JPWO2011142484A1 - Viral infection drug containing polyalkyleneimine - Google Patents
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Abstract
本発明は新規なウイルス感染症治療薬を提供することを目的とする。本発明は、ポリアルキレンイミンと、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種とを含む医薬組成物を提供する。ポリアルキレンイミンと中性もしくは負荷電のリポソームやキトサンを併用すると、ポリアルキレンイミンの細胞毒性を低減させるか、あるいは抗ウイルス活性を高めることができる。It is an object of the present invention to provide a novel therapeutic agent for viral infection. The present invention provides a pharmaceutical composition comprising a polyalkylenimine and at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan. When polyalkyleneimine is used in combination with neutral or negatively charged liposomes or chitosan, the cytotoxicity of polyalkyleneimine can be reduced, or the antiviral activity can be increased.
Description
本発明は、ウイルス感染症治療薬に関する。本発明は特に、ポリアルキレンイミンを含むウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for viral infection. The present invention particularly relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing viral infections comprising polyalkyleneimines.
近年、様々なウイルスが引き起こすウイルス感染症が大きな問題となっている。例えば単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）は、初感染後に潜伏感染し、回帰発症して性器ヘルペスを起こす病原体である。その罹患率は高く、現在の薬剤による治療法では一生涯潜伏感染から抜け出すことは不可能であるとされる。さらに最近になって、ＨＳＶ−２はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染拡大や発症刺激の因子としても注目されるようになってきており（例えば非特許文献１参照）、ＨＳＶ−２感染症の薬物療法はエイズ対策の上からも重要な課題となっている。
現在ヘルペス治療薬としては、抗ウイルス薬であるアシクロビルやビダラビン等の核酸アナログが知られている。しかしこれらの抗ウイルス薬は、ウイルス感染細胞内に入ってウイルス増殖を阻害するため、ウイルス側が薬剤の影響から抜け出すために変異を起こし薬剤耐性を獲得する可能性が高く、治療が長期に及ぶ場合には薬剤耐性ウイルスの出現に注意する必要がある。そこで、これまでの治療薬とは作用機序が異なるウイルス感染症治療薬が求められている。
薬剤耐性ウイルスの出現を阻止するという観点からすると、従来のようにウイルス感染細胞内に入るのではなく、宿主細胞がウイルスに感染する以前にウイルスを不活化することができるウイルス感染治療薬が望ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて宿主細胞に感染する以前のウイルスを不活化する方法としては、例えば特許文献１に記載の方法が知られている。
特許文献１に記載の発明は、平均分子量が５００〜８，０００の範囲にあるポリエチレンイミンを主成分とするウイルス不活化剤を血液や体液等からなるサンプルに加えることで、各種検査測定値に影響を与えることなくサンプルに含まれているウイルスを不活化してウイルス感染を予防するというものである。しかしながら、ポリエチレンイミンは生体に対して高い毒性を有することが知られている。毒性は生細胞を用いない場合にはそれほど問題とはならないが、生細胞が関与する評価系の場合、特に医薬の分野においては新規治療薬を開発するにあたり大きな問題となる。そのため、高い毒性を有するポリエチレンイミンを生体に投与した際にどのように作用するか、特に医薬として使用できる可能性があるかどうかについてはこれまで殆ど調べられてこなかった。
ポリエチレンイミンを生体に投与した数少ない例としては特許文献２が挙げられる。特許文献２には、Ｃ１８アシル基などの疎水性基を導入した分子量８７，０００の直鎖ポリエチレンイミンを希釈してマウスに腹腔内投与すると、インターフェロンγの発現が誘導される等の免疫賦活効果がみられることが記載されている。しかし特許文献２の実施例では、特定の分子量を有し且つ特定の疎水性基が導入されている直鎖ポリエチレンイミンをマウスの腹腔内に投与することしか示していない。ポリエチレンイミンは様々な構造および分子量をとり得るポリマーであるが、特許文献２に開示されているもの以外の、例えば他の分子量を有するポリアルキレンイミンや、分岐鎖あるいは未変性のポリアルキレンイミンを生体に投与した際の作用について実験した例はこれまで知られていない。また、併用する物質によってポリアルキレンイミンの生体への作用が変化しうる可能性についてもこれまで検討されたことはない。In recent years, viral infections caused by various viruses have become a major problem. For example, herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is a pathogen that latently infects after initial infection and causes recurrent genital herpes. Its prevalence is high, and it is said that it is impossible to get out of latent infection for the rest of the life with current drug therapies. More recently, HSV-2 has been attracting attention as a factor for the spread of infection and onset stimulation of human immunodeficiency virus (HIV) (see, for example, Non-Patent Document 1). Drug therapy is an important issue for AIDS countermeasures.
At present, nucleic acid analogs such as acyclovir and vidarabine, which are antiviral drugs, are known as therapeutic drugs for herpes. However, these antiviral drugs enter the virus-infected cells and inhibit virus growth, so the virus side is likely to mutate to get out of the effects of the drug and acquire drug resistance, and treatment is long-term Therefore, it is necessary to pay attention to the emergence of drug-resistant viruses. Thus, there is a need for a therapeutic agent for viral infection that has a different mechanism of action from conventional therapeutic agents.
From the standpoint of preventing the emergence of drug-resistant viruses, it is desirable to have a virus infection therapeutic agent that can inactivate the virus before the host cell is infected with the virus, rather than entering the virus-infected cell as in the past. . As a method for inactivating a virus before infecting a host cell in vitro, for example, a method described in Patent Document 1 is known.
The invention described in Patent Document 1 adds a virus inactivating agent mainly composed of polyethyleneimine having an average molecular weight in the range of 500 to 8,000 to a sample made of blood, body fluid, etc. In this method, the virus contained in the sample is inactivated without affecting the virus infection. However, polyethyleneimine is known to have high toxicity to living bodies. Toxicity is not so much a problem when living cells are not used, but in the case of an evaluation system involving living cells, it becomes a big problem in developing new therapeutic agents, particularly in the field of medicine. For this reason, there has been little investigation so far regarding how it acts when a highly toxic polyethyleneimine is administered to a living body, particularly whether it can be used as a medicine.
Patent document 2 is mentioned as a few examples which administered polyethyleneimine to the biological body. Patent Document 2 discloses an immunostimulatory effect, such as the expression of interferon γ is induced when a linear polyethyleneimine having a molecular weight of 87,000 introduced with a hydrophobic group such as a C18 acyl group is diluted and administered intraperitoneally to a mouse. It is described that is seen. However, the example of Patent Document 2 only shows that a linear polyethyleneimine having a specific molecular weight and having a specific hydrophobic group introduced therein is administered into the abdominal cavity of a mouse. Polyethyleneimine is a polymer that can have various structures and molecular weights, but other than those disclosed in Patent Document 2, for example, polyalkyleneimines having other molecular weights or branched or unmodified polyalkyleneimines There have been no known examples of experiments conducted on the effects of administration. Moreover, the possibility that the action of the polyalkyleneimine on the living body can be changed depending on the substance used in combination has never been studied.
本発明は、新規なウイルス感染症治療薬を提供することを目的とする。本発明は特に、ポリアルキレンイミンを含むウイルス感染症治療薬において、ポリアルキレンイミンの細胞毒性を低減させ、あるいは抗ウイルス活性を高めることを目的とする。
本発明者らは、研究の結果、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種の物質をポリアルキレンイミンと併用することにより、ポリアルキレンイミンの細胞毒性が低減するか、あるいはポリアルキレンイミンの抗ウイルス活性が高まることを見出した。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）重量平均分子量が３００〜４００，０００の範囲であるポリアルキレンイミン、ならびに中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種を含む、ウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物。
（２）重量平均分子量が３００〜４００，０００の範囲であるポリアルキレンイミン、ならびに負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種を含む、（１）に記載の医薬組成物。
（３）キトサンとしてオリゴキトサンを含む、（１）または（２）に記載の医薬組成物。
（４）負荷電のリポソームとして硫酸コレステロールリポソームおよびオレイン酸修飾リポソームから選択される少なくとも１種を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ポリアルキレンイミンが直鎖または分岐鎖のポリエチレンイミンである、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）ウイルス感染症がヘルペスウイルス感染症である、（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
本発明によれば、より細胞毒性が低く、あるいは抗ウイルス効果が高い、比較的安価なウイルス感染症治療薬を提供することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−１１２５１８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。An object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for viral infection. The object of the present invention is to reduce the cytotoxicity of polyalkyleneimine or to increase the antiviral activity, particularly in a therapeutic drug for viral infections containing polyalkyleneimine.
As a result of research, the present inventors have reduced the cytotoxicity of polyalkyleneimine by using at least one substance selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan in combination with polyalkylenimine, or It has been found that the antiviral activity of polyalkyleneimines is enhanced.
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) To treat or prevent a viral infection comprising a polyalkylenimine having a weight average molecular weight in the range of 300 to 400,000, and at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan Pharmaceutical composition.
(2) The pharmaceutical composition according to (1), comprising a polyalkylenimine having a weight average molecular weight in the range of 300 to 400,000, and at least one selected from negatively charged liposomes and chitosan.
(3) The pharmaceutical composition according to (1) or (2), comprising oligochitosan as chitosan.
(4) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (3), comprising at least one selected from cholesterol sulfate liposomes and oleic acid-modified liposomes as negatively charged liposomes.
(5) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (4), wherein the polyalkyleneimine is a linear or branched polyethyleneimine.
(6) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5), wherein the viral infection is a herpesvirus infection.
According to the present invention, it is possible to provide a relatively inexpensive viral infection therapeutic agent with lower cytotoxicity or higher antiviral effect.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2010-112518, which is the basis of the priority of the present application.
図１は、ポリエチレンイミンとリポソームを併用した場合における細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
図２は、リポソームを単独で用いた細胞毒性試験の結果を表すグラフである。
図３は、硫酸コレステロールリポソームを単独で用いた細胞毒性試験の結果を表すグラフである。
図４は、キトサンを単独で用いた細胞毒性試験の結果を表すグラフである。
図５は、ポリエチレンイミンとキトサンを併用した場合における細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
図６は、共焦点レーザー顕微鏡により撮影された写真である。蛍光標識ポリエチレンイミンが細胞内に取り込まれたことが確認できる。
図７は、実施例３のＨＳＶ−２動物感染実験１における感染スコアの推移を表したグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of a cytotoxicity test when polyethyleneimine and liposomes are used in combination.
