가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 방법 또는 전사 기재 방법이 검출 단계 전에 사용되는 경우, 원 시료는 따라서 비교적 적은 수의 표적 미생물 또는 표적 핵산을 함유할 수 있다[예를 들면, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한 American Society for Microbiology, Diagnostic Molecular Microbiology : Principles and Applications 56-70(1993) 참조].
생물 또는 생리학적 시료의 경우, 배양물 중에서 성장된 세포 또는 미생물, 혈액, 조직, 타액, 객담, 분변, 척수액 또는 활액, 혈청, 요 또는 기타 체액을 포함하는(하지만 이들에 한정되지는 않음) 모든 타입의 생리학적 시험표본을 사용하여 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 상기 생리학적 시험표본은 인체, 동물 또는 식물원으로부터 얻을 수 있다. 환경 또는 식품 시료도 또한 본 발명의 방법에 따라 이들 시료 중에 존재하는 미생물로부터 핵산을 유리시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명을 임상적 구강 또는 생식기 면봉채집물 중에 함유된 미생물로부터 핵산을 유리시키는데 사용한다.
세포 시료를 얻은 후, 세포 시료를 투과성화 시약과 접촉시키거나 또는 투과성화 시약 중에 넣고 세포로부터 핵산이 유리될 때까지 약 80 내지 95℃로 가열시켰다. 여기서 사용된 투과성화 시약은 예를 들면 식염수 용액, EDTA 용액 또는 비이온계 세제 용액으로 구성될 수 있다. 이들 투과성화 시약들 중 1종과 본 발명의 방법을 사용하여 표적 미생물을 함유하는 시료로부터 핵산(예를 들면, RNA 및 DNA, 바람직하게는 리보좀 RNA 및 리보좀 RNA 서열을 암호하는 DNA)을 추출할 수 있다. 따라서, 각종 투과성화 시약을 사용하여 본 명세서에 기재한 방법에 따라 세포로부터 핵산을 추출할 수 있다.
바람직하게는, 투과성화 시약은 비이온계 세제와 금속 킬레이트제의 조합물을 포함한다. 본 출원인들은 이들 2개의 시약의 조합물이 세포 시료로부터 추출되는 분해되지 않은 핵산의 양을 최적화시킨다는 것을 발견하였다. 비이온계 세제는 용액 중에 용해시켰을 때 하전되지 않은 세제이다. 본 출원인들은 폴리옥시에틸렌 에테르(미합중국 미저리주 세인트 루이스 소재 시그마 캄파니(Sigma Co.)가 상품명 트리톤(Triton) X-100 및 트리톤 X-102로 시판함) 및 옥틸페놀에틸렌 옥사이드 축합물(미합중국 미저리주 세인트 루이스 소재 시그마 캄파티가 상품명 노니뎃(Nonidet) P-40으로 시판함)과 같은 비이온계 세제를 사용하여 본 발명의 핵산 추출방법을 성공적으로 실행하였다. 따라서, 당업계의 숙련인은 각종 비이온계 세제를 사용하여 본 발명의 방법을 실행할 수 있음을 알 것이다.
투과성화 시약에 첨가되는 금속 킬레이트제는 마그네슘, 망간 및 아연과 같은 유리 금속 이온을 킬레이트화시키거나 또는 결합시킨다. 이론으로 성립되길 바라지는 않지만, 유리 금속 이온의 킬레이트화는 소정의 핵산을 분해시킬 수 있는 뉴클레아제와 같은 효소를 억제시키는 것으로 믿어진다. 금속 킬레이트제는 또한 미생물 세포벽의 일부 분자 성분들을 해리시킬 수 있다. 각종의 금속 킬레이트제를 이러한 목적으로 사용할 수 있다. 본 출원인들은 적은 비용 및 편리함 때문에 EDTA를 사용하였다.
바람직하게는, 투과성화 시약은 약 0.01 내지 약 1%의 비이온계 세제 및 약 1mM 내지 약 100mM의 EDTA, 보다 바람직하게는 0.07% 트리톤 X-100 및 10mM EDTA를 함유한다. 트리톤 X-100의 0.07% 농도는 스트렙토콕쿠스 피오게네스로부터 본질적으로 모든 표적 리보좀 RNA를 유리시키는데 충분한 것으로 밝혀졌다. 게다가, 10mM보다 큰 EDTA 농도는 어떠한 추가의 이점을 제공하지 않는 것으로 나타났다.
비록 본 발명의 실행에 필수적이지는 않지만, 투과성화 시약은 투과성화 시약의 pH를 안정화시키기 위하여 약한 완충제, 바람직하게는 HEPES (4-2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄 술폰산)의 유리산을 함유할 수 있다. 투과성화 시약이 제조되어 나중에 사용하기 위해 저장될 경우에는, 저장 기간 동안 바람직하지 못한 미생물의 성장을 막기 위하여 방부제를 투과성화 시약에 첨가할 수도 있다. 바람직하게는, 5.7mM 소듐 아지드를 첨가한다. 소정의 표적 핵산이 RNA인 경우, 용액의 pH는 8.0 이하로 조절되어야 한다. 바람직하게는, 투과성화 시약의 pH를 염기, 즉 수산화리튬을 첨가하여 pH 7.5로 조절한다. 본 명세서에서 기재한 것 이외에 8.0 이하의 pH에서 사용하기 적절한 완충제는 당업계의 통상의 숙련인들에게 공지되어 있다.
