JPS63258895A - ヒンジペプチド、その製造法及びその合成免疫原製造への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なヒンジペプチド、その製造法及びその合
成免疫原製造への応用に関うる。

合成部分的配列によるプロティン・リゾチミンについて
の５ｅｌａ作業グループの研究１）Ｒ。

Ａｒｎ０ｎ及びＭ’、５ｅｌａ　（１９８９）　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ１％Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ　、　ｔｌｓＡ　６２．１６３−１７０；（２）
　Ｒ，Ａｒｎｏｎ、Ｅ、Ｍａｒｏｎ。

Ｍ、５ｅｌｅ及びＧ、Ｂ、＾ｎｆｉｎｓｅｎ（１９７１
）　Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６８．１４５０−１４５４　）は、感
染性のない代用ワクチン製造のためにウィルスエンベロ
ツブ・プロティン又は細菌毒の部分配列であってこれら
の病原体の抗原部に相当する部分配列の可能な使用にラ
イての以後の研究（（３）　Ｍ、５ｅｌａ（１９７４）
　Ｂｕｌｌ。

Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ　７２．７３−８６；（４）
　Ｒ，Ａ、Ｌａｒｎｅｒ　（１９１１２）Ｎａｔｕｒｅ
　（Ｌｏｎｄｏｎ）　１９９．５９２；（５）　Ｍ、５
ｅｌｅ　（１９８３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２．
４１５−４２４　）のための基礎を成した。この種の合
成ワクチンは、Ｔ−及びＢ−細胞レベルに対する持続性
免疫応答に関して天然の病原体の免疫原（ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｅ）ポテンシャルを模倣しかつＴｈ−及びＢ−細
胞を誘発する決定基を完全に排除する（ｅｘｐｒｉｍｉ
ｅｒｅｎ）はずである。

現在これらの試みの一般的方法はプロティンの抗原配列
範囲の合成ペプチド配列と担体プロティンとの又は何倍
も強い免疫原語特性のポリマー化合物との橋かけ反応剤
による結合に基いている。

この関係において特異性橋かけ反応剤に関心が高まって
おり（（７）　Ｖ、Ｃ，５ｔｅｖｅｎｓ（１９８６）　
　５ｙｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉ
ｇｅｎｓ″ＣＩＢ＾Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍ−ｐ
ｏｓｉｕｍ　１１９．　Ｗｉｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔ
ｅｒ　ｐｐ、２００−２２５　）、これに関連して本発
明者らの独自の研究は著しい進歩を導いた（（８）　Ｒ
，Ｇｅｌｇｅｒ、Ｌ、Ｍｏｒｃｉｄｅｒ　Ｅ、Ｗｕｎｓ
−ｃｈ（１９８４）　”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　１９８４　
”　（ＩＪ、Ｉ％ａｇｎａｒｓｏｎ［）＾１ｍｑｕｉｓ
ｔ　ａｎｄ　Ｗｌｋｓｅｌｌ　Ｉｎｔ、、Ｓｔｏｃｋｈ
ｏｌｍ　ｐｐ、　４５１−４５６）この種のペプチド／
プロティン接合体はすでに実験動物の免疫用に用いられ
ている。免疫応答は公知の免疫助剤の添加又は組みこみ
によってさらに向上させることができる。

これらの研究は　１）ウィルス−エンベロツブ・プロテ
ィン及び細菌毒の支配的な免疫抗原決定基は立体的に固
定された形の特定のプロティン配列に相当すること及び
２）この種の抗原決定基の担体は単に貯蔵作用に役立つ
のみでなく、Ｔｈ−及びＢ−細胞の側の特異性認識のた
めの抗原決定基配列の発現において決定的な役割を果し
もすることという知見（（９）展望：５ｙｔｈｅｔｉｃ
　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓＡｎｔｉｇｅｎｓ、　ＣＩＢ
Ａ　　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　
１１９゜ｗｉｌｅｙ、ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、　１９８
６）を導いた。