FIG. 2 is a graph showing the results of a cytotoxicity test using liposomes alone.
FIG. 3 is a graph showing the results of a cytotoxicity test using a cholesterol sulfate liposome alone.
FIG. 4 is a graph showing the results of a cytotoxicity test using chitosan alone.
FIG. 5 is a graph showing the results of a cytotoxicity test when polyethyleneimine and chitosan are used in combination.
FIG. 6 is a photograph taken with a confocal laser microscope. It can be confirmed that the fluorescently labeled polyethyleneimine has been taken up into the cells.
FIG. 7 is a graph showing the transition of infection score in HSV-2 animal infection experiment 1 of Example 3.
本発明で用いるポリアルキレンイミンとは、例えばエチレンイミン、プロピレンイミン、ブチレンイミン、ジメチルエチレンイミン、ペンチレンイミン、ヘキシレンイミン、ヘプチレンイミン、オクチレンイミンといった炭素数２〜８のアルキレンイミン、特に炭素数２〜４のアルキレンイミンの１種または２種以上を常法により重合して得られるポリマー、ならびにそれらを種々の化合物と反応させて化学的に変性させたポリマーを意味する。これらのポリアルキレンイミンの中でも、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が本発明において特に好ましい。
ポリエチレンイミンは、例えばエチレンイミンを二酸化炭素、塩酸、臭化水素酸、ｐ−トルエンスルホン酸、塩化アルミニウムまたは三フッ化ホウ素などを触媒として開環重合させるなどの製法により合成することができるポリマーであり、接着、コーティング、ラミネートなどの幅広い分野で広く使用されている。本発明に用いることができる具体的なポリエチレンイミンとしては、例えば日本触媒社から市販されているエポミン（登録商標）（型番：ＳＰ−００３、ＳＰ−００６、ＳＰ−０１２、ＳＰ−０１８、ＳＰ−２００およびＰ−１０００）、和光純薬工業社から市販されているポリエチレンイミン（販売元コード１６１−１７８３１（平均分子量約６００）、販売元コード１６７−１７８１１（平均分子量約１，８００）、および販売元コード１６４−１７８２１（平均分子量約１０，０００））、ポリサイエンシーズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から市販されているポリエチレンイミン（カタログ番号２３９６６−２（直鎖状、ＭＷ２５，０００））、ＢＡＳＦ社から市販されているルパゾール（Ｌｕｐａｓｏｌ，登録商標）（型番：Ｌｕｐａｓｏｌ ＦＧ、Ｌｕｐａｓｏｌ Ｇ２０、Ｌｕｐａｓｏｌ Ｇ３５、およびＬｕｐａｓｏｌ ＰＲ８５１５）などを挙げることができる。
ポリエチレンイミンを含むポリアルキレンイミンは、製法を選択することによって様々な分子量のものを合成することができ、また直鎖状あるいは分岐状のものを合成することができる。例えば、直鎖状のポリエチレンイミンは式：
ポリアルキレンイミンは製法によって様々な構造をとり得るが、本発明におけるポリアルキレンイミンは直鎖あるいは分岐鎖のいずれでもよい。またポリアルキレンイミンは様々な分子量をとりうるが、本発明で用いるポリアルキレンイミンの重量平均分子量は３００〜４００，０００の範囲内である。特に重量平均分子量が３００〜３０，０００、中でも２，０００〜３０，０００、とりわけ２，０００〜２５，０００の範囲であるとより好ましい。本発明で用いるポリアルキレンイミンの重量平均分子量は２，０００〜５，０００の範囲が最も好ましい。なお、ここでいう重量平均分子量とは水溶性糖類（和光純薬社製マルトトリオースおよびマルトヘキサオース、ならびに昭和電工社製プルランＰ−８２など）を標準物質として用いてＧＰＣ（ゲルパーミエイションクロマトグラフィー）法によって測定したものである。
ポリアルキレンイミンは未変性のものであっても、種々の化合物と反応させて化学的に変性、すなわち窒素原子上に置換基を導入させたものであってもよい。ポリアルキレンイミンは、例えばアルデヒド、ケトン、アルキルハライド、イソシアネート、チオイソシアネート、アルケン、アルキン、ビニル化合物（アクリロニトリル等）、エポキシ化合物（エピクロルヒドリン等）、シアナマイド、グアニジン、尿素、有機酸（脂肪酸等）、酸無水物、アシルハライドと反応させて変性させることができる。また、変性によりポリアルキレンイミンの窒素原子上に導入される置換基としては、例えばＣ１−６アルキル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ２−６アルケニル、アシル、アミド（これらの基はさらにヒドロキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、アシル、アミド、スルホニル、スルフィニル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６ハロアルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−６ハロアルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、フェニル、ベンジル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ３−６シクロアルケニルおよび３〜６員の飽和、部分的不飽和または芳香族複素環により置換されていてもよい）が挙げられる。ポリアルキレンイミンと各種化合物との反応例は以下の式のとおりである。
変性させたポリアルキレンイミンの具体例としては、ポリアルキレンイミンエトキシレート、特にポリエチレンイミンエトキシレートが挙げられる。ポリアルキレンイミンエトキシレートとは、ポリアルキレンイミンの窒素原子上にポリエチレングリコール鎖が結合した構造を有するポリマーである。ポリアルキレンイミンエトキシレートは、例えばポリアルキレンイミンにエポキシ化合物を反応させることによって合成することができる。より具体的には、例えばポリエチレンイミンエトキシレートは、窒素雰囲気下、高温、高圧、触媒存在の条件でポリエチレンイミンにエチレンオキサイドを液中フィードすることにより、ポリエチレンイミン中のアミノ基に含まれる活性水素を基点としてエチレンオキサイドを付加させて合成することができる。本発明に用いることができる具体的なポリアルキレンイミンエトキシレートとしては、ポリエチレンイミンエトキシレートであって、重量平均分子量が２，０００〜１５，０００程度、好ましくは４，０００〜１２，０００、特に５，５００〜１０，０００程度であり、無水フタル化法で測定した水酸基価が５０〜５００ｍｇＫＯＨ／ｇ、好ましくは７０〜４００ｍｇＫＯＨ／ｇであるものが好ましい。中でも、ポリエチレンイミンを中心とするデンドリマー構造を有するポリエチレンイミンエトキシレートが特に好ましい。利用可能なポリエチレンイミンエトキシレートの例としては、例えば日本触媒社製のエポミンＳＰ−００６あるいはＳＰ−０１８にエチレンオキサイドを反応させて調製したものが挙げられる。
ポリアルキレンイミンは非常に強いカチオン性のポリマーである。これに対し、ウイルスの表面に存在し宿主細胞と結合する役割を果たす蛋白質は負に帯電していることが知られている。それゆえ、ポリアルキレンイミンをウイルスが存在する環境に投与すると、ポリアルキレンイミンはウイルス表面に静電的に吸着し、その結果ウイルスが宿主細胞の細胞膜に吸着したり、細胞内に侵入したりすることを阻止してウイルスを不活化する。つまりポリアルキレンイミンは生体内でウイルスに直接的に作用してウイルスを不活化するのであり、例えば生体の免疫機能を向上させる免疫賦活剤によっては治療または予防できないウイルス感染症に特に有効である。
ポリアルキレンイミンは、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種と併用することにより、抗ウイルス活性を向上させ、また細胞毒性を低減させることができる。従って、本発明のウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物は、ポリアルキレンイミンと、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種とを含む。中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンは、そのうち２種以上をポリアルキレンイミンと併用してもかまわない。
リポソームとは、リン脂質２分子膜からなり、中に水を含む閉鎖系の脂質小胞体（ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ））である。本発明で用いるリポソームの種類としては特に制限はなく、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、単ラメラ小胞（ＳＵＶ、ＬＵＶ）などのいずれのタイプでもよく、またその調製法も薄膜法、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、エタノール注入法など公知のいずれの手法を用いてもよい。また得られたリポソームの粒径をエクストルーダーや高圧乳化機、超音波等を用いて調整してもよい。
リポソーム膜成分としてはリン脂質など公知の各種脂質を使用することができる。例えば天然由来のホスファチジルコリン（卵黄レシチン、大豆レシチンなど）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリンやこれらの水添品、および合成により得られるジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジセチルホスフェート、ジヘキサデシルホスフェート、ジオクタデシルジメチルアンモニウム塩、ステアリルアミン、ならびにその他の人工脂質等を単独または混合して使用できる。
また、リポソーム膜成分として、膜を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするためにコレステロール、コレステロールコハク酸、硫酸コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール、あるいはスチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）を単独または混合して使用できる。
製造時に用いる成分によって、リポソームを正荷電または負荷電のもの、あるいは中性のもの（すなわち正にも負にも荷電していないもの）とすることができる。本発明においてポリアルキレンイミンと併用するリポソームとしては、中性もしくは負荷電のリポソームが好ましい。中性のリポソームとしては、例えば卵黄レシチンや大豆レシチンといった中性のリン脂質とコレステロールなどの中性のステロールとを用いて製造されたものが挙げられる。負荷電のリポソームとしては、例えば中性の脂質と中性のステロールに加えて、硫酸コレステロールのような負に荷電したステロールを用いて製造されたもの（本明細書において、硫酸コレステロールを膜成分として含むリポソームを硫酸コレステロールリポソームと称する）、あるいは予め調製した中性リポソームをオレイン酸のような脂肪酸などで修飾して製造されたものが挙げられる。リポソームを他の化合物で修飾する方法は当業者に知られている。なお、本発明で用いるリポソームの粒径は特に限定されるものではないが、例えば０．１５μｍ以下であるとより好ましい。中性または負荷電のリポソーム、特に負荷電のリポソームと併用することにより、ポリアルキレンイミンを細胞内に運ぶことができ、ポリアルキレンイミンの抗ウイルス作用を細胞内でも発揮させることが可能となる。すなわち、ポリアルキレンイミンはカチオン性であるため、それ単独では細胞表面に吸着することはできても細胞内に侵入することは難しいと考えられるが、中性または負荷電のリポソーム、特に負荷電のリポソームと併用することにより、細胞膜を通過し細胞内に侵入することが可能になると考えられる。
キトサンとは、多糖類の１種であり、Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合した高分子化合物である。本発明で用いるキトサンとしては、分子量が比較的小さいオリゴキトサンが好ましい。オリゴキトサンの重合度は、例えば３〜１００、特に５〜５０、とりわけ１０〜３０程度であるのが好ましい。
本発明のポリアルキレンイミンならびに中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種を含む医薬組成物は、非特異的な抗ウイルス作用（ウイルスの増殖を抑制してウイルス性疾患の予防と治療をはかる作用）を有する。すなわち本発明の医薬組成物は、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のヘルペスウイルス科に属するウイルス（これらをヘルペスウイルスと総称する）、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス（これらをインフルエンザウイルスと総称する）等のオルトミクソウイルス科に属するウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のレトロウイルス科に属するウイルス、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルス等のパラミクソウイルス科に属するウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス等のピコルナウイルス科に属するウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等のヘパドナウイルス科に属するウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルス等のフラビウイルス科に属するウイルス、ヒトアデノウイルス等のアデノウイルス科に属するウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳウイルス等のコロナウイルス科に属するウイルス、風疹ウイルス等のトガウイルス科に属するウイルス、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス等のラブドウイルス科に属するウイルス、エボラウイルス等のフィロウイルス科に属するウイルス、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）等のパポーバウイルス科に属するウイルスといった種々のウイルスに対して抗ウイルス作用を有し、これらのウイルスへの感染により発症する感染症の治療に有効である。例えば、本発明の医薬組成物は、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルスおよびライノウイルスに対して優れた抗ウイルス作用を有し、これらのウイルスへの感染により発症する感染症の治療に有効である。これらの中でも、本発明の医薬組成物は、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科およびラブドウイルス科等に属するエンベロープを有するウイルス、特にヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスのようなエンベロープを有するウイルスに対して優れた抗ウイルス作用を有し、これらのウイルスへの感染により発症する感染症の治療に有効である。また、ヘルペスウイルスには重量平均分子量２，３１０〜４，６００程度の分岐状あるいは重量平均分子量２５，０００程度の直鎖状のポリエチレンイミンを用いた医薬組成物が、麻疹ウイルスには重量平均分子量２，３１０程度の分岐状のポリエチレンイミンを用いた医薬組成物が、インフルエンザウイルスには重量平均分子量１０，０００程度のポリエチレンイミンエトキシレートを用いた医薬組成物が、コロナウイルスには重量平均分子量１，４７０〜３２１，２００程度の分岐状のポリエチレンイミンあるいは重量平均分子量１０，０００程度のポリエチレンイミンエトキシレートを用いた医薬組成物が特に有効である。