세포 시료를 임상 시험표본 또는 시료가 뉴클레아제를 함유할 수 있는 다른 원으로부터 얻은 경우에는, 특히 표적 핵산이 RNA인 경우 음이온계 세제도 또한 투과성화 시약에 첨가해야 한다. 음이온계 세제는 pH 7.0에서 용액 중에 용해시켰을 때 음으로 하전되는 세제이다. 바람직하게는, 투과성화 시약은 이들 환경에서 1%(w/v) 리튬 라우릴 설페이트(LLS)를 함유한다. 이론으로 성립되길 바라는 것은 아니지만, 음이온계 세제는 임상 시험표본 또는 기타 물질에서 발견되는 임의의 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제를 파괴시키거나 또는 변성시키므로, 따라서 시료 중의 핵산의 분해를 막는 것으로 믿어진다. 음이온계 세제는 세포 시료로부터 핵산의 유리를 실행할 필요가 없다. 약 0.01% 내지 약 2%의 리튬 라우릴 설페이트가 바람직하며, 가장 바람직하게는 LLS의 농도는 0.2% 내지 1%이다. 2%보다 큰 리튬 라우릴 설페이트 농도에서는 표적 핵산의 수율이 감소된다.
일단 세포 시료 및 투과성화 시약을 혼합하면, 혼합물은 80 내지 100℃에서 1 내지 30분 동안 가열시켜야 한다. 본 출원인은 80℃ 이상의 다양한 온도가 효과적인 것을 발견하였다. 80℃ 이하에서는 표적 세포(즉, 스트렙토콕쿠스 피오게네스)로부터 핵산의 추출이 완료되지 않는 것으로 나타났다. 유사하게, 혼합물이 승온에서 유지되는 기간이 비교적 짧고, 일반적으로 용해시키기 어렵다고 생각되는 그람 양성 균인 에스. 피오게네스 약 100만개의 세포를 함유하는 시료 300㎕로부터 리보좀 RNA의 추출은 95℃에서 5분 이내에 핵산을 양호한 수율로 생성시켰다. 따라서, 바람직한 실시태양에서 세포 시료/투과성화 시약 혼합물을 약 95℃에서 약 5분 동안 가열시킨다.
[실시예 1]
[에스. 피오게네스의 효소 용해법과 본 발명의 방법의 비교]
제1도는 각종의 투과성화 프로토콜을 행하여 제조된 스트렙토콕쿠스 피오게네스 세포 제제의 혼성화 속도를 비교하여 나타낸다. 이 실험에서는 하기하는 방법을 사용하였지만, 당업계의 통상의 숙련인은 본 명세서를 읽고난 후 혼성화 프로토콜 및 검출 단계를 여러가지로 변형시킬 수 있고, 본 명세서에 기재한 특정 혼성화 및 검출 방법은 단지 설명하기 위한 것이다.
투과성화 시약(7.4mM HEPES pH 7.5, 0.07%(v/v) 트리톤 X-100, 10mM 디소듐 EDTA 및 5.7mM 소듐 아지드) 1800㎕를 피펫을 사용하여 시험관에 넣었다. 혈액 아가 상에서 18시간 동안 성장시킨 스트렙토콕쿠스 피오게네스 세포를 식염수 용액 중에서 한 번 세척시킨 다음 투과성화 시약 1㎖ 당 3.0×108세포로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액 200㎕를 투과성화 시약 1800㎕를 함유하는 시험관 내로 희석시키고, 현탁액을 95℃에서 가열시키고, 5, 10, 15 및 30분에 시료로부터 분취액 300㎕를 취하여 얼음 상에 두었다.
이 실험에서 혼성화에 사용된 시험관은 동결건조시킨 프로브 시약 중의 스트렙토콕쿠스 피오게네스에 특이성을 갖는 표지시킨 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하였고, 이들 시험관 및 모든 후속 시약들은 달리 언급하지 않는 한, 약쿠프로브(AccuProbe) 그룹 A 스트렙토콕쿠스 배양물 동정 시험 키트(미합중국 캘리포니아주 산 디에고 소재 젠-프로브 인크(Gen-Probe, Inc.) 제품)으로부터 얻었다[예를 들면, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한 AccuProbe package insert, 밀리먼(Milliman) 등의 미합중국 특허 제5,232,831호 ; 및 아놀드(Arnold) 등의 미합중국 특허 제 4,950,613호 참조]. 동결건조시킨 시약이 용해 효소를 함유하기 때문에, 2% LLS(악쿠프로브 시약 2)를 함유하는 용액 50㎕를 각 시험관 내로 혼합시켜 동결건조된 효소를 변성시키고, 대조용 시험관에는 투과성화 완충제 중의 세포 현탁액 50㎕를 넣고, 37℃에서 5분 동안 배양시켜 효소 용해가 일어나도록 한 다음 악쿠프로브 시약 2로 100㎕로 만들었다. 시험관들을 각 시점에서 4배수로 제조하였다. 이어서 나머지 시험관들에 가열 처리한 세포 현탁액 50㎕를 넣었다(다른 대조용 현탁액에도 시험관과 동일한 시약을 제공하지만, 가열 처리 단계 동안 실온에 두었고, 이것을 “세제만” 대조용이라 칭하였다).
시험관을 60℃에서 배양시켜 혼성화를 촉진시켰다. 각 시점에서 취한 2개의 시험관을 5분 동안 배양시키고, 각 시점의 나머지 쌍의 시험관을 30분 동안 배양시켰다. 혼성화 양, 및 따라서 세포로부터 유리된 검출가능한 표적 핵산의 양을 HPA로 측정하였다(예를 들면, 상기한 아놀드 등의 문헌 참조). 시약 3(선별 시약) 300㎕를 각 시험관에 첨가하고, 시험관들을 혼합하고 60℃에서 5분 동안 추가로 배양시켰다. 혼성화된 프로브의 화학발광을 리더(Leader) Ⅰ 광도계(미합중국 캘리포니아주 산 디에고 소재 젠-프로브 인크 제품)로 측정하였다. 분석 시료의 화학발광을 상대광 단위(RLU)로 나타냈으며, 선택된 리보핵산과 혼성화된 프로브의 양에 정비례하였다.