西独特許公開公報（ＤＨ−ＡＩ）−３４３０８９４から
は天然のコレラ毒素の下位単位Ｂの配列の一部に相当す
るポリペプチドを有する高分子担体からなる結合生成物
を包含するコレラ及び熱不安定性大腹菌毒素に抗する合
成ワクチンが公知である。その担体は適切なトキソイド
又は高分子量の合成ポリマーたとえば分子量少なくとも
約５００００のアラニン−リシン−ポリマーなどとする
ことができる。

免疫グロブリンのペプチド連鎖（複数）がヒンジ部を介
して互いに結合してあってたとえばＩｇＧのＹ字形構造
が生じ得るようになることは公知であ゛る。この７字形
が抗原結合の際に必要なＩｇＧ分子の可撓性を可能にす
る。

本発明の課題はプロティンの抗原配列範囲のペプチド配
列を結合するためのヒンジ部として使用可能な多様に応
用できる中心分子をもたらすことである。

最終的には中和する諸特性を備えた、再現可能の免疫応
答に関して有効な免疫原の諸要件には確かに病原体（複
数）の抗原決定基１種又は数種をとりこんだ特定構造の
分子の合成によってのみ成功裡に応えることがでとる。

免疫原としてのこの種の合成ミニプロティンの構成のた
めには担体骨組としていくつかの相異なる固定個所の設
けである特定の構造の中心分子が必要である。この種の
骨組分子を本発明者らは今回ヒンジペプチドの形の免疫
グロブリンの一次構造から採用した。これは式Ｉ （Ｉ） の二重鎖へテロブチツク環状シスチンーペプチドである
。この式中のアミノ酸はすべてＬ−配列である。四つの
固定個所は任意にＮ−又はＣ−末端に三官能性アミノ酸
残基なとりこんで延長でき、選択的に保護され得る。そ
れによって目標を定めての、同−又は相異なる一次構造
のいくつかの抗原決定基の線状又は環状の取りこみが可
能となる。付加的に公知の性格の助剤たとえばムラミル
ペプチド又はアミノ酸の脂肪酸話導体などの共有結合が
随時可能である。

前記式Ｉの中心分子にはこのペプチドの諸特性に不利な
影響を及ぼすことなしに若干の変更を施こすことができ
る。それでたとえば−個所又は数個所のＰｒｏアミノ酸
残基を同じ立体配置を保証するアミノ酸残基により代替
することができるので本発明によるヒンジペプチドを一
般式１．ａ（式中ＸはＰｒｏ又は立体的観点からプロリ
ンと同価であるアミノ酸の残基である）をもって表わす
ことができる。

その他の置換も考えられ得る。

原則としてヒンジ部の二重連鎖は“平行”及び“逆平行
”の配置が可能である。平行配置の方が安定でありそれ
ゆえ優先される。

本発明によるヒンジペプチドは比較的小さく堅固である
という利点がある。このことから結果として生じる安定
性がこのヒンジペプチドから構成される免疫原へも伝わ
り、このことがたとえば酵素の安定性に遊離に影響する
。

本発明によるヒンジペプチドはいくつかの官能基を有し
これらは一部又は全部がそれ自体公知の方法において通
常の保護基たとえばＢＯＣ％ＦＭＯＣ（フルオレニン　
メトキシカルボニル）　、Ｎｐ５（２−二トロフェニル
スルフェニル）　、ｔａｕ　（ｔｅｒｔ−ブチルエステ
ル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテル）　、Ａｃｍ（アセチ
ルアミノメチル）、トリチルにより保護され得る。

理論上は本発明によるヒンジペプチドは天然の免疫グロ
ブリンから分離により作ることができるが、このことは
極端に大きな負担のためのみでなく、まさに合成ワクチ
ン製造により排除さるべき天然起源のワクチン製造の際
の危険と同様の不純分随伴の危険のためからも実施でき
ない。