とりわけ本発明の医薬組成物は、ヘルペスウイルスへの感染により発症する口唇ヘルペス、ヘルペス口内炎、ヘルペス角膜炎、性器ヘルペス、新生児ヘルペス、水痘および帯状疱疹等のヘルペスウイルス感染症の予防または治療に有効であり、中でも単純ヘルペスウイルス２型の感染により発症する性器ヘルペスの予防または治療に特に有効である。さらに本発明の医薬組成物は、アシクロビルなどの従来の抗ウイルス薬に対する耐性を獲得したウイルスに対しても有効である。また本発明の医薬組成物は、これらの他にもインフルエンザ、ＡＩＤＳ、麻疹、おたふくかぜ、ポリオ、かぜ症候群、肝炎、日本脳炎、西ナイル熱、ＳＡＲＳ、風疹、狂犬病、エボラ出血熱、尖圭コンジローマ、疣および子宮頸がんの予防あるいは治療にも有効である。
本発明の医薬組成物は、ポリアルキレンイミンと、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサンから選択される少なくとも１種を、そのままで、あるいは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して製剤化することができる。一般的には、目的に応じて経口投与、静脈内投与、局所投与、経皮もしくは経粘膜投与などの使用に適した剤形で投与される。各種の剤形としては、例えば経口投与のための内服剤、経静脈投与を含む非経口投与のための注射剤、あるいは経皮もしくは経粘膜投与を含む外用投与のための外用剤（外皮用剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、口腔剤もしくは吸入剤など）が挙げられる。なお、外用剤とは内服剤及び注射剤を除いた人体へ直接用いる全ての薬剤を意味する。また外用投与とは目、鼻、耳、口腔、肛門、皮膚もしくは粘膜に直接薬剤を投与することを意味し、経皮もしくは経粘膜投与がこれに含まれる。
内服剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤などを含む。このような液剤は、活性物質を一般的に用いられる希釈剤（例えば、精製水、エタノールまたはそれらの混液など）に溶解、懸濁または乳化させることにより得られる。さらに液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤または緩衝剤などを含有していてもよい。
外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤および点鼻剤などが含まれる。
軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば活性物質を基剤に研和、または溶融させて調製する。軟膏基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（例えば、アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステルまたはオレイン酸エステルなど）、ロウ類（例えば、ミツロウ、鯨ロウまたはセレシンなど）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステルなど）、高級アルコール（例えば、セタノール、ステアリルアルコールまたはセトステアリルアルコールなど）、シリコン油（例えば、ジメチルポリシロキサンなど）、炭化水素類（例えば、親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリンまたは流動パラフィンなど）、グリコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはマクロゴールなど）、植物油（例えば、ヒマシ油、オリーブ油、ごま油またはテレピン油など）、動物油（例えば、ミンク油、卵黄油、スクワランまたはスクワレンなど）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれる基剤を単独でまたは２種以上混合して用いる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させて調製する。ゲル基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、低級アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロピルアルコールなど）、ゲル化剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはエチルセルロースなど）、中和剤（例えば、トリエタノールアミンまたはジイソプロパノールアミンなど）、界面活性剤（例えば、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなど）、ガム類、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ばれる基剤を単独でまたは２種以上混合して用いる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融または乳化させて製造される。クリーム基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（例えば、プロピレングリコールまたは１，３−ブチレングリコールなど）、高級アルコール（例えば、２−ヘキシルデカノールまたはセタノールなど）、乳化剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類または脂肪酸エステル類など）、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ばれる基剤を単独でまたは２種以上混合して用いる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、増粘剤（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラチンまたはメチルセルロースなど）、湿潤剤（例えば、尿素、グリセリンまたはプロピレングリコールなど）、充填剤（例えば、カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウムまたはマグネシウムなど）、水、溶解補助剤、粘着付与剤およびかぶれ防止剤から選ばれる基剤を単独でまたは２種以上を混合して用いる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤およびかぶれ防止剤から選ばれる基剤を単独でまたは２種以上混合して用いる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を水、アルコール（例えば、エタノールまたはポリエチレングリコールなど）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤および懸濁化剤などから選ばれる基剤の１種または２種以上に溶解、懸濁または乳化させて製造する。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。
噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。
注射剤としては、すべての注射剤を含み、点滴剤をも包含する。例えば、筋肉への注射剤、皮下への注射剤、皮内への注射剤、動脈内への注射剤、静脈内への注射剤、腹腔内への注射剤、脊髄腔への注射剤および静脈内への点滴剤などを含む。
注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類などおよびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはポリソルベート８０（登録商標）など）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤または保存剤などを含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
点眼剤には、点眼液、懸濁型点眼液、乳濁型点眼液、用時溶解型点眼液および眼軟膏が含まれる。これらの点眼剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いる。点眼剤の溶剤としては、例えば、滅菌精製水、生理食塩水、その他の水性溶剤または注射用非水性溶剤（例えば、植物油など）などおよびそれらの組み合わせが用いられる。点眼剤は、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなど）、緩衝化剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなど）、界面活性化剤（例えば、ポリソルベート８０（商品名）、ステアリン酸ポリオキシル４０、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、安定化剤（例えば、クエン酸ナトリウムまたはエデト酸ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）などを必要に応じて適宜選択して含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか、無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば、凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の滅菌精製水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤または吸入用液剤が含まれ、当該吸入用液剤は使用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁させて使用する形態であってもよい。これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）、着色剤、緩衝化剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウムまたは濃グリセリンなど）、増粘剤（例えば、カルボキシビニルポリマーなど）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（例えば、ステアリン酸およびその塩など）、結合剤（例えば、デンプンまたはデキストリンなど）、賦形剤（例えば、乳糖またはセルロースなど）、着色剤、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器（例えば、アトマイザーまたはネブライザー）が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使用される。
外用投与のためのその他の組成物としては、活性物質を含有し常法により処方される直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリーなどが含まれる。
本発明の医薬組成物の投与法としては、特にウイルス感染症を発症している局所への外用投与、中でも経皮もしくは経粘膜投与が好ましい。また、本発明の医薬組成物はポリアルキレンイミンの濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以下となるよう外用投与することが好ましく、特に０．００４ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう外用投与することが好ましい。一方、投与量は、ポリアルキレンイミンの重量を基準として、例えば哺乳動物の場合１日あたり体重１ｋｇにつき０．００１〜５０ｍｇ程度とするのが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与はウイルス感染の前もしくは後のいずれに行ってもよいが、特にウイルス感染前あるいは感染直後に投与すると良好な効果を発揮する。ウイルス感染動物に対する投与は１日のみであっても、数日連続して行ってもよい。外用投与においては、特にポリアルキレンイミン濃度が１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ程度、とりわけ２０ｍｇ／ｍｌ程度の比較的濃度が高い剤形での投与の場合は１日のみの投与でも十分な効果を発揮する。また０．００４ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ程度、特に０．００４ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度、中でも０．００４ｍｇ／ｍｌ〜０．４ｍｇ／ｍｌ程度の比較的濃度が低い剤形での投与の場合は、一定日数、例えば２週間程度、あるいは少なくとも３〜７日程度連続して投与することが好ましい。投与は一日あたり１回でもよく、または２〜３回あるいは４〜５回に分けて行ってもよい。
ポリアルキレンイミンの毒性は、ポリアルキレンイミンを変性させることによっても抑えることができる。例えばポリアルキレンイミンをポリアルキレンイミンエトキシレート、特にポリエチレンイミンエトキシレートとすることにより生体に対する毒性を抑えることができる。
本発明の医薬組成物は、ポリアルキレンイミン、中性もしくは負荷電のリポソームおよびキトサン以外の他の活性物質を含んでいてもよい。他の活性物質としては公知の抗ウイルス薬、例えばアシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、ソリブジン、ブリブジン、ガンシクロビル、バルガンシクロビル塩酸塩、ホスカルネットナトリウム水和物、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、サニルブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、インジナビル、サキナビル、ロピナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、エンフュヴィルタイド、アデフォビル、エンテカビルおよびリバビリン、ならびにポビドンヨード等のヨウ素系消毒剤およびクロルヘキシジンのような殺ウイルス効果を有する消毒剤が挙げられる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。The polyalkyleneimine used in the present invention is, for example, an alkyleneimine having 2 to 8 carbon atoms such as ethyleneimine, propyleneimine, butyleneimine, dimethylethyleneimine, pentyleneimine, hexyleneimine, heptyleneimine, octyleneimine, particularly 2 to 2 carbon atoms. It means a polymer obtained by polymerizing one or more of 4 alkyleneimines by a conventional method, and a polymer chemically modified by reacting them with various compounds. Among these polyalkyleneimines, polyethyleneimine (PEI) is particularly preferable in the present invention.