제1도의 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, 5분 동안 가열시킨 세포 시료 혼합물이 30분 동안 가열시킨 세포 시료 혼합물과 동일한 시그널을 가졌기 때문에 투과성화 완충제로 처리한 에스. 피오게네스 세포 시료로부터의 표적 핵산의 추출은 본질적으로 5분만에 완료되었다. 놀랍게도, 투과성화 시약과 함께 배양시킨 세포로부터 유리된 표적 핵산과의 혼성화 정도는 비록 5분 정도의 짧은 시간 동안에서도 효소 처리된 세포로부터 유리된 표적 핵산이 나타내는 정도의 2배이었다. 이 결과는 전혀 에상하지 못한 것이었고, 효소 용해 단계를 갖는 경우보다 적은 비용으로 보다 큰 분석 감응성을 나타냄으로써 명백하게 본 발명의 유용성을 추가하였다.
[실시예 2]
[유리된 RNA 양의 평가]
본 출원인은 상기한 바람직한 방법을 사용하여 거의 모든 세포 리보좀 RNA를 추출 과정 동안에 세포로부터 유리시킬 수 있다고 믿는다. 본 발명의 방법에 의해 투과성화된 세포가 유리시키는 총 세포 리보좀 RNA의 %를 측정하기 위하여, 본 출원인들은 (a) 공지된 농도의 에스. 피오게네스 리보좀 RNA 용액의 희석액 및 (b) 본 발명의 방법에 따라 핵산을 추출하였고, 실시예 1에서와 같이 혼성화를 행한 공지된, 농도의 에스. 피오게네스 세포로부터의 희석액에 대하여 하기하는 혼성화 보호 분석(HPA)을 수행하였다. 제2도는 공지된 양의 리보좀 RNA의 희석액에 대해 수행한 HPA의 결과를 나타내는 그래프이다. 보여지는 바와 같이, 혼성화 생성물의 화학발광은 시료 중의 리보좀 RNA의 양에 비례하게 증가하였다. 유사하게, 제3도는 핵산을 제1도에서와 같이 추출한 에스. 피오게네스 세포 상에서 수행한 HPA의 결과를 나타내는 그래프이다. 각 시료의 화학발광은 시료 중의 세포수와 비례하게 증가한다.
각 세포로부터 유리된 리보좀 RNA의 대략적인 양을 제1도와 제2도로부터의 결과들을 비교하여 계산할 수 있다. 제2도를 살펴 보면, 첨가된 에스. 피오게네스 리보좀 RNA 0.25ng은 약 15,000RLU´s에 대응하였다. 제3도를 살펴보면, 15,000RUL´s는 약 7300개의 세포에 해당한다. 0.25를 7300으로 나누어 세포 당 검출된 리보좀 RNA의 양을 구하였더니, 0.000034ng이었다. 이 수치는 다른 근사치의 실험적 오차 내에 속하는 것으로서, 즉 세균 세포 중에 함유된 리보좀 RNA의 총량은 약 0.00002ng이었다[Handbook of Biochemistry and Biophysics(CRC Press 1992)참조]. 따라서, 전부는 아니더라도 많은 %의 에스. 피오게네스 리보좀 RNA가 본 발명의 투과성화 방법을 사용하여 추출된다고 결론내릴 수 있다.
[실시예 3]
[DNA 및 RNA 모두를 유리시키는 본 발명의 방법의 효과]
본 발명의 방법은 세포가 DNA 및 RNA를 모두 유리시키도록 한다는 것을 입증하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 에스. 피오게네스, 에세리히아 콜리, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 스트렙토콕쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)의 배양물을 혈액 아가 상에서 18시간 동안 성장시켰다. 각 유기체의 3개의 백금이량 10㎕를 멸균 식염수 용액 10ml 중에 현탁시킨 다음 2000×g에서 7분 동안 원심분리시켰다. 상징액을 경사제거하고, 각 유기체의 12개의 백금이량 1㎕를 실시예 1에 기재한 투과성화 시약 12ml에 첨가하였다. 또한, 동일 시약 중에서 각 시험관의 10배 희석액을 제조하였다. 각 현탁액 300㎕를 3개의 별도의 시험관 각각에 제공하였다. 각 세트의 제1 및 제2 시험관을 추가로 처리하기 전에 95℃에서 10분 동안 가열시켰다. 각 세트의 제3 시험관을 실온에 10분 동안 정치시켰다.
세포를 10,000×g에서 5분 동안 원심분리시키고, 상징액을 깨끗한 시험관으로 이동시켰다. 각 세트의 경우, 제1 시험관에 멸균 식염수 용액 15㎕를 넣은 다음 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 각 세트의 제2 및 제3 시험관에 RNA를 가수분해시키기 위해 4N NaOH 25㎕를 제공하여 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다.
3시간 종반에 제2 및 제3 시험관에 1N HCl 70.5㎕를 넣어 pH를 7.0으로 하였다. 한 시험관에는 식염수 용액 70.5㎕를 넣었다. 모든 시험관들을 95℃에서 5분 동안 가열시켜 2중 스트랜드 DNA를 변성시킨 다음 즉시 얼음 상에서 급냉시켰다.
