JPWO2007018315A1 - Protein probes for detecting protein interactions with other molecules - Google Patents

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Abstract

本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動によりタンパク質と他の分子との相互作用を検出し得るタンパク質および該タンパク質を用いた相互作用の検出方法の提供を目的とする、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質との距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質である。The present invention relates to an energy donor for fluorescence resonance energy transfer for the purpose of providing a protein capable of detecting an interaction between a protein and another molecule by fluorescence resonance energy transfer, and a method for detecting an interaction using the protein. A protein comprising a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance and a fluorescently labeled amino acid labeled with an energy acceptor, wherein the steric structure changes when bound to a molecule capable of binding to the protein, and an energy donor It is a protein in which two types of fluorescently labeled amino acids exist at positions where the distance and orientation between the fluorescent substance and the energy acceptor fluorescent substance change, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer can be changed.

Description

本発明は、２種類の蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブに関する。   The present invention relates to a protein probe containing two types of fluorescently labeled amino acids and detecting an interaction between the protein and another molecule.

タンパク質と他の分子との相互作用を検出する技術として、表面プラズモン共鳴を利用した検出技術があった。しかしながら、表面プラズモン共鳴を測定するためには、金属薄膜を形成させた基板上にタンパク質を固定化する必要があり、固定化により立体構造が変化することも考えられる。従って、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を捉えることは困難であった。
また、蛍光標識したタンパク質に他の物質が結合した際の蛍光偏光度の増加を測定することにより、タンパク質と他の物質との結合を測定する技術も存在する。しかし、この方法によって、測定できるのはタンパク質と他の物質との結合の有無であり、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を捉えることはできなかった。
さらに、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をタンパク質に結合させることで、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を、蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することが行なわれている（特許文献１および２を参照）。
エネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質としては、化学修飾によりそれらを結合させたタンパク質、化学合成によりそれらを結合させたタンパク質、遺伝子融合により緑色蛍光タンパク質およびその改変体を結合させたタンパク質、などがある。
例えば、緑色蛍光を発する分子と赤色蛍光を発する分子をタンパク質に結合させることにより、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。また、青緑色蛍光タンパク質と黄色蛍光タンパク質をタンパク質のＮ末端とＣ末端に結合させることでも、同様にタンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。
しかしながら、タンパク質と他の分子との相互作用の検出を行なうためには、それに適した部位に受容体と供与体を結合させる必要がある。化学修飾ではエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ狙った部位に特異的に結合させることは困難なため、それにより得られるタンパク質では、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。一方、化学合成によりエネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質は、化学合成できる分子量に限界があるため、分子量が約１万以下のものに限られる。また、遺伝子融合では緑色蛍光タンパク質およびその改変体の結合がタンパク質の活性を大きく低下させ、さらに結合部位はタンパク質のＮ末端とＣ末端に制限されるため、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。
標識物質で標識された標識非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法として、４塩基コドンを用いた方法等が知られている（特許文献３参照）。該方法によれば、タンパク質の特定部位に標識アミノ酸を導入することが可能である。また、２種類の非天然アミノ酸の導入法も知られており（非特許文献１および２を参照）、これらの方法を組み合わせて用いることで、２種類の標識アミノ酸を特定部位に含むタンパク質を合成することが可能である。
特開２００４−５３４１６号公報 特開２００４−１８７５４４号公報 国際公開第ＷＯ２００４／００９７０９号パンフレット Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−１２１９５，１９９９ Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１１０６０−１１０６４，２００１ As a technique for detecting the interaction between proteins and other molecules, there has been a detection technique using surface plasmon resonance. However, in order to measure surface plasmon resonance, it is necessary to immobilize the protein on the substrate on which the metal thin film is formed, and it is also conceivable that the three-dimensional structure changes due to the immobilization. Therefore, it has been difficult to capture the three-dimensional structural change of the protein caused by the interaction between the protein and other molecules.
There is also a technique for measuring the binding between a protein and another substance by measuring the increase in the degree of fluorescence polarization when another substance is bound to the fluorescently labeled protein. However, this method can measure the presence / absence of binding between the protein and another substance, and cannot capture the three-dimensional structural change of the protein caused by the interaction between the protein and other molecules.
In addition, by binding the energy donor and energy acceptor of fluorescence resonance energy transfer to the protein, protein conformational changes caused by the interaction of the protein with other molecules can be detected as changes in fluorescence resonance energy transfer. (See Patent Documents 1 and 2).
Proteins in which energy donors and energy acceptors are combined include proteins that have been combined by chemical modification, proteins that have been combined by chemical synthesis, and proteins in which green fluorescent protein and variants thereof have been combined by gene fusion. ,and so on.
For example, by binding a molecule that emits green fluorescence and a molecule that emits red fluorescence to a protein, it is possible to detect a change in the three-dimensional structure of the protein caused by the interaction between the protein and another molecule as a change in fluorescence resonance energy transfer. . In addition, by binding blue-green fluorescent protein and yellow fluorescent protein to the N-terminus and C-terminus of the protein, the three-dimensional structural change of the protein caused by the interaction between the protein and other molecules is also considered as the change of fluorescence resonance energy transfer. Can be detected.
However, in order to detect the interaction between the protein and other molecules, it is necessary to bind the acceptor and the donor at a site suitable for the detection. In chemical modification, it is difficult to specifically bind the energy donor and energy acceptor to the target site, so it is difficult to clearly detect the interaction with other molecules in the resulting protein. is there. On the other hand, a protein in which an energy donor and an energy acceptor are combined by chemical synthesis has a limit in the molecular weight that can be chemically synthesized, and thus is limited to a molecular weight of about 10,000 or less. In gene fusion, the binding of green fluorescent protein and its variants greatly reduces the activity of the protein, and the binding site is restricted to the N-terminus and C-terminus of the protein, so the interaction with other molecules is clearly defined. It is difficult to detect.
As a method for introducing a labeled unnatural amino acid labeled with a labeling substance into a protein, a method using a 4-base codon is known (see Patent Document 3). According to this method, a labeled amino acid can be introduced into a specific site of a protein. In addition, methods for introducing two types of unnatural amino acids are also known (see Non-Patent Documents 1 and 2), and by combining these methods, a protein containing two types of labeled amino acids at a specific site is synthesized. Is possible.
JP 2004-53416 A JP 2004-187544 A International Publication No. WO2004 / 009709 Pamphlet Hohsaka T. et al. , J .; Am. Chem. Soc. 121, 12194-12195, 1999. Hohsaka T. et al. , Biochemistry, 40, 11060-11064, 2001.

本発明は、タンパク質が他の分子と相互作用したときの該タンパク質の立体構造が変化し、近接するようになるタンパク質上の２箇所の部位に、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質で標識したアミノ酸をそれぞれ導入したタンパク質であって、蛍光共鳴エネルギー移動によりタンパク質と他の分子との相互作用を検出し得るタンパク質の提供および該タンパク質を用いた相互作用の検出方法の提供を目的とする。
本発明者は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ結合させた非天然アミノ酸を、タンパク質の他の分子との相互作用の検出に適した部位に導入したタンパク質が他の分子と相互作用したときに、タンパク質の立体構造が変化し、エネルギー供与体とエネルギー受容体の距離および配向が変化し、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化することを見出し本発明を完成させた。
この際、本発明者は、４塩基コドン法や終止コドン法等の非天然アミノ酸をタンパク質の特定の位置に導入する方法により、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる位置に蛍光標識アミノ酸を導入した。
すなわち、本発明は以下の態様：
１． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質、
２． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し、もう一方がＮ末端およびＣ末端以外の部位に存在する上記１記載のタンパク質、
３． 蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法または終止コドン法により導入した上記１または２に記載のタンパク質、
４． タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される上記１〜３のいずれかに記載のタンパク質、
５． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質、
６． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である上記５記載のタンパク質、
７． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩である上記６のタンパク質、
８． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がｐ−アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している上記１〜７のいずれかに記載のタンパク質、
９． タンパク質が、カルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１〜８のいずれかに記載のタンパク質、
１０． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記９記載のカルモジュリン、
１１． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記１０記載のカルモジュリン、
１２． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含むカルモジュリン、
１３． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記９記載のマルトース結合タンパク質。
１４． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記１３記載のマルトース結合タンパク質。
１５． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含むマルトース結合タンパク質。
１６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、
２種類の４塩基コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合した２種類のアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法、
１７． ２種類の４塩基コドンの一方を終止コドンに置き換えた上記１６記載の方法。
１８． 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する上記１６または１７に記載の方法、
１９． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１６〜１８のいずれかに記載の方法、
２０． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含ませる上記１９の方法、
２１． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含ませる上記１９記載の方法。
２２． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記被験分子の相互作用を検出する方法、
２３． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２２記載の方法、
２４． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法、
２５． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２４記載の方法、
２６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と該タンパク質と相互作用する少なくとも１つの分子および被験化合物を接触させ、該タンパク質と該分子との相互作用を前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記分子との相互作用を阻害または増強する化合物をスクリーニングする方法、
２７． タンパク質がカルモジュリンであって、タンパク質と相互作用する分子がカルシウム結合タンパク質およびカルシウムイオンである上記２６記載の方法、ならびに
２８． タンパク質がマルトース結合タンパク質であって、タンパク質と相互作用する分子がマルトースである上記２６記載の方法。
に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−２３０７６８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。The present invention relates to two types of fluorescent substances capable of causing fluorescence resonance energy transfer at two sites on a protein where the three-dimensional structure of the protein changes when the protein interacts with other molecules and comes close to each other. For the purpose of providing a protein capable of detecting an interaction between a protein and another molecule by fluorescence resonance energy transfer and a method for detecting an interaction using the protein. To do.
