JPWO2019039179A1 - エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット - Google Patents

Abstract

エクソソームを含む試料から簡便にエクソソームを単離するための手段を提供する。本発明は、担体に担持されたリジンを含む特定のペプチドと、試料中のエクソソームとを結合させて複合体を形成させる複合体形成工程、および前記複合体に金属陽イオンを含む解離バッファーを接触させることによって複合体からエクソソームを解離させる解離工程を含む。

Description

本発明は、エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キットに関する。

エクソソームは、細胞から分泌される直径２０〜１２０ｎｍの膜で覆われた粒子である。エクソソームは、血液、唾液、尿、脳脊髄液等の広範な生体液中に存在しており、その内部には、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）等の様々な物質が含まれていることが知られている。最近では、エクソソームは、その内部に包含する物質を介した細胞間の情報伝達機能を有することが示唆されており、各種疾患や生命現象のバイオマーカーとして注目されている。

エクソソームに内包される物質の中でも、特に、ｍｉＲＮＡは、疾患のバイオマーカーとして注目されている。ｍｉＲＮＡは、エクソソームに内包されることにより、血液中でも長期間安定に存在している。現在までに７００種余りのｍｉＲＮＡが確認されており、これらのうちの比較的少数のｍｉＲＮＡの発現パターンを解析することによって、例えば、腫瘍が発生している臓器を高精度に特定することができる。このように、生体内において極めて重要な情報を有するｍｉＲＮＡを内包したエクソソームを単離する技術は、医療等の分野において極めて重要である。

エクソソームを単離または回収する技術としては、これまでにいくつかの方法が報告されており、例えば、（１）超遠心法、（２）遠心によるペレットダウン、（３）粒子のサイズによる分画、（４）免疫沈降法等が知られている（非特許文献１）。

（１）超遠心法は、試料を超遠心する（具体的には、１０００００×ｇで７０分間の遠心操作を２〜３回行なう）ことによって、エクソソームを沈殿させて単離したり（沈降速度分画法）、ショ糖等の密度勾配溶液を用いることで、大きさまたは密度に基づいてより厳密に分画したりする技術（密度勾配分画法）であり、特に前者は、最も一般的に利用されている標準的な方法である。

（２）遠心によるペレットダウンは、試料に試薬（ポリマー）を添加し、遠心機を用いてエクソソームを沈殿させることにより濃縮する技術である。

（３）粒子のサイズによる分画は、試料を複数（通常、２〜３つ）のフィルターに通して、エクソソームを捕捉する技術であり、操作が容易であるという利点を有する。例えば、２つのフィルターが使用される場合、１つ目の約２００ｎｍのポアサイズのトップフィルターを用いて大きな粒子を取り除き、２つ目の約２０ｎｍのポアサイズのボトムフィルターを用いてエクソソームを捕捉することができる。

（４）免疫沈降法は、特定のタンパク質が表面に存在するエクソソームを、当該タンパク質に対する抗体が固定化された磁性ビーズを用いて回収する技術である。免疫沈降法では、特定のエクソソーム抗原（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等）が表面に存在するエクソソームを捕捉することができ、また、使用する抗体を変えることで、種々のエクソソーム膜表面抗原を標的とした免疫沈降が行なえるという利点を有する。

落谷孝広編（２０１４）「エクソソーム解析マスターレッスン（ｍｉＲＮＡ研究からがん診断まで応用∞！研究戦略とプロトコールが本と動画でよくわかる、実験医学別冊 最強のステップＵＰシリーズ）」羊土社

しかしながら、上記した従来のエクソソームの単離または回収技術は、以下の問題点を有している。

（１）超遠心法は、当該方法で使用される超遠心機が高価であり、また遠心操作に時間がかかる。また、超遠心法は、多くの試料を処理するには不向きであり、さらには、血清試料を用いた際にアルブミン、ＩｇＧ、プロテオソーム等のタンパク質が精製物中に混入する等の欠点を有している。

（２）遠心によるペレットダウンは、あくまでも濃縮方法であるため、用いる試料によっては、著しく多くの夾雑タンパク質が混入することがある。また、培養上清、血清、尿等の試料ごとに試薬の組成を最適化することが必要であり、操作が煩雑である。

（３）粒子のサイズによる分画は、夾雑物が多い試料ではフィルターが目詰まりする可能性がある。また、エクソソームを溶解する必要があるため、解析対象は核酸のみとなるという問題点を有している。

（４）免疫沈降法は、ある特定の抗原分子を標的とする方法であるため、その抗原分子が発現しているエクソソームは捕捉できるが、発現していないエクソソームは補足できないという問題を有している。すなわち、当該方法は、試料中の一部のエクソソームしか捕捉できないという問題点を有している。さらには、回収したエクソソームと抗体との複合体におけるエクソソームと抗体との結合が強固である為、エクソソームと抗体とを解離させてインタクトな状態のエクソソームを単離するためには、タンパク質の変性を伴うような厳しい条件で解離させる必要がある。このためインタクトな状態でのエクソソームの単離は困難である。

したがって、上記の問題点を克服できるような新たなエクソソームの単離技術の開発が求められている。本発明の目的は、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離できる、エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キットを提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定のペプチドを用いること、および特定の解離バッファーを用いることによって、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の一実施形態は、以下のような構成である。
エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、前記試料と、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの単離方法。

本発明の一実施形態によれば、簡便にかつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離することが可能となるという効果を奏する。

図１は、試験例１の実験操作手順の概略を示す図である。 図２は、試験例２の実験操作手順の概略を示す図である。 図３は、試験例３における、１価の金属陽イオンを含む解離バッファーを使用した場合の実験操作手順の概略を示す図である。 図４は、試験例３における、２価の金属陽イオンを含む解離バッファーを使用した場合の実験操作手順の概略を示す図である。 図５は、ペプチドが担持された磁性ビーズ（ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズ）の作製の操作手順の概略を示す図である。 図６は、試験例４の実験操作手順の概略を示す図である。 図７は、試験例５の実験操作手順の概略を示す図である。 図８は、試験例６の実験操作手順の概略を示す図であり、図８の（ａ）は、試験例６における、血清に含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の、実験操作手順の概略を示す図であり、図８の（ｂ）は、試験例６における、解離バッファーに含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の実験操作手順の概略を示す図である。 図９は、単離されたエクソソームの電子顕微鏡観察の結果を示す図である。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。本発明はまた、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。

本明細書中では、用語「ペプチド」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用され、ペプチド結合によってアミノ酸２個以上が結合した化合物を意味する。本明細書中では、アミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。

〔１．エクソソームの単離方法〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法（以下、適宜「本発明の単離方法」という。）は、エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、
前記試料と、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含んでいる。

本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法は、上記構成とすることから、下記（１）〜（３）の効果を奏する。
（１）超遠心機等を使用する必要がないため、短時間に、かつ、簡便に、エクソソームを単離できる。
（２）リジンがエクソソームの膜に結合することを利用しているため、エクソソームにおける抗原分子の発現状態に関わらず、広くエクソソームを捕捉し、単離することができる。
（３）複合体から、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えることが少ない、金属陽イオンを含む解離バッファーを用いたマイルドな（温和な）条件でエクソソームを解離させているため、エクソソームを傷つけることなく（換言すればインタクトな状態、またはインタクトに近い状態で）、エクソソームを単離することができる。

インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離することによって、例えば、（１）エクソソームの生理作用等の機能解析、および（２）バイオマーカー（エクソソーム由来のタンパク質、ｍｉＲＮＡ等の核酸）等に利用することが可能である。

また、エクソソームはがん、アルツハイマー病、心筋梗塞、脳梗塞、および感染症等、幅広い疾患の治療への応用が期待されている。そのため、インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離することによって、単離したエクソソームそのものを、（３）治療薬、および（４）ドラッグデリバリーシステムの運搬体、として利用できる。特に、上記（３）治療薬としてのエクソソームの利用には、（Ａ）再生医療への補助的な利用、（Ｂ）免疫制御を目的とした利用、および（Ｃ）ワクチンとしての利用等が考えられている（参考文献：実験医学、２０１６年、３４巻、ｐ１３９０-１３９６：エクソソームが築く次世代医療）。

上記（Ａ）〜（Ｃ）について具体例を挙げて説明する。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）由来のエクソソームは、最も研究されているエクソソームである。ＭＳＣ由来のエクソソームは、細胞分裂の促進作用、抗アポトーシス作用、および抗炎症作用を持つことが知られている。これにより、損傷組織の周囲の組織の２次的な損傷を抑制することが可能であり、損傷組織の回復を促進することができる。そのため、皮膚および肝臓の再生、並びに心筋梗塞からの回復等の多くの疾患への応用が期待されている（（Ａ）再生医療への補助的な利用）。また、ＭＳＣ由来のエクソソームには、複合的な免疫制御作用があり、自己免疫疾患の治療、および臓器移植後の免疫制御への応用が期待されている（（Ｂ）免疫制御を目的とした利用）。

また、抗原提示細胞にがん抗原ペプチドを反応させた後に回収した、抗原提示細胞から分泌されたエクソソームには、抗原ペプチドが提示されており、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する作用がある。また、がん細胞由来のエクソソームを直接抗原として使用することによって、当該エクソソームをワクチンとして利用することも考えられている（（Ｃ）ワクチンとしての利用）。