本発明にとよるヒンジペプチドの合成用にはさまざまな
方法が提供される。

法Ａ（フローシートＡ） 溶液中での在来のペプチド合成の公知の方法を適用して
（（１０）　）ｌｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｅｎ　ｄｅｒＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｍ　Ｃｈｅｍｉｃ
　Ｖｏｌ、１５１　／　Ｉｔ　（Ｅ、Ｗｕｎｓｃｈ編）
　Ｇｅｐｒｙ　Ｔｈ１ｅａ＋ｅ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ
、　１９８４　）ヒンジペプチドの両頭のペプチド誘導
体！！及びａｔが作られる。引続いてホスフィンを用い
て■及び■からｊｅｒｔ−ブチルチオ残基を還元性に分
１！　（（１１）Ｌ。

Ｍｏｒｏｄｅｒ、　Ｍ、Ｇｅｍｅｉｎｅｒ、　Ｗ、Ｇａ
ｈｒｉｎｇ、　Ｅ、Ｊａｅｇｅｒ。

Ｐ、　Ｔｈａｍｍ及びＥ、Ｗｕｎｓｃｈ　（１９８１）
　Ｂｉｏｐｏｌｙｉｅｓｓ　２０゜１７−３７　）　Ｌ
／た後にシスティンペプチドをアゾ・ジカルボン酸誘導
体（（１２Ｅ、　Ｗｊｉｎｓｃｈ、　Ｓ、　Ｒｏｍａｎ
ｉ。

Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’　ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ
、　ＣｈｇｍＪ６３　（１９８２）４４９−４５３　）
と選択的に結合して七ノーシスチンーペプチド■とする
。第２のシスチン橋かけは、今度は文献（（１３）　Ｂ
、　Ｋａａ＋ｂｅｒａ及びＬ　Ｒｉｔｔｅｌ（１９６８
）　）Ｉｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　５１．２０
６１−２０６４）から公知の方法に従ってペプチド誘導
体■のヨウ素酸化により選択的に作られる。これによっ
て一般式Ｖのへブチド話導体が入手可能となる。

フローシート°Ａ ヒンジ−ペプチド誘導体の合成方法　Ａ：Ｒｔ−Ｔｈｒ
（Ｒｚ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
（ＳｔＢω−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＲｓ　　　（
ＩＩ）Ｒ４−Ｔｈｒ（Ｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＬＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−ＯＲｓ　　　（Ｉ［Ｉ）Ｒ＋　−Ｔｈｒ（Ｒｔ）
　−Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−ＯＲ＝＋　　　　　　　　
　　　　　　　（ＩＶ）Ｒｔ−ＴｈｒＧｌｇ）−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｐｒｏ−
ＯＲ３＋　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　
　　　　（Ｖ）Ｒ４−Ｔｈｒ　（Ｒｚ）　−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＲ
１法Ｂ　フローシートＢ 方法Ａの別法としてオクタペプチド屈導体■を在来のペ
プチド合成法に従って作る０両方のｔｅｒｔブチルチオ
基の分離はここでもまたホスフィンを用いる還元により
（（１１）　Ｌ、　Ｍｏｒｏｃｌｅｒ、　Ｍ、　Ｇａｍ
ｅ−ｉｎｅｒ、　Ｗ、　Ｇａｈｒｉｎｇ、　Ｅ、　Ｊａ
ｅｇｅｒ、　Ｐ、　Ｔｈａｉ’Ｉ１１及びＥ、　Ｗｕｎ
ｓｃｈ　（１９８１）　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２０
．　１７−３７）行なわれる。結果として生じるビス−
システィン−ペプチド誘導体■は空気酸化により１Ｏ−
３乃至１０−’Ｍの濃度においてヒンジペプチド誘導体
■に変えられる。双方の連鎖の平行配置はエネルギー上
から望ましく、もっばら式■の生成物が生じることにな
る。このことは方法Ａ（目標ジスルフィド橋かけ）及び
方法Ｂによるヒンジペプチド製造の比較実験によりて立
証された。