The present inventor has found that a protein in which a non-natural amino acid to which an energy donor and an energy acceptor for fluorescence resonance energy transfer are respectively bound is introduced into a site suitable for detecting an interaction with another molecule of the protein is another molecule. The present inventors have found that the three-dimensional structure of the protein changes when interacting with the protein, the distance and orientation of the energy donor and energy acceptor change, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes.
At this time, the inventor introduced a fluorescently labeled amino acid at a position where fluorescence resonance energy transfer occurs by a method of introducing a non-natural amino acid such as a 4-base codon method or a stop codon method into a specific position of the protein.
That is, the present invention has the following aspects:
1. A protein containing a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescent labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor, when bound to a molecule capable of binding to the protein A protein that can change the efficiency of fluorescence resonance energy transfer by the presence of two types of fluorescently labeled amino acids at positions where the three-dimensional structure changes and the distance and orientation of the energy donor fluorescent substance and the energy acceptor fluorescent substance change,
2. One of a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor are present at the N-terminal or C-terminal of the protein, and the other is N The protein according to 1 above, which is present at a site other than the terminal and C-terminal;
3. The protein according to 1 or 2 above, wherein an amino acid labeled with a fluorescent substance is introduced by a 4-base codon method or a stop codon method,
4). The protein according to any one of the above 1 to 3, wherein the molecule capable of binding to the protein is selected from the group consisting of a protein, a nucleic acid, a sugar, and a low molecular weight molecule,
5. The protein according to any one of the above 1 to 4, wherein the fluorescent substance serving as an energy donor and the fluorescent substance serving as an energy acceptor are fluorescent substances having an excitation wavelength and an emission wavelength in the visible light region,
6). A fluorescent substance that serves as an energy donor and a fluorescent substance that serves as an energy acceptor include a molecule or a salt thereof containing 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene as a basic skeleton in its chemical structure The protein according to 5 above, which is a derivative thereof,
7). The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. 6. The protein according to 6 above, wherein the fluorescent substance is 4,4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof.
8). The protein according to any one of the above 1 to 7, wherein the fluorescent substance serving as an energy donor and the fluorescent substance serving as an energy acceptor are bonded to the para-position amino group of p-aminophenylalanine,
9. The protein according to any one of 1 to 8, wherein the protein is calmodulin or maltose-binding protein,
10. Amino acids labeled with energy donors and energy acceptors are distances and orientations so that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when calmodulin interacts with calmodulin binding proteins and calcium ions The calmodulin of claim 9, present at a position on the calmodulin where
11. The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. The fluorescent substance is 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and an amino acid labeled with the fluorescent substance is 11. The calmodulin of claim 10, wherein the calmodulin is present at a position on the calmodulin where the distance and orientation can change such that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the calmodulin interacts with calmodulin binding protein and calcium ions.
12 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora Calmodulin comprising 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof at the 40th and N-terminus of the calmodulin amino acid sequence, or at the 99th and N-terminus of the amino acid sequence of calmodulin,
13. The distance and orientation of an amino acid labeled with an energy donor fluorescent substance and an energy acceptor fluorescent substance change so that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the maltose binding protein interacts with maltose. 10. The maltose binding protein according to 9 above, which is present at a position on the obtained maltose binding protein.
14 The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. The fluorescent substance is 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and an amino acid labeled with the fluorescent substance is 14. The maltose binding protein according to 13 above, wherein the maltose binding protein is present at a position on the maltose binding protein where the distance and orientation can be changed so that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the maltose binding protein interacts with maltose.
15. 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof at the 171st and N-terminal of the amino acid sequence of maltose-binding protein, or the maltose-binding containing 283th and N-terminal of the amino acid sequence of maltose-binding protein, respectively protein.
16. A method for producing the protein according to any one of 1 to 9 above,
A step of preparing mRNA of a protein into which two types of 4-base codons are inserted, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the protein interacts with another molecule at the position where the 4-base codon is inserted. The location of the mRNA corresponding to the location on the protein where the distance and orientation can vary, such as
A step of preparing two types of amino acids labeled with two types of fluorescent substances capable of causing fluorescence resonance energy transfer, each having a tRNA having an anticodon for the four-base codon bound thereto, and the mRNA and amino acid A method of synthesizing a protein using the bound tRNA,
17. 17. The method according to 16 above, wherein one of the two types of 4-base codons is replaced with a stop codon.
18. 18. The method according to 16 or 17 above, wherein the protein is synthesized in a cell-free translation system.
19. The method according to any one of the above 16 to 18, wherein the protein is calmodulin or maltose binding protein,
20. 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora -19a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, respectively, at the 40th and N-terminal of the amino acid sequence of calmodulin or the 99th and N-terminal of the amino acid sequence of calmodulin,
21. 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof is included in the amino acid sequence of the maltose binding protein at positions 171 and N, respectively, or at the amino acid sequence of maltose binding protein at the position of 283 and N, respectively. 19. The method according to 19.
22. The protein according to any one of 1 to 9 above is contacted with a test molecule, and the three-dimensional structure change of the protein due to the interaction between the protein and the test molecule is detected by measuring fluorescence resonance energy transfer, A method for detecting the interaction of the test molecules,
23. 23. The method according to 22 above, wherein the protein is calmodulin or maltose binding protein.
24. The protein according to any one of 1 to 9 above is contacted with a test molecule, and the three-dimensional structure change of the protein due to the interaction between the protein and the test molecule is detected by measuring fluorescence resonance energy transfer, A method of screening for interacting molecules,
25. 25. The method according to 24 above, wherein the protein is calmodulin or maltose binding protein.
26. The protein according to any one of 1 to 9 above, at least one molecule that interacts with the protein, and a test compound are brought into contact, and the interaction between the protein and the molecule causes a change in the three-dimensional structure of the protein by fluorescence resonance energy transfer. A method for screening a compound that is detected by measuring and inhibiting or enhancing the interaction between the protein and the molecule,
27. 27. The method according to the above item 26, wherein the protein is calmodulin and the molecule that interacts with the protein is a calcium-binding protein and a calcium ion; 27. The method according to 26, wherein the protein is maltose-binding protein, and the molecule that interacts with the protein is maltose.
About.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2005-230768 which is the basis of the priority of the present application.

図１は、蛍光標識アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入法の概要を示す図である。
図２は、１分子のタンパク質への２種類の非天然アミノ酸の導入法の概要を示す図である。
図３は、１分子のタンパク質への２種類の蛍光標識アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入法の概要を示す図である。
図４は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用したタンパク質と他の分子との相互作用の検出法を示す図である。カルモジュリン結合タンパク質との相互作用に伴って、カルモジュリンの構造変化が起き、その結果蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（緑色の分子）から受容体（赤色の分子）へエネルギー移動が起こる。この変化は蛍光スペクトルの変化として検出される。
図５Ａは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質の合成法を示す図である。
図５Ｂは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図６は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図７は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図８は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図９は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１０は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１１は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１２は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１３は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１４は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１５は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１６は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１７は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１８は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１９は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for site-specific introduction of a fluorescently labeled amino acid into a protein.
FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for introducing two types of unnatural amino acids into one molecule of protein.
FIG. 3 is a diagram showing an outline of a site-specific introduction method of two types of fluorescently labeled amino acids into a protein of one molecule.
FIG. 4 is a diagram showing a method for detecting an interaction between a protein and another molecule using fluorescence resonance energy transfer. Upon interaction with the calmodulin binding protein, a structural change of the calmodulin occurs, resulting in an energy transfer from the energy donor (green molecule) of fluorescence resonance energy transfer to the acceptor (red molecule). This change is detected as a change in the fluorescence spectrum.
FIG. 5A is a diagram showing a method for synthesizing a protein into which two types of fluorescently labeled amino acids have been introduced.
FIG. 5B is a photograph showing the results of SDS-PAGE of a protein into which two types of fluorescently labeled amino acids have been introduced.
FIG. 6 shows a three-dimensional structure (A) in a state of interaction with calcium ions of calmodulin in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 40th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced in the amino acid sequence of calmodulin, and calcium ions and calmodulin binding. It is a figure which shows the three-dimensional structure (B) of the state which interacted with protein.
FIG. 7 shows the state in which the amino acid sequence of calmodulin interacts with the calcium ion of calmodulin introduced with 40th BODIPY FL and the amino acid labeled with BODIPY558 / 568 at the N-terminal, and the state in which the calcium ion interacts with the calmodulin-binding protein. It is a figure which shows the fluorescence spectrum.
FIG. 8 shows a three-dimensional structure (A) in a state of interacting with calcium ions of calmodulin in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 99th position and BODIPY558 / 568 is introduced at the N-terminus in the amino acid sequence of calmodulin, and calcium ions and calmodulin binding. It is a figure which shows the three-dimensional structure (B) of the state which interacted with protein.
FIG. 9 shows a state in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 99th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced into the calmodulin in an amino acid sequence, and a state in which the calcium ion interacts with a calmodulin-binding protein. It is a figure which shows the fluorescence spectrum.
FIG. 10 shows a three-dimensional structure (A) in a state of interacting with calcium ion of calmodulin in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 113th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced in the amino acid sequence of calmodulin, and the calcium ion and calmodulin binding. It is a figure which shows the three-dimensional structure (B) of the state which interacted with protein.
FIG. 11 shows a state in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 113th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced into the calmodulin in an amino acid sequence, and a state in which the calcium ion interacts with a calmodulin-binding protein. It is a figure which shows the fluorescence spectrum.
FIG. 12 shows a three-dimensional structure (A) in a state of interacting with calcium ion of calmodulin in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 148th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced in the amino acid sequence of calmodulin, and the calcium ion and calmodulin binding. It is a figure which shows the three-dimensional structure (B) of the state which interacted with protein.
FIG. 13 shows a state in which the amino acid sequence of calmodulin interacts with calcium ions of calmodulin introduced with an amino acid labeled with BODIPY FL at position 148 and BODIPY558 / 568 at the N-terminus, and in a state of interaction with calcium ions and calmodulin-binding protein. It is a figure which shows the fluorescence spectrum.