Polyethyleneimine is a polymer that can be synthesized by a method such as ring-opening polymerization using ethyleneimine as a catalyst with carbon dioxide, hydrochloric acid, hydrobromic acid, p-toluenesulfonic acid, aluminum chloride, boron trifluoride, or the like. Yes, it is widely used in a wide range of fields such as adhesion, coating, and lamination. Specific polyethyleneimines that can be used in the present invention include, for example, Epomin (registered trademark) (model number: SP-003, SP-006, SP-012, SP-018, SP- 200 and P-1000), polyethyleneimine commercially available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (sales code 161-17831 (average molecular weight about 600), sales code 167-17811 (average molecular weight about 1,800), and sales Original code 164-17821 (average molecular weight of about 10,000)), polyethyleneimine (catalog number 23966-2 (linear, MW 25,000)) commercially available from Polysciences, Inc., BASF Lupasol (registered trademark) commercially available from the company Model Number: Lupasol FG, Lupasol G20, Lupasol G35, and Lupasol PR8515) and the like.
Polyalkyleneimines including polyethyleneimine can be synthesized with various molecular weights by selecting a production method, and can be synthesized with linear or branched ones. For example, linear polyethyleneimine has the formula:
The polyalkyleneimine can have various structures depending on the production method, but the polyalkyleneimine in the present invention may be either linear or branched. The polyalkyleneimine can have various molecular weights, but the weight average molecular weight of the polyalkyleneimine used in the present invention is in the range of 300 to 400,000. In particular, the weight average molecular weight is preferably 300 to 30,000, more preferably 2,000 to 30,000, and particularly preferably 2,000 to 25,000. The weight average molecular weight of the polyalkyleneimine used in the present invention is most preferably in the range of 2,000 to 5,000. The weight average molecular weight referred to here is GPC (gel permeation) using water-soluble sugars (such as maltotriose and maltohexaose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and pullulan P-82 manufactured by Showa Denko KK) as standard substances. Chromatography) method.
The polyalkyleneimine may be unmodified or may be chemically modified by reacting with various compounds, that is, having a substituent introduced on the nitrogen atom. Polyalkyleneimines include, for example, aldehydes, ketones, alkyl halides, isocyanates, thioisocyanates, alkenes, alkynes, vinyl compounds (such as acrylonitrile), epoxy compounds (such as epichlorohydrin), cyanamides, guanidines, ureas, organic acids (such as fatty acids), acids It can be modified by reacting with an anhydride or acyl halide. Examples of the substituent introduced onto the nitrogen atom of the polyalkyleneimine by modification include C 1-6 Alkyl, C 1-6 Hydroxyalkyl, C 2-6 Alkenyl, acyl, amide (these groups are further hydroxy, halo, cyano, nitro, acyl, amide, sulfonyl, sulfinyl, C 1-6 Alkyl, C 1-6 Haloalkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Haloalkenyl, C 2-6 Alkynyl, C 2-6 Haloalkynyl, C 1-6 Alkoxy, C 1-6 Haloalkoxy, phenyl, benzyl, C 3-6 Cycloalkyl, C 3-6 And optionally substituted with 3-6 membered saturated, partially unsaturated or aromatic heterocycles. Examples of the reaction of polyalkyleneimine with various compounds are as follows.
Specific examples of the modified polyalkyleneimine include polyalkyleneimine ethoxylates, particularly polyethyleneimine ethoxylates. The polyalkyleneimine ethoxylate is a polymer having a structure in which a polyethylene glycol chain is bonded to the nitrogen atom of the polyalkyleneimine. The polyalkyleneimine ethoxylate can be synthesized, for example, by reacting an epoxy compound with polyalkyleneimine. More specifically, for example, polyethyleneimine ethoxylate is an active hydrogen contained in an amino group in polyethyleneimine by feeding ethylene oxide into polyethyleneimine in a liquid under a nitrogen atmosphere at high temperature, high pressure and in the presence of a catalyst. It can be synthesized by adding ethylene oxide from the base point. A specific polyalkyleneimine ethoxylate that can be used in the present invention is polyethyleneimine ethoxylate, and has a weight average molecular weight of about 2,000 to 15,000, preferably 4,000 to 12,000. It is preferably about 5,500 to 10,000 and has a hydroxyl value measured by an anhydrous phthalation method of 50 to 500 mgKOH / g, preferably 70 to 400 mgKOH / g. Among these, polyethyleneimine ethoxylate having a dendrimer structure centered on polyethyleneimine is particularly preferable. Examples of usable polyethyleneimine ethoxylates include those prepared by reacting ethylene oxide with Epomin SP-006 or SP-018 manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.
Polyalkyleneimines are very strong cationic polymers. In contrast, proteins that exist on the surface of viruses and play a role in binding to host cells are known to be negatively charged. Therefore, when a polyalkyleneimine is administered to an environment where viruses are present, the polyalkyleneimines are electrostatically adsorbed on the surface of the virus, resulting in the virus adsorbing to the cell membrane of the host cell or entering the cell. To prevent it and inactivate the virus. In other words, polyalkylenimines act directly on viruses in vivo to inactivate viruses, and are particularly effective for viral infections that cannot be treated or prevented by immunostimulants that improve the immune function of the body, for example.
Polyalkyleneimine can improve antiviral activity and reduce cytotoxicity when used in combination with at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan. Therefore, the pharmaceutical composition for treating or preventing the viral infection of the present invention comprises polyalkyleneimine and at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan. Two or more of neutral or negatively charged liposomes and chitosan may be used in combination with polyalkyleneimine.
Liposomes are closed lipid vesicles (vesicles) composed of phospholipid bilayers and containing water therein. The type of liposome used in the present invention is not particularly limited, and any type such as multilamellar vesicles (MLV) and single lamellar vesicles (SUV, LUV) may be used. Any known method such as a spray drying method, a reverse phase evaporation method, a surfactant removal method, or an ethanol injection method may be used. Moreover, you may adjust the particle size of the obtained liposome using an extruder, a high-pressure emulsifier, an ultrasonic wave, etc.
Various known lipids such as phospholipids can be used as the liposome membrane component. For example, naturally occurring phosphatidylcholine (egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, ceramide, sphingomyelin and their hydrogenated products, and synthetically obtained dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine Dimyristoyl phosphatidylcholine, dicetyl phosphate, dihexadecyl phosphate, dioctadecyldimethylammonium salt, stearylamine, and other artificial lipids can be used alone or in combination.
In addition, as a liposome membrane component, cholesterol, cholesterol succinic acid, cholesterol sulfate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, etc. to stabilize the membrane physically or chemically and regulate the fluidity of the membrane Sterols derived from these animals, or plant-derived sterols (phytosterols) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol can be used alone or in combination.
Depending on the components used at the time of manufacture, the liposomes can be positively charged or negatively charged, or neutral (ie, positively or negatively charged). In the present invention, the liposome used in combination with the polyalkyleneimine is preferably a neutral or negatively charged liposome. Examples of neutral liposomes include those produced using neutral phospholipids such as egg yolk lecithin and soybean lecithin and neutral sterols such as cholesterol. As negatively charged liposomes, for example, in addition to neutral lipids and neutral sterols, those produced using negatively charged sterols such as cholesterol sulfate (in this specification, cholesterol sulfate is used as a membrane component). And liposomes prepared by modifying a neutral liposome prepared in advance with a fatty acid such as oleic acid. Methods for modifying liposomes with other compounds are known to those skilled in the art. The particle size of the liposome used in the present invention is not particularly limited, but is more preferably 0.15 μm or less, for example. By using in combination with neutral or negatively charged liposomes, particularly negatively charged liposomes, the polyalkyleneimine can be carried into the cell, and the antiviral action of the polyalkyleneimine can be exhibited within the cell. That is, since polyalkyleneimine is cationic, it can be adsorbed on the cell surface by itself, but it is difficult to enter the cell, but neutral or negatively charged liposomes, particularly negatively charged liposomes. By using in combination with liposomes, it is thought that it becomes possible to pass through the cell membrane and enter the cell.
Chitosan is a kind of polysaccharide and is a polymer compound in which D-glucosamine is bonded to β-1,4. As chitosan used in the present invention, oligochitosan having a relatively small molecular weight is preferable. The degree of polymerization of the oligochitosan is, for example, preferably about 3 to 100, particularly about 5 to 50, especially about 10 to 30.