フローシート　Ｂ ヒンジ−ペプチド誘導体の合成方法　Ｂ：ＲｒＴｈｒ（
Ｒｚ）−Ｃｙｓ（ＳＬＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
（ＳｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＲｓ　　（
Ｖｌ）Ｒｔ−Ｔｈｒ（Ｒｉ）　−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＲｓ　　　　
　　　　（Ｗ）これらのヒンジペプチドの構造はさまざ
まな分析法たとえば浸透圧測定法による分子量決定、酸
性加水分解及び酵素性分解によるアミノ酸分析、ラセミ
体試験及び高分解度各共鳴分光法によって確認できる。

これらの生成物の単一性はクロマトグラフィーによる分
析試験により立証された。

本発明によるヒンジペプチドは有利に、合成免疫原の製
造に利用できる。

それゆえ本発明は合成免疫原の製造法であって本発明に
よるヒンジペプチドを担体プロティンとして使用しこれ
をそれ自体公知の方法においてプロティンの抗原配列範
囲のペプチド配列望ましくは合成ペプチド配列と結合す
ることからなる合成免疫原の製造法も包含する。

この種の抗原決定基接合体合成を以下にモデルとしての
ガストリン／ヒンジペプチドの例について説明する。

法Ａ（フローシートＣ） ヒトのリトル・ガストリン・ｌのノルロイシン−１５相
似体の配列６−１７のＮａ及び側鎖が保護してあるガス
トリン−ペプチド■を混合無水物法によってヒンジペプ
チド誂導体Ｖの両Ｎ末端に最良の収率をもって結合した
。２−メチルインドール及びトリフルオル酢酸／２−メ
チルインドールの存在下においてＨＣＡを用いてＸから
保護基を分離した後にゲル濾過及びセルロース上での配
分クロマトグラフィーによって所望のガストリン−ヒン
ジペプチド接合体℃が単一の生成物として取得できた。

ド℃を混合無水物法によってオクタペプチド■と結合し
て刈とした。酸性で不安定の保護基の二段階分離及びカ
ラムクロマトグラフィーによる中間生成の後今回は結果
として生じたペプチド誘導休店からホスフィン法に従っ
てシスティン保護基を還元的に除去した。得られたビス
−システィン−ペプチドは空気酸化により上記の濃度で
最良の収率でガストリン−ペプチド接合体℃に転化され
た。

ぎ　　　　　　× よ 方法Ａ及び方法Ｂによる生成物は実施された分析測定す
べてにおいて同一と見出された。

ウサギの免疫をこのモデル接合体を用いフロイント助剤
を添加して公知の方法（（１４）　Ｃ，Ｍ。

Ｊｕｒｋｅｌｓｏｎ、　Ｗ、Ｅ、Ｄａｌｅ、　Ｒ，Ｒｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ、　Ｔ、Ｅ。

Ｓｏｌｏｍｏｎ（１９８６）Ｒｅｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
　１５，２０５−２１７）に従って実施した。得られた
抗ガストリンー抗血清タイターは在来のガストリン接合
体たとえばガストリン／リボヌクレアーゼ又はガストリ
ン／クシ血清アルブミンを用いて得られた抗体−タイツ
−（（８）Ｒ，Ｇｅｉｇｅｒ、　Ｌ、Ｍｏｒｏｄｅｒ及
びＥ　、Ｗｔｉｎｓｃｈ　（１９８４）Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ　（Ｕ、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ編）　ａｌｍｑｕｉｓ
ｔ　ａｎｄ　Ｗｉｋｓ−ｅｌｌ　Ｉｎｔ、、Ｓｔｏｃｋ
ｈｏｌｍ　ｐｐ４５１−４５８）と同等であった。

Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｆ（（ＩＩ　ｂ）融点１０
０−１０５℃；［α］　　＝−２０５３°乃至（ｃ＝１
．メタノール）；アミノ酸分＃：ＴｈｒＯ，７８（Ｌ）
　” Ｐｒｏ　３．９３（４）Ａｌａ　１．０Ｏ（１）　Ｃｙ
ｓ　１．９９（２）ニラセミ体試験：　Ｄ−Ａｌａ　Ｏ
，４％；　Ｄ−ａｌｒｏ−Ｔｈｒ　　１％：　Ｄ−Ｐｒ
。