FIG. 14 shows a three-dimensional structure of a state in which it does not interact with other molecules of maltose binding protein in which an amino acid labeled with BODIPY FL at position 171 and BODIPY 558/568 at the N terminus is introduced in the amino acid sequence of maltose binding protein (A ) And a three-dimensional structure (B) in a state of interacting with maltose.
FIG. 15 shows a state in which an amino acid labeled with BODIPY FL at position 171 and BODIPY 558/568 at the N-terminus is introduced in the amino acid sequence of maltose binding protein, and the maltose binding protein does not interact with other molecules. It is a figure which shows the fluorescence spectrum of the state made.
FIG. 16 shows a three-dimensional structure in a state in which it does not interact with other molecules of maltose-binding protein in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 176th position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced in the amino acid sequence of the maltose-binding protein (A ) And a three-dimensional structure (B) in a state of interacting with maltose.
FIG. 17 shows a state in which no amino acid labeled with BODIPY FL at the 176th position and an amino acid labeled with BODIPY558 / 568 at the N-terminal are introduced into the maltose binding protein, and the interaction with maltose. It is a figure which shows the fluorescence spectrum of the state made.
FIG. 18 shows a three-dimensional structure of a state in which it does not interact with other molecules of maltose-binding protein in which an amino acid labeled with BODIPY FL at the 283rd position and BODIPY558 / 568 at the N-terminal is introduced in the amino acid sequence of the maltose-binding protein (A ) And a three-dimensional structure (B) in a state of interacting with maltose.
FIG. 19 shows a state in which no amino acid labeled with BODIPY FL at the 283rd position and an amino acid labeled with BODIPY558 / 568 at the N-terminal has been introduced in the amino acid sequence of the maltose binding protein and the interaction with maltose. It is a figure which shows the fluorescence spectrum of the state made.

本発明のタンパク質は、１分子のタンパク質中に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質を含んでいる。本発明のタンパク質は、エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質の両方を含んでいるので二重標識タンパク質ということもある。
本発明のタンパク質は、特定の他の分子と結合等の相互作用をすることができ、該分子と相互作用することにより、立体構造が変化する。この立体構造が変化することにより、上記エネルギー供与体とエネルギー受容体の立体的な位置が変動し、両者の距離および配向が変化し両者の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化する。
タンパク質は限定されず、分子と相互作用することにより立体構造が変化するいかなるタンパク質も含まれる。このようなタンパク質として、例えば、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、タンパク質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、レコベリン、マルトース結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等が挙げられる。
タンパク質の立体構造の変化は、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトル、紫外吸収および蛍光吸収スペクトル、ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルの変化としてとらえることができ、またシンクロトロン放射線源を用いたＸ線小角散乱法等により立体構造の変化をとらえることができる。
本発明のタンパク質と相互作用する分子は、タンパク質ごとに決まっており、タンパク質、核酸、糖、イオン等のその他の有機または無機の低分子量分子が含まれる。例えば、タンパク質がカルモジュリンの場合、カルモジュリン結合タンパク質やカルシウムイオンが挙げられる。また、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼにはｃＧＭＰ、マルトース結合タンパク質にはマルトースが挙げられる。さらに、ステロイドホルモン受容体やＤＮＡ結合タンパク質には、それぞれのタンパク質に特異的なステロイドホルモンやＤＮＡが挙げられる。
本発明に利用可能な蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる物質としては、ＢＯＤＩＰＹ 化合物、ローダミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
本発明に使用するのに特に好ましい蛍光物質として、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む化合物又はその塩もしくはその誘導体を挙げることができる（本明細書中では、該化合物又はその塩もしくはその誘導体を総称してＢＯＤＩＰＹ化合物とも呼ぶ）。その例としては、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）（励起波長／蛍光波長：５０５ｎｍ／５１３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ（励起波長／蛍光波長：５８８ｎｍ／６１６ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ（励起波長／蛍光波長：５２８ｎｍ／５５０ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（励起波長／蛍光波長：４９５／５０３）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（励起波長／蛍光波長：５５９ｎｍ／５６９ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５４２／５７４）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８０／６０５（励起波長／蛍光波長：５８０／６０５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５８９ｎｍ／６１７ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（励起波長／蛍光波長：５６５／５７１）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７４（励起波長／蛍光波長：５６４／５７０）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１（励起波長／蛍光波長：５８２／５９２）をはじめ、蛍光特性を異にする多種多様なものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州、米国）等から市販されているが、現在市販品として入手可能なものに限定はされない。
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（４００〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。ＢＯＤＩＰＹ化合物には、可視光域内に励起波長および発光波長を有するものが種々あり、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、４８８ｎｍの光で励起され、可視光領域で強い発光を有するため、アルゴンレーザー光によって励起可能であり、既存の汎用機器で高感度かつ容易に検出できるという点で大きな利点を有する。
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
例えば、エネルギー供与体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、エネルギー受容体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８を選択すればよい。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体の組み合わせとして、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８６、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＣｙ３、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、Ａｌｅｘａ４８８とＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８とＣｙ５、などでもよい。
本発明のタンパク質において、立体構造に変化が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにタンパク質中に含ませる必要がある。
このためには、タンパク質中の特定の部位に蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。蛍光標識アミノ酸を導入する位置は、蛍光標識アミノ酸を導入するタンパク質によって異なるが、天然タンパク質のアミノ酸配列に基づいて立体構造を解析し、立体構造上近接する位置にあるアミノ酸部位に蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。タンパク質の立体構造は、例えば市販のタンパク質立体構造解析ソフトウェアを用いることにより予測することができる。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体のどちらか一方をタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に導入しておき、もう一方をタンパク質の内部の数〜数十ヶ所に導入して、その中から本発明に適した導入位置を特定すればよい。
例えば、タンパク質がカルモジュリンである場合、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８）で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に導入すればよい。一方、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の１１３番目とＮ末端、または１４８番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。カルモジュリンのアミノ酸配列は配列番号２に示す。
また、マルトース結合タンパク質においては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７１番目とＮ末端、または２８３番目とＮ末端に導入すればよい。一方、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７６番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に示す。
本発明の蛍光標識アミノ酸は、アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、該芳香環に、スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに、蛍光物質が結合しているものが好ましい。
「芳香環」とは、一般的に、あらゆる不飽和環状化合物を指す。したがって、５もしくは６員の複素芳香環、または２個以上、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個の環構造を含む多環性化合物も含む。特に、芳香環はベンゼン環であることが好ましい。天然型アミノ酸のうち、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳香族アミノ酸であり、該芳香環に蛍光物質が（スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに）結合したものは、本発明の蛍光標識アミノ酸の好ましい例として挙げることができる。
芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質の結合およびスペーサーを介した芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質との結合は、適当な官能基どうしの結合を利用すればよい。タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、天然型あるいは非天然型アミノ酸の、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに蛍光物質を、スペーサーを介して、または介さずに結合する。アミノ基標識用プローブとしてスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、ＮＢＤ−ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物が、チオール基標識用プローブとしてアルキルハライド、マレイミド、アジリジンなどの化合物が、カルボキシル基標識用プローブとしてジアゾメタン化合物、脂肪族臭化物、カルボジイミドなどが利用できる。例えば、蛍光物質にスペーサーを介して、または介さずに、スクシンイミドエステルを導入し、かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導入しアミド結合により両者を結合させることができる。芳香環にアミノ基を導入したアミノ酸として、例えばアミノフェニルアラニンが挙げられる。この際に用いる官能基は、適宜選択導入できるし、結合方法も適宜選択できる。この際、アミド結合形成反応をｐＨ５程度で行なうことで、他にアミノ基が存在していても、アミノフェニルアラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。あるいは、他のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、反応後脱Ｂｏｃ化すればよい。この方法は、例えば、「新生化学実験講座１ 蛋白質ＶＩ 構造機能相関」（社団法人 日本生化学会編 東京化学同人発行、１９９１年３月２０日発行）の記載等を参照すればよい。
「スペーサー」は、蛍光標識アミノ酸分子におけるアミノ酸部と蛍光物質とを連結している部分を指す。即ち、蛍光標識アミノ酸分子内のアミノ酸側鎖と蛍光物質が直接結合しているのではなく、アミノ酸側鎖と蛍光物質との間に１つ以上の原子が存在する場合、該蛍光標識アミノ酸のアミノ酸部と蛍光物質はスペーサーを介して連結しているという。スペーサーは、その主鎖部分にＣ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいればよい。またスペーサーの主鎖構造は、上記原子が２〜１０個、好ましくは３〜８個、さらに好ましくは５、６または７個が直鎖状に結合したものが好ましく、直鎖構造内には、二重結合が１つ以上含まれていてもよい。さらに、スペーサーは、ベンゼン環および／またはシクロヘキシル環などの環状構造を１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、有していてもよい。また、ベンゼン環やシクロヘキシル環などの環状構造、もしくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソプテン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を、後述のタンパク質合成に用いて本発明のタンパク質を作製するためには、アミノ酸にｔＲＮＡと結合させるために必要な特定の基を結合させておく必要がある。例えば、アミノ酸のカルボキシル基にジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）を結合させておけば、３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠落させたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））と結合させ、人工アミノアシルｔＲＮＡを作製することができる。
アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種の１、２または３個の原子を介して間接的に結合していてもよい。芳香環はベンゼン環である場合、ベンゼン環上にスペーサーまたは蛍光物質が結合する位置は、アミノ酸骨格の位置に対して、パラ位またはメタ位であることが、リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、より好ましく、特にパラ位であることが好ましい。
前述のように、芳香環の官能基にスペーサーを介してまたは介さずに蛍光物質を結合させる。アミノフェニルアラニンの場合、パラアミノフェニルアラニン、メタアミノフェニルアラニンが好ましい。
例として、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（４，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−Ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−Ｄｉａｚａ−ｓ−Ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬ）をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ＦＬ標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ）およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８−ＡＦ）の構造をそれぞれ式Ｉおよび式ＩＩに示す。
蛍光物質で標識した標識アミノ酸をタンパク質合成系に用いる場合、標識アミノ酸が結合したアミノアシルｔＲＮＡを合成する必要がある。このため、標識アミノ酸はｔＲＮＡと結合するための結合部分を有する必要があり、該部分として例えばジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）が挙げられる。この際、あらかじめアミノ酸にｐｄＣｐＡを結合させておき、アミノ酸−ｐｄＣｐＡを適当な蛍光物質で標識すればよい。