The pharmaceutical composition comprising the polyalkyleneimine of the present invention and at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan has a nonspecific antiviral action (preventing viral diseases by inhibiting viral growth). And the action of treating. That is, the pharmaceutical composition of the present invention comprises herpesviruses such as herpes simplex virus type 1 (HSV-1), herpes simplex virus type 2 (HSV-2), varicella-zoster virus (VZV) and cytomegalovirus (CMV). Viruses belonging to the family Orthomyxoviridae such as viruses belonging to the family (collectively referred to as herpes viruses), influenza A viruses, influenza B viruses, influenza C viruses (collectively referred to as influenza viruses), and human immunodeficiency Viruses belonging to retroviridae such as virus (HIV), viruses belonging to paramyxoviridae such as measles virus and mumps virus, viruses belonging to picornaviridae such as poliovirus, rhinovirus and hepatitis A virus, type B Viruses belonging to the family Hepadnaviridae such as flame virus, viruses belonging to Flaviviridae such as hepatitis C virus, Japanese encephalitis virus and West Nile virus, viruses belonging to the adenoviridae family such as human adenovirus, coronavirus, SARS virus Viruses belonging to the Coronaviridae family, viruses belonging to the Togaviridae family such as rubella virus, viruses belonging to the Rhabdoviridae family such as rabies virus and vesicular stomatitis virus, viruses belonging to the Filoviridae family such as Ebola virus, and human papillomaviruses It has an antiviral action against various viruses such as viruses belonging to the family of papovaviridae such as (HPV), and is effective in the treatment of infectious diseases caused by infection with these viruses. For example, the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent antiviral action against herpes virus, influenza virus, human immunodeficiency virus, measles virus, poliovirus and rhinovirus, and develops upon infection with these viruses. It is effective in treating infectious diseases. Among these, the pharmaceutical composition of the present invention includes herpesviridae, orthomyxoviridae, retroviridae, paramyxoviridae, hepadnaviridae, flaviviridae, coronaviridae, togaviridae and rhabdoviridae Have an excellent antiviral action against viruses having an envelope belonging to, such as herpes virus, measles virus, influenza virus, coronavirus and human immunodeficiency virus, and infection with these viruses It is effective for the treatment of infections caused by Also, herpes virus has a pharmaceutical composition using a branched polyethyleneimine having a weight average molecular weight of about 2,310 to 4,600 or a linear polyethyleneimine having a weight average molecular weight of about 25,000, and measles virus has a weight average molecular weight. A pharmaceutical composition using about 2,310 branched polyethyleneimine, a pharmaceutical composition using polyethyleneimine ethoxylate having a weight average molecular weight of about 10,000 for influenza virus, and a weight average molecular weight of 1 for coronavirus. , A pharmaceutical composition using a branched polyethyleneimine having a molecular weight of about 470 to 321,200 or a polyethyleneimine ethoxylate having a weight average molecular weight of about 10,000 is particularly effective.
In particular, the pharmaceutical composition of the present invention is effective for the prevention or treatment of herpesvirus infections such as cold sores, herpes stomatitis, herpes keratitis, genital herpes, neonatal herpes, chicken pox and shingles caused by infection with herpes virus. In particular, it is particularly effective for the prevention or treatment of genital herpes caused by herpes simplex virus type 2 infection. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention is effective against viruses that have acquired resistance to conventional antiviral drugs such as acyclovir. In addition to these, the pharmaceutical composition of the present invention includes influenza, AIDS, measles, mumps, polio, cold syndrome, hepatitis, Japanese encephalitis, West Nile fever, SARS, rubella, rabies, Ebola hemorrhagic fever, warts and warts. It is also effective in preventing or treating cervical cancer.
The pharmaceutical composition of the present invention comprises a polyalkyleneimine and at least one selected from neutral or negatively charged liposomes and chitosan as it is or mixed with various pharmacologically acceptable formulation adjuvants. Can be Generally, it is administered in a dosage form suitable for use such as oral administration, intravenous administration, topical administration, transdermal or transmucosal administration depending on the purpose. Various dosage forms include, for example, oral preparations for oral administration, injections for parenteral administration including intravenous administration, or external preparations for external administration including transdermal or transmucosal administration (external preparation) Suppositories, eye drops, nasal drops, ear drops, buccal preparations or inhalants). In addition, an external preparation means all the chemical | medical agents used directly to the human body except an internal medicine and an injection. The topical administration means administration of the drug directly to the eyes, nose, ears, mouth, anus, skin or mucous membrane, and includes transdermal or transmucosal administration.
The internal preparations include pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs. Such a solution can be obtained by dissolving, suspending or emulsifying the active substance in a commonly used diluent (for example, purified water, ethanol or a mixture thereof). Furthermore, the liquid preparation may contain a wetting agent, suspending agent, emulsifying agent, sweetening agent, flavoring agent, fragrance, preservative or buffering agent.
Examples of the dosage form of the external preparation include ointments, gels, creams, poultices, patches, liniments, sprays, inhalants, sprays, aerosols, eye drops and nasal drops. .
The ointment is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is prepared by kneading or melting the active substance in a base. The ointment base is selected from known or commonly used ones. For example, higher fatty acids or higher fatty acid esters (for example, adipic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, adipic acid ester, myristic acid ester, palmitic acid ester, stearic acid ester or oleic acid ester), waxes (E.g., beeswax, whale wax or ceresin), surfactants (e.g., polyoxyethylene alkyl ether phosphates), higher alcohols (e.g., cetanol, stearyl alcohol or cetostearyl alcohol), silicone oils (e.g., Dimethylpolysiloxane), hydrocarbons (eg, hydrophilic petrolatum, white petrolatum, purified lanolin or liquid paraffin), glycols (eg, ethylene glycol, diethylene glycol, propylene) Glycol, polyethylene glycol or macrogol), vegetable oil (eg, castor oil, olive oil, sesame oil or turpentine oil), animal oil (eg, mink oil, egg yolk oil, squalane or squalene), water, absorption enhancer, rash The base selected from the inhibitors is used alone or in combination of two or more. Further, it may contain a humectant, a preservative, a stabilizer, an antioxidant or a flavoring agent.
The gel is produced by a known or commonly used formulation. For example, the active substance is prepared by melting in a base. The gel base is selected from known or commonly used ones. For example, lower alcohol (such as ethanol or isopropyl alcohol), gelling agent (such as carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose or ethylcellulose), neutralizing agent (such as triethanolamine or diisopropanolamine), A base selected from a surfactant (for example, polyethylene glycol monostearate), gums, water, an absorption accelerator and an anti-rash agent is used alone or in admixture of two or more. Furthermore, a preservative, an antioxidant or a flavoring agent may be included.
The cream is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is produced by melting or emulsifying an active substance in a base. The cream base is selected from known or commonly used ones. For example, higher fatty acid esters, lower alcohols, hydrocarbons, polyhydric alcohols (eg, propylene glycol or 1,3-butylene glycol), higher alcohols (eg, 2-hexyldecanol or cetanol), emulsifiers (eg, polyoxy Bases selected from ethylene alkyl ethers or fatty acid esters, etc.), water, absorption accelerators, and rash prevention agents are used alone or in admixture of two or more. Furthermore, a preservative, an antioxidant or a flavoring agent may be included.
The poultice is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is manufactured by melting an active substance in a base, and applying it as a kneaded product on a support. The poultice base is selected from known or commonly used ones. For example, thickeners (eg polyacrylic acid, polyvinylpyrrolidone, gum arabic, starch, gelatin or methylcellulose), wetting agents (eg urea, glycerin or propylene glycol), fillers (eg kaolin, zinc oxide, Bases selected from talc, calcium, magnesium, etc.), water, solubilizers, tackifiers and anti-rash agents are used alone or in admixture of two or more. Furthermore, a preservative, an antioxidant or a flavoring agent may be included.
The patch is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is produced by melting an active substance in a base and spreading and coating it on a support. The base for patch is selected from known or commonly used ones. For example, a base selected from a polymer base, fats and oils, higher fatty acids, tackifiers and anti-rash agents is used alone or in admixture of two or more. Furthermore, a preservative, an antioxidant or a flavoring agent may be included.
The liniment is produced by a known or commonly used formulation. For example, the active substance is dissolved, suspended, or dissolved in one or more bases selected from water, alcohol (for example, ethanol or polyethylene glycol), higher fatty acid, glycerin, soap, emulsifier and suspending agent. Produced by emulsification. Furthermore, a preservative, an antioxidant or a flavoring agent may be included.
Sprays, inhalants, and sprays are buffers that provide isotonicity with stabilizers such as sodium bisulfite in addition to commonly used diluents, such as sodium chloride, sodium citrate or citric acid. An isotonic agent such as
The injection includes all injections and also includes infusions. For example, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intraarterial injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, spinal cavity injection and vein Including instillation agents.
The injection includes a solid injection used by dissolving or suspending in a solution, suspension, emulsion, or solvent for use. An injection is used by dissolving, suspending or emulsifying an active substance in a solvent. As the solvent, for example, distilled water for injection, physiological saline, vegetable oil, propylene glycol, polyethylene glycol, alcohols such as ethanol, and combinations thereof are used. Furthermore, this injection contains a stabilizer, a solubilizing agent (for example, glutamic acid, aspartic acid or polysorbate 80 (registered trademark)), a suspending agent, an emulsifying agent, a soothing agent, a buffering agent or a preservative. Also good. These are sterilized in the final step or prepared by aseptic manipulation. In addition, a sterile solid preparation, for example, a lyophilized product, can be produced and used by dissolving it in sterilized or sterile distilled water for injection or other solvent before use.
The eye drops include eye drops, suspension type eye drops, emulsion type eye drops, in-use dissolved eye drops and eye ointments. These eye drops are produced according to known methods. For example, the active substance is dissolved, suspended or emulsified in a solvent. As a solvent for eye drops, for example, sterilized purified water, physiological saline, other aqueous solvents or non-aqueous solvents for injection (for example, vegetable oil) and the like and combinations thereof are used. Eye drops include isotonic agents (eg, sodium chloride, concentrated glycerin, etc.), buffering agents (eg, sodium phosphate or sodium acetate), surfactants (eg, polysorbate 80 (trade name), stearic acid) Polyoxyl 40 (for example, polyoxyethylene hydrogenated castor oil), stabilizer (for example, sodium citrate or sodium edetate), preservative (for example, benzalkonium chloride or paraben), etc., as appropriate It may be selected and included. These are sterilized in the final step or prepared by aseptic manipulation. In addition, an aseptic solid preparation, for example, a freeze-dried product can be produced and used by dissolving in aseptic or aseptically purified water or other solvent before use.