한 개의 아크리디늄 에스테르 표지시킨 프로브를 사용한 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1과 같이 혼성화 및 분석을 행하였다. 이 프로브는 모든 세균 및 모든 진균에게 통상적인 서열에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 프로브 50㎕를 각 시료 50㎕에 첨가하고, 60℃에서 30분 동안 혼성화를 행하였다. 이어서 시료를 하기하고, 상기한 아놀드 등의 문헌에 기재되어 있는 HPA(혼성화 보호 분석) 방법에서와 같이 처리하였다.
실험 결과를 하기 표 1에서 나타냈다. 데이타는 강 염기에 내성인 핵산(즉, DNA)가 본 발명의 방식으로 처리한 세포로부터 유리되었음을 보여준다. 게다가, 유리된 DNA 집단은 핵산 혼성화에 의해 검출가능한 특이적 서열을 갖는다.
[표 1]
[실시예 4]
[광범위의 미생물로부터 핵산을 유리시키는데 있어서의 본 방법의 적합성]
광범위의 미생물로부터 표적 핵산을 추출하는 본 발명의 방법의 효과를 알아보기 위하여, 실시예 1에 기재한 투과성화 시약을 사용하여 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모를 포함하는 미생물들을 동일한 농도로 함유하는 시료들을 처리하였다. 이 실험에 사용한 모든 세균/모든 효모 프로브는 세균 및 진균에 관하여 비특이적이었다. 즉, 프로브는 상기한 혼성화 조건 하에서 각 미생물로부터 유리된 리보좀 RNA를 혼성화시킬 정도로 모든 세균 및 진균에 통상적인 리보좀 RNA 서열에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 음의 대조용으로서, 동일 유기체를 핵산 추출 단계 후에 제2의 프로브를 유리된 핵산에 첨가하는 것을 제외하고는, 본 발명의 방법에 따라 처리하였다. 제2 프로브는 제1 프로브와 동일한 농도로 혼성화 혼합물 중에 존재하였고, 그룹 A 스트렙토콕쿠스종의 리보좀 RNA에만 함유되어 있는 특이적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 양의 결과(즉, 혼성화된 프로브의 검출)를 상기한 HPA 검출 방법에서 1,000,000 RLU보다 큰 값으로 정의하고, 음의 결과를 1,000,000RLU 이하의 값으로 정의하였다.
제4도는 모두 실시예 1에 따라 처리한 미생물 패널을 열거하고, 분석 결과를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 에스. 피오게네스를 제외한 모든 분석 미생물은 대조용 실험에서 음으로 시험되었다. 어떤 경우에서도, 분석 미생물에 대한 음의 결과가 HPA 검출 분석에서의 3000RLU보다 큰 경우는 없었다. 대조적으로, 본 발명의 방법에 따라 투과성화된 모든 시험 미생물은 모든 세균/모든 효모 HPA 검출방법에 의해 명백히 양의 값을 나타내도록 충분한 양의 리보좀 RNA 표적 핵산을 유리시켰다. 시험 미생물이 효모 및 그람 양성균 뿐만 아니라 각종 속의 그람 음성균을 포함한다는 사실은 이종의 미생물 집단을 함유하는 시료에 대한 본 발명의 방법의 광범위의 적용성, 및 본 명세서에서 기재한 투과성화 시약을 광범위의 미생물의 검출 및 동정에의 응용성을 갖는 속의 핵산 추출제로서 사용하는 것의 효과를 입증한다.
[실시예 5]
[세포벽이 물리적으로 파괴되지 않음의 측정]
일단 핵산이 상기 시료로부터 유리되면, 세포벽이 물리적으로 파괴되었는지 여부를 측정하기 위해 세포 시료를 관찰하였다. 상 콘트라스트 현미경검사법 및 그람 염색법을 비롯하여 세포벽의 일체성을 관찰하는 많은 방법들이 있으며, 이들은 문헌[American Society for Microbiology, Manual of Methods for General Bacteriology 8-9 & 26-27(1981)]에 기재되어 있다. 이에 따라 이 문헌의 표시부는 본 명세서의 한 부분인 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 방법은 처리된 세포에 대해 매우 온화한 방법으로 나타났다. 예를 들면 핵산 증폭, 핵분해성 절단 또는 기타 효소 개재 반응을 포함하는 것과 같은, 분자 생물학의 기술을 포함하는 몇몇 용도의 경우, 미생물의 세포벽이 상당하게 파괴되지 않는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 비핵산 세포 성분은 추출된 핵산의 후속 조작을 방해할 수 있다. 그람 염색법을 사용하여, 통상적으로 그람 양성인 미생물의 세포벽이 물리적으로 파괴되었는지를 석명할 수 있다.
바람직하게는, 본 출원인은 문헌[상기한 문헌 Manual of Methods for General Bacteriology 27-28]에 기재되어 있는 바와 같이 그람 염색을 수행하였다. 그람 염색에 이어 염색된 세포를 현미경 관찰하면, 본 발명의 방법에 의해 투과성화된 후에 조차도 계속해서 보라색으로 염색되어 있고 그들의 특징적인 형태를 유지하는 그람 양성 세포가 생성되었다. 이 결과는 처리된 세균이 물리적으로 완전히 파괴되지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, 효소 처리된 그람 양성 세포는 적색 또는 황색으로 염색되어 그들의 세포벽이 파괴되었음을 나타낸다.