例えば、アミノフェニルアラニンにｐｄＣｐＡを結合させたＡＦ−ｐｄＣｐＡをアミノ酸として用いる場合、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬと結合させると、標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ−ｐｄＣｐＡ）が得られる。該標識アミノ酸をタンパク質合成系にてタンパク質へ導入することが可能である。
蛍光物質によるアミノ酸の標識法の詳細は、ＷＯ２００４／００９７０９に記載されており、該記載に従って実施することができる。
本発明のタンパク質をタンパク質生合成系で合成するには、蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸と、該蛍光標識アミノ酸を特異的にコードするように設計したコドンに対するアンチコドンとが結合されているアミノアシルｔＲＮＡを作製することが必要である。かかるアミノアシルｔＲＮＡを合成するには、例えば、アミノ酸のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、ジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）に結合させた後に脱Ｂｏｃ化などの脱保護化の処理をし、得られたアミノ酸−ｐｄＣｐＡと蛍光物質を反応させることによって、芳香環に導入された官能基を介して蛍光物質を結合させ、得られたｐｄＣｐＡと蛍光標識アミノ酸との結合物を液体クロマトグラフィーにより精製し、一方で、３’末端のＣＡジヌクレオチドが欠落したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））を作製し、これに蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡをリガーゼで結合させることにより得られる。このような、アミノ酸をまずｐｄＣｐＡと結合させた後に蛍光物質と反応させて蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ結合体を得てもよい。
上記の方法により作製された蛍光物質で標識された蛍光標識アミノアシルｔＲＮＡは、無細胞翻訳系または生細胞によるタンパク質合成系を利用して実施することができる。無細胞翻訳系としては、４塩基コドン法、人工塩基コドン法または終止コドン法を使用することが好ましい。
発現させようとする本発明のタンパク質をコードする遺伝子の特定の部位に４塩基コドンまたはアンバーコドン（終止コドン）を導入し、該遺伝子からＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを合成することができる。該ｍＲＮＡを用いて本発明のタンパク質を作製することが可能である。
無細胞翻訳系による合成は、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることにより行うことができる（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，（１９８８）“Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈｙｉｅｌｄ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１１６２；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）“Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６）。市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）やＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞翻訳系に適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、ｐＥＸＰ１やｐＥＸＰ２が挙げられる。
４塩基コドン法においては、ｍＲＮＡの非天然型アミノ酸を導入したい部位に４塩基コドンを組み込み、ｔＲＮＡのアンチコドン部位を対応する４塩基に置換し、さらに非天然型アミノ酸を結合させておく。これらを用いてタンパク質合成を行うと、４塩基コドンに置換した部分ではリボソームの中で４塩基のコドン・アンチコドンペアが形成され、ｔＲＮＡに結合させた非天然型アミノ酸は伸長中のペプチド鎖に組み込まれる。一方、その他の部分は通常通り３塩基ずつ翻訳されるので、最終的に得られるタンパク質には４塩基コドンで指定した部分にのみ非天然型アミノ酸が導入されていることになる。４塩基コドン法は、Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７８−９７７９，１９９６およびＨｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，３４−４０，１９９９の記載に従って実施することができる。また、終止コドン法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ．１８２．１９８９およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，ｐ．８０１３，１９８９、人工塩基コドン法は、Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，１７７−１８２，２００２の記載に従って行うことができる。また、生細胞によるタンパク質合成系により非天然型アミノ酸を導入したタンパク質を得るには、アミノアシルｔＲＮＡ及びｍＲＮＡを細胞内へマイクロインジェクションにより注入する方法が知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，ｐ．４３９，１９９５）、この手法により生細胞に本発明のタンパク質を発現させることができる。
得られたタンパク質はあらかじめＨｉｓタグを導入しておくことにより、Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティービーズ等を用いて精製することができる。
所定のタンパク質分子の任意の位置に２種類の蛍光標識アミノ酸を導入できるという点で、４塩基コドン法、または４塩基コドン法と終止コドン法を組合せた方法を利用するのが望ましい。
このようにして得られた、本発明のタンパク質を用いてタンパク質と該タンパク質と他の分子の相互作用を検出することができる。本発明のタンパク質に他の分子を相互作用させることにより、本発明のタンパク質の立体構造が変化し、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化する。該状態のタンパク質にエネルギー供与体の励起光を照射すると、エネルギー供与体とエネルギー受容体の間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるが、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化することにより、ＦＲＥＴの効率も変化する。これを測定することによりタンパク質の構造変化を検出することができる。
本発明は、本発明のタンパク質と被験分子を接触させ、蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより、タンパク質と被験分子の相互作用を検出する方法も包含する。また、特定のタンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法も包含する。さらに、本発明のタンパク質を、該タンパク質と被験分子との相互作用を阻害または増強する化合物のスクリーニングに用いることもできる。このような化合物は、前記タンパク質が関与する疾患、障害等の治療薬剤として用いることができる。
励起光の光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンイオンレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｌａｓｅｒ）（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
本発明において、エネルギー供与体である蛍光物質またはエネルギー受容体である蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。蛍光共鳴エネルギー移動が起こると、エネルギー受容体からの蛍光強度が増加し、エネルギー供与体からの蛍光強度は減少する。反対に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こらない場合、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動効率が低い場合、エネルギー受容体からの蛍光強度が減少し、エネルギー供与体からの蛍光強度が増加する。所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、タンパク質の立体構造の変化、すなわち他の分子との相互作用を検出することができる。この際、エネルギー供与体からの蛍光強度とエネルギー受容体からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。蛍光の測定は、定常光励起発光を測定する方法で行うこともできるし、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
本発明は、本発明のタンパク質を含む、タンパク質の相互作用研究用試薬もしくはキット、ならびにタンパク質と相互作用する分子のスクリーニング試薬もしくはキットをも包含する。
例えば、具体的には、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてカルモジュリンのｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＡＣＣＣを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識カルモジュリンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識カルモジュリンをＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） カルシウムイオンおよびカルモジュリン結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
また、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＣＧＧＧおよびアンバーコドンＵＡＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてマルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＴＡを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） マルトースおよびマルトース結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。The protein of the present invention contains a fluorescent substance serving as an energy donor (donor) for fluorescence resonance energy transfer (FRET) and a fluorescent substance serving as an energy acceptor (acceptor) for energy transfer in one molecule of protein. Since the protein of the present invention contains both a fluorescent substance serving as an energy donor and a fluorescent substance serving as an energy acceptor, it may be referred to as a double-labeled protein.
The protein of the present invention can interact with a specific other molecule such as a bond, and the three-dimensional structure is changed by interacting with the molecule. By changing this three-dimensional structure, the three-dimensional positions of the energy donor and the energy acceptor are changed, the distance and orientation of the two are changed, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer occurring between the two changes.
The protein is not limited, and includes any protein whose conformation changes by interacting with a molecule. Examples of such proteins include calmodulin, cGMP-dependent protein kinase, steroid hormone receptor, ligand binding domain of steroid hormone receptor, protein kinase C, inositol-1,4,5-triphosphate receptor, recovelin, maltose Examples thereof include binding protein and DNA binding protein.
Changes in the three-dimensional structure of proteins can be considered as changes in CD (circular dichroism) spectra, ultraviolet absorption and fluorescence absorption spectra, NMR (nuclear magnetic resonance) spectra, and X-rays using synchrotron radiation sources Changes in the three-dimensional structure can be captured by a small angle scattering method or the like.
Molecules that interact with the protein of the present invention are determined for each protein, and include other organic or inorganic low molecular weight molecules such as proteins, nucleic acids, sugars, and ions. For example, when the protein is calmodulin, examples thereof include calmodulin-binding protein and calcium ion. In addition, cGMP-dependent protein kinase includes cGMP, and maltose-binding protein includes maltose. Furthermore, steroid hormone receptors and DNA-binding proteins include steroid hormones and DNA specific to each protein.
Substances that can be used in the present invention as energy donors (donors) for fluorescence resonance energy transfer and substances that can be used as energy acceptors (acceptors) for energy transfer include BODIPY compounds, rhodamine, fluorescein (FITC), Texas Red, acridine Any known fluorescent materials including orange, cyber green, Cy3, Cy5, and the like, and derivatives thereof may be mentioned.
As a particularly preferred fluorescent substance for use in the present invention, a compound containing 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene as a basic skeleton in its chemical structure, or a salt or derivative thereof is exemplified. (In the present specification, the compound or a salt thereof or a derivative thereof is collectively referred to as a BODIPY compound). As an example, BODIPY® FL (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid) (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 505 nm / 513 nm), BODIPY (registered trademark) TR (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 588 nm / 616 nm), BODIPY (registered trademark) R6G (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 528 nm / 550 nm), BODIPY (registered trademark) 493/503 ( Excitation wavelength / fluorescence wavelength: 495/503), BODIPY (registered trademark) 558/568 (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 559 nm / 569 nm), BODIPY (registered trademark) TMR-X (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 542/574) BODIPY (registered trademark) 580/605 (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 580/605), ODIPY (registered trademark) TR-X (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 589 nm / 617 nm), BODIPY (registered trademark) 564/570 (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 565/571), BODIPY (registered trademark) 564/574 (excitation) Wavelength / fluorescence wavelength: 564/570), BODIPY (registered trademark) 581/591 (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 582/592), and a wide variety of different fluorescent properties are available from Molecular Probes (Oregon) However, it is not limited to those currently available as commercial products.