Inhalants include aerosols, inhalable powders or inhalable liquids, and the inhalable liquids may be used in the form of being dissolved or suspended in water or other suitable medium at the time of use. These inhalants are produced according to known methods. For example, in the case of inhalation solutions, preservatives (eg, benzalkonium chloride or parabens), colorants, buffering agents (eg, sodium phosphate or sodium acetate), isotonic agents (eg, chloride) Sodium or concentrated glycerin), a thickener (for example, carboxyvinyl polymer, etc.), an absorption enhancer, and the like, as necessary. In the case of powders for inhalation, lubricants (for example, stearic acid and its salts), binders (for example, starch or dextrin), excipients (for example, lactose or cellulose), colorants, antiseptics An agent (for example, benzalkonium chloride or paraben), an absorption enhancer and the like are appropriately selected as necessary. A nebulizer (for example, an atomizer or a nebulizer) is usually used when administering an inhalation solution, and an inhalation administration device for powder medicine is usually used when administering a powder for inhalation.
Other compositions for external administration include suppositories for rectal administration and pessaries for intravaginal administration containing active substances and formulated by conventional methods.
As a method for administering the pharmaceutical composition of the present invention, topical administration, particularly transdermal or transmucosal administration, is particularly preferred. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered externally so that the polyalkyleneimine concentration is 20 mg / ml or less, and particularly preferably externally administered so that the concentration is 0.004 mg / ml to 20 mg / ml. . On the other hand, the dose is preferably about 0.001 to 50 mg per kg of body weight per day based on the weight of polyalkylenimine, for example, in the case of mammals.
Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be carried out either before or after viral infection, but particularly when administered before or immediately after viral infection, good effects are exhibited. Administration to a virus-infected animal may be performed for only one day or for several consecutive days. In the case of external administration, especially in the case of administration in a dosage form having a relatively high polyalkylenimine concentration of about 10 mg / ml to 20 mg / ml, especially about 20 mg / ml, even a single-day administration exhibits a sufficient effect. To do. Also, in the case of administration in a dosage form having a relatively low concentration of about 0.004 mg / ml to 10 mg / ml, particularly about 0.004 mg / ml to 1 mg / ml, especially about 0.004 mg / ml to 0.4 mg / ml. Is preferably administered continuously for a certain number of days, for example, about 2 weeks, or at least about 3-7 days. Administration may be once per day, or may be divided into 2-3 times or divided into 4-5 times.
The toxicity of the polyalkyleneimine can also be suppressed by modifying the polyalkyleneimine. For example, the toxicity to a living body can be suppressed by using polyalkyleneimine ethoxylate, particularly polyethyleneimine ethoxylate.
The pharmaceutical composition of the present invention may contain other active substances other than polyalkyleneimine, neutral or negatively charged liposomes and chitosan. Other active substances include known antiviral drugs such as acyclovir, valacyclovir, penciclovir, famciclovir, vidarabine, idoxuridine, sorivudine, brivudine, ganciclovir, valganciclovir hydrochloride, foscarnet sodium hydrate, oseltamivir, Zanamivir, amantadine, rimantadine, zidovudine, didanosine, zalcitabine, sanilvudine, lamivudine, abacavir, tenofovir, emtricitabine, nevirapine, efavirenz, delavirdine, indinavir, saquinavir, lopinavir, rionavir rennaviravir Iodine-based disinfectants such as fuvirtide, adefovir, entecavir and ribavirin, and povidone iodine Disinfectant with viral killing effect as fine chlorhexidine and the like.
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
［実施例１：ポリエチレンイミンとリポソームまたはキトサンを併用した場合のウイルス活性］
１．サンプル調製法
（１）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
分岐状ポリエチレンイミンであるエポミンＳＰ−０１２（日本触媒社製、ＧＰＣ法による重量平均分子量３，６１０）を用いた。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１００ｍｇ／ｍＬの濃度とし、濃塩酸または希塩酸を用いてｐＨを７．０付近に調整した。
（２）リポソーム（Ｌｉｐｏ：中性リポソーム）
リポソームは、卵黄レシチン（ＥＰＣ：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油社製）とコレステロール（Ｃｈ：和光純薬工業社製、試薬特級）を用い、ＥＰＣ：Ｃｈ＝５：５（モル比）として、修正エタノール注入法により調製した。
各成分をナス型フラスコ中で適量のエタノール（和光純薬工業社製）に溶解させ、６０℃の温浴中でロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡＮ−１０００、東京理科器械社製）により溶液量が１ｍＬ程度になるまでエタノールを留去した。これに同温度まで加温した９ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて振盪させたのち、再びエバポレーターによって完全にエタノールを留去した。この溶液にＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０ｍＬにメスアップして濃度調整を行った。
（３）オレイン酸修飾リポソーム（負荷電リポソーム）
オレイン酸リポソームは、卵黄レシチン（ＥＰＣ：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油社製）、コレステロール（Ｃｈ：和光純薬工業社製、試薬一級）およびオレイン酸を用い、ＥＰＣ：Ｃｈ：オレイン酸＝５：５：２（モル比）として、薄膜法により調製した。
各成分をナス型フラスコ中で適量のクロロホルム（和光純薬社製）に溶解させ、６０℃の温浴中、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡＮ−１０００、東京理科器械社製）を用いて、溶液がなくなりフラスコの内壁に薄膜が形成されるまでクロロホルムを留去した。これに同温度まで加温したＭｉｌｌｉ−Ｑ水９ｍＬを加えて壁面の脂質をはがすように振盪させたのち、再びエバポレーターによって完全にクロロホルムを留去させた。この溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０ｍＬにメスアップして濃度調整を行った。なお、必要に応じて、粒子径調整のためバス型超音波装置（ＢＲＡＮＳＯＮ２５１０Ｊ−ＭＴＨ、１００Ｗ、ＹＡＭＡＴＯ社製）で超音波照射を行い、粒子径を調整した。また、粒子径とゼータ電位は電気泳動光散乱光度計（ＥＬＳ−Ｚ２、大塚電子社製）を用いて、２５±１℃で測定した。
（４）オリゴキトサン
オリゴキトサンとして、ＧＨ−０２０（キトサン１０〜３０分子のオリゴマー、日本油脂社製）を使用した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で溶解して４０ｍｇ／ｍＬの濃度とし、ｐＨを６．２付近に調整した。
２．抗ウイルス活性測定試験法
Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）を用いて、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に対する各サンプルの増殖抑制効果を調べた。
Ｖｅｒｏ細胞を４８穴プレートに培養した。１日後に培地を除去し、ＨＳＶ−２を０．２ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｃｅｌｌ（細胞５個あたり１個のウイルス）で、室温で１時間感染させた。各サンプルは、培地で所定の濃度に希釈した後に、ウイルス感染と同時またはウイルス感染直後に加えた。２０時間後に収穫し、ウイルス量をプラークアッセイによって定量した。その結果から、各サンプルの５０％ウイルス増殖阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
上記とは別に、９６穴プレートにＶｅｒｏ細胞を培養し、所定の濃度に希釈したサンプルを加えた。７２時間培養し、トリパンブルー染色法で生細胞数をカウントし、５０％細胞増殖阻害濃度（ＣＣ５０）を求めた。得られたＣＣ５０値とＩＣ５０値から選択指数を求めた。
３．試験結果
ポリエチレンイミン（ＳＰ−０１２）のみ、ポリエチレンイミンとリポソーム（Ｌｉｐｏ）を併用したもの（１００ｍｇ／ｍＬのＳＰ−０１２と２０ｍｇ／ｍＬのリポソームを含む）、ポリエチレンイミンとオレイン酸修飾リポソームを併用したもの（１ｍｇ／ｍＬのＳＰ−０１２と２ｍｇ／ｍＬのオレイン酸修飾リポソームを含む）、ポリエチレンイミンとオリゴキトサンを併用したもの（１００ｍｇ／ｍＬのＳＰ−０１２と２ｍｇ／ｍＬのオリゴキトサンを含む）、ならびに対照としてアシクロビルをサンプルとして用いて選択指数を求めた。ウイルス感染と同時にサンプルを加えた際の結果を以下の表１に示す。なお、ＣＣ５０値とＩＣ５０値はポリエチレンイミンあるいはアシクロビルの濃度を表している。
次に、ウイルス感染と同時にサンプルを加えた場合と、ウイルス感染の直後にサンプルを加えた場合について選択指数を比較したデータを以下の表２に示す。サンプルとしては、ポリエチレンイミン（ＳＰ−０１２）単独のもの、およびポリエチレンイミンとオレイン酸修飾リポソームを併用したもの（１ｍｇ／ｍＬのＳＰ−０１２と２ｍｇ／ｍＬのオレイン酸修飾リポソームを含む）を用いた。
［実施例２：ポリエチレンイミンとリポソームまたはキトサンを併用した場合の細胞毒性］
１．細胞毒性試験方法
ＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜細胞（ヒト肺粘液性類表皮癌由来）においてＷＳＴ−８アッセイを行った。
ＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜細胞は１０％非動化ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１００μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞を実験の２４時間前に９６穴プレートに播種し、前培養した。各サンプルを培地で希釈して希釈系列を作製し、培養した細胞にゆっくりと添加した。その後、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。細胞生存率の計測は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。細胞生存率の算出には、以下の計算式を用いた。