以下では、本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法に用いられる材料についてまずは説明し、続いて、エクソソームの単離方法の各工程について説明する。

〔１−１．材料〕
（試料）
本発明の単離方法において、「エクソソームを含む試料」（本明細書中では、単に試料とも称する）とはエクソソームを含む混合物であれば、その他の構成は特に限定されず、例えば、エクソソームを含む生物学的試料が挙げられる。

本明細書中では、「生物学的試料」とは、生物の体内から採取された検体を意味する。生物学的試料としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液、汗、母乳、羊水、脳脊髄液（髄液）、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液等が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料の選択は、目的に応じて、当業者により適宜設定され得る。例えば、採取の容易さの観点からは、血液、血漿、血清、唾液、尿等が好ましく用いられる。

本発明の一実施形態では、生物学的試料の由来は、エクソソームを保有する生物種由来であれば別段限定されない。生物学的試料の由来となる生物種としては、例えば哺乳類が好ましい。哺乳類の例としては、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）等が挙げられる。

（ペプチド）
本発明の単離方法において利用するペプチド（以下、適宜「本発明のペプチド」という。）は、互いに近接した４つ以上のリジン（「リシン」ともいう。）を含むペプチドであって、試料中のエクソソームと結合することができる。

本発明のペプチドの説明における「互いに近接した」とは、本発明のペプチドを構成するリジン同士が互いに隣接している（換言すれば、連続している）か、または互いのリジンの間に、１〜５個（より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個）のリジン以外のアミノ酸を含んでいることを意味する。

本発明のペプチドが、互いに近接した４つ以上のリジンを含むことによって、本発明のペプチドはエクソソームと結合できる。本発明は特定の理論に制限されるものではないが、リジンは正の電荷を有しており、エクソソームの膜は細胞膜と同様に負に帯電しているため、本発明のペプチドが互いに近接した４つ以上のリジンを含むことによって、本発明のペプチドはエクソソームと結合できると発明者らは考えている。

本発明のペプチドは、互いに近接した４つ以上のリジンを含んでいればエクソソームを単離できる程度の結合強度を持ってエクソソームに結合することができるが、さらに互いに近接した５つ以上のリジンを含むことが好ましく、互いに近接した６つ以上のリジンを含むことがより好ましく、互いに近接した７つ以上のリジンを含むことがさらに好ましく、互いに近接した８つ以上のリジンを含むことが特に好ましい。本発明のペプチドが上記構成を有することによって、当該ペプチドは、エクソソームとより結合しやすくなるという利点を有する。

本発明のペプチドは、互いに近接した４つ以上のリジンを含む限り、その他の構成は特に限定されず、リジンのみからなるペプチドであってもよく、またリジン以外のアミノ酸を含むペプチドであってもよい。さらには、本発明のペプチドは糖鎖またはイソプレノイド基等のペプチド以外の構造をさらに含む複合ペプチドであってもよい。本発明のペプチドに含まれるアミノ酸は修飾されていてもよい。また本発明のペプチドに含まれるアミノ酸はＬ型であっても、Ｄ型であってもよい。

本発明のペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、ペプチドの発現ベクターが導入された形質転換体によって発現されても、化学合成されてもよい。すなわち、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）等）を利用することができる。また市販されているポリリジンを本発明のペプチドとして利用可能である。市販されているポリリジンは、特に限定されるものではないはないが、後述する実施例において利用したポリ−Ｌ−リジン（分子量４,０００−１５，０００、シグマ社製）、およびポリ−Ｌ−リジン溶液（分子量１５０，０００−３００，０００、シグマ社製）等が挙げられる。

本発明のペプチドは、最小で４つのリジンからなり得るため、本発明のペプチドの分子量の下限は５３０．７［＝（１４６．１９×４）−（１８．０２×３）］であるといえる。本発明のペプチドの分子量の上限は特に限定されるものではないが、溶解性および粘度等の操作性の観点からは３００，０００程度が上限であるといえる。

本発明のペプチドは、単一の分子量を有するペプチドからなるものであっても、それぞれ異なった分子量を有するペプチドの混合物からなるものであってもよい。

（担体）
本発明の単離方法において利用する担体（以下適宜「本発明の担体」という。）は、本発明のペプチドを担持可能な担体を意味する。本発明の担体は、エクソソームに結合した本発明のペプチドと結合しエクソソーム−本発明のペプチド−本発明の担体の順で結合した複合体を形成し得る。

本発明の単離方法では、担体を用いることによって、エクソソームを含む複合体を効率的かつ簡便に単離することが可能となる。

担体は、本発明のペプチドを直接的または間接的に担持（保持）できる構造物であれば、その他の構成は特に限定されない。本発明の担体としては、担体に結合する本発明のペプチドの機能を弱めない支持体であることが好ましく、例えば、ガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、ラテックス粒子、セルロース粒子、マイクロビーズ、シリカビーズ、磁性ビーズ等が挙げられる。本発明の担体としては、エクソソームを含む複合体の回収およびエクソソームの単離を容易に行なうことができるという点で、特に磁性ビーズであることが好ましい。磁性ビーズはタンパク質、ＤＮＡ、細胞等の分離精製において広く使用されており、当業者であれば十分に理解し得る担体である。

（本発明のペプチドと本発明の担体との結合方法）
上述したように、本発明のペプチドと本発明の担体とは結合することによって、本発明のペプチドを本発明の担体が担持することが可能である。

本発明の一実施形態においてペプチドと担体との結合方法は、別段限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。また、ペプチドと担体との結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、ビオチンを結合させた本発明のペプチドと、ストレプトアビジンを結合させた本発明の担体とを用い、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、ペプチドと担体との間接的な結合を形成することが可能である。ストレプトアビジンは４量体を形成しているので、１つの「担体に結合したストレプトアビジン」に対して４つの「ペプチドに結合したビオチン」が結合することができる。つまり本発明の担体がストレプトアビジンを１つ有している場合、本発明の担体１つに対して本発明のペプチドが４つ結合していることになる。それゆえ、本発明の担体は、４つの本発明のペプチドを介して１つ以上のエクソソームに結合することができる。そのため、本発明の担体とエクソソームとの結合力が極めて高くなるか、または、本発明の担体は複数のエクソソームと結合できる。よって、上述の結合方法を用いることにより、極めて高収率にてエクソソームを単離することができる。

ペプチドにビオチンを結合する方法、換言すればビオチンが結合したペプチド（本明細書中では、適宜「ビオチン標識ペプチド」ともいう。）を作製する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持するという観点からは、ビオチンとペプチドとを間接的に結合させることが好ましい。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドに任意のリンカーを連結した後に、ペプチドと連結したリンカーに対してビオチンを結合させればよい。ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持するという観点からは、ペプチドはそのアミノ末端（Ｎ末端）および／またはカルボキシ末端（Ｃ末端）に、ビオチンと結合するためのリンカーを有することが好ましい。

リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー（本明細書中では、「ペプチドリンカー」ともいう。）であってもよいし、ビオチンとペプチドとを連結することが可能な周知の架橋剤またはスペーサーアームであってもよい。

ペプチドリンカーの場合、リンカーの長さおよびそれを構成するアミノ酸の種類は、当業者により適宜設定され得る。ペプチドリンカーの長さは、別段限定されるものではなく、通常、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個（例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個）のアミノ酸からなるリンカーが使用される。また、ペプチドリンカーに用いられるアミノ酸の種類も、別段限定されるものではないが、例えば、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）等が使用され得る。とりわけ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２）等のペプチドリンカー、および、これらが複数回繰り返されたペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）等）が好ましく用いられる。

ビオチンとペプチドとを連結することが可能な周知の架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジルアミド、Ｎ−マレインイミド、イソチオシアネート、ブロモアセトアミド等が挙げられるがこれらに限定されない。

スペーサーアームとしては、周知のものであれば別段限定されないが、例えば、炭素鎖を含むスペーサーアームが用いられ、より好ましくは、炭素数６個の炭素鎖を有するｈｅｘａｎｏｎａｔｅが用いられる。

担体と結合したストレプトアビジンを作製する方法は特に限定されない。例えば、担体とストレプトアビジンとを直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。適宜、公知の手法に従って、担体と結合したストレプトアビジンを作製すればよい。なお、ストレプトアビジンを結合させた磁性ビーズは市販されており、例えばDynabeads（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が知られている。

担体と結合するペプチドの種類は、一種類であってもよいし、複数種類の組み合わせであってもよい。複数種類のペプチドが組み合わせて用いられる場合、その組み合わせは別段限定されない。

（解離バッファー）
本発明の単離方法では、後述する解離工程において、複合体と金属陽イオンを含む解離バッファー（以下、適宜「本発明の解離バッファー」という。）とを接触させることによって、複合体からエクソソームを解離させ、エクソソームを単離する。本発明の解離バッファーは界面活性剤および／またはタンパク質変性剤等を含むことなく、マイルドな（温和な）条件でエクソソームを複合体から解離させることができるため、エクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で単離することができる。このようなマイルドな解離バッファーで、本発明のペプチドとエクソソームとの結合を解離させることができるということを見出したのは本発明者らが初めてであり、この新規知見を知らない当業者は本発明に容易に想到することはできない。またエクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で簡便に単離することができるという効果は、本発明の顕著かつ有利な効果である。