[실시예 6]
[원하는 핵산의 검출 및 측정]
일단 핵산이 시험표본으로부터 유리되면, 핵산 혼성화 및 검출 기술을 사용하여 표적 핵산(들)을 검출하고 측정하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산은 검출하고자 하는 미생물의 표적 서열에 충분히 상보적인 핵산 프로브를 사용하여 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화시키고, 사던 블롯(Southern blots)[마니아티스(Maniatis, T.) 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 참조]과 같은 당업계에 공지되어 있는 방법으로 또는 아놀드 등의 문헌[Clin. Chem., 35 : 1588(1989)] 및 PCT U.S. 88/02746에 기재되어 있는 균질 용액상 방법(혼성화 보호 분석 또는 “HPA”라 불림)에 의해 프로브와 표적 핵산의 2중 스트랜드 하이브리드를 검출함으로써 동정할 수 있다(상기한 문헌들은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다).
아놀드가 설명한 HPA 방법은 아크리디늄 에스테르 양의 선별적 화학 분해에 기초하여 차별적으로 가수분해될 수 있는 아크리디늄-에스테르 표지시킨 DNA 프로브를 합성하는 것으로 구성된다. 선별적 화학 분해는 프로브가 혼성화된 상태에 있는지 또는 혼성화되지 않은 상태에 있는지에 의해 측정된다. 프로브가 핵산 이중 나선구조의 상호작용에 의해 혼성화된 상태에 있을 때 아크리디늄-에스테르 표지를 가수분해로부터 보호시킨다. 혼성화되지 않은 프로브는 그의 아크리디늄-에스테르 표지가 가수분해로부터 보호되지 않은 상태로 있게 된다. 따라서, 혼성화되지 않은 프로브와 관련된 아크리디늄-에스테르 표지의 화학발광은 차별적 가수분해에 의해 급속하게 손실되는 반면, 혼성화된 프로브와 관련된 아크리디늄-에스테르 표지의 화학발광은 최소한의 영향을 받는다. 화학발광은 리더 Ⅰ 광도계(미합중국 캘리포니아 주 산 디에고 소재 젠-프로브 인크. 제품)와 같은 장치를 사용하여 측정할 수 있다.
비록 본 발명의 실행에 필수적이진 않지만, 본 출원인들의 바람직한 HPA법 실행 방법을 기재한다.
[시약]
아크리디늄-에스테르 표지 시약을 문헌[본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한 윅스(Weeks. I.) 등, Acridinium Esters are High-Specific-Activity Labels in an Immunoassay, 29 Clin. Chem., 1474-1479(1983)]에 기재된 바와 같이 합성하였다. 분석 및 화학발광 측정용 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 시험관(12×75㎜)을 미합중국 노쓰 캐롤라이나주 뉴톤 소재 사르스테트(Sarstedt)로부터 구입하였다. 화학발광을 리더 Ⅰ 광도계 중에서 측정하였다. 다른 모든 물질들은 표준 “초순도” 또는 시약 등급의 물질이다.
[방법]
[아크리디늄-에스테르 표지된 DNA 프로브의 제조]
표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 아크리디늄 에스테르를 사용한 DNA 프로브의 화학적 표지화는 DNA 합성 동안에 도입되는 알킬아민 링커-아암 및 메틸 아크리디늄 페닐 에스테르의 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 반응시켜 수행한다. 일단 아크리디늄-에스테르 표지된 프로브를 정제하여 각종 분석 포맷에 사용하면, 프로브 화학발광을 하기하는 바와 같이 리더 Ⅰ 광도계로 검출한다.
[혼성화 보호 분석(HPA)]
혼성화 반응은 통상적으로는 60℃에서 리터 당 리튬 라우릴 설페이트 1%(w/v), 2mM EDTA 및 2mM[에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]테트라아세트산(EGTA)를 함유하는 pH 5.2의 0.1M 리튬 숙시네이트 완충제 중에서 수행한다. 혼성화 부피는 50 내지 200 리터이고, 0.05 내지 0.5pmol의 프로브를 함유한다. 차별적 가수분해를 7.0 내지 8.5의 pH값에서 리터 당 트리톤 X-100 계면활성제 10 내지 50mL를 함유하는 사붕산나트륨 완충제(0.15 내지 0.20M) 중에서 60℃에서 수행한다.
대표적인 HPA 포맷에서는, 표적 핵산을 함유하는 시료를 60℃에서 5 내지 10분 동안 배양시켜 100리터 부피로 DNA 프로브와 혼성화시켰다. 이어서 테트라보레이트 완충제 용액 300리터를 첨가하고, 60℃에서 추가로 5 내지 10분 동안 배양시켰다. 시료를 실온에서 수 분 동안 냉각시킨 후, 2개의 자동화 시약 주입 방법 중의 하나를 사용하여 광도계로 화학발광을 측정하였다. 방법 1에서는, 0.1%(v/v) H2O2및 1mM 질산을 함유하는 용액 200리터를 주입한 후 1초 후에 1 내지 2M NaOH 200리터를 주입하여 생성된 화학발광을 2 내지 5초 동안 합하였다. 방법 2에서는, 1 내지 2M NaOH를 함유하는 0.1%(v/v) H2O2용액 200리터를 주입하고 생성된 화학발광을 2 내지 5초 동안 합하였다. 혼성화 및 차별적 가수분해를 비롯한, 이 방법의 모든 단계들을 한 개의 12×75㎜ 시험관 중에서 수행한다.
HPA와 같은 프로브 검출 방법을 사용함으로써, 표적 핵산의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 아크리디늄-에스테르-표지된 DNA 프로브 분석은 신속하고, 감응성이고, 사용하기 쉽고, 혼성화되지 않은 프로브가 야기시키는 백그라운드가 충분히 낮으므로, HPA는 임상 실험에 유용하다. 또한, 특히 표적 서열의 한 개의 복제물을 갖는 DNA 분자를 검출하는 시험에 대해 감응성이 최대 2×104까지 향상되는, 리보좀 RNA의 검출과 커플링되었을 때, HPA 포맷의 감응성은 이 방법을 임상 실험에 실제 사용할 수 있게 한다.