硫酸コレステロールリポソーム（負荷電リポソーム）は、卵黄レシチン（ＥＰＣ：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油社製）、コレステロール（Ｃｈ：和光純薬工業社製、試薬一級）、硫酸コレステロール（ＣＳ：硫酸コレステロールナトリウム塩、ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、ＥＰＣ：Ｃｈ：ＣＳ＝５：５：２（モル比）とし薄膜法により調製した。
各成分をナス型フラスコ中で適量のクロロホルム（和光純薬社製）に溶解させ、６０℃の温浴中、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡＮ−１０００、東京理科器械社製）を用いて、溶液がなくなりフラスコの内壁に薄膜が形成されるまでクロロホルムを留去した。これに同温度まで加温したＭｉｌｌｉ−Ｑ水９ｍＬを加えて壁面の脂質をはがすように振盪させたのち、再びエバポレーターによって完全にクロロホルムを留去させた。この溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０ｍＬにメスアップして濃度調整を行った。なお、必要に応じて、粒子径調整のためバス型超音波装置（ＢＲＡＮＳＯＮ２５１０Ｊ−ＭＴＨ、１００Ｗ、ＹＡＭＡＴＯ社製）で超音波照射を行い、粒子径を調整した。また、粒子径とゼータ電位は電気泳動光散乱光度計（ＥＬＳ−Ｚ２、大塚電子社製）を用いて、２５±１℃で測定した。
上記１の手順に従って細胞毒性試験を行った。「ＰＥＩ」サンプル（対照）の試験は、ＰＥＩの濃度が５種類の濃度となるような希釈系列を作製して行った。「ＰＥＩ＋Ｌｉｐｏ（ＣＳ）２ｍｇ／ｍＬ」サンプルの試験は、希釈後にＬｉｐｏ（ＣＳ）の濃度が２ｍｇ／ｍＬで一定となり、且つＰＥＩの濃度が５種類の濃度となるような希釈系列を作製して行った。ＰＥＩまたはＰＥＩ＋Ｌｉｐｏ（ＣＳ）は、いずれも希釈系列を作製する前に予め６０℃で１時間インキュベートした。ＰＥＩの濃度に関する５種類の希釈系列は、いずれも１０００μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとした。Ｌｉｐｏ（ＣＳ）の粒子径は１５０ｎｍ以下、ゼータ電位は約−５０ｍＶであった。
試験の結果を図１に示す。Ｌｉｐｏ（ＣＳ）を併用した場合、ＰＥＩのみ使用した場合よりも細胞毒性が軽減する傾向がみられた。
３．リポソーム（Ｌｉｐｏ）または硫酸コレステロールリポソーム（Ｌｉｐｏ（ＣＳ））単独投与時の細胞毒性
リポソーム（中性リポソーム）を単独で用いて細胞毒性試験を行った。リポソームは実施例１の１（２）のように調製したものを用いた。結果を図２に示す。リポソーム単独投与では８ｍｇ／ｍＬまでの濃度において細胞毒性はみられなかった。
次に、硫酸コレステロールリポソーム（負荷電リポソーム）を単独で用いて細胞毒性試験を行った。結果を図３に示す。リポソームが８ｍｇ／ｍＬでも毒性を示さなかったのに対し、硫酸コレステロールリポソームでは２ｍｇ／ｍＬでも強い毒性を示した。この結果から、硫酸コレステロールリポソームがポリエチレンイミンの毒性を減弱させたのは、単独では細胞毒性となるほどの負電荷の影響であることが推察される。
４．ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とキトサンの併用時の細胞毒性
キトサンとしてオリゴキトサンＧＨ−０２０（キトサン１０〜３０分子のオリゴマー、日本油脂社製）を使用した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で溶解して４０ｍｇ／ｍＬの濃度とし、ｐＨを６．２付近に調整した。
予めキトサンを単独で用いて細胞毒性試験を行った。結果を図４に示す。キトサンの単独投与では２ｍｇ／ｍＬまでの濃度においては高い細胞生存率を示した。そこで、細胞毒性が認められなかった１ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの濃度のキトサンをＰＥＩと併用し、細胞毒性試験を行った。結果を図５に示す。ＰＥＩ単独投与時とＰＥＩとキトサン併用時の間には、有意な細胞毒性の差は見られなかった。キトサンの併用によってＰＥＩの細胞毒性は上昇しないことが明らかとなった。
５．共焦点レーザー顕微鏡によりポリエチレンイミン細胞内取り込みの確認
各細胞（ＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜細胞）を実験の２４時間前に３５ｍｍディッシュに播種し、前培養した。その後、蛍光標識ＰＥＩと、場合によりリポソーム（実施例１の１（２）のように調製したもの）を培地で希釈し、ゆっくりと細胞に投与し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、培地を取り除き、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌおよび０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を１ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑに溶かしたもの）で細胞を洗浄し、ＰＢＳで希釈した４％ホルムアルデヒドを加え、室温で１５分間インキュベートした。また、劣化を防ぐためにＡｑｕａ Ｐｏｌｙ／ｍｏｕｎｔ（ｐｏｌｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で細胞を覆い、カバーガラスを乗せた。固定した細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５ ＥＸＣＩＴＥＲ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で観察した。撮影した顕微鏡写真を図６に示す。ＰＥＩ単独投与の場合は細胞全体に蛍光標識による呈色がみられたのに対し、ＰＥＩとリポソームを併用した場合では細胞の核と思われる部分以外に呈色がみられた。これは、ＰＥＩ単独投与の場合は細胞表面にＰＥＩが留まるのに対し、ＰＥＩとリポソームを併用した場合では細胞内にＰＥＩが取り込まれたことを示唆している。このことから、リポソームがポリエチレンイミンを細胞内に輸送する役割を果たしていると推察される。
［実施例３：ＨＳＶ−２動物感染実験１］
単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に対する、ポリエチレンイミンとリポソームまたはキトサンの組み合わせの抗ウイルス作用について、マウスを用いた感染実験を行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢）（ｎ＝５）に、メドロキシプロゲステロン（３ｍｇ／０．１ｍＬ／匹）をウイルス接種の６日前および１日前に皮下注射した。マウスの局所（性器）にＨＳＶ−２を１匹当たり２０μＬずつ（１ｘ１０４ＰＦＵのウイルスを含有）接種した。サンプルの投与は、感染当日は感染１時間前と感染１２時間後に、翌日以降は１日２回（午前９時、午後６時）のペースで感染７日後まで続けた。
サンプルとして、ＰＢＳのみからなる対照、ポリエチレンイミン（ＳＰ−０１２）単独のもの、ポリエチレンイミンとオレイン酸修飾リポソーム（２．５ｍｇ／ｍＬ）を併用したもの、およびポリエチレンイミンとオリゴキトサン（ＧＨ−０２０、０．２ｍｇ／ｍＬ）を併用したものを用いた。対照以外の各サンプルは、１回あたり０．２ｍｇ／２０μＬ／匹のポリエチレンイミンを含むように調製した。
１、３、５日後に局所をＰＢＳで洗浄し、その中のウイルス量を測定した。また、１０日後まで死亡例や感染スコア（０：無症状、１：局所の軽度の炎症、２：浮腫を伴う中等度の炎症、３：浸出液のみられる重度の炎症、４：後肢の麻痺、５：死亡）を記録した。各サンプルにおけるウイルス量の推移と死亡例のデータを表３に、感染スコアの推移を図７に示す。
［実施例４：ＨＳＶ−２感染実験２］
ポリエチレンイミンを中性リポソームと組み合わせたサンプルのＨＳＶ−２に対する作用を感染前投与および感染後投与で比較することを目的とするマウスを用いた感染実験を行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢）（ｎ＝４）に、メドロキシプロゲステロン（３ｍｇ／０．１ｍＬ／匹）をウイルス接種の６日前および１日前に皮下注射した。マウスの局所にＨＳＶ−２を、１匹当たり２０μＬずつ（１ｘ１０４ＰＦＵのウイルスを含有）接種した。感染当日のサンプルの投与は、感染１時間前（Ａ）または感染１時間後（Ｂ）のいずれかに行った。翌日以降は１日２回（午前９時、午後６時）のペースでサンプルを投与し、感染３日目に局所をＰＢＳで洗浄し、その中のウイルス量を測定した。その結果を表４に示す。
サンプルとしては、ＰＢＳのみからなる対照、ポリエチレンイミン（ＳＰ−０１２）単独のもの、およびポリエチレンイミンと中性リポソーム（実施例１の１（２）で調製したもの、３６ｍｇ／ｍＬのリポソームを含む）を併用したものを用いた。投与量は、１回あたり１．０ｍｇ／２０μＬ／匹のポリエチレンイミンを含むように調製した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。[Example 1: Viral activity when polyethyleneimine and liposome or chitosan are used in combination]
1. Sample preparation method (1) Polyethyleneimine (PEI)
Epomin SP-012 (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd., weight average molecular weight 3,610 by GPC method), which is a branched polyethyleneimine, was used. The concentration was adjusted to 100 mg / mL with Milli-Q water, and the pH was adjusted to around 7.0 using concentrated hydrochloric acid or dilute hydrochloric acid.
(2) Liposomes (Lipo: neutral liposomes)
Liposomes are modified as EPC: Ch = 5: 5 (molar ratio) using egg yolk lecithin (EPC: COATSOME NC-50, manufactured by NOF Corporation) and cholesterol (Ch: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade). Prepared by ethanol injection method.
Each component is dissolved in an appropriate amount of ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an eggplant-shaped flask, and the volume of the solution is about 1 mL by a rotary evaporator (EYELAN-1000, manufactured by Tokyo Science Instruments Co., Ltd.) in a 60 ° C. warm bath. Until the ethanol was distilled off. To this was added 9 mL of Milli-Q water heated to the same temperature and shaken, and then ethanol was completely distilled off again using an evaporator. The solution was adjusted to 10 mL with Milli-Q water to adjust the concentration.
(3) Oleic acid modified liposome (negatively charged liposome)
The oleic acid liposome uses egg yolk lecithin (EPC: COATSOME NC-50, manufactured by NOF Corporation), cholesterol (Ch: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., first grade reagent) and oleic acid, and EPC: Ch: oleic acid = 5: It was prepared by a thin film method as 5: 2 (molar ratio).
Each component was dissolved in an appropriate amount of chloroform (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an eggplant-shaped flask, and the solution disappeared using a rotary evaporator (EYELAN-1000, manufactured by Tokyo Science Instrument Co., Ltd.) in a 60 ° C. warm bath. Chloroform was distilled off until a thin film was formed on the inner wall. To this, 9 mL of Milli-Q water heated to the same temperature was added and shaken so as to peel off the lipid on the wall surface, and then chloroform was completely distilled off again by an evaporator. The concentration of this solution was adjusted to 10 mL with Milli-Q water. In addition, if necessary, ultrasonic irradiation was performed with a bath type ultrasonic device (BRANSON 2510J-MTH, 100 W, manufactured by YAMATO) for particle size adjustment, and the particle size was adjusted. The particle size and zeta potential were measured at 25 ± 1 ° C. using an electrophoretic light scattering photometer (ELS-Z2, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
(4) Oligochitosan As oligochitosan, GH-020 (10-30 molecules of chitosan oligomer, manufactured by NOF Corporation) was used. It was dissolved in Milli-Q water to a concentration of 40 mg / mL, and the pH was adjusted to around 6.2.