Moreover, the fluorescent substance to be used preferably has an excitation wavelength in the visible light range (around 400 to 700 nm), and further has a light emission wavelength in the visible light range, and particularly preferably has a high emission intensity in an aqueous solution. There are various types of BODIPY compounds that have an excitation wavelength and an emission wavelength in the visible light range. For example, BODIPY FL is excited by light of 488 nm and has strong emission in the visible light range, and therefore can be excited by argon laser light. Therefore, it has a great advantage in that it can be detected with high sensitivity and easily by existing general-purpose equipment.
The fluorescent substance that becomes an energy donor (donor) for fluorescence resonance energy transfer and the fluorescent substance that becomes an energy acceptor (acceptor) for energy transfer are the emission spectrum of the substance whose excitation spectrum is the energy acceptor. Select so that they overlap. The excitation wavelength and fluorescence wavelength of each fluorescent substance are known and can be easily measured. A combination of fluorescent materials can be appropriately selected based on the excitation wavelength and fluorescent wavelength inherent to the fluorescent material.
For example, BODIPY (registered trademark) FL may be selected as the energy donor, and BODIPY (registered trademark) 558/568 may be selected as the energy acceptor. Alternatively, combinations of energy donor and energy acceptor include BODIPY FL and BODIPY 576/586, BODIPY FL and TAMRA, BODIPY FL and Cy3, Fluorescein and BODIPY 558/568, Alexa488 and BODIPY 558/568, BODIPY 558/568 Cy5, etc. may be used.
In the protein of the present invention, it is necessary to include it in the protein so that the energy donor and the energy acceptor are in a relative position that maintains an appropriate orientation for causing fluorescence resonance energy transfer when the conformation changes. There is.
For this purpose, a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance may be introduced into a specific site in the protein. The position at which the fluorescently labeled amino acid is introduced varies depending on the protein into which the fluorescently labeled amino acid is introduced. do it. The three-dimensional structure of the protein can be predicted by using, for example, commercially available protein three-dimensional structure analysis software. Alternatively, either one of the energy donor and the energy acceptor is introduced into the N-terminal or C-terminal of the protein, and the other is introduced into several to several tens of the interior of the protein. A suitable introduction position may be specified.
For example, if the protein is calmodulin, an amino acid labeled with 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY FL) and 4 -The amino acids labeled with difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY 558/568) are respectively the 40th and N of the amino acid sequence of calmodulin. What is necessary is just to introduce | transduce into the terminal or the 99th and N terminal of the amino acid sequence of calmodulin. On the other hand, an amino acid labeled with 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid and 4-difluoro-5- (2-thienyl)- When amino acids labeled with 4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid are introduced at the 113th and N-terminal or 148th and N-terminal of the amino acid sequence of calmodulin, Even if it interacts with the other molecules, sufficient change in the efficiency of fluorescence resonance energy transfer does not occur. The amino acid sequence of calmodulin is shown in SEQ ID NO: 2.
In the maltose-binding protein, an amino acid labeled with BODIPY FL and an amino acid labeled with BODIPY558 / 568 may be introduced into the 171st and N-terminal or 283th and N-terminal of the maltose-binding protein, respectively. On the other hand, when the amino acid labeled with BODIPY FL and the amino acid labeled with BODIPY558 / 568 are introduced at the 176th and N-terminal of the maltose binding protein, sufficient fluorescence resonance energy transfer even if the protein interacts with other molecules No change in efficiency occurs. The amino acid sequence of the maltose binding protein is shown in SEQ ID NO: 5.
The fluorescently labeled amino acid of the present invention preferably has an aromatic ring in the side chain of the amino acid portion, and a fluorescent substance is bound to the aromatic ring with or without a spacer.
“Aromatic ring” generally refers to any unsaturated cyclic compound. Accordingly, it includes 5 or 6 membered heteroaromatic rings, or polycyclic compounds containing 2 or more, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3 ring structures. In particular, the aromatic ring is preferably a benzene ring. Among natural amino acids, phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are natural aromatic amino acids that contain an aromatic ring in the side chain, and a fluorescent substance is bound to the aromatic ring (with or without a spacer). Can be mentioned as preferred examples of the fluorescently labeled amino acids of the present invention.
Bonding between an amino acid having an aromatic ring and a fluorescent substance and binding between an amino acid having an aromatic ring and a fluorescent substance via a spacer may be performed by using a bond between appropriate functional groups. Any of various functional groups such as amino group, thiol group, carboxyl group, hydroxyl group, aldehyde group, allyl group, and halogenated alkyl group of natural or non-natural amino acids that do not participate in peptide elongation reaction during protein synthesis The fluorescent substance is bound to the spacer with or without a spacer. Compounds such as succinimide ester, isothiocyanate, sulfonyl chloride, NBD-halide, and dichlorotriazine are used as amino group labeling probes, and compounds such as alkyl halide, maleimide, and aziridine are used as thiol group labeling probes, and diazomethane is used as a carboxyl group labeling probe. Compounds, aliphatic bromides, carbodiimides and the like can be used. For example, it is possible to introduce a succinimide ester into a fluorescent substance via a spacer or not, and introduce an amino group into an aromatic ring of an amino acid and bond them together by an amide bond. Examples of amino acids having an amino group introduced into an aromatic ring include aminophenylalanine. The functional group used in this case can be selected and introduced as appropriate, and the bonding method can also be selected as appropriate. At this time, by performing the amide bond forming reaction at about pH 5, even if there are other amino groups, it can be selectively reacted with the amino group of the side chain of aminophenylalanine. Alternatively, other amino groups may be protected by Boc or the like, and debocated after the reaction. This method may be referred to, for example, the description of “Shinsei Kagaku Kogaku Kenkyu 1 Protein VI Structure-Functional Correlation” (published by the Japan Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Doujin, published on March 20, 1991).
“Spacer” refers to a portion that links an amino acid moiety and a fluorescent substance in a fluorescently labeled amino acid molecule. That is, when the amino acid side chain in the fluorescently labeled amino acid molecule and the fluorescent substance are not directly bonded, but there is one or more atoms between the amino acid side chain and the fluorescent substance, the amino acid of the fluorescently labeled amino acid The part and the fluorescent substance are said to be connected via a spacer. The spacer should just contain at least 1 or more of C, O, N, and S in the principal chain part. Further, the main chain structure of the spacer is preferably one in which the above atoms are 2 to 10, preferably 3 to 8, more preferably 5, 6 or 7 bonded in a straight chain, One or more double bonds may be contained. Furthermore, the spacer may have 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, cyclic structures such as a benzene ring and / or a cyclohexyl ring. Moreover, the thing of the structure where cyclic structures, such as a benzene ring and a cyclohexyl ring, or the cyclic structure and the said linear structure were combined may be sufficient. Specific examples include polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polyisoptene, polystyrene, polyvinyl, and polyvinyl chloride, polyethers such as polyoxyethylene, polyethylene glycol, and polyvinyl alcohol, polyamide, polyester, polyimide, polyurethane, and polycarbonate.
In order to produce a protein of the present invention using a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance for protein synthesis described later, it is necessary to bind a specific group necessary for binding to tRNA to the amino acid. For example, if a dinucleotide (pdCpA) is bound to the carboxyl group of an amino acid, it can be bound to a tRNA lacking the 3′-terminal CA dinucleotide (tRNA (−CA)) to produce an artificial aminoacyl-tRNA. it can.
Whether the aromatic ring is directly bonded to the atoms forming the amino acid skeleton, or indirectly bonded via one, two or three atoms of at least one of C, O, N and S Good. When the aromatic ring is a benzene ring, the position where the spacer or fluorescent substance is bonded to the benzene ring is para or meta relative to the position of the amino acid skeleton, so that the efficiency of incorporation into the ribosome is higher. More preferably, the para position is particularly preferable.
As described above, the fluorescent substance is bonded to the functional group of the aromatic ring with or without a spacer. In the case of aminophenylalanine, paraaminophenylalanine and metaaminophenylalanine are preferable.
As an example, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora- BODIPY FL-labeled aminophenylalanine derivatives (BODIPY FL-AF) and BODIPY in which 3a, 4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid; BODIPY (registered trademark) -FL) is bound to the aromatic ring of the side chain of aminophenylalanine The structures of BODIPY 558 / 568-labeled aminophenylalanine derivatives (BODIPY 558 / 568-AF) in which (registered trademark) 558/568 is bonded to the aromatic ring of the side chain of aminophenylalanine are shown in Formula I and Formula II, respectively.
When a labeled amino acid labeled with a fluorescent substance is used in a protein synthesis system, it is necessary to synthesize an aminoacyl tRNA to which the labeled amino acid is bound. Therefore, the labeled amino acid needs to have a binding moiety for binding to tRNA, and examples of the moiety include dinucleotide (pdCpA). At this time, pdCpA may be bound to an amino acid in advance, and amino acid-pdCpA may be labeled with an appropriate fluorescent substance.
For example, when AF-pdCpA in which pdCpA is bound to aminophenylalanine is used as an amino acid, labeled amino acid-pdCpA (BODIPY FL-AF-pdCpA) is obtained when bound to BODIPY FL. The labeled amino acid can be introduced into a protein by a protein synthesis system.
Details of the method for labeling an amino acid with a fluorescent substance are described in WO2004 / 009709, and can be carried out according to the description.