本発明の解離バッファーに含まれる金属陽イオンとしては、特に限定されず、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、銀イオン、および銅(I)イオン等の１価の金属陽イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、銅（II）イオン、鉄(II)イオン、スズ(II)イオン、コバルト(II)イオン、および鉛（II）イオン等の２価の金属陽イオン、ならびにアルミニウムイオン、および鉄(III)イオン等の３価の金属陽イオン、等が挙げられる。本発明の解離バッファーに含まれる金属陽イオンとしては、これら金属陽イオンの中でも、水溶性が高いことから、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンが好ましい。さらに、複合体からエクソソームを十分に解離させることができることから、本発明の解離バッファーは、上述した金属陽イオンの中でもナトリウムイオン、カリウムイオン、もしくはマグネシウムイオンを、単独でまたは組み合わせて含むことが好ましい。

本発明の目的は、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離することである。よって、本発明の単離方法において「インタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離する」とは、エクソソームを傷つけることなく（ほぼ傷つけることなく）、試料中のエクソソームを、試料中のエクソソーム以外の物質（例えばタンパク質等）から分離し、単離することを意味する。換言すれば、本発明の単離方法において「インタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離する」とは、エクソソームの膜構造（具体的には脂質二重膜構造）を保った状態（ほぼ保った状態）で、および、膜に存在するタンパク質の構造を保った状態（ほぼ保った状態）で、試料中のエクソソームを、試料中のエクソソーム以外の物質と分離し、単離することを意味する。

解離バッファーは、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えない範囲において、金属陽イオン以外の物質を含んでいてもよい。

解離バッファーにおける金属陽イオンの濃度は、複合体からエクソソームを解離させることが可能であり、かつ、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えない限り、特に限定されない。つまり、使用する本発明のペプチドとエクソソームとの結合強度、および金属陽イオンの種類（価数）等に応じて最適な陽イオンの濃度は変わり得る為、適宜最適な濃度を検討の上、決定すればよい。なお、本発明の解離バッファーにおける金属陽イオンの濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、０．０１Ｍ〜５Ｍであることが好ましく、０．０５Ｍ〜２Ｍであることがより好ましく、０．１Ｍ〜１Ｍであることがさらに好ましく、０．３Ｍ〜０．７Ｍであることが特に好ましい。

また、解離バッファーのｐＨは適宜設定され得る。解離バッファーのｐＨは、５〜１０であることが好ましく、６〜９であることがより好ましく、７〜８であることがさらに好ましく、７．３〜７．５であることが特に好ましい。解離バッファーのｐＨが上記範囲であれば、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えないため好ましい。

〔１−２．工程〕
（複合体形成工程）
本発明の単離方法に含まれる複合体形成工程（以下、適宜「本発明の複合体形成工程」という。）は、エクソソームを含む試料と本発明のペプチドと、本発明の担体とを接触させるか、または、前記試料と、本発明の担体に担持された本発明のペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体（エクソソーム−本発明のペプチド−本発明の担体の順で結合した複合体。以下、適宜「本発明の複合体」という。）を形成させる複合体形成工程である。つまり、本発明の複合体形成工程では、本発明のペプチドが本発明の担体に担持されていない状態で本発明のペプチドと本発明の担体と試料とを接触させた後にエクソソーム−本発明のペプチド−本発明の担体の順で結合した複合体を形成させてもよいし、本発明の担体に本発明のペプチドが既に担持させた状態で当該ペプチドと試料とを接触させて本発明の複合体を形成してもよいということである。ただし、より効率的に本発明の複合体を形成するという観点からは後者の態様がより好ましいといえる。

エクソソームを含む試料と本発明のペプチドと本発明の担体とを接触させる方法としては、試料中のエクソソームと本発明のペプチドと本発明の担体とが、それぞれ結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、試料中に、本発明のペプチドと本発明の担体とを添加し、混合する方法が挙げられる。試料、本発明のペプチド、および本発明の担体を接触させる際の添加および混合する順序は特に限定されない。例えば、（１）本発明のペプチドおよび本発明の担体を同時に、試料に添加し、混合してもよく、（２）試料に本発明のペプチドを添加し、混合した後に、本発明の担体を添加し、混合してもよく、（３）試料に本発明の担体を添加し、混合した後に、本発明のペプチドを添加し、混合してもよい。ただし、本発明のペプチドがエクソソームに結合し、本発明のペプチドと本発明の担体とが結合することから上記（２）の手順が好ましいかもしれない。上述した方法による、試料とペプチドと担体との接触によって、エクソソームとペプチドと担体とを含む本発明の複合体が形成され得る。

また、試料と、本発明の担体に担持された本発明のペプチドとを接触させる方法としては、試料中のエクソソームと本発明の担体に担持された本発明のペプチドとが結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、試料中に本発明の担体に担持された本発明のペプチドを添加し、混合させる方法が挙げられる。

試料と本発明のペプチドと本発明の担体との接触時間、または、試料と本発明の担体に担持された本発明のペプチドとの接触時間は、本発明の複合体を形成するために十分な時間であれば限定されるものではなく、適宜最適な条件を検討の上、決定され得る。

また、エクソソームを含む試料と本発明のペプチドと本発明の担体との接触において、例えば柱状または円筒状の容器（カラム）に本発明の担体を充填することによって作製した、担体を含むカラム（本明細書中では、「担体カラム」という。）を用いることも可能である。担体カラムに試料を含む溶液およびペプチドを含む溶液を通液させて本発明の複合体を得る方法としては、試料中のエクソソームと本発明のペプチドと本発明の担体とが、それぞれ結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、次の（１）〜（３）が挙げられる：（１）担体カラムに、本発明のペプチドを含む溶液を添加し、当該溶液を通液させることによって、本発明の担体に本発明のペプチドを結合させた後、担体カラムに試料を含む溶液を添加し、当該溶液を通液させることによって本発明の複合体を形成させる；（２）予め試料に本発明のペプチドを添加し、混合する等して、試料と本発明のペプチドとを接触させることによって、試料中のエクソソームとペプチドとが結合してなる複合体（エクソソーム−ペプチド複合体）を形成させ、その後、エクソソーム−ペプチド複合体を含む溶液を担体カラムに添加し、通液させることによって、本発明のペプチドと本発明の担体とが結合して本発明の複合体を形成させる；（３）担体カラムに試料を含む溶液および本発明のペプチドを含む溶液同時に添加し、それら溶液を通液させることによって、本発明の複合体を形成させる。

上記（１）〜（３）において、担体カラムと、ペプチドおよび／もしくは試料、または、エクソソーム−ペプチド複合体を含む試料、との接触時間は、試料中のエクソソームとペプチドと担体とが本発明の複合体を形成するために十分な時間であることが好ましい。上記時間は、担体カラムへの試料溶液（エクソソームを含む試料をおよび/もしくは本発明のペプチドを含む溶液、またはエクソソーム−ペプチド複合体を含む溶液）の通液速度、または、当該試料溶液を添加してから通液を開始するまでの時間等を調整することによって、適宜設定できる。

また、エクソソームを含む試料と本発明の担体に担持された本発明のペプチドとの接触において、例えば柱状または円筒状の容器（カラム）に本発明のペプチドが担持された本発明の担体を充填することによって調製したカラム（本明細書中では、「ペプチドカラム」という。）を用いることも可能である。当該ペプチドカラムに試料を含む溶液を通液させることによって、試料と本発明の担体に担持された本発明のペプチドとを接触させ、本発明の複合体を得ることが可能である。ペプチドカラムと試料との接触時間は、試料中のエクソソームと本発明の担体に担持された本発明のペプチドとが本発明の複合体を形成するために十分な時間であることが好ましい。上記時間は、試料を含む溶液の通液速度、または、当該溶液を添加してから通過を開始するまでの時間等を調整することによって、適宜設定できる。

前記担体カラムまたは前記ペプチドカラムに試料溶液を通液させるための物理的方法は従来公知の方法を用いることが可能である。例えば、以下（１）〜（３）の方法が挙げられる。
（１）鉛直方向に載置された担体カラム（またはペプチドカラム）上に、前記試料溶液を添加し、重力によって担体カラム（またはペプチドカラム）内に前記試料溶液を通液させる方法。
（２）担体カラム（またはペプチドカラム）の一方に前記試料溶液を添加し、試料溶液を添加した方向から加圧するか、または、試料溶液を添加した方向とは逆の方向から吸引することによって、担体カラム（またはペプチドカラム）内に前記試料溶液を通液させる方法。
（３）担体カラム（またはペプチドカラム）の一方に試料溶液を添加した後、当該担体カラム（またはペプチドカラム）を遠心チューブ内に装填し、当該遠心チューブを遠心分離することによって、担体カラム（またはペプチドカラム）内に前記試料溶液を通液させる方法。なお、上記（３）の方法は、いわゆる従来公知のスピンカラムを用いた方法である。

（解離工程）
本発明の単離方法に含まれる解離工程（以下、適宜「本発明の解離工程」という。）は、前記複合体形成工程によって得られた本発明の複合体と、金属陽イオンを含む本発明の解離バッファーとを接触させて、本発明の複合体からエクソソームを解離させる工程である。