１％。

元素分析　Ｃ３゜１ｈａＮ＋ａＯ＋ｓＳ４．Ｈ２０（１
１７１，５）計算値：　Ｃ５１，２６Ｈ６，７１Ｎ１１
．９６５１０．９５実測値：　Ｃ５１，４８Ｈ６，７２
Ｎ１１．５９５１０．７６゛）括弧内は計算値 Ｐｒｏ−ＯＨ（ＩＩｌ　ｂ） Ｉｌ　ｂを９５％トリフルオルエタノール中でトリブチ
ルホスフィン５当量を用いて還元して（室温において３
時間）収率９３％で得られた。

［α］二’＝−１８．２°乃至［す：、　＝−２１７，
３゜（ｃ　＝　１　、メタノール） 元素分析　Ｃ４゜Ｈ８５Ｎ９０１１５２　（９１２，１
５）計算値：　Ｃ５２，６７Ｈ７，１８Ｎ１３．ｌ１２
５７．０３実測値：　Ｃ５２，６３Ｈ７，２０Ｎ１３．
４９５７．０９肚虹肚１３．　　　　　　　　　　　　
　　（ｒＶ　ｂ）ジメチルホルムアミド中でアーゾジカ
ルボン酸ジｔｅｒｔブチルエステル０．５当量を用いて
のＩｌ　ｂの酸化； 収率８１％；融点１８０−１８５℃（分解）；［α］：
＝−２０４．０°乃至［ａ］　　　＝−２４３，４°　
（Ｃ＝１８０％酢酸） アミノ酸分析：　Ｔｈｒ　１．３４（２）　Ｐｒｏ　７
．９２（８）　Ａｌａ２．００（２）　Ｃｙｓ　４．Ｑ
３（４）；ペプチド含有量＝９２％ 表」己」皿 （ｖ　ｂ） ８０％酢酸中のＲｒｂ　　（ｃ＝２ｘｌＯ−’Ｍ）を８
０％酢酸中のヨウ素（５当量、ｃ　＝　Ｉ　Ｘ　１２−
’Ｍ）へゆりくり滴下する：ペプチド最終濃度ＬＸ　１
０−’Ｍ　＠収率ニア４％；融点２１５−２２（１℃（
分解）；［α］　冨−３２１，０”乃至［α］　　　＝
−３８２，６゜Ｏ５４６ （ｃ＝１．８０％酢酸） アミノ酸分析：　Ｔｈｒ　１．６０（２）　Ｐｒｏ　７
．８３（８）　Ａｌａ２．００（２）　Ｃｙｓ　４．０
０（４）；ペプチド含有量：９８％ ラセミ体試験：Ｄ−Ａｌａ　Ｏ，８％ＨＤ−ａｌｔｏ−
Ｔｈｒ　Ｏ，８％；　Ｄ−Ｐｒｏ　＜１％浸透圧法分子
量測定：実測値Ｍｒ＝　１．４７０ 理論値Ｍｒ＝　１６７８．１ 元素分析　０７４８１１８Ｎ＋６０２゜Ｓ４，５Ｈ＊０
（１，７８８，２）計算値：　Ｃ５Ｇ、２７　Ｎ７．１
８　Ｎ１２．６７５７．２５実測値：　Ｃ５０，２０）
１７．０８８１２．フＱ　５７．０２五ｌ己１■ ［）１−Ｌｅｕ−［Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）］］５−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）　−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎ　１ｅ−
Ａｓｐ　（Ｏｔａｕ）　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　（ｔａｕ）
　−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒａ
−Ｐｒｏ−ＯＨＩ　、　　（Ｘ　ｂ）　　混合無水物法
によるＶｂ（１当量）とＮｐ５−Ｌｅｕ−［Ｇｌｕ　（
ＯｔＢｕ）　］−Ａ　１ａ−Ｔｙｒ（ｔａｕ）−Ｇｌｙ
−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ　（ＯｔＢｕ）−ｐｈｅ−０
）１　　（ＩＸ　）３当量との化学変化及び引続いての
２−メチルインドールの存在におけるＮ−メチルピロリ
ドン中の）１ｃＩＬを用いるＮｐ５−分１１ｉ１ｉ　Ｌ
）１８０でのゲル濾過による精製（溶媒；Ｎ−メチルピ
ロリドン）、収率３５％。