[본 발명을 실행하기 위한 키트]
상기한 방법을 수행하기 위한 키트는 쉽게 구할 수 있는 물질 및 시약으로부터 제조할 수 있다. 키트는 투과성화 시약, 프로브 시약 및 선별 시약을 포함하게 된다. 본 출원인들의 바람직한 실시태양으로부터 명백하게 드러나는 바와 같이, 이 키트는 단지 프로브 시약 중의 핵산 프로브가 소정의 용도에 특이적인 핵산 프로브이도록 선택함으로써, 질병, 상태 또는 유기체, 예를 들면 미생물을 나타내는 임의의 핵산 서열을 검출하도록 변형시킬 수 있다.
출원인의 바람직한 실시태양은 스트렙토콕쿠스 피오게네스 시험에 관한 키트이다. 바람직하게는, 시료는 멸균 면봉채취법으로 환자의 인후로부터 얻었다. 인후 면봉채취물 전체를 폴리프로필렌 시험관 중의 투과성화 시약 300㎕에 넣었다. 본 출원인의 투과성화 시약은 모두 쉽게 구입할 수 있는 물질들로부터 제조하고, 5.7mM 소듐 아지드, 7.4mM HEPES(유리산), 0.07%(v/v) 트리톤 X-100, 1%(w/v) 리튬 라우릴 설페이트, 10mM EDTA(유리산), 및 투과성화 시약을 pH 7.5로 조절하기에 충분한 수산화리튬으로 구성된다. 약 30초 이상 동안 약 95℃로 가열시켰을 때, 투과성화 시약은 인후 면봉채집물 시료 중의 스트렙토콕쿠스 피오게네스 세포로부터 핵산을 유리시킨다. 각종 농도 및 시약이 본 발명의 성공적인 실행을 가능하게 하므로 특정 농도 및 시약이 출원인의 발명을 제한하는 것으로 간주해서는 안된다. 본 명세서는 적절한 농도, 시약 및 조건의 선택에 대한 안내를 제공하고, 전적으로 본 명세서 뒤의 특허 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 실시태양의 특정 실시예를 제공한다.
이어서 혼합물을 95℃에서 10분 동안 가열 블록 상에 위치시킨다. 가열 후, 시험관을 실온에서 5분 동안 냉각시킨다. 냉각 기간 동안 면봉채집물을 깨끗한 폴리프로필렌 관 쪽으로 압착시킨다. 냉각 후, 유체 50㎕를 깨끗한 폴리프로필렌 시험관으로 제거시킨다. 이어서, 프로브 시약 50㎕를 시료 유체 50㎕에 첨가하였다. 바람직하게는, 프로브 시약은 리튬 라우릴 설페이트 1%(w/v), 2mM EDTA 및 2mM EGTA 및 스트렙토콕쿠스 피오게네스의 리보좀 RNA 영역에 특이적 데옥시리보핵산 0.05pmol를 함유하는 pH 5.2의 0.1M 리튬 숙시네이트 완충제를 함유한다.
이어서, 프로브 시약을 60℃에서 30분 동안 배양시켜 아크리디늄-에스테르 표지된 프로브가, 추출 단계에 의해 용액 내로 유리된 스트렙토콕쿠스 피오게네스 리보좀 RNA와 혼성화되도록 한다. 배양 후, 선별 시약 300㎕를 첨가한다. 바람직하게는, 선별 시약은 0.1%(w/v) 트리톤 X-100을 함유하는 0.15M 사붕산나트륨 완충제 pH 7.5이다.
생성된 용액을 보르텍스 믹서를 사용하여 철저하게 혼합시키고, 60℃에서 7분동안 배양시켜 아크리디늄-에스테르 표지의 차별적 가수분해를 일으켰다. 최종 배양 후, 혼성화된 프로브 존재에 대해 분석하기 전에 프로브 시험관을 실온에서 5분 이상 냉각시켰다. 화학발광을 광도계로 측정하여 눈금을 읽어 시료 중에 스트렙토콕쿠스 피오게네스가 존재하는지 여부를 구한다.
비록 핵산 추출 및 검출 방법을 구체적으로 기재하였지만, 다른 시약, 농도 및 온도를 본 발명을 벗어나지 않고서 사용할 수 있다는 것을 이해해야 하며, 이러한 다른 시약, 농도 및 온도의 사용이 본 발명을 읽고난 후의 당업계의 통상의 숙련인에게 명백한 것임을 이해해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 따라 유리된 핵산은 이어서 선택 및 검출 단계 전에 핵산 증폭 단계를 거칠 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발며의 본질 또는 필수적 특징을 벗어남이 없이 다른 구체적 형태로 실시되거나, 제조되거나 또는 이용될 수 있다. 따라서 본 실시태양은 모든 면에서 예시적인 것이지 제한적인 것이 아니다. 본 발명의 영역은 상기한 명세서에 의하기보다는 특허 청구의 범위에 의해 나타난다. 특허 청구의 범위의 등가물의 범위 및 의미 내에 속하는 모든 변화는 본 명세서에 포함된다.