本発明の複合体と本発明の解離バッファーとを接触させる方法としては、本発明の複合体からエクソソームを解離させるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、本発明の複合体を含む容器に本発明の解離バッファーを添加し、混合させる方法が挙げられる。本発明の複合体と本発明の解離バッファーとの接触時間は、複合体からエクソソームが解離するために十分な時間であれば特に限定されるものではない。本発明の複合体と本発明の解離バッファーとの接触によって、エクソソームは本発明の複合体から解離され、当該解離バッファーへ移動する。そして、当該解離バッファーと本発明の担体とを分離し当該解離バッファーを単離することにより、エクソソームを単離することができる。

本発明の解離工程において、本発明のペプチドは、本発明の担体に結合されたままでいてもよく、本発明の担体から解離されていてもよい。また、上記分離の後、単離された解離バッファー中に本発明のペプチドが含まれていてもよい。エクソソームをより純度高く単離する観点から、本発明の解離工程において本発明のペプチドは本発明の担体に結合されたままでいることが好ましく、上記分離の後、単離された解離バッファー中に本発明のペプチドが含まれていないことが好ましい。

また、複合体形成工程においてカラムが使用された場合には、複合体形成工程において本発明の複合体が形成されたカラムに、本発明の解離バッファーを通液させることによって、本発明の複合体と本発明の解離バッファーとを接触させることが可能である。カラムへ本発明の解離バッファーを通液させるための物理的方法としては、（複合体形成工程）の項に記載した（１）〜（３）の方法が挙げられる。カラムと本発明の解離バッファーとを接触させた場合には、エクソソームは複合体から解離され当該解離バッファーへ移動する。従って、カラム通液後の解離バッファーを単離することによって、エクソソームを単離することができる。

本発明の単離方法は、上述した複合体形成工程および解離工程以外の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば洗浄工程、および回収工程が挙げられる。

（回収工程）
回収工程は、複合体形成工程と解離工程との間に設けられ、複合体形成工程によって得られた本発明の複合体を回収する工程である。回収工程は、複合体形成工程および担体等に応じて従来公知の方法が適宜採用され得る。

担体が、〔１−１．材料〕の（担体）の項で説明したような構造物である場合には、遠心分離によって本発明の複合体含む担体を回収することができる。例えば、５００ｇ〜４０００ｇの条件下で遠心を行なうことによって、本発明の複合体を含む担体を回収することが可能である。

また担体が、磁性ビーズである場合には、従来公知のマグネティックスタンド等の磁性体を用いて外部から磁力を与えることによって、担体を容易に回収することができる。担体が磁性ビーズであり、磁性体を用いて回収する場合には、遠心の方法と比較して、以下の（１）および（２）の利点を有する：（１）磁性ビーズである担体は、磁性体に引き寄せられているため、上清をほぼ完全に取り除くことが可能であり、得られるエクソソームの純度が高くなること；（２）上清を取り除く際に、磁性ビーズを一緒に取り除いてしまう虞が小さくなり、得られるエクソソームの損失を防ぐことができること（エクソソームの単離率を向上することができる）。

なお、本発明の複合体形成工程において、担体カラムまたはペプチドカラムが用いられる場合には、本発明の複合体を含む担体はカラム内に留まることとなる。このため、上述の回収工程は必要とされない。

（洗浄工程）
本発明の単離方法には、解離工程の前に、さらに洗浄工程が含まれていることが好ましい。

洗浄工程は、回収された本発明の複合体、または、カラム中の本発明の複合体を、適当な洗浄液を用いて、適当な回数洗浄する工程である。洗浄工程は、当該複合体が解離しない条件下で行なわれるものであれば、使用される洗浄液の種類および洗浄回数等は特に限定されない。

洗浄工程で使用される洗浄液としては、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）が挙げられる。

本発明の一実施形態が回収工程を含む場合には、洗浄工程としては、以下のような方法が挙げられる。（１）回収された本発明の複合体を含む担体を前記洗浄液と混合することによって、担体を当該洗浄液に再懸濁する。（２）再度、本発明の複合体を含む担体を回収する（すなわち、本発明の複合体を含む担体と洗浄液とを分離する。）。

また本発明の複合体形成工程において、担体カラムまたはペプチドカラムが用いた場合には、本発明の複合体が形成された後のカラムに対して前記洗浄液を適当量通液すればよい。

〔２．エクソソームの単離キット〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離キット（以下、適宜「本発明のキット」という）は、上述した本発明の単離方法を行なうためのキットであって、上述した本発明のペプチド、本発明の担体、および本発明の解離バッファー、を含む。よって、キットの構成の説明については、〔１．エクソソームの単離方法〕の説明が援用可能である。

本発明のキットに含まれる本発明のペプチドおよび本発明の担体は、本発明のペプチドが本発明の担体に予め担持された状態で本発明のキットに含まれていてもよいし、それぞれが別体として含まれていてもよい。

また、本発明のキットには、磁性ビーズ、ストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ、およびマグネティックスタンド等の磁性体、ならびにビオチン等が含まれていてもよい。

また本発明のキットには、上記の構成の他に、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ、カラム等）が含まれていてもよい。本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。本発明のキットの説明において使用される用語「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図され得る。

また本発明のキットは、本発明の単離方法を実施するための説明書を備えていてもよい。

〔まとめ〕
本発明の一実施形態は、以下のような構成である。
〔１〕エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、前記試料と、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの単離方法。
〔２〕前記ペプチドに含まれるリジンは連続していることを特徴とする、〔１〕に記載のエクソソームの単離方法。
〔３〕前記ペプチドに含まれるリジンは、８つ以上であることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のエクソソームの単離方法。
〔４〕前記担体は、磁性ビーズであることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕の何れか１つに記載のエクソソームの単離方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕の何れか１つに記載のエクソソームの単離方法を行なうためのエクソソームの単離キットであって、前記ペプチド、前記担体、および前記解離バッファー、を含むことを特徴とする、エクソソームの単離キット。

以下、実施例により本発明の一実施形態を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
〔実験方法〕
＜１＞ペプチドが担持された磁性ビーズ（ポリリジン固定化磁性ビーズ）の作製
互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドを磁性ビーズ（担体）に結合させ（担持させ）、ペプチドが担持された磁性ビーズを作製した。

担体としては、ストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ（ＶＥＲＩＴＡＳ社製、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（本明細書中では、「ストレプトアビジン磁性ビーズ」ともいう。）を用いた。

ペプチドとしては、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）からなるリンカーペプチドと、４、８、または１６個の連続したリジン残基からなる配列と、を含むペプチド（以下、「ポリリジンペプチド」という。）を使用した。本実施例で用いたアミノ酸は全てＬ型アミノ酸である。当該ポリリジンペプチドは、さらに、ストレプトアビジンを有する磁性ビーズ（担体）と結合するために、ポリリジンペプチドのＮ末端にビオチンが結合されている。当該ビオチンが結合しているポリリジンペプチドを、以下、「ビオチン標識ポリリジンペプチド」と称する。なお、本実施例において使用したビオチン標識ポリリジンペプチドは、ユーロフィンジェノミクス社による受託合成により作製された。

本実施例において使用した、３つのビオチン標識ポリリジンペプチドの名称、およびそれぞれのビオチン標識ポリリジンペプチドが有するポリリジンペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである。
１．Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ４；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＫＫＫＫ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
２．Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ８；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
３．Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ１６；ＧＧＧＳＧＧＧＳＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。

ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用を利用して、具体的には以下の方法によって、ペプチドが担持された磁性ビーズを作製した。
（１）５０μL（０．５ｍｇ）のストレプトアビジン磁性ビーズを、１．５ｍLのマイクロチューブ（単に「チューブ」ともいう。）に加え、当該チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（２）チューブをマグネットスタンドから外し、０．３ｍLのＰＢＳを添加し、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
当該（２）の操作（洗浄）を合計３回行なった。
（３）チューブに２００μLのＰＢＳを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをＰＢＳ中に再懸濁し、洗浄したストレプトアビジン磁性ビーズ（２００μL）を得た。
（４）チューブに、それぞれ、１５μLのビオチン標識ポリリジンペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ４、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ８、またはＢｉｏｔｉｎ−Ｋ１６）（１００μＭ）を加えた。
（５）チューブを室温で３０分混合し、ビオチン標識ポリリジンペプチドとストレプトアビジン磁性ビーズとを接触させることによって、ビオチン標識ポリリジンペプチドをストレプトアビジン磁性ビーズに結合させた（すなわち担持させた。）。
（６）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（７）上記（２）と同様の操作（洗浄）を合計３回行なった。
（８）チューブに５０μLのＰＢＳを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをＰＢＳ中に再懸濁し、ビオチン標識ポリリジンペプチドが担持されたストレプトアビジン磁性ビーズ（０．５ｍｇ／５０μL）を得た。

本明細書中では、ビオチン標識ポリリジンペプチドが担持されたストレプトアビジン磁性ビーズを、ポリリジン固定化磁性ビーズという。また、本明細書中では、特に、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ４を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズ、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ８を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズ、およびＢｉｏｔｉｎ−Ｋ１６を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズを、それぞれ、「Ｋ４固定化磁性ビーズ」、「Ｋ８固定化磁性ビーズ」、および「Ｋ１６固定化磁性ビーズ」という。