In order to synthesize the protein of the present invention in a protein biosynthesis system, an aminoacyl-tRNA in which a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance and an anticodon for a codon designed to specifically encode the fluorescently labeled amino acid are combined It is necessary to produce. In order to synthesize such an aminoacyl-tRNA, for example, the amino group of the amino acid is protected by Boc, etc., bound to a dinucleotide (pdCpA), and then subjected to deprotection such as deBoc, and the resulting amino acid -By reacting pdCpA with a fluorescent substance, the fluorescent substance is bound via a functional group introduced into the aromatic ring, and the resulting conjugate of pdCpA and a fluorescently labeled amino acid is purified by liquid chromatography, It is obtained by preparing tRNA lacking the 3′-terminal CA dinucleotide (tRNA (−CA)) and binding the fluorescently labeled amino acid -pdCpA thereto with ligase. Such an amino acid may be first bound to pdCpA and then reacted with a fluorescent substance to obtain a fluorescently labeled amino acid-pdCpA conjugate.
The fluorescently labeled aminoacyl-tRNA labeled with the fluorescent substance produced by the above method can be carried out using a cell-free translation system or a protein synthesis system using living cells. As the cell-free translation system, it is preferable to use a 4-base codon method, an artificial base codon method, or a stop codon method.
A 4-base codon or amber codon (stop codon) is introduced into a specific site of the gene encoding the protein of the present invention to be expressed, and mRNA of the protein of the present invention is synthesized from the gene using RNA polymerase. be able to. It is possible to produce the protein of the present invention using the mRNA.
Synthesis by a cell-free translation system can be carried out by expressing a gene by mixing it with a necessary reagent in vitro without introducing an expression vector containing the gene to be expressed into the host cell (Spirin, A S. et al, (1988) “A continuous cell-free translation system couple of production polypeptides in high ff, i. Et., Et al., 96. Kim, D. h. protein synthesis system from E. coli "Eur. J. Biochem. 239, 881-886). Proteins can be expressed using commercially available cell-free expression kits. Examples of such kits include Rapid Translation System (RTS) (Roche) and Expressway In Vitro Protein Synthesis System (Invitrogen). In this case, the expression vector to be used is not limited, but a vector suitable for each cell-free translation system may be used. The former expression vector for kits includes pIVEX2.2bNde, and the latter expression vector for kits includes pEXP1 and pEXP2.
In the 4-base codon method, a 4-base codon is incorporated into the site of the mRNA where the unnatural amino acid is to be introduced, the anti-codon site of the tRNA is substituted with the corresponding 4 base, and the non-natural amino acid is further bound. When protein synthesis is carried out using these, a 4-base codon-anticodon pair is formed in the ribosome at the part replaced with the 4-base codon, and the unnatural amino acid bound to tRNA is incorporated into the growing peptide chain. It is. On the other hand, since the other part is translated by 3 bases as usual, the unobtained amino acid is introduced only in the part designated by the 4-base codon in the finally obtained protein. The 4-base codon method is described by Hohsaka T. et al. , Et al. , J .; Am. Chem. Soc. , 118, 9778-9779, 1996 and Hohsaka T .; , Et al. , J .; Am. Chem. Soc. 121, 34-40, 1999. Also, the stop codon method is described in Science, 244, p. 182.1989 and J.H. Am. Chem. Soc. 111, p. 8013, 1989, the artificial base codon method is described in Hirao, I .; , Et al. , Nature Biotech. , 20, 177-182, 2002. In addition, in order to obtain a protein into which an unnatural amino acid is introduced by a protein synthesis system using living cells, a method of injecting aminoacyl tRNA and mRNA into cells by microinjection is known (Science, 268, p. 439, 1995), the protein of the present invention can be expressed in living cells by this technique.
The obtained protein can be purified using His-tag affinity beads or the like by introducing a His tag in advance.
In view of the fact that two kinds of fluorescently labeled amino acids can be introduced at an arbitrary position of a given protein molecule, it is desirable to use a 4-base codon method or a method combining the 4-base codon method and the stop codon method.
Thus obtained protein of the present invention can be used to detect the interaction between the protein and the protein and other molecules. By allowing other molecules to interact with the protein of the present invention, the three-dimensional structure of the protein of the present invention is changed, and the distance and orientation between the energy acceptor and the energy donor are changed. When the protein in this state is irradiated with excitation light of the energy donor, fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs between the energy donor and the energy acceptor, but the distance and orientation of the energy acceptor and the energy donor are changed. As a result, the efficiency of FRET also changes. By measuring this, a structural change of the protein can be detected.
The present invention also includes a method for detecting an interaction between a protein and a test molecule by bringing the protein of the present invention into contact with the test molecule and measuring fluorescence resonance energy transfer. Also encompassed are methods of screening for molecules that interact with specific proteins. Furthermore, the protein of the present invention can also be used for screening for compounds that inhibit or enhance the interaction between the protein and a test molecule. Such a compound can be used as a therapeutic agent for diseases, disorders and the like involving the protein.
As a light source for the excitation light, a light source in which a broad ultraviolet light or visible light is set to a desired wavelength range using a filter or a spectroscope may be used, or a monochromatic light such as a laser may be used. When a laser light source is used, a helium cadmium laser (442 nm) is generally used, but a blue diode laser (405 nm), an argon ion laser (457 nm), an LD-excited solid-state laser (430 nm). Etc. may be used. In the case of the two-photon excitation method, a pulse laser near 800 nm may be used.
In the present invention, fluorescence from both or any one of the fluorescent substance as an energy donor and the fluorescent substance as an energy acceptor may be measured. When fluorescence resonance energy transfer occurs, the fluorescence intensity from the energy acceptor increases and the fluorescence intensity from the energy donor decreases. On the other hand, when fluorescence resonance energy transfer does not occur or when the fluorescence resonance energy transfer efficiency is low, the fluorescence intensity from the energy acceptor decreases and the fluorescence intensity from the energy donor increases. The predetermined wavelength may be measured as a single wavelength, or the fluorescence spectrum may be measured for a certain range of wavelengths. By measuring the degree of increase and decrease in fluorescence from the energy acceptor or energy donor, changes in the protein conformation, ie, interactions with other molecules can be detected. At this time, the ratio of the fluorescence intensity from the energy donor and the fluorescence intensity from the energy acceptor can be measured, and it can be determined from the ratio whether fluorescence resonance energy transfer has occurred. The measurement of fluorescence can be performed by a method of measuring steady light excitation luminescence or a time-resolved fluorescence measurement method. Fluorescence measurement can be performed with a commonly used fluorescence spectrophotometer. Further, a commercially available fluorescence resonance energy transfer analyzer may be used.
The present invention also includes a protein interaction study reagent or kit containing the protein of the present invention, and a screening reagent or kit for molecules that interact with the protein.
For example, specifically, the protein of the present invention can be synthesized as follows, and the interaction with other molecules can be detected using the protein.
(I) The 4-base codons GGGT and CGGG are inserted into a specific site of a gene encoding a protein.
(Ii) Synthesize calmodulin mRNA using T7 RNA polymerase.
(Iii) BODIPY FL-aminophenylalanine (unnatural amino acid containing an energy donor) tRNA (having CCCG as an anticodon) and BODIPY558 / 568-aminophenylalanine (unnatural amino acid containing an energy acceptor) Synthesized tRNA (having ACCC in anticodon).
(Iv) Add the mRNA and tRNA to the E. coli cell-free translation system.
(V) Analyzing the synthesized double fluorescently labeled calmodulin by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
(Vi) The dual fluorescently labeled calmodulin is purified by His-tag affinity beads.
(Vii) Mixing calcium ions and calmodulin-binding protein and measuring the fluorescence spectrum.
In addition, the protein of the present invention can be synthesized as follows, and the interaction with other molecules can be detected using the protein.
(I) A 4-base codon CGGG and an amber codon UAG are inserted into a specific site of a gene encoding a protein.
(Ii) Synthesize mRNA for maltose binding protein using T7 RNA polymerase.
(Iii) BODIPY FL-aminophenylalanine (unnatural amino acid containing an energy donor) tRNA (having CCCG as an anticodon) and BODIPY558 / 568-aminophenylalanine (unnatural amino acid containing an energy acceptor) Synthesized tRNA (having CTA at anticodon).
(Iv) Add the mRNA and tRNA to the E. coli cell-free translation system.
(V) Analyzing the synthesized double fluorescently labeled maltose binding protein by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
(Vi) The double fluorescently labeled maltose binding protein is purified by His-tag affinity beads.
(Vii) Mixing maltose and maltose binding protein and measuring the fluorescence spectrum.