アミノ酸分析；Ａｓｐ　２．１４（２）　Ｔｈｒ　１７
６（２）Ｇｌｕ　９．４０゜（１０）　Ｐｒｏ　８．２
２　（８）Ｇｌｙ　２．１２　（２）　Ａｌａ　４．２
０（４）Ｃｙｓ　４．２２　（４）　Ｌｅｕ　１．８６
　（２）　Ｎｌｅ／Ｔｙｒ　４．１６（４）Ｐｈｅ２．
１８　（２）　；ペプチド含有量二８５％（Ｍｒ−５，
７５９，９ジヒドロクロリドとして）。

Ｋ五血豆 ［トＬｅｕ−［Ｇｌｕｌｓ−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｆ’ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏ
ＨＩ　２　（ＸＩ　ｂ）化合物ｘｂを２−メチルインド
ール（５０当量）の存在において、９９％トリフルオル
酢酸／アニソール（１０：１）で処理する。粗生成物を
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＨＷ−４０５でのゲル濾過（溶出
液２１Ｍ酢酸アンモニウム／２−ブタノール／２−プロ
パツールＩＯＱ：１６：１．５．１）Ｎ７．２）及びセ
ルロースでの配分クロマトグラフィー（溶出液：　０．
０５Ｍ酢酸アンモニウム／２−ブタノール／ｌ−ブタノ
ール／２−プロパツール、２０：１０：４：４　ｐＨ５
，５）によつて精製する。

ＨＣＪ２加水分解物のアミノ酸分析： Ａｓｐ　２．０９　（２）　Ｔｈｒ　１．７２　（２）
　Ｇｌｕ　９．５９　（９）　Ｐｒ。

７．９３（８）Ｇｌｙ　２．１４　（２）　Ａｌａ　３
．９９　（４）　Ｃｙｓ　４．２４（４）Ｌｅｕ　　２
．００（２）　Ｎｌｅ／Ｔｙｒ　３．９５　（４）　Ｐ
ｈｅ　２．０３（２）Ｔｒｐ　１．９２　（２）：ペプ
チド含有量：　８６．６％（Ｍｒ−４，７８９，４）。

ＸＩｂをジチオトレイトールでの還元、ヨード酢酸を用
いてのＳ−カルボキシメチル化の後にアミノペプチダー
ゼＭ／プロリダーゼを用いて消化させてアミノ酸分析す
る。

アミノ酸分析：　Ａｓｐ　２．０９　（２）　Ｔｈｒ　
１．８４　（２）　Ｇｌｕ９．９６　（１０）　Ｐｒｏ
ｓ　６．６０（８）　Ｇｕｙ　２．ＯＱ　（２）　Ａ１
６３．９４（４）　Ｎｌｅ／Ｔｙｒ　３．８２　（４）
　Ｐｈｅ　２．Ｑ２　（２）Ｔｒｐ　１．８０Ｌｅｕ　
（ＴＲＩＳ−緩衝液重複のため）及びＳ−カルボキシメ
チル−システィンは測定してない。