＜２＞ｍｉＲＮＡの抽出および精製
ｍｉＲＮＡの抽出および精製は、ｍｉＲＣＵＲＹ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｃｅｌｌ ＆ Ｐｌａｎｔ（ＥＸＩＱＯＮ社製）を用いて行なった。具体的には、エクソソームが結合しているポリリジン固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）もしくはストレプトアビジン磁性ビーズ（０．５ｍｇ）、解離工程後のエクソソームを含む解離バッファー（１００μL）、または前処理した血清上清（５０μL）に、抽出バッファーとして所定量のＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して、５分間振盪することでエクソソームを溶解し、ｍｉＲＮＡを抽出した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置して上清（ｍｉＲＮＡ画分）を回収し、同社のプロトコールに従って、ｍｉＲＮＡの精製を行なった。最終的に、５０μLのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中にｍｉＲＮＡを回収した。

＜３＞エクソソーム量の測定
本発明の一実施形態では、上記＜２＞の方法に従って回収したｍｉＲＮＡのうち、エクソソームに特異的に含まれることが知られているｍｉＲ１４２-３ｐの量をｑＲＴ-ＰＣＲ法によって定量することによって、エクソソーム量を測定した。

ｑＲＴ-ＰＣＲ法は、（Ａ）まずＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）を、逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＲＴ）により相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）に変換し、（Ｂ）変換されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより定量する方法である。

上記（Ａ）および（Ｂ）の具体的な方法は、以下の通りである。
（Ａ）ＲＴ反応試薬としてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を、プライマーとしてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：０００４６４）（ライフテクノロジーズ社製）のＲＴ−ｐｒｉｍｅｒを用い、同社のプロトコールに従って、逆転写反応を行なった。
（Ｂ）ＰＣＲ反応試薬としてＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ， ｎｏ ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製）またはＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）を、プライマーとしてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：０００４６４）（ライフテクノロジーズ社製）のＰＣＲ−ｐｒｉｍｅｒを用い、同社のプロトコールに従って、リアルタイムＰＣＲを行なった。

＜４＞ポリリジン固定化磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの回収
血清としてＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（シグマ社製）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心を行ない、血球等の成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。このように前処理した血清上清のうち０．１ｍLを１．５ｍLのマイクロチューブに加え、当該チューブに０．４ｍLのＰＢＳを添加して血清上清を希釈し、血清溶液（０．５ｍL）を得た。

血清溶液（０．５ｍL）中のエクソソームを以下の方法で回収した。
（１）上記血清溶液（０．５ｍL）を含むチューブに、上記＜１＞の方法に従って作製したＫ４固定化磁性ビーズ、Ｋ８固定化磁性ビーズ、またはＫ１６固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ／５０μL）を添加した。
（２）チューブを室温で６０分混合することによって、血清溶液中のエクソソームとポリリジン固定化磁性ビーズとを接触させ、ポリリジンペプチドにエクソソームを結合させた。すなわち、当該（２）の工程にて、エクソソームとポリリジンペプチド（ペプチド）とストレプトアビジン磁性ビーズ（担体）とを含む複合体が形成された。
（３）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（４）次の操作を行ない、複合体を洗浄した：（４−１）チューブをマグネットスタンドから外し、０．０１％のウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（本明細書中では、ＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）とも称する。）を０．５ｍL、チューブに添加して、混合した；（４−２）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（５）上記（４）の操作（洗浄）をさらに２回（合計３回）行ない、血清（血清溶液）中のエクソソームを複合体として含む、ポリリジン固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を回収した。

また、ネガティブコントールとして、ビオチン標識ポリリジンペプチドが担持されていないストレプトアビジン磁性ビーズ（０．５ｍｇ／５０μL）を用いて、上記（１）〜（５）と同じような操作を行い、血清（血清溶液）中のエクソソームが結合したストレプトアビジン磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を回収した。

＜５＞免疫沈降法による血清からのエクソソームの回収
血清としてＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（シグマ社製）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心を行ない、血球等の成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。このように前処理した血清上清のうち０．１ｍLを１．５ｍLのマイクロチューブに加え、当該チューブに０．４ｍLのＰＢＳを添加して血清上清を希釈し、血清溶液（０．５ｍL）を得た。

抗体は、ビオチンが結合したＡｎｔｉ-ＣＤ９抗体［ＣＤ９ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＥＭ-６１）Ｂｉｏｔｉｎ， Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製］（以下、「ビオチン標識Ａｎｔｉ−ＣＤ９抗体」、または単に「ＣＤ９抗体」という。）を用いた。

血清溶液（０．５ｍL）中のエクソソームを以下の方法で回収した。
（１）上記血清溶液（０．５ｍL）を含むチューブに、１ｍｇ／ｍLのビオチン標識Ａｎｔｉ-ＣＤ９抗体を５μL添加した。
（２）チューブを室温で６０分混合することによって、血清溶液中のエクソソームとＣＤ９抗体とを接触させ、ＣＤ９抗体にエクソソームに結合させた。
（３）上記（２）のチューブに、５０μL（０．５ｍｇ）のストレプトアビジン磁性ビーズを添加した。
（４）チューブを室温で６０分混合することによって、エクソソームが結合したＣＤ９抗体とストレプトアビジン磁性ビーズとを接触させて、ビオチン標識Ａｎｔｉ−ＣＤ９抗体を介して、エクソソームをストレプトアビジン磁性ビーズに結合させた。
（５）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（６）次の操作を行ない、ＣＤ９抗体を介してエクソソームが結合したストレプトアビジン磁性ビーズを洗浄した：（６−１）チューブをマグネットスタンドから外し、ＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）を０．５ｍL、チューブに添加して、混合した；（６−２）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（７）上記（６）の操作（洗浄）をさらに２回（合計３回）行ない、ＣＤ９抗体を介して血清中のエクソソームが結合している、ストレプトアビジン磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を回収した。

＜６＞ペプチドが担持された磁性ビーズ（ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズ）の作製
担体としては、シリカ磁性ビーズ（ＭｏＢｉＴｅｃ社製、Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｂｅａｄｓ Ｓ１．０）を用いた。

ペプチドとしては、ポリ−Ｌ−リジン（分子量４，０００−１５，０００）［シグマ社製］またはポリ−Ｌ−リジン溶液（分子量１５０，０００−３００，０００）［シグマ社製］の２種類のうちいずれかを用いた。本明細書中ではこれら２種類のポリ−Ｌ−リジンの両方を、「ポリＬリジンペプチド」とも称する。ポリ−Ｌ−リジン（分子量４，０００−１５，０００）は、ミリＱ水（超純水）で１．９ｍｇ／ｍLに調製して使用した。ポリ−Ｌ−リジン溶液（分子量１５０，０００−３００，０００）、１ｍｇ／ｍLの水溶液として販売されており、そのまま使用した。

ペプチドが担持された磁性ビーズ（ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズ）の作製の操作手順の概略を、図５に示す。図５は、ペプチドが担持された磁性ビーズ（ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズ）の作製の操作手順の概略を示す図である。具体的には以下の方法によって、ペプチドが担持された磁性ビーズとして、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズを作製した。
（１）２０μL（０．２ｍｇ）のシリカ磁性ビーズを、１．５ｍLのマイクロチューブに加え、当該チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（２）チューブをマグネットスタンドから外し、０．２ｍLのＰＢＳを添加し、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
当該（２）の操作（洗浄）を合計３回行なった。
（３）チューブに５０μLのＰＢＳを添加し、シリカ磁性ビーズをＰＢＳ中に再懸濁し、洗浄したシリカ磁性ビーズ（５０μL）を得た。
（４）チューブに、９７μLのポリ−Ｌ−リジン（分子量４，０００−１５，０００）を添加し、さらにチューブ内の溶液が３００μLとなるように、１５３μLのＰＢＳを添加した。また別のチューブに、６０μLのポリ-Ｌ-リジン（分子量１５０，０００−３００，０００）を添加し、さらにチューブ内の溶液が３００μLとなるように、１９０μLのＰＢＳを添加した。
（５）チューブを室温で３０分混合し、ポリＬリジンペプチドをシリカ磁性ビーズに結合させた（すなわち固定化した）。
（６）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（７）チューブをマグネットスタンドから外し、０．３ｍLのＰＢＳを添加し、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
当該（７）の操作（洗浄）を合計３回行なった。
（８）マイクロチューブに５０μLのＰＢＳを添加し、シリカ磁性ビーズをＰＢＳ中に再懸濁し、ペプチドが担持された磁性ビーズとして、ポリＬリジンペプチドが担持されたシリカ磁性ビーズ（０．２ｍｇ／５０μL）を得た。

本明細書中では、ポリＬリジンペプチドが担持されたシリカ磁性ビーズを「ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズ」とも称する。また、本明細書中では、ポリ−Ｌ−リジン（分子量４，０００−１５，０００）［シグマ社製］が担持されたシリカ磁性ビーズを、「ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＡ」とも称し、ポリ−Ｌ−リジン溶液（分子量１５０，０００−３００，０００）［シグマ社製］が担持されたシリカ磁性ビーズを、「ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢ」とも称する。

＜７＞ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの回収
血清としてＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（シグマ社製）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心を行ない、血球等の成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。このように前処理した血清上清のうち０．１ｍLを１．５ｍLのマイクロチューブに加え、当該チューブに０．４ｍLのＰＢＳを添加して血清上清を希釈し、血清溶液（０．５ｍL）を得た。