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むカルモジュリンの作製
４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを含むカルモジュリン遺伝子の作製
カルモジュリン遺伝子（配列番号１）を鋳型として、４塩基コドンＣＧＧＧ導入用のオリゴヌクレオチド（例：４０番目に導入する場合の配列は５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’；配列番号３）を用いてＰＣＲを行ない、変異導入を行なった。これをＴ７プロモーター、Ｔ７ｔａｇ配列、４塩基コドンＧＧＧＴを含む発現ベクターに組み込んだ。Ｔ７プロモーターの上流と下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、カルモジュリン遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのカルモジュリン遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，４ｍＭ ＮＴＰ，２ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４０ｕｎｉｔｓ，ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ｕｎｉｔ，Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ １００ｕｎｉｔｓ、カルモジュリン遺伝子ＤＮＡ ５μＬを含む１００μＬの反応液を３７℃で６時間反応させた。合成されたｍＲＮＡは酢酸アンモニウム沈殿の後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿によって精製した。８μｇ／μＬとなるように水に溶解させた。
ＢＯＤＩＰＹ標識アミノ酸−ｔＲＮＡの合成
５ｘＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ ｐＨ７．５，７５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６．５ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＡＴＰ）４μＬ、２００μＭ ｔＲＮＡ（−ＣＡ）２．５μＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液 ２μＬ、０．１％ ＢＳＡ ０．４μＬ、Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．２μＬ、水９．９μＬを混合し、４℃で２時間反応させた。３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５を１０μＬ、水７０μＬを加え、等量のフェノール／クロロホルム＝１／１（０．３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５で飽和させたもの）を加え撹拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、撹拌、遠心した。上層を回収し、エタノール３００μＬを加え、軽く混合し、−２０℃で１時間置いた。１５０００ｒｐｍ ３０ｍｉｎ ４℃で遠心した後、上清を除き、−２０℃で保存してある７０％ＥｔＯＨ ２００μＬを加え、１５０００ｒｐｍ４℃で５秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。１ｍＭ 酢酸カリウムｐＨ４．５２μＬに溶解させた。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙａｌａｌａｎｉｎｅについても同様に合成した。
二重蛍光標識カルモジュリンの無細胞翻訳系による合成
反応液（１０μＬ）に、５５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２１０ｍＭ グルタミン酸カリウム，６．９ｍＭ 酢酸アンモニウム，１．７ｍＭ ジチオスレイトール，１．２ｍＭ ＡＴＰ，０．２８ｍＭ ＧＴＰ，２６ｍＭ ホスホエノールピルビン酸，１ｍＭ スペルミジン，１．９％ ポリエチレングリコール−８０００，３５μｇ／ｍＬ 葉酸，１２ｍＭ 酢酸マグネシウム，０．１ｍＭ ２０種類のアミノ酸、カルモジュリン ｍＲＮＡ（４塩基コドンＧＧＧＴとＣＧＧＧが導入されたもの）８μｇ／μＬを１μＬ、大腸菌抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２μＬ、蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡ溶液を１μＬ混合した。３７℃で１時間翻訳反応を行なった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
翻訳反応液１μＬに、水９μＬと２×サンプルバッファー１０μＬを加え、９５℃５分間加熱した。このうちの５μＬを１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、この電気泳動ゲルを蛍光スキャナー（日立ソフトウェアエンジニアリング社製 ＦＭＢＩＯ−ＩＩＩ）で観察した。４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出、および、５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出により、２つの蛍光標識アミノ酸が導入されていることを確認した。
ＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製
無細胞翻訳系の反応液５０μＬを３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、７．５Ｍ ｕｒｅａに希釈して２００μＬとし、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２０μＬと混合して３０分間振とうした。磁石によりビーズを集めて上清を捨て、洗浄バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｍＬにより４回洗浄した。溶出バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）５０μＬを加え、１時間振とうした後、磁石によりビーズを集めて上清を回収した。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０により平衡化したゲルろ過スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）により脱塩を行なった。
蛍光スペクトル測定
精製した二重蛍光標識カルモジュリン溶液１０μＬを測定バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ ＰＥＧ８０００）１９０μＬと混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより蛍光スペクトルを測定した。カルモジュリン結合ペプチド Ｍ１３（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号４）とマルトース結合タンパク質の融合タンパク質（ＭＢＰ−Ｍ１３）を添加しながら、蛍光スペクトル測定を行なった。結果を図７、図９、図１１、図１３に示す。Preparation of calmodulin containing fluorescently labeled amino acids labeled with fluorescent substances
Preparation of calmodulin gene containing 4-base codons GGGT and CGGG Using the calmodulin gene (SEQ ID NO: 1) as a template, oligonucleotide for introduction of 4-base codon CGGG (example: 5′-TGTTGGGTTCTGCCCCGCAGTGACCCTCAT-3 '; PCR was performed using SEQ ID NO: 3) to introduce mutations. This was incorporated into an expression vector containing a T7 promoter, a T7 tag sequence, and a 4-base codon GGGT. PCR was performed using primers upstream and downstream of the T7 promoter to amplify the calmodulin gene fragment. 50 μL of calmodulin gene DNA was obtained from 100 μL of PCR reaction.
Synthesis of mRNA 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 4 mM NTP, 2 mM supermidine, 10 μg / mL BSA, ribonuclease inhibitor 40 units, inductive pyrosphatase RNA 100 μL of the reaction solution was reacted at 37 ° C. for 6 hours. The synthesized mRNA was purified by ammonium acetate precipitation, phenol chloroform extraction and ethanol precipitation. It was dissolved in water so as to be 8 μg / μL.
Synthesis of BODIPY-labeled amino acid-tRNA 5 × Ligation Buffer (275 mM Hepes-Na pH 7.5, 75 mM MgCl 2 , 16.5 mM DTT, 5 mM ATP) 4 μL, 200 μM tRNA (−CA) 2.5 μL, BODIPY FL-aminophenologicalCp 2 μL of solution, 0.4 μL of 0.1% BSA, 1.2 μL of T4 RNA Ligase (25 units / μL) and 9.9 μL of water were mixed and reacted at 4 ° C. for 2 hours. 10 μL of 3M AcOK pH4.5 and 70 μL of water were added, and an equal amount of phenol / chloroform = 1/1 (saturated with 0.3M AcOK pH4.5) was added, stirred, and centrifuged. The upper layer was collected, an equal volume of chloroform was added, and the mixture was stirred and centrifuged. The upper layer was collected, 300 μL of ethanol was added, mixed gently, and placed at −20 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 15000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, and 200 μL of 70% EtOH stored at −20 ° C. was added, followed by centrifugation at 15000 rpm at 4 ° C. for 5 seconds. The supernatant was removed and dried under reduced pressure. It was dissolved in 1 mM potassium acetate pH 4.52 μL. BODIPY558 / 568-aminophenalalanine was synthesized in the same manner.
To a reaction solution (10 μL) of a double fluorescently labeled calmodulin by a cell-free translation system , 55 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 210 mM potassium glutamate, 6.9 mM ammonium acetate, 1.7 mM dithiothreitol, 1.2 mM ATP , 0.28 mM GTP, 26 mM phosphoenolpyruvate, 1 mM spermidine, 1.9% polyethylene glycol-8000, 35 μg / mL folic acid, 12 mM magnesium acetate, 0.1 mM 20 amino acids, calmodulin mRNA (4-base codons GGGT and CGGG 1 μL of 8 μg / μL, 2 μL of E. coli extract (manufactured by Promega), and 1 μL of a fluorescent-labeled amino acid-tRNA solution were mixed. The translation reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour.
To 1 μL of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis translation reaction solution, 9 μL of water and 10 μL of 2 × sample buffer were added and heated at 95 ° C. for 5 minutes. 5 μL of this was poured into 15% SDS-PAGE, and this electrophoresis gel was observed with a fluorescence scanner (FMBIO-III, manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). It was confirmed that two fluorescently labeled amino acids were introduced by 488 nm excitation / 520 nm detection and 532 nm excitation / 605 nm detection.
50 μL of HisTag affinity purified cell-free translation system reaction solution was diluted to 30 μm Tris-HCl (pH 7.2), 100 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 7.5 Murea to 200 μL, and Ni-NTA magnetic beads (Promega) Mix with 20 μL and shake for 30 minutes. Beads were collected with a magnet, and the supernatant was discarded. The supernatant was washed 4 times with 1 mL of a washing buffer (30 mM Tris-HCl (pH 7.2), 100 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ). 50 μL of elution buffer (30 mM Tris-HCl (pH 7.2), 100 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 500 mM Imidazole) was added and shaken for 1 hour, and then the beads were collected with a magnet and the supernatant was collected. Desalting was performed with a gel filtration spin column (manufactured by Amersham Biosciences) equilibrated with 30 mM Tris-HCl (pH 7.2), 100 mM KCl, 1 mM CaCl 2 and 0.05% Tween20.
Fluorescence spectrum measurement 10 μL of purified double fluorescence-labeled calmodulin solution was used as a measurement buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 0.005% Tween 20, 0.1 mg / ml BSA, 0.1% PEG 8000). Mixed with 190 μL and transferred to a quartz cell. Using a fluorescence spectrometer, the fluorescence spectrum was measured with an excitation wavelength of 490 nm / detection wavelengths of 505 nm to 650 nm. While adding calmodulin-binding peptide M13 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSSAL; SEQ ID NO: 4) and a maltose-binding protein fusion protein (MBP-M13), fluorescence spectra were measured. The results are shown in FIG. 7, FIG. 9, FIG. 11, and FIG.

実施例２ アンバーコドンＴＡＧおよび４塩基コドンＣＧＧＧを含むマルトース結合タンパク質遺伝子の作製
マルトース結合タンパク質（配列番号５）を鋳型として、部位特異的変異導入法により１番目のリジンに対応するコドンをアンバーコドンＴＡＧに置換して、Ｔ７プロモーターとＴ７ｔａｇ配列を含む発現ベクターに組み込んだ。さらに再度部位特異的変異導入法により１７１番目、１７６番目、あるいは２８３番目のアミノ酸に対応するコドンを４塩基コドンＣＧＧＧに置換した。Ｔ７プロモーターの上流とＴ７ターミネーターの下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、マルトース結合タンパク質遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのマルトース結合タンパク質遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
カルモジュリン遺伝子の場合と同様の操作により、マルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成した。
ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを付加したアンバーサプレッサーｔＲＮＡの合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡを合成した。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡは、マイコプラズマカプリコラムのＴｒｐ１ ｔＲＮＡの改変体（配列番号６）を用いて合成した。
二重蛍光標識マルトース結合タンパク質の無細胞翻訳系による合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、二重蛍光標識マルトース結合タンパク質を合成した。
蛍光スペクトル測定
カルモジュリンの場合と同様の操作によりＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製した二重蛍光標識マルトース結合タンパク質溶液１０μＬを、測定バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＰＥＧ、０．００５％ Ｂｒｉｇ３５）と混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより、マルトースの非存在下および０．１ｍＭマルトース存在下で蛍光スペクトルを測定した。結果を図１５、図１７および図１９に示す。 Example 2 Production of a Maltose Binding Protein Gene Containing Amber Codon TAG and 4-Base Codon CGGG Using a maltose binding protein (SEQ ID NO: 5) as a template, a codon corresponding to the first lysine was amber codon TAG Into an expression vector containing a T7 promoter and a T7tag sequence. Furthermore, the codon corresponding to the 171st, 176th, or 283rd amino acid was replaced with the 4-base codon CGGG again by site-directed mutagenesis. PCR was performed using primers upstream of the T7 promoter and downstream of the T7 terminator to amplify the maltose binding protein gene fragment. 50 μL of maltose binding protein gene DNA was obtained from 100 μL of PCR reaction.