Claims (26)

  1. (a) 비이온계 세제, 음이온계 세제 및 금속 킬레이트제로 필수적으로 구성되는 투과성화 시약을 시료에 제공하는 단계 ; (b) 상기 시료 중에 존재하는 광범위의 미생물로부터 세포가 투과성화되어 추가의 정제 없이 핵산 혼성화에 적합한 핵산을 유리시키도록 상기 시료를 약 80℃ 내지 100℃로 가열하는 단계 ; (c) 엄격한 혼성화 조건하에서 각 올리고뉴클레오티드 프로브가 1개 이상의 상기 세포로부터 유리된 표적 핵산과 검출가능한 하이브리드를 형성할 수 있도록 상기 조건하에서 상기 시료에 1개 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 단계 ; 및 (d) 상기 시료 중에 존재하는 상기 광범위의 미생물로부터 1종 이상의 미생물을 동정하는 지표로서 상기 1개 이상의 하이브리드의 존재를 검출하는 단계를 포함하고, 라이소자임 또는 카오트로프(chaotropes)의 부재하에 수행되며, 상기 세포를 투과성화하는데 전단력 또는 기계적 힘을 사용하지 않는, 시료 중의 광범위의 미생물을 동정하는 방법.
  2. 제1항에서 있어서, 상기 1종 이상의 미생물이 아신토박터(Acintobacter)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 에어로콕쿠스(Aerococcus)속, 에어로모나스(Aeromonas)속, 알클라이게네스(Alclaigenes)속, 바실러스(Bacillus)속, 박테리오데스(Bacteriodes)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 브라나멜라(Branhamella)속, 브레비박테륨(Brevibacterium)속, 캄필로박터(Campylobacter)속, 칸디다(Candida)속, 카프노시토파지아(Capnocytophagia)속, 크로모박테륨(Chromobacterium)속, 클로스트리듐(Clostridium)속, 코리네박테륨(Corynebacterium)속, 크립토콕쿠스(Cryptococcus)속, 다이노콕쿠스(Deinococcus)속, 엔테로콕쿠스(Enterococcus)속, 에리시엘로트릭스(Erysielothrix)속, 에세리히아(Escherichia)속, 플라보박테리륨(Flavobacterium)속, 게멜라(Gemella)속, 해모필러스(Haemophilus)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 락토콕쿠스(Lactococcus)속, 레지오넬라(Legionella)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 리스테리아(Listeria)속, 마이크로콕쿠스(Micrococcus)속, 미코박테륨(Mycobacterium)속, 나이세리아(Neisseria)속, 노카르디아(Nocardia)속, 오에르스코비아(Oerskovia)속, 파라콕쿠스(Paracoccus)속, 페디오콕쿠스(Pediococcus)속, 펩토스트렙토콕쿠스(Peptostreptococcus)속, 프로피오니박테륨(Propionibacterium)속, 프로테우스(Proteus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 라넬라(Rahnella)속, 로도콕쿠스(Rhodococcus)속, 로도스피릴륨(Rhodospirillium)속, 스타필로콕쿠스(Staphlococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 스트렙토콕쿠스(Streptococcus)속, 비브리오(Vibrio)속 및 예르시니아(Yersinia)속으로 이루어진 군에 속하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 음이온계 세제가 2%(w/v) 이하의 농도로 상기 투과성화 시약 중에 존재하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 1종 이상의 미생물이 아신토박터속, 악티노마이세스속, 에어로콕쿠스속, 에어로모나스속, 알클라이게네스속, 바실러스속, 박테리오데스속, 보르데텔라속, 브라나멜라속, 브레비박테륨속, 캄필로박터속, 칸디다속, 카프노시토파지아속, 크로모박테륨속, 클로스트리듐속, 코리네박테륨속, 크립토콕쿠스속, 다이노콕쿠스속, 엔테로콕쿠스속, 에리시엘로트릭스속, 에세리히아속, 플라보박테리륨속, 게멜라속, 해모필러스속, 클렙시엘라속, 락토바실러스속, 락토콕쿠스속, 레지오넬라속, 류코노스톡속, 리스테리아속, 마이크로콕쿠스속, 미코박테륨속, 나이세리아속, 노카르디아속, 오에르스코비아속, 파라콕쿠스속, 페디오콕쿠스속, 펩토스트렙토콕쿠스속, 프로피오니박테륨속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 라넬라속, 로도콕쿠스속, 로도스피릴륨속, 스타필로콕쿠스속, 스트렙토마이세스속, 스트렙토콕쿠스속, 비브리오속 및 예르시니아속으로 이루어진 군에 속하는 방법.
  5. (a) 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제로 필수적으로 구성되는 투과성화 시약과 미생물을 접촉시키는 단계 ; 및 (b) 상기 미생물로부터 세포가 투과성화되어 추가의 정제 없이 핵산 혼성화에 적합한 핵산을 유리시키도록 상기 미생물 및 투과성화 시약을 함께 약 80℃ 내지 100℃로 가열하는 단계를 포함하고, 라이소자임 또는 카오트로프의 부재하에 수행되며, 상기 세포를 투과성화하는데 전단력 또는 기계적 힘을 사용하지 않는, 1개 이상의 미생물에 속하는 세포로부터 핵산을 유리하는 방법.