血清溶液（０．５ｍL）中のエクソソームを以下の方法で回収した。
（１）上記血清溶液（０．５ｍL）を含むチューブに、上記＜６＞の方法に従って作製したポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＡまたはＢ（０．２ｍｇ／５０μL）を添加した。
（２）チューブを室温で６０分混合することによって、血清溶液中のエクソソームとポリＬリジン−シリカ磁性ビーズとを接触させ、ポリＬリジンペプチドにエクソソームを結合させた。すなわち、当該（２）の工程にて、エクソソームとポリＬリジンペプチド（ペプチド）とシリカ磁性ビーズ（担体）とを含む複合体が形成された。
（３）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
（４）チューブをマグネットスタンドから外し、０．５ｍLのＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）をチューブに添加して、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。
当該（４）の操作（洗浄）を合計３回行ない、血清（血清溶液）中のエクソソームを複合体として含む、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＡまたはＢ（０．２ｍｇ）を回収した。

〔試験例１〕エクソソームの回収量の比較、およびポリリジン数のエクソソーム回収量に与える影響
本発明のペプチドを用いて回収されたエクソソームの回収量と、従来法である免疫沈降法によって得られたエクソソームの回収量とを比較した。また、本発明のペプチドに含まれるリジンの数（具体的にはポリリジンの鎖長）が、上記エクソソームの回収量に与える影響も評価した。エクソソームの回収量の測定および比較は、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１４２-３ｐ）の量を定量することによって行なった。試験例１の実験操作手順の概略を、図１に示す。図１は、試験例１の実験操作手順の概略を示す図である。

本発明のペプチドを用いたエクソソームの回収は、上記＜４＞の方法に従って行なった。ここで、ポリリジン固定化磁性ビーズとして、Ｋ４固定化磁性ビーズ、Ｋ８固定化磁性ビーズ、またはＫ１６固定化磁性ビーズを用いた。ネガティブコントロールとしては、ビオチン標識ポリリジンペプチドが担持されていないストレプトアビジン磁性ビーズ（すなわちストレプトアビジン磁性ビーズのみ）を用いた。また比較として、従来法である免疫沈降法によるエクソソームの回収は、上記＜５＞の方法に従って行なった。

回収されたエクソソームのそれぞれについて、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。精製されたそれぞれのｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、免疫沈降法によって回収されたエクソソームから得られたｍｉＲ１４２-３ｐの濃度を１として、それぞれの相対濃度を算出し、表１に示した。表１中、Ｃｔ値は、ＰＣＲ産物が一定量に達するサイクル数を示し、ΔＣｔは、各例のＣｔ値から基準とした例のＣｔ値を引いた値を示し、具体的には、各例のＣｔ値から免疫沈降法のＣｔ値を引いた値を示す。

表１の結果より、Ｋ４固定化磁性ビーズ、Ｋ８固定化磁性ビーズ、またはＫ１６固定化磁性ビーズを用いた場合の、ｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、それぞれ０．２５、１１．９６、または６．１９であることが分かった。また、ストレプトアビジン磁性ビーズのみ（表１では「磁性ビーズのみ」と表記）では、ｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は０．０４であることから、ストレプトアビジン磁性ビーズそれ自身にはほとんどエクソソームが結合していないことが分かった。このことから、４つ以上のリジンを含むペプチド（ポリリジンペプチドポリリジン）を用いてエクソソームを回収した場合には、当該ポリリジンペプチドに特異的にエクソソームが結合することによって、エクソソームを回収できることが分かった。また、８つ以上のリジンを含むペプチドを用いてエクソソームを回収した場合には、免疫沈降法によってエクソソームを回収した場合と比べて、６〜１２倍と高い収量にてエクソソームを回収できることが分かった。すなわち、８つ以上のリジンを含むペプチドを用いる場合には、従来の免疫沈降法と比較して、極めて効率よくエクソソームを回収できることが分かった。

なお、４つ以上のリジンを含むペプチドを用いた場合であっても、免疫沈降法によってエクソソームを回収した場合と比べて収量は４分の１程度と劣るものの、エクソソームを回収できることが分かった。４つ以上のリジンを含むペプチドを用いた場合であっても、試料中からエクソソームを回収することができるため、本発明の単離方法を実施することができるといえる。

〔試験例２〕解離バッファーの検討１
エクソソームそのものを利用したい場合、磁性ビーズ（複合体）からインタクトな状態（インタクトに近い状態）でエクソソームを単離する必要がある。従来公知の免疫沈降法の場合、エクソソーム表面のタンパク質と抗体が結合しているので、タンパク質変性剤等で、抗体を変性させエクソソームを磁性ビーズから分離する必要がある。特に、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、エクソソーム表面上のタンパク質も変性させるうえに、さらにエクソソームそのものを溶解させてしまう作用がある。もし温和な条件で、磁性ビーズからエクソソームを解離することができれば、タンパク質の変性がなくインタクトな状態（インタクトに近い状態）でエクソソームを単離することができると考えられる。そこで、本試験例では温和な条件で、磁性ビーズからエクソソームを解離できるか検討を行なった。試験例２の実験操作手順の概略を、図２に示す。図２は、試験例２の実験操作手順の概略を示す図である。

まず、上記＜４＞の方法に従って、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いて、血清からエクソソームを回収した。回収したエクソソームを３等分し、うち１つはＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いてエクソソームを溶解してｍｉＲＮＡを抽出した（コントロール）。残りの２つについて、解離バッファーを用いて複合体からエクソソームを解離させた。

具体的な実験方法は、以下の通りである。
（１）エクソソームを複合体として含むＫ８固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を含むチューブに、ＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）を０．６ｍL添加して、当該Ｋ８固定化磁性ビーズを当該ＰＢＳに再懸濁した。
（２）上記（１）で得られた０．６ｍLのＫ８固定化磁性ビーズの懸濁液を３等分し、０．２ｍLずつ、３本の１．５ｍLのマイクロチューブに分注した。
（３）３本のチューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。ここで、３本のうち１本のチューブについて、上記＜２＞の方法に従って、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０μL）を用いてエクソソームを溶解してｍｉＲＮＡを抽出した（コントロール）。
（４）２本のチューブに、解離バッファーとして、リシン溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ Ｌｙｓｉｎｅ］、または、ＫＣｌ溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＫＣｌ］、をそれぞれ１００μL添加して５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。

単離されたエクソソームのそれぞれについて、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。精製されたそれぞれのｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、解離バッファーを用いずにＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて、エクソソームを溶解することによって得られたｍｉＲ１４２-３ｐの濃度（コントロールの濃度）を１として、それぞれの相対濃度を算出し、表２に示した。

表２の結果より、リシン溶液またはＫＣｌ溶液を用いて解離を行なった場合のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、それぞれ０．３６または１であることが分かった。このことから、解離バッファーとしてリシン溶液またはＫＣｌ溶液を用いた場合、いずれの場合であっても、複合体からエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。ただし、解離バッファーとしてリシン溶液を用いた場合は、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた場合に比してｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は低いものであった。一方、ＫＣｌ溶液を用いた場合では、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いてＫ８固定化磁性ビーズに結合したエクソソームを溶解してｍｉＲＮＡを抽出した場合と同量のエクソソーム量を単離できたことが示された。それ故に、ＫＣｌ溶液は、複合体中のＫ８固定化磁性ビーズに結合したエクソソームの全てを、複合体から解離させることが可能であることが分かった。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと異なり、ＫＣｌ溶液は、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に対して影響を与えない。すなわち、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた場合と比較して、ＫＣｌ溶液を用いた場合は、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に対して、温和な条件でエクソソームを単離することが可能であるといえる。それ故に、ＫＣｌ溶液用いた場合には、エクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で単離できている可能性が高いと考えられる。

なお、従来法である免疫沈降法によって回収（上記＜５＞の方法に従って回収）したエクソソームでは、解離バッファーとしてリシン溶液、または０．５ＭのＫＣｌ溶液を用いたいずれの場合であっても、複合体からエクソソームを解離させることはできなかった。すなわち、免疫沈降法ではインタクトな状態（またはインタクトに近い状態）でエクソソームを単離することはできなかった。

〔試験例３〕解離バッファーの検討２
試験例２の結果から、金属陽イオンであるカリウムイオンを含むＫＣｌ溶液を解離バッファーとして用いることによって、複合体からエクソソームを解離させることができるということが分かった。そこで、様々な濃度および種類の金属陽イオンを含む解離バッファーを使用した場合における、複合体からのエクソソームの単離量について評価を行なった。解離バッファーとしては、１価の金属陽イオンを含む解離バッファーとして、ＫＣｌ溶液、およびＮａＣｌ溶液を使用し、２価の金属陽イオンを含む解離バッファーとしてＭｇＣｌ_２溶液を使用した。試験例３の実験操作手順の概略を、図３または図４に示す。図３は、試験例３における、１価の金属陽イオンを含む解離バッファーを使用した場合の実験操作手順の概略を示す図である。図４は、試験例３における、２価の金属陽イオンを含む解離バッファーを使用した場合の実験操作手順の概略を示す図である。