Synthesis of mRNA mRNA of maltose binding protein was synthesized by the same operation as in the case of the calmodulin gene.
Synthesis of amber suppressor tRNA added with BODIPY558 / 568-aminophenalalanine BODIPY FL-aminophenalalanine-tRNA was synthesized in the same manner as in the case of calmodulin. BODIPY558 / 568-aminophenylalanine-tRNA was synthesized using a modified Trp1 tRNA (SEQ ID NO: 6) of Mycoplasma capricolumn.
Double fluorescently labeled maltose binding protein was synthesized by cell-free translation system. Double fluorescently labeled maltose binding protein was synthesized in the same manner as in the case of calmodulin.
Fluorescence spectrum measurement Histag affinity-purified 10 μL of HisTag affinity purified protein by the same operation as calmodulin was added to a measurement buffer (25 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1% PEG, 0.005% Brig 35) and transferred to a quartz cell. Using a fluorescence spectrometer, fluorescence spectra were measured in the absence of maltose and in the presence of 0.1 mM maltose with an excitation wavelength of 490 nm / detection wavelengths of 505 nm to 650 nm. The results are shown in FIG. 15, FIG. 17, and FIG.

実施例に示すように、本発明の蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質に他の分子が相互作用すると蛍光共鳴エネルギー移動の効率に変化が生じる。
本発明のタンパク質は、タンパク質の種類に応じて、蛍光共鳴エネルギーが充分起こり得る位置に蛍光標識アミノ酸が導入されているので、効率よくタンパク質と他の分子との相互作用を検出することができる。
本発明のタンパク質を用いることにより、タンパク質と他の分子との相互作用を検出し、解析することができ、タンパク質と相互作用する分子のスクリーニングを行うことができる。また、タンパク質と他の分子との相互作用を増強または阻害する化合物のスクリーニングを行うこともでき、該化合物は前記タンパク質が関与する疾患の治療等に用いる薬剤として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
As shown in the Examples, a protein comprising a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer of the present invention and a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor, Two types of fluorescently labeled amino acids exist at positions where the three-dimensional structure changes when bound to a protein-binding molecule and the distance and orientation of the energy donor fluorescent substance and the energy acceptor fluorescent substance change. When other molecules interact with a protein whose transfer efficiency can change, the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes.
In the protein of the present invention, the fluorescence-labeled amino acid is introduced at a position where the fluorescence resonance energy can sufficiently occur according to the type of the protein, so that the interaction between the protein and other molecules can be detected efficiently.
By using the protein of the present invention, the interaction between the protein and another molecule can be detected and analyzed, and the molecule that interacts with the protein can be screened. In addition, a compound that enhances or inhibits the interaction between a protein and another molecule can be screened, and the compound can be used as a drug for treating a disease involving the protein.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
[Sequence Listing]

Claims (28)

蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質。 A protein containing a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescent labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor, when bound to a molecule capable of binding to the protein Proteins that can change the efficiency of fluorescence resonance energy transfer by the presence of two types of fluorescently labeled amino acids at positions where the three-dimensional structure changes and the distance and orientation between the energy donor fluorescent substance and the energy acceptor fluorescent substance change. 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し、もう一方がＮ末端およびＣ末端以外の部位に存在する請求項１記載のタンパク質。 One of a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor for fluorescence resonance energy transfer and a fluorescently labeled amino acid labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor are present at the N-terminal or C-terminal of the protein, and the other is N The protein according to claim 1, which is present at a site other than the terminal and C-terminal. 蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法または終止コドン法により導入した請求項１または２に記載のタンパク質。 The protein according to claim 1 or 2, wherein an amino acid labeled with a fluorescent substance is introduced by a 4-base codon method or a stop codon method. タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the molecule capable of binding to the protein is selected from the group consisting of a protein, a nucleic acid, a sugar, and a low molecular weight molecule. エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the fluorescent substance serving as an energy donor and the fluorescent substance serving as an energy acceptor are fluorescent substances having an excitation wavelength and an emission wavelength in the visible light region. エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である請求項５記載のタンパク質。 A fluorescent substance that serves as an energy donor and a fluorescent substance that serves as an energy acceptor include a molecule or a salt thereof containing 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene as a basic skeleton in its chemical structure The protein according to claim 5, which is a derivative thereof. エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩である請求項６記載のタンパク質。 The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. The protein according to claim 6, wherein the fluorescent substance is 4,4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof. エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がｐ−アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 7, wherein a fluorescent substance serving as an energy donor and a fluorescent substance serving as an energy acceptor are bonded to the para-position amino group of p-aminophenylalanine. タンパク質が、カルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 8, wherein the protein is calmodulin or maltose-binding protein. エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、請求項９記載のカルモジュリン。 Amino acids labeled with energy donors and energy acceptors are distances and orientations so that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when calmodulin interacts with calmodulin binding proteins and calcium ions 10. The calmodulin of claim 9, wherein is present at a position on the calmodulin that can vary. エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、請求項１０記載のカルモジュリン。 The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. The fluorescent substance is 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and an amino acid labeled with the fluorescent substance is 11. The calmodulin of claim 10, wherein the calmodulin is in a position on the calmodulin where the distance and orientation can change such that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the calmodulin interacts with calmodulin binding protein and calcium ions. ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含むカルモジュリン。 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora Calmodulin comprising −3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof at the 40th and N terminus of the calmodulin amino acid sequence or at the 99th and N terminus of the calmodulin amino acid sequence, respectively. エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、請求項９記載のマルトース結合タンパク質。 The distance and orientation of an amino acid labeled with an energy donor fluorescent substance and an energy acceptor fluorescent substance change so that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the maltose binding protein interacts with maltose. The maltose binding protein according to claim 9, which is present at a position on the obtained maltose binding protein. エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、請求項１３記載のマルトース結合タンパク質。 The fluorescent substance serving as an energy donor is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and serves as an energy acceptor. The fluorescent substance is 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof, and an amino acid labeled with the fluorescent substance is 14. The maltose binding protein of claim 13, wherein the maltose binding protein is present at a position on the maltose binding protein where the distance and orientation can change such that the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the maltose binding protein interacts with maltose. ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含むマルトース結合タンパク質。 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof at the 171st and N-terminal of the amino acid sequence of maltose-binding protein, or the maltose-binding containing 283th and N-terminal of the amino acid sequence of maltose-binding protein, respectively protein. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法であって、
２種類の４塩基コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合した２種類のアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法。A method for producing the protein according to any one of claims 1 to 9,
A step of preparing mRNA of a protein into which two types of 4-base codons are inserted, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer changes when the protein interacts with another molecule at the position where the 4-base codon is inserted. The location of the mRNA corresponding to the location on the protein where the distance and orientation can vary, such as
A step of preparing two types of amino acids labeled with two types of fluorescent substances capable of causing fluorescence resonance energy transfer, each having a tRNA having an anticodon for the four-base codon bound thereto, and the mRNA and amino acid And a step of synthesizing a protein using the bound tRNA. ２種類の４塩基コドンの一方を終止コドンに置き換えた請求項１６記載の方法。 The method according to claim 16, wherein one of the two types of 4-base codons is replaced with a stop codon. 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項１６または１７に記載の方法。 The method according to claim 16 or 17, wherein the protein is synthesized in a cell-free translation system. タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 18, wherein the protein is calmodulin or maltose-binding protein. ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含ませる請求項１９記載の方法。 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora The -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof is included in the 40th and N-terminal of the amino acid sequence of calmodulin or the 99th and N-terminal of the amino acid sequence of calmodulin, respectively. Method. ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含ませる請求項１９記載の方法。 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof and 4-difluoro-5- (2-thienyl) -4-bora -3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof is included in the amino acid sequence of the maltose binding protein at positions 171 and N, respectively, or at the amino acid sequence of the maltose binding protein at positions 283 and N, respectively. Item 20. The method according to Item 19. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記被験分子の相互作用を検出する方法。 A protein according to any one of claims 1 to 9 is contacted with a test molecule, and a three-dimensional structural change of the protein due to an interaction between the protein and the test molecule is detected by measuring fluorescence resonance energy transfer, A method for detecting an interaction between the protein and the test molecule. タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項２２記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the protein is calmodulin or maltose binding protein. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法。 A protein according to any one of claims 1 to 9 is contacted with a test molecule, and a three-dimensional structural change of the protein due to an interaction between the protein and the test molecule is detected by measuring fluorescence resonance energy transfer, A method for screening a molecule that interacts with the protein. タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項２４記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the protein is calmodulin or maltose binding protein. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質と該タンパク質と相互作用する少なくとも１つの分子および被験化合物を接触させ、該タンパク質と該分子との相互作用を前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記分子との相互作用を阻害または増強する化合物をスクリーニングする方法。 The protein according to any one of claims 1 to 9, and at least one molecule that interacts with the protein and a test compound are brought into contact with each other, and the interaction between the protein and the molecule is caused by fluorescence of a three-dimensional structural change of the protein. A method of screening for a compound that is detected by measuring resonance energy transfer and inhibits or enhances the interaction between the protein and the molecule. タンパク質がカルモジュリンであって、タンパク質と相互作用する分子がカルシウム結合タンパク質およびカルシウムイオンである請求項２６記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the protein is calmodulin and the molecules that interact with the protein are calcium binding proteins and calcium ions. タンパク質がマルトース結合タンパク質であって、タンパク質と相互作用する分子がマルトースである請求項２６記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the protein is maltose binding protein and the molecule that interacts with the protein is maltose.
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