°リブロリダーゼもＰｒｏ−Ｐｒｏ配列を定量的には消
化しない

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ） （式中Ｘで表わしてあるアミノ酸残基は相互無関係にＰ
   ｒｏアミノ酸残基であるか又は立体的観点からプロリン
   と同価であるアミノ酸残基を表わす）のヒンジペプチド
   。 ２、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） の請求項１記載のヒンジペプチド。 ３、完全に又は部分的に保護してある請求項１又２記載
   のヒンジペプチド。 ４、請求項１乃至３のうちの一つに記載のヒンジペプチ
   ドの製造法であって ａ）在来のペプチド合成の公知の方法を適用してヒンジ
   ペプチドの双方の連鎖のペプチド誘導体Ｒ＿１−Ｔｈｒ
   （Ｒ＿２）−Ｃｙｓ（Ｚ＿１）−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｚ＿
   ２）−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−ＯＲ＿３（IIａ） 及び Ｒ＿４−Ｔｈｒ（Ｒ＿２）−Ｃｙｓ（Ｚ＿１）−Ｘ−Ｘ
   −Ｃｙｓ（Ｚ＿２）−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−ＯＲ＿５（III
   ａ） （式中Ｒ＿１乃至Ｒ＿５はＨ又はペプチド化学において
   通常の保護基望ましくは Ｒ＿１＝Ｈ；ＢＯＣ；ＦＭＯＣ；Ｎｐｓ； Ｒ＿２＝Ｈ；ｔＢｕ； Ｒ＿３＝Ｈ；ｔＢｕ； Ｒ＿４＝Ｈ；ＢＯＣ；ＦＭＯＣ；Ｎｐｓ； Ｒ＿５＝Ｈ；ｔＢｕ でありＺ＿１及びＺ＿２は一方がＡｃｍ又はトリチルを
   、他方がＳｔＢｕを表わす）を作り次にシステイン残基
   のｔｅｒｔ−ブチルチオ−保護基を、ホスフィンたとえ
   ば（Ｃ＿４Ｈ＿９）＿３Ｐを用いて還元分離し、連鎖I
   Iａ及びIIIａの遊離システイン残基をアゾジカルボン酸
   誘導体たとえばＢＯＣ−Ｎ＝Ｎ−ＢＯＣを用いて選択的
   に結合してモノ・システインペプチド ▲数式、化学式、表等があります▼（IVａ） としこれをそれ自体公知の方法においてヨウ素酸化によ
   り酸化して ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖａ） とし次に保護基Ｒ＿１乃至Ｒ＿５をそれ自体公知の方法
   で場合によっては選択的に分離するか 又は ｂ）在来のペプチド合成の公知の方法を適用してオクタ
   ペプチド誘導体 Ｒ＿１−Ｔｈｒ（Ｒ＿２）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｘ−
   Ｘ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−ＯＲ＿３（
   VIａ） （式中Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３はそれぞれ Ｒ＿１＝Ｈ；ＢＯＣ；ＦＭＯＣ；Ｎｐｓ； Ｒ＿２＝Ｈ；ｔＢｕ； Ｒ＿３＝Ｈ；ｔＢｕ； を表わす）を作り、次にシステイン残基のｔｅｒｔ−ブ
   チルチオ保護基をホスフィンたとえば（Ｃ＿４Ｈ＿９）
   ＿３Ｐを用いて還元分離し、よって生成するビスシステ
   インペプチド誘導体Ｒ＿１−Ｔｈｒ（Ｒ＿２）−Ｃｙｓ
   −Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−ＯＲ＿３（VIIａ
   ）を空気酸化によってヒンジ・ペプチド誘導体▲数式、
   化学式、表等があります▼（VIIIａ） に変化させこのものから保護基Ｒ＿１乃至Ｒ＿３をそれ
   自体公知の方法において場合によっては選択的に分離す
   ることからなるヒンジペプチドの製造法。 ５、合成免疫原の製造において請求項１乃至３のうちの
   一つに記載のヒンジペプチドの使用。 ６、ガストリン／ヒンジペプチド接合体の合成において
   請求項１乃至３のうちの一つに記載のヒンジペプチドの
   使用。 ７、担体プロテインとしての請求項１乃至３のうちの一
   つに記載のヒンジペプチドをそれ自体公知の方法におい
   てプロテインの抗原配列範囲のペプチド配列とまた場合
   によっては免疫助剤と連結する合成免疫原の製造法。