まず、上記＜４＞の方法に従って、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いて、血清からエクソソームを回収した。回収したエクソソームを５等分し、うち１つはＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いてエクソソームを溶解してｍｉＲＮＡを抽出した（コントロール）。残りの４つについて、各種の解離バッファーを用いて複合体からエクソソームを解離させた。より具体的な方法は、以下の通りである。
（１）エクソソームを複合体として含むＫ８固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を含むチューブに、ＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）を０．５ｍL添加して、当該Ｋ８固定化磁性ビーズを当該ＰＢＳに再懸濁した。
（２）上記（１）で得られた０．５ｍLのＫ８固定化磁性ビーズの懸濁液を、０．１ｍL（Ｋ８固定化磁性ビーズ：０．１ｍｇ）ずつ、５本の１．５ｍLのマイクロチューブに分注した。
（３）５本のチューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。ここで、５本のうち１本のチューブについて、上記＜２＞の方法に従って、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０μL）を用いてエクソソームを溶解してｍｉＲＮＡを抽出および精製した（コントロール）。
（４）残り４本のチューブに、解離バッファーとして、０．１Ｍ、０．３Ｍもしくは０．５ＭのＫＣｌを含むＫＣｌ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、各濃度（Ｍ）のＫＣｌ］、またはＮａＣｌ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］、をそれぞれ１００μL添加して５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。解離バッファーとして、０．１ＭのＫＣｌを含む０．１Ｍ ＫＣｌ溶液、０．３ＭのＫＣｌを含む０．３Ｍ ＫＣｌ溶液、０．５ＭのＫＣｌを含む０．５Ｍ ＫＣｌ溶液、および０．５ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いた。また、解離バッファーとして０．０５ＭのＭｇＣｌ_２を含む０．０５Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液、０．１ＭのＭｇＣｌ_２を含む０．１Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液、および０．３ＭのＭｇＣｌ_２を含む０．３Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液を用いた以外は上記（１）〜（４）と同様にして、エクソソームを単離した（図４を参照のこと。）。

単離されたエクソソームのそれぞれについて、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。精製されたそれぞれのｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、解離バッファーを用いずにＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて、エクソソームを溶解することによって得られたｍｉＲ１４２-３ｐの濃度（コントロールの濃度）を１として、それぞれの相対濃度を算出し、表３および４に示した。

表３の結果より、０．１Ｍ ＫＣｌ溶液、０．３Ｍ ＫＣｌ溶液、０．５Ｍ ＫＣｌ溶液、または０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いた場合のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、コントロールの濃度１に対して、それぞれ０．０４、０．６０、１、または０．８８であることが分かった。このことから、本試験例において、解離バッファーとして１価の金属陽イオン溶液であるＫＣｌ溶液を用いた場合、ＫＣｌ溶液中のＫＣｌの濃度が０．３Ｍ以上であれば、複合体から十分量のエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。また、解離バッファーとして０．５ＭのＫＣｌ溶液を用いた場合では、コントロールの場合と同量のエクソソーム量を単離できたことが示された。さらに、解離バッファーとして、ＫＣｌ溶液と同じ１価の金属陽イオン溶液であるＮａＣｌ溶液を用いた場合（具体的には、０．５ＭのＮａＣｌ溶液を用いた場合）には、複合体から８８％のエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。

表４の結果より、０．０５Ｍ ＭｇＣｌ溶液、０．１Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液、または０．３Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、コントロールの濃度１に対して、それぞれ０．３２、０．５７、または０．９４であることが分かった。このことから、本試験例において、解離バッファーとして２価の金属陽イオン溶液であるＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合には、ＭｇＣｌ_２溶液中のＭｇＣｌ_２の濃度が０．０５Ｍであっても、複合体からエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。また、解離バッファーとして、ＭｇＣｌ_２の濃度が０．１Ｍ以上のＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合には、複合体から十分量のエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。さらに、解離バッファーとして、０．３ＭのＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合には、複合体から９４％のエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。

Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと異なり、ＮａＣｌ溶液およびＭｇＣｌ_２溶液は、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に対して影響を与えない。すなわち、ＫＣｌ溶液と同様に、ＮａＣｌ溶液およびＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合は、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた場合と比較して、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に対して、温和な条件でエクソソームを単離することが可能である。それ故に、ＫＣｌ溶液と同様に、ＮａＣｌ溶液およびＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合にも、エクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で単離できている可能性が高いと考えられる。

〔試験例４〕ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの回収
ペプチドとして一般的に市販されている長鎖ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジン等）を用い、かつ、担体としてシリカを用いた場合における、血清中のエクソソームの回収量と、従来法である免疫沈降法によって得られたエクソソームの回収量とを比較した。試験例４の実験操作手順の概略を、図６に示す。図６は、試験例４の実験操作手順の概略を示す図である。具体的な方法は以下の通りである。

上記＜６＞の方法に従って作製したポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＡまたはＢを用いて、上記＜７＞の方法に従って血清からエクソソームを回収した。

比較として、従来法である免疫沈降法によるエクソソームの回収を、上記＜５＞の方法に従って行なった。

回収されたエクソソームのそれぞれについて、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、２００μL使用した。精製されたそれぞれのｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、免疫沈降法によって回収されたエクソソームから得られたｍｉＲ１４２-３ｐの濃度を１として、それぞれの相対濃度を算出し、表５に示した。表５中、ポリリジンの分子量は、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズの作製に用いられた、市販されている長鎖ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジン）に含まれるポリリジンの分子量を示している。

表５の結果より、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＡまたはＢを用いた場合の、ｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、それぞれ１．６６または２．２７であることが分かった。このことから、ペプチドとして一般的に市販されている長鎖ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジン等）を用い、かつ、担体としてシリカを用いた場合であっても、血清からエクソソームを回収することができることが分かった。またこの場合、免疫沈降法によってエクソソームを回収した場合と比べて、１．６〜２．３倍と高い収量にてエクソソームを回収できることから、従来法とよりも極めて効率よくエクソソームを回収できることがわかった。

〔試験例５〕ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの単離
解離バッファーを使用した場合における、血清中のエクソソームを含む複合体からの、エクソソームの単離量について評価した。試験例５の実験操作手順の概略を、図７に示す。図７は、試験例５の実験操作手順の概略を示す図である。具体的な方法は以下の通りである。具体的な方法は以下の通りである。

まず、上記＜７＞の方法に従って、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢを用いて、血清からエクソソームを回収した。

次に、エクソソームを複合体として含むポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢ（０．２ｍｇ）を含むチューブに、解離バッファーとして、０．５ＭのＭｇＣｌ_２を含むＭｇＣｌ_２溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２］を１００μL添加して５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。

その後、単離されたエクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。精製されたそれぞれのｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。

また、コントロールとして、〔試験例４〕によって得られたｍｉＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。

ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、コントロールのｍｉＲ１４２-３ｐの濃度を１として、解離バッファーを用いて単離した場合の相対濃度を算出し、表６に示した。

表６の結果より、解離バッファーを用いた場合のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、コントロールの濃度１に対して、０．６７であることが分かった。このことから、解離バッファーとしてＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合、複合体からエクソソームを解離させることが可能であることが分かった。上述したように、ＭｇＣｌ_２溶液を用いた場合は、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた場合と比較して、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に対して、非常に温和な条件でエクソソームを単離することが可能であるといえる。それ故に、ＭｇＣｌ_２溶液用いた場合には、エクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で単離できている可能性が高いと考えられる。

〔試験例６〕エクソソームの精製度の評価
本発明の単離方法を用いて血清からエクソソームを単離した場合の、エクソソームの精製度を、血清中の夾雑タンパク質の除去の程度を指標として、評価した。

血清としては、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（シグマ社製）を用いた。まず、血清に含まれるタンパク質の濃度およびエクソソームの量の測定を行ない、単離前のタンパク質濃度およびエクソソーム量とした。試験例６における、血清に含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の、実験操作手順の概略を図８の（ａ）に示す。具体的には以下の通りである。図８は、試験例６の実験操作手順の概略を示す図であり、図８の（ａ）は、試験例６における、血清に含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の、実験操作手順の概略を示す図である。
（１）血清を、遠心分離機を用いて、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心を行ない、血球等の成分を沈殿させた。
（２）沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。
（３）このように前処理した血清上清のうち０．１ｍLを１．５ｍLのマイクロチューブに加えた。
（４）チューブ中の０．１ｍLの血清上清のうち、５０μLを用いてタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度の測定は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて行なった。
（５）血清上清のうち残りの５０μLを用いて、上記＜２＞の方法に従って、ｍｉＲＮＡを抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。
（６）精製したｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、血清中のエクソソーム量を測定した。