  6. (a) 농도 2%(w/v) 이하의 음이온계 세제, 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제로 필수적으로 구성되는 투과성화 시약과 미생물을 접촉시키는 단계 ; 및 (b) 상기 미생물로부터 세포가 투과성화되어 추가의 정제 없이 핵산 혼성화에 적합한 핵산을 유리시키도록 상기 미생물 및 투과성화 시약을 함께 약 80℃ 내지 100℃로 가열하는 단계를 포함하고, 라이소자임 또는 카오트로프의 부재하에 수행되며, 상기 세포를 투과성화하는데 전단력 또는 기계적 힘을 사용하지 않는, 1개 이상의 미생물에 속하는 세포로 부터 핵산을 유리하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 미생물이 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물이 아신토박터속, 악티노마이세스속, 에어로콕쿠스속, 에어로모나스속, 알클라이게네스속, 바실러스속, 박테리오데스속, 보르데텔라속, 브라나멜라속, 브레비박테륨속, 캄필로박터속, 칸디다속, 카프노시토파지아속, 크로모박테륨속, 클로스트리듐속, 코리네박테륨속, 크립토콕쿠스속, 다이노콕쿠스속, 엔테로콕쿠스속, 에리시엘로트릭스속, 에세리히아속, 플라보박테리륨속, 게멜라속, 해모필러스속, 클렙시엘라속, 락토바실러스속, 락토콕쿠스속, 레지오넬라속, 류코노스톡속, 리스테리아속, 마이크로콕쿠스속, 미코박테륨속, 나이세리아속, 노카르디아속, 오에르스코비아속, 파라콕쿠스속, 페디오콕쿠스속, 펩토스트렙토콕쿠스속, 프로피오니박테륨속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 라넬라속, 로도콕쿠스속, 로도스피릴륨속, 스타필로콕쿠스속, 스트렙토마이세스속, 스트렙토콕쿠스속, 비브리오속 및 예르시니아소긍로 이루어진 군에 속하는 방법.
  9. (a) 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제로 필수적으로 구성되는 투과성화 시약을 시료에 제공하는 단계 ; (b) 유기체로부터 세포가 투과성화되어 추가의 정제 없이 핵산 혼성화에 적합한 핵산을 유리시키도록 상기 시료를 약 80℃ 내지 100℃로 가열하는 단계 ; 및 (c) 상기 시료 중에 상기 유기체의 존재 또는 부존재의 표지로서 상기 세포로부터 유리된 표적 핵산의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하고, 라이소자임 또는 카오트로프의 부재하에 수행되며, 상기 세포를 투과성화하는데 전단력 또는 기계적 힘을 사용하지 않는, 시료 중의 유기체의 존재를 검출하는 방법.
  10. (a) 농도 2%(w/v) 이하의 음이온계 세제, 비이온계 세제 및 금속 킬레이트제로 필수적으로 구성되는 투과성화 시약을 시료에 제공하는 단계 ; (b) 유기체로부터 세포가 투과성화되어 추가의 정제 없이 핵산 혼성화에 적합한 핵산을 유리시키도록 시료를 약 80℃ 내지 100℃로 가열하는 단계 ; 및 (c) 상기 시료 중에 상기 유기체의 존재 또는 부존재의 표지로서 상기 세포로부터 유리된 표적 핵산의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하고, 라이소자임 또는 카오트로프의 부재하에 수행되며, 상기 세포를 투과성화하는데 전단력 또는 기계적 힘을 사용하지 않는, 시료 중의 유기체의 존재를 검출하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 미생물이 아신토박터속, 악티노마이세스속, 에어로콕쿠스속, 에어로모나스속, 알클라이게네스속, 바실러스속, 박테리오데스속, 보르데텔라속, 브라나멜라속, 브레비박테륨속, 캄필로박터속, 칸디다속, 카프노시토파지아속, 크로모박테륨속, 클로스트리듐속, 코리네박테륨속, 크립토콕쿠스속, 다이노콕쿠스속, 엔테로콕쿠스속, 에리시엘로트릭스속, 에세리히아속, 플라보박테리륨속, 게멜라속, 해모필러스속, 클렙시엘라속, 락토바실러스속, 락토콕쿠스속, 레지오넬라속, 류코노스톡속, 리스테리아속, 마이크로콕쿠스속, 미코박테륨속, 나이세리아속, 노카르디아속, 오에르스코비아속, 파라콕쿠스속, 페디오콕쿠스속, 펩토스트렙토콕쿠스속, 프로피오니박테륨속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 라넬라속, 로도콕쿠스속, 로도스피릴륨속, 스타필로콕쿠스속, 스트렙토마이세스속, 스트렙토콕쿠스속, 비브리오속 및 예르시니아속으로 이루어진 군에 속하는 방법.
  12. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 대다수 세포의 세포벽이 파열되지 않는 방법.
  13. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 가열하는 단계가 1 내지 30분 동안 수행되는 방법.
  14. 제1항, 제3항, 제6항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 세제의 농도가 0.2% 내지 1%(w/v)인 방법.
  15. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 라이보좀 RNA를 포함하는 방법.
  16. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 세제가 폴리옥시에틸렌 알콜 및 옥틸페놀에틸렌 옥사이드 축합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 세제의 농도가 0.01% 내지 1%(w/v)인 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 비이온성 세제의 농도가 0.01% 내지 1%(w/v)인 방법.
  19. 제1항, 제3항, 제6항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 세제가 수용성 라우릴 설페이트 염인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 음이온성 세제가 소듐 도데실 설페이트 및 리튬 라우릴 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제1항, 제3항, 제6항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 세제의 농도가 0.05% 내지 2%(w/v)인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 음이온성 세제의 농도가 0.05% 내지 2%(w/v)인 방법.
  23. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 킬레이트제가 EDTA인 방법.
  24. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 킬레이트제의 농도가 10mM인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 금속 킬레이트제의 농도가 10mM인 방법.
  26. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 임의의 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 세제가 0.01% 내지 1%(w/v) 농도의 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸페놀이고, 상기 음이온성 세제가 0.05% 내지 2%(w/v) 농도의 리튬 라우릴 설페이트이고, 상기 금속 킬레이트제가 5 내지 50mM 농도의 EDTA인 방법.
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