2. Antiviral activity measurement test method Vero cells (African green monkey kidney-derived cells) were used to examine the growth inhibitory effect of each sample against herpes simplex virus type 2 (HSV-2).
Vero cells were cultured in 48-well plates. One day later, the medium was removed, and HSV-2 was infected with 0.2 PFU (plaque forming unit) / cell (one virus per 5 cells) for 1 hour at room temperature. Each sample was diluted with a medium to a predetermined concentration and then added at the same time as virus infection or immediately after virus infection. Harvested after 20 hours and viral load was quantified by plaque assay. From the results, the 50% virus growth inhibitory concentration (IC 50 ) of each sample was determined.
Separately from the above, Vero cells were cultured in a 96-well plate, and a sample diluted to a predetermined concentration was added. After culturing for 72 hours, the number of viable cells was counted by trypan blue staining, and a 50% cell growth inhibitory concentration (CC 50 ) was determined. A selection index was determined from the obtained CC 50 value and IC 50 value.
3. Test result Polyethyleneimine (SP-012) only, polyethyleneimine and liposome (Lipo) combined (including 100 mg / mL SP-012 and 20 mg / mL liposome), polyethyleneimine and oleic acid-modified liposomes combined (Including 1 mg / mL SP-012 and 2 mg / mL oleic acid-modified liposome), combined use of polyethyleneimine and oligochitosan (including 100 mg / mL SP-012 and 2 mg / mL oligochitosan), As a control, acyclovir was used as a sample to obtain a selection index. The results when samples were added simultaneously with virus infection are shown in Table 1 below. The CC 50 value and the IC 50 value represent the concentration of polyethyleneimine or acyclovir.
Next, Table 2 below shows data comparing the selectivity index when the sample was added simultaneously with the virus infection and when the sample was added immediately after the virus infection. The sample used was a polyethyleneimine (SP-012) alone or a combination of polyethyleneimine and oleic acid-modified liposomes (including 1 mg / mL SP-012 and 2 mg / mL oleic acid-modified liposomes). .
[Example 2: Cytotoxicity when polyethyleneimine is combined with liposome or chitosan]
1. Cytotoxicity test method WST-8 assay was performed on NCI-H292 mucosal cells (derived from human lung mucinous epidermoid carcinoma).
NCI-H292 mucosal cells were cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen) supplemented with 10% non-immobilized FBS (Fetal bovine serum, Invitrogen) and 100 μg / mL kanamycin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. did. Cells were seeded in 96-well plates 24 hours before the experiment and pre-cultured. Each sample was diluted with a medium to prepare a dilution series, which was slowly added to the cultured cells. The cells were then incubated for 24 hours at 37 ° C. The cell viability was measured by measuring the absorbance at 450 nm using Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories). The following formula was used to calculate the cell viability.
Each component was dissolved in an appropriate amount of chloroform (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an eggplant-shaped flask, and the solution disappeared using a rotary evaporator (EYELAN-1000, manufactured by Tokyo Science Instrument Co., Ltd.) in a 60 ° C. warm bath. Chloroform was distilled off until a thin film was formed on the inner wall. To this, 9 mL of Milli-Q water heated to the same temperature was added and shaken so as to peel off the lipid on the wall surface, and then chloroform was completely distilled off again by an evaporator. The concentration of this solution was adjusted to 10 mL with Milli-Q water. In addition, if necessary, ultrasonic irradiation was performed with a bath type ultrasonic device (BRANSON 2510J-MTH, 100 W, manufactured by YAMATO) for particle size adjustment, and the particle size was adjusted. The particle size and zeta potential were measured at 25 ± 1 ° C. using an electrophoretic light scattering photometer (ELS-Z2, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
Cytotoxicity tests were performed according to the above procedure 1. The test of the “PEI” sample (control) was performed by preparing a dilution series in which the concentration of PEI was 5 types. The test of the “PEI + Lipo (CS) 2 mg / mL” sample is performed by preparing a dilution series in which the Lipo (CS) concentration is constant at 2 mg / mL after dilution and the PEI concentration is 5 types. It was. PEI or PEI + Lipo (CS) was preincubated at 60 ° C. for 1 hour before preparing a dilution series. The five dilution series related to the concentration of PEI were 1000 μg / mL, 750 μg / mL, 500 μg / mL, 250 μg / mL, and 100 μg / mL. The particle size of Lipo (CS) was 150 nm or less, and the zeta potential was about −50 mV.
The test results are shown in FIG. When Lipo (CS) was used in combination, cytotoxicity tended to be reduced as compared with the case where only PEI was used.
3. Cytotoxicity when Liposomes (Lipo) or Cholesterol Sulfate Liposomes (Lipo (CS)) are Administered Cytotoxicity tests were conducted using liposomes (neutral liposomes) alone. Liposomes prepared as in Example 1 1 (2) were used. The results are shown in FIG. Cytotoxicity was not observed at concentrations up to 8 mg / mL with liposomes alone.
Next, a cytotoxicity test was performed using cholesterol sulfate liposomes (negatively charged liposomes) alone. The results are shown in FIG. Liposomes showed no toxicity even at 8 mg / mL, whereas cholesterol sulfate liposomes showed strong toxicity even at 2 mg / mL. From this result, it is presumed that the cholesterol sulfate liposomes attenuated the toxicity of polyethyleneimine due to the influence of negative charges that would cause cytotoxicity alone.
4). Cytotoxicity when polyethyleneimine (PEI) and chitosan are used in combination Oligochitosan GH-020 (10-30 molecule oligomer of chitosan, manufactured by NOF Corporation) was used as chitosan. It was dissolved in Milli-Q water to a concentration of 40 mg / mL, and the pH was adjusted to around 6.2.
A cytotoxicity test was previously performed using chitosan alone. The results are shown in FIG. Chitosan alone showed high cell viability at concentrations up to 2 mg / mL. Thus, a cytotoxicity test was performed using chitosan at a concentration of 1 mg / mL or 2 mg / mL, in which cytotoxicity was not observed, in combination with PEI. The results are shown in FIG. There was no significant difference in cytotoxicity between the administration of PEI alone and the combined use of PEI and chitosan. It was revealed that the combined use of chitosan did not increase the cytotoxicity of PEI.
5. Confirmation of polyethyleneimine intracellular uptake by confocal laser microscope Each cell (NCI-H292 mucosal cell) was seeded in a 35 mm dish and pre-cultured 24 hours before the experiment. Thereafter, fluorescently labeled PEI and optionally liposomes (prepared as in Example 1, 1 (2)) were diluted with medium, slowly administered to the cells, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, the medium was removed and PBS (8 g NaCl, 2.9 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.2 g KCl and 0.2 g KH 2 PO 4 dissolved in 1 L Milli-Q) ), And 4% formaldehyde diluted in PBS was added and incubated at room temperature for 15 minutes. Moreover, in order to prevent deterioration, the cells were covered with Aqua Poly / mount (manufactured by polysciences), and a cover glass was placed thereon. The fixed cells were observed with a confocal laser microscope (LSM5 EXCITER, manufactured by Carl Zeiss). The photographed micrograph is shown in FIG. When PEI alone was administered, coloration due to fluorescent labeling was observed throughout the cells, whereas when PEI and liposomes were used in combination, coloration was observed in areas other than the portion considered to be the cell nucleus. This suggests that PEI stays on the cell surface when PEI alone is administered, whereas PEI is taken up into cells when PEI and liposomes are used in combination. From this, it is inferred that the liposome plays a role of transporting polyethyleneimine into the cell.
[Example 3: HSV-2 animal infection experiment 1]
An infection experiment using mice was conducted on the antiviral effect of a combination of polyethyleneimine and liposome or chitosan against herpes simplex virus type 2 (HSV-2).
BALB / c mice (female, 6 weeks old) (n = 5) were injected subcutaneously with medroxyprogesterone (3 mg / 0.1 mL / animal) 6 and 1 day before virus inoculation. Mice were inoculated with 20 μL of HSV-2 (containing 1 × 10 4 PFU of virus) per mouse (genital). The administration of the sample was continued 1 hour before infection and 12 hours after infection on the day of infection, and then twice a day (9 am, 6 pm) after the next day until 7 days after infection.
As a sample, a control consisting of PBS alone, a polyethyleneimine (SP-012) alone, a combination of polyethyleneimine and oleic acid-modified liposome (2.5 mg / mL), and polyethyleneimine and oligochitosan (GH-020, 0.2 mg / mL) was used in combination. Each sample other than the control was prepared to contain 0.2 mg / 20 μL / animal polyethyleneimine per dose.
After 1, 3, and 5 days, the area was washed with PBS, and the amount of virus therein was measured. Also, deaths and infection scores until 10 days later (0: asymptomatic, 1: local mild inflammation, 2: moderate inflammation with edema, 3: severe inflammation with exudate, 4: hind limb paralysis, 5 : Death). Table 3 shows changes in viral load and death data in each sample, and FIG. 7 shows changes in infection score.
[Example 4: HSV-2 infection experiment 2]
Infection experiments were carried out using mice with the aim of comparing the effect of polyethyleneimine combined with neutral liposomes on HSV-2 between pre-infection administration and post-infection administration.
BALB / c mice (female, 6 weeks old) (n = 4) were injected subcutaneously with medroxyprogesterone (3 mg / 0.1 mL / animal) 6 and 1 day before virus inoculation. Each mouse was inoculated with 20 μL of HSV-2 (containing 1 × 10 4 PFU of virus) per mouse. Administration of samples on the day of infection occurred either 1 hour before infection (A) or 1 hour after infection (B). On the next day and after, the sample was administered twice a day (9 am, 6 pm), and the local area was washed with PBS on the third day of infection, and the amount of virus therein was measured. The results are shown in Table 4.
Samples include a PBS-only control, polyethyleneimine (SP-012) alone, and polyethyleneimine and neutral liposomes (prepared in Example 1, 1 (2), including 36 mg / mL liposomes) What used together was used. The dose was prepared to contain 1.0 mg / 20 μL / unit polyethyleneimine per dose.
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