上記（４）で得られたタンパク質濃度および上記（６）で得られたエクソソーム量を、単離前のタンパク質濃度およびエクソソーム量とし、表７に示した。

次に、本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法を用いて血清からエクソソームを単離した後に、解離バッファーに含まれるタンパク質の濃度およびエクソソームの量の測定を行ない、単離後のタンパク質濃度およびエクソソーム量とした。試験例６における、解離バッファーに含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の実験操作手順の概略を図８の（ｂ）に示す。図８の（ｂ）は、試験例６における、解離バッファーに含まれるタンパク質の濃度およびエクソソーム量の測定の実験操作手順の概略を示す図である。具体的には、以下の通りである。
（７）上記（２）において得られた、前処理した血清上清のうち０．１ｍLを１．５ｍLのマイクロチューブに加え、当該チューブに０．４ｍLのＰＢＳを添加して血清上清を希釈し、血清溶液（０．５ｍL）を得た。当該血清溶液（０．５ｍL）を２本調製した。
（８）上記２本の血清溶液（０．５ｍL）うち１本を用いて、上記＜４＞の方法に従って、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いて、血清からエクソソームを回収した。また、上記２本の血清溶液（０．５ｍL）うち別の１本を用いて、上記＜７＞の方法に従って、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢを用いて、血清からエクソソームを回収した。ここで、エクソソームを複合体として含む、ポリリジン固定化磁性ビーズまたはポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢの洗浄にはＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）の換わりにＰＢＳを使用した。
（９）上記（８）で得られたチューブのうち、エクソソームを複合体として含むＫ８固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を含むチューブに、解離バッファーとして、ＫＣｌ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＫＣｌ］、を１００μL添加した。その後、５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。また、上記（８）で得られたチューブのうち、エクソソームを複合体として含むポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢ（０．２ｍｇ）を含むチューブに、解離バッファーとして、ＭｇＣｌ_２溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２］、を１００μL添加した。その後、５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。
（１０）上記（９）において単離されたエクソソーム（１００μL、２本）のそれぞれを、５０μLずつ２等分し、２等分されたうちの５０μLのそれぞれを用いてタンパク質濃度を測定した。Ｋ８固定化磁性ビーズを用いて得られたエクソソームについて、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて行なった。ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢを用いて得られたエクソソームについて、タンパク質濃度の測定は、バイオ・ラッドプロテインアッセイ（バイオ・ラッド社製）を用いて行った。
（１１）上記（９）において単離されたエクソソーム（１００μL、２本）のうち、２等分されたうちの残りの５０μL（血清５０μLに相当する）のそれぞれを用いて、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを、上記＜２＞の方法に従って抽出および精製した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３５０μL使用した。
（１２）精製したｍｉＲＮＡについて、上記＜３＞の方法に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ１４２-３ｐの量を定量し、エクソソーム量を測定した。

上記（１０）で得られたタンパク質濃度および上記（１２）で得られたエクソソーム量を、単離後のタンパク質濃度およびエクソソーム量とした。Ｋ８固定化磁性ビーズまたはポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢを用いて単離された単離後のタンパク質濃度およびエクソソーム量を、それぞれ表７に示した。

表７において、ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、Ｋ８固定化磁性ビーズまたはポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢを用いて単離された単離後のエクソソームから抽出されたｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度を算出し、示した。ここで、血清上清から直接抽出したｍｉＲＮＡを用いて得られたｍｉＲ１４２-３ｐの濃度（単離前の濃度）を１とした。また、表７中、エクソソーム量（Ｅ）／μLは、血清１μLあたりのエクソソーム量を示しており、エクソソーム量（Ｅ）／タンパク質（μｇ）は、タンパク質濃度（μｇ／μL）および血清１μLあたりのエクソソーム量（Ｅ）に基づき、タンパク質１μｇあたりのエクソソーム量を算定し、示している。エクソソームの精製度は、血清中の夾雑タンパク質の除去の程度に基づき、当該タンパク質の除去の程度が大きいほど、エクソソームの精製度が高いことを意味する。従って、エクソソーム量（Ｅ）／タンパク質（μｇ）の値が大きい方が、エクソソームの精製度が高いことを意味する。

ここで、表７において、単離前のエクソソーム量（Ｅ）／タンパク質（μｇ）の値を（ｘ）とする。また、Ｋ８固定化磁性ビーズで単離後のエクソソーム量（Ｅ）／タンパク質（μｇ）の値を（ｙ）とし、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢで単離後のエクソソーム量（Ｅ）／タンパク質（μｇ）の値を（ｚ）とする。

ｘ／ｘの値（１）を単離前のエクソソームの精製度とし、ｙ／ｘの値（４１８４）をＫ８固定化磁性ビーズで単離後のエクソソームの精製度とし、ｚ／ｘの値（４．５８）をポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢで単離後のエクソソームの精製度とした。それぞれのエクソソームの精製度を、表７に示した。

表７の結果を参照して、まず、エクソソームの量（ｍｉＲ１４２-３ｐの量）を比較する。単離前の濃度１に対して、Ｋ８固定化磁性ビーズで単離後のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、０．２０であり、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢで単離後のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、０．０２であることが分かった。

次に、タンパク質濃度を比較する。単離前の濃度８８．３６４に対して、Ｋ８固定化磁性ビーズで単離後のタンパク質濃度は、０．００４２３と、単離前の濃度と比較して極めて小さいことが分かった。また、ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢで単離後のタンパク質濃度は、０．３８５９μｇ／μLと、単離前の濃度と比較して大きく減少したことが分かった。このことから、本発明の単離方法によれば、血清中のタンパク質の大部分を取り除くことが可能であり、特に、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いた場合には、血清中のタンパク質を劇的に取り除くことが可能であることが分かった。

次に、エクソソームの精製度について比較する。なお、エクソソームの精製度は、タンパク質濃度を指標として評価した。ポリＬリジン−シリカ磁性ビーズＢで単離することによって約４．６倍程度エクソソームを精製できており、Ｋ８固定化磁性ビーズで単離することによって、約４２００倍程度エクソソームを精製できていることが分かった。このことから、本発明の単離方法によれば、エクソソームを精製することが可能であり、特に、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いた場合には、エクソソームを極めて純度よく精製することが可能であることが分かった。

〔試験例７〕本発明の単離方法で単離したエクソソームの電子顕微鏡観察
本発明の単離方法で単離したエクソソームについて、電子顕微鏡による観察を行い、本発明の単離方法によって、インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離できているかを確認した。

具体的な実験方法は、以下の通りである。
（１）まず、上記＜４＞の方法に従って、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いて、血清からエクソソームを回収した。ここで、エクソソームを複合体として含むＫ８固定化磁性ビーズの洗浄には、ＰＢＳ（＋０．０１％ＢＳＡ）の換わりにＰＢＳを用いた。
（２）次に、エクソソームを複合体として含むＫ８固定化磁性ビーズ（０．５ｍｇ）を含むチューブに、解離バッファーとして、１００μLのＫＣｌ溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＫＣｌ］を添加した。５分間振盪することによって、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（１００μL）を単離し、エクソソームを単離した。
（３）次に、エクソソームを含む解離バッファー（１００μL）を、遠心分離機に供し、１２，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離を行い、その上清（１００μL）を回収することによって、解離バッファーから磁性ビーズを完全に取り除いた。
（４）遠心分離後の上清（１００μL）に、４００μLのＰＢＳで添加して希釈液（０．５ｍL）を調製した。
（５）上記希釈液（０．５ｍL）を、限外ろ過用スピンカラム（ＢＩＯＭＡＸ ５０Ｋ ＮＭＷＬ ＭＥＭＢＲＡＮＥ ０．５ＭＬ ＶＯＬ、ミリポア社製）に添加した。希釈液を添加した限外ろ過用スピンカラムを遠心分離機に供し、１２，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。これによって、希釈液を５０μL程度まで濃縮して、エクソソーム濃縮液を調製した。
（６）次に、以下の操作によって、エクソソームの電子顕微鏡試料台への固定化を行なった。
（６−１）電子顕微鏡試料台にカーボンテープを付けた後、その上にアルミホイルを貼付けた。
（６−２）上記アルミホイル上に、２０μLのポリ−Ｌ−リジン溶液（分子量１５０，０００-３００，０００）［シグマ社製］を滴下した後、１０分間静置することによって、アルミホイル上にポリ−Ｌ−リジンを固定化した。
（６−３）未結合のポリ−Ｌ−リジンを取り除くために、超純水２０μLで３回洗浄を行なった。
（６−４）ポリ−Ｌ−リジンを固定化した電子顕微鏡試料台に、上記（５）で調製したエクソソーム濃縮液２０μLを滴下した後、１時間静置することによって、エクソソームを電子顕微鏡試料台に結合させた。
（６−５）さらに、２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳを、電子顕微鏡試料台に結合したエクソソームに２０μL滴下した後、１時間静置することによって、エクソソームの電子顕微鏡試料台への固定化を行なった。
（７）上記（６）で電子顕微鏡試料台へ固定化されたエクソソームを、超純水２０μLで４回洗浄を行ない、室温で、一晩自然乾燥させた。
（８）オートファインコーター（ＪＦＣ-１６００、日本電子株式会社製）を用いて、プラチナコーティングを行なった後、電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ-ＳＥＭ、ＳＩＧＭＡ ＶＰ、カールツァイス社製）によりエクソソームの観察を行なった。

結果を図９に示す。図９は、単離されたエクソソームの電子顕微鏡観察の結果を示す図である。

図９において、１００ｎｍ程度の大きさを持つエクソソームとみられる構造体を観察することができた。観察されたエクソソームは、球状の形態が保たれていることから、膜構造（具体的には脂質二重膜）を保った状態（ほぼ保った状態）であると考えられる。この結果から、本発明の単離方法であれば、インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離できていることが分かった。

本発明によると、簡便に、かつインタクトな状態（インタクトに近い状態）でエクソソームを単離することができる。したがって、本発明によると、エクソソームの内部に包含される物質の解析を簡便に、かつ、詳細に行なうことができるようになる。従って、本発明は、種々の技術分野、とりわけ、製薬および医療分野等において有用である。

Claims (5)

1. エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、
   前記試料と、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、
   前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの単離方法。
2. 前記ペプチドに含まれるリジンは連続していることを特徴とする、請求項１に記載のエクソソームの単離方法。
3. 前記ペプチドに含まれるリジンは、８つ以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載のエクソソームの単離方法。
4. 前記担体は、磁性ビーズであることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のエクソソームの単離方法。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のエクソソームの単離方法を行なうためのエクソソームの単離キットであって、
   前記ペプチド、前記担体、および前記解離バッファー、を含むことを特徴とする、エクソソームの単離キット。